UA116992C2 - Лікування імуноопосередкованого захворювання (варіанти) - Google Patents

Лікування імуноопосередкованого захворювання (варіанти) Download PDF

Info

Publication number
UA116992C2
UA116992C2 UAA201501972A UAA201501972A UA116992C2 UA 116992 C2 UA116992 C2 UA 116992C2 UA A201501972 A UAA201501972 A UA A201501972A UA A201501972 A UAA201501972 A UA A201501972A UA 116992 C2 UA116992 C2 UA 116992C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
compound
half half
cells
sho
day
Prior art date
Application number
UAA201501972A
Other languages
English (en)
Inventor
Пітер Х. Шефер
Раджеш ЧОПРА
Аніта Гандхі
Original Assignee
Селджин Корпорейшн
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Селджин Корпорейшн filed Critical Селджин Корпорейшн
Publication of UA116992C2 publication Critical patent/UA116992C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5375—1,4-Oxazines, e.g. morpholine
    • A61K31/5377—1,4-Oxazines, e.g. morpholine not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. timolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D413/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D413/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing three or more hetero rings

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Винахід стосується способу лікування, профілактики або контролю захворювання, який включає введення пацієнту ефективної кількості сполуки формули І EMBED ISISServer І або її фармацевтично прийнятної солі, енантіомера або рацемічної суміші, де захворювання являє собою вовчак, склеродермію, саркоїдоз, синдром Шегнера.

Description

4 доба 7 доба 2000 т т й г я : 1500 - ті : | шк кі є т ШУ оз і о 1000 що С ще с ІМ бе ; Я «77 ж шо
А м ах 0 З ЕЕ. як КО Я
ДдМСО Досліджува- Дослілжуває ДМ со Досліджува- Досліджува»
Що насполуки вясполука насполука наснолука
НМ 0йюОнМ НМ 0 200нМ 1000 4 доба 7 доба 8004,
З Ж зах жах яке - 600 р ще що 0. т | зе й : й Кк лий Кн тя ; де ок ще д- и ШИ КУ ! І зни и. дМСо Досліджува- Досліджува- ДдМиСО Доєсліджува- Дослійжува: наєполука вна сполука о Насполука насполука оонМ 0 00нМ НМ з0бнМ що 4 доба 7 доба 1000 пннннннвоннккннннннннннн ен овоноікінентнтя ще ЕЗ аж ж ЖЕЖ
Гай Ух пек р й тк Сх -о 60045, ха 400455 С т З Кх о о
ПО- х мне я 200) с | ше
ДМС Досліджува-: Досліджува- дМсСо Досліджува- Досліджува-
І о назполука насполухи на сполука на сполука нм 0 йбМ НМ 0 00нМ
Фіг. 16
1. СПОРІДНЕНІ ЗАЯВКИ
За даною заявкою запитується пріоритет за тимчасовою патентною заявкою США Мо 61/722718, поданою 5 листопада 2012 року, і 61/681491, поданою 9 серпня 2012 року, що включені в даний опис як посилання в повному об'ємі. 2. СПИСОК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
Дана заявка подається зі списком послідовностей, наданому як файл із назвою 12827-207- 888 Зеаієспдх розміром 6571 байт, що створений 8 серпня 2012 року. Список послідовностей включений у даний опис як посилання в повному об'ємі. 3. ГАЛУЗЬ ВИНАХОДУ
Даний винахід стосується способів лікування, профілактики і/або контролю за перебігом захворювань, пов'язаних з лейкоцитарною активністю, включаючи активність В-клітин і/або Т- клітин, моноцитів, макрофагів і інших типів клітин лімфоїдного або мієлоїдного ряду, наприклад, за перебігом імуноопосередкованих захворювань або запальних захворювань, які включають введення сполуки І або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей, включаючи (5)-3-(4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)- 1- оксо-1,3-дигідроізоіндол-2-іл|Іпіперидин-2,б6-діон. Також винахід стосується фармацевтичних композицій і режимів дозування при такому лікуванні, профілактики і/або контролю за перебігом. 4. РІВЕНЬ ТЕХНІКИ
Запальні і імуноопосередковані захворювання, що модулюються лімфоцитарною активністю, включаючи активність В-клітин і/або Т-клітин, такі, як вовчак, склеродермія, озноблений (регпіо) вовчак, саркоїдоз, синдром Шегрена, АМСА-індукований васкуліт, антифосфоліпідний синдром і міастенія, залишаються важливими медичними задачами.
Вовчак або системний червоний вовчак являє собою групу аутоїмунних порушень, які можуть викликати хронічне запалення в різних частинах організму, особливо на шкірі, у суглобах, крові і нирках. Імунна система організму в нормі забезпечує захист білками, які називаються антитілами, від вірусів, бактерій і інших чужорідних матеріалів (тобто антигенів).
При аутоіїмунному порушенні, такому, як вовчак, імунна система втрачає здатність розпізнавати антигени і власні клітини і тканини, що може приводити до того, що антитіла, спрямовані проти власних клітин і тканин організму, утворюють імунні комплекси. Ці імунні комплекси можуть накопичуватися в тканинах і викликати запалення, ушкодження тканин і/або біль. Три найбільш розповсюджені типи вовчака включають системний червоний вовчак (ЗЕ), шкірний червоний вовчак (СГ ЕЕ) і вовчак, який викликається лікарськими засобами. Більш докладний опис вовчака або системного червоного вовчака може бути знайдений в УмаїЇїасе, 2000, Тпе І ири5 ВоокК: А
Сиіде їог Райепі5 апа Тпеїг Ратіїев5, Охіога Опімегейу Ргез55, переглянуте і доповнене видання, що включене в даний опис як посилання в повному об'ємі.
Склеродермія є рідкісним захворюванням і зустрічається стабільно із частотою приблизно 19 випадків на 1 мільйон людини. Точна причина склеродермії невідома. Патологія включає аутоїмунні реакції і зміну функції ендотеліальних клітин і фібробластів. Системна склеродермія звичайно починається зі стовщення шкіри, звичайно шкіри пальців, що супроводжується феноменом Рейно. Хвороба Рейно, як правило, передує подальшим проявам системної склеродермії. На ранній стадії захворювання вражена шкіра може бути набряклою і м'якою.
Звичайною зоною найбільшого стовщення й ущільнення шкіри є обличчя, руки і пальці. Часто відзначається склеродактилія. При обстеженні часто пальпується фрикційне стирання сухожиль і воно може бути хворобливим. На більш пізній стадії захворювання можуть з'являтися виразки і самоампутація пальців. Порушення моторики шлунково-кишкового тракту є ознакою, що часто виявляється печією або діареєю з порушенням усмоктування або псевдонепрохідністю.
Гіпертензія, що виникає вперше, або ниркова недостатність є проявами пов'язаного із захворюванням ушкодження судин. Також можливі серцева недостатність або аритмія, викликані фіброзом серця. (НаспиМйа Е, Гашпау О, Оіадповзі5 апа сіабззійсайоп ої зу«кетіс зсіегові5, Сіїп Вем АПегду Іттипої 2010; 40(2):78-83).
Основними проявами склеродермії і, зокрема, системної склеродермії, є неналежний надмірний синтез і відкладення колагену, ендотеліальна дисфункція, спазм, колапс і облітерація, викликані фіброзом. Для діагностики важливою клінічною ознакою є стовщення шкіри проксимальніше п'ясно-фалангових суглобів. Феномен Рейно є частим, практично універсальним компонентом склеродермії. Його діагностують за зміною кольору шкіри під дією холоду. Симптомами хвороби Рейно є ішемія і стовщення шкіри.
Саркоїдоз являє собою захворювання, що відрізняється утворенням гранулеми, посилюваним лімфоцитами і макрофагами, звичайно класифікованим як відповідь Т-хелперів 1 типу. Думають, що фактором, що робить внесок у первісне запалення легень, є надпродукція (610) фактора некрозу пухлини (ТМРЕ)-а, 1-8 і 1-18. Озноблений вовчак є хронічним шкірним, таким,
що спотворює, проявом саркоїдозу, який в основному вражає обличчя. Лікування саркоїдозу і пов'язаного з ним оознобленого вовчака вкрай обмежене, наприклад, кортикостероїди забезпечують лише помірну ефективність (Вашуаптап ЕР, Уцазоп МА, Теїгвієїп АБ, Моїег ОВ,
Гомег ЕЕ. Таїїдотіа Фог спгопіс загсоїдовів. Спеві. 2002 ди122(1):227-32).
Залишається необхідність у профілактичних або терапевтичних засобах, які можна використовувати для лікування або профілактики імуноопосередкованих і запальних захворювань, включаючи вовчак, склеродермію, озноблений вовчак, саркоїдоз, синдром
Шегрена, АМСА-індукований васкуліт, антифосфоліпідний синдром і міастенія. 5. СУТЬ ВИНАХОДУ
Даний винахід стосується способів лікування, контролю за перебігом, полегшення і/або профілактики захворювань, порушень і/або станів, пов'язаних із імуноопосередкованими і запальними захворюваннями, які включають введення терапевтично ефективної кількості сполуки формули о о нн
М
Сон» з шк; ос
Сполука |, або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоіїзомера, таутомера або рацемічних сумішей.
В одному з варіантів здійснення сполука являє собою 3-(4-(4-морфолін-4- ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3-дигідро-ізоіндол-2-іл|-піперидин-2,б-діон.
В одному з варіантів здійснення сполука являє собою фармацевтично прийнятну сіль 3-(4- (4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3-дигідро-ізоіндол-2-іл|-піперидин-2,б-діону.
В одному з варіантів здійснення сполука являє собою гідрохлорид 3-(4-(4-морфолін-4- ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3-дигідро-ізоіндол-2-іл|-піперидин-2,б-діону.
В одному з варіантів здійснення сполука являє собою /(5)-3-І4-(4-морфолін-4- ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3-дигідроізоіндол-2-іл|-піперидин-2,6-діон з наступною структурою: оо
МН
М-7ї, уко
Н 7 й
В о Сполука ІА, або її фармацевтично прийнятну сіль, сольват, гідрат або таутомер.
В одному з варіантів здійснення сполука являє собою /(5)-3-І4-(4-морфолін-4- ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3-дигідроізоіндол-2-іл|-піперидин-2,6б-діон.
В одному з варіантів здійснення сполука являє собою фармацевтично прийнятну сіль (5)-3-
І4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3-дигідроізоіїндол-2-іл|-піперидин-2,6б-діону.
В одному з варіантів здійснення сполука являє собою гідрохлорид (5)-3-(4-(4-морфолін-4- ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3-дигідроізоіндол-2-іл|-піперидин-2,б-діону.
В одному з варіантів здійснення сполука являє собою /(К)-3-(4-(4-морфолін-4- ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3-дигідроізоіндол-2-іл|-піперидин-2,6-діон з наступною структурою:
оо
МН
М» (в) ; і 0. о
Сполука ІВ, або її фармацевтично прийнятну сіль, сольват, гідрат або таутомер.
В одному з варіантів здійснення сполука являє собою /(К)-3-(4-(4-морфолін-4- ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3-дигідроізоіндол-2-іл|-піперидин-2,6б-діон.
В одному з варіантів здійснення сполука являє собою фармацевтично прийнятну сіль (К)-3-
І4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3-дигідроізоіїндол-2-іл|-піперидин-2,6б-діону.
В одному з варіантів здійснення сполука являє собою гідрохлорид (К)-3-(4-(4-морфолін-4- ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3-дигідроізоіндол-2-іл|-піперидин-2,б-діону.
У визначених варіантах здійснення захворювання вибране з вовчака, склеродермії, синдрому Шегрена, АМСА-індукованого васкуліту, антифосфоліпідного синдрому і міастенії.
В одному з варіантів здійснення даний винахід стосується способів модулювання, наприклад, зниження, лейкоцитарної активності, включаючи активність В-клітин і/або Т-клітин, моноцитів, макрофагів і інших типів клітин лімфоїдного або мієлоїдного ряду, які включають приведення В-клітини і/або Т-клітини в контакт із ефективною кількістю сполуки Ї.
Також даний винахід стосується фармацевтичних композицій, лікарських форм і наборів, що підходять для застосування при лікуванні, профілактики, полегшення і/або контролю за перебігом захворювань, порушень і/або станів, пов'язаних з імуноопосередкованими і запальними захворюваннями, що містять сполуку І, необов'язково в комбінації з одним або декількома іншими терапевтичними засобами.
У визначених варіантах здійснення сполуку І вводять у комбінації з одним або декількома терапевтичними засобами, тобто фармацевтичними засобами, що є модуляторами лейкоцитарної активності, включаючи активність В-клітин і/або Т-клітин, моноцитів, макрофагів і інших типів клітин лімфоїдного або мієлоїдного ряду. Комбінації передбачають одночасне, а також послідовне введення. 6. КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ
На фіг 1 показаний ефект о (5)-3-І4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3- дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,6-діону на диференціювання плазмобластів і активованих В- клітин.
На фіг 2 показаний ефект о (5)-3-І4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3- дигідроізоіндо-2-іл|Іпіперидин-2,б6-діону на життєздатність клітин у ході диференціювання плазмобластів.
На фіг З показаний ефект о (5)-3-І4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3- дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,6-діону на експресію факторів транскрипції в В-клітинах і плазмоцитах.
На фіг 4 о показаний ефект о (5)-3-І4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3- дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,б-діону на продукцію Ідсї у культурах плазмобластів.
На фіг 5А і 5В показаний ефект (5)-3-(4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3- дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,6-діону на експресію факторів транскрипції в В-клітинах і плазмоцитах.
На фіг б показаний ефект о (5)-3-І4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3- дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,б-діону на продукцію Ід у культурах В-клітин на 4, 7 і 10 добу.
На фіг 7 показаний ефект о (5)-3-І4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3- дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,б-діону, окремо й у комбінації з преднізолоном, на продукцію Їдс диференційованими іп міго плазмобластами/плазмоцитами.
На фіг 8 показаний ефект о (5)-3-І4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3- дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,6-діону на експресію СО20/С038 у ході диференціювання В- клітин на 7 добу.
На фіг 9 показаний ефект о (5)-3-І4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3- дигідроізоіндо-2-іл|Іпіперидин-2,б6-діону на життєздатність клітин у ході диференціювання плазмобластів.
На фіг, 10 показаний ефект (5)-3-І4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3- дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,6-діону на диференціювання і функцію В-клітин у РВМС пацієнтів із 5І Е іп міїго.
На фіг. 11А ії 118 показаний ефект (5)-3-І4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3- дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,б-діону на продукцію да і (ДМ, відповідно, у культурах В-клітин на 7 добу.
На фіг, 12 показаний ефект (5)-3-І4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3- дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,6-діону на диференціювання Ср195В-клітин у плазмобласти/плазмоцити.
На фіг, 13 показаний ефект (5)-3-І4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3- дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,6-діону на популяції клітин великого розміру (вікно рг) в аналізі диференціювання нормальних В-клітин.
На фіг, 14 показаний ефект (5)-3-І4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3- дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,6-діону на фактори транскрипції плазмоцитів у культурі для В- клітинного диференціювання.
На фіг. 15А-15ЄЕ показаний ефект (5)-3-І4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3- дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,6-діону (20 НМ) на експресію факторів транскрипції плазмоцитами в культивованих В-клітинах на 7 добу.
На фіг, 16 показаний ефект (5)-3-І4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3- дигідроізоіндо-2-іл|Іпіперидин-2,6-діону на експресію факторів транскрипції в СОЗ38в- плазмобластах/плазмоцитах із РВМС, що диференціюються, пацієнта з 5 Е.
На фіг, о 17 показаний ефект (5)-3-І4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3- дигідроізоіндо-2-іл|Іпіперидин-2,6-діону (представленого на фігурі як сполука І) на СО44 МРЕЇ у культурі для В-клітинного диференціювання на 7 добу.
На фіг, 18 показаний ефект (5)-3-І4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3- дигідроізоіндо-2-ілІпіперидин-2,б-діону на клітини СО20гоп/О44г"оп в аналізі диференціювання нормальних В-клітин на 7 добу.
На фіг, 19 показаний ефект (5)-3-І4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3- дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,6-діону (представленого як сполука І на фігурі) на СО83.-- клітини й експресію СО83-- у культурі для В-клітинного диференціювання на 4 добу і 7 добу.
На фіг, 20 показаний ефект (5)-3-І4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3- дигідроізоіндо-2-іл|Іпіперидин-2,6-діону (представленого як сполука І на фігурі) на експресію .- ланцюга Ід у культурі для В-клітинного диференціювання.
На фіг 21 опроілюстрований ефект 3-(4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3- дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,6-діону на продукцію визначених цитокінів і хемокінів у стимульованих антитілом проти СОЗ Т-клітинах людини, виражений як абсолютна продукована кількість.
На фіг 22 опроілюстрований ефект 3-(4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3- дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,6-діону на продукцію визначених цитокінів і хемокінів у стимульованих антитілом проти СОЗ Т-клітинах людини, виражений як відсоток від контролю.
На фіг. 23 проілюстрований ефект (К)-3-(4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3- дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,6-діону на продукцію визначених цитокінів і хемокінів у стимульованих антитілом проти СОЗ Т-клітинах людини, виражений як абсолютна продукована кількість.
На фіг. 24 проілюстрований ефект (К)-3-(4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3- дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,6-діону на продукцію визначених цитокінів і хемокінів у стимульованих антитілом проти СОЗ Т-клітинах людини, виражений як відсоток від контролю.
На фіг. 25 проілюстрований ефект (5)-3-(4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3- дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,6-діону на продукцію визначених цитокінів і хемокінів у стимульованих антитілом проти СОЗ Т-клітинах людини, виражений як абсолютна продукована кількість.
На фіг. 26 проілюстрований ефект (5)-3-(4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3- дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,6-діону на продукцію визначених цитокінів і хемокінів у стимульованих антитілом проти СОЗ Т-клітинах людини, виражений як відсоток від контролю.
На фіг. 27 проілюстровано інгібування 3-(4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3- дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,6-діоном продукції визначених цитокінів ії хемокінів у стимульованих ліпополісахаридом мононуклеарних клітинах периферичної крові.
На фіг. 28 проілюстроване посилення продукції 3-(4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1- оксо-1,3-дигідроізоіндо-2-іл|Іпіперидин-2,6-діоном визначених цитокінів ії хемокінів. (у стимульованих ліпополісахаридом мононуклеарних клітинах периферичної крові.
На фіг. 29 проілюстровано інгібування (Н)-3-(4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3- дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,6-діоном продукції визначених цитокінів ії хемокінів у (610) стимульованих ліпополісахаридом мононуклеарних клітинах периферичної крові.
На фіг. 30 проілюстроване посилення (К)-3-(4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3- дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,6-діоном продукції визначених цитокінів ії хемокінів у стимульованих ліпополісахаридом мононуклеарних клітинах периферичної крові.
На фіг. 31 проілюстровано інгібування (5)-3-(4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3- дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,6-діоном продукції визначених цитокінів ії хемокінів у стимульованих ліпополісахаридом мононуклеарних клітинах периферичної крові.
На фіг. 32 проілюстроване посилення (5)-3-(4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3- дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,6-діоном продукції визначених цитокінів ії хемокінів у стимульованих ліпополісахаридом мононуклеарних клітинах периферичної крові.
На фіг. 33 проілюстроване посилення 3-(4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3- дигідроізоіндо-2-іл|Іпіперидин-2,6-діоном продукції ІЕМ-гамма МК-клітинами у відповідь на іммобілізований Іда і ІІ -2, виражене як абсолютна продукована кількість.
На фіг. 34 проілюстроване посилення (К)-3-(4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3- дигідроізоіндо-2-іл|Іпіперидин-2,6-діоном продукції ІЕМ-гамма МК-клітинами у відповідь на іммобілізований Іда і ІІ -2, виражене як абсолютна продукована кількість.
На фіг. 35 проілюстроване посилення (5)-3-(4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3- дигідроізоіндо-2-іл|Іпіперидин-2,6-діоном продукції ІЕМ-гамма МК-клітинами у відповідь на іммобілізований Іда і ІІ -2, виражене як абсолютна продукована кількість.
На фіг. 36 проілюстроване посилення 3-(4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3- дигідроізоіндо-2-іл|Іпіперидин-2,6-діоном продукції ІЕМ-гамма МК-клітинами у відповідь на іммобілізований ІдС: і 1/-2, виражене як відсоток від кількості ІЕМ-гамма, продукованого в присутності 1 мкМ помалідоміду.
На фіг. 37 проілюстроване посилення (К)-3-(4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3- дигідроізоіндо-2-іл|Іпіперидин-2,6-діоном продукції ІЕМ-гамма МК-клітинами у відповідь на іммобілізований ІдС: і 1/-2, виражене як відсоток від кількості ІЕМ-гамма, продукованого в присутності 1 мкМ помалідоміду.
На фіг. 38 проілюстроване посилення (5)-3-(4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3- дигідроізоіндо-2-іл|Іпіперидин-2,6-діоном продукції ІЕМ-гамма МК-клітинами у відповідь на іммобілізований ІдС: і 1/-2, виражене як відсоток від кількості ІЕМ-гамма, продукованого в присутності 1 мкМ помалідоміду.
На фіг. 39 показаний ефект сполук, описаних у даному описі, на індуковану факторами росту проліферацію клітин ендотелію пупкових судин людини.
На фіг. 40 показаний ефект сполук, описаних у даному описі, на індуковане факторами росту утворення трубки з ендотеліальних клітин пупкових судин людини.
На фіг. 41 показаний ефект сполук, описаних у даному описі, на індуковану факторами росту інвазію клітин ендотелію пупкових судин людини.
На фіг, 42 показаний ефект (5)-3-І4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3- дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,6-діону на товщину шкіри вогнища ушкодження на моделі індукованого блеоміцином фіброзу шкіри на мишах (профілактика фіброзу, що запускається запаленням).
На фіг. 43 показані мікрофотографії забарвлених гематоксиліном і еозином зрізів шкіри, що демонструють товщину шкіри вогнища ушкодження на моделі індукованого блеоміцином фіброзу шкіри на мишах (профілактика фіброзу, що запускається запаленням).
На фіг, 44 показаний ефект о (5)-3-І4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3- дигідроізоіндо-2-іл|Іпіперидин-2,б-діону на кількість альфа-5ЗМА ж- міофібробласти в шкірі вогнища ушкодження на моделі індукованого блеоміцином фіброзу шкіри на мишах (профілактика індукованого запаленням фіброзу).
На фіг. 45 показаний ефект досліджуваних сполук на товщину шкіри вогнища ушкодження на моделі індукованого блеоміцином фіброзу шкіри на мишах (регресія розвиненого фіброзу).
На фіг. 46 показані мікрофотографії забарвлених гематоксиліном і еозином зрізів шкіри вогнищ ушкодження на моделі індукованого блеоміцином фіброзу шкіри на мишах (регресія розвиненого фіброзу).
На фіг. 47 показане зниження кількостей альфа-ЗМА ж міофібробласти в шкірі вогнища ушкодження на моделі індукованого блеоміцином фіброзу шкіри на мишах (регресія розвиненого фіброзу).
На фіг. 48А показане зменшення товщини шкіри (5)-3-І(4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)- 1-оксо-1,3-дигідроізоіндо-2-іл|Іпіперидин-2,6-діоном у мишей Т5К-1.
На фіг. 488 показане зниження відносного вмісту гідроксипроліну за допомогою (5)-3-(4-(4- морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3-дигідроізоіндо-2-іл|Іпіперидин-2,б-діону в мишей Т5К- бо 1.
На фіг. 49А показане модулювання СТО (5)-3-І(4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо- 1,3-дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,6-діоном.
На фіг. 498 показане модулювання РАЇ1-1 (5)-3-(4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо- 1,3-дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,6-діоном.
На фіг. 49С показане модулювання СОЇЛ1А (5)-3-(4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1- оксо-1,3-дигідроізоіндо-2-іл|Іпіперидин-2,6-діоном.
На фіг. 490 показане модулювання азмА (5)-3-(4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо- 1,3-дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,6-діоном.
На фіг. 49Е показане модулювання ССМР (5)-3-(4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо- 1,3-дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,6-діоном.
На фіг. 49Е показане модулювання ТОЕВ1 (5)-3-(4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо- 1,3-дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,6-діоном.
На фіг 50 показане модулювання СОЇ1, азмА і ЕМ (5)-3-І(4-(4-морфолін-4- ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3-дигідроізоіндо-2-іл|Іпіперидин-2,б-діоном.
На фіг. 51 показане модулювання ММРІ і РАЇ (5)-3-(4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1- оксо-1,3-дигідроізоіндо-2-іл|Іпіперидин-2,6-діоном.
На фіг. 52 показане модулювання Юптиі! (5)-3-(4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо- 1,3-дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,6-діоном.
На фіг. 53 показаний рівень експресії мРНК цереблону в нормальних фібробластах і фібробластах при 556.
На фіг. 54 показаний рівень експресії МРНК цереблону в нормальних тканинах шкіри і тканинах шкіри при 556. 7. ДОКЛАДНИЙ ОПИС
Якщо не визначено інше, усі технічні і наукові терміни, використовувані в даному описі, мають те ж значення, що звичайно має на увазі фахівець у даній галузі. Усі патенти, заявки, опубліковані заявки й інші публікації включені як посилання в повному об'ємі. У випадку, коли існує кілька визначень терміна в даному описі, переважають терміни, визначені в цьому розділі, якщо немає інших вказівок.
Як використовується в даному винаході і якщо немає інших вказівок, терміни "лікувати", "здійснення лікування" і "лікування" стосуються полегшення або зменшення важкості захворювання або симптому, пов'язаних із захворюванням або станом, що піддається лікуванню.
Як використовується в даному винаході "профілактика" і інші форми цих слів включають інгібування виникнення або прогресування захворювання або порушення або симптому конкретного захворювання або порушення. У деяких варіантах здійснення індивідууми зі злоякісною пухлиною в сімейному анамнезі є кандидатами для профілактичних заходів. Як правило, у контексті злоякісної пухлини термін "профілактика" стосується введення лікарського засобу перед появою ознак або симптомів злоякісної пухлини, зокрема, в індивідуумів з ризиком виникнення злоякісної пухлини.
Як використовується в даному винаході і якщо немає інших вказівок, термін "контроль за перебігом" включає профілактику рецидиву конкретного захворювання або порушення в індивідуума, що страждав на нього, продовження часу, протягом якого в індивідуума, що страждав на захворювання або порушення, зберігається ремісія, зниження смертності в індивідуумів, і/або зберігається зниження ваги або профілактики симптому, пов'язаного з захворюванням або станом, відносно яких проводять контроль.
Як використовується в даному винаході "індивідуум" означає тварину, як правило, ссавця, включаючи людину. Як використовується в даному винаході "пацієнт" означає людину.
Як використовується в даному винаході і якщо немає інших вказівок, терміни ""ерапевтично ефективна кількість" і "ефективна кількість" сполуки стосуються кількості, достатньої для забезпечення терапевтичного ефекту при лікуванні, профілактиці і/або контролі за перебігом захворювання, для уповільнення або мінімізації одного або декількох симптомів, пов'язаних із захворюванням або порушенням, відносно яких проводять лікування. Терміни "терапевтично ефективна кількість" і "ефективна кількість" може включати кількість, що поліпшує загальну терапію, знижує або запобігає симптомам або причинам захворювання або порушення, або підсилює терапевтичну ефективність іншого лікарського засобу.
Як використовується в даному винаході і якщо немає інших вказівок, термін "профілактично ефективна кількість" сполуки являє собою кількість, достатню для профілактики захворювання або стану, або одного або декількох симптомів, пов'язаних з захворюванням або станом, або для профілактики його рецидиву. Профілактично ефективна кількість сполуки означає кількість бО лікарського засобу, окремо або в комбінації з іншими засобами, яка забезпечує профілактичний ефект при профілактиці захворювання. Термін "профілактично ефективна кількість" може включати кількість, що поліпшує профілактику в цілому або підсилює профілактичну ефективність іншого профілактичного засобу.
Як використовується в даному винаході і якщо немає інших вказівок, термін "фармацевтично прийнятна сіль" включає, але ними не обмежується, кислу сіль, що може бути присутньою у сполуках, описаних у даному описі. У визначених кислих умовах сполука може утворювати широку множину солей з різними неорганічними й органічними кислотами. Кислоти, які можна використовувати для одержання фармацевтично прийнятних солей таких основних сполук, являють собою кислоти, які утворюють солі, що містять фармакологічно прийнятні аніони, включаючи, але ними не обмежуючись, ацетат, бензолсульфонат, бензоат, бікарбонат, бітартрат, бромід, едетат кальцію, камсилат, карбонат, хлорид, бромід, йодид, цитрат, дигідрохлорид, едетат, едизилат, естолат, есилат, фумарат, глуцептат, глюконат, глутамат, гліколіларсанілат, гексилрезорцинат, гідрабамін, гідроксинафтоат, ізетіонат, лактат, лактобіонат, малат, малеат, манделат, метансульфонат (мезилат), метилсульфат, мускат, напсилат, нітрат, пантотенат, фосфат/дифосфат, полігалактоуронат, саліцилат, стеарат, сукцинат, сульфат, танат, тартрат, теоклат, триетіодид і памоат.
Як використовується в даному винаході і якщо немає інших вказівок, термін "гідрат" означає сполуку, описану в даному описі, або її сіль, що додатково включає стехіометричну або нестехіометричну кількість води, що зв'язана нековалентними міжмолекулярними силами.
Гідрати можуть бути кристалічними або некристалічними.
Як використовується в даному винаході і якщо немає інших вказівок, термін "сольват" означає сольват, що утворився шляхом зв'язку однієї або декількох молекул розчинника зі сполукою, описаною у даному описі. Термін "сольват" включає гідрати (наприклад, моногідрат, дигідрат, тригідрат, тетрагідрат і т. п.). Сольвати можуть бути кристалічними або некристалічними.
Як використовується в даному винаході і якщо немає інших вказівок, термін "стереоізомер" включає всі енантіомерно/стереомерно чисті і енантіомерно/стереомерно збагачені сполуки, описані в даному описі.
Як використовується в даному винаході і якщо немає інших вказівок, термін "стереомерно чистий" або "енантіомерно чистий" означає, що сполука містить один стереоізомер і по суті вільна від його протилежного стереоїзомера або енантіомера. Наприклад, сполука є стереомерно або енантіомерно чистою, коли сполука містить 80 95, 90 95 або 95 95 або більше одного стереоіїзомера і 2095, 1095 або 595 або менше протилежного стереоізомера. У визначених випадках сполуку, описану в даному описі, вважають оптично активною або стереомерно/енантіомерно чистою (тобто по суті К-форма або по суті З-форма) відносно хірального центра, коли сполука має приблизно 80 95 ее (надлишок енантіомера) або більше, переважно, дорівнює або більше 90 95 ее відносно конкретного хірального центра, і більш переважно 95 95 ее відносно конкретного хірального центра.
Як використовується в даному винаході і якщо немає інших вказівок, термін "стереомерно збагачений" або "енантіомерно збагачений" включає рацемічні суміші, а також інші суміші стереомерів сполук, описаних у даному описі (наприклад, К/5-30/70, 35/65, 40/60, 45/55, 55/45, 60/40, 65/35 і 70/30).
Терміни "спільне введення" і "у комбінації з" включають введення двох або більше лікарських засобів (наприклад, сполука І або композиція, описані в даному описі, й інший модулятор лейкоцитарної активності, включаючи активність В-клітин і/або Т-клітин, моноцитів, макрофагів і інших типів клітин лімфоїдного і мієлоїдного ряду або іншого активного засобу) спільно, одночасно або послідовно без конкретних часових меж. В одному з варіантів здійснення сполука | і щонайменше один інший засіб присутні в клітині або в організмі індивідуума одночасно або виявляють свій біологічний або терапевтичний ефект одночасно. В одному з варіантів здійснення лікарський засіб(засоби) знаходяться в одній і тій же композиції або окремій лікарській формі. В іншому варіанті здійснення лікарський засіб(засоби) знаходяться в різних композиціях або окремих лікарських формах. "В-клітина" являє собою лімфоцит, що дозріває в кістковому мозку, і включає наївну В- клітину, В-клітину пам'яті або ефекторну В-клітину (плазмоцити). В-клітина, описана в даному описі, може являти собою нормальну або незлоякісну В-клітину. "Т-клітина" являє собою лімфоцит, що дозріває в тимусі і включає хелперну Т-клітину, Т- клітину пам'яті і цитотоксичну Т-клітину.
Як використовується в даному винаході "загальна виживаність" стосується часу від рандомізації до загибелі з будь-якої причини і загальну виживаність визначають у популяції усіх включених у дослідження пацієнтів. Загальну виживаність можна оцінювати в рандомізованих контрольованих випробуваннях.
Як використовується в даному винаході "частота об'єктивних відповідей" стосується частки пацієнтів зі зниженими заданими симптомами склеродермії наприкінці заданого періоду часу.
Тривалість відповіді звичайно вимірюють від часу первісної відповіді до підтвердженого документально прогресування склеродермії.
Як використовується в даному винаході "час до прогресування" означає час від рандомізації до об'єктивного прогресування склеродермії. У визначених варіантах здійснення час до прогресування не включає смерть.
Як використовується в даному винаході "виживаність без прогресування" означає час від рандомізації до об'єктивного прогресування склеродермії або смерті.
Як використовується в даному винаході "час до констатації відсутності ефекту терапії" означає будь-який кінцевий результат(и), що визначає час від рандомізації до припинення лікування з будь-якої причини, включаючи прогресування захворювання, токсичність лікування і смерть.
Як використовується в даному винаході "смертність" означає показник кількості смертей у даній популяції.
Як використовується в даному винаході "респіраторна смертність" означає пацієнтів, що гинуть від гострої гіпоксемії або іншого конкретного респіраторного погіршення, що приводить до смерті, такого, як потреба в штучній вентиляції, що приводить до смерті, зупинка дихання або будь-яка інша подія в індивідуума, що вважається респіраторною за своєю природою.
Як використовується в даному винаході "респіраторна госпіталізація" означає пацієнтів, госпіталізованих унаслідок погіршення легеневого статусу, документованого в записах при госпіталізації або в іншому медичному висновку.
Як використовується в даному винаході "модифікований шкірний показник Роднана" означає перевірену числову оцінювальну систему для оцінки товщини дерми шкіри.
Як використовується в даному винаході ""овщина шкіри" означає щільну або ущільнену шкіру, яку можна оцінювати з використанням різних способів, включаючи дюрометр і тк55.
Як використовується в даному винаході "ущільнення шкіри" означає шкіру, що є затверділою, червоною, запаленою, стовщеною або хворобливою.
Як використовується в даному винаході "дерматологічний індекс якості життя" означає оцінку якості життя, пов'язану зі шкірними симптомами, у пацієнта, що страждає на склеродермію.
Як використовується в даному винаході "легенева функція" означає будь-який показник зі швидкості форсованого видиху, форсованої життєвої ємності, РЕМ 25-75 905, об'ємів легень або життєвої ємності.
Як використовується в даному винаході "дифузна здатність по монооксиду вуглецю" означає оцінку засвоєння монооксиду вуглецю через альвеолярно-капілярну мембрану. Вона може бути посередником для вимірюванню здатності легень переносити кисень з легень у кровотік.
Як використовується в даному винаході "індекс задишки по Мапйіег" означає інструмент, що забезпечує клінічне вимірювання ускладнення дихання.
Як використовується в даному винаході "анкета лікарні святого Георгія при патології органів дихання" означає інструмент, що визначає якість життя пацієнтів із легеневим захворюванням.
Як використовується в даному винаході "показник шлунково-кишкового тракту консорціуму з клінічних випробуваннях склеродермії ОСІ А" означає анкетування, проведене у пацієнтів зі склеродермією, для оцінки шлунково-кишкових симптомів, пов'язаних зі склеродермією (системною склеродермією).
Як використовується в даному винаході "потік-опосередковане розширення" означає будь- який показник функції судинного ендотелію в пацієнта, що страждає на склеродермію.
Як використовується в даному винаході "випробування шестихвилинної ходьби" означає будь-яку оцінку відстані, яку може пройти пацієнт, що має склеродермію, протягом б хвилин, або будь-яку стандартизовану методику для оцінки здатності ходити протягом фіксованого періоду часу або на фіксовану відстань.
Як використовується в даному винаході, помалідомід стосується наступної сполуки: оо
МН
Сон
Мна З 711 СПОЛУКА
У визначених варіантах здійснення сполука | для застосування в способах, описаних у даному описі, включаючи комбіновану терапію, і в композиціях, описаних у даному описі, являє собою сполуку формули: о о н
Со У
М (в) з
Гм о
Сполука ї, або її фармацевтично прийнятну сіль, сольват, гідрат, стереоіїзомер, таутомер або рацемічні суміші.
В одному з варіантів здійснення сполука являє собою /(5)-3-І4-(4-морфолін-4- ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3-дигідроізоіндол-2-іл|-піперидин-2,6б-діон з наступною структурою: оо дк
М-. ІФ)
Н 0/7
Й
- (У о Сполука ІА, або її фармацевтично прийнятну сіль, сольват, гідрат або таутомер.
В одному з варіантів здійснення сполука являє собою /(5)-3-І4-(4-морфолін-4- ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3-дигідроізоіндол-2-іл|-піперидин-2,6б-діон.
В одному з варіантів здійснення сполука являє собою фармацевтично прийнятну сіль (5)-3-
І4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3-дигідроізоіїндол-2-іл|-піперидин-2,6б-діону.
В одному з варіантів здійснення сполука являє собою гідрохлорид (5)-3-(4-(4-морфолін-4- ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3-дигідроізоіндол-2-іл|-піперидин-2,б-діону.
В одному з варіантів здійснення сполука являє собою /(К)-3-(4-(4-морфолін-4- ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3-дигідроізоіндол-2-іл|-піперидин-2,6-діон з наступною структурою: бо
МН но о о
Сполука ІВ, або її фармацевтично прийнятну сіль, сольват, гідрат або таутомер.
В одному з варіантів здійснення сполука являє собою /(К)-3-(4-(4-морфолін-4- ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3-дигідроізоіндол-2-іл|-піперидин-2,6б-діон.
В одному з варіантів здійснення сполука являє собою фармацевтично прийнятну сіль (К)-3-
І4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3-дигідроізоіїндол-2-іл|-піперидин-2,6б-діону.
В одному з варіантів здійснення сполука вибрана з 3-(4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1- оксо-1,3-дигідроізоіндол-2-іл|-піперидин-2,6б-діону, гідрохлориду 3-(4-(4-морфолін-4- ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3-дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,6б-діону, (К)-3-І4-(4-морфолін-4- ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3-дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,6б-діону, гідрохлориду (К)-3-(4-(4- морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3-дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,б-діону, (5)-3-І(4-(4- морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3-дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,6б-діону і гідрохлориду (5)-3-І4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3-дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,б-діону.
Сполуку І або її фармацевтично прийнятну сіль, сольват, гідрат, стереоізомер, таутомер або рацемічні суміші можна одержувати способами, відомими фахівцю в даній галузі, наприклад, за методикою, описаною в публікації США Мо 2011/0196150, повний зміст якої включений в даний опис як посилання.
Приклад способу одержання описаний у прикладі 1. 7.2 СПОСОБИ ЛІКУВАННЯ
Даний винахід стосується способів лікування, профілактики і/або контролю за перебігом захворювань, порушень і/або станів, пов'язаних з імуноопосередкованими і запальними захворюваннями, які включають введення терапевтично ефективної кількості сполуки І або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей пацієнту. У визначених варіантах здійснення захворювання вибране з вовчака, склеродермії, синдрому Шегрена, АМСА-індукованого васкуліту, антифосфоліпідного синдрому і міастенії. У визначених варіантах здійснення захворювання являє собою вовчак або склеродермію.
Чутливість сполуки 1 або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей можна досліджувати в різних аналізах іп мімо і іп міго, включаючи моделі на тварин, відомі фахівцю в даній галузі, для імуноопосередкованих і запальних захворювань, включаючи, але ними не обмежуючись, модель системного червоного вовчака на мишах МЕКС/Мру-Разірг/), модель системного червоного вовчака на мишах
МАВУМЕ1/у), модель індукованого блеоміцином фіброзу шкіри, і модель на мишах дні 5Кіп-ї1 (Т5К-1). 7.2.1 Лікування склеродермії
У визначених варіантах здійснення даний винахід стосується способів лікування, профілактики і/або контролю за перебігом склеродермії або її симптому, які включають введення терапевтично ефективної кількості сполуки І або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей пацієнту, що страждає на склеродермію. В одному з варіантів здійснення даний винахід стосується способів лікування, профілактики і/або контролю за перебігом склеродермії або її симптому, які включають введення пацієнту ефективної кількості (5)-3-І(4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3- дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,б-діону або його фармацевтично прийнятної солі.
У визначених варіантах здійснення даний винахід стосується способів профілактики склеродермії або її симптому, які включають введення ефективної кількості сполуки І або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей пацієнту з ризиком виникнення склеродермії. В одному з варіантів здійснення даний винахід стосується способів профілактики склеродермії або її симптому, які включають введення ефективної кількості (5)-3-І4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)- 1-оксо-1,3- дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,б-діону або його фармацевтично прийнятної солі.
У визначених варіантах здійснення склеродермія являє собою локалізовану, системну, обмежену або дифузну склеродермію.
У визначених варіантах здійснення системна склеродермія включає СКЕ5Т-синдром (кальциноз, синдром Рейно, дисфункція або порушення рухомості стравоходу, склеродактилія, телеангіектазія). Склеродермія також відома як системна склеродермія або прогресуюча системна склеродермія. У визначених варіантах здійснення даний винахід стосується способів лікування або профілактики хвороби або синдрому Рейно. У визначених варіантах здійснення системна склеродермія включає склеродермічне захворювання легень, склеродермічний нирковий криз, серцеві прояви, м'язову слабість (включаючи втому або обмежений СКЕЗТ), порушення рухомості і спазм шлунково-кишкового тракту, і аномалії в центральній, периферичній і автономній нервовій системі (включаючи синдром зап'ясного каналу, за яким слідує невралгія трійчастого нерва). Також вона включає загальне безсилля, у тому числі депресію і вплив на якість життя.
У визначених варіантах здійснення обмежена склеродермія обмежується руками, обличчям, шиєю або їхніми комбінаціями.
У визначених варіантах здійснення дифузна склеродермія включає стовщення шкіри і також виникає вище зап'ясть (або ліктів). У визначених варіантах здійснення дифузна системна склеродермія являє собою склеродермію без склеродерми, що включає фіброз внутрішніх органів без ущільнення шкіри; або сімейну прогресуючу системну склеродермію.
В одному з варіантів здійснення склеродермія не пов'язана з виснаженням, таким, як викликане захворюванням виснаження.
В одному з варіантів здійснення даний винахід стосується способів зменшення, інгібування або профілактики одного або декількох з наступних симптомів склеродермії: (ї) поступове ущільнення, стовщення і стягування шкіри (наприклад, на кінцівках, наприклад, руках, на обличчі і на ступнях); (її) знебарвлення шкіри; (ії) оніміння кінцівок; (м) блискуча шкіра; (м) невеликі білі утворення під поверхнею шкіри, які прориваються крейдово-білою рідиною; (мі) (610) дисфункція стравоходу Рейно (біль, оніміння і/або зміна кольору рук, що викликається спазмом кровоносних судин під дією холоду або емоційного навантаження); (мії) телеангіектазія (червоні плями, наприклад, на руках, долонях, передпліччях, обличчі і губах); (мії) біль і/або скутість суглобів; (їх) опухання рук і ступнів; (х) шкірна сверблячка; (хі) скутість і скручування пальців; (хі) виразки (нариви) на зовнішній поверхні певних суглобів, таких, як суглоби пальців і лікті; (хії) проблеми з травленням, такі, як печія, ускладненість ковтання, діарея, подразнений кишечник і запор; (хім) втома і слабість; (хм) ускладненість дихання; (хмі) артрит; (хмії) втрата волосся; (хміїї) проблеми з внутрішніми органами; (хіх) виразки пальців; або (хх) аутоампутація пальців, які включають введення ефективної кількості сполуки І пацієнту.
Без зв'язку з якою-небудь конкретною теорією думають, що сполука І або її фармацевтично прийнятна сіль, сольват, гідрат, стереоізомер, таутомер або рацемічні суміші підсилюють імунну відповідь за типом ТИ і пригнічують імунну відповідь за типом Тп2, що може приводити до антифібротичних ефектів на шкірі.
Крім того, даний винахід стосується способів збільшення або зниження товщини шкіри пацієнта, що страждає на склеродермію, які включають введення ефективної кількості сполуки І або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоіїзомера, таутомера або рацемічних сумішей пацієнту. В одному з варіантів здійснення товщина шкіри знижується приблизно на 20 95, приблизно на 25 95, приблизно на 30 95, приблизно на 40 95, приблизно на 50 95, приблизно на 60 95, приблизно на 7095 приблизно на 80 95, приблизно на 90 95 або більше.
Крім того, даний винахід стосується способів досягнення одного або декількох клінічних кінцевих результатів, пов'язаних зі склеродермією, які включають введення ефективної кількості сполуки І або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей пацієнту.
Крім того, даний винахід стосується способів підвищення загальної виживаності, частоти об'єктивних відповідей, часу до прогресування, виживаності без прогресування і/або часу до констатації відсутності ефекту терапії в пацієнта, що страждає на склеродермію, які включають введення пацієнту ефективної кількості сполуки І або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей.
Крім того, даний винахід стосується способів зниження смертності, респіраторної смертності іабо респіраторної госпіталізації в пацієнта, що страждає на склеродермію, які включають введення пацієнту ефективної кількості сполуки | або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей.
Крім того, даний винахід стосується способів поліпшення модифікованого шкірного показника Роднана в пацієнта, що страждає на склеродермію, які включають введення пацієнту ефективної кількості сполуки | або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей. В одному з варіантів здійснення поліпшення модифікованого шкірного показника Роднана складає 5, 10, 15 або 20 балів або більше.
Крім того, даний винахід стосується способів поліпшення або зменшення товщини шкіри в пацієнта, що страждає на склеродермію, які включають введення пацієнту ефективної кількості сполуки І або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей. В одному з варіантів здійснення товщина шкіри знижується приблизно на 2095, приблизно на 25 95, приблизно на 30 95, приблизно на 4095, приблизно на 50 95, приблизно на 60 95, приблизно на 70 95, приблизно на 80 95, приблизно на 90 95 або більше.
Крім того, даний винахід стосується способів поліпшення або зниження ущільнення шкіри в пацієнта, що страждає на склеродермію, які включають введення пацієнту ефективної кількості сполуки І або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей.
Крім того, даний винахід стосується способів поліпшення дерматологічного індексу якості життя в пацієнта, що страждає на склеродермію, які включають введення пацієнту ефективної кількості сполуки І або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей.
Крім того, даний винахід стосується способів поліпшення легеневої функції в пацієнтів, що страждають на склеродермію, які включають введення пацієнту ефективної кількості сполуки І або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей.
Крім того, даний винахід стосується способів поліпшення дифузної здатності по монооксиду вуглецю в пацієнта, що страждає на склеродермію, які включають введення пацієнту ефективної кількості сполуки І або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей. В одному з варіантів здійснення дифузна (610) здатність по монооксиду вуглецю поліпшується внаслідок поліпшення дифузної здатності легень для монооксиду вуглецю (О1со) приблизно на 10 95, приблизно на 20 95, приблизно на 2595, приблизно на 3095, приблизно на 4095, приблизно на 5095, приблизно на 60 95, приблизно на 70 95, приблизно на 80 95, приблизно на 90 95 або більше.
Крім того, даний винахід стосується способів поліпшення індексу задишки по Майіег у пацієнта, що страждає на склеродермію, які включають введення пацієнту ефективної кількості сполуки І або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей. В одному з варіантів здійснення поліпшення індексу задишки по Мапйіег складає 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10 балів або більше.
Крім того, даний винахід стосується способів поліпшення показника опитувальника лікарні святого Георгія при патології органів дихання в пацієнта, що страждає на склеродермію, які включають введення пацієнту ефективної кількості сполуки І або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоіїзомера, таутомера або рацемічних сумішей. В одному з варіантів здійснення поліпшення показника анкети лікарні святого Георгія при патології органів дихання складає 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52 балів або більше.
Крім того, даний винахід стосується способів поліпшення показника шлунково-кишкового тракту консорціуму з клінічних випробувань склеродермії ОСІ А у пацієнта, що страждає на склеродермію, які включають введення пацієнту ефективної кількості сполуки | або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей.
Крім того, даний винахід стосується способів лікування або профілактики виразки пальців у пацієнта або в популяції пацієнтів, що страждають на склеродермію, які включають введення пацієнту ефективної кількості сполуки І або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей.
Крім того, даний винахід стосується способів поліпшення потік-опосередкованого розширення в пацієнта, що страждає на склеродермію, які включають введення пацієнту ефективної кількості сполуки І або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей.
Крім того, даний винахід стосується способів поліпшення або збільшення відстані, пройденої у випробуванні шестихвилинної ходьби, у пацієнта, що страждає на склеродермію, які включають введення пацієнту ефективної кількості сполуки І або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей. В одному з варіантів здійснення збільшення відстані, пройденої у випробуванні шестихвилинної ходьби, складає приблизно 200 метрів, приблизно 250 метрів, приблизно 300 метрів, приблизно 350 метрів, приблизно 400 метрів або більше. 7.2.2 Лікування червоного вовчака
У визначених варіантах здійснення даний винахід стосується способів лікування, профілактики і/або контролю за перебігом червоного вовчака або його симптому, які включають введення терапевтично ефективної кількості сполуки І або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей пацієнту, що страждає на червоний вовчак. В одному з варіантів здійснення даний винахід стосується способів лікування, профілактики і/або контролю за перебігом червоного вовчака або його симптому, які включають введення терапевтично ефективної кількості (5)-3-І(4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)- 1-оксо- 1,3-дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,6-діону або його фармацевтично прийнятної солі пацієнту, що має червоний вовчак.
В одному з варіантів здійснення даний винахід стосується способів профілактики червоного вовчака або його симптому, які включають введення ефективної кількості сполуки І або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей пацієнту, що має ризик наявності червоного вовчака. В одному з варіантів здійснення даний винахід стосується способів профілактики червоного вовчака або його симптому, які включають введення ефективної кількості (5)-3-І(4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3- дигідроізоіндо-2-іл|Іпіперидин-2,б-діону або його фармацевтично прийнятної солі пацієнту, що має ризик наявності червоного вовчака.
У визначених варіантах здійснення даний винахід стосується способів лікування, профілактики і/або контролю за перебігом системного червоного вовчака (5ІЕ), шкірного червоного вовчака (СІ Е) або індукованого лікарським засобом вовчака.
Вираз "системний червоний вовчак" використовують у даному описі взаємозамінно з термінами "ЗІ Е" і "вовчак", і цей вираз стосується всіх проявів захворювання, як відомо в даній галузі (включаючи ремісії і загострення). При БЕ ключову роль грають патологічна гіперактивність В-лімфоцитів і масивна патологічна продукція аутоантитіл імуноглобулінів-гамма (610) (с). Цей патологічний процес приведе до секвестрації і руйнування покритих Ід клітин, фіксації і розщеплення білків системи комплементу, і вивільненню хемотаксинів, вазоактивних пептидів і деструктивних ферментів у тканині (Напйп ВН. Зувіетіс І ири5 Егуїпетайози5. Казрег ОЇ,
Вгашпмаї!а Е, Рашсі А5, Наизег 51, І опдо ОЇ, датезоп, У, еайогв. Нагтізоп'5 Рііпсіріеєв ої Іпіегпаї!
Медісіпе (161й едйіоп). Мем Моїк (05): МеСтгам-НІЇЇ; 2005. рр.1960-1967).
Симптоми 5ГЕ змінюються від людини до людини і можуть з'являтися і проходити. У більшості пацієнтів симптоми включають біль і опухання суглобів. Суглобами, що часто вражаються, є пальці, руки, зап'ястя і коліна. У деяких пацієнтів розвивається артрит. Інші розповсюджені симптоми включають: біль у грудях при глибокому вдиху, втому, лихоманку, тривожність або погане самопочуття (нездужання), втрату волосся, виразки порожнини рота, опухання лімфатичних вузлів, чутливість до сонця, шкірний висип - висип у формі "метелика" на щоках і переніссі вражає приблизно половину людей з 5ІЕ, у деяких пацієнтів висип погіршується під дією сонячного світла, і висип також може бути широко розповсюдженим.
Інші симптоми залежать від того, яка частина організму вражена, і до них належать наступні симптоми:
Головний мозок і нервова система: головні болі, оніміння, відчуття поколювання, судомні напади, проблеми із зором, зміна особистості,
Травний тракт: біль у животі, нудота і блювота,
Серце: патологічні серцеві ритми (аритмії),
Легені: кровохаркання й ускладнення дихання, і
Шкіра: плямиста шкіра, пальці, які змінюють колір на холоді (феномен Рейно).
Деякі пацієнти мають тільки шкірні симптоми. Це називають дискоїдним вовчаком.
В одному з варіантів здійснення даний винахід стосується способів лікування помірного, важкого або дуже важкого 5І Е. Термін "важкий 5І Е", як використовується в даному винаході, стосується стану ЗЕ, якщо пацієнт має один або декілька важких або загрозливих життю симптомів (таких, як гемолітична анемія, велике залучення серця і легень, захворювання нирок або залучення центральної нервової системи).
Крім того, даний винахід стосується способів досягнення одного або декількох клінічних кінцевих результатів, пов'язаних з 5 Е, які включають введення ефективної кількості сполуки І або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей, пацієнту.
Крім того, даний винахід стосується способів підвищення загальної виживаності, частоти об'єктивних відповідей, часу до прогресування, виживаності без прогресування і/або часу до констатації відсутності ефекту терапії в пацієнта, що має 5 Е, які включають введення пацієнту ефективної кількості сполуки І або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей.
У визначеному варіанті здійснення сполука І або її фармацевтично прийнятна сіль, сольват, гідрат, стереоіїзомер, таутомер або рацемічні суміші діють як інгібітори диференціювання первинних СО19-В-клітин пам'яті людини в стадію плазмобластів. Без зв'язку з якою-небудь конкретною теорією, думають, що сполука | або її фармацевтично прийнятна сіль, сольват, гідрат, стереоізомер, таутомер або рацемічні суміші, блокують клітини на незрілій стадії, тим самим знижуючи кількості плазмобластів, які здатні продукувати високі рівні імуноглобулінів.
Функціональним наслідком цього ефекту є знижена продукція імуноглобуліну (с (Ідс) і імуноглобуліну М (І9М) у цих культурах для диференціювання.
У визначених варіантах здійснення сполука І або її фармацевтично прийнятна сіль, сольват, гідрат, стереоізомер, таутомер або рацемічні суміші інгібують здатність первинних СО19жВ- клітин пам'яті людини диференціюватися в стадію плазмобласта. У визначених варіантах здійснення сполука | або її фармацевтично прийнятна сіль, сольват, гідрат, стереоізомер, таутомер або рацемічні суміші не мають значного ефекту на зрілі СО138-- клітини плазми в короткочасних культурах. У визначених варіантах здійснення сполука І або її фармацевтично прийнятна сіль, сольват, гідрат, стереоізомер, таутомер або рацемічні суміші інгібують фактори диференціювання В-клітин, включаючи регулюючий інтерферон фактор 4 (ІКЕ4), індукований лімфоцитами білок дозрівання (ВІ ІМР), білок Х-бокс 1 (ХВР-1) і білок В-клітинної лімфоми 6 (Всіб). 7.2.3 Лікування інших імуноопосередкованих захворювань або порушень
Крім того, даний винахід стосується способів лікування, контролю за перебігом або профілактики інших імуноопосередкованих захворювань або станів з використанням сполуки І або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей. У визначених варіантах здійснення даний винахід стосується способів лікування, контролю за перебігом або профілактики інших імуноопосередкованих захворювань (610) або станів із використанням (5)-3-І4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3-
дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,б-діону або його фармацевтично прийнятної солі. У визначених варіантах здійснення, наприклад, даний винахід стосується способу лікування індивідуума, що має захворювання або порушення, де захворювання або порушення викликане, або пов'язано з, неналежною або небажаною імунною відповіддю, наприклад, захворювання, порушення або стан, при якому є ефективним лікування за допомогою імуносупресії, що включає введення індивідууму сполуки І або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей. У визначених варіантах здійснення даний винахід стосується способу лікування індивідуума, що має захворювання або порушення, де захворювання або порушення викликане, або пов'язане з, неналежною або небажаною імунною відповіддю, наприклад, захворювання, порушення або стан, при якому є ефективним лікування за допомогою імуносупресії що включає введення індивідууму (5)-3-(4-(4-морфолін-4- ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3-дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,6-діону або його фармацевтично прийнятної солі.
У різних конкретних варіантах здійснення зазначене імуноопосередковане захворювання являє собою одне або декілька із захворювань, вибраних із синдрому Шегрена, АМСА- індукованого васкуліту, антифосфоліпідного синдрому, міастенії, хвороби Адісона, осередкової алопеції, анкілозивного спондиліту, синдрому антифосфоліпідних антитіл, антифосфоліпідного синдрому (первинного або вторинного), астми, аутоімунного гастриту, аутоімунної гемолітичної анемії, аутоїмунного гепатиту, аутоїмунного захворювання внутрішнього вуха, аутоімунного лімфопроліферативного захворювання, аутоїмунної тромбоцитопенічної пурпури, хвороби Бало, хвороби Бехчета, бульозного пемфігоїду, кардіоміопатії, глютенової хвороби, хвороби Шагаса, хронічної запальної демієлінізуючої поліневропатії, рубцевого пемфігоїду (наприклад, пемфігоїд слизової оболонки), хвороби холодових аглютинінів, хвороби Дегоса, герпетиформного дерматиту, есенційної кріоглобулінемії змішаного типу, синдрому Гудпасчера, хвороби Грейвса, синдрому Гійєна-Барре, тиреоїдиту Хашимото (хвороба Хашимото; аутоіїмунний тиреоїдит), ідіопатичного фіброзу легень, ідіопатичної тромбоцитопенічної пурпури, ІдА-нефропатії, ювенільного артриту, червоного плоского лишаю, хвороби Меньєра, змішаного захворювання сполучної тканини, осередкової склеродермії, нарколепсії, нейроміотонії, педіатричних аутоїмунних нейропсихіатричних порушень (РАМБОА), пемфігусу звичайного, перніціозної анемії, вузликового поліартеріїту, поліхондриту, ревматичної поліміалгії, первинної агаммаглобулінемії, первинного біліарного цирозу, хвороби Рейно (феномен Рейно), синдрому Рейтера, рецидивного поліхондриту, ревматичної атаки, синдрому Шегрена, синдрому м'язової скутості (синдром Мерша-Вольтмана), артеріїту Такаясу, скроневого артеріїту (гігантоклітинний артеріїт), увеїту, васкуліту (наприклад, васкуліт, не пов'язаний з червоним вовчаком), вітиліго лабо гранулематозу Вегенера. 7.2.4 Лікування пацієнтів з порушеннями нирок
У визначених варіантах здійснення даний винахід стосується способів лікування, профілактики і/або контролю за перебігом захворювання, описаного в даному описі, у пацієнтів з порушеною функцією нирок. У визначених варіантах здійснення даний винахід стосується способів відповідної корекції дози для пацієнтів з порушеною функцією нирок унаслідок, але ними не обмежуючись, захворювання, віку або інших факторів пацієнта.
У визначених варіантах здійснення даний винахід стосується способів лікування, профілактики і/або контролю за перебігом захворювання, описаного в даному описі, або його симптому, у пацієнтів з порушеною функцією нирок, які включають введення терапевтично ефективної кількості сполуки, описаної в даному описі, пацієнту з порушенням функції нирок. В одному з варіантів здійснення даний винахід стосується способів лікування, профілактики і/або контролю за перебігом рецидивного захворювання або його симптому в пацієнтів з порушеною функцією нирок, які включають введення терапевтично ефективної кількості (5)-3-(4-((4- морфолінометил)бензил)уоксі)-1-оксоіїзоіндолін-2-іл)піперидин-2,б-діону або його фармацевтично прийнятної солі пацієнту, що має рецидивне захворювання з порушеною функцією нирок.
В одному із варіантів здійснення даний винахід стосується способів профілактики рецидиву в пацієнтів з пПорушеною функцією нирок, які включають введення ефективної кількості сполуки, описаної в даному описі, пацієнту з порушеною функцією нирок, що має ризик виникнення рецидиву. В одному з варіантів здійснення даний винахід стосується способів профілактики рецидиву в пацієнтів з порушеною функцією нирок, які включають введення ефективної кількості (5)-3-(4-(4-морфолінометил)бензил)уоксі)-1-оксоіїзоіндолін-2-іл)піперидин-2,б-діону або його фармацевтично прийнятної солі пацієнту з порушеною функцією нирок, що має ризик виникнення рецидиву.
В усіх варіантах здійснення, описаних у даному описі, якщо проводять лікування пацієнта з порушенням функції нирок, то існує необхідність введення пацієнту з порушеною функцією нирок більш низької дози сполуки, ніж доза, що вводиться нормальному пацієнту (наприклад, пацієнту без порушення нирок), унаслідок зниженої здатності пацієнта з порушенням нирок елімінувати помалідомід або його метаболіти. Таким чином, в одному з варіантів здійснення даний винахід стосується способу лікування пацієнта з порушенням нирок більш низькою дозою сполуки, описаної в даному описі, ніж доза, що вводиться нормальному пацієнту.
У визначених варіантах здійснення терапевтично або профілактично ефективна кількість сполуки складає від приблизно 0,005 до приблизно 1000 мг на добу, від приблизно 0,01 до приблизно 500 мг на добу, від приблизно 0,01 до приблизно 250 мг на добу, від приблизно 0,01 до приблизно 100 мг на добу, від приблизно 0,1 до приблизно 100 мг на добу, від приблизно 0,5 до приблизно 100 мг на добу, від приблизно 1 до приблизно 100 мг на добу, від приблизно 0,01 до приблизно 50 мг на добу, від приблизно 0,1 до приблизно 50 мг на добу, від приблизно 0,5 до приблизно 50 мг на добу, від приблизно 1 до приблизно 50 мг на добу, від приблизно 0,02 до приблизно 25 мг на добу, або від приблизно 0,05 до приблизно 10 мг на добу. 7.3. ДОЗУВАННЯ І КІЛЬКОСТІ, ЩО ВВОДЯТЬСЯ
Доза сполуки І або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей, що вводяться пацієнту, широко змінюється і може залежати від думки практикуючого фахівця, який здійснює медичну допомогу. Дози сполуки І або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей змінюються залежно від таких факторів, як: конкретне показання, що піддається лікуванню, профілактиці або контролю за перебігом; вік ії стан пацієнта; і кількість другого використовуваного активного засобу, за його наявності Як правило, сполуку | або її фармацевтично прийнятну сіль, сольват, гідрат, стереоізомер, таутомер або рацемічні суміші можна вводити пацієнту від одного до чотирьох або більше разів на добу в дозі приблизно 0,005 мг/кг маси тіла пацієнта до приблизно 10 мг/кг маси тіла пацієнта, однак описане вище дозування може відповідним чином змінюватися залежно від віку, маси тіла і медичного стану пацієнта і типу введення. В одному з варіантів здійснення доза складає від приблизно 0,01 мг/кг маси тіла пацієнта до приблизно 5 мг/кг маси тіла пацієнта, від приблизно 0,05 мг/кг маси тіла пацієнта до приблизно 1 мг/кг маси тіла пацієнта, від приблизно 0,1 мг/кг маси тіла пацієнта до приблизно 0,75 мг/кг маси тіла пацієнта або від приблизно 0,25 мг/кг маси тіла пацієнта до приблизно 0,5 мг/кг маси тіла пацієнта.
В одному з варіантів здійснення вводять одну дозу на добу. У будь-якому даному випадку кількість сполуки І. що вводиться, або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоіїзомера, таутомера або рацемічних сумішей буде залежати від таких факторів, як розчинність активного компонента, використовувана сполука і шлях введення. В одному з варіантів здійснення застосування концентрації для місцевого введення забезпечує внутрішньоклітинну експозицію або концентрацію приблизно 0,01-10 мкМ.
У визначених варіантах здійснення сполуку І або її фармацевтично прийнятну сіль, сольват, гідрат, стереоїзомер, таутомер або рацемічні суміші використовують у кількості від приблизно 0,1 мг до приблизно 1000 мг на добу, і її можна підбирати так, щоб вводити загальноприйнятим шляхом (наприклад, та сама кількість, що вводиться кожну добу періоду лікування, профілактики або контролю за перебігом), курсами (наприклад, один тиждень із введенням, один тиждень без введення), або в кількості, що збільшується або знижується в ході лікування, профілактики або контролю за перебігом. В інших варіантах здійснення доза може складати від приблизно 1 мг до приблизно 300 мг, від приблизно 0,1 мг до приблизно 150 мг, від приблизно 1 мг до приблизно 200 мг, від приблизно 10 мг до приблизно 100 мг, від приблизно 0,1 мг до приблизно 50 мг, від приблизно 1 мг до приблизно 50 мг, від приблизно 10 мг до приблизно 50 мг, від приблизно 20 мг до приблизно 30 мг, або від приблизно 1 мг до приблизно 20 мг. В інших варіантах здійснення доза може складати від приблизно 0,1 мг до приблизно 100 мг, від приблизно 0,1 мг до приблизно 50 мг, від приблизно 0,1 мг до приблизно 25 мг, від приблизно 0,1 мг до приблизно 20 мг, від приблизно 0,1 мг до приблизно 15 мг, від приблизно 0,1 мг до приблизно 10 мг, від приблизно 0,1 мг до приблизно 7,5 мг, від приблизно 0,1 мг до приблизно 5 мг, від приблизно 0,1 мг до приблизно 4 мг, від приблизно 0,1 мг до приблизно З мг, від приблизно 0,1 мг до приблизно 2 мг, або від приблизно 1 мг до приблизно 1 мг. 7.5 КОМБІНОВАНА ТЕРАПІЯ
Сполуку І або її фармацевтично прийнятну сіль, сольват, гідрат, стереоізомер, таутомер або рацемічні суміші можна комбінувати з іншими фармакологічно активними сполуками ("другі активні засоби") у способах і композиціях, описаних у даному описі. Визначені комбінації можуть (610) діяти синергічно при лікуванні конкретних типів захворювань або порушень, і станів і симптомів,
пов'язаних з такими захворюваннями або порушеннями. Сполука І або її фармацевтично прийнятна сіль, сольват, гідрат, стереоізомер, таутомер або рацемічні суміші також можуть діяти, пом'якшуючи несприятливі ефекти, пов'язані з другими активними засобами, і навпаки.
У способах і композиціях, описаних у даному описі, можна використовувати один або кілька активних інгредієнтів або засобів. Другі активні речовини можуть являти собою високомолекулярні сполуки (наприклад, білки) або низькомолекулярні сполуки (наприклад, синтетичні неорганічні, металоорганічні або органічні молекули).
В іншому варіанті здійснення спосіб лікування, описаний у даному описі, включає введення другого лікарського засобу, де другий лікарський засіб являє собою протизапальний лікарський засіб, наприклад, стероїдний протизапальний лікарський засіб, або нестероїдний протизапальний засіб (М5АЇ!ІО), ацетамінофен, напроксен, ібупрофен, ацетилсаліцилову кислоту і т. п. У більш конкретному варіанті здійснення, у якому вводять МЗАЇЮ, також можна вводити інгібітор протонного насоса (РРІ), наприклад, омепразол. В одному з варіантів здійснення протизапальний засіб являє собою кортикостероїд. В іншому варіанті здійснення протизапальний засіб являє собою колхіцин.
В іншому варіанті здійснення другий лікарський засіб являє собою імуномодулюючу сполуку або імунодепресивну сполуку, таку, як азатіоприн (Ітигап'м, Аазап"Мм), метотрексат (КПешптаїгех "м, Тгехаї!"М), пеніциламін (Оереп"М, Сиргітіпе"м), циклофосфамід (Суїюхап М), мікофеналат (СеПСері"М, Муггпіс"мМ), босентан (Тгасіеегт), преднізон (Оеназопе"м, І|їдціа
Ргеа "М), і інгібітор РОЕ5Х. В іншому варіанті здійснення, де індивідуум, що страждає, має виразки пальців і легеневу гіпертензію, можна вводити судинорозширювальний засіб, такий, як простациклін (ілопрост).
В іншому варіанті здійснення другий терапевтичний засіб являє собою інгібітор НОАС, такий, як ромідепсин, вориностат, панобіностат, вальпроєва кислота або беліностат; або біологічний засіб, такий, як інтерлейкін, імуномодулююче моноклональне антитіло або бацила Кальмета-
Герена (ВС).
В іншому варіанті здійснення другий терапевтичний засіб являє собою інгібітор рецепторів
АСІКІЇ або інгібітор активін-АсСіКІ!. Інгібітори рецепторів АсСіКіІ! включають інгібітори АсСіКІА і інгібітори АСІіКІІВ. Інгібітори рецепторів АсСіІКІЇ можуть являти собою поліпептиди, що містять активін-зв'язувальні домени АСсІіКІїЇ. У визначених варіантах здійснення поліпептиди, що містять активін-зв'язувальний домен, зв'язані з Ес-частиною антитіла (тобто одержують кон'югат, що містить поліпептид, що містить активін-зв'язувальний домен, з рецептора АСсСіКІї і Ес-частину антитіла). У визначених варіантах здійснення активін-зв'язувальний домен зв'язаний з Ес- частиною антитіла через лінкер, наприклад, пептидний лінкер.
Приклад активін-зв'язувального поліпептиду АсСІКІА, злитий з Ес-доменом людини, показаний як 5ЕО ІЮ МО:1.
ЗЕО ІЮ МО:
І аАЗЕТОЕСІ ЕЕМАМУ ЕКОВТМОТИМЕРСУСОКОКААНСЕАТМУКМІЗИа5
ІЕІМКОССУЛ ОБІМСУ СА ТОСМЕККОЗРЕМУЕСССЕСММОСМЕКЕЗМЕРЕМ
ЕМТОРТЗМРУТРКРРТаСИатТНТСРРОРАРЕГІЇ СОРБУБІ ЕРРКРКОТІ МІ
ЗАТРЕМТСУММОУМЗНЕОРЕУКЕММ УМО МЕУНМАКТКРАЕЕОУМОТУВУМ
ЗМІ ТМ НОБМ/І МЕОКЕУКСКМУЗМКАЇ РУРІЕКТІЗКАКЕИОРВЕРОМУТІ РР
ЗВЕЕМТКМОМУБІ ТОЇ УК ЕМ РБОІАМЕМ ЕБМСОРЕММУКТТРРМІ О5ОСО
ЕРСУЗКІТМОКЗАУМООСММУЕЗСЗММНЕАЇ НМНУТОКОБІ 5І РОК
Приклад злитого білка, який містить розчинний позаклітинний домен АСсСіКІІВ, злитий з Ес- доменом, показаний як 5ЕО ІЮ МО:2.
ЗЕО Ір МО2
ЕТВЕСІУУМАМУЕГ ЕАТМОБИаЇ ЕВСЕСЕООКАІ НСМАБУУАМЗЗаИ ТЕ! УК кКасурррЕМСсУрАОЕСМАТЕЕМРОММЕСССЕСМЕСМЕВЕТНІ РЕАДССРЕМ ТУЕРРРТаСОТНТСРРОРАРЕГІЇ СОРБЗУБІ ЕРРКРКОТІ МІЗАТРЕУТСУ
МУОУЗНЕОРЕУКЕММУ УМО МЕМНМАКТКРАЕЄОУМЗТУАМУУМІ ТМ НОЮ
МІ МаКЕУКСКУЗМКАЇ РАРІЕКТІЗКАКИІОРАЕРОММУТІ РРОВЕЕМТКМО
МІ ТС УКОЕМРБЗБІАМЕМЕЗМООРЕММУКТТРРМІ ОБраБЗЕРІ КІ ТУ оКЗАМОСаММЕЗСЗУМНЕАЇІ НМНУТОКОІ 5І 5РОК
Наступні приклади неантитільних білків, вибраних для зв'язування активіну або АсСіАПА, і способів їхнього конструювання і селекції розкриті в УУО/2002/088171, УМО/2006/055689,
УМО/2002/032925, ММО/2005/037989, 05 2003/0133939 і 05 2005/0238646, кожна з яких включена в даний опис як посилання в повному об'ємі.
В одному з варіантів здійснення інгібітор рецепторів АСіКІ! являє собою АСЕ-11. В іншому (610) варіанті здійснення інгібітор рецепторів АСІКІ! являє собою АСЕ-536.
Можна вводити будь-яку комбінацію згаданих вище лікарських засобів, що підходять при лікуванні захворювань або їхніх симптомів. Такі лікарські засоби можна вводити в будь-якій комбінації зі сполукою | або її фармацевтично прийнятною сіллю, сольватом, гідратом, стереоізомером, таутомером або рацемічними сумішами, у той самий час або як окремий курс лікування. 7.6 КУРСОВА ТЕРАПІЯ
У визначених варіантах здійснення сполуку І або її фармацевтично прийнятну сіль, сольват, гідрат, стереоізомер, таутомер або рацемічні суміші, описані в даному описі, вводять пацієнту курсами. Курсова терапія залучає введення активної речовини протягом періоду часу, за яким слідує період спокою (тобто припинення введення) протягом деякого періоду часу, і повторення цього послідовного введення. Курсова терапія може знижувати розвиток стійкості до одного або декількох способів терапії, запобігати або зменшувати побічні ефекти одного зі способів терапії, і/або підвищувати ефективність лікування.
Отже, в одному з варіантів здійснення сполуку, описану в даному описі, вводять кожну добу як однократну або розділену дози курсом з від чотирьох до шести тижнів з періодом спокою, що складає приблизно тиждень або два тижні. Курсова терапія, крім того, дозволяє збільшувати частоту, кількість і тривалість курсів введення. Таким чином, інший варіант здійснення включає введення сполуки за даним винаходом протягом більшої кількості курсів, ніж звичайна кількість курсів при введенні її окремо. В іншому варіанті здійснення сполуку за даним винаходом вводять протягом більшої кількості курсів, що звичайно викликає токсичність, яка обмежує дозу, у пацієнта, якому другий активний інгредієнт не вводять.
В одному з варіантів здійснення сполуку, описану в даному описі, вводять кожну добу і безперервно протягом трьох або чотирьох тижнів у дозі від приблизно 0,03 мг до приблизно 10 мг на добу з наступним періодом спокою, що складає один або два тижні. В інших варіантах здійснення доза може складати від приблизно 0,1 мг до приблизно 8 мг, від приблизно 0,3 мг до приблизно б мг, від приблизно 1 мг до приблизно 4 мг, або приблизно 2 мг, з наступним періодом спокою.
В одному з варіантів здійснення сполуку, описану в даному описі, і другий активний інгредієнт вводять перорально, причому введення сполуки, описаної в даному описі, відбувається за 30-60 хвилин до введення другого активного інгредієнта, у ході курсу з від чотирьох до шести тижнів. В іншому варіанті здійснення комбінацію сполуки, описаної в даному описі, і другого активного інгредієнта вводять шляхом внутрішньовенної інфузії протягом приблизно 90 хвилин у ході кожного курсу.
Як правило, кількість курсів, у ході яких проводять комбіноване введення пацієнту, складає від приблизно одного до приблизно 24 курсів, від приблизно двох до приблизно 16 курсів, або від приблизно чотирьох до приблизно трьох курсів. 7.6. БІОМАРКЕРИ
У визначених варіантах здійснення даний винахід стосується біомаркерів для лікування різних захворювань або порушень, описаних у даному описі. В одному з варіантів здійснення біомаркером є кластер диференціювання 44 ("СО44") - молекула, яка зустрічається на поверхні
В-клітин. В іншому варіанті здійснення біомаркером є кластер диференціювання 83 ("СО83") - молекула, яка зустрічається на поверхні В-клітин. В інших варіантах здійснення біомаркером є комбінація СО44 і СО83.
Рівні білкових біомаркерів, описаних у даному описі, можна виявляти або кількісно визначати будь-якими способами, відомими в даній галузі. У визначених варіантах здійснення використовують способи на основі антитіл. У визначених варіантах здійснення способом виявлення або кількісного визначення є імуноблотинг (вестерн-блотинг), твердофазний імуноферментний аналіз (ЕГІЗА), імуногістохімія, проточна цитометрія, цитометричні гранульні матриці або мас-спектрометрія.
У визначених варіантах здійснення способом виявлення або кількісного визначення є імуноблотинг (вестерн-блотинг). У визначених варіантах здійснення способом виявлення або кількісного визначення є твердофазний імуноферментний аналіз (ЕЇІ5А). У визначених варіантах здійснення способом виявлення або кількісного визначення є прямий ЕГІ5БА. У визначених варіантах здійснення способом виявлення або кількісного визначення є непрямий
ЕГІ5А. У визначених варіантах здійснення способом виявлення або кількісного визначення є сендвіч-ЕГІЗА. У визначених варіантах здійснення способом виявлення або кількісного визначення є імуногістохіміяї. У визначених варіантах здійснення способом виявлення або кількісного визначення є проточна цитометрія. У визначених варіантах здійснення способом виявлення або кількісного визначення є цитометричні гранульні матриці. У визначених (610) варіантах здійснення способом виявлення або кількісного визначення є мас-спектрометрія.
Визначені варіанти здійснення включають способи ідентифікації індивідуума, який ймовірно буде відповідати на лікування захворювання, порушення або стану терапевтичною сполукою. У визначених варіантах здійснення спосіб залучає визначення рівня біомаркера в біологічному зразку від індивідуума. У визначених варіантах здійснення біомаркером є СО44. У визначених варіантах здійснення біомаркером є СО83.
У визначених варіантах здійснення способи ідентифікації індивідуума, який ймовірно буде відповідати на лікування захворювання, порушення або стану терапевтичною сполукою, включають: а) визначення рівня біомаркера в біологічному зразку від індивідуума, де біомаркером є СО44, СО83 або їхня комбінація; і 5) порівняння рівня біомаркера в біологічному зразку від індивідуума з еталонним рівнем біомаркера; де індивідуум ймовірно буде відповідати на лікування, якщо рівень біомаркера в біологічному зразку від індивідуума змінений порівняно з еталонним рівнем біомаркера.
У визначених варіантах здійснення способи ідентифікації індивідуума, який ймовірно буде відповідати на лікування захворювання, порушення або стану терапевтичною сполукою, включають: а) визначення рівня біомаркера в біологічному зразку від індивідуума, де біомаркером є СО44, СО83 або їхня комбінація; р) визначення рівня біомаркера в контрольному зразку; і с) порівняння рівня біомаркера в біологічному зразку від індивідуума з рівнем біомаркера в контрольному зразку; де індивідуум ймовірно буде відповідати на лікування, якщо рівень біомаркера в біологічному зразку від індивідуума змінений порівняно з рівнем біомаркера в контрольному зразку.
У визначених варіантах здійснення способи ідентифікації індивідуума, який ймовірно буде відповідати на лікування захворювання, порушення або стану терапевтичною сполукою, включають: а) визначення рівня біомаркера в біологічному зразку від індивідуума, де біомаркером є СО83; і р) порівняння рівня біомаркера в біологічному зразку від індивідуума з еталонним рівнем біомаркера; де індивідуум ймовірно буде відповідати на лікування, якщо рівень біомаркера в біологічному зразку від індивідуума перевищує еталонний рівень біомаркера.
У визначених варіантах здійснення способи ідентифікації індивідуума, який ймовірно буде відповідати на лікування захворювання, порушення або стану терапевтичною сполукою, включають: а) визначення рівня біомаркера в біологічному зразку від індивідуума, де біомаркером є СО83; Б) визначення рівня біомаркера в контрольному зразку; і с) порівняння рівня біомаркера в біологічному зразку від індивідуума з рівнем біомаркера в контрольному зразку; де індивідуум ймовірно буде відповідати на лікування, якщо рівень біомаркера в біологічному зразку перевищує рівень біомаркера в контрольному зразку.
У визначених варіантах здійснення способи ідентифікації індивідуума, який ймовірно буде відповідати на лікування захворювання, порушення або стану терапевтичною сполукою, включають: а) визначення рівня біомаркера в біологічному зразку від індивідуума, де біомаркером є СО44; і р) порівняння рівня біомаркера в біологічному зразку від індивідуума з еталонним рівнем біомаркера; де індивідуум ймовірно буде відповідати на лікування, якщо рівень біомаркера в біологічному зразку від індивідуума є більш низьким, ніж еталонний рівень біомаркера.
У визначених варіантах здійснення способи ідентифікації індивідуума, який ймовірно буде відповідати на лікування захворювання, порушення або стану терапевтичною сполукою, включають: а) визначення рівня біомаркера в біологічному зразку від індивідуума, де біомаркером є СО44; р) визначення рівня біомаркера в контрольному зразку; і с) порівняння рівня біомаркера в біологічному зразку від індивідуума з рівнем біомаркера в контрольному зразку; де індивідуум ймовірно буде відповідати на лікування, якщо рівень біомаркера в біологічному зразку від індивідуума є більш низьким, ніж рівень біомаркера в контрольному зразку.
У визначених варіантах здійснення способи прогнозування здатності індивідуума відповідати на лікування захворювання, порушення або стану терапевтичною сполукою включають: а) визначення рівня біомаркера в біологічному зразку від індивідуума, де біомаркером є СО44, СО83 або їхня комбінація; і 5) порівняння рівня біомаркера в біологічному зразку з еталонним рівнем біомаркера; де різниця між рівнем біомаркера в біологічному зразку від індивідуума й еталонним рівнем біомаркера корелює зі здатністю індивідуума відповідати на лікування.
У визначених варіантах здійснення способи прогнозування здатності індивідуума відповідати на лікування захворювання, порушення або стану терапевтичною сполукою включають: а) визначення рівня біомаркера в біологічному зразку від індивідуума, де (610) біомаркером є СО44, СО83 або їхня комбінація; 5) визначення рівня біомаркера в контрольному зразку; і с) порівняння рівня біомаркера в біологічному зразку від індивідуума з рівнем біомаркера в контрольному зразку; де різниця між рівнем біомаркера в біологічному зразку від індивідуума і рівнем біомаркера в контрольному зразку корелює зі здатністю відповідати індивідуума на лікування.
У визначених варіантах здійснення способи прогнозування здатності індивідуума відповідати на лікування захворювання, порушення або стану терапевтичною сполукою включають: а) визначення рівня біомаркера в біологічному зразку від індивідуума, де біомаркером є СО83; і В) порівняння рівня біомаркера в біологічному зразку з еталонним рівнем біомаркера, де збільшений рівень біомаркера в біологічному зразку від індивідуума порівняно з еталонним рівнем біомаркера корелює зі збільшеною здатністю індивідуума відповідати на лікування.
У визначених варіантах здійснення способи прогнозування здатності індивідуума відповідати на лікування захворювання, порушення або стану терапевтичною сполукою включають: а) визначення рівня біомаркера в біологічному зразку від індивідуума, де біомаркером є СО83; Б) визначення рівня біомаркера в контрольному зразку; і с) порівняння рівня біомаркера в біологічному зразку від індивідуума з рівнем біомаркера в контрольному зразку; де збільшений рівень біомаркера в біологічному зразку від індивідуума порівняно з рівнем біомаркера в контрольному зразку корелює зі збільшеною здатністю індивідуума відповідати на лікування.
У визначених варіантах здійснення способи прогнозування здатності індивідуума відповідати на лікування захворювання, порушення або стану терапевтичною сполукою включають: а) визначення рівня біомаркера в біологічному зразку від індивідуума, де біомаркером є СО44; і б) порівняння рівня біомаркера в біологічному зразку з еталонним рівнем біомаркера, де знижений рівень біомаркера в біологічному зразку від індивідуума порівняно з еталонним рівнем біомаркера корелює зі збільшеною здатністю індивідуума відповідати на лікування.
У визначених варіантах здійснення способи прогнозування здатності індивідуума відповідати на лікування захворювання, порушення або стану терапевтичною сполукою включають: а) визначення рівня біомаркера в біологічному зразку від індивідуума, де біомаркером є СО44; р) визначення рівня біомаркера в контрольному зразку; і с) порівняння рівня біомаркера в біологічному зразку від індивідуума з рівнем біомаркера в контрольному зразку; де знижений рівень біомаркера в біологічному зразку від індивідуума порівняно з рівнем біомаркера в контрольному зразку корелює зі збільшеною здатністю індивідуума відповідати на лікування.
У визначених варіантах здійснення способи моніторингу ефективності лікування захворювання, порушення або стану в індивідуума, якого лікують терапевтичною сполукою, включають: а) одержання першого біологічного зразка від індивідуума; Б) визначення рівня біомаркера в першому біологічному зразку, де біомаркером є СО44, СО83 або їхня комбінація; с) введення терапевтичної сполуки індивідууму; 4) одержання після цього другого біологічного зразка від індивідуума; е) визначення рівня біомаркера в другому біологічному зразку; і У порівняння рівнів біомаркера в першому і другому біологічному зразках; де індивідуум є таким, що відповідає на лікування, якщо рівень біомаркера в другому біологічному зразку індивідуума змінений порівняно з рівнем біомаркера в першому біологічному зразку індивідуума.
У визначених варіантах здійснення способи моніторингу ефективності лікування захворювання, порушення або стану в індивідуума, якого лікують терапевтичною сполукою, включають: а) одержання першого біологічного зразка від індивідуума; Б) визначення рівня біомаркера в першому біологічному зразку, де біомаркером є СО83; с) введення терапевтичної сполуки індивідууму; 4) одержання після цього другого біологічного зразка від індивідуума; є) визначення рівня біомаркера в другому біологічному зразку, і 7) порівняння рівнів біомаркера в першому їі другому біологічному зразках; де індивідуум є таким, що відповідає на лікування, якщо рівень біомаркера в другому біологічному зразку індивідуума перевищує рівень біомаркера в першому біологічному зразку індивідуума.
У визначених варіантах здійснення способи моніторингу ефективності лікування захворювання, порушення або стану в індивідуума, якого лікують терапевтичною сполукою, включають: а) одержання першого біологічного зразка від індивідуума; Б) визначення рівня біомаркера в першому біологічному зразку, де біомаркером є СО44; с) введення терапевтичної сполуки індивідууму; 4) одержання після цього другого біологічного зразка від індивідуума; є) визначення рівня біомаркера в другому біологічному зразку, і 7) порівняння рівнів біомаркера в першому і другому біологічному зразках; де індивідуум є таким, що відповідає на лікування,
якщо рівень біомаркера в другому біологічному зразку індивідуума є більш низьким, ніж рівень біомаркера в першому біологічному зразку індивідуума.
У визначених варіантах здійснення способи моніторингу дотримання індивідуумом режиму лікування захворювання, порушення або стану терапевтичною сполукою включають: а) одержання біологічного зразка індивідуума; Б) визначення рівня біомаркера в біологічному зразку, де біомаркером є СО44, СО83 або їхня комбінація; і с) порівняння рівня біомаркера з рівнем біомаркера в контрольному необробленому зразку індивідуума; де зміна рівня біомаркера в біологічному зразку порівняно з рівнем біомаркера в контрольному зразку вказує на дотримання індивідуумом режиму лікування.
У визначених варіантах здійснення способи моніторингу дотримання індивідуумом режиму лікування захворювання, порушення або стану терапевтичною сполукою включають: а) одержання біологічного зразка індивідуума; Б) визначення рівня біомаркера в біологічному зразку, де біомаркером є СО83; і с) порівняння рівня біомаркера з рівнем біомаркера в контрольному необробленому зразку від індивідуума; де збільшений рівень біомаркера в біологічному зразку порівняно з рівнем біомаркера в контрольному зразку вказує на дотримання індивідуумом режиму лікування.
У визначених варіантах здійснення способи моніторингу дотримання індивідуумом режиму лікування захворювання, порушення або стану терапевтичною сполукою включають: а) одержання біологічного зразка індивідуума; Б) визначення рівня біомаркера в біологічному зразку, де біомаркером є СО44; і с) порівняння рівня біомаркера з рівнем біомаркера в контрольному необробленому зразку від індивідуума; де знижений рівень біомаркера в біологічному зразку порівняно з рівнем біомаркера в контрольному зразку вказує на дотримання індивідуумом режиму лікування.
У визначених варіантах здійснення терапевтична сполука являє собою імуномодулюючу сполуку. У визначених варіантах здійснення терапевтична сполука являє собою гідрохлорид 3-
І4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3-дигідроізоіїндол-2-іл|-піперидин-2,6б-діону, або його фармацевтично прийнятну сіль, сольват, гідрат, стереоіїзомер, таутомер або рацемічні суміші В одному з варіантів здійснення сполука являє собою (5)-3-(4-(4-морфолін-4- ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3-дигідроізоіндол-2-іл|-піперидин-2,6-діон або його фармацевтично прийнятну сіль, сольват або гідрат. 7.7 ФАРМАЦЕВТИЧНІ КОМПОЗИЦІЇ І ДОЗОВАНІ ФОРМИ
Фармацевтичні композиції можна використовувати для одержання окремих лікарських форм.
Фармацевтичні композиції і дозовані форми, описані в даному описі, включають сполуку, описану в даному описі, або її фармацевтично прийнятну сіль, сольват, гідрат, стереоізомер, рацемат, клатрат або проліки. Фармацевтичні композиції і дозовані форми, крім того, можуть містити один або декілька ексципієнтів.
Фармацевтичні композиції і дозовані форми, описані в даному описі, також можуть містити один або кілька додаткових активних інгредієнтів. Приклади необов'язкових других додаткових або активних інгредієнтів описані вище.
Окремі лікарські форми, описані в даному описі, підходять для перорального введення, введення на слизову оболонку (наприклад, назального, сублінгвального, вагінального, букального або ректального), парентерального (наприклад, підшкірного, внутрішньовенного, у вигляді болюсної ін'єкції, внутрішньом'язового або внутрішньоартеріального), місцевого (наприклад, очні краплі або інші офтальмологічні препарати), трансдермального або черезшкірного введення пацієнту. Приклади дозованих форм включають, але не обмежуються ними: таблетки; таблетки у формі капсул; капсули, такі, як м'які еластичні желатинові капсули; крохмальні капсули; пігулки; пастилки; дисперсії; супозиторії; порошки; аерозолі (наприклад, назальні аерозолі або інгалятори); гелі; рідкі дозовані форми, що підходять для перорального введення або введення на слизову оболонку пацієнта, включаючи суспензії (наприклад, водні або неводні рідкі суспензії, емульсії типу "масла-в-воді", або рідкі емульсії "воді-в-маслі"), розчини й еліксири; рідкі дозовані форми, що підходять для парентерального введення пацієнту; очні краплі або інші офтальмологічні препарати, що підходять для місцевого введення; і стерильні тверді речовини (наприклад, кристалічні або аморфні тверді речовини), який можна розбавляти, одержуючи рідкі дозовані форми, що підходять для парентерального введення пацієнту.
Композиція, форма і тип дозованих форм звичайно змінюються залежно від їхнього застосування. Наприклад, дозована форма, використовувана для невідкладного лікування захворювання, може містити більш високі кількості одного або декількох активних інгредієнтів, які вона містить, ніж дозована форма, використовувана для тривалого лікування того ж (610) захворювання. Аналогічно, парентеральна дозована форма може містити менші кількості одного або декількох активних інгредієнтів, які вона містить, ніж пероральна дозована форма, використовувана для лікування того ж захворювання. Ці й інші способи застосування, у яких використовуються конкретні дозовані форми, відрізняються один від одного і будуть зрозумілі фахівцям у даній галузі. Див., наприклад, Кетіпдіоп'є Рпагтасешіса! 5сіепсе5, 181п ейа., Маск
Рибіївпіпо, Еавіоп РА (1990).
В одному з варіантів здійснення фармацевтичні композиції і дозовані форми містять один або декілька ексципієнтів. Придатні ексципієнти добре відомі фахівцям в галузі фармацевтики, і необмежуючі приклади придатних ексципієнтів описані в даному описі. Придатність конкретного ексципієнта для включення у фармацевтичну композицію або дозовану форму залежить від множини факторів, відомих у даній галузі, включаючи, але ними не обмежуючись, спосіб, яким дозовану форму будуть вводити пацієнту. Наприклад, пероральні дозовані форми, такі, як таблетки, можуть містити ексципієнти, не придатні для застосування в парентеральних дозованих формах. Придатність конкретного ексципієнта також може залежати від конкретних активних інгредієнтів у дозованій формі. Наприклад, розкладання деяких активних інгредієнтів може бути прискорене за допомогою деяких ексципієнтів, таких, як лактоза, або під впливом води. Активні інгредієнти, що містять первинні або вторинні аміни, є особливо чутливими до такого прискореного розкладання. Отже, передбачаються фармацевтичні композиції і дозовані форми, що містять невелику кількість або навіть не містять лактози або інших моносахаридів або дисахаридів. Як використовують у даному описі, термін "яка не містить лактози" означає, що кількість наявної лактози, якщо вона є, є недостатньою для істотного підвищення рівня деградації активного інгредієнта.
Композиції, які не містять лактози, можуть містити ексципієнти, що добре відомі в даній галузі і наведені, наприклад, у 0.5. Рпагтасореїа (С5Р) 25-МЕ20 (2002). Загалом, композиції, які не містять лактози, містять активні інгредієнти, зв'язувальну речовину/наповнювач (і змащувальну речовину у фармацевтично сумісних і фармацевтично прийнятних кількостях. В одному з варіантів здійснення дозовані форми, які не містять лактози, містять активні інгредієнти, мікрокристалічну целюлозу, прежелатинізований крохмаль і стеарат магнію.
Також передбачаються безводні фармацевтичні композиції і дозовані форми, що містять активні інгредієнти, оскільки вода може сприяти деградації деяких сполук. Наприклад, додавання води (наприклад, 595) широко прийнято у фармацевтичній галузі як спосіб моделювання тривалого збереження з метою визначення властивостей, таких, як термін зберігання або стабільність сполук з плином часу. Див., наприклад, Уеп5 Т. Сагвієпзеп, ЮОгид еабійу: Ргіпсіріез 4. Ргасіїсе, 2а. Ед., Магсе!ї ОекКег, МУ, МУ, 1995, рр. 379-80. Насправді, вода і нагрівання прискорюють розкладання деяких сполук. Таким чином, ефект води на сполуку може бути значним, оскільки рідина і/або волога часто зустрічаються в ході одержання, обробки, упаковування, збереження, транспортування і застосування сполук.
Безводні фармацевтичні композиції і дозовані форми можна одержувати з використанням безводних або таких, що містять низьку кількість вологи, інгредієнтів і в умовах з низьким вмістом рідини або низьким вмістом вологи. Фармацевтичні композиції і дозовані форми, що містять лактозу і щонайменше один активний інгредієнт, що містить первинний або вторинний амін є безводними, якщо очікується істотний контакт із вологою і/або рідиною в ході одержання, упаковування і/або збереження.
Безводну фармацевтичну композицію потрібно одержувати і зберігати так, щоб підтримувати безводні умови. Таким чином, в одному з варіантів здійснення даний винахід охоплює безводні композиції, упаковані з використанням матеріалів, про які відомо, що вони перешкоджають впливу води, так що їх можна включати в придатні складені набори. Приклади прийнятних пакувальних матеріалів включають, але не обмежуються ними, герметичну фольгу, пластик, контейнери для одиничної дози (наприклад, ампула), блістерну упаковку і контурну упаковку.
Також передбачаються фармацевтичні композиції і дозовані форми, що містять одну або кілька сполук, які зменшують швидкість деградації активного інгредієнта. Такі сполуки, що у даному описі називають "стабілізаторами", включають, але не обмежуються ними, антиоксиданти, такі, як аскорбінова кислота, рН-буфери або сольові буфери.
Подібно до кількостей і типів ексципієнтів, кількості ії конкретні типи активних інгредієнтів у дозованій формі можуть розрізнятися залежно від факторів, таких, як, але ними не обмежуючись, спосіб, за допомогою якого її вводять пацієнтам. В одному з варіантів здійснення дозовані форми включають сполуку, описану в даному описі, у кількості від приблизно 0,10 до приблизно 500 мг. В інших варіантах здійснення дозовані форми включають сполуку, описану в даному описі, у кількості приблизно 0,1, 1, 2, 5, 7,5, 10, 12,5, 15, 17,5, 20, 25, 50, 100, 150, 200, бО 250, 300, 350, 400, 450 або 500 мг.
В інших варіантах здійснення дозовані форми містять другий активний інгредієнт у кількості від 1 до приблизно 1000 мг, від приблизно 5 до приблизно 500 мг, від приблизно 10 до приблизно 350 мг, або від приблизно 50 до приблизно 200 мг. Безумовно, конкретна кількість другого активного засобу буде залежати від конкретного використовуваного засобу, захворювань або порушення, що піддаються лікуванню або контролю за перебігом, і кількості(кількостей) сполуки, описаної в даному описі, і будь-яких необов'язкових додаткових активних речовин, які у поточний час вводяться пацієнту. 6.6.1 Пероральні дозовані форми
Фармацевтичні композиції, які підходять для перорального введення, можуть бути надані як окремі дозовані форми, такі, як, але не обмежуються ними, таблетки (наприклад, жувальні таблетки), таблетки у формі капсул, капсули і рідини (наприклад, сиропи зі смаковими добавками). Такі дозовані форми містять задані кількості активних інгредієнтів і їх можна одержувати способами фармацевтики, добре відомими фахівцям у даній галузі. Див., головним чином, Кетіпдіоп'5 Рпагтасеціїса! 5сіепсев, 201п ед., Маск Рибіїзпіпо, Еазіоп РА (2000).
Пероральні дозовані форми, описані в даному описі, одержують комбінуванням активних інгредієнтів в однорідній суміші щонайменше з одним ексципієнтом відповідно до загальноприйнятих способів одержання фармацевтичних препаратів. залежно від форми препарату, який мають намір вводити, ексципієнтам можна надавати велике різноманіття форм.
Наприклад, ексципієнти, прийнятні для застосування в пероральних рідких або аерозольних дозованих формах, включають, але не обмежуються ними, воду, гліколі, масла, спирти, ароматизатори, консерванти і барвники. Приклади наповнювачів, що підходять для застосування у твердих пероральних дозованих формах (наприклад, порошках, таблетках, капсулах і таблетках у формі капсул) включають, але не обмежуються ними, крохмалі, цукри, мікрокристалічну целюлозу, розріджувачі, гранулюючі засоби, змащувальні речовини, зв'язувальні речовини і дезінтегруючі речовини.
В одному з варіантів здійснення пероральні дозовані форми являють собою таблетки або капсули, у випадку яких використовують тверді ексципієнти. В іншому варіанті здійснення на таблетки можна наносити покриття стандартними способами нанесення водного і неводного покриття. Такі дозовані форми можна одержувати будь-якими способами фармацевтики.
Загалом, фармацевтичні композиції і дозовані форми одержують, рівномірно й однорідно змішуючи активні інгредієнти з рідкими носіями, мілюоподрібненими твердими носіями або і з тими, й іншими, а потім, якщо необхідно, надаючи продукту бажану форму.
Наприклад, таблетку можна одержувати пресуванням або формуванням. Пресовані таблетки можна одержувати пресуванням у придатному пристрої активних інгредієнтів у сипкій формі, такій, як порошок або гранули, необов'язково змішаних з ексципієнтом. Формовані таблетки можна одержувати шляхом формування в придатному пристрої суміші порошкованої сполуки, змоченої інертним рідким розріджувачем.
Приклади ексципієнтів, які можна використовувати в пероральних дозованих формах, описаних у даному описі, включають, але не обмежуються ними, зв'язувальні речовини, наповнювачі, дезінтегруючі речовини і змащувальні речовини. Зв'язувальні речовини, що підходять для застосування у фармацевтичних композиціях і дозованих формах, включають, але не обмежуються ними, кукурудзяний крохмаль, картопляний крохмаль або інші крохмалі, желатин, природні і синтетичні камеді, такі, як гуміарабік, альгінат натрію, альгінова кислота, інші альгінати, порошкова трагакантова камедь, гуарова камедь, целюлозу і її похідні (наприклад, етилцелюлозу, ацетат целюлози, карбоксиметилцелюлозу кальцію, карбоксиметилцелюлозу натрію), полівінілпіролідон, метилцелюлозу, прежелатинізований крохмаль, гідроксипропілметилцелюлозу, (наприклад, Мо. 2208, 2906, 2910), мікрокристалічну целюлозу і їх суміші.
Придатні форми мікрокристалічної целюлози включають, але не обмежуються ними, матеріали, які продаються як АМІСЕГ-РН-101, АМІСЕЇ -РН-103 АМІСЕЇ А!С-581, АМІСЕЇ -РН-105 (доступні від ЕМС Согрогайоп, Атегісап Мізсозе Оімізіоп, Амісе! ЗаІе5, Магси5 НооК, РА) і їх суміші. Конкретна зв'язувальна речовина являє собою суміш мікрокристалічної целюлози і карбоксиметилцелюлози натрію (яка продається як АМІСЕЇ КС-581). Прийнятні безводні ексципієнти або ексципієнти з низьким вмістом вологи включають АМІСЕЇ -РН-10ОЗ"М і крохмаль 15001 М.
Приклади наповнювачів, що підходять для застосування у фармацевтичних композиціях і дозованих формах, описаних у даному описі, включають, але не обмежуються ними, тальк, карбонат кальцію (наприклад, гранули або порошок), мікрокристалічну целюлозу, порошкову целюлозу, декстрати, каолін, маніт, кремнієву кислоту, сорбітол, крохмаль, прежелатинізований (610) крохмаль і їх суміші. В одному з варіантів здійснення зв'язувальна речовина або наповнювач у фармацевтичних композиціях надані в кількості від приблизно 50 до приблизно 99 вагових відсотків фармацевтичної композиції або дозованої форми.
Дезінтегруючі речовини можна використовувати в композиціях для одержання таблеток, які дезінтегрують під дією водного оточення. Таблетки, у яких міститься занадто багато дезінтегруючої речовини, можуть дезінтегрувати при збереженні, у той час як таблетки, що містять її занадто мало, можуть не дезінтегрувати з необхідною швидкістю або в необхідних умовах. Таким чином, для одержання твердих пероральних дозованих форм можна використовувати достатню кількість дезінтегруючої речовини, що не є ні надмірною, ні недостатньою для того, щоб негативним чином змінити вивільнення активних інгредієнтів.
Кількість застосовуваної дезінтегруючої речовини змінюється залежно від типу препарату і його легко визначить фахівець у даній галузі. В одному з варіантів здійснення фармацевтичні композиції містять від приблизно 0,5 до приблизно 15 відсотків за масою дезінтегруючої речовини, або від приблизно 1 до приблизно 5 відсотків за масою дезінтегруючої речовини.
Дезінтегруючі речовини, які можна використовувати у фармацевтичних композиціях і дозованих формах, включають, але ними не обмежуються, агар-агар, альгінову кислоту, карбонат кальцію, мікрокристалічну целюлозу, кроскармелозу натрію, кросповідон, полакрилін калію, натрію крохмалю гліколят, картопляний або маніоковий крохмаль, інші крохмалі, прежелатинізований крохмаль, інші крохмалі, глини, інші альгіни, інші види целюлози, камеді і їх суміші.
Змащувальні речовини, які можна використовувати у фармацевтичних композиціях і дозованих формах, включають, але ними не обмежуються, стеарат кальцію, стеарат магнію, мінеральне масло, легке мінеральне масло, гліцерин, сорбіт, маніт, поліетиленгліколь, інші гліколі, стеаринову кислоту, лаурилсульфат натрію, тальк, гідрогенізовану рослинну олію (наприклад, арахісова олія, бавовняна олія, соняшникова олія, кунжутна олія, маслинова олія, кукурудзяна олія і соєва олія), стеарат цинку, етилолеат, етиллауриат, агар і їх суміші.
Додаткові змащувальні речовини, включають, наприклад, силоїдний силікагель (АЕКОБІЇ. 200, вироблений МУ. БК. (гасе Со., Вайштоге, МО), коагульований аерозоль із синтетичного діоксиду кремнію (який продається Юедивзза Со. ої Ріапо, ТХ), САВ-О-5ІЇ. (пірогенний діоксид кремнію, що являє собою продукт, який продається Сарої Со. ої Во5іоп, МА) і їх суміші. Змащувальні речовини, якщо їх узагалі використовують, можна використовувати в кількості менше приблизно 1 вагового відсотка фармацевтичних композицій або дозованих форм, до складу яких вони включені.
В одному з варіантів здійснення тверда дозована форма містить сполуку, описану в даному описі, безводну лактозу, мікрокристалічну целюлозу, полівінілпіролідон, стеаринову кислоту, колоїдний безводний діоксид кремнію і желатин. 6.6.2 Дозовані форми з контрольованим вивільненням
Активні інгредієнти, такі, як сполуки, описані в даному описі, можна вводити за допомогою засобів контрольованого вивільнення або за допомогою пристроїв для доставки, що добре відомі фахівцям у даній галузі. Приклади включають, але не обмежуються ними, засоби і пристрої, описані в патентах США Мо: 3845770; 3916899; 3536809; 3598123; і 4008719; 5674533; 5059595; 5591767; 5120548; 5073543; 5639476; 5354556; 5639480; 5733566; 5739108; 5891474; 5922356; 5972891; 5980945; 5993855; 6045830; 6087324; 6113943; 6197350; 6248363; 6264970; 6267981; 6376461; 6419961; 6589548; 6613358; 6699500, кожний з яких включений у даний опис як посилання. Такі дозовані форми можна використовувати для забезпечення повільного або контрольованого вивільнення одного або декількох активних інгредієнтів з використанням, наприклад, гідропропілметилцелюлози, інших полімерних матриць, гелів, проникних мембран, осмотичних систем, багатошарових покрить, мікрочастинок, ліпосом, мікросфер або їх комбінації для забезпечення бажаного профілю вивільнення в різних співвідношеннях. Придатні сполуки з контрольованим вивільненням, відомі середнім фахівцям у даній галузі, включаючи сполуки, описані в даному описі, можна без яких-небудь складностей вибрати для застосування з активними інгредієнтами, описаними в даному описі. Таким чином, композиції, описані в даному описі, охоплюють окремі лікарські форми, що підходять для перорального введення, такі, як, але ними не обмежуючись, таблетки, капсули, желатинові капсули і таблетки у формі капсул, що адаптовані для контрольованого вивільнення.
Усі фармацевтичні продукти з контрольованим вивільненням мають загальне призначення, пов'язане з поліпшенням лікарської терапії порівняно з терапією, що досягається при застосуванні неконтрольованих аналогів. В ідеальному випадку, застосування оптимальне розробленого препарату з контрольованим вивільненням характеризується мінімальною кількістю лікарської речовини, використовуваної для лікування або контролю стану протягом (610) мінімального періоду часу. Переваги препаратів з контрольованим вивільненням включають тривалу активність лікарського засобу, зниження частоти дозування і підвищення дотримання режиму і схеми лікування індивідуумом. Крім того, препарати з контрольованим вивільненням можна використовувати для впливу на час початку дії або інші характеристики, такі, як рівень лікарського засобу в крові, і, таким чином, можна впливати на виникнення побічних (наприклад, несприятливих) ефектів.
Більшість препаратів з контрольованим вивільненням розроблено для первісного вивільнення кількості лікарського засобу (активного інгредієнта), що швидко викликає необхідний терапевтичний ефект, і поступового і безперервного вивільнення інших кількостей лікарського засобу для підтримки цього рівня терапевтичного або профілактичного ефекту протягом тривалого періоду часу. З метою підтримки цього постійного рівня лікарського засобу в організмі, лікарський засіб повинен вивільнятися з дозованої форми зі швидкістю, що буде заміняти кількість лікарського засобу, метаболізованого і екскретованого з організму.
Контрольоване вивільнення активного інгредієнта може стимулюватися різними умовами, включаючи, але ними не обмежуючись, рН, температуру, ферменти, воду або інші фізіологічні умови або сполуки.
У визначених варіантах здійснення лікарський засіб можна вводити з використанням внутрішньовенної інфузії, імплантованого осмотичного насоса, трансдермального пластиру, ліпосом або інших способів введення. В одному з варіантів здійснення можна використовувати насос (див., Зейоп, СКС Стії. Кеї. Віотейа. Епо. 14:201 (1987); Виспулаїа еї аї., Зигдегу 88:507 (1980); Зацдек еї аї., М. ЕпаїІ. У. Меа. 321:574 (1989)). В іншому варіанті здійснення можна використовувати полімерні матеріали. В іншому варіанті здійснення систему з контрольованим вивільненням можна поміщати у відповідну область індивідуума, визначену фахівцем у даній галузі, тобто, таким чином, потрібна тільки частина системної дози (див., наприклад, соойзоп,
Меадіса! Арріїсайопе ої СопігоПей еїЇєазе, моЇ. 2, рр. 115-138 (1984)). Інші системи з контрольованим вивільненням розглянуті в огляді Гапдег (Зсіепсе 249:1527-1533 (1990).
Активний інгредієнт може бути диспергований у твердому внутрішньому матриксі, наприклад, поліметилметакрилаті, полібутилметакрилаті, пластифікованому або непластифікованому полівінілхлориді, пластифікованому нейлоні, пластифікованому поліетилентерефталаті, природному каучуку, поліїзопрені, поліїзобутилені, полібутадієні, полієтилені, співполімерах етилен-вінілацетат, силіконових каучуках, полідиметилсилоксанах, силікон-карбонатних співполімерах, гідрофільних полімерах, таких, як гідрогелі, складних ефірах актилової і метакрилової кислоти, колагені, зшитому полівініловому спирті і зшитому частково гідролізованому полівінілацетаті, що оточений зовнішньою полімерною мембраною, наприклад, поліетиленом, поліпропіленом, співполімерами етилен/пропілен, співполімерах етилен/етилакрилат, співполімерах етилен/вінілацетат, силіконовими камедями, полідиметилсилоксанами, неопреновим каучуком, хлорованим поліетиленом, полівінілхлоридом, співполімерами вінілхлориду з вінілацетатом, вініліденхлоридом, етиленом і пропіленом, іоновмісним поліетилентерефталатом, бутилкаучуком, епіхлоргідриновими каучуками, співполімером етилен/вініловий спирт, терполімером етилен/вінілацетат/вініловий спирт, і співполімером етилен/вінілоксієтанол, що нерозчинний в рідинах організму. Потім активний інгредієнт дифундує через зовнішню полімерну мембрану на стадії з контрольованою швидкістю вивільнення. Відсоток активного інгредієнта в таких парентеральних композиціях у високій мірі залежить від їхньої конкретної природи, а також від потреб індивідуума. 6.6.3 Парентеральні дозовані форми
Парентеральні дозовані форми можна вводити пацієнтам різними способами, включаючи, але ними не обмежуючись, підшкірне, внутрішньовенне (включаючи болюсну ін'єкцію), внутрішньом'язове і внутрішньоартеріальне введення. У деяких варіантах здійснення введення парентеральної дозованої форми обходить природний захист пацієнтів від забруднювачів, і, таким чином, у цих варіантах здійснення парентеральні дозовані форми переважно стерильні або їх можна стерилізувати перед введенням пацієнту. Приклади парентеральних дозованих форм включають, але не обмежуються ними, готові розчини для введення, сухі продукти, готові до розведення або суспендування у фармацевтично прийнятному носії для ін'єкції, готові суспензії для ін'єкції, і емульсії.
Прийнятні носії, які можна використовувати для одержання парентеральних дозованих форм, добре відомі фахівцям у даній галузі. Їхні приклади включають, але не обмежуються ними: воду для ін'єкцій О5Р; водні носії, такі, як, але ними не обмежуючись, розчин хлориду натрію для ін'єкцій, розчин Рінгера для ін'єкцій, розчин декстрози для ін'єкцій, розчин декстрози і хлориду натрію для ін'єкцій, і лактатний розчин Рінгера для ін'єкцій; розчинні у воді носії, такі, як, але ними не обмежуючись, етиловий спирт, поліетиленгліколь і поліпропіленгліколь; і неводні носії, такі, як, але ними не обмежуючись, кукурудзяна олія, бавовняна олія, арахісова олія, кунжутна олія, етилолеат, ізопропілміристат і бензилбензоат.
Сполуки, що підвищують розчинність одного або декількох активних інгредієнтів, описаних у даному описі, також можна включати в парентеральні дозовані форми. Наприклад, циклодекстрин і його похідні можна використовувати для підвищення розчинності сполуки, описаної в даному описі. Див., наприклад, патент США Мо 5134127, що включений у даний опис як посилання. 6.6.4 Дозовані форми для місцевого і мукозального застосування
Дозовані форми для місцевого і мукозального застосування, описані в даному описі, включають, але не обмежуються ними, розпорошувані розчини, аерозолі, розчини, емульсії, суспензії або інші форми, відомі фахівцю а даній галузі. Див., наприклад, Кетіпіпдіоп'є
Ріатіасешіса! Зсієпсев, 161й, 181й апа 201й едз5, Маск Рибіїзєпіпу, Еазіоп РА (1980, 1990 апа 2000); і Іпігодисійоп То Рпагтіасешіса! бозаде Еогт5, 4 еай., І еа 5. Ребідег, Рпйадеїрпіа (1985).
Дозовані форми, що підходять для нанесення на слизові тканини порожнини рота, можна одержувати у вигляді рідин для полоскання рота або у вигляді гелів для порожнини рота.
Прийнятні ексципієнти (наприклад, носії і розріджувачі) і інші речовини, які можна використовувати для одержання дозованих форм для місцевого і мукозального застосування, охоплюваних даним винаходом, добре відомі фахівцям в галузі фармацевтики і залежать від конкретної тканини, на яку дана фармацевтична композиція або дозована форма буде нанесена. В одному з варіантів здійснення ексципієнти включають, але не обмежуються ними, воду, ацетон, етанол, етиленгліколь, пропіленгліколь, бутан-1,3-діол, ізопропілміристат, ізопропілпальмітат, мінеральне масло і їх суміші для одержання розчинів, емульсій або гелів, що є не токсичними і фармацевтично прийнятними. Також у фармацевтичні композиції і дозовані форми можна додавати зволожуючі або змочувальні речовини. Приклади додаткових інгредієнтів добре відомі в даній галузі. Див., наприклад, Кетіпдіоп'є Рпагтасешіса! Зсіепсев, 161, 1817 апа 20" едвз., Маск Рибіїзпіпо, Еазіоп РА (1980, 1990 апа 2000).
Для підвищення доставки одного або декількох активних інгредієнтів також можна коректувати рН фармацевтичної композиції або дозованої форми. Також для підвищення доставки можна коректувати полярність розчинника в носії, його іонну силу, або тонічність.
Також для підвищення доставки у фармацевтичні композиції або дозовані форми можна додавати сполуки, такі, як стеарати, для зміни гідрофільності або ліпофільності одного або декількох активних інгредієнтів. В інших варіантах здійснення стеарати можуть служити як ліпідний носій в препараті, як емульгатор або поверхнево-активна речовина, або як речовина для підвищення доставки або для посилення проникнення. В інших варіантах здійснення для додаткової корекції якостей кінцевої композиції можна використовувати солі, сольвати, гідрати, проліки, клатрати або стереоізомери активних інгредієнтів. 6.6.5 НАБОРИ
В одному з варіантів здійснення активні інгредієнти, описані в даному описі, не вводять пацієнту одночасно або тим самим шляхом введення. В іншому варіанті здійснення винахід стосується наборів, що можуть спростити введення відповідних кількостей активних інгредієнтів.
В одному з варіантів здійснення набір містить дозовану форму сполуки, описаної в даному описі. Крім того, набори можуть містити додаткові активні інгредієнти, такі, як інші протизапальні, імуномодулюючі або імунодепресивні сполуки або їх комбінація. Приклади додаткових активних інгредієнтів включають, але не обмежуються ними, активні інгредієнти, описані в даному описі.
В інших варіантах здійснення набори можуть додатково містити пристрої, які використовують для введення активних інгредієнтів. Приклади таких пристроїв включають, але ними не обмежуються, шприци, мішки для краплинного вливання, пластири й інгалятори.
Крім того, набори можуть містити клітини або кров для трансплантації, а також фармацевтично прийнятні носії, які можна використовувати для введення одного або декількох активних інгредієнтів. Наприклад, якщо активний інгредієнт наданий у твердій формі, яку необхідно розбавити для парентерального введення, тоді набір може містити герметичний контейнер із придатним носієм, у якому може бути розчинений активний інгредієнт з одержанням стерильного розчину, який не містить частинок, що придатний для парентерального введення. Приклади фармацевтично прийнятних носіїв включають, але не обмежуються ними: воду для ін'єкцій О5Р; водні носії, такі, як, але ними не обмежуючись, розчин хлориду натрію для ін'єкцій, розчин Рінгера для ін'єкцій, розчин декстрози для ін'єкцій, розчин декстрози і хлориду натрію для ін'єкцій, і лактатний розчин Рінгера для ін'єкцій; носії, що змішуються з водою, такі, як, але ними не обмежуючись, етиловий спирт, поліетиленгліколь і поліпропіленгліколь; і неводні носії, такі, як, але ними не обмежуючись, кукурудзяна олія, бавовняна олія, арахісова олія, кунжутна олія, етилолеат, ізопропілміристат і бензилбензоат. 8. ПРИКЛАДИ
Нижченаведені приклади надані як ілюстрація, а не для обмеження. У прикладах досліджувана сполука стосується // (5)-3-І4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3- дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,6б-діону. 8.1 Приклад 1: Одержання гідрохлориду (5)-3-(4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо- 1,3-дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,6-діону оо
МН
М (в)
Як 0 7.1.1 Метиловий ефір 3-гідрокси-2-метилбензойної кислоти (о; о що он
З-Гідрокси-2-метилбензойну кислоту (105 г, 690 ммоль) додавали до МеонН (800 мл) у 2-л круглодонній колбі з трьома горлечками, обладнаній конденсатором, термометром і елементом магнітної мішалки, а потім додавали Меон (250 мл). До описаного вище розчину додавали
На5О (10 мл, 180 ммоль). Реакційну суміш перемішували при 6220 протягом 17 годин.
Розчинник видаляли у вакуумі. Осад (200 мл) повільно додавали у воду (600 мл) при кімнатній температурі, і утворювалася біла тверда речовина. Суспензію перемішували на крижаній бані протягом 30 хвилин і фільтрували. Тверду речовину промивали водою (5х250 мл) і сушили з одержанням метилового ефіру З3-гідрокси-2-метилбензойної кислоти у вигляді білої твердої речовини (100 г, вихід - 87 95). Сполуку використовували на наступній стадії без подальшого очищення: Ї/СМ5 МН-167; "Н ЯМР (ДМСО-ав) б 2,28 (с, ЗН, СНЗ), 3,80 (с, ЗН, СНЗз), 6,96-7,03 (м, 1ТН, Аг), 7,09 (т, У-7,8 Гц, 1Н, Аг), 7,14-7,24 (м, 1Н, Аг), 9,71 (с, 1Н, ОН). 7.1.2 Метиловий ефір 3-(трет-бутилдиметилсиланілокси)-2-метилбензойної кислоти (в)
Со о. и
Ж
У 1-л колбу КВ із трьома горлечками, обладнану елементом магнітної мішалки і термометром, додавали ОМЕ (300 мл), метил З-гідрокси-2-метилбензоат (90 г, 542 ммоль) і імідазол (92 г, 1,354 ммоль). До описаного вище розчину частинами додавали ТВОМ5-СІ (90 г, 596 ммоль) для контролю внутрішньої температури на рівні 15-19205 протягом 20 хвилин, і після додавання внутрішня температура падала нижче 12Сб. Крижану баню видаляли і реакційну суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 16 годин. Реакційну суміш додавали до крижаної води (500 мл), і отриманий розчин розділяли на дві частини (700 млх2). Кожну частину екстрагували ЕІЮАс (700 мл). Кожен органічний шар промивали холодною водою (350 мл) і насиченим сольовим розчином (350 мл). Органічні шари поєднували і сушили над Ма5Ох.
Об'єднаний органічний шар концентрували з одержанням метилового ефіру 3-(трет- бутилдиметилсиланілокси)-2-метилбензойної кислоти у вигляді ясно-коричневого масла (160 г,
вихід неочищеної речовини - 100 95). Сполуку використовували на наступній стадії без подальшого очищення: І СМ5 МН-281; "Н ЯМР (ДМСО-ав) 5 -0,21 (с, 6Н, СН», СН), 0,73-0,84 (м, 9Н, СН», СН», СН), 2,10 (с, ЗН, СН), 3,60 (с, ЗН, СН), 6,82 (дд, 1Н, Аг), 6,97 (т, У-7,9 Гц, 1Н, Аг), 7,13 (дд, 9-11, 7,7 Гц, 1Н, Аг). 7.1.3 Метиловий ефір 2-бромметил-3-(трет-бутилдиметилсиланілокси)бензойної кислоти (в) (в) з Вг
МВ5 (49,8 г, 280 ммоль) додавали до метил 3-(трет-бутилдиметилсилілокси)-2- метилбензоату (78,4 г, 280 ммоль) у метилацетаті (500 мл) при кімнатній температурі з одержанням суспензії жовтогарячого кольору. Отриману реакційну суміш нагрівали на масляній бані при 402С і освітлювали за допомогою лампи сонячного світла потужністю 300 Вт протягом 4 годин. Реакційну суміш охолоджували і промивали розчином Ма»5Оз (2х600 мл, 50 95 насичена концентрація), водою (500 мл) і насиченим сольовим розчином (600 мл). Органічний шар сушили над Мд5О» і знебарвлювали вугіллям. Органічний шар концентрували з одержанням метилового ефіру 2-бромметил-3-(трет-бутилдиметилсиланілокси)бензойної кислоти у вигляді ясно-коричневого масла (96 г, вихід неочищеної речовини - 91 90). Сполуку використовували на наступній стадії без подальшого очищення: ЇСМ5 М-ВІі-279; "Н ЯМР (ДМСО-ав) б 0,05-0 11 (м, 6Н, СН», СН), 0,82 (с, 9Н, СН», СН», СН), 3,65 (с, ЗН, СН), 4,74 (с, 2Н, СН»), 6,94 (дд, 9У-1,3, 8,1
Гц, 1ТН, Аг), 7,10-7,20 (м, 1Н, Аг), 7,21-7,29 (м, 1Н, Аг). 7.1.4 Метиловий ефір 4-карбамоїлмасляної кислоти оо в
М
(в)
Мо КД
До розчину, що перемішується, метил 2-(бромметил)-3-(трет- бутилдиметилсилілокси)бензоату (137,5 г, 325 ммоль) в ацетонітрилі (1100 мл) у 2-л круглодонній колбі додавали гідрохлорид метил-4,5-діаміно-5--оксопентаноату (70,4 г, 358 ммоль). До суспензії додавали ОІРЕА (119 мл, 683 ммоль) через краплинну лійку протягом 10 хвилин, і суспензію перемішували при кімнатній температурі протягом 1 години, а потім суміш нагрівали на масляній бані при 402С протягом 23 годин. Реакційну суміш концентрували у вакуумі. Осад перемішували в простому ефірі (600 мл), і біла тверда речовина випадала в осад.
Суміш фільтрували і тверду речовину промивали простим ефіром (400 мл). Фільтрат промивали
НСІ (1 н, 200 мл), МанНсСоОз (насичений, 200 мл) і насиченим сольовим розчином (250 мл).
Водний шар і основний шар тримали окремо. Потім тверду речовину далі промивали простим ефіром (250 мл) і рідину промивали описаним вище кислим розчином і основним розчином. Два органічні шари поєднували і концентрували у вакуумі з одержанням метилового ефіру 4-(4- (трет-бутилдиметилсиланілоксі)-1-оксо-1,3-дигідро-ізоіндол-2-іл|-4-карбамоїлмасляної кислоти у вигляді коричневого масла (152 г, вихід неочищеної речовини - 115 95, чистота - 77 95 при Н-
ЯМР). Сполуку використовували на наступній стадії без подальшого очищення: І! СМ5 МН-407. 7.1.5 Метиловий ефір 4-карбамоїл-4-(4-гідроксі-1-оксо-1,3-дигідроіїзоіндол-2-іл)умасляної кислоти де)
У
М он с о
До холодного розчину, що перемішується, метил-5-аміно-4-(4-(трет-бутилдиметилсилілоксі)- 1-оксоізоіндолін-2-іл)-5-оксопентаноату (152 г, 288 ммоль) у ЮОМЕ (500 мл) і воді (55 мл), додавали КгСОз (19,89 г, 144 ммоль) частинами протягом 5 хвилин. Отриману реакційну суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 40 хвилин. Реакційну суміш охолоджували на крижаній бані. До суміші повільно додавали НОСІ (12 М, 23,99 мл, 288 ммоль). Після додавання до суміші додавали ацетонітрил (280 мл), і тверда речовина випадала в осад. Суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 10 хвилин і фільтрували. Тверду речовину промивали ацетонітрилом (50 млх4). Фільтрат концентрували у високому вакуумі з одержанням жовтого масла (168 г). Масло розчиняли в ацетонітрилі (600 мл) і перемішували при кімнатній температурі протягом 10 хвилин. Суміш фільтрували і тверду речовину промивали ацетонітрилом (25 млх2). Фільтрат концентрували у високому вакуумі з одержанням жовтого масла (169 г), що додавали до суміші води (1200 мл) і простого ефіру (1000 мл). Суміш перемішували протягом З хвилин і шари розділяли. Водний розчин концентрували у високому вакуумі й осад перемішували в ацетонітрилі (160 мл) і після перемішування протягом ночі утворювалася біла тверда речовина. Суміш фільтрували з одержанням метилового ефіру 4- карбамоїл-4-(4-гідроксі-1-оксо-1,3-дигідроіїзоіндол-2-іл)умасляної кислоти у вигляді білої твердої речовини (46 г, вихід - 54 90). Фільтрат концентрували й осад кристалізували в ацетонітрилі (60 мл) з одержанням додаткового метилового ефіру 4-карбамоїл-4-(4-гідроксі-1-оксо-1,3-дигідро- ізоїндол-2-іл)умасляної кислоти у вигляді білої твердої речовини (11,7 г, вихід - 14 95). Фільтрат концентрували й осад очищали ІЗСО-хроматографією з одержанням додаткового метилового ефіру 4-карбамоїл-4-(4-гідроксі-1-оксо-1,3-дигідроізоіїндол-2-іл)умасляної кислоти у вигляді білої твердої речовини (13,2 г, вихід - 15 95). Усього було отримано 70,9 г продукту з виходом 83 9о:
І СМ5 МН-293; "Н ЯМР (ДМСО-ав) б 1,95-2,34 (м, 4Н, СН», СНе), 3,51 (с, ЗН, СН), 4,32 (д, 9-17,6
Гц, 1Н, СНН), 4,49 (д, 9-17,4 Гц, 1Н, СНН), 4,73 (дд, У-4,7, 10,2 Гц, 1Н, СНН), 6,99 (дд, 9У-0,8, 7,9
Гц, 1ТН, Аг), 7,10-7,23 (м, 2Н, Аг, МНН), 7,25-7,38 (м, 1Н, Аг), 7,58 (с, 1Н, МНН), 10,04 (с, 1Н, ОН). 7.1.6 3-(4-(4-(морфолінометил)бензил)оксі)-1-оксоізоіндолін-2-іл)упіперидин-2,6б-діон о о н со (У
М (в)
З гм о.
Стадія 1: до розчину 3-(4-гідроксі-1-оксо-1,3-дигідроізоіндол-2-іл)піперидин-2,6-діону (2,5 г, 8,56 ммоль) у ТНЕ (60 мл) додавали трифенілфосфін (на полімерній основі 1,6 ммоль/г, 12 г, 18,8 ммоль). Суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 15 хвилин. Додавали дізопропілазодикарбоксилат (3,96 мл, 18,8 ммоль) при 02С, і суміш перемішували при 020 протягом 30 хвилин. Додавали (4-морфолін-4-ілметилфеніл)метанол (2,62 г, 12,4 ммоль) при 02С, ії суміші дозволяли нагрітися до кімнатної температури і її перемішували при кімнатній температурі протягом ночі. Реакційну суміш фільтрували і фільтрат концентрували. Отримане масло очищали на колонку із силікагелем, що елюювали метиленхлоридом і метанолом (градієнт, продукт виходив при 6 9о метанолі) з одержанням метилового складного ефіру 4- карбамоїл-4-І(І4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3-дигідроіїзоіндол-2-іл|масляної кислоти (2,2 г, вихід - 54 95). Продукт використовували на наступній стадії без подальшого очищення.
Стадія 2: До розчину метилового ефіру 4-карбамоїл-4-(4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)- 1-оксо-1,3-дигідроіїзоіндол-2-іл|масляної кислоти (2,2 г, 4,57 ммоль) у (50 мл) додавали трет- бутоксид калію (0,51 г, 4,57 ммоль) при 02С. Суміш перемішували при 02С протягом 10 хвилин і гасили 1 н. НСІ (5 мл, 5 ммоль), а потім насиченим МанНсоз (25 мл). Суміш екстрагували ЕЮАсС (2х50 мл). Органічний шар промивали водою (30 мл), насиченим сольовим розчином (30 мл), сушили над Мо5О5» і концентрували. До отриманої твердої речовини додавали ЕЮАс (10 мл), а потім гексан (10 мл) при перемішуванні. Суспензію фільтрували з одержанням 3-(4-((4- (морфолінометил)бензил)оксі)-1-оксоізоіндолін-2-ілупіперидин-2,6-діону у вигляді білої твердої речовини (1,5 г, вихід 73 965). ВЕРХ: Умаїег5 Зуттеїгу Стів, 5 МКМ, 3,9х150 мм, 1 мл/хв, 240 нМ, градієнт до 95/5 ацетонітрилу/0,1 95 НзРОх протягом 5 хв: 154,78 хв (97,5 95); т.пл.: 210-2122С;1Н
ЯМР (ДМСО-йв) 5 1,86-2,09 (м, 1Н, СНН), 2,29-2,38 (м, 4Н, СНео,СН»), 2,44 (дд, 9У-4,3, 13,0 Гц, 1Н,
СНН), 2,53-2,64 (м, 1Н, СНН), 2,82-2,99 (м, 1Н, СНН), 3,46 (с, 2Н, СНг), 3,52-3,61 (м, 4Н,
СНае,СнН»), 4,18-4,51 (м, 2Н, СН»), 5,11 (дд, У-5,0, 13,3 Гц, 1Н, МОН), 5,22 (с, 2Н, СН»), 7,27-7,38 (м, 5Н, Аг), 7,40-7,53 (м, ЗН, Аг), 10,98 (с, 1Н, МН) С ЯМР (ДМСО-ав) б 22,36, 31,21, 45,09, 51,58, 53,14, 62,10, 66,17, 69,41, 114,97, 115,23, 127,64, 128,99, 129,81, 129,95, 133,31, 135,29,
137,68, 153,50, 168,01, 170,98, 172,83; | СМ5: 465; Аналітично обчислено для С25Нг7МзО5--0,86
НО: С, 64,58; Н, 6,23; М, 9,04; Знайдено: С, 64,77; Н, 6,24; М, 8,88. (5)-3-(4-(4-(морфолінометил)бензил)оксі)-1-оксоізоіндолін-2-іл)піперидин-2,б-діон і (К)-3-(4- ((4-(морфолінометил)бензил)оксі)-1-оксоізоіндолін-2-іл)іпіперидин-2,6-діон одержували з 3-(4-((4- (морфолінометил)бензил)оксі)-1-оксоізоіндолін-2-ілупіперидин-2,6б-діону за допомогою хірального поділу. Й 8.2 ПРИКЛАД 2: ЕФЕКТ НА ЕКСПРЕСІЮ ФАКТОРІВ ТРАНСКРИПЦІЇ НА МОДЕЛІ
ДИФЕРЕНЦІЮВАННЯ ПЕРВИННИХ В-КЛІТИН ЛЮДИНИ
У цьому прикладі оцінювали ефект (5)-3-(4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3- дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,6-діону (досліджувана сполука) на експресію факторів транскрипції, що контролюють диференціювання плазмоцитів, і продукцію імуноглобулінів, з використанням культуральної системи для диференціювання В-клітин людини іп міїго.
У цьому прикладі використовують наступні скорочення:
Скорочення або спеціальний термін
ВСІ 6 Білок В-клітинної лімфоми 6
ВІІМР-1 Білок індукованого В-лімфоцитами дозрівання 1
ЕЮН
Ембріональна теляча сироватка пиуде;е) Диметилсульфоксид
ІВЕ-4 Регулюючий інтерферон фактор 4
Середня інтенсивність флуоресценції
РАХ5 Білок парного боксу Рах-5 хХВР-1 Зв'язуючий Х-бокс білок 1 50 мл лейкоцитарної плівки від здорових донорів одержували від Віоса Сепіег ої Мем Уегзеу.
Зразки РВМС при вовчаку 5І Е одержували від Сопмегзапі Віо (НипівміПе, АІарбата 35806).
У даному дослідженні використовували наступні реагенти для культивування клітин.
Вид продукту
Середовище Дульбекко, модифіковане за способом сков
Ембріональна теляча сироватка
Трансферин людини пеніциліністрептоміцин
Рекомбінантний 1-2 людини А а О бузіет5
Рекомбінантний 1-6 людини А а О бузіет5
Рекомбінантний 1-10 людини А а О бузіет5
Рекомбінантний 1-15 людини А а О бузіет5
СО40-ліганд/ТМЕЗЕ5/ мічений гістидином А а О бузіет5
Мічене полігістидином Ідсе1-антитіло миші А а О бузіет5
ОМ 2006: літанд ТІСНО людини
Інтерферон-альфа А людини РВ іпіенегоп зоигсе
У проточно-цитометричному аналізі використовували наступні реагенти.
Вид продукту
ЕІТО-антитіло проти СО19 людини ІВО Рпагтідеп
ЕІТО-антитіло проти СО20О людини ІВО Рпагтідеп
РЕ-антитіло проти СО27 людини ІВО Рпагтідеп
РЕ-антитіло проти СОЗ38 людини ІВО Рпагтідеп
АРбС-антитіло проти СОЗ8 людини ІВО Рпагтідеп
ЕІТО-антитіло проти ізотипу ІЧДС1К миші ІВО Рпагтідеп
РЕ-антитіло проти ізотипу (ДСК миші ІВО Рпагтідеп
ЕІТО-антитіло проти ізотипу ІДС2БК миші ІВО Рпагтідеп
АРС-антитіло проти ізотипу ІЧС1К миші ІВО Рпагтідеп
Буфер для забарвлення ІВО Рпагтідеп
Для КТ-ПЛР використовували наступні праймери для генів:
Вид продукту
Аналіз експресії гена АІСОА Арріїєа Віозубвієт
Аналіз експресії гена ВСІ 6 Арріїєа Віозубвієт
Аналіз експресії гена САРОН Арріїєа Віозубвієт
Аналіз експресії гена ІС Арріїєа Віозубвієт
Аналіз експресії гена ІКЕ4 Арріїєа Віозубвієт
Аналіз експресії гена РАХ5 Арріїєа Віозубвієт
Аналіз експресії гена РКОМ1 Арріїєа Віозубвієт
Аналіз експресії гена ХВР1 Арріїєа Віозубвієт
Набір для зворотної транскрипції Арріїєа Віозузівт
Арріїео Віовувієт 7.21 Очищення ПРВМС
П'ятдесят мл лейкоцитарної плівки людини розподіляли аліквотами по 25 мл у дві 50-мл конічні пробірки і в кожну конічну пробірку додавали 25 мл стерильного НВЗ5. Вміст пробірок ретельно перемішували перекиданням. П'ятдесят мл РісоїП-Радие Різ (СЕ Неайнсаге (розташування); каталожний номер Ж 17-1440-02) кімнатної температури розподіляли аліквотами в 50-мл конічні пробірки. Потім обережно і повільно нашаровували 25 мл суміші лейкоцитарна плівка/НВ55 над Рісоїї. Зразки центрифугували при 450 об./хв. протягом 35 хвилин. Верхній шар, що містив плазму, відбирали піпеткою і відкидали. Поверхню контакту, що містила мононуклеарні клітини, переносили в дві 50-мл конічні пробірки. Обидві конічні пробірки заповнювали до загального об'єму 50 мл за допомогою НВ5З5 і центрифугували при 1200 об./хв. протягом 10 хвилин. Клітини знову промивали в НВО5 і центрифугували при 1000 об./хв. протягом 10 хвилин. Клітинний осад ресуспендували за допомогою 20 мл середовища для В- клітин (середовище Ісков ї- 10 95 РЕВ5, 1 95 Р/5, і 5 мкг/мл інсуліну людини) і підраховували на цитометрі. 7.2.2 Збільшення вмісту СО19-В-клітин
Очищені РВМС підраховували і розподіляли аліквотами в кількості 2х108 клітин на пробірку.
Клітини центрифугували при 1200 об./хв. протягом 5 хвилин, а потім супернатанти відкидали.
Клітини ресуспендували в 4 мл буфери Кобозер (5(етсеї! ТесппоЇодіе5, каталожний номер ж 20104) і переносили в 14-мл полістиролову круглодонну пробірку (ВО, каталожний номер Ж 352057) і добре перемішували. Потім додавали 200 мкл коктейлю для збільшення вмісту В- клітин людини (ЗіетсСеї! ТесппоЇодіех, каталожний номер Ж 19054). Зразки струшували на пристрої для струшування і інкубували при кімнатній температурі протягом 10 хвилин. Далі в пробірку додавали 300 мкл магнітних частинок Еазузер (підданих струшуванню на пристрої для струшування) (5іетсСеї! ТесппоЇодіех, каталожний номер Ж 19054). Зразки струшували на пристрої для струшування і інкубували при кімнатній температурі протягом 5 хвилин. Після інкубації протягом 5 хвилин у пробірку додавали 5 мл буфера Кобозер і добре перемішували піпетуванням нагору і вниз. Пробірку відразу поміщали в магніт 5біїмег тадпеї (5іетсеїЇ
Зо
ТесппоЇодіеєх, каталожний номер Ж 19054) і інкубували при кімнатній температурі протягом 5 хвилин. Після інкубації одним безперервним рухом магніт і пробірку перевертали і виливали бажану фракцію в 50-мл конічну пробірку. Ці методики повторювали для РВМС (на один донора), що залишилися, і поєднували. Об'єднану фракцію центрифугували при 1200 об./хв. протягом 5 хвилин, а потім супернатанти відкидали і клітини ресуспендували в 5 мл середовища для В-клітин. Виділені СЮО19-- клітини підраховували на цитометрі. 7.2.3 Аналіз диференціювання В-клітин
Стадія 1 - Активація В-клітин - з 0 доби по 4 добу: одержували свіжий коктейль В-клітин шляхом додавання 50 мкг/мл трансферину людини в середовище для В-клітин. (Середовище
Ісков-10 95 РЕВ5Б, 1 95 Р/5, і 5 мкг/мл інсуліну). Фільтрували об'єм середовища, необхідний для експерименту, через 0,22-мкМ фільтр. До клітин додавали коктейль для диференціювання В- клітин (кінцева концентрація): рекомбінантний 1-2 людини (20 О/мл), ІІ -10 (50 нг/мл), 1-15 (10 нг/мл), СО40-ліганд/ МЕЗЕ5/мічений гістидином (50 нг/мл), мічене полігістидином Ідс1-антитіло миші (5 мкг/мл) і ОМ 2006-ліганд ТІ КЗ людини (10 мкг/мл). П'ять мілілітрів (1х105/мл) СО19--8- клітин додавали в кожен осередок планшета з 6-комірками з плоским дном (кінцева кількість клітин - 5х105/ямка). У кожну досліджувану комірку додавали п'ять мкл (1х)х сполука/ДМмМСО (кінцева концентрація ДМСО - 0,1 95) і інкубували при 372 протягом 4 діб.
Стадія 2 - Одержання плазмобластів - з 4 доби по 7 добу: клітини збирали і підраховували на цитометрі; аліквоту витягали для проточного аналізу, інші клітини промивали РВ5. Готували свіжий коктейль В-клітин шляхом додавання 1 мкг/мл трансферину людини в середовище для
В-клітин. (Середовище Ісков 10 95 РЕВ5, 1 95 Р/5, і 5 мкг/мл інсуліну людини). Фільтрували необхідний об'єм середовища, необхідний для експерименту, через 0,22-мкМ фільтр. До клітин додавали коктейль для диференціювання В-клітин (кінцева концентрація): рекомбінантний 1-2 людини (20 О/мл), 1-10 (50 нг/мл), 1-15 (10 нг/мл), 1-6 (50 нг/мл). Додавали свіжий коктейль В- клітин і клітини переносили назад у вихідні комірки й об'єм доводили назад до 5 мл. П'ять мкл (Іх) 5 сполука/ДМСО додавали в кожну досліджувану комірку (кінцева концентрація ДМСО - 0,1 95) і інкубували при 3720 протягом 4 діб.
На 7 добу клітини збирали і підраховували на цитометрі. Потім клітини розділяли для проточного аналізу і клітини, що залишилися, лізували буфером КІТ і зберігали при -8020 для екстракції РНК і експресії генів. Супернатанти розподіляли аліквотами і заморожували при -2020 для аналізів імуноглобулінів. 7.2.4 Одержання вихідних розчинів і розведень досліджуваних сполук
Досліджувані сполуки зважували і розчиняли в стерильному 10095 ДМСО (диметилсульфоксид; Кезеагсп Огдапіс5, Сіемеапа, ОН) для одержання 40 мМ вихідного розчину. Розведення 40 мМ вихідного розчину використовували в аналізі для одержання кінцевих концентрацій досліджуваних сполук, виходячи зі схеми експерименту. 7.2.5 Екстракція РНК і експресія генів
Диференційовані В-клітини (див. абзаци (002261-(002271Ї) збирали для одержання загальної рибонуклеїнової кислоти (РНК) за допомогою пристрою для екстракції РНК Оіасибе (Оіадеп,
МаїІепсіа, СА) з використанням наборів з мініцентрифугальними колонками ОІАСЕМ ЕМеаву.
Очищену РНК піддавали зворотній транскрипції в КДНК за допомогою термоциклера (МУ
Кезеагсі; Іпс., 5. Вгипо, Оцебес, Канада) з використанням набору зі зворотною транскриптазою (Арріїєйд Віозувєіетв5). Аналіз експресії генів проводили з використанням системи 7500 ЕТ-РСВ 5уяет (Арріїеєй Віозузіетв5) у трьох екземплярах. Для кожного зразка досліджували контроль аналізу у вигляді експресії гена гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази, і його використовували як контроль для нормалізації Для кожного гена зразки в кожному експерименті нормалізувовали до обробки тільки 0,1 95 ДМСО для цього конкретного моменту часу.
Супернатанти (з абзацу І00228Ї) збирали й аналізували за допомогою ЕГІ5А відносно продукції да і (ДМ (2еріоМеїгіх Согр. Вийаїю, МУ). 1.2.6 Фенотипування клітин
Диференційовані В-клітини (див. абзаци 1002261--00227|Ї) збирали, підраховували і розподіляли аліквотами в кількості приблизно 1х105 клітин або менше на 4-мл пробірку. Клітини промивали 1х буфером для забарвлення. Далі клітини блокували 10 95 сироваткою людини/РВ5 протягом 20-30 хвилин. Після блокування клітини центрифугували протягом 5 хвилин при 1200 об./хв. і супернатанти відкидали. У 100 мкл буфера, що залишився, додавали 20 мкл різних антитіл ВО Ріаптідеп Пому згідно зі схемою експерименту. Клітини забарвлювали протягом 20- 30 хвилин при 42б0. Потім клітини промивали 2х буфером для забарвлення і супернатанти відкидали. Далі в пробірки додавали 500 мкл буфера для забарвлення або РВ5. Зразки відразу аналізували і поміщали на 420 на ніч. Клітини забарвлювали антитілом миші проти СО20 і 10) сорз38, С019 і 2027 людини, або відповідними ізотипічними контролями. Усі зразки аналізували з використанням проточного цитометра РАСзЗсСапіо, аналітичного програмного забезпечення
ЕАСс5ОЇма (ВО Віозсієпсе) і аналітичного програмного забезпечення ЕБіІом/о. 7.2.1 Аналіз життєздатності клітин
Для визначення кількості живих клітин В-клітини (див. абзаци (002261-(002271) забарвлювали 0,4 95 трипановим синім і живі клітини підраховували з використанням автоматичного цитометра
Соцпіев5 (Іпмігодеп) у дубльованих зразках.
Дані наносили на графік з використанням програмного забезпечення СгарпРай Ргіхт 5.0.
Величини ІСвто обчислювали з використанням нелінійної регресії, сигмовидної кривої доза- відповідь, що обмежує зверху до 100 95 і знизу до 095, допущення варіабельного нахилу.
Результати для досліджуваних сполук в аналізах (Ід виражали як відсоток інгібування щодо контрольних величин для ДМСО.
Досліджувана сполука залежним від дози чином знижувала відсоток СО20-СО038-- плазмобластів і збільшувала відсоток СО20-С2038- активованих В-клітин. Популяція плазмобластів (квадрант 1) складала 30,495 у контролі у вигляді ДМСО на 7 добу, і досліджувана сполука зменшувала популяцію до 27,3 9о у кількості 2 нМ, 2,1 95 у кількості 20
НМ, і 0,4 95 у кількості 200 нМ (фіг. 1). Досліджувана сполука знижувала життєздатність В-клітин у ході перших 4 діб культивування (фіг. 2). Ефект досліджуваної сполуки на експресію факторів транскрипції В-клітин і плазмоцитів показаний на фіг. 3. Ефект досліджуваної сполуки на продукцію Ідсї у культурах плазмобластів показаний на фіг. 4.
Досліджувана сполука залежним від дози чином і значно інгібувала експресію факторів транскрипції плазмоцитів: ІКЕ4, ВІГІМРІ, і ХВРІ1І. Досліджувана сполука збільшувала рівень фактора транскрипції В-клітин РАХ5. Ефект досліджуваної сполуки на експресію факторів транскрипції В-клітин і плазмоцитів показаний на фіг. 5А і 58.
Досліджувана сполука, помалідомід і леналідомід інгібують продукцію да з ІСво 0,0018 мкМ, 0,049 мкМ ії 0,32 мкМ, відповідно. Дані вказують на те, що досліджувана сполука є в 27 разів більш ефективною, ніж помалідомід, відносно інгібування продукції І(Чдсх у ході диференціювання плазмобластів. Ефект досліджуваної сполуки на продукцію Ідсї у культурах В-клітин на 4, 7 і 10 добу показаний на фіг. 6. Ефект досліджуваної сполуки, окремо й у комбінації з преднізолоном, на продукцію Ідсї диференційованими іп міго плазмобластами/плазмоцитами показаний на фіг. 7. Ефект досліджуваної сполуки на експресію СО20/СО038 у ході диференціювання В-клітин на 7 добу показаний на фіг. 8. Ефект досліджуваної сполуки на життєздатність клітин під час диференціювання плазмобластів показаний на фіг. 9.
У мононуклеарних клітинах периферичної крові виділених від пацієнтів із системним червоним вовчаком (5 Е) досліджувана сполука інгібувала продукцію да і ІМ з ІСво 3,2 НМ і 0,9
НМ, відповідно. Ці дані вказують на те, що досліджувана сполука має потенціал до інгібування диференціювання В-клітин у паросток плазмоцитів, і дозволяють припустити, що досліджувана сполука може бути придатною для лікування аутоїмунних порушень, таких, як 5ІЕ, що характеризуються надпродукцією аутоантитіл. Ефект досліджуваної сполуки на диференціювання і функцію В-клітин у клітинах РВМС пацієнта з 5ІЕ показаний на фіг. 10.
Ефект досліджуваної сполуки на продукцію до і (ДМ у нормальних клітинах РВМС і клітинах
РВМС пацієнта при 51 Е показаний у таблиці 1.
На фіг. 11А і 118 показаний ефект досліджуваної сполуки на продукцію до і ІЇЯМ людини, відповідно, у культурах В-клітин на 7 добу.
Таблиця 1
Ефективність інгібування продукції до і І(ДМ нормальними РВМС і РВМС при 5 Е
Ми ру ит
Пів НО ПОХОСНИ ПК НО 8.3 Приклад 3: Аналіз диференціювання В-клітин з використанням проточної цитометрії і лазерної скануючої цитометрії
Матеріали для культивування клітин: Збагачені нормальні В-клітини і мононуклеарні клітини периферичної крові (РВМС) пацієнта з 5І Е культивували в системі для диференціювання В- клітин іп міго із середовищем ІМОМ (Іпмігодеп) і 10 95 ЕС5, доповненим трансферином людини й інсуліном людини (5ідта), разом з коктейлем цитокінів. Досліджувану сполуку додавали в культуру на добу і 4 добу.
Протокол диференціювання В-клітин: збагачені В-клітини виділяли зі свіжої лейкоцитарної плівки (збагачені лейкоцитами одиниці кількості) за допомогою центрифугування в градієнті густини Рісої-Нурадцие з наступною інкубацією з набором для збільшення вмісту В-клітин людини з негативною селекцією ЕазузЗер (5іет сеї! Тесппоіодіє5). У короткому викладі, 2х108/мл
РВМС змішували з 4 мл буфера Кобозер і переносили в 14-мл полістиролову круглодонну пробірку. Додавали коктейль для збільшення вмісту В-клітин людини (200 мкл) на пробірку, струшували на пристрої для струшування і інкубували при кімнатній температурі протягом 10 хвилин. Додавали магнітні частинки Еазузер (300 мкл на пробірку), струшували на пристрої для струшування і інкубували при кімнатній температурі протягом 5 хвилин. У кожну пробірку додавали буфер Коброзер (5 мл) і добре перемішували піпетуванням нагору і вниз. Пробірки поміщали в магніт 5іїмег тадпеї і інкубували при кімнатній температурі протягом 5 хвилин.
Магніт і пробірку піднімали й одним безперервним рухом перевертали, виливаючи бажану фракцію в 50-мл конічну пробірку. Клітини центрифугували при 1200 об./хв. протягом 5 хвилин.
Супернатант зливали і додавали 5 мл свіжого середовища для В-клітин. Після підрахунку клітин аліквоту витягали для БЕАСбЗ-аналізу і клітини, що залишилися, використовували для культивування. СО19-В-клітини виділяли до 9595 чистоти при визначенні проточною цитометрією. Очищені В-клітини висівали в кількості 1х107 клітин/мл у стерильний б-ямковий планшет у кількості 5 мл на ямку. Усі культивування клітин проводили в середовищі ІМОМ (Іпмйгодеп) і 1095 РС5, доповненому трансферином людини й інсуліном людини (Зідта).
Активацію В-клітин, одержання РВ і одержання РС здійснювали на основі модифікованої системи іп мйго для диференціювання В-клітин у плазмоцити. Усі рекомбінантні цитокіни людини: 1-2, 1-4, 11 -6, 11-10, 1-15, ІМЕ-сх ії СО40І, ії тАБ проти полігістидину додавали на зазначених стадіях культивування. Різні концентрації досліджуваної сполуки (2, 20 і 200 нм) додавали в культуру на 0 добу і 4 добу. На 4 добу усі клітини після однієї і тієї ж обробки поєднували, клітини підраховували, відбирали клітини для ЕБАСб5-аналізу й одержання на цитоцентрифузі. Клітини, що залишилися, висівали в концентрації 2,5х105 клітин/мл у стерильний планшет з б комірками в кількості 5 мл на ямку. РВМС при 5 Е культивували протягом 7 діб в умовах, що прискорюють диференціювання плазмоцитів, як нормальні В- клітини.
Імунофенотипування для проточного цитометричного аналізу: клітини забарвлювали з використанням барвника для багатоколірної прямої імунофлуоресценції для проточно- цитометричного аналізу. Забарвлювання поверхні проводили перед фіксацією клітин і збільшенням їхньої проникності. Клітини (50 мкл; 1х105 клітин/мл у буфері для промивання, 2 95
ЕВЗ з 0,1 95 Мам3 у РВ5) використовували для кожного забарвлювання. Клітини забарвлювали ізотипічним контрольним тАб (1 мкг/105 клітин) і багатоколірними кон'югованим з РІТС тА проти СО20 і кон'югованим з РЕ тАБбБ проти СОЗ8, або кон'юговане з РегСР-Суб5.5 тАб проти ср44, кон'юговане з РЕ тАБб проти СО83 використовували для активованих В-клітин на 4 добу (б020-2038- клітини), і РВ на 4 добу і РВ на 7 добу (СО020-СО38 5), і іншого забарвлювання, що аналізували проточною цитометрією відповідно до інструкцій виробника. Внутрішньоклітинне забарвлювання білків-факторів транскрипції (ВСІ -6, ІВЕ-4, ВІ ІМР-1, РАХ-5 і ХВР-1) ї Іду проводили відповідно до рекомендацій виробників. Проточний цитометричний аналіз проводили за допомогою ЕАСЗСапіо з використанням ЕАСЗОїіма 6 (ВО Віозсіепсе5). Для аналізу даних використовували програмне забезпечення Ріом/о (Тгее Заг).
Одержання центрифугованих на цитоцентрифузі клітин із суспензії одиничних клітин і імунофлуоресцентне забарвлювання для іСуїе: одержували суспензію клітин, що містить не більше 0,5х105 клітин/мл, у РВ5, що містить 2 95 ЕВ5. Аж до 200 мкл цієї суспензії поміщали в кожну кювету і центрифугували при 800 об./хв. протягом З хв. Кювету і папір обережно відокремлювали без ушкодження свіжих центрифугованих на цитоцентрифузі клітин, а потім проводили або негайну фіксацію, або висушування. Нефіксовані центрифуговані на цитоцентрифузі клітини зберігали протягом максимум 2 діб при кімнатній температурі. Клітини на предметних стеклах фіксували зростаючими концентраціями ЕН і дозволяли їм висохнути перед забарвлюванням. Після блокування неспецифічного зв'язування нормальною сироваткою (той же вид, що й у вторинного антитіла), зрізи інкубували сумішшю наступних моноклональних антитіл у зволоженій камері в холодному приміщенні протягом ночі: (і) антитіло проти СОЗ8 людини як маркер плазмобластів, і (її) антитіла проти ВСІ -6, ІВЕ-4, ВІ ІМР-1, РАХ5 ії ХВР-1 для білків-факторів транскрипції. Після промивання предметні стекла інкубували протягом 1 год. при кімнатній температурі в темряві із сумішшю вторинних антитіл, що були індуковані у видах, що відрізняються (із двома різними флуорохромами, тобто АїЇеха Ріпог-488 і АІеха Ріпог-633). Потім предметні стекла промивали РВ5, піддавали контрастному забарвлюванню БАРІ протягом 20 хвилин при кімнатній температурі, покривали покривними стеклами з перешкоджаючим вицвітанню флуоресцентним закріплювальним середовищем, і закріплювали лаком для нігтів.
Предметні стекла зберігали в темряві при 420. Для виключення хибнопозитивних результатів, отриманих шляхом неспецифічного зв'язування вторинного антитіла, усі тканини обробляли подібним чином буфером, що заміняє первинне антитіло. Колір забарвлення антитілом визначали й аналізували кількість у зрізах тканин із використанням іСуїе.
Одержання зображень за допомогою лазерного скануючого цитометра і кількісний аналіз флуоресценції: двоколірне імунофлуоресцентне забарвлювання проводили на клітинах, що були піддані цитоцентрифугуванню на предметних стеклах (Суїозріп 4, Тпепто зсіепійіс), на основі стандартного способу ІНС. Одержання зображення і кількісний аналіз флуоресценції проводили з використанням лазерної скануючої цитометрії (кількісна візуалізуюча цитометрія іСух, СотриСуїє). Проводили два проходження (перше проходження для 488 і друге проходження для 405/633). Сканування низького розрізнення використовували для мозаїчного сканування і сканування високого розрізнення використовували для сканування й аналізу областей. У короткому викладі, предметне скло поміщали на столик І 5С і вибирали область для сканування. У І 5С використовувався аргоновий лазер, що діє при 5 мВт. Предметне скло сканували з використанням 20Х об'єктива. Клітини ідентифікували і відбирали шляхом визначення контуру синьої флуоресценції і мінімального розміру клітин, обумовленого шляхом забарвлювання БАРІ. Поріг виявлення клітин встановлювали для відбору одиничних клітин, виходячи з розсіювання світла вперед, представленого на точковому графіку площі клітин проти інтеграла розсіювання світла вперед. Події розсіювання світла лазера фіксували і використовували для визначення контуру одиничних клітин на зображенні дані сканування.
Розрізнення контуру здійснювалося для ядерної частини сканованої клітини, так щоб контурувалось приблизно 67 95 від загальної пікселізації розсіювання світла. Напруження зусилля детектора РМТ у зеленій і далекій червоній області були встановлені так, щоб під час сканування досягалося не більше 75 95 максимального насичення максимальних пікселів. Після встановлення області сканування предметне скло аналізували з використанням об'єктива 40Х.
Досліджували мінімум б областей сканування для кожного предметного скла. Створювали клітинну галерею шляхом переміщення клітин з кожного з основних піків гістограми інтегрованої флуоресценції в далекій червоній області. Морфологічну композицію переміщених клітин досліджували на контроль якості. Дані можна аналізувати або в інтегрованому логарифмічному режимі флуоресценції, або в лінійному максимальному піксельному режимі. Різні популяції клітин при скануванні І 5С оцінювали як відсоток і МРЇ, ї кількісного порівняння з контролями у 10) вигляді ДМСО.
Аналіз даних: поверхневі і внутрішньоклітинні молекули аналізували за допомогою проточної цитометрії на ГЕАСЗСапіо. Аналіз даних проводили за допомогою Ріом/о. Визначали колір забарвлювання антитілом і кількість аналізували в зрізах тканини з використанням іСуїе.
Різні популяції клітин при скануванні ЕСМ і Ї5С оцінювали як відсоток і МР Її, і кількісного порівняння з контролями у вигляді ДМСО. Дані виражали як середнє значення х 5ЕМ. Усі дані наносили на графік з використанням СгарпРай Ргізт 6.1 (сгарпРай Зоймаге; зап Оіедо, СА).
Статистичний аналіз проводили з використанням одностороннього АМОМА (критерій множинних порівнянь Даннетта) і парного І-критерію Стьюдента. Значимими вважали значення Р, які менші або дорівнюють 0,05.
В-клітини культивували з використанням модифікованої системи іп міго для диференціювання В-клітин у плазмоцити, як описано вище. Багатоколірні кон'юговане з РІТС тАб проти СО20 і кон'юговане з РЕ тАБб проти СОЗ38 використовували для активованих В-клітин на 4 добу (СО0204-С2038- клітини) і плазмобластів на 7 добу (РВ) (С020-СО38). Дані для З різних експериментів, що відповідають З донорам, представлені в таблиці 2. Результати показали, що досліджувана сполука мала значний ефект на диференціювання В-клітин у паросток плазмобластів/плазмоцитів. Вона збільшувала рівень активованих В-клітин і знижувала рівень плазмобластів, а також знижувала життєздатність клітин з плином часу (фіг. 12А і 128В).
Активовані В-клітини (СО20-С038- клітини), оброблені досліджуваною сполукою (20 нМ), не змінювалися значно між 4 добами: (57,9 95-11,595) і 7 добами (50,5 9028,6 95), однак досліджувана сполука значна збільшувала рівень активованих В-клітин порівняно з контролем у вигляді носія (ДМСО) на 4 добу (42,1 965:5-11,5 95, р«0,05) ії 7 добу (12,5 9625,7 95, р«0,05). Тим часом, досліджувана сполука значна знижувала рівень плазмобластів/плазмоцитів (СО20-
СОЗ8'к) на 4 добу (4,8 902,3 95) і на 7 добу (9,7 90ж5,4 95) порівняно з контролем у вигляді ДМСО (доба 4, 25,9 95-24 95 р«0,05; і доба 7, 54,8 95-5,0 95, р«0,001). Більше того: досліджувана сполука дозозалежним чином виснажувала популяцію клітин великого розміру (вікно рг) в аналізі диференціювання нормальних В-клітин (фіг. 13). Відсоток клітин великого розміру на 4 добу після обробки досліджуваною сполукою складав 31,2 95, 23,1 95 і 20,4 95 для обробок 2 нМ, 20 НМ і 200 нМ. Відсоток клітин великого розміру на 7 добу після обробки досліджуваною сполукою складав 34,9 925, 19,9 95 і 11,94 95 для обробок 2 нМ, 20 нМ їі 200 нМ. Порівняно з контролем у вигляді ДМСО, кількість складала 35,5 95 і 34,9 95 на 4 добу і 7 добу, відповідно.
Таблиця 2
Досліджувана сполука інгібує диференціювання плазмобластів 11111111 доба4/777/ | 0 Доба7ї шию 33331 вко Ж дко | ЖЕ пиуде;е) сполука пиуде;е) сполука
Пити свя | заваз | еко зм плазмобласти/плазмоцити, 90 25,952,4 4,852,3 54,8:55,0 9,75,4 т вою твою З евл/ мл клітини, 90 14,753,1 18,3ж5,5 22,855,1 2357,7 миши де | мета | швалі ие клітини, 90 42,151,5 57,9ж411,5 12,5:-5,7 50,528,6
Ефект досліджуваної сполуки на експресію факторів транскрипції В-клітин і плазмоцитів (ВСІ -6, ІВЕ-4, ВІ ІМР-1, РАХ5 ї ХВР-1) оцінювали способом проточної цитометрії. В-клітини культивували, як описано вище, і клітини збирали на 4 добу і 7 добу для імунофлуоресцентного забарвлювання. Спочатку клітини забарвлювали на СО20 і СО38, і після збільшення проникності клітин їх забарвлювали на ВСІ-6, ІВЕ-4, ВІ ІМР-1, РАХ5 і ХВР-1, а потім аналізували шляхом обмеження цільних лімфоцитів. Дані, для З експериментів, що є репрезентативними для З донорів, показані на фіг. 14. Результати показали, що досліджувана сполука (20 нМ) викликала зсув експресії факторів транскрипції в плазмобластах/плазмоцитах.
Вона значно знижувала експресію ІКЕ-4 (р-0,5), ВГІМР-1 (р«0,05) ії ХВР-1 (р«0,05) на 4 добу, але значно збільшувала ВСІ -6 (ре0,05) на 7 добу.
Лазерну скануючу цитометрію (іСуїе) використовували для кількісного аналізу з метою підтвердження результатів проточної цитометрії, описаних вище. В-клітини від нормальних донорів і РВМС від пацієнтів з 5І Е культивували, як описано в способі вище. Клітини збирали на 4 добу і 7 добу для осадження клітин способом цитоцентрифугування на предметні стекла, після чого проводили подвійне імунофлуоресцентне забарвлювання, як описано в розділі
"Способи". СО38 (зелений) експресувався плазмобластами/плазмоцитами, фактори транскрипції (червоний) ВСІ-6, ІВЕ-4, ВІ ІМР-1, РАХ5 або ХВР-1 локалізувалися спільно в цитоплазмі або ядрі. Ядро піддавали контрастному забарвленню БАРІ (синій). На 7 добу в зразках нормальних В-клітин порівняно з контролем у вигляді ДМСО досліджувана сполука (20
НМ) значно збільшувала експресію ВСІ -6 (фіг. 15А, р«0,01), знижувала експресію ІКРЕ-4 (фіг. 158, р«е0,001) ії ВГІМР-1 (фіг. 15С, р«е0,01) у всій популяції лімфоцитів, і значно збільшувала експресію ВСІ -6 (р«е0,05), знижувала експресію ІКЕ-4 (р«0,001), ВГІМР-1 (р«0,001) і РАХ-5 (фіг. 150, р«0,05) у СОЗ8'- плазмобластах/плазмоцитах. Були відсутні зміни ХВР-1 (фіг. 15Е) в обох клітинних популяціях. У РВМС пацієнтів БІ Е досліджували три фактори транскрипції: ВСІ -6,
ІВЕ-4 і ВГІМР-1. Дані показали, що досліджувана сполука мала подібну активність цих факторів транскрипції з клітинами здорових донорів. Досліджувана сполука дозозалежним чином і значно збільшувала експресію ВСІ-б, і інгібувала експресію ІКЕ-4 і ВІІМР-1 у СсОз8в- плазмобластах/плазмоцитах у РВМС, що диференціюються, пацієнта з 5ІЕ на 4 добу і 7 добу (фіг. 16).
З використанням тієї ж системи диференціювання В-клітин іп міго, далі досліджували активність досліджуваної сполуки відносно експресії СО44 і СО83 при диференціюванні В- клітин. Багатоколірне кон'юговане з РІТС тАбБ проти СО20, кон'юговане з РегСР Суб5.5 тАБ проти СО44 і кон'юговане з РЕ тАБб проти СО83 використовували для клітин на 4 добу і 7 добу.
Ефект досліджуваної сполуки оцінювали для З експериментів, що є репрезентативними для З донорів. Дані показали, що досліджувана сполука мала дозозалежним чином і значно знижену середню інтенсивність флуоресценції СО44 (МЕ!) (фіг 17, р«0,01) у зразках для диференціювання В-клітин на 7 добу, що було наслідком виснаження клітин СО20О"опОд4Аой (фіг. 18). Відсоток клітин СО20гоп/СОд44поп на 7 добу після обробки досліджуваною сполукою в концентрації 2 НМ, 20 нМ ії 200 нМ склав 18,4 95, 10,1 95 і 6,6 95, відповідно, порівняно з контролем у вигляді ДМСО, у випадку якого відсоток склав 22,2 95. Виснаження СО44 клітин може знижувати адгезію лейкоцитів. Досліджувана сполука також значна збільшувала загальну популяцію СО83-- клітин і підсилювала експресію СО83-- (фіг. 19). Відсоток СО83 клітин на 4 добу після обробки досліджуваною сполукою в концентрації 2 нМ, 20 нМ і 200 нМ склав 24,1 952,1 95, 40,2 90-3,6 96, 49,5 904,4 95 і 18,4 95. Відсоток СЮО83- клітин на 7 добу після обробки досліджуваною сполукою в концентрації 2 НМ, 20 нМ ї 200 нМ склав 16,3 963,3 95, 36,1 902-3,4 95 і 51,9 9020,5 95, порівняно з ДМСО, для якого цей відсоток склав 13,4 90:52,4 95 і 12,9 96ж23,3 на 4 добу і 7 добу, відповідно.
Високий рівень експресії ІдоУ-ланцюга в пацієнтів з ревматоїдним артритом (КА) прогнозує відсутність відповіді на ритуксимаб. Для оцінки того, чи має досліджувана сполука яку-небудь активність відносно продукції Іду, клітини також використовували для внутрішньоклітинного забарвлювання на Іду. Результати для трьох донорів показали, що досліджувана сполука дозозалежним чином і значно знижувала експресію Ід У-ланцюга в культурах для диференціювання В-клітин на 4 добу. Вона не тільки зменшувала кількість ІдуУ-позитивних клітин (4 доба, 20 нМ на рівні 8,4 901,5 95, 200 нМ на рівні 5,4 90--1,8 95; 7 доба, 20 нМ на рівні 13,2 96ж22,3 95 ії 200 нМ на рівні 7,2 95:2-1,3, відповідно, порівняно з контролем у вигляді ДМСО на рівні 13,1 905-1,5 95 ї 14,4 904,3 на 4 добу і 7 добу, відповідно), але також знижувала МРЇ Іду у позитивних клітинах (фіг. 20). Знижена продукція Ід), Ід і ІдДМ може бути потенційним маркером відповіді на досліджувану сполуку при таких захворюваннях, як КА. 8.4 Приклад 4: Ефект досліджуваних сполук на продукцію цитокінів і хемокінів у стимульованих антитілом проти СОЗ людини Т-клітинах
Цей приклад демонструє ефект (5)-3-І4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3- дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,6-діону, (К)-3-(4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3- дигідроізоіндо-2-іл|Іпіперидин-2,б-діону і 3-(4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3- дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,6-діону на продукцію цитокінів і хемокінів у стимульованих антитілом проти СОЗ Т-клітинах людини з використанням мультиплексної технології І итіпех.
Використовують наступні скорочення:
Скорочення Пояснення або визначення
ІС Інтерлейкін а-с5Е Гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор амМ-С5Е Гранулоцитарно-макрофагальний колонієстимулюючий фактор
ІЕМ-у Інтерферон-гамма тТМЕ-а Фактор некрозу пухлини-альфа
ВАМТЕ5 білок, регульований при активації, експресований і секретований нормальними Т-клітинами
У цьому дослідженні використовували наступні матеріали:
Середовище КРМІ-1640, доповнене 1095 ЕВ5, 100 одиниць/мл пеніциліну, 100 мг/мл стрептоміцину і 2 мМ Г-глутаміну (Се Тесппоодієв5)
Коктейль для збільшення вмісту Т-клітин людини Козейеберф (5гетсеїЇ, каталожний номер й 15061) 12-плексний набір для визначення цитокінів/хемокінів людини І иштіпех (Мійіроге, каталожний номер Ж МРХНОУТО-60ОК-12)
Пристрій Гитіпех І5100 (Мійіроге)
Антитіло проти СОЗ людини, клон ОКТЗ (еВіозсіепсе, каталожний номер Ж 16-0037-85)
Досліджувані сполуки одержували як вихідні 4 мМ розчини у ДМСО. Т-клітини виділяли з лейкоцитарної плівки способом негативної селекції з використанням коктейлю для збільшення вмісту Т-клітин КозецезЗерф за методиками виробника.
Усі 96-ямкові планшети попередньо покривали З мкг/мл антитіла проти СОЗ людини у 100 мкл їх РВ5 протягом 4 годин при 372С. Перед аналізом Т-клітин планшети промивали З рази повним середовищем КРМІ-1640. Потім Т-клітини висівали в попередньо покриті антитілом проти СОЗ планшети при густині 2,5х1095 клітин/ямка в 180 мкл повного середовища КРМІ-1640.
Клітини обробляли 20 мкл 10х титрованих досліджуваних сполук у концентрації 10, 1, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001 ї 0,00001 мкМ у двох екземплярах. Кінцеві концентрації ДМСО складали 0,25 95.
Планшети інкубували протягом 48 годин при 372С, 595 СО». Через 48 годин супернатанти збирали і досліджували за допомогою аналізу з мультиплексними цитометричними гранульними матрицями (СВА) відносно наступних цитокінів/хемокінів: 1-2, 1-3, 11 -5, 1-10, 11-13, 11-15, І - 17А, СМ-С5Е, 1-5, ІЄМ-у, ТМЕ-а і КАМТЕЗ.
Планшети СВА аналізували на пристрої І итіпех І5100.
Дані для кожного донора наносили на графік з використанням програмного забезпечення
СгарпРай Ргізт 5.0 і виражали як середнє значення в пг/мл ж ЗЕМ і 95 від контролю у вигляді
ДМСО 5 ЗЕМ.
Досліджувані сполуки продемонстрували імуномодулюючу активність у стимульованих антитілом проти СОЗ первинних Т-клітинах людини, що змінює продукцію декількох цитокінів і хемокінів. Вихідні рівні цитокінів і хемокінів, продукованих стимульованими Т-клітинами людини, інкубованими з носієм, представлені в таблиці З нижче.
Таблиця З
Вихідні рівні цитокінів і хемокінів
Цитокін/Хемокін Вихідна продукована кількість (пг/мл)
І -2 З1
І - 38
І/-5 27
І/-10 443
І/-13 205
І-17А 19
ОМ-С5Е 132
ІЕМ-у 1271
ТМЕ-а 411
ВАМТЕ5 314
Досліджувані сполуки підсилювали продукцію 1-2, 1-3, І -5, І/-10, 11-13, СМ-С5Е, ІЕМ-у,
КАМТЕ5З і ТМЕ-й у стимульованих Т-клітинах людини. Посилення продукції досліджуваними сполуками було в основному залежним від концентрації для більшості цитокінів і хемокінів, за винятком 1-10 і 1--5. Досліджувані сполуки підсилювали продукцію І--10 при більш низьких концентраціях, але інгібували посилення продукції І--10 при більш високих концентраціях.
Досліджувані сполуки підсилювали продукцію І/-5 в основному при одній концентрації з діапазону концентрацій, що збільшували продукції інших цитокінів. Порівняно з іншими цитокінами і хемокінами в контрольних клітинах продукувались відносно невеликі кількості 1І--2,
І -3, 1-5 ї І/-17А (таблиця 1). Продукція І/-17А не змінювалася значно досліджуваними сполуками. У стимульованих Т-клітинах людини не продукувались кількості, що піддаються вимірюванню, СЕ і 11-15. Ефект 3-(4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3- дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,6-діону на продукцію цитокінів і хемокінів у стимульованих антитілом проти СОЗ Т-клітинах людини, виражений як абсолютна продукована кількість і як відсоток від оброблених носієм контрольних клітин показаний на фіг. 21 і 22, відповідно. Ефект (8)-3-І4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3-дигідроіїзоіндо-2-іл|Іпіперидин-2,б-діону на продукцію цитокінів і хемокінів у стимульованих антитілом проти СОЗ Т-клітинах людини, виражений як абсолютна продукована кількість і як відсоток від оброблених носієм контрольних клітин, показаний на фіг. 23 і 24, відповідно. Ефект (5)-3-І4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)- 1- оксо-1,3-дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,б6-діону на продукцію цитокінів і хемокінів у стимульованих антитілом проти СОЗ Т-клітинах людини, виражений як абсолютна продукована кількість і як відсоток від оброблених носієм контрольних клітин, показаний на фіг. 25 і 26, відповідно. Пунктирна лінія позначає рівень, еквівалентний подвоєній вихідній продукції (ЕСгооб), на фіг. 22, 24 і 26. 8.5 Приклад 5: Протизапальна активність
Протизапальну активність 3-І(4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3-дигідроізоіндол- 2-іл|-піперидин-2,б-діону, (К)-3-(4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3-дигідроізоіндол- 2-іл|-піперидин-2,б-діону і (5)-3-(4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3-дигідроізоіндо-2- іл|Іпіперидин-2,6-діону досліджували в мононуклеарних клітинах периферичної крові людини (ПРВМС). Для визначення інгібіторної (посилюючої) концентрації ІСсо для сполук з метою одночасного визначення профілю прозапальних цитокінів/хемокінів ії І--10 (протизапальний цитокін) зі стимульованих ГРЗ РВМС здорової людини-донора використовували технологію
Гитіпех. 50 мл лейкоцитарної плівки здорових донорів одержували від Віоо4 Сепіег ої Мем/ Уегзеу (Еазі Огапде, Мем Уегзеу). Ліпополісахарид (штам)(каталожний номер Є І -1887) отримували від бідта. Мультиплексні набори з гранулами, з якими зв'язане антитіло, для технології І штіпех
ХМАР отримували від МійПіроге (ВіПегіса, Маззаспизейв) і комбінували в мультиплексний формат перед аналізом. 7.5.1 Очищення мононуклеарних клітин периферичної крові людини 50 мл лейкоцитарної плівки людини розподіляли аліквотами по 25 мл у дві 50-мл конічні пробірки і в кожну конічну пробірку додавали 25 мл стерильного НВЗ5. Вміст пробірок ретельно перемішували перекиданням. П'ятдесят мл РісоїІ-Радие Ріи5 (ЗЕ Неайсаге (розташування); каталожний номер й 17-1440-02) кімнатної температури розподіляли аліквотами в 50-мл конічні пробірки. Потім обережно і повільно нашаровували 25 мл суміші лейкоцитарна плівка/НВ5е5 над
Еісоїї. Зразки центрифугували при 450 об./хв. протягом 35 хвилин. Верхній шар, що містив плазму, відбирали піпеткою і відкидали. Поверхню контакту, що містила мононуклеарні клітини, переносили в дві 50-мл конічні пробірки. Обидві конічних пробірки заповнювали до загального об'єму 50 мл за допомогою НВ5З5 і центрифугували при 1200 об./хв. протягом 10 хвилин.
Клітини знову промивали в НВ5З5 і центрифугували при 1000 об./хв. протягом 10 хвилин.
Клітинний осад ресуспендували за допомогою 20 мл повного середовища КРМІ (АРМІ/5 Фо сироватка людини/1хреп/зігер/діи) і підраховували. 7.5.2 Обробка мононуклеарних клітин периферичної крові
Сто мкл (2х106/мл) ПРВМС додавали в кожну ямку 96-ямкового планшета з плоским дном (кінцева кількість клітин - 2х105/ямка) і інокулювали при 372С протягом 1 години. У кожну досліджувану ямку додавали двадцять мкл (1Ох) сполуки й у кожну контрольну ямку додавали двадцять мкл середовища, що містило 2,596 ДМСО (ДМСОЇкінцева - 0,25 95), і планшет інкубували протягом 1 години при 3720. Потім клітини стимулювали 80 мкл І РЗ5 у концентрації 2,5 нг/мл (І РЗІкінцева -1 нг/мл) і інкубували протягом 18 годин при 3720. 50 мкл супернатанта з кожної ямки переносили в З нові круглодонні 96-ямкові планшети і зберігали при -2020 для аналізу І штіпех. Для кожного зразка проводили дублювання ямки. 7.5.3 Аналіз І штіпех
Зразки супернатанта аналізували відносно цитокінів у мультиплексному форматі відповідно до інструкцій виробника (Міїїроге, ВіПегіса, Ма 01821) з використанням пристрою І итіпех І5100.
Аналізи І/-12 ї М-С5Е проводили в дуплексному форматі з використанням супернатантів у чистому вигляді, у той час як аналіз всіх інших цитокінів проводили в мультиплексному форматі з використанням супернатантів, розведених 1:20. Аналіз даних проводили з використанням програмного забезпечення Орзіагєе Веаайміем/у ІСво обчислювали з використанням нелінійної регресії, сигмовидної кривої доза-відповідь, обмеження зверху до 10095 і знизу до 0 95, допущення варіабельного нахилу. ЕСвзо були основані на обмеженні зверху сигмовидних кривих, що складає 246,9 95, що відповідає середньому посиленню 1ІІ--10, забезпеченому помалідомідом (контроль) при 10 мкМ і нижнього обмеження до 100 95. ІЇСбсо обчислювали з використанням
СгарпРай Ргізт м5.00. Дані відповідають середньому значенню ї- ЗЕМ (стандартна помилка середнього значення) для п (кількість дубльованих експериментів).
Як демонструють дані в таблиці 4 нижче і на фіг. 27, 29 і 31, досліджувані сполуки, головним чином, мали ефективність, що змінюється, відносно інгібування множини досліджених цитокінів,
П-6, 1-8, 1-18, СЄМ-С5Е, МОСС, МІР-Та, МІР-1Д ї ТМЕ-а. Також ці сполуки підсилювали продукцію
І--10, МОР-1 і КАМТЕЗ з різною ефективністю, як описано в таблиці 5 і на фіг. 28, 30 і 32.
Таблиця 4
Узагальнення профілю інгібування цитокінів досліджуваними сполуками
ІСво (МКМ) ІСво (МКМ) ІСво (МКМ)
Таблиця 5
Узагальнення профілю цитокінів - середнє значення 95 від контролю при 0,1 мкм (95 від контролю) (95 від контролю) (95 від контролю) 8.6 Приклад 6: Ефект на функцію природних кілерів (МК) у відсвіт на да /ритуксимаб
У цьому прикладі досліджували здатність досліджуваних сполук підсилювати функцію МК- клітин людини у відповідь на ІдсСуритуксимаб. Імуномодулюючу активність досліджуваних сполук порівнювали в двох аналізах функцій природних кілерів (МК): (1) індукована Ідс і 1-2 продукція інтерферон-гамма (ІЕМ-у).
Нижче надані використані в дослідженні матеріали і їхні джерела:
Лейкоцитарна плівка здорових добровольців (Віосйа Сепіег ої Мему/ Уегзеу)
Еісо!-Нурадне Різ (Різпег Зсіепійіс Со І І.С, РА, каталожний номер Ж 17144002)
Середовище КРМІ-1640, доповнене 1095 ЕВ5 (ембріональна теляча сироватка), 100 одиниць/мл пеніциліну, 100 мг/мл стрептоміцину, і 2 ММ І--глутаміну (Іпмігодеп, каталожний номер 2 21870-076)
Середовище КРМІ-1640 (без фенолового червоного), доповнене 10 95 ЕВ5, 100 одиниць/мл пеніциліну, 100 мг/мл стрептоміцину, і 2 ММ І--глутаміну (Іпмігодеп, каталожний номер 2 11835-030)
Ритуксимаб (ритуксан, Коспе, Іпс.) (каталожний номер Мо СІМ 02241927, Мо партії В50177)
АВ. сироватка людини (Сетіпі Віо Ргодисі5, СА, каталожний номер Ж 100-512)
Набір для нерадіоактивного аналізу цитотоксичності СуюТох 96 Моп (Рготеда, УМ, каталожний номер Ж 51780)
Коктейль для збільшення вмісту МК-клітин людини (5іет СеїЇ Тесппоіодіеєх, Мапсоцймег, ВС, каталожний номер 2 15065)
Антитіло миші проти СО5б- людини, кон'юговане з АРС (ВО Віозсіепсе5, СА, каталожний номер Ж 555518)
Імуноглобулін С людини (ІдС) із сироватки (Зідта, 51. І оці5, МО; каталожний номер 2 12511- 1оМа)
Рекомбінантний ІІ -2 людини (КО Зухіетв5, ММ, каталожний номер 2 202-1Ї -050/СЕ)
Набір для ЕГІ5ЗА на ІЕМ-гамма людини (ТПпепторРїізпег, каталожний номер 2 РІЕНІЕМО5)
Використовували наступні клітинні лінії:
Подібні до активованих В-клітин - дифузна крупноклітинна В-клітинна лімфома (АВС- рІ ВС): клітини Кіма (МСІ, МО)
Подібні до В-клітин зародкового центра - дифузна крупноклітинна В-клітинна лімфома (5СВ- рІ ВС):
М/5И-ОІ С12 (СеІдепе Зідпа!, СА)
ЕРагаде (АТОС, МА)
Фолікулярна лімфома: ООоННаІ (05442, Німеччина)
Лімфома Беркіта (ВІ): Каїї (АТСС, МА).
МК-клітини від здорових донорів виділяли з лейкоцитарної плівки крові за допомогою негативної селекції з використанням коктейлю для збільшення вмісту МК-клітин КозейебЗер (бієт СеїЇ ТесппоЇодіе5, Мапсоимег, ВС) перед центрифугуванням у градієнті густини з РісоїІ-
Нурадие (Ріхпег Зсіепійіс Со ІС, РА) відповідно до інструкцій виробника. СО56-МК-клітини виділяли до «-85 95 чистоти при визначенні проточної цитометрією (ВО Віозсіепсев5, СА). 7.8.1 Аналіз індукованої Іда продукції МК інтерферон-гамма (ІЕМ-гамма)
Дев'яносто шести-ямкові плоскодонні планшети покривали 100 мкг/мл ІДС людини (Зідта) протягом ночі при 42С. Наступного дня ІдС, що не зв'язався, змивали холодним їх РВ5. Потім у покриті (ДС 96-ямкові планшети висівали МК-клітини в кількості 2х105 клітин на ямку в 180 мкл середовища КРМІ-1640 і додавали 10 нг/мл гп1ІІ -2 (К 85. ОО Зузіет5, ММ). Додавали досліджувані сполуки в об'ємі 20 мкл ДМСО. Кінцеві концентрації досліджуваних сполук складали 0,0001, 0,001, 0,01, 01, 1 або 10 мкм. Кінцеві концентрації ДМСО складали 0,25 95. Через 48 годин супернатанти збирали й аналізували за допомогою ЕГІ5А відносно продукції ІЕМ-у.
Дані, використані для визначення здатності досліджуваних сполук підсилювати продукцію
ІЕМ-у МК-клітинами у відповідь на стимуляцію іммобілізованим Ідсі і гпІЇ-2, аналізували для кожного донора з використанням програмного забезпечення СгарпРай Ргібт м5.0. Дані представлені двома способами: (1) як абсолютна величина продукованого ІЄМ-у (пг/мл 5 ЗЕМ), і (2) як відсоток від кількості ІЕМ-у, продукованого в присутності 1 мкМ помалідоміду. ЕС5о являє собою концентрацію досліджуваної сполуки, що забезпечує половину максимальної продукції
ІЕМ-у, при цьому максимальну продукцію визначають як кількість ІЕМ-у, продукованого в присутності 1 мкМ помалідоміду. Величини ЕСво обчислювали з використанням нелінійної регресії, сигмоїдальної кривої доза-відповідь, що обмежує зверху до 100 95 і знизу до 0 95, що допускає варіабельний нахил.
Таблиця 6
Рацемат 0,037 міМ
В-енантіомер 0,016 мМ о5-енантіомер 0,012 мкм
Досліджувані сполуки підсилювали продукцію МК-клітинами ІЕМ-у дозозалежним чином у відповідь на стимуляцію іммобілізованим Ідс і ІЇ-2. Результати для рацемату, К-енантіомера і
З-енантіомера, показані на фіг. 33-35 (виражені як пг/мл продукованого ІЕМ-у), відповідно. На фіг. 36-38 показані результати, виражені як відсоток продукованого на збільшеному рівні ІЕМ-у відносно ІЄМ-у, продукованого в присутності помалідоміду в концентрації 1 мкМ, для рацемату,
В-енантіомера і 5-енантіомера, відповідно. Кожна величина, нанесена на графік на фіг. 33-38, відповідає середньому значенню для 12-14 визначень х ЗЕМ. 8.7. Приклад 7: Аналізи проліферації ендотеліальних клітин судин людини, утворення трубки, міграції й інвазії
У цьому прикладі рацемат стосується 3-І4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3- дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,6-діону, К-енантіомер стосується // (К)-3-І(4-(4-морфолін-4- ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3-дигідроізоіндо-2-іл|Іпіперидин-2,б-діону і 5-енантіомер стосується (5)-3-І4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3-дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,б-діону.
Аналіз проліферації ендотеліальних клітин пуповинної вени людини: ендотеліальні клітини пупкових судин розможували і вирощували в середовищі ЕСМАО2 до 3-6 пасажу для всіх аналізів проліферації. Ендотеліальні клітини пупкових судин людини трипсинізували, промивали 20 95 середовищем ЕВ5/М199 і висівали в те ж середовище в кількості 107 клітин/100 мкл на ямку в 9б-ямкові планшети для культивування клітин. Планшети інкубували протягом ночі при 3726, щоб дозволити клітинам прикріпитися. Потім клітини піддавали голодуванню в середовищі 1 95
ЕВБ/М199 протягом 18 годин після промивання цим же середовищем З рази. Для оптимізації концентрації факторів росту в аналізі проліферації НОМЕС, 100 мкл/ямка 2х серійних розведень факторів росту, починаючи з 100 нг/мл, додавали до НОМЕС у двох екземплярах на 72 години при 372С в інкубаторі для культивування клітин зі зволоженням з 5595 СО». Для аналізу досліджуваних сполук проводили серійне розведення досліджуваних сполук у середовищі 0,4 95
ДМСО/ 95 ЕВ5/М199 у двох екземплярах з 10 мМ вихідних розчинів. До клітин додавали п'ятдесят мікролітрів на ямку серійних розведень досліджуваних сполук (10, 1,0,0,1,.0,01, 0,001, 0,0001, 0,00001 мкМ) на 1-2 години при 372С. Кінцева концентрація ДМСО в клітинах складає 0,195. Потім у кожну ямку додавали 50 мкл відповідних факторів росту в 4х кінцевої концентрації на 72 години при 372С в інкубатора для клітинної культури зі зволоженням з 5 95
СО». Включення тимідину вимірювали шляхом додавання в кожну ямку одного мікрокюрі ЗН- тимідину (Атегепат) у 20 мкл середовища і інкубували при 372С в інкубаторі для клітинної культури зі зволоженням з 5 95 СО» протягом 5-6 годин. Потім клітини трипсинізували і збирали у фільтруючі планшети Опігійег (Б/С (РегКіп ЕІтег) з використанням харвестера клітин (Тотіес). Після висушування планшетів повітрям додавали 20 мкл/ямка Місгозсіпі 20 (РаскКага), а потім планшети аналізували в ТорСошпі МХТ (РасКага). Кожну ямку підраховували протягом однієї хвилини. Експерименти проводили в двох екземплярах у кожного з З донорів.
Аналіз утворення трубки з ендотеліальних клітин пупкових судин людини: сполуки досліджували в аналізі індукованого факторами росту утворення трубки з НОМЕС. Планшети для утворення трубки інкубували при 372С протягом 30 хвилин для полімеризації матригелю.
НОМЕС піддавали голодуванню в основному середовищі ЕВМ2 з 0,1 95 ВБА протягом 5 годин після промивання тим же середовищем З рази. Клітини трипсинізували і центрифугували. Потім у планшети для утворення трубки, покриті матригелем, додавали 25 мкл 4х серійних розведень сполук (10, 1, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001, 0,00001 мкМ) у двох екземплярах з 50 мкл 2х107 клітин/ямка. У планшети додавали п'ятдесят мкл 4Х МЕСЕ (кінцева концентрація - 25 нг/мл) або
БЕСЕ (кінцева концентрація - 10 нг/мл). Потім клітини інкубували протягом ночі (18 годин) при 3720 в інкубаторі зі зволоженням. Мережі трубочок забарвлювали кальцеїном АМ у концентрації 4 мкг/мкл у 295 ЕВБ/НВЗ5 протягом 30 хвилин, і одержували зображення за допомогою флуоресцентної мікроскопії. Трубочки кількісно визначали за допомогою програмного забезпечення для визначення утворення трубок МейаМогриі, що обчислює площу трубок і довжину трубок.
Аналіз інвазії ендотеліальних клітин пупкових судин людини: в аналізі інвазії НОМЕС концентрацію фібронектину людини оптимізують для забезпечення придатної білкової структури для прикріплення клітин, що прикріплюються, до мембрани і забезпечення вільної міграції у відповідь на ангіогенний стимул (наприклад, МЕСЕ, БЕСЕ або НОБ) у нижній камері планшета зі вставкою. НОМЕС піддавали голодуванню в середовищі ЕВМ2 з 0,195 В5БА протягом 6 годин після промивання тим же середовищем З рази. Потім клітини трипсинізували і центрифугували для видалення трипсину, що залишився. Потім х0,5-1х106 клітин у 125 мкл/ямка і 125 мкл вх серійних розведень сполук (10, 1, 0,1, 0,01, 0,001 мкМ) додавали у верхню камеру 24-ямкових і 9б-ямкових планшетів із вставкою ВО Раісоп у двох екземплярах і інкубували протягом «1-2 годин. (Планшети містять блокуючу флуоресценцію мікропористу розмір пор - 3,0 мкМІ мембрану РЕТ, що рівномірно покрита фібронектином людини). Потім у нижню камеру додавали сімсот п'ятдесят мікролітрів 1,33х вихідного розчину МЕСЕ (кінцева концентрація - 25 нг/мл), БЕСЕ (кінцева концентрація - 10 нг/мл) або НОБЕ (кінцева концентрація - 25 нг/мл). Клітини інкубували протягом 22-41 години при 372б. Клітини, що мігрували, забарвлювали кальцетном АМ у концентрації 4 мкг/мл у НВ5О5, що містила 2965 ЕВ5, з використанням 500 мкл/ямка в 24-ямкових планшетах і 200 мкл/ямка в 96-ямкових планшетах.
Планшети інкубували при 372С протягом 90 хвилин і зчитували в пристрої для зчитування флуоресценції планшетів.
Процентне інгібування проліферації клітин, утворення трубки, міграцію й інвазію обчислювали шляхом вирахування результату для контролю у вигляді ДМСО без стимуляції з результатів для досліджуваного зразка, усереднення для всіх реплік, ії нормалізації до стимульованого фактором росту контролю у вигляді ДМСО (0 95 інгібування). Величини ІСво обчислювали з використанням сгарпРаай Ргіхт 5.0.
Результати аналізу проліферації ендотеліальних клітин пупкових судин людини: результати дослідження з оптимізацією факторів росту показали, що оптимальні концентрації МЕСЕ, БЕОЕ і
НЄБЕ для індукції проліферації складали 25, 10 ї 25 нг/мл, відповідно. Досліджувані сполуки досліджували за допомогою оптимізованих концентрацій факторів росту, і результати показали, що рацемат, 5-енантіомер і К-енантіомер не інгібували індуковану МЕСЕ, БЕСЕ або НОЕ проліферацію НОМЕС (фіг. 39). Однак відбувалося посилення проліферації, що спостерігається у випадку оброблених МЕСЕ і НОЕ НОМЕС, за допомогою 5-енантіомера (оброблені МЕСЕ: 1-10
МКМ; оброблені НОР: 0,1-1 мкМ). Також відбувалося значне посилення, що спостерігається в оброблених БЕОЕ НИОМЕС, за допомогою рацемату (0,01-1 мкМ) і К-енантіомера (0,1-1 мкМ).
Величини ІСво узагальнено представлені в таблиці 7.
Таблиця 7
Узагальнення величин ІСвзо з досліджень індукованої факторами росту проліферації ендотеліальних клітин пупкових судин людини сполуки ІСво (мкм) ІСво (мкМ) ІСво (мкМ) о Рацемат/ | 777777 5100/ ЇЇ 7777771717171717179911111111 11111124
Результати аналізу утворення трубки з ендотеліальних клітин пупкових судин людини: досліджувані сполуки виявляли тенденцію відносно інгібування індукованого МЕСЕ утворення трубки НОМЕС з погляду як довжини трубки, так і площі трубки (фіг. 40). Усі сполуки продемонстрували дозозалежний ефект на індуковане МЕСЕ утворення трубки НОМЕС. Б- енантіомер продемонстрував значне інгібування (р«0,05 проти стимульованого контролю у вигляді ДМСО) площі і довжини трубки при 10 мкМ. Також існувала тенденція до інгібування індукованого БЕСЕ утворення трубки НОМЕС з погляду як довжини трубки, так і площі трубки (фіг. 40), хоча цей ефект були менш вираженим, ніж ефекти на індуковане МЕСЕ утворення трубки НОМЕС.
Результати аналізу інвазії ендотеліальних клітин пупкових судин людини: 3-(4-(4-морфолін- 4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3-дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,б-діон, / (К)-3-(4-(4-морфолін-4- ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3-дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,б-діон і / (5)-3-І(4-(4-морфолін-4- ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3-дигідроізоіндо-2-іл|Іпіперидин-2,6б-діон значно інгібували індуковану МЕСЕ, БЕСЕ ії НОЕ інвазію НОМЕС дозозалежними чином (фіг. 41). Сполуки були більш ефективними проти індукованої МЕСЕ і ВЕС інвазії НОМЕС, ніж проти індукованої НОГ інвазії НОМЕС (таблиця 8). Величина ІСво складала «0,3 НМ для інгібування індукованої МЕСЕ інвазії НОМЕС досліджуваними сполуками. ІСво рацемату (0,4 нМ) і 5-енантіомера («0,1 нМ) більш ніж у десять разів перевищувала ІСво В-енантіомера (13 нМ) (таблиця 8).
Таблиця 8
Узагальнення ефектів досліджуваних сполук на індуковану факторами росту інвазію ендотеліальних клітин пупкових судин людини
Сполуки величини ІСво (МКМ) величини ІСво (МКМ) величини ІСво (МКМ) 8.8 Приклад 8: Дослідження на моделі вовчака/фіброзу на мишах
У цьому прикладі досліджували чутливість до (5)-3-(4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)- 1- оксо-1,3-дигідроізоіндо-2-іл|Іпіперидин-2,6-діону в двох схильних до вовчака лініях мишей: модель системного червоного вовчака на мишах МАК /Мру-Равірг/) і модель системного червоного вовчака на мишах МАВУМЕ1/). Досліджувану сполуку вводили в обох моделях у кількості ЗО мг/кг.
На моделі системного червоного вовчака на мишах МК /Мру-Равірг/у, В-клітини периферичної крові продемонстрували відсутність змін на 4 тижні. В-клітини селезінки продемонстрували 3795 збільшення, і рівень аутоантитіл проти дволанцюжкової ДНК продемонстрував 25 95 зниження на 4 тижні.
На моделі системного червоного вовчака на мишах МАВУМЕ1/) В-клітини периферичної крові продемонстрували 25 95 зниження на 4 тижні, В-клітини селезінки продемонстрували відсутність змін, і рівень аутоантитіл проти дволанцюжкової ДНК продемонстрував 86 905 збільшення на 4 тижні. 8.9 Приклад 9: Дослідження на моделі фіброзу шкіри на мишах
У цьому прикладі (5)-3-(4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3-дигідроізоіндо-2- іл|піперидин-2,6-діон досліджували на моделі індукованого блеоміцином фіброзу шкіри з використанням як профілактичних, так і терапевтичних режимів дозування. Блеоміцин є застарілим терапевтичним засобом проти злоякісної пухлини, що, як було показано, викликає фіброз легень. У моделях на тваринах він аналогічним чином індукує ушкодження і фіброз в області доставки.
У цьому прикладі використовують наступні скорочення:
11110100 | дозуванняодинразнадобу./:7/7/://|С2фЩфИ
У цьому дослідженні використовували мишей ОВА/2. У дослідженні використовували вісім тварин на групу введення. Мишей тримали в приміщенні для тварин у стандартних умовах з доступом до їжі і води без обмеження.
Носій, 0,5 95 карбоксиметилцелюлоза (СМС)/О,25 95 Туееп 80, готували в дистильованій НгО і розчиняли протягом ночі за допомогою магнітної мішалки (додавали 0,5 г СМС (Зідта ЖС9481) і 0,25 мл Тмееп 80 (Зідта ЖР8074) до 99,75 мл так, щоб одержати загальний об'єм 100 мл 0,5 95
СМС/0,25 95 Тмееп 80).
Порошок досліджуваної сполуки відважували і суспендували для одержання свіжої суспензії кожну добу в носії 0,5 95 СМС/0,25 95 Тмееп 80, щоб запобігти гідролізу лікарського засобу у водному середовищі. Сполука суспендувалась, але не розчинялася, у цьому носії. Сполуку гомогенізували за допомогою тефлонової товкачика і ступки (гомогенізатор тканин Ройег-
ЕІмепіет) з використанням механізованого гомогенізатора тканин Ебеграсі. Щодобова вихідна концентрація лікарського засобу, використовувана в цих дослідженнях, складала З мг/мл.
Блеоміцин одержували з аптеки Опімегейу ої Епапдеп-Мигетрбегд і свіжий розчин готували один раз на тиждень. Фіброз шкіри індукували в мишей ЮОВА у віці б тижнів за допомогою місцевих внутрішньошкірних ін'єкцій 100 мкл блеоміцину, розчиненого в 0,995 Масі, у концентрації 0,5 мг/мл раз на дві доби у визначених зонах площею 1,5 см? у верхній частині спини. 7.911 Схема дослідження
Модель індукованого блеоміцином фіброзу шкіри на мишах широко використовують для оцінки терапевтичних засобів проти фіброзу. У цій моделі індукують локалізований фіброз шкіри за допомогою внутрішньошкірних ін'єкцій блеоміцину раз на дві доби протягом З тижнів. Ця модель нагадує ранні запальні стадії 556. Для оцінки потенційних ефектів на профілактику фіброзу лікування починали одночасно з першою ін'єкцією блеоміцину. Для дослідження ефекту досліджуваної сполуки на профілактику індукованого блеоміцином фіброзу іп мімо введення проводили в наступних групах: - Контрольна група: внутрішньошкірна ін'єкція масі протягом З тижнів. Введення полягало у
З0 введенні носія (0,5 У6 СМС/0,25 ую Гиуееп 80). - Група блеоміцину без лікування: внутрішньошкірна ін'єкція блеоміцину протягом трьох тижнів. Введення носія (0,5 95 СМС/0,25 95 Гмуееп 80). - Група досліджуваної сполуки: Внутрішньошкірна ін'єкція блеоміцину протягом трьох тижнів.
Досліджувану сполуку вводили в дозі 30 мг/кг; п/о, 00. - Група позитивного контролю: Внутрішньошкірна ін'єкція блеоміцину протягом трьох тижнів.
Ін'єкція іматинібу (50 мг/кг; в/б, ОО). Раніше було показано, що іматиніб мезилат виявляє могутні антифібротичні ефекти при індукованому блеоміцином фіброзі шкіри. Див. АКптеї:Ппіпа А. еї аї.,
Ап Апеит 2009; 60(1):219-224.
Для оцінки регресії фіброзу використовували модифіковану модель індукованого блеоміцином фіброзу шкіри. Мишей попередньо навантажували блеоміцином для індукції стійкого фіброзу шкіри. В одній групі проводили введення досліджуваної сполуки, у той час як навантаження блеоміцином продовжували протягом додаткових трьох тижнів. Результат у цій групі порівнювали з мишами, яких навантажували блеоміцином протягом шести тижнів (профілактика подальшого прогресування), і з мишами, яких навантажували блеоміцином протягом трьох тижнів, а потім Мас! протягом додаткових трьох тижнів (індукція регресії). У дослідженні регресії використовували наступні групи: - Контрольна група: внутрішньошкірна ін'єкція МасСіІ протягом шести тижнів. Контрольне лікування складалося з введення носія. - Група блеоміцину 1 без лікування (регресія): внутрішньошкірна ін'єкція блеоміцину протягом трьох тижнів, а потім внутрішньошкірні ін'єкції Масі протягом додаткових трьох тижнів.
Лікування полягало у веденні носія. Група блеоміцину 2 без лікування (профілактика прогресування): внутрішньошкірна ін'єкція блеоміцину протягом шести тижнів. Лікування полягало у введенні носія. - Група досліджуваної сполуки: внутрішньошкірна ін'єкція блеоміцину протягом шести тижнів. Досліджувану сполуку вводили в дозі 30 мг/кг; п/о, ОО. - Група позитивного контролю: Внутрішньошкірна ін'єкція блеоміцину протягом шести тижнів.
Ін'єкція іматинібу (50 мг/кг; в/б, ОО) 7.9.2 Методика експерименту
Товщину шкіри визначали забарвленням гематоксиліном і еозином і активовані фібробласти визначали з використанням імуногістохімії на альфа-актин гладких м'язів (4-5МА). Товщина шкіри, обумовлена по модифікованому шкірному показнику Роднана, у даний час є найбільш розповсюдженим первинним результатом у клінічних випробуваннях у людини для протифіброзних засобів при 556. Зрізи шкіри забарвлювали гематоксиліном/еозином для кращої візуалізації структури тканини. Товщину дерми аналізували за допомогою мікроскопа
Мікоп Есіїрхсе 80і (Мікоп, Вадпоемедогр, Нідерланди) шляхом вимірюванню максимальної відстані між поверхнею контакту епідерма-дерма і поверхнею контакту дерма-підшкірний жир у 4 різних зрізах шкіри кожної миші. Оцінку проводили 2 незалежні дослідники.
Для кількісного визначення міофібробластів зрізи шкіри депарафінізували і інкубували з 5 95 бичачим сироватковим альбуміном протягом 60 хвилин. Клітини, позитивні по а-5МА, визначали шляхом інкубації з моноклональними антитілами проти а-5МА (клон ТА4; 5Бідпта-Аїагісн,
Зіеіппеїт, Німеччина) протягом 2 годин при кімнатній температурі з наступною інкубацією з З 95 пероксидом водню протягом 10 хвилин. Антитіла кози проти антитіл кролика, мічені пероксидазою хрону (ОЮаКо, Натбриго, Німеччина), використовували як вторинні антитіла.
Експресію а-5МА визуалізували за допомогою 3,3-діамінобензидину тетрагідрохлориду (Зідта-
Аїагісп). Як контролі використовували моноклональні ІдО-антитіла миші (СаІБбіоспет, Зап Оіедо,
СА).
Крім того, кількість колагену в шкірі вогнища ушкодження буде вимірювано за допомогою аналізу колагену ЗігСоЇї; РНК і плазму всіх мишей зберегли для подальших аналізів.
Досліджувана сполука значна зменшує товщину шкіри вогнища ушкодження на моделі індукованого блеоміцином фіброзу шкіри на мишах. Досліджувана сполука в дозі 30 мг/кг; п/о, зо Ор значно перешкоджала стовщенню приблизно на 25:20,49 95 (р«0,001, фіг. 42).
Репрезентативні мікрофотографії забарвлених гематоксиліном і еозином зрізів шкіри показані на фіг. 43. Товщину дерми оцінювали шляхом вимірюванню максимальної відстані між поверхнею контакту епідерма-дерма і поверхнею контакту дерма-підшкірний жир. Лінія між точками поверхні контакту демонструє відносну товщину в групах введення. 35 Для визначення ефекту введення на активацію фібробластів, с-5МА ж міофібробласти підраховували в зрізах ушкодженої шкіри. Як показано на фіг. 44, досліджувана сполука в дозі мг/кг; п/о, ОО, знижувала кількість міофібробластів на 24:3-0,09 95 (р«0,05). Іматиніб у дозі 50 мг/кг знижував стовщення шкіри на 60-0,34 95 (р«0,0001) і кількості міофібробластів на 81-0,11 95 (р-0,0001). 7.9.3 Ефект на регресію індукованого блеоміцином фіброзу шкіри
Інгібіторні ефекти досліджуваної сполуки на прогресування фіброзу також підтверджували в модифікованій моделі з блеоміцином, розробленої для дослідження можливої регресії фіброзу.
Як показано на фіг. 45, досліджувана сполука в дозі 30 мг/кг; п/о», ОО не мала ефекту на стовщення шкіри на моделі регресії. На фіг. 46 показані мікрофотографії репрезентативні забарвлені гематоксиліном і еозином зрізи шкіри. Товщину дерми оцінювали шляхом вимірювання максимальної відстані між поверхнею контакту епідерма-дерма і поверхнею контакту дерма-підшкірний жир. Лінія, проведена між точками поверхонь контакту, демонструє відносну товщину в групах введення. На фіг. 47 показано, що досліджувана сполука не мала ефекту на кількості міофібробластів. Іматиніб у дозі 50 мг/кг знижував індуковану блеоміцином 5о0 товщину шкіри на 50:50,3 95 (р«0,0001) і кількість міофібробластів на 78:0,15 95 (р0,0001). 8.10 Приклад 10: Ефект на моделі на мишах Т5К-1
Протифіброзні ефекти (5)-3-(4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)-1-оксо-1,3-дигідроізоіндо- 2-іл|піперидин-2,6б-діон на моделі на мишах їдні 5Кіп-1 (ТеК-1).
Спочатку досліджували інгібіторні ефекти сполуки на фіброз на моделі на мишах їїдні 5Кіп
Т5К-1. Як показано на фіг. 48, сполука в дозі 30 мг/кг знижувала підшкірне стовщення на 45 95 (р20,001), порівняно з 58 95 зниженням у випадку іматинібу в дозі 50 мг/кг (рх0,001). Оцінений вміст колагену в шкірі при вимірюванні за рівнем гідроксипроліну знижувався на 38 95 сполукою, і на 67 95 іматинібом (рх0,001).
Далі, для дослідження ефекту сполуки на надекспресію генів каскаду ТаЕ-В у шкірі мишей (610) Т5К-1 використовували ЗКТ-ПЛР для вимірюванню рівнів мРНК шести генів: СТОР, РАЇ-1,
СОЇТАТ, о-актин гладких м'язів (АЛЬФА-5МА), олігомерний білок хрящів 1 (СОМР), і ТОЕВІ1.
Надекспресію визначали як надлишок рівнів МРНК, що спостерігається в шкірі мишей Т5К-1, порівняно зі шкірою нормальних мишей ра/ра. Серед цих шести генів тільки чотири (СТОБЕ, РАЇ- 1, СОЇ1А1 ї ТОЕВІ1) надекспресувалися до значно більш високого рівня в Т5К-1 порівняно з нормальними мишами ра/ра. Сполука (30 мг/кг) значимо знижувала надекспресію СТОБЕ і
СОЇІ1А1 на 79 95 (р«х0,001) ії 129 95 (р«х0,001), відповідно (фіг. 49). Надекспресія генів РАЇ!-1 і
ТОРЕВІ1 не інгібувалася сполукою. Ці результати вказують на те, що сполука може знижувати фіброз шкіри шляхом блокування надекспресії деяких профібротичних генів у каскаді ТОИБ-В.
Для подальшого дослідження ефекту сполуки на експресію фібротичних генів у нормальних клітинах (МІ) і клітинах при системній склеродермії (55с), слідували наступним методикам:
Культивування клітин: Нормальні фібробласти шкіри людини і фібробласти шкіри при склеродермії культивували в ОМЕМ, що містить 10 95 ембріональну телячу сироватку (ЕВ5).
Клітини підтримували в інкубаторі з 5 95 СО», 95 95 повітря при 372С. Після досягнення змикання моношару клітини збирали за допомогою 0,0595 трипсину і субкультивували. Клітини використовували на 3-5-ому пасажі.
Схема експерименту: клітини вирощували до змикання моношару на 70-80 95 і вводили в стан спокою шляхом зниження концентрації сироватки до 0,4 95 на ніч. Досліджували ефекти сполуки на фібротичні ефекти ТОЕР і на експресію фібротичних генів у клітинах Мі. і 556.
Ефекти на індукцію ТОВ експресії фібротичних генів: фібробласти Мі попередньо обробляли сполукою протягом 30 хвилин, а потім додавали ТОЕ-В1 для визначення ефектів сполуки на індуковану ТОЕВД експресію фібротичних генів.
Ефекти сполуки на 55Сс2-ЕВ: фібробласти 55Х обробляли сполукою в різних концентраціях і визначали рівні експресії генів колагену ТА1 (СОЇ11), с-актину гладких м'язів (а-З5МА), фібронектину (ЕМ), матриксної металопептидази 1 (ММР/І), інгібітору активатора плазміногену (РАІ) ії ДНК-(цитозин-5-)-метилтрансферази 1(Опіті!ї) через 24 години за допомогою ПЛР у реальному часі.
Кількісна ПЛР у реальному часі: загальну РНК екстрагували з клітин з використанням набору
ЕМеавзу. Концентрацію РНК вимірювали і 1 мкг РНК піддавали зворотній транскрипції в кКДНК із використанням набору КТ-Рігеї в5ігапа Кй. Потім кКДНК ампліфікували з використанням відповідних праймерів і основної суміші для ПЛР Ромжег ЗУВК СОСгееп РСК Маєвхіег Міх. Амплікон (150-200 п. н.) виявляли за допомогою системи АВІ 7500 Кеаї Тіте РСК Зуз(ет. Усі гени-мішені нормалізувовали до ЗАРОН і обчислювали відносні кратні зміни. Кожен зразок оцінювали в трьох екземплярах.
Як показано на фіг. 50, сполука дозозалежним чином знижувала експресію МРНК СОЇ11, азмА і ЕМ у фібробластах 555. Аналогічно, експресія РАЇ (фіг. 51) і Опт! (фіг. 52) також дозозалежним чином знижувалася сполукою у фібробластах 5бс. Як показано на фіг. 51, сполука дозозалежним чином збільшувала експресію ММР-1 у фібробластах 55с. Результати демонструють, що сполука ефективно регулює ключові фібротичні фактори, вказуючи на ефективність сполуки для лікування 556.
Крім того, досліджували рівні цереблону в нормальних фібробластах і фібробластах 55с і тканинах шкіри 556. Як показано на фіг. 53 і 54, більш високі рівні цереблону спостерігали як у фібробластах 55с, так і в тканинах шкіри 55с порівняно з нормальними тканинами. Це вказує на те, що підвищений рівень цереблону залучений у 556. 8.11 Приклад 11: Націлювання на цереблон при В-клітинних дискразіях
Визначали профіль ефекту (5)-3-І4-(4-морфолін-4-ілметилбензилоксі)- 1-оксо-1,3- дигідроізоіндо-2-іл|піперидин-2,б-діону ("сполука ІА") на зв'язування СЕВМ, убіквітинілювання і проліферацію клітин. СЕКВМ є компонентом комплексу убіквітинлігази ЕЗ, що включає СИ 4А,
РОВІ ї КОС-1, і було виявлено, що він є молекулярною мішенню, що зв'язується талідомідом, леналідомідом і помалідомідом.
Дослідження зв'язування з СКВМ проводили з використанням кон'югованих з аналогом талідоміду гранул у конкурентному аналізі. Ендогенний СКВМ із клітин множинної мієломи (ММ) людини вимірювали шляхом інкубації екстрактів клітин з різними концентраціями або сполуки
ІА, або помалідоміду, як позитивного контролю. Афінні гранули, зв'язані з кислотним аналогом талідоміду, інкубували з екстрактами 0266 і після ретельного промивання гранул елюювали білки, що зв'язалися. Зв'язування СКВМ зі зв'язаними з талідомідом афінними гранулами визначали за допомогою кількісного визначення СКВМ з використанням імуноблотингу.
Убіквітинілювання СЕВМ вимірювали в клітинах НЕК293Т, що були трансфіковані міченою на М-кінці Ніз-біотином конструкцією СКВМ, потім попередньо інкубували зі сполуками протягом однієї години, а потім обробляли інгібітором протеасом МоО132 (для зупинки деградації бО убіквітинільованих білків). Клітини лізували й обробляли для вимірювання убіквітинілювання
СКВМ за допомогою 5О5-РАСЕ і імуноблотингу з використанням антитіла проти убіквітину.
Дослідження проліферації клітин проводили в чутливих і стійких до леналідоміду клітинах множинної мієломи. Стійкі або чутливі до леналідоміду клітинні лінії НО2.дО ММ обробляли сполукою ІА протягом 5 діб, а потім оцінювали проліферацію і життєздатність клітин за допомогою забарвлювання 7-аміноактиноміцином Ю ("7-АЮО")М Костимуляцію Т-клітин вимірювали в очищених первинних Т-клітинах людини, стимульованих з використанням іммобілізованого антитіла проти СОЗ у клітинній культурі протягом 2 діб, і секрецію цитокінів вимірювали за допомогою ЕГІЗА.
Продукцію імуноглобулінів М і (с ("дос і ІМ") вимірювали з мононуклеарних клітин периферичної крові нормальних донорів шляхом культивування в присутності факторів диференціювання В-клітин: рекомбінантного 1-2 людини (20 О/мл), 1-10 (50 нг/мл), 1-15 (10 нг/мл), Ніз-міченого ліганду СО40 (50 нг/мл), Ідо1-антитіла миші з полігістидином (5 мкг/мл) і
ОМ 2006-ліганду ТІ КУ людини (10 мкг/мл) протягом 4 діб, а потім з ІІ -2, 1-10, 11-15 ї 1-6 (50 нг/мл) протягом додаткових З діб. Вимірювання Ідс і (ОМ проводили за допомогою ЕГІЗА.
У конкурентних дослідженнях зв'язування СЕВМ попередня інкубація з помалідомідом у концентрації З мкМ приводила до приблизно на 50 95 меншої кількості СЕВМ, що зв'язався з афінними гранулами, у той час як сполука ІА у концентрації 0,1 мкМ приводила до подібного зв'язування СЕКВМ. Дослідження з убіквітинілювання СКВМ у трансфікованних клітинах
НЕК293Т привели до наступної ефективності: сполука ІА ІСз5о-0,19 мкМ; леналідомід ІСво-12,9
МКМ ї помалідомід ІСво-21,6 мкМ. Величини ІСхо для інгібування проліферації за допомогою сполуки ІА зсувалися від 0,01 мкМ у батьківській клітинній лінії НО29 і 0,04 мкМ в обробленому
ДМСО субклоні до 0,51-1,58 мкМ у стійких до леналідоміду субклонах. 50 95 скорочення клітинного циклу (З-фаза) було очевидним після обробки протягом 24 годин клітин НО29 сполукою ІА. Через 48 годин сполука ІА знижувала експресію сурвівіну і ретинобластомного білка ("рЕВ") і збільшувала експресію циклін-залежного інгібітору кіназ р27.
Сполука ІА костимулювала продукцію 1-2 Т-клітинами з ЕСхо приблизно 0,29 нМ, порівняно з 10
НМ для помалідоміду. Сполука ІА інгібувала продукцію Ідс і дм з ІСво 0,35 і 2,1 нМ, відповідно, порівняно з 17 НМ і 63 нМ для помалідоміду.
Результати вказують на те, що сполука ІА зв'язується з СЕВМ із приблизно в 30 разів більш високою афінністю порівняно з помалідомідом, і інгібує убіквітинілювання СЕВМ із приблизно в 110 разів більшою ефективністю, ніж помалідомід, у цій системі. Сполука ІА є приблизно в 34 рази більш ефективною, ніж помалідомід, відносно костимуляції продукції ІЇ-2 Т-клітинами, і вона є в 30-48 разів більш ефективною, ніж помалідомід, відносно інгібування продукції імуноглобуліну. 8.12 Приклад 12: інгібування диференціювання В-клітин у паросток плазмобластів і плазмоцитів
Для дослідження ефектів націлювання на цереблон ("СЕВМ") відносно диференціювання В- клітин у паростки плазмобластів і плазмоцитів, була розроблена модель диференціювання первинних В-клітин людини іп міїго.
СО19-В-клітини периферичної крові людини від нормальних донорів або загальні мононуклеарні клітини периферичної крові РВМС від пацієнтів із системним червоним вовчаком (5ІЕ") культивували в присутності інтерлейкіну ("7-"3-2, І/-10, 1-15, агоніста ТКУ ії СО40І. протягом 4 діб, а потім з 1-2, І/-6, І/-10 і 1-15 протягом додаткових З діб. Клітини підраховували, життєздатність оцінювали і визначали експресію СО20, СО38, С044 і СО83 за допомогою проточної цитометрії. Фактори паростка плазмобластів ІКЕ-4, ВІ ІМР-1, ХВР-1 і Іду, ї маркери зародкового центра РАХ-5 і ВСІ-б6 вимірювали за допомогою аКкТ-ПЛР.
Внутрішньоклітинну експресію білка вимірювали за допомогою лазерної скануючої цитометрії.
Секретовані імуноглобуліни дос і ІДМ вимірювали за допомогою ЕЇ ІА.
У культурах нормальних В-клітин (5)-3-(4-((4-морфолінометил)бензил)оксі)-1-оксоізоіндолін- 2-іл)піперидин-2,6-діон ("сполука І-5") зменшував відсоток усіх життєздатних клітин у цих культурах після 4 доби до 69,6 95 (Р«0,05) або 35,8 95 від контролю (Р«:0,001) при 20 нМ або 200
НМ сполуки І-5, відповідно. Сполука І-5 дозозалежним чином знижувала відсоток життєздатних
СОр20-СО038 плазмобластів на 7 добу з 30,4 95 у контрольних культурах до 27,3 95, 2,1 95 ї 0,4 95 у концентраціях 2 нМ, 20 нМ і 200 нМ, відповідно. На 7 добу аналіз ЗФКТ-ПЛР продемонстрував, що сполука І-5 (20 нМ) знижувала експресію генів факторів паростка плазмобластів ІКРЕ-4,
ВІМР-1, ХВР-1 і Іду до 20,5 Фо, 14,3 Фо, 15,1 Фо і 31,5 90 від контролю, відповідно (Р«е0,001).
При внутрішньоклітинній проточній цитометрії сполука І-5 (20 нМ) значимо знижувала експресію білків ІКЕ-4 (Р-0,5), ВІ ІМР-1 (Р«0,05), і ХВР-1 (Р«0,05) на 4 добу, але значимо збільшувала експресію білка ВСІ -6 (Р«0,05) на 7 добу. При лазерній скануючій цитометрії на 7 (610) добу сполука І-5 (20 нМ) знижувала внутрішньоклітинну експресію СОЗ8 ж клітинами білків ІКЕ-4
(Ре0,001) ії ВІГІМР-1 (Ре0,001), і збільшувала експресію ВСІ-6 (Р«х0,05) (п-3). Сполука І-5 інгібувала продукцію секретованих Іда з ІСво-1,8 нМ (п--3).
У РВМС від пацієнтів з 5 Е сполука І-5 (20 нМ) мала подібні ефекти з ефектами в нормальних В-клітинах, знижуючи експресію генів ВГІМР-1, ХВР-1 і ІдУ до 52,8 95, 49,2 965 і 13,6 95 від контролю, відповідно (Рех0,001) (п-3). Сполука І-5 (20 нМ) значимо знижувала експресію СО38- плазмобластами внутрішньоклітинних білків ВІІМР-1 (Рх0,01) і ІКР-4 (Ре0,001), і збільшувало експресію ВСІ -6 (Рх0,05) (п-3). Сполука І-5 інгібувала продукцію секретованих Ідс і ЗМ у РВМС пацієнта з БІ Е з ІС50 0,9 нМ і 3,2 нМ, відповідно (п-3).
Ці результати демонструють, що націлювання на субстратний корецептор СКВМ комплексу убіквітинлігази ЕЗ за допомогою низькомолекулярної імуномодулюючої сполуки І-5 приводить до могутнього інгібування диференціювання В-клітин у паросток плазмобластів, як показано по зниженню відсотка життєздатних СОЗ38-- клітин, зниженню експресії генів і білків ВГІМР-1, ХВР- 1, ІВЕ-4 і Ід), і інгібуванню продукції секретованих імуноглобулінів. Ці дані вказують на участь комплексу СОЇ 4-СКВМ у диференціюванні В-клітин у паросток плазмоцитів.
Даний винахід не обмежується об'ємом конкретних варіантів здійснення, описаних у даному описі. Дійсно, різні модифікації винаходу на додаток до описаних модифікацій, будуть очевидні фахівцям у даній галузі з представленого вище опису і прикладених креслень. Мають на увазі, що такі модифікації входять в об'єм прикладеної формули винаходу.
У даному описі цитовані різні публікації, патенти і патентні заявки, зміст яких включений як посилання в повному об'ємі.

Claims (20)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Спосіб лікування, профілактики або контролю захворювання, який включає введення пацієнту ефективної кількості сполуки формули (в) (в) Н М со іх у Ї або її фармацевтично прийнятної солі, енантіомера або рацемічної суміші, де захворювання являє собою вовчак.
2. Спосіб за п. 1, де захворювання являє собою системний червоний вовчак.
3. Спосіб за п. 2, де захворювання являє собою важкий системний червоний вовчак.
4. Спосіб за п. 1, де захворювання являє собою шкірний червоний вовчак.
5. Спосіб лікування, профілактики або контролю захворювання, що включає введення пацієнту ефективної кількості сполуки формули
(в) (в) Н М М (в) я; у Ї або її фармацевтично прийнятної солі, енантіомера або рацемічної суміші, де захворювання являє собою склеродермію.
6. Спосіб за п. 5, де склеродермія являє собою локалізовану, системну, обмежену або дифузну склеродермію.
7. Спосіб за п. 6, де системна склеродермія включає синдром СРЕЗ5Т.
8. Спосіб лікування, профілактики або контролю захворювання, що включає введення пацієнту ефективної кількості сполуки формули (в) (в) Н М М (в) я; у Ї або її фармацевтично прийнятної солі, енантіомера або рацемічної суміші, де захворювання являє собою озноблений (рептіо) вовчак або саркоїдоз.
9. Спосіб лікування, профілактики або контролю захворювання, який включає введення пацієнту ефективної кількості сполуки формули
(в) (в) Н М М (в) с у Ї або її фармацевтично прийнятної солі, енантіомера або рацемічної суміші, де захворювання являє собою синдром Шегрена.
10. Спосіб за будь-яким із пп. 1-9, де сполука являє собою /(5)-3-(4-((4- (морфолінометил)бензил)оксі)-1-оксоізоіндолін-2-ілупіперидин-2,6-діон або його фармацевтично прийнятну сіль.
11. Спосіб за будь-яким із пп. 1-9, де сполука являє собою /(5)-3-(4-((4- (морфолінометил)бензил)оксі)-1-оксоізоіндолін-2-іл/упіперидин-2,6б-діон.
12. Спосіб за будь-яким із пп. 1-9, де сполука являє собою гідрохлорид (5)-3-(4-((4- (морфолінометил)бензил)оксі)-1-оксоізоіндолін-2-іл/упіперидин-2,6б-діон.
13. Спосіб ослаблення, інгібування або профілактики симптому системного червоного вовчака, що включає введення пацієнту із симптомом системного червоного вовчака ефективної кількості сполуки, де симптом вибраний із групи, яка складається з: болю в суглобах, опухання суглобів, артриту, болю в грудях при глибокому вдиху, втоми, лихоманки без якої-небудь іншої причини, загального дискомфорту, тривожності, втрати волосся, виразок порожнини рота, опухання лімфатичних вузлів, чутливості до сонячного світла, шкірного висипу, головних болів, оніміння, відчуття поколювань, судомних нападів, проблем із зором, змін особистості, болю в животі, нудоти, блювання, патологічних серцевих ритмів, кровохаркання й ускладненості дихання, плямистої шкіри і феномена Рейно, і де сполука являє собою сполуку формули (в) (в) Н М М (в) с у Ї або її фармацевтично прийнятну сіль, енантіомер або рацемічну суміш.
14. Спосіб ослаблення, інгібування або профілактики симптому склеродерми, який включає введення пацієнту із симптомом склеродерми ефективної кількості сполуки, де симптом вибраний із групи, що складається з: (ї) поступове ущільнення, стовщення і стягування шкіри; (ії) знебарвлення шкіри; (іїї) оніміння кінцівок; (ім) блискуча шкіра; (у) невеликі білі утворення під поверхнею шкіри, що прориваються крейдово-білою рідиною; (мі) дисфункція стравоходу Рейно; (мії) телеангіектазія; (мії) біль і/або скутість суглобів; (їх) опухання рук і ступней; (х) шкірна сверблячка; (хі) скутість і скручування пальців; (хії) виразки на зовнішній поверхні суглобів пальців і ліктів; (хії) печія, ускладненість ковтання, діарея, подразнений кишечник і запор; (хім) втома і слабість; (хм) ускладненість дихання; (хмії) артрит; (хмії) втрата волосся; (хмії) проблеми з внутрішніми органами; (хіх) виразки пальців або (хх) аутоампутація пальців, і де сполука являє собою сполуку формули (в) (в) Н М М (в) с - Ї або її фармацевтично прийнятну сіль, енантіомер або рацемічну суміш.
15. Спосіб поліпшення модифікованого шкірного показника Роднана, зменшення або поліпшення товщини шкіри, зменшення або поліпшення ущільнення шкіри, поліпшення легеневої функції, поліпшення дерматологічного індексу якості життя, поліпшення дифузної здатності по монооксиду вуглецю, поліпшення індексу задишки по Майіег, поліпшення показника опитувальника лікарні святого Георгія при патології органів дихання, поліпшення показника шлунково-кишкового тракту консорціуму з клінічних випробувань склеродермії ОСА, поліпшення потік-опосередкованого розширення або поліпшення або збільшення відстані, пройденої у випробуванні шестихвилинної ходьби, у пацієнта, що страждає на склеродермію, який передбачає введення пацієнту ефективної кількості сполуки І, де сполука являє собою сполуку формули І: (в) (в) Н М М (в) с у Ї або її фармацевтично прийнятну сіль, енантіомер або рацемічну суміш.
16. Спосіб за будь-яким із пп. 13-15, де сполука являє собою /(5)-3-(4-((4- (морфолінометил)бензил)оксі)-1-оксоізоіндолін-2-ілупіперидин-2,6-діон або його фармацевтично прийнятну сіль.
17. Спосіб за будь-яким із пп. 13-15, де сполука являє собою /(5)-3-(4-((4- (морфолінометил)бензил)оксі)-1-оксоізоіндолін-2-іл)упіперилин-2,6б-діон.
18. Спосіб за будь-яким із пп. 13-15, де сполука являє собою гідрохлорид (5)-3-(4-((4- (морфолінометил)бензил)оксі)-1-оксоізоіндолін-2-іл/упіперидин-2,6б-діону.
19. Спосіб за будь-яким із пп. 1-18, який додатково включає введення другого активного засобу, що являє собою протизапальну або імуномодулюючу сполуку.
20. Спосіб за будь-яким із пп. 1-19, де ефективна кількість становить від приблизно 0,005 мг/кг до приблизно 10 мг/кг маси тіла пацієнта. зок ЕЕ ЖК З ВІВ і РЕ х Назамобласт - ву М як Ми ІС 2 Проміжні літня шовний ї АВС с АктИиВОВОМІ Н-хлітни т ОВ як І Тоня ВМ) М шо авя око ПУ пк дресет ВОНИ ЖИМ третя СВІДКА лрехиює ВА - 5 ОА бркспю ШКО СИНИ ев ЩО кН ШИЯ Ж ГО ча яю ІЗ ж Ж і КН Іл ан Б аж и: ше ше М в ЗИ ве они но Мох ав яви ох НК ов щем? Сл яти СИХ НК-А сто п АК ДМС УМ Ка гони Яребітюх ЗК 1-1 БАНЯ 0 ресктен (3-Х 1-4 СБАМСВЯ 0 Хрнхітют КМ-ОВОК 1-3 СВОВАВЯ 0 Зрвма МОВНЕ поро юеіхни но МА: ох 0 З ух З 8 Шайі Що ши ЗВ бою Як щі 5 вані 0 НЕ щи ИЙ ше ву ВИ Мк 5 Ше ШИЯ в; 1 «щі ше дек Я. БІ ще ОЇ в сито етану Хаук ати укл сю дит мети срлете иатутичАму т пе ок ні оо пек оцю Ме оно з оз юки о чо ща КА ЧО пф-Х СО НУК СОННА
Фу. 1 в ри 150 пе й їх А ДОБА ВН в Г7 ДОБА ВЕ 001004 р
3. п ' Що й о ЕЕ А ще ЕЕ ; яти ЕЕ 5 СУД тв 5 в : - х їй А пе І Е м щ ий : З . | с Тв ; с Я Ч. к 0 5 ще а Аг: контроль 2 М 20 НМ 200 нм пей пе пе й-й Досліджувана сполука.
Фіг. 2.
Ко) в от 4 20 ГІ контроль (вед) 2 й 2 ВМ (пе) в Ї ТЯМ. (на) х : 15 й З 2009М (пе) 5 МАЙК . ; ОО ОКО п, І. ЕЕ ря «як -к щ ве ЧК з КУ Я ше Щи- БІ; ке -к ! Зх 5 В е 7 крах т р З ї й па я ще Б Кке АЧХ ля щ І РАХ-Я ІККЯ ВОМР-1 ХВР-1 ВсІ-6 Гон
Фіг. З ІСед мкм) Досліджувана 7 сполука 0018 -ш- рот 0549 що -й-- іеп 02 Же 100 Й п о в 50 Е / Ше: | - хх 0 тт 00001 0001 0 0 1 10 Сполука(мкМ
Фіг. 4
Ж. ВИМР- ХВе-Ї ІвЕй ощ 90 яння - 5 - - - ст - 8 55 ша шо 5 дМсо Ех Фо 12 як Досліджувана З й Її сполука (ЗНМ) В - Її г ох о З і дя я т 5 й р - як і г ПЯ Я жк щ ОВО й пе Я пев. А. хх пу Бл еВ ака КУ. сяк в 5 о 4 7 10 4 7 | 10 й 7 Ю й - Доба : Фіг. ЗА Майн я поь - ХВО с з З ВМР. ХР ІК що - Не Д а дксо о бу я Досліджувана з 5 5 10- - . сполука (ЗМ) ЕВ я й в 6 й | т зв 57 ; «ле «Че пе ко ЛАЙМ яз 0. яв т дм пики ши и п не пит Доба
Фіг. 5В БА нн ; ОО Фе БМ я доба - В, З000 г 2417 доба и В 10 доба Те 7000 - о шо З гй шо 1000 - - у і 0 ле що п о Що й - без Контроль. рот (3ОНМ) Івп (2 МКМ) (енМ) обробки Досліджувана спонука
Фіг. 6 2 є м ї- О доба, до обробки сподуки (ТО доба 200 й жультивунання В-клігин) ко тех : Де
Ед. 100 - і З З ше і Еш ве Е во со З З ке ЕЗ І ка жк ні ТЗ ш---- Е 95 й с ее вк рт ши Кене 5 ої с У МІ КЗ БІ КЕ - щш що о з ее о5щ що є, іє «(вав вВае в и Я Ргед(бО0німлі 5 5 ге Досліджувана сполука мкм
Фіг. 7 ям Дослізжувана сполука С вм ноті сідтиов га ок ДМСО Дасліджувана спалука 30 БМ) 7 доба -ДМОСО 7 люба -ЗНМ 17220 7 лоба АЗ0ВМ 17220 з5126Х МП ою Вб зав ЗАх ТК ше т. ж віч кі? оч ні ЕН ік - І; я ВИ ще: У ен ке і КУ ще | ідіх не фах. ! созв Роб, СО д'є ящуе шин а й Щі та Й тво маш об мли пло дути диплом третю а мими; Мей аа і: Моск ку ть вай хост енлат вежа ШЛЬК І ЯН б о Є лю» о ою о те ою юж тоо СПО РС-А Спо гНо--А 090 ЯТС-А сорго
Чиг. В 20ок07 17 т ГО б лоба Ох хо 4 доба Я І З 7 доба я охю! х т «З 8 ко З в я БОМОЄ Я . Кк з. - 2 со ца - Яд З т с Її що х. г їй Ко 0 С а Ме нер С дМСо 0002 002 Досліджувана сполука (МЕМ)
Фіг. 9
Не ав щ-- - Ос-е , се й С контроль он що 2 НМ ВЕ - ї З 15 ТА нм 5 й вот роя , и С г ГИ ДАЛА ШИ ЧИ НК Те З 7 ВАХ-я ЖКРЖ ВИМРАЇ ХВР-1 ВС-65 0АДІССА Іду д ГЕН га
Фк. 10 5 0 шщ я т З ни - КО я ово-б . в 40-25 в'Е ж . з Е 20-24 ко х Ех 1. - ! ВХ т г я І Досліджувана сполука
Фіг. ПА.
-- що що 1 щ В вх ! ж 120- - щ шк що Ж Ех но со 58040) У ян о ще щу о р Я В 0 Я Бе с бат що Кз в Із Ай як хх хх д. х М Кк вх ле ще їх є 202 о же не я щ І. ЖЖ Е Я ит - З Б Ше з ш-шЕ Мя ва З З що о Я 5 В І ж я с Досліджувана сполука Фів
О доба. ід3-щ ж 1805 да 23 І, 2 зд5 КО З я то кро ж пед ово срот ВЕ-А Я дЛоба досліджувана сполук ЛІДЖУ лука дМсо й 4 доба нОМЕИ-Ра-О Я доба «лей -ро-т7о00-та 105-2695 ТО во п Пози 0 ех В, оз Шу: к що й С М кі що те що ЛК І-й В Еш шо що щеощо б лоб щоб С82О НТЕ-А 023 НТС-А 7 ноба ДМС Доспіджувана сполука з 7 доба дл 1-ро-0- т доба -олв11-РО-11200-ТА 5-х ВОК ов бля си я Ат ЕК с йо 7 "ре, й фе ; з В: Вб» : Най и КИ а т, 4 2-4 5 Б "пе шк" сен т ВВ Ше ОМ от Моб о зо СаО ПТС-А СПО ЯТС-А Фіг, А
Ср Клітини В чо (плазмобластилілазмоцити) й в їх м Во : з зву 07 Вот й їй КК ї ка - ях є 504 КО а вик М Ор МО З пари НЕ СК ж со ДМСО Даснджувама ДСО Досліджувана: шаолука сполука ср Клігини. хо (проміжні клітини) яв с. в во Іс! - М ян 07 З во 05 рах є 40: ХО ж 70 я ДЯ ТО І б ПолА ро що ОЗ дДМСО Досліджувана. ДМС ловнижувана сполука сполука. СОС зВ- Клітини вНЮ (активовані В-клітини) Га Кт я Ж БМ Й в'я р о Бо ря ши пе ДМСО бесліджувана ДМСО Десліджувана сполука І сполука
Фіг. 128 зад: вк ШК жі ; Н Н ! ФОБІБЖІ ве - ДК те дя ме ТОМІ вм Я Б-Я 7 5 я о, ів Ба ІВ ролих ій жк сл КИ вита т Ж б пит ТИ лит й і Н два ПВ их -я п, «др Н 45. і у Н Н с ЙОД / з. 7315 «КА т, ТОВ пк раї ки які аку як Ї бом г ча птн : «2 А «й що Й «й як Фі се С еетеяктненя й Ж нок МЖК йОЯЖ ОК аЖ ож лк ОКО ек ЖК дж о Ж й Ох ЗК ХУ ра точ РЕА РУДА Низ: ай Я З у Ой снвя с хів В Н НЕ деп 1 НВО щу В Еш ща 5 я вд т и ЛА и тв их ОУН й МК НИВИ Я ВУ, ши Не с дв За У В ак /в Шо тк / о. 19.5 Я ох ІЙ і АНА Н Нести Че Б ї якій х Я я І яки щі я ! «| Я На ! ПОКИ я їх 5 сте уеячнртнеті ПН стртттх пан пет / а ке ттринтнттий Ал о ретяртечтуттнто пс нн Ден ух опр ВОМ ЮК ХК ЗИЖКООУК 8 Ж ОМОК ОК. ЖЮк 20 бо Ж мкж ох ЖК УЖ йо Ж Ж рХУ МІК дж яо-А ЕБИ-А РЕО-А РЕ-А чЧиг. ІЗ бо
«Ж грі й ВК . МУКУ сон НИЖ і яд -8-0--- -5- - | шення пе я рес о се и ср сані БЕ нк Кз І 5 І що НОЯ а зді я К в дод р хо же З М тю ро и і ше ши Б Ше ШИ ще ЕВ ОД й ТК як с Б ОБ щавюу БУ лк й щі я Я нн и ШШеНИшОЗ І КЕЙ КИ сну іш У В ЗШ Б рис ЗА пет як: ге т КОКС КИ Р Ми фе З ДМС сне ДМОО Моне ! ДМСО ки дмсо ох ве ВК ян симеа ви п риса б до бкк долу пох юесжую ил, я вою; век свт -- «ко т ВВ У фрастти В ДТ пи ки жи шк БО сутки ЗИ гос жею г пря суттево. ОБО дтдхя вк А МН яке пе У ШЕ ШИК Я ж Б Ка ЗШ рені НН ю НОВ Бооа Я о В нен ШИ ДМСО хезіхенню вона Те пийусі ДСО бхоо 0/ ВМОблючекуко ще В, седлухх
Фиг. Я Нарока екритерцї Й хрипіх Дохиджуюних пуху ха Ха ИОюМУХ УНК ЗУЦОХ зкрий гЯ кантроль що ков стюх ес пов КО СДН я клан зер ОКОО ОВО сон оорооососоосососвовоос одер овсовося - Ва--й ко т в о ше кві ша щи КЕ с МО Я се КМ О х Б М ПСО я С в и і АНУ -- БОМ в ОН С Ж оздипі ОБО слмля ОК с В МВ ЕЕ о ВИЙ ТВОЯ о волор ее 5 т і в Б со і Б БО ЗОЗ шва 0 ВН ні и ші Б ОМ В М ОО 5 СИППИПИПИСИ ПИВ КИ ЕНН ПЕН ШПИШИНИТКИПИШ ШИНИ хх дди і Ре мох зи Я ж с в НА ки п і с й ОН СЕМИ КОН РОБ Кол Я Б Су ЕК ОК С Ко с с с кош и ни и М ПКЕЕ Дю км ДУХУ «ект» БІ В о Я й ше жк и. ЗА Тіврний серпа . Досліпкукана сукоуяа 4 контроль (о мі Ба Заганена цепулннціх РКО, чада жер. щ ! НК, КЕН клітене Ре, у Е яра - ІЩЕ-А
Що. 0 Я хо я що БЖ - 3 й МК їх З За ТОБЯ же С ШИЯ с - Ко з з: ШИ з ВШ ши и ши. З Шя Ж Я З ох ШМК СЖОШЕИЯ З ШО КК й РО я 5 КОХ . Дн сн ви ШИ Ко ша . - Нр Люскю пає Лисак ДСО 0 ДМС лохоповукони спонук сполука дат 15 сравиИВИМР- ОА ВвелмО Б, т Ом є а В с в в І с ММ ли ПИСК КВ АК в Б с о ПО А о Д.КБПщБГД с
3. « 55 с и МО з ІІ я М о «ВОМ о о З ММ ж- ВОМ КО шо ВА ре НИНІ Ж ! козу Загальна овуляція заг ну . ща 10 дався кИтТини еофюдяії 7 у я . «реп, Ж Я шо КОМУ се яка дя ще щ | шо Ре, Боно п х ззарадо ши ДМСЄ Лесйежуюна вм Дюсліужувань І сполука спон уха чн 15
СОВИ РАКА ВАНІ ЕОМ ВН ОВ 1 КК в 3 З Ше я БО З її ОО іш п в п ВОМ - ДИНИ ви 2 ВОМ С в - ПЕ и Ти ИИ т ВВ й ВО и. дБ ОО я ч дО Я З ПИШИ ПОКИ -- В у вс Ес шо я ІОН 20005 нм лини Е п Завльмачивууляній я 1600 ВСАА: клігажн 5 хх т й Й а я ТАК -- ще Парней ікритерні ше ше "Ре, те х КО НЯ Му МАК о пид о ММЗ ОК ОО Кв ЕКО ОБО Ні А КО НЯ й Ген 1: гучачи " Яни тукум щ пед ОСНИЖУКА. зругрзеу (ОБЖ ЛЖуУКАНЕ. ЯМСО де «сполука ДМС сполук
Фр. 130 г ду жк СОЗВАКВВ-А ДІР
М. нс М п - 5 То в Я пн 5, З КК в х ПАХ, ПО КЕ, У ПК ФО КК КК її ИН ПК ПИ ЖИТИ, - М ш Пл вв ще ШИН ЕНН ПВ « а Ж ПДИМИНМ КИ ДК с З дик НН КВ х ОО ВО я 5 : Б ХВ ту і ІЗ Звтальна є вул т600-ї МИС кіт Уци я і ЗСУВ клани
Я. ОДН о о-- ВЕ ск КО Завний гкувтевій В но я г . Нарвий кздитерій шо 000 ща РКО, МДЕ СЕН НЕ БО Ба УТА Жоа на. Фе ї ГО і Ме БК А, зда БИ БеЕе Б ОВ сив п нн и шщщ- хро фо оБшНи КО ра БЕ ОС і Е а ГБ НЕ «Бо КИ Шон по ден пад, МИКЛЬЮКуУВа» вуратих НИМОНЛЖУ НЯ ДИ настука ДСО впомткя цк з дух
Фиг. 15Е
4 доба 7 доба щ к з - х І є ї Щ щх Ше» 1000 іх о ТЯ х вика ро пе Б скуе шо окліню ЖК ши: ж Ор СО іже: 2 що я що що ТУ 0 да 5 ОО я ДдМсо Досліджуває Досліджува- ДМСО дослівжува- Досліджува- насповука о паспонуках І внаснолука на спозука гом 0лонМ нм 020 нМ 1900 4 доба 7 лоба 89045» т І І ж Жак жк хжк 8 600 400: Бе СА ах Яка ле Шо: ее р Ко ще а й З со АК й Со МО РО ки ДМСО Десліджува- Деслійжува- ПСО) Доеліджува. Дослійжува: матсполука цасполука наспопуюа насполука нм ОО 0200нМ нм 0 200НМ 4 доба 7 доба 1000 пня Ж жк - «а то 80041 о Я 400455 5 с С- 706 о х 5 и 012 ше 0 и ККЗ вки нт дМсо Дасліджува- - Досліджува» дО Досліджува- Досліджува- насполука насполуха насполука о снасполука 20нМ он дням 02
Фіг. 16 Усжпонуляція ДОБ їу о ДОБА 4 ДОБА 7 ДОБА в | 2о00ю . НА зок ще 160 Ж В Б ї ТК 87 | | - | Н ї - 19000 І ря Ми т ШИ ДЕ ДЕ як КІ в. ві - ВОЮ Я ї ЛШ шк н ше БОКУ ЖК, ! й і Юа ще З з з зе Н дя Я КЛ є 1 бе сере О-ітртар як еттуттчтинтрння о ші А ОБЖ КК АК ОК ЖК ІН ще 1 оон З сок шк же ду. ех Б рек Гежя Зх кож СА бот -Риср-сув-яй среє 5 аввЕ КЕ 4 ДОБА 7 ДОБА 5 5 пппддтттннтжктя порно по порно у пюООВ жо З й І Сполукаії Сполука 1 5 дБ БЕ АК Й як па БА а ек В 5 У Б Гн НИ У д Н і ій Односторонній чисисрсінний алазіз Критерій мивжицнвх той Е х І НІ Її порівнянь Даннетта (порівняння з кокеропемя у викла. ! З Е ( хх ДМС р. ; й в ї м Зразок Її а це щи У х шення Е 5 щі К, хи М -я« Т ОБА -1ВЯ! РЕ-ДР-безісв Ми р. й зм - -Т л5 ОБА 11 РЕ-ВРУДМСОС5 а дк Ех а Но У - Я -Т ОБА ОСІВ РЕ-ОР-73057 НМ св. ні видра - чех т тп етех ДОБА ОСІВ РЕ-ОВ-220- 20 св. бю юю ОО 03 ОО 5 о-яяня- ДОБА ОСІВ РЕ-ОБ-З20-204НМ оо Сотр-Реср-ую ФИ Сотр-Рибр-сув-вА: Ср
Фіг. 7 дМсо Досліджувана сполука. я М Доспіджупзюз сполука, 20 НМ Досліжуване сполука. 200 ля й ри ТИ 0 сти не т сли МИ бій ва) ж Мовк ло діти пд я тзх Би В ота Ша, да| о й Не с -о ЖЮН І | що МІНІ | но Дак точ Бк щ й Су м | сафінни | ОЇ ЗУ г хи нин В ке : БІ Ж ВВВ вій п Кай СОИНк Я й ЗВЕЛИ КИ «ДАМ й - ІЩЕ тре З Е Е| КО Е и Нд В Що Же і :
во. ; Ед Бо Бо. Е ШЕ 5 а І ще віям | ке Рк а ПИШИ іо 57 СИ ША 70хх 73 те ТМ 05 що ДВ б? нео ою ОЦЕ ЗМ Зо 109 свобпісодяй отр СА: СО Сота НТК: СО Сотр КА СОЮ Сатр АГА: СОЮ клітщни «І кі Ф ді ФІ ок я з Ян й вх «іх о щік в шо 8557 В щи и Е мошки В 5 що а ов БАКИ чні А Ж М жен под: - В Я зи Й нь 4 с До УКУти: Ф зи жа | 5 з х У Шеуих Р Фу ххх КИ д влад :9 БЕ ху Мен лоз РЕ уже ві я Мн во 2 і: ри 8 ГА Вях - - яко є ги Ед? 2 28? Ен Я ота в бо з ав во їх АК 155 34 іс 310: СВ 15 ях Фе о де буре 305 зо 08 002 05 16 ю Іде лох ше но Сотр НТСА: ЧО Сотр НТК СОЮ Сотр. ЕТСА: СВ) Сетр. НТСА; СВО
Фіг. 18 Уся популяція о ДОБА щі: 4 ДОБА 7 ДОБА 250К Е "ст ши 200К сш с і М дом ж В асчь зон 2 Де чи ре п ія, «шя Б о щі ще у. В у " КЕ в ІК и. ве | 5в- чо в пе ща Ц 20 Вр - СЯ хау. ЩІ тЕ ста Я ре р їй ВОК дес у | й 2 пи ш ак їз Інн ! Фрюттеня : Х ва вах 0 ОК З00К 1БОК 200К ок б оює є в ва ги ЕО-К СотрерЕ-к: СО - Бе й Ї: ра - М кЕ ее СОЯ ДОБА І ЛоБА ЕТ 5 1 й Ше б в у Її ит М Гу а й г А 2500 щі їка не З чи, хо ж й Е ах 200 "а ц Н п ке) ї вісі, А ше 509 ї ж Туди : ви Оу, т 5 щ дк як Фе ох 100 щ я х вен Я й шк т со іх Ач: Е ас СЕ - Я а го а ве 2 М - Бут тт ен торт що се і г Щ що би не юю біо бін ВНІ Я сї. Сбілю-РЕ-А: С Сетр-РЄ-А Ср Що й охт5 8 т Я
Л.ДОБА «ВМ РЕ-ПР-бвась Односторонній зиспереіяннй ге во Б що-н В 7 ДОБА АВ рЕ-йр-дМсо їе аначіз Кретерій миоженних й - т - й З і А Зразок сек ДОБА ВН ВЕ-йе-7ю- що яеуненянь Длвнетта (лорівняння 5 В я х Ех Б г: дня ловя ів П РЕю-0Ю Рая кацтралими у явеля і ДМСОЇ Е іі - в У п ДОБА. «Цр-20- ом сх ВЕ 8. 5 ва се ДОБА ВІЙ. РЕ-ДР-ФІЮ-І0дНМ о бо 555
Фіг. 19
4ДОБА ДОБА х 4 ДОБА 7 ДОБА ; | ТТ /й 5 15 І в КА ла в Ж Е - ВИ Б Д | ЕОР А ка те У БИ | ше не ї ї шо у Й а лох ІЗ 5 Я мб МоА не ль в | Ї 0 учет Отто Пе | Її га С 0102 р9 МО о зв 05 бю т Сетр-йРб-А ІВ Сотр-АРО-А Ю 5 ах 8 НТ от чо що М т т по - 1 Е зу Ко ! ж Б В Ро 8 Ще к р ЦЕ | о 8 З З б Її іч | не й як Бела 2000 т бю ОКО 02 05 00600 вою га 1 Фотр-Аре-А І6Ї Сотлд- КАСА І) о Р С що НО) . ДК д Ки а 7 же а КМ ке ИН Б ве 500 " Я з п м ва ху х 3. і як ОКА ї р , АКА ЕВ в 5 Я с я т в'ЖЕ з ж Е б й й Би ме Й ! сесес В З - я пе 3 КИ де б Же БЕ Союр-АРЮ-А б СогадеАРС-А І) й 8 В Е З
Фіг. 20 : щ іо см-с5Е ах зхоо- Т | -- ЩЕ- альфа ВВ Й Н ся а -те- ВАМТЕВ оо 10- нини ще -в-К- о ри че я іі; Б 0 | Б/И Ше ро щх 7 дн -- ОО хх я ВАТА во р не а мч с т м плеучи, -- й СЯ , и и Мвме скс ЧКИ ян р ОО ре Як я ЩЕ шана с но ---3 шин я чл» 0 чен т СЕКТ Нет -5 дохо оо ек о 1 10 100 Жинцевураців сяк Фіг, 21 5 0 й Я - ЕЕ ! Тояю «жк бм-с5Е йо А -в--3 ІЗ ї в / ще ропи : Ух х А ТМЕ-- альфа ЕЕ і ях і 4. ; -й-- ІрК--тамаа ії ММ Ж й У ко ПД зве. Б ШІ З сер ВАМ г 5 4 / в и Ше стеж В Фен. З ск а оо а но Мих ЗИ «ри ТА к ус сссстання соди ше -(-5 у ій МК че їй д-р тр тт -ю ООН ОМ БО 00 | б о Канцентраціх г мк «Фіг. ла
- хі с. й М--тажма Еш з см-АСеЕ Бо у 4 ТМЕ- вльфа ІЗ З зовн в З т -йк- ЦЮ ЕЕ щі фени шия -й3-р.-43 пе щої і: у Ж вл В появ ск--ь єї Мою ме шви Я 5 -р- ТА БОБ Й ТЯ | -к--з «коней нн теоре хз 7 ПАНТЕВ сою оюі бом ми Фі ОО вр-х Концентрація бикмі Фі Б 1200 -ЕН-15 я - 4 я Е 1000 -а- 0-3 ВЕ -ш-сМ-С5Е я 800 до -яе- ВАМТЕ5 вот є 5 боб. ще с. -Ф-ТМЕ-альфа - є ше: о є з -з -й-ІЕМ-тамма 2 суттю і-ї Е шани сих ши НЕ МИ - 0 рт ; т т - --І-17А 0о000100901 0001 000 1 19 що Концентрація (мкм)
Фіг. 24 ще . -й- |ЇМ-гамма вх зБ50б Її т Шеке -ш-сМ-С5Е птожхо3 / 4 ж Е я 2500 / чі. | -- | -10 Е 2000 - З 55 150 т А -е- 1-3 8 1000 у ре фФ--- -к-ї- щ в А й де г я 500 а ото шк -- ТМЕ--альфа о «кеш сн ув -ре- КАМТЕ5 ОО О0001 0001 0010 І І 190 -- А 17А Ковцентрація (мкм)
Фіг. 25
Е-ЬЗ в оя і Е т 1005 т в -3 х В я -ж ; ї : ядо- 1 ! І ШЕсн що ДЕрен с-як-- ї Е Е І - В й е- КАМТЕ5 те шо ле ни ето во Еш а, З я мо-і пу вон ТЕ альфа еВ пре ж ря схе рТА я о дев ль її д- ї лм ни ех ів пек вжи ше зна ПЛ ки ве с НЕ КІС -а- їК- гамма оо ОО ОО 00 1 10 100 Концентрація (мем Фіс, 26 Кк) їмкМі МЕ а жено оо не / а ав о Я ою МОЖ ОО Ж ж оож-нво 000085 ЕЕ Ї ; Йони н М ЕН н ї то 5 ко х ож бМ-о5Е 00092 ОО оте МОЄ 0000006 ог 40- ся щит ой я - ри, й Да --МВ-15 пла т ней роди ---МВ- о Ю- а я ТЩЕ-а ОД Пів, в нн нні или нини НЕ ЕНиНИИ обо бом оди ОБО 4 І т Концентрація (ЧЕМ Фігя? 500- І е -0 - а БАМТЕ5 - Б 1 Ве 400 о ее 00 : 7 вод В, | нн о Ї фр ТК ник ав ве 0 р-н обо особ бо 0 1 Іо) Концентрація (мкм)
Фіг. 28
; Іво ик М) о тт сак-в о ОО ю. ЕІ ож Шин я НВ Е 0 т 7; Ж ко ц-о 00062 жо й Ян и ши Ж - ЕЕ 503 жо и ра у ОМ-С5Е 0038 -е т р: ук і ШАНИ ВЕ 0 7 к ко ; нк й й Ко шифон МР 045 ШЕ ож 7 їй - яЕ 5 яд п --МР-А У 6-4 є г кт ва ж ТЩЕ-а 00095 Ше аа й ВШ нен шанс, нашахи мешнено вжи: кияни ол оо оо ов 1 ю Коицемтвиція мм
Фіг. 29 600 же Ай 500 шт МОР-1 8 А ВАШЕ5
Е. ! ко до 3. / З жов шОЖ ; -И кН здо а Ши Б 100 000001 00001 0001 001 вл |! 19 Концентрація (мкм)
Фіг. 30 ІСкоа їеКМі тен пооя оч деттожннтну ВО м со І ання о ШЕ
Б. 8 : рт й 3 с К-В 00000465 ї НЕ і ра р ее я мом й с2 й ; ЩО дня фонд АМС ОО ших о З І ННЯ дж ке Ж р а --- МІР 0028 ше: дж от сан МР Ів нан ну. Й и ж МЕ 0 плюща оф тенет --0о0 оо Я ям І! їв Кониспураців ЧК «Фіг. 33
З00 сі-ю щ ш МОРАІ - ЕК А вАМЕб ЕВ 4 і хо. і ши /, ох я :
й. но сій - 10 ооо о 0001 0 0 1 юЮ Коппентрація (мкм)
Фіг. 2 вт» ве НН и НИ т Б ше й. 1800 -4; І ; Е шк Е о | ' ї ж в0- 0 1 ІЗ ; 0 000010001 001 0 То 1 Конпентрадня (мем)
Фіг. 33 00 : ; 8-0 Її х ' ' ІЗ : : ; в 8004 - Я 1200 : ; Бу 600. в Е І ї 0 ООН о 0 1.0 юю Каовнцгентрація(мкм) Фіг, 34 х Іво уй Ї трон ї 125 | пре ян: Е що 0 ою ок и 0110001 Ковиеєзрянія (мим
Фіг. 35 0, 5 ! і 5 90 ' То оз 8 : ! ше бі Ї ВЕ ше ше БЕЯ г ше 5 0---4 с- 5 Н ни ше о ан В! В 0 ооо 0001 001 01 40 - Концентрація (мкм).
Фіг. 30 х КО ра ; 1 оз о Ії І - 8 30-. ' Що і І! ге ' 1 ще » ; 5 ще Ї ЕЕ Я ше ! ВЕ я шк ще З па І Н ре с І І ргї К-Я 1 І Й Б й і ї в о - ОО 00001000 901 01 10 то концентрація (мкм)
Фіг. 37 р Ка х 120- : -, ці 1 т . і і г і 1 - 8 1 1 щ Н Н 2-5 90 : І ' г У І: ' - ря І , Фо 1. 1 щ- В : і Ве і Як 080 а щі я ГЕ І І і як В і |! Я ! І Інни Неї . з - - ' Б ЗО ! ' ек і | й Е І 1 ; рей | |! ь-Я з в Е 0-3 Концентрація (мкм
Фіг. 38 д сгз влознкм вс ООВІмиМ й сзблімом 8 со пт г прикм В НМНмКМ Є дз ЗоЖ нм ї ша ЗМ Е слодмкм Е ЗО 5 а ж 5 ща цу х сах. 5 ск Нюзн 2 Бо КнякМ З сни Е ВЮ- Еш їх ТОК Е п : Б :акОдКо Ен яю Е шатми З 0 позоноозуріокіми) 5 зн до Б кави з т Мін М Не іс дисочмЕ 16 кеулі : ПІ рої З ня МКМ ЕОВОНЮ; н м . шо | мвдноо ВЕ Я я ШИ НШеЕ Б Б с соє ЮК (8 інн) хх ї З В і А ня 5 і йде. я З ше ши ше , ой орати. фе НО я Е ГУ ОБ іде Ж КОТА НН МЕ ІНКНІ жо щі о ща «УЖ. й ОО в, 2 г В т Ким НЯ БЕ У ГЕС НЯ Би: ние Не Я ОО ЕКО а. їх Пе, В Янів ЯН ДН ПЕ, КО БОЖЕ і ОБ БОЖІ ЕК БЕН ІН В; Ше ТНБ ЕОМ 5 "в КН я ОН шо В ІК г ПИЯМи мне х БО я ж ОО б АЙ А 5 Ще. ОО ВИЯВ Ще й Х ВІОЛА осві ДИН НІ Я Ж Редемат - по ЕЕ Гквжат В - СЕ Блцемат ОВ. 3» Е сиххіаси СМеКОЙеЕИ Я зкюртнку. ЗВАНІ Я шоммеют бога «Вік. 39
СЗЗ 00001 мкм сот МКМ СЗЗ Од миМ р 0. мкм й мем Плота трубки В Довжина трубки дп 0 МКМ В - їй Ж є 5 Цю ЕН Е х ща ДМСО З тк ДСО вт СДМСО УВО (95 ними) спдмоо кМЕОЕ (95 ни/мл ) ШОВ В 100 учення ВЕ дя яння За п в в. :
Те. ш в : 7 ЩО Ж Е Ї і зе г о я Я З І5 1. Б З і І: Пі Н І. щої БВ Ж ще | яв КІ б СИ о у ЩІ й яв КО, Шов де г р Я ЕМ сич ВУЖ т шо БРАВ ІБК га ня й ї Я. їх ЯН ї їй сш НЕИНЯЄХЮ їх Я що Я: ї. | Не В 5 ! ни ЗиЗАННН я Е МА М: х, я 4. з Є х. Б й х в ук . і і М р ТИ В ЗИ | Ер ЕпрмМО РЕК ще Я Б В ПТК ЯН КМ ТА 5 ї І: тр ЗИМА Ї т ори я 0 є 0 : п гав Вацемат К- 5- е Взцемат Ке Кі . снантіомер «нантіомер З снантіюмер енантіомер 8 Довжина трубка Площа трубки Ж З о ї 159 515 , ши ДСО Я 1 шт ДСО ОВ спдмоб а ВО оніми) 0 СЗДМОЗА КО СЮ. номл) ех Я й що І В підняли полин шині ВО ява КГ ВОЮ др «т т "де Н хай 800 Пор ШЕ ПИ КОКО ОРНІ РВО ТРИ шов Ор и Имя ря В І. ТРЕК 5 5 М Ов во ЯК ОО НЕ ев вех ШЕННЯ РА ЯН ре о. КО ТЕКИ Їй МІН Ка ТУ Р ЕМ | ке ЕЕ |. ОК Тек КМ |: в 5 ЕЕ НА Ше ЕНН. Е нЙ АК ! ке мВ |. ТМ Е гу 1-й з Е й- ЕМ ІЛУАТО ЛОВІ дк ши ОККО Ех її Рацемат ї- ще ш Рацемат В- Фе й енантомер. енантіомор енантюмер. єнантіочер Фіг, 40 г ШИК ак - З ОКЮТ М - СЮЮТУМ х ШК Е САНОК х З ООв мкм Ве КЗ аокМ 2 с ол мМ В вл Ов мем ІЗ далликМ ГУ кб Е са м щі ів жхтикм шо. їю БмімиМ з о мим ЕЕ Бекон хро, СЕ Пе НН ж ОКЛДКООРУЕ ення) ЗО 1 СЛЮМСОВЕ ПО яму 5 їщ- ПЗДМЕОЖНОЮ (25 мими) ее і: ру ЕЗ і в РИ НН ЗЕ ще ЕВ : ВО, в ОБР. й Я зі Я - й ЕН сх ків БА НЯ НА, ТЕ ни во ТІ ПЕ НЯ 5 міши Ме дов 55 ВО ВО Б НЯ я «и В. ие ші і А НИ щі як вої пр пи ориБ о ше ші НО Ж вх й НЕО НЯ 1 НАХ ПМ ОМРИЙ ту КРАЇ 4: т, міт Ор Е нич ше: гу КВ ви Е ПІ ПА МНК МЕЖ. ї х І: НАРО НТ 5 М пики ящ ШЩХ Пп. НІ с: В ЗЕ ення й я Бацамат Ж Х Бацемат В З Ех Рацемат Я. Ка сантомиро ЗНЕНТИСИ сію свакиомку І соойомсро 0 свхкалмкр. аіре р: | Б жк Ез 15 роя Е І ща Е | я їх в. ! що ро в щ- Д і нене ик як і ие сала до і ви а що в і г Хо в'я Мк де дк іш шщ шщ що ЕЙ | що о ля хо | ОО до по В ЧЕ сх сей т линии, в 8 С Бе 054 шо вн пе роко гати В МО пк В | нн Ве 5 | С я й 5 ДОМ 0 КО: Я й паде вх 2 Балняхї Досліджувана пе Контролі Блеоміцин сполука іматиніб (50 мг/кг) (30 мкг) - БлеоМмИВ обробка протягом З тижнів
Фіг. 45, : Нео . я п чн ї й г У з, Ще . й х нн: | к І; оо, і т як Й жу: жу а фот ко Й масі Блеоміцин 3 шк . т ТМ ту ож ях : пр ож. І дк. | 7 а: ЗЕ | ж вч «Я Р з к й І сок - ро що т дк х вояк ше птоз смабся Досліджувана сполука (30 мг/кг Іматиніб (50 мг/кг) фіг, 43 в 40 що 8 нн, Ге Сн щ 1 вання Ж - 5 За ОХ де ЕЕ БК СТЕР ИА шо кине ке що 5 нин СИН - в - КО й мо Й Бони пі жтя ее но 2 Жож вишех що пори а цк Ко ОВ до о 20- воло «що т а. р х ЕК я меня вит | дишкно - кий 15 ; Яни і ЯНА о ин хх у -6 55 я й І рес і КЕ; і 18 з ан ся мож з х 3 р пий УК х8. ; Оу до ож н КЕ т і с о ай Ме З Р СЕ рев 05 о Си и мя ие Ка Ох ку ери Се 03 т песни реа ж шу : Бдеоміцин о Люосліюжувана загин Контролі ї болекічн Їматинію (50 мкг) ЇО мкг я- Блеоміцин обробка протягом З тижнів
Фіг. 44
7.0 (15 ях З жк х о я ля ш реа ! ле СУ ше щі ЕВ іх оті пики поет с ноя. питан тк од У СД ри ще і ск Со ля т В 04-Х ше що є» « ся режи пк во од -- ня лах Ем Ж С зання пики ЩЕ: Ж, ЗХ нн СИ Дт «Кв ках он паскх пев от а ней МИ ПОВЕ ше - ЕК ин Ек 2 в'я па вн м вий Ор ЖУ Ге ло ; п яке ЧЕ о : ди ик пі Е ща ах Др ит га; нь, щі Б у Ен вна ре пн пока да ОО Я й КЕ ооіБМ шу що ДОА Контролї Блеоміцин Блебмііяї Десеілкувана Іматиніб сполукЯ , Зм я бе (50 мг/кг) МОСІ ж (50 мок) я- Блеоміцин (блтижднів) обробка протягом З тижнів «Фіг. 45 ки пови ше с нн кн Кк ндя и коза ше ннжжккннні одн і масі Блеоміцин З ж МИСІ З Ж Блеоміцин Б ж ; | я еко ше.
а 6. | ; совет шо ж шу ЩЕ Досліджувана сполука (30 мг/кг) Іматиніб 50 мг/кг)
Фіг. 46
Б 45 Ге ло р щ дух ; па т 4 С - 5 у ро ро шо ги де ах 354 ння сао що Ох х Дис 8 зд Ох п В ; ше БК 8 як ме ржя Б В вис ГЕ Б 00 о 5 ва й Кох Же жк ве 2.0 они я - де дише
В. 15 КО С пе З, З ї . щени я ло де Б шоє Ох Де Ки 5 1 з Б ДЖ Я 4 05 я А ДН - З ру век ад Ми й й Ва Контрозі Блеоміцин Блеохіцин Досліджувана матиній Е сполука ЗК я би (0 мок) МоСІ Зк (Ю мгаг ) я Блеоміцин (б тижднів) обробка протягом З тижнів «Фіг. 5 кі : й 5 5 ще ЕШка НИ З Я а сія Не Кос БУ СУ Ша Е мех: - й он -е і о Е 5 що в, РО в КЗ жкж що» що йо ж - КО її ж в З Я я - 5 го т є Я Ор в 4 ях т В АХ Е Бо ія Е РО Яй Бех щі шо КОЯ Б ш мок Лот яЯ зм- БО ря я 2 І 3 5 оба гом 5 о Бе ШУ 5 т ій ще АД р а о Є ру ок ой І Ва о 8 нка 55 Я 0 КЯ во 0 9 5 Б іще я і ше Боя о; ШО й : Ше ШЕ вх Я М ОО в ев Ше пі о Б Кл се віч щі Б ре Ра/Ра Лек-! Досліджу. Іматиніб Ра/Ра Тек! боспідку. Тматиціб взна (30 мг/кг вана н я сполука. М сполука Ї5О мг/кг)
Фіг. Я8А Фіг. 488 ю СЕ РА х СА Ж 151 в 1283 ЕЗ Би щи ще 5 в є я 4 В п5- М Ка « НІ ве г. Кх ї ба Но я ке нини г ад ля Ір БЕ бо Пе --ЯКЙ -х ш аб Бах - ЖК С -- Раз ТК лретинуннна ш РаРо 0Т5К-Ї Лосгіхвуєзко Й Фара Т9К-) Досцплхквнох кпйлукУ спюлуєа сючуг - ЗРНА ЗМА КУ СОМЕ В ЖЕНЕ! т 25 5 " я 153 т - - х щі Ї оз Т т від їх | . Б в ши ше они ше з МБ Ба М в ше хар пунш 5 виш р Іще хх В де ША пок Ж ЕХ щодаеа НК шо пдАКе го Рара 0 Те Люкчлжувкох Баве 0 ТК дДооцлжумкех Рейа ТОКЯЇ сухобджукнох сполука «китах сину
Фіг. 490 фі. ме орг. ЯОг
2 . . -- а СО Т0--- ВІО5МА, рення Б ЕМ р Ії В В нини он С жипининнннннлнижшлшлшлшжлжлшлшлшлялненинннни шт В що ся не Іс 8 ПН сх ЗНИНАНННННН Бо соду З : БО РОЯ оп зи й же Мо ще У т Коя Я дрон ВЕ НА; гЗ ЗЕ Я ЖЕ З х сх ле дн ння БОКУ т З Та о нав ввнавн ши є: Я й 5 У С Контроль Досліжувна Контроль 0бнМ 100НМ їм сполука Досліджуванасполука МАВ 5ОС-ТВ
Фіг. 50
ЗА - І У-МІРІ.тен т ки КЕ РА! Ж з ЯК др 1-й пек 88 15 ЩЕ ях ШЕ дв 5-Х . . 5. 7 я. її. Я в й Кантроль Досліджувана Контобпь 308М 0 Т00чМ Її мк сполука Догліджувана слолука МА-ЕВ З9Е-
фік. 51
ЛЯ. -- ЕЕ сленннн Д Ден я В ВЕ | . Ше шо шо й л й й Ковтооль леслітжувані Контоль ЗНМ о 0Т0ОНМ 1 мем 7 «МДосліджувана сполука МВ ЕВ
Фіг. 52
Рівень експресії МЕНК СЕВМ у нормальних фібробластах і Фібробластах з8с ж 4 ТЕ - Од З ще Ж що М і до й і ! жо 2 Ба ЗЕ х у Ех СЯ ях Е : МІ -ЕВ. БОС
Фіг. 53 Рівень експресії МРИК СЕВМ У норматьній тканині пкіри й у тканині шкіри 556 Ж 251 вв ще і Кз шо 001 Ка БО І З я | ся тк шкіра Мі. шкіра 55с
Фіг. 54
UAA201501972A 2012-08-09 2013-08-08 Лікування імуноопосередкованого захворювання (варіанти) UA116992C2 (uk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261681491P 2012-08-09 2012-08-09
US201261722718P 2012-11-05 2012-11-05
PCT/US2013/054051 WO2014025958A2 (en) 2012-08-09 2013-08-08 Treatment of immune-related and inflammatory diseases

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA116992C2 true UA116992C2 (uk) 2018-06-11

Family

ID=49029213

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201501972A UA116992C2 (uk) 2012-08-09 2013-08-08 Лікування імуноопосередкованого захворювання (варіанти)

Country Status (30)

Country Link
US (2) US10919883B2 (uk)
EP (2) EP2882441B1 (uk)
JP (2) JP6250671B2 (uk)
KR (3) KR102266509B1 (uk)
CN (4) CN108938642A (uk)
AU (1) AU2013299625B2 (uk)
BR (1) BR112015002272A2 (uk)
CA (2) CA2881113C (uk)
CY (1) CY1123106T1 (uk)
DK (1) DK2882441T3 (uk)
EA (1) EA029085B1 (uk)
ES (1) ES2800026T3 (uk)
HK (1) HK1211474A1 (uk)
HR (1) HRP20200836T1 (uk)
HU (1) HUE049569T2 (uk)
IL (1) IL237070B (uk)
LT (1) LT2882441T (uk)
MX (1) MX2015001686A (uk)
NI (1) NI201500013A (uk)
NZ (2) NZ628077A (uk)
PH (1) PH12015500276A1 (uk)
PL (1) PL2882441T3 (uk)
PT (1) PT2882441T (uk)
RS (1) RS60416B1 (uk)
SG (1) SG11201500983RA (uk)
SI (1) SI2882441T1 (uk)
TW (1) TWI641371B (uk)
UA (1) UA116992C2 (uk)
WO (1) WO2014025958A2 (uk)
ZA (1) ZA201500466B (uk)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2536706B1 (en) 2010-02-11 2017-06-14 Celgene Corporation Arylmethoxy isoindoline derivatives and compositions comprising and methods of using the same
EP2699091B1 (en) 2011-03-28 2017-06-21 DeuteRx, LLC 2',6'-dioxo-3'-deutero-piperdin-3-yl-isoindoline compounds
US20150038511A1 (en) 2012-08-09 2015-02-05 Celgene Corporation Treatment of immune-related and inflammatory diseases
US9540340B2 (en) 2013-01-14 2017-01-10 Deuterx, Llc 3-(5-substituted-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)-3-deutero-piperidine-2,6-dione derivatives and compositions comprising and methods of using the same
US9695145B2 (en) 2013-01-22 2017-07-04 Celgene Corporation Processes for the preparation of isotopologues of 3-(4-((4- morpholinomethyl)benzyl)oxy)-1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione and pharmaceutically acceptable salts thereof
EP2968334A4 (en) 2013-03-14 2016-08-03 Deuterx Llc 3- (SUBSTITIERTES-4-OXO-quinazolin-3 (4H) -yl) -3-deutero-PIPERIDINE-2,6-DIONE DERIVATIVES
WO2015179279A1 (en) * 2014-05-19 2015-11-26 Celgene Corporation Treatment of immune-related and inflammatory diseases
EP3145513B1 (en) * 2014-05-19 2023-11-15 Celgene Corporation 3-(4-((4-(morpholinomethyl-benzyl)oxy)-1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione for the treatment of systemic lupus erythematosus
US9809603B1 (en) 2015-08-18 2017-11-07 Deuterx, Llc Deuterium-enriched isoindolinonyl-piperidinonyl conjugates and oxoquinazolin-3(4H)-yl-piperidinonyl conjugates and methods of treating medical disorders using same
ES2875905T3 (es) 2016-07-15 2021-11-11 Acceleron Pharma Inc Composiciones que comprenden polipéptidos ActRIIA para su uso en el tratamiento de la hipertensión pulmonar
BR112021006318A2 (pt) 2018-10-01 2021-07-06 Celgene Corp terapia de combinação para o tratamento de câncer
US11719700B2 (en) 2019-03-28 2023-08-08 Alentic Microscience Inc. Upconversion for microscopy
US11255850B2 (en) 2019-03-28 2022-02-22 Alentic Microscience Inc. Bead-based analysis of a sample
US10684278B1 (en) * 2019-03-28 2020-06-16 Alentic Microscience Inc. Bead-based analysis of a sample
US11609233B2 (en) 2019-03-28 2023-03-21 Alentic Microscience Inc. Indicator-based analysis of a sample
WO2021108303A1 (en) * 2019-11-25 2021-06-03 PHPrecisionMed, LLC Pharmaceutical compositions for the treatment of pulmonary hypertension
WO2023097111A2 (en) * 2021-11-29 2023-06-01 Riptide Bioscience, Inc. Methods and compositions for treating calcinosis associated conditions
WO2024064646A1 (en) 2022-09-20 2024-03-28 Celgene Corporation Salts and solid forms of (s)- or racemic 3-(4-((4-(morpholinomethyl)benzyl)oxy)-1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione and methods of using the same

Family Cites Families (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3536809A (en) 1969-02-17 1970-10-27 Alza Corp Medication method
US3598123A (en) 1969-04-01 1971-08-10 Alza Corp Bandage for administering drugs
US3845770A (en) 1972-06-05 1974-11-05 Alza Corp Osmatic dispensing device for releasing beneficial agent
US3916899A (en) 1973-04-25 1975-11-04 Alza Corp Osmotic dispensing device with maximum and minimum sizes for the passageway
US4008719A (en) 1976-02-02 1977-02-22 Alza Corporation Osmotic system having laminar arrangement for programming delivery of active agent
HU196714B (en) 1984-10-04 1989-01-30 Monsanto Co Process for producing non-aqueous composition comprising somatotropin
IE58110B1 (en) 1984-10-30 1993-07-14 Elan Corp Plc Controlled release powder and process for its preparation
US5073543A (en) 1988-07-21 1991-12-17 G. D. Searle & Co. Controlled release formulations of trophic factors in ganglioside-lipsome vehicle
IT1229203B (it) 1989-03-22 1991-07-25 Bioresearch Spa Impiego di acido 5 metiltetraidrofolico, di acido 5 formiltetraidrofolico e dei loro sali farmaceuticamente accettabili per la preparazione di composizioni farmaceutiche in forma a rilascio controllato attive nella terapia dei disturbi mentali organici e composizioni farmaceutiche relative.
PH30995A (en) 1989-07-07 1997-12-23 Novartis Inc Sustained release formulations of water soluble peptides.
US5120548A (en) 1989-11-07 1992-06-09 Merck & Co., Inc. Swelling modulated polymeric drug delivery device
KR0166088B1 (ko) 1990-01-23 1999-01-15 . 수용해도가 증가된 시클로덱스트린 유도체 및 이의 용도
US5733566A (en) 1990-05-15 1998-03-31 Alkermes Controlled Therapeutics Inc. Ii Controlled release of antiparasitic agents in animals
US5580578A (en) 1992-01-27 1996-12-03 Euro-Celtique, S.A. Controlled release formulations coated with aqueous dispersions of acrylic polymers
TW333456B (en) 1992-12-07 1998-06-11 Takeda Pharm Ind Co Ltd A pharmaceutical composition of sustained-release preparation the invention relates to a pharmaceutical composition of sustained-release preparation which comprises a physiologically active peptide.
US5591767A (en) 1993-01-25 1997-01-07 Pharmetrix Corporation Liquid reservoir transdermal patch for the administration of ketorolac
US6087324A (en) 1993-06-24 2000-07-11 Takeda Chemical Industries, Ltd. Sustained-release preparation
IT1270594B (it) 1994-07-07 1997-05-07 Recordati Chem Pharm Composizione farmaceutica a rilascio controllato di moguisteina in sospensione liquida
CA2224381A1 (en) 1995-06-27 1997-01-16 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method of producing sustained-release preparation
TW448055B (en) 1995-09-04 2001-08-01 Takeda Chemical Industries Ltd Method of production of sustained-release preparation
JP2909418B2 (ja) 1995-09-18 1999-06-23 株式会社資生堂 薬物の遅延放出型マイクロスフイア
US5980945A (en) 1996-01-16 1999-11-09 Societe De Conseils De Recherches Et D'applications Scientifique S.A. Sustained release drug formulations
US6264970B1 (en) 1996-06-26 2001-07-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Sustained-release preparation
US5635517B1 (en) 1996-07-24 1999-06-29 Celgene Corp Method of reducing TNFalpha levels with amino substituted 2-(2,6-dioxopiperidin-3-YL)-1-oxo-and 1,3-dioxoisoindolines
US6419961B1 (en) 1996-08-29 2002-07-16 Takeda Chemical Industries, Ltd. Sustained release microcapsules of a bioactive substance and a biodegradable polymer
CA2217134A1 (en) 1996-10-09 1998-04-09 Sumitomo Pharmaceuticals Co., Ltd. Sustained release formulation
ES2221019T3 (es) 1996-10-31 2004-12-16 Takeda Chemical Industries, Ltd. Preparacion de liberacion mantenida.
WO1998027980A2 (en) 1996-12-20 1998-07-02 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method of producing a sustained-release preparation
US5891474A (en) 1997-01-29 1999-04-06 Poli Industria Chimica, S.P.A. Time-specific controlled release dosage formulations and method of preparing same
SK13642000A3 (sk) 1998-03-16 2001-04-09 Celgene Corporation 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)izoindolínové deriváty, farmaceutický prostriedok s ich obsahom a ich použitie
US6613358B2 (en) 1998-03-18 2003-09-02 Theodore W. Randolph Sustained-release composition including amorphous polymer
KR19990085365A (ko) 1998-05-16 1999-12-06 허영섭 지속적으로 약물 조절방출이 가능한 생분해성 고분자 미립구 및그 제조방법
US6248363B1 (en) 1999-11-23 2001-06-19 Lipocine, Inc. Solid carriers for improved delivery of active ingredients in pharmaceutical compositions
US6984522B2 (en) * 2000-08-03 2006-01-10 Regents Of The University Of Michigan Isolation and use of solid tumor stem cells
JP2004526419A (ja) 2000-10-16 2004-09-02 フィロス インク． 抗体模倣物および他の結合タンパク質のためのタンパク質骨格
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
DK1390535T3 (da) 2001-04-26 2010-12-06 Amgen Mountain View Inc Kombinatoriske biblioteker af monomer-domæner
GB0120441D0 (en) 2001-08-22 2001-10-17 Novartis Forschungsstiftung Model of autoimmune disease and methods for identifying anti autoimmune disease disorders
US7173032B2 (en) * 2001-09-21 2007-02-06 Reddy Us Therapeutics, Inc. Methods and compositions of novel triazine compounds
AU2005307789A1 (en) 2004-11-16 2006-05-26 Avidia Research Institute Protein scaffolds and uses thereof
CA2652043A1 (en) * 2006-05-12 2007-11-22 University Of Miami Biomarkers for detection and diagnosis of head and neck squamous cell carcinoma
US20080045485A1 (en) 2006-08-17 2008-02-21 Peter Muir Methods of diagnosing synovial disease in a mammal by detecting bacterial DNA in synovial tissues from dogs with inflammatory knee arthritis and degenerative anterior cruciate ligament rupture
AU2007334436A1 (en) 2006-12-15 2008-06-26 Abbott Laboratories Novel oxadiazole compounds
JP2010522170A (ja) 2007-03-20 2010-07-01 セルジーン コーポレイション ４’−ｏ−置換イソインドリン誘導体および該誘導体を含有する組成物およびその使用方法
MX2009010400A (es) 2007-03-30 2010-02-18 Chu Sainte Justine Método para la determinacion de riesgo de escoliosis.
JP5442185B2 (ja) 2007-04-24 2014-03-12 日本メナード化粧品株式会社 感作性物質評価方法
JP5719762B2 (ja) * 2008-03-31 2015-05-20 ボストン メディカル センター コーポレーション トポイソメラーゼｉ阻害剤のための予測マーカー
WO2009126310A2 (en) 2008-04-10 2009-10-15 Massachusetts Institute Of Technology Methods for identification and use of agents targeting cancer stem cells
PT2376480T (pt) 2008-12-05 2016-10-26 Abbvie Inc Derivados de sulfonamida como agentes indutores de apoptose seletivos de bcl-2 para o tratamento do cancro e de doenças imunes
AU2010236168B2 (en) 2009-04-18 2015-08-13 Genentech, Inc. Methods for assessing responsiveness of B-cell lymphoma to treatment with anti-CD40 antibodies
EP2536706B1 (en) 2010-02-11 2017-06-14 Celgene Corporation Arylmethoxy isoindoline derivatives and compositions comprising and methods of using the same
CA2791905A1 (en) * 2010-03-01 2011-09-09 Caris Life Sciences Luxembourg Holdings, S.A.R.L. Biomarkers for theranostics
WO2012024543A1 (en) 2010-08-18 2012-02-23 Caris Life Sciences Luxembourg Holdings Circulating biomarkers for disease
US20140141986A1 (en) 2011-02-22 2014-05-22 David Spetzler Circulating biomarkers
BR112013032232A2 (pt) * 2011-06-16 2016-09-20 Caris Life Sciences Switzerland Holdings S A R L método de caracterização de câncer através do uso de biomarcador de ácido nucleico
EP3904875A1 (en) 2012-06-29 2021-11-03 Celgene Corporation Methods for determining drug efficacy using ikzf3 (aiolos)
US20140343058A1 (en) 2012-08-09 2014-11-20 Celgene Corporation Treatment of systemic lupus erythematosus
US20150038511A1 (en) 2012-08-09 2015-02-05 Celgene Corporation Treatment of immune-related and inflammatory diseases
UA117141C2 (uk) 2013-10-08 2018-06-25 Селджин Корпорейшн Склади (s)-3-(4-((4-(морфолінометил)бензил)оксі)-1-оксоізоіндолін-2-іл)піперидин-2,6-діону
EP3145513B1 (en) 2014-05-19 2023-11-15 Celgene Corporation 3-(4-((4-(morpholinomethyl-benzyl)oxy)-1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione for the treatment of systemic lupus erythematosus

Also Published As

Publication number Publication date
KR20200058606A (ko) 2020-05-27
HRP20200836T1 (hr) 2020-08-07
KR20210073616A (ko) 2021-06-18
NI201500013A (es) 2019-05-10
EP2882441A2 (en) 2015-06-17
CN104703605A (zh) 2015-06-10
LT2882441T (lt) 2020-07-27
CN108938642A (zh) 2018-12-07
EP3741372A1 (en) 2020-11-25
CY1123106T1 (el) 2021-10-29
BR112015002272A2 (pt) 2017-07-04
RS60416B1 (sr) 2020-07-31
WO2014025958A2 (en) 2014-02-13
AU2013299625A1 (en) 2015-02-12
CA3092279A1 (en) 2014-02-13
TW201408298A (zh) 2014-03-01
HUE049569T2 (hu) 2020-09-28
JP2018070623A (ja) 2018-05-10
EP2882441B1 (en) 2020-04-29
CN114939119A (zh) 2022-08-26
JP2015527349A (ja) 2015-09-17
SG11201500983RA (en) 2015-04-29
KR102266509B1 (ko) 2021-06-16
US20210340132A1 (en) 2021-11-04
KR102118559B1 (ko) 2020-06-03
PT2882441T (pt) 2020-06-29
AU2013299625B2 (en) 2018-02-01
HK1211474A1 (en) 2016-05-27
MX2015001686A (es) 2015-04-10
KR20150039848A (ko) 2015-04-13
TWI641371B (zh) 2018-11-21
PL2882441T3 (pl) 2020-09-21
JP6250671B2 (ja) 2017-12-20
CA2881113C (en) 2020-10-27
JP6595565B2 (ja) 2019-10-23
EA201590342A1 (ru) 2015-07-30
US10919883B2 (en) 2021-02-16
SI2882441T1 (sl) 2020-08-31
CN115068484A (zh) 2022-09-20
EA029085B1 (ru) 2018-02-28
PH12015500276A1 (en) 2015-04-27
CA2881113A1 (en) 2014-02-13
CA3092279C (en) 2023-08-08
DK2882441T3 (da) 2020-05-25
NZ628077A (en) 2017-04-28
NZ727295A (en) 2018-06-29
US20140045844A1 (en) 2014-02-13
ES2800026T3 (es) 2020-12-23
IL237070A0 (en) 2015-03-31
ZA201500466B (en) 2016-06-29
IL237070B (en) 2019-06-30
WO2014025958A3 (en) 2014-04-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA116992C2 (uk) Лікування імуноопосередкованого захворювання (варіанти)
US11524950B2 (en) Treatment of immune-related and inflammatory diseases
EA029485B1 (ru) Способы лечения рака, выбранного из лимфомы, лейкоза, миеломы, глиобластомы, рака ободочной и прямой кишки и печеночно-клеточной карциномы, с использованием 3-(4-((4-(морфолинометил)бензил)окси)-1-оксоизоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-диона
JP2018534252A (ja) 腫瘍細胞を非腫瘍細胞に変換するための医薬的連合体及びその使用
US9717727B2 (en) Methods of treating and preventing leukemia and other cancers of the blood and bone
JP7236134B2 (ja) 腫瘍細胞を非腫瘍細胞に変換するための医薬的連合体及びその使用
CN109715191A (zh) 将赘生性细胞转化成非赘生性细胞的药物缔合物及其用途
WO2000016755A2 (en) Antiviral combinations of lamivudine and adefovir
Grisafi et al. Ibrutinib: from bench side to clinical implications
WO2015179279A1 (en) Treatment of immune-related and inflammatory diseases
WO2015187847A1 (en) Use of prostaglandin e1 (pge1) and misoprostol for treating chronic myelogenous/myeloid leukemia (cml)
CA3216296A1 (en) Inhibitors of ubiquitin specific peptidase 22 (usp22) and uses thereof for treating diseases and disorders
JP3981739B2 (ja) 抗癌剤、癌細胞の増殖を抑制する方法
KR20130069641A (ko) 피리미디닐 인돌 화합물
UA110965C2 (uk) Застосування 3-(5-аміно-2-метил-4-оксохіназолін-3(4h)-іл)-піперидин-2,6-діону в лікуванні імунних і запальних захворювань