EA017849B1

EA017849B1 - Соагонисты глюкагоновых/glp-1-рецепторов

Info

Publication number: EA017849B1
Application number: EA200901108A
Authority: EA
Inventors: Джонатан Дэй; Джеймс Паттерсон; Джозеф Шабенн; Мария Димарчи; Девид Смайли; Ричард Д. Димарчи
Original assignee: Индиана Юниверсити Рисерч Энд Текнолоджи Корпорейшн
Priority date: 2007-02-15
Filing date: 2008-02-13
Publication date: 2013-03-29
Also published as: US20150126440A1; CL2008000479A1; CN101790538B; TWI547499B; WO2008101017A2; IL200396A0; EP2111414B1; IL200396A; HN2009001593A; KR20090119876A; AR065349A1; PA8769301A1; AU2008216265B2; EP2487184A1; JP2014141500A; GT200900229A; ZA200905521B; NZ578948A; DOP2009000194A; PE20090108A1

Abstract

Раскрыты модифицированные глюкагоновые пептиды, обладающие повышенной активностью на глюкагоновом рецепторе в сравнении с нативным глюкагоном. Дополнительная модификация глюкагоновых пептидов посредством образования лактамных мостиков или замены концевой карбоксильной кислоты амидной группой продуцирует пептиды, проявляющие активность соагонистов на глюкагоновом/GLP-1-рецепторе. Растворимость и стабильность этих высокоактивных аналогов глюкагона может быть дополнительно улучшена модифицированием полипептидов посредством пегилирования, замены карбоксиконцевых аминокислот либо добавления карбоксиконцевого пептида, выбранного из группы, которую составляют последовательности SEQ ID NO: 26 (GPSSGAPPPS), SEQ ID NO: 27 (KRNRNNIA) и SEQ ID NO: 28 (KRNR).

Description

Настоящая заявка претендует на приоритет по предварительной заявке на патент США № 60/890087, поданной 15 февраля 2007 г., и по предварительной заявке на патент США № 60/938565, поданной 17 мая 2007 г. Содержание упомянутых предварительных заявок полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.

Предпосылки создания изобретения

Препроглюкагон представляет собой полипептид-предшественник, состоящий из 158 аминокислот, подвергаемый процессингу в различных тканях с образованием ряда различных проглюкагоновых пептидов, в том числе глюкагона, глюкагоноподобного пептида-1 (СЬР-1), глюкагоноподобного пептида-2 (СЬР-2) и оксинтомодулина (ОХМ), которые принимают участие в разнообразных физиологических функциях, в том числе в глюкозном гомеостазе, секреции инсулина, опорожнении желудка и в росте организма вследствие усвоения пищи в кишечнике, а также в регулировании потребления пищи. Глюкагон представляет собой пептид, состоящий из 29 аминокислот, соответствующих аминокислотам 33-61 препроглюкагона, в то время как СЬР-1 продуцируется в виде пептида длиной в 37 аминокислот, соответствующих аминокислотам 72-108 препроглюкагона. Амид СЬР-1(7-36) либо кислота СЬР-1(7-37) являются биологически сильнодействующими формами СЬР-1, проявляющими по сути эквивалентную активность на СЬР-1-рецепторе.

Гипогликемия наблюдается в том случае, когда уровень глюкозы в крови падает слишком низко для обеспечения достаточного количества энергии для жизнедеятельности организма. У взрослых и детей старше 10 лет гипогликемия наблюдается редко, кроме тех случаев, когда она является побочным эффектом лечения диабета, однако она может быть следствием применения других лекарственных препаратов, заболеваний, гормональной или ферментной недостаточности или опухолей. Когда уровень глюкозы в крови начинает опускаться, глюкагон, гормон, продуцируемый поджелудочной железой, подает сигнал печени для расщепления гликогена и выделения глюкозы, что приводит к повышению уровня глюкозы в крови до нормального уровня. Таким образом, общая роль глюкагона в регулировании уровня глюкозы заключается в нейтрализации воздействия инсулина и поддержании уровня глюкозы в крови. Однако у больных диабетом подобная реакция глюкагона на гипогликемию может быть ослаблена, что затрудняет возвращение уровня глюкозы в пределы нормального диапазона.

Гипогликемия является состоянием, представляющим угрозу для жизни, которое требует немедленной медицинской помощи. Введение глюкагона является общепринятым способом лекарственной терапии при лечении острой гипогликемии, посредством которого можно восстановить нормальный уровень глюкозы в течение нескольких минут после введения. В случае применения глюкагона при экстренном лечении гипогликемии, кристаллическую форму глюкагона растворяют в разбавленном кислом буфере, и раствор вводят внутримышечным путем. Несмотря на эффективность упомянутого лечения, методика его проведения тягостна и опасна для лица, находящегося в полубессознательном состоянии. Следовательно, существует потребность в аналоге глюкагона, который сохраняет либо превосходит биологические характеристики исходной молекулы, однако является в достаточной степени растворимым и стабильным, в соответствующих физиологических условиях, чтобы его можно было заранее изготовлять в виде раствора, готового для инъекций.

Кроме того, больным диабетом рекомендуется поддерживать уровень глюкозы в крови, близкий к норме, для отсрочки либо профилактики возникновения микрососудистых осложнений. Достижение этой цели требует, как правило, проведения интенсивной инсулинотерапии. В стремлении к достижению этой цели, врачи столкнулись со значительным повышением частоты и тяжести гипогликемии у больных диабетом. Следовательно, имеется потребность в улучшенных фармацевтических препаратах и усовершенствованных методиках лечения диабета, которые обладают меньшей вероятностью индуцирования гипогликемии, по сравнению с современными методами инсулинотерапии.

СЬР-1 по сравнению с глюкагоном имеет иную биологическую активность. К числу его воздействий относится стимулирование синтеза и секреции инсулина, угнетение секреции глюкагона и удерживание от потребления пищи. Было показано, что СЬР-1 снижает тяжесть гипергликемии (повышенный уровень глюкозы) у больных диабетом. Эксендин-4, пептид из яда ящериц, аминокислотный состав которого почти на 50% совпадает с аминокислотным составом СЬР-1, активизирует СЬР-1-рецептор и так же, как было показано, снижает тяжесть гипергликемии у больных диабетом.

Имеются также данные о том, что СЬР-1 и эксендин-4 могут снижать потребление пищи и стимулировать снижение массы тела, т.е. оказывать эффект, являющийся благотворным не только для больных диабетом, но и для больных, страдающих ожирением. У больных, страдающих ожирением, имеется большой риск развития диабета, гипертензии, гиперлипидемии, сердечно-сосудистых заболеваний и заболеваний опорно-двигательного аппарата.

Таким образом, сохраняется потребность в альтернативных и предпочтительно усовершенствованных методах лечения диабета и ожирения.

Суть изобретения

В соответствии с настоящим описанием предлагаются высокоэффективные аналоги агонистов глюкагона, которые проявляют также повышенную активность на глюкагоновом рецепторе и в соответствии

- 1 017849 с описанными ниже вариантами осуществления проявляют повышенную биофизическую стабильность и/или растворимость в воде. Кроме того, в соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предлагаются аналоги агонистов глюкагона, утратившие избирательность нативного глюкагона в отношении глюкагоновых рецепторов, по сравнению с ОЬР-1-рецепторами, и, тем самым, представляющие собой соагонисты двух упомянутых рецепторов. Посредством определенных модификаций аминокислот аналогов глюкагона можно контролировать относительную активность упомянутого аналога на ОЬР-1рецепторе, по сравнению с относительной активностью на глюкагоновом рецепторе. Таким образом, в соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения предлагаются аналоги соагониста глюкагона, обладающие повышенной активностью на глюкагоновом рецепторе, по сравнению с активностью на ОЬР-1-рецепторе, аналоги соагониста глюкагона, обладающие приблизительно эквивалентной активностью на обоих рецепторах, и аналоги соагониста глюкагона, обладающие повышенной активностью на ОЬР-1-рецепторе, по сравнению с активностью на глюкагоновом рецепторе. Соагонист последней упомянутой категории может быть сконструирован методами генной инженерии для проявления незначительной активности либо полного ее отсутствия на глюкагоновом рецепторе с одновременным сохранением способности активизирования ОЬР-1-рецептора с такой же самой либо лучшей активностью, нежели нативный ОЬР-1. Любой из этих аналогов может также включать модификации, наделяющие их повышенной биофизической стабильностью и/или растворимостью в воде.

Аналоги глюкагона, проявляющие соагонизм на глюкагоновых и ОЬР-1-рецепторах, полезны для нескольких вариантов применения. Прежде всего, применение глюкагона для лечения гипогликемии может привести к гиперкомпенсации низкого уровня глюкозы в крови, следствием чего может быть избыточный уровень глюкозы в крови. При введении соагониста глюкагоновых/ОЬР-1-рецепторов, дополнительная стимуляция ОЬР-1-рецепторов может смягчать воздействие глюкагонового агониста с предотвращением избыточного уровня глюкозы в крови, являющегося следствием лечения гипогликемии.

Кроме того, в соответствии с приведенным описанием аналоги соагониста глюкагона, соответствующие настоящему изобретению, могут применяться для регулирования содержания глюкозы в крови при гипергликемии, стимулирования снижения массы тела либо предотвращения прироста массы тела при введении отдельно либо в комбинации с другими противодиабетическими препаратами либо лекарственными средствами против ожирения. Другим соединением, стимулирующим снижение массы тела, является оксинтомодулин, природный пищеварительный гормон, обнаруживаемый в тонкой кишке (см. И1аЬе1С8, 2005; 54:2390-2395). Оксинтомодулин представляет собой пептид, состоящий из 37 аминокислот, включающий последовательность глюкагона из 29 аминокислот (т.е. последовательность ХЕО ΙΌ N0: 1), за которой следует карбоксиконцевой удлиняющий сегмент (последовательность ХЕО ΙΌ N0: 27), состоящий из 8 аминокислот (ΚΚΝΚΝΝΙΑ). Настоящим изобретением предусматривается, что аналоги глюкагона, раскрытые в настоящем описании, могут факультативно соединяться с упомянутым карбоксиконцевым удлиняющим сегментом (последовательность ХЕО ΙΌ N0: 27), состоящим из 8 аминокислот, однако некоторые варианты осуществления настоящего изобретения также конкретно предусматривают аналоги и применение аналогов, лишенных упомянутых 8 прилегающих аминокислот карбоксильного конца последовательности ХЕО ΙΌ N0: 27.

Модифицированием аминокислот могут быть получены соединения, специально предназначенные для регулирования активности упомянутого пептида по отношению к ОЬР-1, и, следовательно, могут быть получены аналоги глюкагона, соответствующие настоящему изобретению, обладающие особыми свойствами для лечения конкретного состояния либо заболевания. В частности, настоящим изобретением предлагаются аналоги глюкагона, где каждый аналог проявляет типичный относительный уровень активности на соответствующих глюкагоновых и ОЬР-1-рецепторах. Например, модификациям может подвергаться каждый пептид с получением глюкагонового пептида, обладающего активностью на ОЬР1-рецепторе в диапазоне по меньшей мере от приблизительно 10% (включая приблизительно 20, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 125, 150, 175%) до приблизительно 200% или более высокой по сравнению с активностью нативного ОЬР-1 и активностью на глюкагоновом рецепторе в диапазоне по меньшей мере от приблизительно 10% (включая приблизительно 20, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450%) до приблизительно 500% или более высокой по сравнению с активностью нативного глюкагона. Аминокислотная последовательность нативного глюкагона представлена последовательностью ХЕО ΙΌ N0: 1, аминокислотная последовательность амида ОЬР-1(7-36) представлена последовательностью ХЕО ΙΌ N0: 52 и аминокислотная последовательность кислоты ОЬР-1(7-37) представлена последовательностью ХЕО ΙΌ N0: 50. В иллюстративных вариантах осуществления глюкагоновый пептид может проявлять по меньшей мере 10% активности нативного глюкагона на глюкагоновом рецепторе и по меньшей мере 50% активности нативного ОЬР-1 на ОЬР-1-рецепторе, или по меньшей мере 40% активности нативного глюкагона на глюкагоновом рецепторе и по меньшей мере 40% активности нативного ОЬР-1 на ОЬР-1-рецепторе, или по меньшей мере 60% активности нативного глюкагона на глюкагоновом рецепторе и по меньшей мере 60% активности нативного ОЬР-1 на ОЬР-1-рецепторе.

Избирательность глюкагонового пептида в отношении глюкагонового рецептора по сравнению с ОЬР-1-рецептором может описываться как относительный показатель активности глюкагона к активности ОЬР-1 (активность пептида на глюкагоновом рецепторе относительно нативного глюкагона, делен

- 2 017849 ная на активность пептида на СЬР-1-рецепторе относительно нативного СЬР-1). Например, глюкагоновый пептид, проявляющий 60% активности нативного глюкагона на глюкагоновом рецепторе и 60% активности нативного СЬР-1 на СЬР-1-рецепторе, имеет 1:1 отношение активности глюкагона к активности СЬР-1. Примеры отношений активности глюкагона к активности СЬР-1 включают приблизительно 1:1, 1,5:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 или 10:1 либо приблизительно 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2 или 1:1,5. В качестве примера отношение активности глюкагона к активности СЬР-1 10:1 указывает на 10-кратную избирательность в отношении глюкагонового рецептора по сравнению с СЬР-1рецептором. Подобным же образом, отношение активности СЬР-1 к активности глюкагона 10:1 указывает на 10-кратную избирательность в отношении СЬР-1-рецептора по сравнению с глюкагоновым рецептором.

В одном из вариантов осуществления предлагаются аналоги глюкагона, обладающие повышенной активностью и оптимально улучшенной растворимостью и стабильностью. В одном из вариантов осуществления повышенная активность глюкагона обеспечивается модифицированием аминокислоты в положении 16 нативного глюкагона (последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 1). В качестве неограничивающего примера такая повышенная активность может обеспечиваться заменой природного серина в положении 16 глутаминовой кислотой либо другой отрицательно заряженной аминокислотой, имеющей боковую цепь длиной в 4 атома, или же в альтернативном варианте любой аминокислотой из группы, которую составляют глутамин, гомоглутаминовая кислота и гомоцистеиновая кислота, или заряженной аминокислотой, имеющей боковую цепь, содержащую по меньшей мере один гетероатом (например, Ν, О, 8, Р), или боковую цепь длиной приблизительно 4 атома (или 3-5 атомов). В одном из вариантов осуществления агонист глюкагона повышенной активности содержит пептид, представленный последовательностями 8ЕС ГО N0: 2, 8ЕС ГО N0: 3, 8ЕС ГО N0: 4, 81Ь) ГО N0: 5, 8ЕС ГО N0: 6, 81Ь) ГО N0: 7, либо аналог агониста глюкагона, представленный последовательностью 8ЕС ГО N0: 5. В одном из вариантов осуществления предлагается белок-аналог глюкагона, имеющий повышенную активность на глюкагоновом рецепторе относительно глюкагона дикого типа, где пептид содержит последовательности 8ЕС ГО N0: 7, 8ЕС ГО N0: 8, 8ЕС ΙΌ N0: 9 или 8ЕС ΙΌ N0: 10, и где глюкагоновый белок сохраняет свою избирательность в отношении глюкагонового рецептора по сравнению с СЬР-1-рецепторами.

Активность глюкагонового рецептора может быть снижена модифицированием аминокислоты в положении 3, например, посредством замены природного глутамина в положении 3 любой аминокислотой. Было показано, что замена в этом положении кислой, основной либо гидрофобной аминокислотой (глутаминовой кислотой, орнитином, норлейцином) значительно снижает либо ликвидирует активность глюкагонового рецептора. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления аналоги обладают приблизительно 10% или менее активности нативного глюкагона на глюкагоновом рецепторе, например приблизительно 1-10%, или приблизительно 0,1-10%, или более чем приблизительно 0,1%, но менее чем приблизительно 10%, одновременно с этим проявляя по меньшей мере 20% активности СЬР-1 на СЬР-1рецепторе. Например, иллюстративные аналоги, описание которых приводится в этом документе, обладают приблизительно 0,5%, приблизительно 1% либо приблизительно 7% активности нативного глюкагона, в то же время проявляя по меньшей мере 20% активности СЬР-1 на СЬР-1-рецепторе.

В соответствии с другими вариантами осуществления предлагаются аналоги глюкагона, обладающие повышенной или сохраненной активностью на глюкагоновом рецепторе по сравнению с нативным глюкагоновым пептидом, но имеющие также значительно повышенную активность на СЬР-1-рецепторе. Глюкагон, как правило, имеет приблизительно 1% активности нативного СЬР-1 на СЬР-1-рецепторе, в то время как СЬР-1, как правило, имеет менее чем приблизительно 0,01% активности нативного глюкагона на глюкагоновом рецепторе. Повышенная активность на СЬР-1-рецепторе обеспечивается посредством замены карбоксильной группы С-концевой аминокислоты нейтральной по заряду группой, такой как амид либо сложный эфир. В одном из вариантов осуществления эти аналоги глюкагона содержат последовательность 8ЕС ГО N0: 20, где карбоксиконцевая аминокислота имеет амидную группу вместо карбоксильной группы, находящейся в нативной аминокислоте. Эти аналоги глюкагона имеют сильную активность как на глюкагоновых, так и на СЬР-1-рецепторах и, таким образом, выступают на обоих рецепторах в качестве соагонистов. В одном из вариантов осуществления предлагается соагонист глюкагонового и СЬР-1-рецептора, где пептид содержит последовательность 8ЕС ГО N0: 20, в которой аминокислотой в положении 28 является Аки или Ьук и аминокислотой в положении 29 является амид ТНг.

Повышенная активность на СЬР-1-рецепторе обеспечивается также благодаря стабилизации αспиральной структуры С-концевой части глюкагона (приблизительно аминокислоты 12-29) посредством образования внутримолекулярного мостика между боковыми цепями двух аминокислот, разделенных тремя промежуточными аминокислотами. В соответствии с другими вариантами осуществления мостик или линкер имеет приблизительно 8 (либо приблизительно 7-9) атомов в длину и образуется между боковыми цепями аминокислот в положениях 12 и 16, или в положениях 16 и 20, или в положениях 20 и 24, или в положениях 24 и 28. Боковые цепи этих аминокислот могут связываться между собой посредством водородных связей либо ионных взаимодействий, таких как образование солевых мостиков, или с помощью ковалентных связей. В одном из вариантов осуществления предлагается агонист глюкагона, содержащий глюкагоновый пептид с последовательностью 8ЕС ГО N0: 20, где лактамный цикл образуется

- 3 017849 между боковыми цепями остатка лизина, находящегося в положении 12, 20 либо 28, и остатком глутаминовой кислоты, находящимся в положении 16 либо 24, где две аминокислоты глюкагонового пептида, боковые цепи которых участвуют в образовании лактамного цикла, отделены одна от другой тремя промежуточными аминокислотами. В одном из вариантов осуществления лактамсодержащий аналог глюкагона содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которую составляют последовательности 8ЕО ГО N0: 11, 8ЕО ГО N0: 12, 8ЕО ГО N0: 13, 8ЕО ГО N0: 14, 8ЕО ГО N0: 15, 8ЕО ГО N0: 16, 8Е0 ГО N0: 17 и 8ЕС ГО N0: 18. В одном из вариантов осуществления карбоксиконцевая аминокислота лактамсодержащего пептида содержит амидную группу либо сложноэфирную группу вместо концевой карбоксильной группы. В одном из вариантов осуществления глюкагоновый пептид с последовательностями 8ЕО ГО N0: 11, 8ЕО ГО N0: 12, 8ЕО ГО N0: 13, 8ЕО ГО N0: 14, 8ЕО ГО N0: 15, 8ЕО ГО N0: 16, 8Е0 ГО N0: 17 и 8ЕС ГО N0: 18 дополнительно содержит дополнительную аминокислоту, ковалентно присоединенную к карбоксильному концу последовательностей 8ЕС ГО N0: 11, 8ЕС ГО N0: 12, 8ЕО ГО N0: 13, 8ЕО ГО N0: 14, 8ЕО ГО N0: 15, 8ЕО ГО N0: 16, 8ЕО ГО N0: 17 и 8ЕО ГО N0: 18. В соответствии с еще одним вариантом осуществления предлагается глюкагоновый пептид, который содержит последовательность, выбранную из группы, которую составляют последовательности 8ЕС ГО N0: 66, 8Е0 ГО N0: 67, 8Е0 ГО N0: 68 и 8ЕС ГО N0: 69, и также содержит дополнительную аминокислоту, ковалентно присоединенную к карбоксильному концу последовательностей 8ЕС ГО N0: 66, 8ЕС ГО N0: 67, 8Е0 ГО N0: 68 и 8ЕС ГО N0: 69. В одном из вариантов осуществления аминокислотой в положении 28 является аспарагин либо лизин и аминокислотой в положении 29 является треонин.

Повышенная активность на СЬР-1-рецепторе обеспечивается также модифицированием аминокислоты в положении 20. В одном из вариантов осуществления глутамин в положении 20 заменяют другой гидрофильной аминокислотой, имеющей боковую цепь, которая заряжена или же обладает способностью к образованию водородной связи и имеет в длину по меньшей мере приблизительно 5 (или приблизительно 4-6) атомов, например лизином, цитруллином, аргинином либо орнитином.

Любая из описанных выше модификаций, которая повышает или снижает активность глюкагонового рецептора и которая повышает активность СЬР-1-рецептора, может осуществляться отдельно либо комбинировано. Комбинации модификаций, повышающих активность СЬР-1-рецептора, как правило, обеспечивают более высокую активность СЕР-1. нежели любая из таких модификаций по отдельности. Например, настоящее изобретение предлагает аналоги глюкагона, содержащие модификации в положении 16, в положении 20 и на С-концевой карбоксильной группе, факультативно с ковалентной связью между аминокислотами в положениях 16 и 20; аналоги глюкагона, содержащие модификации в положении 16 и на С-концевой карбоксильной группе; аналоги глюкагона, содержащие модификации в положениях 16 и 20, факультативно с ковалентной связью между аминокислотами в положениях 16 и 20; и аналоги глюкагона, содержащие модификации в положении 20 и на С-концевой карбоксильной группе; факультативно при условии, что аминокислотой в положении 12 не является Агд; или же факультативно при условии, что аминокислотой в положении 9 не является С1и.

Другие модификации в положении 1 или положении 2, как описано в данном документе, могут повысить устойчивость пептида к расщеплению дипептидилпептидазой IV (ЭРР IV). Например, аминокислота в положении 2 может быть заменена Ό-серином, аланином, Ό-аланином, валином, глицином, N метилсерином, №метилаланином или же аминоизомасляной кислотой. В альтернативном варианте или же в дополнение к нему аминокислота в положении 1 может быть заменена Ό-гистидином, дезаминогистидином, гидроксилгистидином, ацетилгистидином, гомогистидином, №метилгистидином, αметилгистидином, имидазолуксусной кислотой или же α,α-диметилимидазолуксусной кислотой (ΌΜΙΑ). Наблюдалось, что модификации в положении 2 (например, аминоизомасляная кислота (ΑΙΒ) в положении 2) и в некоторых случаях модификации в положении 1 могут снижать активность глюкагона, иногда значительно; неожиданно подобное снижение активности глюкагона может быть восстановлено с помощью ковалентной связи между аминокислотами в положениях 12 и 16, 16 и 20 либо 20 и 24, например, лактамного мостика между глутаминовой кислотой в положении 16 и лизином в положении 20.

В соответствии с другими вариантами осуществления любое из предшествующих соединений может быть дополнительно модифицировано для повышения стабильности модифицированием аминокислоты в положении 15 последовательности 8ЕС ГО N0: 1 для снижения разложения пептида со временем, особенно в кислотных либо щелочных буферах.

В соответствии с другим вариантом осуществления растворимость глюкагоновых пептидов, раскрытых в настоящем описании, повышается посредством ковалентного присоединения гидрофильной составляющей к пептиду. В одном из вариантов осуществления гидрофильной составляющей является полиэтиленгликолевая (РЕС) цепь, факультативно присоединенная к пептиду в одном либо нескольких положениях 16, 17, 21, 24, 29 либо на С-конце. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления нативную аминокислоту в этом положении заменяют аминокислотой, имеющей боковую цепь, пригодную для образования мостиковых связей с гидрофильными составляющими, для облегчения присоединения гидрофильной составляющей к пептиду. В соответствии с другими вариантами осуществления к пептиду на С-конце добавляют аминокислоту, модифицированную для включения гидрофильной груп

- 4 017849 пы. В одном из вариантов осуществления пептид-соагонист содержит последовательность, выбранную из группы, которую составляют последовательности 8ЕО ГО N0: 11, 8Е0 ГО N0: 12, 8Е0 ГО N0: 13, 8Е0 ГО N0: 14, 5ЕО ГО N0: 15, 5ЕО ГО N0: 16, 5ЕО ГО N0: 17, 5ЕО ГО N0: 18 и 5ЕО ГО N0: 19, где боковая цепь аминокислотного остатка в одном из положений 16, 17, 21 или 24 упомянутого глюкагонового пептида дополнительно содержит полиэтиленгликолевую цепь, имеющую молекулярную массу, выбранную в диапазоне от приблизительно 500 до приблизительно 40000 Да. В одном из вариантов осуществления полиэтиленгликолевая цепь имеет молекулярную массу, выбранную в диапазоне от приблизительно 500 до приблизительно 5000 Да. В другом варианте осуществления полиэтиленгликолевая цепь имеет молекулярную массу от приблизительно 10000 до приблизительно 20000 Да. В других вариантах осуществления полиэтиленгликолевая цепь имеет молекулярную массу от приблизительно 20000 до приблизительно 40000 Да.

В соответствии с другим вариантом осуществления растворимость любого из вышеупомянутых аналогов глюкагона может быть улучшена посредством аминокислотных замен и/или добавлений, которые вводят заряженную аминокислоту в С-концевую часть пептида, предпочтительно в С-концевое положение относительно положения 27 последовательности 8Е0 ГО N0: 1. Факультативно в С-концевую часть могут быть введены одна, две или три заряженные аминокислоты предпочтительно в С-концевом направлении относительно положения 27. В одном из вариантов осуществления нативную(ые) аминокислоту(ы) в положениях 28 и/или 29 заменяют заряженными аминокислотами и/или в соответствии с другим вариантом осуществления к С-концу пептида также добавляют от одной до трех заряженных аминокислот. В дальнейших вариантах осуществления одна, две либо все заряженные аминокислоты имеют отрицательный заряд. Глюкагоновый пептид может подвергаться дополнительным модификациям, например консервативным заменам, что, тем не менее, позволяет ему сохранять активность глюкагона. В одном из вариантов осуществления предлагается пептид-аналог с последовательностью 8Е0 ГО N0: 20, где упомянутый аналог отличается от последовательности 8Е0 ГО N0: 20 1-2 заменами аминокислот в положениях 17-26, и в другом варианте осуществления упомянутый аналог отличается от пептида с последовательностью 8Е0 ГО N0: 20 заменой аминокислоты в положении 20.

В соответствии с одним из вариантов осуществления глюкагоновые пептиды, раскрытые в настоящем описании, модифицируются посредством добавления второго пептида к карбоксильному концу глюкагонового пептида, например последовательности 8Е0 ГО N0: 26, 8Е0 ГО N0: 27 либо 8Е0 ГО N0: 28. В одном из вариантов осуществления глюкагоновый пептид, имеющий пептидную последовательность, выбранную из группы, которую составляют последовательности 8Е0 ГО N0: 11, 8Е0 ГО N0: 12, 5ЕО ГО N0: 13, 5ЕО ГО N0: 14, 5ЕО ГО N0: 15, 5ЕО ГО N0: 16, 5ЕО ГО N0: 17, 5ЕО ГО N0: 18, 5ЕО ГО N0: 19, 8ЕЦ ГО N0: 66, 8Е0 ГО N0: 67, 8Е0 ГО N0: 68 и 8Е0 ГО N0: 69, ковалентно соединяется посредством пептидной связи со вторым пептидом, где второй пептид содержит последовательность, выбранную из группы, которую составляют последовательности 8Е0 ГО N0: 26, 8Е0 ГО N0: 27 и 8Е0 ГО N0: 28. В другом варианте осуществления у глюкагоновых пептидов, содержащих С-концевой удлиняющий сегмент, треонин в положении 29 нативного глюкагонового пептида заменяется глицином. Аналог глюкагона, имеющий замену треонина глицином в положении 29 и содержащий карбоксильный концевой удлиняющий сегмент последовательности 8Е0 ГО N0: 26, в четыре раза активнее на ОЬР-1-рецепторе по сравнению с нативным глюкагоном, модифицированным с включением карбоксильного концевого удлиняющего сегмента последовательности 8Е0 ГО N0: 26. Активность на ОЬР-1-рецепторе может быть дополнительно повышена посредством замены нативного аргинина в положении 18 аланином.

Таким образом, как описано в настоящем документе, предлагаются высокоэффективные аналоги глюкагона либо аналоги соагониста глюкагона, которые также проявляют повышенную растворимость и/или стабильность. Один из иллюстративных примеров высокоэффективного аналога глюкагона проявляет по меньшей мере приблизительно 200% активности нативного глюкагона на глюкагоновом рецепторе, факультативно растворим с концентрацией по меньшей мере 1 мг/мл при рН в пределах 6-8 (например, рН 7) и факультативно сохраняет по меньшей мере 95% исходного пептида (например, 5% или менее исходного пептида разлагается либо расщепляется) через 24 ч при температуре 25°С. Другой иллюстративный пример аналога соагониста глюкагона проявляет более чем приблизительно 40% либо более чем приблизительно 60% активности как на глюкагоновом рецепторе, так и на ОЬР-1-рецепторе (в соотношении в пределах приблизительно 1:3-3:1 либо в пределах приблизительно 1:2-2:1), факультативно растворим при концентрации по меньшей мере 1 мг/мл при рН в пределах 6-8 (например, рН 7) и факультативно сохраняет по меньшей мере 95% исходного пептида через 24 ч при температуре 25°С. Другой иллюстративный аналог соагониста глюкагона проявляет приблизительно 175% или более высокую активность нативного глюкагона на глюкагоновом рецепторе и приблизительно 20% либо более низкую активность нативного ОЬР-1 на ОЬР-1-рецепторе, факультативно растворим при концентрации по меньшей мере 1 мг/мл при рН в пределах 6-8 (например, рН 7) и факультативно сохраняет по меньшей мере 95% исходного пептида через 24 ч при температуре 25°С. Еще один иллюстративный аналог соагониста глюкагона проявляет приблизительно 10% или менее активности нативного глюкагона на глюкагоновом рецепторе и по меньшей мере приблизительно 20%) активности нативного ОЬР-1 на ОЬР-1-рецепторе, факультативно растворим при концентрации по меньшей мере 1 мг/мл при рН в пределах 6-8 (например,

- 5 017849 рН 7) и факультативно сохраняет по меньшей мере 95% исходного пептида через 24 ч при температуре 25°С. Еще один иллюстративный аналог соагониста глюкагона проявляет приблизительно 10% или более низкую (но выше 0,1, 0,5 либо 1%) активность нативного глюкагона на глюкагоновом рецепторе и по меньшей мере приблизительно 50, 60, 70, 80, 90 или 100% либо более высокую активность нативного СЕР-1 на СЬР-1-рецепторе, факультативно растворим при концентрации по меньшей мере 1 мг/мл при рН в пределах 6-8 (например, рН 7) и факультативно сохраняет по меньшей мере 95% исходного пептида через 24 ч при температуре 25°С. В некоторых вариантах осуществления такие аналоги глюкагона сохраняют по меньшей мере 22, 23, 24, 25, 26, 27 или 28 природных аминокислот в соответствующих положениях в нативном глюкагоне (например, имеют 1-7 модификаций, 1-5 модификаций либо 1-3 модификации по сравнению с природным глюкагоном).

Любой из приведенных ниже пептидов исключается из числа соединений, соответствующих настоящему изобретению, хотя их дополнительные модификации, которые проявляют требуемую активность соагониста, фармацевтические композиции, наборы и методы лечения, в которых применяются такие соединения, могут быть включены в настоящее изобретение: пептид последовательности 8ЕС Ш N0: 1 с [Агд12] заменой и С-концевым амидом; пептид последовательности 8ЕС Ш N0: 1 с [Агд12, Ьу520] заменами и С-концевым амидом; пептид последовательности 8ЕС Ш N0: 1 с [Агд12, Ьу824] заменами и С-концевым амидом; пептид последовательности 8ЕС Ш N0: 1 с [Агд12, Ьу829] заменами и Сконцевым амидом; пептид последовательности 8ЕС Ш N0: 1 с [С1и9] заменой; пептид последовательности 8ЕС Ш N0: 1 с отсутствующим Ηί§1, с [С1и9, С1и16, Ьу829] заменами и С-концевым амидом; пептид последовательности 8ЕС Ш N0: 1 с [С1и9, С1и16, Ьу829] заменами и С-концевым амидом; пептид последовательности 8ЕС Ш N0: 1 с [Ьу813, С1и17] заменами, присоединенными через лактамный мостик, и Сконцевым амидом; пептид последовательности 8ЕС Ш N0: 1 с [Ьу817, С1и21] заменами, присоединенными через лактамный мостик, и С-концевым амидом; пептид последовательности 8ЕС Ш N0: 1 с отсутствующим Η181, с [С1и20, Ьу824] заменами, присоединенными через лактамный мостик.

В соответствии с одним из вариантов осуществления предлагается фармацевтическая композиция, содержащая любой из новых глюкагоновых пептидов, раскрытых в настоящем описании, предпочтительно стерильный и предпочтительно имеющий уровень чистоты по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%, и фармацевтически приемлемый растворитель, носитель либо наполнитель. Такие композиции могут содержать глюкагоновый пептид с концентрацией по меньшей мере 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 мг/мл или выше. В одном из вариантов осуществления фармацевтические композиции выполнены в виде водных растворов, которые стерилизуются и факультативно хранятся в различных емкостях. Соединения, соответствующие настоящему изобретению, можно применять в одном из вариантов осуществления, чтобы заранее изготовить растворы, готовые для инъекции. В других вариантах осуществления фармацевтические композиции выполнены в виде лиофилизированного порошка. Фармацевтические композиции могут дополнительно фасоваться как часть набора, который включает в себя одноразовое устройство для введения композиции больному. Емкости либо наборы могут маркироваться для хранения при комнатной либо при пониженной температуре.

В соответствии с одним из вариантов осуществления предлагается способ ускоренного повышения уровня глюкозы или лечения гипогликемии с применением заранее полученной водной композиции глюкагоновых пептидов, соответствующих настоящему изобретению. Упомянутый способ включает стадию введения эффективного количества водного раствора, содержащего новый модифицированный глюкагоновый пептид, раскрытый в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления глюкагоновый пептид пегилирован в положении 21 или 24 глюкагонового пептида, и полиэтиленгликолевая цепь имеет молекулярную массу от приблизительно 500 до приблизительно 5000 Да. В одном из вариантов осуществления раствор модифицированного глюкагона расфасовывается в устройство, применяемое для введения композиции больному, страдающему гипогликемией.

В соответствии с одним из вариантов осуществления предлагается улучшенный способ регулирования уровня глюкозы в крови у инсулинзависимых больных. Упомянутый способ включает стадии введения инсулина в количестве, терапевтически эффективном для регулирования углеводного обмена веществ при диабете, и введения нового модифицированного глюкагонового пептида, раскрытого в настоящем описании, в количестве, терапевтически эффективном для предотвращения гипогликемии, где упомянутые стадии введения осуществляются раздельно в течение промежутка времени продолжительностью 12 ч. В одном из вариантов осуществления глюкагоновый пептид и инсулин вводят одновременно в виде единой композиции, причем глюкагоновый пептид пегилирован полиэтиленгликолевой цепью, имеющей молекулярную массу, выбранную в пределах от приблизительно 5000 до приблизительно 40000 Да.

В другом варианте осуществления предлагается способ инициирования временного паралича кишечника. Упомянутый способ включает стадию введения больному одного либо нескольких глюкагоновых пептидов, раскрытых в настоящем описании.

В еще одном варианте осуществления предлагается способ лечения гипергликемии либо способ снижения прироста массы тела или инициирования снижения массы тела, который включает введение

- 6 017849 эффективного количества водного раствора, содержащего глюкагоновый пептид, соответствующий настоящему изобретению. В одном из вариантов осуществления любой способ включает введение эффективного количества композиции, содержащей агонист глюкагона, выбранный из группы, которую составляют последовательности БЕО ΙΌ N0: 11, БЕО ГО N0: 12, БЕО ГО N0: 13, БЕО ГО N0: 14, БЕО ГО N0: 15, БЕО ГО N0: 16, БЕО ГО N0: 17, БЕО ГО N0: 18 и БЕО ГО N0: 19. В другом варианте осуществления упомянутый способ включает введение эффективного количества композиции, содержащей агонист глюкагона, где агонист глюкагона содержит глюкагоновый пептид, выбранный из группы, которую составляют последовательности БЕО ГО N0: 11, БЕО ГО N0: 12, БЕО ГО N0: 13, БЕО ГО N0: 14, БЕО ГО N0: 15, БЕО ГО N0: 16, БЕО ГО N0: 17, БЕО ГО N0: 18, БЕО ГО N0: 19, БЕО ГО N0: 66, БЕО ГО N0: 67, БЕО ГО N0: 68 и БЕО ГО N0: 69, где аминокислота 29 глюкагонового пептида присоединена к второму пептиду через пептидную связь и упомянутый второй пептид содержит последовательности БЕО ГО N0: 26, БЕО ГО N0: 27 или БЕО ГО N0: 28. В других вариантах осуществления предлагаются способы лечения диабета, включающие одновременное ведение традиционной дозы либо уменьшенной дозы инсулина и глюкагонового пептида, соответствующего настоящему изобретению.

Предлагаются также способы лечения диабета с помощью глюкагонового пептида, соответствующего настоящему изобретению, без одновременного ведения инсулина.

В еще одном аспекте настоящее изобретение предлагает новые способы лечения гипергликемии и новые способы снижения аппетита либо стимулирования снижения массы тела, которые включают введение молекулы соагониста глюкагона/СЬР-1 (включая их фармацевтически приемлемые соли), которая активизирует как глюкагоновые, так и СЬР-1-рецепторы. Агонизм, т.е. активизация, как глюкагоновых, так и СЬР-1-рецепторов, обеспечивает при лечении гипергликемии неожиданное улучшение по сравнению только с агонизмом СЬР-1. Таким образом, добавление глюкагонового агонизма обеспечивает неожиданный аддитивный или синергический эффект либо другое(ие) неожиданное(ые) благоприятное(ые) клиническое(ие) воздействие(я). В соответствии с упомянутыми способами предусматривается введение с обычной дозой инсулина, уменьшенной дозой инсулина либо без инсулина. Агонизм глюкагонового рецептора также имеет непредвиденное благотворное воздействие по сравнению только с агонизмом СЬР-1 при стимулировании снижения массы тела либо предупреждении прироста массы тела.

К примерам молекул соагонистов глюкагона/СЬР-1 относятся глюкагоновые пептиды, соответствующие настоящему изобретению, аналоги СЬР-1, активизирующие как СЬР-1-рецепторы, так и глюкагоновые рецепторы, гибриды глюкагона и СЬР-1 или гибриды аналогов глюкагона и аналогов СЬР-1 либо их химически модифицированные производные. В альтернативном варианте соединение, активизирующее глюкагоновый рецептор, может вводиться одновременно с соединением, активизирующим СЬР1-рецептор (таким как аналог СЕР-1, аналог эксендина-4 либо их производные). Изобретение предусматривает также одновременное ведение аналога агониста глюкагона с аналогом агониста СЬР-1.

Такие способы лечения гипергликемии и/или снижения аппетита либо стимулирования похудания включают введение аналога глюкагона с модификацией в положении 12 (например, Агд12), факультативно в сочетании с модификациями в положении 16 и/или 20. Способы, соответствующие настоящему изобретению, включают также введение аналогов глюкагона, имеющих внутримолекулярный мостик между боковыми цепями двух аминокислот в пределах участка аминокислот 12 и 29, которые разделяются тремя промежуточными аминокислотами, например положения 12 и 16, положения 13 и 17 (например, Ьук13С1и17 либо С1и13Ьук17), положения 16 и 20, положения 17 и 21 (например, Ьук17С1и21 либо С1и17Ьук21), положения 20 и 24 либо положения 24 и 28, при факультативном условии, что аминокислота в положении 9 не является С1и, и факультативно содержащих С-концевой амид либо сложный эфир.

В соответствии с одним из вариантов осуществления из числа таких молекул соагонистов глюкагона/СЬР-1 исключаются любые аналоги глюкагона либо аналоги СЬР-1, которые согласно известному уровню техники пригодны для применения в таком способе. В другом варианте осуществления пептиды, описанные в патенте США № 6864069, действующие как агонист СЬР-1 и антагонист глюкагона при лечении диабета, также исключаются из числа молекул соагонистов глюкагона/СЬР-1. В другом варианте осуществления при лечении диабета исключается применение антагонистов глюкагона, таких как антагонисты, описанные в публикациях Ийкой е! а1., 1. Βίο1. Сйет., 264:789-794 (1989), Айи е! а1., 1. Меб. Сйет., 44:3109-3116 (2001) и Барке е! а1., Мо1. Меб., 8(5):251-262 (2002). В другом варианте осуществления оксинтомодулин или аналог глюкагона, который содержит 8 С-концевых аминокислот оксинтомодулина (последовательность БЕО ГО N0: 27), также исключаются из числа молекул соагонистов глюкагона/СЬР-1.

Ожидается, что такие способы лечения гипергликемии будут пригодны для лечения гипергликемии различных типов, в том числе диабета, сахарного диабета типа Ι, сахарного диабета типа ΙΙ, диабета беременных как инсулинзависимых, так и инсулиннезависимых, и сокращения количества осложнений, обусловленных диабетом, в том числе нефропатии, ретинопатии и сосудистых заболеваний. Предполагается, что такие способы снижения аппетита либо стимулирования снижения массы тела будут пригодны для уменьшения массы тела, предотвращения прироста массы тела, лечения ожирения различной этиологии, включая ожирение, инициированное лекарственными препаратами, и сокращения количества осложнений, связанных с ожирением, в том числе сосудистых заболеваний (коронарная болезнь сердца,

- 7 017849 инсульт, заболевания периферических сосудов, ишемическая реперфузия и т.п.), гипертензии, начальной стадии диабета типа II, гиперлипидемии, болезней костно-мышечной системы.

Все терапевтические способы, фармацевтические композиции, наборы и другие подобные варианты в то

К20 осуществления, описание которых приведено в данном документе, предусматривают, что применение термина аналоги глюкагона охватывает все его фармацевтически приемлемые соли либо сложные эфиры.

Краткое описание фигур

Фиг. 1 - столбиковая диаграмма, представляющая стабильность глюкагона Су8²¹малеимидоРЕ6_5К, инкубированного при 37°С в течение 24, 48, 72, 96, 144 и 166 ч соответственно.

Фиг. 2 - данные, полученные посредством НРЬС анализа глюкагона Су§²¹малеимидоРЕС_5К при рН 5, инкубированного при 37°С в течение 24, 72 или 144 ч соответственно.

Фиг. 3 - данные, показывающие рецептор-опосредованное индуцирование цАМФ аналогами глюкагона. Конкретнее, на фиг. 3 сравнивается индуцирование глюкагонового рецептора аналогами глюкагона Е16, К20 ·, Е15, Е16 А, Е16, К20 ▼, Е15, Е16 Е16 ►и С1ис-ХН₂ .

Фиг. 4А и 4В - данные, показывающие рецептор-опосредованное индуцирование цАМФ аналогами глюкагона. Конкретнее, на фиг. 4А сравнивается индуцирование глюкагонового рецептора аналогами глюкагона СИис-Х'1 Р ·, Е16 С1ис-ХН₂ А, Е3, Е16 С1ис-ХН₂ ▼, Огп3, Е16 С1ис-ХН₂ ◄ и Х1е3, Е16 С1ис-ХН₂ ► с нативным глюкагоном И, в то время как на фиг. 4В сравнивается индуцирование СЬР-1рецептора аналогами глюкагона С1пс-ХН₂ Е16 С1ис-ХН₂ А, Е3, Е16 С1пс-ХН₂ ▼, Огп3, Е16 С1исХН₂ ◄ и Х1е3, Е16 С1ис-ХН₂ с нативным СйР-1 ·.

Фиг. 5А и 5В - данные, показывающие рецептор-опосредованное индуцирование цАМФ аналогами глюкагона. Конкретнее, на фиг. 5А сравнивается индуцирование глюкагонового рецептора аналогами глюкагона (Е16, К20 С1ис-ХН₂ ® (5 нМ, концентрированный раствор), Е15, Е16 С1ис-ХН₂ А (5 нМ, концентрированный раствор), Е16, К20 С1ис-ХН₂ ▼ (10 нМ, концентрированный раствор), Е15, Е16 С1ис-ХН₂ (10 нМ, концентрированный раствор) и Е16 С1ис-ХН₂ ►), с глюкагоном-ХН₂ (), время как на фиг. 5В сравнивается индуцирование СЬР-1-рецептора аналогами глюкагона (Е16, 61ис-ХН₂ ·, Е15, Е16 61ис-ХН₂ А _и Е16 61ис-ХН₂^) с 6ЬР-1 (') и ХН₂-глюкагоном (□).

Фиг. 6А и 6В - данные, показывающие рецептор-опосредованное индуцирование цАМФ аналогами глюкагона. Конкретнее, на фиг. 6А сравнивается индуцирование глюкагонового рецептора аналогами глюкагона (С1ис-ХН₂ К12Е16-ХН₂-лактам А, Е16К20-ХН₂-лактам ▼, К20Е24-ХН₂-лактам ◄ и

Е24К28-ХН₂-лактам ►) с глюкагоном (И), в то время как на фиг. 6В сравнивается индуцирование СЬР1-рецептора аналогами глюкагона (С1ис-ХН₂ ®, К12Е16-ХН₂-лактам А, Е16К20-ХН₂ лактам ▼, К20Е24-ХН₂-лактам ◄и Е24К28-ХН₂-лактам ►) с СЬР-1 ().

Фиг. 7А и 7В - данные, показывающие рецептор-опосредованное индуцирование цАМФ аналогами глюкагона. Конкретнее, на фиг. 7А сравнивается индуцирование глюкагонового рецептора аналогами глюкагона (61ис-ХН₂ ·, Е16 61ис-ХН₂ А, К12, Е16 61ис-ХН₂-лактам ▼, Е16, К20 61ис-ХН₂^ и Е16, К20 С1ис-ХН₂-лактам ►) с глюкагоном (), в то время как на фиг. 7В сравнивается индуцирование бЬР-1-рецептора аналогами глюкагона (С1ис-ХН₂ ®, Е16 С1ис-ХН₂ А, К12, Е16 61ис-ХН₂-лактам ▼, Е16, К20 61ис-ХН₂^ и Е16, К20 61ис-ХН₂-лактам ►) с 6ЬР-1 ().

Фиг. 8А-8Е - данные, показывающие рецептор-опосредованное индуцирование цАМФ аналогами глюкагона на глюкагоновом рецепторе (фиг. 8А, 8С и 8Е) или на бЬР-1-рецепторе (фиг. 8В, 8С и 8Е), где НЕ - гомоглутаминовая кислота и йС - гомоцистеиновая кислота.

Фиг. 9А и 9В - данные, показывающие рецептор-опосредованное индуцирование цАМФ аналогами глюкагона СйР-1 (17-26), где аминокислоты в положениях 17-26 нативного глюкагона (последовательность 8ЕО ГО ХО: 1) были заменены аминокислотами положений 17-26 нативного СйР-1 (последовательность 8ЕО ГО ХО: 50). Конкретнее, на фиг. 9А сравнивается индуцирование глюкагонового рецептора сконструированными аналогами глюкагона СйР-1 (17-26), а на фиг. 9В сравнивается индуцирование СйР-1-рецептора сконструированными аналогами глюкагона СйР-1 (17-26).

Фиг. 10А-Е - диаграммы, представляющие ίη νίνο данные, проявляющие способность глюкагоновых пептидов, соответствующих настоящему изобретению, инициировать снижение массы мышами, которым подкожным путем были введены указанные количества соответствующих соединений. Идентификаторы последовательностей для глюкагонового пептида, перечисленные на фиг. 10А-10Е, выглядят следующим образом: фиг. 10А: химера 2 А1Ь2 С24 40К РЕС (8ЕО ГО ХО: 486), А1Ь2 С24 химера 2 40К лактам (РРР) ГО ХО: 504) и А1Ь2 Е16 К20 С1ис-ХН₂ Ьас 40К (РРР) ГО ХО: 528); фиг. 10В: А1Ь2 С24 Сй1 2 лактам 40К (РРР) ГО ХО: 504), ΏΜΙΆ1 С24 Сй1 2 лактам 40К (РРР) ГО ХО: 505), химера 2 ΏΜΙΆ1 С24 40К (8ЕО ГО ХО: 519) и химера 2 А1Ь2 С24 40К (8ЕО ГО ХО: 486), где цифра в конце последовательности обозначает использованную дозировку, 70 либо 350 нмоль/кг; фиг. 10С: А1В2 без лактама С24 40К (8ЕО

- 8 017849

ΙΌ N0: 504), ΑΙΒ2 Е16 Κ20 без лактама С24 40К (8ЕО ΙΌ N0: 528), ΌΜΙΑ1 Е16 К20 без лактама С24 40К (8ЕО ГО N0: 510), ΌΜΙΑ1 Е16 К20 без лактама СЕХ 40К (8ЕО ГО N0: 513) и ΌΜΙΑ1 Е16 К20 без лактама СЕХ 40К (8ЕО ГО N0: 529); фиг. 10Ό: ΑΙΒ2 без лактама С24 40К (8ЕО ГО N0: 504), ΑΙΒ2 Е16 К20 без лактама С24 40К (8ЕО ГО N0: 528), ΌΜΙΑ1 Е16 К20 без лактама С24 40К (8ЕО ГО N0: 510) и ΌΜΙΑ1 Е16 К20 без лактама/Сех С24 40К (8Еф ΙΌ N0: 513), где цифра в конце последовательности обозначает использованную дозировку, 14 нмоль/кг/неделя либо 70 нмоль/кг/неделя; фиг. 10Е: ΑΙΒ2 без лактама С24 40К (8ЕО ГО N0: 486), СЫ 2 ΑΙΒ2 С24 СЕХ 40К (8ЕО ГО N0: 533), ΑΙΒ2 Е16 Α18 К20 С24 40К (8ЕО ГО N0: 492), ΑΙΒ2 без лактама СЕХ 629 С40 40К (8ЕО ГО N0: 488), ΑΙΒ2 без лактама СЕХ С40 С41-2 (8ЕО ГО N0: 532), ΑΙΒ2 без лактама СЕХ С24 С40-2 (8ЕО ГО N0: 531) и ΑΙΒ2 без лактама С24 60К (8Е6 ГО N0: 498), где обозначение 40К или 60К представляет молекулярную массу полиэтиленгликолевой цепи, присоединенной к глюкагоновому пептиду.

Подробное описание Определения

В описании и формуле изобретения будет применяться следующая терминология, соответствующая определениям, приведенным ниже.

Термин фармацевтически приемлемый носитель, применяемый в настоящем описании, охватывает любой из обычных фармацевтических носителей, таких как забуференный фосфатом солевой раствор, вода, эмульсии, такие как эмульсия масла в воде либо эмульсия воды в масле, и увлажняющие средства различных типов. Упомянутый термин охватывает также любой из агентов, одобренных органом регулирования федерального правительства США или приведенных в Фармакопее США для применения на животных, включая людей.

Термин фармацевтически приемлемая соль, применяемый в настоящем описании, обозначает соли соединений, которые сохраняют биологическую активность исходного соединения и которые не являются нежелательными ни в биологическом, ни в других отношениях. Многие соединения, раскрытые в настоящем описании, способны образовывать кислые и/или основные соли вследствие присутствия аминогрупп и/или карбоксильных групп либо групп, им подобных.

Фармацевтически приемлемые соли с основаниями могут быть получены из неорганических и органических оснований. К числу солей, производных неорганических оснований, относятся (только в качестве примера) соли натрия, калия, лития, аммония, кальция и магния. К числу солей, производных органических оснований, относятся (но ими не ограничиваются) соли первичных, вторичных и третичных аминов.

Фармацевтически приемлемые соли с кислотами могут быть получены из неорганических и органических кислот. К числу солей, производных неорганических кислот, относятся соли хлористоводородной кислоты, бромисто-водородной кислоты, серной кислоты, азотной кислоты, фосфорной кислоты и т.п. К числу солей, производных органических кислот, относятся соли уксусной кислоты, пропионовой кислоты, гликолевой кислоты, пировиноградной кислоты, щавелевой кислоты, яблочной кислоты, малоновой кислоты, янтарной кислоты, малеиновой кислоты, фумаровой кислоты, винной кислоты, лимонной кислоты, бензойной кислоты, коричной кислоты, миндальной кислоты, метансульфоновой кислоты, этансульфоновой кислоты, η-толуолсульфоновой кислоты, салициловой кислоты и т.п.

Термин лечение, применяемый в настоящем описании, охватывает профилактику определенного расстройства либо состояния или облегчение тяжести симптомов, связанных с определенным расстройством либо состоянием и/или предотвращение либо ликвидацию упомянутых симптомов. Например, термин лечение диабета, применяемый в настоящем описании, будет в общем относиться к изменению уровня глюкозы в крови в направлении нормального уровня и может включать повышение или снижение уровня глюкозы в крови в зависимости от конкретной ситуации.

Определение эффективное количество или терапевтически эффективное количество глюкагонового пептида, применяемое в настоящем описании, обозначает нетоксическое, но достаточное количество пептида для обеспечения достижения желаемого эффекта. Например, одним из желаемых эффектов было бы предотвращение либо лечение гипогликемии, определяемой, например, по повышению уровня глюкозы в крови. Альтернативным желаемым эффектом для аналогов соагонистов, раскрытых в настоящем описании, было бы включение лечения гипергликемии, определяемой, например, по незначительному отклонению уровня глюкозы в крови от нормального, либо инициирование снижения массы тела/предупреждение прироста массы тела, определяемое, например, по уменьшению массы тела, либо предотвращение или снижение прироста массы тела, или нормализацию распределения жирового компонента тела. Количество, являющееся эффективным, будет изменяться от субъекта к субъекту в зависимости от возраста и общего состояния индивида, способа введения и т.п. Таким образом, не всегда возможно определить точное эффективное количество. Однако подходящее эффективное количество в любом отдельном случае может быть определено средним специалистом в этой области посредством общепринятой практики экспериментирования.

Термин парентерально обозначает не через пищеварительный тракт, а каким-либо иным путем, например подкожным, внутримышечным, интраспинальным либо внутривенным.

Термин очищенный и подобные термины, применяемые в настоящем описании, относятся к вы- 9 017849 делению молекулы или соединения в форме, являющейся по сути свободной от примесей, которые, как правило, связываются с молекулой либо соединением в нативном либо природном окружении. Термин очищенный, применяемый в настоящем описании, не требует абсолютной чистоты; этот термин, скорее, применяется в качестве относительного определения. Словосочетание очищенный полипептид применяется здесь для описания полипептида, который был отделен от других соединений, в том числе (но без ограничения) от молекул нуклеиновых кислот, липидов и углеводов.

Термин выделенный обозначает удаление эталонного материала из его естественного окружения (например, природного окружения, если он встречается в естественных условиях). Например, естественно встречающийся полинуклеотид, присутствующий в живом животном, не является выделенным, но тот же самый полинуклеотид, отделенный от некоторой части либо всех сосуществующих в природной системе материалов, является выделенным.

Термин пептид, применяемый в настоящем описании, обозначает последовательность из 3 или более аминокислот, как правило, меньше чем 50 аминокислот, где упомянутые аминокислоты являются естественными либо искусственными аминокислотами. Искусственные аминокислоты означают аминокислоты, которые не встречаются ίη νίνο в природных условиях, но которые, тем не менее, могут быть включены в пептидные структуры, описание которых приведено в данном документе.

Термины полипептид и белок, применяемые в настоящем описании, представляют собой термины, применяемые взаимозаменяемо для обозначения полимера аминокислот, независимо от длины упомянутого полимера. Длина полипептидных и белковых полимеров, как правило, превосходит длину пептидов.

Словосочетание глюкагоновый пептид, применяемое в настоящем описании, обозначает любой пептид, содержащий либо аминокислотную последовательность 8Еф ГО N0: 1 или любой аналог аминокислотной последовательности 8Еф ГО N0:1, включая замены аминокислот, добавления, делеции или посттрансляционные модификации (например, метилирование, ацилирование, убиквитирование, внутримолекулярное ковалентное связывание, такое как образование лактамных мостиков, пегилирование и т.п.) пептида, где упомянутый аналог стимулирует активность глюкагонового или СЬР-1-рецептора, что определяется, например, по уровню продуцирования цАМФ с помощью анализа, описание которого приведено в примере 14.

Словосочетание агонист глюкагона обозначает комплексное соединение, содержащее глюкагоновый пептид, который стимулирует активность глюкагонового рецептора, что определяется, например, по уровню продуцирования цАМФ с помощью анализа, описание которого приведено в примере 14.

Словосочетание аналог агониста глюкагона, применяемое в настоящем описании, обозначает глюкагоновый пептид, содержащий последовательность, выбранную из группы, которую составляют последовательности 5ЕЕ) ГО N0: 10, 5ЕЕ) ГО N0: 11, 5ЕЕ) ГО N0: 12, 5ЕЕ) ГО N0: 13, 5ЕЕ) ГО N0: 14 и 8Еф ГО N0: 15, либо аналог такой последовательности, которая была модифицирована с включением одной или нескольких консервативных аминокислотных замен в одном или нескольких положениях 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 или 29.

Термин модификация аминокислоты, применяемый в настоящем описании, обозначает замену, добавление либо делецию аминокислоты и охватывает замену любой из 20 аминокислот либо добавление любой из 20 аминокислот, которые обычно входят в состав человеческих белков, а также атипичных либо искусственных аминокислот. Все ссылки в описании на конкретные номера положений аминокислоты (например, положение 28) относятся к аминокислоте в этом положении в нативном глюкагоне (последовательность 8Еф ГО N0: 1) либо к положению соответствующей аминокислоты в любом из его аналогов. Например, ссылка в описании на положение 28 будет обозначать соответствующее положение 27 для аналога глюкагона, в котором первая аминокислота последовательности 8Еф ГО N0: 1 была удалена. Подобным же образом, ссылка в описании на положение 28 будет обозначать соответствующее положение 29 для аналога глюкагона, у которого перед ^концом последовательности 8Еф ГО N0: 1 была добавлена одна аминокислота. К числу имеющихся на рынке источников атипичных аминокислот относятся компания 5фта-А1бпс11 (Мй^аикее, штат Висконсин), компания СйетРер 1пс. (М1ат1, штат Флорида) и компания Сепхуте РйаттасеийсаИ (СатЬпбде, штат Массачусетс). Атипичные аминокислоты могут быть закуплены от коммерческих поставщиков, синтезированы бе ηονο, химически модифицированы либо получены из других аминокислот.

Словосочетание соагонист глюкагона, применяемое в настоящем описании, обозначает глюкагоновый пептид, проявляющий активность на глюкагоновом рецепторе, уровень которой составляет по меньшей мере от приблизительно 10 до приблизительно 500% или более по сравнению с нативным глюкагоном, и также проявляющий активность на СЬР-1-рецепторе, уровень которой составляет по меньшей мере от приблизительно 10 до приблизительно 200% или более по сравнению с нативным СЬР-1.

Словосочетание молекула соагониста глюкагона/СЬР-1, применяемое в настоящем описании, обозначает молекулу, проявляющую активность на глюкагоновом рецепторе, уровень которой составляет по меньшей мере приблизительно 10% по сравнению с нативным глюкагоном, и также проявляющую активность на СЬР-1-рецепторе, уровень которой составляет по меньшей мере приблизительно 10% по сравнению с нативным СЬР-1.

- 10 017849

Словосочетание нативный глюкагон, применяемое в настоящем описании, обозначает пептид, содержащий последовательность 8ЕО Ш N0: 1; словосочетание нативный ОЬР-1 представляет собой обобщающий термин, обозначающий амид ОЬР-1(7-36) (содержащий последовательность 8Е0 Ш N0: 52), кислоту СЬР-1(1-37) (содержащую последовательность 8Е0 Ш N0: 50) либо смесь двух этих соединений. Общая ссылка в этом описании на глюкагон либо ОЬР-1 при отсутствии любых дополнительных определений обозначает нативный глюкагон либо нативный ОЬР-1 соответственно.

Термин замена аминокислоты, применяемый в настоящем описании, обозначает замену одного остатка аминокислоты другим остатком аминокислоты.

Словосочетание консервативная замена аминокислот, применяемое в настоящем описании, определяется как замена в пределах одной из пяти приведенных ниже групп:

I) небольшие алифатические, неполярные либо слегка полярные остатки

А1а, 8ег, ТЬг, Рго, 01у;

II) полярные, отрицательно заряженные остатки и их амиды и сложные эфиры

Акр, Аки, 01и, О1п, цистеиновая кислота и гомоцистеиновая кислота;

III) полярные, положительно заряженные остатки

Ηΐ8. Агд, Ьук; орнитин (Огп);

IV) большие алифатические, неполярные остатки

МеЕ Ьеи, Не, να1, Сук, норлейцин (Ы1е), гомоцистеин;

V) большие ароматические остатки

РЬе, Туг, Тгр, ацетилфенилаланин.

Обобщающее словосочетание полиэтиленгликолевая цепь или РЕО-цепь, применяемое в настоящем описании, обозначает смеси конденсационных полимеров этиленоксида и воды в виде разветвленной или неразветвленной цепи, представленной общей формулой Н(ОСН₂СН₂)_ПОН, где п равняется по меньшей мере 9. При отсутствии любых дополнительных определений упомянутое словосочетание обозначает полимеры этиленгликоля с усредненным значением молекулярной массы, выбранным в пределах от 500 до 40000 Да. Словосочетание полиэтиленгликолевая цепь или РЕО-цепь применяется в сочетании с числовым индексом для обозначения ее приблизительной средней молекулярной массы. Например, РЕО-5000 означает полиэтиленгликолевую цепь, имеющую усредненное значение молекулярной массы приблизительно 5000 Да.

Термин пегилированный и подобные термины, применяемые в настоящем описании, относятся к соединению, которое было модифицировано по сравнению с его нативным состоянием посредством присоединения к упомянутому соединению полиэтиленгликолевой цепи. Пегилированный глюкагоновый пептид представляет собой глюкагоновый пептид, имеющий полиэтиленгликолевую цепь, ковалентно присоединенную к упомянутому глюкагоновому пептиду.

Общая ссылка на пептид, которая применяется в настоящем описании, относится к пептидам, имеющим модифицированные амино- и карбоксильные концы. Например, аминокислотная цепь, содержащая амидную группу вместо концевой карбоксильной кислоты, определяется аминокислотной последовательностью, обозначающей стандартные аминокислоты.

Термин линкер, применяемый в настоящем описании, обозначает связь, молекулу либо группу молекул, соединяющую две отдельные составляющие одна с другой. Линкеры могут определять оптимальное пространственное размещение двух составляющих или же могут дополнительно обеспечивать лабильную связь, которая предоставляет возможность взаимного разделения двух составляющих. К числу лабильных связей относятся фоторасщепляемые группы, не стойкие к воздействию кислот группы, не стойкие к воздействию оснований группы и расщепляемые ферментами группы.

Термин димер, применяемый в настоящем описании, обозначает комплексное соединение, содержащее две субъединицы, ковалентно присоединенные одна к другой посредством линкера. Термин димер, в случае его применения без каких-либо определений, обозначает как гомодимеры, так и гетеродимеры. Гомодимер содержит две идентичные субъединицы, в то время как гетеродимер содержит две субъединицы, которые различаются, несмотря на то, что две упомянутые субъединицы являются по сути подобными одна другой.

Словосочетание заряженная аминокислота, применяемое в настоящем описании, означает аминокислоту, которая содержит боковую цепь, отрицательно заряженную (т.е. депротонированную) или положительно заряженную (т.е. протонированную), в водном растворе при физиологическом рН. Например, к числу отрицательно заряженных аминокислот относятся аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, цистеиновая кислота, гомоцистеиновая кислота и гомоглутаминовая кислота, в то время как к числу положительно заряженных аминокислот относятся аргинин, лизин и гистидин. К заряженным аминокислотам относятся заряженные аминокислоты из числа 20 аминокислот, обычно обнаруживаемых в человеческих белках, а также атипичные либо искусственные аминокислоты.

Словосочетание кислая аминокислота, применяемое в настоящем описании, означает аминокислоту, которая содержит вторую кислую составляющую, включая, например, карбоксильную либо сульфокислотную группы.

- 11 017849

Примеры осуществления

Настоящее изобретение предлагает глюкагоновые пептиды с повышенной либо пониженной активностью на глюкагоновом рецепторе, СЬР-1-рецепторе либо на обоих рецепторах. Настоящее изобретение предлагает также глюкагоновые пептиды с измененной избирательностью в отношении глюкагонового рецептора, по сравнению с бЬР-1-рецептором.

Повышенная активность на глюкагоновом рецепторе обеспечивается модификацией аминокислоты в положении 16 нативного глюкагона (последовательность 8ЕО Ш N0: 1), как описано в данном документе.

Пониженная активность на глюкагоновом рецепторе обеспечивается, например, модификацией аминокислоты в положении 3, как описано в данном документе.

Повышенная активность на СЬР-1-рецепторе обеспечивается посредством замены карбоксильной трупы С-концевой аминокислоты нейтральной по заряду группой, такой как амид либо сложный эфир.

Повышенная активность на СЬР-1-рецепторе обеспечивается посредством модификаций, предоставляющих возможность образования внутримолекулярного мостика между боковыми цепями двух аминокислот, разделенных тремя промежуточными аминокислотами, например, в положениях 12 и 16, или 16 и 20, или 20 и 24, как описано в данном документе.

Повышенная активность на СЬР-1-рецепторе обеспечивается модификацией аминокислоты в положении 20, как описано в данном документе.

Повышенная активность на СЬР-1-рецепторе предлагается у аналогов глюкагона, содержащих Сконцевой удлиняющий сегмент (последовательность 8Е0 Ш N0: 26). Активность на СЬР-1-рецепторе у таких аналогов, содержащих последовательность 8Е0 Ш N0: 26, может дополнительно повышаться посредством модифицирования аминокислоты в положении 18, 28 или 29 либо в положении 18 и 29, как описано в данном документе.

Восстановление активности на глюкагоновом рецепторе, которая была снижена модификациями аминокислот в положениях 1 и 2, обеспечивается с помощью ковалентной связи между боковыми цепями двух аминокислот, разделенных тремя промежуточными аминокислотами, например, в положениях 12 и 16, или 16 и 20, или 20 и 24, как описано в данном документе.

Дополнительное незначительное повышение активности на СЬР-1-рецепторе обеспечивается посредством модифицирования аминокислоты в положении 10, которой является Тгр.

Любая из описанных выше модификаций, которая повышает или снижает активность на глюкагоновом рецепторе и которая повышает активность на СБР-1-рецепторе. может осуществляться отдельно либо в комбинации. Любая из описанных выше модификаций может также сочетаться с другими модификациями, которые обеспечивают получение других необходимых свойств, таких как повышенная растворимость, и/или стабильность, и/или продолжительность действия. В альтернативном варианте любая из описанных выше модификаций может сочетаться с другими модификациями, которые не оказывают существенного влияния на растворимость, стабильность либо активность. К примерам модификаций относятся (но ими не ограничиваются) приведенные ниже:

(A) улучшение растворимости, например, посредством введения одной, двух, трех или более заряженных аминокислот в С-концевую часть нативного глюкагона, предпочтительно в С-концевом направлении относительно положения 27. Такая заряженная аминокислота может быть введена путем замены нативной аминокислоты заряженной аминокислотой, например, в положениях 28 или 29 или в альтернативном варианте путем добавления заряженной аминокислоты, например, после положения 27, 28 или 29. В иллюстративных вариантах осуществления одна, две, три либо все заряженные аминокислоты имеют отрицательный заряд. В других вариантах осуществления одна, две, три либо все заряженные аминокислоты являются положительно заряженными. Такие модификации повышают растворимость, например обеспечивают по меньшей мере 2-, 5-, 10-, 15-, 25-, 30-кратное или большее увеличение растворимости по сравнению с нативным глюкагоном при заданном рН в пределах от приблизительно 5,5 до 8, например рН 7, при определении через 24 ч при температуре 25°С;

(B) повышение растворимости и увеличение продолжительности действия или периода полувыведения из плазмы посредством добавления гидрофильной составляющей, такой как полиэтиленгликолевая цепь, как описано в данном документе, например, в положении 16, 17, 20, 21, 24 или 29 либо на С-конце пептида;

(C) повышение стабильности модифицированием аспарагиновой кислоты в положении 15, например, путем делеции или замены глутаминовой кислотой, гомоглутаминовой кислотой, цистеиновой кислотой либо гомоцистеиновой кислотой. Такие модификации могут уменьшить разложение или расщепление при рН в пределах от 5,5 до 8, например, с сохранением по меньшей мере 75, 80, 90, 95, 96, 97, 98% или 99% исходного пептида через 24 ч при температуре 25°С;

(Ό) повышение стабильности модифицированием аминокислоты в положении 27, например, путем замены метионином, лейцином либо норлейцином. Такие модификации могут уменьшить окислительную деструкцию;

(Е) повышение устойчивости к расщеплению дипептидилпептидазой IV (ЭРР1У) модифицированием аминокислоты в положении 1 или положении 2, как описано в данном документе;

- 12 017849 (Е) консервативные замены, добавления или делеции, которые не оказывают отрицательного воздействия на активность, например консервативные замены в одном либо нескольких положениях 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 либо 29; или делеция аминокислоты 29, факультативно присоединенной к С-концевому амиду либо сложному эфиру вместо С-концевой карбоксильной группы;

(С) добавление С-концевого удлиняющего сегмента, как описано в данном документе;

(Н) гомодимеризация или гетеродимеризация, как описано в данном документе.

В иллюстративных вариантах осуществления глюкагоновый пептид может содержать суммарно 1, до 2, до 3, до 4, до 5, до 6, до 7, до 8, до 9 или до 10 модификаций аминокислот по сравнению с последовательностью нативного глюкагона.

В одном из вариантов осуществления, раскрытых в настоящем описании, предложен агонист глюкагона, модифицированный по сравнению с пептидом дикого типа (Н18-§ег-С1п-С1у-Тйг-Рйе-Тйт-§ег-Л8рТуг-§ег-Еу8-Туг-Ееи-Л8р-§ег-Лгд-Агд-Л1а-С1п-Л8р-Рйе-Уа1-С1п-Тгр-Ееи-Ме1-А8п-Тйг (последовательность 8ЕО ΙΌ N0: 1)) для повышения активности пептида на глюкагоновом рецепторе. Неожиданно заявители обнаружили, что серин, занимающий положение 16 нативного глюкагона (последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 1), может быть заменен выбранной кислой аминокислотой для повышения активности глюкагона, с точки зрения его способности стимулировать синтез цАМФ в испытании ш νίίτο модели (см. пример 14). Конкретнее, эта замена повышает активность аналога на глюкагоновом рецепторе по меньшей мере в 2, 4, 5 и до 10 раз. Эта замена также повышает активность аналога на СЕР-1-рецепторе по меньшей мере в 5, 10 или 15 раз по сравнению с нативным глюкагоном, однако избирательность сохраняется в отношении глюкагонового рецептора по сравнению с СЕР-1-рецептором.

В соответствии с одним из вариантов осуществления остаток серина в положении 16 нативного глюкагона заменяется аминокислотой, выбранной из группы, которую составляют глутаминовая кислота, глутамин, гомоглутаминовая кислота, гомоцистеиновая кислота, треонин или глицин. В соответствии с другим вариантом осуществления остаток серина в положении 16 нативного глюкагона заменяется аминокислотой, выбранной из группы, которую составляют глутаминовая кислота, глутамин, гомоглутаминовая кислота и гомоцистеиновая кислота, и в еще одном из вариантов осуществления остаток серина заменяется глутаминовой кислотой. В одном из вариантов осуществления глюкагоновый пептид, обладающий повышенной специфичностью в отношении глюкагонового рецептора, содержит пептид последовательностей ЗЕЦ ΙΌ N0: 8, 8ЕЦ ΙΌ N0: 9, 8ЕЦ ΙΌ N0: 10 либо аналог агониста глюкагона, где карбоксиконцевая аминокислота сохраняет свою нативную карбоксильную группу. В соответствии с одним из вариантов осуществления предлагается агонист глюкагона, содержащий последовательность ИЩ-НЦ§ег-С1п-С1у-Тйг-Рйе-Тйг-§ег-Л8р-Туг-§ег-Еу8-Туг-Ееи-А8р-С1и-Лгд-Агд-Л1а-С1п-А8р-Рйе-Уа1-С1п-ТгрЬеи-Ме1-Л8п-Тйг-С00Н (последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0: 10), где пептид проявляет приблизительно в пять раз более высокую активность на глюкагоновом рецепторе по сравнению с нативным глюкагоном, как определяется ш νίίτο анализом цАМФ примера 14.

Глюкагоновые пептиды, соответствующие настоящему изобретению, могут быть дополнительно модифицированы для улучшения растворимости и стабильности пептида в водных растворах при физиологическом рН с одновременным сохранением высокой биологической активности по сравнению с нативным глюкагоном. В соответствии с одним из вариантов осуществления предполагается, что введение гидрофильных групп в положениях 17, 21 и 24 пептида последовательности ЗЕЦ ΙΌ N0: 9 либо последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 10, улучшит растворимость и стабильность высокоэффективного аналога глюкагона в растворах, имеющих физиологический рН. Введение таких групп также увеличивает продолжительность действия, например, поскольку определяется более длительным периодом полувыведения из системы кровообращения. К числу подходящих гидрофильных составляющих относятся любые водорастворимые полимеры, известные в данной области, включая полиэтиленгликоль, гомо- или сополимеры полиэтиленгликоля, монометилзамещенный полимер полиэтиленгликоля (тРЕС) либо полиоксиэтиленглицерол (Р0С). В соответствии с одним из вариантов осуществления гидрофильная группа содержит полиэтиленгликолевую (РЕС) цепь. Конкретнее, в одном из вариантов осуществления глюкагоновый пептид содержит последовательность ЗЕЦ ΙΌ N0: 6 или последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0: 7, где полиэтиленгликолевая цепь ковалентно присоединена к боковым цепям аминокислот, присутствующих в положениях 21 и 24 глюкагонового пептида, и карбоксиконцевая кислота пептида имеет карбоксильную группу.

Настоящим описанием охватываются также другие конъюгаты, в которых глюкагоновые пептиды, соответствующие настоящему изобретению, присоединены факультативно посредством ковалентной связи и факультативно посредством линкера к конъюгату. Присоединение может осуществляться посредством ковалентных химических связей, физических сил, например электростатических, водородных, ионных, ван-дер-ваальсовых, гидрофобных либо гидрофильных взаимодействий. Могут применяться различные системы нековалентного связывания, в том числе биотин-авидин, лиганд/рецептор, фермент/ субстрат, нуклеиновая кислота/белок, связывающий нуклеиновую кислоту, липид/белок, связывающий липид, партнеры молекулы клеточной адгезии или же любые связывающие партнеры либо их фрагменты, которые обладают взаимным сродством.

К примерам конъюгатов относятся (но ими не ограничиваются) гетерологичный пептид или поли

- 13 017849 пептид (включая, например, белок плазмы), средство направленной доставки, иммуноглобулин или его часть (например, вариабельный участок, гипервариабельный участок или Ес-фрагмент), диагностическая метка, такая как радиоизотоп, флуорофор либо энзиматическая метка, полимер, в том числе водорастворимые полимеры, или другие терапевтические либо диагностические агенты. В одном из вариантов осуществления предлагается конъюгат, содержащий глюкагоновый пептид, соответствующий настоящему изобретению, и белок плазмы, где белок плазмы выбран из группы, которую составляют альбумин, трансферрин, фибриноген и глобулины. В одном из вариантов осуществления белковой составляющей плазмы конъюгата является альбумин или трансферрин. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит цепь атомов длиной от 1 до приблизительно 60 атомов, от 1 до 30 атомов или более, от 2 до 5 атомов, от 2 до 10 атомов, от 5 до 10 атомов или от 10 до 20 атомов. В некоторых вариантах осуществления все атомы цепи являются атомами углерода. В некоторых вариантах осуществления атомы цепи в каркасе линкера выбраны из группы, состоящей из С, О, N и Х. Атомы цепи и линкеры могут быть выбраны в соответствии с их ожидаемой растворимостью (гидрофильностью), с целью получения более растворимого конъюгата. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит функциональную группу, которая подвергается расщеплению ферментом, другим катализатором либо гидролитическими условиями, обнаруживаемыми в ткани-мишени, органе либо клетке. В некоторых вариантах осуществления длина линкера является достаточной для снижения потенциала стерического препятствия. Если линкер представляет собой ковалентную связь или пептидильную связь, а конъюгат является полипептидом, упомянутый конъюгат в целом может быть гибридным белком. Такие пептидильные линкеры могут иметь любую длину. Варианты линкеров имеют в длину от приблизительно 1 до 50 аминокислот, от 5 до 50 аминокислот, от 3 до 5 аминокислот, от 5 до 10 аминокислот, от 5 до 15 аминокислот или от 10 до 30 аминокислот. В альтернативном варианте такие гибридные белки могут быть получены методами рекомбинантных ДНК, известных среднему специалисту в этой области.

В представленном описании раскрыты также глюкагоновые гибридные пептиды или белки, где второй пептид или полипептид был соединен с концом, например карбоксильным концом, глюкагонового пептида. Конкретнее, гибридный глюкагоновый пептид может содержать агонист глюкагона последовательностей ХЕО ΙΌ N0: 55, ХЕО ΙΌ N0: 9 или ХЕО ΙΌ N0: 10, который дополнительно содержит аминокислотную последовательность ХЕО ΙΌ N0: 26 (ОРХХОАРРРХ), последовательность ХЕО ΙΌ N0: 27 (ККН№МА) или последовательность ХЕО ΙΌ N0: 28 (ККНК.), присоединенную к аминокислоте 29 глюкагонового пептида. В одном из вариантов осуществления аминокислотная последовательность ХЕО ΙΌ N0: 26 (ОРХХОАРРРХ), последовательность ХЕО ΙΌ N0: 27 (КМтаУА) или последовательность ХЕО ΙΌ N0: 28 (К^Ю присоединяется к аминокислоте 29 глюкагонового пептида посредством пептидной связи. Заявители установили, что замена у глюкагоновых гибридных пептидов, содержащих С-концевой удлиняющий пептид эксендина-4 (например, последовательность ХЕО ΙΌ N0: 26 или последовательность ХЕО ΙΌ N0: 29), нативного остатка треонина в положении 29 глицином, резко усиливает активность на ОЬР-1-рецепторе. Эта аминокислотная замена может применяться в сочетании с другими модификациями, раскрытыми в настоящем описании, для повышения сродства аналогов глюкагона к ОЬР-1рецептору. Например, замена Т29О может комбинироваться с аминокислотными заменами Х16Е и №0К, факультативно с лактамным мостиком между аминокислотами 16 и 20 и факультативно с добавлением полиэтиленгликолевой цепи, как описано в данном документе. В одном из вариантов осуществления предлагается соагонист глюкагонового/ОЬР-1-рецептора, содержащий последовательность ХЕО ΙΌ N0: 64. В одном из вариантов осуществления глюкагоновая пептидная часть глюкагонового гибридного пептида выбрана из группы, которую составляют последовательности ХЕО ΙΌ N0: 55, ХЕО ΙΌ N0: 2, ХЕО ΙΌ N0: 3, ХЕО ΙΌ N0: 4 и ХЕО ΙΌ N0: 5, где полиэтиленгликолевую цепь, в случае ее присутствия в положениях 17, 21, 24, или в С-концевой аминокислоте, или в обоих положениях 21 и 24, выбирают в диапазоне от 500 до 40000 Да. Конкретнее, в одном из вариантов осуществления глюкагоновый пептидный сегмент выбран из группы, которую составляют последовательности ХЕО ΙΌ N0: 7, ХЕО ΙΌ N0: 8 и ХЕО ΙΌ N0: 63, где полиэтиленгликолевая цепь выбрана в диапазоне от 500 до 5000 Да. В одном из вариантов осуществления глюкагоновый пептид представляет собой гибридный пептид, содержащий последовательности ХЕО ΙΌ N0: 55 и ХЕО ΙΌ N0: 65, где пептид последовательности ХЕО ΙΌ N0: 65 присоединен к карбоксильному концу последовательности ХЕО ΙΌ N0: 55.

В соответствии с одним из вариантов осуществления дополнительная химическая модификация глюкагонового пептида последовательности ХЕО ΙΌ N0: 10 обеспечивает повышенную активность на ОЬР-1-рецепторе до такой степени, когда относительные активности на глюкагоновом рецепторе и ОЬР1-рецепторе оказываются фактически эквивалентными. Соответственно, в одном из вариантов осуществления предлагается соагонист глюкагонового/ОЬР-1-рецептора, где концевая аминокислота глюкагоновых пептидов, соответствующих настоящему изобретению, имеет амидную группу, вместо карбоксильной группы, присутствующей у нативной аминокислоты. Относительная активность аналога глюкагона на соответствующих глюкагоновых и ОЬР-1-рецепторах может регулироваться посредством дополнительных модификаций глюкагонового пептида с получением аналогов, проявляющих от приблизительно 40 до приблизительно 500% или более активности нативного глюкагона на глюкагоновом рецепторе и от приблизительно 20 до приблизительно 200% или более активности нативного ОЬР-1 на ОЬР-1

- 14 017849 рецепторе, например 50-, 100-кратное или более увеличение по сравнению с нормальной активностью глюкагона на СЬР-1-рецепторе.

В другом варианте осуществления предлагаются аналоги глюкагона, проявляющие активность соагониста глюкагонового/СЬР-1-рецептора, где внутримолекулярный мостик образован между двумя боковыми цепями аминокислот для стабилизации объемной структуры карбоксильного конца пептида. Конкретнее, боковые цепи аминокислотных пар 12 и 16, 16 и 20, 20 и 24 или 24 и 28 присоединяются одна к другой и, тем самым, стабилизируют α-спираль глюкагона. Две боковые цепи могут быть соединены одна с другой посредством водородных связей, ионных взаимодействий, таких как образование солевых мостиков, или же с помощью ковалентных связей. В некоторых вариантах осуществления величина цикла или линкера составляет приблизительно 8 атомов или приблизительно 7-9 атомов.

К числу примеров составления пар аминокислот, способных к ковалентному связыванию с образованием линкерного мостика из семи атомов, относятся 0гп-С1и (лактамный цикл); Ьук-Акр (лактам) или гомосерин-гомоглутамин (лактон). К числу примеров составления пар аминокислот, которые могут образовывать линкер из восьми атомов, относятся Ьук-С1и (лактам); гомолизин-Акр (лактам); 0тгомоглутамин (лактам); 4-амино-РНе-Акр (лактам); либо Туг-Акр (лактон). К числу примеров составления пар аминокислот, которые могут образовывать линкер из девяти атомов, относятся гомолизин-С1и (лактам); Ьук-гомоглутамин (лактам); 4-амино-РЬе-С1и (лактам); либо Туг-С1и (лактон). Любая из боковых цепей этих аминокислот может дополнительно заменяться дополнительными химическими группами до тех пор, пока не разрушается объемная структура α-спирали. Средний специалист в этой области может предусмотреть альтернативное составление пар либо альтернативные аналоги аминокислот, в том числе химически модифицированные производные, которые могли бы образовать стабилизирующую структуру подобного же размера и необходимого действия. Например, дисульфидный мостик гомоцистеингомоцистеин имеет в длину 6 атомов и может подвергаться дополнительному модифицированию для получения желательного эффекта. Даже без ковалентного присоединения описанное выше составление пар аминокислот или же подобное составление пар, которое может предусматриваться средним специалистом в этой области, может также обеспечить дополнительную стабильность α-спирали через нековалентные связи, например, посредством образования солевых мостиков либо взаимодействий водородных связей.

Дополнительные варианты осуществления включают приведенное ниже составление пар, факультативно с лактамным мостиком: С1и в положении 12 с Ьук в положении 16; нативный Ьук в положении 12 с С1и в положении 16; С1и в положении 16 с Ьук в положении 20; Ьук в положении 16 с С1и в положении 20; С1и в положении 20 с Ьук в положении 24; Ьук в положении 20 с С1и в положении 24; С1и в положении 24 с Ьук в положении 28; Ьук в положении 24 с С1и в положении 28.

В соответствии с одним из вариантов осуществления предлагается аналог глюкагона, проявляющий активность соагониста глюкагонового/СЬР-1-рецептора, где упомянутый аналог содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которую составляют последовательности 8ЕО ΙΌ N0: 11, 8Е0 ΙΌ N0: 47, 8Е0 ΙΌ N0: 48 и 8Е0 ΙΌ N0: 49. В одном из вариантов осуществления боковые цепи ковалентно соединены между собой, а в другом варианте осуществления две аминокислоты соединены между собой с образованием лактамного цикла. Величина лактамного цикла может изменяться в зависимости от длины боковых цепей аминокислот, и в одном из вариантов осуществления лактам образуется посредством присоединения боковых цепей аминокислоты лизина к боковой цепи глутаминовой кислоты.

Порядок амидной связи в лактамном цикле может изменяться на обратный (например, лактамный цикл может быть образован между боковыми цепями Ьук 12 и С1и16 или в альтернативном варианте между С1и12 и Ьук16). В соответствии с одним из вариантов осуществления предлагается аналог глюкагона последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 45, где по меньшей мере один лактамный цикл образован между боковыми цепями аминокислотной пары, выбранной из группы, которую составляют аминокислотные пары 12 и 16, 16 и 20, 20 и 24 или 24 и 28. В одном из вариантов осуществления предлагается соагонист глюкагонового/СЬР-1-рецептора, где упомянутый соагонист содержит аналог глюкагонового пептида последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 20, где упомянутый пептид содержит внутримолекулярный лактамный мостик, образованный между положениями 12 и 16 аминокислот или же между положениями 16 и 20 аминокислот. В одном из вариантов осуществления предлагается соагонист глюкагонового/СЬР-1-рецептора, содержащий последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 20, где внутримолекулярный лактамный мостик образован между положениями 12 и 16 аминокислот, между положениями 16 и 20 аминокислот или же между положениями 20 и 24 аминокислот и аминокислотой в положении 29 является глицин, где последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 29 присоединена к С-концевой аминокислоте последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 20. В другом варианте осуществления аминокислотой в положении 28 является аспарагиновая кислота.

Растворимость глюкагонового пептида последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 20 может быть дополнительно улучшена, например, введением одной, двух, трех или более заряженных аминокислот в Сконцевую часть глюкагонового пептида последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 20, предпочтительно в Сконцевом направлении относительно положения 27. Такая заряженная аминокислота может быть введена посредством замены нативной аминокислоты заряженной аминокислотой, например, в положениях 28

- 15 017849 или 29, либо в альтернативном варианте посредством добавления заряженной аминокислоты, например, после положения 27, 28 или 29. В дальнейших вариантах осуществления одна, две, три либо все заряженные аминокислоты являются отрицательно заряженными. В альтернативном варианте растворимость может также быть повышена посредством ковалентного присоединения гидрофильных составляющих, например полиэтиленгликоля, к пептиду.

В соответствии с одним из вариантов осуществления предлагается аналог глюкагона, содержащий последовательность 8Еф ΙΌ N0: 55, где упомянутый аналог отличается от последовательности 8Еф ΙΌ N0: 55 1-3 аминокислотами, выбранными из положений 1, 2, 3, 5, 7, 10, 11, 13, 14, 17, 18, 19, 21, 24, 27, 28 и 29, причем упомянутый глюкагоновый пептид проявляет по меньшей мере 20% активности нативного 0ЬР-1 на 0ЬР-1-рецепторе.

В соответствии с одним из вариантов осуществления предлагается соагонист глюкагонового/0ЬР-1рецептора, содержащий последовательность ^2-^5^1--0111-015--011--41^-011-^^513^54^^4.5-5^5-1-401.1^13^13-^8-^8^13^13^513^110-731^13-7113-401.1^01^13^13-^ (последовательность 8Еф ΙΌ N0: 33), в которой Хаа в положении 15 выбрана из группы аминокислот, которую составляют Α5ρ, 01и, цистеиновая кислота, гомоглутаминовая кислота и гомоцистеиновая кислота, Хаа в положении 16 выбрана из группы аминокислот, которую составляют 8ег, 01и, 01η, гомоглутаминовая кислота и гомоцистеиновая кислота, Хаа в положении 20 представляет собой 01η или Ьу5, Хаа в положении 24 представляет собой 01η или 01и, Хаа в положении 28 представляет собой Α5η, Ьу5 или кислую аминокислоту, Хаа в положении 29 представляет собой Т1г, 01у или кислую аминокислоту, Я представляет собой СООН или С0ИН₂ при условии, что в случае, если в положении 16 находится серин, то в положении 20 находится Ьу5, или в альтернативном варианте в случае, если в положении 16 находится серин, то в положении 24 находится 01и, а в положении 20 либо в положении 28 находится Ьу5. В одном из вариантов осуществления соагонист глюкагонового/0ЬР-1-рецептора содержит последовательность 8Еф ΙΌ N0: 33, где аминокислотой в положении 28 является аспарагиновая кислота и аминокислотой в положении 29 является глутаминовая кислота. В другом варианте осуществления аминокислотой в положении 28 является нативный аспарагин, аминокислотой в положении 29 является глицин и аминокислотная последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 29 или последовательность 8Еф ΙΌ N0: 65 ковалентно присоединена к карбоксильному концу последовательности 8Еф ΙΌ N0: 33.

В одном из вариантов осуществления предлагается соагонист, содержащий последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 33, где к карбоксильному концу пептида добавлена дополнительная кислая аминокислота. В еще одном варианте осуществления карбоксиконцевая аминокислота аналога глюкагона имеет амид вместо карбоксильной группы природной аминокислоты. В одном из вариантов осуществления аналог глюкагона содержит последовательность, выбранную из группы, которую составляют последовательности 840 ΙΌ N0: 40, 840 ΙΌ N0: 41, 840 ΙΌ N0: 42, 840 ΙΌ N0: 43 и 840 ΙΌ N0: 44.

В соответствии с одним из вариантов осуществления предлагается аналог глюкагонового пептида последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 33, где упомянутый аналог отличается от последовательности 8Еф ΙΌ N0:33 1-3 аминокислотами, выбранными из положений 1, 2, 3, 5, 7, 10, 11, 13, 14, 17, 18, 19, 21 и 27 при условии, что в случае, если аминокислотой в положении 16 является серин, то в положении 20 находится лизин, либо между аминокислотой в положении 24 и любой аминокислотой в положении 20 либо в положении 28 образован лактамный мостик. В соответствии с одним из вариантов осуществления упомянутый аналог отличается от последовательности 8Еф ΙΌ N0:33 1-3 аминокислотами, выбранными из положений 1, 2, 3, 21 и 27. В одном из вариантов осуществления аналог глюкагонового пептида последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 33 отличается от этой последовательности 1-2 аминокислотами, либо в одном из вариантов осуществления одной аминокислотой, выбранной из положений 1, 2, 3, 5, 7, 10, 11, 13, 14, 17, 18, 19, 21 и 27 при условии, что в случае, если аминокислотой в положении 16 является серин, то в положении 20 находится лизин, либо между аминокислотой в положении 24 и любой аминокислотой в положении 20 либо в положении 28 образован лактамный мостик.

В соответствии с другим вариантом осуществления предлагается относительно избирательный агонист 0ЬР-1-рецептора, содержащий последовательность NН₂-Н^5-8е^-Xаа-Ο1у-ТЬ^-Рйе-ТЬ^-8е^-Α5ρ-Ту^8е^-^у5-Ту^-^еи-Xаа-Xаа-Α^8-Ά^8-Ά1а-Xаа-Α5ρ-Рйе-Vа1-Xаа-Т^ρ-^еи-Μеΐ-Xаа-Xаа-Я (последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 53), где Хаа в положении 3 выбрана из группы аминокислот, которую составляют 01и, 0гп и №е, Хаа в положении 15 выбрана из группы аминокислот, которую составляют Α5ρ, 01и, цистеиновая кислота, гомоглутаминовая кислота и гомоцистеиновая кислота, Хаа в положении 16 выбрана из группы аминокислот, которую составляют 8ег, 01и, 01η, гомоглутаминовая кислота и гомоцистеиновая кислота, Хаа в положении 20 представляет собой 01η или Ьу5, Хаа в положении 24 представляет собой 01η или 01и, Хаа в положении 28 представляет собой Α5η, Ьу5 или кислую аминокислоту, Хаа в положении 29 представляет собой Т1г, 01у или кислую аминокислоту, Я представляет собой СООН, С0ИН₂, последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 26 или последовательность 8Еф ΙΌ N0: 29 при условии, что в случае, если в положении 16 находится серин, то в положении 20 находится Ьу5, или в альтернативном варианте в случае, если в положении 16 находится серин, то в положении 24 находится 01и, а в положении 20 либо в положении 28 находится Ьу5. В одном из вариантов осуществления аминокислотой в положении 3 является глутаминовая кислота. В одном из вариантов осуществления кислой аминокислотой, замененной в

- 16 017849 положении 28 и/или 29, является аспарагиновая кислота либо глутаминовая кислота. В одном из вариантов осуществления глюкагоновый пептид, в том числе пептид-соагонист, содержит последовательность 8ЕО ГО N0: 33, дополнительно содержащую добавочную кислую аминокислоту, добавленную к карбоксильному концу пептида. В другом варианте осуществления карбоксиконцевая аминокислота аналога глюкагона имеет амид вместо карбоксильной группы природной аминокислоты.

В соответствии с одним из вариантов осуществления предлагается соагонист глюкагонового/ОЬР-1рецептора, содержащий модифицированный глюкагоновый пептид, выбранный из группы, которую составляют ХН₂-Н1к-8ег-О1п-О1у-ТЬг-РЬе-ТЬг-8ег-Акр-Туг-§ег-Еук-Туг-Ееи-Хаа-Хаа-Агд-Агд-А1а-Хаа-АкрРЬе^а1-Хаа-Тгр-Ьеи-Ме1-Хаа-Хаа-В (последовательность 8Е0 ГО N0: 34), где Хаа в положении 15 выбрана из группы аминокислот, которую составляют Акр, О1и, цистеиновая кислота, гомоглутаминовая кислота и гомоцистеиновая кислота, Хаа в положении 16 выбрана из группы аминокислот, которую составляют 8ег, О1и, О1п, гомоглутаминовая кислота и гомоцистеиновая кислота, Хаа в положении 20 представляет собой О1п или Ьук, Хаа в положении 24 представляет собой О1п или О1и, Хаа в положении 28 представляет собой Акп, Акр или Ьук, В представляет собой СООН или С0ХН₂, Хаа в положении 29 представляет собой ТЬг или О1у, В представляет собой СООН, С0ХН₂, последовательности 8Е0 ГО N0: 26 или 8Е0 ГО N0: 29 при условии, что в случае, если в положении 16 находится серии, то в положении 20 находится Ьук, или в альтернативном варианте в случае, если в положении 16 находится серии, то в положении 24 находится О1и, а в положении 20 либо в положении 28 находится Ьук. В одном из вариантов осуществления В представляет собой С0ИН₂, Хаа в положении 15 представляет собой Акр, Хаа в положении 16 выбрана из группы аминокислот, которую составляют О1и, О1п, гомоглутаминовая кислота и гомоцистеиновая кислота, каждая из Хаа в положениях 20 и 24 представляет собой О1п, Хаа в положении 28 представляет собой Акп или Акр и Хаа в положении 29 представляет собой ТЬг. В одном из вариантов осуществления каждая из Хаа в положениях 15 и 16 представляет собой О1и, каждая из Хаа в положениях 20 и 24 представляет собой О1п, Хаа в положении 28 представляет собой Акп или Акр, Хаа в положении 29 представляет собой ТЬг и В представляет собой С0ХН₂.

Сообщалось, что определенные положения нативного глюкагонового пептида могут быть модифицированы с сохранением, по меньшей мере, некоторой части активности исходного пептида. Соответственно, заявители предполагают, что одна либо несколько аминокислот, находящихся в положениях 2, 5, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 27, 28 или 29 пептида последовательности 8Е0 ГО N0: 11 могут быть заменены аминокислотой, отличающейся от кислоты, присутствующей в нативном глюкагоновом пептиде, с сохранением активности на глюкагоновом рецепторе. В одном из вариантов осуществления остаток метионина, присутствующий в положении 27 нативного пептида, заменен лейцином либо норлейцином для предотвращения окислительной деструкции упомянутого пептида. В другом варианте осуществления аминокислота в положении 20 заменена Ьук, Агд, 0т или цитруллином и/или аминокислота в положении 21 заменена О1и, гомоглутаминовой кислотой либо гомоцистеиновой кислотой.

В одном из вариантов осуществления предлагается аналог глюкагона последовательности 8Е0 ГО N0: 20, где от 1 до 6 аминокислот, выбранных из положений 1, 2, 5, 7, 10, 11, 13, 14, 17, 18, 19, 21, 27, 28 или 29 аналога, отличаются от соответствующей аминокислоты последовательности 8Е0 ГО N0: 1 при условии, что в случае, если аминокислотой в положении 16 является серин, то в положении 20 находится Ьук, либо в альтернативном варианте в случае, если в положении 16 находится серин, то в положении 24 находится О1и, а в положении 20 либо в положении 28 находится Ьук. В соответствии с другим вариантом осуществления предлагается аналог глюкагона последовательности 8Е0 ГО N0: 20, где от 1 до 3 аминокислот, выбранных из положений 1, 2, 5, 7, 10, 11, 13, 14, 17, 18, 19, 20, 21, 27, 28 или 29 аналога, отличаются от соответствующей аминокислоты последовательности 8Е0 ГО N0: 1. В другом варианте осуществления предлагается аналог глюкагона последовательностей 8Е0 ГО N0: 8, 8Е0 ГО N0: 9 или 8Е0 ГО N0: 11, где от 1 до 2 аминокислот, выбранных из положений 1, 2, 5, 7, 10, 11, 13, 14, 17, 18, 19, 20 или 21 аналога, отличаются от соответствующей аминокислоты последовательности 8Е0 ГО N0: 1, и в еще одном варианте осуществления от 1 до 2 отличающихся аминокислот представляют собой консервативные аминокислотные замены по сравнению с аминокислотами, присутствующими в последовательности нативного глюкагона (последовательность 8Е0 ГО N0: 1). В одном из вариантов осуществления предлагается глюкагоновый пептид последовательностей 8Е0 ГО N0: 12, 8Е0 ГО N0: 13, 8Е0 ГО N0: 14 или 8Е0 ГО N0: 15, причем упомянутый глюкагоновый пептид дополнительно содержит одну, две или три аминокислотные замены в положениях, выбранных из положений 2, 5, 7, 10, И, 13, 14, 17, 18, 19, 20, 21, 27 или 29. В одном из вариантов осуществления замены в положениях 2, 5, 7, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 27 или 29 представляют собой консервативные аминокислотные замены.

В соответствии с одним из вариантов осуществления предлагается соагонист глюкагонового/ОЬР-1рецептора, содержащий вариант последовательности 8Е0 ГО N0: 33, где от 1 до 10 аминокислот варианта, выбранные из положений 16, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 27, 28 и 29 соответственно, отличаются от соответствующей аминокислоты последовательности 8Е0 ГО N0: 1. В соответствии с одним из вариантов осуществления предлагается вариант последовательности 8Е0 ГО N0: 33, причем упомянутый вариант отличается от последовательности 8Е0 ГО N0: 33 одной или несколькими аминокислотными заменами, выбранными из группы, которую составляют О1п17, А1а18, О1и21, Пе23, А1а24, Vа127 и О1у29. В соответ

- 17 017849 ствии с одним из вариантов осуществления предлагается соагонист глюкагонового/СЬР-1-рецептора, содержащий варианты последовательности 8Еф ΙΌ N0: 33, где от 1 до 2 аминокислот варианта, выбранные из положений 17-26, отличаются от соответствующей аминокислоты последовательности 8Еф ΙΌ N0: 1. В соответствии с одним из вариантов осуществления предлагается вариант последовательности 8Еф ΙΌ N0: 33, где упомянутый вариант отличается от последовательности 8Еф ΙΌ N0: 33 аминокислотной заменой, выбранной из группы, которую составляют С1п17, А1а18, С1и21, 11е23 и А1а24. В соответствии с одним из вариантов осуществления предлагается вариант последовательности 8Еф ΙΌ N0: 33, где упомянутый вариант отличается от последовательности 8Еф ΙΌ N0: 33 аминокислотной заменой в положении 18, где замененная аминокислота выбрана из группы, которую составляют А1а, 5ег, ТЬг, Рго и С1у. В соответствии с одним из вариантов осуществления предлагается вариант последовательности 8Еф ΙΌ N0: 33, причем упомянутый вариант отличается от последовательности 8Еф ΙΌ N0: 33 заменой аминокислоты А1а в положении 18. Такие варианты предусматриваются последовательностью 8Еф ΙΌ N0: 55. В другом варианте осуществления предлагается соагонист глюкагонового/СЬР-1-рецептора, содержащий варианты последовательности 8Еф ΙΌ N0: 33, где от 1 до 2 аминокислот варианта, выбранные из положений 17-22, отличаются от соответствующей аминокислоты последовательности 8Еф ΙΌ N0:1, и в соответствии с еще одним вариантом осуществления предлагается вариант последовательности 8Еф ΙΌ N0: 33, причем упомянутый вариант отличается от последовательности 8Еф ΙΌ N0: 33 1 или 2 аминокислотными заменами в положениях 20 и 21. В соответствии с одним из вариантов осуществления предлагается соагонист глюкагонового/СЬР-1-рецептора, содержащий последовательность ИН₂-Н18-8ег-С1пС1у-Тйг-Рйе-Тйг-8ег-Акр-Туг-8ег-Ьук-Туг-Ьеи-Хаа-Хаа-Агд-Агд-А1а-Хаа-Хаа-Рйе-Уа1-Хаа-Тгр-Ьеи-Ме1Хаа-Хаа-К (последовательность 8Еф ΙΌ N0: 51), причем Хаа в положении 15 представляет собой Акр, С1и, цистеиновую кислоту, гомоглутаминовую кислоту или гомоцистеиновую кислоту, Хаа в положении 16 представляет собой 8ег, С1и, С1п, гомоглутаминовую кислоту или гомоцистеиновую кислоту, Хаа в положении 20 представляет собой С1п, Ьук, Агд, 0т или цитруллин, Хаа в положении 21 представляет собой Акр, С1и, гомоглутаминовую кислоту либо гомоцистеиновую кислоту, Хаа в положении 24 представляет собой С1п или С1и, Хаа в положении 28 представляет собой Акп, Ьук либо кислую аминокислоту, Хаа в положении 29 представляет собой ТЬг или кислую аминокислоту и К представляет собой СООН или С0ИН₂. В одном из вариантов осуществления К представляет собой С0ИН₂. В соответствии с одним из вариантов осуществления предлагается соагонист глюкагонового/СЬР-1-рецептора, содержащий вариант последовательностей 5ЕЕ) ΙΌ N0: 11, 5ЕЕ) ΙΌ N0: 12, 5ЕЕ) ΙΌ N0: 13, 5ЕЕ) ΙΌ N0: 14, 5ЕЕ) ΙΌ N0: 15, 8Еф ΙΌ N0: 47, 8Еф ΙΌ N0: 48 или 8Еф ΙΌ N0: 49, где упомянутый вариант отличается от упомянутой последовательности аминокислотной заменой в положении 20. В одном из вариантов осуществления аминокислотная замена для положения 20 выбрана из группы, которую составляют Ьук, Агд, 0гп и цитруллин.

В одном из вариантов осуществления предлагается агонист глюкагона, содержащий пептид-аналог последовательности 8Еф ΙΌ N0: 34, причем упомянутый аналог отличается от последовательности 8Еф ΙΌ N0: 34 наличием в положении 2 аминокислоты, отличающейся от серина. В одном из вариантов осуществления остаток серина заменен аминоизомасляной кислотой либо аланином, и в одном из вариантов осуществления остаток серина заменен аминоизомасляной кислотой. Такие модификации подавляют расщепление дипептидилпептидазой ГУ с одновременным сохранением специфической активности исходного соединения (например, по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 95% или более активности исходного соединения). В одном из вариантов осуществления растворимость аналога повышается, например, введением 1, 2, 3 или более заряженных аминокислот на С-концевой участок нативного глюкагона, предпочтительно в С-концевом направлении относительно положения 27. В дальнейших вариантах осуществления 1, 2, 3 или все заряженные аминокислоты являются отрицательно заряженными. В другом варианте осуществления упомянутый аналог дополнительно содержит замену нативной аминокислоты кислой аминокислотой в положении 28 или 29 или кислую аминокислоту, добавленную к карбоксильному концу пептида последовательности 8Еф ΙΌ N0: 34.

В одном из вариантов осуществления аналоги глюкагона, раскрытые в настоящем описании, дополнительно модифицированы в положении 1 или положении 2 для снижения восприимчивости к расщеплению дипептидилпептидазой ТУ. В одном из вариантов осуществления предлагается аналог глюкагона последовательностей 5ЕЕ) ΙΌ N0: 9, 5ЕЕ) ΙΌ N0: 11, 5ЕЕ) ΙΌ N0: 12, 5ЕЕ) ΙΌ N0: 13, 5ЕЕ) ΙΌ N0: 14 или 8Еф ΙΌ N0: 15, причем упомянутый аналог отличается от исходной молекулы заменой в положении 2 и проявляет пониженную восприимчивость (т.е. устойчивость) к расщеплению дипептидилпептидазой Ιν. Конкретнее, в одном из вариантов осуществления положение 2 пептида-аналога заменено аминокислотой, выбранной из группы, которую составляют б-серин, аланин, валин, амино-н-масляная кислота, глицин, №метилсерин и аминоизомасляная кислота. В одном из вариантов осуществления положение 2 пептида-аналога заменено аминокислотой, выбранной из группы, которую составляют б-серин, аланин, глицин, №метилсерин и аминоизомасляная кислота. В другом варианте осуществления положение 2 пептида-аналога заменено аминокислотой, выбранной из группы, которую составляют б-серин, глицин, N метилсерин и аминоизомасляная кислота. В одном из вариантов осуществления глюкагоновый пептид содержит последовательность 8Еф ΙΌ N0: 21 или последовательность 8Еф ΙΌ N0: 22.

- 18 017849

В одном из вариантов осуществления предлагается аналог глюкагона последовательностей ВЕЕ) 10 N0: 9, ВЕЕ) 10 N0: 11, ВЕЕ) 10 N0: 12, ВЕЕ) 10 N0: 13, ВЕЕ) 10 N0: 14 или ВЕЕ) 10 N0: 15, причем упомянутый аналог отличается от исходной молекулы заменой в положении 1 и проявляет пониженную восприимчивость (т.е. устойчивость) к расщеплению дипептидилпептидазой ГУ. Конкретнее, положение 1 пептида-аналога заменено аминокислотой, выбранной из группы, которую составляют ά-гистидин, α,αдиметилимидазолуксусная кислота (ΏΜΙΑ), Х-метидгистидин, α-метилгистидин, имидазолуксусная кислота, дезаминогистидин, гидроксигистидин, ацетилгистидин и гомогистидин. В другом варианте осуществления предлагается агонист глюкагона, содержащий пептид-аналог последовательности ВЕЕ) 10 N0: 34, где упомянутый аналог отличается от последовательности ВЕЕ) 10 N0: 34 наличием в положении 1 аминокислоты, отличающейся от гистидина. В одном из вариантов осуществления растворимость аналога повышена, например, посредством введения 1, 2, 3 или более заряженных аминокислот на С-концевом участке нативного глюкагона, предпочтительно в С-концевом направлении относительно положения 27. В иллюстративных вариантах осуществления 1, 2, 3 или все заряженные аминокислоты являются отрицательно заряженными. В другом варианте осуществления аналог дополнительно содержит замену нативной аминокислоты кислой аминокислотой в положении 28 или 29 или кислую аминокислоту, добавленную к карбоксильному концу пептида последовательности ВЕЕ) 10 N0: 34. В одном из вариантов осуществления кислой аминокислотой является аспарагиновая кислота либо глутаминовая кислота.

В одном из вариантов осуществления соагонист глюкагонового/ОЕР-1-рецептора содержит последовательность ВЕЕ) 10 N0: 20, дополнительно содержащую дополнительный карбоксиконцевой удлиняющий сегмент из одной аминокислоты либо пептида, выбранный из группы, которую составляют последовательности ВЕР 10 N0: 26, ВЕР 10 N0: 27 и ВЕР 10 N0: 28. В одном из вариантов осуществления в случае, когда к карбоксильному концу последовательности ВЕО 10 N0: 20 добавлена одна аминокислота, упомянутая аминокислота, как правило, выбрана из числа 20 традиционных аминокислот, и в одном из вариантов осуществления дополнительная карбоксиконцевая аминокислота имеет амидную группу вместо карбоксильной группы нативной аминокислоты. В одном из вариантов осуществления дополнительная аминокислота выбрана из группы, которую составляют глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота и глицин.

В альтернативном варианте осуществления предлагается соагонист глюкагонового/ОЕР-1рецептора, где пептид содержит по меньшей мере один лактамный цикл, образованный между боковой цепью остатка глутаминовой кислоты и остатком лизина, где остаток глутаминовой кислоты и остаток лизина разделены тремя аминокислотами. В одном из вариантов осуществления карбоксиконцевая аминокислота лактама, содержащая глюкагоновый пептид, имеет амидную группу вместо карбоксильной группы нативной аминокислоты.

Конкретнее, в одном из вариантов осуществления предлагается соагонист глюкагона и ОЕР-1, содержащий модифицированный глюкагоновый пептид, выбранный из группы, которую составляют

1®2-Н18-8ег-С1п-С1у-ТЬг-РЬе- ТЬг-Зег-Авр-Туг-Зег-Еуз-Туг-Ьеи-Азр-СНиАг§-Агё-А1а-01п-А8р-Рке-Уа1-01п-Тгр-Ееи- МеьХаа-Хаа-К. (8ЕЭ ГО N0: 66)

ХН₂-Н18-8ег~С1п-О1у-ТЬг-РЪе-ТЬг-8ег-А8р-Туг-8ег-Еу8-Туг-Ееи-Аяр-О1иАг§-Аг§-А1а-Еу8-А8р-РЬе-Уа1-О1п-Тгр-Ееи- Ме1-Хаа-Хаа-К. (8Εζ) ГО N0: 67)

Ж₂-Н18-8ег-О1п-Сг1у-ТЬг-РЬе-ТИг-8ег-А8р-Т}Т-8ег-Еу₅-Туг-1.еи-А8р-8егАгй-Аг§-А1а-Ьу8-Аэр-РЬе-Уа1-С1и-Тгр-Ееи- МеЕХаа-Хаа-И (ЗЕр ГО ΝΟ: 68)

ХН2-Н18-8ег-<31п-С1у-ТЪг-РЬе- ТЬг-Зег-Азр-Туг-Зег-Ьуз-Туг-Ееи-Азр-ЗегАг£-Аг§-А1а-С1п-А8р-РИе-Уа1-С1и-Тгр-Ееи- МеЕЬуз-Хаа-К. (ЗЕр ГО ΝΟ: 69)

ХН₂-Н18-8ег-О1п-О1у-ТЬг-РЬе- ГЪг-Зег-Азр-Туг-Зег-Еуз-Туг-Ееи-Азр-СИиАг§-Аг§-А1а-Еу8-Азр-РЬе-Уа1-С1и-Тгр-Ееи- МеЕАзп-ТЬг-К (ЗЕрЕОЫО: 16)

ХН2-Нл8-5ег-О1п-О1у-ТЬг-РЬе-ТЬг-8ег-А8р-Туг-8ег-Еу8-Туг-Ееи-А8р-СЯиАг§-Аг§-А1а-С1п-Азр-РЬе-Уа1-С1и-Тгр-Ееи- Ме1-Ьуз-ТЬг-К (ЗЕр ГО N0: 17)

МН2-Н18-Зег-С1п-61у-ТЬг-РНе-ТЬг-8ег-А8р-Туг-Зег-Еу8-Туг-Ееи-А8р-С1иАг§-Аг§-А1а-Еуз-А8р~РЬе-Уа1-С1и-Тгр-Ееи- МеЕЕуз-ТЬг-К (8Е(2 ГО N0: 18) ’ ·>

где Хаа в положении 28 Азр или Азп, Хаа в положении 29 представляет собой ТЬг или О1у, К выбран из группы, которую составляют СООН, С0NΗ2, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, глицин, последовательности ВЕР 10 N0: 26, ВЕР 10 N0: 27 и ВЕР 10 N0: 28, а лактамный мостик образован между Еуз в положении 12 и О1и в положении 16 для последовательности ВЕО 10 N0: 66, между О1и в положении 16 и Еуз в положении 20 для последовательности ВЕР ГО N0: 67, между Еуз в положении 20 и О1и в положении 24 для последовательности ВЕО 10 N0: 68, между О1и в положении 24 и Еуз в положении 28 для последовательности ВЕР ГО N0: 69, между Еуз в положении 12 и О1и в положении 16 и между

- 19 017849

Ьук в положении 20 и С1и в положении 24 для последовательности 8ЕЦ ГО N0: 16, между Ьук в положении 12 и С1и в положении 16 и между С1и в положении 24 и Ьук в положении 28 для последовательности 8ЕЦ ГО N0: 17, между С1и в положении 16 и Ьук в положении 20 и между С1и в положении 24 и Ьук в положении 28 для последовательности 8ЕЦ ГО N0: 18. В одном из вариантов осуществления Я выбран из группы, которую составляют СООН, С0№Н₂, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота и глицин, аминокислотой в положении 28 является Аки и аминокислотой в положении 29 является треонин. В одном из вариантов осуществления Я - С0ИН₂, аминокислотой в положении 28 является Акп и аминокислотой в положении 29 является треонин. В другом варианте осуществления Я выбран из группы, которую составляют последовательности 8ЕЦ ГО N0: 26, 8ЕЦ ГО N0: 29 и 8ЕЦ ГО N0: 65, и аминокислотой в положении 29 является глицин.

В еще одном варианте осуществления соагонист глюкагонового/СЬР-1-рецептора выбран из группы, которую составляют последовательности 8ЕЦ ГО N0: 11, 8ЕЦ ГО N0: 12, 8ЕЦ ГО N0: 13, 8ЕЦ ГО N0: 14, 8ЕЦ ГО N0: 15, 8ЕЦ ГО N0: 16, 8ЕЦ ГО N0: 17 и 8ЕЦ ГО N0: 18, где упомянутый пептид дополнительно содержит дополнительный карбоксиконцевой удлиняющий сегмент из одной аминокислоты либо пептида, выбранный из группы, которую составляют последовательности 8ЕЦ ГО N0: 26, 8ЕЦ ГО N0: 27 и 8ЕЦ ГО N0: 28. В одном из вариантов осуществления концевой удлиняющий сегмент содержит последовательности 8ЕЦ ГО N0: 26, 8ЕЦ ГО N0: 29 и 8ЕЦ ГО N0: 65, и глюкагоновый пептид содержит последовательность 8ЕЦ ГО N0: 55. В одном из вариантов осуществления соагонист глюкагонового/СЬР-1-рецептора содержит последовательность 8ЕЦ ГО N0: 33, в которой аминокислотой в положении 16 является глутаминовая кислота, аминокислотой в положении 20 является лизин, аминокислотой в положении 28 является аспарагин и аминокислотная последовательность 8ЕЦ ГО N0: 26 или 8ЕЦ ГО N0: 29 присоединена к карбоксильному концу последовательности 8ЕЦ ГО N0: 33.

В упомянутом варианте осуществления, в котором одна аминокислота добавлена к карбоксильному концу последовательности 8ЕЦ ГО N0: 20, упомянутая аминокислота, как правило, выбрана из числа 20 традиционных аминокислот, и в одном из вариантов осуществления упомянутая аминокислота имеет амидную группу вместо карбоксильной группы нативной аминокислоты. В одном из вариантов осуществления дополнительная аминокислота выбрана из группы, которую составляют глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота и глицин. В упомянутых вариантах осуществления, в которых аналог агониста глюкагона дополнительно содержит карбоксиконцевой удлиняющий сегмент, карбоксиконцевая аминокислота удлиняющего сегмента в одном из вариантов осуществления заканчивается не карбоксильной группой, а амидной группой либо сложноэфирной группой.

В другом варианте осуществления соагонист глюкагонового/СЬР-1-рецептора содержит последовательность ХН₂-Н18-§ег-С1п-С1у-Тйг-Рйе-Тйг-§ег-А8р-Туг-§ег-Ьу8-Туг-Ьеи-А8р-С1и-Агд-Агд-А1а-С1п-А8рРНе-Уа1-С1п-Тгр-Реи-Ме1-Л8п-ТНг-Хаа-С0ХН_; (последовательность 8ЕЦ ГО N0: 19), в которой Хаа в положении 30 представляет любую аминокислоту. В одном из вариантов осуществления Хаа выбрана из числа 20 традиционных аминокислот, и в одном из вариантов осуществления упомянутой аминокислотой является глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота или глицин. Растворимость этого пептида может быть дополнительно улучшена посредством ковалентного присоединения полиэтиленгликолевой цепи к боковой цепи аминокислоты в положении 17, 21, 24 или 30 последовательности 8ЕЦ ГО N0: 19. В еще одном варианте осуществления пептид содержит дополнительный карбоксиконцевой удлиняющий сегмент пептида, выбранный из группы, которую составляют последовательности 8ЕЦ ГО N0: 26, 8ЕЦ ГО N0: 27 и 8ЕЦ ГО N0: 28. В соответствии с одним из вариантов осуществления соагонист глюкагонового/СЬР-1-рецептора содержит последовательности 8ЕЦ ГО N0: 30, 8ЕЦ ГО N0: 31 и 8ЕЦ ГО N0: 32.

Дополнительные сайт-специфические модификации в пределах последовательностей 8ЕЦ ГО N0: 11, 8 ЕС) ГО N0: 12, 8ЕС) ГО N0: 13, 8ЕС) ГО N0: 14, 8ЕС) ГО N0: 15, 8ЕС) ГО N0: 16, 8ЕС) ГО N0: 17, 8ЕС) ГО N0: 18, 8ЕЦ ГО N0: 19 и 8ЕЦ ГО N0: 64 глюкагона могут осуществляться для получения набора агонистов глюкагона, обладающих различной степенью СЬР-1 агонизма. Таким образом, были получены и охарактеризованы пептиды, обладающие фактически идентичной ίη νίίτο активностью на каждом рецепторе. Подобным же образом были идентифицированы и охарактеризованы пептиды с десятикратно избирательно повышенной активностью на каждом из двух рецепторов. Как отмечалось выше, замена остатка серина в положении 16 глутаминовой кислотой повышает активность нативного глюкагона как на глюкагоновом, так и на СЬР-1-рецепторе, однако поддерживает приблизительно десятикратную избирательность в отношении глюкагонового рецептора. Кроме того, посредством замены нативного глутамина в положении 3 глутаминовой кислотой (последовательность 8ЕЦ ГО N0: 22) получают аналог глюкагона, который проявляет приблизительно десятикратную избирательность в отношении СЬР-1-рецептора.

Растворимость пептидов-соагонистов глюкагона/СЬР-1 может быть дополнительно повышена в водных растворах при физиологическом рН с одновременным сохранением высокой биологической активности, в сопоставлении с нативным глюкагоном, посредством введения гидрофильных групп в положениях 16, 17, 21 и 24 пептида либо посредством добавления одной модифицированной аминокислоты (т.е. аминокислоты, модифицированной для включения гидрофильной группы) на карбоксильном конце пептида-соагониста глюкагона/СЬР-1. В соответствии с одним из вариантов осуществления гидрофильная группа содержит полиэтиленгликолевую (РЕС) цепь. Конкретнее, в одном из вариантов осуществле

- 20 017849 ния глюкагоновый пептид содержит последовательности 8Е0 ГО N0: 10, 8Е0 ГО N0: 11, 8Е0 ГО N0: 12, 5ЕО ГО N0: 13, 5ЕО ГО N0: 14, 5ЕО ГО N0: 15, 5ЕО ГО N0: 16, 5ЕО ГО N0: 17 или 5ЕО ГО N0: 18, где полиэтиленгликолевая цепь ковалентно присоединена к боковой цепи аминокислот в положении 16, 17, 21, 24, 29 либо к С-концевой аминокислоте глюкагонового пептида при условии, что в случае, когда пептид содержит последовательности 8Е0 ГО N0: 10, 8Е0 ГО N0: 11, 8Е0 ГО N0: 12 или 8Е0 ГО N0: 13, полиэтиленгликолевая цепь ковалентно присоединена к остатку аминокислоты в положении 17, 21 или 24, когда пептид содержит последовательность 8Е0 ГО N0: 14 или 8Е0 ГО N0: 15, полиэтиленгликолевая цепь ковалентно присоединена к остатку аминокислоты в положении 16, 17 или 21, и когда пептид содержит последовательности 8Е0 ГО N0: 16, 8Е0 ГО N0: 17 или 8Е0 ГО N0: 18, полиэтиленгликолевая цепь ковалентно присоединена к остатку аминокислоты в положении 17 или 21.

В одном из вариантов осуществления глюкагоновый пептид содержит последовательности 8Е0 ГО N0: 11, 8Е0 ГО N0: 12 или 8Е0 ГО N0: 13, причем полиэтиленгликолевая цепь ковалентно присоединена к боковой цепи аминокислот в положении 17, 21, 24 или к С-концевой аминокислоте глюкагонового пептида, и карбоксиконцевая аминокислота пептида имеет амидную группу вместо карбоксильной группы нативной аминокислоты. В одном из вариантов осуществления пептид-соагонист глюкагонового/СЬР-1-рецептора содержит последовательность, выбранную из группы, которую составляют последовательности 5ЕО ГО N0: 12, 5ЕО ГО N0: 13, 5ЕО ГО N0: 14, 5ЕО ГО N0: 15, 5ЕО ГО N0: 16, 8Е0 ГО N0: 17, 8Е0 ГО N0: 18 и 8Е0 ГО N0: 19, причем полиэтиленгликолевая цепь ковалентно присоединена к боковой цепи аминокислоты в положении 17, 21 или 24 последовательностей 8Е0 ГО N0: 12, 8Е0 ГО N0: 13 и 8Е0 ГО N0: 19, или в положении 16, 17 или 21 последовательностей 8Е0 ГО N0: 14 и 8Е0 ГО N0: 15, или в положении 17 или 21 последовательностей 8Е0 ГО N0: 16, 8Е0 ГО N0: 17 и 8Е0 ГО N0: 18 глюкагонового пептида. В другом варианте осуществления пептид-соагонист глюкагонового/бЬР-1-рецептора содержит последовательность 8Е0 ГО N0: 11 или 8Е0 ГО N0: 19, причем полиэтиленгликолевая цепь ковалентно присоединена к боковой цепи аминокислоты в положении 17, 21 или 24 либо к С-концевой аминокислоте глюкагонового пептида.

В соответствии с одним из вариантов осуществления и в соответствии с оговоренными ограничениями, описание которых приведено в предшествующих параграфах, пептид-соагонист глюкагона модифицирован с включением одной или нескольких замен аминокислот в положениях 16, 17, 21, 24 или 29 либо С-концевой аминокислоты, где нативная аминокислота заменена аминокислотой, имеющей боковую цепь, пригодную для образования мостиковых связей с гидрофильными составляющими, в том числе, например, с полиэтиленгликолем. Нативный пептид может быть заменен природной аминокислотой либо синтетической (искусственной) аминокислотой. Определения синтетические либо искусственные аминокислоты касаются аминокислот, которые не встречаются в природных условиях ίη νίνο, но которые, тем не менее, могут быть частью пептидных структур, соответствующих приведенному описанию. В альтернативном варианте аминокислота, имеющая боковую цепь, пригодную для образования мостиковых связей с гидрофильными фрагментами, в том числе, например, с полиэтиленгликолем, может быть добавлена к карбоксильному концу любого из аналогов глюкагона, раскрытых в настоящем описании. В соответствии с одним из вариантов осуществления аминокислотная замена производится в пептиде-соагонисте глюкагонового/СЬР-1-рецептора в положении, выбранном из группы, которую составляют положения 16, 17, 21, 24 либо 29, с заменой нативной аминокислоты аминокислотой, выбранной из группы, которую составляют лизин, цистеин, орнитин, гомоцистеин и ацетилфенилаланин, причем заменяющая аминокислота дополнительно содержит полиэтиленгликолевую цепь, ковалентно присоединенную к боковой цепи аминокислоты. В одном из вариантов осуществления глюкагоновый пептид, выбранный из группы, которую составляют последовательности 8Е0 ГО N0: 12, 8Е0 ГО N0: 13, 5ЕО ГО N0: 14, 5ЕО ГО N0: 15, 5ЕО ГО N0: 16, 5ЕО ГО N0: 17, 5ЕО ГО N0: 18 и 5ЕО ГО N0: 19, дополнительно модифицирован с включением полиэтиленгликолевой цепи, ковалентно присоединенной к боковой цепи аминокислоты в положении 17 или положении 21 глюкагонового пептида. В одном из вариантов осуществления пегилированный соагонист глюкагонового/СЬР-1-рецепора дополнительно содержит последовательности 8Е0 ГО N0: 26, 8Е0 ГО N0: 27 и 8Е0 ГО N0: 29.

В другом варианте осуществления глюкагоновый пептид, содержащий последовательность 8Е0 ГО N0: 55 или 8Е0 ГО N0: 56, дополнительно содержит С-концевой удлиняющий сегмент последовательностей 8Е0 ГО N0: 26, 8Е0 ГО N0: 29 или 8Е0 ГО N0: 65, присоединенный к С-концевой аминокислоте последовательности 8Е0 ГО N0: 55 или 8Е0 ГО N0: 56 и факультативно дополнительно содержит полиэтиленгликолевую цепь, ковалентно присоединенную к боковой цепи аминокислот в положениях 17, 18, 21, 24 или 29 либо к С-концевой аминокислоте пептида. В другом варианте осуществления глюкагоновый пептид содержит последовательность 8Е0 ГО N0: 55 или 8Е0 ГО N0: 56, где полиэтиленгликолевая цепь ковалентно присоединена к боковой цепи аминокислот в положении 21 или положении 24 глюкагонового пептида, и пептид дополнительно содержит С-концевой удлиняющий сегмент последовательностей 5ЕО ГО N0: 26 или 5ЕО ГО N0: 29.

В другом варианте осуществления глюкагоновый пептид содержит последовательность 8Е0 ГО N0: 55, 8Е0 ГО N0: 33 либо 8Е0 ГО N0: 34, где дополнительная аминокислота добавлена к карбоксильному концу последовательности 8Е0 ГО N0: 33 или 8Е0 ГО N0: 34, и полиэтиленгликолевая цепь ковалентно

- 21 017849 присоединена к боковой цепи добавленной аминокислоты. В еще одном варианте осуществления пегилированный аналог глюкагона дополнительно содержит С-концевой удлиняющий сегмент последовательностей БЕО ΙΌ N0: 26 или БЕО ΙΌ N0: 29, присоединенный к С-концевой аминокислоте последовательности БЕО ΙΌ N0: 33 или БЕО ΙΌ N0: 34. В другом варианте осуществления глюкагоновый пептид содержит последовательность БЕО ΙΌ N0: 19, где полиэтиленгликолевая цепь ковалентно присоединена к боковой цепи аминокислоты в положении 30 глюкагонового пептида, и пептид дополнительно содержит С-концевой удлиняющий сегмент последовательностей БЕО ΙΌ N0: 26 или БЕО ΙΌ N0: 29, присоединенный к С-концевой аминокислоте последовательности БЕО ΙΌ N0: 19.

Полиэтиленгликолевая цепь может иметь форму прямой цепи либо она может быть разветвленной. В соответствии с одним из вариантов осуществления полиэтиленгликолевая цепь имеет среднюю молекулярную массу, выбранную в пределах от приблизительно 500 до приблизительно 10000 Да. В одном из вариантов осуществления полиэтиленгликолевая цепь имеет среднюю молекулярную массу, выбранную в пределах от приблизительно 1000 до приблизительно 5000 Да. В альтернативном варианте осуществления полиэтиленгликолевая цепь имеет среднюю молекулярную массу, выбранную в пределах от приблизительно 10000 до приблизительно 20000 Да. В соответствии с одним из вариантов осуществления пегилированный глюкагоновый пептид содержит две или более полиэтиленгликолевых цепей, ковалентно присоединенных к глюкагоновому пептиду, где общая молекулярная масса глюкагоновых цепей составляет от приблизительно 1000 до приблизительно 5000 Да. В одном из вариантов осуществления пегилированный агонист глюкагона содержит пептид (последовательность БЕО ΙΌ N0: 5) либо аналог агониста глюкагона (последовательность БЕО ΙΌ N0: 5), где полиэтиленгликолевая цепь ковалентно присоединена к остатку аминокислоты в положении 21 и в положении 24 и где объединенная молекулярная масса двух полиэтиленгликолевых цепей составляет от приблизительно 1000 до приблизительно 5000 Да.

Как подробно описано в примерах, агонисты глюкагона, соответствующие настоящему изобретению, имеют повышенную биофизическую стабильность и водорастворимость, проявляя, наряду с этим, повышенную биоактивность по сравнению с нативным пептидом. Соответственно, полагают, что агонисты глюкагона, соответствующие настоящему изобретению, пригодны для любого применения, описанного выше для нативного глюкагонового пептида. Таким образом, модифицированные глюкагоновые пептиды, описание которых приведено в данном документе, могут применяться для лечения гипогликемии либо для повышения уровня глюкозы в крови, для инициирования временного паралича кишечника для рентгенологических исследований либо для лечения других болезней обмена веществ, являющихся следствием низкого уровня глюкагона в крови. Ожидается также, что глюкагоновые пептиды, описание которых приведено в данном документе, могут быть применены для уменьшения либо поддержания массы тела, или для лечения гипергликемии, или для снижения уровня глюкозы в крови, или для нормализации уровня глюкозы в крови.

Г люкагоновые пептиды, соответствующие настоящему изобретению, могут вводиться отдельно либо в сочетании с другими антидиабетическими препаратами либо средствами против ожирения. К числу антидиабетических препаратов, известных в данной области либо находящихся в процессе исследования, относятся инсулин, сульфонилмочевины, такие как толбутамид (0гтаке), ацетогексамид (Оуте1ог), толазамид (Тойпаке), хлорпропамид (О1аЬтеке), глипизид (С1исо!го1), глибурид (О1аЬе!а, Мюгопаке, С1упаке), глимепирид (Атагу1) или гликлазид (О1ат1сгоп); меглитиниды, такие как репаглинид (Ргапбт) или натеглинид (Б!агйх); бигуаниды, такие как метформин (С1исорйаде) или фенформин; тиазолидиндионы, такие как росиглитазон (Ауапб1а), пиоглитазон (Ас!ок), троглитазон (Кегийп) или другие ингибиторы РРАКд (активатор пероксисомальной пролиферации); ингибиторы α-глюкозидазы, угнетающие переваривание углеводов, такие как миглитол (С1уке!), акарбос (Ргесоке/С1исоЬау); эксенатид (Вуейа) или прамлинтид; ингибиторы дипептидилпептидазы-4 (ОРР-4), такие как вилдаглиптин или ситаглиптин; ингибиторы БСЬТ (натрийзависимый переносчик глюкозы); или ингибиторы фруктоза-1,6бисфосфатазы.

К числу средств против ожирения, известных в данной области либо находящихся в процессе исследования, относятся средства, подавляющие аппетит, в том числе стимуляторы типа фенэтиламина, фентермин (факультативно с фенфлурамином либо дексфенфлурамином), диэтилпропион (Тепиа!е®), фендиметразин (Рге1и-2®, Воп1г11®), бензфетамин (О1бгех®), сибутрамин (Мепб1а®, КебисШ®); римонабант (Асотрйа®), другие антагонисты каннабиноидного рецептора; оксинтомодулин; флуоксетина гидрохлорид (Ргохас); препарат Опеха (топирамат и фентермин), препарат Ехсайа (бупропион и зонисамид) или препарат Сои!гауе (бупропион и налтрексон); или ингибиторы липаз, подобные ксеникалу (0гйк!а!) либо препарату Се!1йк1а! (известному также как АТЬ-962), или препарат СТ 389-255.

Один из аспектов настоящего описания касается заранее изготовленного водного раствора, раскрытого в настоящем описании глюкагонового агониста для применения при лечении гипогликемии. Улучшенная стабильность и растворимость композиций агониста, соответствующего приведенному описанию, предоставляет возможность заранее изготовлять водные растворы для быстрого введения и лечения гипогликемии. В одном из вариантов осуществления предлагается раствор, содержащий пегилированный агонист глюкагона, для введения пациенту, страдающему гипогликемией, где общая молекулярная масса

- 22 017849 полиэтиленгликолевых цепей, присоединенных к пегилированному агонисту глюкагона, составляет от приблизительно 500 до приблизительно 5000 Да. В одном из вариантов осуществления пегилированный агонист глюкагона содержит пептид, выбранный из группы, которую составляют последовательности 8ЕО ГО N0: 23, 8ЕО ГО N0: 24 и 8Е0 ГО N0: 25 и аналоги агониста глюкагона последовательностей 8Е0 ГО N0: 23, 8Е0 ГО N0: 24, 8Е0 ГО N0: 25, либо пегилированную лактамную производную глюкагона, содержащую последовательность 8Е0 ГО N0: 20, где боковая цепь аминокислотного остатка упомянутого глюкагонового пептида ковалентно присоединена к полиэтиленгликолевой цепи.

Способ лечения гипогликемии, соответствующий настоящему изобретению, включает стадии введения пациенту раскрытых в настоящем описании агонистов глюкагона любым обычным путем введения, в том числе парентерально, например внутривенно, внутрибрюшинно, подкожно либо внутримышечно, внутриоболочечно, чрезкожно, ректально, перорально, назально либо посредством ингаляции. В одном из вариантов осуществления упомянутая композиция вводится подкожно либо внутримышечно. В одном из вариантов осуществления упомянутая композиция вводится парентерально, и композиция, содержащая глюкагон, расфасовывается в шприцы.

Неожиданно заявители обнаружили, что могут быть получены пегилированные глюкагоновые пептиды, сохраняющие биологическую активность и специфичность исходного пептида. Однако увеличение длины полиэтиленгликолевой цепи либо присоединение многочисленных полиэтиленгликолевых цепей к пептиду так, что общая молекулярная масса присоединенного полиэтиленгликоля превышает 5000 Да, начинает замедлять время действия модифицированного глюкагона. В соответствии с одним из вариантов осуществления предлагается глюкагоновый пептид последовательностей 8Е0 ГО N0: 23, 8Е0 ГО N0: 24 и 8Е0 ГО N0: 25, или аналог агониста глюкагона, или пегилированная лактамная производная глюкагона, содержащая последовательность 8Е0 ГО N0: 20, где пептид содержит одну или несколько полиэтиленгликолевых цепей, где общая молекулярная масса присоединенного полиэтиленгликоля превышает 5000 Да и в одном из вариантов осуществления составляет более чем 10000 Да, но менее чем 40000 Да. Такие модифицированные глюкагоновые пептиды имеют пролонгированное время действия, но без снижения биологической активности. Следовательно, такие соединения могут быть введены для пролонгирования эффекта введенного глюкагонового пептида.

Глюкагоновые пептиды, модифицированные для ковалентного присоединения к полиэтиленгликолевой цепи, имеющей молекулярную массу более 10000 Да, могут быть введены в сочетании с инсулином для смягчения действия инсулина и поддержания стабильного уровня глюкозы в крови у больных диабетом. Модифицированные глюкагоновые пептиды, соответствующие настоящему описанию, могут быть введены вместе с инсулином в виде одной композиции, введены одновременно в виде отдельных растворов или в альтернативном варианте инсулин и модифицированный глюкагоновый пептид могут быть введены в разное время. В одном из вариантов осуществления композиция, содержащая инсулин, и композиция, содержащая модифицированный глюкагоновый пептид, вводятся с разрывом в 12 ч. Точное соотношение между модифицированным глюкагоновым пептидом и введенным инсулином будет зависеть, отчасти, от определения уровня глюкагона больного и может определяться посредством общепринятой практики экспериментирования.

В соответствии с одним из вариантов осуществления предлагается композиция, содержащая инсулин и модифицированный глюкагоновый пептид, выбранный из группы, которую составляют последовательности 8Е0 ГО N0: 2, 8Е0 ГО N0: 3, 8Е0 ГО N0: 4, 8Е0 ГО N0: 5 и аналоги агониста глюкагона, где модифицированный глюкагоновый пептид дополнительно содержит полиэтиленгликолевую цепь, ковалентно присоединенную к боковой цепи аминокислоты в положении 17, 21, 24 либо 21 и 24. В одном из вариантов осуществления композиция представляет собой водный раствор, содержащий инсулин и аналог глюкагона. В вариантах осуществления, в которых глюкагоновый пептид содержит последовательность 8Е0 ГО N0: 24 или 8Е0 ГО N0: 25, полиэтиленгликолевая цепь ковалентно присоединена к глюкагоновому пептиду в положении 21 или положении 24. В одном из вариантов осуществления полиэтиленгликолевая цепь имеет молекулярную массу от приблизительно 10000 до приблизительно 40000 Да.

В соответствии с одним из вариантов осуществления модифицированные глюкагоновые пептиды, раскрытые в настоящем описании, применяют для инициирования временного паралича кишечника. Этот способ пригоден для рентгенологических исследований и включает стадию введения эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей пегилированный глюкагоновый пептид, глюкагоновый пептид, содержащий С-концевой удлиняющий сегмент, либо димер таких пептидов. В одном из вариантов осуществления глюкагоновый пептид содержит последовательность, выбранную из группы, которую составляют последовательности 8Е0 ГО N0: 2, 8Е0 ГО N0: 3, 8Е0 ГО N0: 4, 8Е0 ГО N0: 5, 8ЕО ГО N0: 6, 8ЕО ГО N0: 7, 8ЕО ГО N0: 8, 8ЕО ГО N0: 9, 8ЕО ГО N0: 10, 8ЕО ГО N0: 11, 8ЕО ГО N0: 12, 8Е0 ГО N0: 13, 8Е0 ГО N0: 14 и 8Е0 ГО N0: 15. В одном из вариантов осуществления глюкагоновый пептид дополнительно содержит полиэтиленгликолевую цепь массой от приблизительно 1000 до 40000 Да, ковалентно присоединенную к аминокислотному остатку в положении 21 либо положении 24. В одном из вариантов осуществления глюкагоновый пептид выбран из группы, которую составляют последовательности 8ЕО ГО N0: 10, 8ЕО ГО N0: 11, 8ЕО ГО N0: 12, 8ЕО ГО N0: 13, 8ЕО ГО N0: 14 и 8ЕО ГО N0: 15. В одном из вариантов осуществления полиэтиленгликолевая цепь имеет молекулярную массу от

- 23 017849 приблизительно 500 до приблизительно 5000 Да.

В еще одном варианте осуществления композиция, применяемая для инициирования временного паралича кишечника, содержит первый модифицированный глюкагоновый пептид и второй модифицированный глюкагоновый пептид. Первый модифицированный пептид содержит последовательность, выбранную из группы, которую составляют последовательности ЗЕО ΙΌ ЫО: 23, ЗЕО ΙΌ ЫО: 24 и ЗЕО ΙΌ ЫО: 25, факультативно присоединенную к полиэтиленгликолевой цепи массой от приблизительно 500 до приблизительно 5000 Да, и второй пептид содержит последовательность, выбранную из группы, которую составляют последовательности ЗЕО ΙΌ ХО: 23, ЗЕО ΙΌ ХО: 24 и ЗЕО ΙΌ ХО: 25, факультативно присоединенную к полиэтиленгликолевой цепи массой от приблизительно 10000 до приблизительно 40000 Да. В соответствии с этим вариантом осуществления полиэтиленгликолевая цепь каждого пептида ковалентно присоединена к аминокислотному остатку соответствующего пептида в любом из положений 17, 21 либо 24 независимо друг от друга.

Сообщалось, что оксинтомодулин, природный пищеварительный гормон, обнаруживаемый в тонкой кишке, вызывает снижение массы тела при введении крысам или людям (см. Э1аЬе1е5 2005; 54:23902395). Оксинтомодулин представляет собой пептид из 37 аминокислот, содержащий последовательность глюкагона из 29 аминокислот (т.е. последовательность ЗЕО ΙΌ ХО: 1), за которой следует карбоксиконцевой удлиняющий сегмент из 8 аминокислот последовательности ЗЕО ΙΌ ХО: 27 (КРХРХХЗА). Таким образом, заявители полагают, что биологическая активность оксинтомодулина может быть сохранена (т.е. подавление аппетита и инициированное снижение массы/сохранение массы) с одновременным улучшением растворимости и стабильности соединения и улучшением фармакокинетики посредством замены части оксинтомодулина, соответствующей глюкагоновому пептиду, модифицированными глюкагоновыми пептидами, раскрытыми в настоящем описании. Кроме того, заявители полагают также, что усеченная молекула оксинтомодулина, содержащая глюкагоновый пептид, соответствующий настоящему изобретению, при удалении четырех конечных аминокислот оксинтомодулина, также будет эффективна в отношении подавления аппетита и инициирования снижения массы/сохранения массы.

Таким образом, настоящим изобретением предусматриваются также модифицированные глюкагоновые пептиды, соответствующие настоящему изобретению, имеющие карбоксиконцевой удлиняющий сегмент последовательностей ЗЕО ΙΌ ХО: 27 (ККХКХМА) либо ЗЕО ΙΌ ХО: 28. Эти соединения могут быть введены пациентам для инициирования снижения массы тела либо предотвращения прироста массы тела. В одном из вариантов осуществления аналог агониста глюкагона последовательностей ЗЕО ΙΌ ХО: 33 либо 8ЕО ΙΌ ХО: 20, дополнительно содержащий аминокислотную последовательность ЗЕО ΙΌ ХО: 27 (ККХКХМА) либо ЗЕО ΙΌ ХО: 28, присоединенную к аминокислоте 29 глюкагонового пептида, вводят пациентам для инициирования снижения массы либо предотвращения прироста массы тела. Конкретнее, глюкагоновый пептид содержит последовательность, выбранную из группы, которую составляют последовательности <Т) ΙΌ ХО: 10, РЕС) ΙΌ ХО: 12, РЕС) ΙΌ ХО: 13, РЕС) ΙΌ ХО: 14 и РЕС) ΙΌ ХО: 15, дополнительно содержащую аминокислотную последовательность ЗЕО ΙΌ ХО: 27 (ККХРХХЗА) либо 8ЕО ΙΌ ХО: 28, присоединенную к аминокислоте 29 глюкагонового пептида.

Эксендин-4 представляет собой пептид, состоящий из 39 аминокислот. Это мощный стимулятор рецептора, известный как СЬР-1. Сообщалось также, что этот пептид подавляет аппетит и инициирует снижение массы тела. Заявители обнаружили, что концевая последовательность эксендина-4, в случае ее добавления к карбоксильному концу глюкагона, улучшает растворимость и стабильность глюкагона без ухудшения биологической активности последнего. В одном из вариантов осуществления десять концевых аминокислот эксендина-4 (т.е. последовательность ЗЕО ΙΌ ХО: 26 (СРЗЗСАРРЗ)) присоединены к карбоксильному концу глюкагонового пептида, соответствующего настоящему описанию. Предполагается, что эти гибридные белки обладают фармакологической активностью для подавления аппетита и инициирования снижения массы/поддержания массы тела. В соответствии с одним из вариантов осуществления аналог агониста глюкагона последовательностей ЗЕО ΙΌ ХО: 33 либо ЗЕО ΙΌ ХО: 20, дополнительно содержащий аминокислотную последовательность ЗЕО ΙΌ ХО: 26 (СРЗЗСАРРЗ) либо ЗЕО ΙΌ ХО: 29, присоединенную к аминокислоте 29 глюкагонового пептида, вводят пациентам для инициирования снижения массы либо предупреждения прироста массы тела. Конкретнее, глюкагоновый пептид содержит последовательность, выбранную из группы, которую составляют последовательности ЗЕО ΙΌ ХО: 10, РЕС) ΙΌ ХО: 12, РЕС) ΙΌ ХО:13, РЕС) ΙΌ ХО: 14, РЕС) ΙΌ ХО: 15, РЕС) ΙΌ ХО: 16, РЕС) ΙΌ ХО: 17, РЕС) ΙΌ ХО: 18, РЕС) ΙΌ ХО: 66, РЕС) ΙΌ ХО: 67, РЕС) ΙΌ ХО: 68, РЕС) ΙΌ ХО: 69, РЕС) ΙΌ ХО: 55 и РЕС) ΙΌ ХО: 56, дополнительно содержащую аминокислотную последовательность ЗЕО ΙΌ ХО: 26 (СРЗЗСАРРЗ) либо ЗЕО ΙΌ ХО: 29, присоединенную к аминокислоте 29 глюкагонового пептида. В одном из вариантов осуществления введенный аналог глюкагонового пептида содержит последовательность ЗЕО ΙΌ ХО: 64.

Настоящее описание охватывает также мультимеры модифицированных глюкагоновых пептидов, раскрытых в настоящем описании. Два или более модифицированных глюкагоновых пептида могут быть соединены друг с другом с помощью обычных связывающих агентов и способов, известных специалистам в данной области. Например, между двумя модифицированными глюкагоновыми пептидами могут образовываться димеры посредством применения бифункциональных тиоловых агентов сшивания и бифункциональных аминовых агентов сшивания, в особенности для глюкагоновых пептидов, у которых

- 24 017849 были произведены замены остатками цистеина, лизина, орнитина, гомоцистеина либо ацетилфенилаланина (например, последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0: 3 и 8ЕЦ ΙΌ N0: 4). Димер может быть гомодимером или в альтернативном варианте гетеродимером. Согласно одному из примеров осуществления димер содержит гомодимер глюкагонового гибридного пептида, где часть глюкагонового пептида содержит последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0: 11 или 8ЕЦ ΙΌ N0: 20 и аминокислотную последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0: 26 (СР88САРРР8), последовательность 8ЕО ΙΌ N0: 27 (КПХИХМА) либо 8ЕО ΙΌ N0: 28 (ККЫК), присоединенную к аминокислоте 29 глюкагонового пептида. В другом варианте осуществления димер содержит гомодимер аналога глюкагонового агониста (последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0: 11), где глюкагоновый пептид дополнительно содержит полиэтиленгликолевую цепь, ковалентно присоединенную к положению 21 или положению 24 глюкагонового пептида.

В соответствии с одним из вариантов осуществления предлагается димер, содержащий первый глюкагоновый пептид, присоединенный к второму глюкагоновому пептиду посредством линкера, где первый глюкагоновый пептид содержит пептид, выбранный из группы, которую составляют последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0: 8, 8ЕЦ ΙΌ N0: 9, 8ЕЦ ΙΌ N0: 10 и 8ЕЦ ΙΌ N0: 11, и второй глюкагоновый пептид содержит последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0: 20. В соответствии с другим вариантом осуществления предлагается димер, содержащий первый глюкагоновый пептид, присоединенный к второму глюкагоновому пептиду посредством линкера, где упомянутый первый глюкагоновый пептид содержит последовательность, выбранную из группы, которую составляют последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0: 2, 8ЕЦ ΙΌ N0: 3, 8ЕО ΙΌ N0: 4, 8ЕО ΙΌ N0: 5, 8ЕО ΙΌ N0: 8, 8ЕО ΙΌ N0: 9, 8ЕО ΙΌ N0: 10, 8ЕО ΙΌ N0: 11, и второй глюкагоновый пептид содержит последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0: 11 и фармацевтически приемлемые соли упомянутых глюкагоновых полипептидов. В соответствии с другим вариантом осуществления предлагается димер, содержащий первый глюкагоновый пептид, присоединенный к второму глюкагоновому пептиду посредством линкера, где первый глюкагоновый пептид выбран из группы, которую составляют последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0: 11, 8ЕЦ ΙΌ N0: 12, 8ЕЦ ΙΌ N0: 13, 8ЕЦ ΙΌ N0: 14, 8ЕЦ ΙΌ N0: 15, 8ЕЦ ΙΌ N0: 16, 8ЕЦ ΙΌ N0: 17, 8ЕЦ ΙΌ N0: 18 и второй глюкагоновый пептид независимо выбран из группы, которую составляют последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0: 11, 8ЕЦ ΙΌ N0: 12, 8ЕЦ ΙΌ N0: 13, 8ЕС) ΙΌ N0: 14, 8ЕО ΙΌ N0: 15, 8ЕО ΙΌ N0: 16, 8ЕО ΙΌ N0: 17 и 8ЕО ΙΌ N0: 18, и фармацевтически приемлемые соли упомянутых глюкагоновых полипептидов. В одном из вариантов осуществления первый глюкагоновый пептид выбран из группы, которую составляет последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0: 20, и второй глюкагоновый пептид независимо выбран из группы, которую составляют последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0:

8, 8ЕЦ ΙΌ N0: 9 и 8ЕЦ ΙΌ N0: 11. В одном из вариантов осуществления димер образован между двумя пептидами, где каждый пептид содержит аминокислотную последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0: 11.

Модифицированные глюкагоновые пептиды, соответствующие настоящему изобретению, могут предлагаться в соответствии с одним из вариантов осуществления как часть набора. В одном из вариантов осуществления предлагается набор для введения антагониста глюкагона пациенту, нуждающемуся в нем, где набор включает в себя модифицированный глюкагоновый пептид, выбранный из группы, которую составляют: 1) глюкагоновый пептид, содержащий последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0: 20, 8ЕЦ ΙΌ N0:

9, 8ЕЦ ΙΌ N0: 10 или 8ЕЦ ΙΌ N0: 11; 2) глюкагоновый гибридный пептид, содержащий аналог агониста глюкагона последовательностей 8ЕЦ ΙΌ N0: 11, 8ЕЦ ΙΌ N0: 20 или 8ЕЦ ΙΌ N0: 55 и аминокислотную последовательность 8ЕС) ΙΌ N0: 26 (СР88САРРР8), 8ЕО ΙΌ N0: 27 (ККИКЯМА) либо 8ЕО ΙΌ N0: 28 (КРИК), присоединенную к аминокислоте 29 глюкагонового пептида; и 3) пегилированный глюкагоновый пептид последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0: 11 либо 8ЕЦ ΙΌ N0:51, дополнительно содержащий аминокислотную последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0: 26 (СР88САРРР8), 8ЕЦ ΙΌ N0: 27 (КРНКХМА) либо 8ЕЦ ΙΌ N0: 28 (ККЫК.), присоединенную к аминокислоте 29 глюкагонового пептида, где полиэтиленгликолевая цепь, ковалентно присоединенная в положении 17, 21 либо 24, имеет молекулярную массу от приблизительно 500 до приблизительно 40000 Да. В одном из вариантов осуществления набор включает в себя соагонист глюкагона/СЬР-1, где пептид содержит последовательность, выбранную из группы, которую составляют последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0: 11, 8ЕЦ ΙΌ N0: 12, 8ЕЦ ΙΌ N0: 13, 8ЕЦ ΙΌ N0: 14, 8ЕО ΙΌ N0: 15, 8ЕО ΙΌ N0: 16, 8ЕО ΙΌ N0: 17 и 8ЕО ΙΌ N0: 18.

В одном из вариантов осуществления предлагается набор с устройством для введения глюкагоновой композиции пациенту, например, иглой для шприца, шприцом-инъектором, безыгольным шприцем или другим безыгольным инъектором. Набор в альтернативном варианте или в дополнение может включать один или более контейнеров, например флаконов, пробирок, пузырьков, одно- либо многокамерных предварительно заполненных шприцов, капсул, инфузионных насосов (наружных либо имплантируемых), безыгольных шприцов, предварительно заполненных шприцов-инъекторов и т.п., факультативно содержащих глюкагоновый пептид в лиофилизованном виде или в форме водного раствора. Предпочтительно наборы будут также включать в себя инструкции по применению.

В соответствии с одним из вариантов осуществления устройство из набора представляет собой устройство для дозированного распределения аэрозоля, где композиция предварительно расфасована в упомянутое приспособление для дозированного распределения аэрозоля. В другом варианте осуществления набор включает в себя шприц и иглу, и в одном варианте осуществления стерильная глюкагоновая композиция расфасована в шприц.

- 25 017849

Соединения, соответствующие настоящему изобретению, могут быть получены стандартными методами синтеза, методами рекомбинантных ДНК или любыми другими методами получения пептидов и гибридных белков. Несмотря на то, что некоторые искусственные аминокислоты не могут экспрессироваться обычными методами рекомбинантных ДНК, в этой области известны способы их получения. Соединения, соответствующие настоящему изобретению, содержащие непептидные части, могут быть синтезированы посредством стандартных реакций органической химии в дополнение к обычным реакциям химии пептидов, в случае их применимости.

Примеры

Общая методика синтеза.

Аналоги глюкагона синтезировали посредством одностадийной реакции сочетания ΗΒΤϋактивизированной смолы (ΗΒΤϋ - о-бензотриазол-^А^Ь^-тетраметилурония гексафторфосфат) Газ! Вос, начиная с 0,2 ммоль смолы Вос ТГт(0Ь71)Раш, на модифицированном синтезаторе пептидов АррНеб Вюзуз!еш 430А. Вос аминокислоты и ΗΒΤϋ были получены от компании МнГхез! Вю!еск (Г1зкетз, штат Индиана). Применялись приведенные ниже защитные группы боковых цепей: Агд(Тоз), Азп(Хап), Азр(ОсНех), Суз(рМеВ71), Н1з(Вос), Ьуз(2С1-2), 8ет(0В71), ТГт(0В71), Тут(2Вт-2) и Тгр(СНО). В качестве защитной группы боковой цепи Ν-концевого Н1з применяли Вос (трет-бутилоксикарбонил).

Каждую из полученных пептидильных смол обрабатывали 20% раствором пиперидина в диметилформамиде для удаления формильной группы из триптофана. Расщепление жидким фтороводородом осуществляли в присутствии п-крезола и диметилсульфида. Расщепление осуществляли в течение 1 ч на ледяной бане с помощью фтороводородной установки (компания Репптзи1а ЬаЬз). После выпаривания фтороводорода остаток суспендировали в диэтиловом эфире, и твердые материалы отфильтровывали. Каждый пептид экстрагировали в 30-70 мл водного раствора уксусной кислоты и разбавленную аликвоту анализировали средствами НРЬС (высокоэффективная жидкостная хроматография) [Весктап 8уз!еш Сок!, колонка 2отЬах С8 0,46'5 см, 1 мл/мин, 45°С, 214 нм, буфер А - 0,1% раствор ТГА (трифторуксусная кислота), В - 0,1% раствор ТГА/90% раствор ацетонитрила, градиент от 10 до 80% В в течение 10 мин].

Очистку осуществляли средствами ГРЬС (быстрая хроматография белков (полипептидов и полинуклеотидов) высокого разрешения) на колонке Ктошазй С18 2,2'25 см с УФ-мониторингом при 214 нм со сбором 5 мин фракций. Однородные фракции объединяли и лиофилизировали с получением продукта (чистота >95%). Откорректированную молекулярную массу и степень чистоты подтверждали с помощью МА1.1)! (масс-спектрометрия с ионизацией методом лазерной десорбции в матричном растворе)-массспектрального анализа.

Общая методика пегилирования (Суз-малеимид).

Суз-аналог глюкагона, как правило, растворяют в забуференном фосфатом солевом растворе (5-10 мг/мл), и добавляют 0,01М раствор этилендиаминтетрауксусной кислоты (10-15% от общего объема). Добавляют излишек (2-кратный) малеимидметоксиполиэтиленгликолевого реактива (компания №к!аг), и реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре с мониторингом развития реакции средствами НРЬС. Через 8-24 ч реакционную смесь подкисляют и загружают в колонку для препаративной хроматографии с обратной фазой для очистки с помощью градиентного 0,1% раствора ТГА/ацетонитрила. Соответствующие фракции объединяли и лиофилизировали с получением необходимых пегилированных аналогов.

Пример 1. Синтез глюкагона Суз¹⁷(1-29) и подобных моноСуз-аналогов.

0,2 ммоль смолы Вос ТЬт(0Ь71) Раш (компания 8упСНеш 1пс.) в 60 мл реакторе и приведенную ниже последовательность помещали в модифицированный синтезатор пептидов АррНеб Вюзуз!ешз 430А с последующим использованием Газ!Вос НВТи-активизированных одностадийных реакций сочетания.

П80СЧТ-5ОУ8КУТ.П8СКА0ОГС₀Ш.МЖ (последовательность 8Ер ΙΠ N0: 35).

Применялись приведенные ниже защитные группы боковых цепей: Агд(Тоз), Азр(0сНех), Азп(Хап), Суз(рМеВ71), О1и(0сНех), Н1з(Вос), Ьуз(2С1-2), 8ет(В71), ТЬт(В71), Тгр(СН0) и Тут(Вт-2). Полученную пептидильную смолу обрабатывали 20% раствором пиперидина в диметилформамиде для удаления формильной группы из триптофана, затем переносили во фтороводородный реактор и сушили в вакууме. Добавляли 1,0 мл п-крезола и 0,5 мл диметилсульфида с перемешиванием с помощью магнитной мешалки. Реактор присоединяли к фтороводородной установке (компания Репптзи1а ЬаЬз), охлаждали на бане со смесью сухого льда с метанолом, откачивали газ и конденсировали приблизительно 10 мл жидкого фтороводорода. Реакционную смесь перемешивали на ледяной бане в течение 1 ч, после чего фтороводород удаляли в вакууме. Остаток суспендировали в этиловом эфире; твердые вещества отфильтровывали, промывали эфиром и пептид экстрагировали в 50 мл водного раствора уксусной кислоты. Небольшую пробу расщепленного экстракта подвергали аналитическому НРЬС [колонка ХогЬах С8 0,46'5 см, 1 мл/мин, 45°С, 214 нм, буфер А - 0,1% раствор ТГА, буфер В - 0,1% раствор ТГА/90% раствор АСN (ацетонитрил), градиент от 10 до 80% В в течение 10 мин]. Остаток экстракта загружали в колонку для препаративной хроматографии с обратной фазой Ктошазй С18 2,2'25 см и градиент ацетонитрила прогоняли с помощью системы ГРЬС компании Ркагшас1а. 5 мин фракции собирали с УФ-мониторингом

- 26 017849 при 214 нм (2,0 А). А - 0,1% раствор ТРА, В - 0,1% раствор ТРА/50%) раствор ацетонитрила. Градиент от 30 до 100% В в течение 450 мин.

Фракции, содержащие самый чистый продукт (48-52), объединяли, замораживали и лиофилизировали с получением 30,1 мг. Анализ продукта средствами НРЬС показал степень чистоты >90%, а МАРОРмасс-спектральный анализ показал необходимую массу 3429,7. Подобным же образом получили глюкагон Сук²¹, глюкагон Сук²⁴ и глюкагон Сук²⁹.

Пример 2. Синтез глюкагона-Сех и других аналогов с С-концевым удлиняющим сегментом.

285 мг (0,2 ммоль) метоксибензгидриламина (компания М1б^ек! Вю1есЬ) в реакторе емкостью 60 мл и приведенную ниже последовательность помещали в модифицированный синтезатор пептидов АррНеб. Вюкук1етк 430А с последующим осуществлением РакШос НВТЦ-активизированных одностадийных реакций сочетания.

Н₈ОС,Т1_В8|>₃ЧК¥_ВП.ЧККЛОПП75»1Л1Х1'(:1>55С,Л1>РР.<, (последовательность 8Е<2 ГО N0: 36).

Применялись приведенные ниже защитные группы боковых цепей: Агд(Ток), Акр(0сНех), Акп(Хап), Сук(рМеВ/1), С1и(0сНех), Н1к(Вос), Ьук(2С1-2), 8ег(В/1), ТЬг(В/1), Тгр(СН0) и Туг(Вг-2). Полученную пептидильную смолу обрабатывали 20% раствором пиперидина в диметилформамиде для удаления защитной формильной группы из триптофана, затем переносили во фтороводородный реактор и сушили в вакууме. Добавляли 1,0 мл п-крезола и 0,5 мл диметилсульфида с перемешиванием с помощью магнитной мешалки. Реактор присоединяли к фтороводородной установке (компания Репптки1а ЬаЪ.), охлаждали на бане со смесью сухого льда с метанолом, откачивали газ и конденсировали приблизительно 10 мл жидкого фтороводорода. Реакционную смесь перемешивали на ледяной бане в течение 1 ч, после чего фтороводород удаляли в вакууме. Остаток суспендировали в этиловом эфире; твердые вещества отфильтровывали, промывали эфиром и пептид экстрагировали в 50 мл водного раствора уксусной кислоты. Аликвоту расщепленного экстракта подвергали аналитическому НРЬС [колонка /огЬах С8 0,46'5 см, 1 мл/мин, 45°С, 214 нм, буфер А - 0,1% раствор ТРА, буфер В - 0,1% раствор ТРА/90% раствор АСН градиент от 10 до 80% В в течение 10 мин]. Экстракт загружали в колонку для препаративной хроматографии с обратной фазой КготакП С18 2,2'25 см и градиент ацетонитрила прогоняли с помощью системы РРЬС компании РРагтас1а. 5 мин фракции собирали с УФ-мониторингом при 214 нм (2,0 А). А - 0,1% раствор ТРА, В - 0,1% раствор ТРА/50% раствор ацетонитрила. Градиент от 30 до 100% В в течение 450 мин. Фракции 58-65 объединяли, замораживали и лиофилизировали с получением 198,1 мг.

Анализ продукта средствами НРЬС показал степень чистоты более 95%. МАРОРмассспектральный анализ показал присутствие необходимой теоретической массы 4316,7 с продуктом в виде С-концевого амида. Подобным же образом в виде С-концевых карбоксильных кислот были получены оксинтомодулин и оксинтомодулин-КΚNН, начиная с соответствующим образом загруженной полиакриламидной смолы.

Пример 3. Глюкагон Сук¹⁷Ма1-РЕС-5К.

15,1 мг глюкагона Сук¹⁷(1-29) и 27,3 мг метоксиполи(этиленгликоль)малеимида (средняя молекулярная масса 5000, тРЕС-Ма1-5000, компания ^к^аг ТЬегареиНск) растворяли в 3,5 мл забуференного фосфатом солевого раствора (РВ8) и добавляли 0,5 мл 0,01М раствора этилендиаминтетрауксусной кислоты (РОТА). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре и развитие реакции контролировали посредством НРЬС анализа [колонка /огЬах С8 0,46'5 см, 1 мл/мин, 45°С, 214 нм (0,5 А), А 0,1% раствор ТРА, В - 0,1% раствор ТРА/90% раствор АСИ градиент от 10 до 80% В в течение 10 мин].

Через 5 ч реакционную смесь загружали в колонку для препаративной хроматографии с обратной фазой КготакП С18 2,2'25 см. Градиент ацетонитрила прогоняли с помощью системы РРЬС компании РРагтас1а с УФ-мониторингом при длине волны 214 нм и сбором 5 мин фракций. А - 0,1% раствор ТРА, В - 0,1% раствор ТРА/50%) раствор ацетонитрила, градиент от 30 до 100% В в течение 450 мин. Фракции, соответствующие продукту, объединяли, замораживали и лиофилизировали с получением 25,9 мг.

Этот продукт подвергали НРЬС анализу [колонка /огЬах С8 0,46'5 см, 1 мл/мин, 45°С, 214 нм (0,5 А), А - 0,1% раствор ТРА, В - 0,1% раствор ТРА/90% раствор АСН градиент от 10 до 80% В в течение 10 мин], который показал приблизительно 90% чистоту. \1ΛΙ,Ι)Ι (масс-спектрометрия с ионизацией методом лазерной десорбции в матричном растворе)-масс-спектральный анализ показал широкий диапазон массы (что типично для производных полиэтиленгликоля) от 8700 до 9500. Это указывает на добавление к массе исходного глюкагонового пептида (3429) приблизительно 5000 атомных единиц массы.

Пример 4. Глюкагон Сук²¹Ма1-РЕС-5К.

21,6 мг глюкагона Сук²¹(1-29) и 24 мг тРЕС-Ма1-5000 (компания №к1:аг ТЬегареиНск) растворяли в

3,5 мл забуференного фосфатом солевого раствора (РВ8), и добавляли 0,5 мл 0,01М раствора этилендиаминтетрауксусной кислоты (НОТА). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре. Через 2 ч добавляли еще 12,7 мг тРЕС-Ма1-5000. Через 8 ч реакционную смесь загружали в колонку для препаративной хроматографии с обратной фазой КготакП С18 2,2'25 см и градиент ацетонитрила прогоняли (4 мл/мин) с помощью системы РРЬС компании РЬагтас1а со сбором 5 мин фракций. А - 0,1% раствор ТРА, В - 0,1% раствор ТРА/50% раствор ацетонитрила. Градиент от 20 до 80% В в течение 450 мин.

Фракции, соответствующие появлению продукта, объединяли, замораживали и лиофилизировали с

- 27 017849 получением 34 мг. Анализ этого продукта средствами аналитической НРЬС [колонка ΖοΦαχ С8 0,46'5 см, 1 мл/мин, 45°С, 214 нм (0,5 А), А - 0,1% раствор ТЕА, В - 0,1% раствор ТЕА/90% раствор АСН градиент от 10 до 80% В в течение 10 мин] показал наличие однородного продукта, отличающегося от исходного глюкагонового пептида. МАЬЭ! (масс-спектрометрия с ионизацией методом лазерной десорбции в матричном растворе)-масс-спектральный анализ показал широкий диапазон массы (что типично для производных полиэтиленгликоля) от 8700 до 9700. Это указывает на добавление к массе исходного глюкагонового пептида (3470) приблизительно 5000 атомных единиц массы.

Пример 5. Глюкагон Сук²⁴Ма1-РЕО-5К.

20,1 мг глюкагона Сук²⁴(1-29) и 39,5 мг тРЕО-Ма1-5000 (компания №к1аг Тйегареийск) растворяли в 3,5 мл РВХ с перемешиванием и добавляли 0,5 мл 0,01М раствора ЕИТА. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 7 ч, после чего добавляли еще 40 мг тРЕО-Ма1-5000. Приблизительно через 15 ч реакционную смесь загружали в колонку для препаративной хроматографии с обратной фазой Ууйас С18 2,2'25 см и градиент ацетонитрила прогоняли с помощью системы ЕРЬС компании Рйагтааа. 5 мин фракции собирали с УФ-мониторингом при 214 нм (2,0 А). Буфер А - 0,1% раствор ТЕА, буфер В - 0,1% раствор ТЕА/50% раствор ацетонитрила, градиент от 30 до 100% В в течение 450 мин. Фракции, соответствующие продукту, объединяли, замораживали и лиофилизировали с получением 45,8 мг. МАЬОБмасс-спектральный анализ показал типичный для полиэтиленгликоля широкий сигнал с максимумом при 9175,2, что приблизительно на 5000 атомных единиц массы больше, чем у глюкагона С²⁴ (3457,8).

Пример 6. Глюкагон Сук²⁴Ма1-РЕО-20К.

25,7 мг глюкагона Сук²⁴(1-29) и 40,7 мг тРЕО-Ма1-20К (компания №к!аг Тйегареийск) растворяли в

3,5 мл РВХ с перемешиванием при комнатной температуре и добавляли 0,5 мл 0,01М раствора ЕИТА. Через 6 ч соотношение между исходным материалом и продуктом (по результатам определения средствами НРЬС) составляло приблизительно 60:4. Добавляли еще 25,1 мг тРЕО-Ма1-20К и реакционную смесь перемешивали в течение последующих 16 ч. Соотношение продукта существенно не улучшилось, поэтому реакционную смесь загружали в колонку для препаративной хроматографии с обратной фазой Кготакй С18 и очищали с помощью системы ЕРЬС компании Рйагтааа с использованием градиента от 30 до 100% В в течение 450 мин. Буфер А - 0,1% раствор ТЕА, буфер В - 0,1% раствор ТЕА/50% раствор ацетонитрила, расход - 4 мл/мин. 5 мин фракции собирали с УФ-мониторингом при 214 нм (2,0 А). Фракции, содержащие однородный продукт, объединяли, замораживали и лиофилизировали с получением 25,7 мг. Чистота, по результатам определения средствами аналитической НРЬС, достигала уровня ~90%. МАЬОБмасс-спектральный анализ показал широкий пик от 23000 до 27000, что приблизительно на 20000 атомных единиц массы больше, чем у исходного глюкагона С²⁴ (3457,8).

Пример 7. Глюкагон Сук²⁹Ма1-РЕО-5К.

20,0 мг глюкагона Сук²⁹(1-29) и 24,7 мг тРЕО-Ма1-5000 (компания №к!аг Тйегареийск) растворяли в

3,5 мл РВХ с перемешиванием при комнатной температуре и добавляли 0,5 мл 0,01М раствора ЕИТА. Через 4 ч добавляли еще 15,6 мг тРЕО-Ма1-5000 для доведения реакции до завершения. Через 8 ч реакционную смесь загружали в колонку для препаративной хроматографии с обратной фазой Ууйас С18 2,2'25 см, и градиент ацетонитрила прогоняли с помощью системы ЕРЬС компании Рйагташа. 5 мин фракции собирали с УФ-мониторингом при 214 нм (2,0 А). А - 0,1% раствор ТЕА, В - 0,1% раствор ТЕА/50% раствор ацетонитрила. Фракции 75-97 объединяли, замораживали и лиофилизировали с получением 40,0 мг продукта, отличающегося от выделенного посредством ЕГРЬС исходного материала (фракции 58-63). Анализ этого продукта средствами аналитической НРЬС [колонка Ζοώηχ С8 0,46'5 см, 1 мл/мин, 45°С, 214 нм (0,5 А), А - 0,1% раствор ТЕА, В - 0,1% раствор ТЕА/90% раствор АСН градиент от 10 до 80% В в течение 10 мин] показал степень чистоты, превышающую 95%. МАЕИЕмассспектральный анализ показал присутствие полиэтиленгликолевой составляющей с диапазоном массы от 8000 до 10000 (максимум при 9025,3), что на 5540 атомных единиц массы больше, чем у исходного материала (3484,8).

Пример 8. Глюкагон Сук²⁴(2-бутиролактон).

К 24,7 мг глюкагона Сук²⁴(1-29) добавляли 4 мл 0,05М раствора бикарбоната аммония/50% раствора ацетонитрила и 5,5 мкл раствора 2-бромо-4-гидроксимасляной кислоты-д-лактона (100 мкл в 900 мкл ацетонитрила). Через 3 ч перемешивания при комнатной температуре к реакционной смеси добавляли еще 105 мкл лактонового раствора и перемешивали в течение следующих 15 ч. Реакционную смесь разбавляли до 10 мл 10% водным раствором уксусной кислоты, и загружали в колонку для препаративной хроматографии с обратной фазой Кготаы1 С18 2,2'25 см. Градиент ацетонитрила от 20 до 80% В в течение 450 мин прогоняли с помощью системы ЕРЬС (компания Рйагташа) со сбором 5 мин фракций и с УФ-мониторингом при 214 нм (2,0 А). Расход - 4 мл/мин, А - 0,1% раствор ТЕА, В - 0,1% раствор ТЕА/50% раствор ацетонитрила. Фракции 74-77 объединяли, замораживали и лиофилизировали с получением 7,5 мг. Анализ средствами НРЬС показал чистоту 95%, и МАЬОБмасс-спектральный анализ показал массу 3540,7, что на 84 атомные единицы массы больше, чем у исходного материала. Этот результат соответствует добавлению одной бутиролактоновой составляющей.

- 28 017849

Последовательность 81:0 ΙΌ N0: 37 Молекулярная масса - 3541,91

Точная масса - 3538

Молекулярная формула Пример 9. Глюкагон Су5²⁴(8-карбоксиметил).

18,1 мг глюкагона Су5²⁴(1-29) растворили в 9,4 мл 0,1М натрийфосфатного буфера (рН 9,2) и добавили 0,6 мл раствора бромуксусной кислоты (1,3 мг/мл в ацетонитриле). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре и развитие реакции контролировали средствами аналитической НРЬС. Через 1 ч добавили еще 0,1 мл раствора бромуксусной кислоты. Реакционную смесь перемешивали в течение последующих 60 мин, после чего его подкисляли водным раствором уксусной кислоты и загружали в колонку для препаративной хроматографии с обратной фазой Кгоша511 С18 2,2'25 см для очистки. Градиент ацетонитрила прогоняли с помощью системы ГРЬС (компания РГагшас1а) (расход - 4 мл/мин) со сбором 5 мин фракций и с УФ-мониторингом при 214 нм (2,0 А). А - 0,1% раствор ΤΓΑ, В - 0,1% раствор ΤΓΑ/50% раствор ацетонитрила. Фракции 26-29 объединяли, замораживали и лиофилизировали с получением нескольких мг продукта. Анализ средствами аналитической НРЬС показал чистоту 90% и ΜΑΓΌΙ-масс-спектральный анализ подтвердил массу 3515 необходимого продукта.

Последовательность 81:0 ΙΌ N0: 38

Молекулярная масса - 3515,87

Точная масса - 3512

Молекулярная формула - С153Η224Ν42Ο5082

Пример 10. Глюкагон Су5²⁴малеимидоРЕ0-3,4К-димер.

мг глюкагона Су5²⁴ и 1,2 мг Μа1-РЕ0-Μа1-3400 (поли(этиленгликоль)-бис-малеимид, средняя молекулярная масса 3400 (компания Ыек1аг ТЬегареи11С5)) растворяли в 3,5 мл забуференного фосфатом солевого раствора и 0,5 мл 0,01М раствора ΡΌΤΑ и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре. Через 16 ч добавляли еще 16 мг глюкагона Су5²⁴ и перемешивание продолжали. Приблизительно через 40 ч реакционную смесь загружали в колонку РГагшас1а РерЯРС 16/10 и градиент ацетонитрила прогоняли с помощью системы ГРЬС компании РГагшас1а со сбором 2 мин фракций и с УФмониторингом при 214 нм (2,0 А). Расход - 2 мл/мин, А - 0,1% раствор ΤΓΑ, В - 0,1% раствор ΤΓΑ/50% раствор ацетонитрила. Фракции 69-74 объединяли, замораживали и лиофилизировали с получением 10,4 мг. Анализ средствами аналитической НРЬС показал 90% чистоту, ΜΑΓΌΙ-масс-спектральный анализ показал компонент в диапазоне 9500-11000, что соответствует необходимому димеру.

Пример 11. Синтез лактамов глюкагона 285 мг (0,2 ммоль) метоксибензгидриламиновой смолы (компания ΜκΙ\\Ό51 Бю1есЬ) загружали в реактор емкостью 60 мл и приведенную ниже последовательность собирали в модифицированном синтезаторе пептидов Αρρ^ά Β^ο5у5ΐет5 430Α посредством Вос ОЕЗЧУГ-активизированнввх одностадийных реакций сочетания.

ΗδρΟΤΙΤ^ΟΥδΙΏΓΙΏ^ΕΙ^ΑρΠΓΛ^ν/ΓΜίΠ-ΝΈΚ (12-16 лактам; последовательность 81:0 ΙΌ N0: 12)

Применялись приведенные ниже защитные группы боковых цепей: Αγ^(Το5), Α5ρ(0σ^χ), Ά5η(Xаη), 01и(0Гш), Н^5(Β0Μ), Ьу5(Гшос), 8е^(Βζ1), ΤΓγ(Βζ1), ΤΓρ(ΟΠ0), Τ^(Βγ-Ζ). Ьу5(С1-2) применяли в положении 12, если лактамы конструировали из 16-20, 20-24 либо 24-28. Полученную пептидильную смолу обрабатывали 20% раствором пиперидина в диметилформамиде в течение 1 ч с перемешиванием для удаления защитной формильной группы из триптофана, а также защитных групп Гшос и 0Гш из

- 29 017849

1.ук12 и С1и16. После подтверждения удаления положительной нингидринной реакцией, смолу промывали вначале диметилформамидом, затем дихлорметаном, после чего вновь диметилформамидом. Смолу обрабатывали 520 мг раствора (1 ммоль) бензотриазол-1-ил-окси-трис-пирролидино-фосфонийгексафторфосфата (РуВОР) в диметилформамиде и диизопропилэтиламине (ОША). Реакция продолжалась в течение 8-10 ч, и циклизация была подтверждена отрицательной нингидринной реакцией. Смолу промывали вначале диметилформамидом, затем дихлорметаном, после чего обрабатывали трифторуксусной кислотой в течение 10 мин. Удаление Вос-группы было подтверждено положительной нингидринной реакцией. Смолу промывали диметилформамидом и дихлорметаном и сушили перед перенесением во фтороводородный реактор. Добавляли 500 мкл п-крезола с перемешиванием с помощью магнитной мешалки. Реактор присоединяли к фтороводородной установке (компания Репптки1а ЬаЬк), охлаждали на бане со смесью сухого льда с метанолом, откачивали газ и в реакторе конденсировали приблизительно 10 мл жидкого фтороводорода. Реакционную смесь перемешивали на ледяной бане в течение 1 ч, после чего фтороводород удаляли в вакууме. Остаток суспендировали в этиловом эфире; твердые вещества отфильтровывали, промывали эфиром и пептид растворяли в 150 мл смеси 20% раствора ацетонитрила/1% раствора уксусной кислоты.

Анализ неочищенного растворенного пептида средствами аналитической НРЬС осуществляли при следующих условиях [колонка Х!егга С8 4,6'30 мм, 1,50 мл/мин, 220 нм, буфер А - 0,1% раствор ТЕА/10% раствор АС^ буфер В - 0,1% раствор ТЕА/100% раствор АС^ градиент 5-95% В в течение 15 мин]. Экстракт подвергали двукратному разбавлению водой, загружали в колонку для препаративной хроматографии с обратной фазой Уубас С4 2,2'25 см и элюировали градиентом ацетонитрила с помощью системы НРЬС компании \Са1егк (буфер А - 0,1% раствор ТЕА/10% раствор АСН буфер В - 0,1% раствор ТЕА/10% раствор САN (церийнитрат аммония) и градиент 0-100% В в течение 120 мин с расходом 15,00 мл/мин). Анализ очищенного пептида средствами НРЕС показал степень чистоты более 95% и массспектральный анализ с ионизацией электрораспылением подтвердил массу 3506 Да для 12-16 лактама. Лактамы из 16-20, 20-24 и 24-28 были получены подобным же образом.

Пример 12. Анализ растворимости глюкагона.

Раствор (1 или 3 мг/мл) глюкагона (или аналога) получают в 0,01н. растворе НС1. 100 мкл концентрированного раствора разбавляют до 1 мл с помощью 0,01н. раствора НС1 и определяют УФоптическую плотность (276 нм). рН оставшейся части концентрированного раствора доводят до рН 7 с помощью 200-250 мкл 0,1М раствора \а₂11Р0.| (рН 9,2). Раствор отстаивают в течение ночи при температуре 4°С с последующим центрифугированием. После этого 100 мкл надосадочной жидкости разбавляют до 1 мл с помощью 0,01н. раствора НС1 и определяют УФ-оптическую плотность (с дублирующим определением).

Начальные значения оптической плотности корректируют с учетом увеличения объема и определение процента растворимости осуществляют по приведенной ниже формуле

Конечная оптическая плотность

Начальная оптическая плотность

X ΙΟθ _ Процентный показатель растворимости

Результаты приведены в табл. 1, где глюкагон-Сех представляет глюкагон дикого типа (последовательность БЕР ΙΟ N0: 1) плюс карбоксиконцевой удлиняющий сегмент (последовательность БЕР ΙΟ 12

N0: 26) и глюкагон-Сех К представляет последовательность БЕР ΙΟ N0: 39.

Таблица 1

Данные по аналогов глюкагона

Аналог	Процентный показатель растворимости
Глюкагон	16
Глюкагон-Сех, К12	104
Глюкагон-Сех	87
Оксинтомодулин	104
Глюкагон, Суз17РЕО5К	94
Глюкагон, Суз21РЕС5К	105
Глюкагон, Суз24РЕСг5К	133

Пример 13. Анализ связывания глюкагонового рецептора.

Сродство пептидов к глюкагоновому рецептору определяли с помощью конкурентно-связывающего анализа с применением анализа по эффекту близости сцинтилляции. Серийные трехкратные разведения пептидов, полученных в буфере для анализа по эффекту близости сцинтилляции (0,05М раствор трисНС1, рН 7,5, 0,15М раствор №С1, 0,1% раствор (в отношении массы к объему) сывороточного альбумина крупного рогатого скота), смешивали в лунках 96-луночного планшета с белым/прозрачным дном (компания Согшпд Ιιιο., Ас!оп, штат Массачусетс) с 0,05 нМ (3-[¹²⁵I]-иодотирозил)Ту^10 глюкагоном (компания Атегкйат ВюкЛепсек, Р1кса!а^ау, штат Нью-Джерси), 1-6 мкг/лунка, фрагментами плазменной мембраны клеток, сверхэкспрессирующих глюкагоновые рецепторы человека, и гранулами агглютинина типа А проростков пшеницы, обработанных полиэтиленимином (1 мг/лунка), для анализа по эффекту бли

- 30 017849 зости сцинтилляции (компания АшегкЬаш Вюкс1епсек, Р1кса1а\ау, штат Нью-Джерси). После 5 мин встряхивания (800 об/мин) на роторной качалке планшет инкубировали в течение 12 ч при комнатной температуре, после чего считывали на жидком сцинтилляционном счетчике М1стоВе1а 1450 (компания Реткт-Е1шет, ^е11ек1еу, штат Массачусетс). Уровень неспецифически связанной Щ8В) радиоактивности определяли в лунках с концентрацией холодного нативного лиганда, в 4 раза превышающей максимальную концентрацию экспериментальных образцов, и общий уровень связанной радиоактивности выявляли в лунках без конкурента. Процент специфического связывания вычисляли следующим образом: % специфического связывания = ((связанная-неспецифически связанная)/(общая связаннаянеспецифически связанная))х100.

Значения Κ'\₀ определяли с помощью программного обеспечения 0тЮ1п (компания 0тЮ1пЬаЬ, Хопкашринт штат Массачусетс).

Пример 14. Функциональный анализ-синтез цАМФ.

Способность аналогов глюкагона индуцировать цАМФ определяли с помощью репортерного анализа на основе люциферазы светляков. Клетки НЕК293, котрансфицированные глюкагоновым рецептором либо ОЬР-1-рецептором и геном люциферазы, связанным с элементом, реагирующим на цАМФ, лишали сыворотки посредством культивирования в течение 16 ч в среде ЭМЕМ (модифицированная по способу Дульбекко среда Игла, компания Ыуйтодеп, Сат1кЬаб, штат Калифорния), дополненной 0,25% сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота, дополненной химическими компонентами, стимулирующими рост и пролиферацию клеток (компания НуС1опе, Ьодап, штат Юта), после чего инкубировали с серийными разведениями глюкагона, ОЬР-1 или новых аналогов глюкагона в течение 5 ч при температуре 37°С, 5% С0₂ в сенсибилизированных полн-О-лнзином 96-луночных планшетах Вюсоа! (компания ВО Вюкщепеек, 8ап 1оке, штат Калифорния). В конце инкубирования в каждую лунку добавляли 100 мкл люминесцентного субстрата ЬисЬйе (компания Реткт-Е1шет, ^е11ек1еу, штат Массачусетс). Планшет встряхивали в течение непродолжительного периода времени, инкубировали в течение 10 мин в темноте и с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика М1стоВе1а-1450 (компания Реткт-Е1шет, ^е11ек1еу, штат Массачусетс) определяли светоотдачу. Эффективные 50% концентрации вычисляли с помощью программного обеспечения 0пО1п (компания 0тЮ1пЬаЬ, Nо^ίЬатрίоп, штат Массачусетс). Результаты представлены на фиг. 3-9 и в табл. 2-10.

Таблица 2

Индуцирование цАМФ аналогами глюкагона с С-концевым удлиняющим сегментом

Пептид	Индуцирование цАМФ
Глюкагоновый рецептор	ОЬР-1 -рецептор
ЕС₅о, нМ	Ν*	ЕС₅о, нМ	Ν*
Глюкагон	0,22±0,09	14	3,85±1,64	10
ОЬР-1	2214,00±182,43	2	0,04±0,01	14
Глюкагон Сех	0,25±0,15	6	2,75±2,03	7
Оксинтомодулин	3,25±1,65	5	2,53±1,74	5
Оксинтомодулин ΚΚΝΚ	2,77±1,74	4	3,21±0,49	2
Глюкагон К. 12	0,41 ±0,17	6	0,48=1=0,11	5
Глюкагон К. 12 Сех	0,35±0,23	10	1,25±0,63	10
Глюкагон К.12 К20	0,84±0,40	5	0,82±0,49	5
Глюкагон К. 12 К24	1,00±0,39	4	1,25±0,97	5
Глюкагон К12 К29	0,81±0,49	5	0,41±0,24	6
Амид глюкагона	0,2б±0,15	3	1,9О±О,35	2
Оксинтомодулин С24	2,54±0,63	2	5,27±0,26	2
Оксинтомодулин С24	0,97±0,04	1	1,29±0,11	1
Пептид	Индуцирование цАМФ
Глюкагоновый рецептор	СЬР-1-рецептор
ЕС₅о, нМ	Ν* ’	ЕС₅₀, нМ	Ν*
Глюкагон	0,22±0,09	14	3,85±1,64	10
РЕО 20К

* Количество экспериментов

- 31 017849

Таблица 3

Индуцирование цАМФ пегилированными аналогами глюкагона

Пептид	Индуцирование цАМФ
Глюкагоновый рецептор	СЬР-1-рецептор
ЕС₅о, нМ	Ν*	ЕС₅₀, нМ	Ν*
Глюкагон	0,33±0,23	18	12,71±3,74	2
Глюкагон С17 РЕС 5К	0,82±0,15	4	55,86±1,13	2
Глюкагон С21 РЕС 5К	0,37±0,16	6	11,52±3,68	2
Глюкагон С24 РЕС 5К	0,22±0,10	12	13,65±2,95	4
Глюкагон С29 РЕС 5К	0,96±0,07	2	12,71±3,74	2
Глюкагон С24 РЕС 20К	О,О8±О,О5	3	не определялось
Глюкагон С24 димер	0,10±0,05	3	не определялось
СЬР-1	>1000		0,05±0,02	4

* Количество экспериментов

Таблица 4

Индуцирование цАМФ аналогами глюкагона Е16

Процент активности по сравнению с нативным лигандом
Пептид	Глюкагоновый рецептор	СЬР-1-рецептор
Е16 Ο1ιιο-ΝΗ2	187,2	17,8
Глюкагон	100,0	0,8
С1ис-ИН2	43,2	4,0
И1еиЗ, Е16 С1ис-ИН2	7,6	20,6
ЕЗ, Е16 О1ис-ИН2	1,6	28,8
ОгпЗ, Е16 С1ис-ЫН2	0,5	0,1
СЬР-1	<0,1	100

Таблица 5

Индуцирование цАМФ аналогами глюкагона Е16

Процент активности по сравнению с нативным лигандом
Пептид	Глюкагоновый рецептор	СЬР-1-рецептор
Е16 61ис-ИН2	187,2	17,8
Е15, Е16 61ιιο-ΝΗ2	147,0	9,2
Е16, К20 Ο1ιιο-ΝΗ2	130,1	41,5
С1ис-ИН2	43,2	4,0

Таблица 6

Значения ЕС₅₀ в случае индуцирования цАМФ аналогами глюкагона Е16

	Глюкаго-новый рецептор	СЬР-1-рецептор
Пептид	ЕС₅₀ (нМ)	Среднее квадратическое отклонение	η	ЕС₅₀ (нМ)	Среднее квадратическое отклонение	η
Глюкагон	0,28	0,14	10	4,51	нет данных	1
Глюкагон-ЫН2	0,53	0,33	8	1,82	0,96	5
Е16 61υο-ΝΗ2	0,07	0,07	10	0,16	0,14	10
Е16, 030 С1ис-МН2	0,41	0,36	5	0,24	0,10	5
Е16, 030 О1ис-Сех	0,51	0,46	5	1,19	0,86	5
ОЬР-1	2214	нет данных	1	0,03	0,02	9

- 32 017849

Таблица 7

Значения ЕС₅₀ в случае цАМФ аналогами глюкагона Е16

	Глюкагоновый рецептор	СЕР-1-рецептор
Пептид	ЕС₅₀ (нМ)	Среднее квадратическое отклонение	η	ЕС50 (нМ)	Среднее квадратическое отклонение	η
Е16 Глюкаго Η-ΝΗ2	0,07	0,07	10	0,16	0,14	10
ЬС8О₃16 Глюкагон-ЫН2	0,25	0,12	2	0,19	0,02	2
ИЕ16 Глюкагон-Т4Н2	0,17	0,08	2	0,25	0,03	2
Н16 Глюкагон-МН2	0,45	0,3	2	0,38	0,11	2
(Ц 6 Г люкагон-МН2	0,22	ОЛ	2	0,39	0,08	2
ϋ16 Глюкагон-КН2	0,56	0,15	2	0,93	0,28	2
(816) Глюкагон-ЫН2	0,53	0,33	8	1,82	0,96	5

Таблица 8

	Глюкагоновый рецептор	6ЬР-1 -рецептор
Пептид	ЕС₅о (нМ)	Среднее квадратическое отклонение	η	ЕС 50 (нМ)	Среднее квадратическое отклонение	η
Е16 Глюкагон-ЯН2	0,07	0,07	10	0,16	0,14	10
Т16 Глюкагон-ХН2	0,10	0,02	3	1,99	0,48	3
616 Глюкагон-ЫН2	0,10	0,01	3	2,46	0,60	3
Глюкагон-ННЗ	0,53	0,33	4	1,82	0,96	5
СЬР-1	2214	нет данных	1	0,03	0,02	9

Е16 С1ие N16 был в четыре раза активнее на глюкагоновом рецепторе по сравнению с С16-С00Н и Т16 С1ие НН₂, в тех случаях, когда соединения тестировались одновременно.

Таблица 9 Индуцирование цАМФ Е16/лактамными аналогами глюкагона

Процент активности по сравнению с нативным лигандом

Пептид	Глюкагоновый рецептор	6ЬР-1-рецептор
Е24К28 6Ιιιο-ΝΗ2 Ьас	196,4	12,5
Е16К20 Ο1ιιο-ΝΗ2 Ьас	180,8	63,0
К12Е16 61ιχ-ΝΗ2 Ьас	154,2	63,3
К20Е24 О1ис-?Ш2 Ьас	120,2	8,1
Е16 61ис-ЫН2	187,2	17,8
Е16, К20 61ικ-ΝΗ2	130,1	41,5
Г люкагон	100,0	0,8
6г1ис-ЫН2	43,2	4,0

Таблица 10

Индуцирование цАМФ СЕР-1 17-26 аналогами глюкагона

	Глюкагоновый рецептор	СЬР-1 -рецептор
Пептид	ЕС50 (нМ)	Среднее квадратическое отклонение	ЕС50 (нМ)	Среднее квадратическое отклонение
СЬР-1			0,023	0,002
01ιιοΝΗ2	0,159	0,023
Е16 СЬР-1			0,009	0,000
Е16 Глюкагон-№12	0,072	0,007
Е16 6ЬР( 17-26)Ο1υ(27-29)-ΝΗ2	0,076	0,004	0,014	0,001
Е16 6ЬР(17-29)->Ш2	0,46	0,023	0,010	0,000
Е16 ОЬР(17-29)-МН2 Е24, К28	0,23	0,020	0,007
Е16 СЬР(17-29)-ЫН2 Е24, К28 лактам	0,16	0,017	0,007	0

Пример 15. Анализ стабильности аналогов глюкагона Сук-малеимидоРЕС.

Каждый из аналогов глюкагона растворяли в воде или РВ5 и проводили начальный анализ средствами НРЕС. После регулирования рН (4, 5, 6, 7) образцы инкубировали в течение определенного периода

- 33 017849 времени при температуре 37°С и повторно анализировали средствами НРЬС для определения целостности пептида. Определяли концентрацию представляющего интерес специфического пептида и вычисляли процент оставшегося интактным пептида в сопоставлении с данными начального анализа. Результаты для глюкагона Сук²¹-малеимидоРЕС_5К представлены на фиг. 1 и 2.

Пример 16. Представленные ниже глюкагоновые пептиды сконструированы, в целом, как описано выше в примерах 1-11.

Во всех представленных ниже последовательностях а обозначает С-концевой амид.

Η8ζ)€τΤ ΕΓ8ϋΥ 8ΚΥΕΟ ЕККАО ОРУ05У ЬМОТа (§Е0 ГО ΝΟ: 70)

Н8(2ОТ ΓΤ8ΟΥ 8ΚΥΕϋ ЕККАК ОРУОДУ ЕМЬГГа (8Е(^ ГО N0: 71)

ΙΙ8ζ)ΟΤ ΕΤδϋΥ 8ΚΥΕϋ ЕККАК БРУНАУ ЕМЫТа (лактам в положениях

16-20; 8Ε9ΙΟΝΟ: 72)

Η5(2θΤ ΡΤ8ΏΥ 8ΚΥΕΟ ЕККАООЕУОЗУ ЕМКТа (лактам в положениях 12-16;

8Εζ) ГО N0:73)

Н8рОТРГ8О¥8К¥1ГОЕККАКОГУ0^ЕМКТа _{(лактам в} положениях

12-16; 8Е0 ГО ΝΟ: 74)

Η80ΟΤΙΤ8ϋΥ8ΚΥΜΚΚΚΑΕϋΡν0ΑνΕΜΝΤΗ фактам в положениях

16-20; 8Е() ГО ΝΟ: 75)

Н80СЗТ ΡΓ8ϋΥ 8ΚΥ1Ι) ЕКААКβρνθλ¥ ΕΜΝΤη _{ιο Ν0: 76)}

Н80ОТ ΡΤ8ΏΥ 8КУ1ГО ЕКААК ОРУО^У ЬМКГа (лактам положениях

16-20; 8Εζ) ГО N0: 77)

Η8(^ΟΤ ΕΤ8ΟΥ 8ΚΥ1Ό ЕК ΑΑζ) ОЕУ(Ж ЬМИТа

12-16; 8Εζ) ГО ΝΟ: 78)

Н80ОТ ΕΤ8ΌΥ 8ΚΥΕΏ ЕКААК РРУ(Ж ШКГа

12-16; 8Е(^ ГО ΝΟ: 79)

Н8<2ОТ ΓΤ8ϋΥ 8ΚΥΕΟ ККААЕ ОЕУОДУ ΕΜΝΤη (лактам положениях (лактам положениях (лактам положениях

16-20; 8Εζ) ГО N0: 80)

Η8ζ)0Τ ΕΤ8ΟΥ 8ΚΥΕΟ ЕОААК ΕΡΙΑΨ ΕΜΝΤα _(8Ер _{ΙΟ Ν0:} 81)

Η8ρθΤΕΤ8ϋΥ8ΚΥΕΏΕ9ΑΑΚΕΠΑΨΕΜΝΤα _{(лактам в ПОЛО}жениях

12-16; 8ЕС) ГО ΝΟ: 82)

НЗСбТРГЗОУЗКУШЕОААКЕНАЗУШНТа _{(лактам в ПОЛО}жениях

16-20; 8Е(9 ГО ΝΟ: 83)

- 34 017849

Н80ОТ ΕΤ8ΟΥ 8ΚΥΙΌ Εζ)ΑΑΚ ΕΡΙΑΨ ЬУКОа _(δΕρ _{ΙΟ Ν0: 84)}

Η80ΟΤΡΓ8ΟΥ ЗКУГГОЕОААКЕИА^ЬУКОа _{(лактам в положенИ}ях 12-16;

8ЕО ГО ΝΟ: 85)

Η8ΡΟΤΕΓ8ΟΥ 8КУ1ГОЕОААКЕНА^ЬУКОа _{(лактам в} положениях 16-20;

8Е0 ГО N0: 86)

Х1800Т ΕΓδϋΥ 8ΚΥΕΕ) ЕККА<2 ЬМНТа _(8Ер © _Ν0: 87)

Х18СЮТ ΡΤ8ΟΥ 8ΚΥΕΟ ЕККАК ВРУСрМ ЬМХГа _(8Ер _{ΙΟ Ν0: 88})

Х180ОТтО¥8К¥ШЕККАКОРУС1¥Ш1ЧТа _{(лактам в} положениях 16-20;

8Е0 ΙΠΝΟ: 89)

Х18аСТРГ8П¥8К¥ШЕК«АСОРУр5УШКГ_{а (лактам в} положениях 12-16;

8Е0 ГО N0: 90)

ΧΙδρθΤΡΤδϋΥ 8ΚΥΏΟ ЕККАК ОРУО^ЬМХТа (_{лактам в} положениях 12-16;

8Εζ) ГО ΝΟ: 91)

Χ18(2(3ΤΕΓ8ϋΥ 8ΚΥΕΟ КККАЕ РЕУрУ/ЕМИТа (_ла1<там в положениях 16-20; 8Е(2 ГО N0: 92)

Χ180ΟΤΓΤ8ϋΥ8ΚΥΙΙ)ΕΚΑΑΚΟΡν0ΨΕΜΝΤα (_8Ер © \()_: 93)

Х180ОТЭТ5О¥8К¥ШЕКААКОРУ0^ЬМКГа _{(лактам в} положениях 16-20;

8Е() ГО N0: 94)

Χ180ΟΤΕΓ8ΠΥ 8ΚΥ^^ΕΒΑΑ^^ΕV^5V1ΜNΤа (_{лактам в} положениях 12-16;

8Е(^ ГО N0: 95)

Χ180ΟΤΡΤ8ΟΥ ЗКУШЕКААКОРУОУ/ЕМИТа (_{лактам в} положениях 12-16;

8Εζ) ГО N0: 96)

ΧΙ^ΟΤΉ'δΒΥ 8КУ1Ю ККААЕВ1Д^\У1Л1МТа (_{лактам в} положениях 16-20;

8Е0 ГО N0: 97)

Χ1896ΤΡΓ8ϋΥ8ΚΥΕΟ^ΑΑΚΕΕ[ΑΧ¥ΕΜΝΤΗ (_8Ер _{ΙΟ Ν0: 98)}

Х18аОТЕГ8О¥8К¥ЬПЕ0ААКЕНА^1ММТа (_{лактам в} положениях 12-16; 8Е(} ГО N0: 99)

Х18рОТЕГ8О¥8К¥ШЕрААКЕРШУ1ММТа (_{лактам в} положениях 16-20;

8Εζ)©Ν0: 100)

Х18С2ОТ ΕΓ8ϋΥ 8ΚΥΙΌ Εζ)ΑΑΚ ЕРТАУ/ ЕУКСа (_8Ερ ©N0:101)

Χ180ΟΤ ΡΤδϋΥ 8ΚΎΙ3Ο ΕΟΑΑΚ ЕНАУ/ЬУКСта _{(лактам в положениях} 1₂-16;

ЗЕфГОХО: 102)

Χ180ΟΤΡΤ8ϋΥ 8ΚΥΙΊ) ЕОААКЕБТАХУЬУКСа (_лактам в положениях 16-20;

8Е0 ГО ΝΟ: 103), где, в предшествующих последовательностях, Х1=^:(дезамино)Н1з.

ΗΧ29ΟΤΙΤ8ΟΥ8ΚΥΙ^ΕΙ^ΑΡϋΡν0^ΚΜΝΤ₃ (_8Ер ©_ΝΟ: 104)

НХ20ОТΓΓ8ϋΥ 8ΚΥΕΣ) ЕККАКΏΈνΟΦΕΜΝΤη (_8Ερ © _ΝΟ: ]₀₅)

НХ2дОТРГ8О¥8К¥ЬОЕККАКОКУ(2^1ЛШТ_{а (лактам в положе}ниях 16-20; δΕςίϋΝΟ: 106)

ΗΧ20ΟΤΕΤ8ηΥ8ΚΥΕυΕΚΚΑ0ΟΡνρ3νΐΧΙΝΤα (_{лактам в} положениях 12-16;

δΕί^ΙΌΝΟ: 107)

ΗΧ2ζ)ΟΤ ΡΤ8ϋΥ 8К¥Ы) ЕККАК ОРУСЦУ ЬМ№Га (_лаКтам в положениях 12-16;

δΕζΗϋΝΟ: 108)

НХ2(2С1Т РТ80Υ 8ΚΥΙΣ) КККАЕ ΟΕνΟ^ν ЬМИТа (_{лактам в} положениях 16-20;

8Ε()1Τ)ΝΟ: 109)

НХ2(2ОТ ΡΓ8ϋΥ 8ΚΥΙΌ ΕΚΑΑΚΌΡνζΛνΕΜΝΤα (_8Ες ©N0:110)

НХ2ОСЗТ ΡΤδϋΥ 8ΚΥΙ.Σ) ΕΚΑΑΚ ϋΡνονΖ ЬМИТа (_{лактам в} положениях 16-20; 8Εζ) ΙϋΝΟ: 111)

ΙΙΧ20<3ΤΓΤ8ΟΥ8ΚΥΕΟΕΚΑΑ0ϋΕν₀^ΕΜΝΤ_{3 (лактам в положениях} ι₂_16;

8Еф ΙΏΝΟ: 112)

НХ20ОТРГ8ВУ8К¥ЬОЕКААКВРУ(2^ШКТа _{(лактам в положениях 12}__16;

8Е() ΙϋΝΟ: 113)

ΗΧ2ζ)(3Τ ΡΤ8ΏΥ 8К¥Ы) ККААЕ БРУНАУ ЬМИТа (_лактам в положениях 16-20;

8Е(} ΙϋΝΟ: 114)

НХ2рОТ ΡΤ8ΟΥ 3ΚΥΕΟЕрААК ЕР1А1УЬМИТа _(8Е(у © _ΝΟ: 115)

ΗΧ2αθΤΡΓ₈ΠΥ8ΚΥ^ΕΡΑΑΚΕΗΑ^1ΜΝΤ_{3 (лактам в положеН}иях 12-16; 8Е0 ΙΟΝΟ: 116)

НХ2рСТРГ8О¥8К¥Ы>Е0ААКЕЕ1АХ¥ЕММТа _{(лактам в положеН}иях 16-20;

8Εζ)ΙϋΝΟ: 117)

НХ2рСТ ΕΓ8ϋΥ 8ΚΥΕΠЕОААКЕЕШУ ΙΑ/КСа ₍₈рр _{ю Ν}θ. !!₈₎

- 35 017849

НХ2РСТ ΕΓ8ΟΥ ЗКУЬБ ΕρΛΑΚ ΕΡΙΑΨ ЬУКОа _{(лактам в положениях 12}._16;8Εζ) ΙΒΝΟ: 119)

НХ2рС}Т РТЖУ БКУЬСЕрААКЕНААЬУКОа (_{лактам в} положениях 16-20;

8Е(} ΙΟΝΟ: 120), где в предшествующих последовательностях Х2 - аминоизомасляная кислота. ΗΧ20σΤΕΤ8ηΥ8ΚΥΕΟΕΚΚΑ0ηΡνρ\νΕΜΝΤα (§_Ер _{ΙΟ ΝΟ: 121)}

ΗΧ2ζ)(3Τ ΕΓδϋΥ 8ΚΥ1Ο ЕЙКАК ϋΕνΟΨ ЬММГа _(8Ер _{ΙΟ ΝΟ}; 122) ΗΧΙΟΟΤΡΓδυΥδΚΥΕΟΕΚΚΑΚΠΕνρψΙΜΝΤα _{(лактам в} положениях 16-20;

8Ε<)ΙΏΝΟ: 123)

ΗΧ2ζ)6Τ ΕΤ8ϋΥ 8ΚΥΕΟ ΕΙΙΚΑζ) ОЕУрУ/ ЬМИТа (лактам в положениях 12-16; 8Ε(}Π)ΝΟ: 124)

НХ2_СОТЕТ8_ОУ8КУЕПЕККАКБРУр^ЕМ1ЧТа _{(лактам в положениях 12}._16;8Е() ГО N0: 125)

НХгрОТтОУЗКУШКККАЕОЕУр^ШКТа _{(лактам в положеН}иях 16-20; δΕρίϋΝΟ: 126)

НХ2(2ОТЕГ8ОУ 8ΚΥΙΖ>Ε&ΑΑΚϋΓν0ΨΕΜΝΤΗ (_8Ер _{ш Ν0; 127}) ΗΧ2_ΩΟΤΕΤ8ΟΥ8ΚΥΕΟΕΚΑΑΚϋΕνρ^ΕΜΝΤα _{(лактам в положеН}иях 16-20;

8ΕρΐϋΝΟ: 128)

ΗΧ20ΟΤΡΓ8ΟΥ 8ΚΥΙ29 ЕКААО ϋΕΫΟΐν ЕМЛТа (_{лактам в} положениях 12-16;

8ΕςΐϋΝΟ; 129)

НХ20ОТ ΕΤ8ϋΥ 8ΚΥΙΤ)ΕΚΑΑΚ ТУРУСАМΕΜΝΤβ (_{лактам в} положениях 12-16; 8Εζ) ГО N0: 130)

НХ20ОТ ΡΤ8ΟΥ 8ΚΥΙΌ ККААЕ ОЕУЦУУ ЕМЭТа (_{лактам в} положениях 16-20; 8ЕЦ ГО ΝΟ: 131)

НХ2рОТ ΡΤ8ΟΥ 8ΚΥ1Ό Е0ААК ЕПА^УЕМКТа (_8Ер _{ΙΌ Ν0: 132})

НХ20СТ ΡΤ8ΏΥ 8ΚΥΙ1) ЕЦААК ЕЕ1АЗУ ЬМЕГГа (_{лактам в} положениях 12-16;

8ΕρΐϋΝΟ: 133)

НХ20СТЕТ8ПУ 8ΚΥ1Ό ЕрААК ΕΕΙΑ\ν ЬМИТа (_{лактам в} положениях 16-20;

8Е(2ГОЖ): 134)

НХ20СТ ΡΤ8ΠΥ 8ΚΥΙΣ) ЕЦААКΕΠΑ1ΥЬУКОа (_8Ер _{ш Ν0;} ! ₃₅)

НХ2ЦСТ РТ8ОΥ 3ΚΥΙΧ) Е(2ААК ЕР1А\У ЬУКОа (_лактам в положениях 12-16: 8Ε0ΙϋΝΟ: 136)

НХ20ОТЕГ8О¥8КУШЕрААКЕИА^ЬУКОа _{(лактам в положенйЯХ 16}_₂₀. 8Е(Э ΙΌ ΝΟ: 137), где в предшествующих последовательностях Х2 - (Б-А1а).

- 36 017849

Н8Е6Т ΕΓ8ϋΥ 8ΚΥΕΟ ЕККАЦ ОГУЦУ/ ΣΜΝΤα _(8Ер _{ю Ν0}. ₁₃₈₎

Н8ЕОТ ΕΤ8ϋΥ 8ΚΥ1Σ) ЕККАК БРУр^У ΕΜΝΤη _{ΙΟ Νο}: 13 9)

Н8ЕОТ ΕΤ8Ώ Υ 8ΚΥΙΖ) ЕККАК ОРУЦАУ ΕΜΝΤα (лактам положениях

16-20; 8ЕЦ ΙϋΝΟ: 140)

ΙΙ8ΕΟΤ ΡΓ8ϋΥ 8ΚΥ1Ε ЕККАО ϋΡΥρψ ЬМИТа (лактам положениях

12-16; 8Ε<2Π)ΝΟ: 141)

Н8ЕОТ ΕΓ8ΟΥ 8ΚΥΕΟ ЕККАК ОГУЦУ/ ЪМШа (лактам положениях

12-16; ЗЕЦГОИО: 142)

Н8ЕС5Т ΡΤ8ΟΥ 8ΚΥΕΟ КККАЕ ΕΜΝΤ3 (лактам положениях

16-20; ЗЕЦГОИО: 143)

Н8ЕСТ ΡΤ8ΏΥ 8ΚΥΕΏ ЕКААК ОРУЦ^У ШКГГа _(8Ер _{ю Ν}θ. ₁₄₄₎

Η8ΕΟΤΡΤ8ΟΥ8ΚΥΕΏ ЕКААК ОРУЦУ/ЕМКГа _{(лактам в положениях}16-20; 8Ε(2ΙϋΝΟ: 145)

Η8Ε0ΤΡΓ8ΟΥ8ΚΥΕ0ΕΚΑΑ9ΟΡνρ^ΕΜΝΤα _(лактам в положениях 12-16 δΕρίΟΝΟ: 146)

Η8ΕσΤΕΓ8ϋΥ8ΚΥΙΙ> ЕКААК ОРУЦУУЬММТа _{(лактам в положениях}

12-16; 8 Ер Ιϋ ΝΟ: 147)

Н8ЕОТ ΡΤ8ϋΥ 8ΚΥΕΟ ККААЕ ОЕУЦАУ ЕММТа (лактам в положениях

16-20; 8Εζ) ГО ΝΟ: 148)

Н8ЕОТ ΡΤδϋΥ 8ΚΥΕϋ ЕЦААК ЕРШУ ЕМКГГа (_8ЕЦ ГО ΝΟ: 149)

Н8ЕСТКГ8ОУ8КУШЕ9ААКЕИА^ШМТа _{(лактам в ПОЛОЖ}ениях 12-16;

ЗЕЦГОЫО: 150)

Н8ЕОТ РТ8В Υ 8ΚΥΕΠ Ер А АК ΕΡΙΑλΥ ЬЛ/СЧТа _{(лактам в положениях 16}._20;

8ЕЦ ΠΟΝΟ: 151)

Н8ЕОТ ΕΓ8ϋΥ 8ΚΥΕΕ) ЕЦААК ЕЕГАУУ ЬУКОа _{ΙΟ ΝΟ}: 152)

Н8ЕСТ ΡΤ8ΟΥ 8ΚΥΙΤ) ЕОААК ЕИААУ ЬУКОа (_{лактам в} положениях 12-16;

8Εζ)ΙϋΝΟ: 153)

Η8ΕΟΤΡΤ8ϋΥ 8КУ1ГО Е<2ААКЕР1АУУ ЬУКОа _{(лактам в} положениях 16-20;

δΕΟΙϋΝΟ: 154)

Х18ЕСТ ΕΙ8ΟΥ 8ΚΥΙΣ) ЕЕЖАО Е)РУ(^У 1ЖГа _(8Ер ю ΝΟ: 155)

Χ18ΕΟΤΡΤ8ϋΥ8ΚΥΤΟΕΚΚΑΚΟΡνρλνΕΜΝΤΗ _(8Ер _{ш Ν0; 156)}

Х18ЕОТГГ8О¥8К¥ЕОЕККАКОРУр^ЬМХТа _{(лактам в положеН}иях 16-20;

δΕρίϋΝΟ: 157)

Χ18ΕΟΤΡΤ8ϋΥ ЗКУЬО ЕККАО ϋΡνΩλΥ Ι_Λ1ΝΤη _{(лактам в} положениях 12-16;

8ΕρΐϋΝΟ: 158)

Χ18ΕΟΤΡΤ8ΟΥ8ΚΥΕΟΕΚΚΑΚϋΡνρ^ΕΜΝΤ_{3 (лактам в} положениях 12-16;

8Ε0ΙΟΝΟ: 159)

Х18ЕСТ ΡΤ8ϋΥ 5ΚΥ1Ι) ΚΚΚΛΕ ϋΡνζ)\ν ЬМКГа (_лактам в положениях 16-20; 8ЕЦ ΙϋΝΟ: 160)

Х18ЕОТΡΤδϋΎ 8ΚΥΤΣ) ЕКААК ОРУ(^ ΕΜΝΤη (₈₁:р _{Ш Ν0}; 161) Х18ЕОТРГ80¥5КУШЕКААКОРУР^ЬММТа _{(лактам в} положениях 16-20;

8Ер ΙϋΝΟ: 162)

Χ18ΕΟΤΡΤ8ϋΥ8ΚΥΕΒΕΚΑΑΟϋΕνρννΕΜΝΤ_{8 (лактам в} положениях 12-16;

δΕΟΙϋΝΟ: 163)

Х18ЕОТ ΡΤ8ΟΥ 8ΚΥΕϋ ЕКААК ЦЕУОУ/ЬММТа (_{лактам в} положениях 12-16;

δΕΟΙϋΝΟ: 164)

Х18ЕСТРГ8О¥8К¥ЬО ККААЕ ΟΡνΟΨ ΕΜΝΤη _{(лактам в} положениях 16-20;

8Εζ)ΙϋΝΟ: 165)

Χ18ΕΟΤΡΤ8ΟΥ 8ΚΥΙ2Τ ЕрААК ΕΡΙΑλΥ ΕΜΝΤη (§_Ер ГО ΝΟ: 166)

Х18ЕОТРТ8О¥8КУЬ0ЕРААКЕР1АУ/ЬММТа (_{лактам в} положениях 12-16; 8Ер ΙϋΝΟ: 167)

Χ18ΕΟΤΕΓ8ΟΥ 5ΚΥΕΟΕ<2ΑΑΚΕΕΙΑνί ЬМИТа (_лактам в положениях 16-20;

8ΕΡΙΌΝΟ: 168)

ΧΙ8ΕΟΤΡΤ8ϋΥ 8ΚΥΙΌ ЕрААК ЕНАУ/ ЬУКСа (_8Ер _{Ιο Ν0;} !₆₉₎

- 37 017849

Х18ЕОТЕГ8О¥8К¥ЬОЕ0ААКЕР1А^ЬУКОа _{(лактам в положениях 12}._16;

8ΕΟΙΏΝΟ: 170)

Х18ЕСТГГ8В¥8К¥Ы)Е0ААКЕЕ1А^ЬУКОа _{(лактам в} положениях 16-20;

δΕρίϋΝΟ: 171), где в предшествующих последовательностях Х1 - (дезамино )Н18.

НХ2ЕСТ ΡΓ8ΟΥ 8ΚΥΙΒ ЕККА<2 ©РУ(Ж ШИТа (_8Е(^ щ ΝΟ: 172)

НХ2ЕОТ ΡΤ8ΌΥ 8ΚΥΙΒ ЕККАК ИРУ(25¥ ЬММТа _(8Ер _{ГО Ν0:} 173)

НХ2ЕОТГТ8О¥8К¥1ЩЕ1ЩАКОГУ03¥ЬМХТа _{(лактам в положеН}иях 16-20;

δΕρίϋΝΟ: 174)

НХ2ЕОТ ΡΤ8ϋΥ 8К¥ЪЭ ЕККАр βΡνον/ЕМНГа (лактам _в положениях 12-16;

8Ε()ΙΟΝΟ: 175)

НХ2ЕСТ РТ8П Υ 8ΚΥΕΟ ЕККАК ОЕУО^ЕМЫТа (лактам в положениях 12-16; ЗЕЦЮЫО: 176)

ΗΧ2ΕΟΤΡΤ8ΠΥ8ΚΥΕϋΚΚΚΑΕΟΡνθνΕΜΝΤΗ _{(лактам в положенИ}ях 16-20;

8Ер ΙΌ ΝΟ: 177)

Ι4Χ2ΕΟΊ'ΡΤ8ϋΥ8ΚΥΙ^ ЕКААК СРУОЗУШХТа _(8Ер _{ш Ν0;} 178)

НХ2ЕОТ ΡΤδϋΥ 8ΚΥΕΟ ЕКААК ϋΡνΟV ЬМИГа (_лактам _в положениях 16-20;

δΕρίϋΝΟ: 179)

НХ2Е6Т ΕΓ8ϋΥ 8К¥ЪЕ> ЕКААб ϋΡνζΛΥ ЕМЖа (лактам _в положениях 12-16;

δΕρίϋΝΟ: 180)

НХ2ЕСТΡΤδϋΥ 8ΚΥ1ΌЕКААК©РУ()У/ЕМЫТа (лактам в положениях 12-16;

δΕρίϋΝΟ: 181)

НХ2ЕОТ ΡΤ8ΟΥ 3ΚΥΙ© ККААЕ ϋΡνζ)?/ ЕМНГа (_{лактам в} положениях 16-20;

8Εζ) ΙϋΝΟ: 182)

ΗΧ2ΕΟΤΓΓ8ϋΥ 8ΚΥΕΟ ЕбААК ΕΡΙΑ\ν ЬМГУГа (_8Ες) _{ш Ν0; 183})

НХ2ЕОТЕГ8О¥8К¥ЬОЕ9ААКЕЕ1А^1МЬГГа (_{лактам в} положениях 12-16;

δΕζΗϋΝΟ: 184)

НХ2ЕОТЕТ5О¥5К¥ЬОЕ0ААКЕР1А¹УЕМЬГГа (_{лактам в} положениях 16-20;

8Εζ) ΙϋΝΟ: 185)

НХ2ЕОТΡΤδϋΥ 8КΥΣϋЕрААКЕЕ1ААУ ЬУКОа (_8Ер []) \_{0: 186})

НХ2ЕОТ ΡΤ8ΟΥ 8К¥ЬО ЕЦААК ЕНА^У ЕУКСа _{(лактам в положениях 12}._16;

8ЕЦ ГО ΝΟ: 187)

НХ2ЕОТ ΡΤδΒΥ 8ΚΥΕΟ ЕЦААКЕЕГАУ/ЬУНСа _{(лактам в положеН}иях 16-20;

8Ες ΙϋΝΟ: 188), где в предшествующих последовательностях Х2 - аминоизомасляная кислота.

- 38 017849

НХ2ЕСТ ΡΤ8ΟΥ 8КУЬОЕККА<2 ОРУ^ИУЬММТа ^_Ед _{ю Ν0}· } ₈₉)

НХ2ЕОТ ΡΤ8ΒΥ ЖУЬП НИКАК ϋΡνΟ^ν ЬЮТа (_8Ε(^ №N0:190)

НХ2ЕС1Т ΡΤδϋ Υ 8ΚΥΗϋΕΚΚΑΚ ЭРУрЗУ ЬМИТа _{(лактам в П0Л0ЖенИ}ях 16-20;

8Е() 10 N0: 191)

НХ2ЕОТ ΡΤ8ΟΥ 8ΚΥΙΧ» ЕККАО ОРУрЗУ ЬМКТа _{(лактам в положениях 12}._16;

8Е<3 ГО N0: 192)

НХ2ЕОТ ΡΤ8ΟΥ8ΚΥΗΟ ЕККАКЭРУрЗУИМКТа (_лактам в положениях 12-16;

δΕζΗϋΝΟ: 193)

ΗΧ2ΕΟΤΡΓ8ϋΥ 8ΚΥΕΟ ККИАЕ ЮРУРЗУ ЬМЫТа _{(лактам в положениях} 1₆_₂₀;

δΕρίϋΝΟ: 194)

НХ2ЕОТ ΡΤ8ϋΥ 8ΚΥΙΌ ЕКААК ОРУрЗУ ΗΜΝΤα (_8Ер _{ΙΟ ΝΟ;} ! ₉₅) НХ2ЕОТРГ8О¥8К¥ШЕКААКОРУрЗУНМХТа _{(лактам в положени}ях 16-20;

δΕρίϋΝΟ: 196)

НХ2ЕОТ ΤΥ8ϋ Υ 8ΚΥΗϋ ЕКУ Ар ОРУрЗУ НМКГа _{(лактам в положеН}иях 12-16;

8ЕрГОЫО: 197)

НХ2Е6ТЕГ8В¥8К¥ШЕКААКОРУрЗУНМКТа _{(лактам в положеН}иях 12-16; 8Е() ГО N0: 198)

НХ2ЕОТ ΕΓ8ΠΥ 8К¥Ш ККААЕ ϋΡνρΨ ЬМНТа _{(лактам в положенИ}ях 16-20; 8ЕР ГО ΝΟ: 199)

НХ2ЕСТ ΡΤ8ΟΥ 8ΚΥΙΊ) ЕОААК ЕИАЗУ ШЫТа (_8Е(^ щ _Ν0: 200)

НХ2ЕОТ ΕΤ8ΟΥ 8ΚΥΙΧ) ЕрААК ЕР1АЗУ ЕММТа (_{лактам в} положениях 12-16; 8Ер ГО ΝΟ: 201)

НХ2ЕОТ ΕΤ8ΟΥ 8ΚΥΙΧ) ЕрААК ЕЯАЗУЬМЫТа (_лак_лам в положениях 16-20; 8Ер ГО ΝΟ: 202)

НХ2Е6Т ΡΤ8ΟΥ 8ΚΥΕΟ ЕрААК ЕЕТАЗУЬУКОа (_8Ер _{ΙΟ ΝΟ:} 203)

НХ2ЕСТ ΕΓ8ΟΥ 8ΚΥΕΟ ΕΟΑΑΚ ЕЕ1АЗУЕУКСа (_{лактам в} положениях 12-16:

8Е<3 ГО ΝΟ: 204)

НХ2ЕОТ РТ8ОΥ 8ΚΥΙΙ) Εζ)ΑΑΚЕР1АЗУ ЬУКСа (_{лактам в} положениях 16-20:

8Е() ΙϋΝΟ: 205), где в предшествующих последовательностях Х2 - (Ι)-Α1ο).

- 39 017849

Η8(2ΟΤ ΡΤ8ΌΥ 8ΚΥΕΌ ЕККАЦ ПЕУС*У/ ΙΜΝΤα (_8Ер _{ш Ν0: 206)}

Н80ОТ ΡΤδϋΥ 8КУЬП ЕВ&АК ОГУСАУ ЕМЬГГа (_8Ер Ιϋ ΝΟ: 207)

НЗООТетЗОУЗКУШЕВКАКОГУС^ГЛШТа (лактам в положениях 16-20; 8Εζ) ГО N0: 208)

Η8<2θΤΡΤδϋΥЗКУШЕВКАЦВБ¥С*7УЬМКТа (лактам в положениях 12-16; 8Е(} ГО ΝΟ: 209)

Н8СОТРТ8П¥8К¥ЕОЕВВАКБРУС*^ЬМКГа (лактам в положениях 12-16;

8Εζ) ГО N0:210)

Η8ΟΟΤ ΕΓ8ϋΥ 8ΚΥ1Β КВВ.АЕ ϋΡνθ*Ψ ΕΜΝΤα (_лактам в положениях 16-20; 8Е<2 ГО N0:211)

НЗЦОТЕТЗПУ 8ΚΥΙ23 ЕКААК ОЕУС*^ ЬМКГГа (_8Ер _1Г) _{Ν0; 212}) Н80ОТКГ8ЭТ8К¥ШЕКААКОРУС*^ЕМОТа _{(лакгам в} положениях 16-20;

8Е0 ГО N0:213)

НЗООТБТЗОУЗКУШЕйААСОБУС^ЬМКГа (_{лактам в} положениях 12-16; 8Εζ) ГО N0:214)

НЗООТРГЗОУЗКУЬОЕКААКОЕУС^ШКТа _(лактам в положениях 12-16;

8Е(2 ГО ΝΟ: 215)

НЗС2ОТ ΡΤ8ϋΥ 8КУЫ) ККААЕ ВГУС*\У ХЛЮТа (лактам в положениях 16-20;

8Е() ГО N0: 216)

Н800Т ΕΓ8ΏΥ 8ΚΥΕΠ ЕОААК ЕНС*У/ ЕМХТа (_8Ер го ΝΟ: 217)

НЗЦОТ ΡΤ5ϋΥ 3ΚΥΕΟ ЕОААК ЕИС*АУ ЕМКГа (_лактам в положениях 12-16; 8Е() ГО N0: 218)

Н8ЦОТ ΕΓδΌΥ 8ΚΥΙΧ) ЕЦААК ΕΕΚΕΨ ΕΜΝΤη (_лактам в положениях 16-20;

8Е(} ГО N0: 219)

Η80ΟΤΡΤ8ϋΥ 8КУЬО ЕЦААК ЕИС*^ ЦУКОа (_8Ед _{ю Ν0: 22}())

Н80СТ Р1’8Б Υ 8ΚΥΕΟ ЕЦААК ЕР1С*ХУ ЬУКСа _{(лактам в П0Л0ЖеН}иях 12-16; 8Е<2 ГО N0:221)

Н8ЦСТ ΡΓ8ϋΥ 8ΚΥ12Ο ЕЦАДК ЕПС*\¥ ЬУКОа (_лактам в положениях 16-20; 8Е(} ГО N0: 222)

Х18ЦСТРТ8О¥ ЗКУЕПЕКВАЦ ОЕУС*\УЕМХТа (_8Ер _{ГО ΝΟ: 223})

Х150ОТРТ8ОУ8КУШЕКВАКОРУС*^ЕММТа ₍₈₁:р _{ю Ν0; 224})

Х180ОТРТ8О¥8К¥ЕОЕШ<АКПРУС*^ЕМКГа (лактам в положениях 16-20; 8Е() ГО N0: 225)

Χ180θΤΕΓ8ϋΥ 8КУЕОЕККАЦПГУС*ЗУЕМХТа (лактам в положениях 12-16;

8Е(2 ГО N0: 226)

Χ180ΟΤΕΓ8ϋΥ8ΚΥΙΌΕΚΚΑΚΟΡνθ^ΕΜΝΤα _{(лактам в П0Л0Ж}ениях 12-16;

8Εζ) ГО N0: 227)

Х180ОТРГ8ПУ8КУЬОКККАЕОРУС*^ШНТа (лактам в положениях 16-20; 8Е(2 ГО N0: 228)

Х180ОТЕТ8ОУ8КУШЕКААКОРУС*^ШНТа (_8Ер [[) _Ν0; 229)

Х18рОТ ΡΓ8ϋΥ 8ΚΥΕϋ ЕВ.ААК ВРУС*\У ЬМИТа (лактам в положениях 16-20;

8Е(2 ГО N0: 230)

Х18рСТ ΡΤ8ΟΥ 8ΚΥΕΟΕΒΑΑ0 ОРУС*\УЬММТа _{(лактам} в положениях 12-16;

8Е() ГО N0: 231)

ΧΙδΟΟΤ ΡΤ8ΏΥ 8ΚΥΕϋΕΚΑΑΚ 1)ЕУС*ХУ ЕММГа (лактам в положениях 12-16;

8Εζ) ГО N0: 232)

Χ180ΟΤΡΤ8ϋΥ 8ΚΥΕΟ КВААЕ ОЕУС*У¥ ЕМОТа (лактам в положениях 16-20;

8Εζ) ГО N0: 233)

Х15ЦСТ ΡΤ8ΏΥ ЗКУШЕЦААКЕНС*УУ ЕМКГа _(8Ер _{ш Ν0: 234)}

Х180ОТ ΕΤ8ϋΥ 8ΚΥΙΕ) ЕЦААК ЕЯС*5У ЕММТа (лактам в положениях 12-16; 8Εζ) ГО N0: 235)

Х^СХтТРТЗВУЗКУШЕрААКЕИС^ЬМЭТа (лактам в положениях 16-20;

8Ер ГО N0: 236)

Χ18(χ}ΤΕΤ8ϋΥ 8КУШ ЕрААК ЕР1С*^У Ь УКСа (_8Ер _{Ι0 Ν0}; 237)

- 40 017849

X18^СΤΕΓ8^Υ8ΚΥ^^Ε^ΑΑΚΕΡIС*VV^VΚΟ_{а (лактам в положениях 12}._16;

8Е(9 ГО ΝΟ: 238)

Χ18ρσΤΕΓ8ϋΥ8ΚΥυ>Ε9ΑΑΚΕΗΟ^ΕνΚΟ_{3 (лактам в положенИ}ях 16-20;

8Е(} ГО N0: 239), где в предшествующих последовательностях Х1 - (дезамино)Н1к и где С* - Сук либо Сук, присоединенный к гидрофильному полимеру, или в альтернативном варианте С* - Сук, присоединенный к полиэтиленгликолю, имеющему среднюю массу приблизительно 20 кДа, или в альтернативном варианте С* Сук, присоединенный к полиэтиленгликолю, имеющему среднюю массу приблизительно 40 кДа.

НХ20ОТ ΕΤ5ΌΥ 8ΚΥΈΟ ЕВКАО ОЕУС*Ч¥ ЬММТа _(8Ер _{го Ν0; 2}40)

НХ20ОТ ΕΤδϋΥ 8ΚΥΕΟ ЕККАК ОРУС*У¥ ШКГГа _(8Ер _{ш Ν0: 24}1)

НХ2ОСТ ΕΤ8ϋΥ 8Κ.Υ1Ι) ЕККАК ОРУС*№ЬМКТа (_{лактам в} положениях 16-20;

8Е(^ ГО ΝΟ: 242)

ΗΧ2ΡΟΤ^8ΒΥ8ΚΥ^ΕΒ^9ΟΙΎ€*ΨΕΜΝΤβ _{(лактам в} положениях 12-16;

8Е(2 ГО N0: 243)

ΗΧ20ΟΤΡΤ8ϋΥ8ΚΥΕΟΕΚΚΑΚΠΡν€*1¥ΕΜΝΤ3 (лактам в положениях 12-16;

8Εζ) ГО N0: 244)

ΗΧ2ζ)(3Τ ΕΤ8ΒΥ ЗКУЮКВВАЕ ОЕУС*ЗУΕΜΝΤα (лактам в положениях 16-20;

8Е(2 ГО N0: 245)

НХ20ОТ ΓΓ8ϋΥ 8ΚΥΕΟ ЕКААК ϋΡνθ*5¥ ЬМУГа _(8Ер _{ш Ν0: 2}46)

НХ20ОТ ΕΤ8ΟΥ 8ΚΥΕΟ ЕКААК ОРУС*5¥ ΕΜΝΤα (лактам в положениях 16-20;

8ЕД) ГО N0: 247)

НХ2рОТ ΡΤδϋΥ 8ΚΥΕΟ ЕКААО ОРУС*5У ΏΜΝΤα (_{лактам в} положениях 12-16;

8Е(^ ГО N0: 248)

ΗΧ2ζ)0Τ ΓΤ3ΟΥ 3ΚΥ1Ο ЕКААК ОЕУС*5У ЬМЛТа (лактам в положениях 12-16;

8Εζ) ГО N0: 249)

ΗΧ2ζ)(3Τ ΡΤ8ϋΥ 8ΚΥ1Σ> ККААЕ ОРУС*УУ ΙΜΝΤα (лактам в положениях 16-20;

8Е() ГО N0: 250)

НХ2рОТ ΕΓ8ϋΥ 8ΚΥΙΌ Εζ)ΑΑΚ ЕИС*ТС ШКГГа _(8Ер ю N0: 251)

НХ20ОТБТ8О¥8К¥ШЕрААКЕИС*5УШЭТ_а (лактам _в положениях 12-16;

8Е() ГО ΝΟ: 252)

НХ2рОТРГ8О¥8КУ1ГОЕРААКЕР1С*Х¥ЬММТа _{(лактам в} положениях 16-20;

Ер ГО N0: 253)

НХКЭСТЕГЗОУ ЗКУЪОЕРААКЕНС^ЬУКОа _(8Ер _{ю Ν0: 2}54)

НХ20ОТРТ8Р¥8К¥ШЕрААКЕР1С*^ЬУКО_{а (лактам в} положениях 12-16;

8Εζ) ГО N0: 255)

НХгрОТЕГЗСУЗКУЬОЕОААКЕИС^ЬУКОа _(лакТам в положениях 16-20;

8Е(^ ГО N0: 256), где в предшествующих последовательностях Х2 - аминоизомасляная кислота и где С* - Сук либо Сук, присоединенный к гидрофильному полимеру, или в альтернативном варианте С* - Сук, присоединенный к полиэтиленгликолю, имеющему среднюю массу приблизительно 20 кДа, или в альтернативном варианте С* - Сук, присоединенный к полиэтиленгликолю, имеющему среднюю массу приблизительно 40 кДа.

- 41 017849

НХ2рОТ ΕΓδϋΥ 8ΚΥΙΣ) БЕКАР ϋΓνθ*Ψ ШИТа _(8Ερ _{ю Ν0: 257)}

ΗΧ2(2ΟΤ ΕΤ8ϋΥ 8ΚΥΙΙ)ΕΚΚΑΚВРУС*Д¥ ЬММТа _(8Ερ _{ю Ν0: 258)}

НХ2ЦОТ ΡΤ8ΒΥ 8ΚΥΕΌ ΕΚΚΑΚ ОРУС*У/ЕМКГа _{(лактам в положенИ}ях 16-20;

8ΕΟ ГО ΝΟ: 259)

ΗΧ20ΟΤ ΕΤ8ΟΥ 8ΚΥΙΙ) ЕВКАЦ ЭЕУС*^ ЕМЛТа (_{лактам в} положениях 12-16;

8Е() ГО N0: 260)

НХ2ССТРТ8О¥8К¥ШЕКВАКОРУС*^ШКГа _{(лактам в положенИ}ях 12-16;

8Εζ) ГО N0: 261)

ПХ2рОТ ΡΤ8ϋΥ 8ΚΥΙΌ КККАЕ ОРУС*\У ЬМКТа (_лак_лам _в положениях 16-20;

8Ер ГО N0: 262)

НХ2ЦОТ ΡΤ8ϋΥ 8ΚΥΙΣ) ЕКААК ОЕУС*У/ ЪМЖа (_8Е(^ _{ΙΟ Ν0; 263})

НХ2ЦСТ ΡΤ8ϋΥ 8ΚΥΕΟ ЕКААК ОРУСАУ ЬМЫТа (_{лактам в} положениях 16-20;

8Е(} ГО N0: 264)

НХ2Ц0Т ΡΤδϋΥ 8ΚΥΙΒЕЙАА(2 ЦРУС*1¥ ЬМЬГГа (_{лактам в} положениях 12-16;

8Ер ГО N0: 265)

НХ20ОТЕГ8ВУ8КУ1ГОЕКААКОРУС*^1Л1КГа _{(лактам в положениях 12}__16;

8Ер ГО N0: 266)

НХ2СКЗТ ΕΤ8ΟΥ 8ΚΥ1Π ККААЕ ОРУС*\У ЬММТа (_{лактам в} положениях 16-20;

8Ер ГО N0: 267)

ΗΧ2ρθΤΡΤ8ϋΥ 8К¥1ГО ЕрААК ЕНС*5¥ ЬМТОТа _(8Ер _{ю Ν0: 268)}

ΗΧ2ζ)(3Τ ΓΤδϋΥ 8КУ1ГО ЕОААК ЕИС*5У ЬМТЕГа (_лактам в положениях 12-16;

8Ер ГО N0: 269)

НХ2рОТ ΡΤ8ΏΥ 8ΚΥΕΟ ЕрААК ЕР1С*\У ЕМНТа (_{лактам в} положениях 16-20;

8ЕР ГО N0: 270)

НХ2рОТЕТ8Р¥8КУ1ГО ЕрААК ЕИС*5УЬУКОа (_8Ер _{ш ΝΟ: 271})

НХ2рОТ ΕΤ8ΒΥ 8ΚΥ1Ό ЕрААК ЕИС*У7 ЕУКСа (_{лактам в} положениях 12-16;

8ЕР ГО N0: 272)

ΗΧ2ρθΤΕΓ8ϋΥ 8ΚΥ1Β ЕРААК ЕЯС*5УЬУКСта (_{лактам в} положениях 16-20;

8Ер ГО N0: 273), где в предшествующих последовательностях Х2 - (Б-А1а) и где С* - Сук либо Сук, присоединенный к гидрофильному полимеру, или в альтернативном варианте С* - Сук, присоединенный к полиэтиленгликолю, имеющему среднюю массу приблизительно 20 кДа, или в альтернативном варианте С* - Сук, присоединенный к полиэтиленгликолю, имеющему среднюю массу приблизительно 40 кДа.

Н8ЕОТ ΕΓ8ϋΥ 8К¥Ш ЕЕКАр ОРУС*У7 ШИТа _(8Е(^ _{ΙΓ) Ν0; 274})

Н8ЕОТ ΡΤ8ϋΥ 8ΚΥΕΙ) ЕККАКПРУС*Т¥ ЕМЫТа _(8Ες _{ш Ν0: 275)}

Н8ЕОТ ΡΤ8Ώ Υ 8ΚΥΕΏ ЕККАК ОРУС=А¥ ΣΜΝΤα	(лактам	в	положениях
16-20; 8ЕР ГО N0: 276) Н8ЕСТ ΕΓ8ϋΥ 8ΚΥ1Ο ЕККАр ОГУС*У¥ ЬЬШТа	(лактам	в	положениях
12-16; 8ЕР ГО N0:277) Н8Е0Т ΡΤ8ϋ Υ 8ΚΥΕΟ ЕККАК ВЕУС*^¥ ШЫТа	(лактам	в	положениях
12-16; 8ЕР ГО N0:278) Н8Е0Т ΕΓ8ϋΥ 8ΚΥΙΕ> КККАЕ ОРУС*9/ ΙΜΝΤη	(лактам	в	положениях

16-20; 8Ер ГО N0:279)

- 42 017849

Н8Е(ЗТ ΕΤ8ΟΥ ЗКУЬО ЕКААКОРУС*\¥ ЕММТа (_8Ер _{Ш Ν0}; 280)

Н8ЕОТ ΕΓ8ϋΥ 8ΚΎ1Β ЕКААК ИРУС*АУ ЕМИТа (_{лактам в} положениях 16-20;

8Е6 ГО N0: 281)

Н8ЕСТ ΡΤ8ϋΥ 8ΚΥΙΌ ΕΚΑΑζ) ЦРУС*\У ЬМЫТа (_{лактам в} положениях 12-16;

8Е(^ ГО N0: 282)

Н8ЕСТ ΓΤ8ϋΥ 8ΚΥΙΙ) ЕКААК ИЕУС*\У ЕММТа (_{лактам в} положениях 12-16;

8Е6 ГО N0: 283)

Н8В(ЗТ ΡΤδϋΥ 8ΚΥΕϋ ККААЕ ИРУС*\У ЬМИТа (лактам _в положениях 16-20;

8Е6 ГО N0: 284)

Н8ЕОТ ΕΓ8ΟΥ 8ΚΥΙΕ) Е()ААК ЕНС*5У ЬМНТа (_8Ер _{ΙΟ Ν0: 285})

Н8ЕСТ ΓΤ8ΟΥ 8ΚΥΕΟ ЕОААК ЕЯС*5¥ ЬММТа (_{лактам в} положениях 12-16;

8Εζ) ГО N0: 286)

Н8ЕОТ1Т8ОУ8КУЕОЕрААКШС^ЬММТа _{(лактам в положеН}иях 16-20;

8Ер ГО N0:287)

Η3ΕΟΤΡΓ8ΟΥ 8К¥ШЕрААКЕР1С*5¥ЬУКСа _(8Пр _{ю Ν0; 288)}

Н8ЕОТ ΕΓδϋΥ 8ΚΥΙΙ) ЕОААК ЕНСАУ ЕУКОа (_{лактам в} положениях 12-16;

8Е(2 ГО N0: 289)

Н8ЕСТЕГ8О¥8КУЕЭЕ0ААКЕР1С^ЕУКОа _{(лактам в положени}ях 16-20;

8Е6 ГО N0: 290)

Х18ЕСТ ΡΤ8ΠΥ 8ΚΥ1Ό ЕККАр ВРУС*^ ЬМИТа _(8Ер Ю N0: 291) Х18ЕОТРГ8ОУ8КУЬОЕВКАКОГУС*^ЬМИТа (_8Ер _{Ш Ν0: 292}) Х18ЕОТ ΡΤ8ΟΥ 8ΚΥΙΖ) ЕККАК 0ЕУС*1У ЬМТЧТа (_{лактам в} положениях 16-20;

8Е() ГО N0: 293)

Х18ЕСТ ΕΓδϋΥ вК¥ЪОЕККА0ОРУС*У7ЕММТа (лактам в положениях 12-16;

8Ер ГО N0:294)

Х18ЕСТΓΤ8ΟΥδΚΥΣϋЕККАКОРУС^ЬМИТа _{(лактам} в положениях 12-16;

8Е6 ГО N0: 295)

Χ18ΕΟΤΡΓ8ΟΥ δΚΥΙΛ КККАЕ ИРУС*У/ЬМЫТа (лактам в положениях 16-20;

8Е6 ГО N0: 296)

ΧΙδΕΟΤΕΓδϋΥδΚΥΕϋЕКААКОГУСАУЬМГПа _(8Ер _{ш Ν0: 297)}

XI ЗЕСТ ΡΤ8ΌΥ 8КУ1Л) ЕКААК ИРУС'АУ ЕМКТа (_лактам в положениях 16-20;

ЗЕр Ιϋ ΝΟ: 298)

Χ18ΕΟΤ ΓΤ8ΒΥ 8КУ1ГО ЕКАА<2 ОРУС^ХУ ЬМИТа (лактам в положениях 12-16;

8Е(} ГО N0: 299)

Х18ШТРГ8ОУ8К¥ЬПЕКААКОРУС^ШХТа _{(лактам в положениях 12}__16;

8Е(2 ГО N0: 300)

Х18ЕСТ ΕΓδϋΥ 8ΚΥΙΌ ККААЕ ВРУС*ХУ ЬМКГа (лактам в положениях 16-20;

8Εζ)ΙϋΝ0: 301)

Х18ЕОТ ΕΤδϋΥ 8ΚΥΙΣ) ЕфААКЕРГС*^ ΕΜΝΤ& _(8Ер _{ш Ν0; 302)}

Х18ЕСТ ΡΤ5ΏΥ 8КУЬО ΕΩΑΑΚ ЕИС*ЗУ ЬМЫТа _{(лактам в положениях ί2}__16;

8Е<3 ΙϋΝΟ: 303)

XI8ЕОТ ΕΤδϋΥ 8КУ1ГОЕ0ААКЕНСАУ ЬМИТа (_{лактам в} положениях 16-20;

8Е(2 ГО N0: 304)

Х18ЕСТ ΕΓδϋΥ 8КУШЕ0ААКЕНС*\УЬУКСа (_8Е(^ _{ю Ν0; 305})

ΧΙδΕθΤΓΓδϋΥ 8КУ1ЛЭЕРААКЕИС*1¥ ЕУКОа (лактам в положениях 12-16;

ЗЕр ГО N0: 306)

Х18ЕОТРГ8О¥8К¥Ы>ЕСААКЕИС^ЬУКСа _{(лактам в положенИ}ях 16-20;

8Е(} ГО N0: 307), где в предшествующих последовательностях Х2 - (дезамино)]Н1з и где С* - Суз либо Суз, присоединенный к гидрофильному полимеру, или в альтернативном варианте С* - Суз, присоединенный к полиэтиленгликолю, имеющему среднюю массу приблизительно 20 кДа, или в альтернативном варианте С* Суз, присоединенный к полиэтиленгликолю, имеющему среднюю массу приблизительно 40 кДа.

- 43 017849

НХ2ЕСТ ΙΠ8ϋ У 8КУТО ЕКЮ\О ΙΑ4ΝΤα (_8Ер _{Ιο Ν0: 308})

НХ2ЕОТ ΡΤ8ΟΥ ЗКУЪО ЕККАК ОРУС*ЗУЕМИТа _(8Ер _{ΙΟ Ν0:} 309)

НХ2ЕСТ ΡΤ8ϋΥ 8ΚΥΙΤ) ЕК&АК ОРУС*Ч¥ ГММТа (_{лактам в} положениях 16-20;

8Е() ГО N0: 310)

НХ2ЕСТРГ80¥8К¥Ы>ЕККАР0РУС^ЕМНТа _{(лактам в положениях 12}-16;

8Ер ГО N0: 311)

НХ2ЕОТΡΤδϋΥ 8ΚΥΙΣ)ЕВКАК ОРУС*3¥ ЕМИТа (_{лактам в} положениях 12-16;

8Εζ)ΙϋΝΟ: 312)

НХЗЕОТтОУЗКУШКВКАЕОЕУС^ШМТа _{(лактам в положениях 16}__20;

8Е() ГО N0: 313)

НХ2ЕОТ ΕΤ8ΠΥ 8ΚΥΙΊ) ЕНААК ЭРУС*ЧУ ЬММТа _(8Ер Ц) _Ν0: 314)

НХ2ЕОТ ΡΤ5ΌΥ 5ΚΥ1Χ) ЕВААК ПРУС*\У ЕМХГГа (_ЛВктам в положениях 16-20;

8Е(^ ГО N0: 315)

НХ2ЕОТЕТ5О¥8КУ1ГОЕВАА0ОГУС^ШХТа _{(лактам в положениях 12}__16;

8Εζ) Ιϋ ΝΟ: 316)

Ь1Х2ЕСгТЕТ81)У8К¥1ГОЕКААКОРУС^ШНТа фактам _в положениях 12-16;

8ΕΡΙΟΝΟ: 317)

НХ2ЕОТ ΓΤδϋΥ 8ΚΥΙΙ) ККААЕ ЭРУСЛУ ЬММТа фактам в положениях 16-20;

8Е0 ГО N0: 318)

НХ2ЕОТ ΡΤ8ΏΥ 8ΚΥΕΟ ЕЦЛАК ЕИС*1¥ ШЬГГа (_8Ер ш N0: 319)

НХ2ЕОТН’8О¥8КУШЕРААКЕИС^ЬММ’а _{(лактам в положеН}иях 12-16;

8Εζ) ГО N0: 320)

НХгЕСТРТЗОУЗКУШЩААКЕИС^ШШ’а _{(лактам в положенйЯХ 16}._20; δΕρίϋΝΟ: 321)

НХ2ЕОТ ΕΤ8ΠΥ 8ΚΥΕΟ ЕС)ЛАК ЕЕ1С*У7 ЕУКОа (_8Ер ю N0: 322)

ΗΧ2ΕΟΤΡΤ8ΠΥ 8К¥1Х>Е<2ААК.ЕР1С*ХУЬУКСа _{(лактам в положениях 12}__16;

8Ер ГО N0: 323)

НХ2ЕОТБТ8П¥8КУШЕ9ААКЕИС*^ЬУКОа _{(лактам в положенИ}ях 16-20;

8Е0 ГО N0: 324), где в предшествующих последовательностях Х2 - аминоизомасляная кислота и где С* - Сук либо Сук, присоединенный к гидрофильному полимеру, или в альтернативном варианте С* - Сук, присоединенный к полиэтиленгликолю, имеющему среднюю массу приблизительно 20 кДа, или в альтернативном варианте С* - Сук, присоединенный к полиэтиленгликолю, имеющему среднюю массу приблизительно 40 кДа.

- 44 017849

НХ2ЕСТ ΡΤ8Ό Υ 8ΚΥΕΌΕΚΚΑΡ ОРУС*^ ЬМЫТа (_8Ер _{ю Ν0; 325})

НХ2ЕСТ ΕΓ8ΟΥ 8ΚΥΕΟ ЕККАК ОРУС*Х¥ ЬМИТа _{(8Е(2 ю ΝΟ}. ₃₂₆₎

НХ2ЕОТ ΡΤδϋΥ 8ΚΥ1Ο ЕККАК ИРУС*Х¥ЕМХТа (лактам в положениях 16-20;

8Ε(} ГО N0: 327)

НХ2ЕСТ ΡΤδϋΥ 8ΚΥΙ2Ο ЕККАО ОРУС*1¥ ЬМЫТа _{(лактам в положеН}иях 12-16;

8Е(2 ГО ΝΟ: 328)

НХ2ЕСТΡΤδϋΥ 8ΚΥΙΌ ЕККАКОРУС^ЬММТа _{(лактам в положе}ниях 12-16;

8Е() ГО N0: 329)

ΗΧ2ΕΟΤΕΓ8ϋΥ 8ΚΥΕ0 КККАЕ ОРУС*^1ММТа (лактам в положениях 16-20;

8Εζ) ГО ΝΟ: 330)

НХ2ЕСТΡΤ8ϋ¥ 8ΚΥΕΟ ЕКААКИЕУС*\У ЬМЫТа (_8Ер _{ш ΝΟ: 33} η

НХ2ЕОТ ΡΤδϋΥ 8ΚΥ1Ο ЕКААК ОРУС*\¥ ЬМХТа (лактам в положениях 16-20;

8Е() ГО N0: 332)

НХ2ЕСТ ΓΤ8ϋΥ 8ΚΥΙΊ) ЕКААр ОРУС*ЗУ ЬМХГа ( [актам в положениях 12-16;

Ер ГО N0: 333)

НХ2ЕСТ ΕΓδϋΥ 8ΚΎΙΟ ЕКААК 0РУС*1¥ ЬМЬГТа (лактам в положениях 12-16;

8ЕЦ ГО ΝΟ: 334)

НХ2ЕСТ ΤΤ8ϋΥ 8ΚΥΕΟ КК.ААЕ ϋΡνθ*\ν ЬМИТа (лактам в положениях 16-20;

8ЕЦ ГО N0: 335)

НХ2ЕОТ ΕΤδϋΥ 8ΚΥΙΣ) ЕрААК ЕИС*№ ЬМКГа (_8Ер _{ю ΝΟ: 336)}

НХ2ЕСТ ΕΓ8ΏΥ 8ΚΥΙΙ) ЕРААК ЕПС*ЗУ Ι-ΜΝΤβ _{(лактам в положенИ}ях 12-16;

8ЕЦ ГО N0: 337)

НХ2ЕОТ ΕΓ8ϋΥ 8ΚΥΙ20 ЕрААК ЕЯС*^ 13И№Га _{(лактам в} положениях 16-20;

8ΕΡΙΟΝΟ: 338)

ΗΧ2ΕΟΤΕΓ8ΏΥ 8ΚΥΙ2ΟЕрААК ЕР1С*ЗУ ЬУКОа _(8Ер _{ш Ν0; 339)}НХ2ЕаТЕГ8О¥8К¥ЬПЕрААКЕИС*^Ь¥КОа _{(лактам в} положениях 12-16;

8Ер ГО N0: 340)

НХ2ЕОТРГ8О¥8К¥ЬО ЕрААК ЕНС*^ЬУКОа _{(лактам в} положениях 16-20;

8Ер ГОХО: 341), где в предшествующих последовательностях Х2 - (Б-А1а) и где С* - Сук либо Сук, присоединенный к гидрофильному полимеру, или в альтернативном варианте С* - Сук, присоединенный к полиэтиленгликолю, имеющему среднюю массу приблизительно 20 кДа, или в альтернативном варианте С* - Сук, присоединенный к полиэтиленгликолю, имеющему среднюю массу приблизительно 40 кДа.

Н8(2СТ ΓΤ8ΟΥ 8КУЪП С*ККАК ЦЕУСЖЬМКГа _(8Ер _{ΙΕ) Ν}θ. ₃₄₂₎

Н80СТ ΓΓ8ϋΥ 8ΚΥΙΤ> С*ВААКϋΡνΟΨ ΕΜΝΤα _(8Ед _{ΙΟ ΝΟ; 343)}НЗООТСТЗОУЗКУШС^ААКЕРХА^ШЬТГа (_8Ер _{го Ν0}; 344)

НЗООТΡΤ8ΡΥ 8ΚΥ1Ι) Ο^ΑΑΚΕΗΑΨ ЬУКСа (_8Ер _{ΙΟ ΝΟ: 345)}Х18рОТЕТ8ПУ8КУЕЭС*1ЩАКСЕУрАУЕМХТа _(8Ер _{го Ν}θ. ₃₄₆₎Χ18ρθΤΕΓ8ΟΥ8ΚΥΕΟΟ*ΚΑΑΚΏΡνρ\νΕΜΝΤα (_8Ер _{ш Ν0; 34}η Χ18<2σΓΡΓ8ϋΥ 8ΚΥΕΟ С^ААКЕНААУЕМЫТа ^_8Ερ _{ю Ν}θ. _34§) Χ18ρίιΤΕΤ5ϋΥ 8КУ1ГО С*РААКЕНА\УЬУКСта (_8Ερ _{ΙΟ ΝΟ: 349}), где Х2 - (дезамино)Н1к и где С* - Сук либо Сук, присоединенный к гидрофильному полимеру, или в альтернативном варианте С* - Сук, присоединенный к полиэтиленгликолю, имеющему среднюю массу приблизительно 20 кДа, или в альтернативном варианте С* - Сук, присоединенный к полиэтиленгликолю, имеющему среднюю массу приблизительно 40 кДа.

- 45 017849

НХ2рСТЕГ8ВУ8КУ1ГОС*ККАКОЕУрЧУШМТа (_8Ер _{Ι0 Ν0; 350}) НХ20ОТ ΓΓδϋΥ 8ΚΥΕΒ С*КААКВЕУРЧУ ЬМЫТа (_8Ер щ N0: 351) НХ2СЮТ ΕΓ8ΒΥ 8ΚΥΣϋ С*рААКЕРГАЧУ ЬММТа (_8Ер _{ю Ν}θ. ₃₅₂) ΗΧ2ρθΤΡΤ8ϋΥ 8ΚΥΙΌ С*рААКЕНАЧУЬУКСа _(8Ες) _{ш Ν0: 353}) где Х2 - аминоизомасляная кислота; и где С* - Суз либо Суз, присоединенный к гидрофильному полимеру, или в альтернативном варианте С* - Суз, присоединенный к полиэтиленгликолю, имеющему среднюю массу приблизительно 20 кДа, или в альтернативном варианте С* - Суз, присоединенный к полиэтиленгликолю, имеющему среднюю массу приблизительно 40 кДа.

НХ2рСТ ΡΤδϋΥ ЗКУЬО С*ЙКАК ОРУрЧУ ЬММТа (_8Ερπ)ΝΟ: 354) ΗΧ2ΡΟΤΡΤ5ΒΥ 5ΚΥΕΒ С*КААКВГУрЧ¥ ЬММТа (_8Ер _{ΙΕ> Ν0; 355)}ΗΧ2ΡΟΤΕΓ8ΒΥ 8ΚΥ1Ό С*ЦААКЕИАЧУ ЬММТа _(8Ер _{ю Ν0; 356}) ΗΧ2ρσΤΕΓ5ΒΥ8ΚΥΐτ>Ο*ΡΑΑΚΕΕΙΑΧ¥ ЬУКСа (_8Ер ц) ΝΟ: 357), где Х2 - (Э-А1а) и где С* - Суз либо Суз, присоединенный к гидрофильному полимеру, или в альтернативном варианте С* - Суз, присоединенный к полиэтиленгликолю, имеющему среднюю массу приблизительно 20 кДа, или в альтернативном варианте С* - Суз, присоединенный к полиэтиленгликолю, имеющему среднюю массу приблизительно 40 кДа.

Н8ЕСТНГ8ВУ8К¥1ЮС*КЯАКВЕУр\УЬММТа _(8Ер _{ю Ν0}· 358) Η8ΕΟΤΡΤ8ΒΥ 8ΚΥΙΌ С^КААКОРУрЧУ ЬММТа _(8Ер _{ш ΝΟ; 359)}Η8ΕΟΤΡΓ8ΒΥ 8ΚΥΕΟ С^ААК ЕЕЕАЧУ ШКГГа (_8Ер _{Ш Ν0; 360}) НЗЕОТ ΚΓδΒΥ 8ΚΥΕΒ С*рААК ЕЕ1АЧУ ЬУКСа (_8Ер _{ш Ν0: 361)}XI ЗЕСТ ΡΤ8ΒΥ δΚΥΣΒ С*КЙАК ОРУрУУ ЬММТа (_8Ер _{1О Ν0}. ₃₆₂) Х18ЕСТΕΓ8ΒΥ 8ΚΥΙΒ С*КААК ВРУрЧУЬММТа (_8Ер _{ΙΟ ΝΟ}· ₃₆₃) Х18ЕСТ ΕΓ5ΒΥ ЗКУЬВ С*РААК ΕΡΙΑΨ ЕМЕПГа _(8Ер _{ш Ν0; 364)}Х18ЕСТ ΡΤ8ΒΥ 8ΚΥΕΟ С*РААК ЕР1АЧУ ЬУКСа _(8Ер _{ш Ν0; 365}) где Х2 - (дезамино^Н₃ и где С* - Суз либо Суз, присоединенный к гидрофильному полимеру, или в альтернативном варианте С* - Суз, присоединенный к полиэтиленгликолю, имеющему среднюю массу приблизительно 20 кДа, или в альтернативном варианте С* - Суз, присоединенный к полиэтиленгликолю, имеющему среднюю массу приблизительно 40 кДа.

НХ2ЕСТ ΡΤ8ΟΥ ЗКУЬО С*ККАК ОРУрЧУ ЬММТа _(8Ер _{ΙΟΝΟ; 366)}ΗΧ2ΕΟΤΡΓ8ΒΥ 8КУШ С*НААК ВРУрЧУ ЬМИТа (_8Ер _{ш Ν0; 367)}НХ2ЕОТΡΤ8ΒΥ ЗКУЬО С*рААКЕР1АЧУ ЬММТа (_8Ер _{ю Ν0; 368}) НХ2ЕСТРТ8ВУ5КУЬВС*рААКЕР1А^¥ ЬУКСа (_8Ες _{ΙΟΝΟ; 369}χ где Х2 - (Э-А1а) и где С* - Суз либо Суз, присоединенный к гидрофильному полимеру, или в альтернативном варианте С* - Суз, присоединенный к полиэтиленгликолю, имеющему среднюю массу приблизительно 20 кДа, или в альтернативном варианте С* - Суз, присоединенный к полиэтиленгликолю, имеющему среднюю массу приблизительно 40 кДа.

ПХ2ЕСТРТ5ВУ 8ΚΥΙΒ С^ККАКЭРУрЧУ ЬММТа _(8Ер _{Ιο Ν0; 370}) НХ2ЕОТ ΡΤ8ΒΥ 8ΚΥΕΒ С*КААК ОРУрЧУ ЬММТа _(8Ер _{ГО Ν0:} 371) НХ2ЕСТ ΡΤδϋΥ 8КУЬО С*рААКЕНАЧУ ЬММТа _(8Ер _{ю Ν0; 372}) НХ2ЕОТ ΡΤδϋΥ 8ΚΥΕΒ С*рААК ЕНАЧУ ЬУКСа _(8Ер _{ш Ν0; 373)} где Х2 - (Э-А1а) и где С* - Суз либо Суз, присоединенный к гидрофильному полимеру, или в альтернативном варианте С* - Суз, присоединенный к полиэтиленгликолю, имеющему среднюю массу приблизительно 20 кДа, или в альтернативном варианте С* - Суз, присоединенный к полиэтиленгликолю, имеющему среднюю массу приблизительно 40 кДа.

- 46 017849

ΙΙ8ζ)(3Τ ΡΤ8ΟΥ 8ΚΥΕΟ ΕΚΚΑΟ ϋΡνρλΥ ШОТа (_8Ερ _{ΙΟ Ν0:} 374)

Η^σΤΓΓδϋΥ 8ΚΥΕΟ ЕККАК ОЕУОУ/ ЬМЛТа _(8Ед _{ю ΝΟ; 375)}Η8<2(3ΤΡΤ8ΟΥ δΚΥΙΟΕΚΚΑΚΟΡνρτν ЕМОТа (_{лактам в} положениях 16-20;

8Ε(} ГО ΝΟ: 376)

Η80ΟΤ ΕΓ8ϋΥ 8ΚΥΕΟ ΕΚΚΑρ ϋΡνρ5¥ ЕМОТа _{(лактам в положенИ}ях 12-16;

8Е() ГО N0: 377)

Η8ζ)(3Τ ΕΓ8ΟΥ 8ΚΥΕΟ ЕККАК ЭЕУОЗУ ЕМОТа (_{лактам в} положениях 12-16; 8Е(} ГО N0: 378)

Н89ОТРТ8ОУ8К¥ЕОКККАЕОРУ0^ЕМОТа _{(лактам в положенИ}ях 16-20; 8Е(^ ГО N0: 379)

Н8РСТ ΡΤ8ϋΥ 8ΚΥΕΟ ЕКААК ОГУ(}Т¥ ЕМОТа (_8Ер _{ш ΝΟ; 380)}

Н5()(ЗТ ΡΤδϋΥ 8ΚΥΕΟ ЕКААК РГУОЗУ ЕМОТа (_{лактам в} положениях 16-20; 8Ер ГО N0:381)

Н8ЦОТ ΕΓ8ϋΥ 8ΚΥΙΒ ΕΚΑΑΩ ЬМОТа _{(лактам в положениях} 12-16;

8Е() ГО N0: 382)

Η80ΟΤ ΡΓ80Υ 8ΚΥΕΟ ЕКААК ОЕУО^ ЕМОТа (_{лактам в} положениях 12-16; 8Е(2 ГО N0: 383)

Η8ζ)(3Τ ΡΤ8ϋΥ 8ΚΥΕΟ ККААЕ ОЕУЦЗУ ЕМОТа (_{лактам в} положениях 16-20; 8Εζ) ΙϋΝΟ: 384)

Η8(2θΤ ΡΓ8ϋΥ 8ΚΥΙΌ ЕОДАКЕР1АУ7 ЬМОТа (_8Ερ _{ΙΟ ΝΟ; 3}85)

Η8<3<3ΤΡΤ8ΟΥ δΚΥΕΟ Ε<2ΑΑΚЕНААУЬМЛТа (_{лактам в} положениях 12-16;

8Е() ГО N0: 386)

Н80ОТ ΕΓδϋΥ 8ΚΥΕ0 ЕЦААК ΕΗΑΨ ЕМОТа (_{лактам в} положениях 16-20; 8Εζ) ГО N0: 387)

Х180ОТЕТ8ОУ8КУ1ОЕККА(2ОРУ0^ ЕМОТа (_8Ер _{ю Ν}θ. ₃₈₈₎

XI80ΟΤΕΤ8ΟΥ8ΚΥΕΟ ЕККАК ΟΡΥΩ^ν ЬМОТа _(8Ер _{ю Ν0; 389)}

Х180С1Т ΕΓ8ϋΥ 8КУЬО ЕККАК ΟΡνρ’νν ЬМОТа (_{лактам в} положениях 16-20: 8Е0 ГО N0: 390)

Х180ОТРГ8т8К¥ШЕККА0ВРУ0^ЕМПТа _{(лактам в положенИ}ях 12-16:

8Е(₂ Π)ΝΟ: 391)

Х180СТ ΡΤ8ϋΥ 8ΚΥΙΟ ЕККАК ϋΡνΟΨ ЬМОТа _{(лактам в положениях 12}._16:8Е(2 ГО N0: 392)

Х18аОТРГ8П¥8КУ1ГОКК1^В^^1ЛГОТа _{(лактам в положениях} 1₆.₂₀;

8Е(^ ΙΌΝΟ: 393)

Χ180θΤ ΡΤ8ΟΥ 8ΚΥΕ0 ЕКААК ϋΡ\^\ν ЕМОТа (_8Ер _{Ιο Ν0;} 394) Χ180ΟΤΡΤ8ΟΥ 8ΚΥΕΟ ЕКААК ΟΕνθν7 ЕМОТа (_{лактам в} положениях 16-20;

8ΕΡΙΌΝΟ: 395)

Χ180ΟΤΡΤ8ΟΥ 8КУЬО ЕКААр ΟΡνρψ ЬМОТа (_лактам в положениях 12-16; 8Е(} ГО N0: 396)

Х180ОТРГ8О¥8К¥Ы)ЕКААКО№^ЕМОТ_{а (лактам в положениях 12}__16;8Ер ГО N0:397)

Χ180ΟΤΕΓ8ΟΥ8ΚΥ1ΒΚΚΑΑΕϋΕνρ^ ЕМОТа _{(лактам в} положениях 16-20;

8ΕρΐϋΝΟ: 398)

Χ180θΤ ΕΓ8ϋΥ 8ΚΥ1Ο ЕОААК ΕΡΪΑ^ ЬМОТа (_8Ер _{ю ΝΟ; 399})

Х180СТ ΓΤ8ΟΥ ЗКУЪОЕрААК ΕΕΙΑ^ΥЕМОТа (_{лактам в} положениях 12-16; 8Е0 ГО N0: 400)

Χ180θΤΕΤ8ΟΥ 8ΚΥ^^Ε^ΑΑΚΕΡIΑ''ιV^Μ^Τа (_{лактам в} положениях 16-20; 8Е(2 ГО N0: 401), где в предшествующих последовательностях XI - (дезамино)Н18.

- 47 017849

НХ20ОТ ΕΤ8ΟΥ 8ΚΥΕΙ) ЕККАО ИЕУ(Ж ШЛТа (_8Ер _{го Ν0; 402})

НХ20ОТ ΡΤ8ϋΥ 5ΚΥΕΟ ЕККАК ЭРУ(ДУ ЬМИТа _(δΕρ _{ΙΟ Ν0; 403 )}НХ2аОТРГ8О¥8КУШЕККАКОГУОХУЬМОТа _{(лактам в} положениях 16-20;

8Е(} ГО N0: 404)

НХ29СТРГ8О¥8КУШЕККА9ОРУР^ШОТа _{(лактам в} положениях 12-16;

8Е() ГО N0: 405)

НХ20ОТ ΕΤ8ΟΥ δΚΥΤΟ ЕККАК ОРУ<Ж ЬМОТа _{(лактам в} положениях 12-16; 8Е() ГО ΝΟ: 406)

НХ2ОСТ ΡΤδϋΥ 8ΚΥΕΟ КККАЕ ОРУ(/\У ЬМОТа (_{лактам в} положениях 16-20; 8Е0 Ιϋ ΝΟ: 407)

НХ20ОТ ΕΓ8ΟΥ 8КУЬО ЕКААК ОРУОХУ ЬМОТа _(8Ер _{ю ΝΟ; 408)}

НХ20ОТ ΡΤδϋΥ ЗКУЬО ЕКААК ΟΡΥΟλΥ ЬМОТа _{(лактам в} положениях 16-20; 8Е(^ Ιϋ ΝΟ: 409)

ΗX2^ΟΤΚΓ5^Υ5ΚΥ^^ΕΚΑΑ^^ΕV^^^Μ^Τа _{(лактам в положениях 12}__16;

8Е(^ ГО N0:410)

НХ20ОТ РТ8О Υ ЗКУЬО ЕКААК ОРУОУУЬМОТа (пактам в положениях 12-16;

8Е() ГО N0:411)

НХ20ОТ ΓΤ8ΟΥ ЖУЬО ККААЕ ОРУСДУ ЬМОТа (_{лактам в} положениях 16-20; 8Е<2 ГО N0:412)

ΗΧ20ΟΤΕΓ8ΟΥ8ΚΥ1ΒΕ0ΑΑΚΕΗΑ5¥ ЬМОТа (8Е0 ГО N0: 413) ЯХ2РОТ ΡΤ8ΟΥ 5ΚΥΕΟ ЕС?ААК ЕИАХУ ЬМОТа _{(лактам в положеН}иях 12-16;

8Е0 ГО N0:414)

НХ20ОТ ΡΊ’δϋ Υ 8К¥ЬОЕрААКЕЕСААУЬМОТа (лактам в положениях 16-20; 8Е(^ ГО N0:415), где в предшествующих последовательностях Х2 - аминоизомасляная кислота.

ΗΧ2(2ΟΤ ΡΓ8ϋΥ 8К¥ЬО ВККАО ЭРУОХУ ЬМОТа (_8Е(^ _{ю Ν0}· 416) ΗΧ20ΟΤΕΤ8ΟΥ 8ΚΥΙ2Ο ЕККАК ОРУС^ЬМОТа (_8Ер _{ю Ν0; 417)}

ΗΧ2ζ)(3Τ ΡΤ8ΟΥ 5ΚΥΕΟ ЕККАК ОРУ05У ЬМОТа (_{лактам в} положениях 16-20; 8Е(^ ГО N0:418)

НХ2рОТРТ8ОУ8К¥Ь0ЕККА0ОРУ9^У ЬМОТа (_лаКтам в положениях 12-16;

8Е(} ГО N0:419)

НХ206ТРГ8В¥8К¥ЬОЕККАКО^^ШОТа _{(лактам в положениях 12}._16;

8Е() ГО N0: 420)

НХ20ОТЕГ8О¥8К¥ЬО КККАЕΏΡΥΟ^ν ЬМОТа _{(лактам в} положениях 16-20;

8Ер ГО N0:421)

- 48 017849

ΗΧ20ΟΤΡΤ5ϋΥ БКУЬО ΕΚΑΑΚ ОРУЦЗУ ЕМОТа (_8Ερ _{ΙΟ ΝΟ: 422}) ΗΧ2ρθΤΕΓ80Υ8ΚΥΕΟΕΚΑΑΚΟΡνρ3νΕΜΟΤα _{(лактам в положениях 16}.₂₀;

8Ер ГО ΝΟ: 423)

НХ2рОТРТ8ОУ8КУЕОЕДААрОРУрЗУ ЬМОТа _{(лактам в П0Л0ЖениЯ}х 12-16;

8ЕР ГО ΝΟ: 424)

НХ2рОТРТ8ОУ 8ΚΥΕΟΕΚΑΑΚ ЭРУрЗУ ЕМОТа (_{лактам в} положениях 12-16;

8Ер ГО N0: 425)

НХ2РСТ ΡΤ8ΟΥ 8ΚΥΕΟ ККААЕ ОРУОЗУ ЕМОТа _{(лактам в положениях 16}.₂₀;

8Ер ГО N0: 426)

ΗΧ20ΟΤΡΓ8ϋΥ 8ΚΥΙΟ ЕЦААК ЕР1АЗУ ЕМОТа (_8Ер _{ΙΟ Ν0: 427}) НХ20ОТ ΡΤ8ϋΥ 8ΚΥΕΟ Е()ААК ЕИАЗУ ЕМОТа (_{лактам в} положениях 12-16;

8Ер ГО N0: 428)

НХ20ОТ ΡΤ8ϋΥ 8ΚΥΕ0 ЕОААК ЕР1АЗУ ЕМОТа (_{лактам в} положениях 16-20; 8ЕР ГО N0: 429), где в предшествующих последовательностях Х2 - (О-А1а).

Н8Е0ТΡΤ8ϋΥ 8ΚΥΙ1) ЕЕКАр ОРУЦЗУ ЕМОТа (_8Ер _{ш ΝΟ: 430)}

Н8Е0Т ΡΤ80Υ 8КУЬО ЕККАК ОРУЦЗУ ЕМОТа (_8Ер _{ш Νο}: 431)

НЗЕСтТ ΕΓ8ϋΥ 8ΚΥΕϋ ЕККАК ОРУрЗУ ЕМОТа	(лактам	в	положениях	16-20;
8ЕР ГО N0: 432) Н8ЕСТ ΡΤ8ϋΥ 8ΚΥΙ13 ЕККАр ОРУрЗУ ЬМОТа	(лактам	в	положениях	12-16;
8Ер ГО N0: 433) Н8ЕОТ ΡΤ8ΟΥ ЗКУЬО ЕККАК ОРУЦЗУ ЬМОТа	(лактам	в	положениях	12-16;
8Ер ГО N0: 434) Н8ЕОТ ΕΤδϋΥ 8ΚΥΕΟ КККАЕ ОРУЦЗУ ЬМОТа	(лактам	в	положениях	16-20;

8Ер ГО N0:435)

Η8ΕΟΤΡΤ8ΟΥ 8ΚΥΕ0 ЕКААКОРУрЗУ ЕМОТа _(8Пр _{ш ΝΟ: 436)}

Η8Ε6ΤΡΓ8ΟΥ8ΚΥΕΟ ЕКААК ОРУС)3¥ ЕМОТа (_{лактам в} положениях 16-20;

8ЕР ГО N0: 437)

Η8Ε0ΤΡΤ8ΟΎ 8ΚΥΕΟ ЕКААрОРУрЗУ ЕМОТа (лактам в положениях 12-16;

8Ер ГО N0: 438)

- 49 017849

Н8ЕСТΡΤ8ϋΥ 8ΚΥΕΟ ΕΚΑΑΚ ОРУОЗУЬМОТа _{(лактам в положеН}иях 12-16; 8Ер ГО N0: 439)

Н8ЕОТЕГ8О¥8К¥ЬОККААЕОРУ03УШОТа _{(лактам в положениях 16}._20;

8Ер ГО N0: 440)

Н8ЕОТ ΡΤ8ϋΥ 8КУТГО ЕОААК ЕР1АЗУ ЬМОТа _(8Ер _{ю Ν}θ. ₄₄₁)

Н8Е0Т ΡΤ8ϋΥ 8ΚΥ1Β ЕОААК ЕНАЗУ ЬМОТа _{(лактам в положеН}иях 12-16; 8Е0 ГО N0: 442)

Н8ЕОТ ΡΤδϋΥ 8ΚΥΙΒ ЕОААК ЕР1АЗУ ЬМОТа _{(лактам в положениях 16}__20;

8Ер ГО N0: 443)

Х18Е0Т ΡΓ8ϋΥ 8ΚΥΕΟ ЕЖА0 ОРУОЗУ ЬМОТа (_8Е(^ _{ΙΕ> ΝΟ: 444)}Χ18ΕΟΤΡΤ8ΟΥ8ΚΥΕΟ ЕЖАК ОРУРЗУ ЬМОТа ^_8Ер _{ш Ν}θ. ₄₄₅) Χ18ΕΟΤΡΤ8ΟΥ8ΚΥΕΟ ЕЖАК ОРУОЗУ ЬМОТа (_лактам в положениях 16-20;

8Ер ГО N0: 446)

Х18ЕОТРТ8О¥8К¥ЬОЕККАр ОРУРЗУ ЬМОТа _{(лактам в положенИ}ях 12-16;

8ЕР ГО N0: 447)

XI8ЕОТЕГ8ОУЖУЬОЕККАКОЕУрЗУ ЬМОТа (_лаКтам в положениях 12-16;

8ЕР ГО N0: 448)

Χ18ΕΟΤΡΤ8ΟΥ8ΚΥΙΒ КЖАЕ ОРУОЗУ ЬМОТа _{(лактам в положениях 16}._20;

8Ер ГО N0: 449)

Х18ЕСЕГ ΡΤ8ΟΥ 8ΚΥΕ0 ЕКААК ОРУОЗУ ЬМОТа ζ_8Ε(^ _{ΙΕ) ΝΟ; 450})

Х18ЕОТ ΡΓ8ΟΥ 8ΚΥΕΟ ЕКААК ОРУрЗУ ЬМОТа (_{лактам в} положениях 16-20;

8Ер ГО N0: 451)

Х18ЕОТ ΕΓ8ΟΥ 8ΚΥΙΧ)ΕΚΑΑΡ ОРУрЗУ ЬМОТа _{(лактам в положенИ}ях 12-16;

8Ер ГО N0: 452)

Х18ЕСТ ΡΤδϋΥ 8ΚΥΕΟ ЕКААКОРУрЗУЬМОТа _{(лактам в положеН}иях 12-16;

8Е0 ГО N0: 453)

Χ18ΕΟΤΡΤ8ΟΥ 8ΚΥΕΟ ККААЕ ОРУрЗУЬМОТа (_{лактам в} положениях 16-20;

8Ер ГО N0: 454)

Х18Е0Т ΡΤ8ϋΥ 8ΚΥΕΟ ЕОААК ЕР1АЗУ ЬМОТа (_8Ер _{ш Ν0; 455})

XI8ЕОТ ΡΤδϋΥ 8ΚΥΊ-Ο ЕОААКЕЕГАЗУ ЬМОТа (_{лактам в} положениях 12-16;

8Е0 ГО N0: 456)

Х18Е0Т ΕΤ8ΟΥ 8ΚΥΕΟ ЕОААК ЕЕ1А.ЗУ ЬМОТа (_{лактам в} положениях 16-20:

8Е0 ГО N0: 457), где в предшествующих последовательностях Х1 - (дезамино)Н15.

- 50 017849

ΗΧ2ΕΟΤΡΤ3ϋΥ 8ΚΥΙΤ) ЕМЗАС} ПЕУр\У ЬМОТа (8ЕР ГО ΝΟ: 458) НХ2ЕОТ ΡΤ8ΟΥ 8ΚΥΙΒ ЕККАК ПЕУСЖ ЬМЛТа _(8Ер _{ΙΟ Ν0: 459)}НХ2ЕСТЕТ8ОУ8КУЕОЕИкАКЭРУрАЬМОТа (лактам _в положениях 16-20;

8Ер ГО N0: 460)

ΗΧ2ΕΟΤ ΕΤ8ϋΥ 8ΚΥΕΟ ЕККАр ОРУрА ЬМОТа (лактам _в положениях 12-16;

8Ер ГО N0:461)

НХ2Е0Т ΡΤ5ΡΥ 8ΚΥΙΧ) ЕККАК ϋΓνρψ ЬМОТа _{(лактам в} положениях 12-16;

8Ер ГО N0: 462)

НХ2ЕОТ ΡΤ8ϋΥ 8ΚΥΕΟ ККК.АЕ ϋΓνρνν ЬМГУГа (лактам в положениях 16-20;

8ЕР ГО N0: 463)

НХ2ЕОТ ΕΓ8ϋΥ 8ΚΥΙ4) ЕКААК ИРУрА ЬМПТа _(8Ер _{ш Ν0; 464)}НХ2ЕСТ ΡΤ8ϋ Υ 8ΚΥΙΤ) ΕΚ. ААК ΏΡνρΑ ЕМОТа (_лакТам _в положениях 16-20;

8ЕР ГО N0: 465)

НХ2ЕОТ ΕΓ8ϋΥ 8КХЬ0 ЕКААр ОРУрА ЬМОТа _{(лактам в} положениях 12-16;

8ЕР ГО N0: 466)

НХ2ЕСТ ΕΤδϋΥ 8КУЪО ЕКААК ОРУСЛУЕМОТа (лактам _в положениях 12-16;

8Ер ГО N0: 467)

НХ2ЕСТ ΡΤ8ΟΥ 8ΚΥΙ1) ККААЕ ϋΡνρΑ ЬМВТа (лактам в положениях 16-20;

8ЕР ГО N0:468)

НХ2ЕОТ ΡΤ8ΏΥ 8ΚΥΙΧ» ЕрААК ΕΡΙΑ А ШОТа (_{8Е(2 ΙΟ ΝΟ: 469})

НХ2ЕОТ ΡΤ8ϋΥ 8ΚΥΕΟ ЕрААК ЕНА А ЬМБТа (лактам в положениях 12-16;

8Ер ГО N0: 470)

НХ2ЕСТ ΡΤ8ΏΥ 8ΚΥΙΌ ЕрААК ΕΡΙΑΑ ЬМОТа _{(лактам в} положениях 16-20;

8ЕР ГО N0: 471), где в предшествующих последовательностях Х2 - аминоизомасляная кислота.

НХ2ЕСТ ΡΤ8ΒΥ 8ΚΥΕΒ ЕККАр ВЕУр\У ШВТа (_§Ер _{ΙΟ Ν0: 472})

НХ2ЕОТ ΓΤ8ΒΥ 8ΚΥΙΒ ЕККАК ВРУр\¥ ЕМВТа (_8Ер _{ю ΝΟ: 473)}

НХ2ЕОТ ЕТ8ВΥ 8ΚΥΕΕ) ЕККАК ОГУРУ/ ЬМВТа (_лактам _в положениях 16-20;

8Е(^ ГО N0: 474)

НХ2ЕОТ ΡΤ8ΒΥ 8ΚΥΙΒ ЕВКАО ОРУРУУ ЬМВТа _{(лактам в положениях} 12-16;

8Е(} ГО N0: 475)

НХ2ЕОТЕГ8ВУ8К¥1ВЕВКАКВГУР1У1МВТа (_{лактам в} положениях 12-16;

8Е(2 ГО ΝΟ: 476)

НХ2ЕОТ ΚΓ8ϋΥ 8ΚΥΕΒ ККВАЕ ВРУрАУ ЬМВТа (лактам в положениях 16-20;

8Е(} ГО N0: 477)

ΗΧ2ΕΟΤΡΤ8ΒΥ ЖУЕОЕКААКОРУрЧУЕМПТа _(8Ер _{ΙΟ ΝΟ: 478})

НХ2Е6Т ΡΤ8ΒΥ 8КУЬВ ЕКААК ВЕУрАУ ЬМВТа _{(лактам в положениях} 16-20;

8Е(2 ГО N0: 479)

НХ2ЕОТ ЕТ8В Υ 8КУЬИ ЕКААО ЭРУрУУ ЕМВТа _{(лактам в положенйях} 1₂_16;

8Е() ГО N0: 480)

НХ2ЕОТРГ8ВУ8К¥1ГОЕКААКВРУР^1МВТа _{(лактам в положенИ}ях 12-16;

8Е(^ ГО N0: 481)

ΗΧ2ΕΟΤΡΤ8ΒΥ 8ΚΥΕΒ ККААЕ ВГУР^УЕМВТа (лактам в положениях 16-20;

8Е(^ ГО N0:482)

НХ2ЕСТ ΡΤ8ΒΥ 8К¥ЬВ ЕрААК ЕР1АУУ ЬМВТа (_8Ер Ц) N0’ 483)

НХ2ЕОТ ΕΤ8ΒΥ 8ΚΥΕΟЕОААК ΕΡΙΑλν ЬМВТа (_лактам в положениях 12-16;

8Е(2 ГО N0:484)

НХ2ЕОТ ΡΤ8ΒΥ 8ΚΥΕ0 ЕрААК ЕР1АУ/ ЬМОТа (лактам в положениях 16-20;

8Ер ГО N0: 485), где в предшествующих последовательностях Х2 - (Э-А1а).

- 51 017849

Приведенные ниже глюкагоновые пептиды с соотношением активности СЬР-1/глюкагон, равным приблизительно 5 или более, также конструируются, в целом, как описано выше в примерах 1-11. В целом, у этих пептидов АШ (аминоизомасляная кислота) в положении 2 обеспечивает устойчивость против □РР ΙΥ, но также значительно снижает активность глюкагона.

НХ2рОТ ΡΤ8ΡΥ 8ΚΥ1Β ЕрААК ЕР1С*Х¥ ЕМТЧТа _{ю Ν}θ.

ΗΧ2ρθΤΕΤ5ϋΥ 5ΚΥΙΣ) ЕрААК ΕΕΙΑΈΥ ЬМКС*а _{ю Ν0; 48?)}

НХ2р0Т ΕΤδϋΥ 8ΚΥΙΌ ЕРААК ЕР1А5У ΕΜΝΟΟ Р58ОА РРР8С*а (8Ер Π3ΝΟ: 488)

НХ2рСтТ ΕΤ8ϋΥ 8ΚΥ1Ο ЕрААК ΕΡΙΑΨ ΕΜΝ6Ο Р88ОА РРР8С*а (_лактам положениях 16-20; 8ЕР ГО N0: 489)

НХ2рОТ ΕΓ8ΒΥ 8ΚΥΕΡ ЕрААК ЕНС*У/ ΕΜΝΟΟ Р88ОА РРР8а (8Ер ГО N0:490)

НХ2рОТ ΕΓ8ΒΥ ЗКУШ ЕрААК ЕЕ1С*Х¥ ЬМККЗО Р88ОА РРР8а (_лактам (лактам в (лактам в положениях 16-20; 8 Ер ГО N0: 491), где в предшествующих последовательностях Х2 - АШ и где С* - Сук либо Сук, присоединенный к гидрофильному полимеру, или в альтернативном варианте С* - Сук, присоединенный к полиэтиленгликолю, имеющему среднюю массу приблизительно 20 кДа, или в альтернативном варианте С* - Сук, присоединенный к полиэтиленгликолю, имеющему среднюю массу приблизительно 40 кДа.

НХ2рСТ ΕΓ8ΏΥ 3ΚΥΕΟ ЕКААК ОРУС*\¥ ΕΜΝΤη (_8Е(^ _{ш Ν0: 492})

НХ20ОТ ΕΤ5ΠΥ 8ΚΥ1Β ЕКААК ЭРУрЧУ ШКС*а _(8Е(^ _{ш Ν0: 493)}

ΗΧ2<2θΤ ΕΤ8ΟΥ 3ΚΥ1Ο ЕКААК ОРУр\У ЬМЖЮ Р88ОА РРР8С*а (8Ер ГО N0:494)

НХ20ОТ ΕΤδϋΥ 5ΚΥ1Β ЕКААК ϋΡνρ^¥ 1МКСО Р88ОА РРР8С*а положениях 16-20; 8Ер ГО ΝΟ: 495)

НХ2РОТ ΡΤ8ΒΥ 8КУШ ЕКААК ОЕУС*5У ΕΜΝΟΟ Р88ОА РРРЗа (8ЕР ГО N0: 496)

НХ20ОТ ΕΤ8ΟΥ 8ΚΥΙΊ) ЕКААК ϋΕνθ*Ψ ΕΜΝΟΟ Р58СА РРРЗа положениях 16-20; 8Ер ГО N0: 497)

ΗΧ2ΡΟΤ ΡΤ5ϋΥ ЗКУШ ЕККАК ЭЕУС*3¥ ЕМКГа _(8Ер _{ΙΟ Ν0: 498)}

НХ2Р0ТΡΓ8ΟΥ 8ΚΥΙΒ ЕККАКПРУр\У ЕММРа _(8Пр _{ш Ν0; 499)}

НХ2РОТ ЕТЖУ 5ΚΥΙΒ ЕККАК ОТУрЗУ ШЫСО Р88ОА РРР8С*а (8Ер ГО N0: 500)

НХ2рОТ ΡΤ8ϋΥ 8ΚΥΙΒ ЕККАК ОРУрЗУ ΕΜΝΟΟ Р886А РРР8С*а положениях 16-20; 8Εζ) ГО N0: 501)

НХ2РОТ ΡΓ8ΏΥ 8ΚΥΙΧ) ЕККАК Г)РУС*ЧУ ΙΜΝΟΟ Р58ОА РРРЗа (8Е0 ГО ΝΟ: 502)

ΗΧ20ΟΤ ΓΓ8ϋΥ 8ΚΥΙΌ ЕККАК ПРУС*4¥ ΕΜΝΟΟ Р88ОА РРРЗа положениях 16-20; 8Е0 ГО N0: 503), где в предшествующих последовательностях Х2 - АШ и где С* - Сук либо Сук, присоединенный к гидрофильному полимеру, или в альтернативном варианте С* - Сук, присоединенный к полиэтиленгликолю, имеющему среднюю массу приблизительно 20 кДа, или в альтернативном варианте С* - Сук, присоединенный к полиэтиленгликолю, имеющему среднюю массу приблизительно 40 кДа.

Приведенные ниже глюкагоновые пептиды, которые являются соагонистами СЕР-1/глюкагона, также конструируются, в общем, как описано выше, в примерах 1-11. Образование лактамного мостика между аминокислотами 16 и 20 восстанавливает снижение активности глюкагона, вызванное заменой в положении 2.

НХ20СТ ΕΤ8ϋΥ 8ΚΥΙΤ) ЕрААК ЕР1С*У7 ЬМКТа (_{лактам в} положениях 16-20;

8Е0 ГО N0: 504), где в предшествующих последовательностях Х2 - АШ и где С* - Сук либо Сук, присоединенный к гидрофильному полимеру, или в альтернативном варианте С* - Сук, присоединенный к полиэтиленгликолю, имеющему среднюю массу приблизительно 20 кДа, или в альтернативном варианте С* - Сук, присоединенный к полиэтиленгликолю, имеющему среднюю массу приблизительно 40 кДа.

(лактам в (лактам в

- 52 017849

Χ180ΟΤΡΓ5ΟΥ 8КУЫ) ЕОААК ЕР1С*¥/иЛМТа _{(лактам в положеН}иях 16-20;

8ЕО ГО N0: 505)

Х18ОСТ ΡΤδϋΥ 8ΚΥΕΟ ЕОААК ЕРТАЗУ ЬММС*а (лактам в положениях 16-20;

8Еф ГО N0: 506)

XI ЗОСТ РТ8О Υ 8ΚΥΙΧ) ЕОААК ЕИАУУ ΕΜΝ6Ο Р88ОА РРР8С*а (лактам в положениях 16-20; 8Еф ГО N0: 507)

Х180С1Т ΡΤ8ϋΥ 8ΚΥΙΙ) ЕК.КАК ОРУОХУ ΕΜΝΟΟ Р58СтА РРР8С*а (лактам в положениях 16-20; 8Еф ГО N0: 508)

Х180СТ ΡΤ8ϋΥ 8ΚΥΕ0 ЕОААК ЕР1С*\¥ ΕΜΝΟΟ Ρ88ΟΛ РРР8а (лактам в положениях 16-20; 8ЕЦ ГО ΝΟ: 509)

Х18ОСТ ΕΓ8ϋΥ 8КУЫ) ЕККАК ОРУС^ХУ ΣΜΝΤη

8Е0 ΙϋΝΟ: 510)

НХ20ОТ ΡΤ8ΠΥ 8ΚΥΕΟ ЕККАК ОРУС*ЧУ ЩМТа

8Е0 ΙϋΝΟ: 511)

Х180СТ ΡΤδϋΥ 3ΚΥΕΟ ЕККАК ОРУОУ/ ЬМЫС*а (лактам в положениях 16-20;

(лактам в положениях 16-20;

8Е0 ГО N0: 512)

Х180ОТ ΡΤ8ΟΥ 8ΚΥΕϋ ЕККАК ОГУС*ХУ ΕΜΝΟΟ Р38ОА РРРЗа (лактам в положениях 16-20; 8Е0 ГО ΝΟ: 513), где в предшествующих последовательностях Х1 - ОМА (α,α-диметилимидазолуксусная кислота) и где С* - Сук либо Сук, присоединенный к гидрофильному полимеру, или в альтернативном варианте С* Сук, присоединенный к полиэтиленгликолю, имеющему среднюю массу приблизительно 20 кДа, или в альтернативном варианте С* - Сук, присоединенный к полиэтиленгликолю, имеющему среднюю массу приблизительно 40 кДа.

НЗООТРГЗОУЗКУГЛЕрААКЕНС^ЕМНТа _{(фжультативно} с лактамом в положениях 16-20; последовательность 8Еф ΙϋΝΟ: 514), где С* - Сук либо Сук, присоединенный к гидрофильному полимеру, или в альтернативном варианте С* Сук, присоединенный к полиэтиленгликолю, имеющему среднюю массу приблизительно 20 кДа, или в альтернативном варианте С* - Сук, присоединенный к полиэтиленгликолю, имеющему среднюю массу приблизительно 40 кДа.

11Х20СТЕГ8П¥8К¥ЬПЕКВАКОРУС^ЬМХТа _{(лактам в} положениях 16-20;

8Е0 Ιϋ ΝΟ: 517)

НХ2ООТ ΡΤδϋΥ 8КУШ ЕАРАК ζΜΝΤβ _{(лактам в} положениях 16-20;

8Е0 ГО ΝΟ: 528)

НХ2О0Т ΡΤ80Υ зкуиэ ЕАААК ЕР1СЧА/ ьмыес Р53СА РРРЗС*а (§Е0 Го ΝΟ: 531)

НХ20ОТ ΡΤ5ϋΥ 5ΚΥΙΣ) ЕОААК ЕР1АХУ ЬМЫСС Р58ОА РРР5С*С*а (8Е0 ГО N0: 532)

НХ20ОТ ΕΤ8ϋΥ 8ΚΥΕ0 ЕОААК ЕНС*Х¥ ЬМХСКЗ Р38СА РРРЗа (8Е0 ГО N0: 533), где в предшествующей последовательности Х2 - АПЗ и где С* - Сук либо Сук, присоединенный к гидрофильному полимеру, или в альтернативном варианте С* - Сук, присоединенный к полиэтиленгликолю, имеющему среднюю массу приблизительно 20 кДа, или в альтернативном варианте С* - Сук, присоединенный к полиэтиленгликолю, имеющему среднюю массу приблизительно 40 кДа.

НЗООТРТЗПУЗКУЫ)ЕОААКЕНС*У^ЕММТа _(8Ер _{Ι0 ΝΟ}: 518)

ΧΙδΟαΤΡΓδϋΥδΚΥΣϋЕОААК ЕИАУ¥1МЫС*а (_8Ер _ΝΟ.· 520)

Х180ОТΡΤ8ΠΥ8ΚΥΕϋЕККАКϋΡν^νЬМЫТа (8Е0 ГО N0: 530), где в предшествующих последовательностях Х1 - 1)М!А (α,α-диметилимидазолуксусная кислота) и где С* - Сук либо Сук, присоединенный к гидрофильному полимеру, или в альтернативном варианте С* Сук, присоединенный к полиэтиленгликолю, имеющему среднюю массу приблизительно 20 кДа, или в альтернативном варианте С* - Сук, присоединенный к полиэтиленгликолю, имеющему среднюю массу приблизительно 40 кДа.

- 53 017849

Н8рОТ ΚΓ8ΡΥ8ΚΥΕΟ 8ККАО ΌΡνψΝ ШИТОР88ОАИТ8а (_8Ер Ц) N0: 521) Η80θΤ ΡΤ8ΟΥ8ΚΥΕΟ 8ККА<2 0ГУ(2Л¥ БМЫООР88ОАРРР8а _{( 8Е}р _{ю Ν0; 522}) Н80ОТ ΡΤ8ΡΥ8ΚΥΕΟ 8ККАС ОРУОЗУ ЕМКОСРЗЗСАРРРЗа (_8Ер _{ш ΝΟ; 523}) Н80СТ ΡΓ8ϋΥ5ΚΥΙΙ> 8ВКА<2 ϋΡνζΑν ЬУКШР88САРРР8а _(8Ер _{ю Ν0; 524)}Н8рОТРГ8О¥8КУЬО8ККА9ПРУ95¥ШПШР886АРРР8а _(8Ер _{ΙΟ Ν0: 525)}Η8ΰΟΤΡΓ8ϋΥ8ΚΥ1ΟΕΚΕ<ΑΚΟΒν(2λ¥ΕΜΙΧ}ΟΡ88ΟΑΡΡΡ83 (81:(/ П) N0: 526) НАЕСТ РТ8ОУ88УЕЕС0ААКЕИА^ЬУК6Са (8Е() ΙϋΝΟ: 527) Х1Х200Т ΕΤ80Υ 8ΚΥΙΌ ЕКХ5АК ЭРУХЗ\У ΕΜΝΧ4 _(8Ер _{го Ν0:} 61), где Х1 - Н1к, ϋ-гистидин, дезаминогистидин, гидроксигистидин, ацетилгистидин, гомогистидин либо α,α-диметилимидазолукусная кислота (ЭМ^), Ы-метилгистидин, α-метилгистидин либо имидазолуксусная кислота,

Х2 - 8ег, ϋ-серин, А1а, Vа1, глицин, И-метилсерин либо аминоизомасляная кислота (АГО), Иметилаланин и Э-аланин,

Х3 - А1а, О1п либо Сук-РЕО,

Х4 - ТНг-СОМЕ или Суз-РЕО или 0ОР88ОАРРР8 (8Е(} ГО ΝΟ: 515) или

ССР88ОАРРР8С-РЕО (_8Ες _{ΙΕ) ΝΟ: 516}) при условии, что в случае, когда ХЗ представляет собой Суз-Ре§, Х4 - не является Суз-РЕС либо НСР88САРРР8С-РЕС (_8Ер _ΙϋΝθ: 516) и когда Х2 - 8ег, XI не является Ηΐδ,

Х5 - А1а или Апу

Х1Х2(ХтТ ΡΤ8ϋΥ 8К¥1ГО Е(^ Х5АКЕН ХЗУ/ ΙΜΝΧ4 (_8Ер _{т ΝΟ; 62)} где XI - Ηΐδ, ϋ-гистидин, дезаминогистидин, гидроксигистидин, ацетилгистидин, гомогистидин либо альфа,альфа-диметилимидазолукусная кислота (ϋΜΙΑ), Ν-метилгистидин, альфа-метилгистидин либо имидазолуксусная кислота,

Х2 - 8ег, ϋ-серин, А1а, Уа1, глицин, Ν-метилсерин либо аминоизомасляная кислота (ΑΙΒ), Ν-метилаланин и ϋ-аланин,

ХЗ.....А1а, О1п либо Суз-РЕО,

Х4 - ТНг-СОХЧЕ или Суз-РЕО или СОР88ОАРРР8 (§ΕρΠ)ΝΟ: 515) или (ЗОР88ОАРРР8С-РЕО _(8Ер Щ КО: 516), при условии, что в случае, когда ХЗ представляет собой Суз-Ре§, Х4 - не является Суз-РЕСг либо СОР88ОАРРР8С-РЕ6 (_8Ер го N0: 516) и когда Х2 - 8ег,

XI не является Ηΐδ,

Х5 - А1а или Аг§.

Любая из предшествующих последовательностей может включать дополнительные модификации, например 1 модификацию, 2 модификации, 3 модификации, 4 модификации или 5 модификаций, которые не уничтожают активности, включая (но не ограничиваясь) замены Ш10 и В20, которые могут применяться для повышения активности. Любая из предшествующих последовательностей может также быть получена без модификаций, наделяющих устойчивостью к ПРР IV, т.е. в которой нативный Н1к находится в положении 1 и нативный 8ег находится в положении 2. Кроме того, любое из предшествующих соединений может факультативно быть присоединенным к конъюгату, такому как гетерологичный полипептид, иммуноглобулин либо их фрагмент (например, Ес-фрагмент), средство направленной доставки, диагностическая метка либо диагностический или терапевтический агент.

Пример 17. Приведенные ниже глюкагоновые пептиды, модифицированные с включением Сконцевого удлиняющего сегмента (последовательность 8РО ГО N0: 26), присоединенного к карбоксильному концу глюкагонового пептида, были сконструированы, в целом, как описано выше в примерах 1-11, и проверены на активность на ОЕР-1-рецепторах и глюкагоновых рецепторах с помощью т уйго анализа, описание которого приведено в примере 14.

- 54 017849

В табл. 11 представлена активность различных аналогов глюкагона на глюкагоновых и СЬР-1рецепторах. Данные показывают, что в случае аналогов глюкагона, содержащих С-концевой удлиняющий сегмент (последовательность БЕр ΙΏ N0: 26), замены аминокислот в положениях 16, 20, 28 и 29 могут повлиять на активность аналогов на СЕР-1-рецепторе.

Таблица 11

Глюкагон-Сех

Взаимосвязь между структурой и активностью

Глюкагоновый пептид	ЕС 50 (нМ)	Относительная активность (%)	ЕС₅₀(нМ)	Относительная активность (%)
-ΜΝΤ²⁹ (8Ер ΙϋΝΟ: I)	0,086	100
-ΜΝΤΟ³⁰Ρ88ΟΑΡΡΡ8 (8Ер ΙϋΝΟ: 521)	0,14	61	1,19	2
-ΜΝΟΟ³⁰ Р88ОАРРР8 (8Ер ГО N0: 522)	0,28	30	0,31	8
-МКСЮ³⁰ Р88СЗАРРР8 (8Ер ΙϋΝΟ: 523)	0,61	14	0,80	3
-νΚΟΟ³⁰Ρ88ΟΑΡΡΡ8 (8Ер ΙϋΝΟ: 524)	1,16	7	0,21	12
-ΜΌΟΟ³⁰ Р88ОАРРР8 (8Ер ΙϋΝΟ: 525)	0,12	72	0,13	19
Е^\|бК²⁰-МООО³⁰ Р886АРРР8 (ЗЕр ΙϋΝΟ: 526)	0,22	39	0,020	125
СЬР-ЕУКбС³⁰ (ЗЕр ΙϋΝΟ: 527)			0,025	100

Пример 18.

В табл. 12 представлены ш νίΐΐΌ данные, накопленные для различных глюкагоновых пептидов, сравнивающие их относительную активность на глюкагоновых рецепторах и СЕР-1-рецепторах.

Таблица 12

Сравнение агонистов и соагонистов с полиэтиленгликолем и без полиэтиленгликоля

	% активности в сравнении с нативным агентом
Контрольные образцы	глюкагоновый рецептор	ОЬР-1-рецептор
Глюкагон	100	0,78
ОЬР-1	<0,01	100

	Исходный агент без полиэтилен-гликоля	Исходный агент с полиэтиленгликолем
% активности в сравнении с нативным агентом	% активности в сравнении с нативным агентом
АГОНИСТЫ	ОК	ОЬР-1 К	СК	ОЬР-1 К
Химера ΑΙΒ2, Суз24 (8Е() ГО ΝΟ: 486)	15,4	160,6	2,6	82,5
Химера ΑΙΒ2, Суз29 (8ЕЦ ГО ΝΟ: 487)	20,1	124,6	5,6	54,3
Химера ΑΙΒ2, О1у29,30 Суз40 Сех (8ЕЦ ГО ΝΟ: 488)	2,2	359,1	0,3	68,8
Химера ΑΙΒ2, О1у29,30 Суз4О Сех лактам (8ЕЦ ГО ΝΟ: 489)	14,2	169,6	3,2	63,6
Химера ΑΙΒ2, О1у29,30 Суз24 Сех (8Εζ) ГО ΝΟ: 490)	2,5	457,8	0,2	95,4
Химера ΑΙΒ2, О1у29,30 Суз24 Сех лактам (8ЕЦ ГО N0:491)	25,2	381,5	1,4	96,4
Е16, К20А1В2, А18 Суз24 (8ЕЦ ГО ΝΟ: 492)	-	-	1,1	73,5
Е16, К20А1В2, А18 О1у29,30 Суз24 Сех (8ЕЦ ГО ΝΟ: 496)	-	-	0,1	88,5

СОАГОНИСТЫ	ОК	ОЬР-1 К	ОК	ОЬР-1 К
Химера ϋΜΙΑΙ, Суз24 лактам (8Εζ) ΙϋΝΟ: 505)	160,7	82,5	19,1	12,5
Химера А1В2, Суз24 лактам (8ЕЦ ГО ΝΟ: 504)	114,2	230,4	9,2	38,0
Химера ϋΜΑΙ, Суз29 лактам (8Εζ) ГО ΝΟ: 506)	-	-	-	-
Химера ϋΜΙΑΙ, О1у29,30 Суз40 Сех лактам (8ЕЦ ГО ΝΟ: 507)	-	-	-	-
Е16, К20 ϋΜΙΑΙ, О1у29,30 Суз40 Сех лактам (8ЕЦ ГО ΝΟ: 508)	-	-	-	-
Химера ϋΜΙΑΙ, С1у29,30 Суз24 Сех лактам (8ЕЦ ГО ΝΟ: 509)	-	-	-	-
Е16, К20 ϋΜΙΑΙ, Суз24 лактам (8ЕЦ ΙϋΝΟ: 510)	-	-	64,1	9,3
Е16, К20 ΑΙΒ2, Суз24 лактам (8Е(2 ГО ΝΟ: 517)	108,3	96,9	15,8	31,0
Химера Суз24 (8ЕЦ ГО ΝΟ: 518)	-	-	19,8	29,3
Е16, К20 ϋΜΙΑΙ, О1у29,30 Суз24 Сех лактам (8ЕЦ ΙϋΝΟ: 513)	116,0	78,3	12,6	11,3
Химера ϋΜΑΙ, Суз29 (8ЕЦ ΙϋΝΟ: 520)	-	-	5,3	27,3
Химера ϋΜΑΙ, Суз24 (8ЕЦ ΙϋΝΟ: 519)	28,9	64,5	6,9	19,3

СК - глюкагоновый рецептор;

СЬР-1К - СЕР-1-рецептор.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Ненативный глюкагоновый пептид, содержащий последовательность ЗЕО Ш N0: 55 или аналог последовательности ЗЕО Ш N0: 55, представляющий собой искусственный пептид, отличающийся от последовательности ЗЕО ΙΌ N0: 55 1-3 модификациями аминокислот, выбранными из положений 1, 2, 3, 5, 7, 10, 11, 13, 14, 17, 18, 19, 21, 24, 27, 28 и 29, причем упомянутый глюкагоновый пептид проявляет повышенную активность на ОЬР-1-рецепторе по сравнению с нативным глюкагоном, а также содержит внутримолекулярный мостик между боковыми цепями двух аминокислот, разделенных тремя промежуточными аминокислотами, для обеспечения повышенной активности на ОЬР-1-рецепторе, или фармацевтически приемлемая соль такого пептида.
2. Глюкагоновый пептид по п.1, причем упомянутые две боковые цепи связаны одна с другой посредством ковалентной связи.
3. Глюкагоновый пептид по п.2, причем внутримолекулярный мостик представляет собой лактамный мостик.
4. Глюкагоновый пептид по любому из пп.1-3, содержащий лактамный мостик между двумя аминокислотами, выбранными из группы, которую составляют аминокислоты в положениях 16 и 20, аминокислоты в положениях 12 и 16, аминокислоты в положениях 20 и 24 и аминокислоты в положениях 24 и 28.
5. Глюкагоновый пептид по п.4, причем мостик находится между аминокислотами в положениях 16 и 20.
6. Глюкагоновый пептид по п.4, причем мостик находится между аминокислотами в положениях 12 и 16.
7. Глюкагоновый пептид по п.1, причем боковые цепи связаны одна с другой посредством водородных связей или ионных взаимодействий, факультативно посредством солевого мостика.
8. Глюкагоновый пептид по п.7, причем внутримолекулярный мостик представляет собой солевой мостик.
9. Глюкагоновый пептид по п.8, содержащий солевой мостик между двумя аминокислотами, выбранными из группы, которую составляют аминокислоты в положениях 16 и 20, аминокислоты в положениях 12 и 16, аминокислоты в положениях 20 и 24 и аминокислоты в положениях 24 и 28.
10. Глюкагоновый пептид по п.9, причем солевой мостик образован между аминокислотами в положениях 16 и 20.
11. Глюкагоновый пептид по п.9, причем солевой мостик образован между аминокислотами в положениях 12 и 16.
12. Глюкагоновый пептид по любому из пп.1-11, причем аминокислотой в положении 16 является глутаминовая кислота, аминокислотой в положении 20 является лизин, а С-концевая карбоксильная группа заменена амидом, факультативно с лактамным мостиком между глутаминовой кислотой в положении 16 и лизином в положении 20.
13. Глюкагоновый пептид по п.1, который содержит последовательность ЗЕО Ш N0: 55 или ЗЕО ГО N0: 56.
14. Глюкагоновый пептид по любому из предшествующих пунктов, который дополнительно содержит пептид, выбранный из группы, которую составляют последовательности ЗЕО ГО N0: 26, ЗЕО ГО N0: 29 и ЗЕО ГО N0: 65, присоединенные к карбоксильному концу упомянутого глюкагонового пептида.
15. Глюкагоновый пептид по любому из предшествующих пунктов, причем аминокислотой в положении 28 является Акр, Аки или Ьук и аминокислотой в положении 29 является 01у или ТЬг.
16. Глюкагоновый пептид по п.1, причем аминокислота в положении 1 или 2 модифицирована для понижения восприимчивости к расщеплению дипептидилпептидазой IV.
17. Глюкагоновый пептид по п.16, причем аминокислота в положении 2 выбрана из группы, которую составляют ά-серин, аланин, Ό-аланин, валин, глицин, №метилсерин, №метилаланин и аминоизомасляная кислота.
18. Глюкагоновый пептид по п.16 или 17, причем аминокислота в положении 1 выбрана из группы, которую составляют ά-гистидин, дезаминогистидин, гидроксигистидин, ацетилгистидин, гомогистидин, №метилгистидин, α-метилгистидин, имидазолуксусная кислота и α,α-диметилимидазолуксусная кислота (ΌΜΙΑ).
19. Глюкагоновый пептид по любому из предшествующих пунктов, причем аминокислотой в положении 3 является глутаминовая кислота или глутамин.
20. Глюкагоновый пептид по любому из предшествующих пунктов, дополнительно содержащий гидрофильную составляющую, факультативно полиэтиленгликолевую цепь, ковалентно присоединенную в положении 17, 21 или 24 либо к С-концевой аминокислоте глюкагонового пептида.
21. Глюкагоновый пептид по любому из предшествующих пунктов, содержащий С-концевую аминокислоту с нейтральной по заряду группой, факультативно амидом, вместо карбоновой кислоты.
22. Глюкагоновый пептид по п.1, содержащий последовательность ЗЕО ГО N0: 33.
23. Глюкагоновый пептид по п.1, содержащий последовательность аналога последовательности

- 56 017849

ВЕР ΙΌ N0: 33, отличающегося от последовательности ВЕР 10 N0: 33 1-3 аминокислотами, выбранными из положений 1, 2, 3, 5, 7, 10, 11, 13, 14, 17, 18, 19, 21 и 27, при условии, что в случае если аминокислотой в положении 16 является серин, то либо в положении 20 находится лизин, либо между аминокислотой в положении 24 и аминокислотой в положении 20 или 28 образован лактамный мостик.
24. Глюкагоновый пептид по п.23, содержащий последовательность аналога последовательности ВЕР 10 N0: 33, отличающегося от последовательности ВЕР 10 N0: 33 1-2 аминокислотами, выбранными из положений 1, 2, 5, 7, 10, 11, 13, 14, 17, 18, 19, 21 и 27, при условии, что в случае если аминокислотой в положении 16 является серин, то либо в положении 20 находится лизин, либо между аминокислотой в положении 24 и аминокислотой в положении 20 или 28 образован лактамный мостик.
25. Глюкагоновый пептид по п.24, причем аминокислотой в положении 16 является глутаминовая кислота, а С-концевая карбоксильная группа заменена амидом.
26. Глюкагоновый пептид по п.25, причем к боковой цепи аминокислоты в положении 17, 21 или 24 ковалентно присоединена полиэтиленгликолевая цепь.
27. Глюкагоновый пептид по п.25, причем аминокислота в положении 28 или 29 замещена кислой аминокислотой.
28. Глюкагоновый пептид по п.25, причем аминокислота в положении 1 или 2 модифицирована для понижения восприимчивости к расщеплению дипептидилпептидазой Ιν.
29. Глюкагоновый пептид по п.25, который содержит аналог последовательности ВЕР 10 N0: 33, причем аминокислота в положении 2 пептида последовательности ВЕР 10 N0: 33 выбрана из группы, которую составляют ά-серин, аланин, глицин, ^метилсерин и аминоизомасляная кислота.
30. Глюкагоновый пептид по п.25, который содержит аналог последовательности ВЕР 10 N0: 33, причем аминокислота в положении 1 пептида последовательности ВЕР 10 N0: 33 выбрана из группы, которую составляют ά-гистидин, дезаминогистидин, гидроксигистидин, ацетилгистидин и гомогистидин.
31. Глюкагоновый пептид по п.25, дополнительно содержащий гидрофильную составляющую, ковалентно присоединенную в положении 17 или 21 упомянутого глюкагонового пептида.
32. Глюкагоновый пептид по п.31, причем упомянутая гидрофильная составляющая представляет собой полиэтиленгликолевую цепь.
33. Глюкагоновый пептид по п.25, содержащий любую из аминокислотных последовательностей ВЕР 10 N0: 9, ВЕр 10 N0: 10-18, ВЕр 10 N0: 20-22, ВЕр 10 N0: 40-44 и ВЕр 10 N0: 53.
34. Глюкагоновый пептид по п.25, содержащий любую из аминокислотных последовательностей ВЕр 10 N0: 2-4 и ВЕр 10 N0: 23-25.
35. Глюкагоновый пептид по п.1, который содержит последовательность Х1Х₂РОТ ЕТВОУ ВКУЕО

ЕКХ₅АК ОЕ\'Х₃\\' (ВЕр 10 N0: 61) или Х|Х₂РОТ ЕТВОУ ВКУЕО Ер Х₅АК ЕП Х₃^ ΙΧΑΧ (ВЕР 10 N0: 62), при условии, что в случае, когда Х₃ - Суз-РЕО, Х₄ не является Суз-РЕО либо ООРВВОАРРРВС-РЕО, и когда Х₂ - серин, Х₁ не является гистидином, причем факультативно данный пептид дополнительно содержит лактамный мостик между аминокислотами в положениях 16 и 20.
36. Глюкагоновый пептид по п.35, в котором Х₃ - Суз-РЕО, причем факультативно данный глюкагоновый пептид содержит лактамный мостик между аминокислотами в положениях 16 и 20.
37. Глюкагоновый пептид, содержащий последовательность

ЕЩ-Ыз-Зег-СЬ-СДу-ТЬг-РЬе- ТЬг-Зсг-Азр-Туг-Зег-ЬуБ-Туг-Ееа-Азр-ХааХаа-Аг§-А1а-О1п-А8р-РЬе-Уа1-О1п-Тгр-Ееи- Хаа-Авп-ТЬг-В. (8Ες ГО ΝΟ: 2);

НН2-Н18-5ег-О1п-О1у-Тйг-Р11е-ТИг-Зег-Азр-Туг-Зег-Еуд-Туг-Ееи-Азр-ХааАг^Аг§-А1а-С1п-Хаа-РЬе-Уа1-С1п-Тгр-Ьеи- Хаа-Азп-ТЪг-К (8ΕΩ ГО N0: 3);

МН₂-Н18-8ег-О1п-Ст1у-ТЬг-РИе- ТЬг-Зег-Азр-Туг-Зег-Ьуз-Туг-Ьеи-Азр-ХааАг§-Аг§-А1а-О1п-А8р-РЬе-Уа1-Хаа-Тгр-Ьеи-Хаа-А8п-Ткг-К (ЗЕр ГО N0:4);

и аналоги агониста глюкагона последовательностей ВЕР 10 N0: 2, ВЕР 10 N0: 3 и ВЕР 10 N0: 4, где К С00Н или С0Х1 Е и боковая цепь остатка аминокислоты в положении 17, 21 или 24 либо С-концевой аминокислоты упомянутого глюкагонового пептида дополнительно содержит гидрофильную составляющую, ковалентно присоединенную к этому остатку аминокислоты; а также фармацевтически приемлемые соли данного глюкагонового пептида.
38. Глюкагоновый пептид по п.37, причем К - С0ИН₂ и упомянутой гидрофильной составляющей является полиэтиленгликолевая цепь.
39. Глюкагоновый пептид по п.38, который содержит последовательность, выбранную из группы, которую составляют последовательности ВЕР 10 N0: 23, ВЕР 10 N0: 24 и ВЕР 10 N0: 25.
40. Глюкагоновый пептид по п.39, в котором полиэтиленгликолевая цепь имеет молекулярную массу, выбранную в диапазоне от приблизительно 1000 до приблизительно 5000 Да.
41. Глюкагоновый пептид по п.39, в котором полиэтиленгликолевая цепь имеет молекулярную массу по меньшей мере приблизительно 20000 Да.
42. Глюкагоновый пептид, содержащий последовательность, выбранную из последовательностей

- 57 017849

8Е0 ΙΌ N0: 70-514, или его фармацевтически приемлемая соль.
43. Глюкагоновый пептид по п.42, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которую составляют последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 240-256, причем факультативно С* Сук, присоединенный к полиэтиленгликолю, имеющему среднюю массу приблизительно 20 кДа, или в альтернативном варианте С* - Сук, присоединенный к полиэтиленгликолю, имеющему среднюю массу приблизительно 40 кДа.
44. Глюкагоновый пептид, содержащий аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 251, или его фармацевтически приемлемая соль.
45. Глюкагоновый пептид по п.44, отличающийся тем, что Сук в положении 24 содержит малеимидометоксиполиэтиленгликолевую составляющую, причем полиэтиленгликоль имеет среднюю молекулярную массу приблизительно 40 кДа.
46. Глюкагоновый пептид по п.42, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которую составляют последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 308-324, причем факультативно С* Сук, присоединенный к полиэтиленгликолю, имеющему среднюю массу приблизительно 20 кДа, или в альтернативном варианте С* - Сук, присоединенный к полиэтиленгликолю, имеющему среднюю массу приблизительно 40 кДа.
47. Глюкагоновый пептид, содержащий аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 319, или его фармацевтически приемлемая соль.
48. Глюкагоновый пептид по п.42, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которую составляют последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 505-513, причем факультативно С* Сук, присоединенный к полиэтиленгликолю, имеющему среднюю массу приблизительно 20 кДа, или в альтернативном варианте С* - Сук, присоединенный к полиэтиленгликолю, имеющему среднюю массу приблизительно 40 кДа.
49. Глюкагоновый пептид, содержащий аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 510, или его фармацевтически приемлемая соль.
50. Ненативный глюкагоновый пептид, содержащий последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 55 или аналог последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 55, представляющий собой искусственный пептид, отличающийся от последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 55 1-3 модификациями аминокислот, выбранными из положений 1, 2, 3, 5, 7, 10, 11, 13, 14, 17, 18, 19, 21, 24, 27, 28 и 29, причем упомянутый глюкагоновый пептид проявляет повышенную активность на СЬР-1-рецепторе по сравнению с нативным глюкагоном, причем аминокислотой в положении 16 является глутаминовая кислота, аминокислотой в положении 20 является лизин, а С-концевая карбоксильная группа заменена амидом, факультативно с лактамным мостиком между глутаминовой кислотой в положении 16 и лизином в положении 20, или фармацевтически приемлемая соль такого пептида.
51. Аналог глюкагоновой аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 1, содержащий внутримолекулярный мостик между боковыми цепями аминокислот в положениях 12 и 16, 16 и 20, 20 и 24 либо 24 и 28, причем данный аналог проявляет повышенную активность на СЬР-1-рецепторе по сравнению с нативным глюкагоном, или фармацевтически приемлемая соль такого аналога.
52. Гомодимер, включающий в себя два глюкагоновых пептида или аналога, соединенных между собой посредством линкера, причем каждый из этих глюкагоновых пептидов или аналогов представляет собой пептид или аналог по любому из предшествующих пунктов.
53. Гомодимер по п.52, включающий в себя последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 33, где аминокислотой в положении 28 является Акр, аминокислотой в положении 29 является С1у и аминокислотная последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 29 ковалентно присоединена к карбоксильному концу последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 33.
54. Димер, включающий в себя два глюкагоновых пептида или аналога по любому из предшествующих пунктов.
55. Конъюгат, содержащий глюкагоновый пептид или аналог по любому из предшествующих пунктов, присоединенный к гетерологичному пептиду или полипептиду, средству направленной доставки, иммуноглобулину или его части, диагностической метке, полимеру или терапевтическому либо диагностическому агенту.
56. Конъюгат по п.55, причем упомянутый глюкагоновый пептид присоединен к белку плазмы.
57. Конъюгат по п.56, причем карбоксильный конец глюкагонового пептида присоединен к аминокислотной последовательности любой из последовательностей 8Е0 ΙΌ N0: 26-29.
58. Фармацевтическая композиция, содержащая глюкагоновый пептид по любому из пп. 1-50, или аналог по п.51, или его фармацевтически приемлемую соль, или гомодимер по п.52 или 53, или димер по п.54, или конъюгат по любому из пп.55-57, а также фармацевтически приемлемый носитель.
59. Фармацевтическая композиция по п.58, дополнительно содержащая противодиабетический препарат или лекарственное средство против ожирения, а также фармацевтически приемлемый носитель.
60. Фармацевтическая композиция по п.59, отличающаяся тем, что противодиабетический препарат выбран из группы, которую составляют инсулин, сульфонилмочевины, такие как толбутамид (0ппакс). ацетогексамид (Оутс1ог), толазамид (То1шаке), хлорпропамид (П1аЫиеке), глипизид (С1исо1го1), глибурид

- 58 017849 (0|аЬе1а, Мютопаке, С1упаке), глимепирид (Атагу1) или гликлазид (О1ат1сгоп); меглитиниды, такие как репаглинид (Ргапбш) или натеглинид (81ат11х); бигуаниды, такие как метформин (С1исорйаде) или фенформин; тиазолидиндионы, такие как росиглитазон (Ауапб1а), пиоглитазон (Лс1о8), троглитазон (КехиНп) или другие ингибиторы РРАКу (активатор пероксисомальной пролиферации); ингибиторы αглюкозидазы, угнетающие переваривание углеводов, такие как миглитол (С1у§е1), акарбос (Ргесо§е/С1исоЬау); эксенатид (ВуеИа) или прамлинтид; ингибиторы дипептидилпептидазы-4 (ЭРР-4), такие как вилдаглиптин или ситаглиптин; ингибиторы 8СЬТ (натрийзависимый переносчик глюкозы 1) и ингибиторы фруктоза-1,6-бис-фосфатазы, или лекарственное средство против ожирения выбрано из группы, которую составляют средства, подавляющие аппетит, в том числе стимуляторы типа фенэтиламина, фентермин (факультативно с фенфлурамином либо дексфенфлурамином), диэтилпропион (Тепиа!е®), фендиметразин (Рге1и-2®, ВойтП®), бензфетамин (П1бгех®), сибутрамин (МегШа®, КебисЫ®); римонабант (ЛсотрНа®), другие антагонисты каннабиноидного рецептора; оксинтомодулин; флуоксетина гидрохлорид (Ргохас); препарат Цпеха (топирамат и фентермин), препарат Ехсайа (бупропион и зонисамид) или препарат СогИгауе (бупропион и налтрексон); или ингибиторы липаз, подобные ксеникалу (0г115(а() либо препарату СеШМа! (известному также как ЛТЬ-962), и препарат СТ 389-255.
61. Набор для введения глюкагонового пептида или аналога пациенту, нуждающемуся в этом, отличающийся тем, что он включает в себя фармацевтическую композицию по любому из пп.58-60 и устройство для введения упомянутой композиции пациенту.
62. Применение фармацевтической композиции по любому из пп.58-60 для лечения диабета или гипергликемии для снижения прироста массы тела либо инициирования снижения массы тела.
63. Применение глюкагонового пептида по любому из пп.1-50, или аналога по п.51, или их фармацевтически приемлемых солей при изготовлении лекарственного средства для лечения диабета или гипергликемии, или для снижения прироста массы тела, или инициирования снижения массы тела.
64. Способ снижения прироста массы тела либо инициирования снижения массы тела у пациента, включающий введение пациенту фармацевтической композиции по любому из пп.57-59 в количестве, эффективном для снижения прироста массы тела либо инициирования снижения массы тела.
65. Способ лечения диабета или гипергликемии у пациента, включающий введение пациенту фармацевтической композиции по любому из пп.57-59 в количестве, эффективном для лечения диабета или гипергликемии.
66. Способ снижения прироста массы тела либо инициирования снижения массы тела, включающий введение эффективного количества композиции, содержащей агонист глюкагона, включающий в себя глюкагоновый пептид, выбранный из группы, которую составляют последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0: 10, 8ЕО ΙΌ N0: 11, 8ЕО ΙΌ N0: 12, 8ЕЕ) ΙΌ N0: 13, 8ЕЕ) ΙΌ N0: 14, 8ЕЕ) ΙΌ N0: 15, 8ЕЕ) ΙΌ N0: 16, 8ЕЕ) ΙΌ N0: 17, 8ЕЦ ΙΌ N0: 18 и 8ЕЦ ΙΌ N0: 55, причем аминокислота 29 глюкагонового пептида посредством пептидной связи присоединена к второму пептиду, содержащему последовательность, выбранную из группы, которую составляют последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0: 26, 8ЕЦ ΙΌ N0: 27, 8ЕЦ ΙΌ N0: 28, 8ЕЦ ΙΌ N0: 29 и 8ЕЕ) ΙΌ N0: 65.
67. Способ снижения прироста массы тела либо инициирования снижения массы тела, включающий введение эффективного количества композиции, содержащей глюкагоновый пептид по п.1, дополнительно включающий последовательность, выбранную из группы, которую составляют последовательности 8ЕЕ) ΙΌ N0: 26-28 и 8ЕЕ) ΙΌ N0: 65.
68. Способ по п.67, отличающийся тем, что агонист глюкагона дополнительно содержит полиэтиленгликолевую цепь, присоединенную к глюкагоновому пептиду в положении 17, 21 или 24, имеющую молекулярную массу, выбранную в диапазоне от приблизительно 5000 до приблизительно 40000 Да, при условии, что в случае если пептид содержит последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0: 10, 8ЕЦ ΙΌ N0: 11, 8ЕЦ ΙΌ N0: 12 или 8ЕЦ ΙΌ N0: 13, то полиэтиленгликолевая цепь ковалентно присоединена к остатку аминокислоты в положении 16, 17, 21 или 24; если пептид содержит последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0: 14 или 8ЕЦ ΙΌ N0: 15, то полиэтиленгликолевая цепь ковалентно присоединена к остатку аминокислоты в положении 16, 17 или 21; если пептид содержит последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0: 55, то полиэтиленгликолевая цепь ковалентно присоединена к остатку аминокислоты в положении 21 или 24; и если пептид содержит последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0: 16, 8ЕЦ ΙΌ N0: 17 или 8ЕЦ ΙΌ N0: 18, то полиэтиленгликолевая цепь ковалентно присоединена к остатку аминокислоты в положении 17 или 21.
69. Способ лечения гипергликемии с применением заранее изготовленной водной композиции, отличающийся тем, что он включает введение эффективного количества фармацевтической композиции по любому из пп.58-60.
70. Способ по п.69, отличающийся тем, что агонист глюкагона дополнительно содержит полиэтиленгликолевую цепь, присоединенную к глюкагоновому пептиду в положении 16, 17, 21 или 24, имеющую молекулярную массу, выбранную в диапазоне от приблизительно 5000 до приблизительно 40000 Да, при условии, что в случае когда пептид содержит последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0: 10, 8ЕЦ ΙΌ N0: 11, 8ЕЦ ΙΌ N0: 12 или 8ЕЦ ΙΌ N0: 13, полиэтиленгликолевая цепь ковалентно присоединена к остатку аминокислоты в положении 17, 21 или 24, когда пептид содержит последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0: 14

- 59 017849 или 8ЕР ΙΌ N0: 15, полиэтиленгликолевая цепь ковалентно присоединена к остатку аминокислоты в положении 16, 17 или 21, и когда пептид содержит последовательности 8ЕР II) N0: 16, 8ЕР II) N0: 17 или 8ЕР II) N0: 18, полиэтиленгликолевая цепь ковалентно присоединена к остатку аминокислоты в положении 17 или 21.
71. Применение глюкагонового пептида или аналога по любому из предшествующих пунктов в комбинации с противодиабетическим препаратом или лекарственным средством против ожирения для лечения диабета или гипергликемии, или для снижения прироста массы тела, или инициирования снижения массы тела.
72. Применение глюкагонового пептида или аналога по любому из предшествующих пунктов в комбинации с противодиабетическим препаратом или лекарственным средством против ожирения при изготовлении лекарственного средства для лечения диабета или гипергликемии, или для снижения прироста массы тела, или инициирования снижения массы тела.
73. Применение по п.71 или 72, причем противодиабетический препарат выбран из группы, которую составляют инсулин, сульфонилмочевины, такие как толбутамид (0ппаке), ацетогексамид (Эуше1ог), толазамид (Тойпаке), хлорпропамид (ЭхаЬшеке), глипизид (С1исо1го1), глибурид (П1аЬе1а, М1сгопаке, С1упаке), глимепирид (Атагу1) или гликлазид (П1аш1сгоп); меглитиниды, такие как репаглинид (Ргапйш) или натеглинид (81агйх); бигуаниды, такие как метформин (С1исорйаде) или фенформин; тиазолидиндионы, такие как росиглитазон (Аνаηά^а), пиоглитазон (Ас1ок), троглитазон (Яе/ийп) или другие ингибиторы РРАЯу (активатор пероксисомальной пролиферации); ингибиторы α-глюкозидазы, угнетающие переваривание углеводов, такие как миглитол (С1уке1), акарбос (Ргесоке/С1исоЬау); эксенатид (ВуеИа) или прамлинтид; ингибиторы дипептидилпептидазы-4 (ЭРР-4), такие как вилдаглиптин или ситаглиптин; ингибиторы 8СЬТ (натрийзависимый переносчик глюкозы 1) и ингибиторы фруктоза-1,6бис-фосфатазы, или лекарственное средство против ожирения выбрано из группы, которую составляют средства, подавляющие аппетит, в том числе стимуляторы типа фенэтиламина, фентермин (факультативно с фенфлурамином либо дексфенфлурамином), диэтилпропион (Тепиа1е®), фендиметразин (Рге1и-2®, Воп1гй®), бензфетамин (ЭИгех®), сибутрамин (МепШа®, ЯейисШ®); римонабант (Асошрйа®), другие антагонисты каннабиноидного рецептора; оксинтомодулин; флуоксетина гидрохлорид (Рго/ас); препарат Рпеха (топирамат и фентермин), препарат Ехсайа (бупропион и зонисамид) или препарат Сοηί^аνе (бупропион и налтрексон); или ингибиторы липаз, подобные ксеникалу (0гйк1а1) либо препарату Се1Шк1а1 (известному также как АТЬ-962), и препарат СТ 389-255.