TWI733661B - 以高親合性、結合性及特異性結合轉化生長因子－β１的經修飾ＩｇＧ抗體 - Google Patents
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Abstract
經修飾的IgG抗體選擇性地且以高親和性及親合力結合並中和TGFβ1。經修飾的IgG抗體包含4個多肽鏈並且可包含對於多肽鏈拐角區的修飾。經修飾的IgG抗體可用於治療性應用，包括疾病的治療。
Description
經修飾的IgG抗體各自包含第一、第二、第三和第四多肽鏈，其對於轉化生長因子-β1(TGFβ1)呈現高親和性(affinity)和親合力(avidity)，但對於TGFβ2或TGFβ3則無。本發明亦提供包含所述經修飾的IgG抗體的組合物及使用該組合物來治療涉及TGFβ1活性的疾病的方法。
許多嚴重疾病與TGFβ誘導的信號傳輸途徑機能障礙有關。例如，TGFβ的增加的組織水平被認為是特發性肺纖維化和心肌纖維化進展中的因素。此外，高局部組織TGFβ水平可以允許一些類型的癌細胞的維持和進展。因此，TGFβ信號傳輸的下調可以降低此類腫瘤細胞的存活力。
TGFβ同種型是~25kDa同型二聚體分子，其具有相似的結構框架，其中兩個單體經二硫橋共價地連接。哺乳動物同種型具有70-82%的序列同一性，但在血管發育和免疫細胞功能調控中具有不重疊的活性。在人類中已報道了三個TGFβ同種型：TGFβ1、TGFβ2、和TGFβ3(Swiss Prot登錄號分別為P01137、P08112、和P10600)。TGFβ1和TGFβ3在結
合至兩個跨膜受體(稱為TGFβ受體I型和II型)的胞外結構域時觸發細胞信號傳輸級聯反應。TGFβ2可以結合至TGFβ受體I型和II型以及TGFβ受體III型。
已針對臨床使用測試了能結合人類TGFβ1、TGFβ2、和TGFβ3的抗體。例如，Grütter等揭示GC1008(一種人類IgG4單選殖抗體(Mab；即GC1008))，其在臨床開發中用於治療惡性腫瘤和纖維化疾病。Proc.Nat’l Acad. Sci.USA 105(51)：20251-56(2008)。GC1008是「泛特異性的」TGFβ中和抗體，因為其能夠中和所有的三種人類TGFβ同種型。選擇性中和TGFβ1的抗體是公開的，例如在美國專利第6,492,497號和美國專利第7,151,169號中，其在此通過提述併入本文。美替木單抗(metelimumab)，又稱CAT192(IgG4)，是一種選擇性中和TGF-β1的人類IgG4單選殖抗體。參見例如美國專利No.6,492,497。測試美替木單抗用於治療彌散性皮膚系統性硬化病(diffuse cutaneous systemic sclerosis)，又稱硬皮病(scleroderma)，但證明其功效不足。
本發明提供結合TGFβ1的經修飾的IgG抗體，其能選擇性地結合並中和人類TGFβ1。本發明的經修飾的IgG抗體來源於美替木單抗。所述經修飾的IgG抗體的VH和VL域表現出與美替木單抗相似的TGFβ1結合親和性及親合力以及TGFβ1中和能力。在許多情況中，本發明的抗體提供相對於美替木單抗改進的親和性和親和力及中和作用。在一個具體例中，經修飾的IgG抗體含有兩個VL域(其各自連接至CL域)，和VH域(其連接至CH1域)，以及鉸鏈和Fc區。
本發明的經修飾的IgG抗體包含能夠結合TGFβ1的可變域。在另一個具體例中，本發明的經修飾的IgG抗體包含結合蛋白，如通過表
面等離子體共振測量的，所述結合蛋白展現出的針對人類TGFβ1的Kd比同一結合蛋白針對人類TGFβ2的Kd至少低約兩倍(所述結合蛋白展現出的針對人類TGFβ1的Kd是同一結合蛋白針對人類TGFβ2的Kd的至多1/2)。
在另一個具體例中，本發明涉及單離的結合蛋白，其包含能結合TGFβ1的可變域，其中如通過表面等離子體共振測量的，所述結合蛋白展現出的針對人類TGFβ1的Kd比同一結合蛋白針對人類TGFβ3的Kd的至少低約兩倍(所述結合蛋白展現出的針對人類TGFβ1的Kd是同一結合蛋白針對人類TGFβ3的Kd的至多1/2)。
在進一步的具體例中，本發明涉及單離的結合蛋白，其包含能結合TGFβ1的可變域，其中如通過表面等離子體共振測量的，所述結合蛋白展現出的針對人類TGFβ1的Kd比同一結合蛋白針對人類TGFβ2的Kd至少低約兩倍，且比同一結合蛋白針對人類TGFβ3的Kd至少低約兩倍(所述結合蛋白展現出的針對人類TGFβ1的Kd是同一結合蛋白針對人類TGFβ2的Kd的至多1/2，且是同一結合蛋白針對人類TGFβ3的Kd的至多1/2)。
在進一步的具體例中，本發明涉及結合TGFβ1的單離的結合蛋白，其中所述結合蛋白包含第一多肽鏈、第二多肽鏈、第三多肽鏈和第四多肽鏈。在一個方面，所述第一和第二多肽鏈從N末端至C末端具有下式：(VL域)-(連接子1)m-(CL域)，其中所述VL域包含可變輕鏈互補決定區1(LCDR1)、可變輕鏈互補決定區2(LCDR2)、及可變輕鏈互補決定區3(LCDR3)，並且其中m是1，且其中所述連接子1包含具有如下序列的肽：亮胺酸-谷胺酸-異亮胺酸-賴胺酸-Xp-Yq-Zr-精胺酸-蘇胺酸-纈胺酸-丙胺酸，X、Y和
Z獨立地是選自下組的胺基酸：絲胺酸、甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸、異亮胺酸、和蘇胺酸，且p、q和r的每一個獨立地是0至5的整數。在另一個方面，第三和第四多肽鏈從N末端至C末端具有下式：(VH域)-(連接子2)n-(CH1域)-(鉸鏈)s-(Fc區)，其中所述VH域包含可變重鏈互補決定區1(HCDR1)、可變重鏈互補決定區2(HCDR2)、及可變重鏈互補決定區3(HCDR3)；且其中n是0或1而s是0或1。在另一個方面，連接子2包含具有如下序列的肽：蘇胺酸-纈胺酸-絲胺酸-Ad-Be-Cf-絲胺酸-丙胺酸-絲胺酸-蘇胺酸，A、B和C各自獨立地是選自下組的胺基酸：絲胺酸、甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸、異亮胺酸、和蘇胺酸；且其中d、e和f的每一個獨立地是0至5的整數。
在一個方面，連接子2可以含有選自下組的序列：SEQ ID No.45、SEQ ID No.46、SEQ ID No.47、和SEQ ID No.48。
在一個方面，所述HCDR1可以具有具有SEQ ID No.7的胺基酸序列，所述HCDR2可以具有SEQ ID No.8的胺基酸序列，而所述HCDR3可以具有SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11或SEQ ID No.15的胺基酸序列。
VH域的框架區可以選自可變重鏈種系序列。例如，VH域可以選自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中所示的人類VH域序列，或其具有多至5個胺基酸的修飾的變體。
本發明的結合蛋白的VL域可以包含可變輕鏈互補決定區1(LCDR1)、可變輕鏈互補決定區2(LCDR2)、及可變輕鏈互補決定區3(LCDR3)。在一個方面，所述SEQ ID No.12的胺基酸序列，LCDR2可以具有SEQ ID No.13的胺基酸序列，且LCDR3可以具有SEQ ID No.
14的胺基酸序列。
VL域的框架區可以選自可變的λ或κ種系序列。例如，VL域可以選自SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4中所示的人類Vκ域序列，或其具有多至4個胺基酸的修飾的變體。在一個具體例中，二聚體的各個多肽可以包含SEQ ID NO：1中所示的VH域和SEQ ID NO：3中所示的Vκ域，其分別是美替木單抗中存在的VH和VL域。
在另一個具體例中，Fc區通過鉸鏈與CH1域連接。所述鉸鏈可以包含來源於人類IgG1或IgG4鉸鏈區的胺基酸序列。例如，鉸鏈可以包含胺基酸序列PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP(SEQ ID NO：5)，或其具有多至5個胺基酸修飾的變體。在另一個具體例中，鉸鏈長度可以在1至15個胺基酸變化。
在另一個具體例中，在CAT192 Fab拐角區(elbow region)上進行定點誘變以改進TGFβ1結合親和性。將1至5個胺基酸(G、GG、GGS、GGGS和GGGGS)***至輕鏈拐角區以增加鉸鏈的柔性，可能需要所述鉸鏈以呈現來自兩條鏈的功能性結合互補位。來自Expi293轉染的條件培養基顯示出良好的表達和通過八位字節(by Octet)對TGFβ1結合的顯著改進。通過Ni-NTA純化突變體，並用Biacore來證實高TGFβ結合親和性。具有1至5個***至LC拐角區的胺基酸的CAT192突變體重獲scFv對TGFβ1的高親和性結合。這些工程改造的拐角***突變體還保留了同種型-選擇性並可以充當TGFβ1特異性拮抗劑。
在另一個方面，VH域可以含有具有SEQ ID No.7的胺基酸序列的可變重鏈互補決定區1(HCDR1)、具有SEQ ID No.8的胺基酸序列的可變重鏈互補決定區2(HCDR2)、和具有選自下組的胺基酸序列的可變重鏈互補決定區3(HCDR3)：SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、和SEQ ID No.15。
在另一個方面，VL域可以含有具有SEQ ID No.12的胺基酸序列的可變輕鏈互補決定區1(LCDR1)、具有SEQ ID No.13的胺基酸序列的可變輕鏈互補決定區2(LCDR2)、和具有SEQ ID No.14的胺基酸序列的可變輕鏈互補決定區3(LCDR3)。
在另一個方面，連接子1可以含有具有亮胺酸-谷胺酸-異亮胺酸-賴胺酸-Xp-Yq-Zr-精胺酸-蘇胺酸-纈胺酸-丙胺酸的序列的肽，其中X、Y或Z獨立地是選自下組的胺基酸：絲胺酸、甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸、異亮胺酸、和蘇胺酸，且p、q和r的每一個獨立地是0至5的整數。在另一個方面，X、Y或Z的每一個優選為絲胺酸和甘胺酸。在另一個方面，p、q和r的每一個是1。在另一個方面，p是0，而q和r的每一個是1。在另一個方面，p是1，而q和r的每一個是0。在另一個方面，p是2，而q和r的每一個是1。在另一個方面，p是1，而q和r的每一個是2。
在一個具體例中，連接子1可以含有選自下組的序列：SEQ ID No.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25、和SEQ ID No.26，其每一個都是來源於SEQ ID No.21的突變形式。在另一個具體例中，第一多肽鏈含有選自下組的序列：SEQ ID No.39、SEQ ID No.40、和SEQ ID No.41，其每一個都是來源於CAT192 IgG1(SEQ ID No.38)的輕鏈的突變形式。
在另一個方面，連接子1和連接子2可以各自獨立地如上文對連接子1的描述所述。在這個方面，連接子2可以含有具有亮胺酸-谷胺酸-異亮胺酸-賴胺酸-Ad-Be-Cf-精胺酸-蘇胺酸-纈胺酸-丙胺酸的序列的肽，其中A、B和C獨立地是選自下組的胺基酸：絲胺酸、甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸、異亮胺酸、和蘇胺酸，且d、e和f的每一個獨立地是0至5的整數。在另一個方面，A、B和C的每一個優選為絲胺酸
和甘胺酸。在另一個方面，d、e和f的每一個是1。在另一個方面，d是0，而e和f的每一個是1。在另一個方面，d是1，而e和f的每一個是0。在另一個方面，d是2，而e和f的每一個是1。在另一個方面，d是1，而e和f的每一個是2。
在另一個具體例中，連接子2可以含有選自下組的序列：SEQ ID No.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25，和SEQ ID No.26，其每一個都是來源於SEQ ID No.21的突變形式。在另一個具體例中，第一多肽鏈含有選自下組的序列：SEQ ID No.39、SEQ ID No.40、和SEQ ID No.41，其每一個都是來源於CAT192 IgG1(SEQ ID No.38)的輕鏈的突變形式。
在另一個具體例中，本發明的結合TGFβ1的Fab或IgG分子選擇性地結合TGFβ1，但不以顯著的程度結合TGFβ2或TGFβ3。
在另一個具體例中，公開了單離的多核苷酸，其可以包含編碼本發明的經修飾的IgG抗體的核苷酸序列。所述單離的多核苷酸可以是cDNA、重組DNA或合成DNA。宿主細胞可以包含單離的核酸。宿主細胞可以是人類細胞，例如人類胚腎293(HEK293)細胞和來源於其的細胞系，或其可以是中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。製備經修飾的IgG抗體的方法可以包括適於產生所述經修飾的IgG抗體的條件下培養宿主細胞。可以對經修飾的IgG抗體進行純化。純度可以是90%、95%、99%、99.5%或更高。
本發明的經修飾的IgG抗體可以是組合物的組件。該組合物可以是藥物組合物。所述藥物組合物可以包含治療有效量的所述經修飾的IgG抗體。組合物還可以進一步包含一個或多個生物活性組分、賦形劑、或稀釋劑。
一種在人類中治療由TGFβ1活性直接或間接導致的疾病或病況
的方法可以包括施用藥物組合物，所述藥物組合物包含治療有效量的經修飾的IgG抗體。所述疾病或病況可以選自下組：纖維化疾病、癌症、免疫介導的疾病，例如彌散性皮膚系統性硬化病、骨重塑疾病、腎病和/或其組合。經修飾的IgG抗體可以用於製造治療選自下組的疾病或病況的藥物：纖維化疾病、癌症、免疫介導的疾病，例如彌散性皮膚系統性硬化病、骨重塑疾病、腎病和/或其組合。對疾病或病症的治療可以包括中和TGFβ1或抑制TGFβ1信號傳輸。對疾病或病症的治療可以包括抑制TGFβ1介導的纖連蛋白產生、血管內皮生長因子(VEGF)產生、上皮細胞增殖、內皮細胞增殖、平滑肌細胞增殖、或免疫抑制。對疾病或病症的治療可以包括增加自然殺傷細胞活性。
本圖式在此用於描述的目的，而不用於限制本發明的範圍。
圖1描繪了Biacore TGFβ1結合測定的結果，其顯示了當scFv(CAT191)轉變為全長IgG4(CAT192)分子時親和性的損失。
圖2描繪了scFv、Fab、IgG分子、和拐角區的結構元件，其被設計來恢復親和性。
圖3顯示了純化的IgG變體的SDS-PAGE凝膠的結果，所述IgG變體在重鏈和輕鏈拐角區中具有額外的胺基酸。SDS-PAGE顯示了在還原的和非還原的條件下純化的IgG變體的純度。
圖4顯示了純化的IgG變體的Biacore結合測定，所述IgG變體在重鏈和輕鏈拐角區中具有額外的胺基酸。Biacore測定結果證明了變體的同種型選擇性的及高親和性結合。
圖5顯示了純化的IgG變體的A549細胞生物測定，所述IgG變體在重鏈和輕鏈拐角區中具有額外的胺基酸。A549測定比較多種抗體構建
體對TGFβ1刺激的IL-11生產的抑制效果，顯示出拐角工程改造的變體在這項基於細胞的效力測定中是高度有效的。
圖6描繪了Biacore TGFβ1結合測定，其顯示當額外的胺基酸***至CAT192 Fab的重鏈和輕鏈二者的拐角區中時，高親和性結合得到了恢復。
圖7顯示了差示掃描螢光測定法(DSF)對CAT192 Fab突變體熱穩定性的分析。
圖8顯示了差示掃描螢光測定法(DSF)對CAT192 IgG4突變體熱穩定性的分析。
圖9顯示了對CAT192 Fab變體解析的晶體結構。
本發明的經修飾的IgG抗體選擇性地以高親和性和親合力結合並中和TGFβ1。經修飾的IgG抗體可以由與美替木單抗相同的VH和VL域組成。經修飾的IgG抗體有利地顯示出比當可變域以其他形式使用時更大的中和TGFβ1效力。
本文所用的第一組件「和/或」第二組件意指具體公開了分別的第一或第二組件，或是第一和第二組件的組合。除上下文另有明確說明外，單數形式「一」、「一個」和「該」包括複數指稱。
「單離的」多核苷酸(或核酸)或蛋白是使用遺傳工程技術自其天然形式移出和改變的。「純化的」核酸或蛋白可以是基本上純的，例如至少90%純，或是同質形式的。
「選擇性結合」或「選擇性地結合」至人類TGFβ1，意指如通過表面等離子體共振測量的，結合蛋白(例如scFv-Fc二聚體)能夠以比結合至人類TGFβ2或人類TGFβ3更高的親和性結合人類TGFβ1，例如其與
人類TGFβ1的離解常數比其與TGFβ2或人類TGFβ3的離解常數低至少兩倍(其與人類TGFβ1的離解常數是其與TGFβ2或人類TGFβ3的離解常數的至多1/2)。
在一個具體例中，本發明的經修飾的IgG抗體的可變域包含來自美國專利中No.6,492,497公開的CDR(例如美國專利中No.6,492,497的SEQ ID Nos.11-19)的互補決定區(CDR)，其在此通過提述併入。所述CDR區列於下表：
令人驚奇地，揭示了共有的(consensus)HCDR3結合基序，其具有如下序列：
其中：X1可以是任意胺基酸(優選為E或F)，或缺失，X2可以是任意胺基酸(優選為S、D或P)，或缺失，X3可以是任意胺基酸(優選為G、P或A)，或缺失，X4可以是任意胺基酸(優選為V、Q或S)，或缺失，X5可以是任意胺基酸(優選為E、Y或P)，或缺失，
X6可以是任意胺基酸(優選為L、S或D)，或缺失。
在一個具體例中，本公開的經修飾的抗體的VH域包含HCDR1，其具有如下序列：
SEQ ID No.1：人類IgG1 VH域殖株SL15(SQN4 US6492497)
SEQ ID No.2：人類IgG1 VH域殖株JT182(SQN10 US6492497)
SEQ ID No.3：人類IgG1 Vκ域殖株SL15A：(SQN6 US6492497)
SEQ ID No.4：人類IgG1 Vκ域殖株SL15S：(SQN8 US6492497)
SEQ ID No.5：人類IgG1鉸鏈區PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP
SEQ ID No.6：人類IgG1 Fc區
SEQ ID No.7，具有SEQ ID No.8的序列的HCDR2，和具有選自下組的序列的HCDR3：SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、和SEQ ID No.15。CDR序列可以在任意處被1至4個框架區分隔開，其順序為自N末端：FW1-CDR1-FW2-CDR2-FW3-CDR3-FW4。VH域的框架區可以選自可變重鏈種系序列。在一個具體例中，
FW區序列可以選自相同的人類可變重鏈種系序列。VL域的框架區可以選自可變λ或κ種系序列，例如選自相同的人類可變λ或κ種系序列。目前，本領域已知約40個可變重鏈種系序列，如存在40個κ可變種系序列和約30個可變λ種系序列，例如VH3、Vκ1、VH 1-69、和VH 1-e。
在另一個具體例中，可以通過使用本文公開的CDR序列來生成複合的VH或VL域。例如，VH或VL的晶體結構可以用作引導來生產複合域，所述產生用來自一個抗體的CDR序列和用來自另一抗體的種系FW區來進行。更多細節可見於美國專利申請公開號20020099179；及Homes和Foote,J Immunol.1997 Mar 1；158(5)：2192-201，其二者均在此併入本文作為參考。
本經修飾的IgG抗體可以由與美替木單抗中相同的VH和VL域組成，其分別具有SEQ ID No.1和SEQ ID NO.3中所示序列。所述VH域可以用具有SEQ ID NO.2中所示序列的VH域來替代；所述VL域可以用具有SEQ ID NO.4中所示序列的VL域來替代。這些VH和VL域公開於美國專利第6,492,497號(例如美國專利第6,492,497號的SEQ ID NOS：4、6、8、和10)中，其在此併入本文作為參考。
「可變域」(VD)意指免疫球蛋白的高度可變結合域，或受體的配體結合域，其涉及抗原/配體結合，正如本領域技術人員所知的那樣。可變域通常根據其在免疫球蛋白內的位置或來源來稱呼，例如免疫球蛋白的輕鏈可變域(VL)、例如免疫球蛋白的重鏈可變域(VH)、駱駝型免疫球蛋白的重鏈可變域(VHH)。
「變體」可變域包含與參考序列相比胺基酸添加、取代和/或缺失。VH或VL域的「變體」可以具有多至4個此類胺基酸修飾。例如，兩個域的一個可以包含胺基酸取代，而另一個域是未修飾的，或兩個域都
可以包含胺基酸取代。添加或缺失胺基酸殘基的修飾可以在VH或VL域的N末端或C末端進行。例如，可以缺失VH域的N末端殘基。就本公開而言，術語「之間」、「從」、「至」和「至少」是包含(本數)的。例如，「從0至5」的整數意指大於或等於0但小於或等於5的任意整數。
在一個具體例中，可以進行多至5個胺基酸替換以將經修飾的IgG抗體去免疫化。例如，去免疫化可以根據Harding等(2010)mAbs2：256-265的方法來進行。
例如，可以取代VH和/或VL域的框架殘基來增加經修飾的IgG抗體的穩定性和/或降低其聚集的趨勢。低穩定性能影響表達的經修飾的IgG抗體在重組表達時正確折疊的能力，導致表達的抗體級分是非功能性的。低穩定性抗體也可能易於形成潛在免疫原性聚集體或可能具有受損的親合力或儲藏壽命。預期增加VH和/或VL域穩定性和/或降低VH和/或VL域的聚集趨勢的框架胺基酸取代(例如在經修飾的IgG抗體中)公開於例如WO 2007/109254中。預期本VH和VL域中的相應殘基中的取代類似地增加穩定性和/或降低經修飾的IgG抗體聚集的趨勢。
預期能容許的取代包括會以其他人類VH或VL域種系序列中出現的對應胺基酸來替換SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、或SEQ ID No.4的胺基酸的那些。用這些種系序列的任一個中出現的胺基酸對框架胺基酸的取代是可以容許的。例如，SEQ ID No.1的VH域的殘基可以用任何VH種系序列中對應位置中出現的胺基酸來取代，所述VH種系序列例如來自DP-10(VH 1-69)或DP-88(VH 1-e)的種系序列。這種情況中的對應位置是通過不同種系序列之間的序列比對來確定的，所述比對用本領域所熟知的比對技術(例如ClustalW)來進行。
預期容許的額外取代是對大多數側鏈暴露於溶劑的胺基酸進行的那些額外取代，如通過分析三個共晶結構所確定的。可以用本領域所
熟知的技術來評估殘基的溶劑可及的表面積。進一步地，預期對埋藏在可變域內的胺基酸的取代會是更為容許的，如果該胺基酸的側鏈不與鄰近的殘基產生位阻的話。因此，埋藏的胺基酸通常用具有相似或更小尺寸的側鏈的胺基酸來取代。例如，用Leu、Val、Ala、或Gly對埋藏的Ile殘基的取代預期是容許的。可以通過分析所述三個共晶結構來預測可能由取代產生的位阻。預期容許的進一步取代是在可變域內維持現存的靜電相互作用(例如偶極-偶極相互作用、誘導的偶極相互作用、氫鍵、或離子鍵)的那些。
可變域的額外的胺基酸取代包括預期為抗體或其抗原結合片段帶來新的有用特性的那些。例如，可以去除VH和/或VL域中推定的N-醣基化位點以防止或降低N-醣型的形成。可以用Gln來取代胺基末端殘基以引起焦穀醯胺化(pyroglutamylation)，其能降低電荷變體的數目。例如，胺基酸取代可以用於降低等電點，這能降低IgG多肽抗體的清除率。
例如，可變域的表面殘基可以用Cys或Lys殘基來取代，然後能將其共價地修飾並偶聯至分子，所述分子能為抗體或其抗原結合片段帶來有用特性，例如可檢測的標記物、毒素、靶向模塊、或蛋白。例如，能將Cys殘基偶聯至細胞毒性藥物以形成綴合物。還能將Cys殘基偶聯至增加血清半衰期的分子，例如聚乙二醇(PEG)或血清白蛋白。此類胺基酸修飾綜述於例如Beck等(2010)Nature 10：345-52中。
可檢測標記物包括放射性標記物如131I或99Tc，可以用本領域已知方法將其附接至抗體或其抗原結合片段。標記物也包括酶標記物如辣根過氧化物酶。標記物還包括化學模塊如生物素，其可以通過對特異性的同族可檢測模塊(例如帶標記的親和素)的結合來檢測。可以附接其他促進純化的模塊。例如，可以用熟知的重組修飾和表達方法對抗體或其抗原結合片段加His標簽。
通過連接子(此處稱為連接子1)將經修飾的IgG抗體的VL域連接至CL域。任選地通過第二連接子(此處稱為連接子2)將經修飾的IgG抗體的VH域連接至CH1域。適於製備經修飾的IgG抗體的連接子是本領域所熟知的。參見例如Bird等(1988)Science,242：423-426；Huston等(1988)Proc.Nat’l Acad. Sci.USA 85：5879-5883。例如，這可以通過框內融合編碼核酸和在合適的宿主細胞中表達融合蛋白來完成。
連接子1可以含有連接IgG分子內的VL和CL的肽，或具有增加的柔性的修飾形式。例如，其可以具有亮胺酸-谷胺酸-異亮胺酸-賴胺酸-Xp-Yq-Zr-精胺酸-蘇胺酸-纈胺酸-丙胺酸的序列，其中X、Y或Z獨立地是選自下組的胺基酸：絲胺酸、甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸、異亮胺酸、和蘇胺酸，且p、q和r的每一個獨立地是0至5的整數。X、Y或Z的每一個優選地是絲胺酸和甘胺酸，且p、q和r的每一個是1。在另一個方面，p是0，而q和r的每一個是1。在另一個方面，p是1，而q和r的每一個是0。
連接子2可以含有具有蘇胺酸-纈胺酸-絲胺酸-Ad-Be-Cf-絲胺酸-丙胺酸-絲胺酸-蘇胺的序列的肽，A、B和C獨立地是選自下組的胺基酸：絲胺酸、甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸、異亮胺酸、和蘇胺酸，且d、e和f獨立地是是0至5的整數。
在另一個具體例中，任選地將鉸鏈***經修飾的IgG抗體的CH1域和Fc區之間。在一個方面，鉸鏈區是柔性域，其任選地將CH1部分與Fc區連接。IgG分子中鉸鏈區的柔性可以允許Fab臂採取廣範圍的角度，允許結合至以可變距離隔開的表位。合適的鉸鏈區包括，例如具有的胺基酸序列PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP(SEQ ID No.5)的人類IgG1鉸鏈區。例如，該序列對應於人類IgG1上鉸鏈、中鉸鏈的部分、和CH2域的N末端部分，如美國專利第8,048,421號的圖4B中公開的。
在另一個具體例中，經修飾的IgG抗體的合適的Fc區含有兩個或三個恒定區。Fc區可以包括來自人類IgG1的那些(如SEQ ID No.6中所示)或來自IgG4的那些(如SEQ ID No.17的域CH2和CH3中所示)。抗體的Fc區介導其血清半衰期和效應子功能，如補體依賴性的細胞毒性(CDC)、抗體依賴性的細胞毒性(ADCC)、和抗體依賴性的細胞吞噬作用(ADCP)。
可以對鉸鏈和Fc區進行修飾以改進經修飾的IgG抗體的多種特性。在一個具體例中，除了對鉸鏈區的修飾外，還可以對天然存在的人類Fc區的1、2、3、4、5或多至10個胺基酸進行修飾。例如，可以修飾Fc區以增加經修飾的IgG抗體的血清半衰期。IgG的半衰期取決於其對受體FcRn的pH依賴性結合。FcRn在內皮細胞表面上表達，其以pH依賴性的方式結合IgG並保護其不被降解。例如，已顯示定位於CH2和CH3域之間的界面的突變增加對FcRn的結合親和性及IgG1的體內半衰期。例如，此類修飾綜述於Strohl WR.,2009.Optimization of Fc-mediated effector functions of monoclonal antibodies.Curr Opin Biotechnol.20(6)：685-91；及Vaccaro C.et al.,2005.Engineering the Fc region of immunoglobulin G to modulate in vivo antibody levels.Nat Biotechnol.23(10)：1283-8中。
對鉸鏈和/或Fc區的其他修飾可以增加或降低效應子功能。四個人類IgG同種型以不同的親和性結合激活性的Fcγ受體(FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa)、抑制性的FcγRIIb受體、及第一補體組份(C1q)，導致不同的效應子功能。例如，IgG對FcγRs或C1q的結合取決於定位於IgG鉸鏈區和CH2域中的殘基。這些殘基的單個或多個胺基酸取代能通過調製IgG與FcγRs或C1q的相互作用影響效應子功能。已知其他取代影響效應子功能。例如，這些修飾綜述於Strohl(2009)“Optimization of Fc-mediated
effector functions of monoclonal antibodies,”Curr.Opin.Biotechnol.20：685-91中。
代表性的鉸鏈和/或Fc區修飾總結於表1中。
1. Hinton等(2004) J. Biol. Chem. 279(8):6213-16.
2. Vaccaro等(2005) Nature Biotechnol. 23(10):1283-88.
3. Armour等(1999) Eur. J. Immunol. 29(8):2613-24.
4. Shields等(2001) J. Biol. Chem. 276(9):6591-604.
5. Idusogie等(2000) J. Immunol. 164(8):4178-84.
6. Idusogie等(2001) J. Immunol. 166(4):2571-75.
7. Lazar等(2006) Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 103(11):4005-10.
8. Ryan等(2007) Mol.Cancer Ther. 6: 3009-18.
9. Datta-Mannan等(2007) Drug Metab. Dispos. 35: 86-94.
10. Steurer等(1995) J. Immunol. 155(3):1165-74.
11. Richards等(2008) Mol. Cancer Ther. 7(8):2517-27.
12. Labrijn等(2009) Nature Biotechnol. 27(8):767-71.
進一步地，重組胺基酸修飾能用於降低表達的多肽的結構同質性。代表性的例子是Peters等(2012)J.Biol.Chem.287(29)：24525-33，其公開了IgG4鉸鏈區中的Cys至Ser取代，其降低二硫鍵異質性並增加Fab域熱穩定性。類似地，Zhang等(2010)Anal.Chem.82：1090-99公開了工程化IgG2鉸鏈區以限制治療應用中二硫鍵雜亂化(scrambling)和結構異構體的形成。對CH3域的胺基酸修飾也能用於缺失羧基末端Lys殘基以減少電荷變體的數目。胺基酸修飾還能用於改進重組抗體或其抗原結合片段的藥理學功能。例如，胺基酸修飾能用於提高補體活化、通過增加FcγRIIIA結合或減少FcγRIIIB結合來增強抗體依賴性的細胞毒性(ADCC)、和/或通過增加FcRn結合來增加血清半衰期。例如，此類胺基酸修飾綜述於Beck等(2010)Nature 10：345-52中。
本發明進一步的方面提供編碼經修飾的IgG抗體的核酸。例如，單離的核酸可以是合成的DNA、非天然存在的mRNA、或cDNA。例子包括編碼美國專利No.6,492,497的SEQ ID NOS：3、5、7、和9中所示的VH和VL域的核酸。重組宿主細胞可以包含一個或多個上述構建體。製備經修飾的IgG抗體的方法包括在產生經修飾的IgG抗體的條件下在宿主細胞中表達所述編碼胺基酸，以及回收抗體。回收抗體的方法可以包括單離和/或純化該抗體。生產的方法可以包括將抗體配製於組合物中，所述組合物包含至少一個額外的組分，如藥學上可接受的賦形劑。
本文所用的術語「重組宿主細胞」(或簡稱「宿主細胞」)意指其中引入了外源DNA的細胞。應當理解此類術語不僅意指具體的細胞本體，還指這種細胞的後代。因為由於突變或環境影響，具體的修飾可以發生在隨後的數代中，所以實際上這種後代可能與親本細胞不是完全一樣的，但仍然涵蓋在本文所用的術語「宿主細胞」的範圍內。優選的是，宿主細胞包括選自生物界任一種的原核和真核細胞。優選的真核細胞包括原生生物、真菌、植物和動物細胞。最優選的是，宿主細胞包括但不限於原核細胞系大腸桿菌(E.Coli)；哺乳動物細胞系CHO、HEK 293和COS；昆蟲細胞系Sf9；以及真菌細胞釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
可以選擇或構建合適的包含編碼經修飾的IgG抗體的核酸的載體，其含有適當的調控序列，包括啟動子序列、終止子序列、多聚腺苷酸化序列、增強子序列、標記基因序列和適當的其他序列。例如，載體可以是質粒、噬菌體、噬菌粒、腺病毒、AAV、慢病毒。用於操作核酸(例如在製備核酸構建體、誘變、測序、將DNA引入細胞、和基因表達中)的技術和實驗方案，是本領域所熟知的。
本文所用的術語「載體」意指能運輸與其連接的另一核酸的核酸
分子。一種類型的載體是「質粒」，其意指環狀雙鏈DNA環，額外的DNA片段可以連接到其中。另一種類型的載體是病毒載體，其中額外的DNA片段可以連接到該病毒基因組中。一些載體能在它們所被引入的宿主細胞(例如具有細菌複製起點的細菌載體和游離體(episomal)哺乳動物載體)中自主複製。其他載體(例如非游離體(non-episomal)哺乳動物載體)在引入宿主細胞中時能整合至宿主細胞的基因組中，並由此與宿主基因組一起複製。此外，一些載體能指導與其可操作地連接的基因的表達。此類載體在此稱為「重組表達載體」(或簡稱「表達載體」)。通常，在重組DNA技術中實用的表達載體常常是質粒的形式。在本說明書中，「質粒」和「載體」可以互換地使用，因為質粒是最常用的載體形式。然而，本發明意在包括這些其他形式的表達載體，如病毒載體(例如複製缺陷逆轉錄病毒、腺病毒、和腺相關病毒)，其發揮等價的功能。
將此類核酸引入宿主細胞可以用本領域所熟知的技術來完成。對於真核細胞而言，合適的技術可以包括例如磷酸鈣轉染、DEAE-右旋糖酐(DEAE-Dextran)、電穿孔、脂質體介導的轉染、和用逆轉錄病毒或其他病毒轉導。對於細菌細胞，合適的技術可以包括氯化鈣轉化、電穿孔、和用噬菌體轉染。引入後可為引起或允許由核酸的表達，例如通過在用於表達基因的條件下培養宿主細胞來進行。在一個具體例中，本發明的核酸整合至宿主細胞的基因組(例如染色體)中。可以通過按照標準技術含入序列來促進整合，所述序列促進與基因組的重組。
用於在多種不同的宿主細胞中選殖和表達多肽的系統是熟知的。合適的宿主細胞包括細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、昆蟲細胞、真菌、酵母和轉基因植物和動物。本領域中用於表達異源多肽的可用哺乳動物細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎細
胞、小鼠黑色素瘤細胞、大鼠骨髓瘤細胞、人類胚腎細胞(例如HEK293細胞)、人類胚視網膜細胞，和許多其他細胞系。抗體及抗體片段在原核細胞(例如大腸桿菌)中的表達是本領域中已發展完善的。綜述參見例如PlückthunBio/Technology9：545-551(1991)。在培養的真核中表達對於本領域技術人員而言也是可行的，如例如Andersen et al.,(2002)Curr.Opin.Biotechnol.13：117-23中所綜述的。
在另一個具體例中，本發明的經修飾的IgG抗體可以天然地或是由表達宿主(例如CHO、HEK293、或NSO(ECACC 85110503)細胞)選擇地醣基化的，或例如如果通過在原核細胞中表達來產生的話，它們可以是非醣基化的。還可以特意對醣基化進行改變，例如通過抑制岩藻醣基化，從而增加所得的經修飾的IgG抗體的ADCC活性。
經修飾的IgG抗體可用於治療或診斷人類或動物身體的方法中，如人類患者中的疾病或病症的治療方法(其可以包括預防性治療)，其包括使用有效量來治療該患者。可治療的病況包括TGFβ1起作用的任何病況，例如纖維化疾病、癌症、免疫介導的疾病、和傷口癒合，例如彌散性皮膚系統性硬化病、骨重塑疾病、腎病和/或其組合。
已顯示特異性針對人類TGFβ1的抗體在動物模型中對於治療TGFβ1腎小球性腎炎(Border et al.,(1990)Nature 346：371-374)、神經瘢痕形成(Logan et al.,(1994)Eur.J.Neurosci.6：355-363)、真皮瘢痕形成(Shah et al.,(1992)Lancet 339：213-214；Shah et al.,(1994)J.Cell Science 107：1137-1157；Shah et al.,(1995)J.Cell Science 108：985-1002)、及肺纖維化(Giri et al.,(1993)Thorax 48：959-966)是有效的。進一步地，已顯示針對TGFβ1、2、和3的抗體在肺纖維化、輻射誘導的纖維化(美
國專利第5,616,561號)、骨髓纖維化、燒傷、Dupuytren氏攣縮(Dupuytren’s contracture)、胃潰瘍、和類風濕性關節炎模型中是有效的(Wahl et al.,(1993)Exp.Medicine 177：225-230)。
經修飾的IgG抗體對於治療由TGFβ1活性直接或間接引起的疾病和病況是有用的。經修飾的IgG抗體可以在體外或體內選擇性地抑制人類TGFβ1同種型的活性。TGFβ1同種型的活性包括但不限於：TGFβ介導的信號傳輸、細胞外基質(ECM)沉積、抑制上皮和內皮細胞增殖、促進平滑肌增殖、誘導III型膠原表達、誘導TGF-β、纖連蛋白、VEGF和IL-11表達、結合潛在相關肽(Latency Associated Peptide)、腫瘤誘導的免疫抑制、促進血管生成、活化肌成纖維細胞、促進轉移、和抑制NK細胞活性。例如經修飾的IgG抗體對於治療局灶性節段性腎小球硬化(FSGS)、肝纖維化(HF)、急性心肌梗死(AMI)、特發性肺纖維化(IPF)、硬皮病(SSc)、和馬方綜合征(Marfan Syndrome)。
經修飾的IgG抗體對於治療疾病和病況是有用的，所述疾病和病況包括但不限於纖維化疾病(如腎小球性腎炎、神經瘢痕形成、真皮瘢痕形成、肺纖維化(pulmonary fibrosis)、肺部纖維化(lung fibrosis)、輻射誘導的纖維化、肝纖維化、骨髓纖維化)、燒傷、免疫介導的疾病、炎症性疾病(包括類風濕性關節炎)、移植排斥、癌症、Dupuytren氏攣縮、和胃潰瘍。它們對於治療、預防腎機能不全或其降低發病風險也是有用的，所述腎機能不全包括但不限於：糖尿病(I型和II型)腎病、輻射誘導的腎病、梗阻性腎病、彌散性系統性硬化病、肺纖維化、同種異體移植物排斥、遺傳性腎病(例如多囊性腎病、髓質海綿腎、馬蹄腎)、腎小球性腎炎、腎硬化、腎鈣質沉著症、系統性紅斑狼瘡、斯耶格倫氏綜合征(Siogren’s syndrome)、貝格爾氏病(Berger’s disease)、系統性或腎小球性高血壓、小球間質性腎病、腎小管性酸中毒、腎結核、及腎
梗死。具體而言，當與腎素-血管緊張素-醛固酮系統的拮抗劑組合時，經修飾的IgG抗體是有用的，所述拮抗劑包括但不限於：腎素抑制劑、血管緊張素轉化酶(ACE)抑制劑、Ang II受體拮抗劑(也稱為「Ang II受體阻斷劑」)、和醛固酮拮抗劑。例如，用於組合使用經修飾的IgG抗體與此類拮抗劑的方法示於WO 2004/098637中。
經修飾的IgG抗體對於治療與ECM沉積相關的疾病和病況也是有用的，所述疾病和病況包括系統性硬化病、手術後黏附(postoperative adhesions)、瘢痕疙瘩和肥厚性瘢痕形成、增殖性玻璃體視網膜病變、青光眼引流手術(glaucoma drainage surgery)、角膜損傷、白內障、佩倫涅氏病(Peyronie’s disease)、成人呼吸窘迫綜合征、肝硬化、心肌梗死後瘢痕形成、血管成形術後再狹窄(post angioplasty restenosis)、蛛網膜下腔出血後瘢痕形成、多發性硬化、椎板切除術後纖維化、肌腱和其他修復後纖維化、由去除紋身引起的瘢痕形成、膽汁性肝硬化(包括硬化性膽管炎)、心包炎、胸膜炎、氣管造口術、滲透性中樞神經系統損傷、嗜曙紅細胞肌痛綜合征、血管再狹窄、靜脈閉塞性病、胰腺炎和牛皮癬性關節病。
經修飾的IgG抗體對於在疾病和病況中促進上皮細胞再形成也是有用的，所述疾病和病況如靜脈性潰瘍、缺血性潰瘍(褥瘡)、糖尿病性潰瘍、移植部位、移植供體部位、擦傷和燒傷、支氣管上皮的疾病，如哮喘、ARDS、腸上皮的疾病，如與細胞毒性治療相關的粘膜炎、食管潰瘍(反流疾病)、胃潰瘍、小腸和大腸的病損(炎性腸病)。
經修飾的IgG抗體也可以用於促進內皮細胞增殖(例如在穩定動脈粥樣硬化斑塊中)、促進血管血管吻合的傷癒、或抑制平滑肌細胞增殖(例如在動脈疾病、再狹窄、和哮喘中)。
經修飾的IgG抗體對於增強針對巨噬細胞介導的感染的免疫響應
而言是有用的。它們對於降低免疫抑制(例如腫瘤、AIDS、或肉芽腫性疾病引起的免疫抑制)也是有用的。經修飾的IgG抗體對於治療過度增生性疾病是有用的，所述過度增生性疾病如癌症，包括但不限於乳腺、***、卵巢、胃、腎、胰腺、結腸直腸、皮膚、肺、宮頸及膀胱癌、膠質瘤、間皮瘤、以及多種白血病及肉瘤，如卡波西肉瘤(Kaposi’s sarcoma)，並且對於治療或預防此類腫瘤的復發或轉移是有用的。經修飾的IgG抗體對於抑制環孢菌素介導的轉移也是有用的。
在癌症治療的上下文中，「治療」包括任何導致腫瘤生長減緩或腫瘤轉移減少、以及癌症部分緩解從而延長患者預期壽命的醫學干預。
治療方法包括施用經修飾的IgG抗體或包含經修飾的IgG抗體的藥物組合物。經修飾的IgG抗體可用於製造用於施用的藥物中。例如，製備藥物或藥物組合物的方法包括用藥學可接受的賦形劑配製經修飾的IgG抗體。組合物可以單獨施用或與其他治療組合施用，所述組合施用或是同時的或是序貫的，取決於其要治療的病況。
施用優選為以足以對患者顯示出益處的「治療有效量」進行。此類益處至少可以是具體疾病或病況的至少一個症狀的改善。實際的施用量及施用的速率和時間進程會取決於治療的疾病或病況的性質和嚴重程度。治療的處方，例如對劑量等的決定，可以基於臨床前和臨床研究來確定，對所述研究的設計完全是在本領域技術水平內的。
精確劑量會取決於一些因素，包括經修飾的IgG抗體是用於診斷還是用於治療、要治療的部位的大小和位置、以及附接於所述經修飾的IgG抗體的任何可檢測標記物或其他分子的性質。例如，經修飾的IgG抗體的典型劑量用於全身應用可以在100μg至1克的範圍，而用於局部應用可以為1μg至1mg。用於成人患者單一治療的劑量可以針對少兒和嬰兒進行比例性調整。治療可以每天一次、每週兩次、每週一次、每
月一次或根據其他間隔進行重複，由醫師斟酌決定。治療可以是週期性的，並且施用之間的週期為約2周或更多周、優選為約3周或更多周、更優選為4周或更多周，或約每週一次。
在一個具體例中，約0.1、0.3、1、3、10、15毫克、或20毫克的本發明抗體每千克患者體重的劑量水平可能在人類中是有用且安全的。例如，大鼠和小鼠中0.5-5mg/kg在急性病情中是有效的劑量。因此，對於長期給藥而言，基於預期的21天半衰期，可以對人類施用0.3-10mg/kg。劑量對於功效而言可以是足夠的，即使足夠低以助於最佳施用。例如，低於50mg的劑量有助於皮下施用。可以使用靜脈內施用作為針對一些疾病的遞送途徑，其中可能需要高劑量和長給藥間隔。皮下注射能增加對於產品的潛在免疫響應。對局部疾病的局部施用能降低產品的施用量和增加作用部位處的濃度，其能提高安全性。
本發明的經修飾的IgG抗體可以通過注射施用，例如皮下、靜脈內、腔內(例如在腫瘤切除後)、病損內(intralesionally)、腹膜內、或肌內注射。經修飾的IgG抗體還可以通過吸入或局部地(例如眼內、鼻內、直腸、傷口中、皮膚上)、或口服遞送。
經修飾的IgG抗體通常會以藥物組合物的形式施用，所述藥物組合物可以包含除經修飾的IgG抗體外的至少一個組分。因此藥物組合物可以包含藥學可接受的賦形劑、載劑、緩衝劑、穩定劑或其他本領域技術人員所熟知的材料。此類材料應當是無毒的且應當不干擾活性成分的功效。此類材料可以包括例如任何及所有溶劑、分散介質、塗層、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑、和吸收延遲劑。藥學可接受的載劑的一些例子是水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、右旋糖、甘油、乙醇等等，及其組合。在許多情況下，其優選的是包括組合物中的等滲劑，例如糖、多元醇、如甘露醇、山梨醇，或氯化鈉。藥學可接受的物質的其他例
子是潤濕劑或輔助物質，如乳化劑、防腐劑、或緩衝劑，其增加儲藏期或有效性。
載劑或其他材料的準確性質取決於施用途徑。對於靜脈內注射或在患處的注射而言，活性成分會是非經腸的可接受水溶液形式，其是無熱原的且具有合適的pK、等滲性、和穩定性。本領域那些相關技術能很好地製備合適的溶液，例如用等滲介質(如氯化鈉注射液、林格氏注射液(Ringer’s injection)、和乳酸林格氏注射液)來製備。可以包括防腐劑、穩定劑、緩衝劑、抗氧化劑和/或其他添加劑。
可以將經修飾的IgG抗體配製於液體、半固體、或固體形式中，如液體溶液(例如可注射和可輸注(infusible)溶液)、分散液或懸浮液、粉劑、脂質體、和栓劑。優選的形式取決於意欲施用的模式、治療應用、分子的理化特性、以及遞送途徑。配製物可以包括賦形劑、或賦形劑的組合，例如：糖、胺基酸和表面活性劑。液體配製物可以包括廣範圍的經修飾的IgG抗體濃度和pH。固體配製物可以通過例如凍幹法、噴霧乾燥、或通過超臨界流體技術的乾燥來生產。
可以將治療組合物配製為溶液、微乳液、分散液、脂質體、或其他適於高藥物濃度的有序結構。可以通過將經修飾的IgG抗體與上述成分的一個或其組合合併於合適的溶劑中，然後過濾除菌，來製備無菌注射液。通常，通過將活性化合物併入含有基本分散介質和其他來自上述的成分的無菌介質中，來製備分散液。對於用於製備無菌注射液的無菌粉末的情況，優選的製備方法是真空乾燥法和凍幹法，其從其先前經無菌過濾的溶液產出活性成分加任何額外想要的成分的粉末。例如，可以通過使用塗層(如卵磷脂)、通過維持分散液的粒度、或通過使用表面活性劑來維持溶液的適當流動性。對注射組合物的延長的吸收可以通過將延遲吸收的藥劑(例如單硬脂酸鹽和明膠)包含於組合物
中來觸發。
在一些具體例中，可以將活性化合物與載劑製備在一起，所述載劑會保護經修飾的IgG抗體不被快速釋放，如控釋製劑，包括移植物、透皮貼片、和微囊化的遞送系統。可以使用生物可降解的、生物可相容的聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐類、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯類、和聚乳酸。許多用於製備此類製劑的方法是獲得了專利的或是本領域技術人員普遍知曉的。
使用經修飾的IgG抗體的方法可以包括引起或允許對TGFβ的結合。這種結合可以在體內發生，例如在對患者施用經修飾的IgG抗體後發生，或其可以在體外發生，例如在ELISA、Western印跡、免疫細胞化學法、免疫沉澱法、親和色譜法、或基於細胞的測定中發生，或在基於離體的治療方法中發生，例如這樣的方法，其中將細胞或體液離體地與經修飾的IgG抗體接觸然後施用於患者。
提供了包含經修飾的IgG抗體的套盒。可以對經修飾的IgG抗體進行標記以允許其在要確定的樣品中的反應性。例如，可以在診斷分析中採用所述套盒。套盒可以含有用於使用組分的說明。用於幫助此種方法或使其能夠實施的輔助材料可以包含在套盒內。
經修飾的IgG抗體在樣品中的反應性可以通過任何合適的方法來確定，例如放射免疫測定法(RIA)。可以將帶放射性標記的抗原與未標記的抗原(測試樣品)混合並允許其結合至經修飾的IgG抗體。將結合的抗原與未結合的抗原物理性地分離，並確定結合至經修飾的IgG抗體的放射性抗原的量。也可以用非放射性抗原來使用競爭性結合測定，其使用連接至報告分子的抗原或類似物。所述報告分子可以是螢光染料、磷光體(phosphor)、或染料。合適的螢光染料包括螢光素、羅丹明、藻紅蛋白、和德州紅(Texas Red)。合適的發色染料包括二胺基聯苯胺。
其他報告子包括大分子膠原顆粒或微粒材料如乳膠微球(其是有色的、磁性的或順磁性的)，以及生物或化學活性劑，其能直接或間接引起可檢測信號被視覺觀察到、電子地檢測到，或以其他方式記錄到。例如，這些分子可以是催化反應的酶，所述反應顯出顏色或改變顏色或是引起電特性的變化。它們可以是分子可激動性的(molecularly excitable)，從而能態之間的電子躍遷導致特有的光譜吸收或發射。它們可以包括連同生物傳感器一起使用的化學實體。可以採用生物素/親和素或生物素/鏈黴親和素和鹼性磷酸酶檢測系統。抗體-報告子綴合物產生的信號可用於產生樣品中相關抗體結合的可量化的絕對或相對數據。
本發明還提供經修飾的IgG抗體用於測量競爭測定中的抗原水平的用途。可以將經修飾的IgG抗體連接至報告子分子，從而在結合時發生例如物理學或光學變化。報告子分子可以直接或間接地產生可檢測的信號，優選為可測量的信號。報告子分子的連接可以是直接或間接，共價的(例如經肽鍵連接)或是非共價的。經修飾的IgG抗體和蛋白報告子可以通過肽鍵連接並重組表達為融合蛋白。
本發明進一步的方面和具體例根據本公開對於本領域技術人員而言會是明顯的，所述公開包括如下實驗例示。
CAT192是TGFβ1特異性抗體，但當其從scFv轉變為全長IgG4時，其大部分結合親和性都損失了(圖1)。抗體亞型和Fc形式單獨不能解釋這種現象，因為IgG1和IgG4 Fab二者都表現出對TGFβ1非常低的親和性。scFv對TGFβ1的緊密結合可能是由於高柔性，所述高柔性是由連接
重鏈和輕鏈Fv域的長(GGGGS)3連接子產生的。所述高柔性可能在scFv至Fab或IgG形式的轉換過程中損失了。CAT192的低親和性特徵是非常慢的結合速率(on-rate)但同樣非常慢的解離速率(off-rate)。緩慢的結合速率和解離速率提示CAT192和TGFβ1之間的結合可能需要潛在的構象改變(potential conformational change)。本文描述了實驗，設計所述實驗以將scFv的Fab或IgG版本中的柔性/親和性工程改造還原，所述改造是通過向輕鏈拐角區中添加額外的胺基酸來進行的，所述輕鏈拐角區將抗體Fv域連接至CH1域。更具體而言，設計突變以將1個甘胺酸(G)、2個甘胺酸(GG)、2個甘胺酸和1個絲胺酸(GGS)、3個甘胺酸和1個絲胺酸(GGGS)、和4個甘胺酸及1個絲胺酸(GGGGS)序列添加至野生型輕鏈拐角區中，如下表2中所示，添加的胺基酸用下劃線標示。
輕鏈胺基酸#25在scFv中是Ala，但在轉變為IgG4時變為了Ser。因此，納入了額外的A25S突變體作為對照，以測試將Ala變為Ser是否影響scFv對TGFβ1的親和性。野生型CAT192和突變的DNA和胺基酸序列列舉如下。
SEQ ID No.38：CAT192 IgG1野生型LC的胺基酸序列，拐角區用下劃線標示：
SEQ ID No.27：CAT192(IgG1)輕鏈的編碼序列
CAT192LC+G(LEIKGRTVA)
正向 5'-ggctggaaatcaagggccgtacggtggccgc-3' (SEQ ID No.28)
互補 5'-gcggccaccgtacggcccttgatttccagcc-3' (SEQ ID No.29)
CAT192LC+GG.(LEIKGGRTVA)
正向 5'-ggctggaaatcaagggcggccgtacggtggccgc-3' (SEQ ID No.30)
互補 5'-gcggccaccgtacggccgcccttgatttccagcc-3' (SEQ ID No.31)
CAT192LC+GGS.(LEIKGGSRTVA)
正向 5'-ggctggaaatcaagggcggcagccgtacggtggccgc-3' (SEQ ID No.32)
互補 5'-gcggccaccgtacggctgccgcccttgatttccagcc-3' (SEQ ID No.33)
CAT192LC+GGGS.(LEIKGGGSRTVA)
正向 5'-ggctggaaatcaagggcggcggcagccgtacggtggccgc-3' (SEQ ID No.34)
互補 5'-gcggccaccgtacggctgccgccgcccttgatttccagcc-3' (SEQ ID No.35)
CAT192LC+GGGGS.(LEIKGGGGSRTVA)
正向 5'-ggctggaaatcaagggcggcggcggcagccgtacggtggccgc-3' (SEQ ID No.36)
互補 5'-gcggccaccgtacggctgccgccgccgcccttgatttccagcc-3' (SEQ ID No.37)
用Expi293F轉染系統(Life Technologies)，在24孔板規格(4 x 1mL)中將所述5個CAT192 LC突變體以及A25S突變體和WT LC與His標簽化的CAT192 HC Fab共表達。在轉染後4天收穫條件培養基(CM)並用Octet QK384儀器來計算單個測定中的表達量和TGFβ1結合。將純化的CAT192 Fab-His用作標準曲線(稀釋2倍從100至3.125μg/mL)。將CAT192 Fab CM按1：10稀釋於稀釋液中，並納入GC1008 Fab CM作為陽性對照。在1000rpm和30℃平板處測量對抗-Fab-CH1生物傳感器的結合2分鐘，用於定量和捕獲。然後將所述感應器移至含有200nM的TGFβ1的孔中用於結合評估。
TGFβ1結合結果顯示，與WT的對應物相比，每個額外的胺基酸***增加CAT192 Fab的結合親和性。至少2個甘胺酸的添加將結合親和性增加至與GC1008 Fab抗體的水平相當的水平。A25S突變體顯示出弱TGFβ1結合親和性，這與WT和純化的重組CAT192 Fab的親和性相似。該結果是定性的，因為捕獲至感應器的Fab的量沒有針對濃度進行標準化或緩衝消減(buffer subtracted)。
然後用PureSpeed IMAC吸頭(tips)從Rainin純化CAT192 LC Fab變體，從而精確評估對於TGFβ1的親和性並用表面等離子體共振來確證同種型特異性。將每個樣品的條件培養基分入4個孔(每個孔~800μL)
並向每個孔添加~200μL平衡緩衝液，從而每個樣品使用兩個1mL純化吸頭(20μL樹脂)。在洗提步驟後用Amicon超濾器對這些樣品進行緩衝液交換至Gibco PBS pH 7.2中，以去除咪唑。通過A280測量濃度，並將3.5μg裝載於非還原的4-20% Tris-甘胺酸SDS-PAGE凝膠上並用考馬斯亮藍染色(Coomassie stained)以檢查純度。CM中測試的起始材料的總體產量(yield)範圍為12-42%。
用Biacore T200儀器來評估純化的CAT192 WT和LC突變體Fab的TGFβ結合親和性。用胺化學將TGFβ1、TGFβ2、和TGFβ3(124、125、和112 RU)固定化至CM5系列S芯片。對低親和性及高親和性結合劑二者都使用寬的濃度範圍。在HBS-EP+緩衝液中將Fab從270至0.37nM稀釋3倍。一式兩份注射每個樣品。用典型的濃度範圍來確定KD，以30nM作為最高濃度。Biacore結合結果證實了上述的Octet結果，即，在CAT192 LC的拐角區中添加胺基酸改進對TGFβ1的結合親和性。每個額外殘基的***看起來有明顯的分步式(step-wise)改進(圖6)。沒有CAT192 Fab LC突變體在相同條件下結合至TGFβ2或TGFβ3，這說明突變體保留了同種型選擇性，而顯著提高TGFβ1結合。因此，經拐角工程改造的突變體是一組新的變體，其具有同種型選擇性和對TGFβ1的高親和性結合。
繼描述了顯示高親和性和TGFβ1選擇性結合的輕鏈拐角區突變體後，還設計了在重鏈拐角區中***額外胺基酸的突變體來工程改造柔性/親和性，所述重鏈拐角區將抗體Fv域連接至CH1域。更具體而言，設計了將1個甘胺酸(G)、2個甘胺酸(GG)、和4個甘胺酸及1個絲胺酸(GGGGS)序列添加至野生型重鏈拐角區中的突變體，如下表4所示，添加的胺基酸用下劃線標示。
HC+GG-ST是未預料到的來自PCR誘變過程的副產品，其按照所設計地將2個甘胺酸添加至拐角，但還在拐角區末端缺失了2個胺基酸，如通過DNA測序所驗證的。突變體在重鏈拐角區中會具有相同數量的胺基酸，但在拐角連接子中具有不同的胺基酸組成。將其納入作為對照，用於表徵和親和性比較。
CAT192 HC+G引子
正向 5'-ccaccgtgacagtgtctggcagcgccagc-3'(SEQ ID No.50)
互補 5'-gctggcgctgccagacactgtcacggtgg-3'
(SEQ ID No.51)
CAT192 HC+GG-ST引子
正向 5'-ccaccgtgacagtgtctggcggcagcgccagc-3'(SEQ ID No.52)
互補 5'-gctggcgctgccgccagacactgtcacggtgg-3'(SEQ ID No.53)
CAT192 HC+GGGGS引子
正向 5'-caccaccgtgacagtgtctggcggcggcggcagcagcgccagca-3'(SEQ ID No.54)
互補 5'-tgctggcgctgctgccgccgccgccagacactgtcacggtggtg-3'(SEQ ID No.55)
CAT192 HC+GG引子
正向 5'-caccaccgtgacagtgtctggcggcagcgccagca-3'(SEQ ID No.59)
互補 5'-tgctggcgctgccgccagacactgtcacggtggtg-3'(SEQ ID No.60)
用Expi293F轉染系統(Life Technologies)，在24孔板規格(4 x 1mL)中將CAT192 HC突變體與CAT192 LC Fab共表達。在轉染後4天收穫條件培養基，然後用PureSpeed IMAC吸頭從Rainin將其純化，從而精確評估對TGFβ1的親和性。用Biacore T200儀器來評估純化的CAT192突變體Fab的TGFβ結合親和性，如實施例1中所述。圖6中的結果顯示，與輕鏈拐角區中的突變體相似，在CAT192重鏈拐角區中添加胺基酸也改進對TGFβ1的結合親和性。例如，CAT192 HC+GGGGS突變體顯示出對TGFβ1的非常高的親和性。
用Expi293F轉染系統(Life Technologies)，在24孔板規格(4 x 1mL)中，通過在重鏈和輕鏈二者的拐角區處攜帶突變體的DNA共轉染生成了CAT192突變體。不同的組合列於表5中。
在轉染後4天收穫條件培養基，然後用PureSpeed IMAC吸頭從Rainin將其純化，從而精確評估對TGFβ1的親和性。用Biacore T200儀器來評估純化的CAT192突變體Fab的TGFβ結合親和性，如實施例1中所述那樣。圖3中顯示的結果表明，組合突變體恢復CAT192對TGFβ1結合的高親和性。這些突變體Fab的結合親和性(KD)列於表6中。
當對重鏈和輕鏈拐角區二者都進行工程改造時，需要較少的胺基酸***。例如，「HC+G」和「LC+G」突變體的組合顯示出對TGFβ1的非常高的親和性結合。
生成了IgG4形式的突變體以確定是否在基於A549細胞的效力測定中能證實重獲的親和性(由Biacore確定的)。將CAT192 HC Fab選殖至重鏈S228P IgG4主鏈中，以使半抗體(half-antibody)的形成最小化，然後用CAT192 IgG4 S228P HC和LC***突變體共轉染Expi293F細胞。
對全長CAT192 HC和LC***突變體進行30mL轉染，從而得到足夠的用於生物測定的材料。用30μg DNA(15μg LC+15μg HC)轉染Expi293F細胞。在轉染後4天收集條件培養基並通過Octet用Protein A生物傳感器分析為具有約200μg/mL表達。然後用Hi-Trap Protein A HP柱用蠕動泵(peristaltic pump)純化CM。以0.5mL/min將CM裝載至每個柱上，用25柱體積(CV)的50mM NaPi、25mM NaCl pH 7.1(2mL/min)洗滌，用25CV的10mM琥珀酸鈉pH 6.0(2mL/min)洗滌，並在3 x 2mL級分中用10mM琥珀酸鈉pH 3.75以1mL/min洗提(標記為#1、#2、#3)。用0.2M NaOH中和蛋白A洗出液，並添加0.2M NaCl以得到40mM NaCl的終濃度。然後將樣品濃縮並緩衝液交換至50mM NaPi，25mM NaCl pH 7.1中。然後將這些CAT192 IgG4 S228P HC和LC***突變體蛋
白A洗出液運行於4-20% Tris甘胺酸凝膠上(圖3)並通過Biacore比較其TGFβ1/TGFβ2/TGFβ3結合(圖4)。Biacore結果顯示純化的CAT192 IgG4突變體確實重獲TGFβ1結合。突變體均不結合至TGFβ2或TGFβ3(圖4)。
然後在A549細胞效力測定(Rapoza etal.,2006,J Immunol Methods,Vol316,pp18)中對CAT192 IgG S228P LC***突變體進行表徵。結果(圖5)顯示CAT192***突變體中和TGFβ1活性，如由突變體對TGFβ1刺激的IL-11生產的抑制性效果所顯示的。看起來，向輕鏈拐角添加2個甘胺酸足以重獲CAT192功效，如Biacore結合實驗中觀察到。
對拐角-***突變進行了差示掃描螢光測定(DSF)，以確定重鏈和輕鏈鉸鏈區處額外的胺基酸是如何影響CAT192 Fab***突變體的熱穩定性的。DSF的基本原理是，隨著溫度增加，螢光染料結合至蛋白的疏水區，其解折疊(unfold)提供信號的增加。該方法可用限制性的樣品進行，並可用於以高通量方式獲得樣品的相對穩定性。用Sypro橙(Sypro orange)作為螢光染料。所使用的條件是0.1mg/mL蛋白、1：4000染料比和10μL的總體積。結果顯示，隨著在拐角中添加甘胺酸，CAT192 Fab***突變體的相對穩定性輕微降低，具有最長添加物的突變體是穩定性最低的(圖7)。將Tm總結於圖7中。較長鏈突變體的一些的Tm未予計算，這是由於它們的解折疊模式所致。當輕鏈突變體的一些從Fab轉變為IgG4形式時，也觀察到了所述輕微降低(圖8)。
對CAT192 Fab WT和3個變體的蛋白結構進行解析，以提供關於如何以可變域增加的柔性來恢復高親和性的結構解釋。
對CAT192 HC和LC Fab***突變體進行150mL轉染以獲得用於結構研究的足夠材料。用150μg DNA(75μg LC+75μg HC)轉染Expi293F細胞。在轉染後5天收集條件培養基。然後用His-Trap Excel柱純化CM，所述柱是已用20mM NaPi pH 7.4,500mM NaCl,5mM咪唑平衡的。用20mM NaPi pH 7.4,500mM NaCl,500mM咪唑洗提Fab蛋白並立即緩衝液交換至20mM HEPES pH 7.0,50mM NaCl中，其用大小排阻色譜柱(Superdex 200 10/300)來進行。然後將Fab濃縮至20mg/mL並在室溫和4℃二者均設立稀疏矩陣篩選。用於結構確定的所有晶體均
於4℃、以1：1的蛋白對結晶條件比獲得。野生型蛋白和較低結合親和性突變體在相似的PEG條件中(WT：12% PEG 8K/0.1M二甲胂酸鈉(sodium cacodylate)pH 6/0.2M MgCl2,CAT192 WT HC/LC+G：12% PEG 20K/0.1M MES pH 6.5,CAT192 HC+GGGGS/WT LC：12% PEG 20K,0.1M MES pH 5.75)結晶於P21空間群中。高親和性突變體(HC+GG/LC+GG)結晶於2M硫酸銨，0.1M乙酸鈉pH 4.6(空間群：C2)中。
低/中等結合親和性變體和野生型Fab結構(HC+WT/LC+G和HC+GGGGS/LC+WT)幾乎是相同的(圖9A)。WT HC/LC+G和HC+GGGGS/WT LC分別以0.516Å和0.538Å的R.M.S.D與WT CAT192重疊。在這些結構的每一個中，不對稱單元中所有分子的CDRH3區的電子密度是缺失的。這揭示了該CDR對於低/中等結合親和性突變體而言是高度柔性的。相比之下，高結合親和性突變體(HC+GG/LC+GG)與其他CAT192 Fab結構相比表現出可變域中大的構象變化(圖9A)。雖然所有4個Fab之間的恒定域良好地重疊，但CAT192 HC+GG/LC+GG中的可變域與其他結構相比顯著偏移(圖9B)。此外，HC CDR3區在高結合親和性結構中是完全結構化的(completely structured)，並且通過與LC CDR3(<3Å)相互作用而被穩定化。這四個結構根據Biacore結果表明，需要大的構象重排來恢復CAT192的高結合親和性。
SEQ ID No.1：人類IgG1 VH域殖株SL15(SQN4 US6492497)
SEQ ID No.2：人類IgG1 VH域殖株JT182(SQN10 US6492497)
1EQ ID No.3：人類IgG1 Vκ域殖株SL15A：(SQN6 US6492497)
SEQ ID No.4：人類IgG1 Vκ域殖株SL15S：(SQN8 US6492497)
SEQ ID No.5：人類IgG1鉸鏈區PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP
SEQ ID No.6：人類IgG1 Fc區
SEQ ID No.7 SYGMH
SEQ ID No.8 VISYDGSIKYYADSVKG
SEQ ID No.9 TGEYSGYDTSGVEL
SEQ ID No.10 TGEYSGYDTDPQYS
SEQ ID No.11 TGFYSGYDTPASPD
SEQ ID No.12 RASQGIGDDLG
SEQ ID No.13 GTSTLQS
SEQ ID No.14 LQDSNYPLT
SEQ ID No.15 TGX1YSGYDTX2X3X4X5X6
SEQ ID No.16：CAT192(IgG4)輕鏈
SEQ ID No.17：CAT192(IgG4)重鏈
SEQ ID No.18：CAT192(IgG4)S228P重鏈
SEQ ID No.19：CAT191(scFv)
SEQ ID No.20：人類TGFβ1
SEQ ID No.21：CAT192 IgG4野生型LC拐角區LEIKRTVA
SEQ ID No.22：具有1個***的額外胺基酸的突變的LC拐角區LEIKGRTVA
SEQ ID No.23：具有2個***的額外胺基酸的突變的LC拐角區LEIKGGRTVA
SEQ ID No.24：具有3個***的額外胺基酸的突變的LC拐角區LEIKGGSRTVA
SEQ ID No.25：具有4個***的額外胺基酸的突變的LC拐角區LEIKGGGSRTVA
SEQ ID No.26：具有5個***的額外胺基酸的突變的LC拐角區LEIKGGGGSRTVA
SEQ ID No.27：CAT192(IgG1)輕鏈的編碼序列
SEQ ID No.28：CAT192LC+G(LEIKGRTVA)，正向5'-ggctggaaatcaagggccgtacggtggccgc-3'
SEQ ID No.29：CAT192LC+G(LEIKGRTVA)，互補5'-gcggccaccgtacggcccttgatttccagcc-3'
SEQ ID No.30：CAT192LC+GG(LEIKGGRTVA)，正向5'-ggctggaaatcaagggcggccgtacggtggccgc-3'
SEQ ID No.31：CAT192LC+GG(LEIKGGRTVA)，互補5'-gcggccaccgtacggccgcccttgatttccagcc-3'
SEQ ID No.32：CAT192LC+GGS(LEIKGGSRTVA)，正向5'-ggctggaaatcaagggcggcagccgtacggtggccgc-3'
SEQ ID No.33：CAT192LC+GGS(LEIKGGSRTVA)，互補5'-gcggccaccgtacggctgccgcccttgatttccagcc-3'
SEQ ID No.34：CAT192LC+GGGS(LEIKGGGSRTVA)，正向5'-ggctggaaatcaagggcggcggcagccgtacggtggccgc-3'
SEQ ID No.35：CAT192LC+GGGS(LEIKGGGSRTVA)，互補5'-gcggccaccgtacggctgccgccgcccttgatttccagcc-3'
SEQ ID No.36：CAT192LC+GGGGS(LEIKGGGGSRTVA)，正向5'-ggctggaaatcaagggcggcggcggcagccgtacggtggccgc-3'
SEQ ID No.37：CAT192LC+GGGGS(LEIKGGGGSRTVA)，互補5'-gcggccaccgtacggctgccgccgccgcccttgatttccagcc-3'
SEQ ID No.38：CAT192 IgG1野生型LC
SEQ ID No.39：具有1個***的額外胺基酸的突變的輕鏈
SEQ ID No.40：具有2個***的額外胺基酸的突變的輕鏈
SEQ ID No.41：具有3個***的額外胺基酸的突變的輕鏈
SEQ ID No.42：具有4個***的額外胺基酸的突變的輕鏈
SEQ ID No.43：具有5個***的額外胺基酸的突變的輕鏈
SEQ ID No.44：CAT192 IgG4野生型HC拐角區TVTVSSAS
SEQ ID No.45：具有1個***的額外胺基酸的突變的HC拐角區TVTVSGSAS
SEQ ID No.46：具有2個***的額外胺基酸的突變的HC拐角區TVTVSGGSAS
SEQ ID No.47：具有2個***的額外胺基酸且缺失了1個胺基酸的突變的HC拐角區TVTVSGGSA
SEQ ID No.48：具有5個***的額外胺基酸的突變的HC拐角區TVTVSGGGGSSAS
SEQ ID No.49：CAT192 IgG4野生型HC的編碼序列
SEQ ID No.50：CAT192HC+G(TVTVSGSAS)，正向5'-ccaccgtgacagtgtctggcagcgccagc-3'
SEQ ID No.51：CAT192HC+G(TVTVSGSAS)，互補5'-gctggcgctgccagacactgtcacggtgg-3'
SEQ ID No.52：CAT192HC+GG-ST(TVTVSGGSA)，正向5'-ccaccgtgacagtgtctggcggcagcgccagc-3'
SEQ ID No.53：CAT192HC+GG-ST(TVTVSGGSA)，互補5'-gctggcgctgccgccagacactgtcacggtgg-3'
SEQ ID No.54：CAT192HC+GGGGS(TVTVSGGGGSSAS)，正向5'-caccaccgtgacagtgtctggcggcggcggcagcagcgccagca-3'
SEQ ID No.55：CAT192HC+GGGGS(TVTVSGGGGSSAS)，互補5'-tgctggcgctgctgccgccgccgccagacactgtcacggtggtg-3'
SEQ ID No.56：具有1個***的額外胺基酸的突變的重鏈
SEQ ID No.57：具有2個***的額外胺基酸且缺失了2個胺基酸的突變的重鏈
SEQ ID No.58：具有5個***的額外胺基酸的突變的重鏈
SEQ ID No.59：CAT192HC+GG(TVTVSGGSAS)，正向5'-caccaccgtgacagtgtctggcggcagcgccagca-3'
SEQ ID No.60：CAT192HC+GG(TVTVSGGSAS)，互補5'-tgctggcgctgccgccagacactgtcacggtggtg-3'
SEQ ID No.61：具有2個***的額外胺基酸的突變的重鏈
<110> 美商健臻公司
GENZYME CORPORATION
<120> 以高親合性、結合性及特異性結合轉化生長因子-β1的經修飾IgG抗體
MODIFIED-IgG ANTIBODIES THAT BIND TRANSFORMING GROWTH FACTOR-Betal WITH HIGH AFFINITY, AVIDITY AND SPECIFICITY
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Claims (13)
- 一種結合TGFβ1的單離之結合蛋白，其中所述單離之結合蛋白係IgG或該IgG的Fab片段，包含(i)具有SEQ ID NO：3所示之可變域(VL)胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈(LC)，以及(ii)具有SEQ ID NO：1所示之可變域(VH)胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈(HC)，其中：(a)LC拐角區包含連接子，或(b)HC拐角區包含連接子，或(c)(a)與(b)兩者，其中所述在(a)中、在(b)中及在(c)中的連接子係各自獨立包含G、GG、GGS、GGGS，或GGGGS，並且所述HC係為IgG4或IgG1同種型。
- 如請求項1的單離之結合蛋白，其中所述HC係為人類IgG4同種型。
- 如請求項2的單離之結合蛋白，其中所述HC包含鉸鏈區，該鉸鏈區包含S228P突變(EU編碼)。
- 如請求項1的單離之結合蛋白，其中所述HC係為人類IgG1同種型。
- 如請求項1的單離之結合蛋白，其中所述LC包含SEQ ID NO：16、38、39、40、41、42或43的胺基酸序列。
- 如請求項1的單離之結合蛋白，其中所述HC包含SEQ ID NO：17、18、56、57、58，或61的胺基酸序列。
- 如請求項1的單離之結合蛋白，其中所述HC及所述LC係分別包含：SEQ ID NO：18及39；SEQ ID NO：18及40；SEQ ID NO：18及41；SEQ ID NO：18及42； SEQ ID NO：18及43；SEQ ID NO：56及38；SEQ ID NO：56及39；SEQ ID NO：56及40；SEQ ID NO：56及41；SEQ ID NO：56及42；SEQ ID NO：56及43；SEQ ID NO：57及38；SEQ ID NO：57及39；SEQ ID NO：57及40；SEQ ID NO：57及41；SEQ ID NO：57及42；SEQ ID NO：57及43；SEQ ID NO：58及38；SEQ ID NO：58及39；SEQ ID NO：58及40；SEQ ID NO：58及41；SEQ ID NO：58及42；SEQ ID NO：58及43；SEQ ID NO：61及38；SEQ ID NO：61及39；SEQ ID NO：61及40；SEQ ID NO：61及41；SEQ ID NO：61及42；或SEQ ID NO：61及43。
- 一種組成物，其包含有效量之如請求項1的單離之結合蛋白以及醫藥上可接受之賦形劑，用以抑制TGFβ1活性。
- 如請求項1的單離之結合蛋白，其用以抑制有需要之人類中的TGFβ1活性。
- 一種單離之多核苷酸，其包含編碼如請求項1的單離之結合蛋白的核苷酸序列。
- 一種哺乳動物表現載體，其包含如請求項10的多核苷酸。
- 一種用於生產結合TGFβ1的結合蛋白之重組宿主哺乳動物細胞，其包含如請求項11的表現載體。
- 一種製造如請求項1的單離之結合蛋白的方法，其包含將如請求項12的重組宿主細胞培養在適當條件下，以產生所述結合蛋白。
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