ES2253753T3 - Citocina que induce apoptosis. - Google Patents

Abstract

UNA NUEVA CITOQUINA DENOMINADA TRAIL INDUCE LA APOPTOSIS DE DETERMINADAS CELULAS DIANA, INCLUYENDO CELULAS CANCERIGENAS Y CELULAS INFECTADAS POR VIRUS. SE DESCUBREN SECUENCIAS DE DNA AISLADAS QUE CODIFICAN TRAIL, JUNTO CON VECTORES DE EXPRESION Y CELULAS HUESPED TRANSFORMADAS UTILES EN LA PRODUCCION DE POLIPEPTIDOS TRAIL. SE PROPORCIONAN ASIMISMO ANTICUERPOS QUE SE UNEN ESPECIFICAMENTE A TRAIL.

Description

Citocina que induce apoptosis.

Antecedentes de la invención

La muerte celular programada conocida como apoptosis es distinta de la muerte celular debida a necrosis. La apoptosis tiene lugar en la embriogénesis, metamorfosis, atrofia tisular dependiente del sistema endocrino, recambio tisular normal, y muerte de timocitos inmunitarios (inducida a través de su complejo antígeno-receptor o mediante glucocorticoides) (Itoh el al., Cell 66:233, 1991). Durante la maduración de las células T en el timo, se destruyen las células T que reconocen autoantígenos a través de un proceso apoptótico, mientras que otras se seleccionan positivamente. Se ha sugerido la posibilidad de que algunas células T que reconocen ciertos autoepítopos (por ejemplo, determinantes antigénicos que se han procesado y presentado de manera ineficaz de una autoproteína dada) escapen a este proceso de eliminación y posteriormente desempeñen un papel en enfermedades autoinmunitarias (Gammon et al., Immunology Today 12:193, 1991).

Se ha informado de que un antígeno de superficie celular conocido como Fas media en la apoptosis y se cree que desempeña un papel en la deleción clonal de células T autorreactivas (Itoh et al., Cell 66:233, 1991; Watanabe-Fukunage et al., Nature 356:314, 1992). Se ha informado de que reticulando un anticuerpo monoclonal específico con Fas se induce que varias líneas celulares experimenten apoptosis (Yonehara et al., J. Exp. Med., 169:1747, 1989; Trauth et al., Science, 245:301, 1989). Sin embargo, en ciertas condiciones, la unión de un anticuerpo monoclonal específico a Fas puede tener un efecto coestimulante sobre células T recién aisladas (Alderson et al., J. Exp. Med. 178:2231, 1993).

Se han aislado ADN que codifican para un ligando de Fas de rata (Suda et al., Cell, 75:1169, 1993) y un ligando de Fas humano (Takahashi et al., International Immunology 6:1567, 1994). Se ha demostrado que la unión del ligando de Fas a células que expresan el antígeno Fas induce apoptosis (Suda et al., anteriormente, y Takahashi et al., anteriormente).

Es deseable la investigación de la existencia e identidad de otra(s) molécula(s) que desempeñan un papel en la apoptosis. La identificación de tales moléculas proporcionaría un medio adicional de regulación de la apoptosis, así como proporcionaría una percepción adicional del desarrollo de autotolerancia del sistema inmunitario y la etiología de las enfermedades autoinmunitarias.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona una proteína citocina novedosa, así como una ADN aislado que codifica para la citocina y vectores de expresión que comprenden el ADN aislado. Las propiedades de la citocina novedosa, que es un miembro de la familia de ligandos del factor de necrosis tumoral (TNF), incluyen la capacidad para inducir la apoptosis de ciertos tipos de células diana. De este modo, esta proteína se designa como ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF (TRAIL). Entre los tipos de células que se destruyen por el contacto con TRAIL se encuentran células cancerosas tales como células de leucemia, linfoma y melanoma, y células infectadas por un virus.

Un método para producir polipéptidos de TRAIL supone cultivar células huésped transformadas con un vector de expresión recombinante que contiene ADN que codifica para TRAIL en condiciones apropiadas para la expresión de TRAIL, entonces recuperar del cultivo el polipéptido de TRAIL expresado. También se proporcionan anticuerpos dirigidos contra los polipéptidos de TRAIL.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 presenta los resultados de un ensayo descrito en el ejemplo 8. El ensayo demostró que un polipéptido de TRAIL humano soluble indujo la muerte de células Jurkat, que son una línea celular de leucemia.

La figura 2 presenta los resultados de un ensayo descrito en el ejemplo 11. El contacto con un polipéptido de TRAIL humano soluble indujo la muerte de fibroblastos humanos infectados por citomegalovirus, mientras que no se destruyeron fibroblastos no infectados de forma viral.

Descripción detallada de la invención

En el presente documento se proporciona una proteína novedosa designada como TRAIL, junto con un ADN que codifica para TRAIL y vectores de expresión recombinante que comprenden ADN de TRAIL. Un método para producir polipéptidos de TRAIL recombinantes supone cultivar células huésped transformadas con los vectores de expresión recombinantes en condiciones apropiadas para la expresión de TRAIL, recuperar el polipéptido de TRAIL expresado.

La presente invención también proporciona anticuerpos que unen específicamente proteínas TRAIL. En una realización, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales.

La proteína TRAIL induce la apoptosis de ciertos tipos de células diana, tales como células transformadas que incluyen pero que no se limitan a células cancerosas y células infectadas de forma viral. Tal como se demuestra en los ejemplos 5, 8, 9 y 10 de más adelante, TRAIL induce la apoptosis de líneas celulares humanas de leucemia, linfoma y melanoma. Entre los usos de TRAIL se encuentra el uso de destruir células cancerosas. TRAIL encuentra un uso adicional en el tratamiento de infecciones virales. La infección por citomegalovirus (CMV) convirtió los fibroblastos humanos en susceptibles de apoptosis cuando entraron en contacto con TRAIL, mientras que los fibroblastos sin infectar no se destruyeron a través del contacto con TRAIL (véase el ejemplo 11).

Se describe el aislamiento de un ADN que codifica para TRAIL humano en el ejemplo 1 de más adelante. Se presenta la secuencia de nucleótidos del ADN de TRAIL humano aislado en el ejemplo 1 en la SEQ ID NO:1, y se presenta la secuencia de aminoácidos codificada por la misma en la SEQ ID NO: 2. Esta proteína TRAIL humana comprende un dominio citoplasmático N-terminal (aminoácidos 1-18), una región transmembrana (aminoácidos 19-38) y un dominio extracelular (aminoácidos 39-281). El dominio extracelular contiene una región de unión a receptores.

Se depositaron células de la cepa DH10B de E. coli transformadas con un vector recombinante que contiene este ADN de TRAIL humano en la Colección Americana de Cultivos Tipo el 14 de junio de 1995, y se les asignó el nº de registro 69849. Se hizo el depósito bajo las condiciones del Tratado de Budapest. El vector recombinante en la cepa depositada es el vector de expresión pDC409 (descrito en el ejemplo 5). Se digirió el vector con SalI y NotI, y se ligó el ADN de TRAIL humano que incluye la región codificante completa mostrada en la SEQ ID NO: 1 en el vector.

Se aisló ADN que codifica para una segunda proteína TRAIL humana tal como se describe en el ejemplo 2. Se presenta la secuencia de nucleótidos de este ADN en la SEQ ID NO: 3, y se presenta la secuencia de aminoácidos codificada por la misma en la SEQ ID NO: 4. La proteína codificada comprende un dominio citoplasmático N-terminal (aminoácidos 1-18), un región transmembrana (aminoácidos 19-38) y un dominio extracelular (aminoácidos 39-101).

El ADN de la SEQ ID NO: 3 carece de una parte del ADN de la SEQ ID NO: 1, y se designa de este modo como el clon de la variante de deleción de TRAIL humano (huTRAILdv). Los nucleótidos 18 a 358 de la SEQ ID NO: 1 son idénticos a los nucleótidos 8 a 348 del ADN de huTRAILdv de la SEQ ID NO: 3. Faltan los nucleótidos 359 a 506 de la SEQ ID NO: 1 del ADN clonado de la SEQ ID NO: 3. La deleción provoca un desplazamiento en el marco de lectura, que tiene como resultado un codón de terminación dentro del marco tras el aminoácido 101 de la SEQ ID NO: 4. De este modo, el ADN de la SEQ ID NO: 3 codifica para una proteína truncada. Los aminoácidos 1 a 90 de la SEQ ID NO: 2 son idénticos a los aminoácidos 1 a 90 de la SEQ ID NO: 4. Sin embargo, debido a la deleción, la parte C-terminal de la proteína huTRAILdv (aminoácidos 91 a 101 de la SEQ ID NO: 4) difiere de los residuos en las posiciones correspondientes en la SEQ ID NO: 2. A diferencia de la proteína huTRAIL de longitud completa, la proteína huTRAILdv truncada no muestra la capacidad de inducir la apoptosis de las células de leucemia de células T de la línea de células Jurkat.

También se ha aislado un ADN que codifica para una proteína TRAIL de ratón, tal como se describe en el ejemplo 3. Se presenta la secuencia de nucleótidos de este ADN en la SEQ ID NO: 5 y se presenta la secuencia de aminoácidos codificada por la misma en la SEQ ID NO: 6. La proteína codificada comprende un dominio citoplasmático N-terminal (aminoácidos 1-17), una región transmembrana (aminoácidos 18-38) y un dominio extracelular (aminoácidos 39-291). Este TRAIL de ratón es idéntico en un 64% al TRAIL humano de la SEQ ID NO: 2 a nivel de aminoácidos. La región codificante de la secuencia de nucleótidos de TRAIL de ratón es idéntica en un 75% a la región codificante de la secuencia de nucleótidos humana de la SEQ ID NO: 1.

Una realización de la presente invención se refiere a la proteína TRAIL humana caracterizada por la secuencia de aminoácidos N-terminal MetAlaMetMetGluValGlnGlyGlyProSerLeuGlyGlnThr (aminoácidos 1-15 de la SEQ ID NOS: 2 y 4). También se proporcionan en el presente documento las proteínas TRAIL de ratón caracterizadas por la secuencia de aminoácidos N-terminal MetProSerSerGlyAlaLeuLysAspLeuSerPheSerGlnHis (aminoácidos 1-15 de la SEQ ID NO: 6).

El TRAIL de la presente invención es distinto de la proteína conocida como ligando Fas (Suda et al., Cell, 75:1169, 1993; Takahashi et al., International Immunology 6:1567, 1994). El ligando Fas induce la apoptosis de ciertos tipos de células, a través del receptor conocido como Fas. Tal como se demuestra en el ejemplo 5, la apoptosis inducida por TRAIL de las células diana no está mediada por Fas. La secuencia de aminoácidos de TRAIL humano de la SEQ ID NO: 2 es idéntica aproximadamente en un 20% a la secuencia de aminoácidos del ligando Fas humano que se presenta en Takahashi et al., anteriormente. El dominio extracelular de TRAIL humano es idéntico aproximadamente en un 28,4% al dominio extracelular del ligando Fas humano.

Las secuencias de aminoácidos descritas en el presente documento revelan que TRAIL es un miembro de la familia de ligandos de TNF (Smith et al., Cell, 73:1349; Suda et al., Cell, 75:1169, 1993; Smith et al., Cell, 76:959, 1994). Las identidades en tanto por ciento entre la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de TRAIL humano y la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de otras proteínas de esta familia son tal como sigue: un 28,4% con el ligando Fas, un 22,4% con la linfotoxina-\beta, un 22,9% con TNF-\alpha, un 23,1% con TNF-\beta, un 22,1% con el ligando CD30 y un 23,4% con el ligando CD40.

Se probó TRAIL para determinar su capacidad para unir receptores de la familia de receptores TNF-R. Se llevó a cabo el análisis de unión usando el procedimiento de autorradiografía de placas de Gearing et al. (EMBO J. 8:3667, 1989). El análisis no reveló una unión detectable de TRAIL humano a CD30, CD40, 4-1BB, OX40, TNF-R (forma p80), CD27 o LT\betaR (también conocido como TNFR-RP) humanos. Los resultados en el ejemplo 5 indican que TRAIL humano no se une a Fas humano.

Los polipéptidos de TRAIL de la presente invención incluyen polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos que difieren de, pero que son altamente homólogas a, aquellas presentadas en las SEQ ID NO: 2 y 6. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, los homólogos derivados de otras especies de mamíferos, variantes (tanto variantes que se producen de manera natural como aquellas generadas mediante tecnología de ADN recombinante) y los fragmentos de TRAIL que conservan una actividad biológica deseada. Tales polipéptidos muestran una actividad biológica de las proteínas TRAIL de las SEQ ID NO: 2 y 6, y preferiblemente comprenden una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos en un 80% (lo más preferiblemente idéntica al menos en un 90%) a la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 6. Se describen con más detalle estas realizaciones de la presente invención más adelante.

Se identifican secuencias conservadas localizadas en la parte C-terminal de las proteínas de la familia de TNF en Smith et al. (Cell, 73:1349, 1993, véase la página 1353 y la figura 6); Suda et al. (Cell, 75:1169, 1993, véase la figura 7); Smith et al., (Cell, 76:959, 1994, véase la figura 3); y Goodwin et al. (Eur. J. Immunol., 23:2631, 1003, véase la figura 7 y las páginas 2638-39), incorporadas como referencia al presente documento. Entre los aminoácidos en la proteína TRAIL humana que se conservan (al menos en una mayoría de los miembros de la familia de TNF) son aquellos en las posiciones 124-125 (AH), 136 (L), 154 (W), 169 (L), 174 (L), 180 (G), 182 (Y), 187 (Q), 190 (F), 193 (Q) y 275-276 (FG) de la SEQ ID NO: 2. Otra característica estructural de TRAIL es una región espaciadora entre el extremo C-terminal de la región transmembrana y la parte del dominio extracelular que se cree que es la más importante para la actividad biológica. Esta región espaciadora, localizada en el extremo N-terminal del dominio extracelular, consiste en los aminoácidos 39 a 94 de la SEQ ID NO: 2. Se encuentran espaciadores análogos en otros miembros de la familia, por ejemplo, el ligando CD40. Los aminoácidos 138 a 153 corresponden a un bucle entre las hojas b de la proteína TRAIL humana plegada (tridimensional).

En el presente documento se proporcionan proteínas TRAIL unidas a la membrana (que comprenden un dominio citoplasmático, una región transmembrana y un dominio extracelular) así como fragmentos de TRAIL que conservan una propiedad biológica deseada, tal como se describe en el presente documento, de la proteína TRAIL de longitud completa. En una realización, los fragmentos de TRAIL son polipéptidos de TRAIL solubles que comprenden todo o parte del dominio extracelular, pero que carecen de la región transmembrana que provocaría la retención del polipéptido sobre una membrana celular. Las proteínas TRAIL solubles pueden secretarse desde las células en las que se expresan. Ventajosamente, se fusiona un péptido señal heterólogo al extremo N-terminal de manera que se secreta TRAIL soluble con la expresión.

Puede identificarse TRAIL soluble (y distinguirse de sus homólogos unidos a la membrana no solubles) mediante la separación de células intactas que expresan la proteína deseada del medio de cultivo, por ejemplo, mediante centrifugación, y sometiendo a ensayo el medio (sobrenadante) para la presencia de la proteína deseada. La presencia de TRAIL en el medio indica que se secretó la proteína desde las células y de ese modo es una forma soluble de la proteína TRAIL. La presente invención engloba las formas solubles que se producen de manera natural de TRAIL.

El uso de las formas solubles de TRAIL es ventajoso para ciertas aplicaciones. Se facilita la purificación de las proteínas de las células huésped recombinantes, ya que se secretan las proteínas desde las células. Adicionalmente, las proteínas solubles son generalmente más adecuadas para la administración intravenosa.

Son ejemplos de polipéptidos de TRAIL solubles aquellos que contienen el dominio extracelular entero (por ejemplo, aminoácidos 39 a 281 de la SEQ ID NO: 2 o aminoácidos 39 a 291 de la SEQ ID NO: 6). También se proporcionan fragmentos del dominio extracelular que conservan una actividad biológica deseada. Ventajosamente, tales fragmentos incluyen regiones de TRAIL que se conservan en las proteínas de la familia de ligandos de TNF, tal como se describe más adelante.

Son ejemplos adicionales de polipéptidos de TRAIL solubles aquellos que carecen no sólo del dominio citoplasmático y la región transmembrana, sino también de toda o parte de la región espaciadora descrita anteriormente. De este modo los polipéptidos de TRAIL humanos incluyen, pero no se limitan a, los polipéptidos que comprenden los aminoácidos x a 281, en los que x representa cualquiera de los aminoácidos en las posiciones 39 a 95 de la SEQ ID NO: 2. En la realización en la que el residuo 95 es el aminoácido N-terminal, se ha suprimido la región espaciadora entera.

Pueden prepararse los fragmentos de TRAIL, incluyendo los polipéptidos solubles, mediante cualquiera de varias técnicas convencionales. Puede subclonarse una secuencia de ADN que codifica para un fragmento de TRAIL deseado en un vector de expresión para la producción del fragmento de TRAIL. Ventajosamente se fusiona la secuencia de ADN que codifica para TRAIL a una secuencia que codifica para un péptido señal o líder adecuado. Puede sintetizarse químicamente el fragmento de ADN que codifica para TRAIL deseado usando técnicas conocidas. También pueden producirse los fragmentos de ADN mediante la digestión con una endonucleasa de restricción de una secuencia de ADN clonada de longitud completa, y aislarse mediante electroforesis en geles de agarosa. Si es necesario, pueden ligarse los oligonucleótidos que reconstruyen el extremo terminal 5' ó 3', hasta un punto deseado, a un fragmento de ADN generado mediante digestión con enzimas de restricción. Tales oligonucleótidos pueden contener adicionalmente un sitio de escisión por una endonucleasa de restricción en el sentido de 5' de la secuencia codificante deseada, y colocar un codón de iniciación (ATG) en el extremo N-terminal de la secuencia codificante.

También puede emplearse el procedimiento bien conocido de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para aislar y amplificar una secuencia de ADN que codifica para un fragmento de proteína deseado. Se emplean oligonucleótidos que definen los extremos terminales deseados del fragmento de ADN como cebadores 5' y 3'. Los oligonucleótidos pueden contener adicionalmente sitios de reconocimiento para endonucleasas de restricción, para facilitar la inserción del fragmento de ADN amplificado en un vector de expresión. Se describen las técnicas de PCR en Saiki et al., Science 239:487 (1988); Recombinant DNA Methodology, Wu et al., eds, Academia Press, Inc., San Diego (1989), págs. 189-196; y PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., eds., Academia Press, Inc. (1990).

Tal como se entenderá por el experto en la técnica, se identifica la región transmembrana de cada proteína TRAIL tratada anteriormente según los criterios convencionales para la identificación de ese tipo de dominio hidrófobo. Los límites exactos de una región transmembrana pueden variar ligeramente (lo más probablemente en no más de cinco aminoácidos en cada extremo) de los presentados anteriormente. Se dispone de programas informáticos útiles para la identificación de tales regiones hidrófobas en proteínas.

El ADN de TRAIL de la presente invención incluye ADNc, ADN sintetizado químicamente, ADN aislado mediante PCR, ADN genómico y combinaciones de los mismos. Puede aislarse ADN genómico de TRAIL mediante la hibridación con el ADNc de TRAIL descrito en el presente documento usando técnicas convencionales. También se engloba por la presente invención el ARN transcrito a partir del ADN de TRAIL.

Una búsqueda del banco de datos del NCBI identificó cinco etiquetas de secuencias expresadas (EST) que tienen regiones de identidad con ADN de TRAIL. Estas EST (números de registro del NCBI T90422, T82085, T10524, R31020 y Z36726) son todas fragmentos de ADNc humano. Los registros del NCBI no describen ningún polipéptido codificado por las EST, y no indica cuál podría ser el marco de lectura, si lo hubiera. Sin embargo, incluso si se usa el conocimiento del marco de lectura revelado en el presente documento mediante la descripción de las regiones codificantes de TRAIL completas para expresar las EST, ninguno de los polipéptidos codificados tendría la propiedad de inducir apoptosis de los polipéptidos TRAIL presentes reivindicados. En otras palabras, si se insertaran cada una de las cinco EST en los vectores de expresión en el sentido de 3' de un codón iniciador de metionina, en el marco de lectura elucidado en el presente documento, ninguno de los polipéptidos expresados resultantes contendría una parte suficiente del dominio extracelular de TRAIL para inducir la apoptosis de células Jurkat.

Ciertas realizaciones de la presente invención proporcionan ADN aislado que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en los nucleótidos 88 a 933 de la SEQ ID NO: 1 (región codificante de TRAIL humano); los nucleótidos 202 a 933 de la SEQ ID NO: 1 (que codifican para el dominio extracelular de TRAIL humano); los nucleótidos 47 a 922 de la SEQ ID NO: 5 (región codificante de TRAIL de ratón); y los nucleótidos 261 a 922 de la SEQ ID NO: 5 (que codifica para el dominio extracelular de TRAIL de ratón). También se proporcionan ADN que codifican para los fragmentos biológicamente activos de las proteínas de las SEQ ID NOS: 2 y 6. Realizaciones adicionales incluyen secuencias que comprenden los nucleótidos 370 a 930 de la SEQ ID NO:1 y los nucleótidos 341 a 919 de la SEQ ID NO: 5, que codifican para los polipéptidos de TRAIL solubles humanos y murinos particulares, respectivamente, descritos en el ejemplo 7.

Debido a la degeneración del código genético, dos secuencias de ADN pueden diferir, pero codificar para la misma secuencia de aminoácidos. De este modo, la presente invención proporciona secuencias de ADN aisladas que codifican para TRAIL biológicamente activo, seleccionadas del ADN que comprende la región codificante de un ADNc de TRAIL humano o murino, o fragmentos de las mismas, y ADN que es degenerado como resultado del código genético para la secuencia de ADN de TRAIL nativo.

También se proporcionan en el presente documento polipéptidos de TRAIL purificados, tanto recombinantes como no recombinantes. También están dentro del alcance de la presente invención las variantes y derivados de las proteínas TRAIL nativas que conservan una actividad biológica deseada. En una realización, la actividad biológica de una variante de TRAIL es esencialmente equivalente a la actividad biológica de una proteína TRAIL nativa. Una actividad biológica deseada de TRAIL es la capacidad para inducir la muerte en células Jurkat. Se conocen bien los procedimientos de ensayo para detectar la apoptosis de células diana. Entre las características de la muerte celular a través de apoptosis se encuentra el desarrollo escalonado de ADN ("DNA laddering"), y se reconoce como uno de los fenómenos observables que distinguen la muerte celular apoptótica de la muerte celular necrótica. Ejemplos de técnicas de ensayo adecuadas para la detección de la muerte o apoptosis de células diana incluyen aquellas descritas en los ejemplos 5 y 8 a 11. Otra propiedad de TRAIL es la capacidad para unirse a células Jurkat.

Pueden obtenerse variantes de TRAIL mediante mutaciones de secuencias de nucleótidos de TRAIL nativo, por ejemplo. Una variante de TRAIL, tal como se denomina en el presente documento, es un polipéptido sustancialmente homólogo a un TRAIL nativo, pero que tiene una secuencia de aminoácidos diferente a las de TRAIL nativo por una o una pluralidad de deleciones, inserciones o sustituciones. Las secuencias de ADN que codifican para TRAIL de la presente invención engloban secuencias que comprenden una o más adiciones, deleciones o sustituciones de nucleótidos en comparación con una secuencia de ADN de TRAIL nativo, pero que codifica para una proteína TRAIL que es de manera esencial biológicamente equivalente a la proteína TRAIL nativa.

La variante de la secuencia de aminoácidos o de ADN es idéntica al menos en un 80% a la secuencia de TRAIL nativa, lo más preferiblemente idéntica al menos en un 90%. Puede determinarse el grado de homología (identidad en tanto por ciento) entre una secuencia nativa y una mutante, por ejemplo, mediante la comparación de las dos secuencias usando programas informáticos empleados comúnmente para este fin. Un programa adecuado es el programa informático GAP, versión 6.0, descrito por Devereux et al. (Nucl. Acids. Res. 12:387, 1984) y disponible del Grupo Informático de Genética de la Universidad de Wisconsin (UWGCG). El programa GAP utiliza el método de alineamiento de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970), tal como se revisó por Smith y Waterman (Adv. Appl. Math 2:482, 1981). Brevemente, el programa GAP define la identidad como el número de símbolos alineados (es decir, nucleótidos o aminoácidos) que son idénticos, dividido entre el número total de símbolos en la secuencia más corta de las dos. Los parámetros por defecto preferidos del programa GAP incluyen: (1) una matriz de comparación unaria (que contiene un valor de 1 para las identidades y 0 para las no identidades) para nucleótidos, y la matriz de comparación ponderada de Gribskov y Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986, tal como se describe en Schwartz y Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, págs. 353-358, 1979; (2) una penalización de 3,0 para cada hueco y una penalización adicional de 0,10 para cada símbolo en cada hueco; y (3) ninguna penalización para huecos finales.

Pueden llevarse a cabo alteraciones de la secuencia de aminoácidos nativa mediante cualquiera de varias técnicas conocidas. Pueden introducirse mutaciones en loci particulares mediante la síntesis de oligonucleótidos que contienen una secuencia mutante, flanqueada por sitios de restricción que permiten el ligamiento de fragmentos de la secuencia nativa. Tras el ligamiento, la secuencia reconstruida resultante codifica para un análogo que tiene la inserción, sustitución o deleción de aminoácidos deseada.

Alternativamente, pueden emplearse procedimientos de mutagénesis específica de sitio dirigida a oligonucleótidos para proporcionar un gen alterado que tiene codones particulares alterados según la sustitución, deleción o inserción requerida. Las técnicas para hacer tales alteraciones incluyen aquellas descritas por Walter et al. (Gene 42:133, 1986); Bauer et al. (Gene 37:73, 1985); Craik (BioTechniques, enero de 1985, 12-19); Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981); y las patentes de los EE.UU. números 4.518.584 y 4.737.462, que se incorporan como referencia al presente documento.

Las variantes pueden comprender secuencias sustituidas de manera conservativa, lo que significa que se sustituyen uno o más residuos de aminoácidos de un polipéptido de TRAIL nativo por residuos diferentes, pero que el polipéptido de TRAIL nativo sustituido de manera conservativa conserva una actividad biológica deseada que es esencialmente equivalente a la de un polipéptido de TRAIL nativo. Los ejemplos de sustituciones conservativas incluyen la sustitución de aminoácidos que no alteran la estructura secundaria y/o terciaria de TRAIL. Otros ejemplos suponen la sustitución de aminoácidos fuera del dominio de unión a receptores, cuando la actividad biológica deseada es la capacidad para unirse a un receptor en las células diana e inducir la apoptosis de las células diana. Puede sustituirse un aminoácido dado por un residuo que tenga características fisicoquímicas similares, por ejemplo, sustituyendo un residuo alifático por otro (tal como Ile, Val, Leu o Ala por otro), o la sustitución de un residuo polar por otro (tal como entre Lys y Arg; Glu y Asp; o Gln y Asn). Se conocen bien otras sustituciones conservativas tales, por ejemplo, sustituciones de regiones enteras que tienen características de hidrofobicidad similares. Pueden probarse polipéptidos de TRAIL que comprenden sustituciones de aminoácidos conservativas en uno de los ensayos descritos en el presente documento para confirmar que se conserva una actividad biológica deseada de un TRAIL nativo. Se engloban en la presente invención las secuencias de ADN que codifican para polipéptidos de TRAIL que contienen tales sustituciones de aminoácidos conservativas.

Se ha identificado aminoácidos conservados localizados en la parte C-terminal de proteínas en la familia de TNF, y que se cree que son importantes para la actividad biológica. Se tratan estas secuencias conservadas en Smith et al. (Cell, 73:1349, 1993, véase la página 1353 y la figura 6); Suda et al. (Cell, 75:1169, 1993, véase la figura 7); Smith et al., (Cell, 76:959, 1994, véase la figura 3); y Goodwin et al. (Eur. J. Immunol., 23:2631, 1003, véase la figura 7 y las páginas 2638-39). Ventajosamente, no se alteran los aminoácidos conservados cuando se generan secuencias sustituidas de manera conservativa. Si se alteran, se sustituyen los aminoácidos que se encuentran en posiciones equivalentes en otros miembros de la familia de TNF.

También puede modificarse TRAIL para crear derivados de TRAIL mediante la formación de conjugados covalentes o agregativos con otros restos químicos, tales como los grupos glucosilo, lípidos, fosfato, grupos acetilo y similares. Pueden prepararse derivados covalentes de TRAIL mediante el enlace de restos químicos a grupos funcionales en las cadenas laterales de aminoácidos de TRAIL o en el extremo N-terminal o extremo C-terminal de un polipéptido de TRAIL o del dominio extracelular del mismo. Otros derivados de TRAIL dentro del alcance de esta invención incluyen los conjugados covalentes o agregativos de TRAIL o sus fragmentos con otras proteínas o polipéptidos, tales como mediante la síntesis en cultivo recombinante como fusiones en el extremo N-terminal o C-terminal. Por ejemplo, el conjugado puede comprender una secuencia de polipéptidos señal o líder (por ejemplo el líder de factor \alpha de Saccharomyces) en el extremo N-terminal de un polipéptido de TRAIL. El péptido señal o conductor dirige de manera conjunta a la traducción o posterior a la traducción la transferencia del conjugado desde su sitio de síntesis hasta un sitio dentro o fuera de la membrana celular o pared celular.

Las fusiones de polipéptidos de TRAIL pueden comprender péptidos añadidos para facilitar la purificación e identificación de TRAIL. Tales péptidos incluyen, por ejemplo, poli-His o los péptidos de identificación antigénica descritos en la patente de los EE.UU. número 5.011.912 y en Hopp et al., Bio/Technology 6:1204, 1988. Un péptido tal es el péptido FLAG®, Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK) (SEQ ID NO: 7), que es altamente antigénico y proporciona un epítopo unido reversiblemente por un anticuerpo monoclonal específico, permitiendo de este modo un ensayo rápido y una purificación fácil de la proteína recombinante expresada. Esta secuencia también se escinde específicamente mediante la enteroquinasa mucosa bovina en el residuo inmediatamente tras el apareamiento Asp-Lys. Las proteínas de fusión terminadas en este péptido también pueden ser resistentes a la degradación intracelular en E. coli.

Un hibridoma murino designado como 4E11 produce un anticuerpo monoclonal que une el péptido DYKDDDDK (SEQ ID NO: 7) en presencia de ciertos cationes metálicos divalentes (tal como se describe en la patente de los EE.UU. 5.011.912), y se ha depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo bajo el número de registro HB 9259. Los sistemas de expresión útiles para producir proteínas recombinantes fusionadas al péptido FLAG®, así como los anticuerpos monoclonales que unen el péptido y que son útiles en la purificación de proteínas recombinantes, están disponible de Eastman Kodak Company, Scientific Imaging Systems, New Haven, Connecticut.

La presente invención incluye adicionalmente polipéptidos de TRAIL con o sin glucosilación del patrón nativo asociada. El TRAIL expresado en sistemas de expresión de levaduras o mamíferos puede ser similar o significativamente diferente de un polipéptido TRAIL nativo en el peso molecular y el patrón de glucosilación, dependiendo de la elección del sistema de expresión. La expresión de polipéptidos de TRAIL en sistemas de expresión bacteriana, tales como E. coli, proporcionan moléculas no glucosiladas.

Los sitios de glucosilación en el dominio extracelular de TRAIL pueden modificarse para impedir la glucosilación mientras que se permite la expresión de un hidrato de carbono reducido, homogéneo, usando sistemas de expresión de levaduras o mamíferos. Los sitios de N-glucosilación en polipéptidos eucariotas se caracterizan por un triplete de aminoácidos Asn-X-Y, en el que X es cualquier aminoácido a excepción de Pro e Y es Ser o Thr. Modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifica para este triplete tendrán como resultado sustituciones, adiciones o deleciones que evitan el acoplamiento de los residuos de hidrato de carbono a la cadena lateral de Asn. Los procedimientos conocidos para inactivar los sitios de N-glucosilación en proteínas incluyen aquellos descritos en la patente de los EE.UU. 5.071.972 y en el documento EP 276.846. Se encuentra un sitio de N-glucosilación potencial en las posiciones 109-111 en la proteína humana de la SEQ ID NO: 2 y en las posiciones 52-54 en la proteína murina de la SEQ ID NO: 6.

En otro ejemplo, pueden alterarse las secuencias que codifican para residuos de Cys que no son esenciales para la actividad biológica para provocar que los residuos de Cys se eliminen o sustituyan por otros aminoácidos, evitando la formación de puentes disulfuro intramoleculares incorrectos con la renaturalización. Se preparan otros variantes mediante la modificación de residuos de aminoácidos dibásicos adyacentes para aumentar la expresión en sistemas de levaduras en los que está presente la actividad de la proteasa KEX2. El documento 212.914 describe el uso de la mutagénesis específica de sitio para inactivar los sitios de procesamiento de la proteasa KEX2 en una proteína. Se inactivan los sitios de procesamiento de la proteasa KEX2 mediante la deleción, adición o sustitución de residuos para alterar los apareamientos Arg-Arg, Arg-Lys y Lys-Arg para eliminar la aparición de estos residuos básicos adyacentes. Los apareamientos son considerablemente menos susceptibles a la escisión por KEX2, y la conversión de Arg-Lys o Lys-Arg en Lys-Lys representa un enfoque conservativo y preferido para inactivar los sitios KEX2. Se encuentran sitios de procesamiento de la proteasa KEX2 potenciales en las posiciones 89-90 y 149-150 en la proteína de la SEQ ID NO: 2, y en las posiciones 85-86, 135-136 y 162-163 en la proteína de la SEQ ID NO:6.

También se engloban las variantes de TRAIL que se producen de manera natural en la presente invención. Son ejemplos de tales variantes las proteínas que resultan de acontecimientos alternativos de corte y empalme de ARNm (ya que el TRAIL está codificado por un gen multi-exon) o de la escisión proteolítica de la proteína TRAIL, en la que se conserva una actividad biológica deseada. El corte y empalme alternativo de ARNm puede dar una proteína TRAIL truncada pero biológicamente activa, tal como una forma soluble de la proteína que se produce de manera natural, por ejemplo. Las variaciones atribuibles a la proteolisis incluyen, por ejemplo, diferencias en los extremos N o C-terminal con la expresión en diferentes tipos de células huésped, debido a la eliminación proteolítica de uno más aminoácidos terminales de la proteína TRAIL. Además, la escisión proteolítica puede liberar una forma soluble de TRAIL de una forma unida a la membrana de la proteína. También se engloban las variantes alélicas mediante la presente invención.

Oligómeros

La presente invención engloba los polipéptidos de TRAIL en forma de oligómeros, tales como dímeros, trímeros u oligómeros superiores. Los oligómeros pueden formarse mediante enlaces disulfuro entre residuos de cisteína en diferentes polipéptidos de TRAIL, o mediante interacciones no covalentes entre las cadenas polipeptídicas de TRAIL, por ejemplo. En otras realizaciones, los oligómeros comprenden desde dos hasta cuatro polipéptidos de TRAIL unidos a través de interacciones covalentes o no covalentes entre restos peptídicos fusionados a los polipéptidos de TRAIL. Tales péptidos pueden ser ligadores peptídicos (espaciadores) o péptidos que tienen la propiedad de promover la oligomerización. Las cremalleras de leucina y ciertos polipéptidos derivados de anticuerpos se encuentran entre los péptidos que pueden promover la oligomerización de polipéptidos de TRAIL unidos a ellos, tal como se describe con más detalle a continuación. Preferiblemente los polipéptidos de TRAIL son solubles.

Se ha descrito la preparación de proteínas de fusión que comprenden polipéptidos heterólogos fusionados a varias partes de los polipéptidos derivados de anticuerpos (incluyendo el dominio Fc), por ejemplo, por Ashkenazi et al. (PNAS USA 88:10535, 1991); Byrn et al. (Nature 344:667, 1990); y Hollenbaugh y Aruffo ("Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", en Current Protocols in Immunology, Suplemento 4, páginas 10.19.1-10.19.11, 1992), incorporados como referencia al presente documento. En una realización de la invención, se crea un dímero de TRAIL mediante la fusión de TRAIL a un polipéptido de la región Fc derivado de un anticuerpo. El término "polipéptido de Fc" incluye formas nativas y muteínas, así como los polipéptidos de Fc truncados que contienen la región bisagra que promueve la dimerización. Preferiblemente se fusiona el polipéptido Fc a un TRAIL soluble (por ejemplo, que comprende sólo el dominio extracelular).

Se inserta una fusión génica que codifica para la proteína de fusión TRAIL/Fc en un vector de expresión apropiado. Se permite que las proteínas de fusión TRAIL/Fc se ensamblen de manera muy parecida a las moléculas de anticuerpos, con lo que se forman enlaces disulfuro intercatenarios entre los polipéptidos de Fc, produciendo TRAIL divalente. En otras realizaciones, puede sustituirse el TRAIL por la parte variable de una cadena de anticuerpos pesada o ligera. Si las proteínas de fusión están compuestas tanto por cadenas pesadas como ligeras de un anticuerpo, es posible que formen un oligómero de TRAIL con hasta cuatro regiones extracelulares de TRAIL.

Un polipéptido Fc adecuado es el polipéptido de la región Fc nativo derivado de una IgG1 humana, que se describe en la solicitud PCT WO 93/10151, incorporada como referencia al presente documento. Otro polipéptido de Fc útil es la muteína de Fc descrita en la patente de los EE.UU. 5.457.035. La secuencia de aminoácidos de la muteína es idéntica a la de la secuencia Fc nativa presentada en el documento WO 93/10151, excepto porque se ha cambiado el aminoácido 19 de Leu a Ala, se ha cambiado el aminoácido 20 de Leu a Glu, y se ha cambiado el aminoácido 22 de Gly a Ala. Esta muteína de Fc muestra una afinidad reducida por receptores de inmunoglobulinas.

Alternativamente, el TRAIL oligomérico puede comprender dos o más polipéptidos de TRAIL solubles unidos a través de ligadores peptídicos. Los ejemplos incluyen aquellos ligadores peptídicos descritos en la patente de los Estados Unidos 5.073.627 (incorporada como referencia al presente documento). Pueden producirse las proteínas de fusión que comprenden polipéptidos de TRAIL múltiples separados mediante ligadores peptídicos usando la tecnología de ADN recombinante convencional.

Otro método para preparar polipéptidos de TRAIL oligoméricos supone el uso de una cremallera de leucina. Los dominios de cremallera de leucina son péptidos que promueven la oligomerización de las proteínas en las que se encuentran. Originalmente se identificaron las cremalleras de leucina en varias proteínas de unión al ADN (Landschulz et al., Science 240:1759, 1988), y se han encontrado desde entonces en una variedad de proteínas diferentes. Entre las cremalleras de leucina conocidas se encuentran los péptidos que se producen de manera natural y los derivados de los mismos que dimerizan o trimerizan. Son ejemplos de dominios de cremallera de leucina adecuados para producir proteínas TRAIL oligoméricas solubles aquellas descritas en la solicitud PCT WO 94/10308, incorporada como referencia al presente documento. Las proteínas de fusión recombinantes que comprenden un polipéptido de TRAIL fusionado a un péptido que dimeriza o trimeriza en solución se expresan en células huésped adecuadas, y el TRAIL oligomérico soluble resultante se recupera del sobrenadante del cultivo.

Se cree que ciertos miembros de la familia de proteínas de TNF existen en forma trimérica (Beutler y Huffel, Science 264:667, 1994; Banner et al., Cell 73:431, 1993). De este modo, el TRAIL trimérico puede ofrecer la ventaja de una actividad biológica aumentada. Son restos de cremallera de leucina preferidos aquellos que preferencialmente forman trímeros. Un ejemplo es una cremallera de leucina derivada de la proteína surfactante pulmonar D (SPD), tal como se describe en Hoppe et al. (FEBS Letters 344:191, 1994) y en la solicitud de patente de los EE.UU. con número de serie 08/446.922, incorporada como referencia al presente documento. Pueden emplearse otros péptidos derivados de proteínas triméricas que se producen de manera natural en la preparación de TRAIL trimérico.

Tal como se describe en el ejemplo 7, un polipéptido de TRAIL-Flag® soluble expresado en células CV-1/EBNA formó espontáneamente oligómeros que se cree que son una mezcla de dímeros y trímeros. Se aumentó el efecto citotóxico de este TRAIL-Flag® soluble en el ensayo del ejemplo 8 mediante la inclusión de un anticuerpo anti-Flag®, posiblemente porque el anticuerpo facilitó la reticulación de los complejos de TRAIL/receptor. En una realización de la invención, se aumenta la actividad biológica del TRAIL mediante el empleo de TRAIL junto con un anticuerpo que puede reticular TRAIL. Pueden ponerse en contacto las células que van a destruirse tanto con un polipéptido de TRAIL soluble como con un anticuerpo tal.

Como ejemplo, se ponen en contacto células cancerosas o infectadas de forma viral con un anticuerpo anti-Flag® y un polipéptido de TRAIL-Flag® soluble. Preferiblemente, se emplea un fragmento de anticuerpo que carece de la región Fc. Las formas bivalentes del anticuerpo pueden unir los restos de Flag® de dos polipéptidos de TRAIL-Flag® solubles que se encuentran en dímeros o trímeros separados. Puede mezclarse o incubarse el anticuerpo con un polipéptido de TRAIL-Flag® antes de la administración in vivo.

Sistemas de expresión

La presente invención proporciona vectores de expresión recombinante para la expresión de TRAIL, y células huésped transformadas con los vectores de expresión. Puede emplearse cualquier sistema de expresión adecuado. Los vectores incluyen un ADN que codifica para un polipéptido de TRAIL, operativamente unido a secuencias de nucleótidos reguladores de la transcripción o la traducción adecuados, tales como aquellos derivados de un gen de mamífero, microbiano, viral o de insecto. Los ejemplos de secuencias reguladoras incluyen promotores de la transcripción, operadores o potenciadores, un sitio de unión ribosómica a ARNm y secuencias apropiadas que controlan el inicio y la terminación de la transcripción y la traducción. Las secuencias de nucleótidos están operativamente unidas cuando la secuencia reguladora se relaciona funcionalmente con la secuencia de ADN de TRAIL. De este modo, una secuencia de nucleótidos del promotor está operativamente unida a una secuencia de ADN de TRAIL si la secuencia de nucleótidos promotora controla la transcripción de la secuencia de ADN de TRAIL. Generalmente se incorporan al vector de expresión un origen de replicación que le confiere la capacidad para replicarse en las células huésped deseadas, y un gen de selección mediante el cual se identifican los transformantes.

Además, puede incorporarse a los vectores de expresión un secuencia que codifica para un péptido señal apropiado. Puede fusionarse una secuencia de ADN para un péptido señal (líder secretor) dentro del marco para la secuencia de TRAIL de manera que el TRAIL se traduce inicialmente como una proteína de fusión que comprende el péptido señal. Un péptido señal que es funcional en las células huésped pretendidas promueve la secreción extracelular del poli-
péptido de TRAIL. El péptido señal se escinde del polipéptido de TRAIL con la secreción del TRAIL desde la célula.

Las células huésped adecuadas para la expresión de polipéptidos de TRAIL incluyen procariotas, levaduras o células eucariotas superiores. Se describen vectores de clonación y expresión apropiados para su uso con huéspedes celulares bacterianos, fúngicos, de levaduras y de mamíferos, por ejemplo, en Pouwels et al. Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, Nueva York, (1985). También podrían emplearse sistemas de traducción sin células para producir polipéptidos de TRAIL usando ARN derivados de constructos descritos en el presente documento.

Las procariotas incluyen microorganismos gram-negativos o gram-positivos, por ejemplo, E. coli o Bacilli. Las células huésped procariotas adecuadas para la transformación incluyen, por ejemplo, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, y otras especies varias dentro de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus. En una célula huésped procariota, tal como E. coli, un polipéptido de TRAIL puede incluir un residuo de metionina N-terminal para facilitar la expresión del polipéptido recombinante en la célula huésped procariota. Puede escindirse la Met N-terminal del polipéptido de TRAIL recombinante expresado.

Generalmente los vectores de expresión para su uso en células huésped procariotas comprenden uno o más genes marcadores de selección fenotípicos. Un gen marcador de selección fenotípico es, por ejemplo, un gen que codifica para una proteína que confiere resistencia a los antibióticos o que proporciona una necesidad autotrófica. Los ejemplos de vectores de expresión útiles para células huésped procariotas incluyen aquellos derivados de los plásmidos disponibles comercialmente tales como el vector de clonación pBR322 (ATCC 37017). pBR322 contiene genes para la resistencia a la ampicilina y tetraciclina y proporciona de este modo medios simples para identificar las células transformadas. Se inserta un promotor apropiado y una secuencia de ADN de TRAIL en el vector pBR322. Otros vectores disponibles comercialmente incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, EE.UU.).

Las secuencias promotoras usadas comúnmente para vectores de expresión de células huésped procariotas recombinantes incluyen \beta-lactamasa (penicilinasa), sistema de promotor de lactosa (Chang et al., Nature 275:615, 1978; y Goeddel et al., Nature 281:544, 1979), sistema de promotor de triptófano (trp) (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8:4057, 1980; y documento EP-A-36776) y promotor tac (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, pág. 412, 1982). Un sistema de expresión de células huésped procariotas particularmente útil emplea un promotor del fago \lambda P_{L} y una secuencia represora termolábil cI857ts. Los vectores plásmidos disponibles de la Colección Americana de Cultivos Tipo que incorpora derivados del promotor \lambda P_{L} incluyen el plásmido pHUB2 (residente en las cepas de E. coli JMB9, ATCC 37092) y pPLc28 (residente en E. coli RR1, ATCC 53082).

Alternativamente, puede expresarse TRAIL en células huésped de levaduras, preferiblemente del género Saccharomyces (por ejemplo, S. cerevisiae). También pueden emplearse otros géneros de levadura, tales como Pichia o Kluyveromyces. Los vectores de levaduras contendrán a menudo una secuencia de origen de replicación de un plásmido de levadura 2 \mu, una secuencia de replicación autónoma (ARS), una región promotora, secuencias para poliadenilación, secuencias para la terminación de la transcripción y un gen marcador de selección. Las secuencias promotoras adecuadas para los vectores de levaduras incluyen, entre otros, promotores para metalotioneína, 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzemann et al., J. Bio. Chem. 255:2073, 1980) u otras enzimas glucolíticas (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; y Holland et al., Biochem. 17:4900, 1978), tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucocinasa. Se describen adicionalmente otros vectores y promotores adecuados para su uso en la expresión de levaduras en Hitzeman, documento EPA-73.657. Otra alternativa es el promotor ADH2 represible por glucosa descrito por Russell et al. (J. Biol. Chem. 258:2674, 1982) y Beier et al. (Nature 300:724, 1982). Pueden construirse vectores lanzadera replicables tanto en levaduras como en E. coli mediante la inserción de secuencias de ADN de pBR322 para la selección y replicación en E. coli (gen Amp^{r} y origen de replicación) en los vectores de levaduras descritos anteriormente.

Puede emplearse la secuencia líder de factor \alpha de levaduras para la secreción directa del polipéptido de TRAIL. A menudo se inserta la secuencia líder de factor \alpha entre la secuencia promotora y la secuencia del gen estructural. Véase, por ejemplo, Kurjan et al., Cell 30:933, 1982 y Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5330, 1984. Otras secuencias líder adecuadas para facilitar la secreción de polipéptidos recombinantes de huéspedes de levaduras se conocen por aquellos expertos en la técnica. Puede modificarse una secuencia líder cerca de su extremo 3' para contener uno o más sitios de restricción. Esto facilitará la fusión de la secuencia líder al gen estructural.

Los protocolos de transformación de levaduras se conocen por aquellos expertos en la técnica. Uno de tales protocolos se describe por Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929, 1978. El protocolo de Hinnen et al. selecciona transformantes Trp^{+} en un medio selectivo, en el que el medio selectivo consiste en el 0,67% de una base nitrogenada de levaduras, el 0,5% de ácidos casamino, el 2% de glucosa, 10 \mug/ml de adenina y 20 \mug/ml de uracilo.

Pueden hacerse crecer células huésped de levaduras transformadas mediante vectores que contienen una secuencia promotora ADH2 para inducir la expresión en un medio "rico". Un ejemplo de medio rico es uno que consiste en el 1% de extracto de levaduras, el 2% de peptona y el 1% de glucosa complementado con 80 \mug/ml de adenina y 80 \mug/ml de uracilo. La desrepresión del promotor ADH2 tiene lugar cuando se agota la glucosa del medio.

También podrían emplearse sistemas de cultivo de células huésped de mamíferos o insectos para expresar los polipéptidos de TRAIL recombinantes. Los sistemas de baculovirus para la producción de proteínas heterólogas en células de insecto se revisan por Luckow y Summers, Bio/Technology 6:47 (1988). También pueden emplearse líneas celulares establecidas de origen mamífero. Los ejemplos de líneas celulares de células huésped de mamíferos adecuadas incluyen la línea COS-7 de células de riñón de mono (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., Cell 23:175, 1981), células L, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa y líneas celulares BHK (ATCC CRL 10), y la línea celular CVI/EBNA derivada de la línea celular de riñón del mono verde africano CVI (ATCC CCL 70) tal como se describe por McMahan et al. (EMBO J. 10:2821, 1991).

Pueden cortarse las secuencias de control de la transcripción y la traducción para vectores de expresión de células huésped de mamíferos de los genomas virales. Las secuencias promotoras usado comúnmente y secuencias potenciadoras se derivan de los virus del polioma, adenovirus 2, virus de simio 40 (SV40) y citomegalovirus humano. Pueden usarse las secuencias de ADN derivadas del genoma viral SV40, por ejemplo, origen SV40, promotor temprano y tardío, potenciador y sitios de corte y empalme y de poliadenilación, para proporcionar otros elementos genéticos para la expresión de una secuencia de gen estructural en una célula huésped de mamífero. Son particularmente útiles los promotores virales tempranos y tardíos porque ambos se obtienen fácilmente a partir de un genoma viral como un fragmento que también puede contener un origen viral de replicación (Fiers et al., Nature 273:113, 1978). También pueden usarse fragmentos de SV40 más pequeños o más grandes, siempre que se incluya la secuencia de aproximadamente 250 pb, que se extiende desde el sitio Hind III hacia el sitio Bgl I localizado en el origen viral SV40 del sitio de replicación.

Pueden construirse los vectores de expresión para su uso en células huésped de mamíferos tal como se describe en Okayama y Berg (Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983), por ejemplo. Sustancialmente puede construirse un sistema útil para la expresión estable de alto nivel de ADNc de mamíferos en células epiteliales mamarias murinas C127, tal como se describe en Cosman et al. (Mol. Immunol. 23:935, 1986). Se ha depositado como ATCC 39890 un vector de alta expresión, PMLSV N1/N4, descrito en Cosman et al., Nature 312:768, 1984. Se describen vectores de expresión de mamíferos adicionales en el documento EP-A-0367566, y en el documento WO 91/18982. Como alternativa, el vector puede derivarse de un retrovirus. Se describen sistemas de expresión adecuados adicionales más adelante en los ejemplos.

Un sistema de expresión preferido emplea células de ovario de hámster chino (CHO) y un vector de expresión designado como PG5.7. Se describe este vector de expresión en la solicitud de patente de los EE.UU. con número de serie 08/586.509, presentada el 11 de enero de 1996, que se incorpora como referencia al presente documento. Los componentes de PG5.7 incluyen un fragmento del ADN genómico de células CHO, seguido de un promotor derivado de CMV, que está seguido de una secuencia que codifica para un líder triparental de adenovirus, que a su vez está seguido de una secuencia que codifica para la dihidrofolato reductasa (DHFR). Se insertaron estos componentes en el vector plásmido pGEM1 (Promega, Madison, WI). Puede insertarse el ADN que codifica para un polipéptido de TRAIL (o proteína de fusión que contiene TRAIL) entre las secuencias que codifican para el líder triparental y DHFR. Puede añadirse metrotexato al medio de cultivo para aumentar los niveles de expresión, tal como se reconoce en el campo.

El fragmento de ADN genómico de células CHO en el vector PG5.7 aumenta la expresión de TRAIL. Se depositó un lisado de fago que contiene un fragmento de ADN genómico aislado procedente de células CHO en la Colección Americana de Cultivos Tipo el 4 de enero de 1996, y se le asignó el número de registro ATCC 97411. El vector PG5.7 contiene los nucleótidos 8671 a 14507 del inserto de ADN genómico de CHO en el depósito de la cepa ATCC 97411.

Para la expresión de TRAIL, puede añadirse una proteína de tipo II que carece de una secuencia señal nativa, una secuencia señal heteróloga o líder funcional en células huésped de mamífero. Los ejemplos incluyen la secuencia señal para interleucina-7 (IL-7) descrita en la patente de los EE.UU. 4.965.195, la secuencia señal para el receptor de interleucina-2 descrita en Cosman et al., Nature 312:768 (1984); el péptido señal del receptor de interleucina-4 descrito en el documento EP 367.566; el péptido señal del receptor de interleucina-1 de tipo I descrito en la patente de los EE.UU 4.968.607; y el péptido señal del receptor de interleucina-1 de tipo II descrito en el documento EP 460.846.

Un sistema de expresión preferido emplea una secuencia líder derivada de citomegalovirus (CMV). El ejemplo 7 ilustra el uso de uno de tales líderes. En el ejemplo 7, se transformaron las células huésped de mamífero con un vector de expresión que codifica para el péptido Met Ala Arg Arg Leu Trp Ile Leu Ser Leu Leu Ala Val Thr Leu Thr Val Ala Leu Ala Ala Pro Ser Gln Lys Ser Lys Arg Arg Thr Ser Ser (SEQ ID NO: 9) fusionado al extremo N-terminal de un octapéptido designado como FLAG® (SEQ ID NO: 7, descrita anteriormente), que a su vez está fusionado al extremo N-terminal de un polipéptido de TRAIL soluble. Los residuos 1 a 29 de la SEQ ID NO: 9 constituyen una secuencia líder derivada de CMV, mientras que los residuos 30 a 32 están codificados por los oligonucleótidos empleados en la construcción del vector de expresión descrito en el ejemplo 7. En una realización, se coloca el ADN que codifica para un péptido de poli-His (por ejemplo, un péptido que contiene seis residuos de histidina) entre las secuencias que codifican para el líder de CMV y el péptido FLAG®.

Los sistemas de expresión que emplean tales péptidos líder derivados de CMV son útiles para la expresión de proteínas distintas de TRAIL. Se proporcionan en el presente documento vectores de expresión que comprenden una secuencia de ADN que codifica para los aminoácidos 1 a 29 de la SEQ ID NO: 9. En otra realización, el vector comprende una secuencia que codifica para los aminoácidos 1 a 28 de la SEQ ID NO: 9. El ADN que codifica para una proteína heteróloga deseada se coloca en el sentido de 3' de, y en el mismo marco de lectura que, el ADN que codifica para el líder. Puede estar codificados residuos adicionales (por ejemplo, aquellos codificados por los ligadores o cebadores) por el ADN colocado entre las secuencias que codifican para el líder y la proteína heteróloga deseada, tal como se ilustra mediante el vector descrito en el ejemplo 7. Tal como se entiende en el campo pertinente, los vectores de expresión comprenden promotores y cualquier otra secuencia de regulación deseada, operativamente unidos a las secuencias que codifican para el líder y la proteína heteróloga.

Puede escindirse el péptido líder presentado en la SEQ ID NO: 9 tras el residuo de arginina en la posición 29 para producir la forma madura secretada de una proteína fusionada a él. Alternativamente o adicionalmente, la escisión puede tener lugar entre los aminoácidos 20 y 21, o entre los aminoácidos 28 y 29, de la SEQ ID NO; 9.

El experto en la técnica reconocerá que la(s) posición(ones) en la(s) que se escinde el péptido señal puede(n) variar según factores tales como el tipo de células huésped empleadas, si el TRAIL humano o murino se expresa mediante el vector, y similares. El análisis mediante un programa informático revela que el sitio de escisión primario puede encontrarse entre los residuos 20 y 21 de la SEQ ID NO: 9. También se predice que la escisión entre los residuos 22 y 23, y entre los residuos 27 y 28 es posible. Para ilustrar, la expresión y secreción de un polipéptido de TRAIL murino soluble dio como resultado la escisión de un péptido señal derivado de CMV en múltiples posiciones. Las tres especies más destacadas de proteína secretada (en orden descendente) resultaron de la escisión entre los aminoácidos 20 y 21 de la SEQ ID NO: 9, la escisión entre los aminoácidos 22 y 23, y la escisión entre los aminoácidos 27 y 28.

Un método para producir una proteína heteróloga recombinante supone cultivar células huésped de mamífero transformadas con un vector de expresión tal en condiciones que promueven la expresión y secreción de la proteína heteróloga, y recuperar la proteína del medio de cultivo. Pueden usarse los sistemas de expresión que emplean líderes de CMV para producir cualquier proteína deseada, los que ejemplos de los cuales incluyen, pero no se limitan a, factores estimulantes de colonia, interferones, interleucinas, otras citocinas y receptores de citocinas.

Proteína TRAIL purificada

La presente invención proporciona proteínas TRAIL purificadas que pueden producirse mediante sistemas de expresión recombinantes tal como se describieron anteriormente o purificadas de células que se producen de manera natural. El grado de pureza deseado puede depender del uso pretendido de la proteína. Se desea un grado de pureza relativamente alto cuando hay que administrar la proteína in vivo, por ejemplo. Ventajosamente, se purifican los polipéptidos de TRAIL de manera que no se detectan bandas de proteína correspondientes a otras proteínas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE). Se reconocerá por un experto en el campo pertinente que pueden detectarse múltiples bandas que corresponden a la proteína TRAIL mediante SDS-PAGE, debido a la glucosilación diferencial, las variaciones en el procesamiento posterior a la traducción, y similares, tal como se trató anteriormente. Se considera que hay que purificar una preparación de proteína TRAIL hasta que no se visualicen bandas correspondientes a proteínas diferentes (que no son TRAIL). Lo más preferiblemente, se purifica TRAIL hasta la homogeneidad sustancial, tal como se indica mediante una banda de proteína simple con análisis mediante SDS-PAGE. Puede visualizarse la banda de proteína mediante tinción con plata, tinción con azul de Coomassie, o (si la proteína está radiomarcada) mediante autorradiografía.

Un procedimiento para la producción de la proteína TRAIL comprende cultivar una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN que codifica para TRAIL en condiciones tales que se exprese TRAIL. La proteína TRAIL se recupera entonces del cultivo (del medio de cultivo o los extractos celulares). Tal como reconocerá un experto en la técnica, los procedimientos para purificar el TRAIL recombinante variarán según factores tales como el tipo de células huésped empleadas y de si se secreta o no TRAIL en el medio de cultivo.

Por ejemplo, cuando se emplean sistemas de expresión que secretan la proteína recombinante, el medio de cultivo puede en primer lugar concentrarse utilizando un filtro de concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración de Amicon o Millipore Pellicon. Tras la etapa de concentración, el concentrado puede aplicarse a una matriz de purificación tal como un medio de filtración en gel. Alternativamente, puede emplearse una resina de intercambio aniónico, por ejemplo, una matriz o un sustrato que tenga grupos dietilaminoetilo (DEAE) colgantes. Las matrices pueden ser de acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos empleados comúnmente en la purificación de proteínas. Alternativamente, puede emplearse una etapa de intercambio catiónico. Los intercambiadores catiónicos adecuados incluyen diversas matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Se prefieren los grupos sulfopropilo. Finalmente, pueden emplearse una o más etapas de cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa (RP-HPLC) que emplean medios hidrófobos para RP-HPLC (por ejemplo, gel de sílice que tiene grupos metilo u otros grupos alifáticos colgantes) para purificar adicionalmente TRAIL. Pueden emplearse algunas o todas las etapas de purificación anteriores, en diversas combinaciones, para proporcionar una proteína TRAIL purificada.

Puede aislarse la proteína recombinante producida en un cultivo bacteriano mediante la perturbación inicial de las células huésped, centrifugación, extracción a partir de los sedimentos celulares si se trata de un polipéptido insoluble o a partir del líquido sobrenadante si se trata de un polipéptido soluble, seguido por una o más etapas de concentración, precipitación salina ("salting-out"), intercambio iónico, cromatografía de purificación por afinidad o de exclusión por tamaños. Finalmente, puede emplearse RP-HPLC para las etapas de purificación finales. Las células microbianas pueden perturbarse mediante cualquier método conveniente, incluyendo ciclos de congelación-descongelación, sonicación, perturbación mecánica o uso de agentes de lisis celular.

Se emplean preferiblemente células huésped de levaduras transformadas para expresar TRAIL como un polipéptido secretado. Esto simplifica la purificación. El polipéptido recombinante secretado a partir de una fermentación de células huésped de levaduras puede purificarse mediante métodos análogos a los descritos por Urdal et al. (J. Chromatog. 296:171, 1984). Urdal et al. describen dos etapas secuenciales de HPLC en fase inversa para la purificación de IL-2 humana recombinante en una columna de HPLC preparativa.

Alternativamente, los polipéptidos de TRAIL pueden purificarse mediante cromatografía de inmunoafinidad. Puede prepararse una columna de afinidad que contiene un anticuerpo que se une a TRAIL mediante procedimientos convencionales y emplearse en la purificación de TRAIL. El ejemplo 4 describe un procedimiento para generar anticuerpos monoclonales dirigidos contra TRAIL.

Propiedades y usos de TRAIL

La muerte celular programada (apoptosis) se produce durante la embriogénesis, metamorfosis, atrofia tisular dependiente del sistema endocrino, recambio tisular normal, y muerte de timocitos inmunitarios. La regulación de la muerte celular programada es vital para el funcionamiento normal del sistema inmunitario. Para ilustrar, las células T que reconocen autoantígenos se destruyen mediante el proceso apoptótico durante la maduración de las células T en el timo, mientras que otras células T se seleccionan positivamente. Se ha propuesto la posibilidad de que algunas células T que reconocen ciertos autoepítopos (por ejemplo, determinantes antigénicos que se han procesado y presentado de manera ineficaz de una autoproteína dada) escapen a este proceso de eliminación y posteriormente desempeñen un papel en enfermedades autoinmunitarias (Gammon et al., Immunology Today 12:193, 1991).

La apoptosis insuficiente se ha implicado en ciertos estados, aunque los niveles elevados de muerte celular apoptótica se han asociado con otras enfermedades. Se reconoce la conveniencia de identificar y utilizar agentes que regulan la apoptosis en el tratamiento de tales trastornos (Kromer, Advances in Immunology, 58:211, 1995; Groux et al., J. Exp. Med. 175:331, 1992; Sachs y Lotem, Blood 82:15, 1993).

La resistencia anómala de las células T hacia experimentar apoptosis se ha relacionado con linfocitosis, linfadenopatía, esplenomegalia, acumulación de células T autorreactivas, enfermedad autoinmunitaria, desarrollo de leucemia y desarrollo de linfoma (Kromer, anteriormente; véanse especialmente las páginas 214-215). Por el contrario, se ha sugerido que la apoptosis excesiva de las células T desempeña un papel en linfocitopenia, inmunodeficiencia sistémica e inmunodeficiencia específica, siendo ejemplos específicos los estados inmunodeficientes inducidos por virus asociados con mononucleosis infecciosa e infección por citomegalovirus, e inmunosupresión mediada por tumor (Kromer, anteriormente; véase especialmente la página 214). La reducción de células T CD4^{+} en los individuos infectados por VIH puede atribuirse a la muerte celular inducida por activación inapropiada (AICD) mediante apoptosis (Groux et al., J. Exp. Med. 175:331, 1992).

Tal como se demuestra en los ejemplos 5 y 8, TRAIL induce apoptosis de la línea celular de leucemia aguda de células T designada como Jurkat clon E6-1. TRAIL es por tanto, un reactivo de investigación útil en estudios de apoptosis, incluyendo la regulación de la muerte celular programada. Puesto que las células Jurkat son una línea celular de leucemia que surge de las células T, el TRAIL de la presente invención encuentra uso en estudios del papel que TRAIL puede desempeñar en la apoptosis de otras células T transformadas, tales como otros tipos de células malignas que surgen de las células T.

TRAIL se une a células Jurkat, además de inducir la apoptosis de las mismas. TRAIL no provocó la muerte de timocitos murinos recién aislados ni de células T de sangre periférica (PBT) recién extraídas de un donante humano sano. Se derivan varios usos de estas propiedades.

Los polipéptidos de TRAIL pueden utilizarse para purificar células de leucemia, o cualquier otro tipo celular al que se una TRAIL. Las células de leucemia pueden aislarse de la sangre de un paciente, por ejemplo. En una realización, las células se purifican mediante cromatografía de afinidad, utilizando una matriz de cromatografía que tiene TRAIL unido a la misma. El TRAIL unido a la matriz de cromatografía puede ser una proteína de longitud completa, un fragmento de TRAIL que comprende el dominio extracelular, una proteína de fusión que contiene TRAIL, u otro polipéptido de TRAIL adecuado descrito en el presente documento. En una realización, una proteína de fusión soluble de TRAIL/Fc está unida a una columna de proteína A o proteína G a través de la interacción del resto Fc con la proteína A o proteína G. Alternativamente, puede utilizarse TRAIL en el aislamiento de células de leucemia mediante citometría de flujo.

Se espera que las células de leucemia así purificadas mueran tras la unión de TRAIL, pero las células muertas portarán aún los antígenos de superficie celular y pueden emplearse como inmunógenos en la derivación de anticuerpos anti-leucemia. Las células de leucemia, o un antígeno de la superficie celular deseado aislado de las mismas, encuentran un uso adicional en el desarrollo de vacunas.

Puesto que TRAIL se une y destruye las células de leucemia (la línea celular Jurkat), TRAIL también puede ser útil en el tratamiento de la leucemia. Un método terapéutico supone poner en contacto células de leucemia con una cantidad eficaz de TRAIL. En una realización, se pone en contacto la sangre de un paciente con leucemia ex vivo con un polipéptido de TRAIL. El TRAIL puede inmovilizarse sobre una matriz adecuada. TRAIL se une a las células de leucemia, extrayéndolas así de la sangre del paciente antes de devolver la sangre al paciente.

Alternativa o adicionalmente, puede ponerse en contacto la médula ósea extraída de un paciente con leucemia con una cantidad de TRAIL eficaz en la inducción de la muerte de las células de leucemia en la médula ósea. La médula ósea puede aspirarse desde el esternón o las crestas ilíacas, por ejemplo, y ponerse en contacto con TRAIL para purgar las células de leucemia. La médula así tratada se devuelve al paciente.

TRAIL también se une a, e induce la apoptosis de, células de melanoma y linfoma (véanse los ejemplos 5, 9 y 10). Por tanto, los usos de TRAIL que son análogos a los descritos anteriormente para las células de leucemia son aplicables a células de linfoma y melanoma. Los polipéptidos de TRAIL pueden emplearse en el tratamiento del cáncer, incluyendo pero sin limitarse a, leucemia, linfoma y melanoma. En una realización, el linfoma es linfoma de Burkitt. La tabla I en el ejemplo 9 muestra que TRAIL tiene un efecto citotóxico sobre varias líneas celulares de linfoma de Burkitt. El virus de Epstein-Barr es un agente etiológico del linfoma de Burkitt.

Los polipéptidos de TRAIL también encuentran uso en el tratamiento de infecciones virales. El contacto con TRAIL produjo la muerte de las células infectadas por citomegalovirus, pero no del mismo tipo celular cuando no están infectadas, tal como se describe en el ejemplo 11. La capacidad de TRAIL para destruir células infectadas por otros virus puede confirmarse utilizando el ensayo descrito en el ejemplo 11. Tales virus incluyen, pero no se limitan a, virus de la encefalomiocarditis, virus de la enfermedad de Newcastle, virus de la estomatitis vesicular, virus del herpes simple, adenovirus 2, virus de la diarrea viral bovina y virus de Epstein-Barr.

Se administra una cantidad eficaz de TRAIL a un mamífero, incluyendo un ser humano, afectado por una infección viral. En una realización, se emplea TRAIL junto con interferón para tratar una infección viral. En el experimento descrito en el ejemplo 11, el pretratamiento de células infectadas por CMV con \gamma-interferón aumentó el nivel de destrucción de las células infectadas, que estaba mediada por TRAIL. TRAIL puede administrarse junto con otros agentes que ejercen un efecto citotóxico sobre células cancerígenas o células infectadas por virus.

En otra realización, se utiliza TRAIL para destruir células infectadas de manera viral en preparaciones celulares, tejidos u órganos que van a trasplantarse. Para ilustrar, puede ponerse en contacto médula ósea con TRAIL para destruir células infectadas por virus que puede estar presentes en ella, antes de que la médula ósea se trasplante al
receptor.

El TRAIL de la presente invención puede utilizarse en el desarrollo de tratamientos para cualquier trastorno mediado (directa o indirectamente) por cantidades defectuosas o ineficaces de TRAIL. Se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de proteína TRAIL purificada a un paciente afectado con tal trastorno. Alternativamente, pueden emplearse secuencias de ADN de TRAIL en el desarrollo de un enfoque de terapia génica para tratar tales trastornos. La descripción en el presente documento de secuencias de nucleótidos de TRAIL nativo permite la detección de genes de TRAIL defectuosos y la sustitución de los mismos por genes normales que codifican para TRAIL. Los genes defectuosos pueden detectarse en ensayos de diagnóstico in vitro, y mediante comparación de la secuencia de nucleótidos de TRAIL nativo descrita en el presente documento con la de un gen derivado de una persona de la que se sospecha que alberga un defecto en este gen.

La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden TRAIL purificado y un vehículo, diluyente o excipiente fisiológicamente aceptable. Los vehículos, diluyentes y excipientes adecuados son no tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas. Tales composiciones pueden comprender tampones, antioxidantes tales como ácido ascórbico, polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos), proteínas, aminoácidos, hidratos de carbono incluyendo glucosa, sacarosa o dextrinas, agentes quelantes tales como EDTA, glutatión y otros estabilizadores y excipientes empleados comúnmente en las composiciones farmacéuticas. La solución salina tamponada neutra o la solución salina mezclada con albúmina de suero conespecífica están entre los diluyentes apropiados. La composición puede formularse como un liofilizado utilizando soluciones de excipientes adecuados (por ejemplo, sacarosa) como diluyentes.

Para uso terapéutico, se administran las proteínas purificadas de la presente invención a un paciente, preferiblemente un ser humano, para el tratamiento de una manera apropiada para la indicación. Así, por ejemplo, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse localmente, mediante inyección intravenosa, infusión continua, liberación sostenida desde implantes u otra técnica adecuada. Las dosificaciones y la frecuencia de administración adecuadas dependerán, naturalmente, de factores tales como la naturaleza y gravedad de la indicación que se esté tratando, la respuesta deseada, el estado del paciente, etcétera.

La proteína TRAIL empleada en las composiciones farmacéuticas preferiblemente está purificada de tal manera que la proteína TRAIL está sustancialmente libre de otras proteínas de origen natural o endógeno, conteniendo preferiblemente menos de aproximadamente un 1% en masa de contaminantes proteicos residuales de procesos de producción. Sin embargo, tales composiciones pueden contener otras proteínas añadidas como estabilizadores, vehículos, excipientes o coproductos terapéuticos.

Los ADN que codifican para TRAIL descritos en el presente documento encuentran un uso en la producción de polipéptidos de TRAIL, tal como se trató anteriormente. Los fragmentos de las secuencias de nucleótidos de TRAIL también son útiles. En una realización, tales fragmentos comprenden al menos aproximadamente 17 nucleótidos consecutivos, más preferiblemente al menos 30 nucleótidos consecutivos, del ADN de TRAIL humano o murino descrito en el presente documento. Se proporcionan en el presente documento complementos de ADN o ARN de dichos fragmentos,
junto con formas tanto monocatenarias como bicatenarias del ADN de TRAIL de las SEQ ID NOS: 1, 3 y 5.

Entre los usos de tales fragmentos de ácido nucleico de TRAIL se encuentran su uso como sonda o como cebadores en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Como ejemplo, puede emplearse una sonda correspondiente al dominio extracelular de TRAIL. Las sondas encuentran uso en la detección de la presencia de ácidos nucleicos de TRAIL en ensayos in vitro y en tales procedimientos como Northern y Southern blot. También pueden identificarse los tipos celulares que expresan TRAIL. Tales procedimientos se conocen bien y el experto en la técnica puede elegir una sonda de longitud adecuada, dependiendo de la aplicación pretendida particular. Para PCR, se emplean los cebadores 5' y 3' correspondientes a los extremos terminales de una secuencia de ADN de TRAIL deseada para aislar y amplificar esa secuencia, utilizando técnicas convencionales.

Otros fragmentos útiles de ácidos nucleicos de TRAIL son oligonucleótidos antisentido o sentido que comprenden una secuencia de ácido nucleico monocatenario (o bien ARN o bien ADN) que puede unirse a las secuencias ARNm de TRAIL (sentido) o ADN de TRAIL (antisentido) objetivo. Tal fragmento comprende generalmente al menos aproximadamente 14 nucleótidos, preferiblemente desde aproximadamente 14 hasta aproximadamente 30 nucleótidos. La capacidad para crear un oligonucleótido antisentido o sentido, basado en una secuencia de ADNc para una proteína dada, se describe en, por ejemplo, Stein y Cohen, Cancer Res. 48:2659, 1988 y van der Krol et al., Biotechniques 6:958, 1988.

La unión de los oligonucleótidos antisentido o sentido a secuencias de ácido nucleico objetivo da como resultado la formación de dúplex que bloquean la traducción (ARN) o transcripción (ADN) mediante uno de varios medios, incluyendo el aumento de degradación de los dúplex, la terminación prematura de la transcripción o traducción, o mediante otros medios. Los oligonucleótidos antisentido pueden utilizarse, por tanto, para bloquear la expresión de las proteínas TRAIL.

Los oligonucleótidos antisentido o sentido comprenden además oligonucleótidos que tienen estructuras de azúcar-fosfodiéster modificadas (u otros enlaces de azúcar, tales como los descritos en el documento WO91/06629) y en los que tales enlaces de azúcar son resistentes a nucleasas endógenas. Tales oligonucleótidos con enlaces de azúcar resistentes son estables in vivo (es decir, pueden resistir la degradación enzimática) pero conservan la especificidad de secuencia para poder unirse a secuencias de nucleótidos objetivo. Otros ejemplos de oligonucleótidos antisentido o sentido incluyen aquellos oligonucleótidos que están unidos covalentemente a restos orgánicos, tales como los descritos en el documento WO 90/10448 y otros restos que aumentan la afinidad del oligonucleótido por una secuencia de ácido nucleico objetivo, tal como poli(L-lisina). Aún adicionalmente, pueden unirse agentes de intercalación, tales como elipticina, y agentes alquilantes o complejos metálicos a los oligonucleótidos antisentido o sentido para modificar las especificidades de unión del oligonucleótido antisentido o sentido por la secuencia de nucleótidos objetivo.

Los oligonucleótidos antisentido o sentido pueden introducirse en una célula que contiene la secuencia de ácido nucleico objetivo mediante cualquier método de transferencia génica, incluyendo por ejemplo, transfección de ADN mediada por CaPO_{4}, electroporación u otros vectores de transferencia génica tales como el virus de Epstein-Barr. Los oligonucleótidos antisentido o sentido se introducen preferiblemente en una célula que contiene la secuencia de ácido nucleico objetivo mediante la inserción del oligonucleótido antisentido o sentido en un vector retroviral adecuado, poniendo luego en contacto la célula con el vector retroviral que contiene la secuencia insertada, o bien in vivo o bien ex vivo. Los vectores retrovirales adecuados incluyen, pero no se limitan a, el retrovirus murino M-MuLV, N2 (un retrovirus derivado de M-MuLV) o los vectores de doble copia designados como DCT5A, DCT5B y DCT5C (véase la solicitud PCT WO 90/13641). Alternativamente, pueden utilizarse otras secuencias promotoras para expresar el oligonucleótido.

Los oligonucleótidos antisentido o sentido pueden introducirse también en una célula que contiene la secuencia de nucleótidos objetivo mediante la formación de un conjugado con una molécula de unión a ligandos, tal como se describe en el documento WO 91/04753. Las moléculas de unión a ligandos adecuadas incluyen, pero no se limitan a, receptores de la superficie celular, factores de crecimiento, otras citocinas, u otros ligandos que se unan a los receptores de la superficie celular. Preferiblemente, la conjugación de la molécula de unión a ligandos no interfiere sustancialmente en la capacidad de la molécula de unión a ligandos para unirse a su correspondiente molécula o receptor, o bloquear la entrada del oligonucleótido antisentido o sentido o su versión conjugada en la célula.

Alternativamente, puede introducirse un oligonucleótido antisentido o sentido en una célula que contiene la secuencia de ácido nucleico objetivo mediante la formación de un complejo oligonucleótido-lípido, tal como se describe en el documento WO 90/10448. El complejo de oligonucleótido antisentido o sentido-lípido se disocia preferiblemente dentro de la célula por una lipasa endógena.

Anticuerpos inmunorreactivos con TRAIL

Las proteínas TRAIL de la presente invención, o fragmentos inmunogénicos de las mismas, pueden emplearse en la generación de anticuerpos. La presente invención proporciona así anticuerpos que unen específicamente TRAIL, es decir, los anticuerpos se unen a TRAIL a través de los sitios de unión de antígenos del anticuerpo (opuesto a la unión no específica).

Pueden prepararse anticuerpos monoclonales y policlonales mediante técnicas convencionales. Véase, por ejemplo, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al. (eds.), Plenum Press, Nueva York (1980); y Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Land (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1988). La producción de anticuerpos monoclonales que son inmunorreactivos con TRAIL se ilustra adicionalmente en el ejemplo 4 más adelante.

Los fragmentos de unión a antígenos de tales anticuerpos, que pueden producirse mediante técnicas convencionales, también se engloban por la presente invención. Ejemplos de tales fragmentos incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab, F(ab') y F(ab')_{2}. También se proporcionan fragmentos y derivados de anticuerpos producidos mediante técnicas de ingeniería genética.

Los anticuerpos monoclonales de la presente invención incluyen anticuerpos quiméricos, por ejemplo, versiones humanizadas de anticuerpos monoclonales murinos. Tales anticuerpos humanizados pueden prepararse mediante técnicas conocidas, y ofrecen la ventaja de una inmunogenicidad reducida cuando se administran los anticuerpos a seres humanos. En una realización, un anticuerpo monoclonal humanizado comprende la región variable de un anticuerpo murino (o sólo el sitio de unión a antígenos del mismo) y una región constante derivada de un anticuerpo humano. Alternativamente, un fragmento de anticuerpo humanizado puede comprender el sitio de unión a antígenos de un anticuerpo monoclonal murino y un fragmento de región variable (que carece del sitio de unión a antígenos) derivado de un anticuerpo humano. Los procedimientos para la producción de anticuerpos quiméricos y monoclonales modificados mediante ingeniería genética adicionales incluyen los descritos en Riechmann et al. (Nature 332:323, 1988), Liu et al. (PNAS 84:3439, 1987), Larrick et al. (Bio/Technology 7:934, 1989) y Winter y Harris (TIPS 14:139, mayo de 1993).

Entre los usos de los anticuerpos se encuentra el uso en ensayos para detectar la presencia de polipéptidos de TRAIL, o bien in vitro o bien in vivo. Los anticuerpos encuentran un uso adicional en la purificación de TRAIL mediante cromatografía de afinidad.

Aquellos anticuerpos que adicionalmente pueden bloquear la unión de TRAIL a las células diana pueden utilizarse para inhibir una actividad biológica de TRAIL. Un método terapéutico supone la administración in vivo de tal anticuerpo en una cantidad eficaz para inhibir una actividad biológica mediada por TRAIL. Los trastornos mediados o agravados por TRAIL, directa o indirectamente, se tratan así. Generalmente, se prefieren los anticuerpos monoclonales para su uso en tales métodos terapéuticos.

Los anticuerpos dirigidos contra TRAIL pueden ser útiles para tratar microangiopatías trombóticas. Un trastorno de este tipo es la púrpura trombocitopénica trombótica (PTT) (Kwaan, H. C., Semin. Hematol., 24:71, 1987; Thompson et al. Blood, 80:1890, 1992). Se han notificado tasas de mortalidad asociadas con PTT crecientes por los centros de control de enfermedades de los EE.UU. (Torok et al., Am. J. Hematol. 50:84, 1995).

El plasma de pacientes afectados con PTT (incluyendo pacientes VIH^{+} y VIH^{-}) induce la apoptosis de células endoteliales humanas de origen microvascular dérmico, pero no a las de origen de vasos grandes (Laurence et al., Blood, 87:3245, 15 de abril de 1996). Por tanto, se cree que el plasma de pacientes con PTT contiene uno o más factores que inducen directa o indirectamente la apoptosis. En el ensayo descrito en el ejemplo 13 más adelante, los anticuerpos policlonales producidos contra TRAIL inhibieron la apoptosis inducida por plasma de PTT de las células endoteliales microvasculares dérmicas. Los datos presentados en el ejemplo 13 sugieren que TRAIL está presente en el suero de los pacientes con PTT, y puede desempeñar un papel en la inducción de la apoptosis de las células endoteliales microvasculares.

Otra microangiopatía trombótica es el síndrome hemolítico-urémico (SHU) (Moake, J. L., Lancet, 343:393, 1994; Melynck et al., (Arch. Intern. Med., 155:2077, 1995; Thompson et al., anteriormente). Una realización de la invención se refiere al uso de un anticuerpo anti-TRAIL para tratar el estado que a menudo se denomina como "SHU de adulto" (aun cuando también puede atacar a niños). Un trastorno conocido como SHU de la infancia/asociado a diarrea difiere en la etiología del SHU de adulto.

Otros estados caracterizados por la coagulación de pequeños vasos sanguíneos pueden tratarse utilizando anticuerpos anti-TRAIL. Tales estados incluyen, pero no se limitan a los siguientes. Se cree que los problemas cardiacos observados en aproximadamente el 5 - 10% de los pacientes pediátricos con SIDA suponen la coagulación de pequeños vasos sanguíneos. La rotura de la microvasculatura en el corazón se ha notificado en pacientes con esclerosis múltiple. Como ejemplo adicional, se contempla el tratamiento del lupus eritematoso sistémico (LES).

En una realización, se pone en contacto la sangre o el plasma de un paciente con un anticuerpo anti-TRAIL ex vivo. El anticuerpo (preferiblemente un anticuerpo monoclonal) puede unirse a una matriz de cromatografía adecuada mediante procedimientos convencionales. La sangre o plasma del paciente fluye a través de una columna de cromatografía que contiene el anticuerpo unido a la matriz, antes de devolverse al paciente. El anticuerpo inmovilizado se une a TRAIL, eliminando así la proteína TRAIL de la sangre del paciente.

En una realización alternativa, los anticuerpos se administran in vivo, en cuyo caso se emplean de manera deseada anticuerpos bloqueantes. Tales anticuerpos pueden identificarse utilizando cualquier procedimiento de ensayo adecuado, tal como probar los anticuerpos para determinar su capacidad para inhibir la unión de TRAIL a las células diana. Alternativamente, los anticuerpos bloqueantes pueden identificarse en ensayos para determinar la capacidad para inhibir un efecto biológico de la unión de TRAIL a células diana. El ejemplo 12 ilustra un método adecuado de identificación de anticuerpos bloqueantes, en el que se someten a ensayo los anticuerpos para determinar la capacidad para inhibir la lisis mediada por TRAIL de células Jurkat.

La presente invención proporciona así un método para tratar una microangiopatía trombótica, que supone el uso de una cantidad eficaz de un anticuerpo dirigido contra TRAIL. Los anticuerpos de la presente invención pueden emplearse en procedimientos in vivo o ex vivo, para inhibir el daño mediado por TRAIL a (por ejemplo, apoptosis de) las células endoteliales microvasculares.

Los anticuerpos anti-TRAIL pueden emplearse junto con otros agentes útiles en el tratamiento de un trastorno particular. En un estudio in vitro notificado por Laurence et al. (Blood 87:3245, 1996), se consiguió cierta reducción de la apoptosis mediada por plasma de PTT de las células endoteliales microvasculares utilizando un anticuerpo bloqueante anti-Fas, ácido aurintricarboxílico o plasma normal empobrecido en crioprecipitado.

Por tanto, puede tratarse un paciente con un agente que inhiba la apoptosis mediada por el ligando de Fas de células endoteliales, en combinación con un agente que inhiba la apoptosis mediada por TRAIL de células endoteliales. En una realización, se administran un anticuerpo bloqueante anti-TRAIL y un anticuerpo bloqueante anti-Fas ambos a un paciente afectado por un trastorno caracterizado por microangiopatía trombótica, tal como PTT o SHU. Ejemplos de anticuerpos monoclonales bloqueantes dirigidos contra el antígeno Fas (CD95) se describen en la publicación de solicitud PCT número WO 95/10540, incorporada como referencia al presente documento.

En el presente documento, se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo que es inmunorreactivo con TRAIL y un diluyente, excipiente o vehículo adecuado. Los componentes adecuados de tales composiciones son tal como se describieron anteriormente para las composiciones que contienen proteínas TRAIL.

Se facilitan los siguientes ejemplos para ilustrar realizaciones particulares de la presente invención, y no han de considerarse como limitantes del alcance de la invención.

Ejemplo 1 Aislamiento de un ADN de TRAIL humano

Se aisló el ADN que codifica para una proteína TRAIL humana de la presente invención mediante el siguiente procedimiento. Se realizó una búsqueda con el programa TBLASTN de la base de datos dbEST en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI - National Center for Biological Information), utilizando la secuencia de búsqueda LVVXXXGLYYVYXQVXF (SEQ ID NO: 8). Esta secuencia se basa en la región más conservada de la familia de ligandos de TNF (Smith et al., Cell, 73:1349, 1993). Se identificó un archivo de etiqueta de la secuencia expresada (EST - expressed sequence tag), número de registro de GenBank Z36726, utilizando estos parámetros de búsqueda. El archivo GenBank indicó que esta EST se obtenía a partir de una biblioteca de ADNc de aurícula de corazón humano.

Se sintetizaron dos oligonucleótidos de 30 pb basados en secuencias de los extremos 3' y 5' de este archivo EST. El oligonucleótido del extremo 3' tenía la secuencia TGAAATCGAAAGTATGTTTGGGAATAGATG (complemento de los nucleótidos 636 a 665 de la SEQ ID NO: 1) y el oligonucleótido 5' fue TGACGAAGAGAGTATGAA
CAGCCCCTGCTG (nucleótidos 291 a 320 de la SEQ ID NO: 1). Se marcaron los oligonucleótidos en el extremo 5' con ^{32}P \gamma-ATP y polinucleótido cinasa. Se examinaron dos bibliotecas de ADNc de \lambdagt10 mediante métodos convencionales con una mezcla equimolar de estos oligonucleótidos marcados como sonda. Una biblioteca fue una biblioteca de ADNc estirado en 5' de corazón humano (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA). La otra fue una biblioteca de linfocito de sangre periférica (LSP) preparada tal como sigue: se obtuvieron LSP a partir de voluntarios humanos normales y se trataron con 10 ng/ml de OKT3 (un anticuerpo anti-CD3) y 10 ng/ml de IL-2 humana durante seis días. Se lavaron las células de LSP y se estimularon con 500 ng/ml de ionomicina (Calbiochem) y 10 ng/ml de PMA durante 4 horas. Se aisló ARN mensajero de las células de LSP estimuladas. Se empaquetó ADNc sintetizado sobre el molde de ARNm en vectores de fago \lambdagt10 (Gigapak®, Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA).

Se colocaron en placas los fagos recombinantes sobre E. coli de la cepa C600-HFL y se examinaron utilizando técnicas de hibridación en placa habituales. Se sacaron filtros de nitrocelulosa de estas placas por duplicado, y se hibridaron con los oligonucleótidos marcados con ^{32}P durante la noche a 67ºC en una solución de Tris 60 mM pH 8,0, EDTA 2 mM, 5 x solución de Denhardt, 6 x SSC, n-lauroilsarcosina 1 mg/ml, NP40 0,5%, y ADN de esperma de salmón SS 4 \mug/ml. Entonces se lavaron los filtros con 3 x SSC a 67ºC durante treinta minutos.

A partir de la biblioteca de ADNc estirado en 5' de corazón, se obtuvo una placa positiva de entre aproximadamente un millón de placas. Este clon no incluía el extremo 3' del gen. Utilizando la biblioteca de LSP, se obtuvieron aproximadamente 50 placas positivas de entre 500.000 placas. Se eligieron quince de estas placas positivas de la primera vuelta, y se amplificaron los insertos de las reservas enriquecidas utilizando cebadores de oligonucleótido diseñados para amplificar insertos de fago. Se resolvieron los productos resultantes mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5%, se transfirieron a nitrocelulosa, y se analizaron mediante la técnica de transferencia Southern habitual utilizando los oligonucleótidos de 30 meros marcados con ^{32}P como sondas. Se purificaron las dos selecciones de placa que produjeron las bandas más grandes mediante el análisis Southern mediante un examen secundario, y se obtuvieron placas de fagos aislados utilizando los mismos procedimientos descritos anteriormente.

Se preparó ADN a partir de los fagos aislados mediante el método de lisis en placa, y se cortaron los insertos de ADNc con EcoRI, se purificaron mediante electroforesis utilizando agarosa al 1,5% en tampón de tris-borato-EDTA, y se ligaron al plásmido pBluescript® SK(+). Entonces se secuenciaron estos insertos mediante métodos convencionales, y se alinearon las secuencias resultantes.

Se presenta la secuencia de nucleótidos de un ADN de TRAIL humano en la SEQ ID NO: 1 y se presenta la secuencia de aminoácidos codificada por el mismo en la SEQ ID NO: 2. Esta proteína TRAIL humana comprende un dominio citoplásmico N-terminal (aminoácidos 1-18), una región transmembrana (aminoácidos 19-38), y un dominio extracelular (aminoácidos 39-281). El peso molecular calculado de esta proteína es de 32.508 daltones.

Se depositaron las células E. coli de la cepa DH10B transformadas con un vector recombinante que contiene este ADN de TRAIL en la Colección Americana de Cultivos Tipo el 14 de junio de 1995, y se asignó el número de registro 69849. El depósito se realizó bajo los términos del Tratado de Budapest. El vector recombinante en la cepa depositada es el vector de expresión pDC409 (descrito en el ejemplo 5). Se digirió el vector con SalI y NotI, y se ligó el ADN de TRAIL humano que incluye la región codificadora entera mostrada en la SEQ ID NO: 1 al vector digerido.

Ejemplo 2 Aislamiento de ADN que codifica para un TRAIL truncado

Se aisló ADN que codifica para una segunda proteína TRAIL humana tal como sigue. Esta TRAIL truncada no muestra poder inducir la apoptosis de células Jurkat.

El análisis PCR, utilizando los 30 meros descritos en el ejemplo 1 como cebadores de 5' y 3', indicó que 3 de cada 14 de las selecciones de placa de la primera vuelta en el ejemplo 1 contenían formas acortadas del ADN de TRAIL. Se aisló una de las formas acortadas del gen, se ligó al vector de clonación pBluescript® SK(+) (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) y se secuenció.

Se presenta la secuencia de nucleótidos de este ADN en la SEQ ID NO: 3. Se presenta la secuencia de aminoácidos codificada por el mismo en la SEQ ID NO: 4. La proteína codificada comprende un dominio citoplásmico N-terminal (aminoácidos 1-18), una región transmembrana (aminoácidos 19-38), y un dominio extracelular (aminoácidos 39-101).

El ADN de la SEQ ID NO: 3 carece de los nucleótidos 359 a 506 del ADN de la SEQ ID NO: 1, y por tanto se designa como el clon de variante de deleción de TRAIL humana (huTRAILdv). La deleción provoca un desplazamiento en el marco de lectura, lo que da como resultado un codón de terminación dentro del marco tras el aminoácido 101 de la SEQ ID NO: 4. Por tanto, el ADN de la SEQ ID NO: 3 codifica para una proteína truncada. Los aminoácidos 1 a 90 de la SEQ ID NO: 2 son idénticos a los aminoácidos 1 a 90 de la SEQ ID NO: 4. Sin embargo, debido a la deleción, la parte C-terminal de la proteína huTRAILdv (aminoácidos 91 a 101 de la SEQ ID NO: 4) difiere de los residuos en las posiciones correspondientes en la SEQ ID NO:2.

La proteína huTRAILdv carece de las regiones conservadas descritas anteriormente encontradas en el extremo C-terminal de los miembros de la familia de TNF de proteínas. El no poder provocar la muerte apoptótica de las células Jurkat por parte de esta proteína huTRAILdv confirma además la importancia de estas regiones conservadas para la actividad biológica.

Ejemplo 3 ADN que codifica para un TRAIL murino

Se aisló el ADN que codifica para un TRAIL murino mediante el siguiente procedimiento. Se preparó una biblioteca de ADNc que comprendía ADNc derivado del la línea celular T de ratón 7B9 en el vector \lambdaZAP tal como se describe por Mosley et al. (Cell 59:335, 1989). Se transfirió ADN de la biblioteca sobre filtros de nitrocelulosa mediante técnicas convencionales.

Se utilizaron sondas de ADN de TRAIL humano para identificar ADNc de ratón de hibridación sobre los filtros. Se utilizaron dos sondas separadas, en dos vueltas de examen. Se emplearon productos de reacción de PCR de aproximadamente 400 pb de longitud, aislados y amplificados utilizando el ADN de TRAIL humano como modelo, como sonda en la primera vuelta de examen. Estos productos de PCR consistían en un fragmento de la región codificadora de TRAIL humano. La sonda utilizada en la segunda vuelta del examen consistía en la región codificadora entera del ADN de TRAIL humano de la SEQ ID NO: 1. Se utilizó un kit de marcación de ADN cebado aleatorio (Stratagene, La Jolla, CA) para radiomarcar las sondas.

Se llevó a cabo la hibridación a 37ºC en formamida al 50%, seguido de lavado con 1 x SSC, SDS al 0,1% a 50ºC. Se aisló un ADNc de ratón que dio positivo en ambas vueltas de examen.

Se presenta la secuencia de nucleótidos de este ADN en la SEQ ID NO: 5 y se presenta la secuencia de aminoácidos codificados por el mismo en la SEQ ID NO: 6. La proteína codificada comprende un dominio citoplásmico N-terminal (aminoácidos 1-17), una región transmembrana (aminoácidos 18-38), y un dominio extracelular (aminoácidos 39-291). Este TRAIL de ratón es idéntico en un 64% a TRAIL humano de la SEQ ID NO: 2, a nivel de aminoácidos. La región codificadora de la secuencia de nucleótidos de TRAIL de ratón es idéntica en un 75% a la región codificadora de la secuencia de nucleótidos humana de la SEQ ID NO: 1.

Ejemplo 4 Anticuerpos que se unen a TRAIL

Este ejemplo ilustra la preparación de anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a TRAIL. Inmunógenos adecuados que pueden emplearse para generar tales anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, la proteína TRAIL purificada o un fragmento inmunogénico de la misma (por ejemplo, el dominio extracelular), proteínas de fusión que contienen polipéptidos de TRAIL (por ejemplo, proteínas de fusión solubles TRAIL/Fc), y células que expresan TRAIL recombinante sobre la superficie celular.

Técnicas conocidas para producir anticuerpos monoclonales incluyen aquellas descritas en la patente de los EE.UU 4.411.993. Resumidamente, se inmunizan ratones con TRAIL como inmunógeno emulsificado en adyuvante de Freund completo, e inyectado en cantidades que oscilan desde 10-100 \mug por vía subcutánea o intraperitoneal. Diez o doce días después, se reforzaron los animales inmunizados con TRAIL adicional emulsificado en adyuvante de Freund incompleto. Se refuerza a los ratones periódicamente a partir de ese momento con un programa de inmunización semanal o bisemanal. Se toman muestras de suero periódicamente mediante hemorragia retroorbital o escisión de la punta de la cola para análisis mediante ensayo de transferencia en mancha o ELISA (enzyme-linked immuno-sorbent assay - ensayo de inmunoabsorción unido a enzimas) de anticuerpos contra TRAIL.

Siguiendo a la detección de un título de anticuerpo apropiado, se proporciona a los animales que dan positivo una última inyección intravenosa de TRAIL en solución salina. Tres o cuatro días después, se sacrifica a los animales, se recogen células del bazo, y se fusionan células del bazo con una línea celular de mieloma murina tal como NS1 o, preferiblemente, P3x63Ag 8.653 (ATCC CRL 1580). Las fusiones generan células de hibridoma, que se colocan en múltiples placas de microvaloración en un medio HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) selectivo para inhibir la proliferación de células no fusionadas, híbridos de mieloma e híbridos de células del bazo.

Se examina la reactividad frente a TRAIL purificada de las células de hibridoma mediante ELISA mediante adaptaciones de las técnicas descritas por Engvall et al. (Immunochem. 8:871, 1971) y en la patente de los EE.UU. 4.703.004. Pueden inyectarse las células de hibridoma positivas por vía intraperitoneal en ratones BALB/c singénicos para producir ascitis que contiene concentraciones elevadas de anticuerpos monoclonales anti-TRAIL. Alternativamente, pueden hacerse crecer las células de hibridoma in vitro en frascos o frascos rotativos mediante diversas técnicas. Pueden purificarse los anticuerpos monoclonales producidos en ascitis de ratón mediante precipitación con sulfato de amonio, seguida de cromatografía de exclusión en gel. Alternativamente, puede utilizarse cromatografía de afinidad basada en la unión del anticuerpo a la proteína A o la proteína G, así como la cromatografía de afinidad basada en la unión a TRAIL.

Ejemplo 5 Ensayo de apoptosis por desarrollo escalonado de ADN

Se expresó TRAIL humano y se probó su capacidad para inducir apoptosis. Se sintetizaron oligonucleótidos que correspondían a los extremos 3' y 5' de la región codificadora del gen de TRAIL humano, con sitios de restricción SalI y NotI incorporados en los extremos de los oligonucleótidos. Se amplificó la región codificadora del gen de TRAIL humano mediante técnicas de PCR habituales, utilizando estos oligonucleótidos como cebadores. Se digirieron los productos de reacción de PCR con las endonucleasas de restricción SalI y NotI, luego se insertaron en un vector digerido con SalI/NotI pDC409. pDC409 es un vector de expresión para uso en células de mamíferos, pero también puede replicarse en células E. coli.

pDC409 se deriva de un vector de expresión designado como pDC406 (descrito por McMahan et al. EMBO J. 10:2821, 1991, y en la solicitud PCT WO 91/18982, incorporados como referencia al presente documento). pDC406 contiene orígenes de replicación derivados de SV40, virus Epstein-Barr y pBR322, y es un derivado de HAV-EO descrito por Dower et al. J. Immunol. 142:4314 (1989). pDC406 difiere de HAV-EO por la deleción de un intrón presente en la secuencia líder triparental de adenovirus 2 en HAV-EO. Se transcribe y traduce el ADN insertado en un sitio de clonación múltiple (que contiene varios sitios de escisión de endonucleasa de restricción) utilizando elementos reguladores derivados de VIH y adenovirus. El vector contiene también un gen que confiere resistencia a la ampicilina.

pDC409 difiere de pDC406 en que se ha suprimido un sitio Bgl II fuera del mcs (sitio de clonación múltiple) de manera que el sitio Bgl II en el mcs es el único. Se han añadido dos sitios Pme 1 y un sitio Srf 1 al mcs, y se han posicionado tres codones de terminación (TAG) en el sentido de 3' del mcs para funcionar en los tres marcos de lectura. Se ha añadido un cebador/promotor T7 para ayudar en el procedimiento de secuenciación del ADN.

Se derivó la línea celular de riñón de mono CV-1/EBNA-1 (ATCC CRL 10478) mediante transfección de la línea celular CV-1 (ATCC CCL 70) con un gen que codifica para antígeno-1 nuclear del virus Epstein-Barr (EBNA-1) que expresa constitutivamente EBNA-1 llevado desde el potenciador/promotor intermedio temprano del CMV (citomegalovirus) humano, tal como describe McMahan et al., anteriormente. El gen del EBNA-1 permite una replicación episomal de vectores de expresión, tales como pDC409, que contienen el origen EBV (virus Epstein-Barr) de replicación.

Se transfectaron las células CV1/EBNA dejadas crecer en frascos T175 con 15 \mug o bien de pDC409 "vacío" o bien pDC409 que contiene la región que codifica para TRAIL humano. Se cultivaron las células transformadas durante tres días a 37ºC y CO_{2} al 10%. Entonces se lavaron las células con PBS, se incubaron durante 20 minutos a 37ºC en EDTA 50 mM, se rasparon del frasco con un raspador de células, y se lavaron una vez con PBS. A continuación, se fijaron las células en PBS con paraformaldehído al 1% durante 10 minutos a 4ºC, y se lavaron 3 veces con PBS.

Se utilizaron células Jurkat como células diana en este ensayo, para determinar si las células que expresan TRAIL podrían inducir apoptosis en las mismas. La línea celular Jurkat, clon E6-1, es una línea celular de leucemia de células T aguda humana disponible de la Colección Americana de Cultivos Tipo bajo el número de registro ATCC TIB 152, y descrita por Weiss et al. (J. Immunol. 133:123-128, 1984). Se cultivaron las células Jurkat en medio RPMI complementado con suero bovino fetal al 10% y 10 \mug/ml de estreptomicina y penicilina hasta una densidad de 200.000 a 500.000 células por ml. Se cultivaron conjuntamente cuatro millones de estas células por pocillo en una placa de 6 pocillos con 2,5 ml de medio con diversas combinaciones de células fijadas, sobrenadantes de células transfectadas con ligando Fas, y diversos anticuerpos, tal como se indica a continuación.

Tras cuatro horas, se lavaron las células una vez con PBS y se sedimentaron a 1.200 rpm durante 5 minutos en una centrifugadora de mesa. Se resuspendieron los sedimentos y se incubaron durante diez minutos a 4ºC en 500 \mul de tampón que consistía en Tris-HCl 10 mM, EDTA 10 mM, pH 7,5, y Tritón X-100 al 0,2%, que lisa las células pero deja los núcleos intactos. Entonces se centrifugó el lisado a 4ºC durante diez minutos en una micro-centrífuga a 14.000 rpm. Se retiraron los sobrenadantes y se extrajo tres veces con 1 ml de 25:24:1 fenol - cloroformo - alcohol isoamílico, seguido de precipitación con NaOAC y etanol en presencia de 1 \mug de vehículo glucógeno (Sigma).

Se volvieron a suspender los sedimentos resultantes en Tris-HCl 10 mM, EDTA 10 mM, pH 7,5, y se incubaron con 10 \mug/ml de RNasa A a 37ºC durante 20 minutos. Entonces se resolvieron las soluciones de ADN mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5% en tampón de Tris-borato-EDTA, tintadas con bromuro de etidio y fotografiadas mientras se trans-iluminaban con luz UV.

Los resultados fueron los siguientes. Las células CV1/EBNA transfectadas tanto con pDC409 como con pDC409-TRAIL no produjeron desarrollo escalonado del ADN detectable. Las células fijadas a pDC409-TRAIL cultivadas conjuntamente con células Jurkat produjeron desarrollo escalonado del ADN, pero las células fijadas a pDC409 cultivadas conjuntamente con células Jurkat no.

También se observó desarrollo escalonado del ADN cuando se cultivaron conjuntamente las células Jurkat con sobrenadantes concentrados a partir de células COS transfectadas con ADN que codifica para ligando Fas humano en pDC409. Se cree que los sobrenadantes contienen ligando Fas soluble que se libera proteolíticamente de la superficie celular. El desarrollo escalonado del ADN inducido por el ligando Fas pudo bloquearse añadiendo 10 \mug/ml de un anticuerpo monoclonal bloqueante soluble dirigido contra Fas. Este mismo anticuerpo no pudo inhibir el desarrollo escalonado de ADN Jurkat por las células pDC409-TRAIL, lo que indica que TRAIL no induce la apoptosis a través de Fas.

En el mismo procedimiento de ensayo, células CV1/EBNA fijadas transfectadas con pDC409-TRAIL indujeron el desarrollo escalonado del ADN en células U937. U937 (ATCC CRL 1593) es una línea celular de linfoma histiocítico humano. La razón de efector con respecto a células diana era de 1:4 (la misma que en el ensayo con células diana Jurkat).

La fragmentación de ADN celular en un motivo conocido como desarrollo escalonado del ADN es distintiva de la apoptosis. En el ensayo precedente, TRAIL indujo la apoptosis de una línea celular de leucemia y una línea celular de linfoma.

Ejemplo 6 Análisis de Northern blot (inmunotransferencia)

Se analizó la expresión de TRAIL en varios tipos de tejidos diferentes con un procedimiento de northern blot convencional. Se obtuvieron northern blot que contenían ARN poli A+ a partir de una variedad de tejidos de seres humanos adultos (northern blot de tejido múltiple I y II) de Clonetech (Palo Alto, CA). Se prepararon otras transferencias mediante la resolución de muestras de ARN sobre un gel de agarosa-formaldehído al 1,1%, transfiriendo sobre Hybond-N tal como recomienda el fabricante (Amersham Corporation), y tintándolas con azul de metileno para monitorizar las concentraciones de ARN. Se detectaron las transferencias con una ribosonda de ARN antisentido que correspondía a la región codificadora entera de TRAIL humano.

Se detectó ARN de TRAIL humano en linfocitos de sangre periférica, colón, intestino delgado, ovario, próstata, timo, bazo, placenta, pulmón, riñón, corazón, páncreas, y músculo esquelético. Se encontró que los transcriptos de TRAIL eran abundantes en la línea celular de linfoma anaplástico de células grandes Karpas 299 (Fischer et al. Blood, 72:234, 1988) y en células T amigdalinas. El mensaje de TRAIL estaba presente en menor grado en la línea celular de linfoma Burkitt designada Raji.

No se detectó ARNm de TRAIL en testículos, cerebro, o hígado, o en varias líneas celulares T. Se detectaron pocos o ningún transcripto de TRAIL en células T de sangre periférica recién aislada (PBT), o bien estimuladas o bien no estimuladas con PMA e ionóforo de calcio durante 20 horas.

Ejemplo 7 Producción de un polipéptido de TRAIL soluble

Se preparó un polipéptido de TRAIL humano soluble que comprendía los aminoácidos 95 a 281 de la SEQ ID NO: 2 tal como sigue. Este polipéptido es un fragmento del dominio extracelular, que carece de la región espaciadora tratada anteriormente.

Se construyó un vector de expresión que codificaba para TRAIL humano soluble mediante la fusión de ADN dentro del marco que codifica para las siguientes secuencias de aminoácidos (enumeradas desde el extremo terminal N- hasta el C-): una secuencia líder derivada a partir de citomegalovirus (CMV) humano, un epítopo sintético designado Flag®, y los aminoácidos 95-281 de TRAIL humano. El octapéptido Flag® (SEQ ID NO: 7) facilita la purificación de proteínas fusionadas al mismo, tal como se describe anteriormente por Hopp et al. (Biotechnology 6:1204-1210, 1988).

Se aisló el fragmento de ADN que codifica para TRAIL y se amplificó mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), utilizando cebadores de oligonucleótidos que definían los términos de un fragmento de ADN que codificaba para los aminoácidos 95-281 de la SEQ ID NO: 2. El cebador 3' fue un 31-mero que añadía adicionalmente un sitio NotI en el sentido de 3' de la secuencia que codificaba para TRAIL. El cebador 5' añadió un sitio SpeI y una secuencia que codificaba para el epítopo Flag® en el sentido 5' de la secuencia que codificaba para TRAIL. Se llevó a cabo una PCR mediante procedimientos convencionales, utilizando el ADNc de TRAIL humano descrito anteriormente como modelo.

Se digirieron los productos de reacción con SpeI y NotI, y se insertaron en el vector de expresión pDC409 (descrito en el ejemplo 5), que se había escindido con SalI y NotI. También se ligaron al vector oligonucleótidos hibridados que forman un fragmento SalI-SpeI que codifica para un líder de marco de lectura abierto de CMV. Se presenta la secuencia de aminoácidos del líder derivado de CMV como SEQ ID NO: 9. Los aminoácidos 1 a 29 de la SEQ ID NO: 9 se codifican por ADN de CMV, mientras que los aminoácidos 30 a 32 se codifican por los oligonucleótidos empleados en la construcción del vector. Se transfectaron células de E. coli con la mezcla de ligamiento, y se aisló el vector de expresión recombinante deseado a partir de las mismas.

Se transfectaron células de CV1-EBNA (ATCC CRL 10478; descritas en el ejemplo 5) con el vector recombinante, que se designa pDC409-Flag-shTRAIL, y se hicieron crecer para permitir la expresión y secreción del polipéptido Flag®-TRAIL soluble. Se recogieron los sobrenadantes del cultivo 3 días después de la transfección y se aplicaron a una columna que contenía un anticuerpo anti-Flag® designado M2 inmovilizado sobre un soporte sólido. Entonces se lavó la columna con PBS. El anticuerpo M2 monoclonal se describe por Hopp et al. anteriormente, y está disponible de Kodak Scientific Imaging Systems, New Haven, Connecticut. Se eluyeron fracciones de 800 \mul de la columna con citrato 50 mM, y se neutralizaron inmediatamente en 0,45 ml de Tris 1 M (pH 8). Se ajustaron las fracciones a glicerol al 10% y se almacenaron a -20ºC hasta que se necesitaron.

Este TRAIL humano/Flag® recombinante soluble expresado en células CV1/EBNA tiene un peso molecular aparente de 28 kD cuando se analiza mediante electroforesis de gel de poliacrilamida - SDS (SDS - PAGE). El resto Flag® contribuye con unos 880 daltones de manera estimada al peso molecular total. El análisis por filtración en gel de Flag®/TRAIL soluble purificado sugiere que la molécula es multimérica en solución con un tamaño de \sim80kD. Aunque no se desea limitarse por la teoría, el análisis por filtración en gel sugiere que el TRAIL humano/Flag® recombinante soluble formó de manera natural una combinación de dímeros y trímeros, predominando los trímeros.

Se construyó un vector de expresión designado pDC409 - Flag - smTRAIL, que codifica para un CMV líder
- Flag® - proteína TRAIL murina soluble, mediante procedimientos análogos. Se aisló un fragmento de ADN que codificaba para un polipéptido de TRAIL murino soluble y se amplificó mediante PCR. Se emplearon oligonucleótidos que definían los términos de ADN que codifica para los aminoácidos 99 a 291 de la secuencia de TRAIL murina de la SEQ ID NO: 6 como los cebadores 5' y 3' de la PCR.

Ejemplo 8 Lisis de células de leucemia mediante TRAIL soluble

En el ejemplo 5, las células que expresaban TRAIL humano inducían la apoptosis de células Jurkat (una línea celular de leucemia). En el siguiente estudio, un polipéptido de TRAIL humano soluble destruyó células Jurkat.

Se hicieron crecer células Jurkat hasta una densidad de 200.000 a 500.000 células por ml en medio RPMI complementado con suero bovino fetal al 10%, estreptomicina 100 \mug/ml, y penicilina 100 \mug/ml. Se incubaron las células (en placas de 96 pocillos con 50.000 células por pocillo en un volumen de 100 \mul) durante veinte horas con los reactivos indicados en la figura 1. "sobre. TRAIL" se refiere a sobrenadante condicionado (10 \mul por pocillo) a partir de células CV1/EBNA transfectadas con pDC409 - Flag - shTRAIL (véase ejemplo 7). "sobre. control" se refiere a sobrenadante a partir de células CV1/EBNA transfectadas con vector vacío. En los que se indique, se añadió anticuerpo anti-Flag® inmovilizado M2 ("Inm. M2") con una concentración de 10 \mug/ml en un volumen de 100 \mul por pocillo y se dejó adherir o bien durante la noche a 4ºC o bien durante 2 horas a 37ºC, tras lo cual se aspiraron los pocillos y se lavaron dos veces con PBS para retirar anticuerpo no unido. Se incluyeron células Jurkat tratadas con ligando Fas o M3, un anticuerpo monoclonal bloqueante dirigido contra Fas, (Alderson et al. J. Exp. Med., 181:71, 1995; y solicitud PCT WO 95/10540) en el ensayo tal como se indica.

Se evaluó la actividad metabólica de las células así tratadas mediante conversión metabólica de tinte azul alamar, en el siguiente procedimiento. Se midió la conversión de azul alamar mediante la adición de 10 \mul de tinte azul alamar (Biosource International, Camarillo, CA) por pocillo, y la sustracción de la densidad óptica (DO) a 550-600 nm en el momento en el que se añadió el tinte de la DO a 550-600 nm tras cuatro horas. No se traza ninguna conversión de tinte como 0 por ciento de viabilidad, y se traza el nivel de conversión de tinte en ausencia de TRAIL como 100 por ciento de viabilidad. Se calculó el porcentaje de viabilidad mediante la multiplicación de la razón de tinción de cultivos experimental frente a control por 100.

Los resultados se representan en la figura 1. Las barras de error representan la desviación estándar de las medidas de cuatro pocillos independientes, y los valores son la media de estas medidas.

El sobrenadante que contenía TRAIL provocó una reducción significativa de la viabilidad de las células Jurkat. Una reducción superior de la viabilidad celular resultó a partir del contacto con una combinación de sobrenadante que contenía TRAIL y anticuerpo anti-Flag® inmovilizado M2.Una posible explicación es que M2 facilita la reticulación de los complejos Flag®/receptor de TRAIL, incrementando así la fuerza de la señalización.

El ligando Fas demostró poder destruir células Jurkat. El anticuerpo anti-Fas M3 inhibió la actividad del ligando Fas, pero no la actividad de TRAIL.

Con el fin de confirmar que los cambios en la conversión de tinte en el ensayo de azul alamar se debían a muerte celular, se confirmó la disminución de la viabilidad celular inducida por TRAIL mediante la tinción de las células con azul trípano.

Ejemplo 9 Lisis de células de leucemia y linfoma

En los ejemplos 5 y 8, TRAIL indujo la apoptosis de una línea celular de leucemia (Jurkat) y una línea celular de linfoma (U937). El siguiente estudio demuestra además que TRAIL puede destruir células de leucemia y de
linfoma.

Se hicieron crecer las líneas celulares humanas indicadas en la tabla I hasta una densidad de 200.000 a 500.000 células por ml en medio RPMI complementado con suero bovino fetal al 10%, estreptomicina 100 \mug/ml, y penicilina 100 \mug/ml. Se incubaron las células (en placas de 96 pocillos con 50.000 células por pocillo en un volumen de 100 \mul) durante veinte horas con sobrenadantes condicionados (10 \mul por pocillo) a partir de células CV1/EBNA transfectadas con pDC409 - Flag - shTRAIL.

Se evaluó la actividad metabólica mediante conversión de tinte azul alamar, con el procedimiento de ensayo descrito en el ejemplo 8. Los resultados se presentan en la tabla I.

Con el fin de confirmar que los cambios en la conversión de tinte en el ensayo de azul alamar se debían a muerte celular, se confirmó la disminución de la viabilidad celular inducida por TRAIL mediante la tinción de las células con azul trípano. La tinción violeta cristal, realizada tal como se describe por Flick y Gifford (J. Immunol. Methods 68:167-175, 1984), también confirmó los resultados observados en el ensayo de azul alamar. Se confirmó la naturaleza apoptótica de la muerte celular mediante tinción con azul trípano y la visualización de la fragmentación apoptótica mediante microscopía.

Tal como se muestra en la tabla I, muchas líneas celulares cancerosas eran sensibles a la destrucción mediada por TRAIL. La susceptibilidad de tipos de células adicionales a la apoptosis mediada por TRAIL puede determinarse utilizando los procedimientos de ensayo descritos en esta sección de ejemplos.

TRAIL no mostró ningún efecto citotóxico significativo sobre las líneas celulares THP-1, K562, Karpas 299, y MP-1. Se estableció K299, también conocida como Karpas 299, (DSM-ACC31) a partir de sangre periférica de un varón diagnosticado con un grado elevado de linfoma anaplástico de células grandes (Fischer et al. Blood, 72:234, 1988). MP-1 es una línea celular B transformada por EBV derivada espontáneamente (Goodwin et al., Cell, 73:447, 1993). Aunque no se desea limitarse por la teoría, es posible que estas cuatro líneas celulares no expresen un receptor para TRAIL, o se caractericen por una regulación por incremento de un gen que inhibe la apoptosis.

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TABLA 1 Efecto de TRAIL soluble sobre la viabilidad de la línea celular

Línea celular	Descripción	Porcentaje de viabilidad^{a}
Bjab	Linfoma Burkitt	0,5 \pm 3,8
Ramos	Linfoma Burkitt	12,1 \pm 2,1
U937	Linfoma histiocítico	25,2 \pm 8,2
HL60	Leucemia promielocítica	59,5 \pm 3,2
Raji	Linfoma Burkitt	64,9 \pm 4,5
Daudi	Linfoma Burkitt	70,2 \pm 4,2
THP-1	Línea celular monocítica	92,3 \pm 6,8
K562	Leucemia mielógena crónica	97,1 \pm 4,8
K299	Linfoma anaplástico de células grandes	99,0 \pm 4,3
MP-1	Línea celular B espontánea	104,9 \pm 11,7
^{a} Los resultados son medias \pm EEM de 4 pocillos para cada punto de datos

Ejemplo 10 Actividad de cruce de especies de TRAIL

Se probó la reactividad cruzada entre especies de TRAIL humano y murino tal como sigue. Se incubó TRAIL humano y murino con la línea celular de melanoma humano A375 (ATCC CRL 1619). Ya que esta es una línea celular adherente, se utilizó un ensayo de violeta cristal, en vez de azul alamar, para determinar la viabilidad celular. Se hicieron crecer las células A375 en DMEM complementado con suero bovino fetal al 10%, estreptomicina 100 \mug/ml, y penicilina 100 \mug/ml. Se incubaron las células (en placas de 96 pocillos con 10.000 células por pocillo en un volumen de 100 \mul) durante 72 horas con el TRAIL murino soluble descrito en el ejemplo 7. Se realizó tinción con violeta cristal tal como se describe por Flick y Gifford (J. Immunol. Methods 68:167-175, 1984). Los resultados demostraron que el TRAIL tanto humano como murino era activo en estas células humanas, ya que el TRAIL humano y murino destruía células A375.

Se probó si el TRAIL humano podía actuar sobre células murinas, utilizando la línea celular de fibroblastos murina L929. La incubación de células L929 con TRAIL o bien humano o bien murino dio como resultado una disminución en la tinción con violeta cristal, demostrando por tanto que el TRAIL humano y murino son activos sobre (la apoptosis inducida de) células murinas. Además de violeta cristal, se confirmó la muerte celular mediante tinción con azul trípano.

Ejemplo 11 Lisis de células infectadas por CMV

El siguiente experimento demuestra que el Flag® soluble - proteína TRAIL humana preparado en el ejemplo 7 tiene un efecto citotóxico sobre células infectadas por virus.

Se hicieron crecer fibroblastos gingivales humanos normales hasta confluencia sobre placas de 24 pocillos en CO_{2} al 10% y medio DMEM complementado con suero bovino fetal al 10%, estreptomicina 100 \mug/ml, y penicilina 100 \mug/ml. Se trataron las muestras de los fibroblastos tal como se indica en la figura 2. Las concentraciones de citocinas fueron de 10 ng/ml para \gamma-interferón y de 30 ng/ml para Flag® soluble - TRAIL humana. Todas las muestras que recibieron TRAIL también recibieron un exceso del doble en peso de anticuerpo anti-Flag® M2 (descrito anteriormente), que potencia la actividad de TRAIL (presumiblemente mediante reticulación).

El tratamiento previo de las células con las citocinas indicadas fue de 20 horas. Para infectar células por citomegalovirus (CMV), se aspiraron los medios de cultivo y se infectaron las células por CMV en DMEM con una MDI (multiplicidad de infección) aproximada de 5. Tras dos horas se sustituyó el medio que contenía virus por DMEM y se añadieron citocinas tal como se indica. Tras 24 horas, se tiñeron las células con tinte violeta cristal tal como se describe (Flick y Gifford, 1984, anteriormente). Se lavaron dos veces las células teñidas con agua, se rompieron en 200 \mul de desoxicolato de sodio al 2%, se diluyeron 5 veces en agua, y se tomó la DO a 570 nm. Se calculó el porcentaje de tinción máxima mediante la normalización de las DO con la muestra que mostró la tinción superior. Se obtuvieron resultados similares a partir de varios experimentos independientes.

Los resultados presentados en la figura 2 demuestran que TRAIL destruía específicamente fibroblastos infectados por CMV. Esta muerte celular se potenciaba por el tratamiento previo de las células con \gamma-interferón. No resultó ninguna muerte significativa de fibroblastos no infectados por virus del contacto con TRAIL.

Ejemplo 12 Ensayo para identificar anticuerpos bloqueantes

Pueden identificarse anticuerpos bloqueantes dirigidos contra TRAIL mediante la prueba de anticuerpos para determinar si pueden inhibir una actividad biológica particular de TRAIL. En el siguiente ensayo, se probó un anticuerpo monoclonal para determinar si podía inhibir la apoptosis mediada por TRAIL de células Jurkat. La línea celular Jurkat se describe en el ejemplo 5.

Se empleó una línea celular de hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal cultivado contra proteína de fusión soluble TRAIL humana/Flag® en este ensayo. Se incubaron sobrenadantes de los cultivos de hibridoma con Flag®/TRAIL humano soluble 20 ng/ml reticulado con anticuerpo monoclonal anti-Flag® M2 40 ng/ml, en medio RPMI completo en una placa de microvaloración de 96 pocillos. Se añadió una cantidad equivalente de medio de cultivo de hibridoma nuevo a los cultivos de control. La proteína de fusión soluble TRAIL humana/Flag® y el anticuerpo monoclonal designado M2 se describen en el ejemplo 7.

Se empleó el sobrenadante del hibridoma con una dilución de 1:50 (v/v) (concentración inicial), y con diluciones en serie dobles de la misma. Tras incubar a 37ºC, con CO_{2} al 10%, durante 30 minutos, se añadieron 50.000 células Jurkat por pocillo, y se continuó la incubación durante 20 horas.

Entonces se evaluó la viabilidad celular midiendo la conversión metabólica de tinte de azul alamar. Se describe un procedimiento de ensayo de conversión de azul alamar en el ejemplo 8. Se encontró que el anticuerpo monoclonal inhibía la apoptosis de células Jurkat inducida por Flag®/TRAIL humano soluble.

Ejemplo 13 Estudio de bloqueo de TRAIL

Se trataron células endoteliales microvasculares humanas de origen dérmico durante 16-18 horas con plasma de pacientes con púrpura trombocitopénica trombótica (PTT) o con plasma de control, o bien solas o bien en presencia de antisuero policlonal anti-TRAIL. Se empleó una dilución de 1:2.000 del antisuero. El plasma era de pacientes con PTT, designados número 1 y número 2 a continuación. Las células empleadas en los ensayos eran MVEC-1 (HMVEC 2753, compradas de Clonetics, San Diego, CA) y MVEC-2 (DHMVEC 30282, compradas de Cell Systems, Kirkland, WA). Los cultivos de estas células pueden mantenerse tal como se describe por Laurence et al. (Blood, 87:3245,
1996).

Los resultados fueron tal como sigue. Los datos mostrados son de histogramas de ADN de células teñidas con yoduro de propidio, y "pico A_{0}" representa el pico apoptótico (véase Oyaizu et al., Blood, 82:3392, 1993; Nicoletti et al., J. Immunol. Methods, 139:271, 1991; y Laurence et al., Blood, 75:696, 1990).

\newpage

	CE microvasculares	Plasma (al 1%)	Anticuerpo	% del pico A_{0}
Experimento 1
	MVEC-1 dérmica	control	-	0
	MVEC-1 dérmica	PTT (nº 1)	-	19,5
	MVEC-1 dérmica	PTT (nº 1)	+	0,3
Experimento 2
	MVEC-2 dérmica	control	-	0
	MVEC-2 dérmica	PTT (nº 2)	-	20,0
	MVEC-2 dérmica	PTT (nº 2)	Control Ab	13,1
	MVEC-2 dérmica	PTT (nº 2)	+	0,2
Experimento 3
	MVEC-1 dérmica	PTT (nº 1)	-	50,1
	MVEC-1 dérmica	PTT (nº 1)	+	10,6
Experimento 4
	MVEC-2 dérmica	control	-	0
	MVEC-2 dérmica	PTT (nº 1)	-	13,9
	MVEC-2 dérmica	PTT (nº 1)	Control Ab	14,1
	MVEC-2 dérmica	PTT (nº 1)	+	0,6

Los datos revelan que el plasma derivado de pacientes con PTT induce la apoptosis de células endoteliales microvasculares de origen dérmico. Esta apoptosis se inhibió mediante anticuerpos policlonales dirigidos contra TRAIL.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: Immunex Corporation.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TITULO DE LA INVENCIÓN: Citocina Que Induce Apoptosis

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 9

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: Kathryn A. Anderson, Immunex Corporation

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 51 University Street

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Seattle

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: WA

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Estados Unidos

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 98101

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: Apple Macintosh

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: Apple 7.5.2

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: Microsoft Word, versión 6.0.1

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: -falta por asignar-

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 25 de junio de 1996

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE SOLICITUD ANTERIORES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/496.632

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 29 de junio de 1995

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE SOLICITUD ANTERIORES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/548.368

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 1 de noviembre de 1995

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DEL ABOGADO / AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Anderson, Kathryn A.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 32.172

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA / EXPEDIENTE: 2835 - WO

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN SOBRE COMUNICACIONES TELEFÓNICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: (206) 587-0430

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FAX: (206) 233-0644

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TELEX: 756822

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1751 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: huAIC

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE / CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 88..933

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

1

2

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 281 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

3

4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1521 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: HuAIC-dv

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE / CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 78..383

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

5

6

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 101 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

7

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1366 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: MuAIC

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE / CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 47..919

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

9

10

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 291 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

12

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: no relevante

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: péptido FLAG

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: no relevante

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: péptido conservado

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Val Val Xaa Xaa Xaa Gly Leu Tyr Tyr Val Tyr Xaa Gln Val Xaa}

\sac{Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 32 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: no relevante

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CLON: líder de CMV

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Ala Arg Arg Leu Trp Ile Leu Ser Leu Leu Ala Val Thr Leu Thr}

\sac{Val Ala Leu Ala Ala Pro Ser Gln Lys Ser Lys Arg Arg Thr Ser Ser}

Claims (36)

1. ADN aislado que codifica para un polipéptido de TRAIL, en el que dicho polipéptido de TRAIL comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos en un 80% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los aminoácidos 1 a 281 de la SEQ. ID NO: 2 y los aminoácidos 1 a 291 de la SEQ. ID NO: 6, en los que dicho polipéptido de TRAIL puede inducir la apoptosis de células Jurkat.

2. ADN aislado según la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido de TRAIL comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los aminoácidos 1 a 281 de la SEQ. ID NO: 2 y los aminoácidos 1 a 291 de la SEQ. ID NO: 6.

3. ADN aislado que codifica para un polipéptido de TRAIL soluble, en el que dicho polipéptido de TRAIL soluble comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos en un 80% a una secuencia seleccionada de:

(a)

el dominio extracelular de la proteína TRAIL humana de la SEQ. ID NO: 2;

(b)

el dominio extracelular de la proteína TRAIL murina de la SEQ. ID NO: 6;

(c)

un fragmento del dominio extracelular de (a) o (b) en el que el fragmento puede inducir la apoptosis de células Jurkat;

en el que dicho polipéptido TRAIL soluble puede inducir la apoptosis de células Jurkat.

4. ADN según la reivindicación 3, en el que dicho polipéptido de TRAIL soluble comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a)

el dominio extracelular de TRAIL humano (aminoácidos 39 a 281 de la SEQ. ID NO: 2); y

(b)

un fragmento de dicho dominio extracelular, en el que dicho fragmento puede inducir la apoptosis de células Jurkat.

5. ADN según la reivindicación 4, en el que dicho polipéptido de TRAIL soluble comprende la secuencia de aminoácidos x a 281 de la SEQ. ID NO: 2, en la que x representa número entero de desde 39 hasta 95.

6. ADN según la reivindicación 5, en el que dicho polipéptido de TRAIL soluble comprende la secuencia de aminoácidos 95 a 281 de la SEQ. ID NO: 2.

7. ADN según la reivindicación 3, en el que dicho polipéptido de TRAIL soluble comprende una(s) sustitución(ones) conservativa(s) en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a)

el dominio extracelular de TRAIL humano (aminoácidos 39 a 281 de la SEQ. ID NO: 2), en el que el dominio extracelular puede inducir la apoptosis de células Jurkat; y

(b)

un fragmento de dicho dominio extracelular, en el que el fragmento puede inducir la apoptosis de células Jurkat

en el que TRAIL sustituido de manera conservativa puede inducir la apoptosis de células Jurkat.

8. Vector de expresión que comprende un ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Procedimiento para la preparación de un polipéptido de TRAIL, que comprende cultivar una célula huésped transformada con un vector según la reivindicación 8 en condiciones que promueven la expresión de TRAIL, y que recuperan el polipéptido de TRAIL.

10. Polipéptido de TRAIL purificado que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos en un 80% a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los aminoácidos 1 a 281 de la SEQ. ID NO: 2 y los aminoácidos 1 a 291 de la SEQ. ID NO: 6, en el que dicho polipéptido de TRAIL puede inducir la apoptosis de células Jurkat.

11. Polipéptido de TRAIL purificado según la reivindicación 10, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los aminoácidos 1 a 281 de la SEQ. ID NO: 2 y los aminoácidos 1 a 291 de la SEQ. ID NO: 6.

12. Polipéptido de TRAIL humano codificado por el inserto de ADN del vector recombinante depositado en la cepa ATCC 69849.

\newpage

13. Polipéptido de TRAIL soluble purificado que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos en un 80% a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:

(a)

el dominio extracelular de TRAIL humano de la SEQ. ID NO: 2;

(b)

el dominio extracelular de TRAIL murino de la SEQ. ID NO: 6;

(c)

un fragmento del dominio extracelular de (a) o (b) en el que el fragmento puede inducir la apoptosis de células Jurkat;

en el que dicho polipéptido de TRAIL soluble puede inducir la apoptosis de células Jurkat.

14. Polipéptido de TRAIL según la reivindicación 13, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a)

el dominio extracelular de TRAIL humano (aminoácidos 39 a 281 de la SEQ. ID NO: 2); y

(b)

un fragmento de dicho dominio extracelular, en el que dicho fragmento puede inducir la apoptosis de células Jurkat.

15. Polipéptido de TRAIL según la reivindicación 14, que comprende la secuencia de aminoácidos x a 281 de la SEQ. ID NO:2, en la que x representa un número entero de desde 39 hasta 95.

16. Polipéptido de TRAIL según la reivindicación 15, que comprende los aminoácidos 95 a 281 de la SEQ. ID NO:2.

17. Polipéptido de TRAIL según la reivindicación 13, en el que dicho polipéptido de TRAIL soluble comprende una(s) sustitución(ones) conservativa(s) en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a)

el dominio extracelular de TRAIL humano (aminoácidos 39 a 281 de la SEQ. ID NO:2) en el que el dominio extracelular puede inducir la apoptosis de células Jurkat; y

(b)

un fragmento de dicho dominio extracelular, en el que el fragmento puede inducir la apoptosis de células Jurkat;

en el que TRAIL sustituido de manera conservativa puede inducir la apoptosis de células de Jurkat.

18. Oligómero que comprende desde dos hasta tres polipéptidos de TRAIL solubles según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17.

19. Trímero de TRAIL que comprende tres polipéptidos de TRAIL solubles según la reivindicación 16.

20. Anticuerpo que es inmunorreactivo con un polipéptido de TRAIL según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17; o un fragmento de unión de antígenos de dicho anticuerpo.

21. Anticuerpo según la reivindicación 20, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

22. Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 21, en el que dicho anticuerpo es específico para el polipéptido de TRAIL humano de la SEQ. ID NO: 2 o el polipéptido de TRAIL murino de la SEQ. ID NO:6.

23. ADN aislado que codifica para un polipéptido de TRAIL, en el que dicho polipéptido de TRAIL es un fragmento de la proteína TRAIL humana de la SEQ. ID NO: 2 o un fragmento de la proteína TRAIL murina de la SEQ. ID NO: 6, en el que dicho fragmento puede inducir la apoptosis de células Jurkat.

24. Polipéptido de TRAIL purificado, en el que dicho polipéptido de TRAIL es un fragmento de la proteína TRAIL humana de la SEQ. ID NO: 2 o un fragmento de la proteína TRAIL murina de la SEQ. ID NO: 6, en el que dicho fragmento puede inducir la apoptosis de células Jurkat.

25. Proteína de fusión que comprende un polipéptido de TRAIL según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17 ó 24, fusionada a un polipéptido heterólogo.

26. Proteína de fusión según la reivindicación 25, en la que dicho polipéptido heterólogo promueve la oligomerización.

27. Oligómero según la reivindicación 18, que comprende tres polipéptidos de TRAIL solubles.

28. Composición que comprende un polipéptido de TRAIL, oligómero o proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 19 ó 24 a 27, y un vehículo, diluyente o excipiente fisiológicamente aceptable.

29. Composición que comprende un oligómero según la reivindicación 27, y un vehículo, diluyente o excipiente fisiológicamente aceptable.

30. Polipéptido de TRAIL, oligómero o proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 19 ó 24 a 27, para su uso en medicina humana.

31. Polipéptido de TRAIL, oligómero o proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 19 ó 24 a 27, para su uso en la inducción de la apoptosis de células diana.

32. Polipéptido de TRAIL, oligómero o proteína de fusión según la reivindicación 31, en el/la que dichas células diana son células cancerosas.

33. Polipéptido de TRAIL, oligómero o proteína de fusión según la reivindicación 31, en el/la que dichas células diana son células infectadas de forma viral.

34. Polipéptido de TRAIL, oligómero o proteína de fusión, según la reivindicación 32 ó 33, en el/la que dicho oligómero es un trímero.

35. Anticuerpo según la reivindicación 20, 21 ó 22 para su uso en medicina humana.

36. Anticuerpo según la reivindicación 20, 21 ó 22 para su uso en la inhibición de una actividad biológica de un polipéptido de TRAIL.