KR20190104359A - 줄기/전구체 지지 세포의 자가 재생을 유도하기 위한 1h-피롤-2,5-다이온 화합물 및 이의 사용 방법 - Google Patents

줄기/전구체 지지 세포의 자가 재생을 유도하기 위한 1h-피롤-2,5-다이온 화합물 및 이의 사용 방법 Download PDF

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KR20190104359A
KR20190104359A KR1020197022347A KR20197022347A KR20190104359A KR 20190104359 A KR20190104359 A KR 20190104359A KR 1020197022347 A KR1020197022347 A KR 1020197022347A KR 20197022347 A KR20197022347 A KR 20197022347A KR 20190104359 A KR20190104359 A KR 20190104359A
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크리스토퍼 루스
브래들리 테이트
라제쉬 만찬다
윌 매클레인
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프리퀀시 테라퓨틱스, 인크.
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Abstract

본 발명은 딸 세포에서, 조직 세포로 분화하는 능력을 유지시키면서, 줄기/전구체 세포에서 증식을 유도하는 것을 비롯한, 줄기/전구체 지지 세포의 자가 재생을 유도하기 위한, 1H-피롤-2,5-다이온 화합물 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

줄기/전구체 지지 세포의 자가 재생을 유도하기 위한 1H-피롤-2,5-다이온 화합물 및 이의 사용 방법
관련 출원
본 출원은 2017년 4월 11일자로 출원된 미국 출원 제62/484,282호, 및 2016년 12월 30일자로 출원된 제62/441,060호에 대한 우선권을 주장하며, 이들 각각의 전체 내용은 참고로 본 명세서에 포함된다.
기술분야
본 발명은 딸 세포에서, 조직 세포로 분화하는 능력을 유지시키면서, 줄기/전구체 세포(progenitor cell)에서 증식을 유도하는 것을 비롯한, 줄기/전구체 지지 세포(progenitor supporting cell)의 자가 재생을 유도하기 위한, 1H-피롤-2,5-다이온 화합물 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.
줄기세포는 신체에서 다수의 세포 유형을 재생시키는 놀라운 능력을 나타낸다. 배아 줄기세포뿐만 아니라, 조직 특이적 줄기세포는 성인에서 항상성 및 상처 수선에서 뿐만 아니라 발달 동안 중요한 역할을 제공한다. 줄기세포는 분화를 통해서 조직 특이적 세포 유형을 발생시킬 뿐만 아니라 증식을 통해서 그 자체를 재생시킨다. 상이한 줄기세포의 특징은 조직마다 다르며, 이의 본래 유전전 및 후성적 상태에 의해서 결정된다. 그러나, 상이한 줄기세포의 자가 재생과 분화의 균형은 모두 엄격하게 제어된다. 비제어된 자가 재생은 줄기세포의 과성장, 및 가능하게는 종양 형성으로 이어질 수 있는 반면, 비제어된 분화는 줄기세포 풀을 소모시켜, 조직 항상성을 유지하는 능력 손상으로 이어질 수 있다. 따라서, 줄기세포는 이의 환경을 계속적으로 감지하고, 증식, 분화 또는 세포자멸에 적절하게 반응한다. 줄기세포 증식 및 분화의 시기 및 정도를 제어함으로써 재생을 유도하는 것이 바람직할 것이다. 시간에 따라서 제거되는 소분자를 사용하여 증식을 제어하는 것이 줄기세포 증식 및 분화의 시기 및 정도의 제어를 가능하게 할 것이다. 놀랍게도, 상이한 조직으로부터의 조직 줄기세포는 매우 상황 의존적인 방식이긴 하지만, 이의 자가 재생 및 분화의 조절을 위한 제한된 수의 신호전달 경로를 공유한다. 이러한 경로 중 일부는 Wnt 및 GSK3 경로이다.
Lgr5는 광범위한 조직에 걸쳐서 발현되고, 다양한 조직, 예컨대, 소화관 상피(Barker et al. 2007), 신장, 모낭, 및 위(Barker et al, 2010; Haegebarth & Clevers, 2009)에서 성인 줄기세포의 바이오마커로서 식별되어 왔다. 예를 들어, 첫 번째로 포유동물 내이 유모 세포(hair cell)가 LGR5+ 세포로부터 유래된다는 것이 2011년에 발표되었다(Chai et al, 2011, Shi et al. 2012). Lgr5는 Wnt/베타-카테닌 경로의 공지된 구성성분이며, 이것은 분화, 증식, 및 줄기세포 특징 유도에서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀져 있다(Barker et al. 2007).
내이의 유모 세포의 영구적인 손상은 감각신경 청력 손실을 초래하여, 상당한 백분율의 집단에서 의사소통 어려움으로 이어진다. 유모 세포는 음향 자극을 변환하는 수용체 세포이다. 손상된 유모 세포의 재생은 인공기관 장치를 제외하고는 어떠한 요법도 갖지 않는 병태의 치료를 위한 방안을 제공할 것이다. 유모 세포는 포유동물 와우(cochlea)에서 재생되지 않지만, 하등 척추동물에서 새로운 유모 세포는 유모 세포를 둘러싼, 지지 세포라고 불리는, 상피 세포로부터 재생된다.
이전 연구는 유모 세포 형성으로 이어지는 유전자의 활성화 또는 강제 발현을 통한 지지 세포의 유모 세포로의 전환분화에 초점을 맞춰왔고, Atoh1의 발현을 향상시키는 기전에 대한 특별한 초점이 존재한다(Bermingham et al., 1999; Zheng and Gao, 2000; Izumikawa et al., 2005; Mizutari et al., 2013). 흥미롭게도, Atoh1 벡터로 형질주입된 세포는 전정 표현형(vestibular phenotype)을 획득하고(Kawamoto et al., 2003; Huang et al., 2009; Yang et al., 2012, 2013), 완전한 발생이 결핍되어 있다는 것을 나타낸다. 언급된 바와 같이, 유전자 삽입을 통한 Atoh1의 상향조절은 네이티브 와우내에서 발견되지 않는 방식으로 거동하는 비와우 세포 유형을 생성시키는 것으로 밝혀져 있다. 또한, 이러한 방법은 유모 세포 수를 증가시키지만, 지지 세포 수를 감소시킨다. 지지 세포는 전문적인 역할을 갖는 것으로 공지되어 있지만(Ramirez-Camancho 2006, Dale and Jagger 2010), 이러한 세포의 손실은 적절한 와우 기능에서 문제를 생성할 수 있다.
따라서, 상처 이후에 기존의 세포의 기능을 보존/촉진시킬 수 있는 새로운 화합물에 대한 필요성을 오랫동안 체감하였다
본 개시내용은 하기 화학식 (I)의 화합물 및 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 및 호변이성질체를 제공한다:
Figure pct00001
식 중,
Q1는 CH 또는 N이고;
Q2는 C 또는 N이며;
Q3은 C 또는 N이되;
Q1, Q2 및 Q3 중 적어도 하나는 N이고;
R1은 수소, 할로, C1-C4알킬, C1-C4알켄일, C1-C4알킨일, -CN, -OH, -O-C1-C4알킬, -NH2, -NHC(O)R1a 및 -S(O)2NH2로 이루어진 군으로부터 선택되되; 상기 알킬은 할로 및 -OH로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환체로 선택적으로 치환되고; R1a는 C1-C4알킬이고;
R2는 할로, C1-C4알킬, C1-C4알켄일, C1-C4알킨일, -CN, -OH, -O-C1-C4알킬, -NH2, -NH(C1-C4알킬), -N(C1-C4알킬)2, -NHC(O)R2a, 및 -S(O)2NH2로 이루어진 군으로부터 선택되되; 상기 알킬은 할로 및 OH로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환체로 선택적으로 치환되고; R2a는 C1-C4알킬이고;
R3은 수소, 할로, C1-C4알킬, C1-C4알켄일, C1-C4알킨일, -CN, -OH, -O-C1-C4알킬, -NH2, -NHC(O)R3a, 및 -S(O)2NH2로 이루어진 군으로부터 선택되되; 상기 알킬은 할로 및 -OH로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환체로 선택적으로 치환되고; R3a는 C1-C4알킬이고;
Ar은
Figure pct00002
Figure pct00003
로 이루어진 군으로부터 선택되며;
-Z-W-X-Y-는 -C(RZ)2-C(RW)2-N(RX)-C(RY)2-, -C(RZ)2-C(RW)2-CH(RX)-C(RY)2- 또는 -C(RW)2-CH(RX)-C(RY)2-이고;
각각의 RZ는 수소, 중수소, 할로 및 C1-C4알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 RZ 기 둘 모두는 함께 C3-C6사이클로알킬 또는 옥소를 형성하며;
각각의 RW는 수소, 중수소, 할로 및 C1-C4알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 RW 기 둘 모두는 함께 C3-C6사이클로알킬 또는 옥소를 형성하거나;
또는 RZ와 RW는 이들이 부착되는 탄소와 함께 C3-C6사이클로알킬을 형성하고;
RX는 -CORX1, -SO2RX1, 헤테로아릴 및 -(C1-C4알킬렌)-(C3-C8사이클로알킬)로 이루어진 군으로부터 선택되되, 상기 -(C1-C4알킬렌)-(C3-C8사이클로알킬)은 상기 C1-C4알킬렌 상에서 1개 내지 4개의 할로로 선택적으로 치환되고;
RX1은 헤테로사이클릴이되, 상기 헤테로사이클릴은 중수소, 할로, -[C(RX1a)2]p-CN, -CF3, C1-C4알킬, -(CH2)p-OH, -[C(RX1a)2]p-OH, -[C(RX1a)2]p-O-C1-C4알킬, -NHCOC1-C4알킬, -CONHC1-C4알킬, -COH, -CO2H, -[C(RX1a)2]p-COO-C1-C4알킬, -(CH2)p-NH2, -[C(RX1a)2]p-NH2, -[C(RX1a)2]p-NH-C1-C4알킬, -[C(RX1a)2]p-N-(C1-C4알킬)2로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 12개의 치환체로 선택적으로 치환되고; p는 0, 1, 2 또는 3이며; 각각의 RX1a는 수소, 중수소, 할로, -CF3, 및 C1-C4알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 RX1a 기 둘 모두는 함께 C3-C6사이클로알킬을 형성하거나;
또는 RX1은 N(RX2)2이되, RX2는 수소, 알킬, 치환된 알킬로부터 독립적으로 선택되고, 알킬 치환기는 할로, 헤테로사이클 및 치환된 헤테로사이클일 수 있으며; 각각의 RY는 수소, 중수소, 할로 및 C1-C4알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 RY 기 둘 모두는 함께 C3-C6사이클로알킬 또는 옥소를 형성하고; 그리고
m은 0, 1 또는 2이다.
일부 실시형태에서, 하기 화학식 (I)의 화합물은 하기 특징 중 하나 이상을 갖는다:
a) 단 상기 화합물은
Figure pct00004
가 아님;
b) 단 Ar이
Figure pct00005
이고,
Figure pct00006
가
Figure pct00007
또는
Figure pct00008
인 경우, RX1은
Figure pct00009
도 아니고
Figure pct00010
도 아님.
본 개시내용은 하기 화학식 (Ia)의 화합물 및 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 및 호변이성질체를 제공한다:
Figure pct00011
식 중,
Q1는 CH 또는 N이고;
Q2는 C 또는 N이며;
Q3은 C 또는 N이되;
Q1, Q2 및 Q3 중 적어도 하나는 N이고;
R1은 수소, 할로, C1-C4알킬, C1-C4알켄일, C1-C4알킨일, -CN, -OH, -O-C1-C4알킬, -NH2, NHC(O)R3a 및 -S(O)2NH2로 이루어진 군으로부터 선택되되; 상기 알킬은 할로 및 -OH로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환체로 선택적으로 치환되고; R1a는 C1-C4알킬이고;
R2는 수소, 할로, C1-C4알킬, C1-C4알켄일, C1-C4알킨일, -CN, -OH, -O-C1-C4알킬, -NH2, -NH(C1-C4알킬), -N(C1-C4알킬)2, -NHC(O)R2a, 및 -S(O)2NH2로 이루어진 군으로부터 선택되되; 상기 알킬은 할로 및 -OH로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환체로 선택적으로 치환되고; R2a는 C1-C4알킬이고;
R3은 수소, 할로, C1-C4알킬, C1-C4알켄일, C1-C4알킨일, -CN, -OH, -O-C1-C4알킬, -NH2, -NHC(O)R3a, 및 -S(O)2NH2로 이루어진 군으로부터 선택되되; 상기 알킬은 할로 및 -OH로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환체로 선택적으로 치환되고; R3a는 C1-C4알킬이고;
Ar은
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
로 이루어진 군으로부터 선택되되; Ar은 중수소, 할로, 알킬, 알콕시 및 CN으로 선택적으로 치환되고;
Q7은 S, O, CH2, 및 NRQ7로부터 선택되되; RQ7은 수소 또는 선택적으로 치환된 C1-C4알킬이고;
-Z-W-X-Y-는 -C(RZ)2-C(RW)2-N(RX)-C(RY)2-, -C(RZ)2-C(RW)2-CH(RX)-C(RY)2- 또는 -C(RW)2-CH(RX)-C(RY)2-이고;
각각의 RZ는 수소, 중수소, 할로 및 C1-C4알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 RZ 기 둘 모두는 함께 C3-C6사이클로알킬 또는 옥소를 형성하며;
각각의 RW는 수소, 중수소, 할로 및 C1-C4알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 RW 기 둘 모두는 함께 C3-C6사이클로알킬 또는 옥소를 형성하거나;
또는 RZ와 RW는 이들이 부착되는 탄소와 함께 C3-C6사이클로알킬을 형성하고;
RX는 수소, RX1, -CORX1, -SO2RX1, -(C1-C4알킬렌)-RX1로 이루어진 군으로부터 선택되되, 상기 -(C1-C4알킬렌)-RX1은 상기 C1-C4알킬렌 상에서 1개 내지 4개의 할로로 선택적으로 치환되되;
RX1은 C3-C8사이클로알킬, 헤테로아릴 또는 헤테로사이클릴이되, 상기 헤테로사이클릴은 중수소, 할로, -[C(RX1a)2]p-CN, -CF3, C1-C4알킬, -(CH2)p-OH, -[C(RX1a)2]p-OH, -[C(RX1a)2]p-O-C1-C4알킬, -NHCOC1-C4알킬, CONHC1-C4알킬, COH, -CO2H, -[C(RX1a)2]p-COO-C1-C4알킬, -(CH2)p-NH2, -[C(RX1a)2]p-NH2, -[C(RX1a)2]p-NH-C1-C4알킬, -[C(RX1a)2]p-N-(C1-C4알킬)2로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 12개의 치환체로 선택적으로 치환되고; p는 0, 1, 2 또는 3이며; 각각의 RX1a는 수소, 중수소, 할로, -CF3, 및 C1-C4알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 RX1a 기 둘 모두는 함께 C3-C6사이클로알킬을 형성하거나;
또는 RX1은 N(RX2)2이되, RX2는 수소, 알킬, 치환된 알킬로부터 독립적으로 선택되고, 알킬 치환기는 할로, 헤테로사이클 및 치환된 헤테로사이클일 수 있으며;
각각의 RY는 수소, 중수소, 할로 및 C1-C4알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 RY 기 둘 모두는 함께 C3-C6사이클로알킬 또는 옥소를 형성하고; 그리고
m은 0, 1 또는 2이다.
본 개시내용은 하기 화학식 (Ib)의 화합물 및 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 및 호변이성질체를 제공한다:
Figure pct00015
식 중,
Q1는 CH 또는 N이고;
Q2는 C 또는 N이며;
Q3은 C 또는 N이되;
단 Q1, Q2 및 Q3 중 적어도 하나는 N이되; 단 Q1이 CH이고, Q3이 C인 경우, Q2는 N이 아니고;
R1은 수소, 할로, C1-C4알킬, C1-C4알켄일, C1-C4알킨일, -CN, -OH, -O-C1-C4알킬, -NH2, -NHC(O)R3a 및 -S(O)2NH2로 이루어진 군으로부터 선택되되; 상기 알킬은 할로 및 -OH로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환체로 선택적으로 치환되고; R1a는 C1-C4알킬이고;
R2는 수소, 할로, C1-C4알킬, C1-C4알켄일, C1-C4알킨일, -CN, -OH, -O-C1-C4알킬, -NH2, -NH(C1-C4알킬), -N(C1-C4알킬)2, -NHC(O)R2a, 및 -S(O)2NH2로 이루어진 군으로부터 선택되되; 상기 알킬은 할로 및 -OH로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환체로 선택적으로 치환되고; R2a는 C1-C4알킬이고;
R3은 수소, 할로, C1-C4알킬, C1-C4알켄일, C1-C4알킨일, -CN, -OH, -O-C1-C4알킬, -NH2, -NHC(O)R3a, 및 -S(O)2NH2로 이루어진 군으로부터 선택되되; 상기 알킬은 할로 및 -OH로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환체로 선택적으로 치환되고; R3a는 C1-C4알킬이고;
Ar은
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
로 이루어진 군으로부터 선택되되; Ar은 중수소, 할로, 알킬, 알콕시 및 CN으로 선택적으로 치환되고;
각각의 Q6은 CRQ6 및 N으로부터 독립적으로 선택되되; RQ6은 수소, 할로, -CN, 저급 알킬 또는 치환된 알킬이고;
Q7은 S, O, CH2, 및 NRQ7로부터 선택되되; RQ7은 수소 또는 선택적으로 치환된 C1-C4알킬이고;
-Z-W-X-Y-는 -C(RZ)2-C(RW)2-N(RX)-C(RY)2-, -C(RZ)2-C(RW)2-CH(RX)-C(RY)2- 또는 -C(RW)2-CH(RX)-C(RY)2-이고;
각각의 RZ는 수소, 중수소, 할로 및 C1-C4알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 RZ 기 둘 모두는 함께 C3-C6사이클로알킬 또는 옥소를 형성하며;
각각의 RW는 수소, 중수소, 할로 및 C1-C4알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 RW 기 둘 모두는 함께 C3-C6사이클로알킬 또는 옥소를 형성하거나;
또는 RZ와 RW는 이들이 부착되는 탄소와 함께 C3-C6사이클로알킬을 형성하고;
RX는 수소, RX1, -CORX1, -SO2RX1, -(C1-C4알킬렌)-RX1로 이루어진 군으로부터 선택되되, 상기 -(C1-C4알킬렌)-RX1은 상기 C1-C4알킬렌 상에서 1개 내지 4개의 할로로 선택적으로 치환되되;
RX1은 C3-C8사이클로알킬, 헤테로아릴 또는 헤테로사이클릴이되, 상기 헤테로사이클릴은 중수소, 할로, -[C(RX1a)2]p-CN, -CF3, C1-C4알킬, -(CH2)p-OH, -[C(RX1a)2]p-OH, -[C(RX1a)2]p-O-C1-C4알킬, -NHCOC1-C4알킬, CONHC1-C4알킬, COH, -CO2H, -[C(RX1a)2]p-COO-C1-C4알킬, -(CH2)p-NH2, -[C(RX1a)2]p-NH2, -[C(RX1a)2]p-NH-C1-C4알킬, -[C(RX1a)2]p-N-(C1-C4알킬)2로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 12개의 치환체로 선택적으로 치환되고; p는 0, 1, 2 또는 3이며; 각각의 RX1a는 수소, 중수소, 할로, -CF3, 및 C1-C4알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 RX1a 기 둘 모두는 함께 C3-C6사이클로알킬을 형성하거나;
또는 RX1은 N(RX2)2이되, RX2는 수소, 알킬, 치환된 알킬로부터 독립적으로 선택되고, 알킬 치환기는 할로, 헤테로사이클 및 치환된 헤테로사이클일 수 있으며;
각각의 RY는 수소, 중수소, 할로 및 C1-C4알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 RY 기 둘 모두는 함께 C3-C6사이클로알킬 또는 옥소를 형성하고; 그리고
m은 0, 1 또는 2이다.
일 양상에서 본 개시내용은 세포 집단에게 유효량의 본 명세서에 제공된 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 줄기세포의 증식을 위한 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 증식은 노치(notch) 활성화제 또는 HDAC 저해제의 부재 하에서 일어난다.
따라서 본 개시내용의 다양한 양상 중에서, 자가 재생에 대한 집단의 능력, 즉, 동등한 증식 및 '세포 운명 예정화(cell fate specification)' 가능성을 갖는 딸 세포의 반복되는 생성에 대한 능력, 및 분화, 즉, 분화에 대해서 명시된 딸 세포의 생성에 대한 능력을 증가시키기 위해서 세포 집단에서 Wnt 경로를 활성화시키는 방법이 주목될 수 있다. 일 실시형태에서, 세포 집단은 와우 지지 세포 집단이다. 바람직하게는, Wnt 경로는 집단의 구성원에서 그리고 집단의 임의의 유전자 변형 없이 c-myc 유전자의 상류에서 활성화된다. 대신에, Wnt 경로는 바람직하게는 이러한 활성도를 일시적으로 유도하는 소분자에 의해서 활성화된다. 추가로, 지지 세포 집단은 바람직하게는 LGR5+이고, 코르티 기관(Organ of Corti)에 내인성인 지지 세포를 포함한다.
본 개시내용의 추가 양상은 와우 세포 집단에 의해서 포함된 줄기/전구체 지지 세포의 자가 재생을 유도하는 방법이다. 즉, 줄기/전구체 지지 세포는, 딸 세포에서, 유모 세포로 분화하는 능력을 유지시키면서, 증식(즉, 분할하여 딸 세포를 형성함)이 유도된다. 이에 반해서, 줄기/전구체 지지 세포가 단지 증식하도록 유도되면(다능성(multi-potency)을 유지하지 않음), 딸 세포는 유모 세포로 분활되는 능력이 결핍될 것이다. 추가로, 기존의 줄기/전구체 세포 집단의 분화를 단지 강요하는 것은 줄기세포의 풀을 소모할 가능성을 갖는다. 증식은 바람직하게는 이러한 활성도를 일시적으로 유도하는 소분자에 의해서 활성화된다. 추가로, 특정 실시형태에서, 지지 세포 집단은 바람직하게는 LGR5+이고, 코르티 기관(Organ of Corti)에 내인성인 지지 세포를 포함한다.
제1 양상에서, 줄기/전구체 지지 세포의 자가 재생을 유도하기 위해서 1H-피롤-2,5-다이온 화합물을 사용하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 1H-피롤-2,5-다이온 화합물은 하기 화학식 (I)의 화합물이다.
따라서, 특정 실시형태에서, 본 개시내용은 줄기세포 특성을 유도하는 데 관련이 있다고 공지된 경로 및 기전, 예컨대, "유도된 다분화능 줄기세포"를 생성시키는 데 사용되는 것을 활성화시킴으로써 지지 세포의 집단의 자가 재생을 유도하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 경로는 소분자로 활성화된다. 예를 들어, 시험관내에서 지지 세포 집단에 적용되는 경우 화합물은 줄기세포 증식 검정에서 집단이 높은 정도 및 높은 순도로 증식하도록 유도하고, 또한 집단이 줄기세포 분화 검정에서 조직 세포의 고순도 집단으로 분화할 수 있게 한다. 이러한 일 실시형태에서, 화합물은, 다수의 생성을 위해서 분할할 수 있고, 생성된 세포의 고 비율이 조직 세포로 분화하는 능력을 유지할 수 있는 줄기세포를 생성시키도록 증식시킴으로써 줄기 세포 특성을 유도하고, 유지시킨다. 추가로, 증식 중인 줄기세포는 Lgr5, Sox2, Opeml, Phex, lin28, Lgr6, cyclin D1, Msx1, Myb, Kit, Gdnf3, Zic3, Dppa3, Dppa4, Dppa5, Nanog, Esrrb, Rex1, Dnmt3a, Dnmt3b, Dnmt3l, Utf1, Tcl1, Oct4, Klf4, Pax6, Six2, Zic1, Zic2, Otx2, Bmi1, CDX2, STAT3, Smad1, Smad2, smad2/3, smad4, smad5, 및 smad7 중 하나 이상을 포함할 수 있는 줄기세포 마커를 발현한다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 세포의 모 집단을 포함하는, 와우 조직에서 와우 세포의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다. 이러한 실시형태에서 방법은 와우 조직을 줄기세포 증식제와 접촉시켜 와우 조직에서 세포의 확장된 집단을 형성하는 단계를 포함하며, 여기서
줄기세포 증식제는 (i) 줄기세포 증식 검정에서 증식 검정 시간 기간에 걸쳐서 증식 검정으로부터 증식 검정 최종 세포 집단을 형성할 수 있고, (ii)　줄기세포 분화 검정에서 분화 검정 시간 기간에 걸쳐서 분화 검정 초기 세포 집단으로부터 분화 검정 최종 세포 집단을 형성할 수 있고, 여기서
(a) 증식 검정 초기 세포 집단은 (i) 총 세포의 증식 검정 초기 수, (ii) Lgr5+ 세포의 증식 검정 초기 수, (iii) 유모 세포의 증식 검정 초기 수, (iv) 총 세포의 증식 검정 초기 수에 대한 Lgr5+ 세포의 증식 검정 초기 수의 비와 동일한 증식 검정 초기 Lgr5+ 세포 분율, 및 (v) 총 세포의 증식 검정 초기 수에 대한 유모 세포의 증식 검정 초기 수의 비와 동일한 증식 검정 초기 유모 세포 분율을 갖고;
(b) 증식 검정 초기 세포 집단은 (i) 총 세포의 증식 검정 최종 수, (ii) Lgr5+ 세포의 증식 검정 초기 수, (iii) 유모 세포의 증식 검정 최종 수, (iv) 총 세포의 증식 검정 최종 수에 대한 Lgr5+ 세포의 증식 검정 최종 수의 비와 동일한 증식 검정 최종 Lgr5+ 세포 분율, 및 (v) 총 세포의 증식 검정 최종 수에 대한 유모 세포의 증식 검정 최종 수의 비와 동일한 증식 검정 최종 유모 세포 분율을 갖고;
(c) 분화 검정 초기 세포 집단은 (i) 총 세포의 분화 검정 초기 수, (ii) Lgr5+ 세포의 분화 검정 초기 수, (iii) 유모 세포의 분화 검정 초기 수, (iv) 총 세포의 분화 검정 초기 수에 대한 Lgr5+ 세포의 분화 검정 초기 수의 비와 동일한 분화 검정 초기 Lgr5+ 세포 분율, 및 (v) 총 세포의 분화 검정 초기 수에 대한 유모 세포의 분화 검정 초기 수의 비와 동일한 분화 검정 초기 유모 세포 분율을 갖고;
(d) 분화 검정 최종 세포 집단은 (i) 총 세포의 분화 검정 최종 수, (ii) Lgr5+ 세포의 분화 검정 최종 수, (iii) 유모 세포의 분화 검정 최종 수, (iv) 총 세포의 분화 검정 최종 수에 대한 Lgr5+ 세포의 분화 검정 최종 수의 비와 동일한 분화 검정 최종 Lgr5+ 세포 분율, 및 (v) 총 세포의 분화 검정 최종 수에 대한 유모 세포의 분화 검정 최종 수의 비와 동일한 분화 검정 최종 유모 세포 분율을 갖고;
(e) Lgr5+ 세포의 증식 검정 최종 수는 Lgr5+ 세포의 증식 검정 초기 수를 적어도 10배 초과하고; 그리고
(f) 유모 세포의 분화 검정 최종 수는 0이 아닌 수이다.
상기에 기술된 검정은 노치 활성화제 또는 HDAC 저해제를 적용하는 단계를 포함하지 않는다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 와우 세포의 집단에서 지지 세포의 세포 밀도를 증가시키는 방법을 제공한다. 방법은 지지 세포에서 줄기세포 특성을 유도하는 경로 및 기전을 활성화시켜, (새로 형성된 딸 세포에서 지지 세포의 다능성 특성을 유지시키면서) 활성화된 지지 세포를 증식시키고, 그 후 확장된 집단이 유모 세포로 분화할 수 있게 하여(또는 심지어는 유도하여) 확장된 와우 세포 집단을 형성하는 단계를 포함하며, 여기서 확장된 와우 세포 집단에서 유모 세포의 세포 밀도는 본래(비확장된) 와우 세포 집단에서의 유모 세포의 세포 밀도를 초과한다. 일부 실시형태에서, 이러한 증식은 노치 활성화제 또는 HDAC 저해제의 부재 하에서 일어난다. 일부 실시형태에서, 지지 세포 집단은 시험관내 지지 세포 집단이다. 다른 실시형태에서, 지지 세포 집단은 생체내 지지 세포 집단이다. 추가로, 증식 단계는 바람직하게는 와우 구조의 네이티브 구성을 실질적으로 유지시키도록 제어된다. 증식은, c-myc의 유도에 의해서가 아니라 이러한 활성도를 일시적으로 유도하는 본 명세서에 기술된 화합물에 의해서 그리고 집단의 어떠한 유전적 변형도 없이 유도된다. 일부 실시형태에서, 이러한 증식은 노치 활성화제 또는 HDAC 저해제의 부재 하에서 일어난다. 추가로, 특정 실시형태에서, 지지 세포 집단은 바람직하게는 LGR5+이고, 코르티 기관에 내인성인 지지 세포를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 와우 세포의 집단에서 Lgr5+ 지지 세포의 세포 밀도를 증가시키는 방법을 제공한다. 방법은 Lgr5+ 지지 세포에서 줄기세포 특성을 유도 또는 유지시키는 경로 및 기전을 활성화시켜, (이러한 줄기세포 특성을 유지시키면서) 활성화된 Lgr5+ 지지 세포를 증식시키고, 그 후 확장된 집단이 유모 세포로 분화할 수 있게 하여(또는 심지어는 유도하여) 확장된 와우 세포 집단을 형성하는 단계를 포함하며, 여기서 확장된 와우 세포 집단에서 유모 세포의 세포 밀도는 본래(비확장된) 와우 세포 집단에서의 유모 세포의 세포 밀도를 초과한다. 와우 세포의 집단에서 Lgr5+ 지지 세포의 세포 밀도를 증가시키기 위한 일부 실시형태에서, 세포 밀도의 이러한 증가는 노치 활성화제 또는 HDAC 저해제의 부재 하에서 일어난다. 일부 실시형태에서, Lgr5+ 지지 세포 집단은 시험관내 Lgr5+ 줄기세포 집단이다. 다른 실시형태에서, Lgr5+ 지지 세포 집단은 생체내 지지 세포 집단이다. 추가로, 특정 실시형태에서, 증식 단계는 바람직하게는 와우 구조의 네이티브 구성을 실질적으로 유지시키도록 제어된다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 와우 세포의 초기 집단에서 유모 세포의 세포 밀도를 증가시키는 방법을 제공하며, 초기 집단(생체내 또는 시험관내 집단일 수 있음)은 유모 세포, Lgr5- 지지 세포 및 Lgr5+ 지지 세포를 포함한다. 와우 세포의 초기 집단에서 유모 세포의 세포 밀도를 증가시키기 위한 일부 실시형태에서, 세포 밀도의 이러한 증가는 노치 활성화제 또는 HDAC 저해제의 부재 하에서 일어난다. 방법은 초기 집단에 본 명세서에 기술된 화합물을 투여하는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 방법은 줄기세포 마커 Lgr5+를 발현하는 줄기세포 증식 검정에서 줄기세포를 생산한다. 특정 실시형태에서, Lgr5+와 비-Lgr5+ 줄기의 혼합된 집단이 줄기세포 증식 검정에 배치되면, 방법은 Lgr5+인 집단에서 세포의 분율을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 줄기세포 증식 검정에서 이러한 줄기세포의 생산은 노치 활성화제 또는 HDAC 저해제의 부재 하에서 일어난다.
지지 세포 집단을 와우 구조의 네이티브 구성을 파괴하는 정도까지 확장시키는 것은 와우 기능을 저해할 수 있다. 소분자 신호를 사용하여 존재하는 지지 세포의 증식을 유도하는 것은, 특정 세포 유형을 표적으로 할 수 없고, 세포의 유전자 정보를 영구적으로 변경하는 유전자 전달을 사용하는 것보다 더 제어된 유모 세포의 재생을 가능하게 할 수 있다. 대략적인 정상 와우 구조는 사이에 지지 세포를 갖는 유모 세포의 열을 갖는 것이 바람직하고, 유모 세포는 다른 유모 세포와 접촉하지 않는다. 추가로, 유전자 변형을 사용하여 증식을 유도하여 기관의 해부학을 방해하는 와우내의 큰 세포 응집물을 생성하는 것을 회피하는 것이 바람직할 것이다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 유모 세포 및 지지 세포를 포함하는 와우 세포의 초기 집단에서 유모 세포의 세포 밀도를 증가시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 초기 집단에서 지지 세포의 수를 선택적으로 확장시켜 중간 와우 세포 집단을 형성하는 방법을 포함하며, 여기서 중간 와우 세포 집단에서의 유모 세포에 대한 지지 세포의 수의 비는 초기 와우 세포 집단에서의 유모 세포에 대한 지지 세포의 수의 비를 초과한다. 방법은 추가로 중간 와우 세포 집단에서 유모 세포를 생성시켜 확장된 와우 세포 집단을 형성하는 방법을 포함하며, 여기서 확장된 와우 세포 집단에서의 지지 세포에 대한 유모 세포의 수의 비는 중간 와우 세포 집단에서의 지지 세포에 대한 유모 세포의 수의 비를 초과한다. 일부 실시형태에서, 방법은 노치 활성화제 또는 HDAC 저해제의 사용을 포함하지 않는다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 와우 세포의 초기 집단에서 Lgr5+ 지지 세포의 수를 증가시키거나 또는 Lgr5+ 활성도를 증가시키는 방법을 제공하며, 여기서 초기 집단은 지지 세포 및 유모 세포를 포함한다. 예를 들어, 이러한 일 방법에서 Lgr5+ 지지 세포의 수가 초기 집단의 수에 비해서 확장된 중간체 집단이 형성된다. 대안적으로, 이러한 일 방법에서 초기 집단에 비해서 지지 세포의 Lgr5+ 활성도가 증가된 중간체 집단이 형성된다. 대안적으로, 일반적으로 Lgr5+가 결핍되거나 또는 Lgr5+의 매우 낮은 수준을 갖는 세포 유형에서 Lgr5+ 발현을 활성화시킴으로써 Lgr5+ 세포의 수가 초기 세포 집단에 비해서 증가되는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 이러한 대안적인 방법은 노치 활성화제 또는 HDAC 저해제를 포함하지 않는다. 추가 예의 방식에 의해서, Lgr5+ 지지 세포의 수가 확장되고, Lgr5 활성도가 초기 와우 세포 집단에 비해서 증가된 중간체 집단이 형성된다. 중간 와우 세포 집단에서 유모 세포가 생성되어 확장된 와우 세포 집단을 형성할 수 있고, 여기서 확장된 와우 세포 집단에서의 지지 세포에 대한 유모 세포의 비는 중간 와우 세포 집단에서의 지지 세포에 대한 유모 세포의 수의 비를 초과한다.
상기에 언급된 본 개시내용의 실시형태 각각에서, 줄기능은 Wnt를 활성화시키거나 또는 GSK3 활성도를 저해함으로써 유도된다. 일부 실시형태에서, 줄기능을 유도시키는 것은 노치 활성화제 또는 HDAC 저해제의 사용을 포함하지 않는다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 청각 기능장애를 예방 및 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 본 개시내용은 대상체에서 청각 손상을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 대상체에게 유효량의 본 명세서에 제공된 화합물을 투여하는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 또한 본 명세서에 기술된 세포의 생체외 사용에 관한 것이다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 접근법은 고 처리량 스크린(high through screen)을 위해서 그리고 발견 목적을 위해서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 특정 실시형태는 유모 세포 전구체를 증식시키고/거나 유모 세포의 수를 증가시키는 작용제, 및 또한 지지 세포 및/또는 유모 세포(예를 들어, 이의 생존을 지지하기 위해서)를 보호하는 작용제를 식별하는 데 유용하거나, 또한 지지 세포 또는 유모 세포를 비롯한 분화되는 자손에 독성이거나 비독성인 작용제를 식별하는 데 유용하다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 대상체에서 청각계의 세포의 손실 또는 사멸을 저해하는 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 대상체에게 유효량의 본 명세서에 기술된 화합물 또는 이의 유도체 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 및 허용 가능한 담체 또는 부형제를 투여함으로써, 대상체에서 청각계의 세포의 손실 또는 사멸을 저해하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 노치 활성화제 또는 HDAC 저해제의 사용을 포함하지 않는다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 대상체에서 청각계의 세포의 성장을 유지 또는 촉진시키는 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 대상체에게 본 명세서에 기술된 화합물 또는 이의 유도체 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 내인성 수선을 증가시키거나 개시하도록 하기에 유효한 양으로 투여함으로써, 대상체에서 청각계의 세포의 성장을 유지시키거나 촉진시키는 단계를 포함한다.
또한 본 명세서에는 세포의 모 집단, 지지 세포를 비롯한 모 집단 및 다수의 Lgr5+ 세포를 포함하는 와우 조직에서 와우 세포의 집단을 확장시키는 방법이 기술되며, 이 방법은 와우 조직을 줄기세포 증식제와 접촉시켜 와우 조직에서 세포의 확장된 집단을 형성하는 단계를 포함하며, 여기서 줄기세포 증식제는 (i) 줄기세포 증식 검정에서, 줄기세포 증식 검정 세포 집단에서의 Lgr5+ 세포의 수를 적어도 10배 증가시킬 수 있고, (ii) 줄기세포 분화 검정에서, Lgr5+ 세포를 포함하는 세포 집단으로부터 유모 세포를 형성할 수 있다. 와우 세포의 집단을 확장시키기 위한 일부 실시형태에서, 방법은 노치 활성화제 또는 HDAC 저해제의 사용을 포함하지 않는다.
또한 본 명세서에는 세포의 모 집단, 지지 세포를 비롯한 모 집단을 포함하는 와우 조직에서 와우 세포의 집단을 확장시키는 방법이 기술되며, 이 방법은 와우 조직을 줄기세포 증식제와 접촉시켜 와우 조직에서 세포의 확장된 집단을 형성하는 단계를 포함한다. 줄기세포 증식제는 (i) 줄기세포 증식 검정에서 증식 검정 시간 기간에 걸쳐서 증식 검정으로부터 증식 검정 최종 세포 집단을 형성할 수 있고, (ii)　줄기세포 분화 검정에서 분화 검정 시간 기간에 걸쳐서 분화 검정 초기 세포 집단으로부터 분화 검정 최종 세포 집단을 형성할 수 있고, 여기서 (a) 증식 검정 초기 세포 집단은 (i) 총 세포의 증식 검정 초기 수, (ii) Lgr5+ 세포의 증식 검정 초기 수, (iii) 유모 세포의 증식 검정 초기 수, (iv) 총 세포의 증식 검정 초기 수에 대한 Lgr5+ 세포의 증식 검정 초기 수의 비와 동일한 증식 검정 초기 Lgr5+ 세포 분율, 및 (v) 총 세포의 증식 검정 초기 수에 대한 유모 세포의 증식 검정 초기 수의 비와 동일한 증식 검정 초기 유모 세포 분율을 갖고; (b) 증식 검정 초기 세포 집단은 (i) 총 세포의 증식 검정 최종 수, (ii) Lgr5+ 세포의 증식 검정 초기 수, (iii) 유모 세포의 증식 검정 최종 수, (iv) 총 세포의 증식 검정 최종 수에 대한 Lgr5+ 세포의 증식 검정 최종 수의 비와 동일한 증식 검정 최종 Lgr5+ 세포 분율, 및 (v) 총 세포의 증식 검정 최종 수에 대한 유모 세포의 증식 검정 최종 수의 비와 동일한 증식 검정 최종 유모 세포 분율을 갖고; (c) 분화 검정 초기 세포 집단은 (i) 총 세포의 분화 검정 초기 수, (ii) Lgr5+ 세포의 분화 검정 초기 수, (iii) 유모 세포의 분화 검정 초기 수, (iv) 총 세포의 분화 검정 초기 수에 대한 Lgr5+ 세포의 분화 검정 초기 수의 비와 동일한 분화 검정 초기 Lgr5+ 세포 분율, 및 (v) 총 세포의 분화 검정 초기 수에 대한 유모 세포의 분화 검정 초기 수의 비와 동일한 분화 검정 초기 유모 세포 분율을 갖고; (d) 분화 검정 최종 세포 집단은 (i) 총 세포의 분화 검정 최종 수, (ii) Lgr5+ 세포의 분화 검정 최종 수, (iii) 유모 세포의 분화 검정 최종 수, (iv) 총 세포의 분화 검정 최종 수에 대한 Lgr5+ 세포의 분화 검정 최종 수의 비와 동일한 분화 검정 최종 Lgr5+ 세포 분율, 및 (v) 총 세포의 분화 검정 최종 수에 대한 유모 세포의 분화 검정 최종 수의 비와 동일한 분화 검정 최종 유모 세포 분율을 갖고; (e) Lgr5+ 세포의 증식 검정 최종 수는 Lgr5+ 세포의 증식 검정 초기 수를 적어도 10배 초과하고; 그리고 (f) 유모 세포의 분화 검정 최종 수는 0이 아닌 수이다. 상기에 기술된 검정의 일부 실시형태에서, 검정은 노치 활성화제 또는 HDAC 저해제의 사용을 포함하지 않는다.
Lgr5+ 세포의 증식 검정 최종 수는 Lgr5+ 세포의 증식 검정 초기 수보다 적어도 50배, 또는 적어도 100배 더 클 수 있다. 와우 조직에서 세포의 확장된 집단은 모집단보다 더 많은 수의 유모 세포를 포함할 수 있다. 증식 검정 최종 Lgr5+ 세포 분율은 분화 검정 초기 Lgr5+ 세포 분율보다 적어도 2배 더 클 수 있다. 분화 검정 최종 유모 세포 분율은 증식 검정 초기 유모 세포 분율보다 적어도 2배 더 클 수 있다. 증식 검정 최종 유모 세포 분율은 증식 검정 초기 유모 세포 분율보다 적어도 25% 더 작을 수 있다. 증식 검정 최종 Lgr5+ 세포 분율은 증식 검정 초기 Lgr5+ 세포 분율보다 적어도 10% 더 클 수 있다. 와우 조직의 보다 많은 형태학적 특징 중 하나는 유지될 수 있다. 네이티브 형태학은 유지될 수 있다. 줄기세포 증식제는 생체 적합성 젤 또는 폼(foam)일 수 있는 생체 적합성 매트릭스 중에 분산될 수 있다. 와우 조직은 생체내 와우 조직 또는 생체외 와우 조직일 수 있다. 방법은 s-기에 존재하는 Lgr5+ 세포의 집단을 생산할 수 있다. 와우 조직은 대상체에 존재할 수 있고, 와우 조직을 화합물과 접촉시키는 단계는 화합물을 경고막으로(trans-tympanically) 대상체에게 투여함으로써 달성될 수 있다. 와우 조직을 화합물과 접촉시키는 단계는 대상체의 개선된 청각 기능을 초래할 수 있다.
또한 본 명세서에는 청력 손실을 갖거나 또는 청력 손실이 발생할 위험이 있는 대상체를 치료하는 방법이 기술된다. 방법은 대상체의 와우 조직에 본 명세서에 제공된 화합물을 경고막으로 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
또한 본 명세서에는 Myo7a+ 와우 세포를 생성시키는 방법이 기술된다. 방법은 Lgr5+ 와우 세포를 본 명세서에 제공된 화합물과 접촉시킴으로써, Lgr5+ 세포의 확장된 집단을 생성시켜, Myo7a+ 와우 세포를 생성시키는 단게를 포함할 수 있다.
다른 목적 및 특징부는 부분적으로 자명할 것이고 부분적으로 본 명세서 하기에 지적되어 있다.
정의
본 출원에서, "또는"의 사용은 달리 언급되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 본 출원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "포함한다" 및 이 용어의 변형, 예컨대, "포함하는" 및 "포함하다"는 다른 첨가제, 구성성분, 테거(teger) 또는 단계를 배제하도록 의도되지 않는다. 본 출원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약" 및 "대략적으로"는 등가물로서 사용된다. 본 출원에서 약/대략적으로와 함께 또는 그것 없이 사용되는 임의의 수치는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해서 인지되는 임의의 일반적인 변동을 포괄하도록 의미된다. 특정 실시형태에서, 용어 "대략적으로" 또는 "약"은 달리 언급되지 않는 한 또는 그 문맥으로부터 자명하지 않는 한 언급된 참고 값의 양 방향으로(초과 또는 미만) 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 미만에 포함되는 다양한 값(이러한 수가 가능한 값의 100%를 초과할 경우 제외)을 지칭한다.
"투여"는 물질을 대상체에게 도입하는 것을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 투여는 귓바퀴(auricular), 귓바퀴내, 와우내, 전정내, 또는 경고막에 의해서, 예를 들어 주사에 의해서 진행된다. 일부 실시형태에서, 투여는 직접적으로 내이에 진행되며, 예를 들어, 원형 또는 타원형, 귀 캡슐 또는 전정관(vestibular canal)을 통한 주사로 진행된다. 일부 실시형태에서, 투여는 와우 이식 전달 시스템을 통해서 직접적으로 내이내로 진행된다. 일부 실시형태에서, 물질은 중위에 경고막에 의해서 주사된다. 특정 실시형태에서 "투여를 유발하는"은 제1 구성성분이 이미 투여된 후 (예를 들어, 상이한 시기에 및/또는 상이한 액터(actor)에 의해서) 제2 구성성분의 투여를 지칭한다.
"항체"는 면역글로불린 폴리펩타이드, 또는 면역원 결합 능력을 갖는 이의 단편을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "효능제"는 각각 표적 유전자, 단백질, 또는 경로의 발현 또는 활성도의 증가를 유발하는 작용제이다. 따라서, 효능제는 표적 유전자 또는 단백질에 대한 이러한 생리학적 효과를 직접적으로 또는 간접적으로 유발하는, 어느 정도의 방식으로 이의 동족 수용체에 결합하고, 이를 활성화시킬 수 있다. 효능제는 또한 경로 구성성분의 활성도를 조정함으로써, 예를 들어, 경로의 음성 조절인자의 활성도를 저해함으로써 경로의 활성도를 증가시킬 수 있다. 따라서, "Wnt 효능제"는 Wnt 경로의 활성도를 증가시키는 작용제로서 정의될 수 있고, 이것은 세포에서 증가된 TCF/LEF-매개된 전사에 의해서 측정될 수 있다. 따라서, "Wnt 효능제"는 Wnt 패밀리 단백질 중 임의의 것 및 전부, 세포내 베타-카테닌 분해의 저해제 및 TCF/LEF의 활성화제를 비롯한, 프리즐드(Frizzled) 수용체 패밀리 구성원에 결합하고, 이를 활성화시키는 진(true) Wnt 효능제일 수 있다.
"길항제"는 수용체에 결합하고, 그 결과 다른 분자에 의한 결합을 감소시키거나 제거하는 작용제를 칭한다.
"안티-센스"는 길이에 관계 없이, 핵산 서열의 암호 가닥 또는 mRNA에 상보성인 핵산 서열을 지칭한다. 안티센스 RNA는 개체 세포, 조직 또는 오가나노이드(organanoid)에 도입될 수 있다. 안티-센스 핵산은 변형된 골격, 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트, 또는 관련 기술 분야에 공지된 다른 변형된 골격을 함유할 수 있거나, 비-자연 뉴클레오사이드 간 연결을 함유할 수 있다.
본 명세서에서 지칭되는 바와 같이 "상보성 핵산 서열"은 상보성 뉴클레오타이드 염기 쌍으로 구성된 또 다른 핵산 서열과 혼성화될 수 있는 핵산 서열이다. "혼성화시킨다"는 엄격성의 적합한 조건 하에서 상보성 뉴클레오타이드 염기(예를 들어, DNA에서 구아닌(G)과 사이토신(C)에서와 같이, 아데닌(A)은 티민(T)과 염기 쌍을 형성함) 사이에 이중-가닥 분자를 형성하기 위한 쌍을 의미한다(예를 들어, 문헌[Wahl, G. M. and S. L. Berger(1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A. R.(1987) Methods Enzymol. 152:507)] 참고).
"귓바퀴 투여"는 고막을 지나 대상체의 내이로 조성물을 투여하기 위해서 카테터 또는 심지 장치(wick device)를 사용하는 방법을 지칭한다. 심지 또는 카테터의 삽입을 가능하게 하기 위해서, 고막은 적절한 크기의 주사기 또는 피펫을 사용하여 피어싱될 수 있다. 장치는 또한 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된진 임의의 다른 방법, 예를 들어, 장치의 외과 이식을 사용하여 삽입될 수 있었다. 특정 실시형태에서, 심지 또는 카테터 장치는 독립형 장치일 수 있는데, 이는 이것이 대상체의 귀에 삽입되고, 이어서 조성물이 내이로 제어 가능하게 방출됨을 의미한다. 다른 특정 실시형태에서, 심지 또는 카테터 장치는 추가적인 조성물의 투여를 허용하는 펌프 또는 다른 장치에 부착되거나 커플링될 수 있다. 펌프는 투여 단위를 전달하도록 자동으로 프로그래밍되거나 대상체 또는 의료 전문가에 의해서 제어될 수 있다.
"생체 적합성 매트릭스"는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 치료제 방출을 위해 인간에게 투여가 허용된 중합체 담체이다. 생체 적합성 매트릭스는 생체 적합성 젤 또는 폼일 수 있다.
"세포 응집체"는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 증식하여 직경이 40마이크론 초과인 주어진 세포 유형의 클러스터를 형성하고/하거나 3개 초과의 세포 층이 기저막에 수직으로 존재하는 형태를 생성하는 코르티 기관에서의 체세포를 의미해야 한다. "세포 응집체"는 또한 세포 분열이 하나 이상의 세포 유형이 그물판을 파괴하도록 하는 세포의 몸체, 또는 내림프와 외림프 사이에 경계를 생성하는 과정을 지칭할 수 있다.
특이적 세포 유형에 관련하여 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "세포 밀도"는 대표적인 현미경 샘플에서 면적 당 세포 유형의 평균 수이다. 세포 유형은 Lgr5+ 세포, 유모 세포, 또는 지지 세포를 포함할 수 있지만 이들로 제한되지 않는다. 세포 밀도는 와우 또는 코르티 기관을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 주어진 기관 또는 조직에서 주어진 세포 유형으로 평가될 수 있다. 예를 들어, 코르티 기관에서 Lgr5+ 세포 밀도는 코르티 기관을 가로질러 측정되는 경우의 Lgr5+ 세포의 세포 밀도이다. 전형적으로, 지지 세포 및 Lgr5+ 세포는 코르티 기관의 횡단면을 취함으로써 열거될 것이다. 전형적으로, 대표적인 현미경 샘플에서 기술된 바와 같이, 횡단면이 일부 예에서 사용될 수 있지만, 유모 세포는 코르티 기관의 표면을 내려다 봄으로서 열거될 것이다. 전형적으로, Lgr5+ 세포의 세포 밀도는 대표적인 현미경 샘플에 기술된 바와 같이, 코르티 기관의 전체 마운트 제제를 분석하고, 상피의 표면을 따라 주어진 거리에 걸쳐 Lgr5 세포의 수를 계수함에 의해 측정될 것이다. 유모 세포는 번들 또는 유모 세포 특이적 염색과 같은 이들의 형태학적 특징에 의해 식별될 수 있다(예를 들어, 미오신(Myosin) VIIa, 프레스틴(Prestin), vGlut3, Pou4f3, 에스핀(Espin), 컨쥬게이션된-팔로이딘, PMCA2, Ribeye, Atoh1 등). Lgr5+ 세포는 특이적 염색 또는 항체 (예를 들어, Lgr5-GFP 트랜스제닉 리포터, 항-Lgr5 항체 등)에 의해 식별될 수 있다.
"와우 농도"는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 샘플링 와우 유체를 통해 측정된 주어진 작용제의 농도일 것이다. 달리 주목되지 않는 한, 샘플은 와우 중의 작용제의 평균 농도를 대략적으로 대표하도록 와우 유체의 실질적인 충분한 부분을 함유해야 한다. 예를 들어, 샘플은 전정관으로부터 취해질 수 있고, 일련의 유체 샘플은 개개 샘플이 와우의 특정 부분의 와우 유체로 구성되도록 연속적으로 취해질 수 있다.
"상보성 핵산 서열"은 상보성 뉴클레오타이드 염기 쌍으로 구성된 또 다른 핵산 서열과 혼성화될 수 있는 핵산 서열을 지칭한다.
특이적 세포 유형과 관련하여 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "횡단면 세포 밀도"는 대표적인 현미경 샘플에서 조직을 통한 단면적당 세포 유형의 평균 수이다. 코르티 기관의 횡단면은 또한 주어진 평면에서 세포의 수를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 전형적으로, 유모 세포 횡단면 세포 밀도는 대표적인 현미경 샘플에 기술된 바와 같이, 코르티 기관의 전체 마운트 제제를 분석하고 상피의 일부분을 따라 취해진 횡단면에서 주어진 거리를 가로지르는 유모 세포의 수를 계수함에 의해 측정될 것이다. 전형적으로, Lgr5+ 세포의 횡단면 세포 밀도는 대표적인 현미경 샘플에 기술된 바와 같이, 코르티 기관의 전체 마운트 제제를 분석하고 상피의 일부분을 따라 취해진 횡단면에서 주어진 거리를 가로지르는 Lgr5+ 세포의 수를 계수함에 의해 측정될 것이다. 유모 세포는 번들 또는 유모 세포 특이적 염색과 같은 이들의 형태학적 특징에 의해 식별될 수 있다(적합한 염색은, 예를 들어, 미오신 VIIa, 프레스틴, vGlut3, Pou4f3, 컨쥬게이션된-팔로이딘, PMCA2, Atoh1, 등을 포함한다). Lgr5+ 세포는 특이적 염색 또는 항체에 의해 식별될 수 있다(적합한 염색 및 항체는 Lgr5 mRNA, Lgr5-GFP 트랜스제닉 리포터 시스템, 항-Lgr5 항체 등의 형광성 동일계내 혼성화를 포함함).
"감소시키는"은, 예를 들어, 참조군의 수준과 비교할 때, 적어도 5%, 예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 또는 100%만큼 감소시키는 것을 의미한다.
"감소시킨다"는 또한, 예를 들어, 참조군의 수준과 비교할 때, 적어도 1배, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000배 또는 그 초과만큼의 감소를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "분화 기간"은 효과적인 분화 저해 농도 없이 효과적인 줄기능 드라이버 농도가 존재하는 시간의 기간이다.
"효과적인 농도"는 줄기능 드라이버에 대한 효과적인 줄기능 드라이버 농도 또는 확산 저해제에 대한 효과적인 확산 저해 농도일 수 있다.
"효과적인 분화 저해 농도"는 줄기세포 증식 검정의 마지막에 줄기 세포 증식 검정의 시작에 비해서 유모 세포인 세포의 총 집단의 분율에서 50% 초과의 증가를 허용하지 않는 분화 저해제의 최소 농도이다. 효과적인 분화 저해 농도를 측정함에 있어서, 세포에 대한 유모 세포 염색은 Atoh1-GFP 마우스가 아닌 마우스 주에 대한 유모 세포를 정량하기 위해 유세포분석법과 함께 사용될 수 있다. 대안적으로, Atoh1-GFP 마우스 주가 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "효과적인 방출율"(질량/시간)은 효과적인 농도(질량/부피) * 30uL/1시간이다.
"효과적인 줄기능 드라이버 농도"는 줄기능 드라이버 없이 그리고 동일한 농도로 존재하는 모든 다른 구성성분에 의해 수행된 줄기세포 증식 검정에서 Lgr5+ 세포의 수와 비교할 때 줄기세포 증식 검정에서 Lgr5+ 세포의 수에서의 적어도 1.5배 증가를 유도하는 줄기능 드라이버의 최소 농도이다.
"제거하다"는 검출할 수 없는 수준으로의 감소를 의미한다.
"생착하다" 또는 "생착"은 조직의 기존 세포와의 접촉을 통해 생체내 관심대상 조직으로의 줄기 또는 전구체 세포의 혼입 과정을 지칭한다. "상피 전구체 세포"는 상피 세포를 생성하는 세포 계통에 제한될 가능성이 있는 다능성 세포를 지칭한다.
"상피 줄기세포"는 상피 세포를 생성하는 세포 계통을 비롯하여, 다중 세포 계통으로 수임될 가능성이 있는 다능성 세포를 지칭한다.
"단편"은 폴리펩타이드 또는 핵산 분자의 일부를 의미한다. 이 부분은 바람직하게는 참조 핵산 분자 또는 폴리펩타이드의 전체 길이의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%를 함유한다. 단편은 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000개의 뉴클레오타이드 또는 아미노산을 함유할 수 있다.
"GSK3 저해제"는 GSK3, GSK-3알파, 및/또는 GSK-3베타의 활성도를 저해하는 조성물이다.
본 명세서에서 상호 교환적으로 사용되는 바와 같은 "GSK3베타," "GSK3β" 및 "GSK3B"는 글리코겐 합성효소 키나제 3 베타에 대한 동의어이다.
"GSK3베타 저해제"는 GSK3베타의 활성도를 저해하는 조성물이다.
"혼성화시킨다"는 엄격성의 적합한 조건 하에서 상보성 뉴클레오타이드 염기(예를 들어, DNA에서 구아닌(G)과 사이토신(C)에서와 같이, 아데닌(A)은 티민(T)과 염기 쌍을 형성함) 사이에 이중-가닥 분자를 형성하기 위한 짝지움을 지칭한다(예를 들어, 문헌[Wahl, G. M. and S. L. Berger(1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A. R.(1987) Methods Enzymol. 152:507)] 참고).
"저해제"는 표적 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성에서 각각 감소를 초래하는 작용제를 지칭한다. "길항제"는 저해제일 수 있지만, 보다 구체적으로 수용체에 결합하여, 결국 다른 분자에 의한 결합을 감소시키거나 제거하는 작용제이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "저해성 핵산"은 포유동물 세포에 투여될 때 표적 유전자의 발현을 감소시키는 이중-가닥 RNA, RNA 간섭, miRNA, siRNA, shRNA, 또는 안티센스 RNA, 또는 이의 일부, 또는 이의 모방체이다. 전형적으로, 핵산 저해제는 표적 핵산 분자의 적어도 일부, 또는 이의 오쏘로그를 포함하거나, 표적 핵산 분자의 상보성 가닥의 적어도 일부를 포함한다. 전형적으로, 표적 유전자의 발현은 10%, 25%, 50%, 75%, 또는 심지어 90 내지 100%만큼 감소된다.
"시험관내 Lgr5 활성도"는 세포의 시험관내 집단에서 Lgr5의 발현 또는 활성도 수준을 지칭한다. 이는 세포를 단일 세포로 해리시키고, 프로피듐 아이오다이드(PI)로 염색하고, Lgr5-GFP 발현에 대해 세포를 유세포분석기를 사용하여 분석함으로써, 예를 들어, Lgr5-GFP 발현 마우스, 예컨대, B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J 마우스 (Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 또는 Lgr5-GFP 마우스로도 공지됨, 잭슨 랩 스톡 번호: 008875)로부터 유래된 세포에서 측정될 수 있다. 동일한 배양 및 분석 절차를 거친 야생형(비-Lgr5-GFP) 마우스로부터의 내이 상피 세포를 음성 대조군으로서 이용할 수 있다. 전형적으로, 2개의 세포 집단이 한 변수로서 GFP/FITC를 갖는 이변수 플롯에 도시되며, 이는 GFP 양성 및 GFP 음성 집단 둘 모두를 포함한다. Lgr5-양성 세포는 GFP 양성 세포 집단을 게이팅시킴으로써 식별된다. Lgr5-양성 세포의 백분율은 GFP 음성 집단 및 음성 대조군 둘 모두에 대해서 GFP 양성 세포 집단을 게이팅시킴으로써 측정된다. Lgr5-양성 세포의 수는 세포의 총 수에 Lgr5-양성 세포의 백분율을 곱함으로써 계산된다. 비-Lgr5-GFP 마우스로부터 유래된 세포의 경우, Lgr5 활성도는 Lgr5 유전자에 대한 항-Lgr5 항체 또는 정량적-PCR을 사용하여 측정될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "생체내 Lgr5 활성도"는 대상체에서 Lgr5의 발현 또는 활성도의 수준이다. 이는, 예를 들어, 동물의 내이를 제거하고 Lgr5 단백질 또는 Lgr5 mRNA를 측정함으로써 측정될 수 있다. Lgr5 단백질 생산은 와우 샘플을 영상화함으로써 결정되는 바와 같이 형광 강도를 측정하기 위해서 항-Lgr5 항체를 사용하여 측정될 수 있고, 여기서 형광 강도는 Lgr5 존재의 척도로서 사용된다. 웨스턴 블롯은 항-Lgr5 항체로 사용될 수 있고, 여기서 세포를 처리된 기관으로부터 수거하여 Lgr5 단백질의 증가를 결정할 수 있다. 동일계내 혼성화에서의 정량적-PCR 또는 RNA를 사용하여 Lgr5 mRNA 생산에서의 상대적 변화를 측정할 수 있고, 여기서 세포를 내이로부터 수거하여 Lgr5 mRNA의 변화를 결정할 수 있다. 대안적으로, Lgr5 발현은 Lgr5 프로모터 유도된 GFP 리포터 트랜스제닉 시스템을 사용하여 측정될 수 있고, 여기서 GFP 형광의 존재 또는 강도는 유세포분석법, 영상화를 사용하여 직접적으로 검출될 수 있거나, 항-GFP 항체를 사용하여 간접적으로 검출될 수 있다.
"증가시킨다"는 또한, 예를 들어, 참조군 표준품의 수준과 비교할 때, 적어도 1배, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000배 또는 그 초과만큼의 증가를 의미한다.
"증가시키는"은, 예를 들어, 참조군의 수준과 비교할 때, 적어도 5%, 예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99, 100% 또는 그 초과만큼 증가시키는 것을 의미한다.
"귓바퀴내 투여"는 조성물을 직접 주입함으로써 대상체의 중이 또는 내이에 조성물을 투여하는 것을 지칭한다.
"와우내" 투여는 고막을 가로질러 그리고 정원(round) 또는 난원(oval) 막을 가로질러 와우내에 조성물을 직접 주사하는 것을 지칭한다.
"전정내" 투여는 고막을 가로질러 그리고 정원 또는 난원막을 가로 질러 전정 기관내에 조성물을 직접 주사하는 것을 지칭한다.
"단리된"은 이의 자연 상태에서 발견되는 바와 같은 일반적으로 그 물질을 동반한 구성성분으로부터 다양한 정도로 유리된 물질을 지칭한다. "단리시키다"는 본래 공급원 또는 주변으로부터의 분리 정도를 나타낸다.
"Lgr5"는 G-단백질 커플링된 수용체 49(GPR49) 또는 G-단백질 커플링된 수용체 67(GPR67)이라고도 공지된, 류신-풍부 반복부-함유 G-단백질 커플링된 수용체 5에 대한 약어이다. 이것은 인간에서 Lgr5 유전자에 의해 암호화된 단백질이다.
"Lgr5 활성도"는 세포의 집단에서의 Lgr5의 활성 수준으로서 정의된다. 시험관내 세포 집단에서, Lgr5 활성도는 시험관내 Lgr5 활성도 검정으로 측정될 수 있다. 생체내 세포 집단에서, Lgr5 활성도는 생체내 Lgr5 활성도 검정으로 측정될 수 있다.
"Lgr5+ 세포" 또는 "Lgr5-양성 세포"는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 Lgr5를 발현하는 세포이다. "Lgr5- 세포"는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 Lgr5+가 아닌 세포이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "계통 추적(Lineage Tracing)"은 리포터 유도 시에 표적 유전자를 발현시키는 임의의 세포의 운명 추적을 가능하게 하는 마우스 주를 사용하는 것이다. 이것은 유모 세포 또는 지지 세포 유전자(Sox2, Lgr5, 미오신VIIa, Pou4f3 등)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 계통 추적은 리포터 마우스와 교차된 Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 마우스를 사용할 수 있는데, 이는 유도 시, 그것이 유도 시에 Lgr5를 발현시킨 세포의 운명을 추적할 수 있게 한다. 추가 예로서, Lgr5 세포는 단일 세포로 단리되고, 줄기 세포 증식 검정에서 배양되어 집락을 생성하고, 이어서 분화 검정에서 분화될 수 있고, 유모 세포 및/또는 지지 세포 단백질을 염색하고, 유모 세포 또는 지지 세포 염색으로 리포터 동국소화(colocalization)를 결정하여 Lgr5 세포의 운명을 결정함으로써 세포 운명을 분석할 수 있다. 또한, 계통 추적은 치료 후 무손상 기관 내의 지지 세포 또는 유모 세포 운명을 추적하기 위해 와우 체외이식편에서 수행될 수 있다. 예를 들어, Lgr5 세포 운명은 리포터 마우스와 교차된 Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 마우스로부터 와우를 단리하고, 치료 전 또는 치료 동안 Lgr5 세포에서 리포터를 유도함으로써 결정될 수 있다. 이어서, 기관은, 유모 세포 및/또는 지지 세포 단백질을 염색하고, 유모 세포 또는 지지 세포 염색으로 리포터 동국소화를 결정하여 Lgr5 세포의 운명을 결정함으로써 세포 운명에 대해 분석될 수 있다. 또한, 계통 추적은 치료 후 손상되지 않은 기관 내의 지지 세포 또는 유모 세포 운명을 추적하기 위해 생체내에서 수행될 수 있다. 예를 들어, Lgr5 세포 운명은 리포터 마우스와 교차된 Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 마우스에서 리포터를 유도하고, 동물을 치료하고, 와우를 단리시킴으로써 결정될 수 있다. 이어서, 기관은, 유모 세포 및/또는 지지 세포 단백질을 염색하고, 유모 세포 또는 지지 세포 염색으로 리포터 동국소화를 결정하여 Lgr5 세포의 운명을 결정함으로써 세포 운명에 대해 분석될 수 있다. 계통 추적은 관련 기술 분야의 표준인 대안적인 관심대상 리포터를 사용하여 수행될 수 있다.
"포유동물"은 인간, 마우스, 래트, 양, 원숭이, 염소, 토끼, 햄스터, 말, 소 또는 돼지를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 임의의 포유동물을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "평균 방출 시간"은 작용제의 절반이 방출 검정에서 담체로부터 인산염 완충 염수로 방출되는 시간이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "네이티브 형태학"은 조직 구성이 건강한 조직에서의 구성을 크게 반영하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "비-인간 포유동물"은 인간이 아닌 임의의 포유동물을 의미한다.
본 명세서의 관련 문맥에서 사용되는 바와 같이, 용어 세포의 "수"는 0, 1, 또는 그 초과의 세포일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "코르티 기관"은 와우에 위치한 청력 기관의 감각 세포(내부 및 외부 유모 세포)를 지칭한다.
"오가노이드" 또는 "상피 오가노이드"는 기관, 또는 기관의 일부와 유사하고 특정 기관과 관련된 세포 유형을 갖는 세포 클러스터 또는 응집체를 지칭한다.
세포의 "집단"은 1개 초과의 세포의 임의의 수를 지칭하지만, 바람직하게는 적어도 1X103개 세포, 적어도 1X104개 세포, 적어도 1X105개 세포, 적어도 1X106개 세포, 적어도 1X107개 세포, 적어도 1X108개 세포, 적어도 1X109개 세포, 또는 적어도 1X1010개 세포이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "전구체 세포"는 줄기 세포와 같이, 특정 유형의 세포로 분화되는 경향을 갖지만, 이미 줄기 세포보다 더 특이적이고 이의 "표적" 세포로 분화하도록 강요된 세포를 지칭한다.
"참조"는 표준 또는 대조 조건(예컨대, 시험 작용제 또는 시험 작용제의 조합물로 처리되지 않음)을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "방출 검정"은 생체적합성 매트릭스로부터 투석막을 통해 염수 환경으로의 작용제의 방출 속도를 측정하는 시험이다. 예시적인 방출 검정은 적합한 컷오프를 갖는 염수 투석백 내부에 1㎖의 인산염 완충 염수 중의 30 마이크로리터의 조성물을 넣고, 37℃에서 투석백을 10mL의 인산염 완충 염수 내에 넣음으로써 수행될 수 있다. 투석막 크기는 막을 빠져나가는 작용제를 평가할 수 있도록 작용제 크기를 기초로 선택될 수 있다. 소분자 방출을 위해, 3.5 내지 5kDa의 컷오프가 사용될 수 있다. 조성물에 대한 방출 속도는 시간 경과에 따라 변화할 수 있고, 1시간 중분 단위로 측정될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "대표적인 현미경 샘플"은 모든 관련 필드가 측정된 경우 측정될 평균 피처 크기 또는 수가 평균 피처 크기 또는 수를 나타낸다고 합리적으로 언급될 수 있는 세포 배양계, 추출된 조직의 일부, 또는 전체 추출된 기관 내의 충분한 시야의 수를 기술한다. 예를 들어, 주파수 범위에서 코르티 기관에 대한 유모 세포 계수치를 평가하기 위해, ImageJ 소프트웨어(NIH)를 사용하여 와우 전체 마운트의 총 길이 및 개별 계수된 분절의 길이를 측정할 수 있다. 내부 유모 세포, 외부 유모 세포, 및 지지 세포의 총 수는 1200 내지 1400㎛의 4개 와우 분절(정점, 중간-정점, 중간-기저, 및 기저) 중 임의의 것의 전체 또는 분획에서 계수될 수 있고, 100㎛ 필드 크기의 적어도 3개 시야는 합리적으로 대표적인 현미경 샘플로 간주될 것이다. 대표적인 현미경 샘플은 주어진 거리당 세포로서 측정될 수 있는 시야 내의 측정을 포함할 수 있다. 대표적인 현미경 샘플을 사용하여 형태학, 예컨대 세포-세포 접촉, 와우 아키텍처, 및 세포 구성성분(예컨대, 번들, 시냅스)를 평가할 수 있다
"로제트 패터닝"은 5% 미만의 유모 세포가 다른 유모 세포와 인접하는 와우의 특징적인 세포 배열이다.
용어 "샘플"은 수득된, 제공된 및/또는 분석에 적용된 부피 또는 질량을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 샘플은 조직 샘플, 세포 샘플, 유체 샘플 등이거나 이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 샘플은 대상체로부터 취해지거나 (또는) 대상체이다(예컨대, 인간 또는 동물 대상체). 일부 실시형태에서, 조직 샘플은 뇌, 모발(모근 포함), 협측 스왑(swab), 혈액, 타액, 정액, 근육, 또는 임의의 내부 기관, 또는 이들 중 임의의 하나와 관련된 암, 전암성, 또는 종양 세포로부터의 것이거나 이를 포함한다. 유체는 소변, 혈액, 복수, 흉막액, 척수액 등일 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 신체 조직은 뇌, 피부, 근육, 자궁내막, 자궁, 및 자궁경부 조직 또는 이들 중 임의의 하나와 관련된 암, 전암성, 또는 종양 세포를 포함할 수 있지만 이들로 제한되지 않는다. 실시형태에서, 신체 조직은 뇌 조직 또는 뇌 종양 또는 암이다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는, 일부 실시형태에서, "샘플"이 공급원(예컨대, 대상체)으로부터 수득된다는 점에서 "일차 샘플"이고; 일부 실시형태에서, "샘플"이, 예를 들어, 잠재적으로 오염성인 특정 구성성분을 제거하고/하거나 관심대상 특정 구성성분을 단리 또는 정제시키기 위한, 일차 샘플의 처리 결과임을 인지할 것이다.
"자가 재생"은 줄기 세포가 분열하여 모 세포의 것과 구별할 수 없는 발달 잠재력을 갖는 1개(비대칭 분열) 또는 2개(대칭 분열)의 딸 세포를 생성하는 과정을 지칭한다. 자가 재생은 증식 및 미분화된 상태의 유지 둘 모두와 관련된다.
"siRNA"는 이중 가닥 RNA를 지칭한다. 최적으로, siRNA는 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개 또는 24개 뉴클레오타이드 길이이고, 이의 3' 말단에 2개의 염기 오버행을 갖는다. 이러한 dsRNA는 개별 세포 또는 배양계에 도입될 수 있다. 그러한 siRNA를 사용하여 mRNA 수준 또는 프로모터 활성도를 하향조절한다.
"줄기 세포"는 자가-재생하고, 다수의 세포 계통으로 분화되는 능력을 갖는 다능성 세포를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "줄기 세포 분화 검정"은 줄기 세포의 분화 능력을 결정하는 검정이다. 예시적인 줄기 세포 분화 검정에서, 초기 세포 집단을 위한 세포 수는, 코르티 기관 감각 상피를 단리시키고, 상피를 단일 세포로 해리시키고, 세포를 40um 세포 여과기를 통해 통과시킴으로써 3 내지 7일령의 Atoh1-GFP 마우스로부터 수거된다. 대략적으로 5000개 세포를 40㎕의 배양 기질(예를 들어: 마트리겔(코닝(Corning), 성장 인자 감소됨))에 포집하고 500㎕의 적절한 배양 배지, 성장 인자 및 시험될 작용제를 갖는 24웰 플레이트의 웰 중심에 넣는다. 적절한 배양 배지 및 성장 인자는 배지 보충물(1X N2, 1X B27, 2mM 글루타맥스, 10mM HEPES, 1mM N-아세틸시스테인, 및 100U/㎖ 페니실린/100㎍/㎖ 스트렙토마이신)을 갖는 어드밴스트(Advanced) DMEM/F12 및 성장 인자(50ng/㎖ EGF, 50ng/㎖ bFGF, 및 50ng/㎖ IGF-1)를 포함하고, 뿐만 아니라 평가될 작용제(들)를 각각의 웰에 첨가한다. 2일마다 배지를 교환하면서, 세포를 10일 동안 표준 세포 배양 인큐베이터에서 37℃ 및 5% CO2에서 배양하였다. 이어서 줄기 세포 증식 검정 작용제를 제거하고, 분화를 유도하기 위한 기초 배양 배지 및 분자로 대체함으로써 이들 세포를 배양한다. 적절한 기초 배양 배지는 1X N2, 1X B27, 2mM 글루타맥스, 10mM HEPES, 1mM N-아세틸시스테인, 및 100U/㎖ 페니실린/100㎍/㎖ 스트렙토마이신이 보충된 어드밴스트 DMEM/F12이고, 10일 동안 분화를 유도하기 위한 적절한 분자는 3μM CHIR99021 및 5μM DAPT이며, 2일마다 배지를 교환한다. 집단에서 유모 세포의 수는 GFP에 대한 유세포 분석법을 사용하여 측정될 수 있다. 유모 세포 분화 수준은 적합하고 조절되지 않은 참조 또는 하우스키핑 유전자(예컨대, Hprt)를 사용하여 표준화된 유모 세포 마커(예컨대, Myo7a) 발현 수준을 측정하기 위해 qPCR을 사용하여 추가로 평가될 수 있다. 유모 세포 분화 수준은 또한 유모 세포 마커(예컨대, 미오신7a, vGlut3, 에스핀, PMCAs, Ribeye, 컨주게이션된-팔로이딘, Atoh1, Pou4f3 등)를 면역염색시킴으로써 평가될 수 있다. 유모 세포 분화 수준은 또한 미오신7a, vGlut3, 에스핀, PMCAs, 프레스틴, Ribeye, Atoh1, Pou4f3에 대한 웨스턴 블롯에 의해 평가될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "줄기 세포 검정"은 세포 또는 세포 집단이 줄기 세포이거나 줄기 세포 또는 줄기 세포 마커로 풍부한지를 결정하기 위해서 세포 또는 세포 집단을 일련의 기준에 대해 시험하는 검정이다. 줄기 세포 검정에서, 세포/세포 집단은 줄기 세포 마커의 발현과 같은 줄기 세포 특징에 대해 시험되고, 또한 선택적으로 자가 재생 및 분화 능력을 비롯한, 줄기 세포 기능에 대해 시험된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "줄기 세포 증식제"는 자가 재생 및 분화 능력을 갖는 세포 집단의 증가를 유도하는 화합물이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "줄기 세포 증식 검정"은 출발 세포 집단으로부터 줄기 세포의 생성을 유도하는 작용제(들)의 능력을 결정하기 위한 검정이다. 예시적인 줄기 세포 증식 검정에서, 초기 세포 집단에 대한 세포의 수는, 코르티 기관 감각 상피를 단리시키고, 상피를 단일 세포로 해리시킴으로써, 3 내지 7일령의 Lgr5-GFP 마우스, 예컨대 B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J 마우스(Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 또는 Lgr5-GFP 마우스라고도 공지됨, 잭슨 랩 스톡 번호: 008875)로부터 수거된다. 대략적으로 5000개 세포를 40㎕의 배양 기질(예를 들어: 마트리겔(코닝, 성장 인자 감소됨))에 포집하고 500㎕의 적절한 배양 배지, 성장 인자 및 시험될 작용제를 갖는 24웰 플레이트의 웰 중심에 넣는다. 적절한 배양 배지 및 성장 인자는 배지 보충물(1X N2, 1X B27, 2mM 글루타맥스, 10mM HEPES, 1mM N-아세틸시스테인, 및 100U/㎖ 페니실린/100㎍/㎖ 스트렙토마이신)을 갖는 어드밴스트(Advanced) DMEM/F12 및 성장 인자(50ng/㎖ EGF, 50ng/㎖ bFGF, 및 50ng/㎖ IGF-1)를 포함하고, 뿐만 아니라 평가될 작용제(들)를 각각의 웰에 첨가한다. 2일마다 배지를 교환하면서, 세포를 10일 동안 표준 세포 배양 인큐베이터에서 37℃ 및 5% CO2에서 배양하였다. 시험관내 Lgr5 활성도 검정에서 Lgr5+로서 식별된 세포의 수를 계수함으로써 Lgr5+ 세포의 수를 정량한다. 세포 집단에서 Lgr5+로서 식별된 세포의 수를 세포 집단에 존재하는 세포의 총 수로 나눔으로써 Lgr5+인 세포 분율을 정량한다. 집단의 평균 Lgr5+ 활성도는 적합하고 조절되지 않은 참조 또는 하우스키핑 유전자(예컨대, Hprt)를 사용하여 표준화된 집단의 Lgr5의 평균 mRNA 발현 수준을 측정함으로써 정량된다. 집단에서 유모 세포의 수는 유모 세포 마커(예컨대, 미오신VIIa)로 염색함으로써, 또는 유모 세포 유전자(예컨대, Pou4f3-GFP, Atoh1-nGFP)의 내인성 리포터를 사용하고 유세포 분석법을 사용하여 분석함으로써 측정될 수 있다. 유모 세포인 세포의 분율은 세포 집단에서 유모 세포로서 확인된 세포의 수를 세포 집단에 존재하는 세포의 총 수로 나눔으로써 정량된다. Lgr5 활성도는 qPCR에 의해 측정될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "줄기 세포 마커"는 줄기 세포에서 특이적으로 발현되는 유전자 산물(예컨대, 단백질, RNA 등)로서 정의될 수 있다. 한 유형의 줄기 세포 마커는 줄기 세포 동일성의 유지를 직접적이고 특이적으로 지지하는 유전자 산물이다. 예는 Lgr5 및 Sox2를 포함한다. 추가적인 줄기 세포 마커는 문헌에 기술된 검정을 사용하여 식별될 수 있다. 유전자가 줄기 세포 동일성의 유지에 필요한지의 여부를 결정하기 위해서, 기능 획득(gain-of-function) 및 기능 상실(loss-of-function) 연구를 사용할 수 있다. 기능 획득 연구에서, 특정 유전자 산물(줄기 세포 마커)의 과발현은 줄기 세포 동일성 유지에 도움이 될 것이다. 반면 기능 상실 연구에서, 줄기 세포 마커의 제거는 줄기 세포 동일성의 손실을 초래하거나 줄기 세포의 분화를 유도할 것이다. 또 다른 유형의 줄기 세포 마커는 줄기 세포에서만 발현되고, 줄기 세포의 동일성을 유지하기 위해 특이적 기능을 가질 필요가 없는 유전자이다. 이러한 유형의 마커는 마이크로-어레이 및 qPCR과 같은 검정에 의해 분류된 줄기 세포 및 비-줄기 세포의 유전자 발현 시그니처를 비교함으로써 식별될 수 있다. 이러한 유형의 줄기 세포 마커는 문헌에서 찾아볼 수 있다(예를 들어, 문헌[Liu Q. et al., Int J Biochem Cell Biol. 2015 Mar;60:99-111. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25582750]). 잠재적인 줄기 세포 마커는 Ccdc121, Gdf10, Opcm1, Phex 등을 포함한다. 주어진 세포 또는 세포 집단에서 Lgr5 또는 Sox2와 같은 줄기 세포 마커의 발현은 qPCR, 면역조직화학, 웨스턴 블롯, 및 RNA 혼성화와 같은 검정을 사용하여 측정될 수 있다. 줄기 세포 마커의 발현은 또한 주어진 줄기 세포 마커, 예를 들어, Lgr5-GFP 또는 Sox2-GFP의 발현을 지시할 수 있는 트랜스제닉 세포 발현 리포터를 사용하여 측정될 수 있다. 이어서 유세포 분석법 분석을 사용하여 리포터 발현의 활성을 측정할 수 있다. 리포터의 발현을 직접 가시화하기 위해 형광 현미경이 또한 사용될 수 있다. 줄기 세포 마커의 발현은 글로벌 유전자 발현 프로파일 분석을 위한 마이크로어레이 분석을 사용하여 추가로 결정될 수 있다. 주어진 세포 집단 또는 정제된 세포 집단의 유전자 발현 프로파일을 줄기 세포의 유전자 발현 프로파일과 비교하여 2개의 세포 집단 사이의 유사성을 결정할 수 있다. 줄기 세포 기능은 집락 형성 검정 또는 구체 형성 검정, 자가 재생 검정 및 분화 검정에 의해 측정될 수 있다. 집락(또는 구체) 형성 검정에서, 적절한 배양 배지에서 배양될 때, 줄기 세포는 세포 배양 표면(예컨대, 세포 배양 접시) 상에 집락을 형성할 수 있거나 또는 세포 배양 기질(예컨대, 마트리겔)에 임베딩(embedding)될 수 있거나, 또는 현탁액 중에서 배양될 때 구체를 형성할 수 있어야 한다. 집락/구체 형성 검정에서, 단일 줄기 세포를 낮은 세포 밀도로 적절한 배양 배지에 시딩하고, 주어진 시간 기간(7 내지 10일) 동안 증식되게 한다. 이어서, 형성된 집락을 계수하고, 본래 세포의 줄기능의 지표로서 줄기 세포 마커 발현에 대한 점수를 매긴다. 선택적으로, 이어서, 형성된 집락을 선별하고, 계대시켜 이의 자가 재생 및 분화 잠재력을 시험한다. 자가 재생 검정에서, 적절한 배양 배지에서 배양될 때, 세포는 적어도 1회(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20회 등)의 세포 분열에 걸쳐서 줄기 세포 마커(예컨대, Lgr5) 발현을 유지해야 한다. 줄기 세포 분화 검정에서, 적절한 분화 배지에서 배양될 때, 세포는 qPCR, 면역염색, 웨스턴 블롯, RNA 혼성화 또는 유세포 분석법에 의해 측정된 유모 세포 마커 발현에 의해 식별될 수 있는 유모 세포를 생성할 수 있어야 한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "줄기능 드라이버"는 LGR5+ 세포의 증식을 유도하거나, 세포에서 Lgr5를 상향조절하거나, 세포에서 Lgr5 발현을 유지하는 한편, 자가 재생을 위한 잠재력 및 유모 세포로 분화되는 잠재력을 유지하는 조성물이다. 일반적으로, 줄기능 드라이버는 생후 줄기 세포의 적어도 하나의 바이오마커를 상향조절한다. 줄기능 드라이버는 Wnt 효능제 및 GSK3베타 억제제를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
"대상체"는 인간 및 포유동물(예컨대, 마우스, 래트, 돼지, 고양이, 개, 및 말)을 포함한다. 많은 실시형태에서, 대상체는 포유동물, 특히 영장류, 특히 인간이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 소, 양, 염소, 젖소, 돼지, 등과 같은 가축; 가금류, 닭, 오리, 거위, 칠면조 등; 및 사육 동물, 특히 개 및 고양이와 같은 애완동물이다. 일부 실시형태에서 (예컨대, 특히 연구 문맥에서) 대상체 포유동물은, 예를 들어, 설치류(예컨대, 마우스, 래트, 햄스터), 토끼, 영장류, 또는 근교배 돼지와 같은 돼지, 등일 것이다.
와우 상피와 관련하여 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "지지 세포"는 유모 세포가 아닌 코르티 기관 내의 상피 세포를 포함한다. 이는 속기둥 세포, 바깥 기둥 세포, 속손가락 세포, 다이테르 세포, 바깥경계 세포, 보에쳐(Boettcher) 세포, 및/또는 클라우디우스 세포를 포함한다.
"상승작용" 또는 "상승작용적 효과"는 별도로 취한 각 효과의 합보다 큰 효과; 부가 효과보다 더 큰 효과이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "TGF 베타 저해제"는 TGF 베타의 활성도를 감소시키는 조성물이다.
"조직"은 예를 들어, 와우의 조직, 예컨대, 코르티 기관을 비롯한, 특정 기능을 함께 수행하는 동일한 기원으로부터의 유사한 세포의 집합이다.
"경고막" 투여는 고막을 가로질러 중이로의 조성물의 직접 주사를 의미한다.
세포 집단과 관련하여 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "치료"는 결과를 달성하기 위해 집단에 물질을 전달하는 것을 의미한다. 시험관내 집단의 경우, 물질은 집단에 직접적으로 (또는 심지어 간접적으로) 전달될 수 있다. 생체내 집단의 경우, 물질은 숙주 대상체에 대한 투여에 의해 전달될 수 있다.
"Wnt 활성화"는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 Wnt 신호전달 경로의 활성화이다.
용어 "알킬"은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 선형 또는 분지형 포화 탄화수소를 지칭한다. 예를 들어, 알킬기는 1 내지 8개의 탄소 원자(즉, (C1-C8)알킬) 또는 1 내지 6개의 탄소 원자(즉, (C1-C6 알킬) 또는 1 내지 4개의 탄소 원자를 가질 수 있다.
용어 "알켄일"은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 2 내지 약 15 탄소 원자를 갖는, 하나 이상의 이중 결합을 포함하고, 2가 라디킬을 포함할 수 있는 선형 또는 분지형 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 알켄일기의 예는 에텐일, 프로펜일, 부텐일 및 더 고급 유사체 및 이성질체를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
용어 "알킨일"은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 2 내지 약 15 탄소 원자를 갖는, 하나 이상의 삼중 결합을 포함하고, 2가 라디킬을 포함할 수 있는 선형 또는 분지형 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 알킨일기의 예는 에틴일, 프로핀일, 부틴일 및 더 고급 유사체 및 이성질체를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
용어 "할로" 또는 "할로겐"은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 플루오로, 클로로, 브로모 및 아이오도를 지칭한다.
용어 "아릴"은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 단일 모든 탄소 방향족 고리 또는 다중 축합된 모든 탄소 고리 시스템을 지칭하며, 여기서 고리 중 적어도 하나는 방향족이다. 예를 들어, 아릴기는 6 내지 20개의 탄소 원자, 6 내지 14개의 탄소 원자, 또는 6 내지 12개의 탄소 원자를 가질 수 있다. 아릴은 페닐 라디칼을 포함한다. 아릴은 또한 적어도 하나의 고리가 방향족이고, 다른 고리는 방향족이거나 방향족이 아닐 수 있는 약 9 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 다중 축합된 고리 시스템(예를 들어, 2, 3 또는 4개의 고리를 포함하는 고리 시스템)을 포함한다. 이러한 다중 축합된 고리 시스템은 다중 축합된 고리 시스템의 임의의 탄소환 부분 상에서 하나 이상(예를 들어, 1, 2 또는 3개)의 옥소기로 선택적으로 치환될 수 있다. 다중 축합된 고리 시스템의 고리는 원자가 요건이 허용되는 경우 융합된 결합, 스피로 결합 및 브리지된 결합을 통해서 서로에 연결될 수 있다. 상기에 정의되는 바와 같이, 다중 축합된 고리 시스템의 부착 지점은 고리의 방향족 또는 탄소환 부분을 비롯한 고리 시스템의 임의의 위치에 존재할 수 있다.
용어 "헤테로아릴"은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 고리 내에 탄소가 아닌 적어도 하나의 원자를 갖고, 원자는 산소, 질소 및 황으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단일 방향족 고리를 지칭하며; 이 용어는 또한 적어도 하나의 이러한 방향족 고리를 갖는 다중 축합된 고리 시스템을 포함하며, 이러한 다중 축합된 고리 시스템은 하기에 추가로 기술된다. 따라서, 이 용어는 고리 내의, 약 1 내지 6개의 탄소 원자, 및 산소, 질소 및 황으로 이루어진 군으로부터 선택된 약 1 내지 4개의 헤테로원자의 단일 방향족 고리를 포함한다. 황 및 질소 원자는 또한 고리가 방향족인 한 산화된 형태로 존재할 수도 있다. 이 용어는 또한 다중 축합된 고리 시스템(예를 들어, 2, 3 또는 4개의 고리를 포함하는 고리 시스템)을 포함하는데, 여기서 헤테로아릴기는 상기에 정의된 바와 같이, 헤테로아릴(예를 들어, 나프티리딘일, 예컨대, 1,8-나프티리딘일을 형성함), 헤테로사이클(예를 들어, 1, 2, 3, 4-테트라하이드로나프티리딘일, 예컨대, 1, 2, 3, 4-테트라하이드로-1,8-나프티리딘일을 형성함), 탄소환(예를 들어, 5,6,7,8-테트라하이드로퀴놀릴을 형성함) 및 아릴(예를 들어, 인다졸릴을 형성함)로부터 선택된 하나 이상의 고리와 축합되어 다중 축합된 고리 시스템을 형성할 수 있다. 따라서, 헤테로아릴(단일 방향족 고리 또는 다중 축합된 고리 시스템)은 헤테로아릴 고리 내에 약 1 내지 20개의 탄소 원자 및 약 1 내지 6개의 헤테로원자를 갖는다. 이러한 다중 축합된 고리 시스템은 축합된 고리의 탄소환 또는 헤테로사이클 부분 상에서 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3 또는 4개)의 옥소기로 선택적으로 치환될 수 있다. 다중 축합된 고리 시스템의 고리는 원자가 요건이 허용되는 경우 융합된 결합, 스피로 결합 및 브리지된 결합을 통해서 서로에 연결될 수 있다. 다중 축합된 고리 시스템의 개별 고리는 서로에 대해서 임의의 순서로 연결될 수 있다고 이해되어야 한다. 또한 다중 축합된 고리 시스템의 부착 지점(헤테로아릴에 대해서 상기에 정의된 바와 같음)은 다중 축합된 고리 시스템의 헤테로아릴, 헤테로사이클, 아릴 또는 탄소환 부분을 비롯한 다중 축합된 고리 시스템의 임의의 부분에 그리고 탄소 원자 및 헤테로원자(예를 들어, 질소)를 비롯한 다중 축합된 고리 시스템의 임의의 적합한 원자에 존재할 수 있다.
용어 "사이클로알킬"은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 고리 원자로서 탄소 원자 만을 갖고, 2가 라디칼을 포함할 수 있는 약 3 내지 약 8개의 고리원을 갖는 포화된 또는 부분적으로 포화된 고리 구조를 지칭한다. 사이클로알킬기의 예는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헥센, 사이클로펜텐일, 사이클로헥센일을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
용어 "헤테로사이클릴" 또는 "헤테로사이클릭"은 탄소, 및 산소, 인, 질소 또는 황으로부터 선택된 헤테로원자를 함유하는 단환식 또는 다환식 3 내지 24원의 고리를 지칭는데, 여기서 고리 탄소 또는 헤테로원자 중에는 공유된 비편재화 ð 전자(방향족성)가 존재하지 않는다. 헤테로사이클릴의 예는 옥세탄일, 아제타딘일, 테트라하이드로퓨란일, 피롤리딘일, 옥사졸린일, 옥사졸리딘일, 티아졸린일, 티아졸리딘일, 피란일, 티오피란일, 테트라하이드로피란일, 다이옥살린일, 피페리딘일, 모르폴린일, 티오모르폴린일, 티오모르폴린일 S-옥사이드, 티오모르폴린일 S-다이옥사이드, 피페라진일, 아제핀일, 옥세핀일, 다이아제핀일, 트로판일, 및 호모트로판일을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 헤테로사이클릴의 예는 또한 융합된 고리, 브리지된 고리(예를 들어, 2,5-다이아자바이사이클로[2,2,1]헵탄), 및 스피로환식 고리(예를 들어, 2,8-다이아자스피로[4,5]데칸)을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
"또는"의 사용은 달리 언급되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 본 출원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "포함한다" 및 이 용어의 변형, 예컨대, "포함하는" 및 "포함하다"는 다른 첨가제, 구성성분, 테거(teger) 또는 단계를 배제하도록 의도되지 않는다. 본 출원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약" 및 "대략적으로"는 등가물로서 사용된다. 본 출원에서 약/대략적으로와 함께 또는 그것 없이 사용되는 임의의 수치는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해서 인지되는 임의의 일반적인 변동을 포괄하도록 의미된다. 특정 실시형태에서, 용어 "대략적으로" 또는 "약"은 달리 언급되지 않는 한 또는 그 문맥으로부터 자명하지 않는 한 언급된 참고 값의 양 방향으로(초과 또는 미만) 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 미만에 포함되는 다양한 값(이러한 수가 가능한 값의 100%를 초과할 경우 제외)을 지칭한다.
어구 "약제학적으로 허용 가능한"은 합리적인 의학적 판단의 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이, 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하며, 합리적인 유익/유해 비에 상응하는 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여형을 의미하기 위해 본 명세서에서 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제"는 미국 식품의약국(FDA)에 의해 인간 또는 가축에 사용하기에 적합한 것으로 허용되는 임의의 아주반트, 담체, 부형제, 활택제, 감미제, 희석제, 보존제, 염료/착색제, 풍미 증강제, 계면활성제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 안정화제, 등장제, 용매, 계면활성제, 또는 유화제를 비제한적으로 포함한다. 예시적인 약제학적으로 허용 가능한 담체는 당류, 예컨대 락토스, 글루코스 및 수크로스; 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; 셀룰로스, 및 이의 유도체, 예컨대 소듐 카복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; 트라가칸트; 맥아; 젤라틴; 탈크; 코코아 버터, 왁스, 동물 및 식물성 지방, 파라핀, 실리콘, 벤토나이트, 규산, 산화아연; 오일, 예컨대, 땅콩유, 면실유, 잇꽃유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; 폴리올, 예컨대 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; 에스테르, 예컨대, 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; 아가; 완충제, 예컨대, 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; 알긴산; 발열원-비함유 물; 등장성 염수; 링거액; 에틸 알코올; 인삼염 완충액; 및 약제학적 제형에 사용되는 임의의 다른 상용성 물질을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
"약제학적으로 허용 가능한 염"은 산 및 염기 둘 모두의 부가염을 포함한다.
"약제학적으로 허용 가능한 산 부가염"은 유리 염기의 생물학적 효능 및 특성을 보유하고, 생물학적으로 또는 달리 바람직하고, 무기산, 예컨대, 비제한적으로, 염산, 브로민화수소산, 황산, 질산, 인산 등, 및 유기산, 예컨대, 비제한적으로, 아세트산, 2,2-다이클로로아세트산, 아디프산, 알긴산, 아스코르브산, 아스파트산, 벤젠설폰산, 벤조산, 4-아세트아미도벤조산, 캄포르산, 캄포르-10-설폰산, 카프르산, 카프로산, 카프릴산, 탄산, 신남산, 시트르산, 사이클람산, 도데실황산, 에탄-1,2-다이설폰산, 에탄설폰산, 2-하이드록시에탄설폰산, 폼산, 푸마르산, 갈락타르산, 겐티스산, 글루코헵톤산, 글루콘산, 글루쿠론산, 글루탐산, 글루타르산, 2-옥소-글루타르산, 글리세로인산, 글리콜산, 히푸르산, 아이소부티르산, 락트산, 락토비온산, 라우르산, 말레산, 말산, 말론산, 만델산, 메탄설폰산, 점액산, 나프탈렌-1,5-다이설폰산, 나프탈렌-2-설폰산, 1-하이드록시-2-나프토산, 니코틴산, 올레산, 오로트산, 옥살산, 팔미트산, 파모산, 프로피온산, 피로글루탐산, 피루브산, 살리실산, 4-아미노살리실산, 세박산, 스테아르산, 석신산, 타르타르산, 티오시안산, / 톨루엔설폰산, 트라이플루오로아세트산, 운데실렌산 등으로 형성되는 염을 지칭한다.
"약제학적으로 허용 가능한 염기 부가염"은 유리 산의 생물학적 효능 및 특성을 보유하고, 생물학적으로 또는 달리 바람직한 염을 지칭한다. 이러한 염은 유리 산에 대한 무기 염기 또는 유기 염기의 부가로부터 제조된다. 무기 염기로부터 유래되는 염은 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘, 마그네슘, 철, 아연, 구리, 망간, 알루미늄 염 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 예를 들어, 무기 염은 암모늄, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 및 마그네슘 염을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 유기 염기로부터 유래되는 염은 1차, 2차, 및 3차 아민, 자연 발생 치환된 아민을 비롯한 치환된 아민, 환식 아민 및 염기성 이온 교환 수지, 예를 들어, 암모니아, 아이소프로필아민, 트라이메틸아민, 다이에틸아민, 트라이에틸아민, 트라이프로필아민, 다이에탄올아민, 에탄올아민, 데아놀, 2-다이메틸아미노에탄올, 2-다이에틸아미노에탄올, 다이사이클로헥실아민, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 카페인, 프로카인, 하이드라바민, 콜린, 베타인, 베네타민, 벤자틴, 에틸렌다이아민, 글루코사민, 메틸글루카민, 테오브로민, 트라이에탄올아민, 트로메타민, 퓨린, 피페라진, 피페리딘, N-에틸피페리딘, 폴리아민 수지 등의 염을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 특정 실시형태에 사용된 예시적인 유기 염기는 아이소프로필아민, 다이에틸아민, 에탄올아민, 트라이메틸아민, 다이사이클로헥실아민, 콜린 및 카페인을 포함한다.
습윤제, 유화제 및 윤활제, 예컨대, 라우릴황산나트륨 및 스테아르산마그네슘, 뿐만 아니라 착색제, 이형제, 코팅제, 감미제, 풍미제 및 향제, 보존제 및 항산화제가 또한 조성물에 존재할 수 있다.
약제학적으로 허용 가능한 항산화제의 예는 하기를 포함한다: (1) 수용성 항산화제, 예컨대, 아스코르브산, 시스테인 염산염, 소듐 바이설페이트, 소듐 메타바이설파이트, 소듐 설파이트 등; (2) 지용성 항산화제, 예컨대, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화된 하이드록시아니솔(BHA), 부틸화된 하이드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이팅제, 예컨대, 시트르산, 에틸렌다이아민 테트라아세트산(EDTA), 솔비톨, 타르타르산, 인산 등을 포함한다.
본 명세서에 기재된 조성물은 목적하는 전달 경로, 예를 들어, 경고막 주사, 경고막 심지 및 카테터, 및 주사 가능한 데포(depot)에 적합한 임의의 방식으로 제형화될 수 있다. 전형적으로, 제형은 이의 유도체 또는 전구약물, 용매화물, 입체이성질체, 라세미체, 또는 이의 호변이성질체를 비롯한 모든 생리학적으로 허용 가능한 조성물을 임의의 생리학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 및/또는 부형제와 함께 포함한다.
본 발명의 예시적인 실시형태에 대한 설명이 이어진다.
화합물
본 개시내용은 하기 화학식 (I)의 화합물 및 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 및 호변이성질체를 제공한다:
Figure pct00019
식 중, Q1, Q2, Q3, R1, R2, R3, Ar, -Z-W-X-Y- 및 m은 화학식 (I)에 대해서 상기에 정의된 바와 같다.
일부 실시형태에서, 하기 화학식 (I)의 화합물은 하기 특징 중 하나 이상을 갖는다:
a) 단 상기 화합물은
Figure pct00020
가 아님;
b) 단 Ar이
Figure pct00021
이고,
Figure pct00022
가
Figure pct00023
또는
Figure pct00024
인 경우, RX1은
Figure pct00025
도 아니고
Figure pct00026
도 아님.
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 참고로 포함된, 국제 특허 제WO 2003/076442호(PCT/US03/05050)에 개시되지 않은 화학식 (I)의 화합물을 제공한다.
화학식 (I)의 특정 실시형태에서, RX는 -CORX1 또는 -SO2RX1이다.
화학식 (I)의 특정 실시형태에서, RX는
Figure pct00027
Figure pct00028
로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, RX1은 할로인 1 내지 12개의 치환체로 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴이다. 특정 실시형태에서, RX1은 중수소화된 헤테로사이클릴이다. 특정 실시형태에서, 헤테로사이클릴은 단환식 또는 이환식 고리이다. 일부 실시형태에서, 헤테로사이클릴은 융합된, 브리지된 또는 스피로환식 고리이다. 특정 실시형태에서, 헤테로사이클릴은 1 내지 3개의 질소(즉, 1, 2 또는 3개의 질소) 및/또는 1 내지 3개의 산소(즉, 1, 2 또는 3개의 산소)를 함유한다. 특정 실시형태에서, 헤테로사이클릴은 하나의 질소 및/또는 하나의 산소를 함유한다. 특정 실시형태에서, 헤테로사이클릴은 하나의 질소를 함유한다. 특정 실시형태에서, 헤테로사이클릴은 2개의 질소를 함유한다. 특정 실시형태에서, 헤테로사이클릴은 하나의 질소 및 하나의 산소를 함유한다.
일부 실시형태에서, RX1은 피페리딘, 2,8-다이아자스피로[4,5]데칸, 2,5-다이아자바이사이클로[2,2,1]헵탄, 또는 8-옥사-3-아자바이사이클로[3.2.1]옥탄이되, 이들 각각은 중수소, 할로, C1-C4알킬, -[C(RX1a)2]p-OH, -(CH2)p-NMe2, -(CH2)p-NHMe, -(CH2)p-NH2로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 12개의 치환체로 선택적으로 치환되고; p는 0, 1, 2 또는 3이다. 일부 실시형태에서, RX1은 1 내지 6개의 할로 치환체로 선택적으로 치환된 피페리딘이다. 일부 실시형태에서, RX1은 -[C(RX1a)2]p-OH, -(CH2)p-NMe2로 선택적으로 치환된 피페리딘이다.
화학식 (I)의 특정 실시형태에서, 헤테로사이클릴은 C1-C4알킬, -(CH2)p-OH 또는 -(CH2)p-NH2로 선택적으로 치환되고; 여기서 p는 1, 2 또는 3이다. 특정 실시형태에서, RX1은 C1-C4알킬로 치환된 헤테로사이클릴이다. 특정 실시형태에서, RX1은 -(CH2)p-OH로 치환된 헤테로사이클릴이고; 여기서 p는 1, 2 또는 3이다. 특정 실시형태에서, RX1은 -CH2-OH로 치환된 헤테로사이클릴이다. 특정 실시형태에서, RX1은 -(CH2)p-NH2로 치환된 헤테로사이클릴이고; 여기서 p는 1, 2 또는 3이다. 특정 실시형태에서, RX1은 -CH2-NH2로 치환된 헤테로사이클릴이다.
화학식 (I)의 특정 실시형태에서, RX1은 헤테로사이클릴이고, 여기서 헤테로사이클릴은 -[C(RX1a)2]p-CN으로 선택적으로 치환된다. 특정 실시형태에서, RX1은 -[C(RX1a)2]p-OH, -[C(RX1a)2]p-O-C1-C4알킬, -NHCOC1-C4알킬, -CONHC1-C4알킬, COH, -CO2H, -[C(RX1a)2]p-COO-C1-C4알킬, -[C(RX1a)2]p-NH2, -[C(RX1a)2]p-NH-C1-C4알킬 또는 -[C(RX1a)2]p-N-(C1-C4알킬)2로 치환된 헤테로사이클릴이다. 특정 실시형태에서, RX1은 헤테로사이클릴이고, 여기서 헤테로사이클릴은 -CONHC1-C4알킬, -COH, -CO2H, 또는 -[C(RX1a)2]p-COO-C1-C4알킬로 선택적으로 치환된다.
화학식 (I)의 특정 실시형태에서, 각각의 RX1a는 수소 및 할로로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 특정 실시형태에서, RX1a 기 둘 모두는 함께 C3-C6사이클로알킬, 예컨대, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸 또는 사이클로헥실을 형성한다.
화학식 (I)의 특정 실시형태에서, RX는 헤테로아릴이다. 특정 실시형태에서, 헤테로아릴은 단환식 또는 이환식이다. 특정 실시형태에서, 헤테로아릴은 1 내지 3개의 질소(즉, 1, 2 또는 3개의 질소) 및/또는 1 내지 3개의 산소(즉, 1, 2 또는 3개의 산소)를 함유한다. 특정 실시형태에서, 헤테로아릴은 하나의 질소 및/또는 하나의 산소를 함유한다. 특정 실시형태에서, 헤테로아릴은 하나의 질소를 함유한다. 특정 실시형태에서, 헤테로아릴 2개의 질소를 함유한다. 특정 실시형태에서, 헤테로아릴은 하나의 질소 및 하나의 산소를 함유한다. 특정 실시형태에서, RX는
Figure pct00029
이다.
화학식 (I)의 특정 실시형태에서, RX는 -(C1-C4알킬렌)-(C3-C8사이클로알킬)이다. 특정 실시형태에서, -(C1-C4알킬렌)-(C3-C8사이클로알킬)은 C1-C4알킬렌 상에서 하나 내지 2개의 할로로 치환된다. 특정 실시형태에서, C3-C8사이클로알킬은 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸 또는 사이클로헥실이다. 특정 실시형태에서, RX는 -(C1-C4알킬렌)-(C3-C8사이클로알킬)이고, 여기서 -(C1-C4알킬렌)-(C3-C8사이클로알킬)은 C1-C4알킬렌 상에서 1개 또는 2개의 할로로 선택적으로 치환되고, 여기서 C3-C8사이클로알킬은 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸 또는 사이클로헥실이다. 특정 실시형태에서, RX는
Figure pct00030
이다.
본 개시내용은 하기 화학식 (Ia)를 갖는 화합물 및 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 및 호변이성질체를 제공한다:
Figure pct00031
식 중, Q1, Q2, Q3, R1, R2, R3, Ar, -Z-W-X-Y- 및 m은 화학식 (Ia)에 대해서 상기에 정의된 바와 같다.
본 개시내용은 하기 화학식 (Ib)를 갖는 화합물 및 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 및 호변이성질체를 제공한다:
Figure pct00032
식 중, Q1, Q2, Q3, R1, R2, R3, Ar, -Z-W-X-Y- 및 m은 화학식 (Ib)에 대해서 상기에 정의된 바와 같다.
특정 실시형태에서, Q1은 CH이고; Q2는 N이며; Q3은 C이다. 특정 실시형태에서, Q1은 N이고; Q2는 C이며; Q3은 N이다. 특정 실시형태에서, Q1은 CH이고; Q2는 C이며; Q3은 N이다. 특정 실시형태에서, 1은 N이고; Q2는 N이며; Q3은 C이다.
특정 실시형태에서,
Figure pct00033
는
Figure pct00034
로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, R1은 수소 또는 할로이다. 특정 실시형태에서, R1은 C1-C4알킬이고, 여기서 알킬은 할로 및 -OH로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환체로 선택적으로 치환된다. 특정 실시형태에서, R1은 C1-C4알킨일, -CN, -OH 또는 -S(O)2NH2이다. 특정 실시형태에서, R1은 -NH2 또는 -NHC(O)R1a이고, 여기서 R1a는 C1-C4알킬이다. 특정 실시형태에서, R1은 C1-C4알켄일이다. 특정 실시형태에서, R1은 -O-C1-C4알킬이다.
특정 실시형태에서, R2는 수소 또는 할로이다. 특정 실시형태에서, R2는 C1-C4알킬이고, 여기서 알킬은 할로 및 -OH로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환체로 선택적으로 치환된다. 특정 실시형태에서, R2는 C1-C4알킨일, -CN, -OH 또는 -S(O)2NH2이다. 특정 실시형태에서, R2는 -NH2 또는 -NHC(O)R2a이고, 여기서 R2a는 C1-C4알킬이다. 특정 실시형태에서, R2는 -S(O)2NH2이다.
특정 실시형태에서, R2는 C1-C4알켄일이다. 특정 실시형태에서, R2는 -O-C1-C4알킬이다. 특정 실시형태에서, R2는 -NH2, -NH(C1-C4알킬) 또는 -N(C1-C4알킬)2이다.
특정 실시형태에서, R2는 할로, C1-C4알킬, C1-C4알켄일, C1-C4알킨일, -CN, -OH, -O-C1-C4알킬, -NH2, -NH(C1-C4알킬), -N(C1-C4알킬)2, -NHC(O)R2a, 및 -S(O)2NH2로 이루어진 군으로부터 선택되되; 상기 알킬은 할로 및 OH로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환체로 선택적으로 치환되고; R2a는 C1-C4알킬이다. 특정 실시형태에서, R2는 할로, C1-C4알킬, C1-C4알킨일, -CN, -OH, -NH2, -NHC(O)R2a, 및 -S(O)2NH2로 이루어진 군으로부터 선택되고; 여기서 알킬은 할로 및 -OH로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환체로 선택적으로 치환되고; 여기서 R2a는 C1-C4알킬이다. 특정 실시형태에서, R2는 수소가 아니다.
특정 실시형태에서, R3은 수소 또는 할로이다. 특정 실시형태에서, R3은 C1-C4알킬이고, 여기서 알킬은 할로 및 -OH로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환체로 선택적으로 치환된다. 특정 실시형태에서, R3은 C1-C4알킨일, -CN, -OH 또는 -S(O)2NH2이다. 특정 실시형태에서, R3은 -NH2 또는 -NHC(O)R3a이고, 여기서 R3a는 C1-C4알킬이다. 특정 실시형태에서, R3은 C1-C4알켄일이다. 특정 실시형태에서, R3은 -O-C1-C4알킬이다.
특정 실시형태에서, Ar은
Figure pct00035
이다. 특정 실시형태에서, Ar은
Figure pct00036
이다. 특정 실시형태에서, Ar은
Figure pct00037
이다. 특정 실시형태에서, Ar은
Figure pct00038
이다. 특정 실시형태에서, Ar은
Figure pct00039
이다. 특정 실시형태에서, Ar은
Figure pct00040
이다. 특정 실시형태에서, Ar은
Figure pct00041
이다. 특정 실시형태에서, Ar은
Figure pct00042
이다. 특정 실시형태에서, Ar은
Figure pct00043
이다. 특정 실시형태에서, Ar은
Figure pct00044
이다. 특정 실시형태에서, Ar은
Figure pct00045
이다. 특정 실시형태에서, Ar은
Figure pct00046
이다. 특정 실시형태에서, Ar은
Figure pct00047
이다. 특정 실시형태에서, Ar은
Figure pct00048
이다.
화학식 (Ia)의 특정 실시형태에서, Ar은
Figure pct00049
이다. 화학식 (Ia)의 특정 실시형태에서, Ar은
Figure pct00050
이다. 화학식 (Ia)의 특정 실시형태에서, Ar은
Figure pct00051
또는
Figure pct00052
이고, Q7은 S, O, CH2, 및 NRQ7로부터 선택되고; 여기서 RQ7은 수소 또는 선택적으로 치환된 C1-C4알킬이다.
화학식 (Ib)의 특정 실시형태에서, Ar은
Figure pct00053
이다. 화학식 (Ib)의 특정 실시형태에서, Ar은
Figure pct00054
이다. 화학식 (Ib)의 특정 실시형태에서, Ar은
Figure pct00055
또는
Figure pct00056
이고, 여기서 Q7은 S, O, CH2, 및 NRQ7로부터 선택되고; 여기서 RQ7은 수소 또는 선택적으로 치환된 C1-C4알킬이다. 화학식 (Ib)의 특정 실시형태에서, Ar은
Figure pct00057
,
Figure pct00058
이고, 여기서 Q7은 S, O, CH2, 및 NRQ7로부터 선택되고; 여기서 RQ7은 수소 또는 선택적으로 치환된 C1-C4알킬이다. 화학식 (Ib)의 특정 실시형태에서, Ar은
Figure pct00059
이고, 여기서 각각의 Q6은 CRQ6 및 N으로부터 독립적으로 선택되고; 여기서 RQ6은 수소, 할로, -CN, 저급 알킬 또는 치환된 알킬이다.
특정 실시형태에서, -Z-W-X-Y-는 -C(RZ)2-C(RW)2-N(RX)-C(RY)2-이다. 특정 실시형태에서, -Z-W-X-Y-는 -C(RZ)2-C(RW)2-CH(RX)-C(RY)2-이다. 특정 실시형태에서, -Z-W-X-Y-는 -C(RW)2-CH(RX)-C(RY)2-이다.
특정 실시형태에서, 각각의 RZ는 수소 및 할로로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 특정 실시형태에서, RZ 기 둘 모두는 함께 C3-C6사이클로알킬, 예컨대, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸 또는 사이클로헥실을 형성한다. 특정 실시형태에서, RZ 기 둘 모두는 함께 옥소를 형성한다. 특정 실시형태에서, RZ 및 RW는 이들이 부착되는 탄소와 함께 C3-C6사이클로알킬, 예컨대, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸 또는 사이클로헥실을 형성한다.
특정 실시형태에서, 각각의 RW는 수소 및 할로로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 특정 실시형태에서, RW 기 둘 모두는 함께 C3-C6사이클로알킬, 예컨대, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸 또는 사이클로헥실을 형성한다. 특정 실시형태에서, RW 기 둘 모두는 함께 옥소를 형성한다. 특정 실시형태에서, RZ 및 RW는 이들이 부착되는 탄소와 함께 C3-C6사이클로알킬, 예컨대, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸 또는 사이클로헥실을 형성한다.
특정 실시형태에서, 각각의 RY는 수소 및 할로로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 특정 실시형태에서, RY 기 둘 모두는 함께 C3-C6사이클로알킬, 예컨대, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸 또는 사이클로헥실을 형성한다. 특정 실시형태에서, RY 기 둘 모두는 함께 옥소를 형성한다.
화학식 (Ia) 및 (Ib)의 특정 실시형태에서, RX는 H이다. 화학식 (Ia) 및 (Ib)의 특정 실시형태에서, RX는 RX1이며, 이것은 C3-C8사이클로알킬, 헤테로아릴 또는 헤테로사이클릴이고, 여기서 헤테로사이클릴은 중수소, 할로, C1-C4알킬, -(CH2)p-OH, -[C(RX1a)2]p-OH, -[C(RX1a)2]p-O-C1-C4알킬, -NHCOC1-C4알킬, -CONHC1-C4알킬, -(CH2)p-NH2, -[C(RX1a)2]p-NH2, -[C(RX1a)2]p-NH-C1-C4알킬, -[C(RX1a)2]p-N-(C1-C4알킬)2로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 12개의 치환체로 선택적으로 치환되고; 여기서 p는 0, 1, 2 또는 3이며; 여기서 각각의 RX1a는 수소, 중수소, 할로 및 C1-C4알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나 또는 RX1a 기 둘 모두는 함께 C3-C6사이클로알킬을 형성한다.
화학식 (Ia) 및 (Ib)의 특정 실시형태에서, RX는 -CORX1 또는 -SO2RX1이다.
화학식 (Ia) 및 (Ib)의 특정 실시형태에서, RX는
Figure pct00060
Figure pct00061
로부터 선택된다.
화학식 (Ia) 및 (Ib)의 특정 실시형태에서, RX는 -(C1-C4알킬렌)-RX1이고, 여기서 -(C1-C4알킬렌)-RX1은 C1-C4알킬렌 상에서 1개 내지 4개의 할로로 선택적으로 치환된다. 특정 실시형태에서, -(C1-C4알킬렌)-RX1은 C1-C4알킬렌 상에서 1개 내지 4개의 할로로 치환된다. 특정 실시형태에서, -(C1-C4알킬렌)-RX1은 C1-C4알킬렌 상에서 1개 또는 2개의 할로로 치환된다. 특정 실시형태에서, RX는 -(C1-C4알킬렌)-RX1이고, 여기서 -(C1-C4알킬렌)-RX1은 C1-C4알킬렌 상에서 1개 또는 2개의 할로로 선택적으로 치환되고, 여기서 RX1은 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸 또는 사이클로헥실이다. 특정 실시형태에서, RX는
Figure pct00062
이다.
화학식 (Ia) 및 (Ib)의 특정 실시형태에서, RX1은 C3-C8사이클로알킬이다. 특정 실시형태에서, RX1은 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸 또는 사이클로헥실이다.
화학식 (Ia) 및 (Ib)의 특정 실시형태에서, RX1은 헤테로사이클릴이고, 여기서 헤테로사이클릴은 할로인 1 내지 12개의 치환체로 선택적으로 치환된다. 특정 실시형태에서, RX1은 중수소화된 헤테로사이클릴이다. 특정 실시형태에서, 헤테로사이클릴은 단환식 또는 이환식이다. 특정 실시형태에서, 헤테로사이클릴은 1 내지 3개의 질소(즉, 1, 2 또는 3개의 질소) 및/또는 1 내지 3개의 산소(즉, 1, 2 또는 3개의 산소)를 함유한다. 특정 실시형태에서, 헤테로사이클릴은 하나의 질소 및/또는 하나의 산소를 함유한다. 특정 실시형태에서, 헤테로사이클릴은 하나의 질소를 함유한다. 특정 실시형태에서, 헤테로사이클릴은 2개의 질소를 함유한다. 특정 실시형태에서, 헤테로사이클릴은 하나의 질소 및 하나의 산소를 함유한다.
화학식 (Ia) 및 (Ib)의 특정 실시형태에서, RX1은 C1-C4알킬, -(CH2)p-OH 또는 -(CH2)p-NH2로 선택적으로 치환된 헤테로사이클릴이고; 여기서 p는 1, 2 또는 3이다. 특정 실시형태에서, RX1은 C1-C4알킬로 치환된 헤테로사이클릴이다. 특정 실시형태에서, RX1은 -(CH2)p-OH로 치환된 헤테로사이클릴이고; 여기서 p는 1, 2 또는 3이다. 특정 실시형태에서, RX1은 -(CH2)-OH로 치환된 헤테로사이클릴이다. 특정 실시형태에서, RX1은 -(CH2)p-NH2로 치환된 헤테로사이클릴이고; 여기서 p는 1, 2 또는 3이다. 특정 실시형태에서, RX1은 -(CH2)-NH2로 치환된 헤테로사이클릴이다.
화학식 (Ia) 및 (Ib)의 특정 실시형태에서, RX1은 헤테로사이클릴이고, 여기서 헤테로사이클릴은 -[C(RX1a)2]p-CN으로 선택적으로 치환된다. 특정 실시형태에서, RX1은 -[C(RX1a)2]p-OH, -[C(RX1a)2]p-O-C1-C4알킬, -NHCOC1-C4알킬, -[C(RX1a)2]p-NH2, -[C(RX1a)2]p-NH-C1-C4알킬 또는 -[C(RX1a)2]p-N-(C1-C4알킬)2로 치환된 헤테로사이클릴이다. 특정 실시형태에서, RX1은 헤테로사이클릴이고, 여기서 헤테로사이클릴은 -CONHC1-C4알킬, -COH, -CO2H, 또는 -[C(RX1a)2]p-COO-C1-C4알킬로 선택적으로 치환된다.
화학식 (Ia) 및 (Ib)의 특정 실시형태에서, 각각의 RX1a는 수소 및 할로로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 특정 실시형태에서, RX1a 기 둘 모두는 함께 C3-C6사이클로알킬, 예컨대, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸 또는 사이클로헥실을 형성한다.
화학식 (Ia) 및 (Ib)의 특정 실시형태에서, RX1은 헤테로아릴이다. 특정 실시형태에서, 헤테로아릴은 단환식 또는 이환식이다. 특정 실시형태에서, 헤테로아릴은 1 내지 3개의 질소(즉, 1, 2 또는 3개의 질소) 및/또는 1 내지 3개의 산소(즉, 1, 2 또는 3개의 산소)를 함유한다. 특정 실시형태에서, 헤테로아릴은 하나의 질소 및/또는 하나의 산소를 함유한다. 특정 실시형태에서, 헤테로아릴은 하나의 질소를 함유한다. 특정 실시형태에서, 헤테로아릴 2개의 질소를 함유한다. 특정 실시형태에서, 헤테로아릴은 하나의 질소 및 하나의 산소를 함유한다. 특정 실시형태에서, RX1은
Figure pct00063
이다.
화학식 (Ia) 및 (Ib)의 특정 실시형태에서, RX는 -CON(RX2)2이다. 특정 실시형태에서, RX는 -CON(RX2)2이고, 여기서 RX2는 수소 또는 메틸이다. 특정 실시형태에서, RX는 -CONH2이다. 특정 실시형태에서, RX는 -CON(RX2)2이고, 여기서 RX2는 C1-C4알킬이다. 특정 실시형태에서, RX는 -CON(RX2)2이고, 여기서 RX2는 메틸이다.
특정 실시형태에서, m은 0이다. 특정 실시형태에서, m은 1이다. 특정 실시형태에서, m은 2이다.
본 명세서에서 화합물의 일 변형에서, Ar은
Figure pct00064
이고, Q1은 CH이며; Q2는 N이고; Q3은 C이며; Q4는 C이고; Q5는 C이다.
본 명세서에서 화합물의 일 변형에서, Ar은
Figure pct00065
이고, Q1은 CH이며; Q2는 N이고; Q3은 C이며; Q4는 C이고; Q5는 C이다.
본 개시내용은 하기 특징 중 1개, 2개, 3개 또는 그 초과를 갖는 본 명세서에서의 화학식 (I)의 화합물을 제공한다:
Figure pct00066
a) Ar은
Figure pct00067
임;
b) Q1은 CH이고; Q2는 N이며; 그리고 Q3은 C임;
c) R2는 수소 또는 할로임;
d) -Z-W-X-Y-는 -C(RZ)2-C(RW)2-N(RX)-C(RY)2-임;
e) RX는 -CORX1임.
본 개시내용은 하기 특징 중 1개, 2개, 3개 또는 그 초과를 갖는 본 명세서에서의 화학식 (I)의 화합물을 제공한다:
Figure pct00068
a) Ar은
Figure pct00069
임;
b) Q1은 CH이고; Q2는 N이며; 그리고 Q3은 C임;
c) R2는 C1-C4알킬이고, 여기서 알킬은 할로 및 -OH로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환체로 선택적으로 치환됨;
d) -Z-W-X-Y-는 -C(RZ)2-C(RW)2-N(RX)-C(RY)2-임;
e) RX는 -CORX1임.
본 개시내용은 하기 특징 중 1개, 2개, 3개 또는 그 초과를 갖는 본 명세서에서의 화학식 (I)의 화합물을 제공한다:
Figure pct00070
a) Ar은
Figure pct00071
임;
b) Q1은 CH이고; Q2는 N이며; 그리고 Q3은 C임;
c) R2는 C1-C4알킨일, -CN, -OH, -S(O)2NH2, -NH2 또는 -NHC(O)R2a임;
d) -Z-W-X-Y-는 -C(RZ)2-C(RW)2-N(RX)-C(RY)2-임;
e) RX는 -CORX1임.
본 발명의 화합물의 비제한적인 예를 하기에 나타낸다.
Figure pct00072
Figure pct00073
Figure pct00074
Figure pct00075
Figure pct00076
Figure pct00077
Figure pct00078
Figure pct00079
본 개시내용은 하기 화학식 (IIa)를 갖는 화합물 및 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 및 호변이성질체를 제공한다:
Figure pct00080
.
일부 실시형태에서, RX1은
Figure pct00081
로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 개시내용은 하기 화학식 (IIb)를 갖는 화합물 및 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 및 호변이성질체를 제공한다:
Figure pct00082
.
일부 실시형태에서, RX1은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00083
.
일부 실시형태에서, RX1은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00084
Figure pct00085
.
일부 실시형태에서, RX1은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00086
.
본 개시내용은 하기 화학식 (IIc)를 갖는 화합물 및 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 및 호변이성질체를 제공한다:
Figure pct00087
.
일부 실시형태에서, RX1은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00088
일부 실시형태에서, RX1은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00089
Figure pct00090
일부 실시형태에서, RX1은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00091
본 개시내용은 하기 화학식 (IId)를 갖는 화합물 및 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 및 호변이성질체를 제공한다:
Figure pct00092
.
일부 실시형태에서, RX1은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00093
일부 실시형태에서, RX1은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00094
Figure pct00095
.
일부 실시형태에서, RX1은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00096
본 개시내용은 하기 화학식 (IIe)를 갖는 화합물 및 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 및 호변이성질체를 제공한다:
Figure pct00097
.
일부 실시형태에서, RX1은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00098
일부 실시형태에서, RX1은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00099
Figure pct00100
일부 실시형태에서, RX1은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00101
달리 언급되지 않는 한, 본 명세서에 도시된 구조는 또한 하나 이상의 동위원소가 풍부한 원자의 존재 만 상이한 화합물을 포함하는 것을 또한 의미한다. 예를 들어, 중수소 또는 삼중수소에 의한 수소 원자의 대체, 또는 13C 또는 14C에 의한 탄소 원자의 대체, 또는 15N에 의한 질소 원자의 대체, 또는 17O 또는 18O에 의한 산소 원자의 대체를 제외하고 본 구조를 갖는 화합물이 본 개시내용의 범주에 포함된다. 이러한 동위원소 표지된 화합물은 연구 또는 진단 툴로서 유용하다. 특정 실시형태에서, 중수소화를 사용하여 대사를 둔화시킴으로써 화합물 반감기를 잠재적으로 개선시킬 수 있다. 화합물 내의 임의의 또는 모든 수소가 중수소로 대체될 수 있다.
개시된 화합물의 합성 방법
본 발명의 화합물은 표준 화학을 비롯한, 다양한 방법에 의해서 제조될 수 있다. 적합한 합성 경로는 하기에 주어진 반응식에 도시되어 있다.
본 명세서에 기술된 화학식 중 임의의 화합물은 하기 합성 반응식 및 실시예에 의해서 부분적으로 언급된 바와 같이 유기 합성 분야에 공지된 방법에 의해서 제조될 수 있다. 하기에 기술된 반응식에서, 일반적인 원리 또는 화학에 따라서 필요한 경우 민감성 또는 반응성 기를 위한 보호기가 사용된다. 보호기는 유기 합성의 표준 방법에 따라서 조작된다(T. W. Greene and P. G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", Third edition, Wiley, New York 1999). 이러한 기는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 용이하게 자명한 방법을 사용하여 화합물 합성의 편리한 단계에서 제거된다. 선택 공정뿐만 아니라 반응 조건 및 이의 실행 순서는 본 개시내용의 화합물의 제조와 일관되어야 한다.
관련 기술 분야의 통상의 기술자는 본 개시내용의 화합물 중 임의의 것에서 입체중심이 존재하는지의 여부를 인식할 것이다. 따라서, 본 발명은 (합성에서 명시되지 않는 한) 가능한 모든 입체이성질체를 포함하고, 라세미체 화합물뿐만 아니라 개별 거울상이성질체 및/또는 부분입체이성질체도 포함한다. 단일 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체로서의 화합물이 바람직한 경우, 그것은 입체특이적 합성에 의해서 또는 최종 생성물의 분할에 의해서 또는 임의의 편리한 중간체에 의해서 수득될 수 있다. 최종 생성물, 중간체, 또는 출발 물질의 분할은 관련 기술 분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해서 달성될 수 있다. 예를 들어, 문헌["Stereochemistry of Organic Compounds" by E. L. Eliel, S. H. Wilen, and L. N. Mander (Wiley-lnterscience, 1994)]을 참고하기 바란다.
화합물의 제조 방법
본 명세서에 기술된 화합물은 상업적으로 입수 가능한 출발 물질로부터 제조될 수 있거나 또는 공지된 유기, 무기 및/또는 효소 공정을 사용하여 합성될 수 있다.
본 발명의 화합물은 유기 합성 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 다수의 방식에 의해서 제조될 수 있다. 예의 방식에 의해서, 본 개시내용의 화합물은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 인지되는 바와 같은 합성 유기 화학 분야에 공지된 합성 방법 또는 이의 변형과 함께, 하기에 기술된 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 이러한 방법은 하기에 기술된 방법을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
본 발명의 화합물에 대한 대표적인 합성을 반응식 1에 나타낸다.
반응식 1. 화학식 (I)의 예시적인 화합물의 일반적인 합성
Figure pct00102
반응식 1에서, 코어 2는 Q1가 CH이고; Q2가 N이며; Q3이 C이고; R2가 브로모이며; Ar이
Figure pct00103
이고; -Z-W-X-Y-가
Figure pct00104
인 실시형태이다.
화합물 1 및 알릴 알데하이드는 상업적으로 입수 가능한 출발 물질이다. 대안적으로, 화합물 1 및 알릴 알데하이드는 상업적으로 입수 가능한 출발 물질 및/또는 종래의 합성 방법에 의해서 제조된 출발 물질을 사용하여 다양한 상이한 합성 경로를 통해서 합성될 수 있다.
반응식 1을 계속 참고하면, 화합물 1 및 알릴 알데하이드를 반응시켜 적합한 용매, 예컨대, 아세토나이트릴 중에서, 예를 들어, 약 40℃ 내지 100℃의 온도에서 축합 반응으로 화합물 2를 형성한다. 화합물 2를 암모니아와 반응시켜 적합한 용매, 예컨대, 메탄올 중에서 예를 들어, 0℃ 내지 실온의 범위의 온도에서 화합물 3을 형성한다. 화합물 3을 하기에 논의될 커플링 반응에서 사용할 수 있다.
반응식 1을 계속 참고하여, 염기, 예컨대, 알칼리 금속 하이드라이드, 예컨대, 수소화나트륨의 존재 하에서 알킬 할라이드를 사용한 화합물 4의 알킬화로부터 화합물 5를 제조할 수 있다. 반응은 적합한 용매, 예컨대, 다이메틸폼아마이드(DMF) 중에서 예를 들어, 0℃ 내지 실온의 범위에서의 온도에서 수행될 수 있다.
화합물 5의 환원으로부터 화합물 6을 제조할 수 있다. 적합한 환원 시약은 보란 피리딘 착물을 포함한다. 반응은 적합한 용매, 예컨대, 아세트산 중에서 예를 들어, 0℃ 내지 실온의 범위에서의 온도에서 수행될 수 있다.
화합물 7은 화합물 6의 반응으로부터 제조될 수 있다. 반응은 산, 예컨대, 황산 및 아세트산의 존재 하에서 폼알데하이드를 사용하여 수행된다.
화합물 7의 아미노기의 보호로부터 화합물 8을 제조할 수 있다. 적합한 시약은 B℃ 무수물을 포함한다. 반응은 적합한 용매, 예컨대, 테트라하이드로퓨란(THF) 중에서 예를 들어, 0℃ 내지 실온의 범위에서의 온도에서 수행될 수 있다.
화합물 8의 탈수소화로부터 코어 1을 제조할 수 있다. 적합한 시약은 DDQ(2,3-다이클로로-5,6-다이사이아노-1,4-벤조퀴논)를 포함한다. 반응은 적합한 용매, 예컨대, 테트라하이드로퓨란(THF) 중에서 예를 들어, 0℃ 내지 실온의 범위에서의 온도에서 수행될 수 있다.
아미노기의 탈보호 및 이어서 아실 할라이드와의 후속 반응에 의해서 코어 1로부터 화합물 10을 제조할 수 있다. 아미노기의 탈보호는, 보호기가 Boc인 경우, 산성 조건 하에서 수행될 수 있다. 이어서 아실 할라이드와의 반응은 화합물 10을 생성할 수 있다. 반응은 적합한 용매, 예컨대, 다이메틸폼아마이드(DMF) 중에서 예를 들어, 0℃ 내지 실온의 범위에서의 온도에서 수행될 수 있다.
아실화 반응, 예컨대, 프리델 크래프트(Friedel Craft) 아실화 반응에 의해서 화합물 10으로부터 화합물 11을 제조할 수 있다. 이러한 반응에서, 아실 할라이드를 적합한 용매, 예컨대 메틸렌 클로라이드 중에서 예를 들어, 30℃ 내지 100℃의 범위의 온도에서 화합물 10과 반응시킨다. 이어서 생성물을 알코올 및 염기와 반응시켜 화합물 11에서와 같이 에스터를 형성한다.
화합물 11 및 화합물 3을 반응시켜 1H-피롤-2,5-다이온 화합물을 형성한다. 반응은 불활성 유기 용매, 예컨대, 다이메틸폼아마이드, 테트라하이드로퓨란 등 중에서 염기, 예컨대, 칼륨 tert-부톡사이드의 존재 하에서 수행된다.
화합물의 사용 방법
본 개시내용은 Wnt 경로를 활성화시키거나 또는 GSK3-베타 활성도를 저해하는 방법에 관한 것이다. 특허 및 비특허 문헌에서 수 백 개의 알려진 GSK3 저해제가 존재하지만, 다른 치료제의 부재 하에서 투여되는 경우 모든 GSK3 저해제가 줄기세포 증식의 활성화를 촉진시키기에 충분하게 효력이 있는 것은 아닐 것이다.
또 다른 양상에서 본 개시내용은 특정 조직 세포의 부재 또는 결핍과 연관된 장애 또는 질환의 발생 및/또는 중증도를 예방, 감소 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 일 양상에서 본 개시내용은 내이 조직, 특히 내이 유모 세포, 이들의 전구세포, 및 선택적으로 혈관조, 및 연관된 청신경과 관련되는 내이 장애 및 청력 손상의 발생 및/또는 중증도를 예방, 감소 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 특히 흥미로운 것은 유모 세포 수 감소가 원인일 수 있는 영구적 청력 손실 및/또는 유모 세포 기능 저하로 이어지는 그러한 병태이다. 시스플라틴 및 이의 유사체, 아미노글리코사이드 항생제, 살리실레이트 및 이의 유사체, 또는 루프 이뇨제를 비롯한 귀독성 치료 약물의 원치 않는 부작용으로서 발생하는 것이 또한 흥미롭다. 특정 실시형태에서, 본 개시내용은 내이 조직, 특히 내이 지지 세포 및 유모 세포의 성장, 증식 또는 재생을 유도, 촉진 또는 향상시키는 것에 관한 것이다.
특히, 본 명세서에 제시된 방법은 급성 및 만성 귀 질환 및 청력 손실, 현기증 및 균형 문제, 특히 급성 청력 손실, 음향성 외상, 만성 소음 노출로 인한 청력 손실, 노인성 난청, 내이 인공 삽입물 이식 동안의 외상(삽입 외상), 내이 부위의 질병으로 인한 어지러움, 관련된 현기증 및/또는 메니에르병의 증상으로서 관련된 현기증 및/또는 메니에르병의 증상으로서 이명, 및 항생제 및 세포증식억제제 및 기타 약물로 인한 청력 손실의 예방 및/또는 치료를 위한 약제학적 제형의 제조에 유용하다.
와우 지지 세포 집단이 이러한 조성물로 처리되는 경우, 집단이 생체내이든 또는 시험관내이든 간에, 처리된 지지 세포는 증식 및 분화 및 보다 구체적으로는, 와우 유모 세포로의 분화 능력을 갖는다는 점에서 줄기-유사 성향을 나타낸다. 바람직하게는, 조성물은 지지 세포를 유도하고 유지하여 많은 세대 동안 분열할 수 있고, 생성 세포의 유모 세포로의 높은 비율의 분화 능력을 유지하는 딸 줄기세포를 생성한다. 특정 실시형태에서, 증식 중인 줄기세포는 Lgr5, Sox2, Opeml, Phex, lin28, Lgr6, cyclin D1, Msx1, Myb, Kit, Gdnf3, Zic3, Dppa3, Dppa4, Dppa5, Nanog, Esrrb, Rex1, Dnmt3a, Dnmt3b, Dnmt3l, Utf1, Tcl1, Oct4, Klf4, Pax6, Six2, Zic1, Zic2, Otx2, Bmi1, CDX2, STAT3, Smad1, Smad2, smad2/3, smad4, smad5, 및/또는 smad7을 포함할 수 있는 줄기세포 마커를 발현한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 상당한 유모 세포 형성 이전에 이미 존재하는 지지 세포 집단의 줄기능(즉, 자가 재생)을 유지하거나 심지어 일시적으로 증가시키는데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서 이미 존재하는 지지 세포 집단은 속기둥 세포, 바깥 기둥 세포, 속손가락 세포, 다이테르 세포, 바깥경계 세포, 보에쳐 세포, 및/또는 클라우디우스 세포를 포함한다. 대표적인 현미경 샘플에 걸친 계통 추적 및 면역염색(세포 계수치 포함)을 사용한 형태학적 분석은 하나 이상의 이들 세포-유형에서 확장을 확인하는데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이미 존재하는 지지 세포는 Lgr5+ 세포를 포함한다. 면역염색(세포 계수치 포함) 및 qPCR과 RNA 혼성화를 사용한 형태학적 분석은 세포 집단 중에서 Lgr5 상향조절을 확인하는데 사용될 수 있다.
유리하게는, 본 개시내용의 방법은 유전자 조작을 사용하지 않고 이러한 목표를 달성한다. 많은 학문적 연구에 사용된 생식 계열 조작은 청력 손실을 치료하는데 치료학적으로 바람직한 접근법이 아니다. 일반적으로, 요법은 바람직하게는 유전자 요법이 동반되지 않는 소분자, 펩타이드, 항체, 또는 기타 비-핵산 분자 또는 핵산 전달 벡터의 투여를 포함한다. 특정 실시형태에서, 요법은 유기 소분자의 투여를 포함한다. 바람직하게는, 청력 보호 또는 회복은 중이에 주입되어 와우내로 확산되는 (비-유전자적) 치료제의 사용을 통해 달성된다.
와우는 모든 존재하는 세포 유형에 크게 의존하며, 이들 세포의 조직화는 이의 기능에 중요하다. 지지 세포가 신경전달물질 순환 및 와우 역학에 중요한 역할을 한다. 따라서, 코르티 기관 내부에서 로제트 패터닝을 유지하는 것이 기능에 중요할 수 있다. 기저막의 와우 역학은 유모 세포 형질도입을 활성화시킨다. 와우 역학의 높은 감도로 인해서, 대량의 세포를 회피하는 것이 또한 바람직할 수 있다. 결국, 증식 후에라도 기저막을 따르는 유모 세포 및 지지 세포의 적절한 분포 및 관계를 유지시키는 것은 지지 세포 기능으로서 청력에 바람직한 특징인 것으로 보이며, 적절한 역학은 정상 청력에 필요하다.
본 개시내용의 일 실시형태에서, 와우 세포 집단에서 유모 세포의 세포 밀도는 와우 상피에 특유한 로제트 패턴을 유지시키거나 심지어는 확립하는 방식으로 확장된다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 유모 세포의 세포 밀도는 유모 세포 및 지지 세포 둘 모두를 포함하는 와우 세포 집단에서 증가될 수 있다. 와우 세포 집단은 생체내 집단(즉, 대상체의 와우 상피에 의해 포함됨)일 수 있거나 와우 세포 집단은 시험관내(생체외) 집단일 수 있다. 집단이 시험관내 집단인 경우, 세포 밀도 증가는 임의의 처리 전 및 후에 취해진 집단의 대표적인 현미경 샘플을 참조하여 결정될 수 있다. 집단이 생체내 집단인 경우, 세포 밀도의 증가는 대상체의 청력에 대한 효과를 결정함으로써 간접적으로 측정될 수 있는데, 유모 세포 밀도 증가는 청력 개선과 상관관계가 있다.
일 실시형태에서, 신경 세포의 부재하에 줄기세포 증식 검정에 놓인 지지 세포는 리본 시냅스를 형성한다.
네이티브 와우에서, 유모 세포 및 지지 세포의 패터닝은 기저막과 평행한 방식으로 발생한다. 본 개시내용의 일 실시형태에서, 와우 세포 집단에서 지지 세포의 증식은 와우 상피에 특유한 기저막 방식으로 확장된다.
일 실시형태에서, 초기 와우 세포 집단에서 지지 세포의 수는 초기 와우 세포 집단을 본 명세서에 제공된 조성물로 처리함으로써 선택적으로 확장되어 중간 와우 세포 집단을 형성하며, 여기서 중간 와우 세포 집단에서 유모 세포에 대한 지지 세포의 비는 초기 와우 세포 집단에서 유모 세포에 대한 지지 세포의 비를 초과한다. 확장된 와우 세포 집단은 예를 들어, 생체내 집단, 시험관내 집단 또는 심지어 시험관내 외식편일 수 있다. 이러한 일 실시형태에서, 중간 와우 세포 집단에서 유모 세포에 대한 지지 세포의 비는 초기 와우 세포 집단에서 유모 세포에 대한 지지 세포의 비를 초과한다. 예를 들어, 이러한 일 실시형태에서, 중간 와우 세포 집단에서 유모 세포에 대한 지지 세포의 비는 초기 와우 세포 집단에서 유모 세포에 대한 지지 세포의 비를 1.1배만큼 초과한다. 추가 예의 방식에 의해서, 이러한 일 실시형태에서, 중간 와우 세포 집단에서 유모 세포에 대한 지지 세포의 비는 초기 와우 세포 집단에서 유모 세포에 대한 지지 세포의 비를 1.5배만큼 초과한다. 추가 예의 방식에 의해서, 이러한 일 실시형태에서, 중간 와우 세포 집단에서 유모 세포에 대한 지지 세포의 비는 초기 와우 세포 집단에서 유모 세포에 대한 지지 세포의 비를 2배만큼 초과한다. 추가 예의 방식에 의해서, 이러한 일 실시형태에서, 중간 와우 세포 집단에서 유모 세포에 대한 지지 세포의 비는 초기 와우 세포 집단에서 유모 세포에 대한 지지 세포의 비를 3배만큼 초과한다. 상기 실시형태 각각에서, 본 단락에 기술된 바와 같은 와우 세포 집단을 확장시키는, 본 개시내용의 조성물의 능력은 줄기세포 증식 검정에 의해서 결정될 수 있다.
일 실시형태에서, 와우 세포 집단에서 줄기세포의 수는 본 명세서에 제공된 조성물로 와우 세포 집단을 처리함으로써 확장되어 중간 와우 세포 집단을 형성하며, 여기서 중간 와우 세포 집단에서 줄기세포의 세포 밀도는 초기 와우 세포 집단에서 줄기세포의 세포 밀도를 초과한다. 처리된 와우 세포 집단은 예를 들어, 생체내 집단, 시험관내 집단 또는 심지어 시험관내 외식편일 수 있다. 이러한 일 실시형태에서, 처리된 와우 세포 집단에서 줄기세포의 세포 밀도는 초기 와우 세포 집단에서 줄기세포의 세포 밀도를 적어도 1.1배만큼 초과한다. 예를 들어, 이러한 일 실시형태에서, 처리된 와우 세포 집단에서 줄기세포의 세포 밀도는 초기 와우 세포 집단에서 줄기세포의 세포 밀도를 적어도 1.25배만큼 초과한다. 예를 들어, 이러한 일 실시형태에서, 처리된 와우 세포 집단에서 줄기세포의 세포 밀도는 초기 와우 세포 집단에서 줄기세포의 세포 밀도를 적어도 1.5배만큼 초과한다. 추가 예의 방식에 의해서, 이러한 일 실시형태에서, 처리된 와우 세포 집단에서 줄기세포의 세포 밀도는 초기 와우 세포 집단에서 줄기세포의 세포 밀도를 적어도 2배만큼 초과한다. 추가 예의 방식에 의해서, 이러한 일 실시형태에서, 처리된 와우 세포 집단에서 줄기세포의 세포 밀도는 초기 와우 세포 집단에서 줄기세포의 세포 밀도를 적어도 3배만큼 초과한다. 시험관내 와우 세포 집단은 생체내 집단보다 현저하게 더 많이 확장될 수 있고; 예를 들어, 특정 실시형태에서 줄기세포의 확장된 시험관내 집단에서 줄기세포의 세포 밀도는 초기 와우 세포 집단에서 줄기세포의 세포 밀도보다 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2,000 또는 심지어 3,000배 더 높을 수 있다. 상기 실시형태 각각에서, 본 단락에 기술된 바와 같은 와우 세포 집단을 확장시키는, 본 개시내용의 조성물의 능력은 줄기세포 증식 검정에 의해서 결정될 수 있다.
본 발명의 한 양상에 따르면, 와우 지지 세포 집단은 본 명세서에 제공된 조성물로 처리되어 집단의 Lgr5 활성도를 증가시킨다. 예를 들어, 일 실시형태에서 본 명세서에 제공된 조성물은 와우 지지 세포의 시험관내 집단의 Lgr5 활성도를 적어도 1.2배 증가시키고 유지시키는 능력을 갖는다. 추가 예의 방식에 의해서, 이러한 일 실시형태에서 화합물은 와우 지지 세포의 시험관내 집단의 Lgr5 활성도를 1.5배 증가시키는 능력을 갖는다. 추가 예의 방식에 의해서, 이러한 일 실시형태에서 화합물은 와우 지지 세포의 시험관내 집단의 Lgr5 활성도를 적어도 2, 3, 5, 10, 100, 500, 1,000, 2,000 또는 심지어 3,000배 증가시키는 능력을 갖는다. Lgr5 활성도의 증가는 또한 생체내 집단에서 관찰될 수 있으나, 관찰된 증가는 다소 더욱 완만할 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서 화합물은 와우 지지 세포의 생체내 집단의 Lgr5 활성도를 적어도 5% 증가시키는 능력을 갖는다. 추가 예의 방식에 의해서, 이러한 일 실시형태에서 화합물은 와우 지지 세포의 생체내 집단의 Lgr5 활성도를 적어도 10% 증가시키는 능력을 갖는다. 추가 예의 방식에 의해서, 이러한 일 실시형태에서 화합물은 와우 지지 세포의 생체내 집단의 Lgr5 활성도를 적어도 20% 증가시키는 능력을 갖는다. 추가 예의 방식에 의해서, 이러한 일 실시형태에서 화합물은 와우 지지 세포의 생체내 집단의 Lgr5 활성도를 적어도 30% 증가시키는 능력을 갖는다. 상기 실시형태 각각에서, Lgr5 활성도에서 이러한 증가를 위한 화합물의 능력은 예를 들어, 시험관내 Lgr5+ 활성도 검정에서 입증될 수 있고, 생체내 집단에서는 예를 들어, 생체내 Lgr5+ 활성도 검정에서 기관을 단리시키고, Lgr5(예를 들어, Lgr5, Sox2)의 면역염색, 내인성 형광 단백질 발현 및 Lgr5에 대한 qPCR을 사용하여 형태학적 분석을 수행함으로써 측정된 바와 같이 입증될 수 있다.
집단의 Lgr5 활성도를 증가시키는 것에 더하여, 와우 세포 집단에서 Lgr5+ 지지 세포의 수는 Lgr5+ 지지 세포(생체내이든 또는 시험관내이든)를 함유하는 와우 세포 집단을 본 명세서에 제공된 조성물로 처리함으로써 증가될 수 있다. 일반적으로, 줄기/전구체 지지 세포의 세포 밀도는 여러 기전 중 하나 이상을 통해 초기 세포 집단에 비해 확장될 수 있다. 예를 들어, 이러한 한 실시형태에서, 증가된 줄기세포 성향(즉, 유모 세포로 분화하는 더 큰 능력)을 갖는 새로 생성된 Lgr5+ 지지 세포가 생성될 수 있다. 추가의 예의 방식에 의해서, 이러한 일 실시형태에서, 딸 Lgr5+ 세포는 세포 분열에 의해서 생성되지 않지만, 이미 존재하는 Lgr5+ 지지 세포가 유모 세포로 분화되도록 유도된다. 추가 예의 방식에 의해서, 이러한 일 실시형태에서 딸 세포는 세포 분열에 의해 생성되지 않지만, Lgr5- 지지 세포는 더 높은 수준의 Lgr5 활성도로 활성화되고, 이어서 활성화된 지지 세포는 유모 세포로 분화될 수 있다. 기전과 무관하게, 일 실시형태에서, 본 개시내용의 화합물은 와우 지지 세포의 시험관내의 단리된 세포 집단 중의 Lgr5+ 지지 세포의 세포 밀도를 적어도 5배 증가시키는 능력을 갖는다. 추가 예의 방식에 의해서, 이러한 일 실시형태에서 화합물은 와우 지지 세포의 시험관내 집단 중의 Lgr5+ 지지 세포의 세포 밀도를 적어도 10배 증가시키는 능력을 갖는다. 추가 예의 방식에 의해서, 이러한 일 실시형태에서 화합물은 와우 지지 세포의 시험관내 집단 중의 Lgr5+ 지지 세포의 세포 밀도를 적어도 100배, 적어도 500배, 적어도 1,000배 또는 심지어는 적어도 2,000배 증가시키는 능력을 갖는다. Lgr5+ 지지 세포의 세포 밀도 증가는 또한 생체내 집단에 있어서 관찰될 수 있지만, 관찰된 증가는 다소 더욱 완만할 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서 화합물은 와우 지지 세포의 생체내 집단 중의 Lgr5+ 지지 세포의 세포 밀도를 적어도 5% 증가시키는 능력을 갖는다. 추가 예의 방식에 의해서, 이러한 일 실시형태에서 화합물은 와우 지지 세포의 생체내 집단 중의 Lgr5+ 지지 세포의 세포 밀도를 적어도 10% 증가시키는 능력을 갖는다. 추가 예의 방식에 의해서, 이러한 일 실시형태에서 화합물은 와우 지지 세포의 생체내 집단 중의 Lgr5+ 지지 세포의 세포 밀도를 적어도 20% 증가시키는 능력을 갖는다. 추가 예의 방식에 의해서, 이러한 일 실시형태에서 화합물은 와우 지지 세포의 생체내 집단 중의 Lgr5+ 지지 세포의 세포 밀도를 적어도 30% 증가시키는 능력을 갖는다. 시험관내 집단 중의 Lgr5+의 이러한 증가에 대한 화합물의 능력은 예를 들어, 줄기세포 증식 검정 또는 적절한 생체내 검정에서 입증될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 개시내용의 화합물은 네이티브 형태학을 유지하면서, 단백질이 부재하거나 낮은 검출 수준을 갖는 세포에서 Lgr5의 발현을 유도함으로써 와우에서 Lgr5+ 세포의 수를 증가시키는 능력을 갖는다. 일 실시형태에서, 본 개시내용의 화합물은 네이티브 형태학를 유지하고, 세포 응집물을 생성시키지 않으면서, 단백질이 부재하거나 낮은 검출 수준을 갖는 세포에서 Lgr5의 발현을 유도함으로써 와우에서 Lgr5+ 세포의 수를 증가시키는 능력을 갖는다.
Lgr5+ 지지 세포의 세포 밀도를 증가시키는 것에 더하여, 일 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 와우 세포 집단에서 유모 세포에 대한 Lgr5+ 세포의 비를 증가시키는 능력을 갖는다. 일 실시형태에서, 초기 와우 세포 집단 중의 Lgr5+ 지지 세포의 수는 초기 와우 세포 집단을 본 개시내용의 화합물로 처리함으로써 선택적으로 확장되어 확장된 세포 집단을 형성하며, 여기서 확장된 와우 세포 집단 중의 Lgr5+ 지지 세포의 수는 유모 세포의 수와 적어도 동일하다. 확장된 와우 세포 집단은 예를 들어, 생체내 집단, 시험관내 집단 또는 심지어 시험관내 외식편일 수 있다. 이러한 일 실시형태에서, 확장된 와우 세포 집단에서 Lgr5+ 지지 세포 대 유모 세포의 비는 적어도 1:1이다. 예를 들어, 이러한 일 실시형태에서, 확장된 와우 세포 집단에서 Lgr5+ 지지 세포 대 유모 세포의 비는 적어도 1.5:1이다. 추가 예의 방식에 의해서, 이러한 일 실시형태에서, 확장된 와우 세포 집단에서 Lgr5+ 지지 세포 대 유모 세포의 비는 적어도 2:1이다. 추가 예의 방식에 의해서, 이러한 일 실시형태에서, 확장된 와우 세포 집단에서 Lgr5+ 지지 세포 대 유모 세포의 비는 적어도 3:1이다. 추가 예의 방식에 의해서, 이러한 일 실시형태에서, 확장된 와우 세포 집단에서 Lgr5+ 지지 세포 대 유모 세포의 비는 적어도 4:1이다. 추가 예의 방식에 의해서, 이러한 일 실시형태에서, 확장된 와우 세포 집단에서 Lgr5+ 지지 세포 대 유모 세포의 비는 적어도 5:1이다. 상기 실시형태 각각에서, 본 단락에 기술된 바와 같은 와우 세포 집단을 확장시키는, 본 개시내용의 화합물의 능력은 줄기세포 증식 검정에 의해서 결정될 수 있다.
특정 실시형태에서, 방법은 감각 상피 상에서 전체 세포에 대한 Lgr5+ 세포의 분율을 적어도 10%, 20%, 50%, 100%, 250%, 500%, 1,000% 또는 5000% 증가시킨다.
특정 실시형태에서, 조성물은 Lgr5+ 세포가 감각 상피 예를 들어, 코르티 기관 상의 세포의 적어도 10, 20, 30, 50, 70 또는 85%가 될 때까지 Lgr5+ 세포를 증가시킨다.
일반적으로, 와우에서 지지 세포의 과도한 증식이 바람직하게는 회피된다. 일 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 와우의 네이티브 표면을 넘어서는 새로운 세포의 돌출부, 예를 들어, 세포 응집물을 생성하지 않으면서 와우 세포 집단을 확장시키는 능력을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 조성물을 정원 또는 난원 막에 위치시킨 후 30일에, 와우 조직은 네이티브 형태학을 갖는다. 일부 실시형태에서, 화합물을 정원 또는 난원 막에 위치시킨 후 30일에, 와우 조직은 네이티브 형태학을 가지며, 세포 응집물을 갖지 않는다. 일부 실시형태에서, 화합물을 정원 또는 난원 막에 위치시킨 후 30일에, 와우 조직은 네이티브 형태학을 가지며, 코르티 기관 내의 Lgr5+ 세포의 적어도 10, 20, 30, 50, 75, 90, 95, 98, 또는 심지어 적어도 99%는 세포 응집물의 일부가 아니다.
일반적으로, 지지 세포 집단, 및 구체적으로, 상기 기술된 바와 같은 Lgr5+ 지지 세포를 확장시키는 것에 더하여, 본 개시내용의 방법은 딸 세포에서 유모 세포로 분화되는 능력을 유지하는 능력을 갖는다. 생체내 집단에서, 이러한 능력 유지는 대상체의 청력 개선에 의해 간접적으로 관찰될 수 있다. 시험관내 집단에서, 이러한 능력의 유지는 출발 집단과 비교하여 유모 세포 수의 증가에 의해 직접적으로 관찰될 수 있거나 또는 LGR5 활성도, SOX2 활성도 또는 본 명세서의 다른 곳에서 식별된 하나 이상의 다른 줄기세포 마커를 측정함으로써 간접적으로 관찰될 수 있다.
일 실시형태에서, 일반적으로 와우 지지 세포의 집단, 또는 특히 Lgr5+ 지지 세포의 집단의 줄기능을 증가시키는 방법의 능력은 Lgr5 활성도 검정에 의해 결정되는 바와 같이 단리된 Lgr5+ 세포의 시험관내 집단의 Lgr5 활성도 증가와 상관관계가 있을 수 있다. 이미 언급된 바와 같이, 이러한 일 실시형태에서, 화합물은 중간 세포 집단 중의 줄기세포의 Lgr5 활성도를 초기 세포 집단 중의 세포의 Lgr5 활성도와 비교하여 평균 5배 증가시키는 능력을 갖는다. 추가 예의 방식에 의해서, 이러한 일 실시형태에서, 방법은 중간 세포 집단 중의 줄기세포 유전자의 Lgr5 활성도를 초기 세포 집단 중의 세포의 Lgr5 활성도와 비교하여 평균 10배 증가시키는 능력을 갖는다. 추가 예의 방식에 의해서, 이러한 일 실시형태에서, 방법은 중간 세포 집단 중의 줄기세포의 Lgr5 활성도를 초기 세포 집단 중의 세포의 Lgr5 활성도와 비교하여 평균 100배 증가시키는 능력을 갖는다. 추가 예의 방식에 의해서, 이러한 일 실시형태에서, 방법은 중간 세포 집단 중의 줄기세포의 Lgr5 활성도를 초기 세포 집단 중의 세포의 Lgr5 활성도와 비교하여 평균 1000배 증가시키는 능력을 갖는다. 상기 실시형태 각각에서, 세포 집단에서 줄기세포의 활성도 증가는 표적 유전자에 대한 면역염색 또는 내인성 형광 단백질 발현 및 영상화 분석 또는 유세포 분석법을 통한 이들의 상대적 강도 분석에 의해서 또는 표적 줄기세포 유전자에 대한 qPCR을 사용함으로써 시험관내에서 결정될 수 있다. 생성된 줄기세포 집단의 아이덴티티는 선택적으로, 줄기세포 검정에서 정의된 바와 같은, 줄기세포 마커 발현 검정을 포함하는 줄기세포 검정, 집락 형성 검정, 자가 재생 검정 및 분화 검정에 의해 추가로 결정될 수 있다.
일부 실시형태에서 성인 포유동물에 적용되는 방법은 S기에 있는 성인 포유동물 Lgr5+ 세포의 집단을 생성한다.
일 실시형태에서, 마우스의 정원 또는 난원에 본 명세서에 제공된 조성물을 적용한 후, 코르티 기관에서 세포 집단의 생체내 Lgr5+ 활성도는 화합물에 노출되지 않은 집단에 대한 기준선보다 1.3x, 1.5x, 최대 20x 증가한다. 일부 실시형태에서, 마우스의 정원 또는 난원에 대한 화합물 적용은 코르티 기관의 세포에 대해서 평균 생체내 Lgr5+ 활성도를 증가시키며, 이는 화합물에 노출되지 않은 집단에 대한 기준선보다 1.3x, 1.5x, 최대 20x 증가한다.
특정 실시형태에서, 방법은 Lgr5+ 세포 수가 지지 세포 집단의 적어도 10%, 7.5%, 10%, 최대 100%가 될 때까지 Lgr5+ 세포를 증가시킨다.
특정 실시형태에서, 화합물은 와우에서 Lgr5+ 세포의 백분율을 5%, 10%, 25%, 50%, 또는 80%만큼 증가시키는 능력을 갖는다.
특정 실시형태에서, 줄기세포 집단은 생체내 대상체이며, 방법은 청력 손실 및/또는 전정 기능장애에 대한 치료법이다 (예를 들어, 여기서 줄기세포의 확장된 집단으로부터 내이 유모 세포의 생성은 청력 손실의 부분적 또는 완전한 회복을 유도하고/거나 전정 기능을 개선시킨다). 특정 실시형태에서, 줄기세포 집단은 생체내 대상체이며, 방법은 (예를 들어, 청력 손실 및/또는 전정 기능장애와 관련되지 않은 질환 및/또는 장애의 치료를 위해) 대상체에 대한 약물의 공지된 안전한 최대 투여량 보다 높은 농도로 약물을 대상체에게 전달하는 것을 추가로 포함한다(예를 들어, 방법으로부터 발생한 내이 유모 세포의 생성의 부재 하에서 전달되는 경우 공지된 안전한 최대 투여량)(예를 들어, 약물의 용량-제한 귀독성의 감소 또는 제거로 인해서).
특정 실시형태에서, 방법은 생성된 내이 유모 세포를 사용하여 고처리량 스크리닝을 수행하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 방법은 생성된 내이 유모 세포를 사용하여 내이 유모 세포에 대한 독성에 대해서 분자를 스크리닝하는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, 방법은 생성된 내이 유모 세포를 사용하여 내이 유모 세포(예를 들어, 상기 분자에 노출된 내이 유모 세포)의 생존을 개선시키는 능력에 대해 분자를 스크리닝하는 것을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 줄기세포의 확장된 집단을 생성하는 방법이며, 이 방법은 줄기세포 집단(예를 들어, 시험관내, 생체외 또는 시험관내 샘플/대상체)에게 본 명세서에 제공된 조성물을 투여하거나 또는 이의 투여를 유발하는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 투여 단계는 귀 내로의(예를 들어, 경고막에 의해서 중이 및/또는 내이내로의) 1회 이상의 주사를 수행함으로써 수행된다.
특정 실시형태에서, 투여 단계는 GSK3-베타 저해제 및/또는 Wnt 효능제를 지속형 방식으로 투여하는 것을 포함한다.
특정 실시형태에서, 줄기세포는 내이 줄기세포 및/또는 지지 세포이다.
특정 실시형태에서, 방법은 줄기세포의 생성된 확장된 집단을 사용하여 고처리량 스크리닝을 수행하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 방법은 생성된 줄기세포를 사용하여 줄기세포 및/또는 이들의 자손에 대한 독성에 대해서 분자를 스크리닝하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 방법은 생성된 줄기세포를 사용하여 줄기세포 및/또는 이의 자손의 생존을 개선시키는 능력에 대해 분자를 스크리닝하는 것을 추가로 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 청력 손실 및/또는 전정 기능장애를 갖거나 이것이 발생할 위험이 있는 대상체를 치료하는 방법이며, 이 방법은 청력 손실 및/또는 전정 기능장애를 경험했거나 이것이 발생할 위험이 있는 대상체를 식별하는 단계, 본 명세서에 제공된 조성물을 투여하거나 또는 이의 투여를 유발하는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 줄기세포 집단은 Lgr5+ 세포를 포함한다. 특정 실시형태에서, 줄기세포 집단은 생후 세포를 포함한다. 특정 실시형태에서, 줄기세포 집단은 상피 줄기세포를 포함한다. 특정 실시형태에서, 줄기세포는 전구체 세포를 포함한다.
특정 실시형태에서, 투여 단계는 귀 내로의(예를 들어, 경고막에 의해서 중이 및/또는 내이내로의) 1회 이상의 주사를 수행함으로써 수행된다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 내이 유모 세포를 생성시키는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 (예를 들어, 시험관내, 생체외 또는 생체내 샘플/대상체의) 초기 줄기세포 집단에서 줄기세포를 증식시켜, 줄기세포의 확장된 집단을 생성시키는 단계(예를 들어, 확장된 집단이 초기 줄기세포 집단보다 적어도 1.25, 1.5, 1.75, 2, 3, 5, 10, 또는 20배 크도록); 및 줄기세포의 확장된 집단으로부터 내이 유모 세포의 생성을 촉진시키는 단계를 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 내이 유모 세포를 생성시키는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 본 명세서에 제공된 조성물(예를 들어, 약제학적으로 허용 가능한 형태(예를 들어, 염)로)을 대상체의 내이내의 세포 집단에 투여함으로써, 내이 유모 세포의 생성을 촉진시키는 단계를 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 내이 유모 세포를 생성시키는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 (예를 들어, 시험관내, 생체외 또는 생체내 샘플/대상체의) 초기 집단에서 생후 LGR5+ 세포를 증식시켜, LGR5+ 세포의 확장된 집단을 생성시키는 단계(예를 들어, 확장된 집단이 초기 줄기세포 집단보다 적어도 1.25, 1.5, 1.75, 2, 3, 5, 10, 또는 20배 크도록)를 포함하며, LGR5+ 세포의 상기 확장된 집단은 내이 유모 세포를 생성을 초래한다. 특정 실시형태에서, 줄기세포는 전구체 세포를 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 개시내용은 질환 또는 장애를 치료하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 대상체(생체내)의 초기 집단에서 생후 Lgr5+ 상피 세포를 증식시켜, Lgr5+ 상피 세포의 확장된 집단을 생성시키는 단계(예를 들어, 확장된 집단이 초기 생후 Lgr5+ 상피 세포 집단보다 적어도 1.25, 1.5, 1.75, 2, 3, 5, 10 또는 20배 크도록)를 포함한다.
일부 실시형태에서, Lgr5+ 세포는 유모 세포로 분화된다.
유모 세포 재성장
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 내이 유모 세포의 생성을 가능하게 하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 본 개시내용의 화합물을 투여하여 와우 조직의 줄기세포 집단을 확장시키는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 내이 유모 세포의 생성을 가능하게 하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 본 개시내용의 화합물 및 HDAC 저해제를 포함하는 조성물을 투여하여 와우 조직의 줄기세포 집단을 확장시키는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 포유동물에서 청력을 재생시키는 방법에 관한 것이다.
특정 실시형태에서, 줄기세포 집단은 생체내 대상체이며, 방법은 청력 손실 및/또는 전정 기능장애에 대한 치료법이다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 화합물을 사용하여 내이 유모 세포를 생성시켜 생체내에서 초기 집단에서 LGR5+ 세포를 증식시켜, LGR5+ 세포의 확장된 집단을 생성시켜(예를 들어, 확장된 집단이 초기 줄기세포 집단보다 적어도 2배, 3배, 5배, 10배, 또는 20배 크도록), 내이 유모 세포를 생성시키는 방법에 관한 것이다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 화합물 및 HDAC 저해제를 포함하는 조성물을 사용하여 내이 유모 세포를 생성시켜 생체내에서 초기 집단에서 LGR5+ 세포를 증식시켜, LGR5+ 세포의 확장된 집단을 생성시켜(예를 들어, 확장된 집단이 초기 줄기세포 집단보다 적어도 2배, 3배, 5배, 10배, 또는 20배 크도록), 내이 유모 세포를 생성시키는 방법에 관한 것이다.
장 재생
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 장 세포의 생성을 가능하게 하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 본 개시내용의 화합물을 투여하여 장 상피의 줄기세포 집단을 확장시키는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 장 세포의 생성을 가능하게 하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 본 개시내용의 화합물 및 HDAC 저해제를 포함하는 조성물을 투여하여 장 상피의 줄기세포 집단을 확장시키는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 포유동물에서 장 상피를 재생시키는 방법에 관한 것이다.
특정 실시형태에서, 줄기세포 집단은 생체내 대상체이다. 특정 실시형태에서, 방법은 질환, 예컨대, 화학요법-유도된 위장 점막염, 이식편대숙주병, 위궤양, 크론 또는 궤양성 대장염과 관련된 손상된 점막의 수선을 촉진시키기 위한 치료이다.
장 Lgr5+ 증식
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 장 세포의 생성을 가능하게 하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 본 개시내용의 화합물을 투여하여 장 상피의 Lgr5+ 세포 집단을 확장시키는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 장 세포의 생성을 가능하게 하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 본 개시내용의 화합물 및 HDAC 저해제를 포함하는 조성물을 투여하여 장 상피의 Lgr5+ 세포 집단을 확장시키는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 포유동물에서 Lgr5+ 세포 집단 장 세포를 재생시키는 방법에 관한 것이다.
특정 실시형태에서, Lgr5+ 세포 집단은 생체내 대상체이다. 특정 실시형태에서, 방법은 질환, 예컨대, 화학요법-유도된 위장 점막염, 이식편대숙주병, 위궤양, 크론 또는 궤양성 대장염과 관련된 손상된 점막의 수선을 촉진시키기 위한 치료이다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 질환 또는 장애를 치료하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 생체내에서 Lgr5+ 상피 세포를 증식시켜, Lgr5+ 상피 세포의 확장된 집단을 생성시키는 단계(예를 들어, 확장된 집단이 초기 생후 Lgr5+ 상피 세포 집단보다 적어도 2배, 3배, 5배, 10배, 또는 20배 크도록)를 포함한다.
전정 세포의 집단의 확장
특정 실시형태에서, 약제학적 제형은 진정 조직을 접촉시키는 것을 포함하는, 진정 조직에서 진정 세포의 집단을 확장시킬 수 있다. 특정 실시형태에서, 약제학적 제형은 줄기세포 증식 검정에서, 줄기세포 증식 검정 세포 집단 내의 지지 세포의 수를 적어도 10배 또는 적어도 50배 증가시킬 수 있다. 특정 실시형태에서, 약제학적 제형은 줄기세포 분화 검정에서, 진정 지지 세포를 포함하는 세포 집단으로부터 유모세포를 형성할 수 있다.
특정 실시형태에서, 전정 조직은 네이티브 형상을 유지한다. 특정 실시형태에서, 전정 조직은 대상체 내에 존재한다. 특정 실시형태에서, 전정 조직을 조성물과 접촉시키는 단계는 조성물을 대상체에게 경고막으로 투여함으로써 달성된다. 특정 실시형태에서, 전정 조직을 조성물과 접촉시키는 단계는 대상체의 개선된 전정 기능을 초래한다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 특정 조직 세포의 부재 또는 결핍과 연관된 질환을 갖거나 또는 상기 질환의 발생 위험이 있는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 상기 대상체에게 본 개시내용의 화합물을 투여하거나 또는 투여를 유발하는 단계를 포함한다.
특정 실시형태에서, 화합물은 생체 적합성 매트릭스 중에 분산된다. 특정 실시형태에서, 생체 적합성 매트릭스는 생체 적합성 젤 또는 폼이다. 특정 실시형태에서, 화합물은 대상체의 전정 조직에 경고막으로 투여된다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 전정 조직에서 전정 세포의 집단을 확장시키는 방법을 제공하며, 이 방법은 전정 조직을 (i) 본 개시내용의 화합물 및 (ii) TGF-β 저해제와 접촉시켜 전정 조직에서 세포의 확장된 집단을 형성하는 단계를 포함한다.
모유두 세포(Dermal Papilla Cell)의 생성
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 모유두 세포의 생성을 가능하게 하는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 본 개시내용의 화합물을 단독으로 또는 BMP 저해제와 조합하여 투여하여, 모유두 세포의 집단을 확장시키는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 화합물은 포유동물에서 모발을 재생시킬 수 있다. 특정 실시형태에서, 모유두 세포 집단은 생체내 대상체이다. 특정 실시형태에서, 모유두 세포 집단은 탈모의 치료를 위한 생체내 대상체이다. 특정 실시형태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 화합물을 단독으로 또는 BMP 저해제와 조합하여 사용하여 모유두 세포를 생성시켜 생체내에서 초기 집단에서 모유두 세포를 증식시킴으로써, 모유두 세포의 확장된 집단을 초래하는 방법을 제공한다.
투여
정원 또는 난원의 막은 내이 공간에 대한 생물학적 장벽이며, 청력 손상의 국소 치료를 위한 주요 장애물을 대표한다. 투여된 약물은 내이 공간에 도달하기 위해서 이러한 막을 극복해야 한다. 약물은 수술에 의해(예를 들어, 고막을 통한 주사) 정원 또는 난원 막에 국소적으로 배치될 수 있고, 이어서 정원 또는 난원 막을 통해서 관통할 수 있다. 정원 또는 난원을 관통하는 물질은 전형적으로 외림프에 분포되고 따라서 유모 세포 및 지지 세포에 도달한다.
특정 실시형태에서, 약학적 제형은 약물을 정원 또는 난원 막에 국소 투여하기에 적합하다. 약학적 제형은 또한 막 침투 증강제를 함유할 수 있으며, 이는 본 명세서에 언급된 작용제가 정원 또는 난원 막을 통하여 통과하는 것을 지지한다. 따라서, 액체, 겔 또는 폼 제형이 사용될 수 있다. 또한, 경구로 활성 성분을 적용하거나 또는 전달 접근법의 조합을 사용하는 것이 가능하다.
귀에 대한 약물의 고막내(IT) 전달은 임상 목적 및 연구 목적 둘 모두를 위해서 점점 더 사용된다. 일부 그룹은 마이크로카테터 및 마이크로심지를 사용하여 지속형 방식으로 약물을 적용하는 반면, 대부분은 이들을 단일 또는 반복된 IT 주사(최대 2주의 기간에 걸친 최대 8회 주입)으로서 적용하였다.
고막내로 적용된 약물은 정원 또는 난원(RW) 막을 가로질러 주로 내이의 유체로 유입된다고 생각된다. 계산은 귀로 들어가는 약물의 양 및 귀의 길이에 따른 약물의 분포 둘 모두를 제어하는 주요 인자가 중이 공간에 약물이 잔류하는 기간임을 보여준다. 단일 '원-샷' 적용 또는 수 시간의 기간 동안 수성 용액의 적용은 와우 길이에 따라 적용된 물질에 대한 급격한 약물 구배 및 와우의 기저 회전부에서 급격하게 감소하는 농도를 유발하는데, 이는 약물이 후속하여 귀 전체에 걸쳐 분포되기 때문이다.
다른 주사 방법은 삼투 펌프에 의한 것, 또는 이식된 생물질과의 조합에 의한 것 그리고 보다 바람직하게는 주사 또는 주입에 의한 것을 포함한다. 약물의 제어된 방출 동역학 및 분포를 보조할 수 있는 생물질은 하이드로젤 물질, 분해 가능한 물질을 포함한다. 가장 바람직하게는 사용되는 물질 중 한 부류는 동일계내 젤화 물질을 포함한다. 다른 물질은 콜라겐 또는 피브린, 젤라틴 및 탈세포화된 조직을 비롯한 다른 천연 물질을 포함한다. 젤폼이 또한 적합할 수 있다.
전달은 또한 침투 증강제와 같은, 전달되는 조성물에 첨가되는 작용제를 비제한적으로 포함하는 대안적인 수단을 통해서 향상될 수 있거나, 또는 초음파, 전기천공 또는 고속 제트를 통한 장치를 통해서일 수 있다.
본 명세서에 기술된 방법은 또한, PCT 출원 제WO2012103012 A1호에 기술된 그러한 세포 유형을 포함하는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 방법을 사용하여 생성될 수 있는 내이 세포 유형을 위해서 사용될 수 있다.
인간 및 수의학 치료와 관련하여, 투여되는 특정 작용제(들)의 양은 치료하고자 하는 장애 및 장애의 중증도; 사용되는 특정 작용제(들)의 활성도; 환자의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식이; 투여 시간, 투여 경로, 및 사용된 특정 작용제(들)의 배설률; 치료 기간; 사용되는 특정 작용제(들)와 조합되거나 동시에 사용되는 약물; 처방 의사 또는 수의사의 판단; 및 의학 및 수의학 분야에서 공지된 다른 인자를 포함하는 다양한 인자에 좌우될 수 있다.
본 명세서에 기술된 작용제는 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료적 유효량으로 투여될 수 있다. 본 명세서에 기술된 화합물의 투여는 임의의 적합한 투여 경로, 특히 고막내에 의해서 일 수 있다. 다른 경로는 소화, 또는 대안적으로 비경구, 예를 들어, 정맥내, 동맥내, 복강내, 경막내, 심실내, 요도내, 흉골내, 두개내, 근육내, 비내, 피하, 설하, 경피 또는 흡입 또는 취입, 또는 외이도 피부 및 고막의 막을 통한 흡수를 위한 귀 점적주입에 의한 국소적인 것을 포함한다. 이러한 투여는 단일 또는 다중 경구 용량, 규정된 수의 귀 점적, 또는 볼러스 주사, 다중 주사 또는 단기간 또는 장기간 주입일 수 있다. 동일하거나 다양한 투여량의 특정 제형의 시간에 걸친 주기적인 비경구 전달을 위해서 이식 가능한 장치(예를 들어, 이식 가능한 주입 펌프)가 또한 사용될 수 있다. 이러한 비경구 투여의 경우, 화합물은 바람직하게는 물 또는 또 다른 적합한 용매 또는 용매의 혼합물 중의 멸균 용액으로서 제형화된다. 용액은 혈액과의 등장성인 용액을 만들기 위해서, 다른 물질, 예컨대, 염, 당류(특히, 글루코스 또는 만니톨), 완충제, 예컨대, 아세트산, 시트르산 및/또는 인산 및 이들의 나트륨염, 및 보존제를 함유할 수 있다.
본 명세서에 기술된 화합물은 화합물을 내이에 전달하기에 충분한 다수의 방법에 의해서 투여될 수 있다. 내이에 대한 화합물의 전달은 화합물이 정원 또는 난원을 가로질러 내이로 확산될 수 있도록 화합물을 중이에 투여하는 것 및 정원 또는 난원 막을 통한 직접 주사에 의해서 화합물을 내이에 투여하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 귓바퀴 투여, 경고막 심지 또는 카테터, 또는 비경구 투여, 예를 들어, 귓바퀴 내, 경고막, 또는 와우내 주사를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 화합물, 조성물 및 제형은 국소적으로 투여되며, 이는 이들이 전신으로 투여되지 않음을 의미한다.
일 실시형태에서, 주사기 및 바늘 장치는 귓바퀴 투여를 사용하여 화합물 또는 조성물을 대상체에게 투여하는데 사용된다. 적합한 크기의 바늘이 고막을 관통하는 데 사용되며, 조성물을 포함하는 심지 또는 카테터가 관통된 고막을 통해 대상체의 중이 내로 삽입된다. 장치는 정원 또는 난원과 접촉되거나 정원 또는 난원 바로 옆에 위치하도록 삽입될 수 있다. 귓바퀴 투여에 사용되는 예시적 장치는 경고막 심지, 경고막 카테터, 정원 또는 난원 마이크로카테터(의약을 정원 또는 난원에 전달하는 작은 카테터), 및 Silverstein Microwicks(상표명)(튜브를 통과하여 정원 또는 난원에 대한 "심지"를 갖는 작은 튜브, 이는 대상체 또는 의료 전문가에 의한 조절을 허용함)을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
또 다른 실시형태에서, 주사기 및 바늘 장치는 중이 및/또는 내이로의 경고막 주사, 고막 뒤 주사를 사용하여 대상체에게 화합물 또는 조성물을 투여하는데 사용된다. 제형은 경고막 주사를 통해서 정원 또는 난원 막 상에 직접적으로 투여될 수 있거나 도는 와우내 주사를 통해 와우로 직접 또는 전정내 주사를 통해 전정 기관으로 직접 투여될 수 있다.
일부 실시형태에서, 전달 장치는 중이 및/또는 내이에 화합물 또는 조성물이 투여되도록 설계된 장치이다. 단지 예의 방식으로: 지러스 메디컬 게엠베하(GYRUS Medical GmbH)는 정원 또는 난원 니치의 가시화 및 이에 대한 약물 전달을 위한 마이크로-검이경을 제공하고; 아렌버그(Arenberg)는 미국 특허 제5,421,818호; 제5,474,529호; 및 제5,476,446호에서 내부 귀 구조로 유체를 전달하기 위한 의학적 치료 장치를 기술하며, 이들 각각은 이러한 개시내용을 위해서 포함된다. 이러한 개시내용을 위한 참조로서 본 명세서에 포함된 미국 특허 출원 일련 번호 제08/874,208호는 내이로 조성물을 전달하기 위한 유체 전달 도관을 이식하기 위한 수술 방법을 기술한다. 이러한 개시내용을 위한 참조로서 본 명세서에 포함된 미국 특허 출원 공개 제2007/0167918호는 경고막 유체 샘플링 및 의약 적용을 위한 조합된 귀 흡인기 및 의약 분배기를 추가로 기술한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에게 1회 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에게 1회를 초과하게 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 조성물의 제1 투여 이후에 본 명세서에 제공된 조성물의 제2, 제3, 제4 또는 제5 투여가 이어진다.
화합물이 이를 필요로 하는 대상체에 투여되는 횟수는 의료 전문가의 재량, 장애, 장애의 중증도 및 제형에 대한 대상체의 반응에 좌우된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 화합물은 이를 필요로 하는 경증 급성 병태를 갖는 대상체에 1회 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 화합물은 이를 필요로 하는 중등도 또는 중증의 급성 병태를 갖는 대상체에 1회 초과로 투여된다. 대상체의 병태가 개선되지 않는 경우, 의사의 재량에 따라, 화합물은 대상체의 질환 또는 병태의 증상을 완화시키거나 달리 제어하거나 제한하기 위해서 만성적으로, 즉 대상체의 삶의 기간 전체를 비롯한 연장된 기간 동안 투여될 수 있다.
대상체의 상태가 개선되는 경우, 의사의 재량에 따라, 화합물은 연속적으로 투여될 수 있으며; 대안적으로, 투여될 약물의 용량이 특정 시간 기간 동안 일시적으로 감소되거나 일시적으로 중단될 수 있다(즉, "휴약기"). 휴약기의 기간은 단지 예로서, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 12일, 15일, 20일, 28일, 35일, 50일, 70일, 100일, 120일, 150일, 180일, 200일, 250일, 280일, 300일, 320일, 350일 및 365일을 비롯하여, 2일 내지 1년의 사이에서 다양하다. 휴약기 동안 용량 감소는 단지 예로서, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 및 100%를 비롯하여 10% 내지 100%일 수 있다.
대상체의 청력 및/또는 균형이 개선되면, 유지 용량이 필요에 따라 투여될 수 있다. 후속적으로, 투여량 또는 투여 빈도 또는 이들 둘 모두는 선택적으로 증상의 함수로서 개선된 질환, 장애 또는 병태가 유지되는 수준으로 감소된다. 특정 실시형태에서, 대상체는 임의의 증상 재발 시 장기간에 걸쳐 간헐적 치료를 필요로 한다.
특정 실시형태에서, 약제학적 제형은 또한 노치 활성화제, HDAC 저해제, BMP4 길항제, Noggin(BMP4를 저해함), Sox2, 비타민 D(칼시트라이올), 비타민 B(니코티노마이드), 비타민 A, 비타민 C(pVc), Lgr4, p38/MAPK 저해제, ROCK 저해제 및/또는 Alk4/7 저해제로부터 선택된 추가 작용제를 함유할 수 있다. 특정 실시형태에서, 약제학적 제형은 또한 표피 성장 인자(EGF), 섬유모세포 성장 인자(FGF), 인슐린-유사 성장 인자(IGF), 또는 이들의 조합물을 함유할 수 있다.
HDAC를 갖는 조성물
특정 실시형태에서, 약제학적 제형은 HDAC를 또한 함유할 수 있다. 특정 실시형태에서, HDAC를 함유하는 약제학적 제형은 Lgr5+ 세포의 형성을 향상시키거나, 분화를 제어하거나, 줄기능 및 복제를 제어하거나, 청력 및 장 재생을 회복시킬 수 있다.
특정 실시형태에서, HDAC 저해제는 발프로산 또는 이의 전구약물, 에스터, 염 형태 또는 아마이드이다.
특정 실시형태에서, HDAC 저해제는 카복실산 함유 화합물이다. 특정 실시형태에서, 카복실산 함유 화합물은 C6-C20 카복실산이고, 여기서 카복실산은 알킬, 알켄일, 또는 알킨일을 포함한다.
특정 실시형태에서, 카복실산 함유 화합물은 치환된 또는 비치환된 C5-C20 직쇄형, 분지쇄형 또는 환식쇄형 알킬-CO2H, 치환된 또는 비치환된 C5-C20 직쇄형, 분지쇄형 또는 환식쇄형 알켄일-CO2H 및 치환된 또는 비치환된 C5-C20 직쇄형, 분지쇄형, 또눈 환식쇄형 알킨일-CO2H이다. 특정 실시형태에서, 카복실산 함유 화합물은 치환된 C5-C20 직쇄형 또는 분지쇄형 알킬-CO2H이다.
특정 실시형태에서, 카복실산 함유 화합물은 치환된 C5-C20 직쇄형 또는 분지쇄형 알킬-CO2H이고, 여기서 치환체는 -NH2이다. 특정 실시형태에서, 카복실산 함유 화합물은 아미노 치환된 2-프로필펜탄산이다. 특정 실시형태에서, 아미노 치환된 2-프로필펜탄산은 5-아미노-2-프로필펜탄산, 4-아미노-2-프로필펜탄산, 3-아미노-2-프로필펜탄산, 및 2-아미노-2-프로필펜탄산으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 카복실산 함유 화합물은 비치환된 C5-C20 직쇄형 또는 분지쇄형 알킬-CO2H이다. 특정 실시형태에서, 카복실산 함유 화합물은 비치환된 C6-C9 분지화된 직쇄형 알킬-CO2H이다. 특정 실시형태에서, 카복실산 함유 화합물은 비치환된 C8-C9 분지화된 직쇄형 알킬-CO2H이다. 특정 실시형태에서, 카복실산 함유 화합물은 비치환된 C8 분지화된 직쇄형 알킬-CO2H이다.
특정 실시형태에서, 카복실산 함유 화합물은 발프로산이다.
특정 실시형태에서, 카복실산 함유 화합물은 비치환된 C8 분지화된 직쇄형 알킬-CO2H의 전구약물의 형태로 존재하며, 여기서 전구약물은 아마이드 또는 에스터의 형태로 존재한다. 특정 실시형태에서, 비치환된 C8 분지화된 직쇄형 알킬-CO2H의 아마이드는 아미노산과의 축합 생성물이다. 특정 실시형태에서, 발프로산의 아마이드는
Figure pct00105
으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, HDAC 저해제는 표 1에 열거된 저해제 중 임의의 하나이다.
Figure pct00106
Figure pct00107
Figure pct00108
Figure pct00109
본 명세서에 개시된 조성물 및 방법의 다양한 실시형태에서 사용하기 위한 HDAC 저해제의 부류는 표 1의 칼럼 A에 열거된 것을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법의 다양한 실시형태에서 사용하기 위한 구체적인 HDAC 저해제는 표 1의 칼럼 B에 열거된 것을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 표 1 칼럼 B에 열거된 모든 작용제는 이의 유도체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 것으로 이해된다. 표 1 칼럼 A에 열거된 모든 부류는 그 부류를 포함하는 모든 작용제 및 이의 유도체 또는 약제학적으로 허용 가능한 염 둘 모두를 포함하는 것으로 이해된다.
특정 실시형태에서, 카복실산 함유 화합물의 양은 적어도 2wt%(카복실산 함유 화합물 중량/약제학적 조성물 중량) 내지 20wt%이다. 특정 실시형태에서, 조성물은 적어도 4wt%의 카복실산을 포함한다. 특정 실시형태에서, 조성물은 적어도 8wt%의 카복실산을 포함한다. 특정 실시형태에서, 조성물은 적어도 12wt%의 카복실산을 포함한다. 특정 실시형태에서, 조성물은 적어도 16wt%의 카복실산을 포함한다. 특정 실시형태에서, 조성물은 적어도 20wt%의 카복실산을 포함한다.
BMP 저해제를 갖는 조성물
특정 실시형태에서, 약제학적 제형은 BMP 저해제를 또한 함유할 수 있다. BMP 저해제의 예는 본 명세서에 나타나 있다. 다른 예는 국제 특허 제WO2014138088A1호 및 제WO2016054406A1호에 기술되어 있고, 이들은 이들의 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.
Figure pct00110
TGF-베타 저해제를 갖는 조성물
특정 실시형태에서, 약제학적 제형은 TGF-베타 저해제를 또한 함유할 수 있다. 특정 실시형태에서, TGF-베타 저해제를 함유하는 약제학적 제형은 전정 조직을 접촉시키는 것을 포함하는, 전정 조직에서 전정 세포의 집단을 확장시킬 수 있다. 특정 실시형태에서, TGF-베타 저해제를 함유하는 약제학적 제형은 줄기세포 증식 검정에서, 줄기세포 증식 검정 세포 집단 내의 지지 세포의 수를 적어도 10배 또는 적어도 50배 증가시킬 수 있다. 특정 실시형태에서, TGF-베타 저해제를 함유하는 약제학적 제형은 줄기세포 분화 검정에서, 전정 지지 세포를 포함하는 세포 집단으로부터 유모세포를 형성할 수 있다.
일 실시형태에서, TGF-베타 저해제는 616452(렙속스(Repsox)), 갈루니서팁(Galunisertib)(LY2157299), EW-719, IN-1130, EW-7203, EW-7195, SM16, R 268712, GW788388 및 PF-03671148로부터 선택된다.
예시적인 TGF-β 저해제를 표 2에 나타낸다. TGF-베타 타입 I 수용체 저해제는 2-(3-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일)-1,5 나프트티리딘, [3-(피리딘-2-일)-4-(4-퀴노일)]-1H-피라졸, 및 3-(6-메틸피리딘-2-일)-4-(4-퀴놀릴)-1-페닐티오카바모일-1H-피라졸을 포함하지만 이들로 제한되지 않으며, 이것은 칼바이오켐(Calbiochem)(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)으로부터 구매될 수 있다. 다른 소분자 저해제는 특히 SB-431542(예를 들어, 문헌[Halder et al., 2005; Neoplasia 7(5):509-521] 참고), SM16(예를 들어, 문헌[Fu, K et al., 2008; Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology 28(4):665] 참고), 및 SB-505124(예를 들어, 문헌[Dacosta Byfield, S., et al., 2004; Molecular Pharmacology 65:744-52] 참고)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
Figure pct00111
Figure pct00112
Figure pct00113
Figure pct00114
Figure pct00115
Figure pct00116
Figure pct00117
폴록사머를 갖는 조성물
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 a) 본 개시내용의 화합물 및 b) 폴록사머를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
특정 실시형태에서, 약제학적 조성물의 pH는 약 5 내지 약 9이다. 특정 실시형태에서, 약제학적 조성물의 pH는 약 5, 6, 7, 8 또는 9이다.
특정 실시형태에서, 폴록사머의 본재 하에서의 화합물의 용해도는 폴록사머의 부재 하에서 동일한 pH에서 화합물의 용해도보다 약 3배 더 높다. 특정 실시형태에서, 폴록사머의 본재 하에서의 화합물의 용해도는 폴록사머의 부재 하에서 동일한 pH에서 화합물의 용해도보다 약 2, 3, 4 또는 5배 더 높다.
특정 실시형태에서, 약제학적 제형은 폴록사머를 또한 함유할 수 있다. 폴록사머는 폴리옥시에틸렌(폴리(에틸렌 옥사이드))의 2개의 친수성 쇄가 측면에 배치된 폴리옥시프로필렌(폴리(프로필렌 옥사이드))의 중심 소수성 쇄로 구성된 비이온성 삼블록 공중합체이다. 폴록사머는 종종 "기능성 부형제"로서 간주되는데, 그 이유는 필수 구성성분이고, 제형에서 중요한 역할을 한다.
일부 실시형태에서, 폴록사머는 폴록사머 124, 폴록사머 188, 폴록사머 237, 폴록사머 338 또는 폴록사머 407 중 적어도 1종을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴록사머는 폴록사머 124, 폴록사머 188, 폴록사머 237, 폴록사머 338 또는 폴록사머 407 중 2종 이상의 혼합물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 2종 이상의 폴록사머의 혼합물은 폴록사머 407 및 폴록사머 124를 포함한다. 또 다른 실시형태에서 폴록사머는 폴록사머 188 및 폴록사머 407 또는 이들의 혼합물 중 적어도 1종을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴록사머는 폴록사머 407이다.
일부 실시형태에서, 폴록사머는 조성물에 대해서 약 5wt% 내지 약 25wt%의 농도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 폴록사머는 조성물에 대해서 약 10wt% 내지 약 23wt%의 농도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 폴록사머는 조성물에 대해서 약 15wt% 내지 약 20wt%의 농도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 폴록사머는 조성물에 대해서 대략적으로 17wt%의 농도로 존재한다. 일부 실시형태에서, 폴록사머는 조성물에 대해서 대략적으로 21wt%의 농도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 폴록사머는 조성물에 대해서 21wt% 내지 40wt%의 농도로 존재할 수 있다. 또 다른 실시형태에서 폴록사머는 조성물에 대해서 21wt% 내지 30wt%의 농도로 존재한다. 또 다른 실시형태에서 폴록사머는 조성물에 대해서 23wt% 내지 29wt%의 농도로 존재한다. 또 다른 실시형태에서 폴록사머는 조성물에 대해서 23wt% 내지 27wt%의 농도로 존재한다. 또 다른 실시형태에서 폴록사머는 조성물에 대해서 25wt%의 농도로 존재한다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물의 젤화 온도는 약 10℃ 초과이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물의 젤화 온도는 약 11℃ 내지 약 32℃이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물의 젤화 온도는 약 15℃ 내지 약 30℃이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물의 젤화 온도는 약 20℃ 내지 약 28℃이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물의 젤화 온도는 약 24℃ 내지 약 26℃이다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물의 젤화 온도는 약 15℃이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물의 젤화 온도는 약 20℃이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물의 젤화 온도는 약 24℃이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물의 젤화 온도는 약 26℃이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물의 젤화 온도는 약 28℃이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물의 젤화 온도는 약 30℃이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물의 젤화 온도는 약 32℃이다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 10℃ 초과의 젤화 온도를 갖는 약제학적 조성물을 제공하며, 이 조성물은 a) 본 개시내용의 약제학적 활성 화합물; b) 약제학적 조성물의 21wt% 이상의 폴록사머; 및 c) HDAC 저해제를 포함하며; 약제학적 조성물은 10℃ 초과의 젤화 온도를 갖는다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용은 10℃ 초과의 젤화 온도를 갖는 약제학적 조성물을 제공하며, 이 조성물은 a) 본 개시내용의 약제학적 활성 화합물; b) 약제학적 조성물의 21wt% 이상의 폴록사머; 및 c) 카복실산 함유 화합물을 포함하며; 약제학적 조성물은 10℃ 초과의 젤화 온도를 갖는다.
실시예
일반적인 실험 방법
1H NMR 스펙트럼을 브루커 애반스(Bruker Avance) III 400MHz 및 브루커 푸리에(Bruker Fourier) 300MHz 상에서 기록하고, TMS를 내부 표준품으로서 사용하였다.
LCMS를 ES (+) 또는 (-) 이온화 모드; T = 30℃에서 작동하는 애질런트(Agilent) LC/MSD 1200 시리즈(칼럼: C18(50 Х 4.6㎜, 5㎛) 상의 사중극 질량 분석계 상에서 취하였다.
합성 반응식
합성 반응식 1
Figure pct00118
합성 반응식 2
Figure pct00119
합성 반응식 3
Figure pct00120
합성 반응식 4
Figure pct00121
합성 반응식 5
Figure pct00122
합성 반응식 6
Figure pct00123
합성 반응식 7
Figure pct00124
합성 반응식 8
Figure pct00125
합성 반응식 9
Figure pct00126
합성 반응식 10
Figure pct00127
합성 반응식 11
Figure pct00128
합성 반응식 12
Figure pct00129
합성 반응식 13
Figure pct00130
합성 반응식 14
Figure pct00131
합성 반응식 15
Figure pct00132
실험 절차:
중간체 2의 합성.
Figure pct00133
MeCN(540㎖) 중의 중간체 1(20g, 213m㏖)의 용액에 에틸 (E)-4-옥소-부텐오에이트(28.6g, 223m㏖)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 80℃까지 가열시키고, 6시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에서 농축시키고, 잔류물을 (1:0에서 200:1로의 다이클로로메탄/MeOH로 용리시키는) 플래쉬 칼럼 크로마토그래피에 의해서 정제시켜 조물질 중간체 2(25g)를 갈색 고체로서 제공하였다.
중간체 3의 합성.
Figure pct00134
MeOH(100㎖) 중의 조물질 중간체 2(25g)의 용액에 NH3/MeOH(6M, 100㎖)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 EtOAc(500㎖) 중에 붓고, 이어서 여과시켰다. 여과 케이크를 진공 하에서 건조시켜 중간체 3(13g, 2단계에 대해서 35%)을 갈색 고체로서 제공하였다.
1H NMR (DMSO-d 6, 400MHz): δ (ppm) 8.30 (d, J=6.8Hz, 1H), 7.60 (s br, 1H), 7.54 (d, J=5.2Hz, 1H), 7.41 (s, 1H), 7.19-7.23 (m, 1H), 7.06 (s br, 1H), 6.89-6.93 (m, 1H), 3.80 (s, 2H).
중간체 5의 합성.
Figure pct00135
DMF(1000㎖) 중의 중간체 4(100g, 0.51㏖)의 용액에 NaH(60%, 61g, 1.53㏖)를 0℃에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 20분 동안 교반하였다. 2-클로로에틸아민 염산염(89.2g, 0.77㏖)을 0℃에서 혼합물에 나누어 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. TLC(석유 에터/EtOAc=5/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 혼합물을 빙수 중에 붓고, EtOAc(600㎖×3)로 추출하였다. 합한 유기상을 물, 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 농축시켜 중간체 5(110g, 90%)를 황색 오일로서 제공하였다.
1H NMR (CDCl3, 400MHz): δ (ppm) 7.74-7.75 (d, 1H, J=1.2 Hz), 7.21-7.29 (m, 2H), 7.13-7.14 (d, 1H. J=3.2Hz), 6.44-6.45 (d, 1H, J=2.8Hz), 4.14-4.17 (t, 2H, J=6 Hz), 3.08-3.11 (t, 2H, J=6 Hz).
중간체 6의 합성.
Figure pct00136
AcOH(720㎖) 중의 중간체 5(150g, 0.63㏖)의 용액에 보란 피리딘 착물(9.3M, 135.5㎖, 1.26㏖)을 실온에서 N2 하에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 이어서 혼합물을 수성 NaOH로 pH = 9 내지 10으로 조정하고, EtOAc(800㎖×3)로 추출하였다. 합한 유기상을 진공 하에서 농축시켜 조물질 화합물을 제공하였다. 물(720㎖)을 조물질 화합물에 첨가하고, 그 다음 진한 HCl(240㎖)을 천천히 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하고, 수성 NaOH로 pH = 10 내지 11로 조정하고, EtOAc(800㎖×3)로 추출하고, 농축시켜 조물질 화합물을 제공하였다. 메틸 3차 부틸 에터(500㎖) 중의 조물질 화합물의 용액에 AcOH(28㎖)를 실온에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하고, 이어서 여과시키고, 여과 케이크를 메틸 3차 부틸 에터로 세척하고, 건조시켜 중간체 6(120g, 63.5%)을 백색 고체로서 제공하였다.
1H NMR (DMSO-d6, 400MHz): δ (ppm) 7.14 (s, 1H), 7.09-7.12 (d, 1H, J=8.4 Hz), 6.43-6.45 (d, 1H, J=8.4 Hz), 3.33-3.37 (t, 2HJ=8.4 Hz), 3.06-3.09 (t, 2H, J=6.6 Hz), 2.87-2.92 (t, 2H, J=8.4 Hz), 2.76-2.79 (t, 2H, J=6.6 Hz).
중간체 7의 합성.
Figure pct00137
AcOH(80㎖) 및 HCHO(37% 수성, 660㎖) 중의 H2SO4(12.6㎖)의 용액에 중간체 6(100g, 0.33㏖)을 실온에서 나누어 첨가하였다. 혼합물을 50℃에서 20분 동안 교반하였다. 이어서 혼합물을 수성 NaOH로 pH = 9 내지 10으로 조정하고, EtOAc(800㎖×3)로 추출하고, 농축시켜 조물질 중간체 7(100g)을 황색 고체로서 제공하였고, 이것을 정제하지 않고 다음 단계를 위해서 직접 사용하였다.
중간체 8의 합성.
Figure pct00138
THF(700㎖) 중의 중간체 7(100g, 조물질) 및 수성 K2CO3(300㎖, 1M)의 혼합물에 (BOC)2O(94.4g)를 실온에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. TLC(다이클로로메탄/MeOH=10/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 이어서 H2O를 첨가하고, EtOAc(500㎖×3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 농축시켰다. 잔류물을 (50:1에서 5:1로의 석유 에터/EtOAc로 용리시키는) 플래쉬 칼럼 크로마토그래피에 의해서 정제시켜 중간체 8(75g, 2단계에 대해서 64.6%)을 황색 고체로서 제공하였다.
1H NMR (CDCl3, 400MHz): δ (ppm) 7.11 (bs, 1H), 6.99 (bs, 1H), 4.30-4.37 (m, 2H), 3.68 (m, 2H), 3.36-3.40 (m, 2H), 2.96-3.01 (m, 4H), 1.41 (s, 9H).
코어 1의 합성.
Figure pct00139
0℃에서 N2 하에서 THF(490㎖) 중의 중간체 8(49g, 0.14㏖)의 용액에 THF(490㎖) 중의 DDQ(37.9g, 0.17㏖)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 15분 동안 교반하였다. TLC(석유 에터/EtOAc=5/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 이어서 혼합물을 수성 Na2CO3 중에 붓고, EtOAc(400㎖×2)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수로 세척하고, 상에서 건조시키고 Na2SO4 진공 하에서 농축시켰다. 잔류물을 (50:1에서 10:1로의 석유 에터/EtOAc로 용리시키는) 플래쉬 칼럼 크로마토그래피에 의해서 정제시켜 코어 1(24g, 49%)을 황색 고체로서 제공하였다.
1H NMR (CDCl3, 400MHz): δ (ppm) 7.63 (bs, 1H), 7.04-7.15 (m, 2H), 6.46-6.47 (d, 1H, J=3.2 Hz), 4.76-4.83 (m, 2H), 4.25 (m, 2H), 3.92 (m, 2H), 1.42-1.45 (m, 9H).
중간체 10의 합성
Figure pct00140
실온에서 다이클로로메탄(100㎖) 중의 코어 1(10g, 28.5m㏖)의 용액에 HCl/다이옥산(7M, 50㎖)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. TLC(석유 에터/EtOAc=5/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 용매를 진공 하에서 농축시켜 백색 고체를 제공하였다.
5℃ 미만에서 DMF(100㎖) 중의 백색 고체 및 1-피페리딘카보닐 클로라이드(4.6g, 31.3m㏖)의 용액에 Et3N(8.6g, 85.5m㏖)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. TLC(다이클로로메탄/MeOH=10/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 이어서 혼합물을 빙수 중에 붓고, EA(200㎖×4)로 추출하였다. 합한 유기상을 물, 염수로 세척하고, 상에서 건조시키고 Na2SO4 진공 하에서 농축시켰다. 잔류물을 (20:1에서 1:1로의 석유 에터/EtOAc로 용리시키는) 플래쉬 칼럼 크로마토그래피에 의해서 정제시켜 중간체 10(7.5g, 72.8%)을 황색 고체로서 제공하였다.
1H NMR (CDCl3, 400MHz): δ (ppm) 7.86 (d, J=1.6Hz, 1H), 7.26 (s, 1H), 7.02 (t, J=1.6Hz, 1H), 6.47 (d, J=3.2Hz, 1H), 4.63 (s, 2H), 4.22-4.20 (t, J = 4.8Hz, 2H), 3.98-4.00 (t, J = 4.8Hz, 2H), 3.18-3.19 (m, 4H), 1.58-1.40 (m, 6H).
중간체 11의 합성.
Figure pct00141
0℃에서 N2 하에서 다이클로로메탄(100㎖) 중의 중간체 10(10g, 27.6m㏖)의 용액에 (COCl)2(8.8g, 69m㏖)를 첨가하였다. 혼합물을 40℃에서 1시간 동안 교반하였다. TLC(석유 에터/EtOAc=1/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 이어서 -60℃에서 N2 하에서 MeOH(10㎖) 중의 NaOMe(3.7g, 69m㏖)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 물을 첨가하고, 다이클로로메탄(100㎖×3)으로 추출하였다. 합한 유기상을 염수로 세척하고, 상에서 건조시키고 Na2SO4 진공 하에서 농축시켰다. 잔류물을 (5:1에서 1:2로의 석유 에터/EtOAc로 용리시키는) 플래쉬 칼럼 크로마토그래피에 의해서 정제시켜 중간체 11(6g, 48.5%)을 황색 고체로서 제공하였다.
1H NMR (CDCl3, 400MHz): δ (ppm) 8.70 (d, J = 1.6Hz, 1H), 8.29 (s, 1H), 7.41 (s, 1H), 4.67 (s, 2H), 4.41-4.39 (m, 2H), 4.01-3.98 (m, 2H), 3.95 (s, 3H), 3.15-3.01 (m, 4H), 1.60-1.40 (m, 6H).
코어 2의 합성.
Figure pct00142
0 내지 10℃에서 DMF(180㎖) 중의 중간체 11(10g, 22.3m㏖) 및 중간체 3(3.9g, 22.3m㏖)의 용액을 THF(100㎖) 중의 t-BuOK(6.4g, 19.0m㏖)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 0 내지 10℃에서 15분 동안 교반하였다. TLC(다이클로로메탄/MeOH=15/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 이어서 혼합물을 빙수 중에 붓고, EtOAc(100㎖×4)로 추출하였다. 합한 유기상을 물, 염수로 세척하고, 상에서 건조시키고 Na2SO4 진공 하에서 농축시켰다. 잔류물을 (10:5:1에서 1:1:1로의 석유 에터/EtOAc/THF로 용리시키는) 플래쉬 칼럼 크로마토그래피에 의해서 정제시켜 코어 2(6.5g, 50.7%)를 주황색 고체로서 제공하였다.
1H NMR (DMSO-d6, 400MHz): δ (ppm) 11.25 (s, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.91 (s, 1H), 7.65-7.68 (d, J = 6.8Hz, 1H), 7.59-7.61 (d, J = 6.8Hz, 1H), 7.19-7.23 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.04 (s, 1H), 6.55-6.58 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 6.08 (s, 1H), 4.63 (s, 2H), 4.50-4.62 (m, 2H), 3.82-3.86 (m, 2H), 2.94-3.06 (m, 4H), 1.40-1.60 (m, 6H).
LC/MS M+1=573.1
중간체 12의 합성.
Figure pct00143
실온에서 N2 하에서 DMF(200㎖) 중의 코어 1(10g, 28.5m㏖)의 용액에 CuI(5.4g, 28.5m㏖) 및 메틸 2,2-다이플루오로-2-(플루오로설폰일)아세테이트(19.2g, 100m㏖)를 첨가하였다. 혼합물을 80℃에서 2.5시간 동안 교반하였다. TLC(석유 에터/EtOAc=5/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 혼합물을 실온까지 냉각시키고, 여과시켰다. 여과액에 물을 첨가하고, EtOAc(100㎖×4)로 추출하였다. 합한 유기상을 물, 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 농축시켰다. 잔류물을 (20:1에서 5:1로의 석유 에터/EtOAc로 용리시키는) 플래쉬 칼럼 크로마토그래피에 의해서 정제시켜 중간체 12(5.5g, 56.7%)를 황색 고체로서 제공하였다.
1H NMR (CDCl3, 400MHz): δ (ppm) 7.81 (s, 1H), 7.13-7.28 (m, 2H), 6.62 (s, 1H), 4.92-4.84 (m, 2H), 4.22 (s, 2H), 3.98-3.97 (m, 2H), 1.40 (s, 9H).
중간체 13의 합성.
Figure pct00144
N2 하에서 다이클로로메탄(75㎖) 중의 중간체 12(5.0g, 14.7m㏖)의 용액에 (COCl)2(4.6g, 36.7m㏖)를 첨가하였다. 혼합물을 40℃에서 1시간 동안 교반하였다. TLC(석유 에터/EtOAc=1/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 이어서 MeOH(10㎖) 중의 NaOMe(1.98g, 36.7m㏖)의 용액을 -60℃에서 N2 하에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 물을 첨가하고, 다이클로로메탄(100㎖×3)으로 추출하였다. 합한 유기상을 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 농축시켰다. 잔류물을 (10:1에서 5:1로의 석유 에터/EtOAc로 용리시키는) 플래쉬 칼럼 크로마토그래피에 의해서 정제시켜 중간체 13(3.8g, 60.7%)을 황색 고체로서 제공하였다.
1H NMR (CDCl3, 400MHz): δ (ppm) 8.64 (s, 1H), 8.44 (s, 1H), 7.40-7.31 (m, 1H), 4.98-4.88 (m, 2H), 4.51-4.50 (m, 2H), 4.04-4.01 (m, 2H), 3.96 (s, 3H), 1.40 (s, 9H).
중간체 14의 합성.
Figure pct00145
0 내지 10℃에서 DMF(110㎖) 중의 중간체 13(5.5g, 12.9m㏖) 및 중간체 3(2.25g, 12.9m㏖)의 용액에 THF(10㎖) 중의 tBuOK(3.6g, 32.2m㏖)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 0 내지 10℃에서 15분 동안 교반하였다. TLC(석유 에터/EtOAc=1/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 이어서 혼합물을 빙수 중에 붓고, EtOAc(100㎖×4)로 추출하였다. 합한 유기상을 물, 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 농축시켰다. 잔류물을 (100:1에서 30:1로의 다이클로로메탄/MeOH로 용리시키는) 플래쉬 칼럼 크로마토그래피에 의해서 정제시켜 중간체 14(3.5g, 58.3%)를 주황색 고체로서 제공하였다.
1H NMR (CDCl3, 400MHz): δ (ppm) 8.16 (s, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.96 (s, 1H), 7.35 (s, 1H), 7.27 (s, 1H), 7.12-7.08 (m, 2H)), 6.40-6.38 (m, 2H, 4.89-4.77 (m, 2H), 4.50 (s, 2H), 4.04 (s, 2H), 1.48-1.37 (m, 9H).
화합물 I-1의 합성.
Figure pct00146
실온에서 다이클로로메탄(50㎖) 중의 중간체 14(5g, 9.1m㏖)의 용액에 HCl/다이옥산 (50㎖, 7M)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. TLC(다이클로로메탄/MeOH=15/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 용매를 진공 하에서 농축시켜 백색 고체를 제공하였다.
DMF(40㎖) 중의 백색 고체 및 1-피페리딘카보닐 클로라이드(1.8g, 12.3m㏖)의 용액에 실온에서 Et3N(2.49g, 24.6m㏖)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. TLC(다이클로로메탄/MeOH =10/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 이어서 혼합물을 빙수 중에 붓고, EtOAc(100㎖×4)로 추출하였다. 합한 유기상을 물, 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 농축시켰다. 잔류물을 (20:1에서 10:1로의 다이클로로메탄/THF로 용리시키는) 플래쉬 칼럼 크로마토그래피에 의해서 정제시켜 화합물 I-1(3.0g, 70%)을 적색 고체로서 제공하였다.
1H NMR (DMSO-d 6, 400MHz): δ (ppm) 11.30 (s, 1H), 8.17 (s, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.64-7.60 (m, 2H), 7.19 (s, 1H), 6.56 (m, 1H), 6.31 (s, 1H), 4.77-4.69 (m, 2H), 4.68-4.60 (m, 2H), 3.95-3.85 (m, 2H), 3.10-2.90 (m, 4H), 1.55-1.35 (m, 6H).
LC/MS M+1 563.1
화합물 I-2의 합성.
Figure pct00147
실온에서 N-메틸-2-피롤리돈(50㎖) 중의 코어 2(5g, 8.7m㏖)의 용액에 CuCN(2.5g, 28㏖)을 첨가하였다. N2 하에서 혼합물을 150℃에서 6시간 동안 교반하였다. 이어서 혼합물을 빙수 중에 붓고, EtOAc(100㎖×4)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 농축시켰다. 잔류물을 (1:0에서 50:1로의 다이클로로메탄/MeOH로 용리시키는) 플래쉬 칼럼 크로마토그래피에 의해서 정제시켜 화합물 I-2(2.2g, 49%)를 주황색 고체로서 제공하였다.
1H NMR (DMSO-d 6): δ (ppm) 11.30 (s, 1H), 8.07 (s, 1H), 7.97 (s, 1H), 7.66-7.68 (d, 1H，J = 9.2 Hz), 7.54-7.56 (d, 1H, J = 6.8 Hz), 7.29 (s, 1H), 7.19-7.23 (t, J = 8 Hz, 1H), 6.53-6.57 (t, 1H, J = 6.8 Hz), 6.44 (s, 1H), 4.68 (S, 4H), 4.60-4.63 (m, 4H), 3.84-3.88 (m, 2H), 2.96-3.05 (m, 4H), 1.43-1.47 (m, 6H).
LC/MS M+1 520.1
중간체 15의 합성.
Figure pct00148
1,4-다이옥산(500㎖) 중의 코어 1(50g, 0.14㏖)의 용액에 NaI(42.7g, 0.28㏖) 및 CuI(2.7g) 및 2-다이메틸아미노에틸아민(2.5g)을 첨가하였다. N2 하에서 혼합물을 140℃에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 여과시키고, 여과 케이크를 다이클로로메탄로 세척하였다. 합한 유기상을 진공 하에서 농축시켰다. 잔류물을 메틸 3차 부틸 에터로 세척하여 중간체 15(50g, 88.0%)를 황색 고체로서 제공하였다.
중간체 16의 합성.
Figure pct00149
Et3N(120㎖) 및 THF(60㎖）중의 중간체 15(10g, 25.1m㏖)의 용액에 실온에서, 이어서 Pd(PPh3)2Cl2(1.2g, 2.4m㏖) 및 CuI(1.2g, 2.4m㏖)를 N2 하에서 첨가하였다. 이어서 에틴일트라이메틸실란(4.75g, 48.4m㏖)을 적가하였다. 혼합물을 60℃에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 진공 하에서 농축시켜 Et3N을 제거하였다. 이어서 혼합물을 빙수 중에 붓고, CH2Cl2(300㎖×2)로 추출하였다. 합한 유기상을 물, 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 농축시켰다. 잔류물을 (100:1에서 50:1로의 석유 에터/EtOAc로 용리시키는) 플래쉬 칼럼 크로마토그래피에 의해서 정제시켜 중간체 16(6g, 64.8%)을 황색 고체로서 제공하였다.
1H NMR (CDCl3, 400MHz): δ (ppm) 7.63-7.67 (m, 1H), 7.04-7.41 (m, 2H), 6.46-6.49 (m, 1H), 4.77-4.84 (m, 2H), 4.23-4.29 (m, 2H), 3.90-3.97 (m, 2H), 1.43 (s, 9H), 0.26 (s, 9H).
중간체 17의 합성.
Figure pct00150
0℃에서 N2 하에서 다이클로로메탄(110㎖) 중의 중간체 16(10g, 27m㏖)의 용액 에 (COCl)2(8.5g, 67.4m㏖)를 첨가하였다. 혼합물을 40℃에서 1시간 동안 교반하였다. TLC(석유 에터/EtOAc=5/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 이어서 MeOH(10㎖) 중의 NaOMe(3.64g, 67.4m㏖)의 용액을 -60℃에서 N2 하에서 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 물을 첨가하고, 다이클로로메탄(100㎖×3)로 추출하였다. 합한 유기상을 물, 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 농축시켰다. 잔류물을 (100:1에서 5:1로의 석유 에터/EtOAc로 용리시키는) 플래쉬 칼럼 크로마토그래피에 의해서 정제시켜 중간체 17(7g, 56.7%)을 황색 고체로서 제공하였다.
중간체 18의 합성.
Figure pct00151
0 내지 10℃에서 DMF(80㎖) 중의 중간체 17(8g, 17.6m㏖) 및 중간체 3(3.1g, 17.6m㏖)의 용액에 THF(30㎖) 중의 tBuOK(4.9g, 44m㏖)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 0 내지 10℃에서 15분 동안 교반하였다. TLC(석유 에터/EtOAc=1/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 이어서 혼합물을 빙수 중에 붓고, EtOAc(100㎖×4)로 추출하였다. 합한 유기상을 물, 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 농축시켰다. 잔류물을 (100:1에서 50:1로의 다이클로로메탄/MeOH로 용리시키는) 플래쉬 칼럼 크로마토그래피에 의해서 정제시켜 중간체 18(5g, 49%)을 주황색 고체로서 제공하였다.
중간체 19의 합성.
Figure pct00152
실온에서 다이클로로메탄(50㎖) 중의 중간체 18(5g, 8.6m㏖)의 용액에 HCl/다이옥산 (50㎖, 7M)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. TLC(다이클로로메탄/MeOH=15/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 용매를 진공 하에서 농축시켜 백색 고체를 제공하였다.
DMF(50㎖) 중의 백색 고체 및 1-피페리딘카보닐 클로라이드(1.4g, 9.5m㏖)의 용액에 실온에서 Et3N(2.6g, 25.8m㏖)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. TLC(다이클로로메탄/MeOH =10/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 이어서 혼합물을 빙수 중에 붓고, EtOAc(100㎖×4)로 추출하였다. 합한 유기상을 물, 염수로 세척하고, 상에서 건조시키고 Na2SO4 진공 하에서 농축시켜 조물질 중간체 19(5.2g)를 제공하고, 이것을 정제하지 않고 다음 단계를 위해서 직접 사용하였다.
화합물 I-3의 합성.
Figure pct00153
DMF(100㎖) 중의 조물질 중간체 19(5.2g)의 용액에 K2CO3(2g)를 첨가하였다. 혼합물을 50℃까지 가열시키고, 1시간 동안 교반하였다. 이어서 혼합물을 빙수 중에 붓고, EtOAc(100㎖×4)로 추출하였다. 합한 유기상을 물, 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 농축시켰다. 잔류물을 (100:1에서 30:1로의 다이클로로메탄/MeOH로 용리시키는) 플래쉬 칼럼 크로마토그래피에 의해서 정제시켜 화합물 I-3(3g, 2단계에 대해서 18.6%)을 적색 고체로서 제공하였다.
1H NMR (DMSO-d 6, 400MHz): δ (ppm) 11.26 (s, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.65-7.59 (m, 2H), 7.20 (t, 1H, J = 8Hz), 6.97 (s, 1H), 6.58-6.55 (t, J = 6.8Hz, 1H), 6.18 (s, 1H), 4.63 (s, 2H), 4.50-4.60 (m, 2H), 3.80-3.90 (m, 2H), 3.75 (s, 1H), 2.95-3.05 (m, 4H), 1.46-1.35 (m, 6H).
LC/MS M+1 519.2
화합물 I-10의 합성
Figure pct00154
다이옥산(50㎖) 중의 코어 2(5g, 8.8m㏖)의 용액에 아세트아마이드(3.1g, 53.3m㏖), CuI(1.1g, 5.8m㏖), K3PO3 (5.5g, 26.4m㏖)를 RT에서 N2 하에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 20분 동안 교반하였다. N1,N2-다이메틸에탄-1,2-다이아민(1.56g, 17.8m㏖)을 첨가하고, 이어서 혼합물을 115℃에서 5시간 동안 N2 하에서 교반하였다. TLC(다이클로로메탄/MeOH=15/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 이어서 혼합물을 빙수 중에 붓고, EtOAc/THF(3/1, 100㎖×4)로 추출하였다. 합한 유기상을 물, 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 농축시켰다. 잔류물을 (200:1에서 50:1로의 다이클로로메탄/MeOH로 용리시키는) 플래쉬 칼럼 크로마토그래피에 의해서 정제시켜 화합물 I-10(3g, 62%)을 적색 고체로서 제공하였다.
1H NMR (DMSO-d 6, 400MHz): δ (ppm) 11.21 (s, 1H), 9.43 (s, 1H), 7.86 (s, 1H), 7.78 (s, 1H), 7.58-7.64 (m, 2H), 7.17-7.21 (t, 1H, J = 8.0 Hz), 7.00 (s, 1H), 6.77 (s, 1H), 6.56-6.58 (t, 1H, J = 7.2 Hz), 4.60 (s, 2H), 4.40-4.50 (m, 2H), 3.80-3.88 (m, 2H) , 2.88-3.12 (m, 4H), 1.85 (s, 3H) , 1.15-1.20 (m, 6H).
LC/MS M+1 552.2
화합물 I-4의 합성.
Figure pct00155
EtOH(10㎖) 중의 화합물 I-10(3g, 5.4m㏖)의 용액에 HCl(28㎖, 6N)을 실온에서 첨가하였다. 혼합물을 80℃에서 3시간 동안 교반하였다. TLC(다이클로로메탄/MeOH =15/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 이어서 혼합물을 빙수 중에 붓고, 다이클로로메탄(100㎖×2)로 추출하고, 이어서 수 상을 수성Na2CO3로 PH =9 내지 10으로 조정하고, 다이클로로메탄(100㎖×6)으로 추출하고, 진공 하에서 농축시켰다. 잔류물을 메틸 3차 부틸 에터로 세척하고, 여과시켰다. 여과 케이크를 진공 하에서 건조시켜 화합물 I-4(2.1g, 75%)를 적색 고체로서 제공하였다.
1H NMR (DMSO-d6, 400MHz): δ (ppm) 11.19 (s, 1H), 7.86 (s, 1H), 7.84 (s, 1H), 7.62 (bs, 2H), 7.18-7.22 (t, 1H, J = 7.2 Hz), 6.57-6.61 (t, 1H, J = 6.8 Hz), 6.24 (s, 1H), 5.27 (s, 1H), 4.50 (s, 2H), 4.36-4.39 (m, 2H), 4.14-4.17 (m, 2H), 3.75-3.78 (m, 2H), 2.88-3.05 (m, 4H), 1.44-1.48 (m, 6H).
MS/LC M+1 511.1
중간체 22의 합성.
Figure pct00156
실온에서 무수 톨루엔(890㎖) 중의 중간체 21(100g, 0.59㏖)의 용액에 n-BuOH(131.6g, 1.78㏖) 및 TsOH(10g)를 첨가하였다. 혼합물을 120℃에서 밤새 교반하고, 딘-스탁 장치(Dean-stark apparatus)를 사용하여 물을 제거하였다. TLC(석유 에터/EtOAc=5/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다d. 혼합물을 진공 하에서 농축시켜 조물질 중간체 22를 제공하였다. 조물질 중간체 22를 (100:1에서 20:1로의 석유 에터/EtOAc로 용리시키는) 플래쉬 칼럼 크로마토그래피에 의해서 정제시켜 중간체 22(120g, 67.8%)를 황색 오일로서 제공하였다.
1H NMR (CDCl3, 400MHz): δ (ppm) 7.89-7.92 (dd, 1H, J=4.8Hz, 8.8 Hz), 7.51-7.54 (dd, 1H, J=2.8Hz, 9.6Hz), 7.09-7.14 (m, 1H), 6.04 (s, 1H), 3.50-3.56 (m, 4H), 1.55-1.62 (m, 4H), 1.33-1.42 (m, 4H), 0.83-0.93 (m, 6H).
중간체 23의 합성.
Figure pct00157
무수 THF(1500㎖) 중의 중간체 22(50g, 0.17㏖)의 용액에 바이닐마그네슘 브로마이드 용액(1M, 668.8㎖, 668.8m㏖)을 -40 C에서 적가하였다. 혼합물을 -40℃에서 1시간 동안 교반하였다. TLC(석유 에터/EtOAc = 5/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 이어서 혼합물을 수성 NH4Cl 중에 붓고, EtOAc(300㎖×3)로 추출하고, 유기 상을 농축시켜 조물질 화합물을 제공하였다. 조물질 화합물을 (100:1에서 20:1로의 석유 에터/EtOAc로 용리시키는) 플래쉬 칼럼 크로마토그래피에 의해서 정제시켜 화합물(24g)을 황색 오일로서 제공하였다. THF(100㎖) 중의 화합물(24g)의 용액에 HCl(0.5 N, 80㎖)을 실온에서 적가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. TLC(석유 에터/EtOAc =5/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 혼합물을 수성 NaOH로 PH=10으로 조정하고, EtOAc(300㎖×3)로 로 추출하고, 진공 하에서 농축시켜 중간체 23(16g, 58.8%)을 황색 고체로서 제공하였다.
1H NMR (CDCl3, 400MHz): δ (ppm) 10.06 (s, 1H), 7.62 (dd, 1H, J=2Hz, 9.2Hz), 7.38-7.41 (m, 2H), 6.60(t, 1H, J=2.4Hz).
중간체 24의 합성.
Figure pct00158
MeOH(2100㎖) 중의 중간체 23(140g, 0.86㏖)의 용액에 2-아미노에탄올(78g, 1.3㏖) 및 Pd/C(14g)를 실온에서 N2 하에서 첨가하였다. N2 하에서 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서 H2 하에서 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 여과시키고, 농축시켜 중간체 24(200g, 조물질)를 황색 오일로서 제공하였고, 이것을 정제하지 않고 다음 단계를 위해서 직접 사용하였다.
중간체 25의 합성.
Figure pct00159
THF(1300㎖) 중의 중간체 24(90g, 조물질) 및 K2CO3(467㎖, 1M)의 혼합물에 Boc2O(141g)를 실온에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. TLC(다이클로로메탄/MeOH=10/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 이어서 H2O를 첨가하고, EtOAc(500㎖×3)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 농축시켰다. 잔류물을 (10:1에서 1:1로의 석유 에터/EtOAc로 용리시키는) 플래쉬 칼럼 크로마토그래피에 의해서 정제시켜 중간체 25(66.6g, 2단계에 대해서 56%)를 황색 오일로서 제공하였다.
1H NMR (CDCl3, 400MHz): δ (ppm) 10.17 (s, 1H), 7.23-7.26 (m, 2H), 6.78-6.82 (dd, 1H, J = 9.2 Hz, J=2 Hz), 6.48-6.50 (t, 1H, J=2.4Hz), 4.67 (s, 2H), 3.66-3.71 (m, 2H), 3.25-35 (m, 2H), 1.40 (s, 9H).
중간체 26의 합성.
Figure pct00160
THF(1000㎖) 중의 중간체 25(50g, 0.26㏖)의 용액에 Et3N(79g, 0.79㏖) 및 Ms2O(55g, 0.32㏖)를 0℃에서 N2 하에서 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반하였다. TLC(석유 에터/EtOAc=3/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 이어서 그것을 빙수 중에 붓고, EtOAc(400㎖×2)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 농축시켜 중간체 26(50g, 79%)를 황색 오일로서 제공하였다.
1H NMR (CDCl3, 400MHz): δ (ppm) 10.08 (bs, 1H), 7.24-7.29 (m, 2H), 6.81-6.84 (m, 1H), 6.49-6.50 (d, 1H, J=2.4Hz), 4.67 (s, 2H), 4.28-4.31 (m, 2H), 3.48-3.52 (m, 2H), 2.79 (s, 3H), 1.51 (s, 9H).
중간체 27의 합성.
Figure pct00161
DMF(722㎖) 중의 중간체 26(65g, 0.19㏖)의 용액에 NaH(60%, 11.5g, 0.29㏖)를 0℃에서 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 N2 하에서 교반하였다. TLC(석유 에터/EtOAc=3/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 이어서 혼합물을 빙수 중에 붓고, EtOAc(500㎖×4)로 추출하였다. 합한 유기상을 물, 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 농축시켰다. 잔류물을 (50:1에서 10:1로의 석유 에터/EtOAc로 용리시키는) 플래쉬 칼럼 크로마토그래피에 의해서 정제시켜 중간체 27(26g, 53.2%)을 황색 고체로서 제공하였다.
1H NMR (CDCl3, 400MHz): δ (ppm) 7.14-7.16 (d, 1H, J=8Hz), 7.07 (s, 1H), 6.72-6.83 (m, 1H), 6.48-6.49 (d, 1H, J=2.8Hz), 4.84 4.76 (s, 2H), 4.24-4.25 (m, 2H), 3.94 (m, 2H), 1.45-1.48 (m, 9H).
중간체 28의 합성.
Figure pct00162
다이클로로메탄(900㎖) 중의 중간체 27(27.5g, 95.0m㏖)의 용액에 (COCl)2(18g, 142m㏖)를 0℃에서 N2 하에서 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반하였다. TLC(석유 에터/EtOAc=1/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 이어서 MeOH(40.8㎖) 중의 NaOMe(13.4g, 247m㏖)의 용액을 -60℃에서 N2 하에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 물을 첨가하고, 다이클로로메탄(200㎖×3)으로 추출하였다. 합한 유기상을 물, 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 농축시켰다. 잔류물을 (20:1에서 1:1로의 석유 에터/EtOAc로 용리시키는) 플래쉬 칼럼 크로마토그래피에 의해서 정제시켜 중간체 28(20g, 56%)을 백색 고체로서 제공하였다.
1H NMR (CDCl3, 400MHz): δ (ppm) 8.37 (s, 1H), 8.02-8.04 (d, 1H, J=8.4Hz), 6.84-6.91 (m, 1H), 4.80-4.90 (m, 2H), 4.44 (bs, 2H), 3.91-3.98 (m, 5H), 1.41-1.46 (m, 9H).
중간체 29의 합성.
Figure pct00163
0 내지 10℃에서 DMF(120㎖) 중의 중간체 28(10g, 26.5m㏖) 및 중간체 3(4.6g, 26.5m㏖)의 용액에 THF(100㎖) 중의 tBuOK(7.4g, 66.2m㏖)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 0 내지 10℃에서 15분 동안 교반하였다. TLC(석유 에터/EtOAc =1/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 이어서 혼합물을 빙수 중에 붓고, EtOAc(100㎖×4)로 추출하였다. 합한 유기상을 물, 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 농축시켰다. 잔류물을 (20:1에서 1:1로의 석유 에터/EtOAc로 용리시키는) 플래쉬 칼럼 크로마토그래피에 의해서 정제시켜 중간체 29(7g, 52.5%)를 적색 고체로서 제공하였다.
1H NMR (DMSO-d 6, 400MHz): δ (ppm) 11.07 (s, 1H), 8.02-8.01 (d, 1H, J=4Hz), 8.96 (s, 1H), 7.61-7.63 (t, 1H, J=8.8Hz), 7.45 (s, 1H), 7.17 (s, 1H), 6.57-6.64 (m, 1H), 6.47-6.49 (d, 1H, J=8Hz), 5.77-5.80 (d, 1H J =8.4Hz), 4.73 4.78(2H), 4.52 (bs, 2H), 3.96 (bs, 2H), 1.25-1.44 (m, 9H).
코어 3의 합성.
Figure pct00164
실온에서 다이클로로메탄(50㎖) 중의 중간체 29(5g, 9.9m㏖)의 용액에 HCl/다이옥산 (50㎖, 7M)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. TLC(다이클로로메탄/MeOH=15/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 용매를 진공 하에서 농축시켰다. 잔류물을 메틸 3차 부틸 에터로 세척하고, 여과시켰다. 여과 케이크를 진공 하에서 건조시켜 코어 3(4g, 91.9%)을 주황색 고체로서 제공하였다.
1H NMR (DMSO-d 6, 400MHz): δ (ppm) 11.59 (s, 1H), 10.46 (bs, 2H), 8.49 (s, 1H), 8.18 (s, 1H), 8.08-8.12 (m, 2H, J=14Hz), 7.88-7.92 (t, 1H, J=8.0Hz), 7.25-7.29 (t, 1H, J=6.8Hz), 7.04-7.07 (m, 1H), 6.22-6.25 (m, 1H), 4.76 (bs, 2H), 4.62 (bs, 2H), 3.68 (bs, 2H).
중간체 31의 합성.
Figure pct00165
다이옥산(100㎖) 중의 중간체 30(20g, 94m㏖)의 용액에 HCl/다이옥산(100㎖, 7M)을 실온에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. TLC(석유 에터/EtOAc=3/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 혼합물을 메틸 3차 부틸 에터(300㎖) 상에 붓고, 여과시켰다. 여과 케이크를 진공 하에서 건조시켜 중간체 31 염산염(8g, 57%)을 백색 고체로서 제공하였다.
중간체 32의 합성.
Figure pct00166
다이클로로메탄(180㎖) 중의 중간체 31 염산염(7g, 47m㏖)의 용액에 Et3N(14.2g, 141m㏖)을 실온에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 이어서 다이클로로메탄(20㎖) 중의 트라이포스젠(5.6g, 19m㏖)의 용액을 0℃ 내지 10℃에서 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. TLC(다이클로로메탄/MeOH=10/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 이어서 혼합물을 수성 NaHCO3, 물, 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 농축시켰다. 조물질 생성물을 진공에서 증류시켜 중간체 32(2.5g, 30.5%)를 무색 오일로서 수득하였다.
화합물 I-5의 합성.
Figure pct00167
DMF(70㎖) 중의 코어 3(5g, 11.45m㏖)의 용액에 Et3N(3.5g, 34.35m㏖)을 실온에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 이어서 DMF(5㎖) 중의 중간체 32(3.6g, 20.5m㏖)의 용액을 0℃ 내지 10℃에서 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. TLC(다이클로로메탄/MeOH =15/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 혼합물을 빙수 중에 붓고, 메틸 3차 부틸 에터로 추출하여 불순물을 제거하고, 이어서 EtOAc(100㎖×5)로 추출하였다. 합한 EtOAc 상을 물, 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 농축시켜 조물질 화합물 I-5(4.5g, 조물질)를 주황색 고체로서 제공하였다.
1H NMR (DMSO-d 6, 400MHz): δ (ppm) 11.3 (s, 1H), 9.58 (s, 1H), 8.05 (s, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.65 (d, 1H, J=8.8Hz), 7.60 (d, 1H, J=6.8Hz ), 7.21 (t, 1H, J=8Hz), 6.78 (d, 1H, J=9.6Hz), 6.58 (t, 1H, J=6.8Hz), 5.62 (d, 1H, J=2Hz), 4.64 (s, 2H), 4.55 (s, 2H), 3.85 (s, 2H), 3.21-3.37 (m, 2H), 2.73-2.76 (m, 2H), 1.75-1.76 (m, 2H), 1.33-1.47 (m, 3H).
화합물 I-6의 합성.
Figure pct00168
THF(100㎖) 중의 조물질 중간체 33(화합물 I-5)(4.5g)의 용액에 NaBH4(0.16g, 4.2m㏖)를 5℃ 미만에서 나누어 첨가하였다. 첨가 후, 반응 혼합물을 5℃ 미만에서 0.5시간 동안 교반하였다. TLC(다이클로로메탄/MeOH =15/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 이어서 혼합물을 물 중에 붓고, EtOAc(100㎖×4)로 추출하였다. 합한 유기상을 물, 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 농축시켰다. 잔류물을 (200:1에서 30:1로의 다이클로로메탄/MeOH로 용리시키는) 플래쉬 칼럼 크로마토그래피에 의해서 정제시켜 화합물 I-6(3g, 2단계에 대해서 48%)을 주황색 고체로서 제공하였다.
1H NMR (DMSO-d 6, 400MHz): δ (ppm) 11.24 (s, 1H), 8.06 (s, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.64-7.66 (d, 1H, J=8.8Hz ), 7.59-7.61 (d, 1H, J=6.4Hz ), 7.18-7.22 (t, 1H J=8Hz), 6.78-6.80 (d, 1H, J=9.6Hz), 6.56-6.59 (t, 1H J=6.8Hz), 5.62-5.65 (dd, 1H J=2Hz J=10Hz), 4.63 (s, 2H), 4.55 (s, 2H), 4.45-4.47 (t, 2H, J=5.2Hz), 3.85 (s, 2H), 3.40-3.43 (d, 2H J=12.4Hz), 3.23-3.26 (t, 2H, J=4.8Hz), 2.58-2.65 (t, 2H, J=12Hz), 1.55-1.58 (d, 2H J=12.8Hz), 1.47-1.48 (d, 1H J=6.4Hz), 1.05-1.13 (m, 2H).
LC/MS M+1 543.1
중간체 35의 합성.
Figure pct00169
다이클로로메탄(240㎖) 중의 중간체 34 염산염(8.6g, 55.0m㏖)의 용액에 Et3N(16.7g, 165.0m㏖)을 실온에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 이어서 다이클로로메탄(20㎖) 중의 트라이포스젠(6.5g 22.0m㏖)의 용액을 0℃ 내지 10℃에서 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. TLC(다이클로로메탄/MeOH =10/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 이어서 혼합물을 수성 NaHCO3, 물, 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 농축시켰다. 조물질 생성물을 진공에서 증류시켜 중간체 35(4.2g, 42%)를 무색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 400MHz): δ (ppm) 3.80-3.85 (bs, 2H), 3.71-3.75 (bs, 2H), 2.01-2.11 (m, 4H).
화합물 I-7의 합성.
Figure pct00170
DMF(40㎖) 중의 코어 3(3g, 6.8m㏖)의 용액에 Et3N(2.1g, 20.6m㏖)을 실온에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 이어서 DMF(5㎖) 중의 중간체 35(1.4g, 7.5m㏖)의 용액을 0℃ 내지 10℃에서 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. TLC(다이클로로메탄/MeOH =10/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 이어서 혼합물을 빙수 중에 붓고, 메틸 3차 부틸 에터로 추출하여 불순물을 제거하고, 여과시켰다. 여과 케이크를 물(100㎖×3)로 세척하고, 다이클로로메탄(200㎖)에 의해서 용해시키고, 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 농축시켜 화합물 I-7(2.2g, 58%)을 주황색 고체로서 제공하였다.
1H NMR (DMSO-d 6, 400MHz): δ (ppm) 11.24 (s, 1H), 8.06 (s, 1H), 7.91 (s, 1H), 7.62-7.66 (m, 2H), 7.19-7.23 (t, 1H, J=8Hz), 6.84-6.86 (d, 1H, J=8.0Hz), 6.58-6.61 (t, 1H, J=6.4Hz), 5.63-5.66 (d, 1H, J=8.0Hz), 4.70 (s, 2H), 4.58 (bs, 2H), 3.90 (bs, 2H), 3.15 (bs, 4H), 1.93-1.96 (m, 4H).
LC/MS M+1 549.1
중간체 37의 합성.
Figure pct00171
다이클로로메탄(430㎖) 중의 중간체 36 염산염(15g, 100m㏖)의 용액에 Et3N(30.6g, 300m㏖)을 실온에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 이어서 다이클로로메탄(20㎖) 중의 트라이포스젠(11.9g, 40m㏖)의 용액을 0℃ 내지 10℃에서 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. TLC(다이클로로메탄/MeOH =10/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 이어서 혼합물을 수성 NaHCO3, 물, 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 농축시켰다. 조물질 생성물을 진공에서 증류시켜 중간체 37(9.2g, 52%)를 무색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 400MHz): δ (ppm) 4.40 (s, 2H), 3.90-3.94 (d, 2H, J=13.2Hz), 3.41-3.44 (d, 1H, J=13.2Hz), 3.23-3.36 (d, 1H, J=12.8Hz), 1.90-2.04 (m, 2H), 1.80-1.86 (m, 2H).
화합물 I-8의 합성.
Figure pct00172
DMF(40㎖) 중의 코어 3(3g, 6.8m㏖)의 용액에 Et3N(2.1g, 20.6m㏖)을 실온에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 이어서 DMF(5㎖) 중의 중간체 37(1.3g 7.5m㏖)의 용액을 0℃ 내지 10℃에서 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. TLC(다이클로로메탄/MeOH =10/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 이어서 혼합물을 빙수 중에 붓고, EtOAc(100㎖×4)로 추출하였다. 합한 유기상을 물, 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 농축시켰다. 잔류물을 (200:1에서 50:1로의 다이클로로메탄/MeOH로 용리시키는) 플래쉬 칼럼 크로마토그래피에 의해서 정제시켜 화합물 I-8(2.3g, 62%)를 주황색 고체로서 제공하였다.
1H NMR (DMSO-d 6, 400MHz): δ (ppm) 11.24 (s, 1H), 8.05 (s, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.60-7.66 (m, 2H), 7.20-7.24 (t, 1H, J=7.6Hz), 6.80-6.82 (d, 1H, J=9.2Hz), 6.57-6.59 (t, 1H J=6.8Hz), 5.64-5.67 (d, 1H J=10Hz), 4.60 (s, 2H), 4.54 (bs, 2H), 4.19 (s, 2H), 3.84 (bs, 2H), 3.20-3.24 (d, 2H J=12.8Hz), 3.01-3.04 (d, 2H, J=12Hz), 1.74 (s, 4H).
LC/MS M+1 541.1
중간체 39의 합성.
Figure pct00173
MeOH(100㎖) 중의 중간체 38(20g, 113m㏖)의 용액에 HCl/MeOH(4M, 100㎖)를 첨가하고, 이어서 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 진공에서 농축시켰다. 잔류물에 물(500㎖)을 첨가하고, 이어서 EtOAc(200㎖×4)로 추출하였다. 합한 유기상을 염수로 세척하고, 상에서 건조시키고 Na2SO4 진공 하에서 농축시켜 조물질 중간체 39(21g)를 갈색 고체로서 제공하고, 이것을 정제하지 않고 다음 단계를 위해서 직접 사용하였다.
중간체 40의 합성.
Figure pct00174
MeOH(100㎖) 중의 조물질 중간체 39(21g)의 용액에 NH3/MeOH(6M, 100㎖)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 EtOAc(500㎖) 중에 붓고, 이어서 여과시켰다. 여과 케이크를 진공 하에서 건조시켜 중간체 40(8g, 2단계에 대해서 40%)을 회백색 고체로서 제공하였다.
1H NMR (DMSO-d 6, 400MHz): δ (ppm) 7.86 (d, J=8.0Hz, 1H), 7.80 (s br, 1H), 7.72 (d, J=8.4Hz, 1H), 7.62-7.66 (m, 1H), 7.37-7.41 (m, 1H), 7.22 (s br, 1H), 3.88 (s, 2H).
중간체 41의 합성.
Figure pct00175
0 내지 10℃에서 DMF(120㎖) 중의 중간체 28(10g, 26.5m㏖) 및 중간체 40(4.6g, 26.5m㏖)의 용액에 THF(100㎖) 중의 tBuOK(7.4g, 66.2m㏖)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 0 내지 10℃에서 15분 동안 교반하였다. TLC(석유 에터/EtOAc=1/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 이어서 혼합물을 빙수 중에 붓고, EtOAc(100㎖×4)로 추출하였다. 합한 유기상을 물, 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 농축시켰다. 잔류물을 (10:5에서 1:2로의 석유 에터/EtOAc로 용리시키는) 플래쉬 칼럼 크로마토그래피에 의해서 정제시켜 중간체 41(5g, 37.5%)을 적색 고체로서 제공하였다.
1H NMR (DMSO-d 6, 400MHz): δ (ppm) 11.07 (s, 1H), 8.02-8.01 (d, 1H, J=4Hz), 8.96 (s, 1H), 7.61-7.63 (t, 1H, J=8.8Hz), 7.45(s, 1H), 7.17 (s, 1H), 6.57-6.64 (m, 1H), 6.47-6.49(d, 1H, J=8Hz), 5.77-5.80 (d, 1H, J=8.4Hz), 4.73-4.78 (d, 2H), 4.52 (bs, 2H), 3.96 (bs, 2H), 1.25-1.44 (m, 9H).
중간체 42의 합성.
Figure pct00176
실온에서 다이클로로메탄(50㎖) 중의 중간체 41(5g, 9.9m㏖)의 용액에 HCl/다이옥산(50㎖, 7M)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. TLC(다이클로로메탄/MeOH=15/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 용매를 농축시켜 중간체 42(4g, 92%)를 주황색 고체로서 제공하였다.
1H NMR (DMSO-d 6, 400MHz): δ (ppm) 11.59 (s, 1H), 10.46 (s, 1H), 8.49 (s, 1H), 8.17 (s, 1H), 8.08-8.12 (m, 2H, J=14Hz), 7.88-7.92 (t, 1H, J=8.4Hz), 7.25-7.29 (t, 1H, J=13.6Hz), 7.04-7.07 (t, 1H, J=10 Hz), 6.22-6.25 (m, 1H), 4.76 (s, 2H), 4.62 (s, 2H), 4.45 (s, 2H), 3.68 (s, 2H).
화합물 I-9의 합성.
Figure pct00177
DMF(20㎖) 중의 중간체 42(2g, 4.9m㏖) 및 1-피페리딘카보닐 클로라이드(1.1g, 7.4m㏖)의 용액에 Et3N(1.5g, 14.9m㏖)을 실온에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. TLC(다이클로로메탄/MeOH =15/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 혼합물을 빙수 중에 붓고, EtOAc(100㎖×4)로 추출하였다. 합한 유기상을 물, 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 농축시켰다. 잔류물을 메틸 3차 부틸 에터로 세척하고, 여과시켰다. 여과 케이크를 진공에서 건조시켜 화합물 I-9(1.1g, 43.1%)를 주황색 고체로서 제공하였다.
1H NMR (DMSO-d 6, 400MHz): δ (ppm) 11.48 (s, 1H), 8.23 (s, 1H), 7.83-7.86 (d, 1H, J=8.8 Hz), 7.68-7.76 (m, 1H), 7.35-7.39 (t, 1H, J=7.6 Hz), 6.89-6.92 (m, 1H), 6.04-6.07 (m, 1H), 4.66 (s, 2H), 4.57-4.65 (bs, 2H), 3.83-3.90 (m, 2H), 3.01-3.05 (m, 4H), 1.46-1.49 (m, 6H).
LC/MS M+514.1
화합물 I-12의 합성.
출발 물질로서 3,3-다이플루오로피페리딘을 사용하여 화합물 I-12를 화합물 I-7과 유사한 방식으로 합성하였다.
1H NMR (DMSO-d6, 400MHz): δ (ppm) 11.25 (s, 1H), 8.06 (s, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.58-7.66 (m, 2H), 7.18-7.23 (t, 1H, J=8Hz), 6.81-6.79 (d, 1H, J=8.0Hz), 6.58-6.61 (t, 1H, J=6.4Hz), 5.65-5.67 (d, 1H, J=8.0Hz), 4.66 (s, 2H), 4.56 (bs, 2H), 3.88 (bs, 2H), 3.31-3.64 (bs, 2H), 3.07 (bs, 2H), 1.96-2.01 (bs, 2H), 1.69 (bs, 2H).
LC/MS M+1 549.1
화합물 I-13의 합성.
화합물 I-13은 합성 반응식 9에 나타낸 바와 같다.
Figure pct00178
중간체 47과 유사한 방식으로 중간체 44의 합성은 43%의 수율이다.
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ1.47 (9H, s), 1.91-1.94(2H, m), 3.37-3.56 (4H, m), 4.40-4.70(1H, m), 4.71-4.74(1H, m)
중간체 45의 합성
Figure pct00179
중간체 48, 조물질과 유사한 방식으로의 중간체 45의 합성.
화합물 I-13의 합성
Figure pct00180
화합물 I-13의 합성은 화합물 I-19과 유사하고, 2단계에 대한 수율은 20.7%이다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ1.45-1.48 (1H, d, J = 9.2 Hz), 1.54-1.56 (1H, d, J = 9.2 Hz), 2.71-2.73 (1H, d, J = 9.2 Hz), 2.88-2.90 (1H, d, J = 8.4 Hz), 2.97-2.99 (1H, d, J = 9.6 Hz), 3.35-3.37 (1H, d, J = 8.0 Hz), 3.49 (1H, s), 3.75-3.76 (1H, m), 3.90-3.92 (1H, m), 4.04 (1H, s), 4.46-4.50 (1H, m), 4.58-4.74 (3H, m), 5.60-5.62 (1H, d, J = 8.4 Hz), 6.60-6.63 (1H, m), 6.78-6.80 (1H, d, J = 9.6 Hz), 7.20-7.24 (1H, m), 7.63-7.66 (2H, m), 7.90 (1H, s), 8.06 (1H, s).
MS 계산치: 525.5; MS 실측치: 526.2 [M+1]+.
화합물 I-14의 합성.
화합물 I-14를 화합물 I-8과 유사한 방식으로 합성하였다.
LC/MS M+1 548.2
화합물 I-15의 합성.
화합물 I-15를 화합물 I-7과 유사한 방식으로 합성하였다.
LC/MS M+1 556.2
화합물 I-16의 합성
화합물 I-16을 화합물 I-7과 유사한 방식으로 합성하였다.
LC/MS M+1 556.2
화합물 I-17의 합성.
화합물 I-17을 화합물 I-7과 유사한 방식으로 합성하였다.
LC/MS M+1 599.2
화합물 I-18의 합성.
화합물 I-18을 화합물 I-8과 유사한 방식으로 합성하였다.
LC/MS M+1 591.2
화합물 I-19의 합성.
Figure pct00181
다이클로로메탄(25㎖) 중의 중간체 46(1.0g, 4.67m㏖)의 용액에 Et3N(1.41g, 14.0m㏖)을 첨가하였다. 현탁액을 교반하고, 0 내지 10℃에서 DCM(5㎖) 중의 트라이포스젠(0.55g, 1.87m㏖)을 적가하여 처리하였다. 첨가가 완결된 후, 현탁액을 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 빙수(20㎖) 중에 붓고, DCM으로 추출하고, 유기 층을 NaHCO3(수성), 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과시키고, 진공 하에서 농축시켰다. 잔류물을 실리가젤 칼럼 크로마토그래피에 의해서 정제시켜 중간체 47(0.6g, 46.5%)을 무색 오일로서 제공하였다.
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 1.20-1.27 (2H, m), 1.41 (9H, s), 1.72-1.79 (3H, m), 2.84-2.90(1H, m), 3.03-3.09 (3H, m), 4.32-4.35 (2H, m), 4.66 (1H, br s).
화합물 I-19의 합성
Figure pct00182
DMF(13㎖) 중의 코어 3(1.0g, 2.29m㏖)의 용액에 Et3N(0.70g, 6.87m㏖)을 첨가하였다. 현탁액을 교반하고, 0 내지 10℃에서 DMF(2㎖) 중의 중간체 47(0.70g, 2.52m㏖)을 적가하여 처리하였다. 첨가가 완결된 후, 현탁액을 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 빙수(60㎖) 중에 붓고, 여과시키고, 진공에서 농축시켜 중간체 48(1.0g, 조물질)을 적색 고체로서 제공하였다.
화합물 I-19의 합성
Figure pct00183
DCM(30㎖) 중의 중간체 48(1.0g, 조물질)의 용액에 HCl/다이옥산(10㎖，8㏖/L)을 실온에서 첨가하고, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과시키고, 여과 케이크를 물 중에 용해시키고, Na2CO3(수성)로 pH=8 내지 9로 조정하고, 다시 여과시키고, 물로 세척하고, 진공에서 농축시켜 화합물 I-19(130㎎, 10.5%, 2단계)를 적색 고체로서 제공하였다.
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ1.03-1.11(2H, m), 1.13-1.62 (3H, m), 2.44-2.82 (4H, m), 3.41-3.44(2H, m), 3.85(2H, m), 4.54(2H, m), 4.64(2H, m), 5.64-5.66(1H, d, J = 9.6 Hz), 6.56-6.58(1H, m), 6.78-6.81(1H, m), 7.19-7.23(1H, m), 7.60-7.66(2H, m), 7.92(1H, s), 8.06(1H, s).
MS 계산치: 541.6; MS 실측치: 542.2([M+1]+.
화합물 I-20의 합성.
Figure pct00184
DCM(1.5L) 중의 중간체 49(15g, 130.2m㏖)의 용액에 Et3N(19.8g, 195.3m㏖) 및 DMAP(0.8g, 6.5m㏖)를 첨가하였다. 현탁액을 교반하고, tert-부틸클로로다이페닐실란(53.7g, 195.3m㏖)을 0 내지 10℃에서 적가하여 처리하였다. 첨가가 완결된 후, 현탁액을 5시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 빙수(500㎖) 중에 붓고, DCM(300㎖×2)으로 추출하고, 유기 층을 염수(300㎖×2)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과시키고, 진공 하에서 농축시켜 중간체 50(30g, 조물질)을 황색 오일로서 제공하였다.
중간체 51의 합성
Figure pct00185
DCM(900㎖) 중의 중간체 50(30g, 조물질, 84.8m㏖)의 용액에 Et3N(25.8g, 254.5m㏖)을 첨가하였다. 현탁액을 교반하고, DCM(50㎖) 중의 트라이포스젠(10.1g, 33.9m㏖)을 0 내지 10℃에서 적가하여 처리하였다. 첨가가 완결된 후, 현탁액을 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 빙수(300㎖) 중에 붓고, DCM으로 추출하고, 유기 층을 NaHCO3(수성), 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과시키고, 진공 하에서 농축시켰다. 잔류물을 실리가젤 칼럼 크로마토그래피에 의해서 정제시켜 중간체 51(3.1g, 8.8%)을 무색 오일로서 제공하였다.
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ1.05 (9H, s), 1.22-1.29(2H, m), 1.78-1.83 (3H, m), 2.84-2.90(1H, m), 3.01-3.07(1H, m), 3.50-3.51(2H, d, J = 5.6 Hz), 4.30-4.34(2H, m), 7.36-7.45 (6H, m), 7.62-7.64 (4H, m).
중간체 52의 합성
Figure pct00186
DMF(15㎖) 중의 CF 3 코어(합성은 반응식 2에 기술되어 있음)(1.6g, 3.28m㏖)의 용액에 Et3N(1.0g, 9.84m㏖)을 첨가하였다. 현탁액을 교반하고, 0 내지 10℃에서 DMF(5㎖) 중의 51(1.5 g, 3.60m㏖)을 적가하여 처리하였다. 첨가가 완결된 후, 현탁액을 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 빙수(80㎖) 중에 붓고, 여과시키고, 필터 케이크를 물 및 MTBE로 세척하여 중간체 52(0.98g, 조물질)를 적색 고체로서 제공하였다.
화합물 I-20의 합성:
Figure pct00187
THF(20㎖) 중의 중간체 52(0.98g, 조물질)의 용액에 THF(10㎖) 중의 TBAF(0.56g, 1.77m㏖)를 실온에서 첨가하고, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 빙수(40㎖) 중에 붓고, 여과시키고, 여과 케이크를 진공에서 농축시키고, 실리카젤 칼럼 크로마토그래피에 의해서 정제시켜 화합물 I-20(160㎎, 22.8%)을 주황색 고체로서 제공하였다.
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ1.05-1.13(2H, m), 1.48-1.58 (3H, m), 2.54-2.67(2H, m), 3.23-3.26(2H, m), 3.40-3.44(2H, m), 3.87-3.90(2H, m) 4.44-4.47(1H, m) 4.62-4.69(2H, m), 4.72(2H, s), 6.31(1H, s), 6.53-6.56(1H, m), 7.14-7.20(2H, m), 7.60-7.64(2H, m), 7.92(1H, s), 8.16(1H, s), 11.29(1H, s).
MS 계산치: 592.6; MS 실측치: 593.2([M+1]+.
화합물 I-21의 합성.
Figure pct00188
중간체 52와 유사한 방식으로의 중간체 53의 합성. 반응식 3에 기술된 바와 같은 조건을 사용하여 Br을 대체시키고, 그 다음 코어 1에 대해서 기술된 바와 같은 조건을 사용하여 중간체 10으로 탈블로킹시킴으로써 코어 1로부터 CN 코어를 합성 제조하였다.
화합물 I-21의 합성
Figure pct00189
화합물 I-21의 합성은 화합물 I-20의 합성에서의 최종 단계와 유사한 방식이고, 수율은 28.6%이다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ1.08-1.13 (2H, m), 1.47-1.56 (1H, m), 1.56-1.59 (2H, m), 2.58-2.65 (2H,m), 3.23-3.26 (2H, m), 3.40-3.43 (2H, m), 3.86 (2H, s), 4.45-4.61 (1H, m), 4.61(2H, s), 4.68 (2H, s), 6.44 (1H, s), 6.53-6.57 (1H, m), 7.19-7.24 (1H, m), 7.28 (1H, s), 7.54-7.56 (1H, d, J = 6.8 Hz), 7.67-7.69 (2H, d, J = 9.2 Hz), 7.98 (1H, s), 8.08 (1H, s), 11.32 (1H, s).
MS 계산치: 549.6; MS 실측치: 550.2 [M+1]+.
화합물 I-22의 합성 MS 계산치: 620.14; MS 실측치: 621.1 [M+1]+ , 23, 24 MS 계산치: 586.14; MS 실측치: 587.1 [M+1]+ , 26, 27 MS 계산치: 584.17; MS 실측치: 565.1 [M+1]+, 화합물 I-7과 유사한 방식으로 합성할 수 있다.
화합물 I-25의 합성.
화합물 I-25는 합성 반응식 11에 나타낸 바와 같이 합성할 수 있다.
중간체 55의 합성
Figure pct00190
DCM(30㎖) 중의 화합물 54(2.3g, 13.2m㏖)의 용액에 Et3N(2.9g, 29.1m㏖) 및 Boc2O(3.5g, 15.9m㏖)를 첨가하였다. 이어서 혼합물을 R.T.에서 2시간 동안 교반하였다. TLC(DCM/MeOH=10/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 혼합물을 빙수 중에 붓고, DCM으로 추출하고, 합한 유기상을 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 농축시켜 중간체 55(2.3g, 57.8%)를 백색 고체로서 제공하였다.
중간체 56의 합성
Figure pct00191
DMF(30㎖) 중의 중간체 55(2.3g, 9.7m㏖)의 용액에 NaH(0.5g, 13.6m㏖)를 0 내지 10℃에서 첨가하였다. R.T.에서 2시간 동안 교반한 후, 이어서 BnBr(2.5g, 14.6m㏖)을 혼합물에 첨가하였다. TLC(PE/EtOAc=3/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 반응물을 빙수 중에 붓고, EtOAc로 추출하였다. 합한 유기상을 물, 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 농축시켜 조물질을 제공하고, 이것을 실리카젤 크로마토그래피에 의해서 정제시켜 중간체 56(2.8g, 87.5%)을 백색 고체로서 제공하였다.
중간체 57의 합성
Figure pct00192
다이옥산(10㎖) 중의 중간체 56(2.8g, 8.6m㏖)의 용액에 HCl/ 다이옥산(7M, 30㎖)을 첨가하였다. 혼합물을 RT에서 2시간 동안 교반하였다. TLC(PE/EtOAc=3/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 이어서 혼합물을 진공 하에서 농축시켜 중간체 57(1.9g, 조물질)를 황색 오일로서 제공하였다.
중간체 58의 합성
Figure pct00193
DCM(50㎖) 중의 중간체 57(1.9g, 조물질)의 용액에 Et3N(2.1g, 21.1m㏖)을 0 내지 10℃에서 첨가하고, 이어서 DCM(10㎖) 중의 트라이포스젠(0.8g, 2.8m㏖)을 적가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. TLC(PE/EtOAc=5/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 이어서 혼합물을 빙수 중에 붓고, DCM으로 추출하고, 합한 유기상을 NaHCO3(수성), 물, 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 농축시켜 조물질을 제공하고, 이것을 실리카젤 크로마토그래피에 의해서 정제시켜 중간체 58(0.6g, 2단계에 대해서 24.2%)을 백색 고체로서 제공하였다.
1H NMR (CDCl3, 400MHz): δ (ppm) 7.24~7.36 (m, 5H), 4.66~5.27 (m, 2H), 4.16~4.55 (m, 2H), 3.60~3.65 (m, 1H), 3.23~3.30 (m, 1H), 3.17~3.21 (m, 1H), 2.24~2.42 (m, 1H), 1.94~2.03 (m, 1H).
중간체 59의 합성
Figure pct00194
DMF(10㎖) 중의 코어 3(1.1g, 2.6m㏖)의 용액에 Et3N(0.6g, 6.0m㏖)을 첨가하고, 이어서 DMF(3㎖) 중의 중간체 58(0.6g, 2.0m㏖)을 0 내지 10℃에서 적가하고, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. TLC(DCM/MeOH=10/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 이어서 혼합물을 빙수 및 MTBE 중에 붓고, 여과시키고, 여과된 케이크를 MTBE로 세척하고, 진공 하에서 농축시켜 중간체 59(1.0g, 76.3%)를 황색 고체로서 제공하였다.
1H NMR (DMSO-d6, 400MHz): δ (ppm) 11.24 (s, 1H), 8.06 (s, 1H), 7.89 (s, 1H), 7.63~7.66 (m, 2H), 7.26~7.32 (m, 3H), 7.13~7.22 (m, 3H), 6.79~6.83 (m, 1H), 6.56 (t, 1H, J=6.4Hz), 5.64~5.67 (m, 1H), 4.40~4.72 (m, 6H), 3.87~3.89 (m, 1H), 3.70~3.79 (m, 2H), 3.38~3.39 (m, 1H), 3.33 (s, 2H), 3.17~3.16 (m, 1H), 2.06~2.14 (m, 1H), 1.86~1.90 (m, 1H).
화합물 I-26의 합성
Figure pct00195
EtOH(5㎖) 중의 중간체 59(1.0g, 1.5m㏖)의 용액에 HCl(12M, 10㎖)을 첨가하였다. 혼합물을 4시간 동안 환류 가열시켰다. TLC(DCM/MeOH=10/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 이어서 혼합물을 냉각시키고, Na2CO3(수성)로 pH=7 내지 8로 조정하고, 여과시키고, 여과된 케이크를 MTBE로 세척하고, 진공에서 건조시켜 화합물 I-25(0.4g, 46.5%)를 주황색 고체로서 제공하였다.
1H NMR (DMSO-d6, 400MHz): δ (ppm) 11.24 (s, 1H), 8.06 (s, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.63~7.67 (m, 2H), 7.23 (t, 1H, J=7.6Hz), 6.82 (dd, 1H, J=2.0Hz , 9.6Hz), 6.62 (t, 1H, J=6.4Hz), 5.75~5.76 (m, 1H), 5.65 (dd, 1H, J=2.4Hz , 10.0Hz), 4.65~4.74 (m, 2H), 4.49~4.62 (m, 2H), 3.83~3.95 (m, 2H), 3.67~3.69 (m, 1H), 3.16~3.25 (m, 2H), 3.05~3.10 (m, 2H), 2.07~2.14 (m, 1H), 1.86~1.88 (m, 1H).
MS 계산치: 564.17; MS 실측치: 565.1 [M+1]+ ,
화합물 I-28의 합성.
화합물 I-28 MS 계산치: 513.19; MS 실측치: 514.2 [M+1]+은 합성 반응식 12에 나타낸 바와 같이 합성할 수 있다. 중간체 60을 중간체 61로 전환시키는데, 이것은 중간체 2를 중간체 3으로 그리고 중간체 28을 코어 3으로 그리고 코어 3을 화합물 I-1로에 대해서 기술된 바와 같은 조건을 사용하여 화합물 I-28에 대해서 수행한다.
중간체 61의 합성.
Figure pct00196
POCl3(200㎖) 중의 60(10g, 91.7m㏖)의 용액에 다이에틸 말론에이트(73.4g, 458.3m㏖)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 환류 가열시키고, 3시간 동안 교반하였다. 냉각 후, 반응 혼합물을 빙수 중에 붓고, pH=7 내지 8까지 NaHCO3를 첨가하고, EtOAc로 추출하였다. 유기 상을 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과시키고, 감압 하에서 농축시켰다. 잔류물을 플래쉬 칼럼 크로마토그래피에 의해서 정제시켜 61(1.8g, 9.5%)을 백색 고체로서 제공하였다.
1H NMR (DMSO-d6): δ (ppm) 8.43 (d, 1H, J=6.8Hz), 7.75 (d, 1H, J=9.2Hz), 7.37-7.41 (t, 1H), 6.99-7.02 (t, 1H), 4.41 (s, 2H), 4.10-4.16 (q, 2H), 1.17-1.21 (t, 3H).
화합물 I-29 및 화합물 30의 합성을 적절한 중수소화된 출발 물질을 사용함으로써 비중수소화된 물질과 유사한 방식으로 합성할 수 있다.
화합물 I-31의 합성.
화합물 I-31은 합성 반응식 13에 나타낸 바와 같이 합성할 수 있다.
중간체 65의 합성
Figure pct00197
THF(50㎖) 중의 화합물 65(5.0g, 23.5m㏖)의 용액에 TMSCF3(4.0g, 28.2m㏖) 및 TBAF(28.2㎖, 28.2m㏖)를 0℃에서 첨가하였다. 이어서 혼합물을 가온시키고, 30℃에서 3시간 동안 교반하였다. TLC(PE/EtOAc=1/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 혼합물을 빙수 중에 붓고, EtOAc(40㎖×3)로 추출하였다. 합한 유기 상을 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 농축시켜 중간체 66(6g, 조물질)을 황색 오일로서 제공하였다.
1H NMR (CDCl3, 400MHz): δ (ppm) 4.10~4.16 (m, 2H), 3.76~3.77 (m, 1H), 2.70~2.71 (m, 2H), 2.21 (d, 1H, J=6.0Hz), 1.85~1.89 (m, 2H), 1.56~1.64 (m, 1H), 1.53~1.54 (m, 3H), 1.46 (s, 9H).
중간체 67의 합성
Figure pct00198
DMF(50㎖) 중의 중간체 66(5g, 17.7m㏖)의 용액에 NaH(1.0g, 24.7m㏖)를 0 내지 10℃에서 첨가하고, 이어서 BnBr (4.5g, 26.5m㏖)를 적가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. TLC(PE/EtOAc=2/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 이어서 혼합물을 빙수 중에 붓고, EtOAc로 추출하고, 합한 유기상을 물, 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 농축시켜 중간체 67(7.5g, 조물질)을 황색 오일로서 제공하였다.
중간체 68의 합성
Figure pct00199
다이옥산(10㎖) 중의 중간체 67(7.5g, 조물질)의 용액에 HCl/다이옥산(7M, 50㎖)을 첨가하고, 이어서 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. TLC(PE/EtOAc=2/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 이어서 혼합물을 진공 하에서 농축시켜 중간체 68(6.6g, 조물질)을 황색 오일로서 제공하였다.
중간체 69의 합성
Figure pct00200
DCM(130㎖) 중의 중간체 68(6.6g, 조물질)의 용액에 Et3N(6.5g, 63.9m㏖)을 0 내지 10℃에서 첨가하고, 이어서 DCM(20㎖) 중의 트라이포스젠(2.5g, 8.5m㏖)을 적가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. TLC(PE/EtOAc=5/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 이어서 혼합물을 빙수 중에 붓고, DCM으로 추출하고, 합한 유기상을 NaHCO3(수성), 물, 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 농축시켜 조물질을 제공하고, 이것을 실리카젤 크로마토그래피에 의해서 정제시켜 중간체 69(2.0g, 3단계에 대해서 33.8%)을 백색 고체로서 제공하였다.
1H NMR (CDCl3, 400MHz): δ (ppm) 7.32~7.41 (m, 5H), 4.86 (d, 1H, J=11.2Hz), 4.52 (d, 1H, J=11.2Hz), 4.33 (d, 2H, J=12.4Hz), 3.55~3.57 (m, 1H), 3.00~3.03 (m, 1H), 2.81~2.84 (m, 1H), 1.89~1.97 (m, 2H), 1.61~1.64 (m, 1H), 1.45~1.53 (m, 2H).
중간체 70의 합성
Figure pct00201
DMF(40㎖) 중의 코어 3(2.3g, 5.4m㏖)의 용액에 Et3N(1.6g, 16.2m㏖)을 첨가하고, 이어서 DMF(10㎖) 중의 중간체 69(2.0g, 6m㏖)를 0 내지 10℃에서 적가하고, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. TLC(DCM/MeOH=10/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 이어서 혼합물을 빙수 중에 붓고, 여과시키고, 여과된 케이크를 MTBE로 세척하고, 진공 하에서 농축시켜 중간체 70(0.7g, 17.9%)을 적색 고체로서 제공하였다.
1H NMR (DMSO-d6, 400MHz): δ (ppm) 11.25 (s, 1H), 8.06 (s, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.59~7.65 (m, 2H), 7.32~7.37 (m, 5H), 7.15~7.20 (m, 1H), 6.73 (dd, 1H, J=2.0Hz, 9.6Hz), 6.54~6.56 (m, 1H), 5.63 (dd, 1H, J=2.4Hz, 10.0Hz), 4.74 (d, 1H, J=11.2Hz), 4.54~4.64 (m, 5H), 4.01 (t, 1H J=4.8Hz), 3.84~3.86 (m, 2H), 3.41~3.46 (m, 2H), 2.63~2.65 (m, 2H), 1.75~1.90(m, 1H),1.53~1.62 (m, 2H), 1.37~1.40 (m, 2H).
화합물 I-31의 합성
Figure pct00202
EtOH(20㎖) 중의 중간체 70(0.7g, 1.0m㏖)의 용액에 HCl(12M, 10㎖)을 첨가하였다. 혼합물을 5시간 동안 환류 가열시켰다. TLC(D/M=10/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 이어서 혼합물을 냉각시키고, Na2CO3(수성)로 pH=7 내지 8로 조정하고, 여과시키고, 여과된 케이크를 MTBE로 세척하고, 진공 하에서 농축시켜 화합물 I-31(211㎎, 30%)을 황색 고체로서 제공하였다.
1H NMR (DMSO-d6, 400MHz): δ (ppm) 11.25 (s, 1H), 8.06 (s, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.59~7.67 (m, 2H), 7.18~7.22 (m, 1H), 6.77~6.79 (m, 1H), 6.55 (t, 1H, J=6.8Hz), 6.17 (d, 1H, J=7.2Hz), 5.64 (dd, 1H, J=2.0 Hz, 10.0Hz), 4.64 (s, 2H), 4.56 (s, 2H), 3.77~3.85 (m, 3H), 3.42~3.46 (m, 2H), 2.59~2.67 (m, 2H), 1.73~1.74 (m, 1H), 1.60 (bm, 1H), 1.36~1.52 (m, 3H).
MS 계산치: 610.2; MS 실측치: 611.2 [M+1]+
화합물 I-32의 합성.
화합물 I-32 MS 계산치: 555.24; MS 실측치: 556.2 [M+1]+를 화합물 I-19의 합성과 동일한 방식으로 합성할 수 있다.
화합물 I-33의 합성.
화합물 I-33 MS 계산치: 569.26; MS 실측치: 570.2 [M+1]+을 화합물 I-8의 합성과 동일한 방식으로 합성할 수 있다.
화합물 I-34의 합성.
화합물 I-34 MS 계산치: 527.21; MS 실측치: 528.1 [M+1]+를 화합물 I-19의 합성과 동일한 방식으로 합성할 수 있다.
화합물 I-35의 합성.
화합물 I-35 MS 계산치: 541.22; MS 실측치: 542.1 [M+1]+를 화합물 I-19의 합성과 동일한 방식으로 합성할 수 있다.
화합물 I-36의 합성.
화합물 I-36 MS 계산치: 555.24; MS 실측치: 556.2 [M+1]+을 화합물 I-8의 합성과 동일한 방식으로 합성할 수 있다.
화합물 I-37의 합성.
화합물 I-37을 합성 반응식 14에 나타낸 바와 같이 합성할 수 있다.
중간체 72의 합성
Figure pct00203
THF(300㎖) 중의 화합물 71(5.0g, 23.3m㏖)의 용액에 2,4-다이메톡시benzaldehyde (3.9g, 23.3m㏖)를 첨가하고, 이어서 혼합물을 R.T.에서 2시간 동안 교반하였다. NaBHAc3(7.4g, 35m㏖)를 0℃에서 서서히 첨가하였다. 이어서 혼합물을 R.T.에서 3시간 동안 교반하였다. TLC(DCM/MeOH=10/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 혼합물을 빙수 중에 붓고, 분리시키고, 유기 상을 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 농축시켜 중간체 72(9g, 조물질)를 황색 오일로서 제공하였다.
중간체 73의 합성
Figure pct00204
DCM(300㎖) 중의 중간체 72(9.0g, 조물질)의 용액에 Et3N(7.5g, 74.1m㏖)을 0 내지 10℃에서 첨가하고, 이어서 DCM(30㎖) 중의 트라이포스젠(2.9g, 9.9m㏖)을 적가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. TLC(PE/EtOAc=3/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 이어서 혼합물을 빙수 중에 붓고, DCM으로 추출하고, 합한 유기상을 NaHCO3(수성), 물, 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 농축시켜 조물질을 제공하고, 이것을 실리카젤 크로마토그래피에 의해서 정제시켜 중간체 73(3.0g, 2단계에 대해서 30%)을 황색 고체로서 제공하였다.
1H NMR (CDCl3, 400MHz): δ (ppm) 7.07~7.19 (m, 1H), 6.45~6.49 (m, 2H), 4.65 (s, 1H), 4.54 (s, 1H), 4.09~4.14 (m, 2H), 3.81 (s, 3H), 3.80 (s, 3H,), 3.29 (d, 1H, J=6.8Hz), 3.14 (s, 1H), 2.64~2.67 (m, 2H), 1.90~1.91 (m, 1H), 1.60~1.66 (m, 2H), 1.46 (s, 9H), 1.12~1.18 (m, 2H).
중간체 74의 합성
Figure pct00205
DMF(30㎖) 중의 코어 3(2.8g, 6.4m㏖)의 용액에 Et3N(1.9g, 19.2m㏖)을 첨가하고, 이어서 DMF(5㎖) 중의 중간체 73(3.0g, 7.0m㏖)을 0 내지 10℃에서 적가하고, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. TLC(DCM/MeOH=10/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 이어서 혼합물을 빙수 및 MTBE 중에 붓고, 여과시키고, 여과된 케이크를 MTBE로 세척하고, 진공 하에서 농축시켜 중간체 74(1.2g, 24%)를 황색 고체로서 제공하였다.
1H NMR (DMSO-d6, 400MHz): δ (ppm) 11.23 (s, 1H), 8.09 (s, 1H), 7.91 (s, 1H), 7.57~7.64 (m, 2H), 7.08 (t, 1H, J=8.0Hz), 6.98 (d, 1H, J=8.4Hz), 6.71 (dd, 1H, J=1.6Hz, 9.2Hz), 6.49 (d, 1H, J=2.0Hz ), 6.42~6.45 (m, 2H), 5.59~5.62 (m, 1H), 4.65 (s, 2H), 4.53 (s, 2H), 4.14 (s, 2H), 3..82~3.88 (m, 4H), 3.72 (s, 3H), 3.62 (s, 3H), 2.75 (d, 2H, J=6.8Hz), 2.50~2.51 (m, 2H), 1.58 (s, 1H), 1.42~1.45 (m, 2H), 1.34 (s, 9H), 0.71~0.75 (m, 2H).
화합물 I-37의 합성
Figure pct00206
DCM(30㎖) 중의 중간체 74(1.2g, 1.5m㏖)의 용액에 HCl /다이옥산(7M, 10㎖)을 첨가하였다. 혼합물을 R.T.에서 2시간 동안 교반하였다. TLC(DCM/MeOH=10/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 이어서 혼합물을 빙수 중에 붓고, 여과시키고, 여과된 케이크를 물로 용해시키고, Na2CO3(수성)로 pH=7 내지 8로 조정하고, 다시 여과시키고, 여과된 케이크를 MTBE로 세척하고, 진공에서 건조시켜 화합물 I-37(0.27g, 32.9%)을 적색 고체로서 제공하였다.
1H NMR (DMSO-d6, 400MHz): δ (ppm) 8.07 (s, 1H), 7.90 (s, 1H), 7.64 (d, 2H, J=8.4Hz), 7.19~7.23 (m, 1H), 6.76~6.78 (m, 1H), 6.58~6.62 (t, 1H), 6.50 (s, 1H), 5.66 (dd, 1H, J=2.0Hz, 10.0 Hz), 4.78 (s, 2H), 4.53 (s, 2H), 3.90 (bm, 2H), 2.84 (s, 4H), 2.30~2.36 (m, 2H), 1.41 (bd, 3H, J=10.8Hz), 0.84~0.92 (m, 2H).
MS 계산치: 541.22; MS 실측치: 542.2 [M+1]+
화합물 I-38의 합성.
화합물 I-38 MS 계산치: 555.24; MS 실측치: 556.2 [M+1]+을 화합물 I-19의 합성과 동일한 방식으로 합성할 수 있다.
화합물 I-39의 합성.
화합물 I-39 MS 계산치: 569.26; MS 실측치: 570.3 [M+1]+를 화합물 I-8의 합성과 동일한 방식으로 합성할 수 있다.
화합물 I-40의 합성.
화합물 I-40 MS 계산치: 539.21; MS 실측치: 540.2 [M+1]+을 화합물 I-8의 합성과 동일한 방식으로 합성할 수 있다.
화합물 I-41의 합성.
화합물 I-41 MS 계산치: 581.26; MS 실측치: 582.3 [M+1]+을 화합물 I-8의 합성과 동일한 방식으로 합성할 수 있다.
화합물 I-42의 합성.
화합물 I-42 MS 계산치: 581.26; MS 실측치: 582.3 [M+1]+를 화합물 I-8의 합성과 동일한 방식으로 합성할 수 있다.
화합물 I-43의 합성.
화합물 I-43 MS 계산치: 636.14; MS 실측치: 637.1 [M+1]+을 화합물 I-18의 합성과 동일한 방식으로 합성할 수 있다.
화합물 I-44의 합성.
화합물 I-44 MS 계산치: 614.17; MS 실측치: 615.1 [M+1]+를 화합물 I-18의 합성과 동일한 방식으로 합성할 수 있다.
화합물 I-45의 합성.
화합물 I-45 MS 계산치: 562.24; MS 실측치: 563.3 [M+1]+를 화합물 I-36의 합성과 동일한 방식으로 합성할 수 있다.
화합물 I-46의 합성.
화합물 I-46 MS 계산치: 576.26; MS 실측치: 577.3 [M+1]+을 화합물 I-39의 합성과 동일한 방식으로 합성할 수 있다.
화합물 I-47의 합성.
화합물 I-47 MS 계산치: 588.26; MS 실측치: 589.3 [M+1]+을 화합물 I-42의 합성과 동일한 방식으로 합성할 수 있다.
화합물 I-48의 합성.
화합물 I-48 MS 계산치: 530.19; MS 실측치: 531.2 [M+1]+을 합성 반응식 15에 나타낸 바와 같이 합성하여 중간체 79를 생성하였다. 중간체 79를 반응식 6(중간체 23에서 코어 3으로) 및 반응식 8(중간체 42에서 중간체 I-9로)에 나타낸 바와 같이 최종 생성물까지 수행하였다.
중간체 76의 합성
Figure pct00207
무수 THF(130㎖) 중의 중간체 75(20g, 98.5m㏖)의 용액에 BH3.Me2S(10M, 49㎖, 492.6m㏖)를 R.T.에서 N2 하에서 첨가하였다. 혼합물을 RT에서 2시간 동안 교반하고, 이어서 50℃까지 1시간 동안 가열시켰다. TLC(DCM/MeOH=5/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 혼합물을 R.T.까지 냉각시키고, MeOH(50㎖)를 0℃에서 서서히 첨가하고, 혼합물 용액을 농축시켜 조물질 중간체 76(20g, 100% 초과)을 황색 고체로서 수득하였다.
1H NMR (DMSO-d6): δ (ppm) 8.32 (dd, 1H, J=7.2Hz, 10.4Hz), 7.80 (dd, 1H, J=8.0Hz, 11.6Hz), 5.77-5.79 (t, 1H), 4.82 (d, 2 H, J=3.6Hz).
중간체 77의 합성.
Figure pct00208
화합물 I-46의 합성.
THF(300㎖) 중의 중간체 76(20g, 조물질)의 용액에 MnO2(42.8g, 492.5m㏖)를 R.T.에서 N2 하에서 첨가하였다. 혼합물을 80℃에서 5시간 동안 교반하였다. TLC(PE/EtOAc=5/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 이어서 혼합물을 여과시키고, 농축시켜 중간체 77(20g, 100% 초과)을 황색 오일로서 제공하였다. 1H NMR (DMSO-d6): δ (ppm) 10.17 (s, 1H), 8.45-8.50 (dd, 1H, J=6.8Hz, 10.0Hz), 7.99-8.04 (dd, 1H, J=8.0Hz, 10.0Hz).
중간체 78의 합성.
Figure pct00209
무수 톨루엔(180㎖) 중의 중간체 77(20g, 조물질)의 용액에 n-BuOH(26g) 및 TsOH(2g)를 R.T.에서 첨가하였다. 혼합물 반응물을 120℃에서 3시간 동안 교반하였다. 그리고 딘-스탁 장치를 사용하여 물을 제거하였다. TLC(PE/EtOAc=5/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 혼합물을 진공 하에서 농축시켜 조물질 화합물을 제공하였다. 조물질 화합물을 실리카젤 상의 크로마토그래피(PE/EtOAc =1:0에서 200:1로)에 의해서 정제시켜 중간체 78(15g, 3단계에 대해서 48%)을 황색 오일로서 수득하였다.
1H NMR (DMSO-d6): δ (ppm) 8.22-8.27 (dd, 1H, J=7.2Hz, 10.0Hz), 7.63-7.68 (dd, 1H, J=8.4Hz, 11.2Hz), 5.88 (s, 1H), 3.47-3.59 (m, 4H), 1.47-1.54 (m, 4H), 1.27-1.40 (m, 4H), 0.83-0.89 (m, 6H).
중간체 79의 합성.
Figure pct00210
THF(450㎖) 중의 중간체 78(15g, 47.3m㏖)의 용액에 바이닐마그네슘 브로마이드 용액(1M, 189㎖, 189.2m㏖)을 -40℃에서 N2 하에서 적가하였다. 혼합물을 -40℃에서 1시간 동안 교반하였다. TLC(PE/EtOAc =5/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었고, 수성 NH4Cl을 -40℃ 내지 0℃에서 첨가하고, EtOAc로 추출하고, 농축시켜 조물질 화합물을 제공하였다. 조물질 화합물을 실리카젤 상의 크로마토그래피에 의해서 정제시켜 화합물(10g)을 황색 오일로서 수득하였다. EtOAc(100㎖) 중의 화합물(10g)의 용액에 HCl(0.5 N, 100㎖)을 적가하였다. 혼합물을 R.T.에서 1시간 동안 교반하였다. TLC(PE/EtOAc =5/1)는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 혼합물을 수성 NaOH로 pH=8 내지 9로 조정하고, EtOAc로 추출하고, 합한 유기상을 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고, 진공 하에서 농축시켜 중간체 79(6g, 70.5%)를 황색 고체로서 제공하였다.
1H NMR (DMSO-d6): δ (ppm) 11.99 (s, 1H), 10.08 (s, 1H), 7.89-7.94 (dd, 1H, J=7.6Hz, 10.8Hz), 7.54 (d, 1H, J=3.2Hz), 6.72 (d, 1H, J=3.2Hz)
생물학적 실시예
검정:
저해 GSK3α 및 GSK3β에 대한 시험관내 효소 검정을 사용한 재조합 인간 GSK3을 사용한 효소 활성도.
효소 및 기질:
Figure pct00211
검정 조건:
키나제-글로 맥스(Kinase-Glo Max) 발광 키나제 검정 키트(프로메가(Promega))를 사용하여 검정을 수행하였다. 그것은 키나제 반응 이후에 용액 중에 남아있는 ATP의 양을 정량함으로써 키나제 활성도를 측정한다. 검정으로부터의 발광 신호는 존재하는 ATP의 양과 상관관계가 있고, 키나제 활성도의 양과 역의 상관관계가 있다. 화합물을 10% DMSO 중에 용해시키고, DMSO의 최종 농도가 반응물 모두 중에서 1%이도록 5㎕의 용해물을 50㎕의 반응물에 첨가하였다. 효소 반응을 30℃에서 40분 동안 수행하였다. 50㎕의 반응 혼합물은 40mM의 Tris, pH 7.4, 10mM의 MgCl2, 0.1㎎/㎖의 BSA, 2mM의 DTT, 0.1㎎/㎖의 GSKtide 기질, 10uM의 ATP 및 GSK3을 함유한다. 효소 반응 후, 50㎕의 키나제-글로 맥스 발광 키나제 검정 용액(프로메가)을 각각의 반응물에 첨가하였고, 플레이트를 15분 동안 실온에서 인큐베이션시킨다. 발광 신호를 바이오테크 시너지(BioTek Synergy) 2 마이크로플레이트 리더를 사용하여 측정하였다.
데이터 분석:
키나제 활성도 검정을 각각의 농도에서 중복해서 수행하였다. 발광 데이터를 컴퓨터 소프트웨어, 그래프패드 프리즘(Graphpad Prism)을 사용하여 분석하였다. 키나제의 부재 하에서의 발광 강도(Lut)와 키나제의 존재 하에서의 발광 강도(Luc) 간의 차이를 100% 활성도(Lut - Luc)로서 정의하였다. 화합물의 존재 하에서의 발광 신호(Lu)를 사용하여, % 활성도를 하기와 같이 계산하였다: % 활성도 = {(Lut - Lu)/(Lut - Luc)}×100%, 식 중, Lu= 화합물의 존재 하에서의 발광 강도(0 미만의 모든 백분율 활성도를 표에 0이라고 나타내었음).
이어서 % 활성도의 값 대 일련의 화합물 농도를 수학식 Y=B+(T-B)/1+10((LogEC50-X)×힐(hill) 기울기)(식 중, Y= 활성도 백분율, B=활성도 최소 백분율, T=활성도 최대 백분율, X=화합물의 로그, 힐 기울기=기울기 인자 또는 힐 계수)으로 생성된 S자형 용량-반응 곡선의 비선형 회귀 분석을 사용하여 플롯팅하였다. 최대 활성도 백분율의 절반 값을 초래하는 농도에 의해서 IC50 값을 결정하였다.
화합물 대 GSK-알파 및 GSK-베타에 대한 활성도의 표:
본 명세서에서 표는 특정 화합물의 활성도를 나타낸다. 효력에 대해서, "+"는 약 1μM 초과를 나타내고; "++"는 약 100nM 내지 1μM을 나타내고; "+++"는 약 10nM 내지 100nM을 나타내고, "++++"는 약 1nM 내지 10nM을 나타낸다.
Figure pct00212
Figure pct00213
검정: 마우스 균주
Lgr5-EGFP-IRES-Cre-ER 마우스(Barker et al., 2007) (http://jaxmice.jax.org/strain/008875.html)를 사용하여 와우 줄기세포 확장에 대한 소분자의 효과를 분석한다.
내이로부터의 줄기세포의 단리: 모든 동물 연구는 미국 국립보건원 가이드라인(National Institutes of Health guideline)에 따른 승인된 제도적 프로토콜 하에서 수행한다. 신생아 마우스(생후 1 내지 3일)를 사용한 실험의 경우, 와우를 HBSS 중에서 해부하고, 코르티 기관을 혈관조(stria vascularis) 및 와우축으로부터 분리시킨다. 이어서 코르티 기관을 세포 회수 용액(코닝(Corning))으로 1시간 동안 처리하여 기저 간충직으로부터 와우 상피를 분리시킨다. 이어서 상피를 수집하고, TrypLE(라이프 테크놀로지스(Life Technologies))로 15 내지 20분 동안 37˚C에서 처리한다. 기계적 배산(trituration)에 의해서 수득된 단일 세포를 여과시키고(40㎛), 마트리겔(코닝) 중에 3D 배양을 위해서 현탁시킨다.
Lgr5-양성 세포의 확장
세포를 글루타맥스(Glutamax)(킵코(GIBCO)), N2, B27(인비트로젠(Invitrogen)), EGF(50ng/㎖; 케미콘(Chemicon)), bFGF(50ng/㎖; 케미콘), IGF1(50ng/㎖; 케미콘) 및 본 명세서에 제공된 조성물이 보충된, DMEM 및 F12의 1:1 혼합물 중에서 배양한다. 배지를 격일로 변경한다.
특정 약물을 첨가하거나 또는 약물을 첨가하지 않고 성장 인자를 제거한 후에 Lgr5-양성 전구체 세포 줄기세포 집락의 분화를 글루타맥스(깁코), N2, B27(인비트로젠)이 보충된 DMEM 및 F12의 1:1 혼합물 중에서 분화시킨다. 소분자를 배양물에 첨가하여 분화에 대한 이의 효과를 시험한다.
분석
Lgr5-양성 세포를 다양한 조건에서 배양물 중에서 10일(D10) 후에 정량한다. 세포 집락을 TrypLE(깁코)를 사용하여 단일 세포로 해리시킨다. 이어서 세포를 프로피듐 아이오다이드(PI)로 염색하고, Lgr5-GFP 발현에 대해서 유세포 분석기를 사용하여 분석한다. GFP-양성 세포의 수 및 GFP-양성 세포의 백분율을 정량한다.
Atoh1-nGFP-양성 세포를 분화 처리 0일(D0) 및 10일(D10)에 정량하여 분화된 유모 세포의 수를 결정한다. 세포 집락을 세포 회수 용액 중에서 인큐베이션시켜 마트리겔로부터 집락을 방출시키고 TrypLE를 사용하여 단일 세포로 해리시킨다. GFP-양성 세포의 총 수 및 백분율을 다수의 배양 조건에 대해서 유세포 분석기를 사용하여 정량한다. ANOVA를 사용하여 조건에 따른 평균치를 비교하고, 이측 스튜던트 T-시험을 사용하여 각각의 조건을 최고 수율을 갖는 처리와 비교한다.
본 명세서에서 표는 특정 화합물의 활성도를 나타낸다. 효력에 대해서, "+"는 약 1μM 초과를 나타내고; "++"는 약 100nM 내지 1μM을 나타내고; "+++"는 약 1nM 내지 100nM을 나타낸다. 세포의%에 대해서, "+"는 약 0 내지 5%를 나타내고; "++"는 약 6 내지 10%를 나타내고; "+++"는 약 11% 초과를 나타낸다.
Figure pct00214
Figure pct00215

Claims (73)

  1. 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 호변이성질체:
    Figure pct00216

    식 중,
    Q1는 CH 또는 N이고;
    Q2는 C 또는 N이며;
    Q3은 C 또는 N이되;
    Q1, Q2 및 Q3 중 적어도 하나는 N이고;
    R1은 수소, 할로, C1-C4알킬, C1-C4알켄일, C1-C4알킨일, -CN, -OH, -O-C1-C4알킬, -NH2, -NHC(O)R1a 및 -S(O)2NH2로 이루어진 군으로부터 선택되되; 상기 알킬은 할로 및 -OH로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환체로 선택적으로 치환되고; R1a는 C1-C4알킬이고;
    R2는 할로, C1-C4알킬, C1-C4알켄일, C1-C4알킨일, -CN, -OH, -O-C1-C4알킬, -NH2, -NH(C1-C4알킬), -N(C1-C4알킬)2, -NHC(O)R2a, 및 -S(O)2NH2로 이루어진 군으로부터 선택되되; 상기 알킬은 할로 및 OH로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환체로 선택적으로 치환되고; R2a는 C1-C4알킬이고;
    R3은 수소, 할로, C1-C4알킬, C1-C4알켄일, C1-C4알킨일, -CN, -OH, -O-C1-C4알킬, -NH2, -NHC(O)R3a, 및 -S(O)2NH2로 이루어진 군으로부터 선택되되; 상기 알킬은 할로 및 -OH로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환체로 선택적으로 치환되고; R3a는 C1-C4알킬이고;
    Ar은
    Figure pct00217

    Figure pct00218
    로 이루어진 군으로부터 선택되며;
    -Z-W-X-Y-는 -C(RZ)2-C(RW)2-N(RX)-C(RY)2-, -C(RZ)2-C(RW)2-CH(RX)-C(RY)2- 또는 -C(RW)2-CH(RX)-C(RY)2-이고;
    각각의 RZ는 수소, 중수소, 할로 및 C1-C4알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 RZ 기 둘 모두는 함께 C3-C6사이클로알킬 또는 옥소를 형성하며;
    각각의 RW는 수소, 중수소, 할로 및 C1-C4알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 RW 기 둘 모두는 함께 C3-C6사이클로알킬 또는 옥소를 형성하거나;
    또는 RZ와 RW는 이들이 부착되는 탄소와 함께 C3-C6사이클로알킬을 형성하고;
    RX는 -CORX1, -SO2RX1, 헤테로아릴 및 -(C1-C4알킬렌)-(C3-C8사이클로알킬)로 이루어진 군으로부터 선택되되, 상기 -(C1-C4알킬렌)-(C3-C8사이클로알킬)은 상기 C1-C4알킬렌 상에서 1개 내지 4개의 할로로 선택적으로 치환되고;
    RX1은 헤테로사이클릴이되, 상기 헤테로사이클릴은 중수소, 할로, -[C(RX1a)2]p-CN, -CF3, C1-C4알킬, -(CH2)p-OH, -[C(RX1a)2]p-OH, -[C(RX1a)2]p-O-C1-C4알킬, -NHCOC1-C4알킬, -CONHC1-C4알킬, -COH, -CO2H, -[C(RX1a)2]p-COO-C1-C4알킬, -(CH2)p-NH2, -[C(RX1a)2]p-NH2, -[C(RX1a)2]p-NH-C1-C4알킬, -[C(RX1a)2]p-N-(C1-C4알킬)2로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 12개의 치환체로 선택적으로 치환되고; p는 0, 1, 2 또는 3이며; 각각의 RX1a는 수소, 중수소, 할로, -CF3, 및 C1-C4알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 RX1a 기 둘 모두는 함께 C3-C6사이클로알킬을 형성하거나;
    또는 RX1은 N(RX2)2이되, RX2는 수소, 알킬, 치환된 알킬로부터 독립적으로 선택되고, 상기 알킬 치환기는 할로, 헤테로사이클 및 치환된 헤테로사이클일 수 있으며;
    각각의 RY는 수소, 중수소, 할로 및 C1-C4알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 RY 기 둘 모두는 함께 C3-C6사이클로알킬 또는 옥소를 형성하고; 그리고
    m은 0, 1 또는 2이되;
    단 상기 화합물은
    Figure pct00219
    가 아니다.
  2. 제1항에 있어서, RX는 -CORX1인, 화합물.
  3. 제2항에 있어서, RX1은 피페리딘, 2,8-다이아자스피로[4,5]데칸, 2,5-다이아자바이사이클로[2,2,1]헵탄, 또는 8-옥사-3-아자바이사이클로[3.2.1]옥탄이되, 이들 각각은 중수소, 할로, C1-C4알킬, -[C(RX1a)2]p-OH, -(CH2)p-NMe2, -(CH2)p-NHMe, -(CH2)p-NH2로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 12개의 치환체로 선택적으로 치환되고; p는 0, 1, 2 또는 3인, 화합물.
  4. 제3항에 있어서, RX1은 1 내지 6개의 할로 치환체로 선택적으로 치환된 피페리딘인, 화합물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 피페리딘은 -[C(RX1a)2]p-OH, -(CH2)p-NMe2로 선택적으로 치환된, 화합물.
  6. 제1항에 있어서, RX는 헤테로아릴인, 화합물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 헤테로아릴은 단환식 또는 이환식인, 화합물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 헤테로아릴은 1 내지 3개의 질소를 함유하는, 화합물.
  9. 제1항에 있어서, RX는 -(C1-C4알킬렌)-(C3-C8사이클로알킬)인, 화합물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 -(C1-C4알킬렌)-(C3-C8사이클로알킬)은 상기 C1-C4알킬렌 상에서 1개 또는 2개의 할로겐으로 치환된, 화합물.
  11. 제9항에 있어서, 상기 C3-C8사이클로알킬은 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸 또는 사이클로헥실인, 화합물.
  12. 하기 화학식 (Ia)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 호변이성질체:
    Figure pct00220

    식 중,
    Q1는 CH 또는 N이고;
    Q2는 C 또는 N이며;
    Q3은 C 또는 N이되;
    Q1, Q2 및 Q3 중 적어도 하나는 N이고;
    R1은 수소, 할로, C1-C4알킬, C1-C4알켄일, C1-C4알킨일, -CN, -OH, -O-C1-C4알킬, -NH2, -NHC(O)R3a 및 -S(O)2NH2로 이루어진 군으로부터 선택되되; 상기 알킬은 할로 및 -OH로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환체로 선택적으로 치환되고; R1a는 C1-C4알킬이고;
    R2는 수소, 할로, C1-C4알킬, C1-C4알켄일, C1-C4알킨일, -CN, -OH, -O-C1-C4알킬, -NH2, -NH(C1-C4알킬), -N(C1-C4알킬)2, -NHC(O)R2a, 및 -S(O)2NH2로 이루어진 군으로부터 선택되되; 상기 알킬은 할로 및 -OH로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환체로 선택적으로 치환되고; R2a는 C1-C4알킬이고;
    R3은 수소, 할로, C1-C4알킬, C1-C4알켄일, C1-C4알킨일, -CN, -OH, -O-C1-C4알킬, -NH2, -NHC(O)R3a, 및 -S(O)2NH2로 이루어진 군으로부터 선택되되; 상기 알킬은 할로 및 -OH로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환체로 선택적으로 치환되고; R3a는 C1-C4알킬이고;
    Ar은
    Figure pct00221

    Figure pct00222
    로 이루어진 군으로부터 선택되되; Ar은 중수소, 할로, 알킬, 알콕시 및 CN으로 선택적으로 치환되고;
    Q7은 S, O, CH2, 및 NRQ7로부터 선택되되; RQ7은 수소 또는 선택적으로 치환된 C1-C4알킬이고;
    -Z-W-X-Y-는 -C(RZ)2-C(RW)2-N(RX)-C(RY)2-, -C(RZ)2-C(RW)2-CH(RX)-C(RY)2- 또는 -C(RW)2-CH(RX)-C(RY)2-이고;
    각각의 RZ는 수소, 중수소, 할로 및 C1-C4알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 RZ 기 둘 모두는 함께 C3-C6사이클로알킬 또는 옥소를 형성하며;
    각각의 RW는 수소, 중수소, 할로 및 C1-C4알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 RW 기 둘 모두는 함께 C3-C6사이클로알킬 또는 옥소를 형성하거나;
    또는 RZ와 RW는 이들이 부착되는 탄소와 함께 C3-C6사이클로알킬을 형성하고;
    RX는 수소, RX1, -CORX1, -SO2RX1, -(C1-C4알킬렌)-RX1로 이루어진 군으로부터 선택되되, 상기 -(C1-C4알킬렌)-RX1은 상기 C1-C4알킬렌 상에서 1개 내지 4개의 할로로 선택적으로 치환되되;
    RX1은 C3-C8사이클로알킬, 헤테로아릴 또는 헤테로사이클릴이되, 상기 헤테로사이클릴은 중수소, 할로, -[C(RX1a)2]p-CN, -CF3, C1-C4알킬, -(CH2)p-OH, -[C(RX1a)2]p-OH, -[C(RX1a)2]p-O-C1-C4알킬, -NHCOC1-C4알킬, CONHC1-C4알킬, COH, -CO2H, -[C(RX1a)2]p-COO-C1-C4알킬, -(CH2)p-NH2, -[C(RX1a)2]p-NH2, -[C(RX1a)2]p-NH-C1-C4알킬, -[C(RX1a)2]p-N-(C1-C4알킬)2로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 12개의 치환체로 선택적으로 치환되고; p는 0, 1, 2 또는 3이며; 각각의 RX1a는 수소, 중수소, 할로, -CF3, 및 C1-C4알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 RX1a 기 둘 모두는 함께 C3-C6사이클로알킬을 형성하거나;
    또는 RX1은 N(RX2)2이되, RX2는 수소, 알킬, 치환된 알킬로부터 독립적으로 선택되고, 상기 알킬 치환기는 할로, 헤테로사이클 및 치환된 헤테로사이클일 수 있으며;
    각각의 RY는 수소, 중수소, 할로 및 C1-C4알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 RY 기 둘 모두는 함께 C3-C6사이클로알킬 또는 옥소를 형성하고; 그리고
    m은 0, 1 또는 2이다.
  13. 하기 화학식 (Ib)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 호변이성질체:
    Figure pct00223

    식 중,
    Q1는 CH 또는 N이고;
    Q2는 C 또는 N이며;
    Q3은 C 또는 N이되;
    Q1, Q2 및 Q3 중 적어도 하나는 N이되; 단 Q1이 CH이고, Q3이 C인 경우, Q2는 N이 아니고;
    R1은 수소, 할로, C1-C4알킬, C1-C4알켄일, C1-C4알킨일, -CN, -OH, -O-C1-C4알킬, -NH2, -NHC(O)R3a 및 -S(O)2NH2로 이루어진 군으로부터 선택되되; 상기 알킬은 할로 및 -OH로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환체로 선택적으로 치환되고; R1a는 C1-C4알킬이고;
    R2는 수소, 할로, C1-C4알킬, C1-C4알켄일, C1-C4알킨일, -CN, -OH, -O-C1-C4알킬, -NH2, -NH(C1-C4알킬), -N(C1-C4알킬)2, -NHC(O)R2a, 및 -S(O)2NH2로 이루어진 군으로부터 선택되되; 상기 알킬은 할로 및 -OH로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환체로 선택적으로 치환되고; R2a는 C1-C4알킬이며;
    R3은 수소, 할로, C1-C4알킬, C1-C4알켄일, C1-C4알킨일, -CN, -OH, -O-C1-C4알킬, -NH2, -NHC(O)R3a, 및 -S(O)2NH2로 이루어진 군으로부터 선택되되; 상기 알킬은 할로 및 -OH로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환체로 선택적으로 치환되고; R3a는 C1-C4알킬이고;
    Ar은
    Figure pct00224

    Figure pct00225
    로 이루어진 군으로부터 선택되되; Ar은 중수소, 할로, 알킬, 알콕시 및 CN으로 선택적으로 치환되고;
    각각의 Q6은 CRQ6 및 N으로부터 독립적으로 선택되되; CRQ6은 수소, 할로, -CN, 저급 알킬 또는 치환된 알킬이며;
    Q7은 S, O, CH2, 및 NRQ7로부터 선택되되; RQ7은 수소 또는 선택적으로 치환된 C1-C4알킬이고;
    -Z-W-X-Y-는 -C(RZ)2-C(RW)2-N(RX)-C(RY)2-, -C(RZ)2-C(RW)2-CH(RX)-C(RY)2- 또는 -C(RW)2-CH(RX)-C(RY)2-이고;
    각각의 RZ는 수소, 중수소, 할로 및 C1-C4알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 RZ 기 둘 모두는 함께 C3-C6사이클로알킬 또는 옥소를 형성하며;
    각각의 RW는 수소, 중수소, 할로 및 C1-C4알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 RW 기 둘 모두는 함께 C3-C6사이클로알킬 또는 옥소를 형성하거나;
    또는 RZ와 RW는 이들이 부착되는 탄소와 함께 C3-C6사이클로알킬을 형성하고;
    RX는 수소, RX1, -CORX1, -SO2RX1, -(C1-C4알킬렌)-RX1로 이루어진 군으로부터 선택되되, 상기 -(C1-C4알킬렌)-RX1은 상기 C1-C4알킬렌 상에서 1개 내지 4개의 할로로 선택적으로 치환되고;
    RX1은 C3-C8사이클로알킬, 헤테로아릴 또는 헤테로사이클릴이되, 상기 헤테로사이클릴은 중수소, 할로, -[C(RX1a)2]p-CN, -CF3, C1-C4알킬, -(CH2)p-OH, -[C(RX1a)2]p-OH, -[C(RX1a)2]p-O-C1-C4알킬, -NHCOC1-C4알킬, CONHC1-C4알킬, COH, -CO2H, -[C(RX1a)2]p-COO-C1-C4알킬, -(CH2)p-NH2, -[C(RX1a)2]p-NH2, -[C(RX1a)2]p-NH-C1-C4알킬, -[C(RX1a)2]p-N-(C1-C4알킬)2로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1 내지 12개의 치환체로 선택적으로 치환되고; p는 0, 1, 2 또는 3이며; 각각의 RX1a는 수소, 중수소, 할로, -CF3, 및 C1-C4알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 RX1a 기 둘 모두는 함께 C3-C6사이클로알킬을 형성하거나;
    또는 RX1은 N(RX2)2이되, RX2는 수소, 알킬, 치환된 알킬로부터 독립적으로 선택되고, 상기 알킬 치환기는 할로, 헤테로사이클 및 치환된 헤테로사이클일 수 있으며;
    각각의 RY는 수소, 중수소, 할로 및 C1-C4알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 RY 기 둘 모두는 함께 C3-C6사이클로알킬 또는 옥소를 형성하고; 그리고
    m은 0, 1 또는 2이다.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, Q1은 CH이고; Q2는 N이며; 그리고 Q3은 C인, 화합물.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, Q1은 N이고; Q2는 C이며; 그리고 Q3은 N인, 화합물.
  16. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, Q1은 CH이고; Q2는 C이며; 그리고 Q3은 N인, 화합물.
  17. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, Q1은 N이고; Q2는 N이며; 그리고 Q3은 C인, 화합물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, R1은 수소 또는 할로인, 화합물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, R2는 할로인, 화합물.
  20. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, R2는 할로, -CF3, -CN, -C≡CH, NH2, 및 -NHC(O)CH3로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, R3은 수소 또는 할로인, 화합물.
  22. 제1항 및 제13항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, Ar은
    Figure pct00226
    인, 화합물.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, -Z-W-X-Y-는 -C(RZ)2-C(RW)2-N(RX)-C(RY)2-인, 화합물.
  24. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, -Z-W-X-Y-는 -C(RZ)2-C(RW)2-CH(RX)-C(RY)2-인, 화합물.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 각각의 RZ는 수소 및 할로로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 화합물.
  26. 제23항 또는 제24항에 있어서, RZ 기 둘 모두는 함께 C3-C6사이클로알킬을 형성하는, 화합물.
  27. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, RZ 및 RW는 이들이 부착되는 탄소와 함께 C3-C6사이클로알킬을 형성하는, 화합물.
  28. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, -Z-W-X-Y-는 -C(RW)2-CH(RX)-C(RY)2-인, 화합물.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 RW는 수소 및 할로로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 화합물.
  30. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, RW 기 둘 모두는 함께 C3-C6사이클로알킬을 형성하는, 화합물.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 RY는 수소 및 할로로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 화합물.
  32. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, RY 기 둘 모두는 함께 C3-C6사이클로알킬을 형성하는, 화합물.
  33. 제12항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, RX는 RX1이되, RX1은 헤테로아릴인, 화합물.
  34. 제12항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, RX는 -CORX1인, 화합물.
  35. 제12항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, RX는 -SO2RX1인, 화합물.
  36. 제12항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, RX는 -(C1-C4알킬렌)-RX1인, 화합물.
  37. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, RX1은 C3-C8사이클로알킬인, 화합물.
  38. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, RX1은 헤테로사이클릴이되, 상기 헤테로사이클릴은 할로인 1 내지 12개의 치환체로 선택적으로 치환된, 화합물.
  39. 하기로 이루어진 군으로부터 선택된, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 호변이성질체:
    Figure pct00227

    Figure pct00228

    Figure pct00229

    Figure pct00230

    Figure pct00231

    Figure pct00232

    Figure pct00233

    Figure pct00234
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 호변이성질체, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  41. 제40항에 있어서, HDAC 저해제를 더 포함하는, 약제학적 조성물.
  42. 제40항에 있어서, TGF 베타 저해제를 더 포함하는, 약제학적 조성물.
  43. 제40항에 있어서, BMP 저해제를 더 포함하는, 약제학적 조성물.
  44. 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 폴록사머를 더 포함하는, 약제학적 조성물.
  45. 모 집단(parent population)을 포함하는 와우 조직(cochlear tissue)에서 와우 세포의 집단을 확장시키는 방법으로서, 상기 와우 조직을 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 호변이성질체 또는 제40항 내지 제44항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 와우 세포의 집단을 확장시키는 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 와우 조직은 대상체 내에 존재하는, 와우 세포의 집단을 확장시키는 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 와우 조직을 상기 조성물과 접촉시키는 단계는 상기 조성물을 상기 대상체에게 경고막으로(trans-tympanically) 투여함으로써 달성되는, 와우 세포의 집단을 확장시키는 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 와우 조직을 상기 조성물과 접촉시키는 단계는 상기 대상체의 개선된 청각 기능을 초래하는, 와우 세포의 집단을 확장시키는 방법.
  49. 줄기세포 집단에 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 호변이성질체 또는 제40항 내지 제44항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 투여하거나 또는 투여를 유발하는 단계를 포함하는, 조직 세포의 생성을 가능하게 하는 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 조직 세포는 와우 세포인, 조직 세포의 생성을 가능하게 하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 조직 세포는 내이 유모 세포(hair cell)인, 조직 세포의 생성을 가능하게 하는 방법.
  52. 줄기세포 집단에 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 호변이성질체 또는 제40항 내지 제44항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 투여하거나 또는 투여를 유발하는 단계를 포함하는, 특정 조직 세포의 부재 또는 결핍과 연관된 질환을 갖거나 또는 상기 질환의 발생 위험이 있는 대상체의 치료 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 조직 세포는 와우 세포인, 치료 방법.
  54. 제52항에 있어서, 상기 조직 세포는 내이 유모 세포인, 치료 방법.
  55. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 호변이성질체 또는 제40항 내지 제44항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 청력 손실을 갖거나 또는 청력 손실이 발생할 위험이 있는 대상체의 치료 방법.
  56. 제55항에 있어서, 상기 화합물은 상기 대상체의 와우 조직에 경고막으로 투여되는, 치료 방법.
  57. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을, 단독으로 또는 HDAC 저해제와 조합하여 투여하여, 와우 조직의 줄기세포 집단을 확장시키는 단계를 포함하는, 내이 유모 세포의 생성을 가능하게 하는 방법.
  58. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 호변이성질체, 단독으로 또는 HDAC 저해제와 조합하여 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물의 청력을 재생시키는 방법.
  59. 제57항 또는 제58항에 있어서, 상기 투여는 줄기세포 집단에 대한 것이거나 또는 생체내에서 대상체에 대한 것인, 포유동물의 청력을 재생시키는 방법.
  60. 내이 유모 세포를 생성시키는 방법으로서, 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 호변이성질체를, 단독으로 또는 HDAC 저해제와 조합하여 투여하는 단계를 포함하되, 생체내에서 초기 집단에서 LGR5+ 세포를 증식시켜, LGR5+ 세포의 확장된 집단을 초래하고, 내이 유모 세포의 생성을 초래하는, 내이 유모 세포를 생성시키는 방법.
  61. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 단독으로 또는 HDAC 저해제와 조합하여 투여하여, 장 상피의 줄기세포 집단을 확장시키는 단계를 포함하는, 장 세포의 생성을 가능하게 하는 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기 장 상피가 재생되는, 장 세포의 생성을 가능하게 하는 방법.
  63. 제61항에 있어서, 상기 방법은 화학요법-유도된 위장 점막염, 이식편대숙주병(Graph Versus Host Disease), 위궤양, 크론(Crohns) 또는 궤양성 대장염과 관련된 손상된 점막의 수선을 촉진시키기 위한 치료인, 장 세포의 생성을 가능하게 하는 방법.
  64. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을, 단독으로 또는 HDAC 저해제와 조합하여 투여하는 단계를 포함하는, 장 상피의 Lgr5+ 세포 집단을 확장시키는 방법.
  65. 포유동물에서 Lgr5+ 세포 집단 장 세포를 재생시키기 위해서, 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 호변이성질체를 단독으로 또는 HDAC 저해제와 조합하여 사용하는 방법.
  66. 제65항에 있어서, 상기 방법은 화학요법-유도된 위장 점막염, 이식편대숙주병, 위궤양, 크론 또는 궤양성 대장염과 관련된 손상된 점막의 상기 수선을 촉진시키기 위한 치료인, 방법.
  67. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 투여하는 단계를 포함하는, Lgr5+ 상피 세포를 생체내에서 증식시키는 방법.
  68. 전정 조직(vestibular tissue)에서 전정 세포의 집단을 확장시키는 방법으로서, 상기 전정 조직을 (i) 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 및 (ii) TGF-β 저해제와 접촉시켜 상기 전정 조직에서 세포의 확장된 집단을 형성하는 단계를 포함하는, 전정 세포의 집단을 확장시키는 방법.
  69. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 호변이성질체; 및 경고막 투여 장치(trans-tympanic administrative device)를 포함하는, 특정 조직 세포의 부재 또는 결핍과 연관된 질환을 갖거나 또는 상기 질환의 발생 위험이 있는 대상체를 치료하기 위한 시스템.
  70. 특정 조직 세포의 부재 또는 결핍과 연관된 질환을 갖거나 또는 상기 질환의 발생 위험이 있는 대상체를 치료하는 데 사용하기 위한, 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 호변이성질체.
  71. 청력 손실을 갖거나 또는 청력 손실의 발생 위험이 있는 대상체를 치료하는 데 사용하기 위한, 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 호변이성질체.
  72. 특정 조직 세포의 부재 또는 결핍과 연관된 질환을 갖거나 또는 상기 질환의 발생 위험이 있는 대상체를 치료하기 위한 의약의 제조에서의, 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 호변이성질체의 용도.
  73. 청력 손실을 갖거나 또는 청력 손실의 발생 위험이 있는 대상체를 치료하기 위한 의약의 제조에서의, 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 호변이성질체의 용도.
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