JP4868731B2 - 哺乳動物培養細胞由来の無細胞タンパク質合成システム - Google Patents
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Description
本発明の方法において、「無細胞タンパク質合成系」とは、タンパク質の翻訳に必要なタンパク質因子を細胞抽出液として取り出し、試験管内でこの反応を再構成することで目的とするタンパク質を合成させる系である。さまざまな生物種に由来する抽出液を利用して無細胞系を構成することができ、例えば、大腸菌や好熱性細菌等の細菌、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球、マウスL−細胞、エールリッヒ腹水癌細胞、HeLa細胞、CHO細胞及び出芽酵母等の、高いタンパク質合成活性の状態の真核細胞、及び原核細胞の抽出液を用いることができる(Clemens, M.J., Transcription and Translation - A Practical Approach, (1984), pp. 231-270, Henes, B.D. et al. eds., IRL Press, Oxford)。
本発明の無細胞タンパク質合成系は、真核生物細胞である哺乳動物培養細胞の抽出液と、鋳型mRNAとを含み、さらに真核生物の翻訳開始因子及び/又は翻訳制御因子(以下「翻訳開始因子等(eIF等)」という。)が添加される。1つの実施形態において、上記無細胞タンパク質合成系に添加される翻訳開始因子等は、翻訳開始因子eIF2、eIF2B、及びeIF4E、並びに翻訳制御因子p97からなる群より選択される少なくとも1種である。eIF2は、開始tRNAを40Sリボソームサブユニットへ運搬するヘテロ三量体のGTP結合タンパク質である。ヒトeIF2の3つのサブユニットα:36kDa、β:38kDa、及びγ:52kDaをコードするmRNAの塩基配列はGenBankのデータベースにそれぞれAccession No. NM_004094, NM_003908, 及びNM_001415として登録されている。
本発明の方法に用いる鋳型mRNAは、発現したい所望のタンパク質をコードするものであれば特に限定されないが、細胞から直接mRNAを単離するか、前記タンパク質をコードするDNAをRNAポリメラーゼプロモータを有するベクターにクローン化してインビトロ転写反応を行うことにより合成することができる。ファージポリメラーゼプロモータの後ろにクローン化されたDNAのインビトロ転写方法が知られている(Krieq, P. and Melton, D., Nucl. Acids Res., Vol.12, p.7057, 1984)。この方法は、発現したい遺伝子を、SP6、T7、及びT3RNAポリメラーゼのいずれか1つのプロモーターを有するベクターにクローン化する。次いで、このベクターのクローン化された遺伝子の3’末端で制限酵素を使用して線状化され、インビトロ転写反応によってmRNAへの転写を行う。SP6、T7及びT3RNAポリメラーゼプロモータを有する多数のベクターは市販されており、容易に入手可能である。このようにして合成した鋳型mRNAは、5’末端にキャップ構造を有するか、又は有しないもののいずれでもよい。5’末端にキャップを付加する場合は、キャップアナログと呼ばれるキャップ類似体を基質にして、RNAポリメラーゼの酵素反応でキャップを持ったmRNAを合成することができる。
本発明の方法に用いる哺乳動物の抽出液は、哺乳動物細胞を培養し、これを回収して破砕することにより抽出液を調製する。哺乳動物細胞としては特に制限されないが、タンパク質合成活性の高い細胞が好ましく、例えば、マウスL−細胞、エールリッヒ腹水癌細胞、HeLa細胞、CHO細胞などを用いることができる。HeLaS3細胞はHeLa細胞から派生した浮遊細胞であり、細胞培養が容易であり増殖しやすいため特に好ましい。また、培養した細胞は、例えばホモジナイザー等の公知の方法を用いて機械的に破砕することができる。抽出液はミクロコッカスヌクレアーゼ及びCaCl2処理して内因性mRNAを破壊し、その結果バックグラウンド翻訳を減少させて最小にする。次いで、EGTAを加えてCaCl2をキレートさせ、それによってヌクレアーゼを不活化する。
[細胞培養]
シャーレを用いたHeLaS3細胞の培養は、炭酸ガスインキュベーター(CO2濃度5%、37℃)内にて行った。培地は、イーグルMEM培地(SIGMA社製)に、加熱処理を施した10%子ウシ血清(ICN Biomedicals、Inc)、2mMのL−グルタミン溶液、1ユニット/mlペニシリン、0.1mg/mlストレプトマイシンを添加したものを用いた。
細胞濃度が1.0〜1.5×106個/mlに達した時点で、培養液中のHeLaS3細胞を360×g、4℃、10分間の遠心によって回収した。培地は、アスピレーターを用いて除き、培養液1L分から得られた細胞に対して80mlの緩衝液(35mMのHEPES−KOH(25℃でのpH7.5)、140mMのNaCl、11mMグルコース)で軽く懸濁した後、2本の50mlチューブに移し替え、360×g、4℃、5分間の遠心を行った。この操作を3回繰り返した後、細胞容積の1.5倍量の抽出buffer(20mMのHEPES−KOH(25℃でのpH7.5)、135mM酢酸カリウム、30mMのKCl、1.65mM酢酸マグネシウム)を加え、細胞濃度が約2.5×108個/mlになるように懸濁したものをMini-Bomb cell disruption chamber (KONTES)に封入した。細胞の破砕は、窒素ガス圧1.0Mpa、氷中にて静置した状態で行った。30分後、アウトレットポートをゆっくりと開口し、流速約3〜10滴/秒にて細胞破砕液を回収した。得られた細胞破砕液は、10,000×g、4℃、5分間の遠心を2回繰り返し、沈澱画分を除いたもの(2〜2.5ml)を、予め25mlの抽出bufferにて平衡化しておいたPD−10カラム(Amersham)へ添加した。自然落下にてサンプルをカラム内に入り込ませた後、さらに抽出bufferを添加し、カラム下から落下している溶液が透明から乳白色に変わった時点で、約1.7〜2.0mlまで採取したものを細胞抽出液とした。得られた抽出液は均等に小分けし、液体窒素で瞬間凍結後、マイナス80℃にて保存した。
ルシフェラーゼをコードするmRNA、cap−Luc−poly−A及びLuc−poly−Aを合成するために、まず、ルシフェラーゼcDNAをプラスミドpSP72(プロメガ社)のT7RNAポリメラーゼプロモータの下流に挿入したプラスミドpSP72−Lucを作製し、続いて、ルシフェラーゼ遺伝子の下流にポリAストレッチ(85個のデオキシアデニン)を挿入してプラスミドpSP72−LUC−Aを作製した(前掲の非特許文献4参照)。また、EMCVのIRESを有するmRNA、EMCV−Luc−poly−Aを合成するためには、プラスミドpSP72−EMCV−Luc−A(前掲の非特許文献5参照)を用いた。このプラスミドは、pGemCAT−EMCV−LUC(Pause et al., Nature 371, 762-767参照)を鋳型とし、PCRにより増幅したEMCVゲノムの281〜848番目のヌクレオチドからなるDNA断片を、プラスミドpSP72−LUC−AのT7プロモータとルシフェラーゼ遺伝子の間にクローン化することにより作製した。各プラスミドの構造を概略的に図1に表わした。
ルシフェラーゼをコードする各mRNAの翻訳反応を行う前に、抽出液に含まれている内因性のRNAの分解と除去を行った。方法については以下の通りである。抽出液100μl(タンパク質濃度14〜18mg/ml)に対し、1μlの7500ユニット/mlヌクレアーゼS7、100mMのCaCl2を添加し、5分間、20℃の処理を施した後、8μlの30mMのEGTAを加え反応を停止した。次にその抽出液110μlへ、エネルギーミックス溶液(184mMのHEPES−KOH(pH7.5)、13.2mMのATP、1.32mMのGTP、198mMクレアチンリン酸、3.3mMスペルミジン、13.2mM酢酸マグネシウム)を16.4μl、3.3mMアミノ酸溶液(20種)を1.64μl、3.3mg/ml牛肝臓由来t−RNAを4.92μl、6.0mg/mlのクレアチンリン酸キナーゼを1.8μlを加え混合液を調製した。さらに混合液を透析チャンバー(MWCO 50kDa、再生セルロース製)へ充填し、4.9mlの外部液(エネルギーミックス溶液600μl、3.3mMアミノ酸溶液(20種)60μl、抽出buffer3.5ml、100mM酢酸マグネシウム21μl、400mMのEGTA27μlを含む)に対し1.5〜6時間の透析を32℃にて行った。なお、外部液の酢酸カリウム濃度は、目的に応じて変更した。
上記実施例において翻訳増強効果のあったeIF等の調製は以下のとおりである。各々の最終標本のタンパク質濃度はBradford法によりBSAを標準物質に用いて定量した。また、SDS−PAGEの後、クーマシーブルー染色によって他のタンパク質が混入していない事を確認した。
HeLa細胞(ヒト)またはKrebs細胞(マウス)より内因性eIF2を精製して用いた(Trachsel et.al. (1979) Biochim. Bicphys. Acta 561:484-490参照)。
(1)eIF2BのcDNA、発現プラスミド、及び形質転換バキュロウイルスの作製:
各々のcDNAは逆転写PCR(RT−PCR)により得た。RT−PCR用のRNAはHeLa細胞より得た。eIF2B1(GenBank accession number: NM_001414)、eIF2B2(同NM_014239)、eIF2B3(同NM_020365)、eIF2B4(同Q9UI10)、eIF2B5(同XM_291076)に対応するプライマーDNAは各々GeneBankに登録されたシークエンスを参考にした。得られたすべてのcDNAは塩基配列の決定を行い、登録されている配列と一致していることを確認した。精製を容易にするためeIF2B3のC−末端にFLAG配列を、eIF2B4のN−末端に6×His配列を付加した。これらのcDNAをバキュロウイルス作製用のプラスミドpAcDB3(PharMingen)に挿入し、pAcDB3−2B1−2B2−His2B4、及びpAcDB3−2B3−FLAG−2B5を作製した。これらの作製したプラスミドとバキュロウイルスDNA BaculoGold(PharMingen)を昆虫細胞Sf9に同時導入させた。正しく組み換えを起こしたウイルスを選び出し、Baculo−2B1−2B2−his−2B4ウイルスとBaculo−2B3−FLAG−2B5ウイルスを増幅した。前者のウイルスはeIF2B1、eIF2B2そしてHis−eIF2B4を同時に発現するウイルスであり、後者はeIF2B3−FLAGと、eIF2B5を同時に発現するウイルスである。
マウスeIF4EcDNA(Jaramillo et.al. (1991) J.Biol.Chem. 266:10446-10451)をpGEX−6P(アマーシャム社)に挿入し、pGEX−6P−eIF4Eを作製した。pGEX−6P−eIF4Eを大腸菌BL21(DE−3)(pLys)に導入し、600nmにおける吸光度が0.5から0.9に至るまで2LのLuria broth(LB)にて培養した。IPTGを(最終濃度0.1mM)加え、30℃にて12から16時間培養を行うことによりGST−eIF4Eの発現誘導を行った。このバクテリアを遠心によって回収し、一度、バッファー(0.15MのNaCl、20mMのTris)(50ml)にて洗浄した後、バッファー(0.1MのKCl、20mMのHEPES、pH7.5、10%グリセロール、1mMのDTT、0.1%TritonX−100、プロテナーゼ阻害剤「Complete, Roche」)(50ml)に懸濁した。超音波処理によって細胞を破壊した後、超遠心30,000rpm(Beckman 70Ti roter)(1時間)にて不溶性画分を除いた。上澄み液をGlutathione Sepharose 4B レジン(アマーシャム社)(0.5ml)と混合し、4℃にて一時間混和した。この混合液を空のカラムに流し込み、更にバッファー(0.1MのKCl、20mMのHEPES、pH7.5、10%グリセロール、1mMのDTT、0.1%TritonX−100、1mMのEDTA)(30ml)にて洗うことにより非結合タンパク質を除いた。この段階では、GST−eIF4Eがレジンに結合した状態であると考えられる。上のバッファー(0.5ml)にPreScission Protease (12 unit) (アマーシャム社)加え、レジンと混合し、4℃にて一晩混和することによりGST−eIF4EのGSTとeIF4Eの間を切断した。レジンから離れたeIF4Eを回収し、再度Glutathione Sepharose 4B レジン(0.3ml)に通すことにより、完全にGST−eIF4EとGSTを除いた。得られたeIF4E標本をさらに精製するため、バッファーのpHを7.0にした後SP-Sepharose(0.3ml)(ファルマシア)に結合させた。バッファー(0.1MのKCl、20mMのHEPES、pH7.0、10%グリセロール、5mMの2−メルカプトエタノール、0.1mMのEDTA)(10ml)にて洗った後、0.3MのKClの同バッファーにてeIF4Eを溶出した。
p97のcDNA(Imataka et.al. (1997) EMBO J 17:6940-6947)のC−末端にFLAG配列を付加し、pGEX−6Pに挿入し、pGEX−6P−p97−FLAGを作製した。GST−p97−FLAGをGST−eIF4Eと同様に発現させた。超遠心の後の上澄み液をHeparin Sepharose CL-6B (0.5ml)(アマーシャム社)と混合し、4℃にて一時間混和した。非結合タンパク質をGST−eIF4E/Glutathione Sepharose 4Bの場合と同様に洗い流し、結合したタンパク質をバッファー(0.5MのKCl、20mMのHEPES、pH7.5、10%グリセロール、1mMのDTT、0.1%のTritonX−100、1mMのEDTA)(3ml)にて溶出した。溶出液をGlutathione Sepharose4Bレジン(0.5ml)と混合し、eIF4Eの場合と同様の処置をすることにより、p97−FLAGを得た。さらに、eIF2Bの場合と同様にanti-FLAG-resinを用いて精製を完全にした。
Claims (11)
- 哺乳動物の培養細胞から調製された抽出液に、非キャップ付加mRNAと、翻訳開始因子2(eIF2)、及び翻訳開始因子2B(eIF2B)からなる群より選択される少なくとも1つ以上の真核生物の翻訳開始因子とを添加することを特徴とする無細胞タンパク質合成系によるタンパク質の製造方法。
- 前記非キャップ付加mRNAにウイルス核酸由来のリボソーム侵入部位(IRES)を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 120mMから240mMのカリウムイオンを含むことを特徴とする請求項2に記載の方法。
- 哺乳動物の培養細胞から調製された抽出液に、非キャップ付加mRNAと、真核生物の翻訳開始因子2(eIF2)、及び2B(eIF2B)、並びに真核生物の翻訳制御因子p97を添加することを特徴とする無細胞タンパク質合成系によるタンパク質の製造方法。
- 前記哺乳動物の培養細胞が、ヒト培養細胞である請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ヒト培養細胞が、HeLaS3培養細胞である請求項5に記載の方法。
- 哺乳動物培養細胞の抽出液と、
非キャップ付加mRNAと、
真核生物の翻訳開始因子2(eIF2)及び翻訳開始因子2B(eIF2B)を含むことを特徴とする無細胞タンパク質合成のための組成物。 - さらに真核生物の翻訳制御因子p97を含むことを特徴とする請求項7に記載の組成物。
- 前記哺乳動物培養細胞が、ヒト培養細胞である請求項7又は8に記載の組成物。
- 前記ヒト培養細胞が、HeLaS3培養細胞である請求項9に記載の組成物。
- 前記非キャップ付加mRNAがウィルス核酸由来のリボソーム侵入部位(IRES)を含み、さらに120mMから240mMのカリウムイオンを含むことを特徴とする請求項7に記載の組成物。
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