EA029485B1 - Способы лечения рака, выбранного из лимфомы, лейкоза, миеломы, глиобластомы, рака ободочной и прямой кишки и печеночно-клеточной карциномы, с использованием 3-(4-((4-(морфолинометил)бензил)окси)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-диона - Google Patents

Abstract

В рамках изобретения предусматривается способ лечения рака, который включают введение пациенту 3-(4-((4-(морфолинометил)бензил)окси)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-диона, или его энантиомера, или смеси энантиомеров, или его фармацевтически приемлемой соли, где рак представляет собой лимфому, лейкоз, миелому, глиобластому, рак ободочной и прямой кишки или печеночно-клеточную карциному.

Description

настоящее изобретение охватывает способ увеличения дозировки лекарственного средства или вещества против рака, которую можно безопасно и эффективно вводить пациенту, который включает введение пациенту (например, человеку) соединения, описанного в настоящем описании, или его энантиомера или смеси энантиомеров, или их фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, сокристалла, клатрата или полиморфа. Пациенты, для которых является полезным этот способ, представляют собой пациентов, которые вероятно будут иметь неблагоприятный эффект, ассоциированный с лекарственными средствами против рака для лечения конкретного рака кожи, подкожной ткани, лимфатических узлов, головного мозга, легкого, печени, костей, кишечника, толстой кишки, сердца, поджелудочной железы, надпочечника, почки, предстательной железы, молочной железы, ободочной и прямой кишки или их комбинаций. Введение соединения, описанного в настоящем описании, например соединения формулы (I), или его энантиомера или смеси энантиомеров, или их фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, сокристалла, клатрата или полиморфа, смягчает или уменьшает неблагоприятные эффекты, которые имеют такую тяжесть, что это в ином случае ограничило бы количество лекарственного средства против рака.

В одном варианте осуществления соединение, описанное в настоящем описании, например соединение формулы (I), или его энантиомер или смесь энантиомеров, или их фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат, сокристалл, клатрат или полиморф, вводят перорально и ежедневно в количестве в диапазоне от приблизительно 0,1 до приблизительно 150 мг, от приблизительно 1 до приблизительно 50 мг или от приблизительно 2 до приблизительно 25 мг до, во время или после возникновения неблагоприятного эффекта, ассоциированного с введением пациенту лекарственного средства против рака. В определенных вариантах осуществления соединение, описанное в настоящем описании, например соединение формулы (I), или его энантиомер или смесь энантиомеров, или их фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат, сокристалл, клатрат или полиморф, вводят в комбинации с определенными средствами, такими как гепарин, аспирин, коумадин или Ο-ί''5Ρ. чтобы избежать неблагоприятных эффектов, которые ассоциированы с лекарственными средствами против рака, таких как, но не ограничиваясь ими, нейтропения или тромбоцитопения.

В одном варианте осуществления соединение, описанное в настоящем описании, например соединение формулы (I), или его энантиомер или смесь энантиомеров, или их фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат, сокристалл, клатрат или полиморф, вводят пациентам с заболеваниями и нарушениями, ассоциированными или характеризующимися нежелательным ангиогенезом в комбинации с дополнительными активными ингредиентами, включая, но не ограничиваясь ими, лекарственные средства против рака, противовоспалительные лекарственные средства, антигистамины, антибиотики и стероиды.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение охватывает способ лечения, предупреждения и/или управления течением рака, который включает введение соединения формулы (I), или его энантиомера или смеси энантиомеров, или их фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, сокристалла, клатрата или полиморфа, совместно с (например, до, во время или после) общепринятой терапией, включая, но не ограничиваясь ими, хирургическую операцию, иммунотерапию, биологическую терапию, лучевую терапию или другую немедикаментозную терапию, используемую в настоящее время для лечения, предупреждения или управления течением рака. Комбинированное применение соединения, описанного в настоящем описании, и общепринятой терапии может обеспечить уникальный режим лечения, который является неожиданно эффективным у определенных пациентов. Без связи с теорией полагают, что соединение формулы (I) может обеспечить аддитивные или синергические эффекты при введении одновременно с общепринятой терапией.

Как описано в настоящем описании, настоящее изобретение охватывает способ снижения, лечения и/или предупреждения неблагоприятных или нежелательных эффектов, ассоциированных с общепринятой терапией, включая, но не ограничиваясь ими, хирургическую операцию, химиотерапию, лучевую терапию, гормональную терапию, биологическую терапию и иммунотерапию. Соединение, описанное в настоящем описании, например соединение формулы (I), или его энантиомер или смесь энантиомеров, или их фармацевтически приемлемую соль, сольват гидрат, сокристалл, клатрат или полиморф, и другой активный ингредиент можно вводить пациенту до, во время или после возникновения неблагоприятного эффекта, ассоциированного с общепринятой терапией.

В одном варианте осуществления соединение формулы (I) можно вводить в количестве в диапазоне от приблизительно 0,1 до приблизительно 150 мг, от приблизительно 1 до приблизительно 25 мг или от приблизительно 2 до приблизительно 10 мг перорально и ежедневно отдельно или в комбинации со вторым активным средством, описанным в настоящем описании (см., например, раздел 5.4), до, во время или после применения общепринятой терапии.

В определенных вариантах осуществления соединение, описанное в настоящем описании, например, соединение формулы (I), или его энантиомер или смесь энантиомеров, или их фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат, сокристалл, клатрат или полиморф, и доксетаксол вводят пациентам с немелкоклеточным раком легкого, которых ранее лечили карбо/УР 16 и лучевой терапией.

5.6.3. Терапия курсами.

- 22 029485

В определенных вариантах осуществления профилактические или терапевтические средства, описанные в настоящем описании, вводят пациенту курсами. Терапия курсами включает введение активного вещества в течение некоторого периода времени с последующим периодом покоя, и повторение этого последовательного введения. Терапия курсами может снижать развитие устойчивости к одному или нескольким способам терапии, предотвращать или снижать побочные эффекты одного из способов терапии и/или повышать эффективность лечения.

Следовательно, в определенных вариантах осуществления соединение формулы (I), или его энантиомер или смесь энантиомеров, или их фармацевтически приемлемую соль, описанные в настоящем описании, вводят каждые сутки однократной или разделенными дозами курсом из от четырех до шести недель с периодом покоя, составляющим приблизительно неделю или две недели. Кроме того, курсовой способ позволяет увеличение частоты, количества и длительности курсов введения. Таким образом, в определенных вариантах осуществления настоящее изобретение охватывает введение соединения, описанного в настоящем описании, например, соединения формулы (I), или его энантиомера или смеси энантиомеров, или их фармацевтически приемлемой соли, в течение большего количества курсов, чем обычно, когда его вводят отдельно. В определенных вариантах осуществления соединение, описанное в настоящем описании, например соединение формулы (I), или его энантиомер или смесь энантиомеров, или их фармацевтически приемлемую соль, вводят в течение большего количества курсов, которое обычно вызвало бы ограничивающую дозу токсичность у пациента, которому не вводят второй активный ингредиент.

В одном варианте осуществления соединение формулы (I), или его энантиомер или смесь энантиомеров, или их фармацевтически приемлемую соль, вводят каждые сутки и непрерывно в течение трех или четырех недель в дозе от приблизительно 0,1 до приблизительно 150 мг/сутки с последующим перерывом, составляющим одну или две недели.

В другом варианте осуществления соединение формулы (I), или его энантиомер или смесь энантиомеров, или их фармацевтически приемлемую соль, и второй активный ингредиент вводят перорально, причем введение соединения формулы (I) осуществляют за 30-60 мин до второго активного ингредиента, во время курса из от четырех до шести недель. В определенных вариантах осуществления комбинацию соединения формулы (I), или его энантиомера или смеси энантиомеров, или их фармацевтически приемлемой соли, и второго активного ингредиента вводят посредством внутривенной инфузии в течение приблизительно 90 мин в каждом курсе. В определенных вариантах осуществления один курс включает введение от приблизительно 0,1 до приблизительно 150 мг/сутки соединения формулы (I), или его энантиомера или смеси энантиомеров, или их фармацевтически приемлемой соли, и от приблизительно 50 до приблизительно 200 мг/м²/сутки второго активного ингредиента ежедневно в течение от трех до четырех недель, за которым следует одна или две недели покоя. В определенных вариантах осуществления количество курсов, в течение которых у пациента проводят комбинированное лечение, находится в диапазоне от приблизительно одного до приблизительно 24 курсов, от приблизительно двух до приблизительно 16 курсов или от приблизительно четырех до приблизительно трех курсов.

5.7. Фармацевтические композиции и дозированные формы.

В одном варианте осуществления в рамках настоящего изобретения предусматриваются фармацевтические композиции и дозированные формы, которые включают соединение формулы (I), или его энантиомер или смесь энантиомеров, или их фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат, сокристалл, клатрат или полиморф. В другом варианте осуществления фармацевтические композиции и дозированные формы дополнительно содержат один или несколько эксципиентов.

В определенных вариантах осуществления фармацевтические композиции и дозированные формы, описанные в настоящем описании, также содержат один или несколько дополнительных активных ингредиентов. Следовательно, фармацевтические композиции и дозированные формы, описанные в настоящем описании, содержат соединение формулы (I), или его энантиомер или смесь энантиомеров, или их фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат, сокристалл, клатрат или полиморф, и второе активное вещество. Примеры необязательных вторых, или дополнительных, активных ингредиентов описаны в настоящем описании (смотрите, например, раздел 4.3).

Единичные дозированные формы, описанные в настоящем описании, пригодны для перорального введения, введения на слизистую оболочку (например, назального, сублингвального, вагинального, буккального или ректального), парентерального (например, подкожного, внутривенного, в виде болюсной инъекции, внутримышечного или внутриартериального), местного (например, глазные капли или другие офтальмологические препараты), трансдермального или чрескожного введения пациенту. Примеры дозированных форм включают, но не ограничиваются ими: таблетки; таблетки в форме капсул; капсулы, такие как мягкие эластичные желатиновые капсулы; крахмальные капсулы; лепешки; пастилки; дисперсии; суппозитории; порошки; аэрозоли (например, назальные аэрозоли или ингаляторы); гели; жидкие дозированные формы, пригодные для перорального введения или введения на слизнутую оболочку пациента, включая суспензии (например, водные или неводные жидкие суспензии, эмульсии типа "масло-вводе", или жидкие эмульсии "вода-в-масле"), растворы и эликсиры; жидкие дозированные формы, пригодные для парентерального введения пациенту; глазные капли или другие офтальмологические препа- 23 029485

раты, пригодные для местного введения; и стерильные твердые вещества (например, кристаллические или аморфные твердые вещества), которые можно разбавлять, получая жидкие дозированные формы, пригодные для парентерального введения пациенту.

Композиция, форма и тип дозированных форм, описанных в настоящем описании, могут варьировать в зависимости от их применения. Например, дозированная форма, используемая для неотложного лечения заболевания, может содержать более высокие количества одного или нескольких активных ингредиентов, чем дозированная форма, используемая для длительного лечения того же заболевания. Аналогично, парентеральная дозированная форма может содержать меньшие количества одного или нескольких активных ингредиентов, чем пероральная дозированная форма, используемая для лечения того же заболевания. См., например, КеттдЮпк РЬагтасеиИса1 δ^η^5, 18'¹' еб., Маск РиЬНзЫпд, ЕаЧоп РА (1990).

Пригодность конкретного эксципиента для включения в фармацевтическую композицию или дозированную форму, описанные в настоящем описании, зависит от множества факторов, включая, но не ограничиваясь ими, путь введения. Например, пероральные дозированные формы, такие как таблетки, могут содержать эксципиенты, не пригодные для применения в парентеральных дозированных формах. Пригодность конкретного эксципиента также может зависеть от конкретных активных ингредиентов в дозированной форме. Например, разложение некоторых активных ингредиентов может быть ускорено посредством некоторых эксципиентов, таких как лактоза, или под воздействием воды. Активные ингредиенты, которые содержат первичные или вторичные амины, являются особенно чувствительными к такому ускоренному разложению. Следовательно, настоящее изобретение охватывает фармацевтические композиции и дозированные формы, которые содержат небольшое количество или даже не содержат лактозы. Как используют в настоящем описании, термин "не содержащий лактозы" означает, что количество имеющейся лактозы, если она имеется, является недостаточным для существенного повышения уровня деградации активного ингредиента.

Не содержащие лактозы композиции, описанные в настоящем описании, могут содержать эксципиенты, которые приведены, например, в υ.δ. РЬагтасоре1а (υδΡ) 25-ΝΡ20 (2002). В определенных вариантах осуществления не содержащие лактозы композиции содержат активные ингредиенты, связующее вещество/наполнитель и смазывающее вещество в фармацевтически совместимых и фармацевтически приемлемых количествах. В определенных вариантах осуществления не содержащие лактозы дозированные формы содержат активные ингредиенты, микрокристаллическую целлюлозу, прежелатинизированный крахмал и стеарат магния.

Кроме того, настоящее изобретение охватывает безводные фармацевтические композиции и дозированные формы, содержащие активные ингредиенты, поскольку вода может способствовать деградации некоторых соединений. Например, добавление воды (например, 5%) широко принято в фармацевтической области в качестве способа моделирования длительного хранения в целях определения свойств, таких как срок хранения или стабильность составов с течением времени. См., например, 1еи8 Т. Саг8!еи8еи, Огид δΕώίΙίΙν: Ргтар1е8 & Ргасбсе, 2^пб Еб., Магсе1 Эеккег, ΝΥ, ΝΥ, 1995, р. 379-80. В действительности, вода и нагревание ускоряют разложение некоторых соединений. Таким образом, эффект воды на состав может быть значительным, поскольку жидкость и/или влага часто встречаются в ходе изготовления, обработки, упаковывания, хранения, транспортировки и применения составов.

Безводные фармацевтические композиции и дозированные формы, описанные в настоящем описании, можно получать с использованием безводных или содержащих низкое количество влаги ингредиентов и в условиях с низким содержанием жидкости или низким содержанием влаги. Фармацевтические композиции и дозированные формы, которые содержат лактозу и по меньшей мере один активный ингредиент, который содержит первичный или вторичный амин, предпочтительно являются безводными, если ожидается существенный контакт с влагой и/или жидкостью в ходе изготовления, упаковывания и/или хранения.

Безводную фармацевтическую композицию следует получать и хранить так, чтобы поддерживать безводные условия. Таким образом, в определенных вариантах осуществления настоящее изобретение охватывает безводные композиции, упакованные с использованием материалов, которые препятствуют воздействию воды, так что их можно включать в пригодные составные наборы. Примеры приемлемых упаковочных материалов включают, но не ограничиваются ими, герметичную фольгу, пластик, контейнеры для единичной дозы (например, ампула), блистерную упаковку и контурную упаковку.

Кроме того, настоящее изобретение охватывает фармацевтические композиции и дозированные формы, которые содержат одно или несколько соединений, которые уменьшают скорость деградации активного ингредиента. Такие соединения, которые в настоящем описании называют "стабилизаторами", включают, но не ограничиваются ими, антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, рН-буферы или солевые буферы.

Подобно количествам и типам эксципиентов количества и конкретные типы активных ингредиентов в дозированной форме могут различаться в зависимости от факторов, таких как, но не ограничиваясь ими, способ, посредством которого ее вводят пациентам. В определенных вариантах осуществления дозированные формы, описанные в настоящем описании, содержат соединение формулы (Ι), или его энан- 24 029485

тиомер или смесь энантиомеров, или их фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат, сокристалл, клатрат или полиморф, в количестве, находящемся в диапазоне от приблизительно 0,10 до приблизительно 1000 мг, от приблизительно 0,10 до приблизительно 500 мг, от приблизительно 0,10 до приблизительно 200 мг, от приблизительно 0,10 до приблизительно 150 мг, от приблизительно 0,10 до приблизительно 100 мг, или от приблизительно 0,10 до приблизительно 50 мг. В определенных вариантах осуществления дозированные формы, описанные в настоящем описании, содержат соединение формулы (I), или его энантиомер или смесь энантиомеров, или их фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат, сокристалл, клатрат или полиморф, в количестве, составляющем приблизительно 0,1, приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 5, приблизительно 7,5, приблизительно 10, приблизительно 12,5, приблизительно 15, приблизительно 17,5, приблизительно 20, приблизительно 25, приблизительно 50, приблизительно 100, приблизительно 150 или приблизительно 200 мг.

5.7.1. Пероральные дозированные формы.

В определенных вариантах осуществления фармацевтические композиции, описанные в настоящем описании, которые пригодны для перорального введения, составляют в качестве отдельных дозированных форм, примеры которых включают, но не ограничиваются ими, таблетки (например, жевательные таблетки), таблетки в форме капсул, капсулы и жидкости (например, сиропы с вкусовыми добавками). Такие дозированные формы содержат заданные количества активных ингредиентов и их можно получать некоторыми известными способами фармацевтики. См., главным образом, Кеттдйи'к Рйагтасеийса1 Зс1епсе8, 18'¹' еб., Маск РиЪйкЫид, ЕаМоп РА (1990).

В определенных вариантах осуществления пероральные дозированные формы, описанные в настоящем описании, получают комбинированием активных ингредиентов в однородной смеси по меньшей мере с одним эксципиентом в соответствии с общепринятыми способами изготовления фармацевтических препаратов. В зависимости от формы препарата, который намереваются вводить, эксципиентам можно придавать большое разнообразие форм. Например, эксципиенты, приемлемые для применения в пероральных жидких или аэрозольных дозированных формах, включают, но не ограничиваются ими, воду, гликоли, масла, спирты, ароматизаторы, консерванты и красители. Примеры наполнителей, пригодных для применения в твердых пероральных дозированных формах (например, порошках, таблетках, капсулах и таблетках в форме капсул) включают, но не ограничиваются ими, крахмалы, сахара, микрокристаллическую целлюлозу, разбавители, гранулирующие агенты, смазывающие вещества, связующие вещества и дезинтегрирующие вещества.

Вследствие простоты введения таблетки и капсулы представляют собой наиболее преимущественные дозированные формы, в случае которых используют твердые эксципиенты. Если желательно, на таблетки можно наносить покрытие стандартными способами нанесения водного и неводного покрытия. Такие дозированные формы можно получать некоторыми известными фармацевтическими способами. В определенных вариантах осуществления фармацевтические композиции и дозированные формы получают, равномерно и однородно смешивая активные ингредиенты с жидкими носителями, мелкоизмельченными твердыми носителями или и с теми и другими, а затем, если необходимо, придавая продукту желательную форму.

В определенных вариантах осуществления таблетку получают прессованием или формованием. В определенных вариантах осуществления прессованные таблетки получают прессованием в подходящем устройстве активных ингредиентов в сыпучей форме, например порошка или гранул, необязательно смешанных с эксципиентом. В определенных вариантах осуществления формованные таблетки изготавливают путем формования в пригодном устройстве смеси порошкованного соединения, смоченного инертным жидким разбавителем.

Примеры эксципиентов, которые можно использовать в пероральных дозированных формах, описанных в настоящем описании, включают, но не ограничиваются ими, связующие вещества, наполнители, дезинтегрирующие вещества и смазывающие вещества. Связующие вещества, пригодные для применения в фармацевтических композициях и дозированных формах, описанных в настоящем описании, включают, но не ограничиваются ими, кукурузный крахмал, картофельный крахмал или другие крахмалы, желатин, природные и синтетические камеди, такие как гуммиарабик, альгинат натрия, альгиновая кислота, другие альгинаты, порошковая трагакантовая камедь, гуаровая камедь, целлюлозу и ее производные (например, этилцеллюлозу, ацетат целлюллозы, карбоксиметилцеллюлозу кальция, карбоксиметилцеллюлозу натрия), поливинилпирролидон, метилцеллюлозу, прежелатинизированный крахмал, гидроксипропилметилцеллюлозу, (например, Νο. 2208, 2906, 2910), микрокристаллическую целлюлозу и их смеси.

Пригодные формы микрокристаллической целлюлозы включают, но не ограничиваются ими, АУ1СЕЬ-РН-101, АУ1СЕЬ-РН-103 АУ1СЕЬ КС-581, АУ1СЕЬ-РН-105 (РМС Согрогайоп, Атепсап Увсове ЭМбюп, Ауюе1 За1ек, Магсик Ноок, РА) и их смеси. Конкретное связующее вещество представляет собой смесь микрокристаллической целлюлозы и карбоксиметилцеллюлозы натрия (например, АУ1СЕЬ КС-581). Приемлемые безводные эксципиенты или эксципиенты с низким содержанием влаги включают АУ1СЕЬ-РН-103™ и крахмал 1500 ЬМ.

Примеры наполнителей, пригодных для применения в фармацевтических композициях и дозиро- 25 029485

ванных формах, описанных в настоящем описании, включают, но не ограничиваются ими, тальк, карбонат кальция (например, гранулы или порошок), микрокристаллическую целлюлозу, порошковую целлюлозу, декстраты, каолин, маннит, кремниевую кислоту, сорбитол, крахмал, прежелатизинированный крахмал и их смеси. В определенном варианте осуществления связующее вещество или наполнитель в фармацевтических композициях, описанных в настоящем описании, предоставлены в количестве от приблизительно 50 до приблизительно 99 мас.% фармацевтической композиции или дозированной формы.

Дезинтегрирующие вещества можно использовать в композициях, описанных в настоящем описании, для получения таблеток, которые способны дезинтегрировать под воздействием водного окружения. Таблетки, в которых содержится слишком много дезинтегрирующего вещества, могут дезинтегрировать при хранении, в то время как таблетки, которые содержат его слишком мало, могут не дезинтегрировать с требуемой скоростью или в требуемых условиях. Таким образом, для получения твердых пероральных дозированных форм, описанных в настоящем описании, следует применять достаточное количество дезинтегрирующего вещества, которое не является ни чрезмерным, ни недостаточным для того, чтобы отрицательным образом изменить высвобождение активных ингредиентов. Количество применяемого дезинтегрирующего вещества варьирует в зависимости от типа препарата. В определенных вариантах осуществления фармацевтические композиции, описанные в настоящем описании, содержат от приблизительно 0,5 до приблизительно 15 мас.% или от приблизительно 1 до приблизительно 5 мас.% дезинтегрирующего вещества.

Дезинтегрирующие вещества, которые пригодны для применения в фармацевтических композициях и дозированных формах, описанных в настоящем описании, включают, но не ограничиваются ими, агарагар, альгиновую кислоту, карбонат кальция, микрокристаллическую целлюлозу, кроскармелозу натрия, кросповидон, полакрилин калия, натрия крахмала гликолят, картофельный или маниоковый крахмал, другие крахмалы, прежелатинизированный крахмал, другие крахмалы, глины, другие альгины, другие виды целлюлозы, камеди и их смеси.

Смазывающие вещества, которые пригодны для применения в фармацевтических композициях и дозированных формах, описанных в настоящем описании, включают, но не ограничиваются ими, стеарат кальция, стеарат магния, минеральное масло, легкое минеральное масло, глицерин, сорбит, маннит, полиэтиленгликоль, другие гликоли, стеариновую кислоту, лаурилсульфат натрия, тальк, гидрогенизованное растительное масло (например, арахисовое масло, хлопковое масло, подсолнечное масло, кунжутное масло, оливковое масло, кукурузное масло и соевое масло), стеарат цинка, этилолеат, этиллауриат, агар и их смеси. Дополнительные смазывающие вещества включают, но не ограничиваются ими, силоидный силикагель (АЕКО81Ь 200, К. Сгасе Со., ВаШтоге, ΜΌ), коагулированный аэрозоль из синтетического диоксида кремния (Оеди55а Со. о£ Р1аио, ТХ), САВ-О-81Ь (пирогенный диоксид кремния, СаЬо! Со. о£ Войои, МА) и их смеси. В определенных вариантах осуществления смазывающие вещества, если их вообще используют, используют в количестве менее приблизительно 1 мас.% фармацевтических композиций или дозированных форм, в состав которых они включены.

В определенных вариантах осуществления в рамках настоящего изобретения предусматривается твердая пероральная дозированная форма, содержащая гидрохлорид соединения формулы (I), или его энантиомера или смеси энантиомеров, или их фармацевтически приемлемого сольвата, гидрата, сокристалла, клатрата или полиморфа; и безводную лактозу, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, стеариновую кислоту, коллоидный безводный диоксид кремния и желатин.

5.7.2. Дозированные формы с замедленным высвобождением.

В определенных вариантах осуществления активные ингредиенты, описанные в настоящем описании, вводят с помощью средств контролируемого высвобождения или с помощью устройств для доставки. Примеры включают, но не ограничиваются ими, средства и устройства, описанные в патентах США № 3845770, 3916899, 3536809, 3598123, 4008719, 5674533, 5059595, 5591767, 5120548, 5073543, 5639476, 5354556 и 5733566, каждый из которых включен в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. В определенных вариантах осуществления такие дозированные формы предназначены для применения для обеспечения медленного или контролируемого высвобождения одного или нескольких активных ингредиентов с использованием, например, гидропропилметилцеллюлозы, других полимерных матриц, гелей, проницаемых мембран, осмотических систем, многослойных покрытий, микрочастиц, липосом, микросфер или их комбинации для обеспечения желаемого профиля высвобождения в различных соотношениях. Настоящее изобретение охватывает единичные дозированные формы, пригодные для перорального введения, включая, но не ограничиваясь ими, таблетки, капсулы, желатиновые капсулы и таблетки в форме капсул, которые адаптированы для контролируемого высвобождения.

Все фармацевтические продукты с контролируемым высвобождением имеют общее назначение, связанное с улучшением лекарственной терапии по сравнению с терапией, достигаемой при применении неконтролируемых аналогов. В идеальном случае, применение оптимально разработанного препарата с контролируемым высвобождением характеризуется минимальным количеством лекарственного вещества, используемого для лечения или контроля состояния в течение минимального периода времени. Преимущества препаратов с контролируемым высвобождением включают продолжительную активность лекарственного средства, снижение частоты дозирования и повышение соблюдения режима и схемы ле- 26 029485

чения пациентом. Кроме того, препараты с контролируемым высвобождением можно использовать для влияния на время начала действия или другие характеристики, такие как уровень лекарственного средства в крови, и, таким образом, можно влиять на возникновение побочных (например, неблагоприятных) эффектов.

Большинство препаратов с контролируемым высвобождением разработано для первоначального высвобождения количества лекарственного средства (активного ингредиента), которое быстро вызывает требуемый терапевтический эффект, и постепенного и непрерывного высвобождения других количеств лекарственного средства для поддержания этого уровня терапевтического или профилактического эффекта в течение продолжительного периода времени. В целях поддержания этого постоянного уровня лекарственного средства в организме лекарственное средство должно высвобождаться из дозированной формы со скоростью, которая будет заменять количество лекарственного средства, метаболизируемого и экскретируемого из организма.

Контролируемое высвобождение активного ингредиента может стимулироваться различными условиями, включая, но не ограничиваясь ими, рН, температуру, ферменты, воду или другие физиологические условия или соединения.

5.7.3. Парентеральные дозированные формы.

Парентеральные дозированные формы можно вводить пациентам различными способами, включая, но не ограничиваясь ими, подкожное, внутривенное (включая болюсную инъекцию), внутримышечное и внутриартериальное введение. Вследствие того, что их введение, как правило, обходит природную защиту пациентов от загрязнителей, парентеральные дозированные формы предпочтительно стерильны или их можно стерилизовать перед введением пациенту. Примеры парентеральных дозированных форм включают, но не ограничиваются ими, готовые растворы для введения, сухие продукты, готовые к разведению или суспендированию в фармацевтически приемлемом носителе для инъекции, готовые суспензии для инъекции, и эмульсии.

Некоторые приемлемые носители, которые можно использовать для получения парентеральных дозированных форм, описанных в настоящем описании, включают, но не ограничиваются ими: воду для инъекций И8Р; водные носители, такие как, но не ограничиваясь ими, раствор хлорида натрия для инъекций, раствор Рингера для инъекций, раствор декстрозы для инъекций, раствор декстрозы и хлорида натрия для инъекций, и лактатный раствор Рингера для инъекций; растворимые в воде носители, такие как, но не ограничиваясь ими, этиловый спирт, полиэтиленгликоль и полипропиленгликоль; и неводные носители, такие как, но не ограничиваясь ими, кукурузное масло, хлопковое масло, арахисовое масло, кунжутное масло, этилолеат, изопропилмиристат и бензилбензоат.

Соединения, которые повышают растворимость одного или нескольких активных ингредиентов, описанных в настоящем описании, также можно включать в парентеральные дозированные формы, описанные в настоящем описании. Например, циклодекстрин и его производные можно использовать для повышения растворимости соединения, описанного в настоящем описании, например, соединения формулы (I), или его энантиомера или смеси энантиомеров, или их фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, сокристалла, клатрата или полиморфа. См., например, патент США №5134127, содержание которого включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

5.7.4. Дозированные формы для местного и мукозального применения.

Дозированные формы для местного и мукозального применения, описанные в настоящем описании, включают, но не ограничиваются ими, распыляемые растворы, аэрозоли, растворы, эмульсии, суспензии или другие формы, известные специалисту в данной области. См., например, РепипдЮп'з РЬагтасеийса1 8с1епсе8, 16* апй 18* ейз, Маск РиЪПзЫпд, ЕазФп РА (1980 & 1990) и Ιπΐτοά^ΐίοπ ΐο Рйагт1асеийса1 Όοδаде Ροπηδ, 4'¹ ей., Ьеа & РеЫдег, РЫ1айе1рЫа (1985). Дозированные формы, пригодные для нанесения на слизистые ткани полости рта, можно изготавливать в виде жидкостей для полоскания рта или в виде гелей для полости рта.

Приемлемые эксципиенты (например, носители и разбавители) и другие вещества, которые можно использовать для получения дозированных форм для местного и мукозального применения, охватываемых настоящим изобретением, зависят от конкретной ткани, на которую данная фармацевтическая композиция или дозированная форма будет нанесена. С учетом этого факта, в определенных вариантах осуществления типичные эксципиенты включают, но не ограничиваются ими, воду, ацетон, этанол, этиленгликоль, пропиленгликоль, бутан-1,3-диол, изопропилмиристат, изопропилпальмитат, минеральное масло и их смеси для получения растворов, эмульсий или гелей, которые являются не токсичными и фармацевтически приемлемыми. Также, если желательно, в фармацевтические композиции и дозированные формы можно добавлять увлажняющие или смачивающие вещества. Дополнительные примеры таких ингредиентов могут быть найдены, например, в Κет^идΐοи'δ Рйагтасеийса1 баепсез, 16* апй 18* ейз., Маск РиЪПзНтд, ЕазЮп РА (1980 & 1990).

Для повышения доставки одного или нескольких активных ингредиентов также можно корректировать рН фармацевтической композиции или дозированной формы. Аналогично, для повышения доставки можно корректировать полярность растворителя в носителе, его ионную силу или тоничность. Также для повышения доставки в фармацевтические композиции или дозированные формы модно добавлять со- 27 029485

единения, такие как стеараты, для преимущественного изменения гидрофильности или липофильности одного или нескольких активных ингредиентов. При этом стеараты могут служить в качестве липидного носителя в препарате, в качестве эмульгатора или поверхностно-активного вещества, и в качестве вещества для повышения доставки или для усиления проникновения. Для дополнительной коррекции качеств конечной композиции можно использовать различные соли, гидраты или сольваты активных ингредиентов.

6. Примеры

Определенные варианты осуществления изобретения иллюстрируются с помощью следующих неограничивающих примеров.

6.1. Получение 3-(4-((4-(морфолинометил)бензил)окси)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6диона

6.1.1. Метиловый эфир 3-гидрокси-2-метилбензойной кислоты

3-Гидрокси-2-метилбензойную кислоту (105 г, 690 ммоль) добавляли к МеΟН (800 мл) в 2-л круглодонной колбе с тремя горлышками, оборудованной конденсатором, термометром и элементом магнитной мешалки, а затем добавляли МеΟН (250 мл). К описанному выше раствору добавляли Η₂δΟ₄ (10 мл, 180 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при 62°С в течение 17 ч. Растворитель удаляли в вакууме. Осадок (200 мл) медленно добавляли в воду (600 мл) при комнатной температуре, и образовывалось белое твердое вещество. Суспензию перемешивали на ледяной бане в течение 30 мин и фильтровали. Твердое вещество промывали водой (5x250 мл) и сушили с получением метилового эфира 3-гидрокси-2метилбензойной кислоты в виде белого твердого вещества (100 г, выход 87%). Соединение использовали на следующей стадии без дальнейшей очистки:

ЖХ/МС: МН=167;

¹Н-ЯМР (ДМСО-Д6) δ 2,28 (с, 3Н, СН₃), 3,80 (с, 3Н, СН₃), 6,96-7,03 (м, 1Н, Аг), 7,09 (т, 1=7,8 Гц, 1Н, Аг), 7,14-7,24 (м, 1Н, Аг), 9,71 (с, 1Н, ОН).

6.1.2. Метиловый эфир 3-(трет-бутилдиметилсиланилокси)-2-метилбензойной кислоты

В 1-л колбу КВ с тремя горлышками, оборудованную элементом магнитной мешалки и термометром, добавляли ДМФА (300 мл), метил 3-гидрокси-2-метилбензоат (90 г, 542 ммоль) и имидазол (92 г, 1354 ммоль). К описанному выше раствору частями добавляли ТВЭМ8-С1 (90 г, 596 ммоль) для контроля внутренней температуры на уровне 15-19°С в течение 20 мин, и после добавления внутренняя температура падала ниже 1°С. Ледяную баню удаляли и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 ч. Реакционную смесь добавляли к ледяной воде (500 мл) и полученный раствор разделяли на две части (2x700 мл). Каждую часть экстрагировали ЕЮАс (700 мл). Каждый органический слой промывали холодной водой (350 мл) и рассолом (350 мл). Органические слои объединяли и сушили над Мд^д. Объединенный органический слой концентрировали с получением метилового эфира 3-(трет-бутилдиметилсиланилокси)-2-метилбензойной кислоты в виде светло-коричневого масла (160 г, выход неочищенного вещества 100%). Соединение использовали на следующей стадии без дальнейшей очистки: ЖХ/МС: МН=281;

- 28 029485

Ή-ЯМР (ДМСО-а₆) δ -0,21 (с, 6Н, СН₃, СН₃), 0,73-0,84 (м, 9Н, СН₃, СН₃, СН₃), 2,10 (с, 3Н, СН₃), 3,60 (с, 3Н, СН₃), 6,82 (дд, 1Н, Аг), 6,97 (т, 1=7,9 Гц, 1Н, Аг), 7,13 (дд, 1=1,1, 7,7 Гц, 1Н, Аг).

6.1.3. Метиловый эфир 2-бромметил-3-(трет-бутилдиметилсиланилокси)бензойной кислоты

ΝΒ3 (49,8 г, 280 ммоль) добавляли к метил 3-(трет-бутилдиметилсилилокси)-2-метилбензоату (78,4 г, 280 ммоль) в метилацетате (500 мл) при комнатной температуре с получением суспензии оранжевого цвета. Полученную реакционную смесь нагревали на масляной бане при 40°С и освещали с помощью лампы солнечного света мощностью 300 Вт в течение 4 ч. Реакционную смесь охлаждали и промывали раствором №-ьЗО₃ (2x600 мл, 50% насыщенная концентрация), водой (500 мл) и рассолом (600 мл). Органический слой сушили над МдЗО₄ и обесцвечивали углем. Органический слой концентрировали с получением метилового эфира 2-бромметил-3-(трет-бутилдиметилсиланилокси)бензойной кислоты в виде светло-коричневого масла (96 г, выход неочищенного вещества 91%). Соединение использовали на следующей стадии без дальнейшей очистки:

ЖХ/МС: М-Вг=279;

Ή-ЯМР (ДМСО-а₆) δ 0,05-0,11 (м, 6Н, СН₃, СН₃), 0,82 (с, 9Н, СН₃, СН₃, СН₃), 3,65 (с, 3Н, СН₃), 4,74 (с, 2Н, СН₂), 6,94 (дд, 1=1,3, 8,1 Гц, 1Н, Аг), 7,10-7,20 (м, 1Н, Аг), 7,21-7,29 (м, 1Н, Аг).

6.1.4. Метиловый эфир 4-карбамоилмасляной кислоты

К перемешиваемому раствору метил 2-(бромметил)-3-(трет-бутилдиметилсилилокси)бензоата (137,5 г, 325 ммоль) в ацетонитриле (1100 мл) в 2-л круглодонной колбе добавляли гидрохлорид метил4,5-диамино-5-оксопентаноата (70,4 г, 358 ммоль). К суспензии добавляли ΟΙΡΕΛ (119 мл, 683 ммоль) через капельную воронку в течение 10 мин и суспензию перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч, а затем смесь нагревали на масляной бане при 40°С в течение 23 ч. Реакционную смесь концентрировали в вакууме. Осадок перемешивали в простом эфире (600 мл), и белое твердое вещество выпадало в осадок. Смесь фильтровали и твердое вещество промывали простым эфиром (400 мл). Фильтрат промывали НС1 (1н., 200 мл), NаНСО₃ (насыщенный, 200 мл) и рассолом (250 мл). Водный слой и основный слой держали по отдельности. Затем твердое вещество далее промывали простым эфиром (250 мл) и жидкость промывали описанным выше кислым раствором и основным раствором. Два органических слоя объединяли и концентрировали в вакууме с получением метилового эфира 4-[4-(третбутилдиметилсиланил)-1-оксо-1,3-дигидро-изоиндол-2-ил]-4-карбамоилмасляной кислоты в виде коричневого масла (152 г, выход неочищенного вещества 115%, чистота 77% при Ή-ЯМР). Соединение использовали на следующей стадии без дальнейшей очистки:

ЖХ/МС: МН=407.

6.1.5. Метиловый эфир 4-карбамоил-4-(4-гидрокси-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)масляной кислоты

К перемешиваемому холодному раствору метил-5-амино-4-(4-(трет-бутилдиметилсилилокси)-1оксоизоиндолин-2-ил)-5-оксопентаноата (152 г, 288 ммоль) в ДМФА (500 мл) и воде (55 мл) добавляли 1<₂С.'О₃ (19,89 г, 144 ммоль) частями в течение 5 мин. Полученную реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 40 мин. Реакционную смесь охлаждали на ледяной бане. К смеси медленно добавляли НС1 (12 М, 23,99 мл, 288 ммоль). После добавления к смеси добавляли ацетонитрил (280 мл) и твердое вещество выпадало в осадок. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 10 мин и фильтровали.

Твердое вещество промывали ацетонитрилом (4x50 мл). Фильтрат концентрировали в высоком вакууме с получением желтого масла (168 г). Масло растворяли в ацетонитриле (600 мл) и перемешивали

- 29 029485

при комнатной температуре в течение 10 мин. Смесь фильтровали и твердое вещество промывали ацетонитрилом (2x25 мл). Фильтрат концентрировали в высоком вакууме с получением желтого масла (169 г), которое добавляли к смеси воды (1200 мл) и простого эфира (1000 мл). Смесь перемешивали в течение 3 мин и слои разделяли. Водный раствор концентрировали в высоком вакууме и осадок перемешивали в ацетонитриле (160 мл) и после перемешивания в течение ночи образовывалось белое твердое вещество. Смесь фильтровали с получением метилового эфира 4-карбамоил-4-(4-гидрокси-1-оксо-1,3дигидроизоиндол-2-ил)масляной кислоты в виде белого твердого вещества (46 г, выход 54%). Фильтрат концентрировали и осадок кристаллизовали в ацетонитриле (60 мл) с получением дополнительного метилового эфира 4-карбамоил-4-(4-гидрокси-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)масляной кислоты в виде белого твердого вещества (11,7 г, выход 14%). Фильтрат концентрировали и осадок очищали 1§СОхроматографией с получением дополнительного метилового эфира 4-карбамоил-4-(4-гидрокси-1-оксо1,3-дигидроизоиндол-2-ил)масляной кислоты в виде белого твердого вещества (13,2 г, выход 15%). Всего было получено 70,9 г продукта с выходом 83%.

ЖХ/МС: МН=293;

’Н-ЯМР (ДМСО-б₆) δ 1,95-2,34 (м, 4Н, СН₂, СН₂), 3,51 (с, 3Н, СН₃), 4,32 (д, 1=17,6 Гц, 1Н, СНН), 4,49 (д, 1=17,4 Гц, 1Н, СНН), 4,73 (дд, 1=4,7, 10,2 Гц, 1Н, СНН), 6,99 (дд, 1=0,8, 7,9 Гц, 1Н, Аг), 7,10-7,23 (м, 2Н, Аг, ΝΗΗ), 7,25-7,38 (м, 1Н, Аг), 7,58 (с, 1Н, ΝΗΗ), 10,04 (с, 1Н, ОН).

6.1.6. 3-(4-((4-(Морфолинометил)бензил)окси)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион

Стадия 1. К раствору 3-(4-гидрокси-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона (2,5 г, 8,56 ммоль) в ТГФ (60 мл) добавляли трифенилфосфин (на полимерной подложке 1,6 ммоль/г, 12 г, 18,8 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 мин. Добавляли диизопропилазодикарбоксилат (3,96 мл, 18,8 ммоль) при 0°С и смесь перемешивали при 0°С в течение 30 мин. Добавляли (4-морфолин-4-илметилфенил)метанол (2,62 г, 12,4 ммоль) при 0°С, смеси позволяли нагреться до комнатной температуры и ее перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь фильтровали и фильтрат концентрировали. Полученное масло очищали на колонке с силикагелем, которую элюировали метиленхлоридом и метанолом (градиент, продукт выходил при 6% метаноле) с получением метилового эфира 4-карбамоил-4-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1-оксо-1,3дигидроизоиндол-2-ил]масляной кислоты (2,2 г, выход 54%). Продукт использовали на следующей стадии без дальнейшей очистки.

Стадия 2. К раствору метилового эфира 4-карбамоил-4-[4-(4-морфолин-4-илметилбензилокси)-1оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил]масляной кислоты (2,2 г, 4,57 ммоль) в ТГФ (50 мл) добавляли третбутоксид калия (0,51 г, 4,57 ммоль) при 0°С. Смесь перемешивали при 0°С в течение 10 мин и гасили 1н. НС1 (5 мл, 5 ммоль), а затем насыщенным NаΗСОз (25 мл). Смесь экстрагировали Е!ОАс (2x50 мл). Органический слой промывали водой (30 мл), рассолом (30 мл), сушили над Мд§О₄ и концентрировали. К полученному твердому веществу добавляли Е!ОАс (10 мл), а затем гексан (10 мл) при перемешивании. Суспензию фильтровали с получением 3-(4-((4-(морфолинометил)бензил)окси)-1-оксоизоиндолин-2ил)пиперидин-2,6-диона в виде белого твердого вещества (1,5 г, выход 73%). ВЭЖХ: \ν;·ι^Γ5 §утте!гу С₁₈, 5 мкМ, 3,9x150 мм, 1 мл/мин, 240 нм, градиент до 95/5 ацетонитрила/0,1% Н₃РО₄ в течение 5 мин: !_Κ=4,78 мин (97,5%); т.пл.: 210-212°С;

’Н-ЯМР (ДМСО-б₆) δ 1,86-2,09 (м, 1Н, СНН), 2,29-2,38 (м, 4Н, СН₂,СН₂), 2,44 (дд, 1=4,3, 13,0 Гц, 1Н, СНН), 2,53-2,64 (м, 1Н, СНН), 2,82-2,99 (м, 1Н, СНН), 3,46 (с, 2Н, СН₂), 3,52-3,61 (м, 4Н, СН₂,СН₂), 4,18-4,51 (м, 2Н, СН₂), 5,11 (дд, 1=5,0, 13,3 Гц, 1Н, ^Н), 5,22 (с, 2Н, СН₂), 7,27-7,38 (м, 5Н, Аг), 7,40-7,53 (м, 3Н, Аг), 10,98 (с, 1Н, N4);

¹³С-ЯМР (ДМСО-б₆) δ 22,36, 31,21, 45,09, 51,58, 53,14, 62,10, 66,17, 69,41, 114,97, 115,23, 127,64, 128,99, 129,81, 129,95, 133,31, 135,29, 137,68, 153,50, 168,01, 170,98, 172,83.

ЖХ/МС: 465.

Аналитически вычислено для С₂₅Н₂₇^О₅ + 0,86 Н₂О: С, 64,58; Н, 6,23; Ν, 9,04.

Найдено: С, 64,77; Н, 6,24; Ν, 8,88.

(8)-3-(4-((4-(Морфолинометил)бензил)окси)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион и

(К)-3-(4-((4-(морфолинометил)бензил)окси)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион получали из

- 30 029485

3-(4-((4-(морфолинометил)бензил)окси)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-диона посредством хирального разделения.

6.2. Анализы.

6.2.1. Продукция цитокинов Т-клетками.

Т-клетки выделяли из лейкоцитарной пленки отрицательной селекцией с использованием коктейля для увеличения содержания Т-клеток КозеЬе8ер®. Следовали методикам изготовителя. Все 96-луночные планшеты предварительно покрывали 3 мкг/мл антитела против СБ3 человека в 100 мкл 1х РВ8 в течение 4 ч при 37°С. Перед анализом Т-клеток планшеты промывали три раза полной средой КРМЕ1640. Затем Т-клетки высевали в предварительно покрытые СБ3 планшеты при плотности 2,5х10⁵ клеток/лунка в 180 мкл полной среды КРМЕ1640. Клетки обрабатывали 20 мкл 10х-титрованных соединений в концентрации 10, 1, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001 и 0,00001 мкМ. Конечные концентрации ДМСО составляли 0,25%. Планшеты инкубировали в течение 48 ч при 37°С, 5% СО₂. Через 48 ч супернатанты собирали и исследовали с помощью анализа на мультиплексной цитометрической гранульной матрице (СВА) в отношении следующих цитокинов/хемокинов: ГО-2, ГО-3, ГО-5, ТЬ-10, ТЪ-13, ТЪ-15, ГО-17а, ОМ-С8Р, О-8СР, ΉΝ-γ, ΤΝΡ-α и ΚΑΝΤΕ8. Планшеты СВА анализировали на устройстве Ьипппех ^100. Данные от каждого донора наносили на график с использованием программного обеспечения ОтарЬРаб Рпзт 5.0 и выражали в качестве среднего значения в пг/мл ±8ЕМ и % относительно контроля в виде ДМСО±8ЕМ.

Сравнительно низкие концентрации (от 0,01 до 1 нМ) соединения I усиливали ГО-2, ГО-ГО [Щ-5, ГО10. ГО-13, ОМ-С8Р, ΉΝ-γ, ΤΝΡ-α и ΚΑΝΤΕ8 (10 нМ) в стимулированных Т-клетках человека (фиг. 1 и 2). Усиление продукции большинства цитокинов и хемокинов достигало пика при 1-10 нМ соединения I и либо оставалось на этом уровне, либо постепенно снижалось по мере увеличения концентрации. При 1 нМ соединение I повышало продукцию ГО-2, !ГО-13 и ОМ-С8Е до уровней в 7, 5 и 3 раза превышающих уровни для контрольных клеток соответственно. В концентрации 10 нМ соединение I повышало продукцию ГО-2, !ГО-13 и ОМ-С8Е до уровней в 22, 6,5 и 6 раз превышающих уровни в контрольных клетках, соответственно. Соединение I повышало продукцию ГО-10 приблизительно в 1,5-3,5 раза при концентрациях 0,1 и 1 нМ, но ингибировало продукцию ГО-10 при >10 нМ. Соединение I увеличивало продукцию ГО-5 в 6 раз относительно контрольных клеток, но только в концентрации 1 нМ; продукция ГО-5 усиливалась в <2 раза при 10 нМ. Соединение I усиливало продукцию ΚΑΝΤΕ8 в 2-3 раза относительно контрольных клеток в концентрациях в диапазоне от 10 нМ до 10 мкМ. Соединение I усиливало продукцию ΤΝΡ-α и ΉΝ-γ в 2-3 раза при концентрациях в диапазоне от 1 нМ до 10 мкМ.

Низкие концентрации соединения ЕК также усиливали продукцию цитокинов и хемокинов в стимулированных Т-клетках человека. Соединение ЕК в концентрации только 1 нМ усиливало !Е-2, !Е-3, ГО-5, IЬ-10, I^-13. ОМ-С8Е, IΡN-γ, ΚΑΝΤΕ8 и ΤΝΡ-α в стимулированных Т-клетках человека (фиг. 3 и 4). В концентрации 10 нМ соединение ЕК увеличивало продукцию !Е-2, !Е-13 и ОМ-С8Е в 15, 7 и 6 раз относительно контрольных клеток соответственно. Концентрации соединения ЕК от 0,01 до 1 нМ повышали продукцию ГО-10 в приблизительно 6 раз, однако концентрации >10 нМ ингибировали продукцию ГО-10. Концентрации соединения ЕК, находящиеся в диапазоне от 1 до 100 нМ, усиливали продукцию ГО-5 вплоть до 2,5 раза относительно контрольных клеток, однако соединение ЕК не продемонстрировало усиления в 6 раз при 1 нМ, показанного соединением Е8. За исключением характера усиления продукции ГО-5 и, возможно, более низкой степени усиления продукции ΣΗΝ-γ, профиль усиления цитокинов и хемокинов, который проявляло соединение ЕК, был сходен с профилем усиления, который проявляло соединение I, в отношении величины увеличения продукции и диапазона концентраций, в котором происходило усиление.

Низкие концентрации соединения Е8 также повышали продукцию цитокинов и хемокинов в стимулированных Т-клетках человека, и профиль усиления цитокинов и хемокинов, проявляемый соединением Е8, был сходен с профилем усиления, проявляемым соединением I, в отношении величины увеличения продукции и диапазона концентраций, в котором происходило усиление. Соединение Е8 в концентрации только 1 нМ усиливало ГО-2, !Е-3, !Е-5, ГО-Кк [6-13, ОМ-С8Е, ΉΝ-γ, КΑNΤΕ8 и ΤΝΡ-α в стимулированных Т-клетках человека (фиг. 5 и 6). При концентрации 10 нМ соединение Е8 увеличивало продукцию ГО-2, ГО-13 и ОМ-С8Е в 18, 7 и 5 раз относительно контрольных клеток соответственно. Концентрации соединения Е8, составляющие 0,1 и 1 нМ, повышали продукцию ГО-10 приблизительно в 2-3 раза, однако концентрации >10 нМ ингибировали продукцию ГО-10. Как было выявлено для соединения I, усиление продукции 66-5 соединением Е8 достигало пика при 1 нМ. В одном варианте осуществления соединение Е8 дополнительно стимулировало продукцию ГО-2 Т-клетками с ЕС₅₀ приблизительно 0,29 нМ, по сравнению с 10 нМ для помалидомида.

6.2.2. Определение профиля цитокинов в мононуклеарных клетках периферической крови человека.

50 мл лейкоцитарной пленки человека распределяли аликвотами по 25 мл в две 50-мл конические

пробирки и в каждую коническую пробирку добавляли 25 мл стерильного НВ88. Содержимое пробирок тщательно перемешивали переворачиванием. 50 мл ЫсоП-Расцк Р1из (ΟΕ НеаЬЬсаге (расположение); каталожный номер #17-1440-02) комнатной температуры распределяли аликвотами в 50-мл конические пробирки. Затем осторожно и медленно наслаивали 25 мл смеси лейкоцитарная пленка/НВ88 над Еюо11.

- 31 029485

Образцы центрифугировали при 450 об/мин в течение 35 мин. Верхний слой, содержавший плазму, отбирали пипеткой и отбрасывали. Поверхность контакта, содержавшую мононуклеарные клетки, переносили в две 50-мл конических пробирки. Обе конические пробирки заполняли до общего объема 50 мл посредством НВ88 и центрифугировали при 1200 об/мин в течение 10 мин. Клетки вновь промывали в НВ88 и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 мин. Клеточный осадок ресуспендировали с помощью 20 мл полной среды ΚΡΜΙ (КРМ1/5% сыворотка человека/1х реп/§1гер/§1и!) и подсчитывали.

100 мкл (2х10⁶/мл) 1РВМС добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета с плоским дном (конечное количество клеток 2х10⁵/лунка) и инокулировали при 37°С в течение 1 ч. В каждую исследуемую лунку добавляли 20 мкл (10х) соединения и в каждую контрольную лунку добавляли 20 мкл среды, содержавшей 2,5% ДМСО ([ДМСО]конечная=0,25%) и планшет инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Затем клетки стимулировали 80 мкл Ι.Ρ8 в концентрации 2,5 нг/мл ([ЬР8]конечная=1 нг/мл) и инкубировали в течение 18 ч при 37°С. 50 мкл супернатанта из каждой лунки переносили в 3 новых круглодонных 96-луночных планшета и хранили при -20°С для анализа I днптех. Для каждого образца проводили дублирование лунки.

Образцы супернатанта анализировали в отношении цитокинов в мультиплексном формате в соответствии с инструкциями изготовителя (МПНроге, ВШепса, Ма 01821) с использованием устройства Iднптех 18100. Анализы Ш-12 и ОМ-С8Р проводили в дуплексном формате с использованием супернатантов в чистом виде, в то время как анализ всех других цитокинов проводили в мультиплексном формате с использованием супернатантов, разбавленных 1:20. Анализ данных проводили с использованием программного обеспечения СрЛа1е Веас1\ае\у. 1С₅₀ вычисляли с использованием нелинейной регрессии, сигмовидной кривой доза-ответ, ограничения сверху до 100% и снизу до 0%, допущения вариабельного наклона. ЕС₅₀ были основаны на ограничении сверху сигмовидных кривых, составляющем 246,9%, что соответствует среднему усилению Ш-10, обеспеченному полалидомидом (контроль) при 10 мкМ и нижнего ограничения до 100%. 1С₅₀ вычисляли с использованием ОгарНРаП Рп§т ν5.00. Данные соответствуют среднему значению +8ЕМ (стандартная ошибка среднего значения) для η (количество дублированных экспериментов).

Соединение I ингибировало продукцию (в порядке эффективности) Ш-1 β (1С₅₀=0,00085 мкМ)>Т№α (1С₅₀=0,0018)>М0С (1С₅₀=0,0026 мкМ)>ОМ-С8Р (1С₅₀=0,0092 мкМ)>1Б-6 (1С₅₀=0,01 мкМ)>М1Р-1а (1С₅₀=0,19 мкМ)>1Б-8 (1С₅₀>10 мкМ). Соединение I имело небольшой эффект на продукцию М1Р-1в с величиной 1С₅₀>10 мкМ (фиг. 7А и табл. 1). Соединение I повышало продукцию 1Б-10, МСР-1 и ΚΑΝΤΕ8 со средним процентом контрольных величин, составляющим 372, 208 и 153% соответственно, при концентрации 0,1 мкМ (фиг. 7В и табл. 2).

Соединение ЕК. ингибировало продукцию (в порядке эффективности) Ш-Щ аС₅₀=0,0062 мкМ)>Т№-а аС₅₀=0,0095 мк\1)М1)(" аС₅₀=0,012 мкМ)>ОМ-С8Р (^₅₀=0,039 мкМ)>Ш-6 ЦС₅₀=0,083 мкМ)>МШ-1а (IС₅₀=0,045 мкМ)>МШ-Щ ^Сд^Ю мкМ). Также соединение ЕК проявляло умеренный ингибиторный эффект на продукцию Ш-8 с величиной Ш₅₀>10 мкМ (фиг. 8А и табл. 1). Соединение ЕК усиливало продукцию Ш-10, МСР-1 и ΚΑΝΤΕ8 со средним процентом относительно контрольных величин, составляющим 442, 223 и 151% соответственно, при концентрации 0,1 мкМ (фиг. 8В и табл. 2).

Соединение Е8 ингибировало продукцию (в порядке эффективности) Ш-Щ ЦС₅₀=0,00046 мкМ)>Т№-а аС₅₀=0,00059 мк\1)М1)(" аС₅₀=0,0021 мкМ)>ОМ-С8Е аС₅₀=0,0022 мкМ)>Ш-6 (Ш₅₀=0,0038 мкМ)>МШ-1а ЦС₅₀=0,028 мкМ>МШ-Щ (Κ₅₀>10 мкМ). Также соединение Е8 проявляло умеренный ингибиторный эффект на продукцию Ш-8 с величиной Ш₅₀>10 мкМ (фиг. 9А и табл. 1). Соединение Е8 усиливало продукцию Ш-10, МСР-1 и ΚΑΝΤΕ8 до среднего процента относительно контрольных величин, составляющего 379, 233 и 153% соответственно, при концентрации 0,1 мкМ (фиг. 9В и табл. 2).

Таблица 1

Обобщение профиля ингибирования цитокинов исследуемыми соединениями

Исследуемые соединения	Ш-6	Ш-8	Ш-Ιβ	СгМ-СЗР	мис	ΜΙΡ1а	ΜΙΡΙβ	ΤΝΡ-α
Соединение I	0,01	>10	0,00085	0,0092	0,0026	0,19	>10	0,0018
Соединение ЕК	0,083	>10	0,0062	0,039	0,012	0,45	>10	0,0095
Соединение 1-8	0,003 8	>10	0,00046	0,0022	0,0021	0,028	>10	0,00059

- 32 029485

Таблица 2

Обобщение профиля цитокинов для исследуемых соединений

Исследуемые соединения	Ш-10 (% от контроля)	МСР-1 (% от контроля)	ΚΑΝΤΕ8 (% от контроля)
Соединение I	372	208	153
Соединение 1-К	442	223	151
Соединение 1-8	379	233	153

6.2.3. Продукция ΣΡΝ-γ ΝΚ-клетками и антителозависимая клеточная цитотоксичность (АОСС).

ΝΚ-клетки от здоровых доноров выделяли из лейкоцитарной пленки крови посредством отрицательной селекции с использованием коктейля для увеличения содержания ΝΚ-клеток КозеКеЗер (З1ет Се11 ТесЬпо1од1е§, Уапсоиуег, ВС) перед центрифугированием в градиенте плотности с ИсоИ-Нурацие (ИзЬег Зс1епЬЬс Со ЬЬС, РА) в соответствии с инструкциями изготовителя. СО56+ ΝΚ-клетки выделяли до приблизительно 85% чистоты при определении проточной цитометрией (ΒΌ Вюзшепсез, СА).

Анализ индуцированной Σ§Ο продукции ΝΚ интерферона-гамма (ΣΡΝ-γ): 96-луночные плоскодонные планшеты покрывали 100 мкг/мл Σ§Ο человека (З1дта) в течение ночи при 4°С. На следующий день не связавшийся Σ§Ο смывали холодным 1х РВЗ. Затем в покрытые Σ§Ο 96-луночные планшеты высевали ΝΚ-клетки в количестве 2х10⁵ клеток на лунку в 180 мкл среды КРМЕ1640 и добавляли 10 нг/мл ιΊιΠ,-2 (К & Ό Зу§1ет§, ΜΝ). Добавляли исследуемые соединения в объеме 20 мкл ДМСО. Конечные концентрации исследуемых соединений составляли 0,0001, 0,001, 0,01, 0,1, 1 или 10 мкМ. Конечные концентрации ДМСО составляли 0,25%. Через 48 ч супернатанты собирали и анализировали с помощью ЕЫЗА в отношении продукции !ΡΝ-γ.

Данные, использованные для определения усиления исследуемыми соединениями продукции ΓΕΝ-γ ΝΚ-клетками в ответ на стимуляцию иммобилизованным ЕС и гЫЕ-2, анализировали для каждого донора с использованием программного обеспечения ОгарЬРаб Рпзт ν5.0. Данные представлены двумя способами: (1) в качестве абсолютной величины продуцированного ΓΕΝ-γ (пг/мл±ЗЕМ) и (2) в качестве процента от количества !ΡΝ-γ, продуцированного в присутствии 1 мкМ помалидомида. ЕС₅₀ представляет собой концентрацию исследуемого соединения, обеспечивающую половину максимальной продукции !ΡΝ-γ, при этом максимальную продукцию определяют как количество !ΡΝ-γ, продуцированного в присутствии 1 мкМ помалидомида. Величины ЕС₅₀ вычисляли с использованием нелинейной регрессии, сигмоидальной кривой доза-ответ, ограничивающей сверху до 100% и снизу до 0%, допускающей вариабельный наклон.

Анализ АОСС. Очищенные ΝΚ-клетки (5х10⁴) высевали в 96-луночные планшеты с ϋ-образным дном в 100 мкл среды КРМЕ1640 без фенола (ЕуПгодеп) +2% сыворотка АВ+ человека (СЕтпн Вю Ргобис1§, СА) и обрабатывали 10 нг/мл ιΊιΠ,-2 и ритуксимабом (5 мкг/мл) вместе с различными концентрациями исследуемых соединений от 0,01 до 10 мкМ в течение 48 ч. Различные клеточные линии лимфомы (ОСВ-ОБВСБ: ^Зи-ОЕСЕ2 и Рагаде; фоликулярная лимфома: ОоНН2; АВС-ОБВСБ: КЕа; лимфома Беркитта [ВБ]: КаЦ) обрабатывали 5 мкг/мл ритуксимаба в течение 30 мин при 37°С. Не связавшийся ритуксимаб смывали, клетки-мишени (5х10³/100 мкл/лунка) добавляли к предварительно обработанным эффекторным клеткам (ΝΚ-клетки) в соотношении 10:1, и их совместно инкубировали в течение 4 ч при 37°С. Контрольные условия состояли из ΝΚ-клеток вместе с опухолевыми клетками, которые обрабатывали (1) средой отдельно, (2) только ритуксимабом или (3) только Ш-2. С использованием аликвоты супернатанта (50 мкл) цитотоксичность ΝΚ-клеток против опухолевых клеток анализировали с помощью стандартного анализа высвобождения лактатдегидрогеназы (ΕΌΗ) для измерения АОСС (нерадиоактивный анализ цитотоксичности Су1оТох 96, Рготеда, XVI). Самопроизвольное высвобождение клетками-мишенями отдельно составляло <15% от максимального высвобождения при определении с помощью клеток-мишеней, лизированных в 1% ТгЪоп Х-100. В экспериментальное высвобождение вносили поправку путем вычитания самопроизвольного высвобождения из эффекторных клеток в соответствующем разведении. Процент специфического лизиса вычисляли по формуле

процент специфического лизиса = 100х(экспериментальное высвобождение - спонтанное высвобожедние из эффекторных клеток - спонтанное высвобождение из мишеней)/(максимальное высвобождение из мишеней - спонтанное высвобождение из мишеней).

Опосредуемый ΝΚ-клетками специфический лизис вычисляли по следующей формуле: процентный специфический лизис = [(экспериментальное высвобождение - спонтанное

высвобождение)/(максимальное высвобождение - спонтанное высвобождение)]х100.

Результаты анализировали с использованием программного обеспечения ОгарЬРаб Рпзт ν5.0. Данные представлены в качестве процентной цитотоксичности относительно обработанных ДМСО клеток.

- 33 029485

Параллельно определяли способность соединений I, РК и !-δ усиливать опосредуемую рС индукцию продукции ΝΚ-клетками ΣΡΝ-γ. В этот эксперимент было включено всего 7 доноров ΝΚ-клеток, и результаты представлены на фиг. 10 (выраженные в качестве пг/мл продуцированного ΓΡΝ-γ) и на фиг. 11 (выраженные в качестве процента продуцированного на увеличенном уровне ΓΡΝ-γ относительно ΓΡΝ-γ, продуцированного в присутствии помалидомида в концентрации 1 мкМ). Все соединения усиливают продукцию ΝΚ-клетками ΣΡΝ-γ дозозависимым образом в ответ на стимуляцию иммобилизованным рС и К-Ч. Соединение I индуцировало продукцию ΞΕΝ-γ аналогично помалидомиду. Соединения Р§ и РР были несколько более активными, чем соединение I.

В каждой клеточной линии определяли параллельно иммуномодулирующую активность соединений I, РК и Р§ в отношении усиления опосредуемой ритуксимабом АЭСС против нескольких клеточных линий лимфомы. Было включено всего 15 доноров ΝΚ-клеток (три донора ΝΚ-клеток для каждой клеточной линии) и результаты (фиг. 12) показали, что все соединения индуцировали дозозависимую опосредуемую ΝΚ-клетками ЛЭСС во всех клеточных линиях. В клеточных линиях ССВ-ОЬВСЬ (^8и-ОЬСЬ2 и Рагаде), активность, показанная соединением I, сравнима с активностью, показанной помалидомидом. Максимальной активность соединения I была при 0,1 мкМ в ^§и-ОЬСЬ2, но при 1 мкМ в клетках Рагаде. Соединение РК было менее активным, чем соединение Р8, в клетках ^§ИПЬСЬ2. В клеточной линии фолликулярной лимфомы (ИоНН2), соединение I было менее активным, чем соединения Р§ и РК. В клеточной линии ЛВС-ОЬВСЬ (КРа), соединение I было менее активным, чем соединения Р§ и РК. Соединение РК было менее активным, чем соединение Р8. В клеточной линии ВЬ (Ка_р), соединение I было более активным, чем соединения Р§ и РК. Максимальной активность соединения I была при 0,1 мкМ. Соединение РК было более активным, чем соединение Р8, в клетках Кар. Максимальной активность соединения I была при 0,1 мкМ в клеточных линиях ^§и-ОЬСЬ2 и Кар. но 1 мкМ в других клеточных линиях. В основном, соединение I было более активным, чем соединения Р§ и РК, во всех исследованных клеточных линиях, за исключением клеток РРа. Соединение РК было менее активным, чем соединение Р8, в клетках ^8и-ОЬСЬ2 и КРа, но не в других клеточных линиях.

6.2.4. Анализы пролиферации эндотелиальных клеток сосудов человека, образования трубки, миграции и инвазии.

Анализ пролиферации эндотелиальных клеток пуповинной вены человека: эндотелиальные клетки пупочных сосудов размораживали и выращивали в среде ЕСМ2 до 3-6 пассажа для всех анализов пролиферации. Эндотелиальные клетки пупочных сосудов человека трипсинизировали, промывали 20% средой РВ8/М199 и высевали в ту же среду в количестве 10⁴ клеток/100 мкл на лунку в 96-луночные планшеты для культивирования клеток. Планшеты инкубировали в течение ночи при 37°С, чтобы позволить клеткам прикрепиться. Затем клетки подвергали голоданию в среде 1% РВ8/М199 в течение 18 ч после промывания этой же средой 3 раза. Для оптимизации концентрации факторов роста в анализе пролиферации НИУЕС, 100 мкл/лунка 2х серийных разведений факторов роста, начиная со 100 нг/мл, добавляли к НИУЕС в двух экземплярах на 72 ч при 37°С в инкубаторе для культивирования клеток с увлажнением с 5% СО2. Для анализа исследуемых соединений проводили серийное разведение исследуемых соединений в среде 0,4% ДМСО/1% РВ8/М199 в двух экземплярах из 10 мМ исходных растворов. К клеткам добавляли 50 мкл/лунку серийных разведений исследуемых соединений (10, 1,0, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001, 0,00001 мкМ) на 1-2 ч при 37°С. Конечная концентрация ДМСО в клетках составляет 0,1%. Затем в каждую лунку добавляли 50 мкл соответствующих факторов роста в 4х конечной концентрации на 72 ч при 37°С в инкубатора для клеточной культуры с увлажнением с 5% СО2. Включение тимидина измеряли путем добавления в каждую лунку 1 мкКюри ³Н-тимидина (Атеткйат) в 20 мкл среды и инкубировали при 37°С в инкубаторе для клеточной культуры с увлажнением с 5% СО2 в течение 5-6 ч. Затем клетки трипсинизировали и собирали в фильтрующие планшеты ИшРШет СР/С (Реткш Е1тег) с использованием харвестера клеток (ТотГес). После высушивания планшетов воздухом добавляли 20 мкл/лунка МГсгозсшТ 20 (Раскатб), а затем планшеты анализировали в ТорСоииГ ΝΧΤ (Раскатб). Каждую лунку подсчитывали в течение 1 мин. Эксперименты проводили в двух экземплярах у каждого из 3 доноров.

Анализ образования трубки из эндотелиальных клеток пупочных сосудов человека: соединения исследовали в анализе индуцированного факторами роста образования трубки из НИУЕС. Планшеты для образования трубки инкубировали при 37°С в течение 30 мин для полимеризации матригеля. НИУЕС подвергали голоданию в основной среде ЕВМ с 2,1% В8А в течение 5 ч после промывания той же средой 3 раза. Клетки трипсинизировали и центрифугировали. Затем в планшеты для образования трубки, покрытые матригелем, добавляли 25 мкл 4х серийных разведений соединений (10, 1, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001, 0,00001 мкМ) в двух экземплярах с 50 мкл 2х10⁴ клеток/лунка. В планшеты добавляли пятьдесят мкл 4х УЕСР (конечная концентрация=25 нг/мл) или ЪРСР (конечная концентрация=10 нг/мл). Затем клетки инкубировали в течение ночи (приблизительно 18 ч) при 37°С в инкубаторе с увлажнением. Сети трубочек окрашивали кальцеином АМ в концентрации 4 мкг/мкл в 2% РВ§/НВ§§ в течение 30 мин и получали изображения с помощью флуоресцентной микроскопии. Трубочки количественно определяли с помощью программного обеспечения для определения образования трубок МеГаМотрй, вычисляющего площадь трубок и длину трубок.

- 34 029485

Анализ инвазии эндотелиальных клеток пупочных сосудов человека: в анализе инвазии НИУЕС концентрацию фибронектина человека оптимизируют для обеспечения подходящей белковой структуры для прикрепления прикрепляющихся клеток к мембране и обеспечения свободной миграции в ответ на ангиогенный стимул (например, УЕОР, ЬРОР или НОР) в нижней камере планшета с вставкой. НиУЕС подвергали голоданию в среде ЕВМ2 с 0,1% Β8Α в течение 6 ч после промывания той же средой 3 раза. Затем клетки трипсинизировали и центрифугировали для удаления оставшегося трипсина. Затем приблизительно 0,5-1х10⁶ клеток в 125 мкл/лунка и 125 мкл 8х серийных разведений соединений (10, 1, 0,1, 0,01, 0,001 мкм) добавляли в верхнюю камеру 24-луночных и 96-луночных планшетов со вставкой БИ Ра1соп в двух экземплярах и инкубировали в течение приблизительно 1-2 ч.

(Планшеты содержат блокирующую флуоресценцию микропористую [размер пор 3,0 мкм] мембрану ΡΕТ, которая равномерно покрыта фибронектином человека). Затем в нижнюю камеру добавляли семьсот пятьдесят микролитров 1,33х исходного раствора УЕОР (конечная концентрация 25 нг/мл), ЬРОР (конечная концентрация 10 нг/мл) или НОР (конечная концентрация 25 нг/мл). Клетки инкубировали в течение 22±1 час при 37°С. Мигировавшие клетки окрашивали кальцеином АМ в концентрации 4 мкг/мл в НБ88, содержавшей 2% РБ8, с использованием 500 мкл/лунка в 24-луночных планшетах и 200 мкл/лунка в 96-луночных планшетах. Планшеты инкубировали при 37°С в течение 90 мин и считывали в устройстве для считывания флуоресценции планшетов.

Процентное ингибирование пролиферации клеток, образование трубки, миграцию и инвазию вычисляли путем вычитания результата для контроля в виде ДМСО без стимуляции из результатов для исследуемого образца, усреднения для всех реплик, и нормализации к стимулированному фактором роста контролю в виде ДМСО (0% ингибирование). Величины Ю₅₀ вычисляли с использованием Огар№ай Ρΐ'ίκιη 5.0.

Результаты анализа пролиферации эндотелиальных клеток пупочных сосудов человека: результаты исследования с оптимизацией факторов роста показали, что оптимальные концентрации УЕОР, ЬРОР и НОР для индукции пролиферации составляли 25, 10 и 25 нг/мл соответственно. Исследуемые соединения исследовали с помощью оптимизированных концентраций факторов роста, и результаты показали, что соединения Ι, Ι-Р и Ι-8 не ингибировали индуцируемую УЕОР, ЬРОР или НОР пролиферацию НИУЕС (фиг. 13). Однако происходило усиление пролиферации, наблюдаемое в случае обработанных УЕОР и НОР НИУЕС, с помощью соединения Ι-8 (обработанные УЕОР: 1-10 мкМ; обработанные НОР: 0,1-1 мкМ). Также происходило значительное усиление, наблюдаемое в обработанных ЬРОР НИУЕС, с помощью соединения Ι (0,01-1 мкМ) и соединения Ι-Ρ (0,1-1 мкМ). Величины Ю₅₀ обобщенно представлены в табл. 3.

Таблица 3

Обобщение величин Ю₅₀ из исследований индуцируемой факторами роста пролиферации эндотелиальных клеток пупочных сосудов человека

Исследуемые соединения	УЕОР (25 нг/мл), величины 1С50 (мкМ)	ЬРОР (10 нг/мл) величины 1С50 (мкМ)	НОР (25 нг/мл), величины 1С50 (мкМ)
Соединение I	>100	99	24
Соединение 1-К	>100	76	38
Соединение 1-8	>100	52	51

Результаты анализа образования трубки из эндотелиальных кленок пупочных сосудов человека: соединения Ι, Ι-Р и Ι-8 проявляли тенденцию в отношении ингибирования индуцируемого УЕОР образования трубки НИУЕС с точки зрения как длины трубки, так и площади трубки (фиг. 14). Все соединения продемонстрировали дозозависимый эффект на индуцируемое УЕОР образование трубки НИУЕС. Соединение Ι-Р продемонстрировало значительное ингибирование (р<0,05 против стимулированного контроля я виде ДМСО) площади и длины трубки при 10 мкМ. Также существовала тенденция к ингибированию индуцируемого ЬРОР образования трубки НИУЕС с точки зрения как длины трубки, так и площади трубки (фиг. 14), хотя этот эффект был менее выраженным, чем эффекты на индуцируемое УЕОР образование трубки НИУЕС.

Результаты анализа инвазии эндотелиальных клеток пупочных сосудов человека. Соединения Ι, Ι-Р и Ι-8 значительно ингибировали индуцируемую УЕОР, ЬРОР и НОР инвазию НИУЕС дозозависимыми образом (фиг. 15). Соединения были более эффективными против индуцируемой УЕОР и ЬРОР инвазии НИУЕС, чем против индуцируемой НОР инвазии НИУЕС (табл. 4). Величина Ю50 составляла <0,3 нМ для ингибирования индуцируемой УЕОР инвазии НИУЕС соединениями Ι, Ι-Р и Ι-8. Ю50 соединения Ι (0,4 нМ) и соединения Ι-8 (<0,1 нМ) более чем в десять раз превышала Ю₅₀ соединения Ι-Р (13 нМ) (табл. 4).

- 35 029485

Таблица 4

Обобщение эффектов исследуемых соединений на индуцируемую факторами роста инвазию эндотелиальных клеток пупочных сосудов человека

Исследуемые Соединения	Индуцируемая УЕОР инвазия, величины 1С50 (мкМ)	Индуцируемая ЪРОР инвазия, величины 1С50 (мкМ)	Индуцируемая НОР инвазия, величины Κ®ο (мкМ)
Соединение I	0,00014	0,00042	0,59
Соединение 1-К	<0,0001	0,013	0,45
Соединение 1-8	<0,0001	<0,0001	0,019

6.2.5. Анализы клеточного цикла, апоптоза и антипролиферативной активности.

Анализ клеточного цикла: клетки обрабатывали ДМСО или некоторым количеством соединения, описанным в настоящем описании, в течение 48 ч. Окрашивание йодидом пропидия для исследования клеточного цикла проводили с использованием Сус1еТЕ8Т РРР8 (ВесГОп Эюктзоп) в соответствии с протоколом изготовителя. После окрашивания клетки анализировали с помощью проточного цитометра РАС8СаНЪиг с использованием программного обеспечения МосПч! ЬТ (ВесЮп Эюктзоп).

Анализ апоптоза. Клетки обрабатывали ДМСО или некоторым количеством соединения, описанного в настоящем описании, в различные моменты времени, а затем промывали буфером для промывания с аннексином-У (ΒΌ Вюзшепсез). Клетки инкубировали со связывающим аннексин-У белком и йодидом пропидия (ВО Вюзшепсез) в течение 10 мин. Образцы анализировали с использованием проточной цитометрии.

Соединение I индуцировало апоптоз и сопутствующее снижение количества клеток в клеточной линии 1)о1II12. Комбинация соединения I с ритуксаном действовала аддитивным образом в отношении индукции апоптоза и снижения числа живых клеток в клеточной линии 1)о1 II12.

Соединение Р8 индуцировало остановку в 01 в клеточных линиях 1)о1 II12 и \\'8С-1)РСР2. Соединение Р8 и ритуксан исследовали в анализе включения ³Н-тимидина в течение 3 суток. Соединение В8 продемонстрировало мощную антипролиферативную активность, причем Κ®₀ составляла 0,027 мкМ в клетках Кес-1 МСЬ, Κ®₀ составляла 0,04 мкМ в клетках 1)о1 II12 РЬ, и Κ®₀ составляла 0,28 мкМ в клетках Рагаде 1)РВСР. Данные показали, что соединение В8 в комбинации с ритуксаном действовали синергичным образом в клетках 1)о1 II12 РР при вычислении способом дольного продукта; соединение В8 в комбинации с ритуксаном действовали синергичным образом в клетках Рагаде 1)РВСР при вычислении способом дольного продукта; и соединение В8 в комбинации с ритуксаном действовали аддитивным образом в клетках Кес-1 МСР при вычислении способом дольного продукта (фиг. 16).

6.2.6. Анализ включения тимидина в клетки 1)РВСР ΐη νϊΙΐΌ.

Панель клеточных линий 1)1 ,ВС1, с различными цитогенетическими признаками исследовали в отношении их чувствительности к антипролиферативной активности соединений I и В8 (фиг. 17). Клетки обрабатывали исследуемыми соединениями в течение 5 суток при 37°С; пролиферацию клеток определяли с использованием способа включения ³Н-тимидина. Оба соединения, начиная с 0,1-1 мкМ, значительно ингибировали пролиферацию нескольких линий клеток 1)РВСР, в частности клеток подтипа АВС, таких как клетки К1уа, ϋ2932, Т\П)8, ОС4-Ру3 и ОСВРуК). Клетки подтипа АВС оказались более чувствительными к антипролиферативному эффекту, чем клетки других подтипов, включая клетки 0СВЭРВСР и РМВР. Величины Κ®₀ для соединения Р8 обобщенно представлены в табл. 5.

- 36 029485

Таблица 5

Антипролиферативная активность соединения Ι-8 во вторичных анализах

1С50 (мкМ) во вторичном скрининговом анализе с 3Н-тимидином в течение 5 суток ТпсогрогаЕтоп Зесопдагу Зсгееп Аззау
		ревлимид	Соединение 1-3
Подтип АВС	ОС1-ЬуЮ	0, 15	0,0009
и2932	1, б	0, 005
ΤΜΏ8	75	0, 059
ΗίνΑ	>100	2,3
ОС1-ЬуЗ	>100	>10
РМВЪ	Каграз-1106Р	>100	0,28
Подтип ССВ	изи-оьсьг	>100	0,24
зионьд	>100	1, б
ОС1-Ьу19	>100	>10

6.2.7. Клеточные линии, устойчивые к ревлимиду.

Клеточные линии, устойчивые к ревлимиду, получали следующим образом: клетки ΝΟ-Η929 поддерживали в культуре с 1 мкМ ревлимидом в течение 2 месяцев, а затем концентрацию ревлимида увеличивали до 10 мкМ (данные под номером К1-10, К2-10, К3-10 и К4-10) в течение дополнительных 3,5 месяца.

Устойчивые или чувствительные к ревлимиду клеточные линии обрабатывали исследуемыми соединениями в течение 5 суток, а затем оценивали пролиферацию и жизнеспособность клеток посредством окрашивания 7-аминоактиномицином Ό (7-ΆΆΌ). Активность соединения Ι-8 против устойчивых к ревлимиду клеточных линий обобщенно представлена в табл. 6. Данные показали, что соединение Ι-8 было активным против устойчивых к ревлимиду клеточных линий. В одном варианте осуществления наблюдали 50% снижение клеточного цикла (8-фаза) после обработки в течение 24 ч клеток Н929 соединением Ι-8. В другом варианте осуществления через 48 ч соединение Ι-8 снижало экспрессию сурвивина и ретинобластомного белка (рКВ) и увеличивало экспрессию ингибитора циклин-зависимой киназы р27.

Таблица 6

Активность соединения Ι-8 против устойчивых к ревлимиду клеточных линий

1С5о (мкМ)	Контроль	Р1-10	Р.2-10	РЗ-10	Р4-10
Ревлимид	1	>30	>30	>30	>30
Помалидомид	0, 09	>30	>30	6,3	14
Соединение 1-3	0, 01	1,32	1,20	0, 51	1,58

6.2.8. Анализ образования колоний мегакариоцитов.

Анализ образования колоний проводили на нормальном костном мозге человека, обрабатываемом в полутвердом коллагеновом матриксе соединением/I^-3/I^-6/Тро в течение 14-16 суток, и результаты обобщенно представлены в табл. 7. Данные показали, что соединение Ι-8 ингибировало клеткипредшественники мегакариоцитов.

- 37 029485

Таблица 7

Ингибирование, наблюдаемое в анализе образования колоний мегакариоцитов

Ю костного мозга	Соединение	Промежуточные колонии, 1С50 (мМ)	Незрелые колонии, 1С50 (мМ)
0090128	Ревлимид	>10	1,3+/-0,9
	Помалидомид	>10	>10
	Соединение 1-5	9,2+/-0,3	0,08+/-0,03
	Соединение I	>10	0, 1-1,0
	Соединение 1-К	>10	10
	Ревлимид	>10	0,41+/-0,23
	Помалидомид	>10	1+/-0,5
0090714	Соединение 1-5	0,86+/-0,09	0,05+/-0,03
	Соединение I	>10	0,05+/-0,02
	Соединение 1-К	>10	0,4+/-0,4
	Ревлимид	1,3+/-0,09	0,56+/-0,13
	Помалидомид	1,4+/-1,3	0,35+/-0,38
0090616	Соединение 1-5	0,65+/-0,23	0,04+/-0,03
	Соединение I	>10	0,06+/-0,03
	Соединение 1-К	>10	0,4+/-0,2

6.2.9. Ингибиторный эффект в отношении активности Ν’-кВ в клетках ЭБВСБ.

Клетки ЭБВСБ обрабатывали исследуемым соединением или двойным ингибитором ΙΚΚ1/2 (используемым в качестве положительного контроля) в течение 2 суток. Активность Ν’-кВ исследовали с помощью анализа активных мотивов факторов транскрипции с использованием экстрактов ядер клеток после обработки. Рацемическое соединение формулы (Ι) значительно ингибирует активность р65 и р50 Ν’-КБ в концентрациях 1 и 10 мкМ. Было выявлено, что рацемическое соединение формулы (Ι) ингибирует активность Ν’-кВ в некоторых линиях Г)’ВС’ подтипа АВС, таких как клетки ТМГ)8 и ОСН.уК). Эти результаты указывают на то, что эффект на передачу сигнала Ν’-кВ может быть вовлечен в антипролиферативную активность соединения формулы (Ι) против клеток АВС-Э’ВС’ и что исходная активность Ν’-кВ может быть прогностическим биомаркером ответа лимфомы на терапию соединением.

6.2.10. Дополнительные анализы ингибирования ангиогенеза.

Соединения Ι, Ι-К и Ι-δ исследовали в различных анализах ингибирования ангиогенеза. Соединение Ι-δ имело Ιί/₀ 52 нМ в анализе с пупочной артерией человека, и оно было приблизительно в 25 раз более эффективным, чем ревлимид, и приблизительно в 6 раз более эффективным, чем помалидомид. Соединения Ι, Ι-К и Ι-δ продемонстрировали умеренную ангиогенную активность в анализе с аортой крысы.

6.3. Модель ангиогенеза в матригеле на мышах.

Модель ангиогенеза в матригеле на мышах выполняли следующим образом: вставки матригеля вместе с гИУедГ. гБЬРОР и гепарином устанавливали мышам С57В/6 на 10 суток с введением лекарственного средства. Вставки анализировали в отношении тз СЭ31 с помощью ШС. Соединение Ι в количестве 3 и 30 мг/кг значительно ингибирует рост кровеносных сосудов (фиг. 18).

6.4. Модели с ксенотрансплантатами на мышах ΐη νίνο.

6.4.1. Модели лимфомы.

Соединение Ι исследовали в модели ксенотрансплантата Αδυ-Ι)Ό.2 ЭБВСБ в качестве единственного средства и в комбинации с ритуксаном (фиг. 19). Соединение Ι в качестве единственного средства в дозе 3 и 30 мг/кг продемонстрировало ингибирование роста опухоли, сходное с ингибированием релимидом в дозе 30 мг/кг. Когда соединение Ι вводили в комбинации с ритуксаном, наблюдали полную регрессию (объем опухоли <25 мм³) во всех исследованных группах комбинированного введения (фиг. 19 и табл. 8).

- 38 029485

Таблица 8

Эффективность соединения I в комбинации с ритуксаном в модели с ксенотрансплантатом ^3Ц-1)ЕСк2 ЭЬВСЬ

Лекарственное средство 1 (2 мг/кг, в/в, чм)	Лекарственное средство 2	Выживаемость без опухоли на 44 сутки
Ритуксан		2/10
Ритуксан	Ревлимид (30 мг/кг)	6/9
Ритуксан	Соединение I (3 мг/кг)	6/10
Ритуксан	Соединение I (30 мг/кг)	6/10

Соединение 1-3 исследовали в модели с ксенотрансплантатом фолликулярной лимфомы ΌοΗΗ2, и результаты обобщенно представлены в табл. 9. Данные показали, что соединение 1-3 в дозе 2 и 40 мг/кг значительно ингибирует рост опухоли в исследовании монотерапии и (фиг. 20). Данные также показали, что соединение 1-3 в дозе 3 мг/кг в комбинации с ритуксаном значительно ингибировало рост опухоли относительно монотерапии и было более эффективным, чем ревлимид, в дозе 30 мг/кг в комбинации с ритуксаном в отношении ингибирования роста опухоли (фиг. 21). Данные 1НС для СЮ31 представлены на фиг. 22.

Таблица 9

Активность соединения 1-3 в модели с ксенотрансплантатом фолликулярной лимформы ΌοΗΗ2

Лекарственное средство 1 (мг/кг)	Лекарственное средство 2 (мг/кг)	% Τ6Ι на Ώ12 (Т/С)	% ТСР ((ΤΟ) /С)
Ревлимид (40)		49	17
Соединение 1-3 (2)а		49	33
Соединение 1-3 (40) а		67	52
Ритуксан (1)		19	34
Ревлимид (30)		19	12
Соединение 1-3 (3)ь		27	13
Соединение 1-3 (30) ь		35	21
Ревлимид (30)	Ритуксан (1)	54	52
Соединение 1-3 (3)ь	Ритуксан (1)	71	57
Соединение 1-3 (30) ь	Ритуксан (1)	50	56

^а91% 3-энантиомер, 9% К-энантиомер;

^Ь84% 3-энантиомер, 16% К-энантиомер.

Соединение I исследовали в модели с ксенотрансплантатом лимфомы Кес-1 из клеток мантийной зоны, и результаты представлены на фиг. 23.

6.4.2. Модели множественной миеломы.

Соединения I, КК и К3 исследовали в модели с ксенотрансплантатом множественной миеломы ΝΟ-Η929, и результаты представлены на фиг. 24. Данные показали, что соединения I и К3 значительно ингибировали рост опухоли Н929 дозозависимым образом и были сравнимыми друг с другом. На 19 сутки соединение Ь3 продемонстрировало 87% ингибирование роста опухоли в дозе 30 мг/кг, 67% ингибирование роста опухоли в дозе 3 мг/кг, и 34% ингибирование роста опухоли в дозе 0,3 мг/кг.

- 39 029485

6.4.3. Модели глиобластомы.

Соединения I, ЕК и ЕЗ исследовали в модели с ксенотрансплантатом глиобластомы И87, и результаты представлены на фиг. 25. Данные показали, что соединения I и ЕЗ значительно ингибировали рост опухоли И87 в дозе 30 мг/кг ςά. В одном исследовании соединение I в дозе 30 мг/кг продемонстрировало >80% ингибирование роста опухоли на 48 сутки, и соединение ЕЗ в дозе 30 мг/кг продемонстрировало приблизительно 60% ингибирование роста опухоли на 48 сутки. В другом исследовании соединение ЕЗ в дозе 15 мг/кг продемонстрировало приблизительно 47% ингибирование роста опухоли на 43 сутки. Не было выявлено значимых изменений массы тела для всех исследованных соединений.

6.4.4. Модели рака ободочной и прямой кишки.

Соединения I, ЕК и ЕЗ исследовали в модели с ксенотрансплантатом рака ободочной и прямой кишки НСТ116, и результаты представлены на фиг. 26.

6.4.5. Модели печеночно-клеточного рака.

Соединения I, ЕЕ и ЕЗ исследовали в модели с ксенотрансплантатом печеночно-клеточного рака Нер3Ъ, и результаты представлены на фиг. 27.

6.5. Фармакокинетика.

Фармакокинетика соединения ЕЗ в крыс и обезьян обобщенно представлена в табл. 10.

Таблица 10

Фармакокинетика соединения ЕЗ у крыс и обезьян

	Крыса 5Ό*	Обезьяна* *
Доза	2 мг/кг, в/в	10 мг/кг, п/о	0,5 мг/кг, в/в	1 мг/кг, п/о
Стах		1500 нг/мл (3,3 мкМ)		140 нг/мл (0,31 мкМ)
лис	890 нг*ч/мл (2 мкМ-ч)	2,400 нг*ч/мл (5,2 мкМ-ч)	490 нг*ч/мл (1,1 мкМ-ч)	390 нг*ч/мл (0,87 мкМч)
Г		52%		20%
Уз 5	2,9 л/кг		1,2 л/кг
СЪр	37 мл/мин/кг		8,4 мл/мин/кг
*67% 5-энантиомер, 33% К-энантиомер **>99,5% 5-энантиомер, <0,5% К-энантиомер

6.6. Модели с цереблоном.

6.6.1. Анализ убиквитинилирования СКВЫ.

Убиквитинилирование СКВЫ измеряли в клетках НЕК293Т, которые были трансфицированы меченной на Ν-конце Ηΐδ-биотином конструкцией СКВЫ, затем предварительно инкубировали с исследуемыми соединениями в течение одного часа, а затем обрабатывали в течение 1 ч ингибитором протеасом (для остановки деградации убиквитинилированных белков). Клетки лизировали и обрабатывали для измерения убиквитинилирования СКВЫ с помощью ЗОЗ-РЛОЕ и анализа с использованием иммуноблоттинга с антителом против убиквитина.

В одном варианте осуществления соединение ЕЗ исследовали в анализе убиквитинилирования цереблона (СКВЫ) с использованием методик, описанных выше, и он показал величину ТС₅₀, составляющую 0,19 мкМ, в то время величины Κλ₀ составляют 12,9 мкМ для леналидомида и 21,6 мкМ для помалидомида. В другом варианте осуществления соединение ЕЗ ингибировало аутоубиквитинилирование белка СКВЫ ([С₅₀=0,5 мкМ), но не мутантного белка СКВЫ-У^/ЛЛ.

6.6.2. Конкурентный анализ с аффинными гранулами с талидомидом.

Клетки миеломы человека И266 высевали в количестве 0,5х10⁶ клеток/мл, выращивали до количества 1,5 х10⁶ клеток/ мл в 2-л вращающихся колбах Ег1ептеуег с вентилируемыми крышками, клетки собирали центрифугированием, подсчитывали и промывали в РВЗ, а затем осадок замораживали в жидком азоте. Осадки клеток И266 размораживали при комнатной температуре в лизирующем буфере ЫР-40 (0,5% ЫР40, 50 мМ Ττΐδ НС1 (рН 8,0), 150 мМ ЫаС1, 0,5 мМ ΌΤΤ, 0,25 мМ РМЗР, 1х смесь ингибиторов протеаз (КоеЬе, ПкПапароН. Щ) в количестве приблизительно 1-2х10⁸ клеток на мл (10-20 мг белка/мл). Клеточный дебрис и нуклеиновые кислоты удаляли центрифугированием (14000 об/мин, 30 мин, 4°С). Полученный супернатант хранили на льду перед использованием в анализе связывания с аффинными гранулами с аналогом талидомида в качестве содержащего СКВЫ экстракта И266.

- 40 029485

Гранулы, связанные с аналогом талидомида, получали с использованием аффинных гранул ΡΟ от Латадаиа 5е1ко Со 1арап в соответствии со способами, описанными в Йо с1 а1., "Иепййсайоп о£ а рптагу 1агце1 о£ (аПйотИ (егаЮдетсПу", 5с1епсе 327:1345-1350, 2010, и хранили при 4°С в течение вплоть до 4 недель перед применением в анализах.

В конкурентных экспериментах аликвоты объемом 0,5 мл (3-5 мг белка) экстракта лизата И266 предварительно инкубировали (15 мин, комнатная температура) с 5 мкл ДМСО (контроль) или 5 мкл соединения в различных концентрациях в ДМСО. Связанные с аналогом талидомида гранулы (0,3-0,5 мг) добавляли к экстрактам белков и образцы вращали (2 ч, 4°С). Гранулы промывали три раза 0,5 мл буфера ΝΡ40, а затем связавшиеся белки элюировали буфером для образца 5Э5-РЛОЕ. Образцы подвергали 5Э5-РЛОЕ и иммуноблоттингу, проводимому с использованием антитела против ΟΚΒΝ 65-76 (разведение 1:10000) и антитела против ΌΌΒ1 (разведение 1:2000). В конкурентных анализах с аффинными гранулами с талидомидом использовали систему Ы-СОК Обеккеу для количественного определения плотности полос ΟΚΒΝ, и относительные количества ΟΚΒΝ определяли посредством усреднения по меньшей мере трех контролей в виде ДМСО и выражения ΟΚΒΝ в каждом конкурентном образце в качестве процентного ингибирования белка ΕΚΒΝ относительно усредненных контролей в качестве 100% связывания.

Твердый исходный материал соединения (30 мМ) разбавляли в ДМСО за 1 ч до применения и приготавливали серийные разведения в ДМСО непосредственно перед добавлением к экстрактам. Первоначальное разведение 30 мМ исходного материала составляло 1:3 для 10 мМ раствора (или 10 мкМ раствора в конечном анализе) с последующими серийными разведениями 1:10.

Клетки И266 выращивали до логарифмической фазы во вращающихся колбах, клетки собирали центрифугированием, подсчитывали и промывали в РВ5 перед замораживанием осадка в жидком азоте.

Данные двух независимых экспериментов с образцами каждого эксперимента подергали двум независимым иммуноблоттингам и вычислению плотности сигнала ΕΚΒΝ относительно контрольной плотности, нанесенной на график с использованием нелинейного регрессионного анализа РгктСгарк с логарифмом ингибитора против ответа с переменным наклоном. Программа РгктСгарк вычисляла 5ЕМ для каждой точки концентрации соединения.

Соединение Е5 исследовали в конкурентном анализе с аффинными гранулами с талидомидом с использованием методик, как описано выше, и результат представлен на фиг. 28. Данные показали, что соединение Е5 связывается с эндогенным ΘΚΒΝ человека. В одном варианте осуществления соединение Е5 в концентрации 0,1 мкМ приводило к приблизительно на 50% меньшему количеству ΕΚΒΝ, связавшегося с аффинными гранулами, в то время как помалидомид в концентрации 3 мкМ приводил к приблизительно на 50% меньшему количеству ΕΚΒΝ, связавшегося с аффинными гранулами.

6.6.3. Нацеливание на цереблон при Ъ-клеточных дискразиях.

Определяли эффект (5)-3-(4-((4-морфолинометил)бензил)окси)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин2,6-диона ("соединение ^5% на связывание ΕΚΒΝ, убиквитинилирование и пролиферацию клеток. ΕΚΒΝ является компонентом комплекса убиквитинлигазы Е3, включающего СиЬ4Л, ΌΌΒ1 и ΚΟ^Ο и было выявлено, что он является молекулярной мишенью, связываемой талидомидом, леналидомидом и помалидомидом.

Исследования связывания с ΕΚΒΝ проводили с использованием конъюгированных с исследуемым соединением гранул в конкурентном анализе. Эндогенный ΕΚΒΝ из клеток множественной миеломы (ММ) человека измеряли путем инкубации экстрактов клеток с различными концентрациями либо соединения Е5, либо помалидомида, в качестве положительного контроля. Аффинные гранулы, связанные с кислотным аналогом талидомида, инкубировали с экстрактами И266 и после тщательного промывания гранул элюировали связавшиеся белки. Связывание ΘΚΒΝ со связанными с талидомидом аффинными гранулами определяли с помощью количественного определения ΕΚΒΝ с использованием иммуноблоттинга.

Убиквитинилирование ΕΚΒΝ измеряли в клетках НЕК293Т, которые были трансфицированы меченной на Ν-конце Ηίδ-биотином конструкцией ΘΚΒΝ, затем предварительно инкубировали с соединениями в течение 1 ч, а затем обрабатывали ингибитором протеасом МО132 (для остановки деградации убиквитинилированных белков). Клетки лизировали и обрабатывали для измерения убиквитинилирования ΘΚΒΝ с помощью 5Э5-РЛОЕ и иммуноблоттинга с использованием антитела против убиквитина. Исследования пролиферации клеток проводили в чувствительных и устойчивых к леналидомиду клетках множественной миеломы. Устойчивые или чувствительные к леналидомиду клеточные линии Н929 ММ обрабатывали соединением Е5 в течение 5 суток, а затем оценивали пролиферацию и жизнеспособность клеток посредством окрашивания 7-аминоактиномицином Ό ("7-ΆΌΌ"). Костимуляцию Т-клеток измеряли в очищенных первичных Т-клетках человека, стимулированных с использованием иммобилизованного антитела против СЭ3 в клеточной культуре в течение 2 суток, и секрецию цитокинов измеряли с помощью ЕЫ5Л.

Продукцию иммуноглобулинов М и О ('Ί§Ο и !дМ") измеряли из мононуклеарных клеток периферической крови нормальных доноров путем культивирования в присутствии факторов дифференцировки В-клеток: рекомбинантного Ю-2 человека (20 ед/мл), Ю-10 (50 нг/мл), Ю-15 (10 нг/мл), Ηίδ-меченного

- 41 029485

лиганда ί'.Ό40 (50 нг/мл), [дСЕантитела мыши с полигистидином (5 мкг/мл) и ΘΌΝ 2006-лиганда ТЬК9 человека (10 мкг/мл) в течение 4 суток, а затем с ГЕ-2, ГЬ-10, ГО-15 и ГО-6 (50 нг/мл) в течение дополнительных 3 суток. Измерение I§Μ и !дС проводили с помощью ЕЫ§А.

В конкурентных исследованиях связывания ί','ΡΒΝ предварительная инкубация с помалидомидом в концентрации 3 мкМ приводила к приблизительно на 50% меньшему количеству СРВН связавшегося с аффинными гранулами, в то время как соединение Е8 в концентрации 0,1 мкМ приводило к сходному связыванию СРВК Исследования по убиквитинилированию ί','ΡΒΝ в трансфицированных клетках НЕК293Т привели к следующей эффективности: соединение Е8 Κ5₀=0,19 мкМ; леналидомид ^50=12,9 мкМ и помалидомид Κ5₀=21,6 мкМ. Величины Ю5С1 для ингибирования пролиферации с помощью соединения Е§ сдвигались от 0,01 мкМ в родительской клеточной линии Н929 и 0,04 мкМ в обработанном ДМСО субклоне до 0,51-1,58 мкМ в устойчивых к леналидомиду субклонах.

50% сокращение клеточного цикла (δ-фаза) было очевидным после обработки в течение 24 ч клеток Н929 соединением Б8. Через 48 ч соединение Б8 снижало экспрессию сурвивина и ретинобластомного белка ("рКВ") и увеличивало экспрессию циклин-зависимого ингибитора киназ р27. Соединение Б8 костимулировало продукцию [Щ-2 Т-клетками с ЕС₅₀ приблизительно 0,29 нМ, по сравнению с 10 нМ для помалидомида. Соединение Б8 ингибировало продукцию !дМ и !дС с 0,35 и 2,1 нМ соответственно, по сравнению с 17 и 63 нМ для помалидомида.

Результаты указывают на то, что соединение Б8 связывается с ί','ΡΒΝ с приблизительно в 30 раз более высокой аффинностью по сравнению с помалидомидом и ингибирует убиквитинилирование ί','ΡΒΝ с приблизительно в 110 раз большей эффективностью, чем помалидомид, в этой системе. Соединение Б8 является приблизительно в 34 раза более эффективным, чем помалидомид, в отношении костимуляции продукции ГО-2 Т-клетками, и оно является в 30-48 раз более эффективным, чем помалидомид, в отношении ингибирования продукции иммуноглобулина.

6.7. Клинический протокол.

Описано клиническое исследование для определения безопасности, переносимости, фармакокинетики и эффективности соединения формулы (I), или его энантиомера или смеси энантиомеров, или их фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, сокристалла, клатрата или полиморфа, при введении перорально индивидуумам с развернутыми солидными опухолями, неходжкинской лимфомой или множественной миеломой. Вводят непереносимую дозу (КТО), максимально переносимую дозу (МТЭ) и рекомендованную дозу 2 фазы (ΡΡ2Ό). Также оценивают эффект соединения на биомаркеры ангиогенеза в биоптатах опухоли до и во время лечения.

Схема исследования. Исследование состоит из двух частей: увеличение дозы (часть А) и введение стабильной дозы (часть В). В части А индивидуумам вводят однократные и многократные возрастающие дозы соединения формулы (I), или его энантиомера или смеси энантиомеров, или их фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, сокристалла, клатрата или полиморфа, для измерения фармакокинетики (РК) и идентификации максимально переносимой дозы (МТЭ) и рекомендованной дозы 2 фазы (ΚΡ2Ό). Для идентификации первоначальной токсичности используют стандартную схему повышения дозы (3 + 3) (§1топ е( а1., 1997). Исходным группам из трех индивидуумов вводят соединение формулы (I), или его энантиомер или смесь энантиомеров, или их фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат, сокристалл, клатрат или полиморф (0,5 мг один раз в сутки) с возрастанием дозы 100% до первого случая токсичности степени 3 или более высокой токсичности, предположительно связанной с лекарственным средством во время первого курса, и в это время конкретную группу расширят всего до шести индивидуумов. Эту стандартную схему с увеличением дозы начинают, чтобы установить непереносимую дозу (КТО) и МТЭ. Также можно оценивать в отношении безопасности меньшие приращения и дополнительных индивидуумов. Приблизительно 20-40 индивидуумам проводят лечение и оценку в части А; однако общее количество индивидуумов в части А зависит от количества групп вводимых доз, необходимых для установления МТЭ. Дозу считают дозой КТО, когда 2 или более из 6 оцениваемых индивидуумов в группе испытывают связанную с лекарственным средством ограничивающую дозу токсичность (ЭБТ) во время курса 1. После установления КТО увеличение дозы прекращают. МТЭ определяют как последний уровень дозы ниже КТО, при котором 0 или 1 из 6 оцениваемых индивидуумов испытывают ЭБТ во время курса 1. Для более точного определения МТЭ и ΡΡ2Ό может потребоваться промежуточная доза (т.е. доза между КТО и последним уровнем дозы перед КТО) или дополнительные индивидуумы в любой группе введения дозы.

В части В дозирование индивидуумам может начинаться с МТЭ и/или более низкого уровня дозы, исходя из данных безопасности, РК и/или ΡΌ из части А. Приблизительно 100 индивидуумам (вплоть до 20 на группу), стратифицированных по типу опухоли, проводят введение и оценку безопасности и противоопухолевой активности после каждых двух курсов терапии. Дозы и схему дозирования определяют соответствующим образом. В ходе части В, данные безопасности изучают регулярно в отношении продолжения исследования в зависимости от ситуации.

Исследуемая выборка. Мужчины и женщины в возрасте 18 лет или старше с развернутыми солидными опухолями (8Т), неходжкинской лимфомой (КНЬ), множественной миеломой (ММ) или развернутыми нерезектабельными солидными опухолями, включая индивидуумов у которых произошло прогрес- 42 029485

сирование (или которые не были способны переносить) при стандартной терапии или для которых не существует стандартной терапии против рака. Выбранные типы опухоли включают метастазирующий рак молочной железы (тВС), мультиформную глиобластому (СВМ), печеночно-клеточную карциному (НСС), диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому (ОЬВСЬ) и множественную миелому (ММ).

Дозирование и длительность исследования. Во время первого курса только в части А каждому индивидууму вводят однократную суточную дозу соединения формулы (I), или его энантиомера или смеси энантиомеров, или их фармацевтически приемлемой соли, сольвата, гидрата, сокристалла, клатрата или полиморфа, на 1 сутки с последующим периодом наблюдения и взятия образцов РК в течение 48 ч, за которым следуют 1 сутки ежедневного непрерывающегося дозирования в течение 28 суток (курс 1=30 суток). В ходе последующих курсов части А индивидуумам проводят курсы из 28 суток с непрерывным дозированием начиная с 1 по 28 сутки. Соединение формулы (I), или его энантиомер или смесь энантиомеров, или их фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат, сокристалл, клатрат или полиморф, вводят один раз или два раза в сутки в первоначальной дозе 0,1, 0,5, 1, 2, 4, 5, 7,5, 10, 20, 25, 50 или 100 мг. Доза может составлять 0,1, 0,5, 1, 2, 4, 5, 7,5, 10 мг при введении один раз в сутки. Доза может составлять 50, 25 или 10 мг при введении два раза в сутки. Во время введения дозу можно корректировать в сторону увеличения или снижения от исходной дозы. Как описано выше, при необходимости лекарственное средство можно водить курсами.

В ходе части В индивидуумам проводят непрерывное дозирование в течение 28 суток от начала введения. Отсутствует период после первоначальной однократной дозы со сбором образцов для исследования РК в течение 48 ч.

Терапию прекращают, если имеются признаки прогрессирования заболевания, неприемлемой токсичности или в случае, если индивидуум/врач решат прекратить терапию. Индивидуум может продолжать получать соединения без прекращения при условии, что это является полезным по мнению исследователя.

Составление групп для исследования происходит приблизительно в течение 24 месяцев. Завершение активного лечения и наблюдение индивидуума может занимать дополнительные 3-6 месяцев.

Исследуемое лечение. Соединение формулы (I), или его энантиомер или смесь энантиомеров, или их фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат, сокристалл, клатрат или полиморф, предоставляют для перорального введения в качестве капсул с 0,1, 0,5, 1 и 3 мг. Соединение упаковывают в бутылки внутри коробок, содержащих лекарственное средство на 28 суток.

В ходе части А (фаза увеличения дозы), уровень дозы начинается с 0,5 мг один раз в сутки после однократной дозы для исследования РК. После введения первой дозы последнему индивидууму в любой группе, индивидуумов наблюдают в течение по меньшей мере 30 суток перед тем, как можно будет начать исследование следующей группы с указанной в протоколе дозой. Увеличение дозы у индивидуума не допускается, если только это не одобрено 5>аГе1у Ке\ае\у СоттШее (8КС) посредством медицинского мониторинга главным исследователем и спонсором.

В ходе части В индивидуумам можно вводить соединение формулы (I), или его энантиомер или смесь энантиомеров, или их фармацевтически приемлемую соль, сольват, гидрат, сокристалл, клатрат или полиморф, на уровне ΜΤΌ и/или на более низком уровне дозы, исходя из оценок безопасности, РК и РО из части А. Приблизительно 100 индивидуумов (заранее отобранные типы опухолей в группах из вплоть до 20 индивидуумов) оценивают в отношении безопасности и противоопухолевых эффектов.

Обзор оценки эффективности. Индивидуумов оценивают в отношении эффективности после каждых 2 курсов. Первичной переменной эффективности является ответ. Ответ опухоли основан на критериях Кекроике Еуа1иаДои СгПепа ш ЗоНб Титогк (КЕСШТ 1.1), критериях ^огккйор Сгкепа

(ПУС) для ЫНЬ, критериях Iиΐе^ηаΐ^οиа1 ГОиГогт Кекроике СгПепа (ШКС) для множественной шеломы (приложение А, раздел 18.1), или Кекроикек Аккекктет Гог №иго-Оисо1о§у (ΡΛΝΟ) ХУогктд Огоир для СВМ.

Вторичные/искомые конечные результаты включают показатели биомаркеров в крови и опухоли, гистопатологический ответ и корреляцию с данными фармакогеномики. Также исследуют дополнительные переменные эффективности (например, статус эффективности ЕСОО, исходы РЕТ); кроме того, измеряют изменения гиповаскуляризации по константе переноса объема (КИаик) и исходной АИС ДАИС) с использованием ЭСЕ-МКЕ

Обзор показателей безопасности. Переменными безопасности для этого исследования являются неблагоприятные явления, клинические лабораторные переменные, ЭКГ с 12 отведениями (по центру), оценку ЬУЕЕ, данные физикального обследования и основные показатели жизнедеятельности.

Обзор оценки фармакокинетики. Профили РК соединения формулы (I) и его метаболитов определят путем серийного взятия образцов крови и мочи во время первого курса лечения. Их сопоставляют с фармакодинамическими (РЭ) исходами, когда это возможно.

Примеры, представленные выше, предназначены для предоставления специалисту в данной области полного раскрытия и описания того, как получать и применять заявленные варианты осуществления, и они не предназначены для ограничения объема того, что описано в настоящем описании. Подразумевает- 43 029485

ся, что модификации, которые являются очевидными специалистам в данной области, находятся в объеме нижеследующей формулы изобретения. Все публикации, патенты и патентные заявки, цитированные в настоящем описании, включены в настоящее описание в качестве ссылок, как если бы было конкретно и индивидуально указано, что каждая такая публикация, патент или патентная заявка включены в настоящее описание в качестве ссылок.

6.8. Применение у пациентов с нарушением почек.

(δ)-3-(4-((4-Морфолинометил)бензил)окси)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион ("соединение Ι-δ") является более эффективным, чем предшествующие иммуномодулирующие соединения, такие как талидомид. Иммуномодулирующие соединения продемонстрировали значительную клиническую активность у пациентов с рефрактерным и/или рецидивирующим и рефрактерным заболеванием. Нарушение почек является распространенным сопутствующим заболеванием для пациентов с множественной миеломой, возникающим у более чем 40% пациентов. (Е1еййегак1§-Рарар1акоуои е! а1., Ьеик кутрИота 2011; 52 (12):2299-2303).

Пациентам с множественной миеломой с нарушениями почек вводят соединение Ι-δ в соответствии с режимами лечения, описанными в настоящем описании. Известно, что определенные иммуномодулирующие соединения, которые метаболизируются и выводятся почками, выводятся на низких уровнях в качестве исходного лекарственного средства. Характеристики сходных иммуномодулирующих соединений, таких как помалидомид, указывают на то, что степень почечной функции незначительно влияет на уровень исходного лекарственного средства.

Claims (21)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ лечения рака, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества 3-(4-((4-(морфолинометил)бензил)окси)-1-оксоизоиндолин-2ил)пиперидин-2,6-диона, который имеет следующую структуру:

   или его энантиомера или смеси энантиомеров, или его фармацевтически приемлемой соли, где рак представляет собой лимфому, лейкоз, миелому, глиобластому, рак ободочной и прямой кишки или печеночно-клеточную карциному.
2. 2. Способ по п.1, где рак представляет собой рак ободочной и прямой кишки Дьюкса С и Ό, нерезектабельную карциному ободочной и прямой кишки, метастатическую печеночно-клеточную карциному, кариотипы острого миелобластного лейкоза, лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому, Тклеточную лимфому кожи, кожную В-клеточную лимфому, диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому, низкозлокачественную фолликулярную лимфому, нерезектабельную печеночно-клеточную карциному, макроглобулинемию Вальденстрома, вялотекущую миелому или медленно растущую миелому.
3. 3. Способ по п.1, где рак представляет собой неходжкинскую лимфому.
4. 4. Способ по п.3, где неходжкинская лимфома представляет собой диффузную крупноклеточную Вклеточную лимфому.
5. 5. Способ по п.3, где неходжкинская лимфома представляет собой фолликулярную лимфому, лимфому Беркитта или лимфому из клеток мантийной зоны.
6. 6. Способ по п.1, где рак представляет собой множественную миелому.
7. 7. Способ по п.1, где рак представляет собой рак ободочной и прямой кишки, печеночно-клеточную карциному или глиобластому.
8. 8. Способ по п.1, где рак представляет собой глиобластому.
9. 9. Способ по любому из пп. 1-8, где рак является рецидивирующим или рефрактерным.
10. 10. Способ по любому из пп.1-9, где рак является лекарственно-устойчивым к леналидомиду.
11. 11. Способ по п.6, где множественная миелома является рецидивирующей или рефрактерной.
12. 12. Способ по п.6, где множественная миелома является лекарственно-устойчивой к леналидомиду.
13. 13. Способ по любому из пп.1-12, дополнительно включающий введение терапевтически эффективного количества ритуксимаба.
14. 14. Способ по любому из пп.1-13, где 3-(4-((4-(морфолинометил)бензил)окси)-1-оксоизоиндолин-2ил)пиперидин-2,6-дион, или его энантиомер или смесь энантиомеров, или его фармацевтически приемлемую соль вводят в количестве от приблизительно 0,3 до приблизительно 40 мг/кг.

    - 44 029485
15. 15. Способ по п.14, где соединение вводят в количестве приблизительно 0,3, 3 или 30 мг/кг.
16. 16. Способ по п.14, где соединение вводят перорально.
17. 17. Способ по п.14, где соединение вводят в капсуле или таблетке.
18. 18. Способ по п.17, где соединение вводят в капсуле с 10 или 25 мг.
19. 19. Способ по любому из пп.1-18, где соединение вводят в течение 21 суток, за которыми следуют семь суток покоя, в ходе курса из 28 суток.
20. 20. Способ по любому из пп.1-19, где соединение представляет собой (3)-3-(4-((4(морфолинометил)бензил)окси)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-дион.
21. 21. Способ по любому из пп.1-19, где соединение представляет собой гидрохлорид (3)-3-(4-((4(морфолинометил)бензил)окси)- 1 -оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-диона.

    - 45 029485

    029485