ES2225132T3 - Anticuerpos especificos y fragmentos de anticuerpos para tgfbeta1. - Google Patents

Abstract

Miembro de unión específica aislado capaz de unir el TGFbeta1, en donde dicho miembro de unión específica comprende un dominio de unión a antígeno que comprende un CDR3 de VH con una secuencia de aminoácidos sustancialmente tal como se dispone en el CDR3 del VH del SL15, identificado por la SEC. Nº ID.: 13, o el CDR3 del VH del JT182, identificado por la SEC. Nº ID.: 15.

Description

Anticuerpos específicos y fragmentos de anticuerpo para TGF\beta_{1}.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a miembros de unión específica, particularmente a anticuerpos y fragmentos de los mismos, los cuales se unen al factor de crecimiento transformante 1 (TGF\beta_{1}). Más particularmente, la invención se refiere a miembros de unión específica que incluyen el CDR3 de la VH del anticuerpo SL15 (el anticuerpo anteriormente conocido como Kylie), especialmente el dominio VH del SL15, el cual podría estar en combinación con los dominios SL15A o SL15S. Más aún, la invención se refiere al uso de tales miembros de unión específica en preparaciones farmacéuticas, particularmente para el tratamiento de la enfermedad fibrótica, la modulación de la curación de las heridas, y el tratamiento del cáncer.

Antecedentes de la invención

La PCT/GB89/02.450 publicada como WO97/13.844 descubre el aislamiento de anticuerpos humanos específicos para el TGF\beta_{1}, y anticuerpos humanos específicos para el TGF\beta_{2}. Describe anticuerpos con el dominio VH de 31G9 y variantes del dominio. Más específicamente, la solicitud describía el anticuerpo CS37 que comprende el dominio VH del 31G9 junto con el dominio VL del CS37 y variantes de este dominio, incluyendo anticuerpos que:

(i)

compiten en ELISA con el CS37 por la unión al TGF\beta_{1},

(ii)

unen el TGF\beta_{1} preferentemente con relación al TGF\beta_{3}, y

(iii)

neutralizan el TGF\beta_{1}.

Descubrimiento de la invención

La presente invención se basa en la identificación de anticuerpos que están relacionados con el CS73, pero que tienen propiedades ventajosas inesperadas en relación a la unión y neutralización del TGF\beta_{1}. Éstos no se unen a, o neutralizan, el TGF\beta_{2} o el TGF\beta_{3}.

Los anticuerpos de la presente invención neutralizan intensamente el TGF\beta_{1} activo. El epítopo para estos anticuerpos se halla en la región C-terminal del TGF\beta_{1} (residuos 83-112) e incluye el bucle formado por los residuos 92-98 del TGF\beta_{1}, también conocido como dedo 2, una región que se ha identificado que interacciona con el receptor del TGF\beta_{1}. Los anticuerpos unen preferentemente el TGF\beta_{1} activo con respecto al TGF\beta_{1} latente.

También se descubren en ésta variantes del SL15S que neutralizan intensamente el TGF\beta_{1}. Estas varían principalmente por sustituciones de aminoácidos en el CDR3 de los dominios VH o VL. Sin embargo, hay otros sitios en los que podrían hacerse sustituciones, por ejemplo, en el residuo 25 en la cadena ligera podría sustituirse una alanina, generándose el anticuerpo de IgG4, IgG4 SL15A, CAT-192. Podrían hacerse varias sustituciones que son compatibles con la retención de la intensa actividad neutralizante. Los anticuerpos de esta invención serán particularmente útiles para el tratamiento de las enfermedades fibróticas, por ejemplo, la fibrosis pulmonar, la modulación de la respuesta de cicatrización, por ejemplo, en la curación de heridas y en la cicatrización corneal, y en otros contextos discutidos con más detalle más abajo, tales como el tratamiento de tumores.

Las proteínas unidoras específicas, tales como los anticuerpos, que se basan en las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de los ventajosos dominios VH y VL de anticuerpo identificados en ésta, particularmente las regiones CDR3, serán útiles para los propósitos discutidos, y representan aspectos de la presente invención.

Las realizaciones más preferidas de la presente invención, en sus diversos aspectos, se basan en el CDR3 de VH del dominio VH del SL15 identificado en ésta, dominios VH que incluyen el CDR3 del VH del SL15, especialmente el mismo dominio VH del SL15, y emparejamientos de tales dominios VH con dominios VL, especialmente los dominios VL del SL15A y SL15S, u otros dominios VL que comprenden el CDR3 del VL del SL15. El dominio unidor de antígeno del SL15 (en cualquier formato, por ejemplo, scFv o IgG4) consiste en el VH del SL15 y, en dos variantes, bien el VL del SL15A (CS37) o el VL del SL15S (CS37 con A25S). En cualquiera de las dos variantes, el SL15 es el anticuerpo anteriormente conocido como Kylie. El scFv del SL15S es conocido también como CAT-191; la IgG4 de SL15A es también conocida como CAT-192; y la IgG54 de SL15S es también conocida como CAT-193.

Otras realizaciones de la invención en sus varios aspectos se basan en el CDR3 del VH del JT182, dominios VH que incluyen el CDR3 del JT182, especialmente el dominio VH del JT182, y emparejamientos de tales dominios VH con dominios VL, especialmente el dominio VL del CS37. El JT182 no es tan efectivo como el SL15, pero todavía tiene inesperadas propiedades mejoradas respecto el CS37.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un miembro de unión específica aislado capaz de unir el TGF\beta_{1}, en donde dicho miembro de unión específica comprende un dominio unidor de antígeno que comprende un CDR3 de VH con una secuencia de aminoácido sustancialmente tal como se dispone para el CDR3 del VH del SL15 o JT182 en la Tabla 1 o Tabla 2.

TABLA 1 CDR3 de Clones anti-TGFb1 y Potencias Relativas de los scFV

1

Los residuos que difieren entre los fragmentos de scFv están subrayados.

La invención proporciona además dicho miembro de unión específica aislado, el cual comprende además un CDR1 de VH o CDR2 de VH con secuencias de aminoácidos sustancialmente tal como se dispone en uno o ambos del CDR1 del VH y CDR2 del VH del VH del CS37, preferiblemente ambos (Tabla 2).

TABLA 2 Secuencias de CDR de los CDR del CS37, SL15 y JT182

2

En una realización preferida, los dominios de unión están portados por una estructura de anticuerpo humano. Un ejemplo preferido de una realización tal es un dominio VH con una secuencia de aminoácidos sustancialmente tal como la dispuesta en el dominio VH del JT182, la secuencia del cual se detalla en la SEC. Nº ID.: 10. Un realización aún más preferida es un dominio VH con una secuencia de aminoácidos sustancialmente tal como la dispuesta en el dominio VH del SL15, la secuencia del cual se detalla en la SEC. Nº ID.: 4.

En un segundo aspecto, la invención proporciona un miembro de unión específica aislado capaz de unir el TGF\beta_{1}, en donde dicho miembro de unión específica comprende un dominio unidor de antígeno que comprende un dominio VL con una secuencia de aminoácidos sustancialmente tal como la dispuesta en el dominio VL del SL15S, la secuencias del cual se detalla en la SEC. Nº ID.: 8.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un miembro de unión específica capaz de unir el TGF\beta_{1}, que comprende un dominio VH tal como se dispuso más arriba en relación al primer aspecto, y un dominio VL, en donde, preferiblemente, el dominio VL tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente tal como la dispuesta en el dominio VL del CS37 (SL15A), la secuencias del cual se detalla en la SEC. Nº ID.: 6, o el VL del SL15S, la secuencias del cual se detalla en la SEC. Nº ID.: 8.

En una realización particularmente preferida, la invención proporciona un miembro de unión específica que comprende el dominio VL del CS37 y un dominio VH seleccionado de entre el VH del JT182 y el VH del SL15, más preferiblemente el VH del SL15. En una realización aún más particularmente preferida, la invención proporciona un miembro de unión específica que comprende el VH del SL15 y el VL del SL15A (VL del CS37) o el VL del SL15S.

Las realizaciones preferidas de la invención proporcionan miembros de unión específica que comprenden el dominio VH de JT182 o VH de SL15, en los cuales se han realizado 1, 2, 3, 4 ó 5 sustituciones de aminoácidos en un CDR, por ejemplo, el CDR3, y/o el FR, cuyos miembros de unión específica retienen la capacidad de unir el TGF\beta_{1}. Otras realizaciones preferidas adicionales proporcionan miembros de unión específica que comprenden el VL del SL15A (CS37) o el VL del SL15S, o el dominio VL del SL15S (CS37) o el VL del SL15A en los cuales se han realizado 1, 2, 3, 4 ó 5 sustituciones de aminoácidos en un CDR, por ejemplo, el CDR3, y/o FR, cuyos miembros de unión específica retienen la capacidad de unir el TGF\beta_{1}. Tales sustituciones de aminoácidos son generalmente "conservadoras", por ejemplo, sustituciones de un residuo hidrofóbico tal como la isoleucina, valina, leucina o metionina por otro, o la sustitución de un residuo polar por otro, tal como arginina por lisina, ácido glutámico por aspártico, o glutamina por asparagina. En ciertas posiciones también son permisibles las sustituciones no conservadoras.

Tales miembros de unión específica son también capaces de unir el TGF\beta_{1}. Las realizaciones preferidas carecen de reactividad cruzada significativa con el TGF\beta_{2} y/o TGF\beta_{3}, preferiblemente con el TGF\beta_{1} y TGF\beta_{3}.

Las realizaciones preferidas neutralizan fuertemente el TGF\beta_{1}, y tienen una potencia de al menos 5 veces mejor que la del CS37, más preferiblemente aproximadamente 10 veces, 15 veces, 20 veces, 50 veces, 75 veces, 100 veces o 150 veces mejor, en un ensayo con radioreceptor (Lucas, C. et al., Meth. Enzymology 198:303-316 (1991)). La potencia se mide con el anticuerpo bajo estudio y con el CS37 en formatos moleculares equivalentes, por ejemplo, como anticuerpos monovalentes (scFv o Fab) o como anticuerpos bivalentes (IgG1 o IgG4).

Las realizaciones preferidas unen el TGF\beta_{1} activo con preferencia respecto al TGF\beta_{1} latente.

Las variantes de los dominios VH y VL y de los CDR de los que están formados estas secuencias en ésta, y las cuales pueden emplearse en miembros de unión específica para el TGF\beta_{1}, pueden obtenerse por medio de procedimientos de alteración de la secuencia o mutación y búsqueda. Tales procedimientos también se proporcionan en la presente invención.

Además de las secuencias de anticuerpos, el miembro de unión específica también podría comprender otros aminoácidos, por ejemplo, formando un péptido o polipéptido, tales como un dominio plegado, o para conferir a la molécula otra característica funcional aparte de su capacidad de unir el antígeno. Los miembros de unión específica de la invención podrían ser portadores de una marca detectable, o podrían estar conjugados a una toxina o enzima (por ejemplo, a través de un enlace peptidilio o de un engarce).

En aspectos adicionales, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un miembro de unión específica tal como se ha definido más arriba, y procedimientos para preparar miembros de unión específica de la invención, los cuales comprenden la expresión de dichos ácidos nucleicos en condiciones que permiten la expresión de dicho miembro de unión y la recuperación del miembro de unión.

Los miembros de unión específica acordes con la invención podrían usarse en un procedimiento de tratamiento o diagnosis del cuerpo humano o animal, tal como un procedimiento de tratamiento (el cual podría incluir el tratamiento profiláctico) de una enfermedad o alteración en un paciente humano, el cual comprende administrar a dicho paciente una cantidad efectiva de un miembro de unión específica de la invención. Las condiciones tratables de acuerdo con la presente invención se describen más abajo.

Estos y otros aspectos de la invención se describen más abajo con mayor detalle.

Todos los documentos mencionados en ésta se incorporan por referencia. Las secuencias descritas en ésta se muestran y se denominan en la notación convencional de 5' a 3' y N a C respectivamente para las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos, a menos que se indique específicamente lo contrario.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Neutralización del TGF\beta_{1} pero no del TGF\beta_{2} o \beta_{3} por parte del scFv del SL15S en un ensayo de proliferación usando células TF1. Se muestra que la neutralización por parte del mAb de Genzyme (Mab 1D.11.16, cuadrados) o del scFv del SL15S (rombos) del TGF\beta_{1}, \beta_{2} o \beta_{3} indujo la inhibición de la proliferación de TF1.

Figura 2: Inhibición de la unión del [^{125}I]TGF\beta_{1} a células A594 mediante scFv anti-TGF\beta_{1}. Las preparaciones de scFv de SL15S, JT183 y CS37 se valoraron 2 veces y se ensayaron por su capacidad para inhibir la unión del
[^{125}I]TGF\beta_{1} a células A594. El SL15S y el JT183 se usaron como his-preps, el CS37 se purificó mediante FPLC.

Figura 3: Inhibición de la unión del [^{125}I]TGF\beta_{1} a células A594 mediante anticuerpos anti-TGF\beta_{1}. El scFv de SL15S, la IgG4 de SL15S y la IgG4 de SL15A se compararon con el mAb de Genzyme por su capacidad para inhibir la unión del [^{125}I]TGF\beta_{1} a células A594. Los datos son el promedio de 3 experimentos, usando una serie de dilución de tres veces.

Figura 4: Inhibición de la unión del [^{125}I]TGF\beta_{1} a células A594 por parte del scFv en presencia de TGF\beta_{1} latente. Se ensayaron el scFv del SL15S y la IgG4 del SL15A por su capacidad para inhibir la unión del [^{125}I]TGF\beta_{1} a células A594. Para investigar si el SL15S reconocía el TGF\beta_{1} latente, el experimento estándar se realizó en presencia 0,1 nM de TGF\beta_{1} latente, TGF\beta_{1} activo, o TGF\beta_{1} latente activado con ácido. Los datos se expresan como % del máximo para cada conjunto de condiciones.

Figura 5: Neutralización de la inhibición de la proliferación de células TF1 inducida por el TGF\beta_{1} mediante scFv e IgG en presencia de TGF\beta_{1} latente. La capacidad del scFv del SL15S o de la IgG4 del SL15A apra neutralizar la inhibición del crecimiento inducida por el TGF\beta_{1} latente, el TGF\beta_{1} activo, o el TGF\beta_{1} latente activado con ácido, se comparó en el ensayo con TF1. En (a) se compararon diversas concentraciones de formatos de TGF\beta_{1}, mientras que en (b) se compararon el scFv y la IgG4 frente a 20 mM de formatos del TGF\beta_{1}. Los datos se expresan como % del control (crecimiento en ausencia de TGF\beta_{1}). La inhibición inducida por el TGF\beta_{1} se debe a la pequeña cantidad de TGF\beta_{1} activo presente en la preparación latente.

Figura 6: Inhibición de la unión del scFv del CS37 exhibido sobre fagos al TGF\beta_{1} usando TFG\beta quiméricos. La unión del scFv del CS37 exhibido sobre fagos al TGF\beta_{1} se ensayó mediante ELISA en presencia de: la isoforma TGF\beta_{1} (TGF\beta_{1}); la isoforma TGF\beta_{2} (TGF\beta_{2}); TGF\beta_{1}/\beta_{2} (83-112) (1-1-2); TGF\beta_{2}/\beta_{1} 83-112 (2-2-1); TGF\beta_{1}-\beta_{2} (40-112) (1-2-2); o TGF\beta_{2}-\beta_{1} (92-98).

Figura 7: Inhibición de la unión del SL15S (scFv del Kylie) exhibido sobre fagos al TGF\beta_{1} usando TFG\beta quiméricos. La unión del scFv del SL15S (Kylie) exhibido sobre fagos al TGF\beta_{1} se ensayó mediante ELISA en presencia de: la isoforma TGF\beta_{1} (TGF\beta_{1}); la isoforma TGF\beta_{2} (TGF\beta_{2}); TGF\beta_{1}/\beta_{2} (83-112) (1-1-2); TGF\beta_{2}/\beta_{1} 83-112 (2-2-1); TGF\beta_{1}-\beta_{2} (40-112) (1-2-2); o TGF\beta_{2}-\beta_{1} (92-98) (92-98).

Figura 8: El efecto del CAT192 sobre la re-epitelización corneal se investigó a continuación de una herida excisional con trépano de la córnea bovina aislada en el modelo de cultivo de órganos con interfaz aérea. Las córneas bovinas se trataron, bien con 100 \mul de Medio 199 libre de suero (control), o con medio que contenía el vehículo (para el anticuerpo y TGF\beta_{1}). Inmediatamente después de la herida se administraron anticuerpos nulos del mismo isotipo (10 \mug), TGF\beta_{1} (1 ng), o CAT192 (10 \mug), y a intervalos de 12 horas a partir de entonces. El CAT192 causó un incremento significativo en la velocidad de re-epitelización de la córnea bovina herida, mientras que el TGF\beta_{1} causó una disminución significativa en esta variable. Los datos se expresan como porcentaje de re-epitelización de la herida corneal. Cada punto representa el valor medio y las barras verticales muestran el error estándar de la media de 8 córneas por punto. El efecto de los diferentes tratamientos se comparó en cada instante usando el ANOVA de medidas repetidas con el test de Bonferroni. * P < 0,01 en comparación con el grupo de tratamiento con anticuerpo nulo; t P < 0,01 en comparación con el grupo tratado con el vehículo.

Figura 9: El efecto del CAT192 sobre la re-epitelización corneal se investigó a continuación de una herida por excisión con trépano de la córnea bovina aislada en el modelo de cultivo de órganos con interfaz aérea. El CAT192 (0,001-10 \mug) se administró inmediatamente después de la herida, y a intervalos de 12 horas a partir de entonces. El CAT192 causó un incremento relacionado con la dosis significativo en re-epitelización de la córnea bovina herida. El EC50 para el CAT192 estuvo entre 0,01 y 0,1 \mug. Los datos se expresan como porcentaje de cambio en la re-epitelización del grupo control tratado con vehículo. Las líneas de puntos muestran el error estándar de la media del grupo control con vehículo. Cada punto representa el valor medio, y las barras verticales muestra el error estándar de la media de 6 córneas por punto. El efecto de las diferentes dosis de CAT192 se comparó con el tratamiento control usando el ANOVA de una vía, y el test de Dunnet; * P \leftarrow 0,01.

Descripción detallada de la invención Terminología Miembro de unión específica

Describe un miembro de un par de moléculas que tienen especificidad de unión la una por la otra. Los miembros de un par de unión específica podrían derivarse naturalmente o producirse total o parcialmente de forma sintética. Un miembro del par de moléculas tiene un área sobre su superficie, o una cavidad, que se une específicamente a, y es por tanto complementaria de una determinada organización espacial y polar del otro miembro del par de moléculas. Por tanto, los miembros del par tienen la propiedad de unirse específicamente entre ellos. Son ejemplos de tipos de pares de unión específica: el antígeno-anticuerpo, la biotina-avidina, la hormona-receptor de la hormona, el receptor-ligando, el enzima-sustrato. Esta aplicación se refiere a reacciones del tipo antígeno-anticuerpo.

Anticuerpo

Describe una inmunoglobulina, sea natural o producida parcial o totalmente de forma sintética. El término también incluye cualquier polipéptido o proteína que tenga un dominio unidor que es, o es sustancialmente homólogo de, un dominio unidor de anticuerpo. Estos pueden derivarse a partir de fuentes naturales, o podrían producirse parcial o completamente de forma sintética. Son ejemplos de anticuerpos los isotipos de inmunoglobulinas y sus subclases isotípicas; los fragmentos que comprenden un dominio de unión de antígeno, tales como Fab, scFv, Fv, dAb, Fd; y los diacuerpos.

Es posible tomar anticuerpos monoclonales y otros anticuerpos y usar técnicas de la tecnología del ADN recombinante para producir otros anticuerpos o moléculas quiméricas que retienen la especificidad del anticuerpo original. Tales técnicas podrían implicar introducir el ADN que codifica la región variable de inmunoglobulina, o las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un anticuerpo, en las regiones constantes, o regiones constantes más regiones estructurales, de una inmunoglobulina diferente. Ver, por ejemplo, la EP-A- 184.187, la GB-2.188.638-A, o la EP-A-239.400. Podría someterse un hibridoma u otra célula que produjera un anticuerpo a mutación genética u otros cambios, los cuales podrían o no alterar la especificidad de unión de los anticuerpos producidos.

Puesto que los anticuerpos pueden modificarse de un cierto número de formas, el término "anticuerpo" debería considerarse que abarca cualquier miembro de unión específica o sustancia que tenga un dominio unidor con la especificidad requerida. Por tanto, este término abarca los fragmentos de anticuerpo, los derivados, equivalentes funcionales, y homólogos de anticuerpo, incluyendo cualquier polipéptido que comprenda un dominio unidor de inmunoglobulina, tanto si es natural o completa o parcialmente sintético. Por tanto, las moléculas quiméricas que comprenden un dominio unidor de inmunoglobulina, o equivalente, fusionado a otro polipéptido están incluidas. La clonación y expresión de anticuerpos quiméricos se describe en EP-A-0.120.694 y EP-A-0.125.023.

Se ha mostrado que los fragmentos de un anticuerpo completo pueden realizar la función de unir antígenos. Los ejemplos de fragmentos unidores son (i) el fragmento Fab consistente en dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) el fragmento Fd consistente en los dominios VH y CH1; (iii) el fragmento Fv consistente en los dominios VL y VH de un único anticuerpo; (iv) el fragmento dAb (Ward, E.S. et al., Nature 341:544-546 (1989)), el cual consiste en un dominio VH; (v) regiones CDR aisladas; (vi) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos, (vii) moléculas Fv de cadena sencilla (scFv), en donde un dominio VH y un dominio VL están unidos mediante un engarce peptídico que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de unión de antígeno (Bird, et al., Science 242:423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988)); (viii) dímeros de Fv de cadena sencilla biespecíficos (PCT/US92/09.965); y (ix) "diacuerpos", fragmentos multivalentes o multiespecíficos construidos mediante la fusión de genes (WO94/13.804; P. Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)). Las moléculas de Fv, scFv o diacuerpo podrían estabilizarse mediante la incorporación de puentes disulfuro uniendo los dominios VH y VL (Y. Reiter et al., Nature Biotech 14:1239-1245 (1996)). Los minicuerpos que comprenden un scFv unido a un dominio CH3 también podrían construirse (S. Hu et al., Cancer Res. 56:3055-3061 (1996)).

Los diacuerpos son multímeros de polipéptidos, en los que cada polipéptido comprende un primer dominio que comprende una región unidora de una cadena ligera de inmunoglobulina, y un segundo dominio que comprende una región unidora de una cadena pesada de inmunoglobulina, estando unidas las dos regiones (por ejemplo, mediante un engarce peptídico) pero siendo incapaces de asociarse entre ellas para formar un sitio de unión de antígeno: los sitios de unión de antígeno se forman mediante la asociación del primer dominio de un polipéptido dentro del multímero con el segundo dominio de otro polipéptido dentro del multímero (WO94/13.804).

Cuando deban usarse anticuerpos biespecíficos, estos podrían ser anticuerpos biespecíficos convencionales, los cuales pueden construirse de diferentes formas (Holliger, P. y Winter, G., Current Opinion Biotechnol. 4:446-449 (1993)), por ejemplo, pueden prepararse químicamente o a partir de hibridomas híbridos, o podrían se cualquiera de los fragmentos biespecíficos de anticuerpo mencionados más arriba. Podría ser preferible usar dímeros de scFv o diacuerpos en vez de anticuerpos completos. Los diacuerpos y scFv pueden construirse sin una región Fc, usando sólo dominios variables, reduciendo potencialmente los efectos de la reacción anti-idiotípica.

Los diacuerpos biespecíficos, a diferencia de los anticuerpos completos biespecíficos, también podrían ser particularmente útiles puesto que pueden construirse y expresarse fácilmente en E. coli. Los diacuerpos (y muchos otros polipéptidos tales como los fragmentos de anticuerpo) con las especificidades de unión apropiadas pueden seleccionarse fácilmente usando la exhibición sobre fagos (WO94/13.804) a partir de bibliotecas. Si un brazo del diacuerpo debe mantenerse constante, por ejemplo, con una especificidad dirigida contra el antígeno X, entonces puede construirse una biblioteca en donde el otro brazo se varía y se selecciona un anticuerpo con la especificidad apropiada. Los anticuerpos enteros biespecíficos pueden construirse mediante manipulación "knobs-into-holes" (J.B.B. Ridgeway et al., Protein Eng. 9:616-621 (1996)).

Los diacuerpos podrían construirse con un sitio unidor para el TGF\beta_{1} formado por los dominios VH y VL, tal como se descubre en esta solicitud, siendo el otro sitio de unión para el TGF\beta_{1}. El sitio de unión de TGF\beta_{2} podría formarse, por ejemplo, a partir de los dominios VH y VL del anticuerpo 6B1 (WO97/13.844).

Dominio de unión a antígeno

Describe la parte de un anticuerpo que comprende el área que se une específicamente a, y es complementaria de parte o de la totalidad de un antígeno. Cuando un antígeno es grande, un anticuerpo podría unirse sólo a una parte concreta del anticuerpo, la cual se denomina epítopo. Un dominio unidor de antígeno podría ser proporcionado por uno o más dominios variables de anticuerpo (por ejemplo, un fragmento de anticuerpo denominado Fd consistente en un dominio VH). Preferiblemente, un dominio de unión de antígeno comprende una región variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) y una región variable de cadena pesada de anticuerpo (VH).

Específico

Podría usarse para referirse a la situación en la cual un miembro de un par de unión específica no mostrará ninguna unión significativa con moléculas distintas de su(s) pareja(s) de unión específica. El término es también aplicable cuando, por ejemplo, un dominio de unión de antígeno es específico para un epítopo determinado, el cual es portado por un cierto número de antígenos, en cuyo caso el miembro de unión específica portador del dominio de unión de antígeno será capaz de unirse a los diversos antígenos portadores del epítopo.

Comprende

Se usa generalmente en el sentido de incluir, es decir, que permite la presencia de una o más características o componentes.

Aislado

Se refiere al estado en el cual los miembros de unión específica de la invención, o el ácido nucleico que codifica tales miembros de unión, estará de acuerdo con la presente invención. Los miembros y ácido nucleico estarán libres o sustancialmente libres de materiales con los que están naturalmente asociados, tales como otros polipéptidos o ácidos nucleicos con los cuales se hallan en su entorno natural, o el entorno en el que se preparan (por ejemplo, un cultivo celular) cuando tal preparación es mediante tecnología de ADN recombinante practicada in vitro o in vivo. Los miembros y ácido nucleico podrían formularse con diluyentes o adyuvantes, y todavía aislarse por motivos prácticos -por ejemplo, los miembros estarán normalmente mezclados con gelatina u otros portadores si se usan para recubrir placas de microvaloración para su uso en inmunoensayos, o estarán mezclados con portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables cuando se usen en diagnosis o terapia. Los miembros de unión específica también podrían estar glicosilados, bien naturalmente o mediante sistemas de células eucariotas heterólogas (por ejemplo, células CHO o NS0 (ECACC 85110503), o podrían no estar glicosilados (por ejemplo, si se producen mediante expresión en una célula procariota).

Por "sustancialmente tal como se dispone en" se pretende indicar que el CDR o dominio VH o VL de la invención será idéntico o altamente similar con las regiones especificadas a partir de las cuales se dispone la secuencia en ésta. Por "altamente similar" se contempla que podrían hacerse desde 1 hasta 5, preferiblemente desde 1 hasta 4, tales como de 1 a 3 ó 1 ó 2, ó 3 ó 4 sustituciones en el CDR y/o dominio VH o VL.

La estructura para realizar un CDR de la invención será generalmente de una secuencia de cadena pesada o ligera de un anticuerpo, o una porción sustancial de la misma en la cual el CDR está situado en una ubicación correspondiente a la del CDR de los dominios variables VH y VL de anticuerpo codificados por los genes reordenados de inmunoglobulina. Las estructuras y ubicaciones de los dominios variables de inmunoglobulina podrían determinarse por referencia a (Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4ª edición, U.S. Department of Health and Human Services, 1987, y actualizaciones del mismo, ahora disponibles en Internet (http://immuno.bme.nwu.edu)). Los CDR son generalmente tal como los define Kabat. Adicionalmente, en el CDR podrían injertarse residuos de injerto del bucle definido por Chothia adyacente al CDR1 del VH de Kabat. Para el SL15S esto incluiría los residuos 26 a 30 de la cadena pesada (GFTGS).

Preferiblemente, una secuencia de aminoácidos, sustancialmente tal como se dispone en la Tabla 1, se lleva como el CDR3 en un dominio variable de cadena pesada humana o en una porción sustancial del mismo.

Los dominios variables empleados en la invención podrían derivarse de cualquier dominio de línea germinal o dominio variable humano reordenado, o podrían ser un dominio variable sintético basado en secuencias consenso de dominios variables humanos conocidos. Las secuencias derivadas de CDR de la invención podrían introducirse en un repertorio de dominios variables que carezcan de regiones CDR3, usando la tecnología del ADN recombinante.

Por ejemplo, Marks et al. (Bio/Technology 10:779-783 (1992)) describen procedimientos para producir repertorios de dominios variables de anticuerpo, en los cuales los cebadores consenso dirigidos contra o adyacentes al extremo 5' del área del dominio variable se usan conjuntamente con cebadores consenso contra la tercera región estructural humana de genes del VH humano para proporcionar un repertorio de dominios variables VH que carecen de CDR3. Marks et al., describen además cómo este repertorio podría combinarse con un CDR3 de un anticuerpo concreto. Usando técnicas análogas, las secuencias derivadas de CDR3 de la presente invención barajarse con repertorios de dominios VH o VL que carecieran de un CDR3, y los dominios VH o VL completos barajados podrían combinarse con un dominio VH o VL afín para proporcionar miembros de unión específica de la invención. El repertorio podría a continuación exhibirse sobre un sistema huésped apropiado, tal como el sistema de exhibición sobre fagos de WO92/01.047 de forma que pudieran seleccionarse miembros de unión específica apropiados. Un repertorio podría consistir en, desde algo como 10^{4} miembros hacia arriba, por ejemplo, desde 10^{6} hasta 10^{8} o 10^{10} miembros.

También se descubren técnicas de mezcla o combinatorias análogas en Stemmer (Nature 370:389-391 (1994)), el cual describe la técnica en relación a un gen de la \beta-lactamasa, pero observa que la estrategia podría usarse para la generación de anticuerpos.

Una alternativa adicional es general regiones VH o VL nuevas portadoras de secuencias derivadas del CDR de la invención usando mutagénesis aleatoria de, por ejemplo, el gen del SL15 o del JT182, o los genes del SL15A o SL15S, para generar mutaciones dentro del dominio variable entero. Tal técnica es descrita por Gram et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580 (1992)), los cuales usaron PCR propensa al error.

Otro procedimiento que podría usarse es la mutagénesis dirigida contra regiones CDR de los genes VH o VL. Tales técnicas son descritas por Barbas et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994)) y Schier et al. (J. Mol. Biol. 263:551-567 (1996)).

Todas las técnicas descritas más arriba son conocidas como tales en la técnica y no forman parte por sí mismas de la presente invención. La persona capacitada será capaz de usar tales técnicas parar proporcionar miembros de unión específica de la invención usando metodología rutinaria en la técnica.

Un aspecto ulterior de la invención proporciona un procedimiento para obtener un dominio de anticuerpo unidor de antígeno específico para el TGF\beta_{1}, y preferiblemente uno o más de las propiedades adicionales descubiertas en ésta para los miembros de unión específica acordes con realizaciones de la invención, comprendiendo el procedimiento proporcionar, por medio de la adición, supresión, sustitución o inserción de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de un dominio VH detallado en ésta (SL15 o JT182), un dominio VH que es una secuencia de aminoácidos variante de la del dominio VH, combinando el dominio VH así proporcionado con uno o más dominios VL, y ensayando la combinación o combinaciones VH/VL para identificar un dominio de anticuerpo unidor de antígeno específico para el TGF\beta_{1}, y opcionalmente con una o más de dichas propiedades preferidas. Dicho dominio VL podría tener una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente tal como se dispone para el SL15A (CS37) o podría tener una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente tal como se dispone para el VL.

Podría emplearse un procedimiento análogo en el cual una o más variantes de secuencias de un dominio VL descubierto en ésta se combinan con uno o más dominios VH.

Un aspecto adicional de la invención proporciona un procedimiento para preparar un miembro de unión específica para el TGF\beta_{1}, procedimiento que comprende:

a)

proporcionar un repertorio de partida de ácidos nucleicos que codifican un dominio VH, los cuales o bien incluyen un CDR3 a ser remplazado o carecen de una región codificante del CDR3;

b)

combinar dicho repertorio con un ácido nucleico donante que codifica una secuencia de aminoácidos sustancialmente tal como se dispone en ésta para el CDR3 del VH del SL15 o JT182, de tal forma que el ácido nucleico donante se inserta en una región CDR3 en el repertorio, con objeto de proporcionar un repertorio de producto de ácidos nucleicos que codifican un dominio VH;

c)

expresar los ácidos nucleicos de dicho repertorio de producto; y

d)

seleccionar un miembro de unión específica para el TGF\beta_{1}; y

e)

recuperar dicho miembro de unión específica o el ácido nucleico que lo codifica.

De nuevo, podría emplearse un procedimiento análogo en el cual un CDR3 de VL de la invención se combinan con un repertorio de ácidos nucleicos que codifican un dominio VL, el cual o bien incluye un CDR3 a remplazar o carece de una región que codifique el CDR3.

Similarmente, uno o más, o los tres CDR podrían injertarse en un repertorio de dominios VH o VL, los cuales se examinan a continuación en busca de un miembro de unión específica o miembros de unión específica para el TGF\beta_{1}.

Una porción sustancial de un dominio variable de inmunoglobulina comprenderá al menos las tres regiones CDR, junto con sus regiones estructurales intermedias. Preferiblemente, la porción también incluirá al menos aproximadamente el 50% de una de las dos o de ambas la primera y cuarta regiones estructurales, siendo el 50% el 50% C-terminal de la primera región estructural y el 50% N-terminal de la cuarta región estructural. Los residuos adicionales en el extremo N-terminal o C-terminal de la parte sustancial del dominio variable podría ser aquélla que no está normalmente asociada con las regiones del dominio variable que ocurren de forma natural. Por ejemplo, la construcción de miembros de unión específica de la presente invención realizada mediante técnicas de ADN recombinante podría resultar en la introducción de residuos N- o C-terminales codificados por engarces introducidos para facilitar la clonación u otros pasos de manipulación. Otros pasos de manipulación incluyen la introducción de engarces para unir dominios variables de la invención a secuencias proteicas adicionales, incluyendo las cadenas pesadas de inmunoglobulinas, otros dominios variables (por ejemplo, en la producción de diacuerpos) o marcas de proteínas, tal como se discute con mayor detalle más abajo.

Aunque en un aspecto preferido de la invención se prefieren los miembros de unión específica que comprenden un par de dominios VH y VL, los dominios de unión sencillos badasdos en secuencias de dominios VH o VL forman aspectos adicionales de la invención. Se sabe que los dominios de inmunoglobulina sencillos, especialmente los dominios VH, son capaces de unir antígenos diana de manera específica.

En el caso de cualquiera de los dominios de unión específica de cadena sencilla, estos dominios podrían usarse para examinar en busca de dominios complementarios capaces de formar un miembro de unión específica de dos dominios capaz de unir el TGF\beta_{1}.

Esto podría conseguirse mediante procedimientos de exhibición sobre fagos usando la denominada estrategia combinatoria dual jerárquica, tal como se descubre en WO92/01.047, en la cual una colonia individual, que contiene el clon de la cadena H o L, se usa para infectar una biblioteca completa de clones que codifican la otra cadena (L o H), y el miembro de unión específica de dos cadenas resultante se selecciona de acuerdo con las técnicas de exhibición sobre fagos, tales como aquéllas descritas en esa referencia. Esta técnica también se descubre en Marks et al., ibid.

Los miembros de unión específica de la presente invención podrían comprender además regiones constantes de anticuerpo o partes de las mismas. Por ejemplo, un dominio VL tal como el VL de SL15A o el VL de S15S podría unirse por su extremo C-terminal a dominios constantes de cadena ligera, incluyendo las cadenas C\kappa y C\lambda humanas, preferiblemente las cadenas C\lambda. Similarmente, los miembros de unión específica basado en el VH del SL15 podrían unirse por su extremo C-terminal a la totalidad o parte de una cadena pesada de inmunoglobulina derivada de cualquier isotipo de anticuerpo, por ejemplo, IgG, IgA, IgE e IgM, y de cualquiera de las subclases de isotipo, particularmente de IgG1 e IgG4. IgG4 es la preferida.

Los anticuerpos de la invención podrían marcarse con una marca detectable o funcional. Las marcas detectables incluyen los marcadores radiactivos tales como el ^{131}I o el ^{99}Tc, los cuales podrían unirse a anticuerpos de la invención usando técnicas químicas convencionales conocidas en el campo de la visualización de anticuerpos. Las marcas también podrían incluir marcadores enzimáticos, tales como la peroxidasa de rábano silvestre. Las marcas incluyen además grupos químicos tales como la biotina, la cual puede detectarse a través de la unión a un grupo afín específico detectable, por ejemplo, avidina marcada.

Los anticuerpos de la presente invención se diseñan para usarse en procedimientos de diagnosis y tratamiento en sujetos humanos o animales, preferiblemente humanos.

Se ha mostrado que los anticuerpos específicos para el TGF\beta_{1} humano son efectivos en modelos animales para el tratamiento de las enfermedades fibróticas y otras enfermedades en las que el TGF\beta_{1} está sobreexpresado, tales como la artritis reumatoide o el cáncer. Se ha mostrado que los anticuerpos contra el TGF\beta_{1} son efectivos en el tratamiento de la glomerulonefritis (W.A. Border et al., Nature 346:371-374 (1990)); la cicatrización neural (A. Logan, et al., Eur. J. Neurosci. 6:335-363 (1994)); la cicatrización dérmica (M. Shah et al., Lancet 339:213-214 (1992); M. Shah et al., J. Cell. Science 107:1137-1157 (1994); M. Shah et al., 108:985-1002 (1995)), y en la fibrosis pulmonar (Giri et al., Thorax 48:959-966 (1993)). Además, se ha observado que los anticuerpos que reaccionan de forma cruzada con las isoformas del TGF\beta, 1, 2 y 3, son efectivo en modelos de la fibrosis pulmonar, la fibrosis inducida por radiación (Barcellos-Hoff, patente estadounidense nº 5.616.561 (1997)), la mielofibrosis, las quemaduras, la contractura de Dupuyen, las úlceras gástricas y la artritis reumatoide (Wahl et al., J. Exp. Medicine 177:225-230 (1993)).

Hay un cierto número de condiciones adicionales asociadas con la deposición de matriz extracelular que podrían mejorar mediante la administración de un anticuerpo dirigido con el TGF\beta_{1}. Éstas incluyen la esclerosis sistémica, las adhesiones posteriores a operaciones, la cicatrización queloide e hipertrófica, la vitreoretinopatía proliferativa, la cirugía de drenaje del glaucoma, la lesión corneal, las cataratas, la enfermedad de Peyronie, la nefropatía diabética, el síndrome de la molestia respiratoria humana, la cirrosis del hígado, el infarto de miocardio posterior, la restenosis posterior a la angioplastia, las cicatrices queloides, la cicatrización después de una hemorragia subaracnoidea, la esclerosis múltiple, la fibrosis después de la laminectomía, la fibrosis después de la reparación de tendones y otras reparaciones, la supresión de tatuajes, la colangitis esclerotizante, la pericarditis, la pleuresia, la traqueostomía, la lesión penetrante del CNS, el síndrome miálgico eosinofílico, la restenosis vascular, la enfermedad oclusiva de venas, la pancreatitis y la artropatía psoriática. En algunos casos, el tratamiento en combinación con un anticuerpo dirigido contra el TGF\beta_{2}, tal como la IgG4 de 6B1 (CAT-152) (ver WO97/13.844) podría emplearse de forma valiosa, por ejemplo, en el tratamiento de la cicatrización dérmica. La eficacia de la IgG4 del SL15A en el tratamiento de las heridas del epitelio corneal se demuestra en el Ejemplo 6.

El éxito del CAT-192 para promover la curación de las heridas de la córnea proporciona una indicación de su utilidad en otras condiciones en las que la promoción de la re-epitelización es beneficiosa. Estas incluyen las enfermedades de la piel, tales como las úlceras venenosas, las úlceras isquémicas (llagas por presión), úlceras diabéticas, sitios de injertos, sitios donantes de injertos, abrasiones y quemaduras, enfermedades del epitelio bronquial, tales como el asma, la ARDS, las enfermedades del epitelio intestinal, tales como la mucositis asociada con el tratamiento citotóxico, las úlceras esofágicas (enfermedad del reflejo), las úlceras estomacales, las lesiones del intestino delgado e intestino grueso (enfermedad inflamatoria intestinal).

El TGF\beta también inhibe la proliferación endotelial, por tanto los anticuerpos anti-TGF\beta podrían usarse para estabilizar placas ateroescleróticas y acelerar la curación de la anastomosis vascular. El TGF\beta podría estimular la proliferación del músculo liso de forma que el tratamiento anti-TGF\beta podría ser adicionalmente apropiado para la enfermedad arterial y para el asma.

El asma es una alteración inflamatoria crónica de las vías aéreas que se manifiesta como una obstrucción intermitente del flujo de aire, la cual a lo largo del tiempo podría devenir progresiva. Tanto en la forma alérgica de la enfermedad como en la no-alérgica hay evidencia de una respuesta local de células T alterada en favor de la liberación de la citoquina Th-2, lo que resulta en que el isotipo de las células B cambian a IgE, en la reclutamiento de mastocitos, eosinófilos y basófilos, y en la activación y liberación de un amplio rango de mediadores inflamatorios. No obstante, ha pasado a estar claro que la inflamación, por sí misma, no es capaz de explicar muchas de las características del asma crónico y que la también se requiere la reestructuración de la pared de las vías aéreas (Holgate, S.T. et al., J. Allergy Clin. Immunol. 2000 (en prensa)). Esta respuesta "remodeladora" es la responsable de la incompleta eficacia terapéutica de los corticosteroides, con una hipersensibilidad bronquial persistente (BHR) (Lundgren R. et al., Eur. Respir. J. 1(10):883-889 (1988)), y una disminución progresiva de la función pulmonar a lo largo del tiempo, la cual ocurre en aquellos asmáticos con una enfermedad más crónica y grave (Lange, P. et al., N. Engl. J. Med. 339(7):1194-1200 (1998)).

La fibrosis subepitelial y submucosa está implicada en el asma. Cuando se examinan mediante CT de alta resolución, los pacientes con asma grave tienen vías aéreas más gruesas en comparación con los sujetos normales o aquéllos con una enfermedad suave (Awadh, N. et al., Thorax 53(4):248-253 (1998)). Esto implica el engrosamiento y una densidad creciente de la capa de colágeno de la SBM, incrementos en el músculo liso y en las redes microvasculares (Carroll, N., et al., Am. Rev. Respir. Dis. 147(2):405-410 (1993)). En base a las mediciones realizadas en las vías humanas y en modelos en conejillo de indias de exposición crónica a antígeno, el engrosamiento de la SBM refleja el de la pared entera de la vía aérea. Se ha observado que el engrosamiento del colágeno de la SBM se correlaciona con la gravedad, cronicidad y BHR de la enfermedad.

El engrosamiento de la SBM se debe a la deposición de colágenos intersticiales de los Tipos I, III y V y de fibronectina en la lamina reticularis y se origina a partir de los miofibroblastos, cuyo número y actividad está incrementada en el asma (Brewster, C.E., et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 3(5):507-511 (1990)) y adicionalmente potenciados por la exposición a alérgeno (Gizycki, M.J., et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 16(6):664-673 (1997)). Los estudios de biopsias y lavados bronquiales han proporcionado un argumento convincente del epitelio como una fuente potencial de factores de crecimiento profibrogénico. En el asma, la inmunotinción para el TGF\beta y el b-FGF muestra tanto la ubicación epitelial como la tinción extensiva de la matriz, indicativas de importantes interacciones entre estos factores de crecimiento y los proteoglicanos de la matriz a través de sitio de unión específicos para glicosaminoglicanos (GAG) (Redington, A.E. et al., J. Pathol. 186(4):410-415 (1998)). Ambos, el TGF\beta_{1} y el b-FGF se hallan en concentraciones incrementadas en el fluido de lavado, con incrementos adicionales que ocurren después de la exposición a alérgeno (Redington, A.E., et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 156(2, Pt. 1):642-647 (1997)). El análisis en tejidos de los factores de crecimiento, de las citoquinas y de las quimioquinas ha mostrado que éstos están principalmente presentes en formas complejas, de elevado peso molecular. Se ha identificado el péptido asociado a la latencia como la molécula unidora de TGF\beta, y, usando un modelo de explante bronquial, se ha mostrado que la exposición a alérgeno de tejido mucosal asmático resulta en la activación del TGF\beta que depende de la actividad de plasmina, mientras que el b-FGF se libera en forma soluble mediante heparina y heparinasa respectivamente a partir de mastocitos y eosinófilos (McConnell, W., et al., Eur. Respir. J. 152s (1999), tipo de referencia: resumen).

El asma también está implicado en la lesión epitelial y en el remodelado de la vías aéreas. Un rasgo característico de las vías aéreas remodeladas en el asma el la gran lesión epitelial causada por los productos de las células inflamatorias (Laitinen, L.A., et al., Am. Rev. Respir. Dis. 131(4):599-606 (1985)). La lesión mucosal no sólo permite que pasen sin impedimentos las moléculas lesivas para el tejido hacia las vías aéreas, sino que también causa que el epitelio pase a estar "activado" con la expresión de una variedad de quimioquinas pro-inflamatorias, mediadores autacoides, y moléculas de adhesión, los cuales contribuyen a la inflamación crónica (Holgate, S.T. et al., J. Allergy Clin. Immunol. 2000 (en prensa)). Las células epiteliales lesionadas y las reparadoras son también reguladoras importantes de la remodelación de las vías aéreas a través de la producción incrementada de factores de crecimiento fibroproliferantes y profibrogénicos, incluyendo las isoformas del TGF\beta (Zhang, S., et al., Lab. Invest. 79(4):395-405 (1999)). Recientemente se ha hallado que el perjuicio de la reparación epitelial mediada por el factor de crecimiento epidérmico (EGFR) causa una liberación altamente incrementada de TGF\beta_{2} por parte de las células epiteliales dañadas, y una marcada mejora de la expresión del gen del colágeno III cuando el medio condicionado se añade a cultivos de miofibroblastos. Puesto que la isoformas del TGF\beta son potentes inhibidores de la proliferación de células epiteliales, la producción excesiva de TGF\beta en el asma podría ser responsable de los valores inesperadamente bajos de expresión del PCNA marcador de proliferación hallado en el epitelio asmático (Demoly, P., et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 150(1):214-217 (1994)). De esta forma, las condiciones que favorecen la biosíntesis del colágeno por parte de los miofibroblastos subepiteliales también podrían contribuir a la cronicidad de la enfermedad retardando la reparación del epitelio. Por tanto, se esperaría que la reducción de los niveles de TGF\beta, mediante el uso de miembros de unión específica de la presente invención, tratara la necesidad en el asma crónico y grave de impedir la biosíntesis de matrix proteica por parte de los miofibroblastos bronquiales, así como la promoción de la reparación del epitelio bronquial con objeto de restaurar un fenotipo epitelial no activado y la función de barrera normal.

El TGF\beta_{1} también modula las respuestas inmune e inflamatoria, por ejemplo, en respuesta al cáncer o a las infecciones. Un anticuerpo contra el TGF\beta_{1} podría usarse para mejorar la respuesta inmune contra infecciones tales como la hepatitis B, la hepatitis C, o la tuberculosis, o para reducir la inmunosupresión inducida por, por ejemplo, tumores, infección del SIDA, o las enfermedades granulomatosas. Un anticuerpo contra el TGF\beta_{1} podría ser útil para el tratamiento del rechazo agudo y crónico del transplante de órganos, y de tumores malignos, y podría usarse en la prevención de la extensión de las células cancerosas inducida por el tratamiento con ciclosporina.

Un anticuerpo contra el TGF\beta_{1} podría usarse como un adyuvante para la inmunoterapia.

Un anticuerpo contra el TGF\beta_{1} podría usarse para la inhibición de la angiogénesis, por ejemplo, en el tratamiento de tumores. La gran mayoría de células tumorales expresan niveles detectables de TGF\beta_{1} (Wojtowicz-Praga, J. Immunother. 20(3):165-177 (1997)). Más aún, las células que producen niveles más elevados de TGF\beta_{1} tienen un potencial metastásico (Blanckaert et al., Cancer Res. 53(17):4075-4081 (1993)) o invasor (Arteaga, et al., Cell Growth and Differentiation 4(3):193-201 (1993) más elevado. En muchos cánceres, los niveles de TGF\beta_{1} en plasma se correlacionan con la progresión de la enfermedad. Por tanto, la fuente de TGF\beta_{1} pueden ser las células tumorales así como el tejido que las rodea.

El TGF\beta es un potente supresor de la transformación maligna en tejido epitelial sano normal y puede inhibir la proliferación. No obstante, muchos cánceres avanzados devienen resistentes a las acciones inhibidoras del crecimiento del TGF\beta a resultas de anormalidades en el receptor del TGF\beta del Tipo II (Markowitz et al., Science 268(5215):1336-1338 (1995)) o de la transducción de la señal SMAD (Hata et al., Mol. Med. Today 4(6):257-262 (1998)).

Los tumores requieren un aporte de sangre para su crecimiento por encima de 1 mm^{3} y para la metástasis (Folkman, Breast Cancer Res. 36(2):109-118 (1995)). Esto ha conducido al rápido desarrollo de tratamientos anti-angiogénicos para tumores sólidos.

Se ha observado que el TGF\beta_{1} causa directamente angiogénesis mediante regulación hacia arriba de la producción de VEGF in vitro e in vivo. Los cánceres de mama contienen cantidades elevadas de macrófagos infiltrantes. El papel y función de estas células dentro del tumor permanece sin aclarar, pero un cierto número de estudios han hallado una asociación con una prognosis pobre. Tantos las células tumorales como los macrófagos del tumor producen VEGF in vitro y la producción es regulada hacia arriba por el TGF\beta_{1}. Los niveles de VEGF en suero están potenciados en pacientes con cáncer de mama, y estos niveles se correlacionan directamente con los niveles de TGF\beta_{1} en suero. Por tanto, la expresión del TGF\beta_{1} por parte de las células del cáncer de mama y de los macrófagos asociados al cáncer podría elegirse como una respuesta angiogénica a través de la generación de VEGF (Donovan et al., Ann. Surg. Oncol. 4(8):621-627 (1997); Harmey et al., Ann. Surg. Oncol. 5(3):271-278 (1998)).

Ueki et al. (Japanese Journal of Cancer Research 84(6):589-593 (1992)) demostraron que el TGF\beta_{1} potenciaba el crecimiento tumoral in vivo. Este grupo transfectó células CHO con el gen del TGF\beta_{1}, lo que resultó en la sobreexpresión de TGF\beta_{1}, se observó que las células de CHO que secretaban TGF\beta_{1} crecían más rápidamente que las células no transfectadas cuando se inyectaban subcutáneamente en ratones inmunosuprimidos. Se observó una vascularización prominente en tumores derivados de células transfectadas con TGF\beta_{1}; la vascularización estaba disminuida en las células no transfectadas. Además, el anticuerpo neutralizante anti-TGF\beta_{1} fue capaz de inhibir tanto el crecimiento como la angiogénesis en los tumores derivados de células transfectadas con el TGF\beta_{1}. Por tanto, la sobreproducción de TGF\beta_{1} por parte de células tumorales contribuyó al crecimiento tumoral y a la neovascularización.

Se sabe que los pacientes que tienen cáncer también tienen un sistema inmunitario defectuoso. Recientemente, se ha sugerido que el TGF\beta_{1} juega un papel clave en la inmunosupresión asociada a tumores. Este tópico ha sido el foco de una reciente revisión (Wojtowicz-Praga, 1997, ibid). Ciertamente, el TGF\beta_{1} parece ser un potente inmunosupresor, y se ha detectado consistentemente a partir de una variedad de líneas celulares y en plasma de huéspedes portadores de tumores.

La neutralización del TGF\beta_{1} por parte de anticuerpos monoclonales o la inhibición de la producción por parte de genes anti-sentido resulta en una atenuación del crecimiento tumoral y de la capacidad metastásica en modelos animales. El crecimiento de células de cáncer de mama MCF-7 transfectadas con el TGF\beta_{1} en ratones es impedida por el 2G7 (dosis i.p. repetidas), un anticuerpo anti-TGF\beta_{1,2,3} (Arteaga et al., ibid). El crecimiento de células MCF-7 normales es impedido por el 2G7 pero sólo cuando el tratamiento se inició en el momento de la inoculación de las células tumorales. Además, se ha proporcionado una evidencia más convincente de una acción de los anticuerpos anti-TGF\beta para suprimir la inmunosupresión inducida por el tumor (Arteaga, et al., J. Clin. Invest. 92(6):2569-2576). La MDA-231, una línea ce células de cáncer de mama humanas, causó una disminución en la actividad de las células asesinas naturales ("natural killer", NK) de bazo en ratones inmunosuprimidos a continuación de su inoculación i.p. El 2G7 (200 \mug cada dos días, i.p.) atenuó los tumores intra-abdominales y las metástasis en pulmón, así como incrementó marcadamente la actividad de la actividad de las células NK de bazo. Más aún, el medio condicionado a partir de cultivos de células tumorales de MDA-231 inhibió la actividad de células NK procedentes de sangre humana; de nuevo, el 2G7 impidió esto. El crecimiento de xenoinjertos subcutáneos de células MDA-231 sólo fue inhibido transitoriamente por el 2G7. La acción del 2G7 sobre el crecimiento tumoral, la metástasis, y la actividad de células NK estuvo ausente en ratones inmunosuprimidos deficientes en células NK beige (Arteaga, et al., J. Clin. Invest.
92(6):2569-2576).

En un estudio adicional, el anticuerpo 2G7 anti-TGF\beta_{1} (500 \mug i.p. cada dos días), en combinación con la IL-2 (10.000 U i.p., 2\times diariamente), fue capaz de reducir las metástasis pulmonares de melanoma de B16, pero no fue tan efectivo como la inoculación i.v. El 2G7 solo también redujo el número de metástasis pulmonares pero no fue tan efectivo como la terapia combinada. Los niveles de TGF\beta_{1} en plasma se redujeron significativamente en los animales tratados con anticuerpo (Wojtowicz-Praga, et al., J. Immunother. Emphasis Tumour Immunol. 19(3):169-175 (1996)). Dos estudios previos, o bien no consiguieron mostrar un efecto, o sólo causaron un pequeño efecto usando la combinación de anti-TGF\beta_{1} e IL-2 (Gridley, et al., Cancer Biother. 8(2):159-170 (1993); Mao et al., Cancer Biother.
9(4):317-327 (1994), respectivamente), no obstante, las dosis de anticuerpos anti-TGF\beta_{1} usadas en estos estudios fueron pequeñas (100 ng y 1 \mug respectivamente). Por tanto, la combinación de terapia anti-TGF\beta_{1} con inmunoestimulación parecería, a partir de datos de modelos animales, proporcionar una prueba de concepto para esta estrategia terapéutica contra el cáncer.

Hoefer y Anderer (Cancer Immunol. Immunother. 41(5):302-308 (1995)) demostraron que la línea celular de carcinoma humana, SLU-1, y la sublínea altamente metastásica SLU-M1, resultaban en metástasis en ratones inmunosuprimidos a continuación de su inoculación s.c. La incidencia de la metástasis así como el crecimiento del tumor primario se redujeron mediante tratamiento con anticuerpos anti-TGF\beta_{1} (tratamiento desde el día 3, cada 3-4 días, con 100 \mug s.c. en el sitio del tumor). Los autores sugirieron que los anticuerpos invertían la inmunosupresión inducida por el TGF\beta_{1} conduciendo a la inhibición del crecimiento tumoral y de la metástasis.

Trabajos previos han demostrado también que los anticuerpos anti-TGF\beta_{1} pueden reducir la metástasis de tumor in vivo (Arteaga et al., J. Clin. Invest. 92(6):2569-2576 (1993); Hoefer y Anderer, 1995, ibid.; Wojtowicz-Praga et al., 1996, ibid.). Las conclusiones iniciales a partir de estos estudios sugieren que la inmunosupresión inducida por el TGF\beta_{1} permitió la metástasis de estos xenoinjertos de tumor. No obstante, un artículo reciente sugiere que el TGF\beta_{1} podría potenciar directamente el potencial invasor y metastásico de las células (Hojo et al., Nature 397:530-534 (1999)). La ciclosporina induce de forma dependiente de la dosis la liberación del TGF\beta_{1} a partir de células de adenocarcinoma pulmonar humano en cultivo, sin embargo, el mecanismo de producción del TGF\beta_{1} por parte de la ciclosporina no se conoce. El tratamiento de células de adenocarcinoma con ciclosporina (o TGF\beta_{1}) resulta en el arrugado de la membrana, la formación de seudópodos, el crecimiento independiente del anclaje (invasor) y la motilidad. Un anticuerpo anti-TGF\beta_{1} inhibe in vitro estos cambios de morfología y motilidad celular. Se efectuaron observaciones similares para adenocarcinoma de células renales, para células epiteliales de la glándula mamaria, y células pulmonares epiteliales del pulmón de visón. En ratones beige-SCID inmunodeficientes (deficientes en células T, células B, células NK), la ciclosporina incrementó el número de metástasis a continuación de la incubación (i.v.) de células de adenocarcinoma de células renales de ratón, de carcinoma pulmonar de Lewis, o de cáncer de vejiga humana. El tratamiento con el anticuerpo neutralizador anti-TGF\beta_{1,2,3}, 1D11.16 (200 \mug por día, dosis inicial 1 día antes de la inoculación con células tumorales) redujo significativamente el número de metástasis pulmonares en ratones tratados con ciclosporina (hasta niveles inferiores a los del grupo control no tratado con ciclosporina). Por tanto, parece ser que la ciclosporina puede, a través de una acción dependiente de la producción de TGF\beta_{1}, incrementar la invasión y metástasis en modelos animales con independencia del sistema inmune del huésped (Hojo et al., 1999, ibid.).

La evidencia procedente de los modelos in vitro e in vivo sugiere que el TGF\beta_{1} puede potenciar la formación del tumor utilizando tres mecanismos principales: la angiogénesis, la inmunosupresión y los cambios fenotípicos de células tumorales para incrementar el comportamiento invasor y metastásico. Por tanto, se esperaría que la inhibición del TGF\beta_{1} inhibiera el cáncer en humanos y, en una única molécula, proporcionara una terapia anti-cáncer combinada.

Los cánceres en los que se ha implicado el TGF\beta_{1} incluyen los cánceres de mama, próstata, ovario, estómago, colorectal, de piel, pulmón, cervical y de vejiga, así como varias leucemias y sarcomas, tales como el Sarcoma de Kaposi. En consecuencia, los anticuerpos de la invención podrían administrarse para el tratamiento de cánceres en los que el TGF\beta_{1} está implicado, bien en la angiogénesis, en la metástasis o en la progresión del tumor, incluyendo los cánceres de las condiciones anteriores. Por supuesto, se apreciará que en el contexto de la terapia del cáncer, "tratamiento" incluye cualquier intervención médica que resulta en una ralentización del crecimiento del tumor o una reducción en la metástasis del tumor, así como en la remisión parcial del cáncer con objeto de prolongar la esperanza de vida de un paciente.

La terapia con anticuerpo para el tratamiento del cáncer es un tratamiento establecido en la técnica. Actualmente, hay tres anticuerpos anti-cáncer autorizados para su uso clínico en los Estados Unidos de Norteamérica y/o Europa (Panorex para el tratamiento del cáncer colorectal, Rituxan para el linfoma de células-B, y Herceptin para el cáncer de mama), además de otros numerosos anticuerpos anti-cáncer actualmente en ensayos clínicos de la Fase I, II o III. Estos anticuerpos se usan a menudo en la última etapa del tratamiento y se consideran efectivos según el criterio del parágrafo precedente, así como, en algunos casos, proporcionando una total remisión del tumor.

En consecuencia, los aspectos adicionales de la invención proporcionan procedimientos de tratamiento que comprenden la administración de un miembro de unión específica según tal como se proporcionan, composiciones farmacéuticas que comprenden tal miembro de unión específica, y el uso de tal miembro de unión específica en la fabricación de un medicamento para su administración, por ejemplo, en un procedimiento de fabricación de un medicamento o composición farmacéutica que comprende formular el miembro de unión específica con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

De acuerdo con la presente invención, las composiciones proporcionadas podrían administrarse a individuos. La administración lo es preferiblemente en una "cantidad terapéuticamente aceptable", siendo esta suficiente para mostrar un beneficio para un paciente. Tal beneficio podría ser al menos una mejora de al menos un síntoma. La cantidad actual administrada, y la velocidad y programa de administración, dependerán de la naturaleza y gravedad de lo que se está tratando, La prescripción del tratamiento, por ejemplo, decisiones sobre dosificación, etc, se halla dentro de las responsabilidades del médico practicante y otros doctores médicos. Las dosis apropiadas de anticuerpo son bien conocidas en la técnica; consultar Ledermann, J.A., et al., Int. J. Cancer 47:659-664 (1991); Bagshawe, K.D., et al., Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4:915-922 (1991).

Una composición podría administrarse sola o en combinación con otros tratamientos, bien simultánea o secuencialmente, dependiendo de la condición a tratar.

Los anticuerpos de la presente invención podrían administrarse a un paciente que precisa un tratamiento a través de cualquier ruta apropiada, usualmente mediante inyección en la circulación sanguínea o directamente en el sitio a tratar, por ejemplo, córnea, herida, tumor, etc. La dosis precisa dependerá de un cierto número de factores, incluyendo si el anticuerpo es para diagnóstico o para tratamiento, el tamaño y ubicación del área a tratar (por ejemplo, herida), la naturaleza exacta del anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo completo, fragmento o diacuerpo), y la naturaleza de cualquier marca detectable u otra molécula unida al anticuerpo. Una dosis de anticuerpo típica estará en el rango de 0,5 mg a 100 g para aplicaciones sistémicas, tales como el tratamiento de la fibrosis en la glomerulonefritis o
en el tratamiento de cánceres, y de 10 \mug a 1 mg para aplicaciones locales, tales como el tratamiento de la cicatri-
zación dérmica. Típicamente, el anticuerpo será un anticuerpo entero, preferiblemente del isotipo IgG4. Esta es una dosis para un único tratamiento de un paciente adulto, la cual podría ajustarse proporcionalmente para niños y
adolescentes, y también ajustarse para otros formatos de anticuerpo en proporción a su peso molecular. Los tratamientos podrían repetirse diariamente, dos veces por semana, semanalmente o a intervalos de meses, a la discreción del médico.

Actualmente se prefiere el uso de un anticuerpo entero del isotipo IgG4 para las aplicaciones sistémicas y locales, pero para las aplicaciones locales podría ser particularmente valioso un anticuerpo scFv.

Los miembros de unión específica de la presente invención usualmente se administrarán en forma de una composición farmacéutica, la cual podría comprender al menos un componente además del miembro de unión específica.

Por tanto, las composiciones farmacéuticas acordes con la presente invención, y para su uso de acuerdo con la presente invención, podrían comprender, además del ingrediente activo, una excipiente, portador, tampón, estabilizador u otro material farmacéuticamente aceptable bien conocidos por los especialistas en la técnica. Tales materiales no deberían ser tóxicos y no deberían interferir con la eficacia del ingrediente activo. La naturaleza precisa del portador u otro material dependerá de la ruta de administración, la cual podría ser oral, o mediante inyección, por ejemplo, intravenosa.

Las composiciones farmacéuticas para administración oral podrían estar en forma de tableta, cápsula, polvo o líquido. Una tableta podría comprender un portador sólido, tal como la gelatina, o un adyuvante. Las composiciones farmacéuticas líquidas generalmente comprenden un portador líquido tal como el agua, petroleo, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintético. Podrían incluirse la solución salina fisiológica, la solución de dextrosa u otro sacárido, o glicoles tales como el etilenglicol, propilenglicol, o polietilenglicol. Las formulación como gotas para los ojos también podría ser valiosa para la prevención y tratamiento de la fibrosis o cicatrización ocular.

Para la inyección intravenosa, o para la inyección en el sitio de lesión, el ingrediente activo estará en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable, la cual está libre de pirógenos y tiene un pH, isotonicidad y estabilidad apropiados. Aquellos con formación suficiente en la técnica están capacitados para preparar soluciones apropiadas usando, por ejemplo, vehículos isotónicos tales como la Inyección de Cloruro Sódico, la Inyección de Ringer, la Inyección de Ringer con Lactato.

Según se precise, podrían incluirse conservantes, estabilizadores, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos.

El anticuerpo podría administrarse a partir de un sistema de suministro continuado para prevenir la fibrosis, o podría depositarse sobre dispositivos prostéticos, tales como recambios de cadera, para prevenir el desarrollo de fibrosis asociado con su inserción.

Una composición podría administrarse sola o en combinación con otros tratamientos, bien simultánea o secuencialmente, dependiendo de la condición a tratar. Otros tratamiento podrían incluir la administración de dosis apropiadas de fármacos calmantes, como los fármacos antiinflamatorios no esteroideos (por ejemplo, aspirina, paracetamol, ibuprofeno o cetoprofeno), u opiáceos tales como la morfina, o antiheméticos.

La presente invención proporciona un procedimiento que comprende causar o permitir la unión de un miembro de unión específica, tal como se proporciona en ésta, al TGF\beta_{1}. Tal como se ha destacado, tal unión podría tener lugar in vivo, por ejemplo, a continuación de la administración de un miembro de unión específica, o un ácido nucleico que codifica un \mue, o podría tener lugar in vitro.

La cantidad de unión del \mue al TGF\beta_{1} podría determinarse. La cuantificación podría relacionarse con la cantidad de TGF\beta_{1} en una muestra de ensayo, la cual podría ser de interés diagnóstico, por ejemplo, la medición del TGF\beta_{1} se ha propuesto también como un indicador de la ateroesclerosis, estando correlacionadas las bajas concentraciones con la ateroesclerosis avanzada.

Las reactividades de los anticuerpos con una muestra podrían determinarse mediante cualesquier medios apropiados. El radioinmunoensayo (RIA) es una posibilidad.

El TGF\beta_{1} marcado radiactivamente se mezcla con TGF\beta_{1} sin marcar (la muestra de ensayo) y se deja unir al anticuerpo. El TGF\beta_{1} unido se separa físicamente del TGF\beta_{1} no unido y se determina la cantidad de TGF\beta_{1} radiactivo unido al anticuerpo. Cuanto más TGF\beta_{1} hay en la muestra de ensayo menos TGF\beta_{1} radiactivo se unirá al anticuerpo. También podría usarse un ensayo de unión competitivo con TGF\beta_{1} no radiactivo, usando TGF\beta_{1} o un análogo del TGF\beta_{1} unido a una molécula informadora. La molécula informadora podría ser un fluorocromo, un fósforo o un colorante de láser con características de emisión y absorción espectralmente aisladas. Los fluorocromos apropiados incluyen la fluoresceína, la rodamina, la ficoeritrina, y el Rojo de Texas. Los colorantes cromogénicos apropiados incluyen la diaminobencidina.

Otros informadores incluyen partículas coloidales macromoleculares o material formado de partículas, tal como cuentas de látex, que están coloreados, son magnéticos o paramagnéticos, y agentes biológica o químicamente activos que pueden directa o indirectamente causar señales detectables para ser observada visualmente, detectadas electrónicamente, o registradas de otro modo. Estas moléculas podrían ser enzimas que catalizan reacciones que, por ejemplo, desarrollan o cambian colores, o causan cambios en las propiedades eléctricas. Podrían ser molecularmente excitables, de tal forma que las transiciones electrónicas entre estados de energía resultan en absorciones o emisiones espectrales características. Podrían incluir entidades químicas usadas conjuntamente con biosensores. Podrían emplearse los sistemas de detección biotina/avidina o biotina/estreptoavidina y fosfatasa alcalina.

Las señales generadas por conjugados individuales de anticuerpo-informador podrían usarse para derivar datos cuantificables absolutos o relativos de la unión del anticuerpo relevante en muestras (normales y de ensayo).

La presente invención también proporciona el uso de un \mue como más arriba para medir los niveles de TGF\beta_{1} en un ensayo de competición, es decir, un procedimiento para medir el nivel de TGF\beta_{1} en una muestra empleando un \mue, tal como se proporciona mediante la presente invención, en un ensayo de competición. Esto podría ser cuando no se requiere la separación física del TGF\beta_{1} unido del no unido. Una posibilidad es uniendo una molécula informadora al \mue de tal forma que con la unión ocurra un cambio físico u óptico. La molécula informadora podría directa o indirectamente generar señales detectables y preferiblemente medibles. La unión de moléculas informadoras podría hacerse directa o indirectamente, covalentemente, por ejemplo, a través de un enlace peptídico, o no covalentemente. La unión a través de un enlace peptídico podría ser a resultas de la expresión recombinante de un gen de fusión que codifica el anticuerpo y la molécula informadora.

La presente invención también proporciona la medición de niveles de TGF\beta_{1} directamente, empleando un \mue de acuerdo con la invención, por ejemplo, en un sistema biosensor.

El modo de determinar la unión no es una característica de la presente invención, y los especialistas en la técnica son capaces de escoger un modo apropiado de acuerdo con su preferencia y conocimiento general.

La presente invención se extiende además hasta un \mue que compite por la unión con el TGF\beta_{1} con cualquir \mue que se una a TGF\beta_{1} y comprenda un dominio V, incluyendo un CDR con los aminoácidos sustancialmente tal como se detallan en ésta, o un dominio V con una secuencia de aminoácidos sustancialmente tal como se detalla en ésta. La competición entre los miembros de unión podría ensayarse in vitro, por ejemplo, etiquetando con una molécula informadora específica un miembro de unión, el cual puede detectarse en presencia de otro(s) miembro(s) no

\hbox{marcado(s),}

para permitir la identificación de miembros de unión específica que se unen al mismo epítopo o a un epítopo que se solapa. La competición podría determinarse usando, por ejemplo, el ELISA de TGF\beta_{1} tal como se describe en el Ejemplo 1.

Los miembros de unión específica preferidos para el TGF\beta_{1} compiten por la unión al TGF\beta_{1} con el CAT-191, el CAT-192 y/o el CAT-193.

Las realizaciones preferidas neutralizan fuertemente el TGF\beta_{1}, y tienen una potencia al menos 5 veces mejor que la del CS37, más preferiblemente aproximadamente 10 veces, 15 veces, 20 veces, 50 veces, 75 veces, 100 veces o 150 veces mejor, en un ensayo de radioreceptor (Lucas, C., et al., Meth. in Enzymology 198:303-316 (1991)). La potencia se mide con el anticuerpo objeto de estudio y el CS37 en formatos moleculares equivalentes, por ejemplo, como anticuerpos monovalentes (scFv o Fab) o como anticuerpos bivalentes (IgG1 o IgG4).

En un aspecto, un \mue acorde con la presente invención une un péptido que incluye la secuencia de aminoácidos de los residuos 92-98 del TGF\beta_{1} (el mismo epítopo que el CS37).

Al ensayar esto, podría emplearse un péptido con esta secuencia más uno o más aminoácidos en cualquier extremo. Un péptido tal podría decirse que "esencialmente consiste" en la secuencia especificada. Los miembros de unión específica acordes con la presente invención también podría ser tales que su unión por el TGF\beta_{1} fuera inhibida por un péptido con o incluyendo la secuencia dada. Al ensayar esto, podría emplearse un péptido con cualquier secuencia más uno o más aminoácidos.

Los miembros de unión específica que se unen a un péptido específico podrían aislarse, por ejemplo, a partir de una biblioteca de exhibición sobre fagos mediante cribado con el(los) péptido(s).

La presente invención proporciona además un ácido nucleico aislado que codifica un miembro de unión específica de la presente invención. El ácido nucleico incluye el ADN y el ARN. En un aspecto preferido, la presente invención proporciona un ácido nucleico que codifica un CDR o el dominio VH o VL de la invención, tal como se ha definido más arriba.

La presente invención también proporciona construcciones en forma de plásmidos, vectores, cassettes de transcripción o expresión, los cuales comprenden al menos un polinucleótido como más arriba.

La presente invención también proporciona una célula huésped recombinante que comprende una o más construcciones como más arriba. Un ácido nucleico que codifica cualquier CDR, dominio VH o VL, o miembro de unión específica tal como se proporciona, forma por sí mismo un aspecto de la presente invención, al igual que lo hace un procedimiento para la producción del producto codificado, procedimiento que comprende la expresión a partir del ácido nucleico que lo codifica. La expresión podría conseguirse convenientemente cultivando en las condiciones apropiadas células huésped recombinantes que contiene el ácido nucleico. A continuación de la producción mediante expresión, podría aislarse y/o purificarse un dominio VH o VL, o un \mue, usando cualquier técnica apropiada, y usarse a continuación según sea apropiado.

Los miembros de unión específica, los dominios VH y/o VL, y las moléculas de ácido nucleico codificante, y los vectores acordes con la presente invención podrían proporcionarse aislados y/o purificado, por ejemplo, a partir de su entorno natural, en forma sustancialmente pura u homogénea, o, en el caso del ácido nucleico, libre o sustancialmente libre de ácido nucleico o genes con origen distinto del de la secuencia que codifica un polipéptido con la función requerida. El ácido nucleico acorde con la presente invención podría comprender ADN o ARN, y podría ser total o parcialmente sintético. La referencia a una secuencia nucleotídica tal como se detalla en ésta abarca una molécula de ADN con la secuencia especificada, y abarca una molécula de ARN con la secuencia especificada, en la cual U es sustituida por T, a menos que el contexto requiera otra cosa.

Los sistemas para la clonación y expresión de un polipéptido en una variedad de células huésped diferentes son bien conocidos. Las células huésped apropiadas incluyen las bacterias, las células de mamíferos, las levaduras, y los sistemas de baculovirus. Las líneas de células de mamífero disponibles en la técnica para la expresión de un polipéptido heterólogo incluyen las células ováricas de hámster chino, las células HeLa, las células renales de cría de hámster, las células del melanoma de ratón NSO, y muchas otras. Un huésped bacteriano común preferido es E. coli.

La expresión de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos en células procariotas tales como E. coli está bien establecida en la técnica. Para una revisión, consultar, por ejemplo, Plückthun, A., Bio/Technology 9:545-551 (1991). La expresión en células eucariotas en cultivo también está disponible para aquéllos especialistas en la técnica como una opción para la producción de un miembro de unión específica, para revisiones recientes consultar, por ejemplo, Reff, M.E., Curr. Opinion Biotech. 4:573-576 (1993); Trill, J.J. et al., Curr. Opinion Biotech. 6:553-560 (1995).

Los vectores apropiados pueden escogerse o construirse, conteniendo secuencias reguladoras apropiadas, incluyendo secuencias promotoras, secuencias terminadoras, secuencias de poliadenilación, secuencias potenciadoras, genes marcadores, y otras secuencias según sea apropiado. Los vectores podrían ser plásmidos, virales, por ejemplo fagos o fagémidos, según sea apropiado. Para detalles adicionales consultar, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muchas técnicas conocidas y protocolos para la manipulación de ácido nucleico, por ejemplo, en la preparación de construcciones de ácido nucleico, mutagénesis, secuenciación, introducción del ADN en las células, y expresión de genes, y análisis de proteínas, se describen con detalle en Short Protocols in Molecular Biology, segunda edición, Eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons, 1992. Los descubrimientos de Sambrook et al. y Ausubel et al. se incorporan en ésta por referencia.

Por tanto, un aspecto adicional de la presente invención proporciona una célula huésped que contiene ácido nucleico tal como se descubre en ésta. Todavía un aspecto ulterior proporciona un procedimiento que comprende introducir tal ácido nucleico en una célula huésped. La introducción podría emplear cualquier técnica disponible. Para las células eucariotas, las técnicas apropiadas podrían incluir la transfección con fosfato cálcico, el DEAE-dextrano, la electroporación, la transfección mediada por liposomas, y la transducción usando retrovirus u otros virus, por ejemplo, el virus de la viruela vacuna o, para células de insectos, baculovirus. Para células bacterianas, las técnicas apropiadas podrían incluir la transformación con cloruro de calcio, la electroporación y la transfección usando bacteriófagos.

La introducción podría seguirse causando o permitiendo la expresión a partir del ácido nucleico, por ejemplo, cultivando las células huésped en condiciones para la expresión del gen.

En una realización, el ácido nucleico de la invención se integra en el genoma (por ejemplo, el cromosoma) de la célula huésped. La integración podría promoverse mediante la inclusión de secuencias que promueven la recombinación con el genoma, de acuerdo con las técnicas estándares.

La presente invención también proporciona un procedimiento que comprende usar una construcción, tal como se menciona más arriba, en un sistema de expresión con objeto de expresar un \mue o un polipéptido como más arriba.

Los siguientes ejemplos ilustran aspectos y realizaciones de la presente invención.

Ejemplo 1 Identificación del scFv SL15S (CAT-191) y del JT182 Ejemplo 2 Construcción de líneas celulares que expresan el anticuerpo IgG4 SL15A (CAT- 192) e IgG4 SL15S (CAT-193) Ejemplo 3 Examen de las propiedades de neutralización del scFv SL15S (CAT-191) e IgG4 SL15A (CAT-192) e IgG4 SL15S (CAT-193) Ejemplo 4 Unión del anticuerpo scFv SL15S (CAT-191) e IgG4 SL15A (CAT-192) al TGF\beta_{1} activo y latente Ejemplo 5 Cartografiado del epítopo de los anticuerpos scFv SL15S y scFv CS37 Ejemplo 1 Identificación del scFv del SL15S (CAT-191) y del JT182

Los presentes inventores han identificado los CDR de anticuerpo y los dominios VH y VL relacionados con los del anticuerpo CS37 descubierto en WO97/13.844, pero con inesperadamente buenas propiedades.

La secuencia del dominio VH del CS37 (31G9) y el ácido nucleico que codifica la misma se muestran respectivamente en la SEC. Nº ID.: 2 y SEC. Nº ID.: 1.

La secuencia del dominio VH del SL15 (también conocido como KYLIE) de la presente invención y el ácido nucleico que codifica la misma se muestran respectivamente en la SEC. Nº ID.: 4 y SEC. Nº ID.: 3.

Las secuencias de los respectivos CDR3 del VH se muestran en la Tabla 1, también la Tabla 2 incluye las secuencias de los CDR1 y CDR2 para ambos dominios VH y VL.

La comparación de los dominios VH del CS37 (31G9) y del SL15 (Kylie) muestran tres diferencias adicionales en los residuos estructurales, en los residuos 1 (glutamina en el CS37 a glutamato en el SL15), 6 (glutamina en el CS37 aglutamato en el SL15), y 44 (glicina en el CS37 a glutamato en el SL15).

El dominio VH del SL15 podría emparejarse con diferentes dominios VL, y se han identificado dos variantes tales del SL15. Una, conocida como SL15A, incluye el VL del CS37. La otra, conocida como SL15S, incluye un VL que corresponde al VL del CS37 excepto por la presencia de serina en el residuo 25 en el SL15S en comparación con la alanina en el SL15A (CS37).

La secuencia del dominio VL del SL15A (CS37) y el ácido nucleico que codifica la misma se muestran respectivamente en la SEC. Nº ID.: 6 y SEC. Nº ID.: 5.

La secuencia del dominio VL del SL15S y el ácido nucleico que codifica la misma se muestran respectivamente en la SEC. Nº ID.: 8 y SEC. Nº ID.: 7.

La secuencia del dominio VH del JT182 (CS37) y el ácido nucleico que codifica la misma se muestran respectivamente en la SEC. Nº ID.: 10 y SEC. Nº ID.: 9.

El scFv del SL15S, el scFv del CS37, y un anticuerpo relacionado, el JT182, se examinaron como sobrenadantes de fagos en ensayos ELISA por su capacidad para unir el TGF\beta_{1}. La placas de ELISA (96 pocillos; Falcon) estaban sin recubrir, o recubiertas con TGF\beta_{1} recombinante (0,2 \mug/ml). Los fagos que se unieron específicamente a la placa recubierta con antígeno se detectaron usando un antisuero anti-fd de oveja (Pharmacia) seguido por anti-oveja conjugado con fosfatasa alcalina (Sigma) y p-nitrofenilfosfato (pNPP) como sustrato (Sigma).

Los fragmentos de scFv se ensayaron subsiguientemente por su capacidad para neutralizar la unión de ^{125}I-TGF\beta_{1} a células A549 en un ensayo de unión a radioreceptor (RRA), usando el protocolo descrito en el Ejemplo 3 (ver más abajo). Para el RRA, los clones individuales se expresaron como scFv soluble y se purificaron subsiguientemente a partir de preparaciones periplásmicas mediante cromatografía de afinidad con metal inmovilizado (IMAC) seguida por fraccionamiento del scFv monomérico mediante FPLC de filtración en gel con una columna Superdex 75 (Pharmacia).

El scFv del SL15S (VH del SL15/VL del SL15) tiene la potencia de neutralización más elevada en el RRA, dando una IC_{50} de 100 pM, la cual es al menos 100 veces mejor que la del CS37. La especificidad completa del scFv del SL15 por la isoforma TGF\beta_{1} ha sido confirmada en el ensayo con TF1, en donde no se ha detectado interacción alguna con el TGF\beta_{2} o TGF\beta_{3}.

Los anticuerpos scFv del SL15S (VH del SL15/VL del SL15; CAT-191, también conocido como scFv de Kylie) y el SL15A (VH del SL15/VL del CS37) se convirtieron en anticuerpos completos.

Ejemplo 2 Construcción de líneas celulares que expresan el anticuerpo IgG4 SL15A (CAT-192) e IgG4 SL15S (CAT-193)

Para la construcción de líneas celulares que expresaran IgG4 humana y anticuerpos K, los dominios variables de la cadena pesada y ligera del scFv del SL15 se clonaron en vectores de expresión en mamíferos que contenían respectivamente los dominios constantes de IgG4 humana y kappa humana. Se prepararon dos versiones, IgG4 SL15A (CAT-192) e IgG4 SL15S (CAT-193). Los anticuerpos también se denominan IgG de Kylie.

Vector de expresión de la cadena pesada

El VH procedente del ADN del scFv del SL15S se amplificó mediante PCR con los oligonucleótidos P80 (SEC. Nº ID.: 25) y P64 (SECID 22), y se unieron mediante PCR de solapamiento con un fragmento de ADN de 159 p.b. que contenía una secuencia señal, sitios de empalme, y el intrón procedente del M13VHPCR1 (Orlandi, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833-3837 (1989)) usando los oligonucleótidos P10 (SECID 20) y P64 (SECID 22). El producto de 558 p.b. de la PCR se cortó con HindIII y ApaI y se clonó en pGamma4 (obtenido de Lonza Biologics) cortado con HindIII-ApaI. El ADN ligado se transformó en E. coli TG1 y se examinaron las colonias resistentes a la ampicilina. Se identificó un plásmido con la inserción correcta y se denominó pKylieVH\gamma4.

Vector de expresión de la cadena ligera

El V\kappa procedente del ADN del scFv del CS37 o del scFv del SL15S se amplificó mediante PCR con los oligonucleótidos P65 (SEC. Nº ID.: 23) y P66 (SECID 24), y se unieron mediante PCR de solapamiento con un fragmento de ADN de 168 p.b. que contenía una secuencia señal, sitios de empalme, y el intrón procedente del M13VKPCR1 (Orlandi, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833-3837 (1989)) usando los oligonucleótidos P11 (SECID 21) y P66 (SECID 24). El producto de 510 p.b. de la PCR se cortó con BstBI y BsiWI y se clonó en pMR15.1 cortado con BstBI-BsiWI. El ADN ligado se transformó en E. coli TG1 y se examinaron las colonias resistentes a la ampicilina. Se identificó un plásmido con la inserción correcta y se denominó pCS37\kappa o pKylie\kappa.

Vector de expresión en tándem

Para cada variante del Kylie se construyó un plásmido sencillo que contenía ambos, los ADN de la cadena pesada y ligera, y el marcador seleccionable gs. El vector de la cadena pesada, pKylieVH\gamma4, se digirió con BamHI y NotI, y se purificó el fragmento de 4497 p.b. que contenía el ADN de la cadena H. El vector de la cadena ligera, pCS37\kappa o pKylie\kappa, se cortó de igual forma con BamHI y NotI, y se aisló el fragmento de 9611 p.b. que contenía el ADN de la cadena L. Los dos fragmentos purificados se ligaron juntos, se transformaron en células de E. coli TG1 y se examinaron las colonias resistentes a la ampicilina. Se identificó un plásmido con las inserciones correctas y las regiones V se confirmaron mediante secuenciación. El vector de expresión final se denominó pKylie4\gammas. Se prepararon dos versiones conteniendo el VL del SL15S y el VL del CS37.

Expresión de la IgG4 SL15A e IgG4 SL15S

La IgG4 SL15S y la IgG4 SL15A se expresaron en la línea celular de mieloma de ratón NS0 (ECEACC 85110503). Se linearizaron cincuenta \mug de pKylie4\gammas mediante digestión con Pvul, se precipitaron con etanol, y se disolvieron en 100 \mul de agua. Se lavaron 10^{7} células NS0 en PBS, se resuspendieron en 0,9 ml de PBS, se mezclaron con el ADN vector, y se mantuvieron en hielo durante 5 minutos. A continuación, se electroporaron las células con un único pulso de 250 V a 960 \muFd, y se incubaron en hielo durante 10 minutos. Las células transfectadas se añadieron entonces a 30 ml de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía glutamina 2 mM y un 10% de suero fetal bovino (FCS) dializado, tal como se describe en Bebbington et al., Bio/Technology 10:169-175 (1992), y se distribuyeron alícuotas de 50 \mul en placas de 6\times96 pocillos. 24 horas más tarde, se añadió DMEM sin glutamina/10% de FCS (Bebbington et al., 1992) a cada pocillo.

De tres a seis semanas después de la transfección, se examinaron las colonias mediante ELISA por su capacidad para secretar IgG humana. Los pocillos de las placas de ELISA (Immulon 4, Dynatech) se recubrieron en bicarbonato/carbonato sódico 50 mM, pH 9,6, con 100 ng por pocillo de anticuerpos IgG anti-humanos de cabra (Harlan). El sobrenadante de los pocillos que contenían colonias transfectadas se añadió a los pocillos en PBS que contenía un 0,05% (v/v) de Tween 20 (PBST) durante 1 hora. Las placas se lavaron 3 veces con PBST y la IgG humana capturada se detectó con 100 \mul de una dilución 1:2000 de anticuerpos kappa anti-humanos de cabra conjugados con peroxidasa de rábano silvestre (HRP) en PBST (Harlan). Transcurridos 30 minutos a temperatura ambiente, se lavaron las placas 3\times con PBST y se añadieron 100 \mul de sustrato OPD. Las reacciones se detuvieron después de 5-10 minutos mediante la adición de 50 \mul de ácido sulfúrico al 12,5% (v/v) y se midió la A 490 nm.

Los transfectantes que secretaban las mayores cantidades de IgG se expandieron para su crecimiento en medio sin glutamina en FCS reducido, en FCS libre de gammaglobulina, o sin FCS. Las líneas celulares se clonaron subsiguientemente mediante dilución limitada.

Purificación de la IgG

Los anticuerpos IgG4 humanos se purificaron mediante cromatografía de afinidad con proteína A, seguida por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). El sobrenadante procedente del cultivo de células NS0 transfectadas que secretaban IgG se clarificó mediante centrifugación y filtración a través de una membrana de 0,22 \mum. Se equilibró con NaCl 0,3 M, fosfato sódico 50 mM, pH 8,0, una columna con matriz de protein A Sepharose Fast Flow (Pharmacia) y se aplicó el sobrenadante. A continuación se lavó extensivamente la columna con fosfato sódico 50 mM, pH 8,0. La IgG humana se eluyó con glicina 0,1 M-HCl pH 3,0. Las fracciones eluidas se neutralizaron con Tris HCl 1 M, pH 9,0, y las fracciones que contenían proteína se identificaron midiendo la absorbancia a 280 nm. La purificación mediante SEC fue con una columna Superdex 200 en PBS. La IgG se concentró finalmente mediante diafiltración frente a PBS libre de pirógenos usando un filtro YM30 MWCO (Amicon).

Ejemplo 3 Examen de las propiedades de neutralización del scFv SL15S (CAT-191) e IgG4 SL15A (CAT-192) e IgG4 SL15S (CAT-193)

La potencia de neutralización del TGF\beta_{1} se midió para el scFv del SL15S (scFv del Kylie) y sus derivados usando un ensayo de radioreceptor y un ensayo de proliferación celular (TF1).

Materiales

El ^{125}I-TGF\beta_{1} fue proporcionado por Amersham (rango de actividad específica 800-2200 Ci/mmol). El TGF\beta_{1}, \beta_{2}, \beta_{3}, TGF\beta_{1} latente, GM-CSF e IL-5 se obtuvieron de R&D Systems (Minneapolis, EE.UU.). El mAb de ratón de Genzyme contra los TGF\beta_{1}, \beta_{2} y \beta_{3} se obtuvo de Genzyme (Cambridge, MA, EE.UU.). La línea celular TF1 fue proporcionada por Robin Thorpe (NIBSC, R.U.) y se cultivó tal como se detalla más abajo. La línea celular de carcinoma epitelial de pulmón humano se obtuvo de la ATCC y se cultivó en DMEM con 10% de FCS y glutamina 2 mM. Todos los otros reactivos fueron proporcionados por Sigma.

Procedimientos Ensayo con radioreceptor

Se sembraron células A549 en placas de 24 pocillos a 2\times10^{5} células por pocillo durante 24 horas con objeto de conseguir >90% de confluencia. Inmediatamente antes del ensayo, las monocapas se lavaron dos veces con tampón (1:1 DMEM:Hams-F12) y con 0,5 ml de tampón de ensayo (1:1 DMEM:Hams-F12 + 0,1% de BSA). Se prepararon diluciones en serie de dos o tres veces en tampón de ensayo y se añadieron a un volumen igual de [^{125}I]TGF\beta_{1} 40 pM en tampón de ensayo.

Después de 1 hora a temperatura ambiente, se añadieron 0,5 ml de esta mezcla de anticuerpo/[^{125}I]TGF\beta_{1} por duplicado a las células (que ya estaban en 0,5 ml de tampón de ensayo), y se incubaron durante 1 hora a 37ºC. La concentración final de [^{125}I]TGF\beta_{1} fue de 10 pM. Se incluyeron controles como unión máxima (a células, sin anticuerpo) y unión mínima (pocillos incubados con el tampón pero sin células) al menos por triplicado.

Las placas finales se lavaron 4\times con PBS enfriado en hielo antes de añadir 0,8 ml de tampón de solubilización (Tris 25 mM, pH 7,5, 10% de glicerol, 1% de Triton-X100). Las placas se dejaron durante al menos 20 minutos sobre una plataforma de agitación antes de contar el contenido de cada pocillo usando un contador de gamma.

Los datos se expresaron, después de restar de la unión mínima, como % de la unión máxima.

En el estudio con el TGF\beta_{1} latente, el % del máximo se calculó para cada conjunto de condiciones (por ejemplo, en presencia de TGF\beta_{1} latente, de TGF\beta_{1} latente activado con ácido, o de TGF\beta_{1} activo).

(Lucas, C., et al., Meth. in Enzymology 198:303-316 (1991))

Ensayo con TF1

Las células TF1 se cultivaron rutinariamente en RPMI1640 que contenía un 5% de FCS y glutamina 2 mM (medio de cultivo) con 2 ng/ml de GM-CSF. Inmediatamente antes del experimento, las células se lavaron dos veces y se resuspendieron a 4\times10^{5} células/ml en medio fresco suplementado con 4 ng/ml de IL-5, bien con o sin TGF\beta_{1}, \beta_{2} o \beta_{3} (cada uno a 50 pM) y se transfirieron alícuotas de 100 \mul a placas de 96 pocillos. Las preparaciones de scFv usadas en este ensayo eran fracciones purificadas mediante FPLC, las cuales tenían la endotoxina suprimida.

Los anticuerpos (series de dilución por dos veces) se prepararon en medio de cultivo, y se añadieron 100 \mul a las células por duplicado. Los controles fueron células sólo con TGF\beta (sin anticuerpo, máxima inhibición del crecimiento) y células sin TGF\beta y sin anticuerpo (inhibición mínima). Las células se incubaron durante 48 horas a 37ºC.

Al final del ensayo se ensayó el número de células usando CellTiter96 (Promega) y los datos se expresaron como % de neutralización, es decir:

% neutralización = \frac{\text{(valor del ensayo - inhibición máxima)}}{\text{(inhibición mínima - inhibición máxima)}} x100

En el estudio del TGF\beta_{1} latente, los datos se expresaron como % del control (crecimiento en ausencia de TGF\beta_{1}), como la cantidad de TGF\beta_{1} activo en cada condición de ensayo cambiada.

(Randall, L.A., et al., J. Immunol. Meth. 164:61-67 (1993)).

Producción de anticuerpos

Los anticuerpos scFv y los anticuerpos IgG4 se prepararon y purificaron tal como se describe más arriba.

Resultados Potencia del scFv del SL15S (CAT-191) y de la IgG4 del SL15A (CAT-192) en un bioensayo (ensayo con TF1)

Se investigó la capacidad del scFv del SL15S (CAT-191) para reconocer el TGF\beta_{1} pero no el TGF\beta_{2} o \beta_{3} en el ensayo con TF1.

El scFv del SL15S (también conocido como scFv del Kylie) neutralizó la inhibición del crecimiento inducida por el TGF\beta_{1}, pero no la inducida por el TGF\beta_{2} o TGF\beta_{3} (Figura 1). Como control se usó un anticuerpo monoclonal, el Mab 1.D.11.15 de Genzyme (Genzyme, Dasch, J.R. et al., J. Immunol. 142:1536-1541 (1989)), el cual neutraliza el TGF\beta_{1}, TGF\beta_{2}, y TGF\beta_{3}. Se ha visto que el Mab 1.D.11.16 es efectivo en modelos de fibrosis pulmonar, fibrosis inducida por radiación (Barcellos-Hoff, patente estadounidense nº 5.616.561, 1997) y de la artritis reumatoide (Wahl et al., J. Exp. Medicine 177:225-230 (1993)). El scFv del SL15S muestra una potencia comparable a la del Mab 1.D.11.16 de Genzyme control contra el TGF\beta_{1}.

La actividad de la IgG4 del SL15A (CAT-192, también denominada IgG4 de Kylie) también se observó en el ensayo con TF1 (Figura 5B) en el estudio que usaba TGF\beta_{1} latente.

Potencia del scFv del SL15S (CAT-191), de la IgG4 del SL15A (CAT-192), y de la IgG4 del SL15S (CAT-193) en el ensayo de radioreceptor

La capacidad del scFv del SL15S parar reconocer el TGF\beta_{1} y neutralizar la unión del TGF\beta_{1} a células A549 se midió en un ensayo de radioreceptor.

En una comparación de his-preps de scFv, el SL15S (Kylie) se comparó con los anticuerpos progenitores CS37 y JT182 (Figura 2), y se halló que era de 100 a 150 veces y 10 veces más activo. El SL15 se reformateó como IgG en dos formas, IgG4 de SL15A (CAT-192) e IgG4 de SL15S (CAT-193). También se analizaron las preparaciones purificadas de scFv de SL15S, IgG4 de SL15A, IgG4 de SL15S, y Mab 1.D.11.16 (mAb de Genzyme) (Figura 3).

El scFv del SL15S tenía una potencia comparable a la del Mab 1.D.11.16 de Genzyme, el cual es efectivo en modelos animales. En resumen, el scFv del SL15S es un anticuerpo altamente potente, neutralizante para el TGF\beta_{1}, con valores de IC_{50} en el rango de 0,03 a 0,1 nM.

Ejemplo 4 Unión del anticuerpo scFv SL15S (CAT-191) e IgG4 SL15A (CAT-192) al TGF\beta_{1} activo y latente

Los experimentos descritos en este ejemplo demostraron que el scFv del SL15S y la IgG4 del SL15A se unen a y neutralizan el TGF\beta_{1} activo, pero no el latente.

El TGF\beta_{1} latente es la forma biológicamente inactiva en la cual el TGF\beta_{1} se secreta de las células, y está compuesto por un dímero de péptido asociado a latencia (consistente en dos monómeros de 249 aminoácidos) y un dímero de TGF\beta_{1} maduro (consistente en dos monómeros de 112 aminoácidos). El TGF\beta_{1} latente no es reconocido por los receptores del TGF\beta de la superficie celular.

Se cree que el TGF\beta_{1} activo es liberado por la acción de proteasas in vivo, las cuales pueden ser imitadas por la acidificación in vitro.

El TGF\beta_{1} latente, tiene una ED50 descrita de 0,43 nM y 0,2 pM respectivamente antes y después de la acidificación, tal como se ensayó en un ensayo de proliferación. El TGF\beta_{1} activo tiene una ED50 en un ensayo de proliferación de 2 pM. Presumiblemente, el efecto del TGF\beta_{1} latente antes de la acidificación se debe a la presencia de algo de TGF\beta_{1} activo. Esta actividad residual debe ser tenida en cuenta en la interpretación de los resultados.

La potencia del scFv del SL15S y de la IgG4 del SL15A se ensayó usando el ensayo de radioreceptor y el ensayo de proliferación de TF1 en presencia de diferentes cantidades de TGF\beta_{1} latente, TGF\beta_{1} activado con ácido, y TGF\beta_{1} activo. Si los anticuerpos reconocen el TGF\beta_{1} latente, su potencia debería reducirse. La interpretación de ambos ensayos es complicada por el hecho de que cualquier TGF\beta_{1} activo presente en la preparación latente competirá con el [^{125}I]TGF\beta_{1} por la unión y tendrá actividad biológica sobre las células.

El TGF\beta_{1} latente se activó con ácido mediante la adición de 2 \mul de HCl 0,5 M a 1 ml de TGF\beta_{1} latente durante 15 minutos, a temperatura ambiente, a continuación se neutralizó con 43 \mul de NaOH 0,05 M/HEPES 0,01 M.

Los resultados muestran que en el ensayo de radioreceptor no hay un efecto significativo del TGF\beta_{1} latente (0,1 nM) sobre la potencia del scFv de SL15S (scFv de Kylie) o el IgG4 de SL15A (IgG de Kylie), mientras que la activación con ácido del TGF\beta_{1} latente, o una concentración equivalente de TGF\beta_{1} activo, reduce la capacidad del anticuerpo para neutralizar la unión del [^{125}I]TGF\beta_{1} (Figura 4).

El ensayo de proliferación de TF1 fue muy sensible a la actividad del TGF\beta_{1} activo en la preparación de TGF\beta_{1} latente. No obstante, se halló que el scFv de SL15S o el IgG4 de SL15A eran capaces de neutralizar la pequeña proporción de TGF\beta_{1} activo de la preparación latente, y cuando el TGF\beta_{1} latente se activa con ácido lo neutralizan efectivamente (Figura 5).

Por tanto, el SL15, en el formato scFv o IgG, se une y neutraliza sólo el TGF\beta_{1} activo pero no el latente, tal como se midió mediante ambos, el ensayo de radioreceptor y el de neutralización de TF1.

Ejemplo 5 Cartografiado del epítopo de los anticuerpos scFv SL15S y scFv CS37

En este ejemplo se determinó el epítopo sobre el TGF\beta_{1} al cual se unen los anticuerpos CS37 y SL15S.

El TGF\beta_{1} y TGF\beta_{2} tienen estructuras similares pero difieren en su afinidad de unión por el repector del Tipo II del TGF\beta y su potencia en un cierto número de ensayos biológicos (O.G. Ottmann y L.M. Pelus, J. Immunol. 140:2661-2665 (1988); J.R. Merwin et al., Am. J. Pathol. 138:37-51 (1991); K.C. Flanders et al., Development 113:183-191 (1991); L. Suardet et al., Cancer Res. 52:3705-3712 (1992); Qian et al., J. Biol. Chem. 271:30656-30662 (1996)) se han aprovechado de las diferencias en afinidad para identificar los residuos clave implicados en la unión con alta afinidad del TGF\beta_{1} al receptor del Tipo II. Esto se ha realizado construyendo una serie de moléculas quiméricas entres el TGF\beta_{1} y el TGF\beta_{2} para identificar aquellas especies que retienen una unión al receptor con elevada afinidad in vitro (Qian et al., ver más arriba) e in vivo (J.K. Burmester et al., Growth Factors 15:231-242 (1998)). De esta forma, se identificó que la región C-terminal abarcada por los residuos 83-112 del TGF\beta_{1} era suficiente para retener una unión eficiente al receptor.

La comparación de las secuencias del TGF\beta_{1} y TGF\beta_{2} identificó varias diferencias, incluyendo un bucle consistente en los residuos 92-98, el cual incluye 4 diferencias de aminoácidos entre el TGF\beta_{1} y el TGF\beta_{2}. Cuando estos residuos del TGF\beta_{2} se introdujeron en el esqueleto del TGF\beta_{1}, la unión al receptor se redujo enormemente, identificando éstos como residuos clave en la interacción del TGF\beta_{1} con el receptor del Tipo II.

Las moléculas quiméricas se usaron de forma similar para cartografiar el sitio de unión del CS37 y scFv de SL15S (CAT-191) sobre el TGF\beta_{1}. El TGF\beta_{1}/\beta_{2} (83-112) corresponde a la región N-terminal y central del TGF\beta_{1} procedente de los residuos 1-82, fusionados con la región C-terminal del TGF\beta_{2} procedente de los residuos 83-112. El TGF\beta_{2}/\beta_{1} 83-112 corresponde a la región N-terminal y central del TGF\beta_{2} procedente de los residuos 1-82, fusionados con la región C-terminal del TGF\beta_{1} procedente de los residuos 83-112. Finalmente, el TGF\beta_{1}-\beta_{2} (40-112) corresponde a la región N-terminal del TGF\beta_{1} procedente de los residuos 1-39, y la región central y C-terminal del TGF\beta_{2} procedente de los residuos 40-112. Éstas se denominan en ésta como 1-1-2, 2-2-1 y 1-2-2 respectivamente, para reflejar la composición relativa de las isoformas.

Estas tres moléculas junto con el TGF\beta_{1} y TGF\beta_{2} se analizaron mediante la inhibición de unión del scFv de SL15S y scFv de CS37 a TGF\beta_{1} inmovilizado, tal como sigue.

Se prepararon fagos que exhibían el scFv de SL15S o scFv de CS37 a partir de clones en pCANTAB6, mediante superinfección con M13K07. Los fagos de precipitaron con PEG y se resuspendieron en PBS que contenía 2% de Marvel. Los fagos (2,5 a 5\times10^{10} en 50 \mul) se añadieron durante 30 minutos a un placa de ELISA previamente bloqueada y recubierta con TGF\beta_{1} a 0,5 \mug/ml.

Para el análisis de inhibición, se usó la misma concentración de fagos y una serie de diluciones de las concentraciones de TGF\beta_{1} establecidas para cada una de la moléculas quiméricas de TGF\beta descritas más arriba (obsequio de J. Burmester, National Institutes of Health) y las isoformas TGF\beta_{1} y \beta_{2}.

Estas se incubaron durante la noche a 4ºC antes de añadirlas a la placa de ELISA. Los fagos que se unieron específicamente a la placa recubierta con antígeno se detectaron usando un antisuero anti-fd de oveja (Pharmacia) seguido por inmunoglobulina anti-oveja conjugada con fosfatasa alcalina (Sigma) y p-nitrofenilfosfato (pNPP) como sustrato (Sigma).

El valor no inhibido (es decir, 0 nM) para el Kylie fue de 1,67 (promedio de 3 lecturas) y para el CS37 fue de 1,216 (promedio de 7 lecturas). Los resultados mostrados en las Figuras 6 y 7 indican que los epítopos reconocidos tanto por el scFv de CS37 como por el scFv de SL15S residen entre los residuos 83-112 del TGF\beta_{1}. Más aún, la molécula mutante TGF\beta_{1}-TGF\beta_{2} (92-98) que comprende el TGF\beta_{1} con la secuencia del TGF\beta_{2} desde los residuos
92-98 también inhibe la unión del scFv de CS37 y SL15S al TGF\beta_{1}, pero con efecto reducido, especialmente para el scFv de SL15S. Esto demuestra que al menos parte del epítopo reconocido por estos residuos de anticuerpo dentro de la región 92-98 (que tiene cuatro residuos, en las posiciones 92, 94, 95 y 98, que difieren entre el TGF\beta_{1} y el
TGF\beta_{2}).

Ejemplo 6 Aceleración de la curación de cicatrices epiteliales corneales en presencia del anticuerpo monoclonal anti-TGF\beta_{1} IgG4 SL15A (CAT-192)

El TGF\beta_{1} ha sido implicado en la modulación de la curación de cicatrices (tanto oculares como dérmicas) y se ha observado que inhibe la velocidad de re-epitelización corneal. Aquí se examinó el efecto de la aplicación tópica de la IgG4 de SL15A (CAT-192) sobre la velocidad de curación de heridas epiteliales corneales usando un modelo de cultivo de órgano (D.M. Foreman et al., Exp. Eye Res. 62:555-564 (1996)).

Se crearon heridas mediante excisión con trepano (5 mm de diámetro, 250 \mum de profundidad) sobre córneas bovinas. Los anillos de esclera corneales mantuvieron en un sistema de cultivo de órganos con interficie con aire, libre de suero, durante hasta 96 horas. En el momento de la herida, y dos días más tarde, se añadieron gota a gota 100 \mul de medio de T8 libre de suero sobre la superficie epitelial y limbus conteniendo: (i) 10 ng/ml de TGF\beta; (ii) 100 \mug/ml de mAb anti-TGF\beta_{1}; (iii) una combinación de (i) y (ii); (iv) 100 mug/ml de anticuerpo nulo (IgG4 de 2G6); (v)
100 mg/ml de diluyente de anticuerpo; o (vi) sin adiciones (n=9 para cada grupo). La re-epitelización se verificó usando un sistema de análisis de imágenes y se expresó como porcentaje del área lesionada original cubierta por el epitelio.

Las córneas control que recibieron medio solo, anticuerpo nulo o diluyente de anticuerpo completaron la re-epitelización transcurridas 72 horas. El tratamiento con 100 \mug/ml de mAb anti-TGF\beta incrementó la velocidad de re-epitelización de tal forma que las córneas estaban completamente re-epiteliadas a las 48 horas (Figura 8). Las corneas tratadas con 10 ng/ml de TGF\beta_{1} presentaron una re-epitelización retrasada en 24 horas, y este efecto inhibidor fue suprimido por el mAb anti-TGF\beta_{1} (Figura 9). Todas las diferencias mencionadas son significativas (p > 0.05). Se realizó la regresión lineal de los puntos experimentales entre las 2 y 48 horas (ver Figura 8) para determinar la velocidad de re-epitelización. El CAT-192 causó un incremento significativo en esta variable (Tabla 3). El análisis histológico sustentó los resultados del análisis de imágenes, y confirmó que la adición de mAb anti-TGF\beta_{1} no afectaba adversamente la arquitectura corneal.

TABLA 3

3

Los resultados confirman el importante papel del TGF\beta_{1} endógeno en la reparación del epitelio corneal y proporciona indicación de que la aplicación tópica del mAb anti-TGF\beta_{1} IgG4 de SL15A (CAT-192) podría usarse para promover la curación mejorada de heridas in vivo.

SEC. Nº ID. :1

Ácido nucleico que codifica el VH del CS37 (31G9)

\vskip1.000000\baselineskip

5

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. Nº ID. :2

Secuencia de aminoácidos del VH del CS37 (31G9)

\vskip1.000000\baselineskip

6

SEC. Nº ID. :3

Ácido nucleico que codifica el VH del SL15

\vskip1.000000\baselineskip

7

\newpage

SEC. Nº ID. :4

Secuencia de aminoácidos del VH del SL15

\vskip1.000000\baselineskip

8

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. Nº ID. :5

Ácido nucleico que codifica el VL del SL15A (CS37)

\vskip1.000000\baselineskip

9

\newpage

SEC. Nº ID. :6

Secuencia de aminoácidos del VL del SL15A (CS37)

10

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. Nº ID. : 7

Ácido nucleico que codifica el VL del SL15S

\vskip1.000000\baselineskip

11

\newpage

SEC. Nº ID. : 8

Secuencia de aminoácidos del VL del SL15S

\vskip1.000000\baselineskip

12

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. Nº ID. : 9

Ácido nucleico que codifica el VH del JT182

\vskip1.000000\baselineskip

13

\newpage

SEC. Nº ID. : 10

Secuencia de aminoácidos del VH del JT182

14

SEC. Nº ID. : 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

SYGMH

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. Nº ID.: 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

VISYDGSIKYYADSVKG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. Nº ID. : 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGEYSGYDTDPQYS

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. Nº ID. : 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGEYSGYDTSGVEL

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. Nº ID. : 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGEYSGYDTPASPD

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. Nº ID. : 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

RASQGIGDDLG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. Nº ID. : 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTSTLQS

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. Nº ID. : 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

LQDSNYPLT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. Nº ID. : 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

RSSQGIGDDLG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. Nº ID. : 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTAAGCTTACTGAGCACACAGGACCTCACC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. Nº ID. : 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AATTTTCGAACTACAGTTACTGAGCACACAGGAPGG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. Nº ID. : 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGGGCCCTTGGTGGAAGCTGAGG

\hfill

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGACGGTGACCGTGGTCCCTTG

\hfill

\newpage

SEC. Nº ID. : 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGGATATCTCTCCACAGGTGTCCACT

\hfill

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGAAATTGTGCTGACTCAGTCTCCA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. Nº ID. : 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTACCGTACGTTTAATCTCCAGTCGTGTCCCTCCGCCGAA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

SEC. Nº ID. : 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGGATATCTCTCCACAGGTGTCCACT

\hfill

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

<110> Cambridge Antibody Technology Limited

\hskip1.1cm

Thompson, Julia E.

\hskip1.1cm

Lennard, Simon N.

\hskip1.1cm

Wilton, Alison J.

\hskip1.1cm

Braddock, Peta S.H.

\hskip1.1cm

Du Fou, Sarah L.

\hskip1.1cm

McCafferty, John G.

\hskip1.1cm

Conroy, Louise A.

\hskip1.1cm

Tempest, Philip R.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Miembros de unión específica contra el TGFbeta1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> AHB/CP5852983

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140> PCT/GB00/01679

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 2000-05-02

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/131.983

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1999-04-30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 369

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 123

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

16

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 369

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

17

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 123

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

18

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 321

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

19

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

20

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 321

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

21

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

22

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 369

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

23

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 123

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

24

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Tyr Gly Met His}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Ile Lys Tyr}

\sac{Tyr Ala Asp Ser Val Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Ala Ser Gln Gly Ile Gly Asp Asp Leu Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Thr Ser Thr Leu Gln Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Gln Asp Ser Asn Tyr Pro Leu Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Ser Ser Gln Gly Ile Gly Asp Asp Leu Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctaagcttac tgagcacaca ggacctcacc

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aattttcgaa ctacagttac tgagcacaca ggacc

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgggccctt ggtggaagct gaggagacgg

\hfill

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgaccgtggt cccttg

\hfill

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttggatatct ctccacaggt gtccactccg

\hfill

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaattgtgct gactcagtct cca

\hfill

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctaccgtacg tttaatctcc agtcgtgtcc

\hfill

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctccgccgaa

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttggatatct ctccacaggt gtccactccg

\hfill

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggtgcagct ggtggagtct gg

\hfill

52

Claims (27)

1. Miembro de unión específica aislado capaz de unir el TGF\beta_{1}, en donde dicho miembro de unión específica comprende un dominio de unión a antígeno que comprende un CDR3 de VH con una secuencia de aminoácidos sustancialmente tal como se dispone en el CDR3 del VH del SL15, identificado por la SEC. Nº ID.: 13, o el CDR3 del VH del JT182, identificado por la SEC. Nº ID.: 15.

2. Miembro de unión específica según la reivindicación 1, que además comprende un CDR1 de VH o un CDR2 de VH con una secuencia de aminoácidos sustancialmente tal como se dispone en uno o ambos del CDR1 de VH de CS37, identificado por la SEC. Nº ID.: 11, y CDR2 de VH de CS37, identificado por la SEC. Nº ID.: 12.

3. Miembro de unión específica según la reivindicación 1 ó 2, el cual comprende además una secuencia de CDR1 tal como se dispone en el CDR1 de VH de CS37, identificado por la SEC. Nº ID.: 11, y en el CDR2 de VH de CS37, identificado por la SEC. Nº ID.: 12.

4. El miembro de unión específico de la reivindicación 3 en donde dichas secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 están portadas por una estructura de anticuerpo humano.

5. Miembro de unión específica aislado capaz de unir el TGF\beta_{1}, en donde dicho miembro de unión específica comprende el dominio VH del SL15 sustancialmente tal como se detalla en la SEC. Nº ID.: 4.

6. Miembro de unión específica aislado capaz de unir el TGF\beta_{1}, en donde dicho miembro de unión específica comprende el dominio VH del JT182 sustancialmente tal como se detalla en la SEC. Nº ID.: 10.

7. Miembro de unión específica aislado capaz de unir el TGF\beta_{1}, en donde dicho miembro de unión específica comprende el dominio VL del SL15S sustancialmente tal como se detalla en la SEC. Nº ID.: 8.

8. Miembro de unión específica aislado capaz de unir el TGF\beta_{1}, en donde dicho miembro de unión específica comprende:

(i)

un dominio VH seleccionado de entre el grupo del dominio VH del SL15 sustancialmente tal como se detalla en la SEC. Nº ID.: 4, y el dominio VH de JT182 sustancialmente tal como se detalla en la SEC. Nº ID.: 10; y

(ii)

un dominio VL seleccionado de entre el grupo del dominio VL del SL15S sustancialmente tal como se detalla en la SEC. Nº ID.: 8, y el dominio VL de SL15A sustancialmente tal como se detalla en la SEC. Nº ID.: 6.

9. El miembro de unión específica aislado de la reivindicación 8 en donde el dominio VH es el dominio VH del SL15 sustancialmente tal como se detalla en la SEC. Nº ID.: 4.

10. El miembro de unión específica aislado de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en la forma de un Fv de cadena sencilla (scFv).

11. El miembro de unión específica aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en la forma de una IgG.

12. El miembro de unión específica aislado de la reivindicación 11, en donde dicha IgG es una IgG1 o IgG4.

13. Composición farmacéutica que comprende el miembro de unión específica de cualquiera de las reivindicaciones precedentes en asociación con un excipiente, portador, tampón o estabilizador farmacéuticamente aceptable.

14. Miembro de unión específica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, o una composición de la reivindicación 13, para su uso en un procedimiento de tratamiento del humano o animal.

15. Miembro de unión específica o composición para su uso según la reivindicación 14, en donde dicho tratamiento es para tratar una condición asociada con la deposición de matriz extracelular en un paciente, incluyendo la glomerulonefritis, la cicatrización queloide y hipertrófica, la vitreoretinopatía proliferativa, la cirugía de drenaje del glaucoma, la lesión corneal y las cataratas.

16. Miembro de unión específica o composición para su uso según la reivindicación 14 en un procedimiento para modular la respuesta inmune o inflamatoria.

17. Miembro de unión específica o composición para su uso según la reivindicación 14 en un procedimiento de tratamiento de un tumor.

18. Miembro de unión específica o composición para su uso según la reivindicación 17, en donde dicho tumor está asociado con la angiogénesis o metástasis.

19. Miembro de unión específica o composición para su uso según las reivindicaciones 17 ó 18, en donde dicho tumor es un tumor de mama, próstata, ovario, estómago, colorectal, de piel, de pulmón, cervical, y de vejiga urinaria, o una leucemia o sarcoma.

20. Miembro de unión específica o composición para su uso según la reivindicación 14 en un procedimiento para tratar asma.

21. Utilización de un miembro de unión específica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, o una composición según la reivindicación 13, para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de una condición en un paciente, estando la condición asociada con la expresión del TGF\beta_{1}.

22. Utilización según la reivindicación 21, en donde dicha condición está asociada con la deposición de matriz extracelular en un paciente, incluyendo la glomerulonefritis, la cicatrización queloide e hipertrófica, la vitreoretinopatía proliferativa, la cirugía de drenaje del glaucoma, la lesión corneal y las cataratas; un tumor, incluyendo un tumor que está asociado con la angiogénesis o metástasis y/o un tumor seleccionado de entre el grupo de tumores de mama, próstata, ovario, estómago, colorectal, de piel, pulmón, cervical, y de vejiga urinaria, o leucemias o sarcomas; o asma.

23. Procedimiento para determinar la cantidad de TGF\beta_{1} en una muestra que comprende, poner en contacto la muestra con un miembro de unión específica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, y determinar la cantidad de unión del miembro de unión específica al TGF\beta_{1} en la muestra.

24. Ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica el miembro de unión específica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

25. Procedimiento para preparar un miembro de unión específica capaz de unir el TGF\beta_{1}, comprendiendo dicho procedimiento in vitro la expresión del ácido nucleico de la reivindicación 24 en una célula hospedadora en condiciones que proporcionan la expresión de dicho ácido nucleico, seguida de la recuperación de dicho miembro de unión específica.

26. Procedimiento para obtener un dominio de unión de antígeno de anticuerpo específico para el TGF\beta_{1}, comprendiendo el procedimiento

proporcionar, mediante la adición, supresión, sustitución o inserción de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de un dominio VH, seleccionado de entre la SEC. Nº ID.: 4 y SEC. Nº ID.: 10, un dominio VH que es una variante de la secuencia de aminoácidos del dominio VH, y combinar el dominio VH así proporcionado con uno o más dominios VL para proporcionar una o más

\hbox{combinaciones VH/VL; y/o}

proporcionar, mediante la adición, supresión, sustitución o inserción de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos del dominio VL de SEC. Nº ID.: 8, un dominio VL que es una variante de la secuencia de aminoácidos del dominio VL, y combinar el dominio VL así proporcionado con uno o más dominios VH para proporcionar una o más combinaciones VH/VL; y

ensayar la combinación o combinaciones VH/VL para identificar un dominio de unión de antígeno de anticuerpo específico para el TGF\beta_{1}.

27. Procedimiento para preparar un miembro de unión específica para el TGF\beta_{1}, procedimiento que comprende:

proporcionar un repertorio de partida de ácidos nucleicos que codifican un dominio VH, el cual, o bien incluye un CDR3 a remplazar, o carece de una región codificante de CDR3;

combinar dicho repertorio con un ácido nucleico donante que codifica una secuencia de aminoácidos sustancialmente tal como se detalla en ésta para el CDR3 del VH del SL15 o JT182, de tal manera que dicho ácido nucleico donante se inserta en la región CDR3 en el repertorio, con el fin de proporcionar un repertorio de producto de ácidos nucleicos que codifican un dominio VH; y

proporcionar un repertorio inicial de ácidos nucleicos que codifican un dominio VL que incluye un CDR3 a ser sustituido o bien carece de una región codificante de CDR3, combinar dicho repertorio con un ácido nucleico donante que codifica una secuencia de aminoácidos sustancialmente tal como se detalla en ésta para el CDR3 del VL del SL15, de tal manera que dicho ácido nucleico donante se inserta en la región CDR3 en el repertorio, con el fin de proporcionar un repertorio de producto de ácidos nucleicos que codifican un dominio VL; y

expresar los ácidos nucleicos de dicho repertorio;

seleccionar un miembro de unión específica para el TGF\beta_{1}; y

recuperar dicho miembro de unión específica o el ácido nucleico que lo codifica.