DE60012500T2

DE60012500T2 - Antikörper und antikörperfragmente mit spezifität für tgfbeta1

Info

Publication number: DE60012500T2
Application number: DE60012500T
Authority: DE
Inventors: Elizabeth Julia Whittlesford THOMPSON; Nicholas Simon Haverhill LENNARD; Jane Alison WILTON; Sally Peta Huntingdon BRADDOCK; Leila Sarah Hitchin DU FOU; Gerald John Babraham MCCAFFERTY; Anne Louise Cambridge CONROY; Ronald Philip West Wratting TEMPEST
Original assignee: Cambridge Antibody Technology Ltd
Current assignee: MedImmune Ltd
Priority date: 1999-04-30
Filing date: 2000-05-02
Publication date: 2005-08-11
Anticipated expiration: 2020-05-03
Also published as: NO20015261L; DE60012500D1; EP1175445B1; BR0010162A; ATE272073T1; NO20015261D0; IL145813A0; NZ514759A; US20030091566A1; ES2225132T3; CA2370304A1; EP1175445A1; WO2000066631A1; US6492497B1; US20030064069A1; GB2350612B; GB2350612A; AU768554B2; AU4588600A; GB0010568D0

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft spezifische Bindungselemente, insbesondere Antikörper und Fragmente davon, die an transformierenden Wachstumsfaktor 1 (TGFβ₁) binden. Im Speziellen behandelt die Erfindung spezifische Bindungselemente, welche die VH CDR3 des Antikörpers SL15 (der ehemals als Kylie bekannte Antikörper), speziell die SL15-VL-Domänen umfassen, die mit den SL15A- oder SL15S-VL-Domänen kombiniert sein können. Darüber hinaus betrifft die Erfindung die Verwendung derartiger spezifischer Bindungselemente in pharmazeutischen Präparaten, insbesondere für die Behandlung fibrotischer Krankheit, für die Modulierung der Wundheilung und die Behandlung von Krebs.
Hintergrund der Erfindung
PCT/GB96/02450, veröffentlicht als WO 97/13844, offenbart die Isolierung von für menschlichen TGFβ₁ spezifischen Antikörpern und von für TGFβ₂ spezifischen Antikörpern. Sie beschreibt Antikörper mit der 31G9-VH-Domäne und Varianten der Domäne. Im Speziellen beschrieb die Anmeldung den Antikörper CS37, der die 31G9-Domäne gemeinsam mit der CS37 VL sowie Varianten dieser Domäne umfasst, einschließlich Antikörper, die:

(i) im ELISA mit CS37 um Bindung an TGFβ₁ konkurrieren,
(ii) TGFβ₁ in Bezug auf TGFβ₃ bevorzugt binden, und
(iii) TGFβ₁ neutralisieren.

Offenbarung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Identifizierung von Antikörpern, die mit CS37 verwandt sind, jedoch unerwartet vorteilhafte Eigenschaften bezüglich der Bindung und Neutralisierung von TGFβ₁ aufweisen. Sie binden oder neutralisieren TGFβ₂ oder TGFβ₃ nicht.
Antikörper der vorliegenden Erfindung neutralisieren in hohem Ausmaß aktiven TGFβ₁. Das Epitop für diese Antikörper liegt in der C-terminalen Region von TGFβ₁ (Reste 83-112) und umfasst die aus Resten 92-98 von TGFβ₁ bestehenden Schleife, die auch als Finger 2 bekannt ist, eine Region, die als mit dem Rezeptor für TGFβ wechselwirkend identifiziert worden ist. Die Antikörper binden in Bezug auf latenten TGFβ₁ bevorzugt an aktiven TGFβ₁.
Varianten von SL15S, die TGFβ₁ in hohem Ausmaß neutralisieren, werden hierin ebenfalls offenbart. Diese unterscheiden sich hauptsächlich durch Aminosäuresubstitutionen in der CDR3 von VH- oder VL-Domänen. Es liegen jedoch andere Stellen vor, wo Substitutionen durchgeführt werden können, z.B. kann am Rest 25 in der Leichtkette ein Alanin substituiert werden, wobei der IgG4-Antikörper, SL15A IgG4, CAT-192 erzeugt wird. Es können mehrere Substitutionen vorgenommen werden, die mit der Erhaltung stark neutralisierender Aktivität kompatibel sind. Die Antikörper dieser Erfindung sind besonders zur Behandlung fibrotischer Krankheiten brauchbar, z.B. Lungenfibrose, Modulierung der Vernarbungsreaktion, z.B. bei Wundheilung und Hornhautvernarbung, sowie in anderen Zusammenhängen, die weiter unten erörtert werden, wie z.B. zur Behandlung von Tumoren.
Spezifische Bindungsproteine, wie z.B. Antikörper, die auf den Complementary-determining-regions (CDRs) der hierin identifizierten Antikörper-VH- und VL-Domänen beruhen, sind für die erörterten Zwecke zweckdienlich und stellen Aspekte der vorliegenden Erfindung dar.
Die besonders bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung und ihre verschiedenen Aspekte basieren auf der hierin identifizierten VH CDR3 der SL15-VH-Domäne, auf VH-Domänen, weiche die SL15 VH CDR3, speziell die SL15-VH-Domäne selbst umfassen, und Paarungen solcher VH-Domänen mit VL-Domänen, im Speziellen mit den SL15A- oder SL15S-VL-Domänen oder einer anderer VL-Domäne, welche die SL15 VL CDR3 umfasst. Die Antikörper-Antigen-Bindungsdomäne SL15 (in welchem Format auch immer, z.B. scFV oder IgG4) besteht aus der SL15 VH und, in zwei Varianten, entweder aus der SL15A VL (CS37) oder SL15S VL (CS37 mit A25S). In allen Varianten handelt es sich bei SL15 um den ehemals als Kylie bekannten Antikörper. SL15S scFV ist auch als CAT 191 bekannt; SL15A IgG4 ist auch als CAT-192 bekannt; und SL15S IgG4 ist auch als CAT-193 bekannt.
Weitere Ausführungsformen der Erfindung basieren in ihren verschiedenen Aspekten auf der JT182 VH CDR3, VH-Domänen, welche die JT182 VH CDR3, speziell die JT182-VH-Domäne umfassen, und Paarungen solcher VH-Domänen mit VL-Domänen, im Speziellen mit der CS37-VL-Domäne. JT182 ist nicht so wirksam wie SL15, weist jedoch trotzdem unerwartet verbesserte Eigenschaften gegenüber CS37 auf.
In einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes spezifisches Bindungselement bereit, das zur Bindung an TGFβ₁ fähig ist, worin das spezifische Bindungselement eine Antigenbindungsdomäne umfasst, die eine VH CDR3 mit einer Aminosäuresequenz umfasst, wie sie im wesentlichen als VH CDR3 von SL15 oder JT182 in Tabelle 1 oder Tabelle 2 dargelegt ist. Tabelle 1: Anti-TGFβ₁-Klone, CDR3s und relative Potenz von scFv
Reste, die sich unter den scFv-Fragmenten unterscheiden, sind unterstrichen.
Die Erfindung stellt weiters das isolierte spezifische Bindungselement bereit, das außerdem eine VH CDR1 oder VH CDR2 mit einer Aminosäuresequenz umfasst, wie sie im Wesentlichen als eine oder beide der VH CDR1 und VH CDR2 der CS37 VH, vorzugsweise beide, dargelegt ist (Tabelle 2). Tabelle 2: CDR-Sequenzen der CDRs von CS37, SL15 und JT182
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Bindungsdomänen von einem menschlichen Antikörpergerüst getragen. Eines der bevorzugten Beispiele einer solchen Ausführungsform ist eine VH-Domäne mit einer Aminosäuresequenz, wie sie im Wesentlichen als die JT182-VH-Domäne dargelegt ist, deren Sequenz in Seq.-ID Nr. 10 dargelegt ist. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform ist eine VH-Domäne mit einer Aminosäuresequenz, wie sie im Wesentlichen als die SL15-VH-Domäne dargelegt ist, deren Sequenz in Seq.-ID Nr. 4 dargelegt ist.
In einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung ein isoliertes spezifisches Bindungselement bereit, das zur Bindung von TGFβ₁ fähig ist, worin das spezifische Bindungselement eine Antigenbindungsdomäne umfasst, die eine VL-Domäne mit einer Aminosäuresequenz umfasst, wie sie im Wesentlichen als die SL15S-VL-Domäne dargelegt ist, deren Sequenz in Seq.-ID Nr. 8 dargelegt ist.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein spezifisches Bindungselement bereit, das zur Bindung von TGFβ₁ fähig ist, das eine wie oben bezüglich des ersten Aspekts dargelegte VH-Domäne, sowie eine VL-Domäne umfasst, worin die VL-Domäne vorzugsweise eine Aminosäuresequenz aufweist, wie sie im Wesentlichen als die CS37 VL (SL15A), deren Sequenz in Seq.-ID Nr. 6 dargelegt ist, oder als die SL15S VL dargelegt ist, deren Sequenz in Seq.-ID Nr. 8 dargelegt ist.
In einer insbesondere bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung ein spezifisches Bindungselement bereit, das die CS37-VL-Domäne und eine aus JT182 VH und SL15 VH, insbesondere SL15 VH gewählte VH-Domäne umfasst. In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung ein spezifisches Bindungselement bereit, das SL15 VH und SL15A VL (CS37 VL) oder SL15S VL umfasst.
Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung stellen spezifische Bindungselemente bereit, welche die JT182-VH- oder SL15-VH-Domäne umfassen, bei denen 1, 2, 3, 4 oder 5 Aminosäuresubstitutionen in einer CDR, z.B. CDR3, und/oder FR vorgenommen worden sind, wobei die spezifischen Bindungselemente ihre Fähigkeit beibehalten, TGFβ₁ zu binden. Weitere bevorzugte Ausführungsformen stellen spezifische Bindungselemente bereit, welche die SL15A (CS37) VL oder SL15S VL, oder SL15A- oder SL15S-VL-Domäne umfassen, bei denen 1, 2, 3, 4 oder 5 Aminosäuresubstitutionen in einer CDR, z.B. CDR3, und/oder FR vorgenommen worden sind, wobei die spezifischen Bindungselemente die Fähigkeit beibehalten, TGFβ₁ zu binden. Derartige Aminosäuresubstitutionen sind im Allgemeinen „konservativ", beispielsweise die Substitution von einem hydrophoben Rest, wie z.B. Isoleucin, Valin, Leucin oder Methionin, durch einen anderen oder die Substitution von einem polaren Rest durch ei nen anderen, wie z.B. Lysin durch Arginin, Asparaginsäure durch Glutamin. An bestimmten Positionen sind nicht-konservative Substitutionen erlaubt.
Derartige spezifische Bindungselemente sind dazu fähig, TGFβ₁ zu binden. Bevorzugten Ausführungsformen fehlt eine signifikante Kreuzreaktivität mit TGFβ₂ und/oder TGFβ₃, vorzugsweise TGFβ₂ und TGFβ₃.
Bevorzugte Ausführungsformen neutralisieren TGFβ₁ in hohem Ausmaß mit einer Wirksamkeit, die in einem Radiorezeptortest (C. Lucas et al., Meth. in Enzymology 198, 303-316 (1991)) zumindest 5 Mal besser, bevorzugter zumindest 10 Mal, 15 Mal, 20 Mal, 50 Mal, 75 Mal, 100 Mal oder 150 Mal besser als die von CS37 ist. Die Wirksamkeit wird mit dem untersuchten Antikörper und CS37 in äquivalenten molekularen Formaten, z.B. als einwertige Antikörper (scFv oder Fab) oder als zweiwertige Antikörper (IgG1 oder IgG4) gemessen.
Bevorzugte Ausführungsformen binden TGFβ₁ gegenüber latentem TGFβ₁ bevorzugt.
Varianten der VH- und VL-Domänen und CDRs, deren Sequenzen hierin dargelegt sind und die in spezifischen Bindungselementen für TGFβ₁ eingesetzt werden können, können mittels Verfahren der Sequenzveränderung oder Mutation und des Screenings erhalten werden. Derartige Verfahren werden durch die vorliegende Erfindung ebenfalls bereitgestellt.
Zusätzlich zu Antikörpersequenzen können die spezifischen Bindungselemente andere Aminosäuren umfassen, die z.B. ein Peptid oder Polypeptid, wie z.B. eine gefaltete Domäne bilden, oder um dem Molekül eine weitere funktionelle Eigenschaft zusätzlich zur Fähigkeit zur Bindung von Antigen zu verleihen. Spezifische Bindungselemente der Erfindung können einen nachweisbaren Marker tragen oder können an ein Toxin oder Enzym (z.B. über eine Peptidylbindung oder über einen Linker) konjugiert werden.
In weiteren Aspekten stellt die Erfindung eine isolierte Nucleinsäure bereit, die eine Sequenz umfasst, die für ein oben definiertes spezifisches Bindungselement kodiert, sowie Verfahren zur Herstellung spezifischer Bindungselemente der Erfindung, umfassend das Exprimieren der Nucleinsäuren unter Bedingungen, welche die Expression des Bindungselements bewirken, sowie das Gewinnen des Bindungselements.
Spezifische Bindungselemente gemäß der Erfindung können in einem Verfahren zur Behandlung oder Diagnose des menschlichen oder tierischen Körpers verwendet werden, wie z.B. ein Verfahren der Behandlung (das prophylaktische Behandlung umfassen kann) einer Krankheit oder Störung bei einem menschlichen Patienten, wobei das Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge eines spezifischen Bindungselements der Erfindung an den Patienten umfasst. Gemäß der Erfindung behandelbare Leiden werden unten beschrieben.
Diese und andere Aspekte der Erfindung werden unten ausführlicher beschrieben.
Alle hierin erwähnten Dokumente sind durch Verweis aufgenommen. Hierin beschriebene Sequenzen sind, wenn nicht ausdrücklich anders angegeben, in der herkömmlichen 5'→3'- und N→C-terminalen Nomenklatur für Nucleinsäure- bzw. Aminosäuresequenzen dargestellt und bezeichnet.
Kurzbeschreibung der Figuren
1: Neutralisierung von TGFβ₁, nicht jedoch TGFβ₂ oder TGFβ₃ durch SL15S scFv in einem Proliferationstest unter Verwendung von TF1-Zellen. Die Neutralisierung der TGFβ₁-, TGFβ₂- oder TGFβ₃-induzierten Hemmung der Vermehrung von TF1 durch Genzyme mAb (Mab 1D.11.16-Quadrate) oder SL15S scFv (Rauten) ist dargestellt.
2: Hemmung der [¹²⁵I]TGFβ₁-Bindung an A549-Zellen durch Anti-TGFβ₁-scFv. ScFv-Präparate von SL15S, JT183 und CS37 wurden 2-fach titriert und auf ihre Fä higkeit getestet, die [¹²⁵I]-TGFβ₁-Bindung an A549-Zellen zu hemmen. SL15S und JT182 wurden als his-preps verwendet, CS37 wurde FPLC-gereinigt.
3: Hemmung der [¹²⁵I]TGFβ₁-Bindung an A549-Zellen durch Anti-TGFβ₁-Antikörper. SL15S scFv, SL15S IgG4 und SL15A IgG4 wurden mit Genzyme mAb hinsichtlich ihrer Fähigkeit verglichen, die [¹²⁵I]TGFβ₁-Bindung an A549-Zellen zu hemmen. Die Daten stellen den Mittelwert von 3 Experimenten dar, wobei eine Dreifachverdünnungsreihe verwendet wurde.
4: Hemmung der [¹²⁵I]TGFβ₁-Bindung an A549-Zellen durch scFv in Gegenwart von latentem TGFβ₁. SL15S scFv und SL15A IgG4 wurden auf ihre Fähigkeit hin getestet, die [¹²⁵I]TGFβ₁-Bindung an A549-Zellen zu hemmen. Um zu untersuchen, ob SL15S latenten TGFβ₁ erkannte, wurde das Standardexperiment in Gegenwart von 0,1 nM latentem TGFβ₁, aktivem TGFβ₁ oder säureinaktiviertem latentem TGFβ₁ durchgeführt. Die Daten sind as %-Max für jeden Satz von Bedingungen dargestellt.
5: Neutralisierung der TGFβ₁-induzierten Hemmung der TF1-Zellen-Vermehrung durch scFv und IgG in Gegenwart von latentem TGFβ₁. Die Fähigkeit von SL15S scFv und SL15A IgG4, die durch latenten TGFβ₁, aktiven TGFβ₁ und säureinaktivierten TGFβ₁ induzierte Wachstumshemmung zu neutralisieren, wurde im TF1-Test verglichen. In (a) wurden variierende Konzentrationen an TGFβ₁-Formaten verglichen, wogegen in (b) scFv und IgG gegen 20 pM TGFβ₁-Formate verglichen wurden. Die Daten sind als % der Kontrolle (Wachstum in Abwesenheit von TGFβ₁) ausgedrückt. Die durch latenten TGFβ₁ induzierte Hemmung beruht auf der im latenten Präparat vorhandenen, geringen Menge an aktivem TGFβ₁.
6: Hemmung der Bindung von an Phagen präsentiertem CS37 scFv an TGFβ₁ unter Verwendung chimärer TGFβs. Die Bindung von an Phagen präsentiertem CS37 scFv an TGFβ₁ wurde mittels ELISA in Gegenwart von Folgendem getestet: der TGFβ₁-Isoform (TGFβ₁); der TGFβ₂-Isoform (TGFβ₂); TGFβ₁/β₂ (83-112) (1-1-2); TGFβ₁/β1 83-112 (2-2-1); TGFβ₁-β₂ (40-112) (1-2-2); oder TGFβ₁-β₂ (92-98) (92-98).
7: Hemmung der Bindung von an Phagen präsentiertem SL15S (Kylie scFv) an TGFβ₁ unter Verwendung chimärer TGFβs. Die Bindung von an Phagen präsentiertem SL15S (Kylie) scFv an TGFβ₁ wurde mittels ELISA in Gegenwart von Folgendem getestet: der TGFβ₁-Isoform (TGFβ₁); der TGFβ₂-Isoform (TGFβ₂); TGFβ₁/β₂ (83-112) (1-1-2); TGFβ₁/β1 83-112 (2-2-1); TGFβ₁-β₂ (40-112) (1-2-2); oder TGFβ₁-β₂ (92-98) (92-98).
8: Die Wirkung von CAT192 auf die Hornhaut-Wiederepithelisierung wurde im Anschluss an eine Trphin-Wundexzision von isolierter Rinderhornhaut im Luftgrenzflächen-Organkulturmodell untersucht. Rinderhornhaut wurde entweder mit 100 μl serumfreies Medium 199 (Kontrolle) oder 100 μl Vehikel enthaltendem Medium (für Antikörper und TGFβ₁) behandelt. Null-Isotyp-angepasster Antikörper (10 μg), TGFβ₁ (1 ng) oder CAT192 (10 μg) wurden unmittelbar nach Verwundung und in 12-stündigen Intervallen danach verabreicht. CAT192 verursachte einen signifikanten Anstieg der Geschwindigkeit der Wiederepithelisierung von verwundeter Rinderhornhaut, wogegen TGFβ₁ eine signifikante Abnahme dieser Variablen verursachte. Die Daten sind als prozentueller Anteil an Wiederepithelisierung der Hornhautwunde ausgedrückt. Jeder Punkt stellt den Mittelwert dar und die senkrechten Balken zeigen die mittlere Standardabweichung von 8 Hornhäuten je Datenpunkt. Die Wirkung der unterschiedlichen Behandlungen wurde zu jedem Zeitpunkt unter Verwendung von Wiederholungsmessungs-ANOVA mit Bonferroni-Test verglichen. *P < 0,01 im Vergleich zur Null-Antikörper-Behandlungsgruppe; t P < 0,01 im Vergleich zur Vehikel-Behandlungsgruppe.
9: Die Wirkung von CAT192 auf die Hornhaut-Wiederepithelisierung wurde im Anschluss an eine Trephin-Wundexzision von isolierter Rinderhornhaut im Luftgrenzflächen-Organkulturmodell untersucht. CAT192 (0,001-10 μg) wurde unmittelbar nach Verwundung und in 12-stündigen Intervallen danach verabreicht. CAT192 ver ursachte einen signifikanten dosisabhängigen Anstieg der Wiederepithelisierung von verwundeter Rinderhornhaut. Die EC50 für CAT192 lag zwischen 0,01 und 0,1 μg. Die Daten sind als prozentuelle Änderung der Wiederepithelisierung der Vehikel-behandelten Kontrollgruppe ausgedrückt. Die punktierten Linien zeigen die mittlere Standardabweichung der Vehikel-Kontrollgruppe. Jeder Punkt stellt den Mittelwert dar und die senkrechten Balken zeigen die mittlere Standardabweichung von 6 Hornhäuten je Datenpunkt. Die Wirkung der unterschiedlichen Dosen an CAT192 wurden unter Verwendung einseitiger ANOVA und Dunnett-Test mit der Kontrollbehandlung verglichen; *P < 0,01.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Terminologie
Spezifisches Bindungselement
Dies beschreibt ein Element oder ein Paar von Molekülen, die Bindungsspezifität füreinander aufweisen. Die Elemente eines spezifischen Bindungspaares können aus der Natur stammen oder völlig oder teilweise synthetisch produziert werden. Eines der Elemente des Paars von Molekülen weist einen Bereich an seiner Oberfläche oder eine Vertiefung auf, die spezifisch an einen speziellen und polaren Bereich des anderen Elements des Paars von Molekülen bindet und daher zu diesem komplementär ist. Folglich weisen die Elemente des Paars die Eigenschaft auf, spezifisch aneinander zu binden. Beispiele von Typen spezifischer Bindungspaare sind Antigen-Antikörper, Biotin-Avidin, Hormon-Hormonrezeptor, Rezeptor-Ligand, Enzym-Substrat. Diese Anmeldung behandelt Antigen-Antikörper-artige Reaktionen.
Antikörper
Dies beschreibt ein natürlich oder teilweise oder völlig synthetisch produziertes Immunglobulin. Der Begriff umfasst außerdem beliebige Polypeptide oder Proteine, die eine Bindungsdomäne aufweisen, die homolog oder im Wesentlichen homolog zu einer Antikörperbindungsdomäne ist. Diese können aus natürlichen Quellen stammen oder teilweise oder völlig synthetisch produziert sein. Beispiele von Antikörpern sind die Immunglobulin-Isotypen und ihre isotypischen Unterklassen; Fragmente, die eine Antigenbindungsdomäne umfassen, wie z.B. Fab, scFv, Fv, dAb, Fd; und Diabodies.
Es ist möglich, monoklonale oder andere Antikörper zu benutzen und Techniken der rekombinanten DNA-Technologie zu verwenden, um andere Antikörper oder chimäre Moleküle zu produzieren, welche die Spezifität des ursprünglichen Antikörpers beibehalten. Derartige Techniken können die Einführung von DNA, die für die variable Immunglobulinregion oder die Complementary-determining-regions (CDRs) eines Antikörpers kodieren, in die konstanten Regionen oder in die konstanten Regionen plus Gerüstregionen eines anderen Immunglobulins umfassen. Siehe beispielsweise EP-A-184.187, GB 2188638A oder EP-A-239.400. Eine Hybridomzelle oder andere Zelle, die einen Antikörper produziert, kann genetischer Mutation oder anderen Änderungen unterzogen werden, welche die Bindungsspezifität von produzierten Antikörpern verändern können oder nicht verändern.
Da Antikörper auf zahlreiche Weisen modifiziert werden können, sollte der Begriff „Antikörper" dahingehend ausgelegt werden, als dass er eine) beliebiges) spezifisches Bindungselement oder Substanz umfasst, das/die eine Bindungsdomäne mit der benötigten Spezifität aufweist. Folglich umfasst dieser Begriff Antikörperfragmente, Derivate, funktionelle Äquivalente und Homologe von Antikörpern, einschließlich jegliches Polypeptid, das eine Immunglobulin-Bindungsdomäne aufweist, ob sie natürlich oder völlig oder teilweise synthetisch ist. Chimäre Moleküle, die eine Immunglobulin-Bindungsdomäne oder ein Äquivalent davon aufweisen, die/das an ein weiteres Polypeptid fusioniert ist, sind daher mit umfasst. Die Klonierung und Expression chimärer Antikörper wird in EP-A-120.694 und EP-A-125.023 beschrieben.
Es ist gezeigt worden, dass Fragmente eines vollständigen Antikörpers die Funktion der Bindung von Antigenen erfüllen können. Beispiele von Bindungsfragmenten sind (i) das auf VL-, VH-, CL- und CH1-Domänen vorliegende Fab-Fragment; (ii) das aus den VH- und CH1-Domänen bestehende Fd-Fragment; (iii) das aus den VL- und VH-Domänen eines einzigen Antikörpers bestehende Fv-Fragment; (iv) das dAb-Fragment (E.S. Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)), das aus einer VH-Domäne besteht; (v) isolierte CDR-Regionen; (vi) F(ab')2-Fragmente, ein zweiwertiges Fragment, das zwei verbundene Fab-Fragmente umfasst; (vii) Einzelketten-Fv-Moleküle (scFv), worin eine VH-Domäne und eine VL-Domäne durch einen Peptid-Linker verbunden sind, was es den beiden Domänen ermöglicht, zu assoziieren, um eine Antigenbindungsstelle auszubilden (Bird et al., Science 242, 423-426 (1988); Huston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988)); (viii) bispezifische Einzelketten-Fv-Dimere (PCT/US92/09965) und (ix) „Diabodies", mehrwertige oder multispezifische Fragmente, die durch Genfusion konstruiert werden (WO 94/13804; P. Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448 (1993)). Fv-, scFv- oder Diabody-Moleküle können durch Einführung von Disulfidbrücken, welche die VH- und VL-Domänen verbinden, stabilisiert werden (Y. Reiter et al., Nature Biotech. 14, 1239-1245 (1996)). Minibodies, die ein an eine CH3-Domäne gebundenes scFv umfassen, können ebenfalls hergestellt werden (S. Hu et al., Cancer Res. 56, 3055-3061 (1996)).
Diabodies sind Multimere von Polypeptiden, wobei jedes Polypeptid eine erste, eine Bindungsregion einer Immunglobulin-Leichtkette umfassende Domäne und eine zweite, eine Bindungsregion einer Immunglobulin-Schwerkette umfassende Domäne umfasst, wobei die beiden Domänen (z.B. über einen Peptid-Linker) verbunden, jedoch unfähig sind, miteinander zu assoziieren, um eine Antigenbindungsstelle auszubilden: Antigenbindungsstellen werden durch die Assoziation der ersten Domäne eines der Polypeptide im Multimer mit der zweiten Domäne eines anderen Polypeptids im Multimer gebildet (WO 94/13804).
Wenn bispezifische Antikörper zu verwenden sind, können diese herkömmliche bispezifische Antikörper sein, die auf zahlreiche Arten hergestellt werden können (P. Hollinger und G. Winter, Current Opinion Biotechnol. 4, 446-449 (1993)), z.B. synthetisch oder aus Hybrid-Hybridomen, oder können beliebige der oben erwähnten bispe zifischen Antikörperfragmente sein. Es kann bevorzugt sein, scFv-Dimere oder Diabodies anstatt vollständiger Antikörper zu verwenden. Diabodies und scFv können ohne eine Fc-Region konstruiert werden, wobei nur variable Domänen verwendet werden, was eventuell die Wirkungen einer anti-idiotypischen Reaktion vermindert.
Bispezifische Diabodies können im Gegensatz zu bispezifischen vollständigen Antikörpern außerdem besonders zweckdienlich sein, da sie leicht konstruiert und in E. coli exprimiert werden können. Diabodies (und viele andere Polypeptide, wie z.B. Antikörperfragmente) geeigneter Bindungsspezifitäten können unter Verwendung von Phagen-Display leicht aus Bibliotheken selektiert werden. Wenn ein Arm des Diabody konstant gehalten werden soll, beispielsweise mit einer gegen Antigen X gerichteten Spezifität, dann kann eine Bibliothek hergestellt werden, wo der andere Arm variiert und ein Antikörper geeigneter Spezifität selektiert wird. Bispezifische vollständige Antikörper können durch „Knobs-into-holes"-Konstruktion hergestellt werden (J.B.B. Ridgeway et al., Protein Eng. 9, 616-621 (1996)).
Diabodies können mit der einen Bindungsstelle für TGFβ₁, die wie in dieser Anmeldung offenbart durch VH- und VL-Domänen gebildet werden, und der anderen Bindungsstelle für TGFβ₂ hergestellt werden. Die TGFβ₂-Bindungsstelle kann beispielsweise aus den VH- und VL-Domänen des Antikörpers 6B1 (WO 97/13844) gebildet werden.
Antigenbindungsdomäne
Dies beschreibt denjenigen Teil eines Antikörpers, der den spezifisch an einen Abschnitt eines Antigens oder an das gesamte Antigen bindenden Bereich umfasst und zu einem Abschnitt eines Antigens oder zum gesamten Antigen komplementär ist. Bei einem großen Antigen kann ein Antikörper möglicherweise nur an einen bestimmten Abschnitt des Antigens binden, wobei dieser Abschnitt als Epitop bezeichnet wird. Eine Antigenbindungsdomäne kann von einer oder mehreren variablen Antikörperdomänen bereitgestellt werden (z.B. ein so genanntes Fd-Antikörperfrag ment, bestehend aus einer VH-Domäne). Vorzugsweise umfasst eine Antigenbindungsdomäne eine variable Leichtketten-Antikörperregion (VL) und eine variable Schwerketten-Antikörperregion (VH).
Spezifisch
Dies kann verwendet werden, um sich auf den Umstand zu beziehen, bei dem ein Element eines spezifischen Bindungspaars keine signifikante Bindung an Moleküle zeigt, die nicht seine spezifischen Bindungspartner sind. Der Begriff ist außerdem anwendbar, wo beispielsweise eine Antigenbindungsdomäne für ein bestimmtes Epitop spezifisch ist, das von einer Reihe von Antigenen getragen wird, wobei in diesem Fall das die Antigenbindungsdomäne tragende spezifische Bindungselement fähig ist, an die verschiedenen, dieses Epitop tragenden Antigene zu binden.
Umfassen
Dies wird im Allgemeinen im Sinne von „enthalten" verwendet, d.h., dass die Gegenwart einer oder mehrerer Eigenschaften oder Komponenten erlaubt ist.
Isoliert
Dies bezieht sich auf den Zustand, in dem sich spezifische Bindungselemente der Erfindung oder Nucleinsäuren, die für solche Bindungselemente kodieren, gemäß der vorliegenden Erfindung befinden. Elemente und Nucleinsäuren sind frei oder im Wesentlichen frei von Material, mit dem sie in der Natur assoziiert sind, wie z.B. frei von anderen Polypeptiden oder Nucleinsäuren, mit denen sie in ihrer natürlichen Umgebung oder in der Umgebung auftreten, in der sie hergestellt werden (z.B. Zellkultur), wenn eine solche Herstellung durch rekombinante, in vitro oder in vivo ausgeführte DNA-Technologie erfolgt. Elemente und Nucleinsäuren können mit Verdünnern oder Adjuvantien formuliert sein und für praktische Zwecke nach wie vor als isoliert gelten – beispielsweise werden Elemente normalerweise mit Gelatine oder ande ren Trägern vermischt, wenn sie zur Beschichtung von Mikrotiterplatten zur Verwendung in Immuntests verwendet werden, oder werden mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern oder Verdünnern gemischt, wenn sie in der Diagnose oder Therapie verwendet werden. Spezifische Bindungselemente können entweder natürlich oder durch Systeme heterologer eukaryotischer Zellen (z.B. CHO- oder NS0- (ECACC 85110503) Zellen) glykosyliert sein, oder sie können (wenn beispielsweise durch Expression in einer prokaryotischen Zelle produziert) unglykosyliert sein.
Unter „im Wesentlichen wie dargelegt" wird verstanden, dass die relevante CDR oder VH- oder VL-Domäne der Erfindung entweder identisch mit oder im höchsten Maße ähnlich zu den angegebenen Regionen ist, von denen die Sequenz hierin dargelegt ist. „Im höchsten Maße ähnlich" sieht vor, dass 1 bis 5, vorzugsweise 1 bis 4, wie z.B. 1 bis 3 oder 1 oder 2, oder 3 oder 4 Substitutionen in der CDR und/oder VH- oder VL-Domäne vorgenommen werden können.
Die Struktur, welche die CDR der Erfindung trägt, stammt im Allgemeinen von einer Antikörper-Schwerketten- oder Leichtkettensequenz oder einem wesentlichen Abschnitt davon, in dem die CDR an einem Ort lokalisiert ist, die der CDR natürlich auftretender variabler VH- und VL-Antikörperdomänen entspricht, die von neugeordneten Immunglobulin-Genen kodiert wird. Die Strukturen und Orte von variablen Immunglobulindomänen können unter Bezugnahme auf Kabat et al. ermittelt werden (E.A. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4. Aufl., US Department of Health and Human Services (1987), und Aktualisierungen davon, nunmehr verfügbar im Internet (http://immuno.bme.nwu.edu)). CDRs sind im Allgemeinen wie von Kabat definiert. Außerdem können bei der CDR-Pfropfung Reste der von Cothia definierten, der Kabat VH CDR1 benachbarten Schleife aufgepfropft werden. Für SL15S würde dies die Reste 26 bis 30 der Schwerkette (GFTGS) umfassen.
Vorzugsweise trägt eine menschliche variable Schwerkettendomäne oder ein wesentlicher Abschnitt davon eine im Wesentlichen wie in Tabelle 1 dargelegte Aminosäuresequenz als CDR3.
In der Erfindung eingesetzte variable Domänen können von einer beliebigen Keimbahn- oder neu geordneten menschlichen variablen Domäne hergeleitet sein, oder können eine synthetische variable Domäne sein, die auf Konsensusdomänen bekannter menschlicher variabler Domänen basieren. CDR-hergeleitete Sequenzen der Erfindung können unter Verwendung rekombinanter DNA-Technologie in ein Repertoire variabler Domänen eingeführt werden, denen CDR3-Regionen fehlen.
Beispielsweise beschreiben Marks et al. (Bio/Technology 10, 779-783 (1992)) Verfahren der Herstellung von Repertoires variabler Antikörperdomänen, bei denen an das 5'-Ende des variablen Domänenbereichs oder in dessen Nachbarschaft geleitete Konsensusprimer zusammen mit Konsensusprimer für die dritte Gerüstregion von menschlichen VH-Genen verwendet werden, um ein Repertoire variabler VH-Domänen bereitzustellen, denen eine CDR3 fehlt. Marks et al beschreiben außerdem, wie dieses Repertoire mit einer CDR3 eines bestimmten Antikörpers kombiniert werden kann. Unter Verwendung analoger Techniken können CDR3-hergeleitete Sequenzen der vorliegenden Erfindung mit Repertoires von VH- oder VL-Domänen, denen eine CDR3 fehlt, einem Shuffling unterzogen und die vollständigen VH- oder VL-Domänen aus dem Shuffling mit einer zugehörigen VL- oder VH-Domäne kombiniert werden, um spezifische Bindungselemente der Erfindung bereitzustellen. Das Repertoire kann dann in einem geeigneten Wirtssystem, wie z.B. dem Phagen-Display-System von WO 92/01047 präsentiert werden, so dass geeignete spezifische Bindungselemente selektiert werden können. Ein Repertoire kann aus beliebigen von 10⁴ individuellen Elementen aufwärts bestehen, beispielsweise aus 10⁶ bis 10⁸ oder 10¹⁰ Elementen.
Analoge Shuffling- oder kombinatorische Techniken werden auch von Stemmer (Nature 370, 389-391 (1994)) offenbart, der die Technik in Bezug auf ein β-Lactamase-Gen beschreibt, jedoch beobachtet, dass der Ansatz zur Erzeugung von Antikörper verwendet werden kann.
Eine weitere Alternative ist die Erzeugung neuer VH- oder VL-Regionen, die CDR-hergeleitete Sequenzen der Erfindung tragen, wobei Zufallsmutagenese, beispielsweise des SL15- oder JT182-VH-Gens oder der SL15A- oder SL15S-VL-Gene verwendet wird, um Mutationen in der gesamten variablen Domäne zu erzeugen. Eine derartige Technik wird von Gram et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 3576-3580 (1992)) beschrieben, der Fehler auslösende PCR verwendete.
Ein weiteres Verfahren, das verwendet werden kann, ist das Abzielen der Mutagenese auf CDR-Regionen von VH- oder VL-Genen. Derartige Techniken werden von Barbas et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3809-3813 (1994)) und Schier et al. (J. Mol. Biol. 23, 551-567 (1996)) offenbart.
Alle der oben beschriebenen Techniken sind auf dem Gebiet der Erfindung an sich bekannt und bilden für sich selbst keinen Teil der vorliegenden Erfindung. Der geübte Fachmann wird in der Lage sein, solche Techniken zu verwenden, um spezifische Bindungselemente der Erfindung unter Verwendung von Routineverfahren auf dem Gebiet der Erfindung bereitzustellen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren bereit, um eine Antikörper-Antigen-Bindungsdomäne zu erlangen, die für TGFβ₁ spezifisch ist und vorzugsweise eine oder mehrere der zusätzlichen Eigenschaften aufweist, die hierin für spezifische Bindungselemente gemäß den Ausführungsformen der Erfindung offenbar sind, wobei das Verfahren das Bereitstellen einer VH-Domäne, die eine Aminosäuresequenzvariante der VH-Domäne ist, durch Addition, Deletion, Substitution oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren in der Aminosäuresequenz einer hierin dargelegten VH-Domäne (SL15 oder JT182), das Kombinieren der so bereitgestellten VH-Domäne mit einer oder mehreren VL-Domänen und das Testen der VH/VL-Kombination oder Kombinationen umfasst, um eine Antikörper-Antigen-Bindungsdomäne zu identifizieren, die für TGFβ₁ spezifisch ist und gegebenenfalls eine oder mehrere der bevorzugten Eigenschaften aufweist. Die VL-Domäne kann eine Aminosäuresequenz aufweisen, wie sie im Wesentlichen für SL15A VL (CS37) dargelegt ist, oder kann eine Aminosäuresequenz aufweisen, wie sie im Wesentlichen für VL dargelegt ist.
Es kann ein analoges Verfahren eingesetzt werden, bei dem eine oder mehrere Sequenzvarianten einer hierin offenbarten VL-Domäne mit einer oder mehreren VH-Domänen kombiniert wird.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines spezifischen Bindungselements bereit, das für TGFβ₁ spezifisch ist, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:

a) Das Bereitstellen eines Ausgangsrepertoires an Nucleinsäuren, die für eine VH-Domäne kodieren und entweder eine zu ersetzende CDR3 enthalten oder keine für CDR3 kodierende Region aufweisen;
b) das Kombinieren des Repertoires mit einer Spendernucleinsäure, die für eine Aminosäuresequenz kodiert, wie sie hierin im Wesentlichen für die SL15- oder JT182-VH-CDR3 dargelegt ist, so dass die Spendernucleinsäure in die CDR3-Region im Repertoire insertiert wird, um ein Produktrepertoire an Nucleinsäuren bereitzustellen, die für eine VH-Domäne kodieren;
c) das Exprimieren der Nucleinsäuren dieses Produktrepertoires; und
d) das Gewinnen des Spezifischen Bindungselements oder der dafür kodierenden Nucleinsäure.

Wiederum kann ein analoges Verfahren eingesetzt werden, bei dem eine VL CDR3 der Erfindung mit einem Repertoire an Nucleinsäuren kombiniert wird, die für eine VL-Domäne kodieren, die entweder eine zu ersetzende CDR3 enthalten oder keine für eine CDR3 kodierende Region aufweisen.
Auf ähnliche Weise können eine oder mehrere oder alle drei CDRs in ein Repertoire von VH- oder VL-Domänen gepfropft werden, die dann auf ein spezifisches Bin dungselement oder auf spezifische Bindungselemente hin gescreent werden, die für TGFβ₁ spezifisch sind.
Ein wesentlicher Abschnitt einer variablen Immunglobulindomäne wird zumindest die drei CDR-Regionen zusammen mit ihren Intervening-Gerüstregionen enthalten. Vorzugsweise wird der Abschnitt außerdem zumindest ungefähr 50% von einem der oder beiden ersten und vierten Gerüstregionen umfassen, wobei es sich bei den 50% um die C-terminalen 50% der ersten Gerüstregion und die N-terminalen 50% der vierten Gerüstregion handelt. Zusätzliche Reste am N-terminalen oder C-terminalen Ende des wesentlichen Abschnitts der variablen Domäne können jene sein, die normalerweise nicht mit natürlich auftretenden variablen Domänenregionen assoziiert sind. Beispielsweise kann die Konstruktion spezifischer Bindungselemente der vorliegenden Erfindung durch rekombinante DNA-Techniken in der Einführung von - oder C-terminalen Resten resultieren, die von Linkern kodiert werden, die eingeführt wurden, um die Klonierung oder andere Manipulationsschritte zu erleichtern. Andere Manipulationsschritte umfassen die Einführung von Linkern, um variable Domänen der Erfindung an weitere Proteinsequenzen, einschließlich Immunglobulin-Schwerketten, an andere variable Domänen (beispielsweise bei der Produktion von Diabodies) oder Proteinmarker wie unten ausführlicher beschrieben zu binden.
Obgleich in einem bevorzugten Aspekt der Erfindung spezifische Bindungselemente bevorzugt sind, die ein Paar von VH- und VL-Domänen umfassen, stellen einzelne Domänen auf Basis von entweder VH- oder VL-Domänensequenzen weitere Aspekte der Erfindung dar. Es ist bekannt, dass einzelne Immunglobulindomänen, insbesondere VH-Domänen, fähig sind, Ziel-Antigene auf spezifische Weise zu binden.
In Falle von einem der beiden spezifischen Einzelketten-Domänen können diese Domänen verwendet werden, um auf komplementäre Domänen zu screenen, die zur Bildung eines zur Bindung von TGFβ₁ fähigen, spezifischen Zwei-Domänen-Bindungselements fähig sind.
Dies kann durch Phagen-Display-Screeningverfahren unter Verwendung des so genannten hierarchischen doppelten kombinatorischen Ansatzes erzielt werden, wie er in WO 92/01047 offenbart ist, bei dem eine individuelle Kolonie, die entweder einen H- oder L-Ketten-Klon enthält, verwendet wird, um eine vollständige Bibliothek von Klonen zu infizieren, die für die andere Kette (L oder H) kodieren. Das resultierende spezifische Zweiketten-Bindungselement wird gemäß Phagen-Display-Techniken selektiert, wie z.B. jenen, die in dieser Literaturstelle beschrieben sind. Diese Technik wird auch in Marks et al., ib. offenbart.
Spezifische Bindungselemente der vorliegenden Erfindung können außerdem Antikörper-Konstantregionen oder Abschnitte davon umfassen. Beispielsweise kann eine VL-Domäne, wie z.B. SL15A VL oder SL15S VL an ihrem C-Terminus an konstante Antikörper-Leichtkettendomänen, einschließlich menschliche Cκ- oder Cλ-Ketten, vorzugsweise Cλ-Ketten gebunden werden. Auf ähnliche Weise können spezifische Bindungselemente, die auf SL15 VH basieren, an ihrem C-terminalen Ende an eine vollständige oder an einen Abschnitt einer Immunglobulin-Schwerkette gebunden werden, die sich von irgendeinem Antikörper-Isotyp, z.B. IgG, IgA, IgE und IgM und irgendeiner der Isotyp-Unterklassen, insbesondere IgG1 und IgG4 herleitet. IgG4 ist bevorzugt.
Antikörper der Erfindung können mit einem nachweisbaren oder funktionellen Marker markiert sein. Nachweisbare Marker umfassen Radiomarker, wie z.B. ¹³¹I oder ⁹⁹Tc, die unter Verwendung herkömmlicher, auf dem Gebiet der Antikörperabbildung bekannter Chemie an Antikörper der Erfindung gebunden werden. Marker umfassen außerdem Enzymmarker, wie z.B. Meerrettichperoxidase. Marker umfassen weiters chemische Gruppierungen, wie z.B. Biotin, die über die Bindung an eine spezifische nachweisbare Gruppierung, z.B. markiertes Avidin nachgewiesen werden können.
Antikörper der vorliegenden Erfindung sind zur Verwendung in Verfahren der Diagnose oder Therapie bei menschlichen oder tierischen Patienten, vorzugsweise menschlichen Patienten konstruiert.
Für menschlichen TGFβ₁ spezifische Antikörper erwiesen sich als wirksam in Tiermodellen zur Behandlung fibrotischer Krankheiten und anderer Krankheiten, bei denen TGFβ₁ überexprimiert wird, wie z.B. Rheumatoidarthritis oder Krebs. Antikörper gegen TGFβ₁ erwiesen sich als wirksam bei der Behandlung von Glomerulonephritis (W.A. Border et al., Nature 346, 371-374 (1990)); Neuronenvernarbung (A. Logan et al., Eur. J. Neurosci. 6, 355-363 (1994)); Hautvernarbung (M. Shah et al., Lancet 339, 213-214 (1992); M. Shah et al., J. Cell. Science 107, 1137-1157 (1994); M. Shah et al., 108, 985-1002 (1995)) und Lungenfibrose (Giri et al., Thorax 48, 959-966 (1993)). Weiters erwiesen sich mit den Isoformen, TGFβs 1, 2 und 3, kreuzreaktive Antikörper als wirksam in Modellen von Lungenfibrose, strahlungsinduzierter Fibrose (Barcellos-Hoff, US-Patent Nr. 5.616-561 (1977)), Myelofibrose, Verbrennungen, Dupuyen-Kontraktur, Magengeschwüren und Rheumatoidarthritis (Wahl et al., J. Exp. Medicine 177, 225-230 (1993)).
Es gibt eine Reihe weiterer Leiden, die mit extrazellulärer Matrix-Ablagerung verbunden sind, die durch Verabreichung eines gegen TGFβ₁ gerichteten Antikörpers gelindert werden können. Diese umfassen systemische Sklerose, postoperative Verwachsungen, keloide und hypertrophe Narbenbildung, proliferative Vitreoretinopathie, Glaucom-Drainage-Operation, Hornhautverletzung, Katratakte, Peyronie-Krankheit, diabetische Nephropathie, Atemnotsyndrom beim Erwachsenen, Leberzirrhose, Postmyokardinfarkt, Postangioplastikrestenose, Keloidvernarbung, Vernarbung nach Subarachnoidalblutung, multiple Sklerose, Fibrose nach Laminektomie, Fibrose nach Sehnen- oder anderen Wiederherstellungen, Entfernung von Tätowierungen, sklerosierender Cholangitis, Perikarditis, Pleuritis, Tracheostomie, penetrierende ZNS-Verletzung, Eosinophilie-Myalgie-Syndrom, Gefäßrestenose, venookklusive Krankheit, Pankreatitis und Psoriasis-Arthropathie. In manchen Fällen kann die Behandlung in Kombination mit einem Antikörper, der gegen TGFβ₂ gerichtet ist, z.B. 6B1 IgG4 (CAT-152) (siehe WO 97/13844), sinnvoll eingesetzt werden, beispielsweise bei der Behandlung von Hautvernarbungen. Die Wirksamkeit von SL15A IgG4 bei der Behandlung von Hornhautepithel-Wundheilung wird in Beispiel 6 nachgewiesen.
Der Erfolg von CAT-192 bei der Förderung der Hornhaut-Wundheilung weist auf seine Brauchbarkeit bei anderen Leiden hin, wo die Förderung der Wiederepithelialisierung vor Vorteil ist. Diese umfassen Erkrankungen der Haut, wie z.B. Venengeschwüre, ischämische Geschwüre (Druckgeschwüre), diabetische Geschwüre, Transplantatstellen, Transplantatspenderstellen, Abschürfungen und Verbrennungen, Erkrankungen des Darmepithels, wie z.B. mit zytotoxischer Behandlung verbundene Mukositis, Ösophagusgeschwüre (Reflex-Krankheit), Magengeschwüre, Dünndarm- und Dickdarm-Läsionen (entzündliche Darmerkrankung).
TGFβ hemmt auch die Endothelproliferation und daher können Anti-TGFβ-Antikörper verwendet werden, um atherosklerotische Plaques zu stabilisieren und die Heilung von Gefäßanastomosen zu beschleunigen. TGFβ kann die Glattmuskelproliferation stimulieren und daher kann eine Anti-TGFβ-Behandlung zusätzlich für Arterienerkrankungen oder Asthma geeignet sein.
Asthma ist eine chronische entzündliche Störung der Atemwege, die sich als periodische Luftstrombehinderung manifestiert, die mit der Zeit progressiv werden kann. Bei allergischen sowie nicht allergischen Formen der Krankheit liegen Belege einer veränderten lokalen T-Zellen-Reaktion zugunsten der Th-2-Zytokin-Freisetzung vor, die in einer B-Zellen-Umschaltung auf IgE, Mastzellen, Eosinophilen- und Basophilen-Rekrutierung und Aktivierung und Freisetzung einer breiten Vielfalt von Entzündungsvermittlern resultiert. Jedoch ist klar geworden, dass die Entzündung alleine viele der für chronisches Asthma charakteristischen Merkmale nicht erklärt und dass eine Restrukturierung der Atemwegswand ebenfalls erforderlich ist (S.T. Holgate et al., J. Allergy Clin. Immunol., im Druck (2000)). Diese „Remodellierungs"-Reaktion bedingt die unvollständige therapeutische Wirksamkeit von Corticosteroiden bei persistenter Bronchialhyperreaktivität (BHR) (R. Lundgren et al., Eur. Respir. J. 1(10), 883-889 (1988)) und dem progressiven Verfall der Lungenfunktion mit der Zeit, die in jenen Asthmatikern mit einer chronischeren und schwereren Erkrankung auftritt (P. Lange et al., N. Engl. J. Med. 339(17), 1194-1200 (1998)).
Subepitheliale und submuköse Fibrose steht im Zusammenhang mit Asthma. Bei Beurteilung mittels Hochauflösungs-CT weisen Patienten mit schwerem Asthma dickere Atemwege im Vergleich zu normalen Patienten und jenen mit leichter Erkrankung auf (N. Awadh et al., Thorax 53(4), 248-253 (1998)). Dies umfasst eine Verdickung und erhöhte Dichte der SBM-Kollagenschicht, Zunahme an Glattmuskel und Mikrogefäßnetzwerken (N. Carroll et al., Am. Rev. Respir. Dis. 147(2), 405-410 (1993)). Auf Basis der bei menschlichen Atemwegen und in einem Meerschweinchen-Modell chronischer Antigenexposition vorgenommenen Messungen widerspiegelt die SBM-Verdickung jene der gesamten Atemwegswand. Von der SBM-Kollagen-Dicke ist gezeigt worden, dass sie mit der Schwere der Erkrankung, Chronizität und BHR korreliert.
SBM-Verdickung gründet sich auf die Ablagerung von Darm-Collagenen der Typen I, III und V und von Fibronectin in der Lamina reticularis und rührt von den Myofibroblasten her, deren Anzahl und Aktivität bei Asthma erhöht ist (C.E. Brewster et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 3(5), 507-511 (1990)) und durch Allergen-Exposition weiter verstärkt wird (M.J. Gizycki et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 16(6), 664-673 (1997)). Bronchienbiopsie- und Lavage-Untersuchungen haben einen zwingenden Fall für das Epithel als eine mögliche Quelle pro-fibrogener Wachstumsfaktoren bereitgestellt. Bei Asthma zeigt die Immunfärbung auf TGFβ und b-FGF die Lokalisierung beider im Epithel und eine ausgeprägte Färbung der Matrix, was auf eine bedeutende Wechselwirkung zwischen diesen Wachstumsfaktoren und Matrix-Proteoglykanen über spezifische Glycosaminoglykan- (GAG-) Bindungsstellen hinweist (A.E. Redington et al., J. Pathol. 186(4), 410-415 (1998)). Sowohl TGFβ₁, als auch b-FGF finden sich in erhöhten Konzentrationen in Lavage-Flüssigkeit mit weiteren Erhöhungen, die nach Allergen-Exposition auftreten (A.E. Redington et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 156(2, Pt 1), 642-647 (1997)). Die Gewebeanalyse von Wachstumsfaktoren, Zytokinen und Chemokinen hat gezeigt, dass diese hauptsächlich in komplexen, hochmolekularen Formen vorliegen. Latenz-assoziiertes Peptid ist als das TGFβ-Bindungsmolekül identifiziert worden und unter Verwendung eines Bronchienexplantatmodells ist gezeigt worden, dass die Allergen-Exposition von asthmati schem Schleimhautgewebe in der Aktivierung von TGFβ resultiert, die von der Plasmin-Aktivität abhängt, während b-FGF in löslicher Form durch Heparin und Heparinase aus Mastzellen bzw. Eosinophilen freigesetzt wird (W. McConnell et al., Eur. Respir. J. 152s (1999), Veröffentlichungsform: Abstract).
Asthma ist außerdem an Epithelverletzung und Atemwegsremodellierung beteiligt. Eine charakteristische Eigenschaft der remodellierten Atemwege bei Asthma ist eine ausgeprägte Epithelschädigung, die durch entzündliche Zellprodukte verursacht wird (L.A. Laitinen et al., Am. Rev. Respir. Dis. 131(4), 599-606 (1985)). Schleimhautschädigung ermöglicht es nicht nur gewebeschädigenden Molekülen, ungehindert in die Atemwegswand zu gelangen, sonder verursacht auch die „Aktivierung" des Epithels mit der Expression einer Vielzahl von entzündungsfördernden Chemokinen, Autacoid-Vermittlern und Adhäsionsmolekülen, die zur chronischen Entzündung beitragen (S.T. Holgate et al., J. Allergy Clin. Immunol. (2000), im Druck). Verletzte und sich reparierende Epithelzellen sind auch wichtige Regulatoren der Atemwegsremodellierung über erhöhte Produktion von fibroproliferativen und profibrogenen Wachstumsfaktoren, einschließlich TGFβ-Isoformen (S. Zhang et al., Lab. Invest. 79(4), 395-405 (1999)). Neulich ist gefunden worden, dass die Beeinträchtigung der epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor- (EGFR-) vermittelten Epithelwiederherstellung eine stark erhöhte Freisetzung von TGFβ₂ durch geschädigte Epithelzellen und eine merkliche Verstärkung der Collagen III-Genexpression verursacht, wenn konditioniertes Medium Myofibroblasten-Kulturen zugegeben wird. Da TGFβ-Isoformen wirksame Inhibitoren der Epithelzellenproliferation sind, könnte die überhöhte Produktion von TGFβ bei Asthma das unerwartet niedrige Expressionsausmaß des Proliferationsmarkers PCNA bedingen, der im asthmatischen Epithel auftritt (P. Demoly et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 150(1), 214-217 (1994)). Auf diese Weise könnten Zustände, welche die Collagen-Biosynthese durch Sub-Epithel-Myofibroblasten begünstigen, ebenfalls zur Chronizität der Krankheit durch Verzögern der Epithelwiederherstellung beitragen. Daher kann von der Verminderung von TGFβ-Spiegeln durch Verwendung spezifischer Bindungselemente der vorliegenden Erfindung erwartet werden, das sie zur Verhinderung der Matrix-Proteinsynthese durch Bron chienfibroblasten sowie zur Förderung der Bronchien-Epithelwiederherstellung zweckdienlich ist, die bei chronischem und schwerem Asthma notwendig sind, um einen nicht-aktivierten Epithel-Phänotyp und normale Barrierenfunktion wiederherzustellen.
TGFβ₁ moduliert außerdem die Immun- und Entzündungsreaktionen, beispielsweise als Reaktion auf Malignität und Infektion. Ein Antikörper gegen TGFβ₁ kann zur Verbesserung der Immunantwort gegen Infektionen, wie z.B. Hepatitis B, Hepatitis C oder Tuberkulose oder zur Verminderung der Immunosuppression verwendet werden, die beispielsweise durch Tumoren oder AIDS-Infektion oder granulomatöse Krankheiten ausgelöst werden. Ein Antikörper gegen TGFβ₁ kann auch zur Behandlung akuter oder chronischer Abstoßung von Organtransplantaten und malignen Tumoren zweckdienlich sein und kann bei der Prävention der Ausbreitung von Krebszellen verwendet werden, die durch Behandlung mit Cyclosporin ausgelöst wird.
Ein Antikörper gegen TGFß₁ kann als Adjuvans für die Immunotherapie verwendet werden.
Ein Antikörper gegen TGFβ₁ kann zur Hemmung der Angiogenese, beispielsweise bei der Behandlung von Tumoren verwendet werden. Der Großteil von Tumorzellen exprimiert nachweisbare Mengen an TGFβ₁ (Wojtowicz-Praga, J. Immunother. 20(3), 165-177 (1997)). Darüber hinaus weisen Zellen, die höhere Mengen an TGFβ₁ produzieren, ein höheres metastatisches (Blanckaert et al., Cancer Res. 53(17), 4075-81 (1993)) oder invasives (Arteaga et al., Cell Growth and Differentiation 4(3), 193-201 (1993)) Potential auf. Bei vielen Krebsformen korrelieren die TGFβ₁-Plasmaspiegel mit der Krankheitsprogression. Folglich können die Tumorzellen sowie umgebendes Gewebe die Quelle von TGFβ₁ sein.
TGFβ ist ein wirksamer Suppressor der malignen Transformation im normalen, gesunden Epithelgewebe und kann die Proliferation hemmen. Jedoch können fortgeschrittene Krebsformen gegen die wachstumshemmenden Wirkungen von TGFβ als Ergebnis von Abnormalitäten beim TGFβ-Rezeptor vom Typ II (Markowitz et al., Science 268 (5215), 1336-8 (1995)) oder der SMAD-Signaltransduktion (Hata et al., Mol. Med. Today 4(6), 257-262 (1998)) resistent werden.
Tumoren erfordern für das Wachstum über 1 mm³ hinaus und zur Metastase eine Blutversorgung (Folkman, Breast Cancer Res. Treat. 36(2), 109-118 (1995)). Dies hat zur raschen Entwicklung von Anti-angiogenen Behandlungen für massive Tumoren geführt.
Von TGFβ₁ ist gezeigt worden, dass es die Angiogenese durch Up-Regulation der VEGF-Produktion in vitro und in vivo indirekt verursacht. Brusttumoren enthalten eine große Anzahl an infiltrierenden Makrophagen. Die Rolle und Funktion dieser Zellen im Tumor verbleibt unklar, jedoch ist in einer Reihe von Untersuchungen ein Zusammenhang mit schlechter Prognose gefunden worden. Sowohl Tumorzellen, als auch Tumor-Makrophagen produzieren VEGF in vitro und die Produktion wird durch TGFβ₁ up-reguliert. Der Serum-VEGF-Spiegel ist in Patienten mit Brustkrebs erhöht und diese Spiegel korrelieren direkt mit Serum-TGFβ₁-Spiegeln. Folglich kann die TGFβ₁-Expression durch Brustkrebszellen und Krebs-assoziierte Makrophagen eine angiogene Reaktion über die Erzeugung von VEGF hervorrufen (Donovan et al., Ann. Surg. Oncol. 4(8), 621.7 (1997); Harmey et al., Ann. Surg. Oncol. 5(3), 271-278 (1998)).
Ueki et al. (Japanese Journal of Cancer Research 84(6), 589-593 (1992)) wiesen nach, dass TGFβ₁ das Tumorwachstum in vivo verstärkte. Diese Gruppe transfizierte CHO-Zellen mit dem TGFβ₁-Gen, was in der Überexpression von TGFβ₁ resultierte. Von den TGFβ₁-sekretierenden CHO-Zellen wurde gezeigt, dass sie schneller als nicht transfizierte Zellen wuchsen, wenn sie subkutan in Nacktmäuse injiziert wurden. Es wurde eine markante Vaskularisierung in Tumoren beobachtet, die von TGFβ₁-transfizierten Zellen stammten; die Vaskularisierung war in nicht transfizierten Zellen vermindert. Außerdem war ein neutralisierender Anti-TGFβ₁-Antikörper fähig, sowohl Wachstum, als auch Angiogenese in denjenigen Tumoren zu hemmen, die von TGFβ₁-transfizierten Tieren stammten. Folglich trug die Überproduktion von TGFβ₁ durch Tumorzellen zum Tumorwachstum und zur Neovaskularisierung bei.
Es ist bekannt, dass Patienten mit Krebs auch ein defektes Immunsystem aufweisen. Kürzlich ist vorgeschlagen worden, dass TGFβ₁ eine Schlüsselrolle bei der mit Tumoren im Zusammenhang stehenden Immunosuppression spielt. Dieses Thema ist der Mittelpunkt eines neulichen Überblickartikels gewesen (Wojtowicz-Praga (1997), ib.). TGFβ₁ scheint zweifellos ein wirksamer Immunosuppressor zu sein und ist durchwegs in einer Vielzahl von Tumorzelllinien und im Plasma von Tumor-tragenden Wirten nachgewiesen worden.
Die Neutralisierung von TGFβ₁ durch monoklonale Antikörper oder die Hemmung der Produktion durch Antisense resultiert in der Abschwächung des Wachstums und der Metastasierungsfähigkeit von Tumoren in Tiermodellen. Das Wachstum von mit TGFβ₁ transfizierten MCF-7-Brustkrebszellen in Mäusen wird mit 2G7 (wiederholte i.p.-Dosen), einem Anti-TGFβ_{1
2 3}-Antikörper (Arteaga et al., id.), verhindert. Das Wachstum normaler MCF-7-Zellen wird von 2G7 verhindert, jedoch nur wenn die Behandlung zum Zeitpunkt der Tumorzelleninokulierung begann. Ferner ist ein überzeugenderer Nachweis für eine Wirkung von Anti-TGFβ-Antikörpern zum Abbau der Tumor-ausgelösten Immunosuppression beigebracht worden (Arteaga et al., J. Clin. Invest. 92(6), 2569-2576). MDA-231, eine menschliche Brustkrebszelllinie, verursachte eine Abnahme der natürlichen Killer- (NK-) Zellaktivität der Milz in Nacktmäusen nach i.p.-Inokulierung. 2G7 (200 μg alle 2 Tage, i.p.) verminderte intraabdominale Tumoren und Lungenmetastase sowie erhöhte deutlich die Aktivität der Milz-NK-Zellaktivität. Darüber hinaus hemmte konditioniertes Medium aus Kulturen von MDA-231-Tumorzellen die NK-Zellaktivität von menschlichem Blut; wiederum wurde dies von 2G7 verhindert. Das Wachstum subkutaner Xenotransplantate von MDA-231-Zellen wurde von 2G7 nur vorübergehend gehemmt. Die Wirkung von 2G7 auf Tumorwachstum, Metastase und NK-Zellaktivität fehlte in beigefarbigen NK-Zellen-defizienten Nacktmäusen (Arteaga et al., J. Clin. Invest. 92(6), 2569-2576).
In einer weiteren Untersuchung war der Anti-TGFβ-Antikörper 2G7 (500 μg i.p. alle zwei Tage) in Kombination mit IL-2 (10.000 U i.p. 2× täglich) fähig, die B16-Melanom-Lungenmetastase zu vermindern, war jedoch nicht so wirksam wie eine i.v.-Inokulierung. 2G7 für sich alleine verminderte ebenfalls die Anzahl an Lungenmetastasen, war jedoch nicht so wirksam wie die kombinierte Therapie. Plasma-TGFβ₁-Spiegel waren in den antikörperbehandelten Mäusen signifikant vermindert (Wojtowicz-Praga et al., J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 19(3), 169-175 (1996)). Zwei vorhergehende Untersuchungen zeigten entweder keine Wirkung, oder riefen nur eine geringe Wirkung hervor, wobei die Kombination von Anti-TGFβ₁ und IL-2 verwendet wurde (Gridley et al., Cancer Biother. 8(2), 159-170 (1993) bzw. Mao et al., Cancer Biother. 9(4), 317-327 (1994)), jedoch waren die Dosen der in diesen Untersuchungen verwendeten Anti-TGFβ₁-Antikörper niedrig (100 ng bzw. 1 μg). Folglich scheint es aus Tiermodelldaten so zu sein, dass die Kombination von Anti-TGFβ-Therapie mit Immunostimulation das Konzept für diesen therapeutischen Ansatz gegen Krebs unter Beweis stellt.
Hoefer und Anderer (Cancer Immunol. Immunother. 41(5), 302-308 (1995)) zeigten, dass die menschliche Karzinomzelllinie SLU-1 und die höchst metastatische Sublinie SLU-M1 nach s.c.-Inokulierung eine Metastase in Nacktmäusen bewirkten. Das Auftreten von Metastase sowie Primärtumorwachstum wurde durch Behandlung mit Anti-TGFβ₁-Antikörpern vermindert (Behandlung vom Tag 3 an, alle 3-4 Tage mit 100 μg s.c. and der Tumorstelle). Die Autoren schlugen vor, dass die Antikörper die TGFβ₁-ausgelöste Immunosuppression rückgängig machten, was eine Hemmung von Tumorwachstum und Metastase bewirkte.
Frühere Arbeiten haben außerdem gezeigt, dass Anti-TGFβ₁-Antikörper die Tumormetastase in vivo verringern können (Arteaga et al., J. Clin. Invest. 92(6), 2569-2576 (1993); Hoefer und Anderer (1995), id.; Wojtowicz-Praga et al. (1996), id.). Anfängliche Schlussfolgerungen aus diesen Untersuchungen schlugen vor, dass eine TGFβ₁-ausgelöste Immunosuppression die Metastase dieser Tumor-Xenotransplantate ermöglichte. Jedoch legt eine neuliche Veröffentlichung nahe, dass TGFβ₁ das invasive und metastatische Potential von Zellen direkt verstärken könnte (Hojo et al., Nature 397, 530-534 (1999)). Cyclosporin induziert dosisabhängig die TGFβ₁-Freisetzung aus menschlichen Lungenadenokarzinomzellen in Kultur, jedoch ist der Mechanismus der TGFβ-Produktion durch Cyclosporin unbekannt. Die Behandlung von Adenokarzinomzellen mit Cyclosporin (oder TGFβ₁) bewirkt Membran-Kräuselung, Pseudopodienbildung, verankerungsunabhängiges (invasives) Wachstum und Beweglichkeit. Ein Anti-TGFβ₁-Antikörper hemmt diese Zellmorphologie- und Beweglichkeitsveränderungen in vitro. Ähnliche Beobachtungen wurden für Nierenzellen-Adenokarzinom, Brustdrüsen-Epithelzellen und Nerz-Lungenepithel-Lungenzellen gemacht. Bei immungeschwächten beigefarbigen SCID-Mäusen (fehlende T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen) erhöhte Cyclosporin die Anzahl an Metastasen nach Inkubation (i.v.) von Maus-Nierenzellen-Adenokarzinom-, Lewis-Lungenkarzinom- oder menschlichen Blasenkrebs-Zellen. Die Behandlung mit dem neutralisierenden Anti-TGFβ_{1 2 3}-Antikörper 1D11.16 (200 μg pro Tag, anfängliche Dosis 1 Tag vor der Tumorzelleninokulierung) verminderte signifikant die Anzahl von Lungenmetastasen bei Cyclosporin-behandelten Mäusen (auf Ausmaße unter jenem der nicht mit Cyclosporin behandelten Kontrollgruppe). Folglich scheint es so zu sein, dass Cyclosporin über eine von der TGFβ₁-Produktion abhängige Wirkung die Invasion und Metastase in Tiermodellen unabhängig vom Immunsystem des Wirts erhöhen kann (Hojo et al. (1999), id.).
Belege aus In-vitro- und In-vivo-Modellen legen nahe, dass TGFβ₁ die Tumorbildung unter Nutzung von drei Hauptmechanismen verstärken kann; Angiogenese, Immunosuppression und phänotypische Veränderungen von Tumorzellen, um invasives und metastatisches Verhalten zu erhöhen. Folglich kann von der Hemmung von TGFβ₁ erwartet werden, das sie Malignitäten im Menschen hemmt und in einem einzigen Molekül eine kombinierte Antikrebstherapie bereitstellt.
Krebsformen, die mit TGFβ₁ in Verbindung gebracht worden sind, umfassen Brust-, Prostata-, Eierstock-, Magen-, Kolorektal-, Haut-, Lungen-, Gebärmutterhals- und Blasenkrebs, sowie verschiedene Leukämien und Sarkome, wie z.B. Kaposisarkom.
Demgemäß können Antikörper der Erfindung zur Behandlung von Krebsformen verabreicht werden, bei denen TGFβ₁ mit Angiogenese, Metastase oder Tumorprogression im Zusammenhang steht, einschließlich die vorangehenden Krebsformen. Es versteht sich, das im Zusammenhang mit der Krebstherapie „Behandlung" jeglichen medizinischen Eingriff umfasst, der in einer Verlangsamung des Tumorwachstums und der Tumormetastase, sowie in einer teilweisen Remission des Krebses resultiert, um die Lebenserwartung eines Patienten zu verlängern.
Antikörpertherapie zur Behandlung von Krebs ist eine etablierte Behandlungsform auf dem Gebiet der Erfindung. Diese Anti-Krebs-Antikörper sind gegenwärtig zur klinischen Verwendung in den Vereinigten Staaten und/oder Europa zugelassen (Panorex für die Behandlung von Kolorektalkrebs, Rituxan für B-Zellen-Lymphom und Herceptin für Brustkrebs), und zwar zusätzlich zu zahlreichen anderen Anti-Krebs-Antikörpern, die sich gegenwärtig in den Phasen I, II oder III klinischer Studien befinden. Diese Antikörper werden häufig zur Behandlung im Spätstadium verwendet und werden bezüglich der Kriterien des vorhergehenden Abschnitts als wirksam angesehen und sorgen in manchen Fällen für eine vollständige Remission des Tumors.
Demgemäß stellen weitere Aspekte der Erfindung Behandlungsverfahren, welche die Verabreichung eines bereitgestellten spezifischen Bindungselements umfassen, pharmazeutischen Zusammensetzungen, die ein derartiges spezifischen Bindungselement umfassen, und die Verwendung eines derartigen spezifischen Bindungselements bei der Herstellung eines Medikaments zur Verabreichung bereit, beispielsweise in einem Verfahren zur Herstellung eines Medikaments oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend das Formulieren des spezifischen Bindungselements mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können bereitgestellte Zusammensetzungen an Individuen verabreicht werden. Die Verabreichung erfolgt vorzugsweise in einer „therapeutisch wirksamen Menge", wobei diese ausreicht, um einem Patienten einen Vorteil zu bieten. Ein solcher Vorteil kann zumindest die Abschwächung von zumin dest einem Symptom sein. Die tatsächlich verabreichte Menge, die Rate und der Zeitverlauf der Verabreichung hängen vom Charakter und der Schwere des zu Behandelnden ab. Die Verschreibung der Behandlung, z.B. Entscheidungen über Dosierung usw., liegt in der Verantwortung praktischer Ärzte und anderer Mediziner. Geeignete Antikörperdosen sind auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt; siehe J.A. Ledermann et al., Int. J. Cancer 47, 659-664 (1991); K.D. Bagshawe et al., Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4, 915-922 (1991).
Eine Zusammensetzung kann für sich alleine oder in Kombination mit anderen Behandlungen, entweder gleichzeitig oder nacheinander in Abhängigkeit vom zu behandelnden Leiden verabreicht werden.
Antikörper der vorliegenden Erfindung können einem Patienten, der eine Behandlung benötigt, über einen beliebigen Weg verabreicht werden, üblicherweise durch Injektion in den Blutkreislauf oder direkt in die zu behandelnde Stelle, z.B. Hornhaut, Wunde, Tumor usw. Die genaue Dosis hängt von einer Reihe von Faktoren ab, einschließlich davon, ob der Antikörper zur Diagnose oder zur Behandlung vorgesehen ist, der Größe und dem Ort des zu behandelnden Bereichs (z.B. Wunde), der genauen Beschaffenheit des Antikörpers (z.B. vollständiger Antikörper, Fragment oder Diabody) und der Beschaffenheit eines beliebigen nachweisbaren Markers oder anderen Moleküls, der/das an den Antikörper gebunden ist. Eine typische Antikörperdosis liegt im Bereich von 0,5 mg bis 100 g für systemische Anwendungen, wie z.B. für die Behandlung von Fibrose bei Glomerulonephritis oder bei der Behandlung von Krebs und 10 μg bis 1 mg für lokale Anwendungen, wie z.B. bei der Behandlung von Hautvernarbung. Typischerweise ist der Antikörper ein vollständiger Antikörper, vorzugsweise der IgG4-Isotyp. Dies ist die Dosis für eine einzelne Behandlung eines erwachsenen Patienten, die für Kinder und Säuglinge proportional angepasst und auch für andere Antikörperformate proportional zum Molekulargewicht eingestellt werden kann. Behandlungen können in täglichen, zweimal wöchentlichen, wöchentlichen oder monatlichen Intervallen nach Ermessen des Arztes wiederholt werden.
Es wird zurzeit bevorzugt, dass ein vollständiger Antikörper des IgG4-Isotyps für systemische und lokale Behandlungen verwendet wird, jedoch kann für lokale Anwendungen ein scFv-Antikörper besonders wertvoll sein.
Spezifische Bindungselemente der vorliegenden Erfindung werden üblicherweise in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht, die zumindest eine Komponente zusätzlich zum spezifischen Bindungselement enthalten kann.
Folglich können pharmazeutische Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung und zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung zusätzlich zum aktiven Inhaltsstoff einen pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten, Träger, Puffer, Stabilisator oder andere Materialien umfassen, die dem Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt sind. Solche Materialien sollten nicht toxisch sein und sollten die Wirksamkeit des aktiven Inhaltsstoffs nicht stören. Die exakte Beschaffenheit des Trägers oder anderen Materials hängt vom Verabreichungsweg ab, der oral oder eine Injektion, z.B. intravenös sein kann.
Pharmazeutische Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung können die Form von Tabletten, Kapseln, Pulvern oder Flüssigkeiten einnehmen. Eine Tablette kann einen festen Träger, wie z.B. Gelatine oder ein Adjuvans enthalten. Flüssige pharmazeutische Zusammensetzungen enthalten im Allgemeinen einen flüssigen Träger, wie z.B. Wasser, Petroleum, Tier- oder Pflanzenöle, Mineralöl oder synthetisches Öl. Physiologische Salzlösung, Dextrose oder andere Zuckerlösungen oder Glykole, wie z.B. Ethylenglykol, Propylenglykol oder Polyethylenglykol können enthalten sein. Die Formulierung als Augentropfen kann zur Verhinderung oder Behandlung von Augenfibrose oder Vernarbung nützlich sein.
Für intravenöse Injektion oder Injektion an der Krankheitsstelle wird der aktive Inhaltsstoff in Form einer parenteral annehmbaren wässrigen Lösung vorliegen, die pyrogenfrei ist und einen geeigneten pH-Wert, eine geeignete Isotonie und Stabilität aufweist. Der ausreichend Fachkundige auf dem Gebiet der Erfindung ist sehr wohl in der Lage, geeignete Lösungen, beispielsweise unter Verwendung isotonischer Vehikel herzustellen, wie z.B. Natriumchlorid-Injektion, Ringer-Lösung, Ringer-Lactatlösung. Konservierungsmittel, Stabilisatoren, Puffer, Antioxidantien und/oder andere Additive können wie erforderlich enthalten sein.
Der Antikörper kann aus einem Retard-Abgabesystem verabreicht werden, um Fibrose zu verhindern, oder kann auf Prothesen, wie z.B. Hüftgelenksersatz, beschichtet werden, um die Entwicklung einer mit ihrem Einsatz verbundenen Fibrose zu verhindern.
Eine Zusammensetzung kann entweder für sich alleine oder in Kombination mit anderen Behandlungen, entweder gleichzeitig oder nacheinander in Abhängigkeit vom zu behandelnden Leiden verabreicht werden. Andere Behandlungen umfassen die Verabreichung geeigneter Dosen von Schmerzmitteln, wie z.B. nicht-steroidischen oder entzündungshemmenden Medikamenten (z.B. Aspirin, Paracetamol, Ibuprofen oder Ketoprofen) oder Opiaten, wie z.B. Morphin oder Antiemetika.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit, das die Bewirkung oder Ermöglichung der Bindung eines hierin bereitgestellten spezifischen Bindungselements an TGFβ₁ umfasst. Wie erwähnt, kann eine derartige Bindung in vivo, z.B. nach Verabreichung eines spezifischen Bindungselements oder einer Nucleinsäure, die für ein spezifisches Bindungselement kodiert, stattfinden, oder kann in vitro stattfinden.
Das Ausmaß der Bindung des spezifischen Bindungselements an TGFβ₁ kann bestimmt werden. Die Quantifizierung kann zur Menge von TGFβ₁ in einer Testprobe, die von diagnostischem Interesse sein kann, in Beziehung gesetzt werden, beispielsweise ist die Messung von TGFβ₁ auch als Indikator für Atherosklerose vorgeschlagen worden, wobei niedrige Konzentrationen mit fortgeschrittener Atherosklerose korrelieren.
Die Reaktivitäten von Antikörpern an einer Probe können durch geeignete Mittel bestimmt werden. Der Radioimmuntest (RIA) ist eine der Möglichkeiten.
Radioaktiv markierter TGFβ₁ wird mit unmarkiertem TGFβ₁ (der Testprobe) gemischt und die Bindung an den Antikörper ermöglicht. Gebundener TGFβ₁ wird physikalisch vom ungebundenen TGFβ₁ getrennt und die Menge des an den Antikörper gebundenen TGFβ₁ bestimmt. Je mehr TGFβ₁ sich in der Testprobe befindet, umso weniger radioaktiver TGFβ₁ wird an den Antikörper binden. Es kann auch ein kompetitiver Bindungstest mit nicht radioaktivem TGFβ₁ unter Verwendung von TGFβ₁ oder einem Analogon von TGFβ₁, das an ein Reportermolekül gebunden ist, verwendet werden. Das Reportermolekül kann ein Fluorochrom, Phosphor oder Laserfarbstoff mit spektral getrennten Absorptions- oder Emissionseigenschaften sein. Geeignete Fluorochrome umfassen Fluorescein, Rhodamin, Phycoerythrin und Texasrot. Geeignete chromogene Substrate umfassen Diaminobenzidin.
Andere Reporter umfassen makromolekulare kolloidale Teilchen oder partikuläres Material, wie z.B. Latexperlen, die gefärbt, magnetisch oder paramagnetisch sind, und biologisch oder chemisch aktive Mittel, die direkt oder indirekt nachweisbare Signale erzeugen, die optisch beobachtet, elektronisch detektiert oder auf andere Weise aufgezeichnet werden können. Diese Moleküle können Enzyme sein, die Reaktionen katalysieren, welche Farben entwickeln oder verändern, oder Änderungen der elektrischen Eigenschaften verursachen. Sie können molekular anregbar sein, so dass Elektronenübergänge zwischen Energieniveaus in charakteristischen spektralen Absorptionen oder Emissionen resultieren. Sie können chemische Gruppierungen umfassen, die in Verbindung mit Biosensoren verwendet werden. Biotin/Avidin- oder Biotin/Streptavidin- und Alkalische Phosphatase-Detektionssysteme können eingesetzt werden.
Die durch einzelne Antikörper-Reporter-Konjugate erzeugten Signale können verwendet werden, um quantifizierbare absolute oder relative Daten der relevanten Antikörperbindung in (Standard- und Test-) Proben herzuleiten.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem die Verwendung eines obigen spezifischen Bindungselements zur Messung von TGFβ₁-Spiegeln in einem kompetitiven Test bereit, d.h., ein Verfahren der Messung der Menge an TGFβ₁ in einer Probe durch Einsatz eines durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten spezifischen Bindungselements in einem kompetitiven Test. Dieser kann erfolgen, wo die physikalische Trennung von gebundenem und ungebundenem TGFβ₁ nicht erforderlich ist. Die Bindung eines Reportermoleküls an das spezifische Bindungselement, so dass eine physikalische oder optische Veränderung auftritt, ist eine der Möglichkeiten. Das Reportermolekül kann direkt oder indirekt nachweisbare und vorzugsweise messbare Signale erzeugen. Die Bindung von Reportermolekülen kann direkt oder indirekt, kovalent, z.B. über eine Peptidbindung, oder nichtkovalent erfolgen. Die Bindung über eine Peptidbindung kann als Ergebnis einer rekombinanten Expression einer Genfusion stattfinden, die für Antikörper und Reportermolekül kodiert.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem die direkte Messung von TGFβ₁-Mengen durch Einsatz eines spezifischen Bindungselements gemäß der Erfindung, beispielsweise in einem Biosensorsystem bereit.
Die Art und Weise der Bestimmung der Bindung ist kein Merkmal der vorliegenden Erfindung und Fachkundige auf dem Gebiet der Erfindung sind in der Lage, eine geeignete Art und Weise nach ihrer Präferenz und ihrem Allgemeinwissen auszuwählen.
Die vorliegenden Erfindung erstreckt sich weiters auf ein spezifisches Bindungselement, das mit irgendeinem spezifischen Bindungselement um die Bindung an TGFβ₁ konkurriert, wobei beide TGFβ₁ binden, und umfasst eine V-Domäne, einschließlich eine CDR mit Aminosäuren, wie sie im Wesentlichen hierin dargelegt sind, oder eine V-Domäne mit einer Aminosäuresequenz, wie sie hierin dargelegt ist. Die Konkurrenz zwischen Bindungselementen kann leicht in vitro getestet werden, beispielsweise durch Bindung eines spezifischen Reportermoleküls an eines der Bindungselemente, das in Gegenwart von einem oder mehreren anderen Bindungselementen nachgewiesen werden kann, um die Identifizierung spezifischer Bindungselemente zu ermöglichen, die dasselbe oder ein überlappendes Epitop binden. Die Konkurrenz kann beispielsweise unter Verwendung von TGFβ₁-ELISA wie in Beispiel 1 beschrieben bestimmt werden.
Bevorzugte Bindungselemente für TGFβ₁ konkurrieren um die Bindung an TGFβ₁ mit CAT 191, CAT 192 und/oder CAT 193.
Bevorzugte Ausführungsformen neutralisieren TGFβ₁ in hohem Ausmaß mit einer Wirksamkeit, die in einem Radiorezeptortest (C. Lucas et al., Meth. in Enzymology 198, 303-316 (1991)) zumindest 5 Mal, vorzugsweise ungefähr 10 Mal, 15 Mal, 20 Mal, 50 Mal, 75 Mal, 100 Mal oder 150 Mal besser als die von CS37 ist. Die Wirksamkeit wird mit dem untersuchten Antikörper und CS37 in gleichwertigen molekularen Formaten, z.B. als einwertige Antikörper (scFv oder Fab) oder als zweiwertige Antikörper (IgG1 oder IgG4) gemessen.
In einem der Aspekte bindet ein spezifisches Bindungselement gemäß der vorliegenden Erfindung ein Peptid, einschließlich die Aminosäuresequenz der Reste 92-98 von TGFβ₁ (dasselbe Epitop wie CS37).
Beim Testen darauf kann ein Peptid mit dieser Sequenz plus eine oder mehrere Aminosäuren an beiden Enden verwendet werden. Von einem derartigen Peptid kann gesagt werden, dass es „im Wesentlichen" aus der vorgegebenen Sequenz „besteht". Spezifische Bindungselemente gemäß der vorliegenden Erfindung können die Eigenschaft aufweisen, dass ihre Bindung an TGFβ₁ durch ein Peptid gehemmt wird, das die angegebene Sequenz aufweist oder umfasst. Beim Testen darauf kann ein Peptid mit einer der Sequenzen plus einer oder mehrerer Aminosäuren verwendet werden.
Spezifische Bindungselemente, die ein spezifisches Peptid binden, können beispielsweise aus einer Phagen-Display-Bibliothek durch Panning mit dem/den Peptid(en) isoliert werden.
Die vorliegende Erfindung stellt weiters eine isolierte Nucleinsäure bereit, die für ein spezifisches Bindungselement der vorliegenden Erfindung kodiert. Nucleinsäure umfasst DNA und RNA. In einem bevorzugten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Nucleinsäure bereit, die für eine oben definierte CDR oder VH- oder VL-Domäne der Erfindung kodiert.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem Konstrukte in Form von Plasmiden, Vektoren, Transkriptions- oder Expressionskassetten bereit, die zumindest eines der obigen Polypeptide umfassen.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem eine rekombinante Wirtszelle bereit, die eines oder mehrere der obigen Konstrukte enthält. Eine Nucleinsäure, die für irgendeine bereitgestellte CDR, VH- oder VL-Domäne oder irgendein bereitgestelltes spezifisches Bindungselement kodiert, stellt selbst einen Aspekt der vorliegenden Erfindung dar, ebenso ein Verfahren der Produktion des kodierten Produkts, wobei das Verfahren die Expression aus der dafür kodierenden Nucleinsäure umfasst. Die Expression kann zweckdienlicherweise durch Kultivieren von rekombinanten Wirtszellen unter geeigneten Bedingungen erzielt werden. Nach der Produktion durch Expression kann eine VH- oder VL-Domäne oder ein spezifisches Bindungselement unter Verwendung irgendeiner geeigneten Technik isoliert und/oder gereinigt und dann in geeigneter Weise verwendet werden.
Spezifische Bindungselemente, VH- und/oder VL-Domänen und kodierende Nucleinsäuremoleküle und Vektoren gemäß der vorliegenden Erfindung können beispielsweise aus ihrer natürlichen Umgebung in im Wesentlichen reiner oder homogener Form oder, im Falle einer Nucleinsäure, frei oder im Wesentlichen frei von Nucleinsäure oder Genen, die nicht die für ein Polypeptid mit der benötigten Funktion kodie rende Sequenz aufweisen, isoliert und/oder gereinigt bereitgestellt werden. Eine Nucleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung kann DNA oder RNA umfassen und kann teilweise oder vollkommen synthetisch sein. Die Bezugnahme auf eine hierin dargelegte Nucleotidsequenz umfasst ein DNA-Molekül mit der spezifizierten Sequenz und umfasst ein RNA-Molekül mit der spezifizierten Sequenz, in der T durch U substituiert ist, es sein denn, dass der Zusammenhang anderes bedingt.
Systeme zur Klonierung und Expression eines Polypeptids in einer Vielzahl von verschiedenen Wirtszellen sind wohlbekannt. Geeignete Wirtszellen umfassen Bakterien-, Säugetierzellen-, Hefe- und Baculovirus-Systeme. Auf dem Gebiet der Erfindung zur Expression eines heterologen Peptids verfügbare Säugetierzelllinien umfassen Chinahamster-Eierstockzellen, HeLa-Zellen, Babyhamster-Nierenzellen, NSO-Maus-Melanomzellen und viele andere. Ein gebräuchlicher, bevorzugter bakterieller Wirt ist E. coli.
Die Expression von Antikörpern und Antikörperfragmenten in prokaryotischen Zellen, wie z.B. E. coli, ist auf dem Gebiet der Erfindung gut eingeführt. Für einen Überblick siehe beispielsweise A. Plückthun, Bio/Technology 9, 545-551 (1991). Die Expression in eukaryotischen Zellen in Kultur ist dem Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung als Alternative zur Produktion eines spezifischen Bindungselements ebenfalls verfügbar, siehe jüngste Überblicksartikel, beispielsweise M.E. Reff, Curr. Opinion Biotech. 4, 573-576 (1993); J.J. Trill et al. (1995) Curr. Opinion Biotech. 6, 553-560.
Es können geeignete Vektoren ausgewählt oder konstruiert werden, die geeignete Regulationssequenzen, einschließlich Promotorsequenzen, Terminatorsequenzen, Polyadenylierungssequenzen, Enhancersequenzen, Markergene und andere geeignete Sequenzen enthalten. Vektoren können geeignete Plasmide, Viren, z.B. ein Phage oder Phagemid sein. Für weitere Einzelheiten siehe beispielsweise Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2. Aufl., Sambrook et al., Gold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Zahlreiche bekannte Techniken und Protokolle zur Manipulation von Nucleinsäuren, beispielsweise bei der Herstellung von Nucleinsäurekonstrukten, Mutagenese, Sequenzierung, Einführung von DNA in Zellen und Genexpression, und Analyse von Proteinen sind in Short Protocols in Molecular Biology, 2. Aufl., Ausubel et al. (Hrsg.), John Wiley & Sons, ausführlich beschrieben. Die Offenbarungen von Sambrook et al. und Ausubel et al. sind hierin durch Verweis aufgenommen.
Folglich stellt ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung eine Wirtszelle bereit, die eine hierin offenbarte Nucleinsäure enthält. Noch ein weiterer Aspekt stellt ein Verfahren bereit, das die Einführung einer derartigen Nucleinsäure in eine Wirtszelle umfasst. Die Einführung kann irgendeine verfügbare Technik einsetzen. Für eukaryotische Zellen können geeignete Techniken Calciumphosphat-Transfektion, DEAE-Dextran, Elektroporation, Liposom-vermittelte Transfektion und Transduktion unter Verwendung von Retroviren oder anderen Viren, z.B. Vaccinia, oder Baculovirus für Insektenzellen umfassen. Für Bakterienzellen können geeignete Techniken Calciumchlorid-Transformation, Elektroporation und Transfektion unter Verwendung von Bakteriophagen umfassen.
Der Einführung kann die Bewirkung oder Ermöglichung der Expression aus der Nucleinsäure folgen, z.B. durch Kultivieren von Wirtszellen unter Bedingungen zur Expression des Gens.
In einer ihrer Ausführungsformen wird die Nucleinsäure der Erfindung in das Genom (z.B. Chromosom) der Wirtszelle integriert. Die Integration wird durch Aufnahme von Sequenzen gefördert, welche die Rekombination mit dem Genom nach Standardtechniken fördern.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Verfahren bereit, das die Verwendung eines oben genannten Konstrukts in einem Expressionssystem bereitstellt, um ein spezifisches Bindungselement oder Polypeptid wie oben beschrieben zu exprimieren.
Die folgenden Beispiele illustrieren Aspekte und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.
Beispiel 1: Identifizierung von SL15S scFv (CAT-191) und JT182.
Beispiel 2: Konstruktion von Zelllinien, die den Antikörper SL15A IgG4 (CAT-192) und SL15S IgG4 (CAT-193) exprimieren.
Beispiel 3: Beurteilung der Neutralisierungseigenschaften von SL15S scFv (CAT-191) und SL15A IgG4 (CAT-192) und SL15S IgG4 (CAT-193):
Beispiel 4: Bindung des Antikörpers SL15S scFv (CAT-191) und SL15A IgG4 (CAT-192) zur Aktivierung von latentem TGFβ₁.
Beispiel 5: Epitop-Kartierung der Antikörper SL15S scFv und CS37 scFv.
Beispiel 1
Identifizierung von SL15S scFv (CAT-191) und JT182
Die Erfinder haben Antikörper-CDRs und VH- und VL-Domänen identifiziert, die mit denen des in WO 97/13844 offenbarten Antikörpers CS37 verwandt sind, jedoch unerwartet gute Eigenschaften aufweisen.
Die Sequenz der CS37-VH- (31G9-) Domäne und die dafür kodierende Nucleinsäure sind in Seq.-ID Nr. 2 bzw. Seq.-ID Nr. 1 dargestellt.
Die Sequenz der SL15- (a.k.a. KYLIE) VH-Domäne der vorliegenden Erfindung und die dafür kodierende Nucleinsäure sind in Seq.-ID Nr. 4 bzw. Seq.-ID Nr. 3 dargestellt.
Die zugehörigen VH-CDR3-Sequenzen sind in Tabelle 1 dargestellt, ebenso in Tabelle 2, die CDR1- und CDR2-Sequenzen von VH- sowie VL-Domänen umfasst.
Der Vergleich von CS37- (31G9-) und SL15- (Kylie) Domänen zeigt drei weitere Unterschiede hinsichtlich Gerüstresten an den Resten 1 (Glutamin CS37 zu Glutamat SL15), 6 (Glutamin CS37 zu Glutamat SL15) und 44 (Glycin CS37 zu Glutamat SL15).
Die SL15-VH-Domäne kann mit verschiedenen VL-Domänen gepaart sein und zwei derartige SL15-Varianten sind identifiziert worden. Eine davon, die als SL15A bekannt ist, umfasst CS37-VL. Die andere, die als SL15S bekannt ist, umfasst eine VL, die mit Ausnahme der Gegenwart von Serin am Rest 25 in SL15S im Vergleich zu Alanin in SL15A (CS37) der CS37-VL entspricht.
Die Sequenz der SL15A-VL- (CS37-) Domäne und die dafür kodierende Nucleinsäure sind in Seq.-ID Nr. 6 bzw. Seq.-ID Nr. 5 dargestellt.
Die Sequenz der SL15S-VL-Domäne und die dafür kodierende Nucleinsäure sind in Seq.-ID Nr. 8 bzw. Seq.-ID Nr. 7 dargestellt.
Die Sequenz der JT182-VH-Domäne und die dafür kodierende Nucleinsäure sind in Seq.-ID Nr. 10 bzw. Seq.-ID Nr. 9 dargestellt.
SL15S scFv, SC37 scFv und ein damit in Beziehung stehender Antikörper wurden als Phagen-Überstände in ELISA-Tests auf die Fähigkeit hin gescreent, TGFβ₁ zu binden. ELISA-Platten (96-Napf; Falcon) waren unbeschichtet oder mit rekombinantem TGFβ₁ (0,2 μg/ml) beschichtet. Phagen, die spezifisch an die antigenbeschichtete Platte banden, wurden unter Verwendung von Schaf-Anti-fd-Antiserum (Pharmacia), gefolgt von Alkalische-Phosphatase-konjugiertem Anti-Schaf (Sigma) und p-Nitrophenylphosphat- (pNNP-) Substrat (Sigma) nachgewiesen.
Die scFv-Fragmente wurden anschließend auf ihre Fähigkeit hin getestet, die Bindung von ¹²⁵I-TGFβ₁ an A549-Zellen in einem Radiorezeptor-Bindungstest (RRA) unter Verwendung des in Beispiel 3 beschriebenen Protokolls (siehe unten) zu neutralisieren. Für den RRA wurden einzelne Klone als lösliches scFv exprimiert und anschließend aus Periplasmapräparaten mittels immobilisierter Metallaffinitätschromatographie (IMAC), gefolgt von Fraktionierung von monomerem scFv mittels Gelfiltrations-FPLC an einer Superdex 75-Säule (Pharmacia) gereinigt.
SL15 scFv (SL15 VH/SL15 VL) weist im RRA die höchste Neutralisierungskraft mit einer IC₅₀ von 100 pM auf, die zumindest 100 Mal besser als die von CS37 ist. Die völlige Spezifität von SL15 scFv für die TGFβ₁-Isoform ist im TF1-Test bestätigt worden, bei dem keine Wechselwirkung mit TGFβ₂ und TGFβ₃ detektiert wurde.
Die scFv-Antikörper SL15S (SL15 VH/SL15 VL; CAT-191; a.k.a. Kylie-scFv) und SL15A (SL15 VH/CS37VL) wurden zum vollständigen Antikörper umgesetzt.
Beispiel 2
Konstruktion von Zelllinien, die den Antikörper SL15A IgG4 (CAT-192) und SL15S IgG4 (CAT-193) exprimieren
Zur Konstruktion von Zelllinien, die menschliches IgG4 exprimieren, wurden κ-Antikörper, Variable SL15-scFv-Schwer- und Leichtkettendomänen in Säugetier-Expressionsvektoren kloniert, die menschliches IgG4 bzw. menschliche Kappa-Konstantdomänen enthielten. Es wurden zwei Versionen, SL15A IgG4 (CAT-192) und SL15S IgG4 (CAT-193) hergestellt. Die Antikörper werden auch Kylie-IgG genannt.
Schwerketten-Expressionsvektor
Die VH aus der SL15S-scFv-DNA wurde mit den Oligonucleotiden P80 (Seq.-ID Nr. 25) und P64 (Seq.-ID Nr. 22) PCR-amplifiziert und durch überlappende PCR an ein DNA-Fragment von 159 by gebunden, das eine Signalsequenz, Spleißstellen und ein Intron aus M13VHPCR1 (Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 3833-3837 (1989)) enthielt, und zwar unter Verwendung der Oligonucleotide P10 (Seq.-ID Nr. 20) und P64 (Seq.-ID Nr. 22). Das PCR-Produkt von 558 by wurde mit HindIII und ApaI geschnitten und in mit HindIII/ApaI-geschnittenes pGamma4 (erhalten von Lonza Biologics) kloniert. Ligierte DNA wurde in E. coli TG1 transformiert, und es wurden Ampicillin-resistente Kolonien gescreent. Ein Plasmid mit der korrekten Insertion wurde identifiziert und pKylieVHγ4 genannt.
Leichtketten-Expressionsvektor
Die Vκ aus der CS37-scFv-DNA aus SL15S scFv wurde mit den Oligonucleotiden P65 (Seq.-ID Nr. 23) und P66 (Seq.-ID Nr. 24) PCR-amplifiziert und durch überlappende PCR an ein DNA-Fragment von 168 by gebunden, das eine Signalsequenz, Spleißstellen und ein Intron aus M13VKPCR1 (Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 3833-3837 (1989)) enthielt, und zwar unter Verwendung der Oligonucleotide P11 (Seq.-ID Nr. 21) und P66 (Seq.-ID Nr. 24). Das PCR-Produkt von 510 by wurde mit BstBI und BsiWI geschnitten und in mit BstBI-BsiWI geschnittenes pMR15.1 kloniert. Ligierte DNA wurde in E. coli transformiert und es wurden Ampicillin-resistente Kolonien gescreent. Ein Plasmid mit der korrekten Insertion wurde identifiziert und pCS37κ oder pKylieκ genannt.
Tandem-Expressionsvektor
Ein einzelnes Plasmid, das Schwer- sowie Leichtketten-DNAs und den selektierbaren gs-Marker enthielt, wurde für jede der Kylie-Varianten konstruiert. Der Schwerketten-Vektor pKylieVHγ4 wurde mit BamHI und NotI verdaut und das die H-Ketten-DNA enthaltende Fragment von 4.497 by gereinigt. Der Leichtketten-Vektor pCS37Vκ oder pKylieκ wurde gleichermaßen mit BamHI und NotI verdaut und das die L-Ketten-DNA enthaltende Fragment von 9.611 bp isoliert. Die beiden gereinigten Fragmente wurden miteinander ligiert, in E. coli TG1-Zellen transformiert und Ampicillin-resistente Kolonien gescreent. Ein Plasmid mit den korrekten Insertionen wurde identifiziert und die V-Regionen durch Sequenzierung bestätigt. Der endgültige Expressionsvektor wurde pKylieg4γs genannt. Es wurden zwei Versionen hergestellt, die SL15S VL oder CS37 VL enthielten.
Expression von SL15S IgG4 und SL15A IgG4
SL15S IgG4 und SL15A IgG4 wurden in der Maus-Myelomzelllinie NS0 (ECACC 85110503) exprimiert. Fünfzig μg pKylieg4γs wurden durch Verdau mit PvuI linearisiert, mit Ethanol präzipitiert und in 100 μl Wasser aufgelöst. 10⁷ NS0-Zellen wurden in PBS gewaschen, in 0,9 ml PBS resuspendiert, mit der Vektor-DNA gemischt und für 5 Minuten auf Eis gehalten. Die Zellen wurden dann mit einem einzigen Puls von 250 V bei 960 μFd der Elektroporation unterzogen und in Eis für 10 Minuten inkubiert. Die transfizierten Zellen wurden dann zu 30 ml Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), das wie von Bebbington et al., Bio/Technology 10, 169-175 (1992) beschrieben 2 mM Glutamin und 10% dialysiertes Fötalkälberserum (FCS) enthielt, zugegeben und 50 μl-Aliquote in 6 × 96-Napf-Platten verteilt. 24 Stunden später wurde Glutamin-freies DMEM/10% FCS (Bebbington et al. (1992) jedem Napf zugegeben.
Drei bis sechs Wochen nach der Transfektion wurden Kolonien mittels ELISA auf die Fähigkeit hin gescreent, menschliches IgG zu sekretieren. Näpfe von ELISA-Platten (Immulon 4, Dynatech) wurden in 50 mM Natriumbicarbonat/carbonat bei pH 9,6 mit 100 ng Ziegen-Anti-Human-IgG-Antikörpern (Harlan) pro Napf beschichtet. Überstand aus transfizierte Kolonien enthaltenden Näpfen wurde den Näpfen in 0,05 Vol.-Tween 20 enthaltendem PBS (PBST) für 1 Stunde zugegeben. Die Platten wurden 3 Mal mit PBST gewaschen und eingefangenes IgG mit 100 μl von 1:2.000 verdünnten, Meerrettichperoxidase- (HRP-) konjugierten Ziege-Anti-Human-Kappa-Antikörpern in PBST (Harlan) nachgewiesen. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur wurden die Platten mit 3 × PBST gewaschen und 100 μl OPD-Substrat zugegeben. Die Reaktionen wurden nach 5-10 Minuten durch Zugabe von 50 μl 12,5 Vol.-% Schwefelsäure gestoppt und die Absorption bei 490 nm gemessen.
Transfektanten, welche die höchsten Mengen an IgG sekretierten, wurden in Glutamin-freiem Medium in reduziertem FCS, in Gammaglobulin-freiem FCS oder ohne FCS vermehrt. Die Zelllinien wurden anschließend durch Grenzverdünnung kloniert.
IgG-Reinigung
Menschliche IgG4-Antikörper wurden mittels Protein A-Affinitätschromatographie, gefolgt von Größenausschlusschromatographie (SEC) gereinigt. Überstand aus der Vermehrung von IgG sekretierenden NS0-Zellen wurde mittels Zentrifugation und Filtration durch eine 0,22 μm-Membran geklärt. Eine Säule mit einer Protein A Sepharose Fast Flow-Matrix (Pharmacia) wurde mit 0,3 M NaCI, 50 mM Natriumphosphat (pH 8,0) äquilibriert und der Überstand aufgegeben. Die Säule wurde dann intensiv mit 50 mM Natriumphosphat (pH 8,0) gewaschen. Menschliches IgG wurde mit 0,1 M Glycin-HCI (pH 3,0) eluiert. Eluierte Fraktionen wurden mit 1 M Tris-HCI (pH 9,0) neutralisiert und Protein enthaltende Fraktionen durch Messung der Absorption bei 280 nm identifiziert. Die Reinigung mittels SEC erfolgte an einer Superdex 200-Säule in PBS. Das IgG wurde schließlich mittels Diafiltration gegen pyrogenfreies PBS unter Verwendung eines YM30 MWCO-Filters (Amicon) konzentriert.
Beispiel 3
Beurteilung der Neutralisierungseigenschaften von SL15S scFv (CAT-191) und SL15A IgG4 (CAT-192) und SL15S IgG4 (CAT-193)
Die Wirksamkeit der Neutralisierung von TGFβ₁ wurde für SL15S scFv (Kylie scFv) und seine Derivate unter Verwendung eines Radiorezeptortests und eines Zellproliferationstests (TF1) gemessen.
Materialien
[¹²⁵I]-TGFβ₁ wurde von Amersham geliefert (Bereich der spezifischen Aktivität 800-2.200 Ci/mmol). Rekombinanter TGFβ₁, β₂, β₃, latenter TGFβ₁, GM-CSF und IL-5 wurden von R&D Systems (Minneapolis, USA) erhalten. Genzyme Maus-mAb gegen TGFβ₁, β₂, β₃ wurde von Genzyme (Cambridge, MA, USA) erhalten. Die TF1-Zelllinie wurde von Robin Thorpe (NIBSC, UK) geliefert und wie unten ausführlich beschrieben kultiviert. Die Human-Lungenepithelkarzinom-Zelllinie A549 wurde von ATCC erhalten und in DMEM mit 10% FCS und 2 mM Glutamin gezüchtet. Alle anderen Reagenzien wurden von Sigma geliefert.
Verfahren
Radiorezeptortest
A549-Zellen wurden zu 2 × 10⁵ Zellen pro Napf für 24 Stunden in 24-Napf-Platten ausgesät, um >90% Konfluenz zu erlangen. Unmittelbar vor dem Test wurden Monolayers zweimal mit Puffer (1:1 DMEM:Hams-F12) gewaschen und 0,5 ml Testpuffer (1:1 DMEM.Hams F12 + 0,1% BSA) zugegeben. Zwei- oder Dreifach-Reihenverdünnungen von Antikörpern wurden in Testpuffer hergestellt und zu einem gleichen Volumen von 40 pM [¹²⁵I]TGFβ₁ in Testpuffer zugegeben.
Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur wurden 0,5 ml dieses Antikörper/[¹²⁵I]TGFβ₁-Gemisches in zweifacher Ausführung den Zellen (bereits in 0,5 ml Testpuffer) zugegeben und für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Endkonzentration an [¹²⁵I]TGFβ₁ betrug 10 pM. Kontrollen wurden als maximale Bindung (an Zellen, kein Antikörper) und minimale Bindung (mit Puffer, jedoch ohne Zellen inkubierte Näpfe) in zumindest dreifacher Ausführung mitgeführt.
Schließlich wurden die Platten 4× mit eiskaltem PBS gewaschen, bevor 0,8 ml Solubilisierungspuffer (25 mM Tris (pH 7,5), 10% Glycerin, 1% Triton X100) zugesetzt wurden. Die Platten wurden für zumindest 20 Minuten auf einer Schwenkplattform belassen, bevor die Inhalt jedes Napfs unter Verwendung eines Gamma-Zählers gezählt wurde.
Die Daten wurden nach Subtraktion der minimalen Bindung als % der maximalen Bindung ausgedrückt.
Bei der Untersuchung unter Verwendung von latentem TGFβ₁ wurden die % der maximalen Bindung für jeden Satz von Bedingungen (z.B. in Gegenwart von latentem TGFβ₁, säureinaktiviertem TGFβ₁ oder aktivem TGFβ₁) berechnet.
(C. Lucas et al., Meth. in Enzymology 198, 303-316 (1991)).
TF1-Test
TF1-Zellen wurden routinemäßig in 5% FCS und 2 mM Glutamin enthaltendem RPMI1640 (Wachstumsmedium) mit 2 ng/ml GM-CSF gezüchtet. Unmittelbar vor dem Experiment wurden die Zellen zweimal gewaschen und zu 4 × 10⁵ Zellen/ml in mit 4 ng/ml IL-5 ergänztem, frischem Medium entweder mit oder ohne TGFβ₁, β₂ oder β₃ (alle zu 50 pM) resuspendiert und Aliquote auf 96-Napf-Platten übertragen. Bei diesem Test verwendete scFv-Präparate waren FPLC-gereinigte Fraktionen, bei denen Endotoxin entfernt worden war.
Antikörper (Zweifach-Verdünnungsreihe) wurden in Wachstumsmedium bereitet und in zweifacher Ausführung den Zellen zugegeben. Die Kontrollen waren Zellen mit TGFβ alleine (kein Antikörper, maximale Wachstumshemmung) und Zellen ohne TGFβ und ohne Antikörper (minimale Hemmung). Die Zellen wurden für 48 Stunden bei 37°C inkubiert.
Am Ende des Tests wurde die Zellzahl unter Verwendung von CellTiter96 (Promega) gemessen und die Daten wurden als % Neutralisierung ausgedrückt, d.h.: % Neutralisierung = ((Testwert – maximale Hemmung) × 100)/(minimale Hemmung – maximale Hemmung)
Bei der Untersuchung von latentem TGFβ₁ wurden die Daten als % der Kontrolle (Wachstum in Abwesenheit von TGFβ₁) ausgedrückt, da die Menge an aktivem TGFβ₁ bei jeder Testbedingung variierte.
(L.A. Randall et al., J. Immunol. Meth. 164, 61-67 (1993)).
Produktion von Antikörpern
ScFv-Antikörper und IgG4-Antikörper wurden wie oben beschrieben hergestellt und gereinigt.
Ergebnisse
Wirksamkeit von SL15S scFv (CAT-191) und SL15A IgG4 (CAT-192) in einem Biotest (TF1-Test)
Die Fähigkeit von SL15S scFv (CAT-191), TGFβ₁, nicht jedoch TGFβ₂ oder β₃ im TF1-Test zu erkennen, wurde untersucht.
SL15S scFv (auch als Kylie scFv bekannt) neutralisierte das durch TGFβ₁ ausgelöste Wachstum, nicht jedoch jenes, das durch TGFβ₂ oder TGFβ₃ ausgelöst wurde (1). Als Kontrolle wurde ein monoklonaler Antikörper, Genzyme Mab 1.D.11.16, verwendet (Genzyme, J.R. Dasch et al., J. Immunol. 142, 1536-1541 (1989)), der TGFβ₁, TGFβ₂ und TGFβ₃ neutralisiert. Von Mab 1.D.11.16 hat sich erwiesen, das er in Modellen der Lungenfibrose, strahleninduzierten Fibrose (Barcellos-Hoff, US-Patent Nr. 5.616.561 (1997)) und Rheumatoidarthritis (Wahl et al., J. Exp. Medicine 177, 225-230 (1993)) wirksam ist. SL15S scFv zeigt eine mit dem Genzyme Mab 1.D.11.16 vergleichbare Wirksamkeit gegen TGFβ₁.
Die Aktivität von SL15A IgG4 (CAT-192; auch Kylie IgG4 genannt) wurde auch im TF1-Test nachgewiesen (5b), und zwar in der Untersuchung unter Verwendung von latentem TGFβ₁.
Wirksamkeit von SL15S scFv (CAT-191), SL15A IgG4 (CAT-192) und SL15S IgG4 (CAT-193) im Radiorezeptortest
Die Fähigkeit von SL15S scFv, TGFβ₁ zu erkennen und die Bindung von TGFβ₁ an A549-Zellen zu neutralisieren, wurde im Radiorezeptortest gemessen.
In einem Vergleich von his-preps von scFv wurde SL15S (Kylie) mit den elterlichen Antikörpern CS37 und JT182 (2) verglichen und erwies sich als 100 bis 150 Mal und 10 Mal aktiver. SL15 wurde als IgG in zwei Formen, SL15A IgG4 (CAT-192) und SL15S IgG4 (CAT-193) neu formatiert. Gereinigte Präparate von SL15S scFv, SL15A IgG4, SL15S IgG4 und Mab 1D.11.16 (Genzyme mAb) wurden ebenfalls analysiert (3).
SL15S scFv hat eine ähnliche Wirksamkeit wie der Genzyme Mab 1.D.11.16, der in Tiermodellen wirksam ist. Zusammenfassend ist SL15S scFv ein höchst wirksamer, neutralisierender Antikörper für TGFβ₁ mit IC₅₀-Werten im Bereich von 0,03 bis 0,1 nM.
Beispiel 4
Bindung des Antikörpers SL15S scFv (CAT-191) und SL15A IgG4 (CAT-192) zur Aktivierung von latentem TGFβ₁
Die in diesem Beispiel beschriebenen Experimente bewiesen, dass SL15S scFv und SL15A IgG4 an TGFβ₁, nicht jedoch an latenten TGFβ₁ binden und TGFβ₁, nicht jedoch latenten TGFβ₁ neutralisieren.
Latenter TGFβ₁ ist die biologisch inaktive Form, in der TGFβ₁ aus Zellen sekretiert wird, und setzt sich aus einem Latenz-assoziierten Peptid-Dimer (bestehend aus zwei Monomeren von 249 Aminosäuren) und einem reifen TGFβ₁-Dimer (bestehend aus zwei Monomeren von 112 Aminosäuren) zusammen. Latenter TGFβ₁ wird von Zelloberflächen-TGFβ-Rezeptoren nicht erkannt.
Von TGFβ₁ wird angenommen, dass es durch die Wirkung von Proteasen in vivo freigesetzt wird, was durch Ansäuerung in vitro nachgeahmt werden kann.
Latenter TGFβ₁ weist eine berichtete ED50 von 0,43 nM und 2 pM vor bzw. nach Ansäuerung auf, wie sie in einem Proliferationstest gemessen wird. Aktiver TGFβ₁ weist in einem Proliferationstest eine berichtete ED50 von ungefähr 2 pM auf. Vermutlich ist die Wirkung von latentem TGFβ₁ vor der Ansäuerung auf die Gegenwart von etwas aktivem TGFβ₁ zurückzuführen. Diese Restaktivität muss bei der Interpretation der Ergebnisse berücksichtigt werden.
Die Wirksamkeit von SL15S scFv und SL15A IgG4 wurde unter Verwendung des Radiorezeptortests und TF1-Proliferationstests in Gegenwart variierender Mengen an latentem TGFβ₁, säureinaktiviertem TGFβ₁ und aktivem TGFβ₁ getestet. Falls die Antikörper latenten TGFβ₁ erkennen, sollte ihre Wirksamkeit vermindert sein. Die Interpretation beider Tests wird durch die Tatsache erschwert, dass jegliches aktives, im latenten Präparat vorhandene TGFβ₁ mit [¹²⁵I)TGFβ₁ um die Bindung konkurrieren und biologische Aktivität an den Zellen aufweisen wird.
Latenter TGFβ₁ wurde durch Zugabe von 2 μl 0,5 M HCI zu 1 ml latentem TGFβ₁ für 15 Minuten bei Raumtemperatur säureinaktiviert und dann mit 43 μl 0,05 M NaOH/0,01 M Hepes neutralisiert.
Die Ergebnisse zeigen, dass im Radiorezeptortest keine signifikante Wirkung von latentem TGFβ₁ (0,1 nM) auf die Wirksamkeit von SL15S scFv (Kylie scFv) oder SL15A IgG4 (Kylie IgG) besteht, wogegen die Säureinaktivierung des latenten TGFβ₁ oder einer, äquivalenten Konzentration an aktivem TGFβ₁ die Fähigkeit des Antikörpers vermindert, die [¹²⁵I]TGFβ₁-Bindung zu neutralisieren (4).
Der TF1-Proliferationstest war sehr empfindlich auf die Aktivität des aktiven TGFβ₁ im latenten TGFβ₁-Präparat. Trotzdem erwiesen sich SL15S scFv oder SL15A IgG4 als fähig, den geringen Anteil an aktivem TGFβ₁ im latenten Präparat zu neutralisieren und bei Säureinaktivierung des latenten TGFβ₁ dieses wirksam zu neutralisieren (5).
Daher bindet und neutralisiert SL15 im scFv- oder IgG-Format nur aktives, nicht jedoch latenter TGFβ₁ sowohl bei Messung im Radiorezeptortest, als auch bei Messung im TF1-Neutralisationstest.
Beispiel 5
Epitop-Kartierung der Antikörper SL15S scFv und CS37 scFv
In diesem Beispiel wurde das Epitop am TGFβ₁ ermittelt, an das die Antikörper CS37 und SL15S binden.
TGFβ₁ und TGFβ₂ weisen ähnliche Strukturen auf, unterscheiden sich jedoch hinsichtlich ihrer Bindungsaffinität für den TGFβ-Typ II-Rezeptor und ihrer Wirksamkeit in einer Reihe von biologischen Tests (O.G. Ottmann und L.M. Pelus, J. Immunol. 140, 2661-2665 (1988); J.R. Merwin et al., Am. J. Pathol. 138, 37-51 (1991); K.C. Flanders et al., Development 113, 183-191 (1991); L. Suardet et al., Cancer Res. 52, 3705-3712 (1992)). Qian et al. (J. Biol. Chem. 271, 30656-30662 (1996)) machten sich die Unterschiede der Affinität zunutze, um die an der hochaffinen Bindung von TGFβ₁ an den Typ II-Rezeptor beteiligten Schlüsselreste zu identifizieren. Dies wurde ausgeführt, indem eine Reihe von chimären Molekülen zwischen TGFβ₁ und TGFβ₂ hergestellt und jene Spezies identifiziert wurden, die eine hochaffine Rezeptorbindung in vitro beibehielten (Qian et al., s.o.) und in vivo (J.K. Burmester et al., Growth Factors 15, 231-242 (1998)). Auf diese Weise wurde die von den Resten 83-112 von TGFβ₁ umfasste C-terminale Region als ausreichend erkannt, um eine wirksame Rezeptorbindung aufrecht zu erhalten.
Der Vergleich der Sequenzen von TGFβ₁ und TGFβ₂ identifizierte mehrere Unterschiede, einschließlich eine aus den Resten 92-98 bestehende Schleife, die 4 Aminosäureunterschiede zwischen TGFβ₁ und TGFβ₂ umfasst. Wenn diese Reste aus TGFβ₂ in ein TGFβ₁-Gerüst eingeführt wurden, wurde die Rezeptorbindung in hohem Ausmaß vermindert, was diese als Schlüsselreste bei der Wechselwirkung von TGFβ₁ mit dem Typ II-Rezeptor identifizierte.
Die chimären Moleküle wurde auf ähnliche Weise verwendet, um die Bindungsstelle von CS37 und SL15S scFv (CAT-191) an TGFβ₁ zu kartieren. TGFβ₁/β₂ (83-112) entspricht der N-terminalen und zentralen Region von TGFβ₁ von Rest 1 bis 82, fusioniert mit der C-terminalen Region von TGFβ₂ von Rest 83 bis 112. TGFβ₂/β₁ 83-112 entspricht der N-terminalen und zentralen Region von TGFβ₂ von den Resten 1 bis 82, fusioniert mit der C-terminalen Region TGFβ₁ von Rest 83 bis 112. Schließlich entspricht TGFβ₁-β₂ (40-112) der N-terminalen Region von TGFβ₁ von Rest 1 bis 39 und der zentralen und C-terminalen Region von TGFβ₂ von Rest 40 bis 112. Diese werden hiernach als 1-1-2, 2-2-1 bzw. 1-2-2 bezeichnet, um die verhältnismäßige Zusammensetzung der Isoformen widerzuspiegeln.
Diese drei Moleküle zusammen mit TGFβ₁ und TGFβ₂ wurden hinsichtlich der Hemmung der Bindung von SL15S scFv und CS37 scFv an immobilisierten TGFβ₁ wie folgt charakterisiert.
Phagen präsentierendes SL15S scFv oder CS37 scFv wurde aus Klonen in pCANTAB6 mittels M13K07-Superinfektion hergestellt. Die Phagen wurden mittels PEG präzipitiert und in 2% Marvel enthaltendem PBS resuspendiert. Die Phagen (2,5 bis 5 × 10¹⁰ in 50 μl) wurden für 30 Minuten einer vorgeblockten, mit 0,5 μg/ml TGFβ₁ beschichteten ELISA-Platte zugegeben.
Für die Hemmanalyse wurde dieselbe Phagenkonzentration verwendet und eine Verdünnungsreihe von TGFβ-Konzentrationen für jedes der oben beschriebenen chimären TGFβ-Moleküle (erhalten von J. Burmester, National Institutes of Health) und die TGFβ₁- und 2-Isoformen vorbereitet.
Diese wurden über Nacht bei 4°C inkubiert, bevor sie der ELISA-Platte zugegeben wurden. Phagen, die spezifisch an die mit Antigen beschichtete Platte banden, wurden unter Verwendung eines Schaf-Anti-fd-Antiserums (Pharmacia), gefolgt von an Alkalische-Phosphatase-konjugiertem Anti-Schaf-Immunglobulin (Sigma) und p-Nitrophenylphosphat- (pNPP-) Substrat (Sigma) nachgewiesen.
Der ungehemmte Wert (d.h., 0 nM) für Kylie betrug 1,67 (Mittelwert dreier Messungen) und betrug für CS37 1,216 (Mittelwert von sieben Messungen). Die in 6 und 7 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die sowohl von CS37 scFv, als auch von SL15S scFv erkannten Epitope sich zwischen den Resten 83-122 von TGFβ₁ befinden. Darüber hinaus hemmt das mutierte Molekül TGFβ₁-β₂ (92-98), das TGFβ₁ mit der TGFβ₂-Sequenz von Rest 92 bis 98 umfasst, ebenfalls die Bindung von CS37 und SL15S scFv an TGFβ₁, jedoch mit verminderter Wirkung, insbesondere für SL15S scFv. Dies beweist, dass zumindest ein Teil des von diesen Antikörpern erkannten Epitops sich innerhalb der Region 92-98 (welche vier Reste an den Positionen 92, 94, 95 und 98 aufweist, die sich zwischen TGFβ₁ und TGFβ₁ unterscheiden) befindet.
Beispiel 6
Beschleunigung der Hornhautepithel-Wundheilung in Gegenwart des monoklonalen Anti-TGFβ₁-Antikörpers SL15A IgG4 (CAT-192)
TGFβ ist mit der Modulation der (okularen sowie dermalen) Wundheilung in Zusammenhang gebracht worden und hemmt erwiesenermaßen die Geschwindigkeit der Wiederepithelisierung. Hier wurde die Wirkung der topischen Anwendung von SL15A IgG4 (CAT-192) auf die Geschwindigkeit der Hornhautepithel-Wundheilung unter Verwendung eines Organkulturmodells beurteilt (D.M. Foreman et al., Exp. Eye Res. 62, 555-564 (1996)).
Es wurden Trephin-Wundexzisionen (5 mm Durchmesser, 250 um Tiefe) an Rinder-Hornhäuten erzeugt. Hornhaut-Skleraringe wurden für bis zu 96 Stunden in einem serumfreien Luftgrenzflächen-Organkultursystem gehalten. Zum Zeitpunkt der Verwundung und zweimal täglich danach wurden 100 μl serumfreies T8-Medium tropfenweise auf Epitheloberfläche und Hornhautrand aufgebracht, wobei das Medium Folgendes enthielt: (i) 10 ng/ml TGFβ₁; (ii) 100 μg/ml Anti-TGFβ₁-mAb; (iii) eine Kombination von (i) und (ii); (iv) 100 μg/ml Null-Antikörper (2G6 IgG4); (v) 100 μg/ml Antikörper-Verdünner; oder (vi) keine Zusätze (n = 9 für jede Gruppe). Die Wiederepithelisierung wurde unter Verwendung eines Bildanalysesystems beurteilt und als prozentueller Anteil der ursprünglich vom Epithel bedeckten Wundfläche ausgedrückt.
Kontroll-Hornhäute, die nur Medium, Null-Antikörper oder Antikörper-Verdünner erhielten, zeigten eine vollständige Wiederepithelisierung bis zum Zeitpunkt 72 Stunden. Die Behandlung mit 100 μg/ml Anti-TGFβ₁-mAb erhöhte die Geschwindigkeit der Wiederepithelisierung dermaßen, dass die Hornhäute bis zum Zeitpunkt 48 Stunden vollständig wiederepithelisiert waren (8). Mit 10 ng/ml TGFβ₁ behandelte Hornhäute zeigten eine verzögerte Wiederepithelisierung bis zum Zeitpunkt 24 Stunden und diese Hemmwirkung wurde durch Anti-TGFβ₁-mAb aufgehoben (9). Alle angegebenen Unterschiede waren signifikant (p<0,05). Es wurde eine lineare Regression an den Datenpunkten zwischen 2 und 48 Stunden durchgeführt (siehe 8), um die Geschwindigkeit der Wiederepithelisierung zu bestimmen. CAT192 verursachte eine signifikante Erhöhung dieser Variablen (Tab. 3). Die histologische Analyse unterstützte die Bildanalyseergebnisse und bestätigte, dass die Zugabe von Anti-TGFβ₁-mAb die Architektur der Hornhaut nicht nachteilig beeinflusste.
Tabelle 3: Wirkung von CAT192 oder TGFβ₁ auf die Geschwindigkeit der Wiederepithelisierung von isolierter Rinder-Hornhaut in Luftgrenzen-Orgenkultur nach Trephin-Wundexzision
Tabelle 3 – Legende
Rinder-Hornhäute wurden mit 100 μl von entweder serumfreiem Medium 199 (Kontrolle) oder Medium enthaltendem Vehikel (für Antikörper und TGFβ₁) Isotyp-passendem Null-IgG4-Antikörper, TGFβ₁ oder CAT192 unmittelbar nach Verwundung und in 12-Stunden-Intervallen danach behandelt. Lineare Regression wurde an den Datenpunkten zwischen 2 und 48 Stunden durchgeführt (siehe 8), um die Geschwindigkeit der Wiederepithelisierung zu bestimmen. CAT192 verursachte eine signifikante Erhöhung der Geschwindigkeit der Wiederepithelisierung von verwundeter Rinder-Hornhaut, wogegen TGFβ₁ eine signifikante Abnahme dieser Variablen verursachte. Die dargestellten Werte sind der Mittelwert und die mittlere Standardabweichung. Die Wirkung der verschiedenen Behandlungen wurde unter Verwendung einseitiger ANOVA mit Tukey-Test verglichen. *p<0,01 im Vergleich zur Null-Antikörper-Behandlungsgruppe; ?P0,01 im Vergleich zur mit Vehikel behandelten Gruppe.
Diese Ergebnisse bestätigen die bedeutende Rolle von endogenem TGFβ₁ bei der Hornhautepithel-Reparatur und bringen einen Nachweis dafür bei, dass die topische Anwendung des Anti-TGFβ₁-mAb SL15A IgG4 (CAT-192) verwendet werden kann, um eine verbesserte Wundheilung in vivo zu fördern.
SEQUENZPROTOKOLL Seq.-ID Nr. 1 Für CS37 VH (31G9) kodierende Nucleinsäure
Seq.-ID Nr. 2 Aminosäuresequenz von CS37 VH (31G9)
Seq.-ID Nr. 3 Für SL15 VH kodierende Nucleinsäure
Seq.-ID Nr. 4 Aminosäuresequenz von SL15 VH
Seq.-ID Nr. 5 Für SL15A VL (CS37) kodierende Nucleinsäure
Seq.-ID Nr. 6 Aminosäuresequenz von SL15A VL (CS37)
Seq.-ID Nr. 7 Für SL15S VL kodierende Nucleinsäure
Seq.-ID Nr. 8 Aminosäuresequenz von SL15S VL
Seq.-ID Nr. 9 Für JT182 VH kodierende Nucleinsäure
Seq.-ID Nr. 10 Aminosäuresequenz von JT182 VH
Seq.-ID Nr. 11
Seq.-ID Nr. 12
Seq.-ID Nr. 13
Seq.-ID Nr. 14
Seq.-ID Nr. 15
Seq.-ID Nr. 16
Seq.-ID Nr. 17
Seq.-ID Nr. 18
Seq.-ID Nr. 19
Seq.-ID Nr. 20
Seq.-ID Nr. 21
Seq.-ID Nr. 22
Seq.-ID Nr. 23
Seq.-ID Nr. 24
Seq.-ID Nr. 25
Sequenzprotokoll

Claims

Isoliertes spezifisches Bindungselement, das zur Bindung von TGFβ₁ fähig ist, worin das spezifische Bindungselement eine Antigen-Bindungsdomäne, die eine VH CDR3 mit einer Aminosäuresequenz umfasst, die im Wesentlichen wie die VH CDR3 von SL15, die durch Seq.-ID Nr. 13 identifiziert ist, oder die VH CDR3 von JT182, die durch Seq.-ID Nr. 15 identifiziert ist, dargelegt ist.
Spezifisches Bindungselement nach Anspruch 1, das außerdem eine VH CDR1 oder eine VH CDR2 mit einer Aminosäuresequenz umfasst, die im Wesentlichen wie eine oder beide der CS37 VH CDR1, die durch Seq.-ID Nr. 11 identifiziert ist, und der CS37 VH CDR2, die durch Seq.-ID Nr. 12 identifiziert ist, dargelegt ist.
Spezifisches Bindungselement nach Anspruch 1 oder 2, die eine CDR1-Sequenz umfasst, die im Wesentlichen wie die CS37 CDR1, die durch Seq.-ID Nr. 11 identifiziert ist, und die CS37 VH CDR2, die durch Seq.-ID Nr. 12 identifiziert ist, dargelegt ist.
Spezifisches Bindungselement nach Anspruch 3, worin die CDR1-, CDR2- und CDR3-Sequenzen von einem Humanantikörpergerüst getragen werden.
Isoliertes spezifisches Bindungselement, das zur Bindung von TGFβ₁ fähig ist, worin das spezifische Bindungselement die SL15-VH-Domäne umfasst, die im Wesentlichen in Seq.-ID Nr. 4 dargelegt ist.
Isoliertes spezifisches Bindungselement, das zur Bindung von TGFβ₁ fähig ist, worin das spezifische Bindungselement die JT182-VH-Domäne umfasst, die im Wesentlichen in Seq.-ID Nr. 10 dargelegt ist.
Isoliertes spezifisches Bindungselement, das zur Bindung von TGFβ₁ fähig ist, worin das spezifische Bindungselement die SL15S-VL-Domäne umfasst, die im Wesentlichen in Seq.-ID Nr. 8 dargelegt ist.
Isoliertes spezifisches Bindungselement, das zur Bindung von TGFβ₁ fähig ist, worin das spezifische Bindungselement Folgendes umfasst: (i) eine VH-Domäne, die aus der aus der SL15-VH-Domäne, die im Wesentlichen in Seq.-ID Nr. 4 dargelegt ist, und der JT182-VH-Domäne, die im Wesentlichen in Seq.-ID Nr. 10 dargelegt ist, bestehenden Gruppe ausgewählt ist; und (ii) eine VL-Domäne, die aus der aus der SL15S-VL-Domäne, die im Wesentlichen in Seq.-ID Nr. 8 dargelegt ist, und der SL15A-VL-Domäne, die im Wesentlichen in Seq.-ID Nr. 6 dargelegt ist, bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Isoliertes spezifisches Bindungselement nach Anspruch 8, worin die VH-Domäne die SL15-VH-Domäne ist, die im Wesentlichen in Seq.-ID Nr. 4 dargelegt ist.
Isoliertes spezifisches Bindungselement nach einem der vorangegangenen Ansprüche in Form eines Einzelketten-Fv (scFv).
Isoliertes spezifisches Bindungselement nach einem der Ansprüche 1 bis 9 in Form eines IgG.
Isoliertes spezifisches Bindungselement nach Anspruch 11, worin das IgG ein IgG1 oder IgG4 ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die das spezifische Bindungselement nach einem der vorangegangenen Ansprüche zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten, Träger, Puffer oder Stabilisator umfasst.
Spezifisches Bindungselement nach einem der Ansprüche 1 bis 12 oder Zusammensetzung nach Anspruch 13 zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung von Menschen oder Tieren.
Spezifisches Bindungselement oder Zusammensetzung zur Verwendung nach Anspruch 14, worin die Behandlung in der Behandlung eines Leidens in Zusammenhang mit extrazellulärer Matrixablagerung bei einem Patienten, wie beispielsweise Glomerulonephritis, keloider und hypertropher Narbenbildung, proliferativer Vitreoretinopathie, Glaukom-Drainage-Operation, Hornhautverletzung und Katarakten, besteht.
Spezifisches Bindungselement oder Zusammensetzung zur Verwendung nach Anspruch 14 in einem Verfahren zur Modulierung der Immun- oder Entzündungsreaktion.
Spezifisches Bindungselement oder Zusammensetzung zur Verwendung nach Anspruch 14 in einem Verfahren zur Behandlung eines Tumors.
Spezifisches Bindungselement oder Zusammensetzung zur Verwendung nach Anspruch 17, worin der Tumor in Zusammenhang mit Angiogenese oder Metastasenbildung steht.
Spezifisches Bindungselement oder Zusammensetzung zur Verwendung nach Anspruch 17 oder 18, worin es sich beim Tumor um einen Brust-, Prostata-, Eierstock-, Magen-, kolorektalen, Haut-, Lungen-, Zervix- oder Blasentumor oder um Leukämie oder ein Sarkom handelt.
Spezifisches Bindungselement oder Zusammensetzung zur Verwendung nach Anspruch 14 in einem Verfahren zur Behandlung von Asthma.
Verwendung eines spezifischen Bindungselements nach einem der Ansprüche 1 bis 12 oder einer Zusammensetzung nach Anspruch 13 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Leidens bei einem Patienten, wobei das Leiden in Zusammenhang mit der Expression von TGFβ₁ steht.
Verwendung nach Anspruch 21, worin das Leiden in Zusammenhang mit extrazellulärer Matrixablagerung bei einem Patienten, einschließlich Glomerulonephritis, keloider und hypertropher Narbenbildung, proliferativer Vitreoretinopathie, Glaukom-Drainage-Operation, Hornhautverletzung und Katarakten; mit einem Tumor, einschließlich eines Tumors in Zusammenhang mit Angiogenese oder Metastasenbildung, und/oder einem Brust-, Prostata-, Eierstock-, Magen-, kolorektalen, Haut-, Lungen-, Zervix- oder Blasentumor, sowie Leukämien oder Sarkomen; oder Asthma steht.
Verfahren zur Bestimmung der Menge an TGFβ₁ in einer Probe, worin die Probe in Kontakt mit einem spezifischen Bindungselement nach einem der Ansprüche 1 bis 12 gebracht und das Ausmaß der Bindung des spezifischen Bindungselements an TGFβ₁ in der Probe bestimmt wird.
Isolierte Nucleinsäure, die eine Sequenz umfasst, welche für das spezifische Bindungselement nach einem der Ansprüche 1 bis 12 kodiert.
Verfahren zur Herstellung eines spezifischen Bindungselements, das zur Bindung von TGFβ₁ fähig ist, wobei das In-vitro-Verfahren das Exprimieren der Nucleinsäure nach Anspruch 24 in einer Wirtszelle unter Bedingungen umfasst, welche die Expression der Nucleinsäure ermöglichen, gefolgt von der Gewinnung des spezifischen Bindungselements.
Verfahren zum Erhalt einer für TGFβ₁ spezifischen Antikörper-Antigen-Bindungsdomäne, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: das Bereitstellen einer VH-Domäne, die eine Aminosäuresequenzvariante einer VH-Domäne ist, durch Addition, Deletion, Substitution oder Insertion von einer oder mehreren Aminosäuren in einer aus Seq.-ID Nr. 4 und Seq.-ID Nr. 10 ausgewählten VH-Domäne, das Kombinieren der so bereitgestellten VH-Domäne mit einer oder mehreren VL-Domänen, um eine oder mehrere VH/VL-Kombinationen bereitzustellen; und/oder das Bereitstellen einer VL-Domäne, die eine Aminosäurensequenzvariante einer VL-Domäne ist, durch Addition, Deletion, Substitution oder Insertion von einer oder mehreren Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der VL-Domäne mit Seq.-ID Nr. 8, das Kombinieren der so bereitgestellten VL-Domäne mit einer oder mehreren VH-Domänen, um eine oder mehrere VH/VL-Kombinationen bereitzustellen; und das Testen der VH/VL-Kombination oder -Kombinationen, um eine für TGFβ₁ spezifische Antikörper-Antigen-Bindungsdomäne zu identifizieren.
Verfahren zur Herstellung eines spezifischen Bindungselements, das für TGFβ₁ spezifisch ist, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: das Bereitstellen eines Ausgangsrepertoirs an Nucleinsäuren, die für eine VH-Domäne kodieren und entweder eine zu ersetzende CDR3 enthalten oder keine für CDR3 kodierende Region aufweisen; das Kombinieren des Repertoires mit einer Spendernucleinsäure, die für eine Aminosäuresequenz kodiert, wie sie hierin im Wesentlichen für die SL15- oder JT182-VH-CDR3 dargelegt ist, so dass die Spendernucleinsäure in die CDR3-Region im Repertoire insertiert wird, um ein Produktrepertoire an Nucleinsäuren bereitzustellen, die für eine VH-Domäne kodieren; und/oder das Bereitstellen eines Ausgangsrepertoirs an Nucleinsäuren, die für eine VL-Domäne kodieren, die entweder eine zu ersetzende CDR3 enthalten oder keine für CDR3 kodierende Region aufweisen; das Kombinieren des Repertoires mit einer Spendernucleinsäure, die für eine Aminosäuresequenz kodiert, wie sie hierin im Wesentlichen für die SL15-VL-CDR3 dargelegt ist, so dass die Spendernucleinsäure in die CDR3-Region im Repertoire in sertiert wird, um ein Produktrepertoire an Nucleinsäuren bereitzustellen, die für eine VL-Domäne kodieren; das Exprimieren der Nucleinsäuren dieses Produktrepertoires; das Auswählen eines spezifischen Bindungselements, das für TGFβ₁ spezifisch ist; und das Gewinnen des spezifischen Bindungselements oder der dafür kodierenden Nucleinsäure.