JP2011511778A - エステルに基づいたペプチドプロドラッグ - Google Patents

エステルに基づいたペプチドプロドラッグ Download PDF

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Abstract

生体活性ポリペプチドのプロドラッグ製剤が提供され、ここで生体活性ポリペプチドは、ジペプチドの、エステル結合を介した生体活性ポリペプチドへの結合により修飾されている。本明細書に開示されているプロドラッグは、幾つかの実施態様において、少なくとも１．５時間（例えば、少なくとも１０時間）、より典型的には２０時間を超えて７０時間未満の延長された半減期を有し、化学不安定性により駆動される非酵素反応により、生理学的条件下で活性形態に変換される。
【選択図】 図５Ａ

Description

ペプチドに基づいた薬剤は、比較的短い作用持続時間及び変動する療指数を有する極めて効果的な医薬である。本開示は、プロドラッグ誘導体が薬剤の作用開始を遅延し、半減期を延長するように設計されている、ペプチドに基づいたプロドラッグを対象とする。遅延された作用開始は、プロドラッグの活性化の前にその全身分布を可能にするという点において有利である。したがって、プロドラッグの投与は、投与時のピーク活性により引き起こされる合併症を排除し、母体薬剤の治療指数を増加させる。
ペプチド及びタンパク質アゴニストの受容体認識、続くプロセッシングは、多くのペプチド及びタンパク質に基づいた薬剤の主要な分解の経路である。したがって、受容体へのペプチド薬剤の結合は、生物学的刺激をもたらすが、続く、ペプチド又はタンパク質の酵素分解を介したペプチド／タンパク質誘導薬理学の不活性化も開始する。本開示によると、プロドラッグは、対応する受容体によるプロドラッグの認識を阻害する戦略に基づいて、ペプチド又はタンパク質の生物学的半減期を延長するように調製することができる。
本明細書に開示されているプロドラッグは、最終的に、受容体により認識されうる構造に化学的に変換され、この化学変換の速度は、インビボでの生物学的作用の開始時間及び持続時間を決定する。本出願に開示された分子設計は、追加的な化学添加剤又は酵素に依存しないで、分子内化学反応に依存している。プロドラッグ化学は、脂肪族ヒドロキシル基が活性部位に収容されうる場合及び化学的に修飾された誘導体が活性の不十分なペプチド又はタンパク質を生じる場合、ペプチド及びタンパク質に基づいた薬剤に広く適用可能である。この点を例示する特定の例は、活性部位のセリンに、セリンプロテアーゼのファミリーの可逆セリンエステルを形成することである。
インスリンは、奇跡的なペプチドホルモンである。ほとんど全ての形態の糖尿病においてグルコースを低下する、比類のない能力を示す。残念ながら、その薬理学は、グルコース感受性ではなく、したがって、生命を脅かす低血糖症をもたらしうる過剰作用の能力がある。相反する薬理学は、インスリン治療の顕著な特徴であり、そのため、低血糖症を生じることなく血中グルコースを正常化することが極めて困難である。更に、天然インスリンは、作用の持続時間が短く、基礎グルコースの制御における使用に適するように修飾する必要がある。インスリン作用の開始を遅延する確立された手法には、溶解性の低減及びアルブミン結合が含まれる。プロドラッグ化学は、投与部位からのクリアランス及び高度に規定された濃度での血漿中の平衡化の後、インスリン作用の開始及び持続時間を正確に制御する機会を提供する。
インスリン構造機能関係を詳述する豊富な研究の歴史が、プロドラッグを成功裏に用いることができるアミノ酸の位置を導く。インスリンは、酵素プロセッシングを介して、低効力の単鎖プロインスリンから生合成的に誘導される二本鎖ヘテロ二量体である。ヒトインスリンは、ジスルフィド結合により一緒に結合し、合計で５１個のアミノ酸を有する、２つのペチド鎖（「Ａ鎖」（配列番号６１３）及び「Ｂ鎖」（配列番号６１４）から構成される。Ｂ鎖のＣ末端領域及びＡ鎖の２つの末端は、インスリン受容体への高親和性結合の部位を構築する三次元構造に関係する。ヒドロキシル基の選択的挿入は、この活性部位領域内の多数の位置で効力を失うことなく収容されうる。特定のジペプチドによるこれらの活性部位のヒドロキシル基の化学エステル化は、活性を著しく減少させ、適切なプロドラッグとして役立つ。
プレプログルカゴンは、１５８アミノ酸前駆体ポリペプチドであり、異なる組織においてプロセシングされて、グルコースホメオスタシス、インスリン分泌、胃排出及び腸管成長、並びに食物摂取の調節を含む多種多様な生理学的機能に関わる、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）及びオキシントモジュリン（ＯＸＭ）を含む多数の異なるプログルカゴン誘導ペプチドを形成する。グルカゴンは、プレプログルカゴンのアミノ酸３３から６１に対応する２９アミノ酸ペプチド（配列番号６１２）であり、一方、ＧＬＰ−１は、プレプログルカゴンのアミノ酸７２から１０８に対応する３７アミノ酸ペプチドとして産生される。ＧＬＰ−１（７−３６）アミド（配列番号６０２；Ｃ末端はアルギニンアミドである）又はＣＬＰ−１（７−３７）酸（配列番号６０１；Ｃ末端はグリシンである）は、ＧＬＰ受容体で実質的に同等の活性を示す、生物学的に活性のある形態のＧＬＰ−１である。
グルカゴンは、重篤な低血糖症の緊急の治療に使用される命を救う医薬である。オキシントモジュリンは、食欲を抑制し、体重を低下させる薬理学的能力を有することが報告されている。ＧＬＰ−１様アゴニストによる臨床研究は、このペプチドのファミリーがＩＩ型糖尿尿の有効な治療であることを実証している。加えて、このグルコース依存性作用のため、インスリン療法よりも本質的に安全であり、したがって低血糖症の可能性を排除しうる。構造活性関係研究は、これらの３つのペプチド（グルカゴン、ＧＬＰ−１及びオキシントモジュリン）のそれぞれのＮ末端ヒスチジンが、完全な作用のために特に重要であることを示し、Ｎ末端延長形態は、生物学的効力を激しく減少させることを示した。
これらの３つのペプチドの治療上の使用に関する一つの欠点は、これらの血漿における顕著に短い半減期（およそ２分間）である。したがって、妥当な血糖制御を得るために、天然グルカゴン関連類縁体ペプチドを、長期間連続的に投与する必要がある。短い半減期は、第２と第３のアミノ酸の間を切断するジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による急速な分解によりもたらされる。この切断は、天然ペプチドを不活性にするばかりでなく、グルカゴン及びＧＬＰ−１の場合では、短縮形態は、それらの対応する受容体において機能的アンタゴニストとなる。したがって、グルカゴン、ＧＬＰ−１及びオキシントモジュリン、並びの関連するペプチドの、これらの構造の薬剤作用の完全な治療可能性を実現する長期作用変種の必要性が存在する。
一つの実施態様によると、生体活性ポリペプチドのプロドラッグ誘導体は、好ましくは、エステル結合を介して生体活性ポリペプチドにジペプチドを共有結合させることによって調製される。一つの実施態様において、ジペプチドは、対応する受容体又は補助因子と相互作用する生体活性ポリペプチドの能力を妨げる位置で、生体活性ポリペプチドに共有結合する。続く、生理学的条件下及び酵素作用の不在下でのジペプチドの除去は、ポリペプチドの完全な活性を回復する。
一つの実施態様によると、式Ｉ：
Figure 2011511778
 の一般構造を含むプロドラッグが提供され、
式中、
Ｒ３は、ＮＨ２、アミノ酸配列及び下記：
Figure 2011511778
 からなる群より選択され、
Ｒ４は、−ＯＨ、ＮＨ２又はアミノ酸配列であり、
Ｒ１０は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル及び（ＣＨ２）ｎ（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）からなる群より選択され、
Ｗは、Ｃ６〜Ｃ１０アリール又は結合であり、
ｎは、０〜３の整数であり、
Ｒ１及びＲ２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２＋）ＮＨ２、（Ｃ４〜Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ９及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より独立して選択され、
Ｒ５は、ＯＨ又はＮＨ２であり、
Ｒ９は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、ＮＨ２又はＯＨであり、
Ｒ７は、−Ｏ−アミノ酸又はＯであり、
Ｒ１２は、−ＯＨ、Ｈか、又は下記：
Figure 2011511778
 であるが、
但し、Ｒ１２が下記：
Figure 2011511778
 である場合、Ｒ３は下記：
Figure 2011511778
 ではなく、
更に、Ｒ３が、ＮＨ２又はアミノ酸配列である場合、Ｒ１２は下記：
Figure 2011511778
 である。
幾つかの実施態様において、Ｒ３又はＲ４は、生体活性ペプチドのアミノ酸配列である。より特定の実施態様において、Ｒ３は、下記構造：
Figure 2011511778
 の側鎖を含む生体活性ペプチドのアミノ酸のＮ末端側のアミノ酸配列であり、そしてＲ４は、生体活性ペプチドのアミノ酸のＣ末端側のアミノ酸配列である。
幾つかの実施態様において、Ｒ３が下記：
Figure 2011511778
 であり、Ｒ７がＯ−アミノ酸である場合、Ｒ７は、下記構造：
Figure 2011511778
 の側鎖を含む生体活性ペプチドのアミノ酸のＮ末端側のアミノ酸配列であり、そしてＲ４は、生体活性ペプチドのアミノ酸のＣ末端側のアミノ酸配列である。
一つの実施態様において、Ｒ３は、下記：
Figure 2011511778
 であり、そしてＲ７及びＲ４は、グルカゴン、ＧＬＰ−１又はインスリンペプチドのアミノ酸配列を表す。
代替的な実施態様において、Ｒ３は、グルカゴン、ＧＬＰ−１又はインスリンペプチドのいずれかから選択されるＮ末端配列であり、Ｒ４は、グルカゴン、ＧＬＰ−１又はインスリンペプチドのいずれかから選択されるカルボキシ末端配列であり、そしてＲ１２は、下記：
Figure 2011511778
 である。
一つの実施態様によると、式ＩＩ：
Figure 2011511778
 の一般構造を含む、生体活性タンパク質のプロドラッグ誘導体が提供され、
式中、Ｒ３は、Ｈ又は生体活性タンパク質（例えば、グルカゴン、ＧＬＰ−１若しくはインスリンペプチド）のＮ末端アミノ酸であり、Ｒ４は、ＯＨ又は生体活性タンパク質（例えば、グルカゴン、ＧＬＰ−１若しくはインスリンペプチド）のＣ末端アミノ酸であり、Ｒ１０は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル及び（ＣＨ２）ｎ（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）からなる群より選択され、ｎは、０〜３の整数であり、
Ｒ１及びＲ２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２＋）ＮＨ２、（Ｃ４〜Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ９及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より独立して選択され、Ｒ５は、ＯＨ又はＮＨ２であり、そしてＲ９は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、ＮＨ２又はＯＨである。一つの実施態様において、Ｒ１は、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６アリール）及び（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ５〜Ｃ６ヘテロアリール）からなる群より選択され、Ｒ２は、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）Ｃ１〜Ｃ４アルキル、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６アリール）及び（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ５〜Ｃ６ヘテロアリール）からなる群より選択され、そしてＲ５は、ＯＨ又はＮＨ２である。
一つの実施態様において、ジペプチドは、セリン又はトレオニン残基のヒドロキシル基を介して生体活性ポリペプチドに結合している（すなわち、式ＩＩの化合物において、ｎは０であり、Ｒ１０はＨであるか、又はｎは０であり、Ｒ１はＣＨ３である）。より詳細には、修飾されたセリン又はトレオニン残基は、ジペプチド結合が、天然受容体又は基質と相互作用する生体活性ポリペプチドの能力を妨げるように、タンパク質結合ドメイン又は活性部位に配置されている。
式ＩＩの一般構造のプロドラッグに関して、Ｒ３又はＲ４の少なくとも一方は、生体活性ペプチドのアミノ酸を表す。幾つかの実施態様において、Ｒ３及びＲは、生体活性ペプチドのアミノ酸を表す。
幾つかの実施態様において、プロドラッグは、一般式Ａ−Ｂ−Ｑを含み、ここで、Ａは、Ｂに共有結合しているヒドロキシル酸又はアミノ酸であり、Ｂは、エステル結合を介してＱに共有結合しているアミノ酸であり、そしてＱは、生体活性ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質、例えばグルカゴンスーパーファミリーペプチド（例えば、グルカゴン関連類縁体ペプチド）であり、ＱからのＡ−Ｂの化学切断半減期（ｔ１／２）は、生理学的条件下、ＰＢＳ中で約１週間以下である。
一つの実施態様によると、一般構造Ａ−Ｂ−Ｑを含む非触媒自己切断複合体が提供され、ここで、Ｑは、既知の生体活性ペプチドであり、Ａ−Ｂは、ジペプチドを表す。より詳細には、Ａは、アミノ酸又はヒドロキシル酸のいずれかであることができ、Ｂは、アミノ酸である。ジペプチド（Ａ−Ｂ）は、対応する受容体又は補助因子と相互作用するＱの能力を妨げる位置で、エステル結合を介してＱに共有結合している。一つの実施態様において、Ｑは、生体活性ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質、例えばグルカゴン関連類縁体ペプチドのようなグルカゴンスーパーファミリーペプチドであり、そしてＡ−Ｂは、下記構造：
Figure 2011511778
 のジペプチドを表し、
式中、
Ｒ１及びＲ２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２＋）ＮＨ２、（Ｃ４〜Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ９及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より独立して選択され、
Ｒ５は、ＯＨ又はＮＨ２であり、
Ｒ９は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、ＮＨ２又はＯＨであり、そして
Ｒ７は、−Ｏ−アミノ酸又はＯである。
一つの実施態様において、一般構造Ａ−Ｂ−Ｑを有する複合体を含む注射用デポ組成物が提供され、ここで
Ａは、アミノ酸又はヒドロキシル酸であり、
Ｂは、エステル結合を介してＱに共有結合しているアミノ酸であり、そしてＱは、生体活性ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質、例えばグルカゴン関連類縁体ペプチドのようなグルカゴンスーパーファミリーペプチドであり、ジペプチドＡ−Ｂは、更に、Ａ又はＢの側鎖に結合しているデポ・ポリマーを含む。デポ・ポリマーは、複合体Ａ−Ｂ−Ｑが注射部位において有効に捕捉されているか、そうでなければその標的（例えば、受容体）と相互作用することができない十分な大きさであるように選択される。ＱからのＡ−Ｂの化学切断は、ジケトピペラジン又はジケトモルホリンを産生し、活性な生体活性ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を、投与後に所定の持続期間にわたって制御された方法で患者に放出する。
一つの実施態様によると、生体活性ペプチドは、インスリン、グルカゴン及びＧＬＰ−１、並びに前記ポリペプチドの誘導体から選択され、ここでポリペプチドの誘導体は、天然配列に対して１〜６個のアミノ酸置換を含む。置換するアミノ酸は、天然アミノ酸又は合成アミノ酸のいずれかであることができ、一つの実施態様において、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換を表す。
一つの実施態様において、プロドラッグは、式ＩＩＩ：
Figure 2011511778
 〔式中、Ｒ３は、生体活性タンパク質（例えば、グルカゴン、ＧＬＰ−１又はインスリンペプチド）のＮ末端アミノ酸を含み、Ｒ４は、生体活性タンパク質（例えば、グルカゴン、ＧＬＰ−１又はインスリンペプチド）のＣ末端アミノ酸を含み、Ｒ１及びＲ２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より独立して選択され、そしてＲ５は、ＯＨ又はＮＨ２である〕で示される一般構造を含み、ここで非酵素活性化ｔ１／２は、１〜１００時間であり、より典型的には、１２〜７２時間であり、一つの実施態様では、ｔ１／２は２４〜４８時間である。
一つの実施態様において、Ｒ１は、ＣＨ２（ＣＨ３）２、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ６ヘテロアリール）からなる群より選択され、Ｒ２は、Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ６ヘテロアリール）からなる群より選択され、そしてＲ５は、ＯＨ又はＮＨ２である。
プロドラッグが式ＩＩＩの一般構造を含む幾つかの実施態様において、Ｒ３は、下記構造：
Figure 2011511778
 の側鎖を含むアミノ酸のＮ末端側である、生体活性タンパク質のＮ末端側アミノ酸を含み、そしてＲ４は、前記アミノ酸のＣ末端側である、生体活性タンパク質のＣ末端側アミノ酸を含む。
プロドラッグが式Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩの一般構造を含む幾つかの態様において、生体活性ペプチド、生体活性ポリペプチド又は生体活性タンパク質は、グルカゴンスーパーファミリーペプチド（例えば、グルカゴン関連類縁体ペプチド）、オステオカルシン、インスリン、及び前記のうちの１つの類縁体、誘導体又は結合体からなる群より選択される。
幾つかの態様において、グルカゴンスーパーファミリーペプチドは、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ；配列番号６５７）、血管作用性小腸ペプチド（ＶＩＰ；配列番号６５８）、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド２７（ＰＡＣＡＰ−２７；配列番号６５９）、ペプチドヒスチジンメチオニン（ＰＨＭ；配列番号６６０）又はセクレチン（配列番号６６１）、グルカゴン（配列番号６１２）、エキセンディン−４（配列番号６６２）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）（配列番号６０１として提供されるアミノ酸７〜３７）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）（配列番号６６３）、ＧＩＰ（配列番号６６４）若しくはオキシントモジュリン（配列番号６６５）、及び前記のうちの１つの類縁体、誘導体、又は結合体からなる群より選択される。
プロドラッグが式Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩの一般構造を含む幾つかの態様において、グルカゴンスーパーファミリーペプチドは、グルカゴン関連類縁体ペプチドである。
一つの実施態様によると、インスリンのプロドラッグ誘導体が提供され、ここでインスリンプロドラッグは、配列番号６２６の配列を含むＡ鎖及び配列番号６２８の配列を含むＢ鎖を含み、下記の式：
Figure 2011511778
 のジペプチドは、配列番号６２６の１、４若しくは２１位又は配列番号６２８の１、５、１２若しくは２１位に配置されたアミノ酸の側鎖にエステル結合を介して結合しており、式中、Ｒ１及びＲ２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より独立して選択され、そしてＲ５は、ＯＨ又はＮＨ２である。
一つの実施態様によると、ＧＬＰ−１又はグルカゴンのプロドラッグ類縁体が提供され、ここでプロドラッグは、下記の一般式：
Ｒ３−Ｙ−Ｒ４
で示されるポリペプチドを含み、
式中、Ｙは、下記：
Figure 2011511778
 からなる群より選択される構造であり、
ｎは、０〜３から選択される整数であり、ｍは、１〜４から選択される整数であり、
Ｒ３は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｇ（配列番号６２１）及び下記：
Figure 2011511778
 からなる群より選択されるアミノ酸配列であり、
Ｘ１は、ヒスチジン、ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモ−ヒスチジン、チロシン及びフェニルアラニンからなる群より選択され、Ｘ２は、グリシン、アラニン、セリン、バリン、Ｄ−アラニン、アミノイソ酪酸、Ｎ−メチルアラニン、並びに同様の大きさの天然及び合成アミノ酸からなる群より選択され、Ｘ３は、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン及びアスパラギンからなる群より選択され、Ｘ４は、デスアミノヒスチジン、デスアミノホモ−ヒスチジン、デスアミノチロシン及びデスアミノフェニルアラニンからなる群より選択され、
Ｒ４は、下記：
ＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧ（配列番号６０３）、
ＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ−アミド（配列番号６０４）、
ＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＸ１４ＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−アミド（配列番号６０５）（ここでＸ１４は、Ａｒｇ又はＧｌｙである）、
ＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴ（配列番号６１８）及び
ＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−アミド（配列番号６２０）
からなる群より選択されるアミノ酸配列であり、
Ｒ５は、ＮＨ２又はＨＯであり、
Ｒ６は、Ｈであるか、又は下記：
Figure 2011511778
 であり、
Ｒ７は、Ｏ又はＯＸ４Ｘ２Ｘ３Ｇ（配列番号６３４）であり、
Ｒ１及びＲ２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より独立して選択され、そしてＲ５は、ＯＨ又はＮＨ２であるが、
但し、Ｒ３が下記：
Figure 2011511778
 である場合、Ｒ６はＨであり、Ｒ６が下記：
Figure 2011511778
 である場合、Ｒ３はＸ１Ｘ２Ｘ３Ｇ−（配列番号６２１）であり、
更に、Ｒ６がＨである場合、Ｒ３はＸ１Ｘ２Ｘ３Ｇ−（配列番号６２１）ではない。
一つの実施態様において、Ｒ１は、ＣＨ２（ＣＨ３）２、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より選択され、Ｒ２は、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）からなる群より選択され、そしてＲ５は、ＯＨ又はＮＨ２である。
一つの実施態様において、式ＩＩＩ：
Figure 2011511778
 の構造を含むＧＬＰ−１プロドラッグが提供され、
式中、
Ｒ３は、Ｒ５ＨＡＱＧ（配列番号６３９）、Ｒ５ＦＡＱＧ（配列番号６４０）、Ｒ５ＹＡＱＧ（配列番号６４１）からなる群より選択されるアミノ酸であり、
Ｒ４は、下記：
ＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧ（配列番号６０３）、
ＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ−アミド（配列番号６０４）及び
ＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＸ１４ＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−アミド（配列番号６０５）（ここでＸ１４は、Ａｒｇ又はＧｌｙである）
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、
Ｒ５は、ＮＨ２又はＨＯであり、そして
Ｒ１及びＲ２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より独立して選択され、そしてＲ５は、ＯＨ又はＮＨ２である。
一つの実施態様において、Ｒ１は、ＣＨ２（ＣＨ３）２、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ６ヘテロアリール）からなる群より選択され、Ｒ２は、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６アリール）からなる群より選択され、そしてＲ５は、ＯＨ又はＮＨ２である。
図１は、ＧＬＰ−１類縁体ＨＯ−ＦＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＸＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号６０７；ＨＯ−Ｆ７，ＧＬＰ（８−３６）−ＣＥＸ）を調製する合成スキームである。 図２は、ＧＬＰ−１（●）に対するＧＬＰ−１類縁体ＨＯ−Ｆ７，ＧＬＰ（８−３６）−ＣＥＸ（○）のバイオアッセイの結果を示すグラフである。 図３は、エステル結合したアミン求核剤ジペプチドプロドラッグを調製する合成スキームである。 図４は、エステル結合したヒドロキシル求核剤ジペプチドプロドラッグを調製する合成スキームである。 図５Ａ及び５Ｂは、アミン求核剤を有するプロドラッグによる（図５Ａ）及びヒドロキシル求核剤を有するプロドラッグによる（図５Ｂ）エステル結合の切断によって、活性化合物と、ジケトピペラジン又はジケトモルホリンをそれぞれ生じることを表す概略図である。 図６Ａ〜６Ｄは、４つのプロドラッグ（Ａ：ＨＯ−Ｆ５ｄＶ６−Ｏ−Ｆ７，ＧＬＰ（８−３６）−ＣＥＸ；６Ｂ：Ｆ５Ｖ６−Ｏ−Ｆ７，ＧＬＰ（８−３６）−ＣＥＸ；６Ｃ：ＨＯ−Ｆ５Ｆ６−Ｏ−Ｆ７，ＧＬＰ（８−３６）−ＣＥＸ及び６Ｄ：Ｇ５Ｖ６−Ｏ−Ｆ７，ＧＬＰ（８−３６）ＣＥＸ）の構造と、それぞれのｔ１／２時間を示す。 図７は、適切なＧＬＰ−１対照に対するＧ５Ｖ６−Ｏ−Ｆ７，ＧＬＰ（８−３６）ＣＥＸの相対的効力を経時的に示すバイオアッセイデータを表す棒グラフである。 図８は、適切なＧＬＰ−１対照に対するＨＯ−Ｆ５Ｆ６−Ｏ−Ｆ７，ＧＬＰ（８−３６）−ＣＥＸの相対的効力を経時的に示すバイオアッセイデータを表す棒グラフである。 図９は、ＧＬＰ−１（■）に対する内部セリン／トレオニンＧＬＰ誘導体（Ｆ７Ｑ９Ｓ１１ＧＬＰＣＥＸ◆及びＦ７Ｑ９Ｔ１１ＧＬＰＣＥＸ◇）のバイオアッセイの結果を示すグラフである。 図１０は、プロドラッグＦ７Ｑ９−Ｓ１１−（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）−ＧＬＰ−ＣＥＸの動力学的プロフィールを示す、プロドラッグと薬剤の経時的な濃度の対数をプロットしたグラフである。このデータは、経時的なプロドラッグ（◆）の消滅及び薬剤（□）の出現を示す。ここに示されている結果は、本明細書に開示されているプロドラッグの典型的なものである。 図１１Ａ〜１１Ｃは、（Ｈ７Ｆ），（Ｅ９Ｑ），［Ｔ１１Ｓ−Ｏβ−（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）］，ＧＬＰ（８−３６）−ＣＥＸの合成の合成スキームを提示する。 図１２は、ＤＩＯマウスにおけるグルコース注射の後の、ＰＢＳビヒクル、ＧＬＰ−１に基づいたペプチド（ペプチドＢ又はＤを２nmol/kg）又は２つの異なるＧＬＰ−１に基づいたペプチドのプロドラッグ（ペプチドＡ、Ｃ又はＥを２nmol/kg）の注射に対する反応の時間（分）の関数としての血中グルコース（mg/dl）のグラフを表す。 図１３は、ＤＩＯマウスにおけるグルコース注射の後の、ＰＢＳビヒクル、ＧＬＰ−１に基づいたペプチド（ペプチドＦを２nmol/kg）又は２つの異なるＧＬＰ−１に基づいたペプチドのプロドラッグ（ペプチドＧ又はＨを２nmol/kg）の注射に対する反応の時間（分）の関数としての血中グルコース（mg/dl）のグラフを表す。 図１４は、ＤＩＯマウスにおけるグルコース注射の後の、ＰＢＳビヒクル、ＧＬＰ−１に基づいたペプチド（ペプチドＤ又はＦを０．６７nmol/kg）又はＧＬＰ−１に基づいたペプチドのプロドラッグ（ペプチドＥ又はＧを０．６７nmol/kg）の注射に対する反応の時間（分）の関数としての血中グルコース（mg/dl）のグラフを表す。 図１５は、ＤＩＯマウスにおけるグルコース注射の後の、ビヒクル対照、ＧＬＰ−１に基づいたペグ化ペプチドの１５又は７０nmol/kg（ペプチドＹ及びＦ−Ｐｅｇ）又はＧＬＰ−１に基づいたペプチドのプロドラッグの１５又は７０nmol/kg（ペプチドＺ又はＧ−Ｐｅｇ）の注射に対する反応の時間（分）の関数としての血中グルコース（mg/dl）のグラフを表す。 図１６は、ビヒクル対照、ＧＬＰ−１に基づいたペグ化ペプチドの１５又は７０nmol/kg（ペプチドＹ及びＦ−Ｐｅｇ）又はＧＬＰ−１に基づいたペプチドのプロドラッグの１５又は７０nmol/kg（ペプチドＺ又はＧ−Ｐｅｇ）を注射したＤＩＯマウスの体重の総変化のグラフを表す。 図１７は、ビヒクル対照、ＧＬＰ−１に基づいたペグ化ペプチドの１５又は７０nmol/kg（ペプチドＹ及びＦ−Ｐｅｇ）又はＧＬＰ−１に基づいたペプチドのプロドラッグの１５又は７０nmol/kg（ペプチドＺ又はＧ−Ｐｅｇ）を注射したＤＩＯマウスの総食餌摂取のグラフを表す。 図１８は、特定のグルカゴンスーパーファミリーペプチドのアミノ酸配列の整列である。
〔定義〕
本発明を記載し、請求するに際し、以下の用語を下記に記載した定義に従って使用する。
本明細書で使用されるとき、用語「プロドラッグ」は、その薬理学的効果を示す前に生体内変化を受ける任意の化合物と定義される。
「生体活性ポリペプチド」は、生物学的効果をインビトロ及び／又はインビボで発揮することができるポリペプチドを意味する。
本明細書で使用されるとき、あるペプチドに対する一般的な参照は、修飾されたアミノ及びカルボキシ末端を有するペプチドも包含することが意図される。例えば、末端カルボン酸の代わりにアミノ基を含むアミノ酸鎖は、標準的なアミノ酸を示すアミノ酸配列に包含されることが意図される。本明細書で使用されるとき、用語「Ｏ−アミノ酸」又は「ＨＯ−アミノ酸」は、アミノ酸又はアミノ酸配列のＮ末端の天然アミノ基が、酸素基又はヒドロキシル基にそれぞれ置換されているアミノ酸を示す。例えば、「Ｏ−ＨＡＥＧ」又は「ＨＯ−ＨＡＥＧ」は、Ｎ末端の天然アミノ基が、酸素基又はヒドロキシル基にそれぞれ置換されているアミノ酸配列（ＨＡＥＧ）を示すことが意図される。本明細書で使用されるとき、用語「ヒドロキシル酸」又は「ヒドロキシル酸」は、天然アルファアミノ基がヒドロキシル基で置換されているアミノ酸を意味する。同様に、名称「−アミノ酸−アミド」は、天然カルボキシ基がアミド基で置換されているアミノ酸配列を表す。
立体化学を特定していないアミノ酸の名称は、アミノ酸又はラセミ混合物のＬ又はＤ型のいずれも包含することが意図される。
本明細書で使用されるとき、用語「薬学的に許容される担体」には、リン酸緩衝食塩水、水、油／水又は水／油乳剤のような乳剤、並びに多様な種類の湿潤剤のような標準的な医薬担体のいずれかが含まれる。この用語は、また、ヒトを含む動物における使用が米国連邦政府の規制当局により承認されているか又は米国薬局方に記載されている作用物質のいずれかを包含する。
本明細書で使用されるとき、用語「薬学的に許容される塩」は、母体化合物の生物学的活性を保持し、生物学的にも非生物学的にも有害ではない化合物の塩を意味する。本明細書に開示されている化合物の多くは、アミノ及び／若しくはカルボキシル基又は同様の基の存在によって酸性及び／又は塩基性の塩を形成することができる。
薬学的に許容される塩基性付加塩は、無機又は有機塩基から調製することができる。無機塩基から誘導される塩には、単なる例として、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム及びマグネシウム塩が含まれる。有機塩基から誘導される塩には、第一級、第二級及び第三級アミンの塩が含まれるが、これらに限定されない。
薬学的に許容される酸性付加塩は、無機又は有機塩基から調製することができる。無機酸から誘導される塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などが含まれる。有機酸から誘導される塩には、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などが含まれる。
本明細書で使用されるとき、用語「治療する」には、特定の障害若しくは状態を予防すること、又は特定の障害若しくは状態に関連する症状を緩和すること、及び／又は前記症状を防止若しくは排除することが含まれる。例えば、本明細書で使用されるとき、用語「糖尿病を治療する」は、一般に血中グルコースレベルをほぼ正常なレベルに維持することを意味し、所定の状態に応じて血中グルコースレベルを増加又は減少することを含むことができる。
本明細書で使用されるとき、プロドラッグの「有効」量又は「治療有効量」は、所望の効果をもたらすプロドラッグの非毒性であるが十分な量を意味する。例えば、一つの望ましい効果は、高血糖症の予防又は治療である。「有効」である量は、個体の年齢及び全身状態、投与様式などによって被験者毎に変わる。したがって、正確な「有効量」を規定することがいつも可能というわけではない。しかし、個別の症例における適切な「有効」量は、慣用的な実験を使用して当業者によって決定することができる。
用語「非経口的」は、消化管を介するのではなく、皮下、筋肉内、脊髄内又は静脈内のような他の経路によることを意味する。
用語「グルカゴンスーパーファミリーペプチド」は、Ｎ末端及びＣ末端領域の構造に関連するペプチド群を意味する（例えば、Sherwood et al., Endocrine Reviews 21: 619-670 (2000)を参照すること）。この群のメンバーには、全てのグルカゴン関連類縁体ペプチド、また、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ；配列番号６５７）、血管作用性小腸ペプチド（ＶＩＰ；配列番号６５８）、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド２７（ＰＡＣＡＰ−２７；配列番号６５９）、ペプチドヒスチジンメチオニン（ＰＨＭ；配列番号６６０）及びセクレチン（配列番号６６１）、並びに天然ペプチドに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個までのアミノ酸修飾を有するそれらの類縁体、誘導体又は結合体が含まれる。グルカゴンスーパーファミリーペプチドは、好ましくは、対応する受容体と相互作用する能力を保持する。例えば、グルカゴン、並びにグルカゴン類縁体、誘導体及び結合体は、好ましくは、グルカゴン受容体と相互作用する能力を保持する。
特に記述のない限り、グルカゴンスーパーファミリーペプチドにおける、あるアミノ酸位置（例えば、プロドラッグ部分、結合体部分、親水性ポリマーの結合、アシル化又はアルキル化、アミノ酸修飾などのための）に対するあらゆる参照は、天然グルカゴンアミノ酸配列（配列番号６１２）を基準とする位置を参照し、代表的なグルカゴンスーパーファミリーペプチドの整列については、図１８を参照すること。
用語「グルカゴン関連類縁体ペプチド」は、グルカゴン、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２及びＧＩＰ受容体の１つ以上のいずれかにおいて生物学的活性（アゴニスト又はアンタゴニストとして）を有し、天然グルカゴン（配列番号６１２）、天然オキシントモジュリン（配列番号６６５）、天然エキセンディン−４（配列番号６６２）、天然ＧＬＰ−１（配列番号６０１及び６０２）、天然ＧＬＰ−２（配列番号６６３）又は天然ＧＩＰ（配列番号６６４）のうちの少なくとも１つと、少なくとも４０％の配列同一性（例えば、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％）を共有するアミノ酸を含む、ペプチドを意味する。特に記述のない限り、グルカゴン関連類縁体ペプチドにおける、あるアミノ酸位置（例えば、プロドラッグ部分、結合体部分、親水性ポリマーの結合、アシル化又はアルキル化、アミノ酸修飾などのための）に対するあらゆる参照は、天然グルカゴンアミノ酸配列（配列番号６１２）を基準とする位置を意味する。
本明細書で使用されるとき、用語「同一性」は、２つ以上の配列の類似性に関する。同一性は、同一の残基の数を残基の総数で割り、積に１００を掛けて百分率を得ることによって測定される。したがって、全く同じ配列の２つのコピーが１００％の同一性を有し、互いにアミノ酸欠失、付加又は置換を有する２つの配列は、低い程度の同一性を有する。
当業者は、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool, Altschul et al. (1993) J. MoI. Biol. 215:403-410）のようなアルゴリズムを用いるもののような幾つかのコンピュータープログラムが配列同一性の決定のために利用可能なことを認識している。
用語「ＧＬＰ−１アゴニスト」は、実施例２に記載されているような検証済インビトロモデルアッセイを使用したｃＡＭＰ産生により測定されるＧＬＰ−１受容体活性を刺激する化合物を意味する。
本明細書で使用されるとき、用語「天然ＧＬＰ−１」は、ＧＬＰ−１（７−３６）アミド（配列番号６０２の配列から構成される）、ＧＬＰ−１（７−３７）酸（配列番号６０１の配列から構成される）又はこれらの２つの化合物の混合物を示す総称である。本明細書で使用されるとき、更なる名称が不在なときの「ＧＬＰ−１」への一般的な参照は、それぞれ天然ＧＬＰ−１を意味することが意図される。
本明細書で使用されるとき、用語「グルカゴンペプチド」は、配列番号６１２の天然グルカゴンペプチドを示すとともに、配列番号６１２の配列に対して１、２、５、７、８、１０、１２、１３、１４、１６、１７、１８、２４、２８及び２９位のアミノ酸位置で１つ以上のアミノ酸置換を有する、修飾された誘導体をも示す総称である。
本明細書で使用されるとき、用語「ＧＬＰ−１ペプチド」は、天然ＧＬＰ−１を示すとともに、天然ＧＬＰ−１配列に対して１、２、５、７、８、１０、１２、１３、１４、１６、１７、１８、２４、２８及び２９位のアミノ酸位置で１つ以上のアミノ酸置換を有する修飾された誘導体をも示す総称である。
本明細書で使用されるとき、用語「インスリンペプチド」は、配列番号６１３のＡ鎖及び配列番号６１４のＢ鎖、並びに、Ａ５、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１２、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８、Ａ２１、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１３、Ｂ１４、Ｂ１７、Ｂ２０、Ｂ２１、Ｂ２２、Ｂ２３、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９及びＢ３０から選択される位置で１つ以上のアミノ酸置換又はＢ１〜５及びＢ２６〜３０のいずれか若しくは全ての位置で欠失を有するＡ鎖及び／又はＢ鎖の修飾誘導体を含む、５１アミノ酸二量体を示す総称である。
本明細書で使用されるとき、アミノ酸「修飾」は、アミノ酸の置換、付加又は欠失を意味し、ヒトタンパク質において一般的に見出される２０個のアミノ酸に加え、異形又は非天然のアミノ酸のいずれかによる、置換又は付加が含まれる。異形アミノ酸の商業供給源には、Sigma-Aldrich（Milwaukee, WI）、ChemPep Inc.（Miami, FL）及びGenzyme Pharmaceuticals（Cambridge, MA）が含まれる。異形アミノ酸を、商業供給者から購入する、新規に合成する又は天然アミノ酸から化学的に修飾する若しくは誘導体化することができる。
本明細書で使用されるとき、アミノ酸「置換」は、１個のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基に代えることを意味する。
本明細書で使用されるとき、用語「保存的アミノ酸置換」は、以下の５つの群の１つの範囲内の交換として本明細書において定義される：
Ｉ．小型で脂肪族の非極性又は僅かに極性の残基：
Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ；
ＩＩ．極性の負荷電残基及びそれらのアミド：
Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ；
ＩＩＩ．極性の正荷電残基：
Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、オルニチン（Ｏｒｎ）；
ＩＶ．大型で脂肪族の非極性残基：
Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ホモシステイン；
Ｖ．大型の芳香族残基：
Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、アセチルフェニルアラニン。
本明細書で使用されるとき、総称「ポリエチレングリコール鎖」又は「ＰＥＧ鎖」は、一般式：Ｈ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ（ｎは９以上）により表される、分岐鎖又は直鎖の、エチレンオキシドと水の縮合ポリマーの混合物を意味する。更なる特定がない限り、この用語は、５００〜８０，０００ダルトンの範囲から選択される平均総分子量を有するエチレングリコールのポリマーを含むことが意図される。「ポリエチレングリコール鎖」又は「ＰＥＧ鎖」を数字の接尾辞と組み合わせて使用して、およその平均分子量を示す。例えば、ＰＥＧ−５，０００は、平均約５，０００ダルトンの総分子量を有するポリエチレングリコール鎖を意味する。
本明細書で使用されるとき、用語「ペグ化」及び同様の用語は、ポリエチレングリコール鎖を化合物に結合することにより天然の状態が修飾された化合物を意味する。「ペグ化ポリペプチド」は、共有結合しているＰＥＧ鎖を有するポリペプチドである。
本明細書で使用されるとき、「リンカー」は、２つの別々の実体を互いに結合する結合、分子又は分子群である。リンカーは、２つの実体に最適な間隔をもたらしてもよいし、更に２つの実体が互いに分離することを可能にする不安定な結合を提供してもよい。不安定な結合には、光切断基、酸不安定部分、塩基不安定部分及び酵素切断基が含まれる。
本明細書で使用される「二量体」は、リンカーを介して互いに共有結合している２つのサブユニットを含む複合体である。二量体という用語は、意味を限定する言葉がなく使用される場合、ホモ二量体とヘテロ二量体の両方を包含する。ホモ二量体は、２つの同一のサブユニットを含み、一方、ヘテロ二量体は、異なる２つのサブユニットを含むが、２つのサブユニットは、実質的に互いに類似している。
本明細書で使用されるとき、用語「Ｃ１〜Ｃｎアルキル」（ここでｎは１〜６であることができる）は、１個から特定の個数までの炭素原子を有する分岐鎖又は直鎖のアルキル基を表す。典型的なＣ１〜Ｃ６アルキル基には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ペンチル、ヘキシルなどが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、用語「Ｃ２〜Ｃｎアルケニル」（ここでｎは２〜６であることができる）は、２個から特定の個数までの炭素原子及び少なくとも１つの二重結合を有するオレフィン性不飽和の分岐鎖又は直鎖基を表す。そのような基の例には、１−プロペニル、２−プロペニル（−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、１，３−ブタジエニル（−ＣＨ＝ＣＨＣＨ＝ＣＨ２）、１−ブテニル（−ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ３）、ヘキセニル、ペンテニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
用語「Ｃ２〜Ｃｎアルキニル」（ここでｎは２〜６であることができる）は、２からｎ個の炭素原子及び少なくとも１つの三重結合を有する不飽和の分岐鎖又は直鎖基を意味する。そのような基の例には、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−ペンチニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、用語「アリール」は、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、インデニルなどが含まれるが、これらに限定されない、１又は２つの芳香族環を有する単環式又は二環式の炭素環系を意味する。アリール環の大きさ及び置換基又は結合基の存在は、存在する炭素の数を示すことによって示される。例えば、用語「（Ｃ１〜Ｃ３アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）」は、１員〜３員のアルキル鎖を介して母体部分に結合している５員〜１０員アリールを意味する。
本明細書で使用されるとき、用語「ヘテロアリール」は、１又は２つの芳香族環を含有し、芳香族環に少なくとも１個の窒素、酸素又は硫黄原子を含有する、単環式又は二環式の環系を意味する。ヘテロアリール環の大きさ及び置換基又は結合基の存在は、存在する炭素の数を示すことによって示される。例えば、用語「（Ｃ１〜Ｃｎアルキル）（Ｃ５〜Ｃ6ヘテロアリール）」は、１員から「ｎ」員のアルキル鎖を介して母体部分に結合している５員又は６員ヘテロアリールを意味する。
本明細書で使用されるとき、用語「荷電アミノ酸」は、生理学的ｐＨの水溶液中に負に荷電（すなわち、脱プロトン化）している、又は正に荷電（すなわち、プロトン化）している側鎖を含むアミノ酸を意味する。例えば、負荷電アミノ酸には、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン酸、ホモシステイン酸及びホモグルタミン酸が含まれ、一方、正荷電アミノ酸には、アルギニン、リシン及びヒスチジンが含まれる。荷電アミノ酸には、ヒトタンパク質において一般的に見出される２０個のアミノ酸、また異形又は非天然のアミノ酸のうちの荷電アミノ酸が含まれる。
本明細書で使用されるとき、用語「酸性アミノ酸」は、例えばカルボン酸又はスルホン酸基のような第２の酸性部分を含むアミノ酸を意味する。
本明細書で使用されるとき、用語「患者」は、更なる指定のない限り、任意の家畜化された温血脊椎動物（例えば、家畜類、ウマ、ネコ、イヌ及び他のペット類が含まれるが、これらに限定されない）並びにヒトを包含することが意図される。
〔実施態様〕
本開示は、既知の生体活性ポリペプチドのプロドラッグ誘導体の製剤を記載する。より詳細には、本明細書に開示されるプロドラッグは、母体生体活性ペプチド又はタンパク質の半減期を増強しながら、同時に、非酵素分解機構を介したプロドラッグの活性化を可能にするように配合される。理想的なプロドラッグは、生理学的条件下（例えば、ｐＨ７．２及び３７℃）において水に溶解性であるべきであり、長期保存において粉末形態で安定するべきである。また、免疫学的に無症状であり、母体薬剤と比べて低い活性を示すべきである。典型的には、プロドラッグは、母体薬剤の活性の１０％未満を示し、一つの実施態様において、プロドラッグは、母体薬剤と比べて１０％未満、５％未満、約１％又は１％未満の活性を示す。更に、体内に注射されたとき、プロドラッグは、確定された時間内に活性薬剤に定量的に変換されるべきである。本明細書に開示されているように、出願人たちは、それぞれの目的を満たす既知の生体活性ポリペプチドのプロドラッグを製造する一般的技術を提供する。
より詳細には、エステル結合を介して生体活性ポリペプチドに共有結合しているジペプチドを有するように修飾された既知の生体活性ポリペプチドの配列を含む化学可逆性プロドラッグが、提供される。一つの実施態様において、生理学的条件下で非酵素活性化半減時間（ｔ１／２）の１〜１００時間を有するプロドラッグが提供される。本明細書に開示されている生理学的条件は、約３５〜４０℃の温度、約７．０〜約７．４のｐＨを含むこと、より典型的には７．２〜７．４のｐＨ及び３６〜３８℃の温度を含むことが意図される。
有利なことには、切断の速度、したがってプロドラッグの活性化の速度は、ジペプチドプロ部分の構造及び立体化学、また求核剤の強度によって決まる。本明細書に開示されているプロドラッグは、最終的に、薬剤の天然受容体により認識されうる構造に化学的に変換され、この化学変換の速度は、インビボでの生物学的作用の開始時間及び持続時間を決定する。本出願に開示された分子設計は、追加的な化学添加剤又は酵素に依存しないで、分子内化学反応に依存している。変換の速度は、ジペプチド置換基の化学的性質及び生理学的条件下でのその切断により制御される。生理学的ｐＨ及び温度は高度に確定された範囲内で厳しく規定されているので、プロドラッグから薬剤への変換速度は、患者内及び患者間で高度な再現性を示す。
本明細書に開示されているように、生体活性ポリペプチドが半減期を少なくとも１時間、より典型的には２０時間を超えるが１００時間未満延長し、固有の化学不安定性により駆動される非酵素反応を介して生理学的条件下で活性形態に変換される、プロドラッグが提供される。一つの実施態様において、プロドラッグの非酵素活性化ｔ１／２時間は、１〜１００時間、より典型的には１２〜７２時間であり、一つの実施態様では、ｔ１／２は、３７℃及びｐＨ７．２でリン酸緩衝溶液（例えば、ＰＢＳ）においてプロドラッグをインキュベートすることにより測定すると、２４〜４８時間である。多様なプロドラッグの半減期は、式：ｔ１／２＝．６９３／ｋを使用して計算され、ここで「ｋ」は、プロドラッグの分解の一次反応速度定数である。一つの実施態様において、プロドラッグの活性化は、エステル結合で結合したジペプチドの切断と、ジケトピペラジン又はジケトモルホリン及び活性な生体活性ポリペプチドの形成の後で生じる（図５Ａ及び５Ｂを参照すること）。天然又は合成アミノ酸から構成される特定のジペプチドは、生理学的条件下で分子内分解を促進して生体活性ペプチドを放出することが確認されている。
プロドラッグ化学は、脂肪族ヒドロキシル基が活性部位に収容されうる場合及び化学的に修飾された誘導体が活性の不十分な（例えば、母体に対して１０％以下の活性を有する）ペプチド又はタンパク質を生じる場合、ペプチド及びタンパク質に基づいた薬剤に広く適用可能である。この点を例示する特定の例は、活性部位のセリンに、セリンプロテアーゼのファミリーの可逆セリンエステルを形成することである。このプロドラッグ技術を用いることができる医学的に重要なペプチド及びタンパク質には、インスリン、グルカゴン及びグルカゴン関連ペプチド（ＧＬＰ、オキシントモジュリン）、ガストリン阻害ペプチド（ＧＩＰ）、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、カルシトニン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）、膵ポリペプチド（ＰＰ）、並びに関連する物質が含まれるが、これらに限定されない。このプロドラッグ技術を用いることができる医学的に重要なタンパク質には、成長ホルモン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、好中球刺激成長因子（ＣＧＳＦ）、インターフェロン、血液凝固酵素、抗体、レプチンなどが含まれるが、これらに限定されない。一つの実施態様によると、グルカゴン、インスリン、ＧＬＰ−１のプロドラッグ又はグルカゴン、インスリン若しくはＧＬＰ−１の修飾誘導体が提供される。本明細書で使用されるとき、グルカゴン、インスリン又はＧＬＰ−１の修飾誘導体には、例えば、１、２、３、４，５又は６個のアミノ酸置換によってグルカゴン、インスリン又はＧＬＰそれぞれの天然配列と異なるポリペプチドが含まれる。
一つの実施態様によると、例えばセリン若しくはトレオニン残基の側鎖を有するヒドロキシル又はＮ末端ヒドロキシル化アミノ酸（ＨＯ−アミノ酸）のヒドロキシル基を含む、生体活性ペプチド又はタンパク質の脂肪族ヒドロキシル基は、下記の基：
Figure 2011511778
 の、エステル結合を介した生体活性ポリペプチドへの共有結合により改質されており、式中、Ｒ１及びＲ２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２＋）ＮＨ２、（Ｃ４〜Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ９及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より独立して選択され、そしてＲ５は、ＯＨ又はＮＨ２である。
幾つかの実施態様において、生体活性ペプチドは、グルカゴンスーパーファミリーペプチド（例えば、グルカゴン関連類縁体ペプチド）、オステオカルシン又は前記のうちの１つの類縁体、誘導体若しくは結合体である。
一つの実施態様において、生体活性タンパク質は、ＧＬＰ−１又はインスリンである。
一つの実施態様において、Ｒ１及びＲ２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より独立して選択され、そしてＲ５は、ＯＨ又はＮＨ２である。一つの実施態様において、Ｒ１は、ＣＨ２（ＣＨ３）２、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より選択され、Ｒ２は、Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より選択され、そしてＲ５は、ＯＨ又はＮＨ２である。
一つの実施態様によると、式Ｉ：
Figure 2011511778
 の一般構造を含むプロドラッグが提供され、
式中、Ｒ３は、ＮＨ２、ＨＯ−、アミノ酸配列及び下記：
Figure 2011511778
 からなる群より選択され、
Ｒ４は、−ＯＨ、ＮＨ２又はアミノ酸配列であり、
Ｒ１０は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル及び（ＣＨ２）ｎ（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）からなる群より選択され、
Ｗは、Ｃ６〜Ｃ１０アリール又は結合であり、
ｎは、０〜３の整数であり、
Ｒ１及びＲ２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２＋）ＮＨ２、（Ｃ４〜Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ９及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より独立して選択され、
Ｒ５は、ＯＨ又はＮＨ２であり、
Ｒ９は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、ＮＨ２又はＯＨであり、
Ｒ７は、−Ｏ−アミノ酸又はＯであり、
Ｒ１２は、−ＯＨであるか、又は下記：
Figure 2011511778
 であるが、
但し、Ｒ１２が下記：
Figure 2011511778
 である場合、Ｒ３は、下記：
Figure 2011511778
 ではなく、
更にＲ３が、ＮＨ２又はアミノ酸配列である場合、Ｒ１２は、下記：
Figure 2011511778
 である。
幾つかの実施態様において、Ｒ３又はＲ４は、生体活性ペプチドのアミノ酸配列である。より特定の実施態様において、Ｒ３は、下記構造：
Figure 2011511778
 の側鎖を含む生体活性ペプチドのアミノ酸のＮ末端側のアミノ酸配列であり、そしてＲ４は、生体活性ペプチドのアミノ酸のＣ末端側のアミノ酸配列である。
幾つかの実施態様において、Ｒ３が下記：
Figure 2011511778
 であり、Ｒ７がＯ−アミノ酸である場合、Ｒ７は、下記構造：
Figure 2011511778
 の側鎖を含む生体活性ペプチドのアミノ酸のＮ末端側のアミノ酸配列であり、そしてＲ４は、生体活性ペプチドのアミノ酸のＣ末端側のアミノ酸配列である。
一つの実施態様において、Ｒ３は、下記：
Figure 2011511778
 であり、そしてＲ７及びＲ４は、グルカゴン、ＧＬＰ−１又はインスリンペプチドのアミノ酸配列を表す。
代替的な実施態様において、Ｒ３は、グルカゴン、ＧＬＰ−１又はインスリンペプチドのいずれかから選択されるＮ末端配列であり、Ｒ４は、グルカゴン、ＧＬＰ−１又はインスリンペプチドのいずれかから選択されるカルボキシ末端配列であり、そしてＲ１２は、下記：
Figure 2011511778
 である。
一つの実施態様によると、式ＩＩ：
Figure 2011511778
 の一般構造を含む生体活性タンパク質のプロドラッグ誘導体が提供され、
式中、Ｒ３は、Ｈ又は生体活性タンパク質（例えば、グルカゴン、ＧＬＰ−１若しくはインスリンペプチド）のＮ末端アミノ酸であり、Ｒ４は、ＯＨ又は生体活性タンパク質（例えば、グルカゴン、ＧＬＰ−１若しくはインスリンペプチド）のＣ 末端アミノ酸を表し、Ｒ１０は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル及び（ＣＨ２）ｎ（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）からなる群より選択され、ｎは、０〜３の整数であり、
Ｒ１及びＲ２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２＋）ＮＨ２、（Ｃ４〜Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ９及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より独立して選択され、Ｒ５は、ＯＨ又はＮＨ２であり、そしてＲ９は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、ＮＨ２又はＯＨである。
一つの実施態様において、Ｒ１は、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６アリール）及び（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より選択され、Ｒ２は、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）Ｃ１〜Ｃ４アルキル、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６アリール）及び（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より選択され、そしてＲ５は、ＯＨ又はＮＨ２である。
一つの実施態様において、ジペプチドは、セリン又はトレオニン残基のヒドロキシル基を介して生体活性ポリペプチドに結合している（すなわち、式ＩＩＩの化合物において、ｎは０であり、Ｒ１０はＨであるか、又はｎは０であり、Ｒ１０はＣＨ３である）。より詳細には、修飾されたセリン又はトレオニン残基は、ジペプチドの結合が、天然受容体又は基質と相互作用する生体活性ポリペプチドの能力を妨げるように、タンパク質結合ドメイン又は活性部位に配置されている。
式ＩＩの一般構造のプロドラッグに関して、Ｒ３又はＲ４の少なくとも一方は、生体活性ペプチドのアミノ酸を表す。幾つかの実施態様において、Ｒ３及びＲ４は、生体活性ペプチドのアミノ酸を表す。
一つの実施態様によると、式ＩＩの一般構造を有するポリペプチドが提供され、式中、Ｒ３は、Ｈ及びアミノ酸配列からなる群より選択され、
Ｒ４は、−ＯＨ又はアミノ酸配列であり、
Ｒ１０は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル及び（ＣＨ２）ｎ（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）からなる群より選択され、ｎは、０〜３の整数であり、
Ｒ１は、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６アリール）及び（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ５〜Ｃ６ヘテロアリール）からなる群より選択され、
Ｒ２は、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）Ｃ１〜Ｃ４アルキル、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６アリール）及び（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ５〜Ｃ６ヘテロアリール）からなる群より選択され、そしてＲ５は、ＯＨ又はＮＨ２である。
更なる実施態様において、Ｒ１０はＨであり、そしてｎは０である。
一つの実施態様によると、式ＩＶ：
Figure 2011511778
 の一般構造を有するプロドラッグが提供され、
式中、Ｒ３は、Ｈか又は生体活性ポリペプチドに存在するセリン／トレオニン残基（天然のものか又はアミノ酸置換として）の上流に配置されている生体活性タンパク質のＮ末端アミノ酸であり、Ｒ４は、ＯＨか又は生体活性ポリペプチド（酸又はアミド）に存在するセリン／トレオニン残基（天然のものか又はアミノ酸置換として）の下流に配置されている生体活性タンパク質のＣ末端アミノ酸であり、Ｒ１０は、Ｈ又はＣＨ３であり、前記生体活性タンパク質内に配置されているセリン／トレオニン部分は、下記の基：
Figure 2011511778
 の共有結合により修飾されており、
Ｒ１及びＲ２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２＋）ＮＨ２、（Ｃ４〜Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ９及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より独立して選択され、
Ｒ５は、ＯＨ又はＮＨ２であり、
Ｒ９は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、ＮＨ２又はＯＨである。
一つの実施態様において、Ｒ１は、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）及び（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より選択され、Ｒ２は、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）Ｃ１〜Ｃ４アルキル、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）及び（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より選択され、そしてＲ５は、ＯＨ又はＮＨ２である。一つの実施態様において、修飾のために選択されたセリン又はトレオニン残基は、ジペプチドの結合が、天然受容体又は基質と相互作用する生体活性ポリペプチドの能力を妨げるように、タンパク質結合ドメイン又は活性部位に配置されている。
式ＩＩ又は式ＩＶの一般構造を含むプロドラッグに関して、Ｒ３又はＲ４の少なくとも一方は、生体活性ペプチドのアミノ酸を表す。幾つかの実施態様において、Ｒ３及びＲは、両方とも生体活性ペプチドのアミノ酸を表す。幾つかの実施態様において、Ｒ３は、下記構造：
Figure 2011511778
 の側鎖を含む生体活性ペプチドのアミノ酸のＮ末端側のアミノ酸配列であり、そしてＲ４は、生体活性ペプチドのアミノ酸のＣ末端側のアミノ酸配列である。
一つの実施態様によると、生体活性ポリペプチドは、インスリン、グルカゴン、ＧＬＰ−１及びこれらのポリペプチドの誘導体から選択され、ここで誘導体は、天然配列に対して１、２、３、４、５又は６個のアミノ酸が異なっている。一つの実施態様において、インスリン、グルカゴン、ＧＰＬ−１誘導体は、天然の配列と、１、２、３、４、５又は６個の保存的アミノ酸置換によって異なっている。
一つの実施態様において、プロドラッグは、式ＩＩＩ：
Figure 2011511778
 〔式中、Ｒ３は、生体活性タンパク質の天然のＮ末端アミノ酸を含み、Ｒ４は、生体活性タンパク質の天然のＣ末端アミノ酸を含み、Ｒ１及びＲ２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）2、ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より独立して選択され、そしてＲ５は、ＯＨ又はＮＨ２である〕で示される一般構造を含み、ここで非酵素活性化ｔ１／２は、１〜１００時間である。一つの実施態様において、プロドラッグのｔ１／２は、２０〜７０時間である。
一つの実施態様において、Ｒ１は、ＣＨ２（ＣＨ３）２、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ６ヘテロアリール）からなる群より選択され、Ｒ２は、Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ６ヘテロアリール）からなる群より選択され、そしてＲ５は、ＯＨ又はＮＨ２である。
プロドラッグが式ＩＩＩの一般構造を含む幾つかの実施態様において、Ｒ３は、下記構造：
Figure 2011511778
 の側鎖を含む生体活性タンパク質のアミノ酸のＮ末端側のＮ末端アミノ酸を含み、そしてＲ４は、生体活性タンパク質のアミノ酸のＣ末端側のＣ末端アミノ酸を含む。
一つの実施態様によると、生体活性ポリペプチドは、インスリン、グルカゴン、ＧＬＰ−１、並びにインスリン、グルカゴン及びＧＬＰ−１の誘導体から選択され、ここでポリペプチドの誘導体は、天然配列に対して１〜６個のアミノ酸置換を含む。置換するアミノ酸は、天然アミノ酸又は合成アミノ酸のいずれかであることができ、一つの実施態様において、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換を表す。
生体活性ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質
エステル結合を介してプロドラッグのジペプチド部分に結合している生体活性ペプチド、生体活性ポリペプチド又は生体活性タンパク質は、グルカゴンスーパーファミリーペプチド（例えば、グルカゴンスーパーファミリーのメンバー（Sherwood et al., 2000, supraに記載されたもの）、グルカゴン関連類縁体ペプチド）、オステオカルシン、インスリン又はその類縁体、誘導体若しくは結合体であることができる。
オステオカルシン
幾つかの実施態様において、生体活性ペプチドは、オステオカルシンであるか、又は、天然ペプチドの長さにわたって天然オステオカルシンと少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性があるアミノ酸配列を含む、オステオカルシンの類縁体若しくは誘導体である。関連する実施態様において、生体活性ペプチドは、天然オステオカルシンに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個までのアミノ酸修飾を有するオステオカルシンの類縁体を含むことができる。
インスリン
他の実施態様において、生体活性ペプチドは、インスリンであるか、又は、それぞれ天然ペプチドの長さにわたってインスリンの天然Ａ又はＢ鎖と少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性があるアミノ酸配列を含むＡ鎖及びＢ鎖を含む、インスリンの類縁体若しくは誘導体である。関連する実施態様において、インスリン類縁体又は誘導体は、天然Ａ又はＢインスリン鎖に対して１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個までのアミノ酸修飾を有するインスリンＡ又はＢ鎖の類縁体を含むことができる。特定の実施態様において、インスリンのＡ鎖は、配列番号６１３若しくは配列番号６２６又はその類縁体若しくは誘導体（例えば、配列番号６１３若しくは６２６に少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％の同一性を有するか又は配列番号６１３若しくは６２６に対して１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個までのアミノ酸修飾を有する）のアミノ酸配列を含む。加えて、幾つかの実施態様において、インスリンのＢ鎖は、配列番号６１４、配列番号６２７若しくは配列番号６２８又はその誘導体若しくは類縁体（例えば、配列番号６１４、配列番号６２７若しくは配列番号６２８に少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％の同一性を有するか又は配列番号６１４、配列番号６２７若しくは配列番号６２８に対して１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個までのアミノ酸修飾を有する）のアミノ酸配列を含むことができる。
グルカゴンスーパーファミリーペプチド
更に他の実施態様において、生体活性ペプチドは、例えば、ＧＨＲＨ（配列番号６５７）、ＶＩＰ（配列番号６５８）、ＰＡＣＡＰ−２７（配列番号６５９）、ＰＨＭ（配列番号６６０）、セクレチン（配列番号６６１）、グルカゴン（配列番号６１２）、エキセンディン−４（配列番号６６２）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）（例えば、配列番号６０１により提示されるアミノ酸７〜３７）、グルカゴン様−２（ＧＬＰ−２）（配列番号６６３）、ＧＩＰ（配列番号６６４）及びオキシントモジュリン（配列番号６６５）が含まれる、当該技術において既知のグルカゴンスーパーファミリーペプチドのいずれかである。
グルカゴンスーパーファミリーペプチドは、Ｎ末端アミノ酸内の相同性及び／又はＣ末端部分内のアルファ−へリックス構造が含まれるが、これらに限定されない共通の構造特徴を有することができる。Ｃ末端は一般に受容体結合において機能し、Ｎ末端は一般に受容体シグナル伝達において機能すると考えられる。Ｎ末端及びＣ末端部分の幾つかのアミノ酸、例えば、Ｈｉｓ１、Ｇｌｙ４、Ｐｈｅ６、Ｐｈｅ２２、Ｖａｌ２３、Ｔｒｐ２５及びＬｅｕ２６（グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）は、対応する位置のグルカゴンスーパーファミリーのメンバーのアミノ酸が同一性を示すか、保存的に置換されているか、そうでなければアミノ酸側鎖に類似性を示すように、グルカゴンスーパーファミリーのメンバーのうちで高度に保存されている。
グルカゴンスーパーファミリーペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個までのアミノ酸修飾を有する天然アミノ酸配列を含む、ＧＨＲＨ（配列番号６５７）、ＶＩＰ（配列番号６５８）、ＰＡＣＡＰ−２７（配列番号６５９）、ＰＨＭ（配列番号６６０）、セクレチン（配列番号６６１）、グルカゴン（配列番号６１２）、エキセンディン−４（配列番号６６２）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）（例えば、配列番号６０１として提示されるアミノ酸７〜３７）、グルカゴン様−２（ＧＬＰ−２）（配列番号６６３）、ＧＩＰ（配列番号６６４）及びオキシントモジュリン（配列番号６６５）の類縁体又は誘導体であることができる。
例えば、グルカゴンスーパーファミリーペプチドは、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号６２４）、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−ＣＯＮＨ２（配列番号７２３）、オキシントモジュリンカルボキシ末端延長、ＫＲＮＲＮＮＩＡ（配列番号６２５）又はＫＧＫＫＮＤＷＫＨＮＩＴＱ（配列番号６６６）が含まれるが、これらに限定されない、Ｃ末端又はＣ末端アミノ酸配列を含むことができる。グルカゴンスーパーファミリーペプチドの追加のＣ末端アミノ酸配列が、下記において更に詳述されている。
また、例えば、グルカゴンスーパーファミリーペプチドは、天然ペプチドの長さにわたって、天然ＧＨＲＨと少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性があるアミノ酸配列を含む、ＧＨＲＨの類縁体（配列番号６５７）であることができる。グルカゴンスーパーファミリーペプチドは、ＧＨＲＨに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個までのアミノ酸修飾を有するＧＨＲＨの類縁体を含むことができる。
さらに更なる実施態様において、生体活性ペプチドは、類縁体ペプチド配列に対して２つ以上の天然グルカゴンのキメラであるアミノ酸配列を含むことができる。幾つかの実施態様において、生体活性ペプチドは、天然グルカゴン（配列番号６１２）に対して少なくとも約５０％の同一性がある及び配列番号６１２のアミノ酸１２〜２９に対応するアミノ酸のアルファ−ヘリカル立体配座を保持する、アミノ酸を含む。
生体活性ペプチドは、グルカゴンスーパーファミリーペプチドの結合体であることができる。結合体は、グルカゴン関連類縁体ペプチドに関して本明細書において更に記載される。この文脈における結合体の教示は、一般に、グルカゴン関連類縁体ペプチドではない生体活性ペプチドに当てはまる。
幾つかの実施態様において、グルカゴンスーパーファミリーペプチドは、グルカゴン関連類縁体ペプチド、例えば、グルカゴン（配列番号６１２）、オキシントモジュリン（配列番号６６５）、エキセンディン−４（配列番号６６２）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）（配列番号６０１として提示されるアミノ酸７〜３７）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）（配列番号６６３）、ＧＩＰ（配列番号６６４）、又はこれらの類縁体、誘導体及び結合体である。幾つかの実施態様において、グルカゴン関連類縁体ペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個までのアミノ酸修飾を有する、天然グルカゴン、天然エキセンディン−４、天然（７−３７）ＧＬＰ−１、天然ＧＬＰ−２、天然ＧＨＲＨ、天然ＶＩＰ、天然ＰＡＣＡＰ−２７、天然ＰＨＭ、天然オキシントモジュリン、天然セクレチン又は天然ＧＩＰのアミノ酸配列を含む。そのようなペプチドは当該技術において知られている。例えば、ＷＯ２００８／０２３０５０、ＷＯ２００７／０３０５１９、ＷＯ２００５／０５８９５４、ＷＯ２００３／０１１８９２、ＷＯ２００７／０４６８３４、ＷＯ２００６／１３４３４０、ＷＯ２００６／１２４５２９、ＷＯ２００４／０２２００４、ＷＯ２００３／０１８５１６及びＷＯ２００７／１２４４６１（それぞれその全体が参照として本明細書に組み込まれる）を参照すること。
関連する実施態様において、グルカゴン関連類縁体ペプチドは、天然ペプチドの長さにわたって（又はグルカゴンに対応する位置にわたって、例えば図１８を参照すること）、天然グルカゴン、天然オキシントモジュリン、天然エキセンディン−４、天然（７−３７）ＧＬＰ−１、天然ＧＬＰ−２又は天然ＧＩＰの対応する配列と少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性があるアミノ酸配列を含む。
特定の実施態様において、グルカゴン関連類縁体ペプチドは、本明細書において詳述される、クラス１、２、３、４又は５グルカゴン関連類縁体ペプチドである。
グルカゴン関連類縁体ペプチド
特定の態様において、本開示は、グルカゴン関連類縁体ペプチドに関する。グルカゴン関連類縁体ペプチドという用語は、グルカゴン、オキシントモジュリン、エキセンディン−４、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２及びＧＩＰ受容体の１つ以上のいずれかにおいて生物学的活性（アゴニスト又はアンタゴニストとして）を有し、天然グルカゴン、天然オキシントモジュリン、天然エキセンディン−４、天然ＧＬＰ−１、天然ＧＬＰ−２又は天然ＧＩＰのうちの少なくとも１つと、少なくとも４０％の配列同一性（例えば、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％）を共有するアミノ酸を含む、ペプチドを意味する。グルカゴン関連類縁体ペプチドの全ての可能な活性のサブセットが考慮され、例えば、グルカゴン又はＧＬ−１若しくはＧＩＰ受容体のいずれかの１つ以上と生物学的活性（アゴニスト又はアンタゴニストとして）を、それぞれ提示される天然ペプチドに対する配列同一性の全ての可能なサブセットと一緒に有する、例えば天然グルカゴンの長さにわたって、天然グルカゴンと少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む、ペプチドが考慮されることが理解される。
本発明の一つの実施態様において、グルカゴン関連類縁体ペプチドは、グルカゴン受容体アゴニスト活性、ＧＩＰ受容体アゴニスト活性、グルカゴン受容体／ＧＬＰ−１受容体コアゴニスト活性、グルカゴン受容体アンタゴニスト活性又はグルカゴン受容体アンタゴニスト及びＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性を有するペプチドである。幾つかの実施態様において、ペプチドは、分子のＣ末端の半分においてアルファ−ヘリカル立体配座を保持する。幾つかの実施態様において、ペプチドは、受容体相互作用又はシグナル伝達に関わる位置、例えば、グルカゴンの３位又は（１−３７）ＧＬＰ−１の７、１０、１２、１３、１５若しくは１７位を保持する。したがって、グルカゴン関連類縁体ペプチドは、クラス１、クラス２、クラス３、クラス４及び／又はクラス５のペプチドであることができ、それぞれ本明細書において更に記載される。
修飾
グルカゴン関連類縁体ペプチドは、修飾を有する天然グルカゴンアミノ酸配列（配列番号６１２）を含むことができる。例示的な実施態様において、グルカゴン関連類縁体ペプチドは、天然グルカゴン配列に対して合計１個、２個まで、３個まで、４個まで、５個まで、６個まで、７個まで、８個まで、９個まで又は１０個までのアミノ酸修飾、例えば保存的又は非保存的置換を含むことができる。本明細書に記載される修飾及び置換は、特定の態様において、グルカゴン関連類縁体ペプチド内の特定の位置において実施され、ここで位置の番号付けはグルカゴン（配列番号６１２）の番号付けに対応する。幾つかの実施態様において、１、２、３、４又は５個の非保存的置換は、２、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８又は２９のいずれかの位置において実施され、５個までの更なる保存的置換が、これらの位置のいずれかにおいて実施される。幾つかの実施態様において、１、２又は３個のアミノ酸修飾が１〜１６の位置の範囲内のアミノ酸で実施され、１、２又は３個のアミノ酸修飾が１７〜２６の位置の範囲内のアミノ酸で実施される。幾つかの実施態様において、そのようなグルカゴン関連類縁体ペプチドは、天然グルカゴンの対応する位置に少なくとも２２、２３、２４、２５、２６、２７又は２８個の天然に生じるアミノ酸を保持する（例えば、天然に生じるグルカゴンに対して１〜７、１〜５又は１〜３個の修飾を有する）。
ＤＰＰ−ＩＶ耐性
幾つかの実施態様において、グルカゴン関連類縁体ペプチドは、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断に対する感受性を低減するために、１又は２位に修飾を含む。より詳細には、幾つかの実施態様において、グルカゴン関連類縁体ペプチド（例えば、図１０に記載のものから選択されたもの）の１位は、Ｄ−ヒスチジン、アルファ，アルファ−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン及びホモ−ヒスチジンからなる群より選択されるアミノ酸で置換されている。より詳細には、幾つかの実施態様において、グルカゴン関連類縁体ペプチドの２位は、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、バリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン及びアミノイソ酪酸からなる群より選択されるアミノ酸で置換されている。
親水性部分
一つの実施態様において、グルカゴン関連類縁体ペプチド（例えば、クラス１グルカゴン関連類縁体ペプチド、クラス２グルカゴン関連類縁体ペプチド、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチド、クラス４グルカゴン関連類縁体ペプチド又はクラス５グルカゴン関連類縁体ペプチド）は、親水性部分に結合（共有結合）している。親水性部分を、タンパク質と活性化ポリマー分子との反応に使用される任意の適切な条件下でグルカゴン関連ペプチドに結合することができる。アシル化、還元的アルキル化、マイケル付加、チオールアルキル化又はＰＥＧ部分に対する反応性基（例えば、アルデヒド、アミノ、エステル、チオール、α−ハロアセチル、マレイミド又はヒドラジノ基）と標的化合物に対する反応性基（例えば、アルデヒド、アミノ、エステル、チオール、α−ハロアセチル、マレイミド又はヒドラジノ基）との他の化学選択的結合／連結方法を含む、当該技術において既知のあらゆる方法を使用することができる。水溶性ポリマーを１つ以上のタンパク質に結合するのに使用できる活性化基には、スルホン、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフレート、トレシレート、アジリジン、オキシラン及び５−ピリジルが、限定されることなく含まれる。還元的アルキル化によりペプチドに結合する場合、選択されるポリマーは、重合の程度が制御されるように単一の反応性アルデヒドを有するべきである。例えば、Kinstler et al., Adv. Drug. Delivery Rev. 54: 477-485 (2002); Roberts et al., Adv. Drug Delivery Rev. 54: 459-476 (2002)及びZalipsky et al., Adv. Drug Delivery Rev. 16: 157-182 (1995)を参照すること。
適切な親水性部分には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン化ポリオール（例えば、ＰＯＧ）、ポリオキシエチレン化ソルビトール、ポリオキシエチレン化グルコース、ポリオキシエチレン化グリセロール（ＰＯＧ）、ポリオキシアルキレン、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、モノ−（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−又はアリールオキシ−ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、ポリアセタール、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリ（ベータ−アミノ酸）（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー（ＰＰＧ）及び他のポリアルキレンオキシド、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、コロン酸又は他の多糖ポリマー、フィコール又はデキストラン、並びにこれらの混合物が含まれる。デキストランは、主にα１−６結合により結合しているグルコースサブユニットの多糖ポリマーである。デキストランは、多くの分子量範囲、例えば１kD〜約１００kD又は約５、１０、１５若しくは２０kD〜約２０、４０、５０、６０、７０、８０若しくは９０kDで入手することができる。
一つの実施態様において、親水性部分は、Ｃ末端延長内又はＣ末端アミノ酸において、前記グルカゴン関連類縁体ペプチドの１６、１７、２１、２４、２９、４０位の１つ以上のアミノ酸残基の側鎖に共有結合している、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖又は他の水溶性ポリマーである。幾つかの実施態様において、その位置の天然アミノ酸は、ペプチドへの親水性部分の結合を促進するために、親水性部分との架橋に適した側鎖を有するアミノ酸で置換されている。例示的なアミノ酸には、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−Ｃｙｓ又はアセチルフェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）が含まれる。他の実施態様において、親水性基を含むように修飾されているアミノ酸が、ペプチドのＣ末端に付加される。
親水性部分、例えばポリエチレングリコール鎖は、幾つかの実施態様によると、約５００〜約４，００００ダルトンの範囲から選択される分子量を有する。一つの実施態様において、ポリエチレングリコール鎖は、約５００〜約５，０００ダルトン又は約１，０００〜約５，０００ダルトンの範囲から選択される分子量を有する。別の実施態様において、親水性部分、例えばポリエチレングリコール鎖は、約１０，０００〜約２０，０００ダルトンの分子量を有する。更に他の例示的な実施態様において、親水性部分、例えばポリエチレングリコール鎖は、約２０，０００〜約４０，０００ダルトンの分子量を有する。
直鎖又は分岐鎖ポリマーが考慮される。得られる結合体の調製は、実質的に単分散又は多分散であることができ、ペプチド１つあたり約０．５、０．７、１、１．２、１．５又は２つのポリマー部分を有することができる。
アシル化
一つの実施態様において、グルカゴン関連類縁体ペプチド（例えば、クラス１グルカゴン関連類縁体ペプチド、クラス２グルカゴン関連類縁体ペプチド、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチド、クラス４グルカゴン関連類縁体ペプチド又はクラス５グルカゴン関連類縁体ペプチド）は、修飾されてアシル基を含む。アシル化は、非アシル化グルカゴン関連類縁体ペプチドにより示される活性がアシル化によって保持される限り、１〜２９位、Ｃ末端延長内の位置、又はＣ末端アミノ酸のいずれかを含む、グルカゴン関連類縁体ペプチド内の任意の位置で実施することができる。例えば、非アシル化ペプチドがグルカゴンアゴニスト活性を有する場合、アシル化ペプチドは、グルカゴンアゴニスト活性を保持する。また、例えば、非アシル化ペプチドがグルカゴンアンタゴニスト活性を有する場合、アシル化ペプチドは、グルカゴンアンタゴニスト活性を保持する。例えば、非アシル化ペプチドがＧＬＰ−１アゴニスト活性を有する場合、アシル化ペプチドは、ＧＬＰ−１アゴニスト活性を保持する。非限定例には、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８又は２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）でのアシル化が挙げられる。アシル基を、グルカゴン関連類縁体ペプチドのアミノ基に直接的に又はグルカゴン関連類縁体ペプチドのアミノ基にスペーサーを介して間接的に共有結合することができ、ここでスペーサーは、グルカゴン関連類縁体ペプチドのアミノ基とアシル基との間に位置している。グルカゴン関連類縁体ペプチドを、親水性部分が結合している同じアミノ酸の位置又は異なるアミノ酸の位置でアシル化することができる。非限定例には、１０位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）でのアシル化、及びグルカゴンペプチドのＣ末端部分における１つ以上の位置、例えば２４、２８若しくは２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）、Ｃ末端延長内、又はＣ末端（例えば、Ｃ末端Ｃｙｓの付加を介する）でのペグ化が挙げられる。
本発明の特定の態様において、グルカゴン関連類縁体ペプチドは、グルカゴン関連類縁体ペプチドのアミノ酸の側鎖のアミン、ヒドロキシル又はチオールの直接的なアシル化により修飾されて、アシル基を含む。幾つかの実施態様において、グルカゴン関連類縁体ペプチドは、アミノ酸の側鎖アミン、ヒドロキシル又はチオールを介して直接アシル化される。幾つかの実施態様において、アシル化は、１０、２０、２４又は２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）においてである。この点において、アシル化グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号６１２のアミノ酸配列を含むこともできるし、又は１０、２０、２４及び２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のアミノ酸の少なくとも１個が修飾されて側鎖アミン、ヒドロキシル若しくはチオールを含む任意のアミノ酸となる、本明細書に記載されている１つ以上のアミノ酸修飾を含む配列番号６１２の修飾アミノ酸配列を含むこともできる。本発明の幾つかの特定の実施態様において、グルカゴン関連類縁体ペプチドの直接アシル化は、１０位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のアミノ酸の側鎖アミン、ヒドロキシル又はチオールを介して生じる。
幾つかの実施態様において、側鎖アミンを含むアミノ酸は、式ＶＩＩＩ：
Figure 2011511778
 で示されるアミノ酸である。
幾つかの例示的な実施態様において、式ＶＩＩＩのアミノ酸は、ｎが４（Ｌｙｓ）であるか又はｎが３（Ｏｒｎ）であるアミノ酸である。
他の実施態様において、側鎖ヒドロキシルを含むアミノ酸は、式ＩＸ：
Figure 2011511778
 で示されるアミノ酸である。
幾つかの例示的な実施態様において、式ＩＸのアミノ酸は、ｎが１（Ｓｅｒ）であるアミノ酸である。
更に他の実施態様において、側鎖チオールを含むアミノ酸は、式Ｘ：
Figure 2011511778
 で示されるアミノ酸である。
幾つかの例示的な実施態様において、式Ｘのアミノ酸は、ｎが１（Ｃｙｓ）であるアミノ酸である。
本発明の一つの実施態様において、アシル化グルカゴン関連類縁体ペプチドは、ペプチドとアシル基との間にスペーサーを含む。幾つかの実施態様において、グルカゴン関連類縁体ペプチドは、アシル基に共有結合しているスペーサーと共有結合する。幾つかの例示的な実施態様において、グルカゴン関連類縁体ペプチドは、スペーサーのアミン、ヒドロキシル又はチオールのアシル化により修飾されてアシル基を含み、ここでスペーサーは、グルカゴン関連類縁体ペプチドの１０、２０、２４若しくは２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のアミノ酸の側鎖又はＣ末端アミノ酸に結合している。スペーサーが結合しているアミノ酸は、スペーサーへの結合を可能にする部分を含む任意のアミノ酸であることができる。例えば、側鎖ＮＨ２、−ＯＨ又は−ＣＯＯＨを含むアミノ酸（例えば、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕ）が適している。この点において、アシル化グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号６１２のアミノ酸配列を含むこともできるし、又は１０、２０、２４及び２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のアミノ酸の少なくとも１個が修飾されて側鎖アミン、ヒドロキシル若しくはカルボキシレートを含む任意のアミノ酸となる、本明細書に記載されている１つ以上のアミノ酸修飾を含む配列番号６１２の修飾アミノ酸配列を含むことができる。
幾つかの実施態様において、スペーサーは、側鎖アミン、ヒドロキシル若しくはチオールを含むアミノ酸であるか又は側鎖アミン、ヒドロキシル若しくはチオールを含むアミノ酸を含むジペプチド若しくはトリペプチドである。
アシル化がスペーサーのアミン基を介して生じる場合、アシル化は、アミノ酸のアルファアミン又は側鎖アミンを介して生じることができる。アルファアミンがアシル化される場合、スペーサーアミノ酸は、任意のアミノ酸であることができる。例えば、スペーサーアミノ酸は、疎水性アミノ酸、例えばＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒであることができる。あるいは、スペーサーアミノ酸は、酸性残基、例えばＡｓｐ及びＧｌｕであることができる。スペーサーアミノ酸の側鎖アミンがアシル化される場合、スペーサーアミノ酸は、側鎖アミンを含むアミノ酸、例えば式ＶＩＩＩのアミノ酸（例えば、Ｌｙｓ又はＯｒｎ）である。この場合、スペーサーアミノ酸のアルファアミンと側鎖アミンの両方ともアシル化されることが可能であり、それによりグルカゴンペプチドがジアシル化される。本発明の実施態様はそのようなジアシル化分子を含む。
アシル化がスペーサーのヒドロキシル基を介して生じる場合、アミノ酸又はジペプチド若しくはトリペプチドのアミノ酸のうちの１個は、式ＩＸのアミノ酸であることができる。特定の例示的な実施態様において、アミノ酸はＳｅｒである。
アシル化がスペーサーのチオール基を介して生じる場合、アミノ酸又はジペプチド若しくはトリペプチドのアミノ酸のうちの１個は、式Ｘのアミノ酸であることができる。特定の例示的な実施態様において、アミノ酸はＣｙｓである。
一つの実施態様において、スペーサーは、親水性二官能スペーサーを含む。特定の実施態様において、スペーサーは、アミノポリ（アルキルオキシ）カルボキシレートを含む。この点において、スペーサーは、例えばＮＨ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ（ＣＨ２）ｍＣＯＯＨを含むことができ、ここでｍは、１〜６の任意の整数であり、そしてｎは、２〜１２の任意の整数であり、例えば、Peptides International, Inc. (Louisville, KY)により販売されている８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸である。
アミン、ヒドロキシル及びチオールを介したペプチドアシル化に適した方法は、当該技術において知られている。例えば、Miller, Biochem Biophys Res Commun 218: 377-382 (1996); Shimohigashi and Stammer, lnt J Pept Protein Res 19: 54-62 (1982);及びPreviero et al., Biochim Biophys Acta 263: 7-13 (1972)（ヒドロキシルを介したアシル化の方法）;並びにSan and Silvius, J Pept Res 66: 169-180 (2005)（チオールを介したアシル化の方法）; Bioconjugate Chem. "Chemical Modifications of Proteins: History and Applications" pages 1, 2-12 (1990); Hashimoto et al., Pharmacuetical Res. "Synthesis of Palmitoyl Derivatives of Insulin and their Biological Activity" Vol. 6, No: 2 pp.171-176 (1989)を参照すること。
アシル化グルカゴン関連類縁体ペプチドのアシル基は、任意の大きさ、例えば任意の長さの炭素鎖であることができ、直鎖でも分岐鎖でもよい。本発明の幾つかの特定の実施態様において、アシル基は、Ｃ４〜Ｃ３０脂肪酸である。例えば、アシル基は、Ｃ４脂肪酸、Ｃ６脂肪酸、Ｃ８脂肪酸、Ｃ１０脂肪酸、Ｃ１２脂肪酸、Ｃ１４脂肪酸、Ｃ１６脂肪酸、Ｃ１８脂肪酸、Ｃ２０脂肪酸、Ｃ２２脂肪酸、Ｃ２４脂肪酸、Ｃ２６脂肪酸、Ｃ２８脂肪酸又はＣ３０脂肪酸のいずれかであることができる。幾つかの実施態様において、アシル基は、Ｃ８〜Ｃ２０脂肪酸、例えばＣ１４脂肪酸又はＣ１６脂肪酸である。
代替的な実施態様において、アシル基は胆汁酸である。胆汁酸は、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、タウロコール酸、グリココール酸及びコレステロール酸が含まれるが、これらに限定されない任意の適切な胆汁酸であることができる。
本明細書に記載されているアシル化グルカゴン関連類縁体ペプチドは更に修飾されて、親水性部分を含むことができる。幾つかの特定の実施態様において、親水性部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を含むことができる。親水性部分の組み込みは、本明細書に記載されたいずれかの方法のような任意の適切な手段によって達成することができる。この点において、アシル化グルカゴン類縁体ペプチドは、本明細書に記載されている修飾のいずれかを含む配列番号６１２を含むことができ、ここで、１０、２０、２４及び２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）の少なくとも１個のアミノ酸はアシル基を含み、１６、１７、２１、２４若しくは２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）、Ｃ末端延長内の位置、又はＣ末端アミノ酸の少なくとも１個のアミノ酸は修飾されて、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−Ｃｙｓ又はＡｃ−Ｐｈｅとなり、アミノ酸の側鎖は、親水性部分（例えば、ＰＥＧ）に共有結合している。幾つかの実施態様において、アシル基は、場合によりＣｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−Ｃｙｓ又はＡｃ−Ｐｈｅを含むスペーサーを介して１０位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）に結合しており、親水性部分は、２４位のＣｙｓ残基に組み込まれている。
あるいは、アシル化グルカゴン関連類縁体ペプチドは、スペーサーを含むことができ、ここでスペーサーは、アシル化も修飾もされて、親水性部分を含む。適切なスペーサーの非限定例には、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−Ｃｙｓ及びＡｃ−Ｐｈｅからなる群より選択される１個以上のアミノ酸を含むスペーサーが挙げられる。
アルキル化
一つの実施態様によると、グルカゴン関連類縁体ペプチド、例えば、クラス１グルカゴン関連類縁体ペプチド、クラス２グルカゴン関連類縁体ペプチド、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチド、クラス４グルカゴン関連類縁体ペプチド又はクラス５グルカゴン関連類縁体ペプチドは、修飾されて、循環半減期を延長する及び／又は作用の開始を遅延する及び／若しくは作用の持続時間を延長する及び／又はＤＰＰ−ＩＶのようなプロテアーゼに対する耐性を改善する目的で、エーテル、チオエーテル又はアミノ結合を介してグルカゴン関連類縁体ペプチドに結合しているアルキル基を含む。
アルキル化は、グルカゴン、ＧＬＰ−１又は他のグルカゴン関連類縁体ペプチド受容体に関してグルカゴン関連類縁体ペプチドのアゴニスト又はアンタゴニスト活性が保持される限り、１〜２９位、Ｃ末端延長内の位置、又はＣ末端アミノ酸のいずれかを含む、グルカゴン関連類縁体内の任意の位置において実施することができる。幾つかの実施態様において、非アルキル化ペプチドがグルカゴンアゴニスト活性を有する場合、アルキル化ペプチドはグルカゴンアゴニスト活性を保持する。他の実施態様において、非アルキル化ペプチドがグルカゴンアンタゴニスト活性を有する場合、アルキル化ペプチドはグルカゴンアンタゴニスト活性を保持する。幾つかの実施態様において、非アルキル化ペプチドがＧＬＰ−１アゴニスト活性を有する場合、アルキル化ペプチドは、ＧＬＰ−１アゴニスト活性を保持する。非限定例には、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８又は２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）でのアルキル化が挙げられる。アルキル基を、グルカゴン関連類縁体ペプチドのアミノ基に直接的に又はグルカゴン関連類縁体ペプチドのアミノ基にスペーサーを介して間接的に共有結合することができ、ここでスペーサーは、グルカゴン関連類縁体ペプチドのアミノ基とアルキル基との間に位置している。グルカゴン関連類縁体ペプチドを、親水性部分が結合している同じアミノ酸の位置又は異なるアミノ酸の位置でアルキル化することができる。非限定例には、１０位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）でのアルキル化、及びグルカゴン関連類縁体ペプチドのＣ末端部分における１つ以上の位置、例えば２４、２８若しくは２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）、Ｃ末端延長内、又はＣ末端（例えば、Ｃ末端Ｃｙｓの付加を介する）でのペグ化が挙げられる。
本発明の特定の態様において、グルカゴン関連類縁体ペプチドは、グルカゴン関連類縁体ペプチドのアミノ酸の側鎖のアミン、ヒドロキシル又はチオールの直接的なアルキル化により修飾されて、アルキル基を含む。幾つかの実施態様において、グルカゴン関連類縁体ペプチドは、アミノ酸の側鎖アミン、ヒドロキシル又はチオールを介して直接アルキル化される。幾つかの実施態様において、アルキル化は、１０、２０、２４又は２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）においてである。この点において、アルキル化グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号６１２のアミノ酸配列を含むことができるし、又は１０、２０、２４及び２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のアミノ酸の少なくとも１個が修飾されて側鎖アミン、ヒドロキシル若しくはチオールを含む任意のアミノ酸となる、本明細書に記載されている１つ以上のアミノ酸修飾を含む配列番号６１２の修飾アミノ酸配列を含むこともできる。本発明の幾つかの実施態様において、グルカゴン関連類縁体ペプチドの直接アルキル化は、１０位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のアミノ酸の側鎖アミン、ヒドロキシル又はチオールを介して生じる。
幾つかの実施態様において、側鎖アミンを含むアミノ酸は、式ＶＩＩＩのアミノ酸である。幾つかの例示的な実施態様において、式ＶＩＩＩのアミノ酸は、ｎが４（Ｌｙｓ）であるか又はｎが３（Ｏｒｎ）であるアミノ酸である。
他の実施態様において、側鎖ヒドロキシルを含むアミノ酸は、式ＩＸのアミノ酸である。幾つかの例示的な実施態様において、式ＩＸのアミノ酸は、ｎが１（Ｓｅｒ）であるアミノ酸である。
更に他の実施態様において、側鎖チオールを含むアミノ酸は、式Ｘのアミノ酸である。幾つかの例示的な実施態様において、式Ｘのアミノ酸は、ｎが１（Ｃｙｓ）であるアミノ酸である。
本発明の一つの実施態様において、アルキル化グルカゴン関連類縁体ペプチドは、ペプチドとアルキル基との間にスペーサーを含む。幾つかの実施態様において、グルカゴン関連類縁体ペプチドは、アルキル基に共有結合しているスペーサーと共有結合する。幾つかの例示的な実施態様において、グルカゴン関連類縁体ペプチドは、スペーサーのアミン、ヒドロキシル又はチオールのアルキル化により修飾されてアルキル基を含み、ここでスペーサーは、グルカゴン関連類縁体ペプチドの１０、２０、２４又は２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のアミノ酸の側鎖に結合している。スペーサーが結合しているアミノ酸は、スペーサーへの結合を可能にする部分を含む任意のアミノ酸であることができる。例えば、側鎖ＮＨ２、−ＯＨ又は−ＣＯＯＨを含むアミノ酸（例えば、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕ）が適している。この点に関して、アルキル化グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号６１２のアミノ酸配列を含もことができるし、又は１０、２０、２４及び２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のアミノ酸の少なくとも１個が修飾されて側鎖アミン、ヒドロキシル若しくはカルボキシレートを含む任意のアミノ酸となる、本明細書に記載されている１つ以上のアミノ酸修飾を含む配列番号６１２の修飾アミノ酸配列を含むこともできる。
幾つかの実施態様において、スペーサーは、側鎖アミン、ヒドロキシル若しくはチオールを含むアミノ酸であるか又は側鎖アミン、ヒドロキシル若しくはチオールを含むアミノ酸を含むジペプチド若しくはトリペプチドである。
アルキル化がスペーサーのアミン基を介して生じる場合、アルキル化は、アミノ酸のアルファアミン又は側鎖アミンを介して生じることができる。アルファアミンがアルキル化される場合、スペーサーアミノ酸は、任意のアミノ酸であることができる。例えば、スペーサーアミノ酸は、疎水性アミノ酸、例えばＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒであることができる。あるいは、スペーサーアミノ酸は、酸性残基、例えばＡｓｐ及びＧｌｕであることができる。スペーサーアミノ酸の側鎖アミンがアルキル化される場合、スペーサーアミノ酸は、側鎖アミンを含むアミノ酸、例えば式ＶＩＩＩのアミノ酸（例えば、Ｌｙｓ又はＯｒｎ）である。この場合、スペーサーアミノ酸のアルファアミンと側鎖アミンの両方ともアルキル化されることが可能であり、それによりグルカゴンペプチドがジアルキル化される。本発明の実施態様はそのようなジアルキル化分子を含む。
アルキル化がスペーサーのヒドロキシル基を介して生じる場合、アミノ酸又はスペーサーのアミノ酸のうちの１個は、式ＩＸのアミノ酸であることができる。特定の例示的な実施態様において、アミノ酸はＳｅｒである。
アルキル化がスペーサーのチオール基を介して生じる場合、アミノ酸又はスペーサーのアミノ酸のうちの１個は、式Ｘのアミノ酸であることができる。特定の例示的な実施態様において、アミノ酸はＣｙｓである。
一つの実施態様において、スペーサーは、親水性二官能スペーサーを含む。特定の実施態様において、スペーサーは、アミノポリ（アルキルオキシ）カルボキシレートを含む。この点において、スペーサーは、例えばＮＨ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ（ＣＨ２）ｍＣＯＯＨを含むことができ、ここでｍは、１〜６の任意の整数であり、そしてｎは、２〜１２の任意の整数であり、例えば、Peptides International, Inc. (Louisville, KY)により販売されている８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸である。
アミン、ヒドロキシル及びチオールを介したペプチドアルキル化に適した方法は、当該技術において知られている。例えば、ウィリアムソンエーテル合成を使用して、グルカゴン関連類縁体ペプチドとアルキル基との間にエーテル結合を形成することができる。また、ハロゲン化アルキルによるペプチドの求核置換反応は、エーテル、チオエーテル又はアミノ結合のいずれかをもたらすことができる。
アルキル化グルカゴン関連類縁体ペプチドのアルキル基は、任意の大きさ、例えば任意の長さの炭素鎖であることができ、直鎖でも分岐鎖でもよい。本発明の幾つかの実施態様において、アルキル基は、Ｃ４〜Ｃ３０アルキルである。例えば、アルキル基は、Ｃ４アルキル、Ｃ６アルキル、Ｃ８アルキル、Ｃ１０アルキル、Ｃ１２アルキル、Ｃ１４アルキル、Ｃ１６アルキル、Ｃ１８アルキル、Ｃ２０アルキル、Ｃ２２アルキル、Ｃ２４アルキル、Ｃ２６アルキル、Ｃ２８アルキル又はＣ３０アルキルのいずれかであることができる。幾つかの実施態様において、アルキル基は、Ｃ８〜Ｃ２０アルキル、例えばＣ１４アルキル又はＣ１６アルキルである。
幾つかの実施態様において、アルキル基は、胆汁酸のステロイド部分、例えば、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、タウロコール酸、グリココール酸及びコレステロール酸を含む。
本明細書に記載されているアルキル化グルカゴン関連類縁体ペプチドは更に修飾されて、親水性部分を含むことができる。幾つかの特定の実施態様において、親水性部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を含むことができる。親水性部分の組み込みは、本明細書に記載されたいずれかの方法のような任意の適切な手段によって達成することができる。この点において、アルキル化グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号６１２又は本明細書に記載されているアミノ酸修飾の１つ以上を含む配列番号２のアミノ酸配列を含むことができ、ここで、１０、２０、２４及び２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）の少なくとも１個のアミノ酸はアルキル基を含み、１６、１７、２１、２４若しくは２９位、Ｃ末端延長内の位置、又はＣ末端アミノ酸の少なくとも１個のアミノ酸は修飾されて、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−Ｃｙｓ又はＡｃ−Ｐｈｅとなり、アミノ酸の側鎖は、親水性部分（例えば、ＰＥＧ）に共有結合している。幾つかの実施態様において、アルキル基は、場合によりＣｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−Ｃｙｓ又はＡｃ−Ｐｈｅを含むスペーサーを介して１０位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）に結合しており、親水性部分は、２４位のＣｙｓ残基に組み込まれている。
あるいは、アルキル化グルカゴン関連類縁体ペプチドは、スペーサーを含むことができ、ここでスペーサーは、アルキル化も修飾もされて、親水性部分を含む。適切なスペーサーの非限定例には、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ホモ−Ｃｙｓ及びＡｃ−Ｐｈｅからなる群より選択される１個以上のアミノ酸を含むスペーサーが挙げられる。
アルファ−へリックス構造の安定化
幾つかの実施態様において、分子内架橋が２つのアミノ酸側鎖の間に形成されて、グルカゴン関連類縁体ペプチドのカルボキシ末端部分（例えば、アミノ酸１２〜２９（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる））の三次元構造を安定する。２つのアミノ酸側鎖は、水素結合、塩架橋の形成のようなイオン相互作用又は共有結合を介して互いに結合することができる。
幾つかの実施態様において、分子内架橋は、３個のアミノ酸で離れている２個のアミノ酸、例えばｉとｉ＋４の位置のアミノ酸の間に形成され、ここでｉは、野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる１２〜２５の間（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４及び２５）の任意の整数である。より詳細には、野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによるアミノ酸対１２と１６、１６と２０、２０と２４又は２４と２８（ｉ＝１２、１６、２０又は２４であるアミノ酸対）の側鎖が、互いに結合し、それによりグルカゴンアルファ−へリックスを安定化する。代替的には、ｉは１７であることができる。
幾つかの特定の実施態様において、ｉとｉ＋４の位置のアミノ酸が分子内架橋で結合している場合、リンカーの大きさは、約８原子又は約７〜９原子である。
別の実施態様において、分子内架橋は、２個のアミノ酸で離れている２個のアミノ酸、例えばｊとｊ＋３の位置のアミノ酸の間に形成され、ここでｊは、野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる１２〜２６の間（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５及び２６）の任意の整数である。幾つかの特定の実施態様において、ｊは１７である。
幾つかの特定の実施態様において、ｊとｊ＋３位のアミノ酸が分子内架橋で結合している場合、リンカーの大きさは、約６原子又は約５〜７原子である。
更に他の実施態様において、分子内架橋は、６個のアミノ酸で離れている２個のアミノ酸、例えばｋとｋ＋７の位置のアミノ酸の間に形成され、ここでｋは、野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる１２〜２２の間（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１及び２２）の任意の整数である。幾つかの特定の実施態様において、ｋは、１２、１３又は１７である。例示的な実施態様において、ｋは１７である。
共有結合して６原子結合架橋を形成することができるアミノ酸対形成の例には、ＯｒｎとＡｓｐ、Ｇｌｕと式ＶＩＩＩ（式中、ｎは２である）のアミノ酸及びホモグルタミン酸と式ＶＩＩＩ（式中、ｎは１である）のアミノ酸が挙げられ、ここで式ＶＩＩＩは、下記：
Figure 2011511778
 である。
共有結合して７原子結合架橋を形成することができるアミノ酸対形成の例には、Ｏｒｎ−Ｇｌｕ（ラクタム環）、Ｌｙｓ−Ａｓｐ（ラクタム）又はホモＳｅｒ−ホモＧｌｕ（ラクトン）が挙げられる。８原子リンカーを形成することができるアミノ酸対形成の例には、Ｌｙｓ−Ｇｌｕ（ラクタム）、ホモＬｙｓ−Ａｓｐ（ラクタム）、Ｏｒｎ−ホモＧｌｕ（ラクタム）、４−アミノＰｈｅ−Ａｓｐ（ラクタム）又はＴｙｒ−Ａｓｐ（ラクトン）が挙げられる。９原子リンカーを形成することができるアミノ酸対形成の例には、ホモＬｙｓ−Ｇｌｕ（ラクタム）、Ｌｙｓ−ホモＧｌｕ（ラクタム）、４−アミノＰｈｅ−Ｇｌｕ（ラクタム）又はＴｙｒ−Ｇｌｕ（ラクトン）が挙げられる。これらのアミノ酸の側鎖のいずれかを、アルファ−へリックスの三次元構造が妨げられない限り、追加的な化学基で追加的に置換することができる。当業者は、同様の大きさ及び所望の効果の構造の安定化を作り出す、代替的な対形成又は化学的に修飾された誘導体を含む代替的なアミノ酸類縁体を想像することができる。例えば、ホモシステイン−ホモシステインジスルフィド架橋は、長さが６個の原子であり、更に修飾して所望の効果をもたらすことができる。共有結合がなくても、上記に記載されたアミノ酸対形成又は当業者が想像できる同様の対形成も、非共有結合を介して、例えば塩架橋又は水素結合相互作用の形成を介してアルファ−へリックスに追加的な安定性をもたらすことができる。
ラクタム環の大きさは、アミノ酸の側鎖の長さに応じて変わることができ、一つの実施態様において、ラクタムは、リシンアミノ酸の側鎖とグルタミン酸の側鎖に結合することによって形成される。更なる例示的な実施態様（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）は、場合によりラクタム架橋による以下の対形成を含む：１２位のＧｌｕと１６位のＬｙｓ；１２位の天然Ｌｙｓと１６位のＧｌｕ；１６位のＧｌｕと２０位のＬｙｓ；１６位のＬｙｓと２０位のＧｌｕ；２０位のＧｌｕと２４位のＬｙｓ；２０位のＬｙｓと２４位のＧｌｕ；２４位のＧｌｕと２８位のＬｙｓ；２４位のＬｙｓと２８位のＧｌｕ。あるいは、ラクタム環におけるアミド結合の順番を逆転することができる（例えば、ラクタム環を、Ｌｙｓ１２とＧｌｕ１６の側鎖、あるいはＧｌｕ１２とＬｙｓ１６の側鎖の間に形成することができる）。
ラクタム架橋以外の分子内架橋を使用して、グルカゴン関連類縁体ペプチドのアルファ−へリックスを安定化することができる。一つの実施態様において、分子内架橋は疎水性架橋である。この場合、分子内架橋は、場合により、グルカゴン関連類縁体ペプチドのアルファ−へリックスの疎水性面の部分である２個のアミノ酸の側鎖の間にある。例えば、疎水性架橋により結合しているアミノ酸のうちの１個は、１０、１４及び１８位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のアミノ酸であることができる。
一つの特定に態様において、オレフィンメタセシスを、全炭化水素架橋系を使用してグルカゴン関連類縁体ペプチドのアルファ−へリックスの１又は２巻きを架橋するために使用する。この場合、グルカゴン関連類縁体ペプチドは、多様な長さのオレフィン性側鎖を有する及びｉとｉ＋４又はｉ＋７の位置でＲ又はＳ立体化学のいずれかに配置されている、α−メチル化アミノ酸を含むことができる。例えば、オレフィン性側鎖は（ＣＨ２）ｎを含むことができ、ここでｎは、１〜６の任意の整数である。一つの実施態様において、架橋長さが８原子では、ｎは３である。そのような分子内架橋を形成する適切な方法は、当該技術において記載されている。例えば、Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122: 5891-5892 (2000)及びWalensky et al., Science 305: 1466-1470 (2004)を参照すること。あるいは、グルカゴンペプチドは、隣接するヘリックスの巻きに配置されているＯ−アリルＳｅｒ残基を含むことができ、これらはルテニウム触媒閉環メタセシスを介して一緒に架橋されている。そのような架橋の手順は、例えばBlackwell et al., Angew, Chem., Int. Ed. 37: 3281- 3284 (1998)に記載されている。
別の特定の態様において、システインのペプチド模倣体として広く採用されている、非天然チオジアラニンアミノ酸であるランチオニンの使用を、アルファ−へリックスの１巻きを架橋するために使用する。ランチオニンに基づく環化の適切な方法は、当該技術において知られている。例えば、Matteucci et al., Tetrahedron Letters 45: 1399-1401 (2004); Mayer et al., J. Peptide Res. 51: 432-436 (1998); Polinsky et al., J. Med. Chem. 35: 4185-4194 (1992); Osapay et al., Ｊ. Med. Chem. 40: 2241-2251 (1997); Fukase et al., Bull. Chem. Soc. Jpn. 65: 2227-2240 (1992); Harpp et al., J. Org. Chem. 36: 73-80 (1971); Goodman and Shao, Pure Appl. Chem. 68: 1303-1308 (1996);及びOsapay and Goodman, J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1599-1600 (1993)を参照すること。
幾つかの実施態様において、ｉとｉ＋７位の２つのＧｌｕ残基の間のα，ω−ジアミノアルカン鎖、例えば１，４−ジアミノプロパンと１，５−ジアミノペンタンを使用して、グルカゴンペプチドのアルファ−へリックスを安定化する。そのような鎖は、ジアミノアルカン鎖の長さに応じて、９原子又はそれ以上の長さの架橋の形成をもたらす。そのような鎖で架橋されたペプチドを産生する適切な方法は、当該技術において記載されている。例えば、Phelan et al., J. Am. Chem. Soc. 119: 455-460 (1997)を参照すること。
本発明の更に別の実施態様において、ジスルフィド架橋を使用して、グルカゴン関連類縁体ペプチドのアルファ−へリックスの１又は２巻きを架橋する。あるいは、１個又は両方の硫黄原子がメチレン基で置換されて等配電子マクロ環化をもたらす、修飾ジスルフィド結合を使用して、グルカゴン関連類縁体ペプチドのアルファ−へリックスを安定化する。ジスルフィド架橋又は硫黄に基づく環化により修飾する適切な方法は、例えば、Jackson et al., J. Am. Chem. Soc. 113: 9391-9392 (1991)及びRudinger and Jost, Experientia 20: 570-571 (1964)に記載されている。
更に別の実施態様において、グルカゴン関連類縁体ペプチドのアルファ−へリックスは、ｉとｉ＋４に位置する２つのＨｉｓ残基又はＨｉｓとＣｙｓ対による金属原子の結合を介して安定化される。金属原子は、例えば、Ｒｕ（ＩＩＩ）、Ｃｕ（ＩＩ）、Ｚｎ（ＩＩ）又はＣｄ（ＩＩ）であることができる。そのような金属結合に基づいたアルファ−へリックス安定化の方法は、当該技術において知られている。例えば、Andrews and Tabor, Tetrahedron 55: 11711-11743 (1999); Ghadiri et al., Ｊ. Am. Chem. Soc. 112: 1630-1632 (1990);及びGhadiri et al., J. Am. Chem. Soc. 119: 9063-9064 (1997)を参照すること。
グルカゴン関連類縁体ペプチドのアルファ−へリックスは、代替的には他のペプチド環化の方法により安定化することができ、それらの方法は、Davies, J. Peptide. Sci. 9: 471-501 (2003)により検討されている。アルファ−へリックスは、アミド化架橋、チオエーテル架橋、チオエステル架橋、尿素架橋、カルバメート架橋、スルホンアミド架橋などの形成を介して安定化することができる。例えば、チオエステル架橋を、Ｃ末端とＣｙｓ残基の側鎖との間に形成することができる。あるいは、チオエステルを、チオール（Ｃｙｓ）及びカルボン酸（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）を有するアミノ酸の側鎖を介して形成することができる。別の方法において、ジカルボン酸、例えばスベリン酸（オクタン二酸）などのような架橋剤は、遊離アミン、ヒドロキシル、チオール基及びこれらの組み合わせのような、アミノ酸側鎖の２つの官能基の間に結合を導入することができる。
一つの実施態様によると、グルカゴン関連類縁体ペプチドのアルファ−へリックスは、ｉとｉ＋４の位置への疎水性アミノ酸の組み込みを介して安定化される。例えば、ｉはＴｙｒであることができ、そしてｉ＋４はＶａｌ又はＬｅｕであることができる；ｉはＰｈｅであることができ、そしてｉ＋４はＣｙｓ又はＭｅｔであることができる；ｉはＣｙｓであることができ、そしてｉ＋４はＭｅｔであることができる；或いはｉはＰｈｅであることができ、そしてｉ＋４はＩｌｅであることができる。本明細書の目的のために、上記のアミノ酸対形成を逆転することができ、これによりｉ位置の示されたアミノ酸を代替的にｉ＋４の位置に配置することができ、一方、ｉ＋４のアミノ酸をｉ位置に配置することができることが理解されるべきである。
グルカゴン関連類縁体ペプチドが、グルカゴンアゴニスト活性、ＧＩＰアゴニスト活性、グルカゴンアンタゴニスト活性及びＧＬＰ−１活性を有するペプチドである、本発明の他の実施態様によると、アルファ−へリックスは、グルカゴン関連類縁体ペプチドのＣ末端部分（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによるアミノ酸１２〜２９の付近）に１個以上のアルファ−へリックス安定化アミノ酸を（アミノ酸置換又は挿入にいずれかにより）組み込むことを介して安定化される。特定の実施態様において、アルファ−へリックス安定化アミノ酸は、メチル、エチル、プロピル及びｎ−ブチルから選択される同一若しくは異なる基により二置換されているアミノ酸である又はシクロオクタン若しくはシクロヘプタン（例えば、１−アミノシクロオクタン−１−カルボン酸）により二置換されているアミノ酸である任意のアミノイソ酪酸（ＡＩＢ）が含まれるが、これに限定されないα，α−二置換アミノ酸である。幾つかの実施態様において、グルカゴン関連類縁体ペプチドの１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４又は２９位の１、２、３、４つ又はそれ以上は、α，α−二置換アミノ酸で置換されている。特定の実施態様において、１６、２０、２１及び２４位の１、２、３つ又は全てがＡＩＢで置換されている。
結合体
本開示は、また、グルカゴン関連類縁体ペプチド（例えば、クラス１グルカゴン関連類縁体ペプチド、クラス２グルカゴン関連類縁体ペプチド、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチド、クラス４グルカゴン関連類縁体ペプチド又はクラス５グルカゴン関連類縁体ペプチド）が、場合により共有結合を介し、そして場合によりリンカーを介して、結合体部分に結合している結合体を包含する。結合は、共有化学結合、静電気、水素、イオン、ファンデルワールスのような物理的な力又は疎水的若しくは親水的相互作用により達成することができる。ビオチン−アビジン、リガンド／受容体、酵素／基質、核酸／核酸結合タンパク質、脂質／脂質結合タンパク質、細胞付着分子パートナー又は互いに親和性を有する任意の結合パートナー若しくはそのフラグメントを含む、多様な非共有結合系を使用することができる。
グルカゴン関連類縁体ペプチドを、ペプチドの標的アミノ酸残基と、これらの標的アミノ酸の選択された側鎖又はＮ若しくはＣ末端残基と反応することができる有機誘導体化剤との反応により、直接的な共有結合を介して結合体部分に結合することができる。ペプチド又は結合体部分の反応性基には、例えば、アルデヒド、アミノ、エステル、チオール、α−ハロアセチル、マレイミド又はヒドラジノ基が含まれる。誘導体化剤には、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介して結合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介して結合）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸又は当該技術に既知の他の作用物質が含まれる。あるいは、結合体部分を、多糖又はポリペプチド担体のような中間体担体を介してペプチドに間接的に結合することができる。多糖担体の例にはアミノデキストランが挙げられる。適切なポリペプチド担体の例には、ポリリシン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、それらのコポリマー及びこれらのアミノ酸の混合ポリマー、並びに得られる装填担体に望ましい溶解性の特性を付与する他のもの、例えばセリンが挙げられる。
システイニル残基は、最も一般的には、クロロ酢酸又はクロロアセトアミドのようなα−ハロアセテート（及び対応するアミン）と反応して、カルボキシメチル又はカルボキシアミドメチル誘導体を与える。システイニルン残基は、ブロモトリフルオロアセトン、アルファ−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロ水銀ベンゾエート、２−クロロ水銀−４−ニトロフェノール又はクロロ−７−ニトロベンゾ−オキサ−１，３−ジアゾールと反応させることによっても誘導体化される。
ヒスチジル残基は、ジエチルピロカーボネートとｐＨ５．５〜７．０で反応させることによって誘導体化され、それはこの作用物質がヒスチジル側鎖に比較的特異性があるからである。パラ−ブロモフェナシルブロミドも有用であり、反応は、好ましくは０．１Mカコジル酸ナトリウムによりｐＨ６．０で実施される。
リシニル及びアミノ末端残基は、無水コハク酸又は他のカルボン酸無水物と反応する。これらの作用物質による誘導体化は、リシニル残基の電荷を逆転する効果を有する。アルファ−アミノ含有残基を誘導体化するのに適した他の試薬には、メチルピコリンイミデート、ピリドキサールホスフェート、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４−ペンタンジオンのようなイミドエステル及びグリオキシレートとのトランスアミダーゼ触媒反応が含まれる。
アルギニル残基は、１つ又は幾つかの従来の試薬、なかでもフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン及びニンヒドリンによる反応で修飾される。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高pKaのために、反応がアルカリ条件下で実施される必要がある。更に、これらの試薬は、リシンの基、またアルギニン−イプシロン−アミノ基と反応することができる。
チロシル残基の特定の修飾は、スペクトル標識をチロシル残基に導入するのに特に興味深く、芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンによる反応によって行うことができる。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミダゾール及びテトラニトロメタンを使用して、Ｏ−アセチルチロシル種及び３−ニトロ誘導体がそれぞれ形成される。
カルボキシル側基（アスパルチル又はグルタミル）は、Ｒ及びＲ′が異なるアルキル基であるカルボジイミド（Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ′）、例えば１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミド又は１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドとの反応により選択的に修飾される。更に、アスパルチル又はグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル及びグルタミニル残基に変換される。
他の修飾には、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のアルファ−アミノ基のメチル化（T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)）、アスパラギン又はグルタミンの脱アミド化、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び／又はＣ末端カルボン酸基のアミド化若しくはエステル化が含まれる。
別の種類の共有的修飾には、ペプチドへのグリコシドの化学的又は酵素的結合が含まれる。糖を、（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインのような遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、トレオニン若しくはヒドロキシプロリンのような遊離ヒドロキシル基、（ｅ）チロシン若しくはトリプトファンのような芳香族残基、又は（ｆ）グルタミンのアミド基、に結合することができる。これらの方法は、１９８７年９月１１日に公開されたＷＯ８７／０５３３０及びAplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に記載されている。
本明細書に記載されているグルカゴン関連類縁体ペプチドのいずれかに結合することができる例示的な結合体部分には、異種ペプチド又はポリペプチド（例えば、血漿タンパク質を含む）、標的作用物質、免疫グロブリン若しくはその一部（例えば、可変部領域、ＣＤＲ若しくはＦｃ領域）、放射性同位体、蛍光体若しくは酵素標識のような診断用標識、水溶性ポリマーを含むポリマー、又は他の治療若しくは診断剤が含まれるが、これらに限定されない。一つの実施態様において、本発明のグルカゴン関連類縁体ペプチド及び血漿タンパク質を含む結合体が提供され、ここで血漿タンパク質は、アルブミン、トランスフェリン、フィブリノゲン及びグロブリンからなる群より選択される。一つの実施態様において、結合体の血漿タンパク質部分は、アルブミン又はトランスフェリンである。幾つかの実施態様において、リンカーは、１〜約６０個、又は１〜３０個以上の原子長さ、２〜５個の原子、２〜１０個の原子、５〜１０個の原子又は１０〜２０個の原子長さの原子鎖を含む。幾つかの実施態様において、鎖原子は全て炭素原子である。幾つかの実施態様において、リンカーの主鎖の鎖原子は、Ｃ、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群より選択される。鎖原子及びリンカーは、より溶解性のある結合体をもたらすと予想される溶解性（親水性）に従って選択することができる。幾つかの実施態様において、リンカーは、酵素若しくは他の触媒による切断、又は標的組織若しくは臓器若しくは細胞において見出される加水分解的条件による切断の対象となる官能基を提供する。幾つかの実施態様において、リンカーの長さは、立体障害の潜在性を低減するのに十分な長さである。リンカーが共有結合又はペプチジル結合であり、結合体がポリペプチドである場合、結合体は全体が融合タンパク質であることができる。そのようなペプチジルリンカーは任意の長さであることができる。例示的なリンカーは、約１〜５０個のアミノ酸長さ、５〜５０個、３〜５個、５〜１０個、５〜１５個又は１０〜３０個のアミノ酸長さである。そのような融合タンパク質は、代替的には当業者に既知の組み換え遺伝子操作法により産生することができる。
上記に記述したように、幾つかの実施態様において、グルカゴン関連類縁体ペプチドは、免疫グロブリン又はその一部（例えば、可変部領域、ＣＤＲ又はＦｃ領域）に結合、例えば融合している。既知の種類の免疫グロブリン（Ｉｇ）には、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭが含まれる。Ｆｃ領域はＩｇ重鎖のＣ末端領域であり、これは、再循環（延長された半減期をもたらす）、抗体依存性細胞仲介細胞障害性（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞障害性（ＣＤＣ）のような活性を実施するＦｃ受容体への結合に関与している。
例えば、幾つかの定義によると、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、重鎖のＣｙｓ２２６からＣ末端まで伸びている。「ヒンジ領域」は、一般に、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０まで伸びている（他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、システイン結合に関わるシステインを整列することによりＩｇＧ１配列と整列させることができる）。ＩｇＧのＦｃ領域には２つの定常部ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３が含まれる。ヒトＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインは、通常、アミノ酸２３１からアミノ酸３４１まで伸びている。ヒトＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ３ドメインは、通常、アミノ酸３４２から酸４４７まで伸びている。免疫グロブリン又は免疫グロブリンのフラグメント若しくは領域のアミノ酸番号付けに関する参照は、全て、Kabat et al. 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Md.に基づいている。関連する実施態様において、Ｆｃ領域は、１つ以上の、ＣＨ１以外の免疫グロブリン重鎖の天然又は修飾定常部領域、例えばＩｇＧ及びＩｇＡのＣＨ２及びＣＨ３領域又はＩｇＥのＣＨ３及びＣＨ４領域を含むことができる。
適切な結合体部分は、ＦｃＲｎ結合部位を含む免疫グロブリン配列の一部を含む。サルベージ受容体であるＦｃＲｎは、免疫グロブリンを再循環して、血液循環に戻すことに関与する。ＦｃＲｎ受容体に結合するＩｇＧのＦｃ部分の領域は、Ｘ線結晶構造解析に基づいて記載されている（Burmeister et al. 1994, Nature 372:379）。ＦｃＲｎへのＦｃの主な接触領域は、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインの接合部に近接している。Ｆｃ−ＦｃＲｎ接触点は、全て単一Ｉｇ重鎖の範囲内である。主な接触部位には、ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基２４８、２５０〜２５７、２７２、２８５、２８８、２９０〜２９１、３０８〜３１１及び３１４、並びにＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３８５〜３８７、４２８及び４３３〜４３６が含まれる。
幾つかの結合体部分は、ＦｃγＲ結合部位（１つ又は複数）を含んでも含まなくてもよい。ＦｃγＲは、ＡＤＣＣ及びＣＤＣに関与する。ＦｃγＲと直接接触するＦｃ領域内の位置の例は、アミノ酸２３４〜２３９（低ヒンジ領域）、アミノ酸２６５〜２６９（Ｂ／Ｃループ）、アミノ酸２９７〜２９９（Ｃ′／Ｅループ）及びアミノ酸３２７〜３３２（Ｆ／Ｇ）ループである（Sondermann et al., Nature 406: 267-273, 2000）。ＩｇＥの低ヒンジ領域は、ＦｃＲＩ結合にも関わっている（Henry, et al., Biochemistry 36, 15568-15578, 1997）。ＩｇＡ受容体結合に関わる残基は、Lewisらにより記載されている（J Immunol. 175:6694-701, 2005）。ＩｇＥ受容体結合に関わるアミノ酸残基は、Sayers らにより記載されている（J Biol Chem. 279(34):35320-5, 2004）。
アミノ酸修飾を免疫グロブリンのＦｃ領域に行うことができる。そのような可変部Ｆｃ領域は、Ｆｃ領域のＣＨ３ドメイン（残基３４２〜４４７）に少なくとも１つのアミノ酸修飾、及び／又はＦｃ領域のＣＨ２ドメイン（残基２３１〜３４１）に少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。ＦｃＲｎに親和性の増加を付与すると考えられる突然変異には、Ｔ２５６Ａ、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ及びＮ４３４Ａが含まれる（Shields et al. 2001, J. Biol. Chem. 276:6591）。他の突然変異は、ＦｃＲｎの親和性を有意に低減することなく、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ及び／又はＦｃγＲＩＩＩＡへのＦｃ領域の結合を低減することができる。例えば、Ａｌａ又は他のアミノ酸によるＦｃ領域の２９７位のＡｓｎの置換は、高度に保存されたＮ−グリコシル化部位を除去し、Ｆｃ領域の延長された半減期を伴って免疫原性の低減、また、ＦｃγＲへの結合の低減をもたらすことができる（Routledge et al. 1995, Transplantation 60:847; Friend et al. 1999, Transplantation 68:1632; Shields et al. 1995, J. Biol. Chem. 276:6591）。ＦｃγＲへの結合を低減する、ＩｇＧ１の２３３〜２３６位でのアミノ酸の修飾が行われた（Ward and Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77 and Armour et al. 1999, Eur. J. Immunol. 29:2613）。幾つかの例示的なアミノ酸置換は、米国特許第７，３５５，００８号及び同第７，３８１，４０８号に記載されており、それぞれその全体が参照として本明細書に組み込まれる。
融合ペプチド−Ｃ末端延長
特定の実施態様において、グルカゴン関連類縁体ペプチドペプチドは、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号６２４）、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−ＣＯＮＨ２（配列番号７２３）、オキシントモジュリンカルボキシ末端延長、ＫＲＮＲＮＮＩＡ（配列番号６２５）又はＫＧＫＫＮＤＷＫＨＮＩＴＱ（配列番号６６２）が含まれるが、これらに限定されない、Ｃ末端又はＣ末端アミノ酸配列を含むことができる。例えば、エキセンディン−４の末端の１０個のアミノ酸（すなわち、配列番号６２４の配列（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ））は、本開示のクラス１グルカゴン関連類縁体ペプチド、クラス２グルカゴン関連類縁体ペプチド、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチド、クラス４グルカゴン関連類縁体ペプチド又はクラス５グルカゴン関連類縁体ペプチドのカルボキシ末端に結合している。
減量を誘導する別の化合物は、オキシントモジュリンであり、これは小腸において見出された天然に生じる消化ホルモンである（Diabetes 2005; 54:2390-2395を参照すること）。オキシントモジュリンは、グルカゴンの２９アミノ酸配列、その後に続く配列番号６２５（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）の８アミノ酸カルボキシ末端延長を含有する、３７アミノ酸ペプチド（配列番号６６１）である。したがって、一つの実施態様において、配列番号６２５の配列のカルボキシ末端延長又は配列ＫＲＮＲを有する４アミノ酸延長を更に含む、グルカゴン関連類縁体ペプチドのプロドラッグ誘導体が提供される。
グルカゴン関連類縁体ペプチドの作製方法
本明細書に開示されているこのグルカゴン関連類縁体ペプチド（及びプロドラッグ）を、標準的な合成方法、組み換えＤＮＡ技術又はペプチド及び融合タンパク質を調製する他の任意の方法により調製することができる。特定の非天然アミノ酸を標準的な組み換えＤＮＡ技術により発現することはできないが、それらを調製する技術は当該技術において知られている。非ペプチド部分を包含する本発明の化合物を、適用可能であれば、標準的なペプチド化学反応に加えて、標準的な有機化学反応により合成することができる。
グルカゴン関連類縁体ペプチドのクラスは、以下において詳細に記載される。クラス１、２、３、４及び５グルカゴン関連類縁体ペプチドに関する開示のそれぞれのセクションに関して、修飾は、上記に詳述されたプロドラッグ化合物のグルカゴン関連類縁体ペプチド部分に関して記載される。したがって、グルカゴン関連類縁体ペプチドのクラスに関して記載される構造要素は、更に修飾されて上記に記載されたプロドラッグ化合物を生じる生体活性ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の構造要素である。
クラス１グルカゴン関連類縁体ペプチド
特定の実施態様において、グルカゴン関連類縁体ペプチドはクラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドであり、本明細書、並びに国際特許出願公報第２００８／０８６０８６号（２００８年７月１７日公開）及び米国仮出願第６１／０９０，４１５号に記載されており、その内容は全体が参照として本明細書に組み込まれる。
活性
クラス１グルカゴンペプチドは、天然グルカゴンペプチド（配列番号７０１）に対してグルカゴン受容体活性を保持する。例えば、グルカゴンペプチドは、天然グルカゴンの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％の活性、８０％の活性、８５％の活性又は９０％の活性を保持することができる（例えば実施例２に一般的に記載されているアッセイを使用するｃＡＭＰ産生により測定した、グルカゴンペプチド対グルカゴンのＥＣ５０の逆比として計算）。一つの実施態様において、クラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドは、グルカゴンと同じ又はそれを超える活性（本明細書において、用語「効力」と同義的に使用される）を有する。
本明細書に記載されている任意のクラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドは、例えば実施例２のアッセイを使用して、グルカゴン受容体を過剰発現しているＨＥＫ２９３細胞におけるｃＡＭＰ誘導について試験したとき、約１００nM、７５nM、５０nM、４０nM、３０nM、２０nM、１０nM、５nM、１nM又はそれ以下のＥＣ５０をヒトグルカゴン受容体において示すことができる。典型的なペグ化ペプチドは、非ペグ化ペプチドと比較するとより高いＥＣ５０を示す。
幾つかの実施態様において、クラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドは、ＧＬＰ−１受容体において天然ＧＬＰ−１の約５％、４％、３％、２％若しくは１％未満の活性を示す及び／又はＧＬＰ−１受容体と比較してグルカゴン受容体に約５倍、１０倍若しくは１５倍を超える選択性を示す。例えば、幾つかの実施態様において、クラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドは、ＧＬＰ−１受容体において天然ＧＬＰ−１の５％未満の活性を示し、ＧＬＰ−１受容体と比較してグルカゴン受容体に５倍を超える選択性を示す。
改善された溶解性
天然グルカゴンは、特に生理学的ｐＨで水溶液に不十分な溶解性しか示さず、経時的に凝集及び沈殿する傾向がある。対照的に、クラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドは、一つの実施態様において、２５℃で２４時間後の６〜８又は６〜９のｐＨ、例えばｐＨ７で天然グルカゴンと比較して少なくとも２倍、５倍又はそれよりもさらに高い溶解性を示す。
したがって、一つの実施態様において、クラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドは、Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ（配列番号７０１）の野生型ペプチドに対して修飾されて、特に約５．５〜約８．０のｐＨ範囲で水溶液におけるペプチドの溶解性改善し、同時に、天然ペプチドの生物学的活性を保持する。
例えば、本明細書に記載されている任意のクラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドは、親水性部分をペプチドに結合することによって更に改善することができる。そのような基の導入も、例えば延長された循環半減期により測定すると、作用の持続時間を増加する。親水性部分は本明細書において更に記載される。
荷電残基による修飾
一つの実施態様において、溶解性は、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸及びグルタミン酸からなる群より選択される荷電アミノ酸での天然非荷電アミノ酸の置換によりクラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドに電荷を付加する又は荷電アミノ酸をペプチドのアミノ若しくはカルボキシ末端に付加することによって改善される。
一つの実施態様によると、クラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドは、ペプチドが、荷電アミノ酸をペプチドのＣ末端部分に、一つの実施態様では、配列番号７０１の２７位のＣ末端側の位置に導入する、アミノ酸置換及び／又は付加により修飾されるという事実によって、改善された溶解性を有する。場合により、１、２又は３個の荷電アミノ酸を、Ｃ末端部分の範囲内に、一つの実施態様ではＣ末端から２７位に導入することができる。一つの実施態様によると、２８位及び／又は２９位の天然アミノ酸が荷電アミノ酸で置換されている、並びに／或いは１〜３個の荷電アミノ酸がペプチドのＣ末端、例えば２７、２８又は２９位の後ろに付加されている。例示的な実施態様において、１、２、３個又は全ての荷電アミノ酸は、負に荷電されている。他の実施態様において、１、２、３個又は全ての荷電アミノ酸は、正に荷電されている。
特定の例示的な実施態様において、クラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドは、以下の修飾の任意の１又は２つを含むことができる：ＥによるＮ２８の置換；ＤによるＮ２８の置換；ＤによるＴ２９の置換；ＥによるＴ２９の置換；２７、２８又は２９位の後ろへのＥの挿入；２７、２８又は２９位の後ろへのＤの挿入。例えば、Ｄ２８Ｅ２９、Ｅ２８Ｅ２９、Ｅ２９Ｅ３０、Ｅ２８Ｅ３０、Ｄ２８Ｅ３０である。
一つの例示的な実施態様によると、クラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号７１１のアミノ酸配列、又は天然グルカゴン若しくはそのグルカゴンアゴニスト類縁体に対して１〜３個の更なるアミノ酸修飾（グルカゴンアゴニストについて本明細書において記載されている）を含有するその類縁体を含む。配列番号７１１は、天然タンパク質の２８位のアスパラギン残基がアスパラギン酸で置換されている修飾されたクラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドを表す。別の例示的な実施態様において、クラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドは、天然タンパク質の２８位のアスパラギン残基がグルタミン酸で置換されている配列番号７３８のアミノ酸配列を含む。他の例示的な実施態様は、配列番号７２４、７２５、７２６、７３３、７３５、７３６及び７３７のクラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドを含む。
２８及び／若しくは２９位において通常に生じるアミノ酸を荷電アミノ酸で置換すること並びに／又はクラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドのカルボキシ末端に１〜２個の荷電アミノ酸を付加することは、生理学的なｐＨ（すなわち、約６．５〜約７．５のｐＨ）の水溶液におけるグルカゴンペプチドの溶解性及び安定性を、少なくとも５倍増強し、３０倍まで増強する。したがって、一つの実施態様のクラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドは、グルカゴン活性を保持し、２５℃で２４時間後に測定したとき、約５５〜８の所定のｐＨ、例えばｐＨ７で天然グルカゴンに対して少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２５倍、３０倍又はそれ以上の溶解性を示す。
グルカゴン活性を依然として保持することが可能であるような追加的な修飾、例えば保存的置換（この修飾は本明細書において更に記載される）をクラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドに行うことができる。
改善された安定性
任意のクラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドは、追加的に、例えば２５℃で２４時間後に元のペプチドの少なくとも９５％を保持する、改善された安定性及び／又は低減された分解を示してもよい。本明細書に開示される任意のクラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドは、追加的に、例えば２５℃で２４時間後に元のペプチドの少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％を保持する、５．５〜８の範囲内のｐＨにおいて改善された安定性を示すことができる。クラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドは、その薬学的特性を変える追加的な修飾、例えば、効力の増加、循環半減期の延長、保存寿命の増加、沈殿若しくは凝集の低減及び／又は分解の低減、例えば保存後の切断若しくは化学修飾の発生の低減を含むことができる。
更なる例示的な実施態様において、前記のクラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドのいずれかを、配列番号７０１の１５位のアミノ酸を修飾して特に酸性又はアルカリ性の緩衝剤におけるペプチドの経時的な分解を低減することによって、更に修飾して安定性を改善することができる。例示的な実施態様において、１５位のＡｓｐは、Ｇｌｕ、ホモ−Ｇｌｕ、システイン酸又はホモ−システイン酸で置換されている。
あるいは、本明細書に記載されているクラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドのいずれかを、配列番号７０１の１６位のアミノ酸を修飾することより更に修飾して、安定性を改善することができる。例示的な実施態様において、１６位のＳｅｒは、Ｔｈｒ若しくはＡＩＢにより又はグルカゴン受容体における抗力を増強する、クラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドに関して本明細書に記載されているアミノ酸置換のいずれかにより置換されている。そのような修飾は、Ａｓｐ１５−Ｓｅｒ１６のペプチド結合の切断を低減する。
幾つかの実施態様において、本明細書に記載されているクラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドのいずれかを、２０、２１，２４又は２７の位置のうちの１、２、３つのいずれか又は４つを全て修飾することより更に修飾して、多様なアミノ酸位置での分解を低減することができる。例示的な実施態様には、Ａｌａ又はＡＩＢによる２０位のＧｌｎの置換、Ｇｌｕによる２１位のＡｓｐの置換、Ａｌａ又はＡＩＢによる２４位のＧｌｎの置換、Ｌｅｕ又はＮｌｅによる２７位のＭｅｔの置換が含まれる。メチオニンの除去又は置換は、メチオニンの酸化に起因して分解を低減する。Ｇｌｎ又はＡｓｎの除去又は置換は、Ｇｌｎ又はＡｓｎの脱アミド化に起因して分解を低減する。Ａｓｐの除去又は置換は、Ａｓｐの脱水により環状スクシンイミド中間体を形成し、続く異性化によりイソアスパラギン酸塩を形成することにより生じる分解を低減する。
増強された効力
別の実施態様によると、ペプチドが天然グルカゴン（配列番号７０１）の１６位にアミノ酸修飾を含む、グルカゴン受容体において増強された効力を有するクラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドが提供される。非限定例によると、そのような増強された効力は、１６位の天然に生じるセリンをグルタミン酸により又は４原子の長さの側鎖を有する別の負荷電アミノ酸により、あるいはグルタミン、ホモグルタミン酸若しくはホモシステイン酸のいずれかにより、又は少なくとも１個のヘテロ原子（例えば、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ）を含有する側鎖であり、約４（若しくは３〜５）原子長さの側鎖を有する荷電アミノにより置換することによってもたらすことができる。グルタミン酸による１６位のセリンの置換は、グルカゴン活性を、グルカゴン受容体において少なくとも２倍、４倍、５倍及び１０倍を超えるまで増強する。幾つかの実施態様において、クラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドは、ＧＬＰ−１受容体に対してよりもグルカゴン受容体に対して選択性を保持し、例えば少なくとも５倍、１０倍又は１５倍の選択性である。
ＤＰＰ−ＩＶ耐性
幾つかの実施態様において、本明細書に開示されているクラス１グルカゴンペプチドは、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断に対する感受性を低減するために、１又は２位において更に修飾されている。より詳細には、幾つかの実施態様において、クラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドの１及び／又は２位は、本明細書に記載されるＤＰＰ−ＩＶ耐性アミノ酸で置換されている。一つの実施態様において、類縁体ペプチドの２位は、アミノイソ酪酸で置換されている。一つの実施態様において、類縁体ペプチドの２位は、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、グリシン、Ｎ−メチルセリン及びε−アミノ酪酸からなる群より選択されるアミノ酸で置換されている。別の実施態様において、クラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドの２位は、Ｄ−セリン、グリシン及びアミノイソ酪酸からなる群より選択されるアミノ酸で置換されている。
グルカゴンペプチドの１位及び／又は２位のアミノ酸の修飾によるグルカゴン活性の低減は、グルカゴンペプチドのＣ末端部分（アミノ酸１２〜２９付近）のアルファ−へリックス構造の安定化により回復することができる。アルファ−へリックス構造は、例えば、共有又は非共有分子内架橋（例えば、位置「ｉ」と「ｉ＋４」（ここでｉは、１２〜２５の整数である）のアミノ酸の側鎖の間のラクタム架橋）の形成、アルファ−へリックス安定化アミノ酸（例えば、α，α−二置換アミノ酸）による１２〜２９位付近のアミノ酸の置換及び／又は挿入により安定化することができ、本明細書において更に記載される。
３位の修飾によるグルカゴン活性の低減
グルカゴン受容体活性は、３位のアミノ酸修飾により、例えば任意のアミノ酸による３位の天然に生じるグルタミンの置換により、低減することができる。酸性、塩基性又は疎水性アミノ酸（グルタミン酸、オルチニン、ノルロイシン）によるこの位置での置換は、グルカゴン受容体活性を実質的に低減又は破壊する。
Ｃ末端アミド及びエステルによるＧＬＰ−１活性の増強
ＧＬＰ−１受容体における増強された活性は、Ｃ末端アミノ酸のカルボン酸を、アミド又はエステルのような電荷中性基で置換することによってもたらされる。逆に、ペプチドのＣ末端の天然カルボン酸の保持は、ＧＬＰ−１受容体よりもグルカゴン受容体に対するクラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドの比較的大きな選択性（例えば、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０倍を超える）を維持する。
更なる修飾及び組み合わせ
溶解度及び／又は安定性及び／又はグルカゴン活性を更に増加することができるような追加的な修飾をクラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドに行うことができ溶解性る。クラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドは、代替的に、溶解性又は安定性に実質的に影響を与えない及びグルカゴン活性を実質的に減少しない他の修飾を含むことができる。例示的な実施態様において、クラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドは、天然グルカゴン配列に対して、合計で１１個まで又は１２個まで又は１３個まで又は１４個までのアミノ酸修飾を含むことができる。例えば、保存的又は非保存的置換、付加又は欠失を、２、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８又は２９位のいずれかにおいて実施することができる。
クラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドの例示的な修飾には、下記が含まれるが、これらに限定されない：
（ａ）少なくとも部分的なグルカゴンアゴニスト活性を保持しながらの非保存的置換、保存的置換、付加又は欠失、例えば、２、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８又は２９位の１つ以上での保存的置換、Ｖａｌ又はＰｈｅによる１０位のＴｙｒの置換、Ａｒｇによる１２位のＬｙｓの置換、Ａｌａによるこれらの位置の１つ以上での置換；
（ｂ）少なくとも部分的なグルカゴンアゴニスト活性を保持しながらの、２９及び／又は２８位、並びに場合により２７位のアミノ酸の欠失；
（ｃ）分解を低減しうる、例えばグルタミン酸、ホモグルタミン酸、システイン酸若しくはホモシステイン酸での置換による、１５位のアスパラギン酸の修飾；又は、Ａｓｐ１５−Ｓｅｒ１６結合の切断による分解を同様に低減しうる、例えばトレオニン、ＡＩＢ、グルタミン酸での置換、若しくは４原子の長さの側鎖を有する別の負荷電アミノ酸での置換、あるいはグルタミン、ホモグルタミン酸若しくはホモシステイン酸のいずれかでの置換による、１６位のセリンの修飾；
（ｄ）溶解性及び／又は半減期を増加しうる、例えば１６、１７、２０、２１、２４、２９、４０位又はＣ末端アミノ酸への、本明細書に記載されている水溶性ポリマーのポリエチレングリコールのような親水性部分の付加；
（ｅ）酸化分解を低減するための、例えばロイシン又はノルロイシンでの置換による２７位のメチオニンの修飾；
（ｆ）Ｇｌｎの脱アミド化を介して生じる分解を低減するための、例えばＡｌａ又はＡＩＢでの置換による２０又は２４位のＧｌｎの修飾；
（ｇ）Ａｓｐの脱水により環状スクシンイミド中間体を形成し、続いて異性化によりイソアスパラギン酸塩を形成することにより生じる分解を低減するための、例えばＧｌｕでの置換による２１位のＡｓｐの修飾；
（ｈ）場合により「ｉ」と「ｉ＋４」（ここでｉは、１２〜２５、例えば１２，１６、２０、２４の整数である）の位置の間のラクタム架橋のような分子内架橋と組み合わせてもよい、ＤＰＰ−ＩＶ切断への耐性を改善する、本明細書に記載されている１又は２位での修飾；
（ｉ）場合により親水性部分の付加と組み合わせてもよい、循環半減期を増加しうる及び／又は作用持続時間を延長しうる及び／又は作用の開始を遅延しうる、本明細書に記載されているグルカゴンペプチドのアシル化；
（ｊ）本明細書に記載されているＣ末端延長；
（ｋ）本明細書に記載されているホモ二量体化又はヘテロ二量体化；並びに
（ａ）〜（ｋ）の組み合わせ。
一つの実施態様において、クラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドの例示的な修飾には、Ａ群から選択される少なくとも１個のアミノ酸修飾、並びにＢ群及び／又はＣ群から選択される１個以上のアミノ酸修飾が含まれ、
Ａ群は、
荷電アミノ酸による２８位のＡｓｎの置換；
Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸及びホモシステイン酸からなる群より選択される荷電アミノ酸による２８位のＡｓｎの置換；
Ａｓｎ、Ａｓｐ又はＧｌｕによる２８位での置換；
Ａｓｐによる２８位での置換；
Ｇｌｕによる２８位での置換；
荷電アミノ酸による２９位のＴｈｒの置換；
Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸及びホモシステイン酸からなる群より選択される荷電アミノ酸による２９位のＴｈｒの置換；
Ａｓｎ、Ｇｌｕ又はＬｙｓによる２９位での置換；
Ｇｌｕによる２９位での置換；
２９位の後への１〜３個の荷電アミノ酸の挿入；
２９位の後へのＧｌｕ又はＬｙｓの挿入；
２９位の後へのＧｌｕ−Ｌｙｓ又はＬｙｓ−Ｌｙｓの挿入；或いは
これらの組み合わせであり、
Ｂ群は、
Ｇｌｕによる１５位のＡｓｐの置換；
Ｔｈｒ又はＡＩＢによる１６位のＳｅｒの置換であり、
Ｃ群は、
ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断に対するグルカゴンペプチドの感受性を低減する、非天然アミノ酸による１位のＨｉｓの置換；
ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）により切断に対するグルカゴンペプチドの感受性を低減する、非天然アミノ酸による２位のＳｅｒの置換；
Ａｒｇによる１２位のＬｙｓの置換；
Ａｌａ又はＡＩＢによる２０位のＧｌｎの置換；
Ｇｌｕによる２１位のＡｓｐの置換；
Ａｌａ又はＡＩＢによる２４位のＧｌｎの置換；
Ｌｅｕ又はＮｌｅによる２７位のＭｅｔの置換；
２７〜２９位のアミノ酸の欠失；
２８〜２９位のアミノ酸の欠失；
２９位のアミノ酸の欠失；或いは
これらの組み合わせである。
例示的な実施態様において、１２位のＬｙｓはＡｒｇで置換されている。別の例示的な実施態様において、２９及び／又は２８位、並びに場合により２７位のアミノ酸は、欠失している。
幾つかの特定の実施態様において、グルカゴンペプチドは、（ａ）ＤＰＰ−ＩＶ耐性を付与する１及び／又は２位でのアミノ酸修飾、例えば１位でのＤＭＩＡによる又は２位でのＡＩＢによる置換、（ｂ）１２〜２９位の範囲内、例えば１６及び２０位の分子内架橋又はα，α二置換アミノ酸による１６，２０、２１及び２４位のアミノ酸の１個以上の置換、場合により（ｃ）例えば２４、２９位又はＣ末端アミノ酸のＣｙｓを介したＰＥＧのような親水性部分への結合、場合により（ｄ）例えばＮｌｅでＭｅｔを置換する２７位でのアミノ酸修飾、場合により（ｅ）分解を低減する２０、２１、及び２４位でのアミノ酸修飾、並びに場合により（ｆ）配列番号７２０への結合を含む。別の特定の実施態様において、グルカゴンペプチドは、（ａ）Ａｓｐ２８Ｇｌｕ２９又はＧｌｕ２８Ｇｌｕ２９又はＧｌｕ２９Ｇｌｕ３０又はＧｌｕ２８Ｇｌｕ３０又はＡｓｐ２８Ｇｌｕ３０、場合により（ｂ）例えばＴｈｒ又はＡＩＢでＳｅｒを置換する１６位でのアミノ酸修飾、場合により（ｃ）例えばＮｌｅでＭｅｔを置換する２７位でのアミノ酸修飾、並びに場合により分解を低減する２０、２１及び２４位でのアミノ酸修飾を含む。特定の実施態様において、グルカゴンペプチドは、Ｔ１６、Ａ２０、Ｅ２１、Ａ２４、Ｎｌｅ２７、Ｄ２８、Ｅ２９である。
一つの実施態様において、クラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドは、１〜３個のアミノ酸修飾を有する、アミノ酸配列：
Ｘ１−Ｘ２−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｚ（配列番号７３９）を含み、
ここで、Ｘ１及び／又はＸ２は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断に対するグルカゴンペプチドの感受性を低減する（又は耐性を増加する）、非天然アミノ酸であり、
Ｚは、−ＣＯＯＨ（天然に生じるＣ−末端カルボキシレート）、−Ａｓｎ−ＣＯＯＨ、Ａｓｎ−Ｔｈｒ−ＣＯＯＨ及びＹ−ＣＯＯＨからなる群より選択され、Ｙは１〜２個のアミノ酸であり、
分子内架橋、好ましくは共有結合は、ｉの位置のアミノ酸の側鎖と、ｉ＋４の位置のアミノ酸の側鎖を連結し、ｉは、１２、１６、２０又は２４である。
幾つかの実施態様において、分子内架橋はラクタム架橋である。幾つかの実施態様において、配列番号７３９のｉ及びｉ＋４の位置のアミノ酸は、Ｌｙｓ及びＧｌｕ、例えばＧｌｕ１６及びＬｙｓ２０である。幾つかの実施態様において、Ｘ１は、Ｄ−Ｈｉｓ、Ｎ−メチル−Ｈｉｓ、アルファ−メチル−Ｈｉ、イミダゾール酢酸、デス−アミノ−Ｈｉｓ、ヒドロキシル−Ｈｉｓ、アセチル−Ｈｉｓ、ホモ−Ｈｉｓ及びアルファ，アルファ−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）からなる群より選択される。他の実施態様において、Ｘ２は、Ｄ−Ｓｅｒ、Ｄ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｎ−メチル−Ｓｅｒ、Ｖａｌ及びアルファ，アルファイソ酪酸（ＡＩＢ）からなる群より選択される。幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドは、Ｃ末端延長の範囲内のアミノ酸位置１６、１７、２０、２１、２４、２９、４０のいずれか又はＣ末端アミノ酸で親水性部分と共有結合している。例示的な実施態様において、この親水性部分は、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステイン又はアセチル−フェニルアラニン残基に、これらの位置のいずれかにおいて共有結合している。例示的な親水性部分には、例えば１，０００ダルトンから約４０，０００ダルトン又は約２０，０００ダルトンから約４０，０００ダルトンの分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。
別の実施態様において、クラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドは、アミノ酸配列：
Ｘ１−Ｘ２−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｚ（配列番号７３９）を含み、
ここで、Ｘ１及び／又はＸ２は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断に対するグルカゴンペプチドの感受性を低減する（又は耐性を増加する）、非天然アミノ酸であり、
グルカゴンペプチドの１６、２０、２１及び２４位の１、２、３、４つ又はそれ以上は、α，α−二置換アミノ酸で置換されており、
Ｚは、−ＣＯＯＨ（天然に生じるＣ−末端カルボキシレート）、−Ａｓｎ−ＣＯＯＨ、Ａｓｎ−Ｔｈｒ−ＣＯＯＨ及びＹ−ＣＯＯＨからなる群より選択され、Ｙは１〜２個のアミノ酸である。
前記のクラス１グルカゴン関連類縁体ペプチド又は類縁体への例示的な更なるアミノ酸修飾には、Ａｒｇによる１２位のＬｙｓの置換；Ｇｌｕによる１５位のＡｓｐの置換；Ｔｈｒ若しくはＡＩＢによる１６位のＳｅｒの置換；Ａｌａ若しくはＡＩＢによる２０位のＧｌｎの置換；Ｇｌｕによる２１位のＡｓｐの置換；Ａｌａ若しくはＡＩＢによる２４位のＧｌｎの置換；Ｌｅｕ若しくはＮｌｅによる２７位のＭｅｔの置換；荷電アミノ酸による２８位のＡｓｎの置換；Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸及びホモシステイン酸からなる群より選択される荷電アミノ酸による２８位のＡｓｎの置換；Ａｓｎ、Ａｓｐ若しくはＧｌｕによる２８位での置換；Ａｓｐによる２８位での置換；Ｇｌｕによる２８位での置換；荷電アミノ酸による２９位のＴｈｒの置換；Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸及びホモシステイン酸からなる群より選択される荷電アミノ酸による２９位のＴｈｒの置換；Ａｓｐ、Ｇｌｕ若しくはＬｙｓによる２９位での置換；Ｇｌｕによる２９位での置換；２９位の後への１〜３個の荷電アミノ酸のよる挿入；Ｇｌｕ若しくはＬｙｓの３０位（すなわち、２９位の後）への挿入；場合によりＬｙｓの３１位への挿入；Ｃ末端への配列番号７２０の付加；或いはこれらの組み合わせが含まれる。
グルカゴン受容体活性を増加する、部分的なグルカゴン受容体活性を保持する、溶解性を改善する、安定性を増加する、又は分解を低減するような、クラス１グルカゴンアゴニストについて上記に記載された修飾のいずれも、クラス１グルカゴンペプチドに個別に又は組み合わせて適用することができる。したがって、グルカゴン受容体において天然グルカゴンの少なくとも２０％の活性を保持し、６〜８又は６〜９のｐＨ（例えば、ｐＨ７）で少なくとも１mg/mLの濃度で溶解性であり、場合により２５℃で２４時間後、元のペプチドの少なくとも９５％を保持する（例えば、元のペプチドの５％以下が分解又は切断される）、クラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドを調製することができる。あるいは、グルカゴン受容体において天然グルカゴンの少なくとも約１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％又は１０倍以上の活性を示し、場合により６〜８又は６〜９のｐＨ（例えば、ｐＨ７）で少なくとも１mg/mLの濃度で溶解性であり、場合により２５℃で２４時間後、元のペプチドの少なくとも９５％を保持する（例えば、元のペプチドの５％以下が分解又は切断される）、高い効力のクラス１グルカゴンペプチドを調製することができる。
クラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドの実施態様の例
一つの実施態様によると、配列番号７０１の天然グルカゴンペプチドは、負荷電アミノ酸（例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）による２８及び／又は２９位の天然アミノ酸の置換及び場合によりペプチドのカルボキシ末端への負荷電アミノ酸（例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）の付加によって修飾される。代替的な実施態様において、配列番号７０１の天然グルカゴンペプチドは、正電荷アミノ酸（例えば、リシン、アルギニン又はヒスチジン）による２９位の天然アミノ酸の置換及び場合によりペプチドのカルボキシ末端への１〜２個の正荷電アミノ酸（例えば、リシン、アルギニン又はヒスチジン）の付加により修飾される。一つの実施態様によると、ペプチドが配列番号７３４のアミノ酸配列を含むが、但し、２８又は２９位の少なくとも１個のアミノ酸が酸性アミノ酸で置換されている及び／又は追加の酸性アミノ酸が配列番号７３４カルボキシ末端に付加されている、改善された溶解性及び安定性を有するクラス１グルカゴン関連類縁体ペプチド提供される。一つの実施態様において、酸性アミノ酸は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸及びホモシステイン酸からなる群より独立して選択される。
一つの実施態様によると、配列番号７３３アミノ酸配列を含むアゴニストであって、２７、２８又は２９位の少なくとも１個のアミノ酸が非天然アミノ酸残基で置換されている（すなわち、類縁体の２７、２８又は２９位に存在する少なくとも１個のアミノ酸が配列番号７０１の対応する位置に存在するアミノ酸と異なる酸性アミノ酸である）、改善された溶解性及び安定性を有するクラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドが提供される。一つの実施態様によると、配列番号７３３の配列を含むが、但し、２８位のアミノ酸がアスパラギンであり、２９位のアミノ酸がトレオニンである場合、ペプチドが、グルカゴンペプチドのカルボキシ末端に付加されるＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ又はＧｌｕからなる群より独立して選択される１〜２個のアミノ酸を更に含む、クラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドが提供される。
天然グルカゴンペプチドの特定の位置を修飾し、同時に母体ペプチドの活性の少なくとも一部分を保持できることが報告されている。したがって、出願人たちは、配列番号７１１のペプチドの２、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８又は２９位の位置に配置されている１個以上のアミノ酸を、天然グルカゴンペプチドに存在するものと異なるアミノ酸で置換し、依然として増強された抗力、生理学的ｐＨでの安定性及び母体グルカゴンペプチドの生物学的活性を保持できると予測する。例えば、一つの実施態様によると、天然ペプチドの２７位に存在するメチオニン残基をロイシン又はノルロイシン又はノルロイシンに変えて、ペプチドの酸化分解を防止する。
一つの実施態様において、１、２、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２４位から選択される１〜６個のアミノ酸が配列番号７０１の対応するアミノ酸と異なる、配列番号７３３のクラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドが提供される。別の実施態様によると、ペプチドの１、２、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２４位から選択される１〜３個のアミノ酸が配列番号７０１の対応するアミノ酸と異なる、配列番号７３３のクラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドが提供される。別の実施態様において、ペプチドの１、２、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２４位から選択される１〜２個のアミノ酸が配列番号７０１の対応するアミノ酸と異なる、配列番号７０７、配列番号７０８又は配列番号７３４のクラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドが提供され、更なる実施態様において、１〜２個の異なるアミノ酸は、天然配列（配列番号７０１）に存在するアミノ酸に対して保存的アミノ酸置換を表す。一つの実施態様において、グルカゴンペプチドが２、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７又は２９位から選択される位置で１、２又は３個のアミノ酸置換を更に含む、配列番号７１１又は配列番号７１３のクラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドが提供される。一つの実施態様において、２、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２７又は２９位での置換は、保存的アミノ酸置換である。
一つの実施態様において、配列番号７０１の類縁体ペプチドを含むクラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドであって、２位にセリン以外のアミノ酸を有すること及び２８若しくは２９位の天然アミノ酸の酸性アミノ酸置換を有することによって又は配列番号７０１のペプチドのカルボキシ末端に付加された酸性アミノ酸によって配列番号７０１と異なるペプチドが提供される。一つの実施態様において、酸性アミノ酸は、アスパラギン酸又はグルタミン酸である。一つの実施態様において、ペプチドが２位での置換により母体分子と異なっている、配列番号７０９、配列番号７１２、配列番号７１３又は配列番号７３２のクラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドが提供される。より詳細には、ペプチドの２位は、Ｄ−セリン、アラニン、Ｄ−アラニン、グリシン、Ｎ−メチルセリン及びアミノイソ酪酸からなる群より選択されるアミノ酸で置換されている。
別の実施態様において、配列番号７０１の類縁体ペプチドを含むクラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドであって、１位にヒスチジン以外のアミノ酸を有すること及び２８若しくは２９位の天然アミノ酸の酸性アミノ酸置換を有することによって又は配列番号７０１のペプチドのカルボキシ末端に付加された酸性アミノ酸によって配列番号７０１と異なるペプチドが提供される。一つの実施態様において、酸性アミノ酸は、アスパラギン酸又はグルタミン酸である。一つの実施態様において、ペプチドが１位での置換により母体分子と異なっている、配列番号７０９、配列番号７１２、配列番号７１３又は配列番号７３２のクラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドが提供される。より詳細には、ペプチドの１位は、ＤＭＩＡ、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン及びホモ−ヒスチジンからなる群より選択されるアミノ酸で置換されている。
一つの実施態様によると、クラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号７０９、配列番号７１２、配列番号７１３及び配列番号７３２からなる群より選択される配列を含む。更なる実施態様において、配列番号７０９、配列番号７１２、配列番号７１３又は配列番号７３２の配列を含み、配列番号７０９、配列番号７１２、配列番号７１３又は配列番号７３２のＣ末端に付加された１〜２個のアミノ酸を更に含み、追加のアミノ酸がＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸又はホモシステイン酸からなる群より独立して選択される、クラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドが提供される。一つの実施態様において、カルボキシ末端に付加される追加のアミノ酸は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ又はＧｌｕからなる群より選択されるか、或いは更なる実施態様において、追加のアミノ酸は、Ａｓｐ又はＧｌｕである。
別の実施態様において、クラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号７０７又はそのグルカゴンアゴニスト類縁体の配列を含む。一つの実施態様において、ペプチドは、配列番号７０８、配列番号７１０、配列番号７１１、配列番号７１２及び配列番号７１３からなる群より選択される配列を含む。別の実施態様において、ペプチドは、配列番号７０８、配列番号７１０及び配列番号７１１からなる群より選択される配列を含む。一つの実施態様において、クラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドは、グルカゴンペプチドのＣ末端に付加される、Ａｓｐ及びＧｌｕからなる群より選択される追加のアミノ酸を更に含んで、配列番号７０８、配列番号７１０及び配列番号７１１の配列を含む。一つの実施態様において、クラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号７１１又は配列番号７１３の配列を含み、更なる実施態様において、グルカゴンペプチドは、配列番号７１１の配列を含む。
一つの実施態様によると、下記：
ＮＨ２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号７３４）、
ＮＨ２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｒ（配列番号７１１）、及び
ＮＨ２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｒ（配列番号７１３）
からなる群より選択される修飾グルカゴンペプチドを含むクラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドが提供され、
ここで、１５位のＸａａは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、ホモグルタミン酸又はホモシステイン酸であり、２８位のＸａａは、Ａｓｎ又は酸性アミノ酸であり、２９位のＸａａは、Ｔｈｒ又は酸性アミノ酸であり、Ｒは、酸性アミノ酸、ＣＯＯＨ又はＣＯＮＨ２であるが、但し、酸性酸残基は、２８、２９又は３０位のうちの１つに存在する。一つの実施態様において、ＲはＣＯＯＨであり、別の実施態様において、ＲはＣＯＮＨ２である。
より詳細には、クラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドは、グルカゴンペプチドＮＨ２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号７３４）を含むグルカゴンアゴニスト類縁体を含む融合グルカゴンペプチドであることができ、ここでＲは、酸性アミノ酸又は結合及びグルカゴンペプチド配列のカルボキシ末端アミノ酸に結合している配列番号７１３配列７２０（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）、配列番号７２１（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）又は配列番号７２２（ＫＲＮＲ）のアミノ酸配列である。 一つの実施態様において、グルカゴンペプチドは、グルカゴンペプチド配列のカルボキシ末端アミノ酸に結合している配列番号配列７２０（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）、配列番号７２１（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）又は配列番号７２２（ＫＲＮＲ）のアミノ酸配列を更に含む、配列番号７３３、配列番号７０７又は及び配列番号７０８からなる群より選択される。一つの実施態様において、グルカゴン融合ペプチドは、グルカゴン融合ペプチド配列のアミノ酸２９に結合している配列番号７２０（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）、配列番号７２１（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）又は配列番号７２２（ＫＲＮＲ）のアミノ酸配列を更に含んでいる、配列番号７０２、配列番号７０３、配列番号７０４、配列番号７０５及び配列番号７０６又はそのグルカゴンアゴニスト類縁体を含む。一つの実施態様によると、融合ペプチドは、１６、１７、２１、２４、２９位若しくはＣ末端延長内のアミノ酸、又はＣ末端アミノ酸に結合しているＰＥＧ鎖を更に含み、ここでＰＥＧ鎖は、５００から４０，０００ダルトンの範囲から選択される。一つの実施態様において、配列番号７２０（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）、配列番号７２１（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）又は配列番号７２２（ＫＲＮＲ）のアミノ酸配列は、ペプチド結合を介してグルカゴンペプチドのアミノ酸２９に結合している。一つの実施態様において、グルカゴン融合ペプチドのグルカゴンペプチド部分は、配列番号７１０、配列番号７１１及び配列番号７１３からなる群より選択される配列を含む。一つの実施態様において、グルカゴン融合ペプチドのグルカゴンペプチド部分は、配列番号７１１又は配列番号７１３の配列を含み、ここでＰＥＧ鎖は、２１、２４、２９位、Ｃ末端延長内、又はＣ末端アミノ酸にそれぞれ結合している。
別の実施態様において、融合ペプチドのグルカゴンペプチド配列は、アミノ酸２９に結合している配列番号７２０（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）、配列番号７２１（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）又は配列番号７２２（ＫＲＮＲ）のアミノ酸配列を更に含む、配列番号７１１の配列を含む。一つの実施態様において、グルカゴン融合ペプチドは、配列番号７２４、配列番号７２５及び配列番号７２６からなる群より選択される配列を含む。典型的には、本発明の融合ペプチドは、標準的なカルボン酸基を有するＣ末端アミノ酸を有する。しかし、Ｃ末端アミノ酸がカルボン酸に対してアミド置換を有するこれらの配列の類縁体も、実施態様として包含される。一つの実施態様によると、融合グルカゴンペプチドは、アミノ酸２９に結合している配列番号７２３（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−ＣＯＮＨ２）のアミノ酸配列を更に含んでいる、配列番号７１０、配列番号７１１及び配列番号７１３からなる群より選択されるグルカゴンアゴニスト類縁体を含む。
例示的なグルカゴンペプチドは、配列番号７０２、配列番号７０３、配列番号７０４、配列番号７０５、配列番号７０６、配列番号７０７、配列番号７０８、配列番号７０９、配列番号７１０、配列番号７１１及び配列番号７３３からなる群より選択され、ここで、グルカゴンペプチドのアミノ酸２９は、ペプチド結合を介して第２ペプチドに結合し、前記第２ペプチドは、配列番号７２０、配列番号７２１又は配列番号７２２の配列を含む。一つの実施態様において、グルカゴンペプチドはペグ化されている。
本明細書に記載されているクラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドを更に修飾して、水溶液中のペプチドの溶解性及び安定性を改善しながら、同時にグルカゴンペプチドの生物学的活性を保持することができる。一つの実施態様によると、配列番号７１１のペプチド又はそのグルカゴンアゴニスト類縁体の１６、１７、２０、２１、２４及び２９位から選択される１つ以上の位置への親水性基の導入は、溶解性及び安定性を改善すると予測される。より詳細には、一つの実施態様において、配列番号７１０、配列番号７１１、配列番号７１３又は配列番号７３２のクラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドは修飾されて、２１及び２４位に存在するアミノ酸の側鎖に共有結合している１つ以上の親水性基を含む。
一つの実施態様によると、配列番号７１１のクラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドは修飾されて、１６、１７、２０、２１、２４及び／又は２９位に１個以上のアミノ酸置換を含有し、ここで天然アミノ酸は、例えばＰＥＧを含む親水性部分との架橋に適した側鎖を有するアミノ酸で置換されている。天然ペプチドを、天然に生じるアミノ酸又は合成（非天然の）アミノ酸で置換することができる。合成又は非天然のアミノ酸とは、インビボで天然に生じないが、それでも、本明細書に記載されるペプチド構造に組み込むことができるアミノ酸を意味する。
一つの実施態様において、配列番号７１０、配列番号７１１又は配列番号７１３のクラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドであって、天然グルカゴンペプチド配列が修飾されて、天然に生じる又は合成のアミノ酸を天然配列の１６，１７、２１、２４、２９位、Ｃ末端延長内、又はＣ末端アミノ酸の少なくとも１つに含有するペプチドが提供され、ここで、アミノ酸置換は親水性部分を更に含む。一つの実施態様において、置換は２１又は２４位においてであり、更なる実施態様において、親水性部分はＰＥＧ鎖である。一つの実施態様において、配列番号７１１のクラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドは少なくとも１つのシステイン残基で置換されており、ここでシステイン残基の側鎖は、例えばマレイミド、ビニルスルホン、２−ピリジルチオ、ハロアルキル及びハロアシルを含むチオール反応性試薬により更に修飾される。これらのチオール反応試薬は、カルボキシ、ケト、ヒドロキシ及び他のエーテル基、並びにポリエチレングリコール単位のような他の親水性部分を含有することができる。代替的な実施態様において、天然グルカゴンペプチドはリシンで置換されており、置換リシン残基の側鎖は、カルボン酸の活性エスエル（スクシンイミド、無水物など）又はポリエチレングリコールのような親水性部分のアルデヒドのようなアミン反応性試薬を使用して更に修飾される。一つの実施態様において、クラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号７１４、配列番号７１５、配列番号７１６、配列番号７１７配列番号７１８及び配列番号７１９からなる群より選択される。
一つの実施態様によると、ペグ化クラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドは、グルカゴンペプチドに共有結合している２つ以上のポリエチレン鎖を含み、ここでグルカゴン鎖の総分子量は、約１，０００〜約５，０００ダルトンである。一つの実施態様において、ペグ化クラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号７０６のペプチドを含み、ここで、ＰＥＧ鎖は２１位及び２４位のアミノ酸残基に共有結合しており、２つのＰＥＧ鎖の合計した分子量は、約１，０００〜約５，０００ダルトンである。別の実施態様において、ペグ化クラス１グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号７０６のペプチドを含み、ここで、ＰＥＧ鎖は２１位及び２４位のアミノ酸残基に共有結合しており、２つのＰＥＧ鎖の合計した分子量は、約５，０００〜約２０，０００ダルトンである。
ポリエチレングリコール鎖は、直鎖の形態であってもよいし、分岐鎖であってもよい。一つの実施態様によると、ポリエチレングリコール鎖は、約５００〜約４０，０００ダルトンの範囲から選択される平均分子量を有する。一つの実施態様において、ポリエチレングリコール鎖は、約５００〜約５，０００ダルトンの範囲から選択される分子量を有する。別の実施態様において、ポリエチレングリコール鎖は、約２０，０００〜約４０，０００ダルトンの分子量を有する。
グルカゴンアゴニストは、グルカゴンアゴニスト活性を保持する１、２、３、４又は５個までの更なる修飾を場合により有する、配列番号７０１〜７５８のアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドであることができる。
クラス２グルカゴン関連類縁体ペプチド
特定の実施態様において、グルカゴン関連類縁体ペプチドはクラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドであり、これは本明細書及び米国仮出願第６１／０９０，４４８号に記載されており、その内容は全体が参照として本明細書に組み込まれる。
活性
天然グルカゴンは、ＧＩＰ受容体を活性化せず、通常、ＧＬＰ−１受容体に対する天然ＧＬＰ−１の活性の約１％の活性しか有さない。本明細書に記載されている天然グルカゴン配列に対する修飾は、天然グルカゴン（配列番号８０１）の活性と同等な若しくはよりも良好な強力なグルカゴン活性、天然ＧＩＰ（配列番号８０４）の活性と同等な若しくはよりも良好な強力なＧＩＰ活性、及び／又は、天然ＧＬＰ−１の活性と同等な若しくはよりも良好な強力なＧＬＰ−１活性を示すことができる、クラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドを産生する。この点において、クラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドは、グルカゴン／ＧＩＰコアゴニスト、グルカゴン／ＧＩＰ／ＧＬＰ−１トリアゴニスト、ＧＩＰ／ＧＬＰ−１コアゴニスト、又はＧＩＰアゴニストグルカゴンペプチドのうちの１つであってもよく、本明細書において更に記載される。
幾つかの実施態様において、本明細書に記載されているクラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドは、ＧＩＰ受容体活性化活性において約１００nM以下又は約７５、５０、２５、１０、８、６、５、４、３、２若しくは１nM以下のＥＣ５０を示す。幾つかの実施態様において、クラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドは、グルカゴン受容体活性化において約１００nM以下又は約７５、５０、２５、１０、８、６、５、４、３、２若しくは１nM以下のＥＣ５０を示す。幾つかの実施態様において、クラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドは、ＧＬＰ−１受容体活性化において約１００nM以下又は約７５、５０、２５、１０、８、６、５、４、３、２若しくは１nM以下のＥＣ５０を示す。受容体活性化は、受容体を過剰発現しているＨＥＫ２９３細胞におけるｃＡＭＰ誘導を測定するインビトロアッセイにより、例えば、実施例２に記載されているように、受容体をコードするＤＮＡと、ｃＡＭＰ応答配列に結合したルシフェラーゼ遺伝子とを同時形質移入されたＨＥＫ２９３細胞をアッセイすることにより、測定することができる。
幾つかの実施態様において、クラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドは、天然ＧＩＰ（ＧＩＰ効力）を基準として、ＧＩＰ受容体において少なくとも約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％若しくは２００％又はそれ以上の活性を示す。幾つかの実施態様において、クラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドは、グルカゴンを基準（グルカゴン効力）として、グルカゴン受容体において少なくとも約１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％若しくは５００％又はそれ以上の活性を示す。幾つかの実施態様において、クラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドは、天然ＧＬＰ−１を基準（ＧＬＰ−１効力）として、ＧＬＰ−１受容体において少なくとも約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％若しくは２００％又はそれ以上の活性を示す。受容体の天然リガンドを基準とする、受容体でのクラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドの活性は、クラス２グルカゴン関連類縁体ペプチド対天然リガンドのＥＣ５０の逆比として計算される。
一つの実施態様において、クラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドは、グルカゴン受容体及びＧＩＰ受容体の両方に対して活性を示す（「グルカゴン／ＧＩＰコアゴニスト）。これらのクラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドは、ＧＩＰ受容体と比べてグルカゴン受容体への天然グルカゴンの選択性を失っている。幾つかの実施態様において、ＧＩＰ受容体におけるクラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドのＥＣ５０は、グルカゴン受容体におけるＥＣ５０と比べて約５０倍、４０倍、３０倍又は２０倍未満の差がある（より高い又はより低い）。幾つかの実施態様において、クラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドのＧＩＰ効力は、そのグルカゴン効力と比べて、約５００倍、４５０倍、４００倍、３５０倍、３００倍、２５０倍、２００倍、１５０倍、１００倍、７５倍、５０倍、２５倍、２０倍、１５倍、１０倍又は５倍未満の差（より高い又はより低い）がある。幾つかの実施態様において、グルカゴン受容体におけるクラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドのＥＣ５０で割ったＧＩＰ受容体におけるクラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドのＥＣ５０の比は、約１００、７５、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０又は５未満である。幾つかの実施態様において、クラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドのグルカゴン効力と比較したクラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドのＧＩＰ効力の比は、約５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、７５、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０又は５未満である。幾つかの実施態様において、ＧＬＰ−１活性は、例えば７位でのアミノ酸修飾により有意に低減又は破壊される。
別の実施態様において、クラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドは、グルカゴン、ＧＩＰ及びＧＬＰ−１受容体において活性を示す（「グルカゴン／ＧＩＰ／ＧＬＰ−１トリアゴニスト」）。これらのクラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドは、ＧＬＰ−１とＧＩＰの両方の受容体と比べてグルカゴン受容体への天然グルカゴンの選択性を失っている。幾つかの実施態様において、ＧＩＰ受容体におけるクラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドのＥＣ５０は、グルカゴン及びＧＬＰ−１の受容体におけるそれぞれのＥＣ５０と比べて約５０倍、４０倍、３０倍又は２０倍未満の差（より高いかより低い）がある。幾つかの実施態様において、クラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドのＧＩＰ効力は、グルカゴン及びＧＬＰ−１の効力と比べて約５００倍、４５０倍、４００倍、３５０倍、３００倍、２５０倍、２００倍、１５０倍、１００倍、７５倍、５０倍、２５倍、２０倍、１５倍、１０倍又は５倍未満の差（より高い又はより低い）がある。幾つかの実施態様において、ＧＬＰ−１受容体におけるトリアゴニストのＥＣ５０で割ったＧＩＰ受容体におけるトリアゴニストのＥＣ５０の比は、約１００、７５、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０又は５未満である。幾つかの実施態様において、トリアゴニストのＧＬＰ−１効力と比較したトリアゴニストのＧＩＰ効力の比は、約１００、７５、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０又は５未満である。関連する実施態様において、グルカゴン受容体におけるトリアゴニストのＥＣ５０で割ったＧＩＰ受容体におけるトリアゴニストのＥＣ５０の比は、約１００、７５、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０又は５未満である。幾つかの実施態様において、トリアゴニストのグルカゴン効力と比較したトリアゴニストのＧＩＰ効力の比は、約５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、７５、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０又は５未満である。
更に別の態様において、クラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドは、ＧＬＰ−１及びＧＩＰの受容体において活性を示すが、グルカゴン活性は、例えば３位でのアミノ酸修飾により有意に低減又は破壊される（「ＧＩＰ／ＧＬＰ−１コアゴニスト」）。例えば、酸性、塩基性又は疎水性アミノ酸（グルタミン酸、オルチニン、ノルロイシン）によるこの位置での置換は、グルカゴン活性を低減する。幾つかの実施態様において、ＧＩＰ受容体におけるグルカゴンペプチドのＥＣ５０は、ＧＬＰ−１受容体におけるＥＣ５０と比べて約５０倍、４０倍、３０倍又は２０倍未満の差（より高い又はより低い）がある。幾つかの実施態様において、クラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドのＧＩＰ効力は、ＧＬＰ−１効力と比べて約２５倍、２０倍、１５倍、１０倍又は５倍未満の差（より高い又はより低い）がある。幾つかの実施態様において、これらのクラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドは、グルカゴン受容体において天然グルカゴンの約１０％以下の活性を有し、例えば、約１〜１０％又は約０．１〜１０％又は約０．１超であるが約１０％未満である。幾つかの実施態様において、ＧＬＰ−１受容体におけるクラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドのＥＣ５０で割ったＧＩＰ受容体におけるクラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドのＥＣ５０の比は、約１００、７５、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０又は５未満である。幾つかの実施態様において、クラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドのＧＬＰ−１効力と比較したクラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドのＧＩＰ効力の比は、約１００、７５、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０又は５未満である。
更なる態様において、クラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドは、ＧＩＰ受容体において活性を示すが、グルカゴン及びＧＬＰ−１活性は、例えば３及び７位でのアミノ酸修飾により有意に低減又は破壊される（「ＧＩＰアゴニストグルカゴンペプチド」）。幾つかの実施態様において、これらのクラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドは、グルカゴン受容体において天然グルカゴンの約１０％以下の活性しか有さず、例えば、約１〜１０％又は約０．１〜１０％又は約０．１、０．５％又は１％超であるが約１％、５％又は１０％未満である。幾つかの実施態様において、これらのクラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドは、また、ＧＬＰ−１受容体において天然ＧＬＰ−１の約１０％以下の活性しか有さず、例えば、約１〜１０％又は約０．１〜１０％又は約０．１、０．５％又は１％超であるが約１％、５％又は１０％未満である。
幾つかの実施態様において、クラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドがペグ化されていない場合、ＧＩＰ受容体活性化におけるクラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドのＥＣ５０は、約４、２、１nM以下であるか又は類縁体は、ＧＩＰ受容体において天然ＧＩＰの少なくとも約１％、２％、３％、４％若しくは５％の活性を有する。関連する実施態様において、ＧＬＰ−１受容体活性化における非ペグ化クラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドのＥＣ５０は、約４、２、１nM以下であるか又はＧＬＰ−１受容体における天然ＧＬＰ−１の少なくとも約１％、２％、３％、４％若しくは５％の活性を有する。更に他の関連する実施態様において、グルカゴン受容体活性化における非ペグ化クラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドのＥＣ５０は、約４、２、１nM以下であるか又はグルカゴン受容体における天然グルカゴンの少なくとも約５％、１０％、１５％若しくは２０％の活性である。幾つかの実施態様において、非ペグ化クラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドは、グルカゴン受容体における天然グルカゴンの約１％未満の活性を有する。幾つかの実施態様において、非ペグ化クラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドは、ＧＬＰ−１受容体における天然ＧＬＰ−１の約１０％、５％又は１％未満の活性を有する。
クラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドがＰＧＥのような親水性部分に結合している実施態様において、１つ以上の受容体における関連するＥＣ５０は、より高い場合がある。例えば、ＧＩＰ受容体活性化におけるペグ化類縁体のＥＣ５０は、約１０nM以下であるか、又はクラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドは、ＧＩＰ受容体における天然ＧＩＰの少なくとも約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％又は０．５％の活性を有する。関連する実施態様において、ＧＬＰ−１受容体活性化におけるペグ化クラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドのＥＣ５０は、約１０nM以下であるか、又はＧＬＰ−１受容体における天然ＧＬＰ−１の少なくとも約０．１％、０．２％、０．３％、０．４％若しくは０．５％の活性を有する。更に他の関連する実施態様において、グルカゴン受容体活性化におけるペグ化クラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドのＥＣ５０は、約１０nM以下であるか又はグルカゴン受容体における天然グルカゴンの少なくとも約０．５％、１％、１．５％若しくは２％の活性である。幾つかの実施態様において、クラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドは、グルカゴン受容体における天然グルカゴンの約１％未満の活性を有する。幾つかの実施態様において、クラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドは、ＧＬＰ−１受容体における天然ＧＬＰ−１の約１０％、５％又は１％未満の活性を有する。
修飾
クラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドについて本明細書に開示されている修飾は、グルカゴン（配列番号８０１）を操作して、増加したＧＩＰ活性、グルカゴン活性及び／又はＧＬＰ−１活性を示すグルカゴンペプチドを作り出すことを可能にする。クラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドについて本明細書に開示されている他の修飾は、得られるペプチドの半減期を延長する、溶解性を増加する、又は安定性を増加する。クラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドについて本明細書に開示されている更に他の修飾は、活性に対して何も効果がないか、又は所望の活性を破壊することなく行うことができる。同じ目的（例えば、ＧＩＰ活性を増加する）に役立つクラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドについて本明細書に開示されている修飾のいずれかも、個別に又は組み合わせて適用することができる。増強された特性を付与する、クラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドを参照する単一又は一連の組み合わせのいずれかを、個別に又は組み合わせて適用することができ、例えばＧＩＰ及びＧＬＰ−１活性の増加を半減期の増加と組み合わせることができる。関連する実施態様において、１、２、３、４、５、６個又はそれ以上のアミノ酸修飾は、非保存的置換、付加又は欠失であってもよい。幾つかの実施態様において、１、２、３、４、５、６個又はそれ以上のアミノ酸修飾は、保存的置換であってもよい。
ＧＩＰ活性に影響を与える修飾
ＧＩＰ受容体における増強された活性は、１位でのアミノ酸修飾によりもたらされる。例えば、１位のＨｉｓは、大型の芳香族アミノ酸、場合によりＴｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、アミノ−Ｐｈｅ、ニトロ−Ｐｈｅ、クロロ−Ｐｈｅ、スルホ−Ｐｈｅ、４−ピリジル−Ａｌａ、メチル−Ｔｙｒ又は３−アミノＴｙｒで置換されている。１位のＴｙｒと、アミノ酸１２〜２９に対応する領域内のアルファ−へリックスの安定化との組み合わせは、ＧＩＰ受容体、並びにＧＬＰ−１受容体及びグルカゴン受容体を活性化するクラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドを提供する。アルファ−へリックス構造は、例えば共有若しくは非共有分子内架橋の形成によって、又はアルファ−へリックス安定化アミノ酸（例えば、α，α−二置換アミノ酸）による１２〜２９位付近のアミノ酸の置換及び／若しくは挿入によって、安定化することができる。
ＧＩＰ受容体における増強された活性は、また、２７及び／又は２８位、並びに場合により２９位でのアミノ酸修飾によってもたらされる。例えば、２７位のＭｅｔは、大型の脂肪族アミノ酸、場合によりＬｅｕで置換され、２８位のＡｓｎは、小型の脂肪族アミノ酸、場合によりＡｌａで置換され、２９位のＴｈｒは、小型の脂肪族アミノ酸、場合によりＧｌｙで置換されている。ＬＡＧによる２７〜２９位での置換は、これらの位置において天然ＭＮＴ配列に対して増加したＧＩＰ活性をもたらす。
ＧＩＰ受容体における増強された活性は、また、１２位でのアミノ酸修飾によりもたらされる。例えば、１２位は、大型の脂肪族で非極性のアミノ酸、場合によりＩｌｅで置換されている。
ＧＩＰ受容体における増強された活性は、また、１７及び／又は１８位でのアミノ酸修飾によりもたらされる。例えば、１７位は、極性残基、場合によりＧｌｎで置換され、１８位は、小型の脂肪族アミノ酸、場合によりＡｌａで置換されている。ＱＡによる１７及び１８位での置換は、これらの位置において天然ＲＲ配列に対して増加したＧＩＰ活性をもたらす。
ＧＩＰ受容体における増加された活性は、１２〜２９位のアミノ酸側鎖の間に分子内架橋の形成を可能にする修飾によってもたらされる。例えば、分子内架橋を、ｉ及びｉ＋４の位置又はｊ及びｊ＋３の位置又はｋ及びｋ＋７の位置の２つのアミノ酸の側鎖の間の共有結合により形成することができる。例示的な実施態様において、架橋は、１２と１６位、１６と２０位、２０と２４位、２４と２８位又は１７と２０位の間にある。他の実施態様において、塩架橋のような非共有相互作用を、これらの位置の正と負の荷電アミノ酸の間で形成することができる。
ＧＩＰ受容体活性を増加する上記に記載された修飾のいずれも、個別に又は組み合わせて適用することができる。ＧＩＰ受容体活性を増加する修飾の組み合わせは、一般に、単独で実施されるそのような修飾のいずれのものよりも高いＧＩＰ活性をもたらす。
グルカゴン活性に影響を与える修飾
一つの実施態様において、増強されたグルカゴン効力は、天然グルカゴン（配列番号８０１）の１６位でのアミノ酸修飾によりもたらされる。非限定例によると、そのような増強された効力は、１６位の天然に生じるセリンをグルタミン酸により又は４原子の長さの側鎖を有する別の負荷電アミノ酸により、あるいはグルタミン、ホモグルタミン酸若しくはホモシステイン酸のいずれかにより又は少なくとも１個のヘテロ原子（例えば、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ）を含有する側鎖であり、約４（若しくは３〜５）原子長さの側鎖を有する荷電アミノにより置換することによってもたらすことができる。幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドは、ＧＬＰ−１受容体よりもグルカゴン受容体に対して元の選択性を保持する。
グルカゴン受容体活性は、３位のアミノ酸修飾により、例えば任意のアミノ酸による３位の天然に生じるグルタミンの置換により低減することができる。酸性、塩基性又は疎水性アミノ酸（グルタミン酸、オルチニン、ノルロイシン）によるこの位置での置換は、グルカゴン受容体活性を実質的に低減又は破壊することを示している。そのような場合では、３位に置換を含むそのようなペプチドのペグ化は、グルカゴン受容体活性を増加した。
１及び２位でのアミノ酸修飾により低減されたグルカゴン活性の回復は、１２〜２９位のアミノ酸側鎖の間に分子内架橋の形成を可能にする修飾によってもたらされる。例えば、分子内架橋を、ｉ及びｉ＋４の位置又はｊ及びｊ＋３の位置又はｋ及びｋ＋７の位置の２つのアミノ酸の側鎖の間の共有結合により形成することができる。他の実施態様において、塩架橋のような非共有相互作用を、これらの位置の正と負の荷電アミノ酸の間で形成することができる。
ＧＬＰ−１活性に影響を与える修飾
ＧＬＰ−１受容体における増強された活性は、Ｃ末端アミノ酸のカルボン酸を、アミド又はエステルのような電荷中性基で置換することによってもたらされる。
ＧＬＰ−１受容体における増強された活性は、また、例えば２個のアミノ酸の側鎖の間の分子内架橋の形成を介して又は本明細書において更に記載される、アルファ−へリックス安定化アミノ酸（例えば、α，α−二置換アミノ酸）によるグルカゴンのＣ末端部分（１２〜２９位付近）のアミノ酸置換及び／若しくは挿入を介して、アミノ酸１２〜２９付近のアルファ−へリックス構造を安定化することによってもたらされる。例示的な実施態様において、アミノ酸対１２と１６、１３と１７、１６と２０、１７と２１、２０と２４又は２４と２８（ｉ＝１２、１６、２０又は２４のアミノ酸対）の側鎖は、互いに結合しており、したがってグルカゴンアルファ−へリックスを安定化する。幾つかの実施態様において、架橋又はリンカーは、特に架橋がｉ及びｉ＋４の位置の間にある場合、約８（又は７〜９）原子長である。幾つかの実施態様において、架橋又はリンカーは、特に架橋がｊ及びｊ＋３の位置の間にある場合、約６（又は５〜７）原子長である。
幾つかの実施態様において、分子内架橋は、（ａ）グルタミン酸による又は４原子長の側鎖を有する別の負荷電アミノ酸による、あるいはグルタミン、ホモグルタミン酸若しくはホモシステイン酸のうちの１つによる又は少なくとも１つのヘテロ原子（例えば、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ）を含有する側鎖を有し、約４（若しくは３〜５）原子長の側鎖の荷電アミノ酸による、１６位の天然に生じるセリンの置換によって、並びに（ｂ）荷電されている又は水素結合の能力を有するのいずれかであり、少なくとも約５（又は４〜６）原子長の側鎖を有する別の親水性アミノ酸、例えば、リシン、シトルリン、アルギニン又はオルニチンによる、２０位の天然に生じるグルタミンの置換によって、形成される。１６及び２０位のそのようなアミノ酸の側鎖は、塩架橋を形成することができるし共有結合することもできる。一つの実施態様において、２つのアミノ酸は、互いに結合してラクタム環を形成する。
幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドのＣ末端部分におけるアルファ−へリックス構造の安定化は、ラクタム架橋以外の分子内架橋の形成によって達成される。例えば、適切な共有結合方法には、オレフィンメタセシス、ランチオニンに基づいた環化、ジスルフィド架橋又は改質硫黄含有架橋形成、α，ω−ジアミノアルカン鎖の使用、金属原子架橋の形成、ペプチド環化の他の方法、のいずれかの１つ以上が含まれ、これらがアルファ−へリックスの安定化のために使用される。
更に他の実施態様において、１つ以上のα，α−二置換アミノ酸が、所望の活性を保持する位置でこのＣ末端部分（アミノ酸１２〜２９）において挿入又は置換される。例えば、１６、２０、２１又は２４位のうちの１、２、３つ又は全てが、α，α−二置換アミノ酸、例えばＡＩＢで置換されている。
ＧＬＰ−１受容体における増加された活性は、本明細書において記載されているように、２０位でのアミノ酸修飾によりもたらされる。
ＧＬＰ−１受容体における増加された活性は、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号８９５）又はＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号８９６）をＣ末端に付加することによりもたらされる。そのような類縁体におけるＧＬＰ−１活性を、本明細書に記載されているように、１８、２８若しくは２９位のアミノ酸又は１８及び２９位のアミノ酸を修飾することにより、更に増加することができる。
ＧＬＰ−１効力の更なる中程度の増加は、１０位のアミノ酸を修飾して、大型の芳香族アミノ酸残基、場合によりＴｒｐにすることによりもたらされる。
ＧＬＰ−１受容体における低減された活性は、本明細書において記載されているように、例えば７位でのアミノ酸修飾によりもたらされる。
ＧＬＰ−１受容体における効力を、１８位の天然アルギニンのアラニン置換により更に増強することができる。
ＧＬＰ−１受容体活性を増加する、クラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドについて上記に記載された修飾のいずれも、単独又は組み合わせて適用することができる。ＧＬＰ−１受容体活性を増加する修飾の組み合わせは、一般に、単独で実施されるそのような修飾のいずれのものよりも高いＧＬＰ−１活性をもたらす。例えば、本発明は、場合により１６位と２０位のアミノ酸の間に共有結合を有する、１６位、２０位及びＣ末端カルボン酸基に修飾を含むグルカゴンペプチド；１６位及びＣ末端カルボン酸基に修飾を含むグルカゴンペプチド；場合により１６位と２０位のアミノ酸の間に共有結合を有する、１６位及び２０位に修飾を含むグルカゴンペプチド；並びに２０位及びＣ末端カルボン酸基に修飾を含むグルカゴンペプチドを提供する。
ＤＰＰ−ＩＶ耐性を改善する修飾
１及び／又は２位での修飾は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）切断に対するペプチドの耐性を増加することができる。例えば、本明細書において記載されているように、１位及び／又は２位をＤＰＰ−ＩＶ耐性アミノ酸で置換することができる。一つの実施態様において、２位のアミノ酸をＮ−メチルアラニンで置換する。
２位での修飾（例えば、２位でのＡＩＢ）、及び幾つかの場合においては１位での修飾（例えば、１位でのＤＭＩＡ）は、グルカゴン活性を時々有意に低減しうるが、驚くべきことに、本明細書に記載されているように、このグルカゴン活性の低減は、グルカゴンのＣ末端部分（アミノ酸１２〜２９付近）におけるアルファ−へリックス構造を、例えば２個のアミノ酸の側鎖の間の共有結合の形成を介して安定化することによって回復できることが観察された。幾つかの実施態様において、共有結合は、「ｉ」と「ｉ＋４」の位置又は「ｊ」と「ｊ＋３」の位置のアミノ酸の間、例えば１２と１６位、１６と２０位、２０と２４位、２４と２８位又は１７と２０位の間にある。例示的な実施態様において、この共有結合は、１６位のグルタミン酸と２０位のリシンとの間のラクタム架橋である。幾つかの実施態様において、この共有結合は、本明細書に記載されているように、ラクタム架橋以外の分子内架橋である。
分解を低減する修飾
更なる例示的な実施態様において、クラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドのいずれかを、配列番号８０１の１５及び／又は１６位のアミノ酸を修飾して特に酸性又はアルカリ性の緩衝剤におけるペプチドの経時的な分解を低減することによって、更に修飾して安定性を改善することができる。そのような修飾は、Ａｓｐ１５−Ｓｅｒ１６のペプチド結合の切断を低減する。例示的な実施態様において、１５位でのアミノ酸修飾は、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、システイン酸又はホモシステイン酸によるＡｓｐの欠失又は置換である。他の例示的な実施態様において、１６位でのアミノ酸修飾は、Ｔｈｒ又はＡＩＢによるＳｅｒの欠失又は置換である。他の例示的な実施態様において、１６のＳｅｒは、グルタミン酸により又は４原子長の側鎖を有する別に負荷電アミノ酸により、あるいはグルタミン、ホモグルタミン酸若しくはホモシステイン酸のいずれかにより置換されている。
幾つかの実施態様において、天然ペプチドの２７位に存在するメチオニン残基は、例えば欠失又は置換により修飾される。そのような修飾は、ペプチドの酸化分解を防止することができる。幾つかの実施態様において、２７位のＭｅｔは、ロイシン、イソロイシン又はノルロイシンで置換されている。幾つかの特定の実施態様において、２７位のＭｅｔは、ロイシン又はノルロイシンで置換されている。
幾つかの実施態様において、２０及び／又は２４位のＧｌｎは、例えば欠失又は置換により修飾される。そのような修飾は、Ｇｌｎの脱アミド化を介して生じる分解を低減することができる。幾つかの実施態様において、２０及び／又は２４位のＧｌｎは、Ａｌａ又はＡＩＢで置換されている。幾つかの実施態様において、２０及び／又は２４位のＧｌｎは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎ又はシトルリンで置換されている。
幾つかの実施態様において、２１位のＡｓｐは、例えば欠失又は置換により修飾される。そのような修飾は、Ａｓｐの脱水により環状スクシンイミド中間体を形成し、続く異性化によりイソアスパラギン酸塩を形成することにより生じる分解を低減することができる。幾つかの実施態様において、２１位は、Ｇｌｕ、ホモグルタミン酸又はホモシステイン酸で置換されている。幾つかの実施態様において、２１位はＧｌｕで置換されている。
アルファ−へリックス構造の安定化
クラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドのＣ末端部分（アミノ酸１２〜２９位付近）におけるアルファ−へリックス構造の安定化は、ＧＬＰ−１及び／又はＧＩＰ活性の増強、並びに１及び／又は２位でのアミノ酸修飾により低減されたグルカゴン活性の回復をもたらす。アルファ−へリックス構造は、例えば共有若しくは非共有分子内架橋の形成によって又はアルファ−へリックス安定化アミノ酸（例えば、α，α−二置換アミノ酸）による１２〜２９位付近のアミノ酸の置換及び／若しくは挿入によって安定化することができる。ＧＩＰアゴニストのアルファ−へリックス構造の安定化は、本明細書に記載されているように達成することができる。
アシル化及びアルキル化
幾つかの実施態様によると、本明細書に開示されているグルカゴンペプチドは修飾されて、本明細書に記載されているように、アシル基又はアルキル基を含む。アシル化又はアルキル化は、循環しているグルカゴンペプチドの半減期を増加することができる。アシル化又はアルキル化は、有利なことに、グルカゴン及び／若しくはＧＬＰ−１受容体において作用の開始を遅延する、及び／若しくは作用の持続時間を延長する、並びに／又はＤＰＰ−ＩＶのようなプロテアーゼに対する耐性を改善する、並びに／又は溶解性を改善することができる。グルカゴンペプチドのグルカゴン及び／又はＧＬＰ−１及び／又はＧＩＰ受容体における活性を、アシル化の後で維持することができる。幾つかの実施態様において、アシル化グルカゴンペプチドの効力は、非アシル化型のグルカゴンペプチドに匹敵する。クラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドを、本明細書に記載されているように、親水性部分が結合している同じアミノ酸の位置又は異なるアミノ酸の位置でアシル化又はアルキル化することができる。
幾つかの実施態様において、本発明は、グルカゴンペプチドの１０位のアミノ酸に共有結合しているアシル基又はアルキル基を含むように修飾されているグルカゴンペプチドを提供する。グルカゴンペプチドは、グルカゴンペプチドの１０位のアミノ酸とアシル基又はアルキル基との間にスペーサーを更に含むことができる。幾つかの実施態様において、アシル基は、脂肪酸若しくは胆汁酸又はこれらの塩であり、例えばＣ４０〜Ｃ３０脂肪酸、Ｃ８〜Ｃ２４脂肪酸、コール酸、Ｃ４〜Ｃ３０アルキル、Ｃ８〜Ｃ２４アルキル又は胆汁酸のステロイド部分を含むアルキルである。スペーサーは、アシル又はアルキル基を結合するのに適した反応性基を有する任意の部分である。例示的な実施態様において、スペーサーは、アミノ酸、ジペプチド若しくはトリペプチド、又は親水性二官能スペーサーを含む。幾つかの実施態様において、スペーサーは、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ及びＮＨ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ（ＣＨ２）ｍＣＯＯＨを含むスペーサーからなる群より選択され、ここでｍは、１〜６の任意の整数であり、そしてｎは、２〜１２の任意の整数である。そのようなアシル化又はアルキル化グルカゴンペプチドは、親水性部分、場合によりポリエチレングリコールを更に含むこともできる。前述のグルカゴンペプチドのいずれも、２つのアシル基若しくは２つのアルキル基又はそれらの組み合わせを含むことができる。
結合体及び融合体
ＧＩＰアゴニストは、本明細書に記載されているように、複合体部分に結合することができ、この結合は場合により共有結合を介してでもよいし、リンカーを介してでもよい。
他の実施態様において、第２ペプチドはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号８９６）であり、ここでＸは、２０個の通常のアミノ酸、例えばグルタミン酸、アスパラギン酸又はグリシンのうちの１つから選択される。一つの実施態様において、Ｘは、アミノ酸の側鎖に共有結合している親水性部分を更に含むアミノ酸、例えばＣｙｓを表す。そのようなＣ末端延長は溶解性を改善し、ＧＩＰ又はＧＬＰ−１活性も改善することができる。グルカゴンペプチドがカルボキシ末端延長を更に含む幾つかの実施態様において、延長のカルボキシ末端アミノ酸は、カルボン酸ではなくアミド基又はエステル基で終わる。
幾つかの実施態様において、例えばＣ末端延長を含むグルカゴンペプチドにおいて、野生型グルカゴンの２９位のトレオニンはグリシンで置換されている。例えば、２９位のトレオニンにグリシン置換を有し、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号８９５）のＣ末端延長を含むグルカゴンペプチドは、同じＣ末端延長を含むように修飾された天然グルカゴンよりも、ＧＬＰ−１受容体において、４倍効力がある。このＴ２９Ｇ置換を、本明細書に開示されている他の修飾と一緒に使用して、ＧＬＰ−１受容体に対するグルカゴンペプチドの親和性を増強することができる。例えば、Ｔ２９Ｇ置換を、Ｓ１６Ｅ及びＮ２０Ｋアミノ酸置換と、場合によりアミノ酸１６と２０の間のラクタム架橋と、場合により本明細書に記載されているＰＥＧ鎖の付加と、組み合わせることができる。
幾つかの実施態様において、アミノ酸がＣ末端に付加されており、付加アミノ酸は、グルタミン酸、アスパラギン酸及びグリシンからなる群より選択される。
溶解性を増強する修飾
別の実施態様において、グルカゴンペプチドのいずれかの溶解性を、ペプチドのＣ末端部分における、好ましくは配列番号８０１の２７位のＣ末端側の位置に荷電アミノ酸を導入する、アミノ酸置換及び／又は付加によって改善することができる。場合により、１、２又は３個の荷電アミノ酸を、Ｃ末端部分の範囲内に、好ましくは２７位のＣ末端側に導入することができる。幾つかの実施態様において、２８及び／又は２９位の天然アミノ酸が１又は２個の荷電アミノ酸で置換されている、並びに／或いは更なる実施態様において、１〜３個の荷電アミノ酸もまたペプチドのＣ末端に付加されている。例示的な実施態様において、１、２個又は全ての荷電アミノ酸は、負に荷電されている。幾つかの実施態様において、負荷電アミノ酸（酸性アミノ酸）は、アスパラギン酸又はグルタミン酸である。
ＧＩＰ活性（並びに場合によりＧＬＰ−１活性及び／又はグルカゴン活性）を依然として保持することが可能であるような更なる修飾、例えば保存的置換をグルカゴンペプチドに行うことができる。
他の修飾
ＧＩＰ活性を増加又は減少する、グルカゴン受容体活性を増加又は減少する、及びＧＬＰ−１受容体活性を増加するような、クラス２ペプチドについて上記に記載された修飾のいずれも、個別に又は組み合わせて適用することができる。クラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドについて上記に記載された修飾のいずれかを、クラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドに関して本明細書に記載されている、溶解性及び／又は安定性及び／又は作用持続時間の増加のような、他の所望の特性を付与する他の修飾と組み合わせることもできる。あるいは、クラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドについて上記に記載された修飾のいずれかを、溶解性又は安定性又は活性に実質的に影響を与えない、クラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドに関して本明細書に記載されている他の修飾と組み合わせることができる。例示的な修飾には以下が含まれるが、これらに限定されない：
（Ａ）例えば、天然グルカゴンのＣ末端部分、好ましくは２７位のＣ末端側の位置への１、２、３個又はそれ以上の荷電アミノ酸の導入により溶解性を改善すること。そのような荷電アミノ酸は、例えば２８又は２９位で天然アミノ酸を荷電アミノ酸により置換する、あるいは２７、２８又は２９位の後に荷電アミノ酸を付加することによって導入することができる。例示的な実施態様において、１、２、３個又は全ての荷電アミノ酸は、負に荷電されている。他の実施態様において、１、２、３個又は全ての荷電アミノ酸は、正に荷電されている。そのような修飾は溶解性を増加し、例えば、２５℃で２４時間後に測定したとき、約５．５〜８の所定のｐＨ、例えばｐＨ７で、天然グルカゴンを基準として少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２５倍、３０倍又はそれ以上の溶解性をもたらす。
（Ｂ）例えばペプチドの１６、１７、２０、２１、２４若しくは２９位、Ｃ末端延長内、又はＣ末端アミノ酸への、本明細書に記載されているポリエチレングリコール鎖のような親水性部分の付加により、溶解性及び作用持続時間又は循環半減期を増加すること。
（Ｃ）本明細書に記載されているグルカゴンペプチドのアシル化又はアルキル化により、溶解性及び／若しくは作用持続時間若しくは循環半減期を増加すること、並びに／又は作用開始を遅延すること。
（Ｄ）本明細書に記載されている１又は２位のアミノ酸の修飾により、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）への耐性を導入することを介して、作用持続時間又は循環半減期を増加すること。
（Ｅ）１５位のＡｓｐの修飾により、例えばグルタミン酸、ホモグルタミン酸、システイン酸又はホモシステイン酸による欠失又は置換により、溶解性を増加すること。そのような修飾は、５．５〜８の範囲内のｐＨにおいて分解又は切断を低減することができ、例えば２５℃で２４時間後に元のペプチドの少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％を保持することができる。そのような修飾は、Ａｓｐ１５−Ｓｅｒ１６のペプチド結合の切断を低減する。
（Ｆ）１６位のＳｅｒの修飾により、例えばＴｈｒ又はＡＩＢでの置換により、安定性を増加すること。そのような修飾も、Ａｓｐ１５−Ｓｅｒ１６のペプチド結合の切断を低減する。
（Ｇ）２７位のメチオニンの修飾により、例えばロイシン又はノルロイシンでの置換により、安定性を増加すること。そのような修飾は酸化分解を低減することができる。安定性は、２０又は２４位のＧｌｎの修飾により、例えば、Ａｌａ又はＡＩＢでの置換により増強することもできる。そのような修飾は、Ｇｌｎの脱アミド化を介して生じる分解を低減することができる。安定性は、２１位のＡｓｐの修飾により、例えばＧｌｕでの置換により増強することができる。そのような修飾は、Ａｓｐの脱水により環状スクシンイミド中間体を形成し、続く異性化によりイソアスパラギン酸塩を形成することによって生じる分解を低減することができる。
（Ｈ）実質的に活性に影響を与えない非保存的若しくは保存的置換、付加又は欠失、例えば、２、５、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８若しくは２９位の１つ以上での保存的置換；Ａｌａによるこれらの位置の１つ以上での置換；２７、２８若しくは２９位の１つ以上でのアミノ酸の欠失；又は場合によりＣ末端カルボン酸基の代わりにＣ末端アミド若しくはエステルと組み合わせた、アミノ酸２９の欠失；Ａｒｇによる１２位のＬｙｓの置換；Ｖａｌ若しくはＰｈｅによる１０位のＴｙｒの置換。
ペグ化後の活性の保存は、Ｃ末端へのＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号８９５）の付加によりもたらされる。
天然グルカゴンペプチドの幾つかの位置を修飾し、同時に母体ペプチドの活性の少なくとも一部分を保持することができる。したがって、出願人たちは、２、５、１０、１１、１２、１３、１４、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８又は２９位に配置された１個以上のアミノ酸を、天然グルカゴンペプチドに存在するものと異なるアミノ酸で置換することができ、依然としてグルカゴン受容体において活性を保持することができると予測する。
幾つかの実施態様において、１８位は、Ａｌａ、Ｓｅｒ又はＴｈｒからなる群より選択されるアミノ酸で置換されている。幾つかの実施態様において、２０位のアミノ酸は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、シトルリン又はＡＩＢで置換されている。幾つかの実施態様において、２１位は、Ｇｌｕ、ホモグルタミン酸又はホモシステイン酸で置換されている。幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドは、１６、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２７、２８及び２９位から選択される１〜１０個のアミノ酸修飾を含む。例示的な実施態様において、修飾は、Ｇｌｎ１７、Ａｌａｌ８、Ｇｌｕ２１、Ｉｌｅ２３、Ａｌａ２４、Ｖａｌ２７及びＧｌｙ２９からなる群より選択される１個以上のアミノ酸置換である。幾つかの実施態様において、１７〜２６位から選択される１〜２個のアミノ酸は、母体ペプチドと異なる。他の実施態様において、１７〜２２位から選択される１〜２個のアミノ酸は、母体ペプチドと異なる。更に他の実施態様において、修飾は、Ｇｌｎ１７、Ａｌａ１８、Ｇｌｕ２１、Ｉｌｅ２３及びＡｌａ２４である。
幾つかの実施態様において、１個以上のアミノ酸がグルカゴンペプチドのカルボキシ末端に付加されている。アミノ酸は、典型的には、２０個の通常のアミノ酸の１つから選択され、幾つかの実施態様において、アミノ酸は、天然アミノ酸のカルボン酸の代わりにアミド基を有する。例示的な実施態様において、付加アミノ酸は、グルタミン酸、アスパラギン酸及びグリシンからなる群より選択される。
活性を破壊しない他の修飾は、Ｗ１０又はＲ２０を含む。
幾つかの実施態様において、本明細書に開示されているクラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドは、１又は２個のアミノ酸残基によるＣ末端の切断により修飾され、それでも、グルカゴン、ＧＬＰ−１及び／又はＧＩＰ受容体において同様の活性及び効力を保持する。この点において、２９及び／又は２８位のアミノ酸を欠失することができる。
例示的な実施態様
幾つかの実施態様において、クラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドは、以下の修飾：
（ａ）１位でのアミノ酸修飾、
（ｂ）（ｉ）ｉ及びｉ＋４の位置のアミノ酸の側鎖の間又はｊ及びｊ＋３の位置のアミノ酸の側鎖の間のラクタム架橋（ここで、ｉは、１２、１３、１６、１７、２０又は２４であり、ｊは１７である）、或いは（ｉｉ）１６、２０、２１又は２４位の１、２、３つ又は全てにおけるα，α−二置換によるアミノ酸置換、
（ｃ）２７、２８及び２９の１、２つ又は全てにおけるアミノ酸修飾、並びに
（ｄ）１、２、３、４、５、６又は８個の更なるアミノ酸修飾
を有する、ＧＩＰアゴニスト活性を有するグルカゴン（配列番号８０１）の類縁体であり、
ここで、ＧＩＰ受容体活性化における類縁体のＥＣ５０は、約１００nM以下である。
例示的な実施態様において、
（ａ）１位でのアミノ酸修飾は、大型の芳香族アミノ酸、場合によりＴｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、アミノ−Ｐｈｅ、ニトロ−Ｐｈｅ、クロロ−Ｐｈｅ、スルホ−Ｐｈｅ、４−ピリジル−Ａｌａ、メチル−Ｔｙｒ又は３−アミノＴｙｒによる１位のＨｉｓの置換である、
（ｂ）（ｉ）ラクタム架橋は、１６及び２０位のアミノ酸の間にあり、１６及び２０位のアミノ酸の一方はＧｌｕで置換され、１６及び２０位のアミノ酸の他方はＬｙｓで置換されている、又は（ｉｉ）α，α−二置換アミノ酸はＡＩＢであり、
（ｃ）２７位のＭｅｔは、大型の脂肪族アミノ酸、場合によりＬｅｕで置換されており、
（ｄ）２８位のＡｓｎは、小型の脂肪族アミノ酸、場合によりＡｌａで置換されており、そして、
（ｅ）２９位のＴｈｒは、小型の脂肪族アミノ酸、場合によりＧｌｙで置換されている。
類縁体は、下記のものを含むがこれらに限定されない、更なる修飾を含むことができる：
（ａ）１２位でのアミノ酸修飾、場合によりＩｌｅによる置換、
（ｂ）１７及び１８位でのアミノ酸修飾、場合により１７位でのＱによる及び１８位でのＡによる置換、
（ｃ）Ｃ末端へのＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号８９５）の付加、又は
これらの任意の組み合わせ。
類縁体は、下記のものを含むがこれらに限定されない、更なる修飾を、代替的に又は追加的に含むこともできる：
（ａ）Ｄ−Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｎ−メチル−Ｓｅｒ、ＡＩＢ、Ｖａｌ又はアミノ−イソ酪酸で置換されている２位のＳｅｒ；
（ｂ）Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ又はＶａｌで置換されている１０位のＴｙｒ；
（ｃ）１０位のＬｙｓへのアシル基の結合；
（ｄ）Ａｒｇで置換されている１２位のＬｙｓ；
（ｅ）Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ又はＡＩＢで置換されている１６位のＳｅｒ；
（ｆ）Ｇｌｎ、Ｌｙｓ又はＧｌｕで置換されている１７位のＡｒｇ；
（ｇ）Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＧｌｙで置換されている１８位のＡｒｇ；
（ｈ）Ａｌａ、Ｌｙｓ、シトルリン、Ａｒｇ、Ｏｒｎ又はＡＩＢで置換されている２０位のＧｌｎ；
（ｉ）Ｇｌｕ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸で置換されている２１位のＡｓｐ；
（ｊ）Ｉｌｅで置換されている２３位のＶａｌ：
（ｋ）Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ又はＡＩＢで置換されている２４位のＧｌｎ；並びに
（ｌ）２、５、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１，２４、２７、２８及び２９位のいずれかでの保存置換；或いは
これらの任意の組み合わせ。
幾つかの実施態様において、クラス２グルカゴン関連類縁体ペプチドは、１６、１７、２０、２１、２４又は２９位のアミノ酸、２９位の後のＣ末端延長内（例えば、３０位）の付加アミノ酸、又はＣ末端アミノ酸のいずれかにおいて、親水性部分に共有結合している。例示的な実施態様において、この親水性部分は、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステイン又はアセチル−フェニルアラニン残基に、これらの位置のいずれかにおいて共有結合している。例示的な親水性部分には、例えば１，０００ダルトンから約４０，０００ダルトン又は約２０，０００ダルトンから約４０，０００ダルトンの分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。
ＧＩＰアゴニストは、ＧＩＰアゴニスト活性を保持する１、２、３、４又は５個までの更なる修飾を場合により有する、例えば配列番号８０５〜８９４のアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドであることができる。
クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチド
特定の実施態様において、グルカゴン関連類縁体ペプチドはクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドであり、本明細書、並びに国際特許出願公報第２００８／１０１０１７号（２００８年８月２１日公開）及び米国仮出願第６１／０９０，４１２号に記載されており、その内容は全体が参照として本明細書に組み込まれる。
活性
クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、グルカゴン受容体において増加した活性を示すペプチドであることができ、更なる実施態様において、増強された生物物理学的安定性及び／又は水溶性を示す。加えて、一つの実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、天然グルカゴンのＧＬＰ−１受容体対グルカゴン受容体の選択性を失っており、したがってこれらの２つの受容体のコアゴニストを表す。クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチド内の選択されたアミノ酸修飾は、ＧＬＰ−１受容体対グルカゴン受容体の相対的活性を制御することができる。したがって、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、ＧＬＰ−１受容体よりもグルカゴン受容体において高い活性を有するグルカゴン／ＧＬＰ−１コアゴニスト、両方の受容体にほぼ同等の活性を有するグルカゴン／ＧＬＰ−１コアゴニスト、又はグルカゴン受容体よりもＧＬＰ−１受容体において高い活性を有するグルカゴン／ＧＬＰ−１コアゴニストであることができる。後者の分類のコアゴニストを操作して、グルカゴン受容体においてほとんど又は全く活性を示さないようにすることができ、それでも、天然ＧＬＰ−１と同じ又はそれより良好な効力でＧＬＰ−１受容体を活性化する能力を保持することができる。これらのコアゴニストのいずれかは、増強された生物物理学的安定性及び／又は水溶性を付与する修飾を含むこともできる。
クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドの修飾は、天然ＧＬＰ−１を基準として、ＧＬＰ−１受容体において少なくとも約１０％（少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、１００％、１２５、１５０％、１７５％を含む）から約２００％のいずれか又はそれ以上の活性を有し、天然グルカゴンを基準として、グルカゴン受容体において少なくとも約１０％（約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、１００％、１２５、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％を含む）から約５００％のいずれか又はそれ以上の活性を有するグルカゴンペプチドを産生するために、実施することができる。天然グルカゴンのアミノ酸配列は、配列番号１であり、ＧＬＰ−１（７−３６）アミドのアミノ酸配列は、配列番号５２であり、ＧＬＰ−１（７−３７）酸のアミノ酸配列は、配列番号５０である。例示的な実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、グルカゴン受容体において天然グルカゴンの少なくとも１０％の活性及びＧＬＰ−１受容体において天然ＧＬＰ−１の少なくとも５０％の活性、又はグルカゴン受容体において天然グルカゴンの少なくとも４０％の活性及びＧＬＰ−１受容体において天然ＧＬＰ−１の少なくとも４０％の活性、又はグルカゴン受容体において天然グルカゴンの少なくとも６０％の活性及びＧＬＰ−１受容体において天然ＧＬＰ−１の少なくとも６０％の活性を示す。
クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドのグルカゴン受容体対ＧＬＰ−１受容体の選択性は、グルカゴン／ＧＬＰ−１活性の相対比（天然グルカゴンに対するグルカゴン受容体でのペプチドの活性を、天然ＧＬＰ−１に対するＧＬＰ−１受容体におけるペプチドの活性で割ったもの）として記載することができる。例えば、グルカゴン受容体において天然グルカゴンの６０％の活性を示し、ＧＬＰ−１受容体において天然ＧＬＰ−１の６０％の活性を示すクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、グルカゴン／ＧＬＰ−１活性の１：１比を有する。グルカゴン／ＧＬＰ−１活性の例示的な比には、約１：１、１．５：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１若しくは１０：１、又は約１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２若しくは１：１．５が含まれる。例としては、グルカゴン／ＧＬＰ−１活性比の１０：１は、ＧＬＰ−１受容体と比べてグルカゴン受容体への１０倍の選択性を示す。同様に、ＧＬＰ−１／グルカゴン活性比の１０：１は、グルカゴン受容体と比べてＧＬＰ−１受容体への１０倍の選択性を示す。
幾つかの実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、グルカゴン受容体において天然グルカゴンの約１０％以下の活性を有し、例えば、約１〜１０％又は約０．１〜１０％又は約０．１％超であるが約１０％未満であり、一方、ＧＬＰ−１受容体におけるＧＬＰ−１の少なくとも２０％の活性を示す。例えば、本明細書に記載されている例示的なクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、天然グルカゴンの約０．５％、約１％又は約７％の活性を有し、一方、ＧＬＰ−１受容体におけるＧＬＰ−１の少なくとも２０％の活性を示す。
クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、グルカゴン受容体若しくはＧＬＰ−１受容体又は両方において増加又は減少した活性を有するグルカゴンペプチドであることができる。クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、グルカゴン受容体対ＧＬＰ−１受容体における変化した選択性を有するグルカゴンペプチドであることができる。
したがって、本明細書に開示されているように、改善された溶解性及び／又は安定性も示す、高い効力のクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドが提供される。例示的な高効力クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、グルカゴン受容体において天然グルカゴンの少なくとも約２００％の活性を有し、２５℃で２４時間後、場合により、６〜８又は６〜９又は７〜９のｐＨ（例えばｐＨ７）で少なくとも１mg/mLの濃度で溶解性であってもよく、場合により、元のペプチドの少なくとも９５％を保持してもよい（例えば、元のペプチド５％以下が分解又は切断される）。別の例として、例示的なクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、グルカゴンとＤＬＰ−１の両方の受容体において（約１：３〜３：１又は約１：２〜２：１の比で）約４０％を超える又は約６０％を超える活性を示し、２５℃で２４時間後、場合により、６〜８又は６〜９又は７〜９のｐＨ（例えばｐＨ７）で少なくとも１mg/mLの濃度で溶解性であってもよく、場合により、元のペプチドの少なくとも９５％を保持してもよい。別の例示的なクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、グルカゴン受容体において天然グルカゴンの約１７５％以上の活性及びＤＬＰ−１受容体において天然ＧＬＰ−１の約２０％以下の活性を示し、２５℃で２４時間後、場合により、６〜８又は６〜９又は７〜９のｐＨ（例えばｐＨ７）で少なくとも１mg/mLの濃度で溶解性であってもよく、場合により、元のペプチドの少なくとも９５％を保持してもよい。更に別の例示的なクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、グルカゴン受容体において天然グルカゴンの約１０％以下の活性及びＤＬＰ−１受容体において天然ＧＬＰ−１の少なくとも約２０％の活性を示し、２５℃で２４時間後、場合により、６〜８又は６〜９又は７〜９のｐＨ（例えばｐＨ７）で少なくとも１mg/mLの濃度で溶解性であってもよく、場合により、元のペプチドの少なくとも９５％を保持してもよい。更に別の例示的なクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、グルカゴン受容体において天然グルカゴンの約１０％以下であるが０．１％、０．５％又は１％を超える活性及びＤＬＰ−１受容体において天然ＧＬＰ−１の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％若しくは１００％又はそれ以上の活性を示し、２５℃で２４時間後、場合により、６〜８又は６〜９又は７〜９のｐＨ（例えばｐＨ７）で少なくとも１mg/mLの濃度で溶解性であってもよく、場合により、元のペプチドの少なくとも９５％を保持してもよい。幾つかの実施態様において、そのようなクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、天然グルカゴンの対応する位置に少なくとも２２、２３、２４、２５、２６、２７又は２８個の天然に生じるアミノ酸を保持する（例えば、天然に生じるグルカゴンに対して１〜７、１〜５又は１〜３個の修飾を有する）。
グルカゴン活性に影響を与える修飾
グルカゴン受容体において増加された活性は、天然グルカゴン（配列番号１）の１６位でのアミノ酸修飾によりもたらされる。一つの実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ（配列番号１）の野生型ペプチドに対して修飾されて、グルカゴン受容体におけるペプチドの抗力が増強されたグルカゴンアゴニストである。天然グルカゴン（配列番号１）の１６位に通常生じるセリンを、選択された酸性アミノ酸で置換して、検証済インビトロモデルアッセイ（実施例２を参照すること）におけるｃＡＭＰ合成を刺激する能力に関して、グルカゴンの抗力を増強することができる。より詳細には、この置換は、この類縁体の抗力を、グルカゴン受容体において少なくとも２倍、４倍、５倍及び１０倍を超えるまで増強する。この置換は、また、天然グルカゴンを基準として、ＧＬＰ−１受容体における類縁体の活性を少なくとも５倍、１０倍又は１５倍増強するが、選択性は、ＧＬＰ−１受容体に対しての場合よりもグルカゴン受容体に対して維持されている。
非限定例によると、そのような増強された効力は、１６位の天然に生じるセリンをグルタミン酸により又は４原子の長さの側鎖を有する別の負荷電アミノ酸により、あるいはグルタミン、ホモグルタミン酸若しくはホモシステイン酸のいずれかにより又は少なくとも１個のヘテロ原子（例えば、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ）を含有する側鎖であり、約４（若しくは３〜５）原子長さの側鎖を有する荷電アミノにより置換することによってもたらすことができる。一つの実施態様によると、天然グルカゴンの１６位のセリン残基は、グルタミン酸、グルタミン、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、トレオニン又はグリシンからなる群より選択されるアミノ酸で置換されている。一つの実施態様によると、天然グルカゴンの１６位のセリン残基は、グルタミン酸、グルタミン、ホモグルタミン酸及びホモシステイン酸からなる群より選択されるアミノ酸で置換されており、一つの実施態様では、セリン残基はグルタミン酸で置換されている。
一つの実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７のペプチド又は配列番号５のグルカゴンアゴニスト類縁体を含む。一つの実施態様によると、ペプチドが配列番号７、配列番号８、配列番号９又は配列番号１０の配列を含み、グルカゴンペプチドがＧＬＰ−１受容体よりもグルカゴン受容体に選択性を保持する、野生型グルカゴンに対してグルカゴン受容体において増強された効力を有するクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドが提供される。一つの実施態様において、グルカゴン受容体に増強された選択性を有するクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号８、配列番号９、配列番号１０のペプチド又はそのグルカゴンアゴニスト類縁体を含み、カルボキシ末端アミノ酸は、天然カルボン酸基を保持する。一つの実施態様によると、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、ＮＨ２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−ＣＯＯＨ（配列番号１０）を含み、ここでペプチドは、実施例２のインビトロｃＡＭＰアッセイにより測定すると、天然グルカゴンを基準として、グルカゴン受容体においておよそ５倍増強された抗力を示す。
グルカゴンセプターにおける低減された活性は、例えば３位でのアミノ酸修飾によりもたらされる。酸性、塩基性又は疎水性アミノ酸（グルタミン酸、オルチニン、ノルロイシン）によるこの位置での置換は、グルカゴン受容体活性を実質的に低減又は破壊することを示している。特に、本明細書に記載されているグルカゴン類縁体、グルカゴンアゴニスト類縁体、グルカゴンコアゴニスト及びグルカゴン／ＧＬＰ−１コアゴニスト分子を含むクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドのいずれかを修飾して、３位に修飾を、例えばＧｌｕで置換されたＧｌｎを含有させて、グルカゴン受容体に対する選択性と比較して、ＧＬＰ−１受容体に対して高い選択性、例えば１０倍の選択性を有するペプチドを産生することができる。
２位での修飾（例えば、２位でのＡＩＢ）及び幾つかの場合では１位での修飾が、グルカゴン活性を低減しうることが観察された。グルカゴン活性のこの低減は、例えば本明細書に記載されている方法を介して、例えば「ｉ」と「ｉ＋４」の位置、例えば１２と１６位、１６と２０位又は２０と２４位のアミノ酸の間の共有結合を介して、グルカゴンのＣ末端部分のアルファ−へリックスを安定化することによって、回復することができる。幾つかの実施態様において、この共有結合は、１６位のグルタミン酸と２０位のリシンとの間のラクタム架橋である。幾つかの実施態様において、この共有結合は、ラクタム架橋以外の分子内架橋である。例えば、適切な共有結合方法には、オレフィンメタセシス、ランチオニンに基づいた環化、ジスルフィド架橋又は改質硫黄含有架橋形成、α，ω−ジアミノアルカン鎖の使用、金属原子架橋の形成、及びペプチド環化の他の方法、のいずれかの１つ以上が含まれる。
ＧＬＰ−１活性に影響を与える修飾
ＧＬＰ−１受容体における増強された活性は、Ｃ末端アミノ酸のカルボン酸を、アミド又はエステルのような電荷中性基で置換することによってもたらされる。一つの実施態様において、これらのクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号２０の配列を含み、ここでカルボキシ末端アミノ酸は、天然アミノ酸に見出されるカルボン酸基の代わりにアミド基を有する。これらのクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、グルカゴンとＤＬＰ−１の両方の受容体において強力な活性を有し、したがって、両方の受容体においてコアゴニストとして作用する。一つの実施態様によると、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、グルカゴン及びＧＬＰ−１受容体のコアゴニストであり、ここで、ペプチドは、配列番号２０の配列を含み、２８位のアミノ酸は、Ａｓｎ又はＬｙｓであり、２９位のアミノ酸はＴｈｒ−アミドである。
ＧＬＰ−１受容体における増加された活性は、グルカゴンのＣ末端部分（例えば、残基１２〜２９付近）のアルファ−へリックスを安定化する修飾によりもたらされる。
幾つかの実施態様において、そのような修飾は、３個の介在アミノ酸により離れている２個のアミノ酸（すなわち、「ｉ」の位置のアミノ酸と「ｉ＋４」の位置のアミノ酸（ここでｉは、１２〜２５の任意の整数である））により離れている２個のアミノ酸、２個の介在アミノ酸により離れている２個のアミノ酸、すなわち、「ｊ」の位置のアミノ酸と「ｊ＋３」の位置のアミノ酸（ここでｊは、１２〜２７の任意の整数である）、又は６個の介在アミノ酸により離れている２個のアミノ酸、すなわち、「ｋ」の位置のアミノ酸と「ｋ＋７」の位置のアミノ酸（ここでｋは、１２〜２２の任意の整数である）、のそれぞれの側鎖の間での分子内架橋の形成を可能にする。例示的な実施態様において、架橋又はリンカーは、約８（又は約７〜９）原子長であり、１２と１６位又は１６と２０位又は２０と２４位又は２４と２８位のアミノ酸の側鎖の間に形成される。２つのアミノ酸側鎖は、水素結合、塩架橋の形成のようなイオン相互作用又は共有結合を介して互いに結合することができる。
一つの実施態様によると、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体コアゴニスト活性を示し、配列番号１１、４７、４８及び４９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。一つの実施態様において、側鎖は互いに共有結合しており、一つの実施態様において、２個のアミノ酸が互いに結合してラクタム環を形成する。
一つの実施態様によると、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号４５を含み、ここで少なくとも１つのラクタム環が、アミノ酸対１２と１６、１６と２０、２０と２４及び２４と２８からなる群より選択されるアミノ酸対の側鎖の間に形成される。一つの実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号２０のグルカゴンペプチド類縁体を含み、ここでペプチドは、１２と１６位のアミノ酸の間又は１６と２０位のアミノ酸の間に形成された分子内ラクタム架橋を含む。一つの実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、アミノ酸配列２０の配列を含み、ここで、分子内ラクタム架橋は、１２と１６位のアミノ酸の間、１６と２０位のアミノ酸の間又は２０と２４位のアミノ酸の間に形成され、２９位のアミノ酸はグリシンであり、配列番号２９の配列は、配列番号２０のＣ末端アミノ酸と結合している。更なる実施態様において、２８位のアミノ酸はアスパラギン酸である。
幾つかの特定の実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドのＣ末端部分におけるアルファ−へリックス構造の安定化は、ラクタム架橋以外の分子内架橋の形成によって達成される。例えば、適切な共有結合方法には、オレフィンメタセシス、ランチオニンに基づいた環化、ジスルフィド架橋又は改質硫黄含有架橋形成、α，ω−ジアミノアルカン鎖の使用、金属原子架橋の形成、ペプチド環化の他の方法、のいずれかの１つ以上が含まれ、これらがアルファ−へリックスの安定化のために使用される。
更に、ＧＬＰ−１受容体における増強された活性は、所望の活性を保持する位置への１個以上のα，α−二置換アミノ酸の導入を介して、グルカゴンペプチドのＣ末端部分（アミノ酸１２〜２９付近）のアルファ−へリックス構造を安定化することによって達成することができる。幾つかの態様において、アルファ−へリックスの安定化は、この方法により、塩架橋又は共有結合のような分子内架橋を導入することなく達成される。幾つかの実施態様において、グルカゴンペプチドの１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４又は２９位の１、２、３、４つ又はそれ以上は、α，α−二置換アミノ酸で置換されている。例えば、アミノイソ酪酸（ＡＩＢ）によるクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドの１６位の置換は、塩架橋又はラクタムの不在下で、ＧＬＰ−１活性を増強する。幾つかの実施態様において、１６、２０、２１又は２４位の１つ以上は、ＡＩＢで置換されている。
ＧＩＰ−１受容体における増強された活性は、２０位でのアミノ酸修飾により達成することができる。一つの実施態様において、２０位のグルタミンは、荷電されている又は水素結合の能力を有するのいずれかであり、少なくとも５（又は約４〜６）原子長である側鎖を有する別の親水性アミノ酸に、例えばリシン、シトルリン、アルギニン又はオルチニンで置換されている。
ＧＬＰ−１受容体において増加された活性は、配列番号２６のＣ末端延長を含むクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドにおいて示されている。配列番号２６を含むそのようなクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドにおけるＧＬＰ−１活性を、本明細書に記載されているように、１８、２８若しくは２９位のアミノ酸又は１８及び２９位のアミノ酸を修飾することにより、更に増加することができる。
ＧＬＰ−１効力の更なる中程度の増加は、１０位のアミノ酸を修飾してＴｒｐにすることによって達成することができる。
ＧＬＰ−１受容体活性を増加する修飾の組み合わせは、一般に、単独で実施されるそのような修飾のいずれのものよりも高いＧＬＰ−１活性をもたらす。例えば、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、場合により１６と２０位のアミノ酸の間に共有結合を有して、１６位、２０位及びＣ末端カルボン酸基に修飾を含むことができる；１６位及びＣ末端カルボン酸基に修飾を含むことができる；場合により１６と２０位のアミノ酸の間に共有結合を有して、１６及び２０位に修飾を含むことができる；又は２０位及びＣ末端カルボン酸基に修飾を含むことができるが、場合により１２位のアミノ酸はＡｒｇではなく、若しくは場合により９位のアミノ酸はＧｌｕではない。
溶解性に影響を与える修飾
親水性部分の付加
クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドを更に修飾して、生理学的ｐＨでの水溶液中のペプチドの溶解性及び安定性を改善しながら、同時に天然グルカゴンに対して高い生物学的活性を保持することができる。本明細書において考察される親水性部分を、本明細書において更に考察されるように、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドに結合することができる。
一つの実施態様によると、配列番号９又は配列番号１０を含むクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドの１７、２１及び２４位への親水性部分の導入は、生理学的ｐＨを有する溶液における高効力グルカゴン類縁体の溶解性及び安定性を改善すると予測される。そのような基の導入も、例えば延長された循環半減期により測定すると、作用の持続時間を増加する。
一つの実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８及び配列番号１９からなる群より選択される配列を含み、ここで前記クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドの１６、１７、２１又は２４位のうちの１つのアミノ酸残基の側鎖は、約５００〜約４０，０００ダルトンの範囲から選択される分子量を有するポリエチレングリコール鎖を更に含む。一つの実施態様において、ポリエチレングリコール鎖は、約５００〜約５，０００ダルトンの範囲から選択される分子量を有する。別の実施態様において、ポリエチレングリコール鎖は、約１０，０００〜約２０，０００ダルトンの分子量を有する。更に他の例示的な実施態様において、ポリエチレングリコール鎖は、約２０，０００〜約４０，０００ダルトンの分子量を有する。
適切な親水性部分には、本明細書に記載されている親水性部分、ＰＥＧのホモ−又はコポリマー、及びＰＥＧのモノメチル置換ポリマー（ｍＰＥＧ）を含む、当該技術において既知の任意の水溶性ポリマーが含まれる。一つの実施態様によると、親水性基は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を含む。より詳細には、一つの実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号６又は配列番号７の配列を含み、ここで、ＰＥＧ鎖は、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドの２１及び２４位の存在するアミノ酸の側鎖に共有結合し、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドのカルボキシ末端アミノ酸は、カルボン酸基を有する。一つの実施態様によると、ポリエチレングリコール鎖は、約５００〜約１０，０００ダルトンの範囲から選択される平均分子量を有する。
一つの実施態様によると、ペグ化クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドに共有結合している２つ以上のポリエチレン鎖を含み、ここでグルカゴン鎖の総分子量は、約１，０００〜約５，０００ダルトンである。一つの実施態様において、ペグ化グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号５から構成されるペプチド又は配列番号５のグルカゴンアゴニスト類縁体を含み、ここで、ＰＥＧ鎖は２１位及び２４位のアミノ酸残基に共有結合しており、２つのＰＥＧ鎖の合計した分子量は、約１，０００〜約５，０００ダルトンである。
荷電Ｃ末端
配列番号２０を含むクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドの溶解性を、例えば、配列番号２０のグルカゴンペプチドのＣ末端部分、好ましくは２７位のＣ末端側の位置に、１、２、３個又はそれ以上の荷電アミノ酸を導入することにより、更に改善することができる。そのような荷電アミノ酸は、例えば２８又は２９位で天然アミノ酸を荷電アミノ酸で置換する、あるいは２７、２８又は２９位の後に荷電アミノ酸を付加することによって導入することができる。例示的な実施態様において、１、２、３個又は全ての荷電アミノ酸は、負に荷電されている。グルカゴン活性を依然として保持することが可能であるような追加的な修飾、例えば保存的置換をクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドに行うことができる。一つの実施態様において、１７〜２６位での１又は２個のアミノ酸置換により配列番号２０と異なる類縁体、一つの実施態様において、２０位でのアミノ酸置換により配列番号２０のペプチドと異なる類縁体である、配列番号２０のクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドの類縁体が提供される。
アシル化／アルキル化
一つの実施態様によると、グルカゴンペプチドは修飾されて、アシル基を含み、循環半減期を延長する及び／又は作用の開始を遅延する及び／又は作用の持続時間を延長する及び／又はＤＰＰ−ＩＶのようなプロテアーゼに対する耐性を改善する。クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドのグルカゴン受容体及びＧＬＰ−１受容体における活性は、アシル化の後で維持される。更に、アシル化類縁体の効力は、非アシル化型のクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドに匹敵していた。
幾つかの実施態様において、本発明は、グルカゴンペプチドの１０位のアミノ酸に共有結合しているアシル基又はアルキル基を含むように修飾されているクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドを提供する。グルカゴンペプチドは、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドの１０位のアミノ酸とアシル基又はアルキル基との間にスペーサーを更に含むことができる。前述のクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドのいずれも、２つのアシル基若しくは２つのアルキル基又はそれらの組み合わせを含むことができる。
本発明の特定の態様において、アシル化クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号５３４〜５４４及び５４６〜５４９のいずれかのアミノ酸配列を含む。
Ｃ末端切断
幾つかの実施態様において、本明細書に記載されているクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、グルカゴン及びＧＬＰ−１受容体における活性及び／又は効力に影響を与えることなく、グルカゴンペプチドのＣ末端の１又は２個のアミノ酸（すなわち、２９及び／又は２８位）の切断又は欠失により更に修飾される。この点において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、天然グルカゴンペプチド（配列番号１）のアミノ酸１〜２７又は１〜２８を含むことができ、更に、本明細書に記載されている１個以上の修飾を有してもよい。
一つの実施態様において、切断クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号５５０又は配列番号５５１を含む。別の実施態様において、切断グルカゴンアゴニストペプチドは、配列番号５５２及び配列番号５５３を含む。
Ｃ末端延長
一つの実施態様によると、本明細書に開示されているクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、グルカゴンペプチドのカルボキシ末端、例えば配列番号２６、配列番号２７又は配列番号２８への第２ペプチドの付加により修飾される。一つの実施態様において、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８及び配列番号６９からなる群より選択される配列を有するクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、ペプチド結合を介して第２ペプチドに共有結合しており、ここで第２ペプチドは、配列番号２６、配列番号２７及び配列番号２８からなる群より選択される配列を含む。更なる実施態様において、Ｃ末端延長を含むクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドにおいて、野生型グルカゴンの２９位のトレオニンはグリシンで置換されている。２９位のトレオニンにグリシン置換を有し、配列番号２６のカルボキシ末端延長を含むクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号２６のカルボキシ末端延長を含むように修飾された天然グルカゴンよりも、ＧＬＰ−１受容体において、４倍効力がある。ＧＬＰ−１受容体における効力を、１８位の天然アルギニンのアラニン置換により更に増強することができる。
したがって、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号２７（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）又は配列番号２８のカルボキシ末端延長を有することができる。一つの実施態様によると、配列番号３３又は配列番号２０を含むクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、グルカゴンペプチドのアミノ酸２９に結合している配列番号２７（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）又は配列番号２８のアミノ酸配列を更に含む。より詳細には、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５からなる群より選択される配列を含み、更に、グルカゴンペプチドのアミノ酸２９に結合している列番号２７（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）又は配列番号２８のアミノ酸配列を含む。より詳細には、グルカゴンペプチドは、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号５５及び配列番号５６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、更に、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドのアミノ酸２９に結合している配列番号２６（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）又は配列番号２９のアミノ酸配列を含む。一つの実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号６４の配列を含む。
他の修飾
グルカゴン受容体活性を増加又は減少し、ＧＬＰ−１受容体活性を増加するクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドに関して上記に記載された修飾のいずれも、個別に又は組み合わせて適用することができる。ＧＬＰ−１受容体活性を増加する修飾の組み合わせは、一般に、単独で実施されるそのような修飾のいずれのものよりも高いＧＬＰ−１活性をもたらす。上記に記載された修飾のいずれかを、増加した溶解性及び／又は安定性及び／又は作用持続時間のような他の所望の特性を付与するクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドを参照した本明細書に記載されている他の修飾と組み合わせることもできる。あるいは、上記に記載された修飾のいずれかを、溶解性又は安定性又は活性に実質的に影響を与えない、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドについて本明細書に記載されている他の修飾と組み合わせることができる。例示的な修飾には以下が含まれるが、これらに限定されない：
（Ａ）例えば、天然グルカゴンのＣ末端部分、好ましくは２７位のＣ末端側の位置への１、２、３個又はそれ以上の荷電アミノ酸の導入により溶解性を改善すること。そのような荷電アミノ酸は、例えば２８又は２９位で天然アミノ酸を荷電アミノ酸で置換する、あるいは２７、２８又は２９位の後に荷電アミノ酸を付加することによって導入することができる。例示的な実施態様において、１、２、３個又は全ての荷電アミノ酸は、負に荷電されている。他の実施態様において、１、２、３個又は全ての荷電アミノ酸は、正に荷電されている。そのような修飾は溶解性を増加し、例えば、２５℃で２４時間後に測定したとき、約５．５〜８の所定のｐＨ、例えばｐＨ７で、天然グルカゴンを基準として少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２５倍、３０倍又はそれ以上の溶解性をもたらす。
（Ｂ）例えばペプチドの１６、１７、２０、２１、２４若しくは２９位又はＣ末端アミノ酸への、本明細書に記載されているポリエチレングリコール鎖のような親水性部分の付加により、溶解性及び作用持続時間又は循環半減期を増加すること。
（Ｃ）１５位のアスパラギン酸の修飾により、例えばグルタミン酸、ホモグルタミン酸、システイン酸又はホモシステイン酸による欠失又は置換により、溶解性を増加すること。そのような修飾は、５．５〜８の範囲内のｐＨにおいて、特に酸性又はアルカリ性緩衝液において分解又は切断を低減することができ、例えば２５℃で２４時間後に元のペプチドの少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％を保持することができる。
（Ｄ）２７位のメチオニンの修飾により、例えばロイシン又はノルロイシンでの置換により、安定性を増加すること。そのような修飾は酸化分解を低減することができる。安定性は、２０又は２４位のＧｌｎの修飾により、例えば、Ａｌａ又はＡＩＢでの置換により増強することもできる。そのような修飾は、Ｇｌｎの脱アミド化を介して生じる分解を低減することができる。安定性は、２１位のＡｓｐの修飾により、例えばＧｌｕでの置換により増強することができる。そのような修飾は、Ａｓｐの脱水により環状スクシンイミド中間体を形成し、続く異性化によりイソアスパラギン酸塩を形成することによって生じる分解を低減することができる。
（Ｅ）本明細書に記載されているＤＰＰ−ＩＶ耐性アミノ酸による１又は２位のアミノ酸の修飾により及びＮ−メチル−アラニンによる２位のアミノ酸の修飾を含むことにより、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ ＩＶ）に対する耐性を増加すること。
（Ｆ）活性に影響を与えない保存的若しくは非保存的置換、付加又は欠失、例えば、２、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８若しくは２９位の１つ以上での保存的置換；２７、２８若しくは２９位の１つ以上での欠失；又はＣ末端カルボン酸基の代わりにＣ末端アミド若しくはエステルと場合により組み合わせたアミノ酸２９の欠失。
（Ｇ）本明細書に記載されているＣ末端延長を付加すること；
（Ｈ）本明細書に記載されているグルカゴンペプチドの例えばアシル化又はアルキル化により、循環半減期を増加する及び／又は作用持続時間を延長する及び／又は作用開始を遅延すること。
（Ｉ）本明細書に記載されているホモ二量体化又はヘテロ二量体化。
他の修飾には、大型の芳香族アミノ酸（例えば、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はアミノ−Ｐｈｅ）による１位のＨＩｓの置換；Ａｌａによる２位のＳｅｒの置換；Ｖａｌ又はＰｈｅによる１０位のＴｒｙの置換；Ａｒｇによる１２位のＬｙｓの置換；Ｇｌｕによる１５位のＡｓｐの置換；Ｔｈｒ又はＡＩＢによる１６位のＳｅｒの置換が含まれる。
大型の芳香族アミノ酸（例えば、Ｔｙｒ）による１位のＨｉｓの非保存的置換を含有するＧＬＰ−１活性を有するクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、アルファ−へリックスが例えば本明細書に記載されているもののいずれかのような分子内架橋を介して安定化している限り、ＧＬＰ−１活性を保持することができる。
結合体及び融合体
クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドを結合体部分に結合することができ、この結合は、共有結合を介してでもよいし、リンカーを介してでもよい。
クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、また、第２ペプチド又はポリペプチドがクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドの末端、例えばカルボキシ末端に融合している融合ペプチド又はタンパク質の一部であってもよい。
より詳細には、融合クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、アミノ酸２９に結合している配列番号２６（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）、配列番号２７（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）又は配列番号２８（ＫＲＮＲ）のアミノ酸配列を更に含んでいるグルカゴンペプチドであって、配列番号５５、配列番号９又は配列番号１０であるグルカゴンアゴニストを含むことができる。一つの実施態様において、配列番号２６（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）、配列番号２７（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）又は配列番号２８（ＫＲＮＲ）のアミノ酸配列は、ペプチド結合を介してクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドのアミノ酸２９に結合している。出願人たちは、エキセンディン−４のＣ末端延長ペプチド（例えば、配列番号２６又は配列番号２９）を含むクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチド融合ペプチドにおいて、グリシンによる２９位の天然トレオニン残基の置換が、ＧＬＰ−１活性を顕著に増加することを発見した。このアミノ酸置換を、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドに関して本明細書に開示されている他の修飾と一緒に使用して、ＧＬＰ−１受容体に対するグルカゴン類縁体の親和性を増強することができる。例えば、Ｔ２９Ｇ置換を、Ｓ１６Ｅ及びＮ２０Ｋアミノ酸置換と、場合によりアミノ酸１６と２０の間のラクタム架橋と、場合により本明細書に記載されているＰＥＧ鎖の付加と、組み合わせることができる。一つの実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号６４の配列を含む。一つの実施態様において、グルカゴン融合ペプチドのクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチド部分は、配列番号５５、配列番号２、配列番号３、配列番号４及び配列番号５からなる群より選択され、ここでＰＥＧ鎖は、１７、２１、２４位若しくはＣ末端アミノ酸又は２１及び２４位の両方に存在する場合、５００〜４０，０００ダルトンの範囲から選択される。より詳細には、一つの実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドセグメントは、配列番号７、配列番号８及び配列番号６３からなる群より選択され、ここでＰＥＧ鎖は、５００〜５，０００範囲から選択される。一つの実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号５５及び配列番号６５の配列を含む融合ペプチドであり、ここで配列番号６５のペプチドは、配列番号５５のカルボキシ末端に結合している。
一つの実施態様によると、配列番号１０のクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドの追加的な化学修飾は、グルカゴン受容体及びＧＬＰ−１受容体における相対的活性が実質的に同等である点まで増加したＧＬＰ−１受容体抗力を付与する。したがって、一つの実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、天然アミノ酸に存在するカルボン酸基の代わりにアミド基を含む末端アミノ酸を含む。グルカゴン受容体及びＧＬＰ−１受容体それぞれにおけるクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドの相対的活性を、グルカゴン受容体において天然グルカゴンの約４０％〜約５００％以上の活性及びＧＬＰ−１受容体における天然ＧＬＰ−１の約２０〜約２００％以上の活性、例えば、ＧＬＰ−１受容体におけるグルカゴンの通常の活性に対して５０倍又は１００倍以上を示す類縁体を産生するように更に修飾することによって、調整することができる。
例示的な実施態様
一つの実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号５５の類縁体であり、前記類縁体は、１、２、３、５、７、１０、１１、１３、１４、１７、１８、１９、２１、２４、２７、２８及び２９位から選択される１〜３個のアミノ酸によって配列番号５５と異なっており、前記クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、ＧＬＰ−１受容体における天然ＧＬＰ−１の少なくとも２０％の活性を示す。
一つの実施態様によると、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列：
ＮＨ２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号３３）を含み、ここで、１５位のＸａａは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、ホモグルタミン酸及びホモシステイン酸からなるアミノ酸の群より選択され、１６位のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ，ホモグルタミン酸及びホモシステイン酸からなるアミノ酸の群より選択され、２０位のＸａａは、Ｇｌｎ又はＬｙｓであり、２４位のＸａａは、Ｇｌｎ又はＧｌｕであり、２８位のＸａａは、Ａｓｎ、Ｌｙｓ又は酸性アミノ酸であり、２９位のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ又は酸性アミノ酸であり、そしてＲはＣＯＯＨ又はＣＯＮＨ２であるが、但し、１６位がセリンである場合、２０位はＬｙｓであるか、あるいは１６位がセリンであり、２４位がＧｌｕである場合、２０位又は２８位のいずれかはＬｙｓである。一つの実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号３３の配列を含み、ここで、２８位のアミノ酸はアスパラギン酸であり、２９位のアミノ酸はグルタミン酸である。別の実施態様において、２８位のアミノ酸は天然のアスパラギンであり、２９位のアミノ酸はグリシンであり、配列番号２９又は配列番号６５のアミノ酸配列は、配列番号３３のカルボキシ末端に共有結合している。
一つの実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、追加的な酸性アミノ酸がペプチドのカルボキシ末端に付加されている配列番号３３の配列を含む。更なる実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドのカルボキシ末端アミノ酸は、天然アミノ酸のカルボン酸基の代わりにアミドを有する。一つの実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３及び配列番号４４からなる群より選択される配列を含む。
一つの実施態様によると、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号３３を含む類縁体であり、前記類縁体は、１、２、３、５、７、１０、１１、１３、１４、１７、１８、１９、２１及び２７位から選択される１〜３個のアミノ酸により配列番号３３と異なるが、但し、１６位のアミノ酸がセリンである場合、２０位はリシンであるか、又はラクタム架橋が、２４位のアミノ酸と、２０位又は２８位のアミノ酸との間に形成される。一つの実施態様によると、類縁体は、１、２、３、２１及び２７位から選択される１〜３個のアミノ酸により配列番号３３と異なっている。一つの実施態様において、配列番号３３のグルカゴンペプチドの類縁体は、１若しくは２個のアミノ酸、又は一つの実施態様では１、２、３、５、７、１０、１１、１３、１４、１７、１８、１９、２１及び２７位から選択される単一のアミノ酸によって配列番号３３の配列とは異なっているが、但し、１６位のアミノ酸がセリンである場合、２０位はリシンであるか、又はラクタム架橋が、２４位のアミノ酸と、２０位又は２８位のアミノ酸との間に形成される。
別の実施態様によると、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、ＮＨ２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号５３）の配列を含む相対的に選択性のＧＬＰ−１受容体アゴニストであり、ここで、３位のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｏｒｎ又はＮｌｅからなるアミノ酸の群より選択され、１５位のＸａａは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、ホモグルタミン酸及びホモシステイン酸からなるアミノ酸の群より選択され、１６位のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸及びホモシステイン酸からなるアミノ酸の群より選択され、２０位のＸａａは、Ｇｌｎ又はＬｙｓであり、２４位のＸａａは、Ｇｌｎ又はＧｌｕであり、２８位のＸａａは、Ａｓｎ、Ｌｙｓ又は酸性アミノ酸であり、２９位のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ又は酸性アミノ酸であり、そしてＲは、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２、配列番号２６又は配列番号２９であるが、但し、１６位がセリンである場合、２０位はＬｙｓであるか、あるいは１６がセリンであり、２４位がＧｌｕである場合、２０位又は２８位のいずれかはＬｙｓである。一つの実施態様において、３位のアミノ酸はグルタミン酸である。一つの実施態様において、２８及び／又は２９位で置換されている酸性アミノ酸は、アスパラギン酸又はグルタミン酸である。一つの実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、ペプチドのカルボキシ末端に付加されている追加的な酸性アミノ酸を更に含む、配列番号３３の配列を含む。更なる実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドのカルボキシ末端アミノ酸は、天然アミノ酸のカルボン酸基の代わりにアミドを有する。
一つの実施態様によると、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、下記：
ＮＨ２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号３４）からなる群より選択される修飾グルカゴンペプチドを含み、ここで、１５位のＸａａは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、ホモグルタミン酸及びホモシステイン酸からなるアミノ酸の群より選択され、１６位のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ，ホモグルタミン酸及びホモシステイン酸からなるアミノ酸の群より選択され、２０位のＸａａは、Ｇｌｎ又はＬｙｓであり、２４位のＸａａは、Ｇｌｎ又はＧｌｕであり、２８位のＸａａは、Ａｓｎ、Ａｓｐ又はＬｙｓであり、Ｒは、ＣＯＯＨ又はＣＯＮＨ２であり、２９位のＸａａは、Ｔｈｒ又はＧｌｙであり、そしてＲはＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２、配列番号２６又は配列番号２９であるが、但し、１６位がセリンである場合、２０位はＬｙｓであるか、あるいは１６位がセリンであり、２４位がＧｌｕである場合、２０位又は２８位のいずれかはＬｙｓである。一つの実施態様において、ＲはＣＯＮＨ２であり、１５位のＸａａはＡｓｐであり、１６位のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸及びホモシステイン酸からなるアミノ酸の群より選択され、２０及び２４位のＸａａは、それぞれＧｌｎであり、２８位のＸａａは、Ａｓｎ又はＡｓｐであり、そして２９位のＸａａは、Ｔｈｒである。一つの実施態様において、１５及び１６位のＸａａは、それぞれＧｌｕであり、２０及び２４位のＸａａは、それぞれＧｌｎであり、２８位のＸａａは、Ａｓｎ又はＡｓｐであり、２９位のＸａａはＴｈｒであり、そしてＲはＣＯＮＨ２である。
一つの実施態様によると、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、増強されたＧＬＰ−１活性を有し、（ａ）大型の芳香族アミノ酸による１位のＨｉｓのアミノ酸置換及び（ｂ）分子のＣ末端部分（例えば、１２〜２９位付近）のアルファ−へリックスを安定化する分子内架橋を含む。特定の実施態様において、１位のアミノ酸は、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、アミノ−Ｐｈｅ、ニトロ−Ｐｈｅ、クロロ−Ｐｈｅ、スルホ−Ｐｈｅ、４−ピリジル−Ａｌａ、メチル−Ｔｙｒ又は３−アミノＴｙｒである。特定の態様において、分子内架橋は、３個の介在アミノ酸により離れている２個のアミノ酸の側鎖の間、すなわち、アミノ酸ｉとｉ＋４の側鎖の間にある。幾つかの実施態様において、分子内架橋はラクタム架橋である。本発明のより特定の実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、ペプチドの１位に大型の芳香族アミノ酸及び１６と２０位のアミノ酸の間にラクタム架橋を含む。そのようなクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、１個以上（例えば、２、３、４、５個又はそれ以上）の本明細書に記載されている他の修飾を更に含むことができる。例えば、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、Ｃ末端カルボキシレートの代わりにアミドを含むことができる。したがって、一つの実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号５５５のアミノ酸配列を含む。
本発明の更に別の実施態様によると、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、増強されたＧＬＰ−１活性を有し、（ａ）アミノ酸位置１２〜２９内にα，α−二置換アミノ酸による１個以上の置換及び場合により（ｂ）Ｃ末端アミドを含む。幾つかの態様において、そのようなクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、特に、グルカゴンのＣ末端部分（１２〜２９位付近）のアルファ−へリックスを安定化する分子内架橋を欠いていることが理解されるべきである。幾つかの実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドの１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４又は２９位の１、２、３、４つ又はそれ以上は、α，α−二置換アミノ酸、例えばアミノイソ酪酸（ＡＩＢ）、メチル、エチル、プロピル及びｎ−ブチルから選択される同一若しくは異なる基で二置換されたアミノ酸又はシクロオクタン若しくはシクロヘプタン（例えば、１−アミノシクロオクタン−１−カルボン酸）により置換されている。例えば、ＡＩＢによる１６での置換は、塩架橋又はラクタムの不在下で、ＧＬＰ−１活性を増強する。幾つかの実施態様において、１６、２０、２１又は２４位の１、２，３つ又はそれ以上は、ＡＩＢで置換されている。そのようなクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、アシル化、アルキル化、ペグ化、Ｃ末端での１〜２個のアミノ酸の欠失、Ｃ末端での荷電アミノ酸による付加及び／又は置換、Ｃ末端カルボキシレートのアミドへの交換、Ｃ末端延長の付加、並びにＬｅｕ又はＮｌｅによる２７位のＭｅｔの置換、Ｇｌｕ（又は同様のアミノ酸）による１５位のＡｓｐの置換、ＤＰＰ−ＩＶプロテアーゼ耐性を達成するアミノ酸による１及び／又は２位での置換、Ａｌａによる２位のＳｅｒの置換、Ｖａｌ又はＰｈｅによる１０位のＴｙｒの置換、Ａｒｇによる１２位のＬｙｓの置換、Ｔｈｒ又はＡＩＢによる１６位のＳｅｒの置換、Ａｓｐ、Ｇｌｕ又はＡＩＢによる２０及び／又は２４位のＧｌｎの置換、Ｇｌｕ又はＴｈｒによる１６位のＳｅｒの置換、Ａｌａによる１８位のＡｒｇの置換、Ｌｙｓによる２０位のＧｌｎの置換、Ｇｌｕによる２１位のＡｓｐの置換及びＡｓｎ又はＣｙｓによる２４位のＧｌｎの置換のような保存的及び／又は非保存的アミノ酸置換、が含まれるが、これらに限定されない、本明細書に記載されている他の修飾の１個以上を更に含むことができる。幾つかの実施態様において、前記のクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、２９位にＧｌｎ若しくはＧｌｙを含むか又はＣ末端延長の付加、例えば２８位のアミノ酸へのＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号２６）Ｃ末端の付加を含む。特定の態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、Ｃ末端カルボキシレートの代わりに１つ以上のアミド基、アシル基、例えばＣ１６脂肪酸、及び親水性部分、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。また、別の特定の態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号１に対して１０個以下の修飾を含み、１６、２０、２１及び／又は２４位にＡＩＢにより１個以上のアミノ置換を含む、配列番号１〜２５、３０〜６４及び６６〜５５５のいずれかのアミノ酸配列を含み、ここでペプチドは、ペプチドの２個のアミノ酸の側鎖の間の分子内架橋を欠いている。したがって、より特定の態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号５５６〜５６１のいずれかのアミノ酸配列を含む。
天然グルカゴンペプチドの特定の位置を修飾し、同時に母体ペプチドの活性の少なくとも一部分を保持できることが報告されている。したがって、出願人たちは、配列番号１１のクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドの２、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８又は２９位に配置された１個以上のアミノ酸を、天然グルカゴンペプチドに存在するものと異なるアミノ酸で置換することができ、依然としてグルカゴン受容体において活性を保持することができると予測する。一つの実施態様において、天然ペプチドの２７位に存在するメチオニン残基をロイシン又はノルロイシンに変えて、ペプチドの酸化分解を防止する。別の実施態様において、２０位のアミノ酸は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎ若しくはシトルリンで置換されている、及び／又は２１位は、Ｇｌｕ、ホモグルタミン酸若しくはホモシステイン酸で置換されている。
一つの実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、１、２、５、７、１０、１１、１３、１４、１７、１８、１９、２１、２７、２８又は２９位から選択される追加的な１〜６個のアミノ酸の変化によって配列番号１の対応するアミノ酸と異なる配列番号２０を含むが、但し、１６位のアミノ酸がセリンである場合、２０位はＬｙｓであるか、あるいは１６位がセリンであり、２４位がＧｌｕである場合、２０位又は２８位のいずれかは、Ｌｙｓである。別の実施態様によると、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、１、２、５、７、１０、１１、１３、１４、１７、１８、１９、２０、２１、２７、２８又は２９位から選択される１〜３個のアミノ酸が配列番号１の対応するアミノ酸と異なる、配列番号２０を含む。別の実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、１、２、５、７、１０、１１、１３、１４、１７、１８、１９、２０又は２１位から選択される１〜２個のアミノ酸が配列番号１の対応するアミノ酸と異なる、配列番号８、配列番号９又は配列番号１１を含み、更なる実施態様において、１〜２個の異なるアミノ酸は、天然グルカゴン配列（配列番号１）に存在するアミノ酸に対して保存的アミノ酸置換を表す。一つの実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、２、５、７、１０、１１、１３、１４、１７、１８、１９、２０、２１、２７又は２９位から選択される位置で１、２又は３個のアミノ酸置換を更に含む、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５を含む。一つの実施態様において、２、５、７、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２７又は２９位での置換は、保存的アミノ酸置換である。
一つの実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、１６、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２７、２８及び２９位それぞれから選択される１〜１０個のアミノ酸が配列番号１の対応するアミノ酸と異なっている配列番号３３の変異配列を含む。一つの実施態様によると、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、Ｇｌｎ１７、Ａｌａ１８、Ｇｌｕ２１、Ｉｌｅ２３、Ａｌａ２４、Ｖａｌ２７及びＧｌｙ２９からなる群より選択される１個以上のアミノ酸置換により配列番号３３と異なっている。一つの実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、１７〜２６位から選択される１〜２個のアミノ酸が配列番号１の対応するアミノ酸と異なっている配列番号３３の変異配列を含む。一つの実施態様によると、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、Ｇｌｎ１７、Ａｌａ１８、Ｇｌｕ２１、Ｉｌｅ２３及びＡｌａ２４からなる群より選択されるアミノ酸置換により配列番号３３と異なっている、配列番号３３の変異配列を含む。一つの実施態様によると、配列番号３３の変異配列は、１８位のアミノ酸置換により配列番号３３と異なっており、ここで置換アミノ酸は、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＧｌｙからなる群より選択される。一つの実施態様によると、配列番号３３の変異配列は、１８位のＡｌａのアミノ酸置換により配列番号３３と異なっている。そのような変異は、配列番号５５に包含される。別の実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、１７〜２２位から選択される１〜２個のアミノ酸が配列番号１の対応するアミノ酸と異なっている配列番号３３の変異配列を含み、更なる実施態様において、配列番号３３の変異体の変異配列は、２０及び２０位の１〜２個のアミノ酸置換により配列番号３３と異なっている。一つの実施態様によると、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列：
ＮＨ２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号１５）を含み、ここで、１５位のＸａａは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、ホモグルタミン酸又はホモシステイン酸であり、１６位のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸又はホモシステイン酸であり、２０位のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎ又はシトルリンであり、２１位のＸａａは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ホモグルタミン酸又はホモシステイン酸であり、２４位のＸａａは、Ｇｌｎ又はＧｌｕであり、２８位のＸａａは、Ａｓｎ、Ｌｙｓ又は酸性アミノ酸であり、２９位のＸａａは、Ｔｈｒ又は酸性アミノ酸であり、そしてＲは、ＣＯＯＨ又はＣＯＮＨ２である。一つの実施態様において、ＲはＣＯＮＨ２である。一つの実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号４７、配列番号４８又は配列番号４９の変異配列を含み、これは２０位のアミノ酸置換により前記配列と異なっている。一つの実施態様において、アミノ酸置換は、２０位のＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎ又はシトルリンからなる群より選択される。
一つの実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、２位にセリン以外のアミノ酸を有することにより配列番号３４と異なる、配列番号３４の類縁体ペプチド配列を含む。一つの実施態様において、セリン残基は、アミノイソ酪酸、Ｄ−アラニンで置換されており、一つの実施態様において、セリン残基は、アミノイソ酪酸で置換されている。そのような修飾は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶにより切断を抑制しながら、同時に母体化合物の固有の効力を保持する（例えば、母体化合物の効力の少なくとも７５、８０、８５、９５％又はそれ以上）。一つの実施態様において、類縁体の溶解性は、例えば、天然グルカゴンのＣ末端部分、好ましくは２７位のＣ末端側の位置への１、２、３個又はそれ以上の荷電アミノ酸の導入により増加される。例示的な実施態様において、１、２、３個又は全ての荷電アミノ酸は、負に荷電されている。別の実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、天然アミノ酸の２８若しくは２９位に酸性アミノ酸置換、又は配列番号３４のペプチドのカルボキシ末端に付加された酸性アミノ酸を更に含む。
一つの実施態様において、本明細書に開示されているクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断に対する感受性を低減するために、１又は２位において更に修飾されている。一つの実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、２位での置換により母体分子と異なり、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断に対して低減された感受性（すなわち、耐性）を示す、配列番号９、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３配列番号１４又は配列番号１５の配列を含む。より詳細には、一つの実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドの２位は、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、バリン、α−アミノイソ酪酸、グリシン、Ｎ−メチルセリン及びε−アミノ酪酸からなる群より選択されるアミノ酸で置換されている。一つの実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドの２位は、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、グリシン、Ｎ−メチルセリン及びアミノイソ酪酸からなる群より選択されるアミノ酸で置換されている。別の実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドの２位は、Ｄ−セリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン及びα−アミノ酪酸からなる群より選択されるアミノ酸で置換されている。一つの実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号２１又は配列番号２２の配列を含む。
一つの実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、１位での置換により母体分子と異なり、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断に対して低減された感受性（すなわち、耐性）を示す、配列番号９、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３配列番号１４又は配列番号１５の変異配列を含む。より詳細には、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドの１位は、Ｄ−ヒスチジン、アルファ，アルファ−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン及びホモ−ヒスチジンからなる群より選択されるアミノ酸である。別の実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、類縁体が、１位にヒスチジン以外のアミノ酸を有することにより配列番号３４と異なる、配列番号３４の類縁体ペプチドを含む。一つの実施態様において、類縁体の溶解性は、例えば、天然グルカゴンのＣ末端部分、好ましくは２７位のＣ末端側の位置への１、２、３個又はそれ以上の荷電アミノ酸の導入により増加される。例示的な実施態様において、１、２、３個又は全ての荷電アミノ酸は、負に荷電されている。別の実施態様において、類縁体は、天然アミノ酸の２８若しくは２９位に酸性アミノ酸置換又は配列番号３４のペプチドのカルボキシ末端に付加された酸性アミノ酸を更に含む。一つの実施態様において、酸性アミノ酸は、アスパラギン酸又はグルタミン酸である。
一つの実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、１個のアミノ酸の追加的なカルボキシ末端延長又は配列番号２６、配列番号２７及び配列番号２８からなる群より選択されるペプチドを更に含む、配列番号２０の配列を含む。実施態様において、単一のアミノ酸が配列番号２０のカルボキシ末端に付加される場合、アミノ酸は典型的には２０個の通常のアミノ酸のうちの１個から選択され、一つの実施態様において、追加的なカルボキシ末端アミノ酸は、天然アミノ酸のカルボン酸の代わりにアミド基を有する。一つの実施態様において、追加的なアミノ酸は、グルタミン酸、アスパラギン酸及びグリシンからなる群より選択される。
代替的な実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、グルタミン酸残基とリシン残基の側鎖の間に形成された少なくとも１つのラクタム架橋を含み、グルタミン酸残基及びリシン残基は、３個のアミノ酸により離れている。一つの実施態様において、ラクタムを有するクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドのカルボキシ末端アミノ酸は、天然アミノ酸のカルボン酸基の代わりにアミド基を有する。より詳細には、一つの実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、下記：
ＮＨ２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号６６）、
ＮＨ２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号６７）、
ＮＨ２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号６８）、
ＮＨ２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号６９）、
ＮＨ２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｒ（配列番号１６）、
ＮＨ２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｒ（配列番号１７）、
ＮＨ２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｒ（配列番号１８）、
からなる群より選択される修飾グルカゴンペプチドを含み、
ここで、２８位のＸａａは、Ａｓｐ又はＡｓｎであり、２９位のＸａａは、Ｔｈｒ又はＧｌｙであり、Ｒは、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２、グルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン、配列番号２６、配列番号２７及び配列番号２８からなる群より選択され、ラクタム架橋は、配列番号６６では１２位のＬｙｓと１６位のＧｌｕの間、配列番号６７では１６位のＧｌｕと２０位のＬｙｓの間、配列番号６８では２０位のＬｙｓと２４位のＧｌｕの間、配列番号６９では２４位のＧｌｕと２８位のＬｙｓの間、配列番号１６では１２位のＬｙｓと１６位のＧｌｕの間及び２０位のＬｙｓと２４位のＧｌｕの間、配列番号１７では１２位のＬｙｓと１６位のＧｌｕの間及び２４位のＧｌｕと２８位のＬｙｓの間、並びに配列番号１８では１６位のＧｌｕと２０位のＬｙｓの間及び２４位のＧｌｕと２８位のＬｙｓの間に形成される。一つの実施態様において、Ｒは、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２、グルタミン酸、アスパラギン酸、グリシンからなる群より選択され、２８位のアミノ酸はＡｓｎであり、２９位のアミノ酸はトレオニンである。一つの実施態様において、ＲはＣＯＮＨ２であり、２８位のアミノ酸はＡｓｎであり、２９位のアミノ酸はトレオニンである。別の実施態様において、Ｒは、配列番号２６、配列番号２９及び配列番号６５からなる群より選択され、２９位のアミノ酸はグリシンである。
更なる実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８からなる群より選択され、ここでペプチドは、配列番号２６、配列番号２７及び配列番号２８からなる群より選択される１個アミノ酸又はペプチドの追加的なカルボキシ末端延長を更に含む。一つの実施態様において、末端延長は、配列番号２６、配列番号２９又は配列番号６５の配列を含み、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号５５の配列を含む。一つの実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号３３の配列を含み、ここで、１６位のアミノ酸はグルタミン酸であり、２０位のアミノ酸はリシンであり、２８位のアミノ酸はアスパラギンであり、配列番号２６又は配列番号２９のアミノ酸配列は、配列番号３３のカルボキシ末端に結合している。
実施態様において、単一のアミノ酸が配列番号２０のカルボキシ末端に付加される場合、アミノ酸は典型的には２０個の通常のアミノ酸のうちの１個から選択され、一つの実施態様において、アミノ酸は、天然アミノ酸のカルボン酸の代わりにアミド基を有する。一つの実施態様において、追加的なアミノ酸は、グルタミン酸、アスパラギン酸及びグリシンからなる群より選択される。一つの実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドがカルボキシ末端延長を更に含む場合、延長のカルボキシ末端アミノ酸は、一つの実施態様において、カルボン酸ではなくアミド基又はエステル基で終わる。
別の実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、ＮＨ２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｘａａ−Ｘａａ−ＣＯＮＨ２（配列番号１９）の配列を含み、ここで３０位のＸａａは、任意のアミノ酸を表す。一つの実施態様において、Ｘａａは、２０個の通常のアミノ酸のうちの１個から選択され、一つの実施態様において、アミノ酸は、グルタミン酸、アスパラギン酸又はグリシンである。このペプチドの溶解性は、配列番号１９の１７、２１、２４又は３０位のアミノ酸の側鎖にＰＥＧ鎖を共有結合することによって、更に改善することができる。更なる実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号２６、配列番号２７及び配列番号２８からなる群より選択されるペプチドの追加的なカルボキシ末端延長を含む。一つの実施態様によると、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体コアゴニストは、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２の配列を含む。
配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９及び配列番号６４のグルカゴン配列への追加的な部位特異的内部修飾を行って、多様な程度のＧＬＰ−１アゴニスト作用を有する一連のクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドを生じることができる。したがって、それぞれの受容体において実質的に同一のインビトロ効力を有するペプチドが調製され、特徴決定される。同様に、２つの受容体それぞれにおいて選択性が１０倍増強されたペプチドが同定され、特徴決定されている。上記に示したように、グルタミン酸による１６位のセリン残基の置換は、グルカゴンとＧＬＰ−１の両方の受容体において天然グルカゴンの効力を増強するが、グルカゴン受容体に対しておよそ１０倍の選択性を維持する。加えて、グルタミン酸で３位の天然グルタミンを置換することによって（配列番号２２）、ＧＬＰ−１受容体におよそ１０倍の選択性を示すグルカゴン類縁体を生成する。
クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドの溶解性は、ペプチドの１６、１７、２１及び２４位に親水性基を導入することにより又はクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドのカルボキシ末端への単一修飾アミノ酸（すなわち、親水性基を含むように修飾されたアミノ酸）の付加により、生理学的ｐＨの水溶液において更に増強されると同時に、天然グルカゴンに対して高い生物学的活性も保持することができる。一つの実施態様によると、親水性基は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を含む。より詳細には、一つの実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７又は配列番号１８の配列を含み、ここで、ＰＥＧ鎖は、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドの１６、１７、２１、２４位のアミノ酸又はＣ末端アミノ酸の側鎖に共有結合しているが、但し、ペプチドが配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２又は配列番号１３を含む場合、ポリエチレングリコール鎖は、１７、２１、又は２４位のアミノ酸残基に共有結合しており、ペプチドが配列番号１４又は配列番号１５を含む場合、ポリエチレングリコール鎖は、１６、１７又は２１位のアミノ酸残基に共有結合しており、ペプチドが配列番号１６、配列番号１７又は配列番号１８を含む場合、ポリエチレングリコール鎖は、１７又は２１位のアミノ酸残基に共有結合している。
一つの実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号１１、配列番号１２又は配列番号１３の配列を含み、ここで、ＰＥＧ鎖は、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドの１７、２１、２４位のアミノ酸又はＣ末端アミノ酸の側鎖に共有結合しており、ペプチドのカルボキシ末端アミノ酸は、天然アミノ酸のカルボン酸基の代わりにアミド基を有する。一つの実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８及び配列番号１９からなる群より選択される配列を含み、ここで、ＰＥＧ鎖は、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドの配列番号１２、配列番号１３及び配列番号１９の１７、２１若しくは２４位又は配列番号１４及び配列番号１５の１６、１７若しくは２１位又は配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８の１７若しくは２１位のアミノ酸の側鎖に共有結合している。別の実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号１１又は配列番号１９の配列を含み、ここでＰＥＧ鎖は、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドの１７、２１若しくは２４位のアミノ酸又はＣ末端アミノ酸の側鎖に共有結合している。
一つの実施態様によると、先行段落において但し書きで限定されているように、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは修飾されて、１６、１７、２１、２４若しくは２９位又はＣ末端アミノ酸に１個以上のアミノ酸置換を含有し、ここで天然アミノ酸は、例えばＰＥＧを含む親水性部分との架橋に適している側鎖を有するアミノ酸で置換されている。天然ペプチドを、天然に生じるアミノ酸又は合成（非天然）アミノ酸で置換することができる。合成又は非天然アミノ酸とは、インビボで天然に生じないが、それでも、本明細書に記載されるペプチド構造に組み込むことができるアミノ酸を意味する。あるいは、例えばＰＥＧを含む親水性部分との架橋に適している側鎖を有するアミノ酸を、本明細書に開示されているクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドのいずれかのカルボキシ末端に付加することができる。一つの実施態様によると、１６、１７、２１、２４又は２９からなる群より選択される位置で、天然アミノ酸を、リシン、システイン、オルチニン、ホモシステイン及びアセチルフェニルアラニンからなる群より選択されるアミノ酸に代えるアミノ酸置換を、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドにおいて行い、ここで置換アミノ酸は、アミノ酸の側鎖に共有結合しているＰＥＧ鎖を更に含む。一つの実施態様において、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８及び配列番号１９からなる群より選択されるクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、更に修飾されて、グルカゴンペプチドの１７又は２１いのアミノ酸の側鎖に共有結合しているＰＥＧ鎖を含む。一つの実施態様において、ペグ化クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号２６、配列番号２７又は配列番号２９の配列を更に含む。
別の実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号５５又は配列番号５６のＣ末端アミノ酸に結合している配列番号２６、配列番号２９又は配列番号６５のＣ末端延長を更に含み、場合により、ペプチドの１７、１８、２１、２４若しくは２９位のアミノ酸又はＣ末端アミノ酸の側鎖に共有結合しているＰＥＧ鎖を更に含んで、配列番号５５又は配列番号５６の配列を含む。別の実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号５５又は配列番号５６を含み、ここで、ＰＥＧ鎖は、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドの２１又は２４位のアミノ酸の側鎖に共有結合しており、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号２６又は配列番号２９のＣ末端延長を更に含む。
別の実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号５５又は配列番号３３又は配列番号３４を含み、ここで、追加的なアミノ酸は、配列番号３３又は配列番号３４のカルボキシ末端に付加され、ＰＥＧ鎖は、付加アミノ酸の側鎖に共有結合している。更なる実施態様において、ペグ化クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号３３又は配列番号３４のＣ末端アミノ酸に結合している配列番号２６又は配列番号２９のＣ末端延長を更に含む。別の実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号１９の配列を含み、ここで、ＰＥＧ鎖は、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドの３０位のアミノ酸の側鎖に共有結合しており、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号１９のＣ末端アミノ酸に結合している配列番号２６又は配列番号２９のＣ末端延長を更に含む。
一つの実施態様によると、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、ラクタム環が、１２、２０又は２８位に配置されているリシン残基と１６又は２４位に配置されているグルタミン酸残基の側鎖の間に形成されている配列番号２０の配列を含み、ここで側鎖がラクタム環の形成に参加しているグルカゴンペプチドの２つのアミノ酸は、３個の介在アミノ酸により互いに離れている。一つの実施態様によると、ラクタムを有するクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。一つの実施態様において、ラクタムを有するペプチドのカルボキシ末端アミノ酸は、末端カルボン酸の代わりにアミド基又はエステル基を含む。一つの実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７又は配列番号１８のカルボキシ末端に共有結合している追加的なアミノ酸を更に含んで、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８を含む。更なる実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８及び配列番号６９のカルボキシ末端に共有結合している追加的なアミノ酸を更に含んで、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８及び配列番号６９からなる群より選択される配列を含む。一つの実施態様において、２８位のアミノ酸は、アスパラギン又はリシンであり、２９位のアミノ酸はトレオニンである。
一つの実施態様によると、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、以下の修飾：２位のＡＩＢ、３位のＧｌｕ、１０位のＬｙｓ、１６位のＧｌｕ、１７位のＧｌｎ、１８位のＡｌａ、２０位のＬｙｓ、２１位のＧｌｕ、２３位のＩｌｅ、２４位のＡｌａ、を含んで天然グルカゴン（配列番号１）のアミノ酸配列を含み、ここで、１０位のＬｙｓはＣ１４〜Ｃ１６脂肪酸でアシル化されており、Ｃ末端カルボキシレートはアミドで置換されている。特定の実施態様において、このクラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、そのＮ末端アミノ酸を介してジペプチジドＤ−Ｌｙｓ−サルコシンに結合している。
幾つかの実施態様において、クラス３グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号７０〜５１４、５１７〜５３４又は５５４のいずれかのアミノ酸配列から（実質的に）構成され、ＧＬＰ−１アゴニスト及び／又はグルカゴンアゴニスト活性を保持する１、２、３，４又は５個までの更なる修飾を有してもよい。
クラス４グルカゴン関連類縁体ペプチド
特定の実施態様において、グルカゴン関連類縁体ペプチドは、クラス４グルカゴン関連類縁体ペプチドである（例えば、その全体が本明細書に組み込まれる国際（ＰＣＴ）特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８０９７３を参照すること）。
活性
一つの実施態様によると、クラス４グルカゴン関連類縁体ペプチドが提供される（以下では「クラス４ペプチド」と呼ぶ）。特定の態様において、グルカゴンアンタゴニスト活性を有するクラス４ペプチドが提供される。グルカゴンアンタゴニストを、グルカゴンアゴニスト作用の抑制が望ましいあらゆる状況に使用することができる。最も直接的で明白な使用は糖尿病の治療におけるものであり、高血糖症の前臨床モデルで血中グルコースの低下をもたらすグルカゴンアンタゴニスト作用が実証されている。グルカゴンアンタゴニストを更に修飾して、化合物の生物物理学的安定性及び／又は水溶性を改善しながら、同時に母体化合物のアンタゴニスト活性を維持することができる。特定の態様において、クラス４ペプチドは、純粋なグルカゴンアンタゴニストとして定義される。
用語「グルカゴンアンタゴニスト」は、グルカゴン活性に反作用するか又はグルカゴン機能を妨げる化合物を意味する。例えば、グルカゴンアンタゴニストは、グルカゴン受容体においてグルカゴンにより達成される最大反応の少なくとも６０％の阻害（例えば、少なくとも７０％の阻害）、好ましくは少なくとも８０％の阻害を示す。一つの実施態様において、グルカゴンアンタゴニストは、グルカゴン受容体においてグルカゴンにより達成される最大反応の少なくとも９０％の阻害を示す。特定の実施態様において、グルカゴンアンタゴニストは、グルカゴン受容体においてグルカゴンにより達成される最大反応の１００％の阻害を示す。加えて、約１μMの濃度のグルカゴンアンタゴニストは、グルカゴン受容体においてグルカゴンにより達成される最大アゴニスト活性の約２０％未満を示す。一つの実施態様において、グルカゴンアンタゴニストは、グルカゴン受容体においてグルカゴンにより達成される最大アゴニスト活性の約１０％未満を示す。特定の実施態様において、グルカゴンアンタゴニストは、グルカゴン受容体においてグルカゴンにより達成される最大アゴニスト活性の約５％未満を示す。更に別の特定の実施態様において、グルカゴンアンタゴニストは、グルカゴン受容体においてグルカゴンにより達成される最大アゴニスト活性の０％を示す。
「純粋なグルカゴンアンタゴニスト」とは、検証済インビトロモデルアッセイを使用してｃＡＭＰ産生により測定されるグルカゴン又はＧＬＰ−１受容体活性の検出刺激を生じない、グルカゴンアンタゴニストのことである（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８０９７３を参照すること）。例えば、純粋なグルカゴンアンタゴニストは、グルカゴン受容体においてグルカゴンにより達成される最大アゴニスト活性の約５％未満（例えば、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０％）を示し、ＧＬＰ−１受容体においてＧＬＰ−１により達成される最大アゴニスト活性の約５％未満（例えば、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０％）を示す。
したがって、幾つかの態様において、純粋なグルカゴンアンタゴニスト活性を示すクラス４ペプチドが提供される。一つの実施態様によると、グルカゴンアンタゴニストは、グルカゴン受容体が０．８nMのグルカゴンとグルカゴンアンタゴニストに同時に接触したとき、インビトロアッセイでｃＡＭＰ産生により測定すると、グルカゴン受容体のグルカゴン誘導ｃＡＭＰ産生を最大で少なくとも５０％低減する活性を示す。一つの実施態様において、グルカゴンアンタゴニストは、グルカゴン受容体のグルカゴン誘導ｃＡＭＰ産生を最大量で少なくとも８０％低減する。
クラス４ペプチドは、グルカゴンアンタゴニストについて既に記載されているあらゆる使用に適していると考えられる。したがって、本明細書に記載されているクラス４ペプチドを、高血糖症の治療又はグルカゴンの高血中レベル若しくは高血中グルコースレベルをもたらす他の代謝疾患の治療に使用することができる。一つの実施態様によると、本明細書に開示されているクラス４ペプチドを使用して治療される患者は、家畜化された動物であり、別の実施態様では、治療される患者はヒトである。糖尿病患者におけるグルカゴン抑制の欠如が、部分的には糖原症の促進を介した食後高血糖に寄与することが研究によって示唆されている。経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）の際の、及びソマトスタチン誘導グルカゴン抑制の存在又は不在下での血中グルコースの分析は、高グルカゴンレベルの被験者においてグルコースの有意な増加を示した。したがって、本発明のクラス４ペプチドは、高血糖症の治療に使用することができるし、インスリン依存性又はインスリン非依存性のいずれかのＩ型真性糖尿病、ＩＩ型真性糖尿病又は妊娠糖尿病を含む多様な種類の糖尿病を治療すること及び腎障害、網膜症及び血管疾患を含む糖尿病の合併症を低減することに有用であることが予想される。
一つの実施態様において、エキセンディン−４の末端アミノ酸１０個（すなわち配列番号９１９（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）の配列）は、クラス４ペプチドのカルボキシ末端に結合している。これらの融合タンパク質は、食欲を抑制し、減量／体重維持を誘導する薬理学的活性を有すると予測される。一つの実施態様によると、本明細書に開示されているクラス４ペプチドは更に修飾されて、配列番号９４２のクラス４ペプチドのアミノ酸２４に結合している配列番号９１９（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）のアミノ酸配列を含むことができ、個体に投与して減量を誘導する又は体重維持を援助することができる。より詳細には、配列番号９０２、配列番号９０３、配列番号９０４、配列番号９０５、配列番号９０６、配列番号９０７、配列番号９０８、配列番号９３６、配列番号９３９、配列番号９４０、配列番号９４１、配列番号９４２、配列番号９４３及び配列番号９４４からなる群より選択される配列を含み、クラス４ペプチドのアミノ酸２４に結合している配列番号９１９（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）のアミノ酸配列を更に含むクラス４ペプチドを、食欲の抑制及び減量／体重維持の誘導に使用する。一つの実施態様において、投与されるクラス４ペプチドは、配列番号９４６又は配列番号９４７の配列を含む。
そのような食欲を減退する又は体重の減少を促進する方法は、体重の低減、体重増加の防止又は薬剤誘導肥満を含む多様な原因の肥満の治療、並びに血管疾患（冠動脈疾患、発作、末梢血管疾患、虚血再灌流など）、高血圧、ＩＩ型糖尿病の発症、高脂血症及び筋骨格系疾患を含む肥満に関連する合併症の低減に有用であることが予想される。
本発明のクラス４ペプチドを、単独で又は他の抗糖尿病又は抗肥満剤と組み合わせて投与することができる。当該技術において既知であるか又は調査中の抗糖尿病剤には、インスリン；トルブタミド（Orinase）、アセトヘキサミド（Dymelor）、トラザミド（Tolinase）、クロルプロパミド（Diabinese）、グリピジド（Glucotrol）、グリブリド（Diabeta, Micronase, Glynase）、グリメピリド（Amaryl）又はグリクラジド（Diamicron）のようなスルホニル尿素；レパグリニド（Prandin）又はナテグリニド（Starlix）のようなメグリチニド；メトホルミン（Glucophage）又はフェンホルミンのようなビグアナイド；ロシグリタゾン（Avandia）、ピオグリタゾン（Actos）若しくはトログリタゾン（Rezulin）又は他のＰＰＡＲγインヒビターのようなチアゾリジンジオン；ミグリトール（Glyset）、アルカボース（Precose/Glucobay）のような炭水化物の消化を阻害するアルファグルコシダーゼインヒビター；エクセナチド（Byetta）又はプラムリンチド；ビルダグリプチン又はシタグリプチンのようなジペプチジルペプチダーゼ−４（ＤＰＰ−４）インヒビター；ＳＧＬＴ（ナトリウム依存性グルコーストランスポーター１）インヒビター；又はＦＢＰａｓｅ（フルクトース１，６−ビスホスファターゼ）インヒビター、が含まれる。
当該技術において既知であるか又は調査中の抗肥満剤には、フェネチルアミン型刺激薬、フェンテルミン、（場合により、フェンフルラミン又はデクスフェンフルラミンを伴う）、ジエチルプロピオン（Tenuate（登録商標））、フェンジメトラジン（Prelu-2（登録商標）、Bontril（登録商標））、ベンズフェタミン（Didrex（登録商標））、シブトラミン（Meridia（登録商標）、Reductil（登録商標））を含む食欲抑制薬；リモナバン（Acomplia（登録商標））、他のカンナビノイド受容体アンタゴニスト；オキシントモジュリン；塩酸フルオキセチン（Prozac）；Qnexa（トピラメート及びフェンテルミン）、Excalia（ブプロピオン及びゾニサミド）又はContrave（ブプロピオン及びナルトレキソン）；或いはゼニカル（Orlistat）若しくはCetilistat（ATL-962としても知られている）又はGT 389-255と類似しているリパーゼインヒビター、が含まれる。
本発明のクラス４ペプチドを、代謝性るいそうを罹患している患者に投与することもできる。癌患者の過半数が、意図されない進行性の減量、衰弱、並びに低体脂肪及び筋肉により特徴付けられる代謝性るいそうを経験していると推定される。この症状は、ＡＩＤＳ患者において同様に一般的であり、細菌及び寄生虫疾患、リウマチ様関節炎、並びに腸、肝臓、肺及び心臓の慢性疾患においても存在しうる。通常、食欲不振に関連し、加齢の状態又は物理的外傷の結果として表れる可能性がある。代謝性るいそうは、生活の質を減少し、基礎状態を悪化させる症状であり、死亡の主な原因である。出願人たちは、本明細書に開示されているクラス４ペプチドを患者に投与して、代謝性るいそうを治療できると予測する。
本明細書に開示されているクラス４ペプチドを含む医薬組成物を、標準的な薬学的に許容される担体及び当業者に既知の投与経路を使用して、配合及び投与することができる。したがって、本開示は、本明細書に開示されている１つ以上のクラス４ペプチドを薬学的に許容される担体と組み合わせて含む医薬組成物も包含する。医薬組成物は、クラス４ペプチドを単独の薬学的に活性な成分として含むことができるし、クラス４ペプチドを１つ以上の追加的な活性剤と組み合わせることもできる。一つの実施態様によると、本発明のクラス４ペプチドと、ＧＬＰ−１受容体（例えば、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１類縁体、エキセンディン−４類縁体又はそれらの誘導体）を活性化する化合物とを含む組成物が提供される。一つの実施態様によると、本発明のクラス４ペプチドと、インスリン又はインスリン類縁体とを含む組成物が提供される。あるいは、配列番号９４２の配列を含み、配列番号９４２のアミノ酸２４に結合している配列番号９１９（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）のアミノ酸配列及び抗肥満ペプチドを更に含む、減量の誘導又は体重増加の防止をもたらす組成物を提供することができる。適切な抗肥満ペプチドには、米国特許第５，６９１，３０９号、同第６，４３６，４３５号又は米国特許出願第２００５／０１７６６４３号に開示されているものが含まれ、ＧＬＰ−１、ＧＩＰ（胃抑制ポリペプチド）、ＭＰ１、ＰＹＹ、ＭＣ−４、レプチンが含まれるが、これらに限定されない。
クラス４ペプチド構造
一つの実施態様において、通常は（グルカゴン、配列番号９０１の）９位に生じるアスパラギン酸がグルタミン酸又はシステイン酸の基づいた誘導体で置換されている、クラス４グルカゴン関連類縁体ペプチドが提供される。より詳細には、最初のアミノ酸の欠失（ｄｅｓ−Ｈｉｓ）及び９位のアスパラギン酸のグルタミン酸による置換が、幾つかの態様において、クラス４ペプチドをもたらす。グルカゴンの９位のアミノ酸が置換されているスルホン酸置換基を有するクラス４グルカゴン関連類縁体ペプチドは、カルボン酸に基づくアミノ酸と同様に機能するが、溶解性のような物理的特性に関して幾つかの重要な差がある。従来のｄｅｓ−Ｈｉｓ，Ｇｌｕ９クラス４ペプチドにおいて９位で等配電子グルタミン酸により置換されたとき、ホモシステイン酸（ｈＣｙｓＳＯ３）は、部分的なアンタゴニスト及び弱いアゴニストを保持する。
一つの実施態様において、最初の２〜５個のアミノ酸が除去され、９位（配列番号９０１の番号付けによる）がｈＣｙｓ（ＳＯ３）、ホモグルタミン酸、β−ホモグルタミン酸又は下記構造：
Figure 2011511778
 〔式中、Ｘ５は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ２〜Ｃ４アルケニル若しくはＣ２〜Ｃ４アルキニルである〕を有するシステインのアルキルカルボキシレート誘導体で置換されているクラス４ペプチドが、高度に特異的であり、強力であり、悪影響与えるアゴニスト特性を有さないホルモンアンタゴニストとして提供される。
一つの実施態様によると、配列番号９０１の野生型配列と比べて、Ｎ末端からの２〜５個のアミノ酸残基の欠失、及び、天然グルカゴンの９位のグルタミン酸の、ホモグルタミン酸、β−ホモグルタミン酸、システインのスルホン酸誘導体又は下記構造：
Figure 2011511778
 〔式中、Ｘ５は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ２〜Ｃ４アルケニル又はＣ２〜Ｃ４アルキニルである〕
を有するシステインのアルキルカルボキシレート誘導体での置換、によって修飾されたグルカゴンペプチドを含む、クラス４ペプチドが提供される。
特定の実施態様において、Ｎ末端からの２〜５個のアミノ酸残基の欠失及び天然グルカゴンの９位のＡｓｐの置換を含むクラス４ペプチドは、３個までのアミノ酸修飾により更に修飾される。例えば、クラス４ペプチドは、１、２又は３個の保存的アミノ酸修飾を含むことができる。代替的に又は追加的に、クラス４ペプチドは、下記からなる群より選択される１個以上のアミノ酸修飾を含むこともできる：
Ａ．１０、２０及び２４位（配列番号９０１のアミノ酸番号付けによる）の１若しくは２個のアミノ酸の置換、又はエステル、エーテル、チオエーテル、アミド若しくはアルキルアミン結合を介してアシル基若しくはアルキル基に共有結合しているアミノ酸によるクラス４ペプチドのＮ若しくはＣ末端アミノ酸の置換；
Ｂ．１６、１７、２０、２１及び２４位（配列番号９０１のアミノ酸番号付けによる）の１若しくは２個のアミノ酸の置換、又はＣｙｓ、Ｌｙｓ、オルチニン、ホモシステイン及びアセチル−フェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）からなる群より選択されるアミノ酸によるクラス４ペプチドのＮ若しくはＣ末端アミノ酸の置換（ここでアミノ酸の群は親水性部分に共有結合している）；
Ｃ．クラス４ペプチドのＮ又はＣ末端の親水性部分に共有結合するアミノ酸の付加；
Ｄ．システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸及びホモシステイン酸による１５位（配列番号９０１の番号付けによる）のＡｓｐの置換；
Ｅ．システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸及びホモシステイン酸による１６位（配列番号９０１の番号付けによる）のＳｅｒの置換；
Ｆ．配列番号９０１のアミノ酸番号付けによる１６、２０、２１及び２４位の１つ以上の位置でのＡＩＢによる置換；
Ｇ．配列番号９０１の番号付けによる２９位のアミノ酸又は２８及び２９位のアミノ酸の欠失；
Ｈ．荷電アミノ酸による２８位のＡｓｎ及び２９位のＴｈｒ（配列番号９０１のアミノ酸番号付けによる）のそれぞれ又は両方の置換及び／又は配列番号９０１のＣ末端の１〜２個の荷電アミノ酸の付加；
Ｉ．Ｌｅｕ又はノルロイシンによる２７位（配列番号９０１のアミノ酸番号付けによる）のＭｅｔの置換；
Ｊ．配列番号９０１のＣ末端への配列番号９１９〜９２１及び９５３のいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドの付加（ここで２９位（配列番号９０１の番号付けによる）のＴｈｒはＴｈｒ又はＧｌｙである）；並びに
Ｋ．アミド又はエステルによるＣ末端カルボキシレートの交換。
特定の実施態様において、クラス４ペプチドは、上記に記載されたアミノ酸修飾のＡ、Ｂ若しくはＣ、又はそれらの組み合わせを含む。更に別の特定の実施態様において、クラス４ペプチドは、アミノ酸修飾のＡ、Ｂ及び／又はＣに加えて、上記に記載されたアミノ酸修飾のＤ〜Ｋ又はそれらの組み合わせを更に含む。
一つの実施態様において、クラス４ペプチドは、最初の５個のアミノ酸がＮ末端から除去され、残りのＮ末端アミノ基がヒドロキシル基で置換されて（「ＰＬＡ６類縁体」）、配列番号９３９のペプチドを産生する、グルカゴンペプチドを含む。出願人たちは、最初の５個のアミノ酸の欠失及び９位（天然のグルカゴンにおいて）のグルタミン酸の置換を有するクラス４ペプチド類縁体において、フェニル−乳酸によりフェニルアラニンを置換すると、これらのグルカゴンアンタゴニスト類縁体の潜在能力を更に増強することを見出した。
一つの実施態様において、配列番号９３９のクラス４ペプチドは、一般構造：
Figure 2011511778
 〔式中、Ｘ６は、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ２〜Ｃ３アルケン又はＣ２〜Ｃ３アルキニルであり、一つの実施態様では、Ｘ６はＣ１〜Ｃ３アルキルであり、別の実施態様では、Ｘ６はＣ２アルキルである〕で示されるアミノ酸で４位（天然グルカゴンの９位）のアスパラギン酸残基を置換することにより更に修飾される。一つの実施態様において、クラス４ペプチドは、最初の５個のアミノ酸がＮ末端から除去されており、かつ４位（天然グルカゴンの９位）のアスパラギン酸残基がシステイン酸又はホモシステイン酸で置換されているグルカゴンペプチドを含む。一つの実施態様において、クラス４ペプチドは、配列番号９３９、配列番号９０７及び配列番号９０８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むグルカゴンペプチドを含む。一つの実施態様において、クラス４ペプチドは、配列番号９０８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、ここで４位のアミノ酸はホモシステイン酸である。
別の実施態様において、配列番号９３９のクラス４ペプチドは、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、β−ホモグルタミン酸又は一般構造：
Figure 2011511778
 〔式中、Ｘ５は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ２〜Ｃ４アルケニル又はＣ２〜Ｃ４アルキニルである〕を有するシステインのアルキルカルボキシレート誘導体で４位（天然グルカゴンの９位）のアスパラギン酸残基を置換することにより更に修飾される。特定の実施態様において、Ｘ５は、Ｃ１又はＣ２アルキルである。
しかし、出願人たちは、ｄｅｓ １−５グルカゴン類縁体（すなわち、最初の５個のアミノ酸か欠失しているグルカゴン類縁体）におけるＰＬＡによるＮ末端フェニルアラニンの置換によって、４位（天然グルカゴンの９位）の天然アスパラギン酸残基の更なる置換が、純粋なアンタゴニスト作用を示す類縁体を産生するのに必要ではなくなることを発見した。この結果は、グルカゴン（２−２９）類縁体の高度な親和性及び強力なアンタゴニストを産生するために４位の天然アスパラギン酸を置換しなければならないという従来技術の教示の観点からすると驚くべきことである。ＰＬＡ置換の使用は、Ｇｌｕ９及びｈＣｙｓ（ＳＯ３Ｈ）９類縁体とポイント比較しているＡｓｐ９類縁体の相対的な潜在能力を改善する。
３，４−２Ｆ−フェニルアラニン（３，４−２Ｆ−Ｐｈｅ）、２−ナフチルアラニン（２−Ｎａｌ）、Ｎ−アシル−フェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）、アルファ−メチルヒドロケイ皮酸（ＭＣＡ）及びベンジルマロン酸（ＢＭＡ）を含む他のフェニルアラニン類縁体によるフェニルアラニン残基の置換は、ＰＬＡ置換と同等の効力では機能しなかった。
４及び５位を含む６位以外（天然グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）の部位でのＰＬＡの置換は、ＰＬＡ６類縁体が、僅かに延長したＮ末端を有するグルカゴン類縁体よりもかなり強力なアンタゴニストであること明らかにした。本発明は、Ｎ末端アミノ酸がアシル化及びアルキル化「Ｏ末端」ペプチドで置換されている類縁体も含む。
更に、ＰＬＡ９置換は、アンタゴニストの効力を増大するのみならず、ペグ化において重要な役割も果たす。ＰＬＡ６類縁体を、グルカゴンアゴニスト作用を回復することなく選択的にペグ化することができる。ＰＬＡ置換が不在であると、類縁体のペグ化は、驚くべきことにグルカゴンアゴニスト作用を誘発する。グルカゴンアゴニスト作用は、ペグ化されたＰＬＡ６類縁体では見られない。３、６及び１９位（天然グルカゴンの８、１１及び１９位）並びＮ末端アミノ酸残基を含む幾つかの部位がペグ化のために調査された。一つの実施態様において、ペグ化は１９位（天然グルカゴンの２４位）で行われるが、その部位は最も強力で選択的なグルカゴンアンタゴニスト作用を示す。
一つの実施態様において、クラス４ペプチド一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含み、ここでＡは、
（ｉ）フェニル乳酸（ＰＬＡ）；
（ｉｉ）ＰＬＡのオキシ誘導体；
（ｉｉｉ）連続した２個のアミノ酸がエステル又はエーテル結合を介して結合しているアミノ酸２〜６個のペプチド
からなる群より選択され；
Ｂは、配列番号９０１のアミノ酸ｉ〜２６を表し（ここでｉは、３、４、５、６又は７であり）、更に、下記からなる群より選択される１個以上のアミノ酸置換を含んでもよく：
（ｉｖ）Ｇｌｕ、Ｃｙｓのスルホン酸誘導体、ホモグルタミン酸、β−ホモグルタミン酸又は下記構造：
Figure 2011511778
 〔式中、Ｘ５は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ２〜Ｃ４アルケニル又はＣ２〜Ｃ４アルキニルである〕を有するシステインのアルキルカルボキシレート誘導体による９位（配列番号９０１のアミノ酸番号付けによる）のＡｓｐの置換；
（ｖ）エステル、エーテル、チオエーテル、アミド又はアルキルアミン結合を介してアシル又はアルキル基に共有結合しているアミノ酸による１０、２０及び２４位（配列番号９０１のアミノ酸番号付けによる）の１又は２個のアミノ酸の置換；
（ｖｉ）Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、オルチニン、ホモシステイン及びアセチル−フェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）からなる群より選択されるアミノ酸による１６、１７、２０、２１及び２４位（配列番号９０１のアミノ酸番号付けによる）の１又は２個のアミノ酸の置換（ここでアミノ酸の群は親水性部分に共有結合している）；
（ｖｉｉ）システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸及びホモシステイン酸による１５位（配列番号９０１の番号付けによる）のＡｓｐの置換；
（ｖｉｉｉ）システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸及びホモシステイン酸による１６位（配列番号９０１の番号付けによる）のＳｅｒの置換；
（ｉｘ）配列番号９０１のアミノ酸番号付けによる１６、２０、２１及び２４位の１つ以上の位置でのＡＩＢによる置換；
、そして
Ｃは、下記：
（ｘ）Ｘ；
（ｘｉ）Ｘ−Ｙ；
（ｘｉｉ）Ｘ−Ｙ−Ｚ；
（ｘｉｉｉ）Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ１０
（ここで、Ｘは、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ又はＮｌｅであり；Ｙは、Ａｓｎ又は荷電アミノ酸であり；Ｚは、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、オルニチン（Ｏｒｎ）、ホモシステイン、アセチル−フェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）又は荷電アミノ酸であり、Ｒ１０は、配列番号９１９〜９２１及び９５３からなる群より選択される）；
（ｘｉｖ）Ｃ末端カルボキシレートがアミドで置換されている（ｘ）〜（ｘｉｉｉ）のいずれか
からなる群より選択される。
特定の態様において、クラス４ペプチドは、ＰＬＡのオキシ誘導体を含む。本明細書で使用されるとき、「ＰＬＡのオキシ誘導体」とは、ヒドロキシ基がＯ−Ｒ１１（式中、Ｒ１１は化学的部分である）で置換されているＰＬＡの修飾構造を含む化合物を意味する。この点において、ＰＬＡのオキシ誘導体は、例えばＰＬＡのエステル又はＰＬＡのエーテルであることができる。
ＰＬＡのオキシ誘導体を作製する方法は、当該技術において既知である。例えば、オキシ誘導体がＰＬＡのエステルである場合、エステルを、ＰＬＡのヒドロキシルと、求核剤を有するカルボニルとの反応により形成することができる。求核剤は、アミン又はヒドロキシルが含まれるが、これらに限定されない任意の適切な求核剤であることができる。したがって、ＰＬＡのエステルは、式ＸＩ：
Figure 2011511778
 〔式中、Ｒ７は、ＰＬＡのヒドロキシルと、求核剤を有するカルボニルとの反応により形成されるエステルである〕
で示される構造を含むことができる。
求核剤を有するカルボニル（ＰＬＡのヒドロキシルと反応してエステルを形成する）は、例えば、カルボン酸、カルボン酸誘導体又はカルボン酸の活性化エステルであることができる。カルボン酸誘導体は、塩化アシル、酸無水物、アミド、エステル又はニトリルでありうるが、これらに限定されない。カルボン酸の活性化エステルは、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、トシレート（Ｔｏｓ）、カルボジイミド又はヘキサフルオロホスフェートであることができる。幾つかの実施態様において、カルボジイミドは、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１，１′−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）又は１，３−ジイソプロピルカルボジイミド（ＣＩＣＤ）である。幾つかの実施態様において、ヘキサフルオロホスフェートは、ヘキサフルオロホスフェート ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノンホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、２−（１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、及びｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）からなる群より選択される。
ヒドロキシル基（例えば、ＰＬＡのヒドロキシル）を用いる反応によりエーテルを作製する方法も当該技術において既知である。例えば、ＰＬＡのヒドロキシル基を、ハロゲン化アルキル又はトシル化アルキルアルコールと反応させて、エーテル結合を形成することができる。
一般に、化学的部分であるＲ１１は、クラス４ペプチドの活性を減少させないものである。幾つかの実施態様において、化学的部分は、クラス４ペプチドの活性、安定性及び／又は溶解性を増強する。
特定の実施態様において、酸素含有結合を介して（例えば、エステル又はエーテル結合を介して）ＰＬＡに結合している化学的部分は、ポリマー（例えば、ポリアルキレングリコール）、炭水化物、アミノ酸、ペプチド又は脂質、例えば脂肪酸又はステロイドである。
特定の実施態様において、化学的部分はアミノ酸であり、場合により、式ＸＩがデプシペプチドであるようにペプチドの一部であってもよい。この点において、ＰＬＡは、クラス４ペプチドがＰＬＡ残基の１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６個又はそれ以上）のアミノ酸Ｎ末端を含むように、クラス４ペプチドのＮ末端アミノ酸残基以外の位置にあることができる。例えば、クラス４ペプチドは、クラス４ペプチドのｎ位にＰＬＡを含むことができ、ここでｎは２、３、４、５又は６である。
ＰＬＡ残基のアミノ酸Ｎ末端は、合成でありうるか又は天然に生じうる。特定の実施態様において、Ｎ末端ＰＬＡであるアミノ酸は、天然に生じるアミノ酸である。一つの実施態様において、ＰＬＡのＮ末端であるアミノ酸は、天然グルカゴンのＮ末端アミノ酸である。例えば、クラス４ペプチドは、Ｎ末端に、配列番号９５４〜９５８のいずれかのアミノ酸配列を含むことができ、ここでＰＬＡは、エステル結合を介してトレオニンに結合している：
配列番号９５４ Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＰＬＡ
配列番号９５５ Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＰＬＡ
配列番号９５６ Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＰＬＡ
配列番号９５７ Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＰＬＡ
配列番号９５８ Ｔｈｒ−ＰＬＡ
代替的な実施態様において、１個以上のＮ末端アミノ酸を天然グルカゴンのアミノ酸以外のアミノ酸で置換することができる。例えば、クラス４ペプチドが５又は６位のアミノ酸としてＰＬＡを含む場合、１位及び／又は２位のアミノ酸は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断に対して感受性を低減するアミノ酸であることができる。より詳細には、幾つかの実施態様において、クラス４ペプチドの１位は、Ｄ−ヒスチジン、アルファ，アルファ−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン及びホモ−ヒスチジンからなる群より選択されるアミノ酸である。より詳細には、幾つかの実施態様において、アンタゴニストペプチドの２位は、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、バリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、Ｎ−メチルアラニン及びアミノイソ酪酸（ＡＩＢ）からなる群より選択されるアミノ酸である。また、例えば、クラス４ペプチドが４、５又は６位のアミノ酸としてＰＬＡを含む場合、クラス４ペプチドの３位のアミノ酸は、天然グルカゴンの天然グルタミン残基とは対照的に、グルタミン酸であることができる。本発明の例示的な実施態様において、クラス４ペプチドは、Ｎ末端に、配列番号９５９〜９６１のいずれかのアミノ酸配列を含む。
式ＸＩの化合物を含むクラス４ペプチドに関して、ポリマーは、ＰＬＡのヒドロキシル基と反応することができる限り、任意のポリマーであることができる。ポリマーは、当然のことながら又は通常は、求核剤を有するカルボニルを含むものであることができる。あるいは、ポリマーは、カルボニルを有するカルボニルを含むように誘導体化されているものであることができる。ポリマーは、以下のいずれかを誘導体化したポリマーであることができる：ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン及びポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレートを含むその誘導体、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、 ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）及びポリ（オクタデシルアクリレート）を含むアクリル酸エステル及びメタクリル酸エステルのポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルハロゲン化物、ポリ（酢酸ビニル）及びポリビニルピロリドンを含むポリビニルポリマー、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタン及びそのコポリマー、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、カルボキシエチルセルロース、三酢酸セルロース及びセルロース硫酸ナトリウム塩を含むセルロース、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）及びポリ（エチレンテレフタレート）を含むポリエチレン、並びにポリスチレン。
ポリマーは、合成の生分解性ポリマー（例えば、乳酸とグリコール酸ポリマー、ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリウレタン、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）及びポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン））及び天然の生分解性ポリマー（例えば、アルギン酸塩及びデキストランを含む他の多糖類、セルロース、コラーゲン、その化学誘導体（化学基、例えばアルキル、アルキレンの置換、付加、ヒドロキシル化、酸化、及び当業者により日常的に行われる他の修飾）、アルブミン及び他の親水性タンパク質（例えば、ゼイン、他のプロラミン及び疎水性タンパク質））を含む生分解性ポリマー、並びにこれらの任意のコポリマー又は混合物であることができる。一般に、これらの物質は、インビボにおける酵素的加水分解又は水への暴露によって、表面又はバルク侵食により分解される。
ポリマーは、H. S. Sawhney, C. P. Pathak and J. A. Hubbell in Macromolecules, 1993, 26, 581-587により記載される生体侵食性ヒドロゲル（この教示は本明細書に組み込まれる）、ポリヒアルロン酸、カゼイン、ゼラチン、グルチン、ポリ無水物、ポリアクリル酸、アルギン酸塩、キトサン、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）及びポリ（オクタデシルアクリレート）のような生体付着性ポリマーであることができる。
一つの実施態様において、ポリマーは水溶性ポリマーである。適切な水溶性ポリマーは、当該技術において既知であり、例えば、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ；Klucel）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ；Methocel）、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルエチルセルロース、ヒドロキシプロピルブチルセルロース、ヒドロキシプロピルペンチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース（Ethocel）、ヒドロキシエチルセルロース、多様なアルキルセルロース及びヒドロキシアルキルセルロース、多様なセルロースエーテル、酢酸セルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、酢酸ビニル／クロトン酸コポリマー、ポリ−ヒドロキシアルキルメタクリレート、ヒドロキシメチルメタクリレート、メタクリル酸コポリマー、ポリメタクリル酸、ポリメチルメタクリレート、無水マレイン酸／メチルビニルエーテルコポリマー、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム及びカルシウム、ポリアクリル酸、酸性カルボキシポリマー、カルボキシポリメチレン、カルボキシビニルポリマー、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンコポリマー、ポリメチルビニルエーテル−ｃｏ−無水マレイン酸、カルボキシメチルアミド、カリウムメタクリレートジビニルベンゼンコポリマー、ポリオキシエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、並びにこれらの誘導体、塩及び組み合わせが含まれる。
特定の実施態様において、ポリマーは、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、ポリアルキレングリコールである。
炭水化物は、アルファ離脱基を有するカルボニルを含むか、又は含むように作成される限り、任意の炭水化物であることができる。炭水化物は、例えば、アルファ離脱基を有するカルボニルを含むように誘導体化されているものであることができる。この点において、炭水化物を、単糖（例えば、グルコース、ガラクトース、フルクトース）、二糖（例えば、スクロース、ラクトース、マルトース）、オリゴ多糖（例えば、ラフィノース、スタキオース）、多糖（デンプン、アミラーゼ、アミロペクチン、セルロース、キチン、カロース、ラミナリン、キシラン、マンナン、フコイダン、ガラクトマンナン）から誘導体化することができる。
式ＸＩの化合物を含むクラス４ペプチドに関して、脂質は、アルファ離脱基を有するカルボニルを含む任意の脂質であることができる。脂質は、例えば、カルボニルを含むように誘導体化されたものであることができる。この点において、脂質は、脂肪酸（例えば、Ｃ４〜Ｃ３０脂肪酸、エイコサノイド、プロスタグランジン、ロイコトリエン、トロンボキサン、Ｎ−アシルエタノールアミン）、グリセロ脂質（例えば、一置換、二置換、三置換グリセロール）、グリセロリン脂質（例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン）、スフィンゴ脂質（例えば、スフィンゴシン、セラミド）、ステロール脂質（例えば、ステロイド、コレステロール）、プレノール脂質、サッカロ脂質又はポリケチド、油、ロウ、コレステロール、ステロール、脂溶性のビタミン、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質の誘導体であることができる。
一つの実施態様において、Ｒ７は、約１００kDa以下、例えば９０kDa以下、約８０kDa以下、約７０kDa以下、約６０kDa以下、約５０kDa以下、約４０kDa以下の分子量を有する。したがって、Ｒ７は、約３５kDa以下、３０kDa以下、約２５kDa以下、約２０kDa以下、約１５kDa以下、約１０kDa以下、約５kDa以下又は１kDaの分子量を有することができる。
代替的な実施態様において、クラス４ペプチドは、Ａとして、連続した２個のアミノ酸がエステル又はエーテル結合を介して結合しているアミノ酸２〜６個のペプチドを含む。エステル又はエーテル結合は、例えば、アミノ酸２と３、３と４、４と５又は５と６の間にあることができる。場合により、ペプチドを、ポリマー（例えば、親水性ポリマー）への結合を含む他の化学的部分への共有結合、アルキル化又はアシル化により更に修飾することができる。
一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含むクラス４ペプチドに関して、Ｂは、天然グルカゴンの、例えば配列番号９０１のアミノ酸ｉ〜２６を表し、ここでｉは、３、４、５、６又は７であり、場合により１個以上のアミノ酸修飾を含む。特定の実施態様において、Ｂは、配列番号９０１のアミノ酸７〜２６を表し、更に修飾されていてもよい。
一つの実施態様において、Ｂは、３個までのアミノ酸修飾により修飾されている。例えば、配列番号９０１の天然アミノ酸配列を表すＢは、１個以上の保存的アミノ酸修飾で修飾されている。
別の実施態様において、Ｂは、本明細書に記載された（ｉｖ）〜（ｉｘ）からなる群より選択される１個以上のアミノ酸修飾を含む。特定の実施態様において、Ｂは、アミノ酸修飾（ｖ）及び（ｖｉ）のうちの一方又は両方を含む。更なる特定の実施態様において、Ｂは、（ｖ）及び（ｖｉ）に加えて、（ｉｖ）、（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）及び（ｉｘ）からなる群より選択されるアミノ酸修飾の１個又は組み合わせを含む。
別の特定の実施態様において、クラス４ペプチドは、Ｃ末端に１個以上の荷電アミノ酸を含む。例えば、Ｙ及び／又はＺは、荷電アミノ酸、例えばＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ及びＧｌｕであることができる。更に別の実施態様において、クラス４ペプチドは、Ｚに１〜２個の荷電アミノ酸（例えば、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ及びＧｌｕ）Ｃ末端を含む。特定の態様において、１〜２個の荷電アミノ酸に続くＺは、Ｒ１０を含まない。
一つの実施態様において、クラス４ペプチドは、本明細書に記載されているクラス４ペプチドのアミノ酸残基に共有結合している親水性部分を含む。例えば、クラス４ペプチドは、配列番号９０１の番号付けによる１、１６、２０、２１又は２４位のアミノ酸に共有結合している親水性部分を含むことができる。別の実施態様において、親水性部分は、クラス４ペプチドのＣ末端アミノ酸に結合しており、これは幾つかの場合では、ＺのＣ末端側の１〜１１個のアミノ酸である。更に別の実施態様において、親水性部分はＰＬＡに結合しており、ＡがＰＬＡである場合は、ＰＬＡ−Ｐｈｅ又はＰＬＡ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅに結合しており、ここでＰＬＡは修飾されて、親水性部分を含む。別の実施態様において、親水性部分を含むアミノ酸は、クラス４ペプチドのＮ又はＣ末端に付加されている。 別の実施態様において、クラス４ペプチドは、本明細書に記載されているアシル基又はアルキル基を含む。例えば、アシル化又はアルキル化は、配列番号９０１の番号付けによる１０、２０又は２４位のアミノ酸の側鎖の外で生じることができる。代替的な実施態様において、アシル化又はアルキル化は、幾つかの場合では、Ｚへのアミノ酸１〜１１個のＣ末端である、クラス４ペプチドのＣ末端アミノ酸の側鎖の外で生じる。更に別の実施態様において、ＡがＰＬＡ、ＰＬＡ−Ｐｈｅ又はＰＬＡ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅである場合、ＰＬＡは修飾されて、アシル又はアルキル基を含む。
例示的な実施態様
クラス４ペプチドは、ペプチドの連続した少なくとも２個のアミノ酸がエステル又はエーテル結合を介して結合している限り、合成又は天然の任意のアミノ酸を含むことができる。特定の実施態様において、ペプチドは天然グルカゴンのアミノ酸を含む。例えば、ペプチドはｊから６個の天然グルカゴン（配列番号９０１）を含むことができ、ここでｊは１、２、３、４又は５である。あるいは、ペプチドは、１個以上のアミノ酸修飾を有する、配列番号９０１のＮ末端に基づいたアミノ酸配列を含むことができる。１位及び／又は２位のアミノ酸は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断に対して感受性を低減させるアミノ酸であることができる。例えば、ペプチドは、Ｄ−ヒスチジン、アルファ，アルファ−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン及びホモ−ヒスチジンからなる群より選択されるアミノ酸を、クラス４ペプチドの１位に含むことができる。より詳細には、幾つかの実施態様において、アンタゴニストペプチドの２位は、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、バリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、Ｎ−メチルアラニン及びアミノイソ酪酸（ＡＩＢ）からなる群より選択されるアミノ酸である。また、例えば、クラス４ペプチドの３位のアミノ酸は、天然グルカゴンの天然グルタミン残基とは対照的に、グルタミン酸であることができる。したがって、クラス４ペプチドは、
Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号９６８）；
Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号９６９）；又は
Ｘａａ３−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号９７０）
のアミノ酸配列を含むことができ、
ここで、Ｘａａ１は、Ｈｉｓ、Ｄ−ヒスチジン、アルファ，アルファ−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン及びホモ−ヒスチジンからなる群より選択され；Ｘａａ２は、Ｓｅｒ、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、バリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、Ｎ−メチルアラニン及びアミノイソ酪酸（ＡＩＢ）からなる群より選択され；そしてＸａａ３は、Ｇｌｎ又はＧｌｕである。
本発明は、クラス４ペプチドのＣ末端アミノ酸が、天然アミノ酸に存在するカルボン酸基を置換しているアミド基を有する実施態様も包含する。
幾つかの実施態様において、クラス４ペプチドがペグ化されている場合、クラス４ペプチドは、特に「Ｎ末端」アミノ酸がＰＬＡ（フェニル−乳酸）である６〜２９個の短縮されたグルカゴンペプチドを含む。そのようなグルカゴン誘導体は特有の効能を示す。これらは、天然Ｎ末端フェニルアラニンを有するものよりも強力なペプチドであり、ペグ化の結果、あらゆるグルカゴンアゴニスト作用を抑制し、このことは天然フェニルアラニンにおいて見られない。最後に、現在の文献は、９位の天然アスパラギン酸の置換がアンタゴニスト活性にとって必要であることを確立しているが、出願人たちは、そのような置換はＰＬＡ６−（６−２９）グルカゴン類縁体においてはもはや必要ではないという驚くべき結果を発見した。
一つの実施態様において、クラス４ペプチドのアミノ酸は少なくとも１つのシステイン残基で置換されており、ここでシステイン残基の側鎖は、例えばマレイミド、ビニルスルホン、２−ピリジルチオ、ハロアルキル及びハロアシルを含むチオール反応性試薬により更に修飾される。これらのチオール反応試薬は、カルボキシ、ケト、ヒドロキシ及び他のエーテル基、並びにポリエチレングリコール単位のような他の親水性部分を含有することができる。代替的な実施態様において、クラス４ペプチドのアミノ酸は、リシンで置換され、置換リシン残基の側鎖は、カルボン酸の活性エスエル（スクシンイミド、無水物など）又はポリエチレングリコールのような親水性部分のアルデヒドのようなアミン反応性試薬を使用して更に修飾される。一つの実施態様によると、天然ペプチドの１２位に対応するリシン残基は、アルギニンで置換され、単一のリシン置換は、天然ペプチドの１、１６、１７、２０、２１、２４若しくは２９位に対応するアミノ酸の１つに挿入されるか又はリシンは、クラス４ペプチドのＮ若しくはＣ末端に付加される。
別の実施態様において、天然ペプチドの２７位に対応するメチオニン残基をロイシン又はノルロイシンに変えて、ペプチドの酸化分解を防止する。
幾つかの実施態様において、本明細書に記載されているクラス４ペプチドは、グルカゴン受容体における活性又は効力に影響を与えることなく、グルカゴンペプチドのＣ末端の１又は２個のアミノ酸の切断又は欠失（すなわち、天然グルカゴンの２９位又は２８及び２９位のアミノ酸の切断）により更に修飾される。この点において、本明細書に記載されているクラス４ペプチドは、例えば、天然グルカゴンペプチド（配列番号９０１）のアミノ酸１〜２７、１〜２８、２〜２７、２〜２８、３〜２７、３〜２８、４〜２７、４〜２８、５〜２７、５〜２８、６〜２７又は６〜２８から実質的に構成されるか又は構成されることができ、本明細書に記載されているクラス４ペプチド活性をもたらす１個以上の修飾を有する。
本開示のクラス４ペプチドは、グルカゴンペプチドの機能にとって重要ではないことが知られている位置にもアミノ酸置換を包含する。一つの実施態様において、置換は、配列番号９３９の２、５、６、７、８、９、１２、１３、１４、１５、１６、１９、２２、２３又は２４からなる群より選択される１、２又は３つの位置での保存的アミノ酸置換である。一つの実施態様において、クラス４ペプチドは、配列番号９４２のペプチド誘導体を含み、ここでグルカゴンペプチドは、２、５、６、７、８、９、１２、１３及び１４位から選択される１〜３つのアミノ酸位置で配列番号９４２に対して更なるアミノ酸置換を含む。一つの実施態様において、配列番号９４２の２、５、６、８、９、１２、１３及び１４位での置換は、保存的アミノ酸置換である。一つの実施態様において、天然ペプチドの１６、１７、２０、２１、２４又は２９位、とりわけ２１及び／又は２４位に対応するアミノ酸はシステイン又はリシンで置換されており、ここでＰＥＧ鎖は、置換システイン又はリシン残基と共有結合している。
一つの実施態様によると、修飾クラス４ペプチドは、ペプチドに共有結合している２つ以上のポリエチレン鎖を含み、ここでグルカゴン鎖の総分子量は、約１，０００〜約５，０００ダルトンである。一つの実施態様において、ペグ化クラス４ペプチドは、配列番号９１２及び配列番号９２２からなる群より選択されるペプチドを含み、ここで前記ペプチドは、１１及び１９位のアミノ酸に結合しているポリエチレングリコール鎖を含み、２つのＰＥＧ鎖の合計した分子量は、約１，０００〜約５，０００ダルトンである。
一つの実施態様によると、下記：
Ｒ１−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｒ２（配列番号９０９）、
Ｒ１−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｘａａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｒ２（配列番号９１０）、
Ｒ１−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｒ２（配列番号９１１）及び
Ｒ１−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｘａａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｒ２（配列番号９１２）
からなる群より選択される修飾グルカゴンペプチドを含むクラス４ペプチドが提供され、
ここで、４位のＸａａは、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン酸又はホモシステイン酸であり、７位のＸａａは、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり、１０位のＸａａは、アスパラギン酸、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸及びホモシステイン酸であり、１１位のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステイン又はアセチルフェニルアラニンであり、１６位のＸａａは、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステイン又はアセチルフェニルアラニンであり、１９位のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステイン及びアセチルフェニルアラニンであり、２２位のＸａａは、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ又はＮｌｅであり、Ｒ１は、ＯＨ又はＮＨ２であり、そしてＲ２は、ＣＯＯＨ又はＣＯＮＨ２であり、ペプチドは、配列番号９０９の１１位、配列番号９１０の１６位、配列番号９１１の１９位、配列番号９１２の１６及び１９位でペグ化されているが、但し、４位のＸａａがアスパラギン酸である場合は、Ｒ１はＯＨである。一つの実施態様によると、ペプチドは、配列番号９０９、配列番号９１０又は配列番号９１１の配列を含み、ここでＲ１はＯＨであり、そしてＲ２はＣＯＮＨ２である。一つの実施態様において、ペプチドは、配列番号９０９、配列番号９１０又は配列番号９１１の配列を含み、ここでＲ１はＯＨであり、Ｒ２はＣＯＮＨ２であり、そして４位のアミノ酸はアスパラギン酸であり、更なる実施態様において、そのようなペプチドは、配列番号９１９の配列を含むカルボキシ末端延長を含む。
一つの実施態様によると、本ペプチドは、配列番号９０９、配列番号９１０、配列番号９１３、配列番号９１４及び配列番号９１６からなる群より選択される配列を含み、ここで本ペプチドは、配列番号９０９及び配列番号９１３の１１位でペグ化されており、配列番号９１０の１６位でペグ化されており、そして配列番号９１０及び配列番号９１４の１９位でペグ化されている。一つの実施態様において、グルカゴンアゴニストは、配列番号９１３及び配列番号９１４のペプチドを含む。一つの実施態様において、本明細書に開示されているクラス４ペプチドのＣ末端アミノ酸は、天然アミノ酸に存在するカルボン酸基の代わりにアミド基を有する。一つの実施態様によると、クラス４ペプチドは、配列番号９１８の配列を含む。
一つの実施態様において、血漿タンパク質がペプチドのアミノ酸側鎖に共有結合してグルカゴンペプチドの溶解性、安定性及び／又は薬物動態を改善しているクラス４ペプチドが提供される。例えば、血清アルブミンを本明細書に提示されているクラス４ペプチドに共有結合することができる。一つの実施態様において、血漿タンパク質が、天然グルカゴンペプチドの１６、１７、２０、２１、２４又は２９位に対応するアミノ酸に共有結合している。より詳細には、一つの実施態様において、血漿タンパク質は、天然グルカゴンペプチドの１６又は２４位に対応するアミノ酸に結合しており、クラス４ペプチドは、配列番号９０３、配列番号４、配列番号９０５、配列番号９０６、配列番号９０７、配列番号９０８、配列番号９０９、配列番号９１１、配列番号９１２、配列番号９２２、配列番号９２３、配列番号９２４、配列番号９２５、配列番号９２６、配列番号９２７、配列番号９２８、配列番号９３６及び配列番号９３９の配列を含む。一つの実施態様において、クラス４ペプチドは、配列番号９０９、配列番号９１０、配列番号９１１及び配列番号９１２からなる群より選択されるペプチドを含む。
一つの実施態様によると、免疫グロブリン分子のＦｃ部分を表す直鎖アミノ酸配列が、本明細書に開示されているクラス４ペプチドのアミノ酸側鎖に共有結合してグルカゴンペプチドの溶解性、安定性及び／又は薬物動態を改善している、クラス４ペプチドが提供される。例えば、免疫グロブリン分子のＦｃ部分を表すアミノ酸配列は、配列番号907、配列番号939のグルカゴンペプチド又はそのグルカゴン類縁体の１１、１２、１５、１６、１９、２１又は２４位に共有結合することができる。一つの実施態様において、Ｆｃペプチドは、配列番号９０６、配列番号９０７、配列番号９０８又は配列番号９３６のクラス４ペプチドの１１又は１９位に共有結合している。Ｆｃ部分は、通常、ＩｇＧから単離されるが、任意の免疫グロブリンからのＦｃペプチドフラグメントも同等に機能するはずである。一つの実施態様において、グルカゴンペプチドは、配列番号９０３、配列番号９０４、配列番号９０５、配列番号９０７、配列番号９０８及び配列番号９３９からなる群より選択され、ここでＦｃ部分は、天然グルカゴンペプチドの１６、１７、２０、２１、２４又は２９位に対応する位置に結合している。一つの実施態様において、クラス４ペプチドは、配列番号９０９、配列番号９１０、配列番号９１１及び配列番号９１２からなる群より選択されるグルカゴンペプチドを含み、ここでＦｃペプチドは、配列番号９０９、配列番号９１０、配列番号１１のそれぞれ１１、１６又は１９位及び配列番号９１２の１１と１９の両方の位置に配置されているアミノ酸の側鎖に結合している。
本発明の特定の実施態様において、クラス４ペプチドは、配列番号９６２、９６４〜９６７及び９７１のいずれかのアミノ酸配列を含む。
溶解性を改善する修飾
クラス４ペプチドを更に修飾して、生理学的ｐＨの水溶液におけるペプチドの溶解性を改善しながら、同時に、幾つかの態様において、グルカゴンアンタゴニスト活性を保持することができる。天然ペプチドの１、１６、１７、２０、２１、２４及び２９位に対応した位置又はＣ末端への親水性基の導入は、得られたクラス４ペプチドの生理学的ｐＨを有する溶液における溶解性を改善しながら、同時に母体化合物のアンタゴニスト活性を保持することができる。したがって、一つの実施態様において、本開示のクラス４ペプチドは、更に修飾されて、天然グルカゴンペプチドの１、１６、１７、２０、２１、２４及び２９位のアミノ酸又はＮ若しくはＣ末端アミノ酸に対応したアミノ酸の側鎖に共有結合している１つ以上の親水性基を含む。更なる実施態様において、天然グルカゴンペプチドの１６及び２４位のアミノ酸に対応したアミノ酸の側鎖は、親水性基に共有結合しており、一つの実施態様において、親水性基はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
出願人たちは、天然グルカゴンが、電荷をカルボキシ末端に導入してペプチドの溶解性を増強しながら、同時にペプチドのアゴニスト特性を保持するように修飾されうることも発見した。増強された溶解性は、ほぼ中性のｐＨでのグルカゴン溶液の調製及び保存を可能にする。比較的中性のｐＨ（例えば、約６．０〜約８．０のｐＨ）でのグルカゴン溶液の配合は、クラス４ペプチドの長期安定性を改善する。
ここでも、出願人たちは、本明細書に開示されているクラス４ペプチドを同様に修飾して、比較的中性のｐＨ（例えば、約６．０〜約８．０のｐＨ）の水溶液における溶解性を増強しながら、同時に母体タンパク質のアンタゴニスト特性を保持できることを予測する。したがって、本発明の一つの実施態様は、野生型グルカゴン（配列番号９０１）の６〜２９位に存在する天然アミノ酸に対して、荷電アミノ酸による天然非荷電アミノ酸の置換により又はカルボキシ末端への荷電アミノ酸の付加により、ペプチドに電荷を付加するように更に修飾されている、配列番号９３９のクラス４ペプチドを対象とする。一つの実施態様によると、配列番号９３９のクラス４ペプチドの１〜３個の非荷電天然アミノ酸は、荷電アミノ酸で置換されている。一つの実施態様において、荷電アミノ酸は、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸及びグルタミン酸からなる群より選択される。より詳細には、出願人たちは、荷電アミノ酸による天然グルカゴンの２８及び／又は２９位に対応する位置で通常生じるアミノ酸の置換、及び／又はクラス４ペプチドのカルボキシ末端への１〜２個の荷電アミノ酸の付加が、生理学的なｐＨ（すなわち、約６．５〜約７．５のｐＨ）の水溶液におけるクラス４ペプチドの溶解性及び安定性を増強することを発見した。したがって、本明細書に開示されているクラス４ペプチドのそのような修飾は、特に約５．５〜約８．０の範囲のｐＨの水溶液における溶解性に同様の効果を有すると同時に、母体ペプチドの生物学的活性を保持することが予測される。
一つの実施態様によると、配列番号９３９のクラス４ペプチドは、負荷電アミノ酸（例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）による天然グルカゴンの２８位及び／又は２９位に対応する天然アミノ酸の置換及び場合によりペプチドのカルボキシ末端への負荷電アミノ酸（例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）の付加によって修飾される。代替的な実施態様において、配列番号９３９のクラス４ペプチドは、正電荷アミノ酸（例えば、リシン、アルギニン又はヒスチジン）による天然グルカゴンの２９位に対応する天然アミノ酸の置換及び場合によりペプチドのカルボキシ末端への１〜２個の正荷電アミノ酸（例えば、リシン、アルギニン又はヒスチジン）の付加により修飾される。一つの実施態様によると、改善された溶解性及び安定性を有するクラス４ペプチドが提供され、ここでペプチドは、配列番号９４１のアミノ酸配列を含むが、但し、配列番号９４１の２３又は２４位の少なくとも１個のアミノ酸は酸性アミノ酸で置換されている及び／又は追加の酸性アミノ酸は配列番号９４１のカルボキシ末端に付加されている。一つの実施態様において、酸性アミノ酸は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸及びホモシステイン酸からなる群より独立して選択される。
一つの実施態様によると、改善された溶解性及び安定性を有するクラス４ペプチドが提供され、ここでアンタゴニストは配列番号９４１、配列番号９４２、配列番号９４３又は配列番号９４４のアミノ酸配列を含み、２３位又は２４位の少なくとも１個のアミノ酸は、非天然アミノ酸残基で置換されている（すなわち、類縁体の２３又は２４位に存在する少なくとも１個のアミノ酸は、配列番号９０７の対応する位置に存在するアミノ酸と異なる酸性アミノ酸である）。一つの実施態様によると、配列番号９４１又は９４２の配列を含むクラス４ペプチドが提供されるが、但し、２３位のアミノ酸がアスパラギンであり、２４位のアミノ酸がトレオニンである場合、ペプチドは、グルカゴンアンタゴニストのカルボキシ末端に付加される、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ又はＧｌｕからなる群より独立して選択される１〜２個のアミノ酸を更に含む。
別の実施態様において、配列番号９４２のクラス４ペプチドの溶解性は、親水性部分を１１、１２、１５、１６、１９又は２４位のアミノ酸残基に共有結合して改善することができ、一つの実施態様において、親水性部分は、１１、１６又は１９位のアミノ酸に結合しており、更なる実施態様において、親水性部分は、アミノ酸１９に結合している。一つの実施態様において、親水性部分は、血漿タンパク質であるか又は免疫グロブリンのＦｃ部分であり、代替的な実施態様において、親水性部分は、親水性炭化水素鎖である。一つの実施態様において、親水性部分は、約１，０００〜約５，０００ダルトンの範囲から選択される分子量を有するポリエチレングリコールである。別の実施態様では、親水性部分は、少なくとも約２０，０００ダルトンの分子量を有するポリエチレングリコールである。一つの実施態様において、ポリエチレン修飾クラス４ペプチドは、配列番号９０９、配列番号９１０、配列番号９１１、配列番号９１２、配列番号９４３、配列番号９４４又は配列番号９４５のアミノ酸配列を含む。
安定性を改善する修飾
天然グルカゴンの１５〜１６位のＡｓｐ−Ｓｅｒ配列は、水性緩衝剤において天然ホルモンの早期化学切断をもたらす特有の不安定ジペプチドとして同定されている。例えば、０．０１NのＨＣｌに３７℃で２週間維持されたとき、５０％を超える天然グルカゴンがフラグメントに切断されうる。２つの遊離切断ペプチド１−１５及び１６−２９は、グルカゴン様生物学的活性を欠いており、したがって、グルカゴン及び関連する類縁体の水性予備処方に対して制限となる。Ｇｌｕによる天然グルカゴンペプチドの１５位のＡｓｐの選択的化学置換は、１５−１６ペプチド結合の化学切断を実質的に排除することが観察されている。
したがって、本発明のクラス４ペプチドを同様に修飾して、水性緩衝剤における早期化学切断に対する感受性を減少できることが予想される。一つの実施態様によると、本明細書に記載されているクラス４ペプチドを更に修飾して、天然グルカゴンペプチドの１５位に配置されている天然アスパラギン酸アミノ酸を、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸及びホモシステイン酸からなる群より選択されるアミノ酸で置換することによって、水溶液中の安定性を増強することができる。一つの実施態様によると、配列番号９３９のクラス４ペプチドの１０位のアスパラギン酸残基を、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸及びホモシステイン酸からなる群より選択されるアミノ酸で置換することができ、一つの実施態様において、配列番号９３９の１０位の天然アスパラギン酸はグルタミン酸で置換される。一つの実施態様によると、アンタゴニストが配列番号９３６、配列番号９４０及び配列番号９４２からなる群より選択される配列を含む、水溶液において改善された溶解性を有するクラス４ペプチドが提供される。更なる実施態様において、クラス４ペプチドはアミド化されている。
一つの実施態様によると、本明細書に記載されているクラス４ペプチドの分解を低減することによる安定性の増加は、グルタミン酸、システイン酸、ホモグルタミン酸又はホモシステイン酸による１６位（天然グルカゴンの番号付けによる）のセリンの置換によって達成することもできる。特定の実施態様において、１６位（天然グルカゴンの配列番号付けによる）のセリンは、グルタミン酸で置換されている。より特定的な態様において、そのような修飾を含むクラス４ペプチドは、Ｃ末端カルボキシレートを含み、アミド化されていない。
一つの実施態様において、配列番号９０７、配列番号９３６、配列番号９３９、配列番号９４０、配列番号９４１、配列番号９４２、配列番号９４３及び配列番号９４４からなる群より選択されるグルカゴンペプチドを含み、天然グルカゴンペプチドの１１、１２、１５、１６、１９及び／又は２４位に対応する位置での１つ以上の追加的なアミノ酸置換により更に修飾されているクラス４ペプチドが提供され、ここでアミノ酸置換は、例えばＰＥＧを含む親水性部分による架橋に適した側鎖を有するアミノ酸による置換を含む。ペプチドを、天然に生じるアミノ酸又は合成（非天然）アミノ酸で置換することができる。合成又は非天然アミノ酸とは、インビボで天然に生じないが、それでも、本明細書に記載されるペプチド構造に組み込むことができるアミノ酸を意味する。一つの実施態様において、ペプチドが配列番号９０７、配列番号９３６、配列番号９３９、配列番号９４０、配列番号９４１、配列番号９４２、配列番号９４３及び配列番号９４４の配列を含み、天然グルカゴンペプチドの２１又は２４位に対応する位置に結合しているポリエチレン鎖を更に含む、クラス４ペプチドが提供される。更なる実施態様において、クラス４ペプチドのＣ末端は修飾されて、カルボン酸基がアミド基で置換されている。
融合ペプチド及び結合体
本開示は、第２ペプチドがクラス４ペプチドのＣ末端に融合しているクラス４ペプチド融合ペプチドも包含する。より詳細には、融合タンパク質は、クラス４ペプチドのＣ末端アミノ酸に結合している配列番号９１９（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）、配列番号９２０（Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ）又は配列番号９２１（Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ａｒｇ）のアミノ酸配列を更に含む、配列番号９４４のクラス４ペプチドを含むことができる。一つの実施態様において、配列番号９１９（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）のアミノ酸配列は、ペプチド結合を介して配列番号９４２のクラス４ペプチドのアミノ酸２４に結合している。別の実施態様において、融合タンパク質は、クラス４ペプチドのアミノ酸２４に結合している配列番号９１９（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）のアミノ酸配列を更に含む、配列番号９０７、配列番号９３６、配列番号９３９、配列番号９４０、配列番号９４１又は配列番号９４３のクラス４ペプチドを含む。別の実施態様において、融合ペプチドは、クラス４ペプチドのアミノ酸２４に結合している配列番号９２０、配列番号９２１又は配列番号９５３のアミノ酸配列を更に含む、配列番号９０７、配列番号９３６、配列番号９３７、配列番号９３８、配列番号９３９、配列番号９４１又は配列番号９４３のクラス４ペプチドを含む。一つの実施態様において、クラス４ペプチドは、配列番号９４６及び配列番号９４７からなる群より選択される配列を含む。更なる実施態様において、融合ペプチドのＣ末端は修飾されて、カルボン酸基がアミド基で置換されている。
一つの実施態様において、クラス４ペプチド融合ペプチドが提供され、ここで、融合ペプチドのクラス４ペプチド部分が、配列番号９０３、配列番号９０４、配列番号９０５、配列番号９０６、配列番号９０７、配列番号９０８、配列番号９０９、配列番号９１１、配列番号９１２、配列番号９１３、配列番号９１４、配列番号９１５、配列番号９１０、配列番号９１６、配列番号９１７、配列番号９１８及び配列番号９３９からなる群より選択され、配列番号９１９の配列がグルカゴンアンタゴニスト部分のカルボキシ末端に融合しており、ＰＧＥ鎖が、存在する場合は、５００〜４，０００ダルトンの範囲から選択される。より詳細には、一つの実施態様において、クラス４ペプチドセグメントは、配列番号９１３、配列番号９１４、配列番号９１５、配列番号９１６、配列番号９４６及び配列番号９４７からなる群より選択され、ＰＧＥ鎖は、５００〜５，０００ダルトンの範囲から選択され、より好ましくは、一つの実施態様において、ＰＥＧ鎖は約１，０００ダルトンである。更なる実施態様において、Ｃ末端は修飾されて、カルボン酸基がアミド基で置換されている。
クラス４ペプチドは、カルボキシ末端へ付加された１〜２個の荷電アミノ酸を更に含むことができる。一つの実施態様において、１〜２個の荷電アミノ酸が配列番号９４４のカルボキシ末端に付加される場合、アミノ酸は、例えばグルタミン酸及びアスパラギン酸を含む負荷電アミノ酸である。一つの実施態様において、クラス４ペプチドは配列番号９４２の配列を含み、天然グルカゴンペプチドの対応する２７及び２８位の少なくとも１つは、アスパラギン酸及びグルタミン酸からなる群より選択されるアミノ酸を含み、配列番号９４２は、場合により修飾されて、カルボキシ末端に付加された１〜２個の負荷電アミノ酸の付加を含む。一つの実施態様において、負荷電アミノ酸は、グルタミン酸又はアスパラギン酸である。
本明細書に開示されているクラス４ペプチドを、例えばインスリンを含む他の活性剤と組み合わせて、過剰グルカゴン活性により特徴付けられている疾患又は状態を治療することができる。一つの実施態様において、１０，０００ダルトンを超える分子量を有するＰＥＧ鎖に共有結合するように修飾されたクラス４ペプチドを、インスリンと一緒に投与して、糖尿病患者の安定した血中グルコースレベルの維持を助けることができる。本開示のクラス４ペプチドを単一組成物としてインスリンと同時投与すること、別々の液剤として同時に投与することができるか、あるいは、インスリンとクラス４ペプチドを互いに異なる時間で投与することができる。一つの実施態様において、インスリンを含む組成物及びクラス４ペプチドを含む組成物を、互いに１２時間以内に投与する。クラス４ペプチドと投与されたインスリンの正確な比率は、部分的には患者のグルカゴンレベルを決定することによって決まり、慣用的な実験により決定することができる。
二量体ペプチド
本開示は、本明細書に開示されている修飾クラス４ペプチドの多量体も包含する。２つ以上の修飾クラス４ペプチドを、標準的な結合剤及び当業者に既知の手順を使用して一緒に結合することができる。例えば、二量体は、２つの修飾クラス４ペプチドから、特にシステイン、リシン、オルチニン、ホモシステイン又はアセチルフェニルアラニン残基（例えば、配列番号９０９、配列番号９１０、配列番号９１１及び配列番号９１２）により（例えば、１１、１６又は１９位で）置換されているクラス４ペプチドの場合では、二官能チオール架橋剤及び二官能アミン架橋剤の使用を介して、形成することができる。二量体は、ホモ二量体であってもよいし、ヘテロ二量体であってもよい。一つの実施態様において、二量体は、配列番号９０８、配列番号９０９、配列番号９１０、配列番号９１１、配列番号９１２、配列番号９４５、配列番号９４６又は配列番号９４７からなる群より独立して選択される２つのクラス４ペプチドから形成され、ここで２つのペプチドは、それぞれのペプチドの１１位、それぞれのペプチドの１６位若しくはそれぞれのペプチド１９位又はこれらの任意の組み合わせに結合しているリンカーを介して互いに結合している。一つの実施態様において、結合は、それぞれのクラス４ペプチドのペプチドのＣｙｓ１１とＣｙｓ１１又はＣｙｓ１９とＣｙｓ１９又はＣｙｓ１１とＣｙｓ１９残基の間のジスルフィド結合である。
同様に、二量体は、配列番号９０３、配列番号４、配列番号９０５、配列番号９０６、配列番号９０７、配列番号９０８、配列番号９０９、配列番号９１０、配列番号９１１、配列番号９１２、配列番号９３６、配列番号９３７、配列番号９３８、配列番号９３９及び配列番号９４２からなる群より独立して選択される２つのクラス４ペプチドから形成することができ、ここで結合は、天然グルカゴンペプチドに対応した１６、２１及び２４位から独立して選択されるアミノ酸位置の間で形成される。
一つの実施態様によると、それぞれ配列番号９４６の配列を含む２つのクラス４ペプチドを含むクラス４ペプチド二量体が提供され、ここで２つのアンタゴニストは、アミノ酸の２５位を介してジスルフィド結合により互いに結合している。別の実施態様において、それぞれ配列番号９４７の配列を含む２つのクラス４ペプチドを含むクラス４ペプチド二量体が提供され、ここで２つのアンタゴニストは、アミノ酸の３５位を介してジスルフィド結合により互いに結合している。一つの実施態様において、二量体は、配列番号９４６と配列番号９４７のクラス４ペプチドから形成され、１０位のアミノ酸はグルタミン酸である。
一つの実施態様において、二量体は、配列番号９０７、配列番号９０８、配列番号９３６、配列番号９３７、配列番号９４０、配列番号９３９、配列番号９４０、配列番号９４１、配列番号９４２からなる群及び前記クラス４ペプチドの薬学的に許容される塩より選択されるクラス４ペプチド融合ペプチドのホモ二量体を含む。一つの実施態様によると、リンカーを介して第２クラス４ペプチドに結合している第１クラス４ペプチドとを含む二量体が提供され、ここで、二量体の第１及び第２グルカゴンペプチドは、配列番号９０７、配列番号９０８、配列番号９３６、配列番号９３７、配列番号９３９、配列番号９４０、配列番号９４１及び配列番号９４２からなる群と、前記グルカゴンポリペプチドの薬学的に許容される塩より独立して選択される。別の実施態様において、二量体の第１及び第２クラス４ペプチドは、配列番号９０７、配列番号９０８、配列番号９３６及び配列番号９３９からなる群より独立して選択される。
別の実施態様において、二量体は、配列番号９２３、配列番号９２４、配列番号９２５、配列番号９２６、配列番号９２７、配列番号９２８、配列番号９２９、配列番号９３０、配列番号９３１からなる群より選択されるクラス４ペプチドのホモ二量体を含む。別の実施態様において、二量体の第１及び第２ペプチドが、配列番号９２３、配列番号９２４、配列番号９２５、配列番号９２６、配列番号９２７及び配列番号９２８からなる群より独立して選択されるアミノ酸配列を含むクラス４ペプチド量体が提供される。別の実施態様において、二量体は、配列番号９０９、配列番号９１１及び配列番号９１２からなる群より選択されるクラス４ペプチドのホモ二量体を含み、ここでペプチドは、グルカゴンペプチドの１１又は１９位に共有結合しているポリエチレングリコール鎖を更に含む。
クラス４グルカゴン関連類縁体ペプチドは、グルカゴンアンタゴニスト活性を保持する１、２、３、４又は５個までの更なる修飾を場合により有する、配列番号９０１〜９７１のアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含むことができる。
クラス５グルカゴン関連類縁体ペプチド
特定の実施態様において、グルカゴン関連類縁体ペプチドは、クラス５グルカゴン関連類縁体ペプチドである（例えば、その全体が本明細書に組み込まれる国際（ＰＣＴ）特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８１３３３を参照すること）。
活性
特定の態様において、クラス５グルカゴン関連類縁体ペプチド（以下では「クラス５ペプチド」と呼ぶ）は、グルカゴンアゴニスト作用の抑制が望ましく、そしてＧＬＰ−１活性の同時の刺激も望ましいあらゆる状況に利用される、グルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストであることができる。例えば、ＧＬＰ−１刺激と一緒になったグルカゴンアンタゴニスト活性を糖尿病の治療に使用することができ、ここでは、高血糖症の前臨床モデルで血中グルコースの低下をもたらすグルカゴンアンタゴニスト作用が実証され、ＧＬＰ−１活性がインスリン産生と関連している。ＧＬＰ−１活性を示す化合物も、肥満の治療及び体重増加の防止に有用であることが知られている。
特定の態様において、クラス５ペプチドは、他のグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストについて既に記載されているあらゆる使用に適していると考えられる。これらの２つの活性は、代謝症候群、特に糖尿病及び肥満の治療に極めて望ましい特性を個別に示してきた。グルカゴンアンタゴニスト活性は、グルカゴンアゴニスト作用の抑制が望ましいあらゆる状況に有用である。ＧＬＰ−１アゴニスト作用の存在は、更に、膵臓からのグルカゴンの内因性分泌を抑制する一方で、インスリン合成及び分泌を刺激する。２つの薬理学的作用は、相乗様式で働いて代謝異常を正常化する。したがって、クラス５ペプチドを、高血糖症の治療又はグルカゴンの高血中レベル若しくは高血中グルコースレベルをもたらす他の代謝疾患の治療に使用することができる。一つの実施態様によると、本明細書に開示されているクラス５ペプチドのようなグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニストを使用して治療される患者は、家畜化された動物であり、別の実施態様では、治療される患者はヒトである。糖尿病患者におけるグルカゴン抑制の欠如が、部分的には糖原症の促進を介した食後高血糖に寄与することが研究によって示唆されている。経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）の際の血中グルコースの分析及びソマトスタチン誘導グルカゴン抑制の存在又は不在は、高グルカゴンレベルの被験者においてグルコースの有意な増加を示した。したがって、本明細書に記載されているグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１アゴニスト又はクラス５ペプチドは、高血糖症の治療に使用することができるし、インスリン依存性又はインスリン非依存性のいずれかのＩ型真性糖尿病、ＩＩ型真性糖尿病又は妊娠糖尿病を含む多様な種類の糖尿病を治療すること及び腎障害、網膜症及び血管疾患を含む糖尿病の合併症を低減することに有用であることが予想される。
そのような食欲を減退する又は体重の減少を促進する方法は、体重の低減、体重増加の防止又は薬剤誘導肥満を含む多様な原因の肥満の治療、並びに血管疾患（冠動脈疾患、発作、末梢血管疾患、虚血再灌流など）、高血圧、ＩＩ型糖尿病の発症、高脂血症及び筋骨格系疾患を含む肥満に関連する合併症の低減に有用であることが予想される。
クラス５ペプチドを含む医薬組成物を、標準的な薬学的に許容される担体及び当業者に既知の投与経路を使用して、配合及び投与することができる。したがって、本開示は、本明細書に開示されている１つ以上のクラス５ペプチドを薬学的に許容される担体と組み合わせて含む医薬組成物も包含する。医薬組成物は、クラス５ペプチドを単独の薬学的に活性な成分として含むことができるし、クラス5ペプチドを１つ以上の追加的な活性剤と組み合わせることもできる。一つの実施態様によると、クラス５ペプチドと、インスリン又はインスリン類縁体とを含む組成物が提供される。あるいは、配列番号１０１５又は配列番号１０５１の配列を含み、配列番号１０１５又は配列番号１０５１のアミノ酸２４に結合している配列番号１０２１（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）又は配列番号１０５０のアミノ酸配列及び抗肥満ペプチドを更に含む、減量の誘導又は体重増加の防止をもたらすことができる組成物を提供することができる。適切な抗肥満ペプチドには、米国特許第５，６９１，３０９号、同第６，４３６，４３５号又は米国特許出願第２００５／０１７６６４３号に開示されているものが含まれる。
クラス５ペプチド構造
一つの実施態様によると、グルカゴンペプチドを含むクラス５ペプチドが提供され、このグルカゴンペプチドは、Ｎ末端からの最初の１〜５個のアミノ酸残基（例えば、最初のアミノ酸、最初の２個のアミノ酸、最初の３個のアミノ酸、最初の４個のアミノ酸、最初の５個のアミノ酸）の欠失と、例えば、水素結合、又は塩架橋の形成のようなイオン相互作用を介する、又は共有結合による、１２位と１６位、１６位と２０位、２０位と２４位及び２４位と２８位（天然グルカゴンペプチド配列による）から選択されるアミノ酸対の側鎖の相互の結合による、化合物のＣ末端部分（野生型グルカゴン、配列番号１００１のアミノ酸番号付けにより１２〜２９位のアミノ酸の付近）のアルファ−へリックス構造の安定化とによって修飾される。あるいは、残基１２〜１９付近のアルファ−へリックス構造の安定化は、所望の活性を保持する位置での１個以上のα，α−二置換アミノ酸の導入によって達成される。幾つかの実施態様において、クラス５ペプチド又はその類縁体の１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４又は２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）の１、２、３、４つ又はそれ以上の位置は、α，α−二置換アミノ酸で置換されている。例えば、アミノイソ酪酸（ＡＩＢ）によるクラス５ペプチド又はその類縁体の１６位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）での置換は、塩架橋又はラクタムの不在下で安定化したアルファ−へリックスをもたらす。幾つかの実施態様において、１６、２０、２１又は２４位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）の１、２、３つ又はそれ以上の位置がＡＩＢで置換されている。
一つの実施態様によると、ペプチドがＧＬＰ−１受容体において天然ＧＬＰ−１により達成される最大アゴニスト作用の少なくとも８０％を示し、インビトロアッセイにおけるｃＡＭＰ産生により測定して、グルカゴン受容体における最大グルカゴン誘導ｃＡＭＰ産生を少なくとも約５０％低減するグルカゴンアンタゴニスト活性を示す、クラス５ペプチドが提供される。一つの実施態様において、クラス５ペプチドは、ＧＬＰ−１受容体における天然ＧＬＰ−１の活性の少なくとも９０％を示し、グルカゴン受容体における最大グルカゴン誘導ｃＡＭＰ産生を少なくとも約８０％低減するグルカゴンアンタゴニスト活性を示す。
一つの実施態様によると、クラス５ペプチドは、配列番号１００２のペプチド誘導体を含み、ここでグルカゴンペプチドは、１、２、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１９、２２及び２４位から選択される１〜３つのアミノ酸位置で配列番号１００２に対して更なるアミノ酸置換を含み、ＧＬＰ−１受容体における天然ＧＬＰ−１の活性の少なくとも９０％を示し、グルカゴン受容体における最大グルカゴン誘導ｃＡＭＰ産生を少なくとも約８０％低減するグルカゴンアンタゴニスト活性を示す。
幾つかの実施態様において、クラス５ペプチドのＣ末端部分（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによるアミノ酸１２〜２９の付近）のアルファ−へリックス構造は、例えば、共有若しくは非共有分子内架橋の形成により又はアルファ−へリックス安定化アミノ酸（例えば、α，α−二置換アミノ酸）での１２〜２９位付近のアミノ酸の置換及び／若しくは挿入により安定化される。幾つかの実施態様において、クラス５ペプチド又はその類縁体の１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４又は２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）の１、２、３、４つ又はそれ以上の位置は、α，α−二置換アミノ酸、例えばアミノイソ酪酸（ＡＩＢ）で置換されている。例えば、アミノイソ酪酸（ＡＩＢ）によるクラス５ペプチド又はその類縁体の１６位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）での置換は、塩架橋又はラクタムの不在下で安定化したアルファ−へリックスをもたらす。
一つの実施態様において、クラス５ペプチドは、配列番号１０１５又は配列番号１０５１を含み、より詳細には、配列番号１００５、配列番号１００６、配列番号１００７、配列番号１００８、配列番号１００９、配列番号１０１６、配列番号１０１７、配列番号１０１８、配列番号１０１９、配列番号１０２２、配列番号１０２３、配列番号１０２４及び配列番号１０２５からなる群より選択される配列を含む。更なる実施態様において、クラス５ペプチドは、配列番号１０１５又は配列番号１０５１のペプチド誘導体を含み、ここでペプチドは、１、２、５、６、８、９、１２、１３及び１４位から選択される１〜３つのアミノ酸位置で配列番号１０１５又は配列番号１０５１に対して更なるアミノ酸置換を含む。一つの実施態様において、１、２、５、６、８、９、１２、１３及び１４位での置換は、保存的アミノ酸置換である。一つの実施態様において、配列番号１００５又は配列番号１００６の２４位のトレオニンは、グリシンで置換されている。
一つの実施態様によると、クラス５ペプチドは、ペプチドの更なる修飾を表し、ここでは、Ｎ末端欠失に加えて、天然グルカゴンペプチドの６位のフェニルアラニンが修飾されて、例えば、Ｎ末端アミノ基の代わりにヒドロキシル基を含む。更なる実施態様において、Ｃ末端アミノ酸の天然カルボン酸は、アミド又はエステルのような電荷中性基で置換されている。
一つの実施態様によると、クラス５ペプチドが調製されるが、ここでは、天然グルカゴンの最初の３〜５個のアミノ酸を欠失し、天然グルカゴンペプチドに対して９位のアミノ酸を、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、β−ホモグルタミン酸、システインのスルホン酸又は下記構造：
Figure 2011511778
 〔式中、Ｘ５は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ２〜Ｃ４アルケニル若しくはＣ２〜Ｃ４アルキニルである〕を有するシステインのアルキルカルボキシレート誘導体からなる群より選択されるアミノ酸で置換し、グルカゴンのＣ末端部分（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによるアミノ酸１２〜２９の付近）のアルファ−へリックス構造を、例えば、ラクタム架橋を、天然グルカゴンペプチドに対して、アミノ酸１２と１６又はアミノ酸１６と２０の側鎖の間に形成することによって安定化する７原子結合架橋を形成する共有結合が可能なアミノ酸対形成の例は、本開示の全体をとおして詳述されている。一つの実施態様において、システインのスルホン酸誘導体は、システイン酸又はホモシステイン酸である。
一つの実施態様において、配列番号１００５、配列番号１００６、配列番号１００７又は配列番号１００８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むクラス５が提供され、ここで前記ペプチドは、配列番号１００５のアミノ酸７及び１１の側鎖の間、配列番号１００６の１１位と１５位の間、配列番号１００７の１５位と１９位の間、配列番号１００８の１９位と２４位の間に形成されるラクタム環を含み、前記配列は、それぞれ更に修飾されて、ペプチドに共有結合している親水性部分を含む。より詳細には、一つの実施態様において、ラクタムを有するクラス５ペプチドは、それぞれ、ポリエチレングリコール鎖の共有結合により修飾されている。例えば、配列番号１００５を含むクラス５ペプチドでは、ペプチドは、１２、１５、１６、１９及び２４からなる群より選択される位置でペグ化されており、配列番号１００６を含むクラス５ペプチドでは、ペプチドは、１２、１６、１９及び２４からなる群より選択される位置でペグ化されており、配列番号１００７を含むクラス５ペプチドでは、ペプチドは、１１、１２，１６及び２４からなる群より選択される位置でペグ化されており、配列番号１００８を含むクラス５ペプチドでは、ペプチドは、１１、１２、１５及び１６らなる群より選択される位置でペグ化されている。一つの実施態様によると、ペプチドが、配列番号１０４７又は配列番号１０４８の配列における１２、１６、１９及び２４からなる群より選択される位置でペグ化されている、配列番号１０４７又は配列番号１０４８を含むクラス５ペプチドが提供される。更なる実施態様において、配列番号１０４７又は配列番号１０４８のペプチドは、ペプチドのカルボキシ末端への配列番号１０２１の配列の付加により更に修飾される。
特定の対応において更に上記に詳述されているように、クラス５ペプチドが提供されるが、ここでは、天然グルカゴンの最初の５個のアミノ酸を欠失し、Ｎ末端アミノ酸のアミノ基（フェニルアラニン）をヒドロキシル基で置換し（すなわち、最初のアミノ酸はフェニル乳酸である）、１２位と１６位、１６位と２０位、２０位と２４位及び２４位と２８位から選択される１つ以上のアミノ酸対の側鎖を互いに結合させて、それによりクラス５ペプチドのアルファ−へリックスを安定化する。
一つの実施態様において、グルタミン酸、グルタミン、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、トレオニン又はグリシンからなる群より選択されるアミノ酸による１１位（天然グルカゴンのアミノ酸番号付けによる１６位）のセリン残基の置換によって修飾されている、配列番号１００２の配列を含むクラス５ペプチドが提供される。一つの実施態様によると、配列番号１００２の１１位のセリン残基は、グルタミン酸、グルタミン、ホモグルタミン酸及びホモシステイン酸からなる群より選択されるアミノ酸で置換されており、一つの実施態様では、セリン残基はグルタミン酸で置換されている。一つの実施態様によると、クラス５ペプチドは、配列番号１０３８の配列を含む。
一つの実施態様において、分子内架橋を２つのアミノ酸側鎖の間に形成して配列番号１００２のペプチドのカルボキシ末端の三次元構造を安定化した、クラス５ペプチドが提供される。より詳細には、配列番号１００２のアミノ酸対７と１１、１１と１５、１５と１９又は１９と２３から選択される１つ以上のアミノ酸の側鎖を互いに結合して、Ｃ末端部分においてアルファ−へリックスを安定化する。２つの側鎖は、水素結合、イオン相互作用（例えば、塩架橋の形成）又は共有結合を介して互いに結合することができる。一つの実施態様によると、リンカーの大きさは、７〜９個の原子であり、一つの実施態様において、リンカーの大きさは、８個の原子である。一つの実施態様において、クラス５ペプチドは、配列番号１００５、配列番号１００６、配列番号１００７及び配列番号１００８からなる群より選択される。一つの実施態様において、クラス５ペプチドのＣ末端アミノ酸は、天然アミノ酸に存在するカルボン酸基を置換したアミド基を有する。
一つの実施態様によると、類縁体が配列番号１００９のアミノ酸配列を含むクラス５ペプチドが提供される。一つの実施態様において、配列番号１００９のペプチドのカルボキシ末端の三次元構造は、ペプチドの側鎖の間の共有結合の形成により安定化される。一つの実施態様において、２つのアミノ酸側鎖が互いに結合してラクタム環を形成する。ラクタム環の大きさは、アミノ酸の側鎖の長さに応じて変わることができ、一つの実施態様において、ラクタムは、リシンアミノ酸の側鎖とグルタミン酸の側鎖に結合することによって形成される。一つの実施態様において、クラス５ペプチドのＣ末端アミノ酸は、天然アミノ酸に存在するカルボン酸基を置換したアミド基を有する。
ラクタム環におけるアミド結合の順番を逆転することができる（例えば、ラクタム環を、Ｌｙｓ１２とＧｌｕ１６の側鎖、あるいはＧｌｕ１２とＬｙｓ１６の側鎖の間に形成することができる）。一つの実施態様によると、少なくとも１つのラクタム環が、配列番号１００９のアミノ酸対７と１１、１１と１５、１５と１９及び１９と２３からなる群より選択されるアミノ酸対の側鎖の間に形成される、配列番号１００９のグルカゴン類縁体が提供される。一つの実施態様において、ペプチドが配列番号１０１０の配列を含むクラス５ペプチドが提供され、前記配列は、配列番号１０１０の７及び１１位のアミノ酸の間又は１１及び１５位のアミノ酸の間又は１５及び１９位のアミノ酸の間に形成される分子内ラクタム架橋を更に含む。一つの実施態様において、ペプチドが配列番号１０１１の配列を含むクラス５ペプチドが提供され、前記配列は、配列番号１０１１の７及び１１位のアミノ酸の間又は１１及び１５位のアミノ酸の間に形成される分子内ラクタム架橋を更に含む。一つの実施態様において、クラス５ペプチドは、配列番号１７の配列を含む。
配列番号１００５の誘導体を含む追加的なクラス５ペプチドが提供され、ここで配列番号１００５の１０位（天然グルカゴンの１５位）のアスパラギン酸は、一般構造：
Figure 2011511778
 〔式中、Ｘ６は、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ２〜Ｃ３アルケン又はＣ２〜Ｃ３アルキニルであり、一つの実施態様では、Ｘ６はＣ１〜Ｃ３アルキルであり、別の実施態様では、Ｘ６はＣ２アルキルである〕で示されるアミノ酸であるグルタミン酸で置換されている。一つの実施態様において、配列番号１００９の１０位（天然グルカゴンの１５位）が、グルタミン酸、システイン酸、ホモシステイン酸及びホモグルタミン酸からなる群より選択されるアミノ酸で置換されている、配列番号１００９のクラス５ペプチド誘導体が提供される。更なる実施態様において、配列番号１００９の１０位は、システイン酸又はホモシステイン酸からなる群より選択されるアミノ酸で置換されている。一つの実施態様において、配列番号１００６、配列番号１００７又は配列番号１００８の１０位が、グルタミン酸、システイン酸、ホモシステイン酸及びホモグルタミン酸からなる群より選択されるアミノ酸で置換されている、配列番号１００６、配列番号１００７又は配列番号１００８のクラス５ペプチド誘導体が提供される。一つの実施態様において、クラス５ペプチドのＣ末端アミノ酸は、天然アミノ酸に存在するカルボン酸基を置換したアミド基を有する。
一つの実施態様において、クラス５ペプチドのアミノ酸は少なくとも１つのシステイン残基で置換されており、ここでシステイン残基の側鎖は、例えばマレイミド、ビニルスルホン、２−ピリジルチオ、ハロアルキル及びハロアシルを含むチオール反応性試薬により更に修飾される。これらのチオール反応試薬は、カルボキシ、ケト、ヒドロキシ及び他のエーテル基、並びにポリエチレングリコール単位のような他の親水性部分を含有することができる。代替的な実施態様において、クラス５ペプチドのアミノ酸は、リシンで置換され、置換リシン残基の側鎖は、カルボン酸の活性エスエル（スクシンイミド、無水物など）又はポリエチレングリコールのような親水性部分のアルデヒドのようなアミン反応性試薬を使用して更に修飾される。一つの実施態様によると、配列番号１００５のペプチドの７位に対応するリシン残基は、アルギニンで置換されており、単一のリシン置換が、配列番号１００５の１２、１５、１６、１９及び２４位に対応する１個以上のアミノ酸に挿入されている。
別の実施態様において、本明細書に開示されているクラス５ペプチドの２２位に対応するメチオニン残基をロイシン又はノルロイシンに変えて、ペプチドの酸化分解を防止する。
更に、クラス５ペプチドは、幾つかの態様において、グルカゴン類縁体の機能にとって重要ではないことが知られている位置にもアミノ酸置換を包含する。一つの実施態様において、置換は、２、５、６、７、８、９、１２、１３、１４、１５、１６、１９、２２、２３又は２４からなる群より選択される１、２又は３つの位置での保存的アミノ酸置換である。一つの実施態様において、天然ペグルカゴンプチドの１６、１７、２０、２１、２４又は２９位、とりわけ天然グルカゴンの２１及び／又は２４位に対応するアミノ酸はシステイン又はリシンで置換されており、ここでＰＥＧ鎖は、置換システイン又はリシン残基と共有結合している。
一つの実施態様によると、ペプチドの１１、１２、１５、１６、１９及び／又は２４位に対応する位置での１つ以上の追加的なアミノ酸置換（例えばシステインによる置換を含む）により更に修飾されている、配列番号１００９から構成される配列を含むクラス５ペプチドが提供され、ここでアミノ酸置換は、例えばＰＥＧを含む親水性部分との架橋に適した側鎖を有するアミノ酸を含む。天然グルカゴンを、天然アミノ酸又は合成（非天然）アミノ酸で置換することができる。合成又は非天然アミノ酸とは、インビボで天然に生じないが、それでも、本明細書に記載されるペプチド構造に組み込むことができるアミノ酸を意味する。一つの実施態様において、ペプチドが配列番号１００９を含み、ペプチドの１６又は１９位に結合しているポリエチレン鎖を更に含む、クラス５ペプチドが提供される。更なる実施態様において、グルカゴン類縁体のＣ末端は修飾されて、カルボン酸基がアミド基で置換されている。
一つの実施態様によると、下記：
Ｒ１−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｒ２（配列番号１０３９）、
Ｒ１−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｘａａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｒ２（配列番号１０１３）、
Ｒ１−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｒ２（配列番号１０１４）及び
Ｒ１−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｘａａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｒ２（配列番号１０１２）
からなる群より選択されるグルカゴン類縁体を含むクラス５ペプチドが提供され、
ここで、４位のＸａａは、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン酸又はホモシステイン酸であり、１０位のＸａａは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、ホモグルタミン酸及びホモシステイン酸であり、１６位のＸａａは、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステイン又はアセチルフェニルアラニンであり、１９位のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステイン及びアセチルフェニルアラニンであり、２２位のＸａａは、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ又はＮｌｅであり、Ｒ１はＯＨ又はＮＨ２であり、そしてＲ２は、Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｓｅｒ（配列番号１０２１）、Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｘａａ（配列番号１０５０；ここでＸａａは、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステイン又はアセチルフェニルアラニンである）、ＣＯＯＨ又はＣＯＮＨ２であり、ペプチドは、配列番号１０１３の１６位、配列番号１０１４の１９位及び配列番号１２の１６と１９位で場合によりペグ化されている。一つの実施態様において、配列番号１０１２〜１０１４及び１０３９の２４位のＴｈｒは、Ｇｌｙで置換されている。一つの実施態様によると、ペプチドは、グルカゴンアンタゴニストは、配列番号１０１３又は配列番号１０１４の配列を含み、ここでＲ１はＯＨである。一つの実施態様によると、ペプチドは、Ｒ１がＯＨであり、Ｒ２がＣＯＮＨ２である、配列番号１０１３又は配列番号１０１４の配列を含む。一つの実施態様によると、ペプチドは、Ｒ１がＯＨであり、Ｒ２がＣＯＮＨ２であり、２４位のトレオニンがグリシンで置換されている、配列番号１０１３又は配列番号１０１４の配列を含む。
一つの実施態様において、クラス５ペプチドは、対応するアミノ酸位置での天然グルカゴン残基の置換により更に修飾されて、天然ＧＬＰ−１の１つ以上のアミノ酸を含む。例えば、クラス５ペプチドは、２、３，１７、１８、２１、２３及び２４位（天然グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のいずれかの位置に１つ以上のアミノ酸置換を含むことができる。特定の実施態様において、クラス５ペプチドは、以下のアミノ酸置換の１個以上により修飾される：Ｓｅｒ２のＡｌａでの置換、Ｇｌｎ３のＧｌｕでの置換、Ａｒｇ１７のＧｌｎでの置換、１８位のＡｒｇのＡｌａでの置換、２１位のＡｓｐのＧｌｕでの置換、２３位のＶａｌのＩｌｅでの置換、そして２４位のＧｌｎのＡｌａでの置換（アミノ酸の位置は、天然グルカゴン配列による）。特定の実施態様において、クラス５ペプチドは、Ｓｅｒ２のＡｌａでの置換及びＧｌｎ３のＧｌｕでの置換（天然グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）により修飾される。別の実施態様において、クラス５ペプチドは、以下のアミノ酸置換の１つ以上により修飾される：Ａｒｇ１７のＧｌｎでの置換、１８位のＡｒｇのＡｌａでの置換、２１位のＡｓｐのＧｌｕでの置換、２３位のＶａｌのＩｌｅでの置換、そして２４位のＧｌｎのＡｌａでの置換（天然グルカゴンによるアミノ酸番号付け）。更に別の特定の実施態様において、クラス５ペプチドは修飾されて、２１位（配列番号１００１の番号付けによる）のＧｌｕのみを含む。したがって、クラス５ペプチドは、配列番号１０６０〜１０７０、１０７３〜１０７８、１０８０〜１０８８、１０９０〜１０９６、１１０３、１１０４、１１０６及び１１１４〜１１１８のいずれかのアミノ酸配列を含むことができる。
また、本明細書において提供されるクラス５ペプチド又その結合体は、（１）本明細書に記載された方法により（例えば、分子内架橋又は１個以上のアルファ，アルファ−二置換アミノ酸又若しくは１６位（配列番号１００１の番号付けによる）の酸性アミノ酸の組み込み又はそれらの組み合わせにより）安定化されたアルファ−へリックス、（２）Ｃ末端カルボキシレートの代わりにＣ末端アミド又はエステル、及び（３）一般構造Ａ−Ｂ−Ｃ、を含み、
ここでＡは、下記：
（ｉ）フェニル乳酸（ＰＬＡ）；
（ｉｉ）ＰＬＡのオキシ誘導体；及び
（ｉｉｉ）連続した２個のアミノ酸がエステル又はエーテル結合を介して結合しているアミノ酸２〜６個のペプチド
からなる群より選択され；
Ｂは、配列番号１００１のアミノ酸ｐ〜２６を表し（ｐは、３、４、５、６又は７である）、更に、例えばクラス５ペプチドについて記載された修飾のいずれかを含む、本明細書に記載されている１個以上のアミノ酸修飾を含んでもよい。例えば、前記１個以上の修飾は、下記：
（ｉｖ）Ｇｌｕ、Ｃｙｓのスルホン酸誘導体、ホモグルタミン酸、β−ホモグルタミン酸又は下記構造：
Figure 2011511778
 〔式中、Ｘ５は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ２〜Ｃ４アルケニル若しくはＣ２〜Ｃ４アルキニルである〕
を有するシステインのアルキルカルボキシレート誘導体により９位（配列番号１００１のアミノ酸番号付けによる）のＡｓｐの置換；
（ｖ）エステル、エーテル、チオエーテル、アミド又はアルキルアミン結合を介してアシル又はアルキル基に共有結合しているアミノ酸による１０、２０及び２４位（配列番号１００１のアミノ酸番号付けによる）の１又は２個のアミノ酸の置換；
（ｖｉ）Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、オルチニン、ホモシステイン及びアセチル−フェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）からなる群より選択されるアミノ酸による１６、１７、２０、２１及び２４位（配列番号１００１のアミノ酸番号付けによる）の１又は２個のアミノ酸の置換（ここでアミノ酸の群は親水性部分に共有結合している）；
（ｖｉｉ）システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸及びホモシステイン酸による１５位（配列番号１００１の番号付けによる）のＡｓｐの置換；
（ｖｉｉｉ）システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸及びホモシステイン酸による１６位（配列番号１００１の番号付けによる）のＳｅｒの置換；
（ｉｘ）Ｇｌｎによる１７位のＡｒｇの交換、Ａｌａによる１８位のＡｒｇの交換、Ｇｌｕによる２１位のＡｓｐの交換、Ｉｌｅによる２３位のＶａｌの交換及びＡｌａによる２４位のＧｌｎの交換（配列番号１００１のアミノ酸番号付けによる）；
（ｘ）Ｇｌｕによる１６位のＳｅｒの交換、Ｇｌｕによる２０位のＧｌｎの交換又はＧｌｕによる２４位のＧｌｎの交換（配列番号１００１のアミノ酸番号付けによる）
からなる群より選択されることができ、
Ｃ（一般構造Ａ−Ｂ−Ｃにおけるもの）は、下記：
（ｖｉｉ）Ｘ；
（ｖｉｉｉ）Ｘ−Ｙ；
（ｉｘ）Ｘ−Ｙ−Ｚ；
（ｘ）Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ１０
（ここでＸは、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ又はＮｌｅであり；Ｙは、Ａｓｎ又は荷電アミノ酸であり；Ｚは、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、オルニチン（Ｏｒｎ）、ホモシステイン、アセチル−フェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）又は荷電アミノ酸であり、Ｒ１０は、配列番号１０２１、１０２６、１０２７及び１０５０からなる群より選択される）
からなる群より選択される。
特定の態様において、ペプチドは、ＰＬＡのオキシ誘導体を含む。本明細書で使用されるとき、「ＰＬＡのオキシ誘導体」とは、ヒドロキシ基がＯ−Ｒ１１（式中、Ｒ１１は化学的部分である）で置換されているＰＬＡの修飾構造を含む化合物を意味する。この点において、ＰＬＡのオキシ誘導体は、例えばＰＬＡのエステル又はＰＬＡのエーテルであることができる。
ＰＬＡのオキシ誘導体を作製する方法は、当該技術において既知である。例えば、オキシ誘導体がＰＬＡのエステルである場合、エステルを、ＰＬＡのヒドロキシルと、求核剤を有するカルボニルとの反応により形成することができる。求核剤は、アミン又はヒドロキシルが含まれるが、これらに限定されない任意の適切な求核剤であることができる。したがって、ＰＬＡのエステルは、式ＸＩ：
Figure 2011511778
 〔式中、Ｒ７は、ＰＬＡのヒドロキシルと、求核剤を有するカルボニルとの反応により形成されるエステルである〕
で示される構造を含む。
求核剤（ＰＬＡのヒドロキシルと反応してエステルを形成する）を有するカルボニルは、例えば、カルボン酸、カルボン酸誘導体又はカルボン酸の活性化エステルであることができる。カルボン酸誘導体は、塩化アシル、酸無水物、アミド、エステル又はニトリルでありうるが、これらに限定されない。カルボン酸の活性化エステルは、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、トシレート（Ｔｏｓ）、カルボジイミド又はヘキサフルオロホスフェートであることができる。幾つかの実施態様において、カルボジイミドは、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１，１′−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）又は１，３−ジイソプロピルカルボジイミド（ＣＩＣＤ）である。幾つかの実施態様において、ヘキサフルオロホスフェートは、ヘキサフルオロホスフェート ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノンホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、２−（１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）及びｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）からなる群より選択される。
ヒドロキシル基（例えば、ＰＬＡのヒドロキシル）を用いる反応によりエーテルを作製する方法も当該技術において既知である。例えば、ＰＬＡのヒドロキシル基を、ハロゲン化アルキル又はトシル化アルキルアルコールと反応させて、エーテル結合を形成することができる。
特定の実施態様において、酸素含有結合を介して（例えば、エステル又はエーテル結合を介して）ＰＬＡに結合している化学的部分は、ポリマー（例えば、ポリアルキレングリコール）、炭水化物、アミノ酸、ペプチド又は脂質、例えば脂肪酸又はステロイドである。
特定の実施態様において、化学的部分はアミノ酸であり、場合により、式ＸＩがデプシペプチドであるようにペプチドの一部であってもよい。この点において、ＰＬＡは、ペプチドがＰＬＡ残基の１個以上（例えば、１、２、３、４、５、６個又はそれ以上）のアミノ酸Ｎ末端を含むように、ペプチドのＮ末端アミノ酸残基以外の位置にあることができる。例えば、ペプチドは、ペプチドのｎ位にＰＬＡを含むことができ、ここでｎは２、３、４、５又は６である。
ＰＬＡ残基のアミノ酸Ｎ末端は、合成されたものでもよいし天然のものでもよい。特定の実施態様において、Ｎ末端ＰＬＡであるアミノ酸は、天然に生じるアミノ酸である。一つの実施態様において、ＰＬＡのＮ末端であるアミノ酸は、天然グルカゴンのＮ末端アミノ酸である。例えば、ペプチドは、Ｎ末端に、配列番号１０５２〜１０５６のいずれかのアミノ酸配列を含むことができ、ここでＰＬＡは、エステル結合を介してトレオニンに結合している：
配列番号１０５２ Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＰＬＡ
配列番号１０５３ Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＰＬＡ
配列番号１０５４ Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＰＬＡ
配列番号１０５５ Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＰＬＡ
配列番号１０５６ Ｔｈｒ−ＰＬＡ
代替的な実施態様において、１個以上のＮ末端アミノ酸を天然グルカゴンのアミノ酸以外のアミノ酸で置換することができる。例えば、ペプチドが５又は６位のアミノ酸としてＰＬＡを含む場合、１位及び／又は２位のアミノ酸は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断に対して感受性を低減するアミノ酸であることができる。より詳細には、幾つかの実施態様において、ペプチドの１位は、Ｄ−ヒスチジン、アルファ，アルファ−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン及びホモ−ヒスチジンからなる群より選択されるアミノ酸である。より詳細には、幾つかの実施態様において、アンタゴニスト／アゴニストペプチドの２位は、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、バリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、Ｎ−メチルアラニン及びアミノイソ酪酸（ＡＩＢ）からなる群より選択されるアミノ酸である。また、例えば、ペプチドが４、５又は６位のアミノ酸としてＰＬＡを含む場合、ペプチドの３位のアミノ酸は、天然グルカゴンの天然グルタミン残基とは対照的に、グルタミン酸であることができる。本発明の例示的な実施態様において、ペプチドは、Ｎ末端に、配列番号１０５７〜１０５９のいずれかのアミノ酸配列を含む。
式ＸＩの化合物を含むペプチドに関して、ポリマーは、ＰＬＡのヒドロキシル基と反応することができる限り、任意のポリマーであることができる。ポリマーは、当然のことながら又は通常は、求核剤を有するカルボニルを含むものであることができる。あるいは、ポリマーは、カルボニルを有するカルボニルを含むように誘導体化されているものであることができる。ポリマーは、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン及びポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレートを含むその誘導体、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、 ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）及びポリ（オクタデシルアクリレート）を含むアクリル酸エステル及びメタクリル酸エステルのポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルハロゲン化物、ポリ（酢酸ビニル）及びポリビニルピロリドンを含むポリビニルポリマー、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタン及びそのコポリマー、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、カルボキシエチルセルロース、三酢酸セルロース及びセルロース硫酸ナトリウム塩を含むセルロース、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）及びポリ（エチレンテレフタレート）を含むポリエチレン、並びにポリスチレンのいずれかの誘導体化ポリマーであることができる。
ポリマーは、合成の生分解性ポリマー（例えば、乳酸とグリコール酸ポリマー、ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリウレタン、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）及びポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン））及び天然の生分解性ポリマー（例えば、アルギン酸塩及びデキストランを含む他の多糖類、セルロース、コラーゲン、その化学誘導体（化学基、例えばアルキル、アルキレンの置換、付加、ヒドロキシル化、酸化、及び当業者により日常的に行われる他の修飾）、アルブミン及び他の親水性タンパク質（例えば、ゼイン、他のプロラミン及び疎水性タンパク質））を含む生分解性ポリマー、並びにこれらの任意のコポリマー又は混合物であることができる。一般に、これらの物質は、インビボにおける酵素的加水分解又は水への暴露によって、表面又はバルク侵食により分解される。
ポリマーは、H. S. Sawhney, C. P. Pathak and J. A. Hubbell in Macromolecules, 1993, 26, 581-587により記載される生体侵食性ヒドロゲル（この教示は本明細書に組み込まれる）、ポリヒアルロン酸、カゼイン、ゼラチン、グルチン、ポリ無水物、ポリアクリル酸、アルギン酸塩、キトサン、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）及びポリ（オクタデシルアクリレート）のような生体付着性ポリマーであることができる。
一つの実施態様において、ポリマーは水溶性ポリマーである。適切な水溶性ポリマーは、当該技術において既知であり、例えば、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ；Klucel）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ；Methocel）、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルエチルセルロース、ヒドロキシプロピルブチルセルロース、ヒドロキシプロピルペンチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース（Ethocel）、ヒドロキシエチルセルロース、多様なアルキルセルロース及びヒドロキシアルキルセルロース、多様なセルロースエーテル、酢酸セルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、酢酸ビニル／クロトン酸コポリマー、ポリ−ヒドロキシアルキルメタクリレート、ヒドロキシメチルメタクリレート、メタクリル酸コポリマー、ポリメタクリル酸、ポリメチルメタクリレート、無水マレイン酸／メチルビニルエーテルコポリマー、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム及びカルシウム、ポリアクリル酸、酸性カルボキシポリマー、カルボキシポリメチレン、カルボキシビニルポリマー、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンコポリマー、ポリメチルビニルエーテル−ｃｏ−無水マレイン酸、カルボキシメチルアミド、カリウムメタクリレートジビニルベンゼンコポリマー、ポリオキシエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、並びにこれらの誘導体、塩及び組み合わせが含まれる。
特定の実施態様において、ポリマーは、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、ポリアルキレングリコールである。
炭水化物は、アルファ離脱基を有するカルボニルを含むか、又は含むように作成される限り、任意の炭水化物であることができる。炭水化物は、例えば、アルファ離脱基を有するカルボニルを含むように誘導体化されているものであることができる。この点において、炭水化物を、単糖（例えば、グルコース、ガラクトース、フルクトース）、二糖（例えば、スクロース、ラクトース、マルトース）、オリゴ多糖（例えば、ラフィノース、スタキオース）、多糖（デンプン、アミラーゼ、アミロペクチン、セルロース、キチン、カロース、ラミナリン、キシラン、マンナン、フコイダン、ガラクトマンナン）から誘導体化することができる。
脂質は、アルファ離脱基を有するカルボニルを含む任意の脂質であることができる。脂質は、例えば、カルボニルを含むように誘導体化されたものであることができる。この点において、脂質は、脂肪酸（例えば、Ｃ４〜Ｃ３０脂肪酸、エイコサノイド、プロスタグランジン、ロイコトリエン、トロンボキサン、Ｎ−アシルエタノールアミン）、グリセロ脂質（例えば、一置換、二置換、三置換グリセロール）、グリセロリン脂質（例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン）、スフィンゴ脂質（例えば、スフィンゴシン、セラミド）、ステロール脂質（例えば、ステロイド、コレステロール）、プレノール脂質、サッカロ脂質又はポリケチド、油、ロウ、コレステロール、ステロール、脂溶性のビタミン、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質、の誘導体であることができる。
一つの実施態様において、Ｒ７は、約１００kDa以下、例えば９０kDa以下、約８０kDa以下、約７０kDa以下、約６０kDa以下、約５０kDa以下、約４０kDa以下の分子量を有する。したがって、Ｒ７は、約３５kDa以下、３０kDa以下、約２５kDa以下、約２０kDa以下、約１５kDa以下、約１０kDa以下、約５kDa以下又は１kDaの分子量を有することができる。
代替的な実施態様において、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含むペプチドは、連続した２個のアミノ酸がエステル又はエーテル結合を介して結合しているアミノ酸２〜６個のペプチドをＡとして含む。エステル又はエーテル結合は、例えば、アミノ酸２と３、３と４、４と５又は５と６の間にあることができる。場合により、Ａのペプチドを、ポリマー（例えば、親水性ポリマー）への結合を含む他の化学的部分への共有結合、アルキル化又はアシル化により更に修飾することができる。
特定の実施態様において、ＰＬＡを含む上記に記載されたクラス５ペプチドは修飾されて、例えばＰＬＡのエステル又はＰＬＡのエーテルのようなＰＬＡのオキシ誘導体を含む。例えば、クラス５ペプチドは、配列番号１００２、１００５〜１０２０、１０２２〜１０２５、１０３２〜１０３６、１０３８、１０３９、１０４５、１０４６及び１０５１のいずれかのアミノ酸配列を含むことができ、ＰＬＡは、エステル又はエーテル結合を介して、アミノ酸、ペプチド、ポリマー、アシル基又はアルキル基に結合する。アミノ酸、ペプチド、ポリマー、アシル基又はアルキル基は、本明細書に記載されている任意のものであることができる。ＰＬＡがエステル結合を介してアミノ酸又はペプチドに結合している場合、クラス５ペプチドは、デプシペプチドと考慮することができる。
また、別の特定の実施態様において、ＰＬＡを欠いている上記記載のクラス５ペプチドは修飾されて、７位（天然グルカゴンの番号付けによる）のアミノ酸へのＮ末端である連続した２個のアミノ酸の間に少なくとも１つのエステル結合又はエーテル結合を含む。特定の実施態様において、クラス５ペプチドは、連続した２個のアミノ酸の間に少なくとも１つのエステル又はエーテル結合を含む。さらに特定の実施態様において、クラス５ペプチドは、配列番号１００１のＮ末端の６個のアミノ酸を含み、Ｎ末端の６個のアミノ酸の連続した２個のアミノ酸は、エステル又はエーテル結合を介して結合している。
Ａのペプチドは、連続した少なくとも２個のアミノ酸がエステル又はエーテル結合を介して結合している限り、合成又は天然の任意のアミノ酸を含むことができる。特定の実施態様において、Ａのペプチドは天然グルカゴンのアミノ酸を含む。１位及び／又は２位のアミノ酸は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断に対して感受性を低減させるアミノ酸であることができる。例えば、Ａのペプチドは、Ｄ−ヒスチジン、アルファ，アルファ−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン及びホモ−ヒスチジンからなる群より選択されるアミノ酸を１位に含むことができる。より詳細には、幾つかの実施態様において、Ａのペプチドの２位は、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、バリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、Ｎ−メチルアラニン及びアミノイソ酪酸（ＡＩＢ）からなる群より選択されるアミノ酸である。また、例えば、Ａのペプチドの３位のアミノ酸は、天然グルカゴンの天然グルタミン残基とは対照的に、グルタミン酸であることができる。したがって、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃのペプチドは、下記：
Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号１１０７）；
Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号１１０８）；又は
Ｘａａ３−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号１１０９）
のアミノ酸配列を含むことができ、
ここで、Ｘａａ１は、Ｈｉｓ、Ｄ−ヒスチジン、アルファ，アルファ−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン及びホモ−ヒスチジンからなる群より選択され；Ｘａａ２は、Ｓｅｒ、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、バリン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、Ｎ−メチルアラニン及びアミノイソ酪酸（ＡＩＢ）からなる群より選択され；そしてＸａａ３は、Ｇｌｎ又はＧｌｕである。
一つの実施態様において、Ｂは、３個までのアミノ酸修飾により修飾されている。例えば、配列番号１００１の天然アミノ酸配列を表すＢは、１個以上の保存的アミノ酸修飾で修飾されている。
別の実施態様において、Ｂは、本明細書に記載された（ｉｖ）〜（ｘ）からなる群より選択される１個以上のアミノ酸修飾を含む。特定の実施態様において、Ｂは、アミノ酸修飾（ｖ）及び（ｖｉ）のうちの一方又は両方を含む。更なる特定の実施態様において、Ｂは、（ｖ）及び（ｖｉ）に加えて、（ｉｖ）、（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）及び（ｘ）からなる群より選択されるアミノ酸修飾の１個又は組み合わせを含む。
本明細書に記載されているように、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含むペプチドは、Ｃ末端に１個以上の荷電アミノ酸、例えば本明細書に記載されているＹ及び／又はＺを含むことができる。代替的に又は追加的に、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含むペプチドは、ＣがＸ−Ｙ−Ｚを含む場合、Ｚへの１〜２個の荷電アミノ酸Ｃ末端を更に含むこともできる。荷電アミノ酸は、例えば、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ及びＧｌｕのうちの１つであることができる。特定の実施態様において、ＹはＡｓｐである。
一つの実施態様において、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含むペプチドは、１、１６、２０、２１若しくは２４位（配列番号１００１のアミノ酸番号付けによる）のアミノ酸残基又は一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含むペプチドのＮ若しくはＣ末端残基に共有結合している親水性部分を含む。特定の実施態様において、親水性部分は、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含むペプチドのＣｙｓ残基に結合している。この点において、天然グルカゴン（配列番号１００１）の１６、２１、２４又は２９位のアミノ酸はＣｙｓ残基で置換されていることができる。あるいは、親水性部分を含むＣｙｓ残基を、例えば、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含むペプチドがＣ末端延長を含む場合、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含むペプチドのＣ末端に３０又は４０位として付加することができる（位置は配列番号１００１のアミノ酸番号付けによる）。あるいは、親水性部分は、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含むペプチドのＰＬＡに、ＰＬＡのヒドロキシル部分を介して結合することができる。親水性部分は、例えばポリエチレングリコールを含む、本明細書に記載されている任意のものでありうる。
特定の態様において、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含むペプチドは、分子内架橋が組み込まれたために安定化したアルファ−へリックスを含む。一つの実施態様において、分子内架橋はラクタム架橋である。ラクタム架橋は、９位と１２位のアミノ酸、１２位と１６位のアミノ酸、１６位と２０位のアミノ酸、２０位と２４位のアミノ酸又は２４位と２８位のアミノ酸（配列番号１００１のアミノ酸番号付けによる）の間にあることができる。特定の実施態様において、１２位と１６位のアミノ酸又は１６位と２０位のアミノ酸（配列番号１００１のアミノ酸番号付けによる）は、ラクタム架橋を介して結合している。ラクタム架橋の他の位置も考慮される。
追加的に又は代替的に、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含むペプチドは、例えば１６、２０、２１又は２４（配列番号１００１のアミノ酸番号付けによる）の任意の位置にアルファ，アルファ−二置換アミノ酸を含むこともできる。一つの実施態様において、アルファ，アルファ−二置換アミノ酸はＡＩＢである。特定の実施態様において、ＡＩＢは、１６位（配列番号１００１の番号付けによる）に配置されている。
代替的に又は追加的に、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含むペプチドは修飾されて、１６位（配列番号１００１の番号付けによる）に酸性アミノ酸を含むこともでき、この修飾はアルファ−へリックスの安定性を増強する。一つの実施態様において、酸性アミノ酸は、側鎖スルホン酸又は側鎖カルボン酸を含むアミノ酸である。より特定の実施態様において、酸性アミノ酸は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ホモグルタミン酸、Ｃｙｓのスルホン酸誘導体、システイン酸、ホモシステイン酸、Ａｓｐ、及び下記構造：
Figure 2011511778
 〔ここで、Ｘ５は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ２〜Ｃ４アルケニル又はＣ２〜Ｃ４アルキニルである〕
を有するＣｙｓのアルキル化誘導体からなる群より選択される。
特定の実施態様において、クラス５ペプチドは、配列番号１０６０〜１０７０、１０７３〜１０７８、１０８０〜１０８８、１０９０〜１０９６、１１０３、１１０４、１１０６及び１１１４〜１１１８のいずれかのアミノ酸配列を含むか、又は表９のペプチド２〜６、表１０のペプチド１〜８及び表１１のペプチド２〜６、８及び９のいずれかのアミノ酸配列を含むことができる。
Figure 2011511778
Figure 2011511778
Figure 2011511778
一つの実施態様において、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含むペプチドは、クラス５ペプチドである。特定の実施態様において、ペプチドは、ＧＬＰ−１受容体において天然ＧＬＰ−１により達成される最大アゴニスト作用の少なくとも約５０％を示し、グルカゴン受容体において天然グルカゴンにより達成される最大反応の少なくとも約５０％の阻害を示す。別の特定の実施態様において、ペプチドは、ＧＬＰ−１受容体において天然ＧＬＰ−１により達成される最大アゴニスト作用の少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約１００％を示す。代替的に又は追加的に、ペプチドは、グルカゴン受容体において天然グルカゴンにより達成される最大反応の少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約１００％の阻害を示す。
幾つかの実施態様において、下記（１）〜（３）を含み、更に（４），（５）も含んでもよい、クラス５ペプチド又はその結合体が提供される：
（１）以下のものが含まれるが、これらに限定されない、グルカゴンアンタゴニスト活性を付与する修飾：
（ａ）場合により野生型グルカゴンのＮ末端から１〜５個のアミノ酸の欠失を伴ってもよい、ＰＬＡによる６位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のＰｈｅの置換、又は
（ｂ）場合により、グルタミン酸、ホモグルタミン酸若しくはシステインのスルホン酸誘導体による野生型グルカゴンの９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）のＡｓｐの置換を伴ってもよい、野生型グルカゴンのＮ末端からの２〜５個のアミノ酸の欠失；；
（２）以下のものが含まれるが、これらに限定されない、ＧＬＰ−１アゴニスト活性を付与する修飾：
（ａ）野生型グルカゴンのアミノ酸１２〜２９の範囲内、例えば１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４若しくは２９位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）の１、２、３、４つ若しくはそれ以上の位置でのα，α−二置換アミノ酸の挿入若しくは置換；又は
（ｂ）野生型グルカゴンのアミノ酸１２〜２９の範囲内の分子内架橋、例えば、塩架橋若しくはラクタム架橋若しくは別の種類の共有結合の導入；又は
（ｃ）ＧＬＰ−１の対応するアミノ酸による２、３、１７、１８、２１、２３若しくは２４位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）の１つ以上の位置でのアミノ酸の置換、例えば、Ｓｅｒ２のＡｌａでの置換、Ｇｌｎ３のＧｌｕでの置換、Ａｒｇ１７のＧｌｎでの置換、１８位のＡｒｇのＡｌａでの置換、２１位のＡｓｐのＧｌｕでの置換、２３位のＶａｌのＩｌｅでの置換、及び／若しくは、２４位のＧｌｎのＡｌａでの置換；又は
（ｄ）野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによるアミノ酸１２〜２９位の付近のアルファ−へリックス構造を安定化する他の修飾；そして；
（３）ＧＬＰ−１アゴニスト活性を強化する他の修飾、例えば、
（ａ）Ｃ末端カルボキシレートの代わりにＣ末端アミド又はエステル；
並びに、 （４）以下の修飾のうちの１つ以上：
（ａ）例えばＮ末端、若しくは６、１６、１７、２０、２１、２４、２９、４０位、若しくはＣ末端アミノ酸への、ポリエチレングリコールのような親水性部分の共有結合、及び／又は
（ｂ）アシル化若しくはアルキル化；並びに／或いは
（５）以下の追加的な修飾のうちの１つ以上：
（ａ）場合により、本明細書に記載されているように、ＤＰＰ−ＩＶ切断への耐性を改善する１又は２位での修飾を伴ってもよく、場合により、６位（野生型グルカゴンの番号付けによる）のＰＬＡへのエステル結合を介してでもよい、Ｎ末端へのアミノ酸の共有結合、例えばＮ末端への１〜５個のアミノ酸の共有結合；
（ｂ）２９位及び／又は２８位（野生型グルカゴンの番号付けによる）における、及び場合により２７位における、アミノ酸の欠失；
（ｃ）Ｃ末端へのアミノ酸の共有結合；
（ｄ）所望の活性を保持しながらの非保存的置換、保存的置換、付加又は欠失、例えば、２、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８又は２９位の１つ以上の位置での保存的置換、Ｖａｌ又はＰｈｅによる１０位のＴｙｒの置換、Ａｒｇによる１２位のＬｙｓの置換、Ａｌａによるこれらの位置の１つ以上での置換；
（ｅ）分解を低減しうる、例えばグルタミン酸、ホモグルタミン酸、システイン酸若しくはホモシステイン酸での置換による１５位のアスパラギン酸の修飾；又はＡｓｐ１５−Ｓｅｒ１６結合の切断による分解を同様に低減しうる、例えばトレオニン、ＡＩＢ、グルタミン酸での置換、若しくは４原子の長さの側鎖を有する別の負荷電アミノ酸での置換、代替的にはグルタミン、ホモグルタミン酸若しくはホモシステイン酸のいずれかでの置換による１６位のセリンの修飾；
（ｆ）酸化分解を低減するための、例えばロイシン又はノルロイシンでの置換による２７位のメチオニンの修飾；
（ｇ）Ｇｌｎの脱アミド化を介して生じる分解を低減するための、例えばＡｌａ又はＡＩＢでの置換による２０又は２４位のＧｌｎの修飾；
（ｈ）Ａｓｐの脱水により環状スクシンイミド中間体を形成し、続いて異性化によりイソアスパラギン酸塩を形成することにより生じる分解を低減するための、Ｇｌｕでの置換による２１位のＡｓｐの修飾；
（ｊ）本明細書に記載されているホモ二量体化又はヘテロ二量体化；及び
（ｋ）上記の組み合わせ。
同じ部類内の修飾のいずれかを一緒に組み合わせてもよいこと及び／又は異なる部類の修飾が組み合わされることが理解される。例えば、前記修飾の（１）（ａ）を（２）（ａ）及び（３）と組み合わせることができ；（１）（ａ）を、（２）（ｂ）（例えば、ラクタム架橋又は塩架橋）及び（３）と組み合わせることができ；（１）（ａ）を（２）（ｃ）及び（３）と組み合わせることができ；（１）（ｂ）を（２）（ａ）及び（３）と組み合わせることができ；（１）（ｂ）を（２）（ｂ）（例えば、ラクタム架橋又は塩架橋）及び（３）と組み合わせることができ；（１）（ｂ）を（２）（ｃ）及び（３）と組み合わせることができ；前述のいずれかを（４）（ａ）及び／又は（４）（ｂ）と組み合わせることができ；そして前述のいずれかを（５）（ａ）〜（５）（ｋ）のいずれかと組み合わせることができる。
例示的な実施態様において、α，α−二置換アミノ酸ＡＩＢは、１６、２０、２１又は２４位（野生型グルカゴンのアミノ酸番号付けによる）の１、２、３つ又は全ての位置で置換される。
例示的な実施態様において、分子内架橋は塩架橋である。
別の例示的な実施態様において、分子内架橋は、共有結合、例えばラクタム架橋である。幾つかの実施態様において、ラクタム架橋は、９位と１２位のアミノ酸、１２位と１６位のアミノ酸、１６位と２０位のアミノ酸、２０位と２４位のアミノ酸又は２４位と２８位のアミノ酸（配列番号１００１のアミノ酸番号付けによる）の間にある。例示的な実施態様において、６、１０、２０又は２４位、Ｎ末端、又はＣ末端（野生型グルカゴン（配列番号１００１）のアミノ酸番号付けによる）にアシル化又はアルキル化が存在する。
例示的な実施態様において、修飾には下記が含まれる：
（ｉ）システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸及びホモシステイン酸による１５位（配列番号１００１の番号付けによる）のＡｓｐの置換；
（ｉｉ）システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸及びホモシステイン酸による１６位（配列番号１００１の番号付けによる）のＳｅｒの置換；
（ｉｉｉ）荷電アミノ酸による２８位のＡｓｎの置換；
（ｉｖ）Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸及びホモシステイン酸からなる群より選択される荷電アミノ酸による２８位のＡｓｎの置換；
（ｖ）Ａｓｎ、Ａｓｐ又はＧｌｕによる２８位での置換；
（ｖｉ）Ａｓｐによる２８位での置換；
（ｖｉｉ）Ｇｌｕによる２８位での置換；
（ｖｉｉｉ）荷電アミノ酸による２９位のＴｈｒの置換；
（ｉｘ）Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸及びホモシステイン酸からなる群より選択される荷電アミノ酸による２９位のＴｈｒの置換；
（ｘ）Ａｓｎ、Ｇｌｕ又はＬｙｓによる２９位での置換；
（ｘｉｉ）Ｇｌｕによる２９位での置換；
（ｘｉｉ）２９位の後への１〜３個の荷電アミノ酸の挿入；
（ｘｉｉｉ）２９位の後へのＧｌｕ又はＬｙｓの挿入；
（ｘｉｖ）２９位の後へのＧｌｕ−Ｌｙｓ又はＬｙｓ−Ｌｙｓの挿入；或いは
これらの組み合わせ。
ＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性、グルカゴン受容体アンタゴニスト活性、ペプチド溶解性及び／又はペプチド安定性を増加するような、上記に記載された修飾のいずれかを、個別に又は組み合わせて適用することができる。
安定性を増強する修飾
一つの実施態様によると、本明細書に開示されているクラス５ペプチドを更に修飾して、クラス５ペプチドのカルボキシ末端アミノ酸（２４位）に結合している配列番号１０２１（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）又は配列番号１０５０のアミノ酸配列を含めることができ、これを個体に投与して、減量を誘導するか又は体重維持を支援することができる。より詳細には、クラス５ペプチドは、配列番号１００５、配列番号１００６、配列番号７、配列番号１００７、配列番号１００８、配列番号１００９、配列番号１０１２、配列番号１０１３、配列番号１０１４、配列番号１０１６、配列番号１０１７、配列番号１０１８、配列番号１０１９、配列番号１０２２、配列番号１０２３、配列番号１０２４及び配列番号１０２５からなる群より選択される配列を含み、ペプチド又はクラス５ペプチドのカルボキシ末端アミノ酸（２４位）に結合している配列番号１０２５（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）又は配列番号１０５０のアミノ酸配列を更に含み、食欲の抑制及び減量／体重維持の誘導に使用される。一つの実施態様において、投与されるペプチド又はクラス５ペプチドは、カルボキシ末端アミノ酸（２４位）に結合している配列番号１０２１（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）のアミノ酸配列を更に含むクラス５ペプチドであって、配列番号１０１６、配列番号１０１７、配列番号１０１８及び配列番号１０１９からなる群より選択される配列を含む。一つの実施態様において、本方法は、配列番号１０４５又は配列番号１０４６の配列を含むクラス５ペプチドを投与することを含む。
したがって、本明細書に開示されているクラス５ペプチドを同様に修飾して、水性緩衝剤における早期化学切断に対する感受性を減少できることが予想される。一つの実施態様によると、本明細書に記載されているクラス５ペプチドは、水溶液中の安定性を増強するために、天然グルカゴンの対応する１５位に配置されている天然アスパラギン酸アミノ酸を、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸及びホモシステイン酸からなる群より選択されるアミノ酸で置換することによって、更に修飾することができる。一つの実施態様によると、配列番号１００５、配列番号１００６、配列番号１００７又は配列番号１００８のクラス５ペプチドの１０位のアスパラギン酸残基を、システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸及びホモシステイン酸からなる群より選択されるアミノ酸で置換することができ、一つの実施態様において、配列番号１００５、配列番号１００６、配列番号１００７又は配列番号１００８の１０位の天然アスパラギン酸はグルタミン酸で置換される。一つの実施態様において、アンタゴニストが配列番号１００９の修飾配列を含み、修飾がＧｌｕによる配列番号１００９の１０位のＡｓｐの置換を含む、水溶液において改善された安定性を有するクラス５ペプチドが提供される。一つの実施態様において、クラス５ペプチドは、配列番号１０２２、配列番号１０２３、配列番号１０２４及び配列番号１０２５からなる群より選択される配列を含む。一つの実施態様において、クラス５ペプチドはアミド化されている。
天然グルカゴンの１５〜１６位のＡｓｐ−Ｓｅｒ配列は、水性緩衝剤において天然ホルモンの早過ぎる化学切断をもたらす特有の不安定ジペプチドとして同定されている。例えば、０．０１NのＨＣｌに３７℃で２週間維持されたとき、５０％を超える天然グルカゴンがフラグメントに切断されうる。２つの遊離切断ペプチド１−１５及び１６−２９は、グルカゴン様生物学的活性を欠いており、したがって、グルカゴン及び関連する類縁体の水性予備処方に対する制約となる。Ｇｌｕによる天然グルカゴンの１５位のＡｓｐの選択的化学置換は、１５−１６ペプチド結合の化学切断を実質的に排除することが観察されている。
更なる例示的な実施態様において、前述の任意の化合物を、安定性を改善するために、天然グルカゴンの１５又は１６位に対応するアミノ酸を修飾して特に酸性又はアルカリ性の緩衝剤におけるペプチドの経時的な分解を低減することによって、更に修飾することができる。
溶解性を増強する修飾
クラス５ペプチドを更に修飾して、生理学的ｐＨの水溶液におけるペプチドの溶解性を改善しながら、特定の態様において、同時に、グルカゴンアンタゴニスト及びＧＬＰ−１アゴニスト活性を保持することができる。配列番号１００５のペプチドの１２、１５、１６、１９及び２４位又は配列番号１００６のペプチドの１２、１６、１９若しくは２４位に対応する位置への親水性基の導入は、生理学的ｐＨを有する溶液における得られたペプチドの溶解性を改善しながら、同時に母体化合物のグルカゴンアンタゴニスト及びＧＬＰアゴニスト活性を保持することができる。したがって、一つの実施態様において、本開示のクラス５ペプチドは更に修飾されて、配列番号１００５又は配列番号１００６のペプチドの１２、１５、１６、１９及び２４位のアミノ酸に対応するアミノ酸の側鎖に共有結合している１つ以上の親水性基を含む。更なる実施態様において、配列番号１００５又は配列番号１００６の１６及び１９位のアミノ酸に対応するアミノ酸の側鎖は、親水性基に共有結合しており、一つの実施態様において、親水性基はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
クラス５グルカゴン関連類縁体ペプチドは、電荷をカルボキシ末端に導入してペプチドの溶解性を増強しながら、同時にペプチドのアゴニスト特性を保持するように修飾することができる。増強された溶解性は、ほぼ中性のｐＨでのグルカゴン溶液の調製及び保存を可能にする。比較的中性のｐＨ（例えば、約６．０〜約８．０のｐＨ）でのグルカゴン溶液の配合は、クラス5ペプチドの長期安定性を改善する。
出願人たちは、本明細書に開示されているクラス５ペプチドを同様に修飾して、比較的中性のｐＨ（例えば、約６．０〜約８．０のｐＨ）の水溶液における溶解性を増強しながら、幾つかの態様において、同時にグルカゴンアンタゴニスト及びＧＬＰ−１活性を保持できることを予測する。したがって、一つの実施態様は、野生型グルカゴン（配列番号1001）の６〜２９位に存在する天然アミノ酸に対して、荷電アミノ酸による天然非荷電アミノ酸の置換により又はカルボキシ末端への荷電アミノ酸の付加により、ペプチドに電荷を付加するように更に修飾されている、配列番号１００５、配列番号１００６、配列番号１００７又は配列番号１００８のグルカゴンアンタゴニスト／ＧＬＰ−１を対象とする。一つの実施態様によると、本明細書に開示されているクラス５ペプチドの１〜３個の非荷電天然アミノ酸は、荷電アミノ酸で置換されている。一つの実施態様において、荷電アミノ酸は、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸及びグルタミン酸からなる群より選択される。より詳細には、出願人たちは、荷電アミノ酸による（天然グルカゴンの）２８及び／若しくは２９位に対応する位置で通常生じるアミノ酸の置換、並びに／又はペプチドのカルボキシ末端への１〜２個の荷電アミノ酸の付加が、な生理学的なｐＨ（すなわち、約６．５〜約７．５のｐＨ）の水溶液におけるクラス５ペプチドの溶解性及び安定性を増強することを発見した。したがって、クラス５ペプチドのそのような修飾は、特に約５．５〜約８．０の範囲のｐＨの水溶液における溶解性に同様の効果を有すると同時に、母体ペプチドの生物学的活性を保持することが予測される。
一つの実施態様によると、配列番号１００５、配列番号１００６、配列番号１００７又は配列番号１００８のクラス５ペプチドは、負荷電アミノ酸（例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）によるこれらの配列の２３位及び／又は２４位の天然アミノ酸の置換、並びに場合によりペプチドのカルボキシ末端への負荷電アミノ酸（例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）の付加によって修飾される。代替的な実施態様において、配列番号１００５、配列番号１００６、配列番号１００７又は配列番号１００８のクラス５ペプチドは、正荷電アミノ酸（例えば、リシン、アルギニン又はヒスチジン）による配列番号１００５、配列番号１００６、配列番号１００７又は配列番号１００８の２４位の天然アミノ酸の置換、及び場合によりペプチドのカルボキシ末端への１又は２つの正荷電アミノ酸（例えば、リシン、アルギニン又はヒスチジン）の付加によって修飾される。一つの実施態様によると、配列番号１０１５又は配列番号１０５１のアミノ酸配列を含む類縁体であって、配列番号１０１５又は配列番号１０５１の２３又は２４位の少なくとも１個のアミノ酸が、酸性アミノ酸及び／又は配列番号１０１５若しくは配列番号１０５１のカルボキシ末端に付加されている追加の酸性アミノ酸で置換されている、改善された溶解性及び安定性を有するクラス５ペプチドが提供される。一つの実施態様において、酸性アミノ酸は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸及びホモシステイン酸からなる群より独立して選択される。
一つの実施態様によると、配列番号１０１６、配列番号１０１７、配列番号１０１８又は配列番号１０１９のアミノ酸配列を含むアンタゴニストであって、改善された溶解性及び安定性を有するクラス５ペプチドが提供される。一つの実施態様によると、配列番号１０１６又は配列番号１０１７の配列を含むグルカゴンアゴニストが提供される。一つの実施態様において、クラス５ペプチドは、配列番号１０２０の配列を含む。
一つの実施態様において、配列番号１０１５又は配列番号１０５１の配列を含むクラス５ペプチドが提供される。一つの実施態様において、配列番号１０１５又は配列番号１０５１の４位は、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、システイン酸又はホモシステイン酸であり、一つの実施態様において、４位は、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン酸又はホモシステイン酸であり、更なる実施態様において、配列番号１０１５又は配列番号１０５１の４位は、アスパラギン酸又はグルタミン酸であり、一つの実施態様において、配列番号１０１５又は配列番号１０５１の４位は、アスパラギン酸である。一つの実施態様において、配列番号１０１５の４位がアスパラギン酸であり、配列番号１０１５の１０位がグルタミン酸である、配列番号１０１５又は配列番号１０５１の配列を含むクラス５ペプチドが提供される。更なる実施態様において、配列番号１０１５又は配列番号１０５１のＣ末端アミノ酸は、天然カルボン酸基を、アミド又はエステルのような電荷中性基で置換するように修飾されている。
クラス５ペプチド融合体
一つの実施態様において、本明細書に記載されているクラス５ペプチドのカルボキシ末端アミノ酸は、配列番号１０２１、１０２６、１０２７及び１０５０からなる群より選択される配列を含む第２ペプチドに共有結合している。例えば、一つの実施態様において、配列番号１０１５、配列番号１０５１、配列番号１００５、配列番号１００６、配列番号１００７、配列番号１００８、配列番号１０１２、配列番号１０１３、配列番号１０１４、配列番号１０１６、配列番号１０１７、配列番号１０１８、配列番号１０１９、配列番号１０２２、配列番号１０２３、配列番号１０２４及び配列番号１０２５のそれぞれのクラス５ペプチドは、配列番号１０２１（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）、配列番号１０２６（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）、配列番号１０２７（ＫＲＮＲ）及び配列番号１０５０（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＸ）からなる群より選択される配列を含む第２ペプチドに共有結合している。
一つの実施態様において、カルボキシ末端アミノ酸に結合している配列番号１０２１（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）のアミノ酸配列を更に含む、配列番号１００５、配列番号１００６、配列番号１００７、配列番号１００８、配列番号１００９、配列番号１０２２、配列番号１０２３、配列番号１０２４及び配列番号１０２５からなる群より独立して選択される２つの配列を含むクラス５ペプチド二量体が提供される。
幾つかの態様において、クラス５ペプチドは、Ｃ末端の１又は２個のアミノ酸の切断又は欠失（すなわち、天然グルカゴンの２９位又は２８及び２９位のアミノ酸の切断）により更に修飾される。好ましくは、切断は、クラス５ペプチドの活性（例えば、グルカゴンアンタゴニスト作用／ＧＬＰ−１アゴニスト作用）に影響を与えない。
クラス５ペプチド結合体
グルカゴンペプチドが結合体部分に結合している、クラス５ペプチドの結合体も提供され、この結合は共有結合を介してでもよいし、リンカーを介してでもよい。
クラス５ペプチドがポリエチレングリコール鎖を含むこれらの実施態様において、ポリエチレン鎖は、直鎖の形態であってもよいし、分岐鎖であってもよい。一つの実施態様によると、ポリエチレングリコール鎖は、約５００〜約１０，０００ダルトンの範囲から選択される平均分子量を有する。一つの実施態様において、ポリエチレングリコール鎖は、約１，０００〜約５，０００ダルトンの範囲から選択される平均分子量を有する。一つの実施態様において、ポリエチレングリコール鎖は、約１，０００〜約５，０００ダルトンの範囲から選択される平均分子量を有する。一つの実施態様において、ポリエチレングリコール鎖は、約１，０００〜約２，０００ダルトンから選択される平均分子量を有する。一つの実施態様において、ポリエチレングリコール鎖は、約１，０００ダルトンの平均分子量を有する。
一つの実施態様において、ペグ化クラス５ペプチドは、配列番号１０１５又は配列番号１０５１の配列から構成されるペプチドを含み、ここでポリエチレングリコール鎖は、配列番号１０１５又は配列番号１０５１の１１、１２、１５、１６、１９及び２４位からなる群より選択されるアミノ酸に結合しており、ＰＥＧ鎖の分子量は、約１，０００〜約５，０００ダルトンである。一つの実施態様において、ペグ化クラス５ペプチドは、配列番号１０１５又は配列番号１０５１の配列から構成されるペプチドを含み、ここでポリエチレングリコール鎖は、配列番号１０１５又は配列番号１０５１の１６又は１９位のアミノ酸に結合しており、ＰＥＧ鎖の分子量は、約１，０００〜約５，０００ダルトンである。更なる実施態様において、修飾クラス５ペプチドは、ペプチドに共有結合している２つ以上のポリエチレン鎖を含み、ここでグルカゴン鎖の総分子量は、約１，０００〜約５，０００ダルトンである。一つの実施態様において、クラス５ペプチドは、配列番号１０１５又は配列番号１０５１の配列を含み、ここでポリエチレングリコール鎖は、配列番号１０１５又は配列番号１０５１の１６及び１９位のアミノ酸に結合しており、２つのＰＥＧ鎖の合計した分子量は、約１，０００〜約５，０００ダルトンである。
クラス５グルカゴン関連類縁体ペプチドは、配列番号1００１〜１１１８のアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含むことができ、更に、グルカゴンアンタゴニスト及びＧＬＰ−１アゴニスト活性を保持するような、１、２、３、４又は５個までの更なる修飾を有してもよい。
生体活性ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質に対するジペプチドの位置
プロドラッグジペプチドは、エステル結合を介して、生体活性ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の任意のアミノ酸に共有結合している。幾つかの実施態様において、ジペプチドは、生体活性ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の活性部位の一部であるアミノ酸又はヒドロキシル酸に結合している。
幾つかの実施態様において、ジペプチドは、生体活性ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の第１アミノ酸との間のエステル結合を介して、生体活性ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質に結合している。幾つかの態様において、ジペプチドは、生体活性ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の第１アミノ酸の側鎖に結合している一方、他の態様では、ジペプチドは、生体活性ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の第１アミノ酸のアルファ炭素にエステル結合を介して結合している。後者の場合において、生体活性ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の第１アミノ酸は、ＨＯ−アミノ酸である。より特定の態様において、生体活性ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の第１アミノ酸は、ＨＯ−Ｈｉｓ、ＨＯ−Ｔｙｒ、ＨＯ−Ｐｈｅ又はＨＯ−Ｐｈｅの誘導体である。
他の実施態様において、ジペプチドは、生体活性ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の最終アミノ酸との間のエステル結合を介して、生体活性ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質に結合している。幾つかの態様において、ジペプチドは、生体活性ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の最終アミノ酸の側鎖に結合している一方、他の態様では、ジペプチドは、生体活性ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の最終アミノ酸のアルファ炭素にエステル結合を介して結合している。後者の場合において、生体活性ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の最終アミノ酸は、天然のアルファカルボキシレート基がアルコール基で置換されているアミノアルコールである。
代替的な実施態様において、ジペプチドは、生体活性ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の内部アミノ酸残基に結合している。幾つかの実施態様において、内部アミノ酸は、側鎖ヒドロキシル基を含むアミノ酸、例えばＳｅｒ、Ｔｈｒである。
幾つかの実施態様において、生体活性ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質がグルカゴンである場合、ジペプチドは、グルカゴン（配列番号６１２）の２、５、７、８又は１１位に結合している。他の実施態様において、生体活性ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質がグルカゴンスーパーファミリーペプチド（例えば、グルカゴン関連類縁体ペプチド）である場合、ジペプチドは、グルカゴン（配列番号６１２）の２、５、７、８又は１１位に対応するグルカゴンスーパーファミリーペプチドの位置に結合している。グルカゴンの２、５、７、８又は１１位に対応するグルカゴンスーパーファミリーペプチドの位置は、グルカゴンスーパーファミリーペプチドのアミノ酸配列を天然グルカゴンのアミノ酸配列と整列させることによって決定することができる。例えば、図１８において、多数のグルカゴンスーパーファミリーペプチド配列がグルカゴン配列（配列番号６１２）と整列している。
幾つかの実施態様において、生体活性ペプチドがインスリンである場合、ジペプチドは、インスリンのＡ鎖の４若しくは２１位又はインスリンのＢ鎖の５若しくは９位に結合している。別の実施態様において、生体活性ペプチドがインスリンである場合、ジペプチドは、インスリンのＡ又はＢ鎖のＮ又はＣ末端アミノ酸に結合している。より特定の実施態様において、インスリンが配列番号６２６及び／又は配列番号６２８を含む場合、ジペプチドは、配列番号６２６の１、４若しくは２１位のアミノ酸又は配列番号６２８の１、５、１２若しくは２１位のアミノ酸に結合している。
他の生体活性ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質に関しては、生体活性ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の天然アミノ酸配列に存在するＳｅｒ又はＴｈｒ残基にエステル結合を介して結合しているジペプチドを含むような、生体活性ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質のプロドラッグ形態の活性レベルを試験することによって、ジペプチドが結合するべき位置を決定することができる。修飾された生体活性ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の活性レベルが、ジペプチドを含まない対応する生体活性ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の活性レベルの約１０％未満（例えば、約５％未満、約１％未満）である場合、ジペプチドが結合するＳｅｒ又はＴｈｒは、ジペプチドの結合には良好な位置であると確認される。
あるいは、生体活性ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を修飾して、天然アミノ酸をＳｅｒ又はＴｈｒで置換することができ、修飾された生体活性ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を活性について試験することができる。修飾された生体活性ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質が、未修飾の生体活性ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の活性と同様である、同一である又はそれ以上である場合、修飾された生体活性ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を、天然アミノ酸と置き換わったＳｅｒ又はＴｈｒに結合しているジペプチド部分を含むプロドラッグとして、活性について試験することができる。修飾された生体活性ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質のプロドラッグの活性レベルが、ジペプチドを含まない未修飾の生体活性ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の活性レベルの約１０％未満（例えば、約５％未満、約１％未満）である場合、ジペプチドが結合するＳｅｒ又はＴｈｒは、ジペプチドの結合には良好な位置であると確認される。
プロドラッグジペプチド部分
本明細書に記載されているプロドラッグのジペプチドは、生理学的条件下（例えば、酵素又は追加の化学薬品の不在下）でＰＢＳ中でジケトピペリジン（ＤＫＰ）又はジケトモルホリン（ＤＭＰ）を形成することができる、２個の共有結合したアミノ酸同士、又は共有結合したヒドロキシル酸とアミノ酸の任意の組み合わせである。ＤＫＰ又はＤＭＰの形成は、ジペプチドと生体活性ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質との間のエステル結合の切断をもたらす。ジペプチドの構造は、ＤＫＰ又はＤＭＰ形成の傾向を決定し、したがって生体活性ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質からのジペプチドの切断速度を決定する。幾つかの態様において、ジペプチドは構造Ａ−Ｂを含み、ここで、Ａは、Ｂに共有結合しているヒドロキシル酸又はアミノ酸であり、Ｂは、エステル結合を介して生体活性ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質に結合しているアミノ酸である。
幾つかの実施態様において、Ａ及びＢは、それぞれアミノ酸又はヒドロキシル酸のＬ立体異性体であり、この場合、ＤＫＰ又はＤＭＰの形成は、ジペプチジルがＬ立体異性体及びＤ立体異性体を含む場合よりも遅くなる。
幾つかの態様において、Ａ及びＢは、それぞれ立体障害又は嵩高の側鎖を含み、それらの例として、（ｉ）式ＶＩＩ：
Figure 2011511778
 〔式中、Ｘ及びＹは、それぞれ、Ｃ、Ｏ、Ｓ又はＮからなる群より独立して選択され、そしてＲ１５及びＲ１６は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、（Ｃ２〜Ｃ１８アルキル）ＯＨ、（Ｃ２〜Ｃ１８アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ２〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ２〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ２〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２＋）ＮＨ２（Ｃ４〜Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ１７及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より独立して選択され、ここでＲ１７は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、ＮＨ２又はＯＨである〕で示される構造を含む分岐側鎖；並びに
（ｉｉ）芳香族アミノ酸の側鎖（例えば、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ）、が挙げられる。そのような側鎖の存在は、生体活性ペプチドからの切断速度、及びＤＫＰ又はＤＭＰ形成速度を低減する。
他の実施態様において、ＡもＢも、立体障害又は嵩高の側鎖を含まない。そのような側鎖の不在は、生体活性ペプチドからの切断速度及びＤＫＰ又はＤＭＰ形成速度を低減する。
更に他の実施態様において、Ａ又はＢの一方は、切断の中間的な速度、及びＤＫＰ又はＤＭＰ形成の中間的な速度をもたらすような立体障害又は嵩高の側鎖を含む。本明細書に記載されているプロドラッグの具体的なジペプチド部分としては、表４及び５、並びに下記の例示的なプロドラッグ実施態様で本明細書において示されている任意のジペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
例示的なプロドラッグ実施態様
幾つかの実施態様において、プロドラッグは、一般構造Ａ−Ｂ−Ｑを含み、ここで、Ａは、Ｂに共有結合しているヒドロキシル酸又はアミノ酸であり、Ｂは、エステル結合を介してＱに共有結合しているアミノ酸であり、そしてＱは、生体活性ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質、例えばグルカゴンスーパーファミリーペプチド（例えば、グルカゴン関連類縁体ペプチド）であり、ＱからのＡ−Ｂの化学切断半減期（ｔ１／２）は、生理学的条件下、ＰＢＳ中で約１週間以下である。
Ａ−Ｂは、あらゆる酵素と無関係な方法によりＱから切断される。したがって、生理学的条件下でのＰＢＳにおけるＱからのＡ−Ｂのｔ１／２は、生理学的条件下でのＤＰＰ−ＩＶプロテアーゼを含む溶液におけるＱからのＡ−Ｂのｔ１／２と有意に異なっていない。ＤＰＰ−ＩＶプロテアーゼを含む溶液は、例えば血清であることができる。幾つかの態様において、生理学的条件下でのＰＢＳにおけるＱからのＡ−Ｂのｔ１／２は、生理学的条件下でのＤＰＰ−ＩＶプロテアーゼを含む溶液におけるＱからのＡ−Ｂのｔ１／２の２倍以下である。
生理学的条件下でのＰＢＳにおけるＱからのＡ−Ｂのｔ１／２は、幾つかの態様において、約２４時間以下であり、例えば、約１〜約２時間、約５時間以下、約８時間以下、約１２時間以下、約１６時間以下、約２０時間以下である。
幾つかの態様において、生理学的条件下でのＰＢＳにおけるＱからのＡ−Ｂのｔ１／２は、約１．５時間未満である。これらの場合において、Ａの側鎖もＢの側鎖も、式ＶＩＩ：
Figure 2011511778
 〔式中、Ｘ及びＹは、それぞれ、Ｃ、Ｏ、Ｓ又はＮからなる群より独立して選択され、そしてＲ１５及びＲ１６は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、（Ｃ２〜Ｃ１８アルキル）ＯＨ、（Ｃ２〜Ｃ１８アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ２〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ２〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ２〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２＋）ＮＨ２（Ｃ４〜Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ１７及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より独立して選択され、ここでＲ１７は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、ＮＨ２又はＯＨである〕で示される構造を含まず、
Ｂは、場合により、芳香族アミノ酸であってもよく、
Ａ又はＢは、場合により、二置換アミノ酸、例えばＡＩＢであってもよい。
幾つかの態様において、生理学的条件下でのＰＢＳにおけるＱからのＡ−Ｂのｔ１／２が約１．５時間未満である場合、Ａは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｈｉｓ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、二置換アミノ酸（例えば、ＡＩＢ）若しくはヒドロキシル酸又は前記のいずれかのＤ立体異性体からなる群より選択され、
Ｂは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ｈｉｓ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、二置換アミノ酸（例えば、ＡＩＢ）、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ又は前記のいずれかのＤ立体異性体からなる群より選択される。
幾つかの実施態様において、Ａ及びＢは、それぞれ下記構造：
−ＣＨ２−Ｘ−Ｒ１
〔式中、Ｘは、Ｃ、Ｏ、Ｓ又はＮであり、Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、（Ｃ２〜Ｃ１８アルキル）ＯＨ、（Ｃ２〜Ｃ１８アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ２〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ２〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ２〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２＋）ＮＨ２（Ｃ４〜Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ９及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）であり、ここでＲ９は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、ＮＨ２又はＯＨである〕で示される側鎖を含む。
更に他の実施態様において、Ａ及びＢの一方又は両方は、側鎖（例えば、上記に記載されている）及びＣ１〜Ｃ１８アルキルによる第２置換を含む二置換アミノ酸である。
他の実施態様において、ＱからのＡ−Ｂのｔ１／２は、約１．５時間から約２４時間である。そのような場合、（ｉ）Ａ及びＢの一方のみが、式ＶＩＩ：
Figure 2011511778
 〔式中、Ｘ及びＹは、それぞれ、Ｃ、Ｏ、Ｓ又はＮからなる群より独立して選択され、そしてＲ１５及びＲ１６は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、（Ｃ２〜Ｃ１８アルキル）ＯＨ、（Ｃ２〜Ｃ１８アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ２〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ２〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ２〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２＋）ＮＨ２（Ｃ４〜Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ１７及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より独立して選択され、ここでＲ１７は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、ＮＨ２又はＯＨである〕で示される分岐側鎖を含み、Ａ及びＢの他方は、芳香族アミノ酸ではないか、（ｉｉ）Ａのみが芳香族アミノ酸であるか、或いは、（ｉｉｉ）Ａ及びＢは、それぞれ芳香族アミノ酸であり、一方はＤアミノ酸であり、他方はＬアミノ酸である。特定の実施態様において、Ｂは、分岐側鎖を含む。
更に他の実施態様において、生理学的条件下でのＰＢＳにおけるＱからのＡ−Ｂのｔ１／２は、１週間未満であるが約２４時間を超え、例えば、約３６時間を超える、約４８時間を超える、約７２時間を超える、約９６時間を超える、約１２０時間を超える、約１５０時間を超える。そのような場合、Ａ及びＢは、それぞれ独立して、芳香族アミノ酸であるか、又は、式ＶＩＩ：
Figure 2011511778
 〔式中、Ｘは、Ｃ、Ｏ、Ｓ又はＮであり、Ｒ１５及びＲ１６は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、（Ｃ２〜Ｃ１８アルキル）ＯＨ、（Ｃ２〜Ｃ１８アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ２〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ２〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ２〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２＋）ＮＨ２（Ｃ４〜Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ１７及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）であり、ここでＲ１７は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、ＮＨ２又はＯＨである〕で示される分岐側鎖を含み、Ａ及びＢが両方とも芳香族アミノ酸である場合、両方ともＬアミノ酸である。
幾つかの態様において、Ａ−Ｂは、ＢとＱの第１アミノ酸との間のエステル結合を介してＱに結合している。幾つかの態様において、Ａ−Ｂは、Ｑの第１アミノ酸の側鎖に結合しており、他の態様においてＡ−Ｂは、Ｑの１アミノ酸のアルファ炭素にエステル結合を介して結合している。後者の場合では、Ｑの第１アミノ酸はＨＯ−アミノ酸である。より特定の態様において、Ｑの第１アミノ酸は、ＨＯ−Ｈｉｓ、ＨＯ−Ｔｙｒ、ＨＯ−Ｐｈｅ又はＨＯ−Ｐｈｅの誘導体である。
他の実施態様において、Ａ−Ｂは、ＢとＱの最終アミノ酸との間のエステル結合を介してＱに結合している。幾つかの態様において、Ａ−Ｂは、Ｑの最終アミノ酸の側鎖に結合しており、他の態様において、Ａ−Ｂは、Ｑの最終アミノ酸のアルファ炭素にエステル結合を介して結合している。後者の場合において、Ｑの最終アミノ酸は、天然のアルファカルボキシレート基がアルコール基で置換されているアミノアルコールである。
更に他の実施態様において、Ａ−Ｂは、ＢとＱの内部アミノ酸との間のエステル結合を介してＱに結合している。より特定の態様において、Ｑの内部アミノ酸は、２、５、７、８又は１１位（天然グルカゴン（配列番号６１２）のアミノ酸番号付けによる）に配置されている。幾つかの態様において、Ｑの内部アミノ酸は、ヒドロキシル基（例えばＳｅｒ、Ｔｈｒ）を含む側鎖を含むアミノ酸である。
一つの実施態様において、一般構造Ａ−Ｂ−Ｑを有する複合体を含む注射用デポ組成物が提供され、ここで、
Ａは、アミノ酸又はヒドロキシル酸であり、
Ｂは、エステル結合を介してＱに共有結合しているアミノ酸であり、そしてＱは、生体活性ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質であって、例えばグルカゴン関連類縁体ペプチドのようなグルカゴンスーパーファミリーペプチドであり、ジペプチドＡ−Ｂは、更に、Ａ又はＢに結合しているデポ・ポリマーを含む。ジペプチドＡ−Ｂは、Ｑからの所望の非酵素的自己切断半減期をもたらす、本出願において既に記載されている任意の構造を含むことができ、ここでジペプチド構造は、デポ・ポリマーへの結合により更に修飾される。デポ・ポリマーとしては、複合体Ａ−Ｂ−Ｑが注射部位において有効に捕捉されるのに十分な大きさであるか、そうでなければその標的（例えば、受容体）と相互作用することができないようなものが選択される。一つの実施態様において、デポ・ポリマーは、Ａ及び／又はＢの側鎖に結合している。この実施例における使用に適したデポ・ポリマーには、例えば、本明細書の１６４〜１６６頁（英文）に提供されている式ＸＩの化合物について開示されている任意のポリマー、並びに当業者に既知の他の生体適合性ポリマーが含まれる。
ＱからのＡ−Ｂの化学切断は、ジケトピペラジン又はジケトモルホリンを産生し、活性な生体活性ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を、投与後に所定の持続時間にわたって制御された方法で患者に放出する。一つの実施態様によると、例えばヒドロキシルを有するセリン若しくはトレオニン残基の側鎖又はＮ末端ヒドロキシル化アミノ酸（ＨＯ−アミノ酸）のヒドロキシル基を含む、生体活性ペプチド又はタンパク質（Ｑ）の脂肪族ヒドロキシル基は、下記：
Figure 2011511778
 で示されるジペプチド（Ａ−Ｂ）の、エステル結合を介した生体活性ポリペプチドへの共有結合により修飾されており、式中、Ｒ１及びＲ２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２＋）ＮＨ２、（Ｃ４〜Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ１７及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より独立して選択され、Ｒ１７は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、ＯＨ又はＮＨ２であり、そしてＲ５は、ＯＨ又はＮＨ２であり、ジペプチド（Ａ−Ｂ）は更に修飾されて、ジペプチドに共有結合しているデポ・ポリマーを含む。ジペプチドを含むデポ・ポリマーは、生体活性ペプチド又はタンパク質の任意の脂肪族ヒドロキシル基、例えば、ヒドロキシルを有するセリン若しくはトレオニン残基の側鎖又はペプチドの末端に配置されているヒドロキシル酸のヒドロキシル基などを介して、生体活性ペプチド又はタンパク質に結合することができる。一つの実施態様において、Ｒ１及びＲ２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、（Ｃ２〜Ｃ１８アルキル）ＯＨ、（Ｃ２〜Ｃ１８アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ２〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ２〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ２〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２＋）ＮＨ２（Ｃ４〜Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ１７及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より独立して選択され、ここでＲ１７は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、ＮＨ２又はＯＨであり、デポ・ポリマーは、Ｒ１及び／又はＲ２置換基の一方を介して共有結合している。一つの実施態様において、生体活性ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質は、グルカゴンスーパーファミリーペプチド又はグルカゴン関連類縁体ペプチドである。一つの実施態様において、２つ以上のデポ・ポリマーが、単一のジペプチド要素に結合している。
デポ・ポリマーとしては、生体適合性であって、ジペプチド／デポ・ポリマー複合体の共有結合により修飾されている生体活性ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質が注射部位において捕捉されたままであるのに十分な大きさであるような、及び／又は患者に投与されたときに対応する受容体と相互作用することができないようなものが選択される。続くジペプチドの切断は、意図される標的と相互作用する生体活性ペプチドを放出する。ジペプチド要素に対する異なる組み合わせの置換を選択することは、所望の時間の間にわたって生体活性ペプチドを個別に放出するジペプチド／生体活性ペプチド複合体の混合物を含む、注射用組成物の調製を可能にする。一つの実施態様において、１つ以上のデポ・ポリマーが、直接的に、又はリンカーを介して間接的に、Ａ及び／又はＢに共有結合している。一つの実施態様において、１つ以上のデポ・ポリマーは、Ａ又はＢと、高親和性結合によって（Ａ若しくはＢとの直接的な相互作用を介して又はＡ若しくはＢに共有結合している結合部分を介して）非共有結合的に結合している。例えば、一つの実施態様において、デポ・ポリマーは、共有結合Ｃ１６又はＣ１８アシル又はアルキル基への結合を介してＡ又はＢの側鎖に間接的に結合している。ＱからのＡ−Ｂの化学切断は、ジケトピペラジン又はジケトモルホリンを産生し、活性な生体活性ペプチドを、投与後に所定の持続時間にわたって制御された方法で放出して患者の全身に分布し（これらの実施態様では、最初の複合体は最初に捕捉されている）、活性な生体活性ペプチドがその標的リガンドと相互作用することを可能にする。
一つの実施態様において、複数の異なるジペプチド／生体活性ペプチド複合体を含み、ジペプチド／生体活性ペプチド複合体がジペプチド部分の構造に基づいて互いに異なっている、注射用組成物が提供される。一つの実施態様によると、ジペプチド／生体活性ペプチド複合体は、Ａ又はＢに結合しているデポ・ポリマーを有する一般構造Ａ−Ｂ−Ｑ（直ぐ上に定義されている）の化合物を含み、ここでジペプチド／生体活性ペプチド複合体は、Ａ及び／又はＢの置換基に基づいて互いに異なっている。この方法では、生体活性ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質（Ｑ）が個別の異なる複合体の切断速度に基づいて長時間にわたって制御された方法で放出される、注射用組成物を提供することができる。一つの実施態様によると、遊離形態の生体活性ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質（Ｑ）と、ジペプチド要素に共有結合している生体活性ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質（Ｑ）との混合物を含む、組成物が提供される。この方法では、投与された組成物には、遊離形態の活性な生体活性ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質が存在するために、即座の治療効果を有する。加えて、ジペプチドがＡ−Ｂ−Ｑ複合体から切断され、活性な追加的生体活性ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質（Ｑ）を、組成物の最初の投与後の所定の時間間隔で放出するので、延長された又は遅延された生物学的効果も生じる。
一つの実施態様によると、デポ・ポリマーは、当業者に既知の生体適合性ポリマーから選択される。デポ・ポリマーは、典型的には、約２０，０００〜１２０，０００ダルトンの範囲から選択される大きさを有する。一つの実施態様において、デポ・ポリマーは、約４０，０００〜１００，０００又は約４０，０００〜８０，０００ダルトンの範囲から選択される大きさを有する。一つの実施態様において、デポ・ポリマーは、約４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００又は８０，０００ダルトンの大きさを有する。適切なデポ・ポリマーには、デキストラン、ポリラクチド、ポリグリコリド、カプロラクトンに基づいたポリマー、ポリ（カプロラクトン）、ポリ無水物、ポリアミン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリジオキサノン、ポリアセタール、ポリケタール、ポリカーボネート、ポリホスホエステル、ポリエステル、ポリブチレンテレフタレート、ポリオルトカーボネート、ポリホスファゼン、スクシネート、ポリ（リンゴ酸）、ポリ（アミノ酸）、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリヒドロキシセルロース、多糖類、キチン、キトサン、ヒアルロン酸及びコポリマー、ターポリマー及びそれらの混合物、並びにカプロラクトンに基づいたポリマーを含む、生分解性ポリマー及びそれらのコポリマー、プロブチレンテレフタレートを含む、ポリカプロラクトン及びそのコポリマーが含まれるが、これらに限定されない。一つの実施態様において、デポ・ポリマーは、ポリエチレングリコール、デキストラン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸及び乳酸とグリコール酸のコポリマーからなる群より選択され、一つの特定実施態様において、デポ・ポリマーはポリエチレングリコールである。一つの実施態様において、ジペプチド要素に結合しているデポ・ポリマーの合計した分子量は、約４０，０００〜８０，０００ダルトンであり、一つの実施態様において、デポ・ポリマーはポリエチレングリコールである。
一つの実施態様によると、デポ・ポリマーは、ジペプチド「Ａ−Ｂ」の２個のアミノ酸の一方の側鎖（又はジペプチドの「Ａ」の位置に存在するヒドロキシル酸の側鎖）に結合している。一つの実施態様において、ジペプチドＡ−Ｂは、システイン又はリシン残基を含んで、デポ・ポリマーの結合を容易にする反応性基を提供する。一つの実施態様において、ジペプチドＡ−Ｂは、４０，０００〜８０，０００ダルトンの範囲から選択される分子量を有するポリエチレングリコールがリシン又はシステイン側鎖に共有結合している、リシン又はシステインを含む。
幾つかの実施態様において、Ｑはグルカゴンスーパーファミリーペプチドである。より特定の態様において、Ｑは、本明細書に記載されているいずれかのようなグルカゴン関連類縁体ペプチドである。
一つの実施態様によると、下記の基：
Figure 2011511778
 が、Ａ鎖のＡ１、Ａ４若しくはＡ２１又はＢ鎖のＢ５、Ｂ９、Ｂ１６若しくはＢ２５から選択される位置で共有結合している、インスリンのプロドラッグ誘導体が提供される。一つの実施態様において、インスリンプロドラッグは、配列番号６１３のＡ鎖及び配列番号６１４のＢ鎖を含み、Ａ鎖のＡ４若しくはＡ２１又はＢ鎖のＢ５、Ｂ９から選択される位置のアミノ酸は、下記の構造：
Figure 2011511778
 を有する修飾アミノ酸で置換されているか、或いはＢ１６又はＢ２５の位置のアミノ酸は、下記の構造：
Figure 2011511778
 を有する修飾アミノ酸で置換されており、
式中、Ｒ１０は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル及び（ＣＨ２）ｎ（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）からなる群より選択され、Ｗは、Ｃ６〜Ｃ１０アリール又は結合であり、ｎは、０〜３の整数であり、
Ｒ１２は、下記：
Figure 2011511778
 であり、
Ｒ１及びＲ２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２＋）ＮＨ２、（Ｃ４〜Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ９及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より独立して選択され、
Ｒ５は、ＯＨ又はＮＨ２であり、そしてＲ９は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、ＮＨ２又はＯＨである。一つの実施態様において、Ｒ１は、ＣＨ２（ＣＨ３）２、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より選択され、Ｒ２は、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より選択される。一つの実施態様において、インスリンプロドラッグは、Ａ５、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１２、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８、Ａ２１、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１３、Ｂ１４、Ｂ１７、Ｂ２０、Ｂ２１、Ｂ２２、Ｂ２３、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９及びＢ３０から選択される位置で１個以上の追加のアミノ酸置換を更に含み、一つの実施態様において、これらのアミノ酸置換は保存的アミノ酸置換である。インスリンの所望の活性に悪影響を与えないこれらの位置での適切なアミノ酸置換は、同業者に知られており、例えば、Mayer, et al., Insulin Structure and Function, Biopolymers. 2007;88(5):687-713において示されており、この開示は参照として本明細書に組み込まれる。一つの実施態様において、インスリンプロドラッグは、Ａ５、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１２、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ１３、Ｂ１４、Ｂ１７、Ｂ２０、Ｂ２１、Ｂ２２、Ｂ２３、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９及びＢ３０から選択される位置で１〜３個のアミノ酸置換を含む。一つの実施態様において、インスリンプロドラッグは、天然インスリンＢペプチドのＢ１〜５及びＢ２６〜３０の位置のアミノ酸の１個以上の欠失により、別の実施態様では、アミノ酸Ｂ１〜５及び／又はＢ２６〜３０の欠失により、天然インスリン配列に対して更に修飾されている。一つの実施態様において、Ａ８のアミノ酸は、ヒスチジン、アルギニン及びリシンからなる群より選択されるアミノ酸である。更なる実施態様において、Ｂ１０のアミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸及びシステイン酸からなる群より選択されるアミノ酸である。
一つの実施態様によると、Ａ鎖及びＢ鎖を含むインスリンプロドラッグが提供され、ここで、Ａ鎖は配列番号６２６の配列を含み、Ｂ鎖は配列番号６２８の配列を含み、更に、下記の一般構造：
Figure 2011511778
 のジペプチドが、エステル結合を介して、Ａ１、Ａ４、Ａ２１、Ｂ５、Ｂ９、Ｂ１６又はＢ２５位（配列番号６１３及び配列番号６１４それぞれの天然Ａ鎖及びＢ鎖配列による）のアミノ酸に結合しており、式中、Ｒ１及びＲ２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２＋）ＮＨ２、（Ｃ４〜Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ９及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より独立して選択され、Ｒ５は、ＯＨ又はＮＨ２であり、そしてＲ９は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、ＮＨ２又はＯＨである。一つの実施態様において、Ｒ１は、ＣＨ２（ＣＨ３）２、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より選択され、Ｒ２は、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より選択される。一つの実施態様において、Ｒ１は、ＣＨ２（ＣＨ３）２、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より選択され、Ｒ２は、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より選択される。更なる実施態様において、インスリンプロドラッグは、配列番号６２６又は配列番号６２８の配列に対して１〜６個又は１〜３個のアミノ酸置換を更に含む。一つの実施態様において、インスリンプロドラッグのＢ鎖は、配列番号６２７の配列を含む。
一つの実施態様において、インスリンプロドラッグは、Ｘ５ＩＶＸ６ＱＣＣＸ７ＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＸ８（配列番号６２６）及びＸ１３ＬＣＧＸ９Ｘ１０ＬＶＥＡＬＸ１１ＬＶＣＧＥＲＧＦＸ１２（配列番号６２８）の配列を含み、ここで、Ｘ６はグルタミン酸であり、Ｘ７は、トレオニン、ヒスチジン、アルギニン及びリシンからなる群より選択され、Ｘ８は、アスパラギン又はグリシンであり、Ｘ９はセリンであり、Ｘ１０は、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸及びシステイン酸からなる群より選択され、Ｘ１１及びＸ１２は、両方ともチロシンであり、Ｘ１３はヒスチジンであり、そしてＸ５は、下記構造：
Figure 2011511778
 を有し、式中、Ｒ１は、ＣＨ２（ＣＨ３）２、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より選択され、Ｒ２は、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より選択され、そしてＲ５は、ＯＨ又はＮＨ２である。代替的な実施態様において、インスリンプロドラッグは、Ｘ５ＩＶＸ６ＱＣＣＸ７ＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＸ８（配列番号６２６）及びＸ１３ＬＣＧＸ９Ｘ１０ＬＶＥＡＬＸ１１ＬＶＣＧＥＲＧＦＸ１２（配列番号６２８）の配列を含み、ここで、Ｘ５はグリシンであり、Ｘ７は、トレオニン、ヒスチジン、アルギニン及びリシンからなる群より選択され、Ｘ１０は、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸及びシステイン酸からなる群より選択され、Ｘ１１及びＸ１２は、両方ともチロシンであり、Ｘ６、Ｘ８、Ｘ９又はＸ１３の１つは、下記構造：
Figure 2011511778
 を有し、式中、Ｒ１０は、Ｈ又はＣＨ３からなる群より選択され、ｎは、０又は３であり、Ｒ１は、ＣＨ２（ＣＨ３）２、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より選択され、Ｒ２は、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より選択され、そしてＲ５は、ＯＨ又はＮＨ２である。一つの実施態様において、ｎは０であり、そしてＲ１０はＨである。
代替的な実施態様において、インスリンプロドラッグは、Ｘ５ＩＶＸ６ＱＣＣＸ７ＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＸ８（配列番号６２６）及びＸ１３ＬＣＧＸ９Ｘ１０ＬＶＥＡＬＸ１１ＬＶＣＧＥＲＧＦＸ１２（配列番号６２８）の配列を含み、ここで、Ｘ５はグリシンであり、Ｘ６はグルタミン酸であり、Ｘ７は、トレオニン、ヒスチジン、アルギニン及びリシンからなる群より選択され、Ｘ８は、アスパラギン又はグリシンであり、Ｘ９はセリンであり、Ｘ１０は、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸及びシステイン酸からなる群より選択され、Ｘ１３はヒスチジンであり、Ｘ１１及びＸ１２の一方は、チロシン又はフェニルアラニンであり、他方は、下記構造：
Figure 2011511778
 を有し、式中、Ｒ１は、ＣＨ２（ＣＨ３）２、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より選択され、Ｒ２は、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より選択され、そしてＲ５は、ＯＨ又はＮＨ２である。
一つの実施態様によると、下記の基：
Figure 2011511778
 が、グルカゴン又はＧＬＰ−１ペプチドの１、２、５、７、８又は１１から選択される位置で共有結合している、グルカゴン又はＧＬＰ−１のプロドラッグ誘導体が提供される。一つの実施態様において、グルカゴン又はＧＬＰ−１プロドラッグの２、５、７、８又は１１位のアミノ酸は、下記構造：
Figure 2011511778
 を有するアミノ酸を含み、
式中、Ｒ１０は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル及び（ＣＨ２）ｎ（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）からなる群より選択され、ｎは、０〜３の整数であり、
Ｒ１２は、下記：
Figure 2011511778
 であり、
Ｒ１及びＲ２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２＋）ＮＨ２、（Ｃ４〜Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ９及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より独立して選択され、
Ｒ５は、ＯＨ又はＮＨ２であり、そしてＲ９は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、ＮＨ２又はＯＨである。一つの実施態様において、Ｒ１は、ＣＨ２（ＣＨ３）２、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より選択され、Ｒ２は、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より選択される。一つの実施態様において、グルカゴン及びＧＬＰ−１プロドラッグは、天然配列に対して、１、２、５、８、１０、１２、１３、１４、１６、１７、１８、２４、２８及び２９位からなる群より選択される１個以上のアミノ酸置換を更に含む。
一つの実施態様において、配列番号６１２の誘導体を含むグルカゴンプロドラッグが提供され、ここで、誘導体は、１、２、５、７、８、１０、１２、１３、１４、１６、１７、１８、２４、２８及び２９位から選択される位置での１〜６個又は１〜３個のアミノ酸置換より配列番号６１２と異なっており、下記の基：
Figure 2011511778
 が、グルカゴンペプチドの１、２、５、７、８又は１１から選択される位置で共有結合しており、式中、Ｒ１は、ＣＨ２（ＣＨ３）２、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より選択され、Ｒ２は、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より選択され、そしてＲ５は、ＯＨ又はＮＨ２である。
一つの実施態様において、配列番号６２９の誘導体を含むＧＬＰ−１プロドラッグが提供され、ここで、誘導体は、１、２、３、５、８、１０、１２、１３、１４、１６、１７、１８、２４、２８及び２９位から選択される位置での１〜６個又は１〜３個のアミノ酸置換より配列番号６２９と異なっており、下記の基：
Figure 2011511778
 が、グルカゴンペプチドの１、２、５、７、８又は１１から選択される位置で共有結合しており、式中、Ｒ１は、ＣＨ２（ＣＨ３）２、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より選択され、Ｒ２は、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より選択され、そしてＲ５は、ＯＨ又はＮＨ２である。
一つの実施態様において、グルカゴン及びＧＬＰ−１誘導体は、１、２及び１６位の１つ以上での置換により天然ペプチドと異なっているアミノ酸配列を含む。一つの実施態様において、グルカゴン及びＧＬＰ−１誘導体は、１６位での置換により天然ペプチドと異なっているアミノ酸配列を含み、ここで置換しているアミノ酸は、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸又はホモシステイン酸からなる群より選択される。更なる実施態様において、グルカゴン及びＧＬＰ−１誘導体は、１、２及び／又は１６位での置換により天然ペプチドと異なっているアミノ酸配列を含み、ここで、１位での置換は、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン及びホモ−ヒスチジンからなる群より選択され、２位での置換は、Ｄ−セリン、アラニン、グリシン、Ｎ−メチルセリン及びアミノイソ酪酸からなる群より選択される。
一つの実施態様によると、ＧＬＰ−１又はグルカゴンのプロドラッグ類縁体が提供され、ここで、プロドラッグは、下記の一般構造：

Ｒ３−Ｙ−Ｒ４
で示されるポリペプチドを含み、
式中、Ｙは、下記：
Figure 2011511778
 からなる群より選択される構造であり、
ｎは、０〜３から選択される整数であり、ｍは、１〜４から選択される整数であり、Ｒ３は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｇ−（配列番号６２１）又は下記：
Figure 2011511778
 からなる群より選択されるアミノ酸配列であり、
Ｘ１は、ヒスチジン、ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモ−ヒスチジン、チロシン及びフェニルアラニンからなる群より選択され、Ｘ２は、グリシン、アラニン、セリン、バリン、Ｄ−アラニン、アミノイソ酪酸、Ｎ−メチルアラニン、並びに同様の大きさの天然及び合成アミノ酸からなる群より選択され、Ｘ３は、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン及びアスパラギンからなる群より選択され、Ｘ４は、デスアミノヒスチジン、デスアミノホモ−ヒスチジン、デスアミノチロシン及びデスアミノフェニルアラニンからなる群より選択され、
Ｒ４は、（配列番号６１５）、（配列番号６１６）、（配列番号６１７）、（配列番号６１８）及び（配列番号６１９）からなる群より選択されるアミノ酸配列であり、
配列番号６１５〜６１９の１１位のＸは、セリン、グリシン、グルタミン酸、グルタミン、ホモグルタミン酸又はホモシステイン酸であり、
Ｒ５は、ＮＨ２又はＨＯであり、
Ｒ６は、Ｈであるか、又は下記：
Figure 2011511778
 であり、
Ｒ１及びＲ２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より独立して選択され、そしてＲ５は、ＯＨ又はＮＨ２であるが、但し、Ｒ３が下記：
Figure 2011511778
 である場合、Ｒ６はＨであり、Ｒ６が下記：
Figure 2011511778
 である場合、Ｒ３はＸ１Ｘ２Ｘ３Ｇ−（配列番号６２１）であり、更に、Ｒ６がＨである場合、Ｒ３は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｇ−（配列番号６２１）ではない。一つの実施態様において、Ｒ１は、ＣＨ２（ＣＨ３）２、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より選択され、Ｒ２は、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）からなる群より選択され、そしてＲ５は、ＯＨ又はＮＨ２である。
一つの実施態様によると、グルカゴン又はＧＬＰ−１のプロドラッグが提供され、ここで、プロドラッグは、ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ（配列番号６０２）又はＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴ（配列番号６１２）の配列のペプチド誘導体を含み、ペプチド誘導体は、１、２、５、８、１０〜１４、１６、１７、１８、２４、２８及び２９位から選択される位置で配列番号６０２又は配列番号６１２に対して１〜６個のアミノ酸置換を含み、１、２、５、７、８及び１１位から選択される位置で、エステル結合を介してペプチドに結合している、下記の式：
Figure 2011511778
 のジペプチドを有する。一つの実施態様において、２、５、７、８又は１１位のアミノ酸は、セリン残基であり、ジペプチドは、セリン側鎖と形成したエステル結合を介して結合している。典型的には、これらのプロドラッグは、プロドラッグ形態である間は１０％未満の活性しか示さず、活性化されると完全な活性を示す。
一つの実施態様によると、ＧＬＰ−１のプロドラッグ誘導体が提供される。実施例４の表６及び７に提示されたデータにより開示されているように、物理的及び化学的に安定であり、増強された半減期を示し、酵素の助けを借りることなく生理学的条件下で活性ポリペプチドに変換される、多種多様なＧＬＰ−１プロドラッグ誘導体が調製される。これらのＧＬＰ−１類縁体のうちの４つは、生理学的条件下で、２０時間を超える半減期を有する活性ポリペプチドに変換される。これらの類縁体は、天然アミノ酸配列に対して最小限の改変しか有さず、このことは潜在的な免疫源性有害作用を最小限にするはずである。ＧＬＰ−１のＮ末端でのプロドラッグ化学の確立は、この特定の部位が生体活性にとって極めて重要である他のペプチドへの使用に転化可能であると予測される。
一つの実施態様によると、プロドラッグＧＬＰ−１類縁体は、一般式：

Ｒ３−Ｙ−Ｒ４
で示されるポリペプチドを含み、
式中、Ｙは、下記：
Figure 2011511778
 からなる群より選択される構造であり、
Ｒ３は、ＨＸ２ＱＧ−（配列番号６３５）、ＦＸ２ＱＧ−（配列番号６３６）、Ｘ１Ｘ２ＱＧ−（配列番号６３７）又は下記：
Figure 2011511778
 からなる群より選択されるアミノ酸であり、
Ｘ１は、ヒスチジン、ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモ−ヒスチジン、チロシン及びフェニルアラニンからなる群より選択され、Ｘ２は、グリシン、アラニン、セリン、バリン、Ｄ−アラニン、アミノイソ酪酸、Ｎ−メチルアラニン、並びに同様の大きさの天然及び合成のアミノ酸からなる群より選択され、
Ｒ４は、ＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧ（配列番号６０３）、
ＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ−アミド（配列番号６０４）、
ＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＸ１４ＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−アミド（配列番号６０５）
（ここでＸ１４は、Ａｒｇ又はＧｌｙである）、
ＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＫＲＮＲＮＮＩＡ（配列番号６０６）及び
配列番号３、４、５又は６の誘導体（ここで誘導体は、配列番号６０３，６０４、６０５又は６０６と、１〜３個のアミノ酸により異なり、一つの実施態様では１〜３個の保存的アミノ酸により異なる）からなる群より選択されるアミノ酸配列であり、
Ｒ５は、ＮＨ２又はＨＯであり、
Ｒ６は、Ｈであるか、又は下記：
Figure 2011511778
 であり、
Ｒ７は、Ｏ−ＨＸ２ＱＧ−（配列番号６３５）、Ｏ−ＦＸ２ＱＧ−（配列番号６３６）及びＯ−ＹＸ２ＱＧ−（配列番号６３８）からなる群より選択されるアミノ酸配列であり、
Ｒ１及びＲ２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より独立して選択されるが、但し、Ｒ３が下記：
Figure 2011511778
 である場合、Ｒ６はＨであり、Ｒ６が下記：
Figure 2011511778
 である場合、Ｒ３は、Ｒ５ＨＸ２ＱＧ−（配列番号６３５）、Ｒ５ＦＸ２ＱＧ−（配列番号６３６）又はＲ５ＹＸ２ＱＧ−（配列番号３８）であり、更に、Ｒ６がＨである場合、Ｒ３は、Ｒ５ＨＸ２ＱＧ−（配列番号６３５）、Ｒ５ＦＸ２ＱＧ−（配列番号６３６）又はＲ５ＹＸ２ＱＧ−（配列番号６３８）ではない。一つの実施態様において、Ｒ１は、ＣＨ２（ＣＨ３）２、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ６ヘテロアリール）からなる群より選択され、Ｒ２は、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６アリール）からなる群より選択され、そしてＲ５は、ＯＨ又はＮＨ２である。
一つの実施態様において、式Ｖ：
Figure 2011511778
 の一般構造を有するＧＬＰ−１プロドラッグが提供され、
式中、Ｒ４は、下記：
ＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧ（配列番号６０３）、
ＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ−アミド（配列番号６０４）、
ＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＸ１４ＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−アミド（配列番号６０５）
（ここでＸ１４は、Ａｒｇ又はＧｌｙである）、及び
配列番号６０３、６０４又は６０５の誘導体（ここで誘導体は、配列番号６０３，６０４又は６０５と、１〜３個のアミノ酸により異なり、一つの実施態様では１〜３個の保存的アミノ酸により異なる）
からなる群より選択されるアミノ酸配列であり、
Ｒ５は、ＮＨ２又はＨＯであり、
Ｒ７は、Ｏ−ＨＸ２ＱＧ−（配列番号６３５）及びＯ−ＦＸ２ＱＧ−（配列番号６３６）からなる群より選択されるアミノ酸配列であり、
Ｘ２は、グリシン、アラニン、セリン、バリン、Ｄ−アラニン、アミノイソ酪酸、Ｎ−メチルアラニン、並びに同様の大きさの天然及び合成アミノ酸からなる群より選択されるアミノ酸であり、そして
Ｒ１及びＲ２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より独立して選択される。
一つの実施態様によると、、式ＩＩＩ又はＶの一般構造を有するプロドラッグであって、Ｒ１が、ＣＨ２（ＣＨ３）２及びＣＨ２（Ｃ６アリール）からなる群より選択され、Ｒ２がＣＨ２（Ｃ６アリール）であり、そしてＲ５がＯＨであるプロドラッグが提供される。更なる実施態様において、Ｒ４は、ＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＸ１４ＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−アミド（配列番号６０５）であり、ここでＸ１４は、Ａｒｇ又はＧｌｙである。別の実施態様において、式ＩＩＩ又はＶの一般構造を有するプロドラッグであって、Ｒ１がＣＨ２（ＣＨ３）２であり、Ｒ２が、Ｈ又はＣＨ２（Ｃ６アリール）であり、そしてＲ５がＮＨ２であるプロドラッグが提供される。更なる実施態様において、Ｒ４は、ＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＸ５ＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−アミド（配列番号６０５）であり、ここでＸ１４は、Ａｒｇ又はＧｌｙである。
一つの実施態様において、式ＩＩＩ：
Figure 2011511778
 の一般構造を有するＧＬＰ−１プロドラッグが提供され、
式中、
Ｒ３は、Ｒ５ＨＡＱＧ（配列番号６３９）、Ｒ５ＦＡＱＧ（配列番号６４０）、Ｒ５ＹＡＱＧ（配列番号６４１）からなる群より選択されるアミノ酸であり、
Ｒ４は、下記：
ＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧ（配列番号６０３）、
ＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ−アミド（配列番号６０４）及び
ＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＸ１４ＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−アミド（配列番号６０５）
（ここでＸ１４は、Ａｒｇ又はＧｌｙである）
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、
Ｒ５は、ＮＨ２又はＨＯであり、
Ｒ１及びＲ２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ６ヘテロアリール）からなる群より独立して選択され、そしてＲ５は、ＯＨ又はＮＨ２である。一つの実施態様において、Ｒ１は、ＣＨ２（ＣＨ３）２、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ６ヘテロアリール）からなる群より選択され、Ｒ２は、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ６アリール）からなる群より選択され、そしてＲ５は、ＯＨ又はＮＨ２である。
一つの実施態様によると、式ＩＩＩの一般構造を有するプロドラッグであって、Ｒ１が、ＣＨ２（ＣＨ３）２及びＣＨ２（Ｃ６アリール）からなる群より選択され、Ｒ２がＣＨ２（Ｃ６アリール）であり、そしてＲ５がＯＨであるプロドラッグが提供される。更なる実施態様において、Ｒ４は、ＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＸ１４ＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−アミド（配列番号６０５）であり、ここでＸ１４は、Ａｒｇ又はＧｌｙである。別の実施態様において、式ＩＩＩの一般構造を有するプロドラッグであって、Ｒ１がＣＨ２（ＣＨ３）２であり、Ｒ２が、Ｈ又はＣＨ２（Ｃ６アリール）であり、Ｒ５がＮＨ２であり、Ｒ４が、ＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＸ１４ＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−アミド（配列番号６０５）であり、Ｘ１４が、Ａｒｇ又はＧｌｙであるプロドラッグが提供される。一つの実施態様において、式ＶＩ：
Figure 2011511778
 の一般構造を有するプロドラッグが提供され、
式中、Ｒ１３は、ＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−アミド（配列番号６０８）又はＡＱＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−アミド（配列番号６０９）であり、本プロドラッグは、およそ６４時間の半減期を有する。
合成ペプチドの生体活性は、実施例２に詳細に記述されているインビトロ細胞アッセイを使用して決定されている。簡潔には、このアッセイは、細胞に基づいたアッセイであって、ここでは、ＧＬＰ−１受容体と、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）に結合したルシフェラーゼ遺伝子とを、宿主細胞に同時形質移入する。ルシフェラーゼ遺伝子の転写は、ｃＡＭＰ応答配列に結合しているｃＡＭＰ応答配列結合タンパク質（ＣＲＥＢ）により調節される。誘導されるｃＡＭＰ産生は、受容体へのＧＬＰ−１結合に正比例しており、発現されたルシフェラーゼ遺伝子の検出された活性によって示される。本明細書に開示されているプロドラッグは、７．２のｐＨ及び３７℃の温度でＰＢＳ緩衝液においてインキュベートされた後、効力を回復した。更に、本発明のＧＬＰ−１類縁体は、天然アミノ酸配列に対して最小限の改変しか有さず、このことは潜在的な免疫源性有害作用を最小限にするはずである。
本明細書に開示されているプロドラッグを更に修飾して、生理学的ｐＨの水溶液においてペプチドの溶解性を改善しながら、同時にペプチドの腎臓クリアランスを防止してペプチドの有効持続時間を増強することができる。ペプチドは、血漿タンパク質と比較すると比較的小型の分子サイズであるために、容易に取り除かれてしまう。４０kDを超えてペプチドの分子量の増加させると、腎臓の閾値を超え、血漿中の持続時間を有意に延長する。したがって、一つの実施態様において、ペプチドプロドラッグは更に修飾されて、共有結合した親水性部分を含む。一つの実施態様において、親水性部分は、血漿タンパク質ポリエチレン鎖又は免疫グロブリンのＦｃ部分である。したがって、一つの実施態様において、本開示のプロドラッグは更に修飾されて、アミノ酸の側鎖に共有結合している１つ以上の親水性基を含む。
一つの実施態様によると、本明細書に開示されているインスリンプロドラッグは、親水性部分をＢ鎖のＮ末端アミノ酸又は配列番号６２７の２９位のアミノ酸のいずれかに結合することにより更に修飾される。別の実施態様において、本明細書に開示されているグルカゴン及びＧＬＰ−１プロドラッグは、親水性部分を配列番号６１２及び配列番号６０２それぞれの２０、２１、２４位に対応するアミノ酸に結合することにより又はグルカゴン若しくはＧＬＰ−１プロドラッグのカルボキシ末端に修飾アミノ酸を付加することにより、更に修飾される。Ｃ末端付加アミノ酸は、修飾されて、アミノ酸に親水性部分を含む。一つの実施態様において、本明細書に開示されているグルカゴン及びＧＬＰ−１プロドラッグは、配列番号６１２及び配列番号６０２それぞれの２４位に対応するアミノ酸に親水性部分を結合することより更に修飾される。一つの実施態様において、親水性部分は、血漿タンパク質ポリエチレン鎖及び免疫グロブリンのＦｃ部分からなる群より選択される。
一つの実施態様において、親水性基はポリエチレン鎖であり、一つの実施態様において、２つ以上のポリエチレン鎖が、プロドラッグの２つ以上のアミノ酸側鎖に共有結合している。グルカゴン又はＧＬＰ−１プロドラッグでは、複数のポリエチレン鎖を、２０、２１、２４の群より選択される位置に結合することができるし、ペプチドのＣ末端に、側鎖にポリエチレン鎖が結合した単一の追加のアミノ酸を付加することもできるる。一つの実施態様において、Ｃ末端に付加されたアミノ酸は、修飾システインである。
一つの実施態様によると、本明細書に開示されているプロドラッグはアミノ酸置換により更に修飾され、置換しているアミノ酸は、例えばポリエチレングリコールを含む親水性部分との架橋に適している側鎖を含む。一つの実施態様において、親水性部分が結合するプロドラッグの位置のアミノ酸は、天然又は合成アミノ酸により置換されて（又はプロドラッグのＣ末端に付加されて）、親水性部分を導入するか又はその容易な結合を可能にする。例えば、一つの実施態様において、２０、２１、２４位（グルカゴン又はＧＬＰ−１プロドラッグ）の天然アミノ酸をリシン又はシステイン残基で置換して（或いはリシン又はシステイン残基をＣ末端に付加して）、ポリエチレン鎖の共有結合を可能にする。
一つの実施態様において、プロドラッグは、カルボキシ末端に付加された単一のシステイン残基を有するか、又はプロドラッグペプチドは、少なくとも１つのシステイン残基で置換されており、ここでシステイン残基の側鎖は、例えばマレイミド、ビニルスルホン、２−ピリジルチオ、ハロアルキル及びハルアシルのようなチオール反応性試薬で更に修飾される。これらのチオール反応試薬は、カルボキシ、ケト、ヒドロキシル及び他のエーテル基、並びにポリエチレングリコール単位のような他の親水性部分を含有することができる。代替的な実施態様において、プロドラッグは、カルボキシ末端に付加された単一のリシン残基を有するか又はプロドラッグペプチドは、リシンで置換されており、置換するリシン残基の側鎖は、カルボン酸の活性エスエル（スクシンイミド、無水物など）又はポリエチレングリコールのような親水性部分のアルデヒドのようなアミン反応性試薬を使用して更に修飾される。
本開示のグルカゴン及びＧＬＰ−１プロドラッグは、ＧＬＰ−１類縁体の機能に重要ではないことが知られている位置で天然グルカゴン及びＧＬＰ−１配列のアミノ酸置換を包含する。一つの実施態様において、置換は、１、２、５、８、１０、１２〜１４、１６〜１８、２４、２８及び２９、からなる群より選択される１、２、４、５又は６つの位置での保存的アミノ酸置換である。一つの実施態様において、天然ＧＬＰ−１／グルカゴンプチドの２０、２１及び２４位、とりわけ天然ＧＬＰ−１／グルカゴンの２１及び２４位に対応するアミノ酸は、システイン又はリシンで置換されており、ここでＰＥＧ鎖は、置換システイン又はリシン残基と共有結合している。更なる実施態様において、ＧＬＰ−１類縁体のＣ末端は修飾されて、カルボン酸基がアミド基で置換されている。
プロドラッグがポリエチレングリコール鎖を含むこれらの実施態様において、ポリエチレン鎖は、直鎖の形態であってもよいし、分岐鎖であってもよい。一つの実施態様によると、ポリエチレングリコール鎖は、約２０，０００〜約６０，０００ダルトンの範囲から選択される平均分子量を有する。複数のポリエチレン鎖をプロドラッグに結合して、最適な溶解性及び血中クリアランス特性を有するプロドラッグを提供することができる。一つの実施態様において、プロドラッグは、約２０，０００〜約６０，０００ダルトンの範囲から選択される平均分子量を有する単一ポリエチレングリコール鎖に結合している。別の実施態様において、プロドラッグは、２つのポリエチレングリコール鎖に結合し、２つの鎖の合計した平均分子量は、約４０，０００〜約８０，０００ダルトンの範囲から選択される。一つの実施態様において、２０，０００又は６０，０００ダルトンの平均分子量を有する単一ポリエチレングリコール鎖がプロドラッグに結合している。一つの実施態様において、単一ポリエチレングリコール鎖が、プロドラッグに結合し、約４０，０００〜約５０，０００ダルトンの範囲から選択される平均分子量を有する。一つの実施態様において、２つのポリエチレングリコール鎖が、プロドラッグに結合し、第１及び第２ポリエチレングリコール鎖は、それぞれ２０，０００ダルトンの平均分子量を有する。別の実施態様において、２つのポリエチレングリコール鎖が、プロドラッグに結合し、第１及び第２ポリエチレングリコール鎖は、それぞれ４０，０００ダルトンの平均分子量を有する。
更なる実施態様において、ペプチドに共有結合している２つ以上のポリエチレン鎖を含むグルカゴン又はＧＬＰ−１プロドラッグが提供され、ここでグルカゴン鎖の総分子量は、約４０，０００〜約６０，０００ダルトンである。一つの実施態様において、ペグ化グルカゴン又はＧＬＰ−１プロドラッグは、グルカゴン又はＧＬＰ−１ペプチドの２０、２１及び２４位の１個以上のアミノ酸に結合しているポリエチレングリコール鎖を含み、ここでＰＥＧ鎖の合計した分子量は、約４０，０００〜約８０，０００ダルトンである。一つの実施態様において、ペプチドに共有結合している２つ以上のポリエチレン鎖を含むインスリンプロドラッグが提供され、ここでグルカゴン鎖の総分子量は、約４０，０００〜約６０，０００ダルトンである。一つの実施態様において、ペグ化インスリンプロドラッグは、Ｂ鎖のＮ末端及び／又はＢ鎖の２９位（例えば、配列番号６２７）の１個以上のアミノ酸に結合しているポリエチレングリコール鎖を含み、ここでＰＥＧ鎖の合計した分子量は、約４０，０００〜約８０，０００ダルトンである。
一つの実施態様によると、下記：
Figure 2011511778
 からなる群より選択される化合物の構造を含むグルカゴン又はＧＬＰ−１プロドラッグが提供され、
式中、Ｘは、ＣＨ２（ＣＨ３）２であり、Ｙは、フェニルであり、
Ｒ３は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｇ（配列番号６２１）であり、Ｘ１は、ヒスチジン、ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモ−ヒスチジン、チロシン及びフェニルアラニンからなる群より選択され、Ｘ２は、グリシン、アラニン、セリン、バリン、Ｄ−アラニン、アミノイソ酪酸、Ｎ−メチルアラニン、並びに同様の大きさの天然及び合成アミノ酸からなる群より選択され、Ｘ３は、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン及びアスパラギンからなる群より選択され、
Ｒ４は、下記：
ＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧ（配列番号６０３）、
ＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ−アミド（配列番号６０４）、
ＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＸ１４ＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−アミド（配列番号６０５）
（ここでＸ１４は、Ａｒｇ又はＧｌｙである）、
ＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴ（配列番号６１８）及び
ＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−アミド（配列番号６２０）
からなる群より選択されるアミノ酸配列であり、
Ｒ８は、下記：
ＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＸＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−アミド（配列番号６０８）、
ＡＱＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＸＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−アミド（配列番号６０９）、
ＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧ（配列番号６３０）、
ＡＱＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧ（配列番号６３１）、
ＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴ（配列番号６３２）及び
ＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−アミド（配列番号６３３）
からなる群より選択される。
一つの実施態様によると、Ｒ８は、ＡＥＧＴＲ４又はＡＱＧＴＲ４からなる群より選択されるポリペプチドを含み、Ｒ３は、ＯＨ−ＨＡＥＧ−（配列番号６４２）、ＨＡＱＧ−（配列番号６３９）、ＨＡＥＧ−（配列番号６４３）、ＦＡＥＧ−（配列番号６４４）及びＦＡＱＧ−（配列番号６４０）からなる群より選択されるアミノ酸配列であり、そしてＲ４は、配列番号６１６及び配列番号６１８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。一つの実施態様において、Ｒ４は、ＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧ（配列番号６０３）、ＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ−アミド（配列番号６０４）、ＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＸ１４ＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−アミド（配列番号６０５）（ここでＸ１４は、Ａｒｇ又はＧｌｙである）及びＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＫＲＮＲＮＮＩＡ（配列番号６０６）からなる群より選択される。
一つの実施態様によると、グルカゴン又はＤＬＰ−１プロドラッグ類縁体であって、血漿タンパク質がペプチドのアミノ酸側鎖に共有結合してグルカゴン又はＧＬＰ−１プロドラッグ類縁体の溶解性、安定性及び／又は薬物動態を改善している類縁体が提供される。例えば、血清アルブミンを本明細書に提示されているグルカゴン又はＧＬＰ−プロドラッグ類縁体に共有結合することができる。一つの実施態様において、血漿タンパク質は、配列番号６０４又は配列番号６１２のペプチドの２０、２１、又は２４位に対応するアミノ酸に共有結合している。より詳細には、一つの実施態様において、血漿タンパク質は、グルカゴン又はＧＬＰ−１プロドラッグ類縁体の２１又は２４位に対応するアミノ酸に結合している。
一つの実施態様によると、免疫グロブリン分子のＦｃ部分を表す直鎖アミノ酸配列が、本明細書に開示されているグルカゴン又はＧＬＰ−１プロドラッグ類縁体のアミノ酸側鎖に共有結合して、グルカゴン又はＧＬＰ−１プロドラッグ類縁体の溶解性、安定性及び／又は薬物動態を改善している、グルカゴン又はＧＬＰ−１プロドラッグ類縁体が提供される。例えば、免疫グロブリン分子のＦｃ部分を表すアミノ酸配列は、配列番号６０４のペプチド又はグルカゴン若しくはＧＬＰ−１プロドラッグの２０、２１又は２４位に共有結合することができる。より詳細には、一つの実施態様において、Ｆｃ部分は、グルカゴン又はＧＬＰ−１プロドラッグ類縁体の２１又は２４位に対応するアミノ酸に結合しており、類縁体は、配列番号６０４又は配列番号６１２の配列を含む。Ｆｃ部分は、典型的には、ＩｇＧから単離されるものであが、任意の免疫グロブリンからのＦｃペプチドフラグメントも同等に機能するはずである。
本開示は、本発明のプロドラッグが結合している他の結合体も包含し、この結合は、共有結合を介してでもよいし、リンカーを介してでもよい。結合は、共有化学結合、静電気、水素、イオン、ファンデルワールスような物理的な力又は疎水的若しくは親水的相互作用により達成することができる。ビオチン−アビジン、リガンド／受容体、酵素／基質、核酸／核酸結合タンパク質、脂質／脂質結合タンパク質、細胞付着分子パートナー又は互いに親和性を有する任意の結合パートナー若しくはそのフラグメントを含む、多様な非共有結合系を使用することができる。
例示的な結合体には、異種ペプチド又はポリペプチド（例えば、血漿タンパク質を含む）、標的作用物質、免疫グロブリン又はその一部（例えば、可変部領域、ＣＤＲ若しくはＦｃ領域）、放射性同位体、蛍光体若しくは酵素標識のような診断用標識、水溶性ポリマーを含むポリマー、又は他の治療若しくは診断剤が含まれるが、これらに限定されない。一つの実施態様において、本発明のプロドラッグポリペプチド及び血漿タンパク質を含む結合体が提供され、ここで血漿タンパク質は、アルブミン、トランスフェリン及びフィブリノゲンからなる群より選択される。一つの実施態様において、結合体の血漿タンパク質部分は、アルブミン又はトランスフェリンである。幾つかの実施態様において、リンカーは、１〜約６０個、又は１〜３０個以上の原子長さ、２〜５個の原子、２〜１０個の原子、５〜１０個の原子又は１０〜２０個の原子長さの原子鎖を含む。幾つかの実施態様において、鎖原子は全て炭素原子である。幾つかの実施態様において、リンカーの主鎖の鎖原子は、Ｃ、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群より選択される。鎖原子及びリンカーは、より溶解性のある結合体をもたらすと予想される溶解性（親水性）に従って選択することができる。幾つかの実施態様において、リンカーは、酵素による又は標的組織若しくは臓器若しくは細胞において見出される他の触媒的若しくは加水分解的条件による切断の対象となる官能基を提供する。幾つかの実施態様において、リンカーの長さは、立体障害の潜在性を低減するのに十分な長さである。リンカーが共有結合又はペプチジル結合であり、結合体がポリペプチドである場合、結合体は全体が融合タンパク質であることができる。そのようなペプチジルリンカーは任意の長さであることができる。例示的なリンカーは、約１〜５０個のアミノ酸長さ、５〜５０個、３〜５個、５〜１０個、５〜１５個又は１０〜３０個のアミノ酸長さである。そのような融合タンパク質は、代替的には当業者に既知の組み換え遺伝子操作法により産生することができる。
出願人たちは、天然グルカゴン及びＧＬＰ−１が、電荷をカルボキシ末端に導入してペプチドの溶解性を増強しながら、同時にペプチドのアゴニスト特性を保持するように修飾されうることも発見した。増強された溶解性は、ほぼ中性のｐＨでのグルカゴン及びＧＬＰ−１溶液の調製及び保存を可能にする。比較的中性のｐＨ（例えば、約５．０〜約７．０のｐＨ）でのグルカゴン及びＧＬＰ−１溶液の配合は、類縁体の長期安定性を改善する。
出願人たちは、本明細書に開示されているグルカゴン及びＧＬＰ−１プロドラッグを同様に修飾して、比較的中性のｐＨ（例えば、約５．０〜約７．０のｐＨ）の水溶液における溶解性を増強しながら、同時に母体タンパク質の活性を保持できることを予測する。したがって、本発明の一つの実施態様は、天然アミノ酸に対して、荷電アミノ酸による天然非荷電アミノ酸の置換により又はカルボキシ末端への荷電アミノ酸の付加により、ペプチドに電荷を付加するように更に修飾されている、グルカゴン又はＧＬＰ−１類縁体を対象とする。一つの実施態様によると、本開示のグルカゴン又はＧＬＰ−１プロドラッグの１〜３個の非荷電天然アミノ酸は、荷電アミノ酸で置換されている。一つの実施態様において、荷電アミノ酸は、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸及びグルタミン酸からなる群より選択される。より詳細には、出願人たちは、荷電アミノ酸による、グルカゴン（配列番号６１２）の２８若しくは２９位又はＧＬＰ−１（配列番号６０２）の２８若しくは２９及び３０位に対応する位置で通常生じるアミノ酸の置換、並びに／又はグルカゴン若しくはＧＬＰ−１プロドラッグのカルボキシ末端への１〜２個の荷電アミノ酸の付加が、生理学的なｐＨ（すなわち、約６．０〜約７．０のｐＨ）の水溶液におけるプロドラッグの溶解性及び安定性を増強することを発見した。本明細書に開示されているグルカゴン及びＧＬＰ−１プロドラッグのそのような修飾は、特に約５．０〜約７．０の範囲のｐＨの水溶液における溶解性に同様の効果を有すると同時に、母体ペプチドの生物学的活性を保持することが予測される。
使用
開示されているＧＬＰ−１、グルカゴン及びインスリンプロドラッグは、これらの生体活性ペプチドについて既に記載されてきたあらゆる使用に適していると考えられる。したがって、本明細書に記載されているプロドラッグを、低血糖症、高血糖症の治療、又はグルカゴンの高／低血中レベル若しくは高／低血中グルコースレベルをもたらす他の代謝疾患の治療に使用することができる。一つの実施態様によると、本明細書に開示されているプロドラッグを使用して治療される患者は、家畜化された動物であり、別の実施態様では、治療される患者はヒトである。
本発明による高血糖症又は低血糖症を治療する方法は、静脈内、腹腔内、皮下若しくは筋肉内のような非経口、鞘内、経皮、直腸内、経口、鼻腔内又は吸入を含む、任意の標準的投与経路を使用して、本開示のプロドラッグを患者に投与する工程を含む。一つの実施態様において、組成物は皮下又は筋肉内投与される。一つの実施態様において、組成物は非経口投与され、プロドラッグ組成物はシリンジの中に予め包装されている。
エキセンディン−４（Exendin-4）は、３９個のアミノ酸で作製されるペプチドである。ＧＬＰ−１受容体の刺激物質は、食欲を抑制し、減量を誘導することが報告されている。一つの実施態様において、エキセンディン−４の末端アミノ酸１０個（すなわち、配列番号６２４（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）の配列）が、本開示のグルカゴン及びＧＬＰ−１プロドラッグのカルボキシ末端に結合している。これらの融合タンパク質は、食欲を抑制し、減量／体重維持を誘導する薬理学的活性を有すると予測される。一つの実施態様によると、本開示のプロドラッグ誘導体であって、配列番号６０２、配列番号６１２、配列番号６２２、配列番号６２３又は配列番号６２９のペプチド配列を含み、カルボキシ末端配列に結合している配列番号６２４（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）のアミノ酸配列を更に含む誘導体を、個体に投与して、食欲を減退させるか又は体重の減少を促進する。一つの実施態様によると、患者は家畜化された動物であり、別の実施態様では、治療される患者はヒトである。そのような食欲を減退する又は体重の減少を促進する方法は、体重の低減、体重増加の防止又は薬剤誘導肥満を含む多様な原因の肥満の治療、並びに血管疾患（冠動脈疾患、発作、末梢血管疾患、虚血再灌流など）、高血圧、ＩＩ型糖尿病の発症、高脂血症及び筋骨格系疾患を含む肥満に関連する合併症の低減に有用であることが予想される。一つの実施態様において、投与されたペプチドは、配列番号６０５の配列を含む。本発明は、本明細書に記載されているグルカゴン及びＧＬＰ−１プロドラッグが、更にこの１０アミノ酸カルボキシ末端延長（配列番号６２４）と結合してもよいことを考慮するが、本発明は、配列番号６２４の１０個の隣接アミノ酸を欠いている類縁体を特に考慮する。
減量を誘導する別の化合物としては、オキシントモジュリンがあるが、これは小腸において見出された天然の消化ホルモンである（Diabetes 2005; 54:2390-2395を参照すること）。オキシントモジュリンは、グルカゴンの２９アミノ酸配列、その後に続く配列番号６２５（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）の８アミノ酸カルボキシ末端延長を含有する、３７アミノ酸のペプチドである。したがって、一つの実施態様において、配列番号６２５の配列のカルボキシ末端延長を更に含む、グルカゴン及びＧＬＰ−１のプロドラッグ誘導体が提供される。より詳細には、一つの実施態様によると、本開示のプロドラッグ誘導体は、カルボキシ末端配列に結合している配列番号６２５（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）のアミノ酸配列を更に含む、配列番号６０２、配列番号６１２、配列番号６２２又は配列番号６２３のペプチド配列を含む。これらのペプチドを、減量の誘導又は体重増加の防止に使用することができる。本発明は、本明細書に記載されているグルカゴン及びＧＬＰ−１プロドラッグが、更にこの８アミノ酸カルボキシ末端延長（配列番号６２５）と結合してもよいことを考慮するが、本発明は、配列番号６２５の８個の隣接アミノ酸を欠いている類縁体を特に考慮する。
本発明のグルカゴン及びＧＬＰ−１プロドラッグを、代謝性るいそうを罹患している患者に投与することもできる。癌患者の過半数が、意図されない進行性の減量、衰弱、並びに低体脂肪及び筋肉により特徴付けられる代謝性るいそうを経験していると推定される。この症候群は、ＡＩＤＳ患者において同様に一般的であり、細菌及び寄生虫疾患、リウマチ様関節炎、並びに腸、肝臓、肺及び心臓の慢性疾患においても存在しうる。通常、食欲不振に関連し、加齢の状態又は物理的外傷の結果として表れる可能性がある。代謝性るいそうは、生活の質を減少し、基礎状態を悪化させる症状であり、死亡の主な原因である。
組み合わせ
本発明のインスリン、グルカゴン及びＧＬＰ−１プロドラッグは、単独で、又は他の抗糖尿病又は抗肥満剤と組み合わせて投与することができる。当該技術において既知であるか又は調査中の抗糖尿病剤には、インスリン；トルブタミド（Orinase）、アセトヘキサミド（Dymelor）、トラザミド（Tolinase）、クロルプロパミド（Diabinese）、グリピジド（Glucotrol）、グリブリド（Diabeta, Micronase, Glynase）、グリメピリド（Amaryl）又はグリクラジド（Diamicron）のようなスルホニル尿素；レパグリニド（Prandin）又はナテグリニド（Starlix）のようなメグリチニド；メトホルミン（Glucophage）又はフェンホルミンのようなビグアナイド；ロシグリタゾン（Avandia）、ピオグリタゾン（Actos）若しくはトログリタゾン（Rezulin）又は他のＰＰＡＲγインヒビターのようなチアゾリジンジオン；ミグリトール（Glyset）、アルカボース（Precose/Glucobay）のような炭水化物の消化を阻害するアルファグルコシダーゼインヒビター；エクセナチド（Byetta）又はプラムリンチド；ビルダグリプチン又はシタグリプチンのようなジペプチジルペプチダーゼ−４（ＤＰＰ−４）インヒビター；ＳＧＬＴ（ナトリウム依存性グルコーストランスポーター１）インヒビター；又はＦＢＰａｓｅ（フルクトース１，６−ビスホスファターゼ）インヒビターが含まれる。
当該技術において既知であるか又は調査中の抗肥満剤には、フェネチルアミン型刺激薬、フェンテルミン、（場合により、フェンフルラミン又はデクスフェンフルラミンを伴う）、ジエチルプロピオン（Tenuate（登録商標））、フェンジメトラジン（Prelu-2（登録商標）、Bontril（登録商標））、ベンズフェタミン（Didrex（登録商標））、シブトラミン（Meridia（登録商標）、Reductil（登録商標））を含む食欲抑制薬；リモナバン（Acomplia（登録商標））、他のカンナビノイド受容体アンタゴニスト；オキシントモジュリン；塩酸フルオキセチン（Prozac）；Qnexa（トピラメート及びフェンテルミン）、Excalia（ブプロピオン及びゾニサミド）又はContrave（ブプロピオン及びナルトレキソン）；或いはゼニカル（Orlistat）若しくはCetilistat （ATL-962としても知られている）又はGT 389-255と類似しているリパーゼインヒビターが含まれる。
医薬組成物
本明細書に開示されているプロドラッグを含む医薬組成物を、標準的な薬学的に許容される担体及び当業者に既知の投与経路を使用して、配合及び投与することができる。したがって、本開示は、本明細書に開示されている１つ以上のプロドラッグ又はその薬学的に許容される塩を、薬学的に許容される担体と組み合わせて含む医薬組成物も包含する。一つの実施態様において、医薬組成物は、リン酸緩衝剤系中に約４．０〜約７．０のｐＨでプロドラッグを１mg/mlの濃度で含む。医薬組成物は、プロドラッグを単独の薬学的に活性な成分として含むことができるし、プロドラッグを１つ以上の追加的な活性剤と組み合わせることもできる。一つの実施態様によると、本発明のグルカゴン又はＧＬＰ−１プロドラッグと、インスリン又はインスリン類縁体又は本開示のインスリンプロドラッグの１つとを含む組成物が提供される。あるいは、グルカゴン又はＧＬＰ−１プロドラッグと抗肥満ペプチドとを含む、減量を誘導する又は体重増を防止することができる組成物が提供される。適切な抗肥満ペプチドには、米国特許第５，６９１，３０９号、同第６，４３６，４３５号又は米国特許出願第２００５／０１７６６４３号に開示されているものが含まれる。
一つの実施態様によると、医薬組成物であって、好ましくは滅菌され、好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の純度レベルの、本明細書に開示されている任意の新規プロドラッグと、薬学的に許容される希釈剤、担体又は賦形剤とを含む医薬組成物が提供される。そのような組成物は、グルカゴン、ＧＬＰ−１又はインスリンプロドラッグを含有することができ、得られる活性ペプチドは、少なくとも０．５mg/ml、１mg/ml、２mg/ml、３mg/ml、４mg/ml、５mg/ml、６mg/ml、７mg/ml、８mg/ml、９mg/ml、１０mg/ml、１１mg/ml、１２mg/ml、１３mg/ml、１４mg/ml、１５mg/ml、１６mg/ml、１７mg/ml、１８mg/ml、１９mg/ml、２０mg/ml、２１mg/ml、２２mg/ml、２３mg/ml、２４mg/ml、２５mg/ml又はそれ以上の濃度で存在する。一つの実施態様において、医薬組成物は、滅菌されていて、場合により多様な容器に保存されていてもよい水性液剤を含む。本発明の化合物を一つの実施態様に従って使用して、注射可能な予備処方液剤を調製することができる。別の実施態様において、医薬組成物は凍結乾燥粉末剤を含む。医薬組成物を、患者に組成物を投与するための使い捨て装置を含むキットの一部として、更に包装することができる。容器又はキットにラベルを付けて周囲温度又は冷蔵温度で保存することができる。
本明細書に記載されている全ての治療方法、医薬組成物、キット及び他の同様の実施態様は、プロドラッグ化合物が全ての薬学的に許容される塩を含むことを考慮する。
キット
一つの実施態様において、プロドラッグ組成物を患者に投与する装置を有するキットが提供される。キットは、多様な容器、例えばバイアル、チューブ、ボトルなどを更に含むことができる。好ましくは、キットは使用説明書も含む。一つの実施態様によると、キットの装置は、エアゾール・ディスペンサーであり、ここで組成物はエアゾール装置内に予め包装されている。別の実施態様において、キットは、シリンジ及び針を含み、一つの実施態様において、プロドラッグ組成物は、シリンジの中に予め包装されている。
製造方法
本明細書に記載されているプロドラッグは、標準的な合成方法、組み換えＤＮＡ技術又はペプチド及び融合タンパク質を調製する他の任意の方法により調製することができ、これらの幾つかの方法は、実施例セクションに記載されている。特定の非天然アミノ酸は標準的な組み換えＤＮＡ技術により発現することはできないが、それらを調製する技術は当該技術において知られている。非ペプチド部分を包含する本発明の化合物を、適用可能であれば、標準的なペプチド化学反応に加えて、標準的な有機化学反応によっても合成することができる。
〔実施例〕
一般的ペグ化プロトコール：（Ｃｙｓ−マレイミド）
典型的には、ＧＬＰ Ｃｙｓ類縁体をリン酸緩衝食塩水（５〜１０mg/ml）に溶解し、０．０１Mエチレンジアミン四酢酸を加える（総容量の１０〜１５％）。過剰量（２倍）のマレイミドメトキシＰＥＧ試薬（Dow）を加え、反応物を室温で撹拌し、その間、ＨＰＬＣで反応進行をモニタリングする。８〜２４時間後、反応混合物を酸性化し、精製のために０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル勾配を使用する分取逆相カラムに装填する。適切な画分をまとめ、凍結乾燥して、所望のペグ化誘導体を得た。
〔実施例１〕
グルカゴン及びＧＬＰ−１類縁体の合成
グルカゴン及びＧＬＰ−１のプロドラッグ誘導体を調製する可能性を調査するために、多数のペプチド類縁体と合成した。標準的な手順を本実施例において、並びに図３及び４において簡潔に記載し、詳細を後で考察する。
材料：
ＰＡＭ樹脂（ＰＡＭ樹脂は、ＯＣＨ２−フェニルアセトアミドメチル−コポリスチレン−１％ジビニルベンゼンである）、（１００〜１８０メッシュ、１％ＤＶＢ架橋ポリスチレン；装填０．７〜１．０mmol/g）、Ｂｏｃ保護及びＦｍｏｃ保護アミノ酸は、Midwest Biotechから購入した。α−ヒドロキシ酸（フェニル乳酸及びグリコール酸）のような他の試薬は、Aldrichから購入した。Ｂｏｃ保護アミノ酸を使用する固相ペプチド合成は、Applied Biosystem 430A Peptide Synthesizerにより実施した。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸合成は、Applied Biosystems Model 433 Peptide Synthesizerを使用して実施した。デプシ−ペプチドの手作業での合成は、焼結反応容器において類似の手順（Schnolzer, M., et al., (1992) Int J Pept Protein Res 40(3-4):180-193）を使用して実施した。
ペプチド合成（Ｂｏｃアミノ酸／ＨＦ切断）：
これらの類縁体の合成は、Applied Biosystem Model 430A Peptide Synthesizerにより実施した。合成ペプチドは、アミノ酸の連続付加により構築し、各アミノ酸の活性化エステルは、ＤＭＦ中の１．９mmol（３．８mlの０．５M溶液）の３−（ジエトキシ−ホスホリルオキシ）−３Ｈ−ベンゾ〔ｄ〕〔１，２，３〕トリアジン−４−オン（ＤＥＰＢＴ）を、２mmolのＢｏｃ保護アミノ酸を含有するカートリッジに加えることによって生成した。アミノ酸を、カートリッジの中で窒素ガスを通気することにより溶解した。１mlのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンをカートリッジに加えて、エステル形成を実施した。この溶液を、ＰＡＭ樹脂に結合しているＣ末端残基を０．２mmol含有する反応容器に移し、数回撹拌し、１０分間樹脂に結合させた。洗浄して未反応試薬を除去した後、Ｎ末端Ｂｏｃ保護基を、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で５分間処理することにより除去した。樹脂をＤＭＦで洗浄し、このサイクルを、鎖が組み立てられるまで工程を所望の回数繰り返した。合成の終了時（典型的には、３０個のアミノ酸）には、反応容器は、およそ１．２〜１．５ｇの保護ペプチジル−ＰＡＭ樹脂を含有した。樹脂をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で数回洗浄し、トリフルオロ酢酸で処理して最後のｔＢｏｃ保護基を除去し、ＤＭＦ、ジクロロメタン（ＤＣＭ）で最終的に数回追加的に洗浄し、乾燥した。
ペプチジル樹脂を無水ＨＦで処理し（このセクションの後記において手順が詳述される）、このことによって、典型的にはおよそ３０mg（収率約５０％）の粗脱保護ペプチドを得た。
ペプチド合成（Ｆｍｏｃアミノ酸／ＨＦ切断）：
この合成スキームは、選択的な部位の幾つかのアミノ酸において手作業で実施した。この処理において、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸は、より広範囲の合成戦略の一部として、内部セリンプロドラッグを合成するためのみに使用した。ここでは、ＦＭＯＣ化学が合成に使用されるものの、ペプチドは、常に、固体支持体からペプチドを切断するためにＨＦによる処理を必要とするＰＡＭ樹脂に構築されることに留意するべきである。これらのペプチドの収率は、およそ、Ｂｏｃ／ＰＡＭ合成において前述したものと同じである。
この合成は、前のセクションに記載されたとおりに実施した。結合工程の終了時に、ペプチジル樹脂を２０％ピペリジンで処理して、Ｎ末端Ｆｍｏｃ保護基を除去した。それをＤＭＦで繰り返し洗浄し、この反復サイクルを結合工程の所望の回数繰り返した。全合成の終了時にペプチジル樹脂を、ＤＣＭを使用して乾燥し、ペプチドを、無水ＨＦにより樹脂から切断した。
デシ−ペプチド合成（アミノエステル形成）
この場合では、ペプチジル樹脂は、Ｎ末端アミンの代わりにα−ヒドロキシルＮ末端延長を有し、アシル化は、αヒドロキル基において実施された。この反応は、ヒドロキシル基がアミンと比較して弱い求核剤であるので、アミド結合形成よりも長い時間かかる。反応時間は、典型的には１２時間であった。
最初に、各アミノ酸の活性化エステルは、１mmol（０．１５５ml）のジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を、ＤＣＭ ２mlの中のＢｏｃ保護アミノ酸残基２mmolの溶液を含有するカートリッジに加えることにより、生成した。これを１０℃で１０分間冷却した。０．９mmol（２４４mg）のジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）をカートリッジに加えて、エステル形成を加速させた。この混合物を、ペプチドが合成される、ペプチジル樹脂を含有する容器に移した。反応容器を１２時間撹拌した。
ペプチジル樹脂を、ＤＣＭを使用して乾燥し、所望のペプチドの合成を続けた。全合成の終了時にペプチジル樹脂を、ＤＣＭを使用して乾燥し、無水ＨＦで最終的に処理して、所望のペプチドを生成した。
Ｎ末端ヒドロキシルペプチド合成（αヒドロキシルＮ末端延長）
この反応では、ペプチジル樹脂の遊離アミンをαヒドロキシル酸と反応させて、αヒドロキシルＮ末端延長を形成する。この点において、そのようなαヒドロキシル酸を２つのみ使用し、すなわち、グリコール酸（ＯＨ−グリシン）及びフェニル乳酸（ＯＨ−フェニルアラニン）であった。これらの合成も手作業で実施した。ペプチドをαヒドロキル酸の添加により構築し、αヒドロキル酸の活性化エステルは、０．９mmolのＤＥＰＢＴ（２７０mg）を、ＤＭＦ ２ml中のＢｏｃ保護残基１mmolの溶液を含有するカートリッジに加えることによって生成した。０．５mlのＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）をカートリッジに加えて、エステル形成を加速させた。この混合物を、ペプチドが合成される、ペプチジル樹脂を含有する容器に移した。反応時間は、６時間であった。
ペプチジル樹脂を、ＤＣＭを使用して乾燥し、所望のペプチドの合成を続けた。全合成の終了時にペプチジル樹脂を、ＤＣＭを使用して乾燥し、無水ＨＦで切断して、遊離ペプチドを生成した。
ペプチジル樹脂のＨＦ処理
ペプチジル樹脂（３０mg〜２００mg）を切断のためにフッ化水素（ＨＦ）反応容器に入れた。５００μLのｐ−クレゾールを、カルボニウムイオンスカベンジャーとして容器に加えた。容器をＨＦ系に接続し、メタノール／ドライアイス混合物の中に沈めた。容器を真空ポンプで排気し、１０mlのＨＦを蒸留して反応容器の中にいれた。このペプチジル樹脂とＨＦの反応混合物を０℃で１時間撹拌し、その後、真空を確立し、ＨＦを素速く排気した（１０〜１５分間）。容器を注意深く取り外し、およそ３５mlのエーテルを充填して、ペプチドを沈殿させ、ＦＨ処理によりもたらされたｐ−クレゾール及び小型有機保護基を抽出した。この混合物を、テフロンフィルターを利用して濾過し、２回繰り返して、全ての過剰クレゾールを除去した。この濾液を廃棄した。沈殿ペプチドを、およそ２０mlの１０％酢酸（水溶液）で溶解した。所望のペプチドを含有するこの濾液を収集し、凍結乾燥した。
質量分析を使用した分析
質量スペクトルを、標準的なＥＳＩイオン供給源を備えたSciex API-IIIエレクトロスプレー四重極質量分析機を使用して得た。使用したイオン化条件は以下である：陽イオンモードのＥＳＩ；イオンスプレー電圧３．９kV；オルフィス電位６０V。使用した噴霧及びカーテンガスは、流速．９L/分の窒素であった。質量スペクトルを、１工程あたり０．５Th及び滞留時間が２ミリ秒の６００〜１８００Thompsonで記録した。試料（約１mg/mL）を、１％酢酸を有する５０％アセトニトリル水溶液に溶解し、外部シリンジポンプにより５μL/分の速度で導入した。
ペプチドをＥＳＩ ＥＳによりＰＢＳ溶液で分析したとき、最初にこれらを、製造会社（Millipore Corporation, Billerica, MA、http://www.millipore.com/catalogue.nsf/docs/C5737を参照すること）により提示された説明書に従って、０．６μLのＣ４樹脂を含有するZipTip固相抽出チップを使用して脱塩した。
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析：
予備分析を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及びＭＡＬＤＩ分析を使用して、これらの粗ペプチドにより実施して、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）緩衝剤（ｐＨ７．２）における相対的変換率の近位値を得た。粗ペプチド試料を、１mg/mLの濃度でＰＢＳ緩衝剤に溶解した。１mlの得られた溶液を１．５mlのＨＰＬＣバイアルに保存し、次に密封して３７℃でインキュベートした。１００μlのアリコートを多様な時間間隔で抜き取り、室温に冷却し、ＨＰＬＣで分析した。
ＨＰＬＣ分析は、２１４nmでＵＶ検出器を使用するBeckman System Gold Chromatography系を使用して実施した。ＨＰＬＣ分析は、１５０mm×４．６mmのC18 Vydacカラムで実施した。流速は１ml/分であった。溶媒Ａは、蒸留水中０．１％ＴＦＡを含有し、溶媒Ｂは、９０％ＣＨ３ＣＮ中０．１％ＴＦＡを含有した。直線勾配を用いた（１５分間で４０％から７０％のＢ）。データを収集し、Peak Simple Chromatographyソフトウエアを使用して分析した。
加水分解の初期速度を使用して、それぞれのプロドラッグの解離速度定数を測定した。プロドラッグ及び薬剤の濃度を、それぞれのピーク領域から推定した。プロドラッグの一次反応解離速度定数を、多様な時間間隔でプロドラッグの濃度の対数をプロットすることにより決定した。このプロットの勾配は、速度定数「ｋ」を与える。次に多様なプロドラッグの分解の半減期を、式：ｔ１／２＝．６９３／ｋを使用して計算した。
ＨＰＬＣを使用した分取精製
およそのｔ１／２を示すプロドラッグが確認されると、プロドラッグを精製した。精製は、シリカに基づいた１×２５cmのVydac C18（粒径５μ、孔径３００Å）カラムのＨＰＬＣ分析を使用して実施した。使用した器具は、Waters Associates６００型ポンプ、７１７型注入器及び４８６型ＵＶ検出器であった。２１４nmの波長を全ての試料に使用した。溶媒Ａは、蒸留水中１０％ＣＨ３ＣＨ／０．１％ＴＦＡを含有し、溶媒Ｂは、ＣＨ３ＣＮ中０．１％ＴＦＡを含有した。直線勾配を用いた（２時間で０％から１００％のＢ）。流速は、１．２ml/分であり、画分の大きさは６mlであった。約３５０mgの粗ペプチドから、典型的には８０mgの純粋なペプチド（収率約２３％）を得た。
〔実施例２〕
バイオアッセイ実験設計：ｃＡＭＰ検出のためのルシフェラーゼに基づいたレポーター遺伝子アッセイ
ｃＡＭＰを誘導するグルカゴン及びＧＬＰ−１類縁体又はプロドラッグのそれぞれの能力を、ホタルルシフェラーゼに基づいたレポーターアッセイにより測定した。誘導されるｃＡＭＰ産生は、受容体へのグルカゴン又はＧＬＰ−１の結合に正比例している。グルカゴン又はＧＬＰ−１受容体のそれぞれと、ｃＡＭＰ応答配列に結合しているルシフェラーゼ遺伝子とを同時形質移入されたＨＥＫ２９３細胞を、バイオアッセイに用いた。
細胞を、０．２５％ウシ増殖血清（HyClone, Logan, UT）が補充されたダルベッコ最小必須培地（Invitrogen, Carlsbad, CA）における１６時間の培養により血清を取り除き、次にＧＬＰ−１類縁体又はプロドラッグいずれかの希釈系列と共に、９６ウエルポリ−Ｄ−リシン被覆「バイオコート」プレート（BD Biosciences, San Jose, CA）において３７℃、５％ＣＯ２で５時間インキュベートした。インキュベーションの終了時に、１００μLのLucLiteルミネセンス基質試薬（Perkin-Elmer, Wellesley, MA）を各ウエルに加えた。プレートを短時間振とうし、暗黒で１０分間インキュベートし、発光をMicroBeta-1450液体シンチレーションカウンター（Perkin-Elmer, Wellesley, MA）で測定した。有効５０％濃度（ＥＣ５０）は、Origin ソフトウェア（OriginLab, Northampton, MA）を使用して計算した。
〔実施例３〕
ＧＬＰ−１アミドに基づいたプロドラッグの生体活性
Ｉ）ＧＬＰ−オキシントモジュリン
最後の８個のアミノ酸がオキシントモジュリン由来であるＧＬＰ−オキシントモジュリンキメラペプチド（配列番号６１０）を合成した。
ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＫＲＮＲＮＮＩＡ（配列番号６１０）
このキメラペプチドを合成する合理的な背景は、（１）およそ４３００Daの質量のペプチドを合成できることを実証すること及び（２）このペプチドが生物学的に活性があることが示される場合、延長Ｃ末端を有するＧＬＰ−１類縁体を、他の修飾を有するＧＬＰ−１ペプチドの塩基配列として使用できること、という２つであった。
ＧＬＰ−オキシントモジュリンペプチドは、４３２２．５ダルトンの質量を有することが見出された。ＧＬＰ−オキシントモジュリンペプチドの受容体結合活性は、実施例２に記載されているＧＬＰ−受容体ルシフェラーゼアッセイにより、ルシフェラーゼアッセイにおける天然ＧＬＰ−１ペプチドと少なくとも同じ程度に強力であると決定された。
ＩＩ）Ｎ末端へのジペプチドの付加
分子内環化、切断及びジケトピペラジン（ＤＫＰ）又はジケトモルホリン（ＤＭＰ）の形成におけるプロドラッグの能力を研究するために、異なるジペプチドをＧＬＰ−１（ａａ７−３７）のＮ末端に共有結合した。生物学的に不活性なジペプチド延長ＧＬＰ−１ペプチドを、ＤＫＰ又はＤＭＰの形成を伴うアミド結合の切断による活性ペプチド薬剤ＧＬＰ−１（ａａ７−３７）への変換のために設計した。これを図５Ａ及び５Ｂに概略的に表す。多様な半減期を有するプロドラッグは、ジペプチドのアミノ酸の側鎖（Ｒ１及びＲ２）を化学的に修飾することにより想像される。
合成された第１ペプチド（Ｇ５Ｐ６Ｈ７，ＧＬＰ（８−３７）と呼ばれる）は、ＧＬＰ−１（ａａ７−３７）のＮ末端に結合しているＧｌｙ−Ｐｒｏジペプチドを含んだ。ペプチドを、上記に記載された固相合成により合成的に調製した。合成は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析により確認した（３５０９．５Da）。
Ｐｒｏ−Ｐｒｏジペプチド又はＰｒｏ−Ｈｉｓジペプチドのいずれかを含むＧＬＰ−１（ａａ７−３７）に基づいたペプチドプロドラッグを、同様に合成した。ジペプチド延長Ｇｌｙ−Ｐｈｅ又はＰｈｅ−Ｐｈｅを合成して、アミド結合の切断を立体的に補助することによりＤＰＫ形成を促進した。プロリンのシス配向は、ＤＫＰの形成に最適な立体配座をジペプチドが採用するのを促進することに寄与すると仮定された。
Ｐｒｏ−Ｈｉｓジペプチドを含むペプチドに関して、目的のカルボニル結合は、２つのヒスチジン（アミノ酸Ｙ及びヒスチジル離脱基）の間に挟まれていた。この設計は、ジケトピペラジン形成を介したアミド結合のプロトン補助切断を対象とした。
アミド結合の酸塩基触媒された一般的な加水分解は、単一アミノ酸（γ−Ｇｌｕ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ又はＨｉｓ）の付加を含むペプチドを合成することによって試みられた。離脱基が活性ペプチド（ＧＬＰ−１（ａａ７−３７））のＮ末端のヒスチジンであるので、イミダゾール環が、一般的な酸塩基触媒による切断を補助しうることが目的であった。
Ｎ末端延長ペプチドを、それぞれ、ＰＢＳ緩衝剤において３７℃でおよそ１週間インキュベートした。あるいは、ペプチドを、それぞれ１００℃で１２０分間加熱して、アミド結合の切断を加速した。プロドラッグの切断を逆相ＨＰＬＣ及びＭＳで分析した。表１に示されているように、切断されたペプチドのうち、アミド結合の強靱さを示しているものはない（表１）。
表１：天然ＧＬＰ−１（ａａ７−３７）を形成するためのＨ７，ＧＬＰ（７−３７）プロドラッグの切断の試み
Figure 2011511778
 化合物４、５及び６では、単一アミノ酸がＧＬＰ−１のＮ末端に付加された。
全ての場合において、ＧＬＰ−１の１位（ヒスチジル離脱基）にはヒスチジンがある。
これらのデータに基づいて、イミダゾール核は、アミド結合の切断を緩和する役割を果たしたと仮定した。この可能性を試験するために、異なる離脱基を有するペプチドを研究した。具体的には、７位のＨｉｓがＰｈｅで置換されているＧＬＰ−１のａａ７−３７を含むペプチド（Ｆ７，ＧＬＰ（８−３７）と呼ばれる）を、上記に記載された手順を使用して合成し、精製した。このペプチドは、天然ＧＬＰの１０％の抗力を有する完全なアゴニストと決定された。ジペプチドをＦ７，ＧＬＰ（８−３７）のＮ末端に付加して、ジペプチドと活性ペプチド（Ｆ７，ＧＬＰ（８−３７））のＮ末端との間のアミド結合の切断及びＤＫＰの形成について研究した。Ｆ７，ＧＬＰ（８−３７）の第１ペプチドプロドラッグにおいて、Ｇｌｙ−ＰｒｏをＮ末端に付加し、第２ペプチドプロドラッグでは、サルコシンを使用し、このことは、切断速度を増強することが以前に報告されている（Hamel, A. R. et al., (2004) Journal of Peptide Research 63: 147-154）。両方のジペプチド延長はアミド結合の切断を立体的に補助するように設計されているが、アミド結合は、切断に対して耐性の状態を維持した（表２）。
表２：ジペプチド延長Ｆ７，ＧＬＰ（７−３７）の切断の試み
Figure 2011511778
 「ａ」：全ての場合において、ＧＬＰの１位（フェニルアラニン離脱基）にはフェニルアラニンがある。
「ｂ」：Ｓａｒはサルコシンを表す。
ＩＩＩ）Ｆ７，ＧＬＰ（８−３６）−ＣＥＸのＮ末端へのジペプチドの付加
Ｆ７，ＧＬＰ（８−３７）類縁体は、ＰＢＳ中で３７℃で不十分な溶解性を示すことが見出された。したがって、酸基の代わりにＣ末端アミドを有するエキセンディン−４の最後の１０個のアミノ酸を含む、配列番号６１１の修飾ＧＬＰ−１類縁体（ＧＬＰ（７−３６）−ＣＥＸアミドと呼ばれる）を調製した。
Ｈ７ＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＸＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−アミド（配列番号６１１）
ＧＬＰ（７−３６）−ＣＥＸアミドは、天然ＧＬＰ−１配列よりもインビトロにおいておよそ１０倍を超えて強力であることが観察されており、このペプチドの類縁体は、ＰＢＳ中で明らかに溶解度がより高いことが見出されている。
Ｇｌｙ−Ｇｌｙジペプチド（Ｇ５Ｇ６Ｆ７，ＧＬＰ（８−３６）−ＣＥＸ）又はアルファ−アミノ基がヒドロキシル基で置換されたＯＨ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙジペプチド（ＯＨ−Ｇ５Ｇ６Ｆ７，ＧＬＰ（８−３６）−ＣＥＸ）を含む、７位のＨｉｓがＰｈｅに代わっているＧＬＰ（７−３６）−ＣＥＸアミドの類縁体のプロドラッグを合成した。これらのペプチドを試験し、嵩高の少ないグルシル離脱基の効果を調べ、いずれかの求核剤（アミン又はヒドロキシル）が２，５−ジケトピペラジン又は２，５−ジケトモルホリンのそれぞれの形成によりアミド結合を切断し、それによって活性Ｆ７，ＧＬＰ（８−３６）−ＣＥＸペプチドを再生できるかについて決定した。プロドラッグの切断を、上記に記載されたとおりに試験し、結果を表３に示す。
表３：Ｇ７，ＧＬＰ（７−３６）−ＣＥＸのＮ末端へ付加されたジペプチドの切断の試み
Figure 2011511778
 「ａ」：全ての場合において、ＧＬＰの１位（グリシル離脱基）にはグリシンがある。
表３に示されている結果に基づいて、アミド結合は、２，５−ジケトピペラジン（ＤＫＰ）又は２，５−ジケトモルホリン（ＤＭＰ）のいずれかの形成による生理学的条件下での切断が非常に困難であると結論付けられた。このことは、高温下であっても、試験した求核剤及び離脱基と無関係であった。
〔実施例４〕
ＧＬＰ−１エステルに基づいたプロドラッグの生体活性
ＩＶ）デシ−ペプチド及びエステル
デシ−ペプチドは、エステル結合を介して別のペプチドのＮ末端のヒドロキシル基にジペプチドを付加することによって合成した。結合手順は、実験セクションに記載されており、これらは極めて効果的であることが実証された。前記のように、分子内環化（ジケトピペラジン形成）及び母体薬剤（Ｎ末端ヒドロキシルペプチド）の放出について異なる傾向のジペプチドを研究した。ジペプチドを付加するに際し、エステル結合を切断するアミン求核剤とエステル結合を切断するヒドロキシル求核剤の両方を調製し、研究した。
Ｖ）ＨＯ−Ｆ７，ＧＬＰ（８−３６）−ＣＥＸのＯＨ末端へのジペプチドの付加
ＨＯ−Ｆ７，ＧＬＰ（８−３６）−ＣＥＸペプチドを、ＧＬＰ（８−３６）−ＣＥＸ ＰＡＭ樹脂から合成し（合成スキームを図１に表す）、これらの実験において母体薬剤として役立てた。このペプチドは、０．００８nMのＥＣ５０値を有し（図２）、一方、天然ＧＬＰ−１は、０．０１１nMのＥＣ５０値を有す。したがって、ＨＯ−Ｆ７，ＧＬＰ（８−３６）−ＣＥＸは、天然ＧＬＰ−１と少なくとも同じ程度に強力であることが見出された。このことは最も重要であり、ヒスチジンをフェニル乳酸で置換できるので、いくらか予想外の観察である。このことは、追加の評価の根拠となった。続く実験は、同様の結果をもたらした。この結果はＨＯ−Ｆ７，ＧＬＰ（８−３６）−ＣＥＸのＣＥＸ延長の機能である可能性が存在する。この点において、エキセンディン−４のＣ末端領域がＧＬＰ−１受容体への親和性を増加すると報告されている。
ＨＯ−Ｆ７，ＧＬＰ（８−３６）−ＣＥＸのαヒドロキシル基をアシル化し、エステル結合を切断するアミン求核剤（図５Ａ）及びエステル結合を切断するヒドロキシル求核剤（図５Ｂ）の両方を調製し、研究した。図５Ａ及び図５Ｂに示されているように、２，５−ジケトピペラジン（アミン求核剤）又は２，５−ジケトモルホリン（ヒドロキシル求核剤）と共に、生物学的に活性なＨＯ−Ｆ７，ＧＬＰ（８−３６）−ＣＥＸが放出される。
２，５−ジケトピペラジン（ＤＫＰ）又は２，５−ジケトモルホリン（ＤＭＰ）の可能な形成及びＨＯ−Ｆ７，ＧＬＰ（８−３６）−ＣＥＸの同時の生成を探索するために、プロドラッグをＰＢＳ緩衝剤において３７℃でおよそ１週間インキュベートした。またペプチドを１００℃で加熱して、切断に対する感受性を決定した（表４）。
表４：ジペプチド延長ＨＯ−Ｆ７，ＧＬＰ（７−３６）−ＣＥＸの切断
Figure 2011511778
 ＊ｔ１／２はＰＢＳ（ｐＨ７．２）における３７℃でのＨＯ−Ｐｈｅ−ＧＬＰ８−３６−ＣＥＸの５０％放出に必要な時間である。標準的な一次反応プロットにより計算される。＃３含むこれらのエステルは全て１００℃で切断された。全ての場合において、ＧＬＰの１位（ヒドロキシルフェニルアラニン離脱基）にはＨＯ−Ｐｈｅがある。
表４に示されている最初の２つのペプチド（ペプチド１及び２）を分析して、いずれかの求核剤（アミン又はヒドロキシル）がエステル結合をＤＫＰ又はＤＭＰそれぞれの形成により切断できるかを決定した。結果は、エステルがアミドよりも切断に対してより感受性があるという予想を確証した。ペプチド３、４、８、９及び１０の比較的遅い切断速度は、ジペプチド延長（Ｐｈｅ又はＶａｌ）の嵩高がプロドラッグ切断速度に大きく影響を与えたことを示唆している。メチルと水素側鎖の間に実質的に差はないが（ペプチド５、６及び７）、イソプロピル基（β分岐）の存在は、ペプチド３、４及び１０において明白なように、エステル切断の速度を著しく減速させる。ヒドロキシルと比較してアミンがより強力な求核剤であるので、ペプチド１０はペプチド３よりも速く解離し、これは、ペプチド１及び２においても実証されている。最後に、ペプチド８及び９の間のｔ１／２の大きな差は、ジペプチドにおける側鎖の相互作用（図５Ａ及び５ＢのＲ１及びＲ２）も、重要な役割を果たすことを示している。この同じ効果がペプチド３及び４において示されている。両方の場合において、Ｌ、Ｄ−ジペプチドジアステレオ異性体は、対応するＬ，Ｌ−ジアステレオ異性体よりも速く切断される。
ペプチド４、８及び１０の構造を図６Ａ〜６Ｃに表す。観察されたプロドラッグの半減期は、置換基Ｘが嵩高になると増加する（表４のペプチド３、４、８、９及び１０）。これは、おそらく、Ｘの大きさが増加すると遷移状態（ＴＳ）がより立体障害的になるためである。したがって活性化エネルギーが増加し、それによってプロドラッグの安定性が増加する。
これは、２対の立体異性体（ペプチド３と４、８と９）において特に例示されている。ここで、ジペプチド延長のＣ末端の単一アミノ酸の立体化学を変えることによって、速度に大きな差が観察された。対応する遷移状態の立体障害は、Ｌ，Ｄ−ジアステレオ異性体と比較してＬ，Ｌ−ジペプチドジアステレオ異性体においてはるかに大きい。したがって、ペプチド３は、ペプチド４と比較してより大きいｔ１／２を有し、ペプチド８は、ペプチド９よりも大きいｔ１／２を有する。
ペプチド１０は、Ｆ５Ｖ６−Ｏ−Ｆ７，ＧＬＰ（８−３６）−ＣＥＸである。これは６４時間のｔ１／２を有し、生理学的条件下での切断において最長の持続時間のプロドラッグを表す。この場合の遷移状態は、フェニルアラニルとバリル側鎖との立体相互作用のため、かなり妨げられている。
母体薬剤ＨＯ−Ｆ７，ＧＬＰ（８−３６）−ＣＥＸ（４０１９Da）を形成するペプチド１０（図６Ｂ）（４２６４Da）の切断は、分子内環化である。したがって、他の不純物の存在は、内部解離の速度に影響を与えないと想定される。加えて、プロドラッグ及び薬剤の両方を、汚染ペプチドの最中でもＭＡＬＤＩ分析により追跡している。
類似デシペプチドの第２セットも、切断速度に対するジペプチド延長構造の効果を更に試験して研究した（表５）。これらの合成は、図３及び４に概説されたものと同じパターンに従っている。主な差は、この場合では、Ｒ２又はＹ部位が嵩高フェニルアラニルの代わりに障害の少ない水素（グリシル残基）であることである。この場合、グリコール酸（ＯＨ−グリシン）又はグリシンをプロドラッグの末端に使用した。
表５：ＨＯ−Ｇ５Ｘ６−Ｏ−Ｆ７，ＧＬＰ（７−３６）ＣＥＸのエステル結合の切断
Figure 2011511778
 ｔ１／２はＰＢＳ（ｐＨ７．２）における３７℃でのＨＯ−Ｐｈｅ−ＧＬＰ８−３６−ＣＥＸの５０％放出に必要な時間である。標準的な一次反応プロットにより計算される。これらのエステルは全て１００℃で切断された。全ての場合において、ＧＬＰの１位（ヒドロキシルフェニルアラニン離脱基）にはＯＨ−Ｐｈｅがある。１ＡＩＢ：α−アミノイソ酪酸；２ＰｈＧ：フェニルグリシン；３ｔＢｕｔ：第三級ブチル
分析は、既に説明したものと同じ方法で完了した。表４に示されている最初の２つのペプチド（ペプチド１及び２）を分析して、いずれかの求核剤（アミン又はヒドロキシル）がエステル結合を２，５−ジケトピペラジン又は２，５−ジケトモルホリンそれぞれの形成により切断できるかを決定した。これら２つのペプチドを表５により分析し、再度試験して、陽性対照として役立てた。予測したように、研究した求核剤は両方ともエステル結合を切断することができた。この化合物セット（表５の化合物２〜９）は、立体嵩高が除去されているので、前記の場合よりも速く切断すると予測される。Ｘの大きさが構造的に嵩高になると、遷移状態はますます密集してくる。したがって活性化エネルギーが増加し、それによってプロドラッグの安定性が増加する。このことは、Ｘがイソプロピル（バリン）基である化合物１０において見られる（化合物構造については図６Ｄを参照すること）。Ｘが第三級ブチル基（化合物７）である場合、化合物は、３７℃のＰＢＳ緩衝剤（ｐＨ７．２）において全く切断しない。表５において、立体異性体の対（化合物３と４、８と８）は、ほぼ同じ速度で解離する。このことは、おそらく、立体異性体がエネルギーにおいて大きな差を示さないからである（おそらく、グリシンの非キラル性質のためである）。したがって、この場合では、グリシル，Ｌ−ジペプチド延長及びグリシル，Ｄ−ジペプチド延長の両方は、同等のエネルギー遷移状態を有する。
化合物３が化合物１０よりも速く解離するという観察は、ｐＨ７．２及び３７℃でアミンと比較すると、ヒドロキシルがより強力な求核剤であることを示唆している。この異常についての１つの可能な説明は、Ｎ末端アミンのpKaが化合物１０において僅かに増加しているということでありうる。その結果、７．２のｐＨにおいて、アミン求核剤は、不均衡にプロトン化され、したがってプロドラッグ切断のより遅い速度の原因となっている。
したがって、この結果は、側鎖の構造特性（特に、バリン及びtert−ブチルグリシンを含有するジペプチドにおいて明らかなβ分岐）を示し、求核剤の立体化学及びpKaは、切断の相対的速度を決定する役割を果たす。幾つかの速い及び遅い切断エステルプロドラッグ候補が同定され、生物作用能について試験した。
ＶＩ）選択された長期作用プロドラッグ候補のバイオアッセイ
４つの長期持続時間プロドラッグを生物作用能試験による更なる分析のために選択した。全てのペプチドをＨＰＬＣにより精製し、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析により質量を確認した後、ルシフェラーゼに基づいたバイオアッセイを実施した。抗力率を、母体の平均ＥＣ５０と対応するプロドラッグの平均ＥＣ５０とを比較する目的で計算した。結果を表６にまとめる。
表６：選択した長期作用エステルプロドラッグのバイオアッセイ
Figure 2011511778
これらの観察は、エステル結合ジペプチド配列の、母体薬剤の末端ヒドロキシル基への付加が、薬剤の効力を顕著に低減することを明白に示している。２つのペプチドを更に分析して、プロドラッグがＰＢＳ（ｐＨ７．２）における２４時間のインキュベーションの後で母体薬剤の効力に戻るかを決定した。選択されたペプチドは、ｔ１／２値に基づいて類縁体４及び５（表６）であった。
これらの実験は、ＨＰＬＣ精製試料を使用し、ルシフェラーゼに基づいたアッセイにより実施した。効力率の計算は、母体の平均ＥＣ５０とプロドラッグの平均ＥＣ５０とを比較して行った。結果を表７にまとめ、図７及び８に図示する。
表７：プロドラッグから薬剤への変換を示すバイオアッセイの結果
Figure 2011511778
 ＊−ＰＢＳ中で１週間インキュベーションした後の類縁体５（効力はほぼ完全に回復した）
０−括弧内の時間は対応するペプチドのインキュベーションの時間を意味する
表７の類縁体５は、１週間のインキュベーションの後でその効力は母体薬剤に近い効力に変換されている。両方のプロドラッグは、母体薬剤への漸進的変換のため、ＰＢＳ中で２４時間インキュベートされた後、大きな効力を示す（図７及び８を参照すること）。
ＶＩＩ）ペプチドの内部部位からのエステルプロドラッグ
本明細書に開示されているプロドラッグは、生理学的条件下（ｐＨ＝７．２及び温度＝３７℃）で自発的に変換して、母体薬剤を生じる。この変換においては、ｐＨ及び温度に依存しており、それはこれらが生理学的に実質的に不変であるからであり、またこのことは、プロドラッグから活性形態へのあらゆる特定の酵素仲介プロセッシングの必要性を排除する。Ｎ末端に確立されたプロドラッグ化学は、また、エステルプロドラッグを調製することができる内部生体活性部位への使用に転化可能であるはずである。
エステルプロドラッグを作製するために、ジペプチドを付加することができるセリン／トレオニン残基の賢明な選択が探索されてきた。ペプチドは、ＧＬＰ−１の末端での結果と同様の様式で、ジペプチドの付加の前に生物学的に活性でなければならず、付加の後で不活性でなければならない。したがって、ペプチド変種を、プロドラッグ修飾形態の探求の前に、生物学的活性について試験した。
内部部位におけるプロドラッグの合成及び分析
２つのペプチドを、内部プロドラッグ候補開発の可能な出発点として合成した。第１のペプチドは、（Ｈ７Ｆ），（Ｅ９Ｑ），ＧＬＰ（８−３６）−ＣＥＸであり、第２のペプチドは、（Ｈ７Ｆ），（Ｅ９Ｑ），（Ｔ１１Ｓ），ＧＬＰ（８−３６）−ＣＥＸであった。エステルプロドラッグの合成は、第５アミノ酸のヒドロキシル基（（Ｈ７Ｆ），（Ｅ９Ｑ），ＧＬＰ（８−３６）−ＣＥＸ及び（Ｈ７Ｆ），（Ｅ９Ｑ），（Ｔ１１Ｓ），ＧＬＰ（８−３６）−ＣＥＸそれぞれのトレオニン又はセリン側鎖）において試みられた。これらの分子では、１２位のＰｈｅまで、ＰＡＭ樹脂に対してＢｏｃベンジル型合成を実施した。残りの合成は、Ｆｍｏｃに基づいた化学を使用して完了した。このことは、セリン側鎖の保護基を選択的に除去し、多の全ての保護基をそのまま残す機会を与えた。このことは、１１位のセリンの遊離ヒドロキシル基の選択的アシル化を可能にした。
より詳細には、Ｂｏｃベンジル戦略は、セリンのヒドロキシル保護ベンジル基が、除去のためにＨＦ処理を必要とするので、合成の全体にわたって使用することができなかった。したがって、ＨＦ処理が樹脂からペプチドを同時に除去するので、エステルプロドラッグをペプチド樹脂において合成することができなかった。これが、Ｓｅｒを１１位（Ｆｍｏｃ−Ｏ−ｔブチル−Ｌ−セリン）に付加し、続いてＧｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｌａ及びＰｈｅをＦｍｏｃ−保護アミノ酸として付加した理由である。セリンのｔ−ブチル保護基は、ＴＦＡで２時間処理して選択的に除去した。Ｂｏｃ保護ジペプチドプロ部分をこのヒドロキシル基に付加して、エステルプロドラッグの合成を終了させた。最終Ｂｏｃ保護基をＴＦＡで処理して除去し、Ｎ末端Ｆｍｏｃ基をＤＭＦ中２０％ピペリジンで処理して除去した。これは、セリン及びトレオニン残基のヒドロキシル側鎖からジペプチドエステルを構築する有用な戦略であることが見出された。３位のグルタミン酸残基もグルタミンで置換して、側鎖カルボキシル基へのあらゆる不要な結合を防止した。これは、以前の報告が３位はＧＬＰ−１効力にとって重要でないと示唆しているので、活性の損失をもたらさないと想定された。
既に記載したように、ＨＰＬＣによるこれらのペプチドの精製及びＭＡＬＤＩによる質量の確認の後、バイオアッセイを実施した。抗力率を計算し、ペプチド（薬剤候補）の平均ＥＣ５０を天然ＧＬＰ−１の平均ＥＣ５０と比較した。結果を表８にまとめ、図９に示す。
表８：内部セリン／トレオニン薬剤候補のバイオアッセイの結果
Figure 2011511778
 ＧＬＰ−１を基準として使用した。
ペプチド（Ｈ７Ｆ），（Ｅ９Ｑ），ＧＬＰ（８−３６）−ＣＥＸ及び（Ｈ７Ｆ），（Ｅ９Ｑ），（Ｔ１１Ｓ），ＧＬＰ（８−３６）−ＣＥＸは、それぞれ天然ＧＬＰ−１の２０％及び３３．３％の効力を有する完全なアゴニストであった。これら両方のペプチドは、可能性のある薬剤候補として開発するのに十分に強力であると決定された。
Ｇｌｙ−Ｇｌｙジペプチドは、合成の容易さについての初期調査として、ＧＬＰ−１類縁体へ付加されることが想像された。セリン側鎖のヒドロキシル基は、より嵩高のトレオニン側鎖と比較して容易にアシル化された。１つの可能性のあるプロドラッグである（Ｈ７Ｆ），（Ｅ９Ｑ），〔Ｔ１１Ｓ−Ｏβ−（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）〕，ＧＬＰ（８−３６）−ＣＥＸは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙジペプチドをセリン側鎖のヒドロキシル基へ付加することにより合成した。この点において、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ末端エステルプロドラッグのｔ１／２は、約１時間であり（表５）、一方、内部エステルプロドラッグのｔ１／２は、およそ３倍長いことが見出された。
（Ｈ７Ｆ），（Ｅ９Ｑ），〔Ｔ１１Ｓ−Ｏβ−（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）〕，ＧＬＰ（８−３６）−ＣＥＸプロドラッグは、ｔ１／２＝２．７時間で解離して、２，５−ジケトピペラジン（ＤＫＰ）と共に、母体薬剤の（Ｈ７Ｆ），（Ｅ９Ｑ），（Ｔ１１Ｓ），ＧＬＰ（８−３６）−ＣＥＸを生じることが観察された。このプロドラッグの絶対効力は、その半減期が、細胞培養に基づいたルシフェラーゼアッセイにおけるプロドラッグのインキュベーション時間（５時間）よりも短いので、決定されなかった。プロドラッグの半減期（２．７時間）は、ほぼ７０％のプロドラッグが活性実体に５時間で変換したことを示し、したがって、アッセイをこのプロドラッグで正確に実施することができなかった。しかし、内部セリンプロドラッグを活性実体に変換する能力は確立された。
プロドラッグから薬剤への変換条件（ｐＨ＝７．２及び温度＝３７℃）は、生理学的に実質的に不変であるので、ＧＬＰ−１のＯ末端に確立されたプロドラッグ化学を、内部部位からの切断に使用できることも見出された。
〔実施例５〕
以下の実施例において、アミノ酸位置は、野生型で未熟のＧＬＰ−１（配列番号６６７）に従っており、全てのペプチドは、Ｃ末端カルボキシレート基の代わりにＣ末端アミド基を含んだ。
初期平均体重の４９．５ｇを有する６群の糖尿病誘導肥満（ＤＩＯ）マウス（１群あたり８匹のマウス）に、２nmol/kgのＰＢＳビヒクル対照及び下記に記載されたペプチドＡ〜Ｅの１つで腹腔内注射した。
ペプチドＡ（本明細書において「ペプチドＢ（ｄＦ，ｄＦ）」とも呼ばれる）は、ＧＬＰ−１に基づいたペプチドのプロドラッグであり、そのプロドラッグジペプチド部分（ｄ−Ｐｈｅ−ｄＰｈｅ）は、ペプチドＢと呼ばれる生体活性ＧＬＰ−１ペプチドにＯ末端を介して結合している。ペプチドＡは、配列番号６４５のアミノ酸配列を有する。
ペプチドＢ（本明細書において、「ＨＯ−Ｐｈｅ７，Ｇｌｕ２２ ＧＬＰ−Ｃｅｘ」ともよばれる）は、ペプチドＡ及びＣのＧＬＰ−１に基づいたペプチドの非プロドラッグ形態である。ペプチドＢは、配列番号６４６のアミノ酸配列を有し、７位のＨｉｓがフェニル乳酸（ＰＬＡ）で置換され、８位のＡｌａがＡＩＢで置換されている、２２位のＧｌｙがＧｌｕで置換されている、そしてＣ末端がエキセンディン−４のＣ末端アミノ酸により９個のアミノ酸で延長されている点において、天然ＧＬＰ−１（配列番号６６７）と異なっている。
ペプチドＣ（本明細書において「ペプチドＢ（ｄＦ，ｄＶ）」とも呼ばれる）は、ペプチドＢのＧＬＰ−１に基づいたペプチドの第２プロドラッグ形態であり、そのプロドラッグジペプチド部分（ｄ−Ｐｈｅ−ｄ−Ｖａｌ）は、生体活性ＧＬＰ−１ペプチドにＯ末端を介して結合している。ペプチドＣは、配列番号６４７のアミノ酸配列を有する。
ペプチドＤ（本明細書において「Ｓｅｒ１１，Ｇｌｕ２２ ＧＬＰ−Ｃｅｘ」とも呼ばれる）は、ＧＬＰ−１に基づいたペプチドであり、１１位のＴｈｒがＳｅｒで置換されている、８位のＡｌａがＡＩＢで置換されている、２２位のＧｌｙがＧｌｕで置換されている、そしてＣ末端がエキセンディン−４のＣ末端アミノ酸により９個のアミノ酸で延長されている点において、天然ＧＬＰ−１（配列番号６６７）と異なっている。ペプチドＤは、配列番号６４８のアミノ酸配列を有する。
ペプチドＥ（本明細書において「ペプチドＤ Ｓｅｒ１１（ｄＦ，ｄＶ）」とも呼ばれる）は、ペプチドＤのプロドラッグであり、そのプロドラッグジペプチド部分（ｄ−Ｐｈｅ−ｄ−Ｖａｌ）は、生体活性ＧＬＰ−１ペプチドに、１１位のＳｅｒのヒドロキシル基とｄ−Ｖａｌのカルボキシレート基との間に形成されたエステル結合を介して結合している。ペプチドＥは、配列番号６４９のアミノ酸配列を有する。
化合物のうちの１つ又はビヒクル対照の注射の１５分後（０時点）、２５％(w/v）グリコール食塩溶液を、体重１kgあたり１．５ｇの用量で注射した。マウスの血中グルコース濃度を、化合物又はビヒクル対照の注射の時点、グルコース注射の時点、グルコース注射の１５、３０、６０及び１２０分後に測定した。
図１２に示されているように、ペプチドＡ〜Ｅのうちの１つを与えたあらゆる群において、グルコース注射後の血中グルコース濃度は、ビヒクル対照を注射したマウスにおけるグリコール注射後の血中グルコースレベルと比較して上昇しなかった。ペプチドＢ及びＤのプロドラッグ形態（すなわち、ペプチドＡ、Ｃ及びＥ）を注射したマウスの血中グルコース濃度は、ペプチドの対応する非プロドラッグ形態を注射したマウスの血中グルコースレベルよりも高く、ＧＬＰ−１受容体への化合物の最大結合を防止するジペプチドプロドラッグ部分の能力を示している。プロドラッグの差動効果は、プロドラッグがＧＬＰ−１に基づいたペプチドのＮ末端に結合したときに見られる効果と比較して、プロドラッグジペプチド部分が１１位のアミノ酸の側鎖に結合したときのほうが大きかった。
〔実施例６〕
以下の実施例において、アミノ酸位置は、野生型で未熟のＧＬＰ−１（配列番号６６７）に従っており、全てのペプチドは、Ｃ末端カルボキシレート基の代わりにＣ末端アミド基を含んだ。
マウスに２nmol/kgのＰＢＳビヒクル対照又は下記に記載されているペプチドＦ〜Ｈの１つを注射した以外は、実施例５に記載された実験を繰り返した。
ペプチドＦ（本明細書において「ｄｅｓＮＨ２−Ｈｉｓ７，Ｓｅｒ８，Ｇｌｕ２２ ＧＬＰ−Ｃｅｘ」とも呼ばれる）は、ＧＬＰ−１に基づいたペプチドであり、７位のＨｉｓがデスアミノ−Ｈｉｓで置換されている、８位のＡｌａがＳｅｒで置換されている、２２位のＧｌｙがＧｌｕで置換されている、そしてＣ末端がエキセンディン−４のＣ末端アミノ酸により９個のアミノ酸で延長されている点において、天然ＧＬＰ−１（配列番号６６７）と異なっている。ペプチドＦは、配列番号６５０のアミノ酸配列を有する。
ペプチドＧ（本明細書において「ペプチドＦ−Ｓｅｒ２（ｄＦ，ｄＶ）」とも呼ばれる）は、ペプチドＦのプロドラッグであり、そのプロドラッグジペプチド部分（ｄ−Ｐｈｅ−ｄＶａｌ）は、ペプチドＦに、ペプチドＦの２位のＳｅｒのヒドロキシル基とｄ−Ｖａｌのカルボキシレート基との間に形成されたエステル結合を介して結合している。ペプチドＧは、配列番号６５１のアミノ酸配列を有する。
ペプチドＨ（本明細書において「ペプチドＡ−Ｓｅｒ２（ｄＦ，ｄＶ）」とも呼ばれる）は、本明細書においてペプチドＸ（Ｈｉｓ７，Ｓｅｒ８，Ｇｌｕ２２ ＧＬＰ−Ｃｅｘ）と呼ばれるＧＬＰ−１に基づいたペプチドプロドラッグである。ペプチドＸは、８位のＡｌａがＳｅｒで置換されている、２２位のＧｌｙがＧｌｕで置換されている、そしてＣ末端がエキセンディン−４のＣ末端アミノ酸により９個のアミノ酸で延長されている点において、天然ＧＬＰ−１（配列番号６６７）と異なっている。ペプチドＨのプロドラッグジペプチド部分（ｄＰｈｅ−ｄＶａｌ）は、ペプチドＸに、ペプチドＸの２位のＳｅｒのヒドロキル基とｄ−Ｖａｌのカルボキシレート基との間に形成されたエステル結合を介して結合している。ペプチドＨは、配列番号６５２のアミノ酸配列を有する。
マウスの血中グルコースレベルを、実施例５に記載されたとおりに測定した。図１３に示されているように、ペプチドＦ〜Ｈは、グリコールの注射を受けたマウスにおいて、血中グルコースの上昇を抑制した。ペプチドＦのプロドラッグ形態（すなわち、ペプチドＧ）を注射したマウスの血中グルコース濃度は、対応する非プロドラッグ形態を注射したマウスの血中グルコースレベルよりも高く、ＧＬＰ−１受容体へのペプチドの最大結合を防止するジペプチドプロドラッグ部分の能力を示している。
〔実施例７〕
以下の実施例において、アミノ酸位置は、野生型で未熟のＧＬＰ−１（配列番号６６７）に従っており、全てのペプチドは、Ｃ末端カルボキシレート基の代わりにＣ末端アミド基を含んだ。
マウスに０．６７nmol/kgの水ビヒクル対照又は実施例５及び６に記載されたペプチドＤ、Ｅ、Ｆ及びＧの１つを注射した以外は、実施例５に記載された実験を繰り返した。 マウスの血中グルコースレベルを、実施例５に記載されたとおりに測定した。図１４に示されているように、ＧＬＰ−１に基づいたペプチドのプロドラッグ形態を注射したマウスは、対応する非プロドラッグ形態を注射したマウスのグルコースレベルと比較して、グルコースを注射したときに高い血中グルコースレベルを示した。これらのデータは、ＧＬＰ−１受容体へのＧＬＰ−１に基づいたペプチドの最大結合を防止するプロドラッグ部分の能力を示す。
〔実施例８〕
以下の実施例において、アミノ酸位置は、野生型で未熟のＧＬＰ−１（配列番号６６７）に従っており、全てのペプチドは、Ｃ末端カルボキシレート基の代わりにＣ末端アミド基を含んだ。
初期平均体重の５６ｇを有する９群の糖尿病誘導肥満（ＤＩＯ）マウス（１群あたり８匹のマウス）に、１５又は７０nmol/kgの下記に記載されているペプチドＹ、Ｚ、Ｆ−Ｐｅｇ及びＧ−Ｐｅｇ又はＰＢＳビヒクル対照を１回腹腔内注射し、１週間追跡した。
ペプチドＹ（本明細書において「Ａｉｂ８，Ｇｌｕ２２ ＧＬＰ−Ｃｅｘ ４０ｋＰｅｇ」とも呼ばれる）は、ＧＬＰ−１に基づいたペプチドであり、８位のＡｌａがＡＩＢで置換されている、２２位のＧｌｙがＧｌｕで置換されている、３０位のＡｌａが、４０kDaのＰＥＧに共有結合しているＣｙｓで置換されている、そしてＣ末端がエキセンディン−４のＣ末端アミノ酸により９個のアミノ酸で延長されている点において、天然ＧＬＰ−１（配列番号６６７）と異なっている。ペプチドＹは、配列番号６５３のアミノ酸配列を有する。
ペプチドＺ（本明細書において「ＧＬＰ Ａｉｂ８，Ｓｅｒ１１（ｄＦ，ｄＶ）Ｇｌｕ２２ ＧＬＰ−Ｃｅｘ ４０ｋＰｅｇ」とも呼ばれる）は、ＧＬＰ−１に基づいたペプチドのプロドラッグであり、８位のＡｌａがＡＩＢで置換されている、１１位のＴｈｒがＳｅｒで置換されている、２２位のＧｌｙがＧｌｕで置換されている、３０位のＡｌａが、４０kDaのＰＥＧに共有結合しているＣｙｓで置換されている、そしてＣ末端がエキセンディン−４のＣ末端アミノ酸により９個のアミノ酸で延長されている点において、天然ＧＬＰ−１（配列番号６６７）と異なっている。ペプチドＺのプロドラッグジペプチド部分（ｄ−Ｐｈ３−ｄ−Ｖａｌ）は、ＧＬＰ−１に基づいたペプチドに、１１位（配列番号６６７の番号付けによる）のＳｅｒのヒドロキシル基とｄ−Ｖａｌのカルボキシレートとの間に形成されたエステル結合を介して結合している。ペプチドＺは、配列番号６５４のアミノ酸配列を有する。
ペプチドＦ−Ｐｅｇ（本明細書において「ＧＬＰ ｄｅｓ−ＮＨ２Ｈｉｓ７，Ｓｅｒ８，Ｇｌｕ２２−Ｃｅｘ ４０ｋＰｅｇ」とも呼ばれる）は、ＧＬＰ−１に基づいたペプチドであり、７位のＨｉｓがデスアミノ−Ｈｉｓで置換されている、８位のＡｌａがＳｅｒで置換されている、２２位のＧｌｙがＧｌｕで置換されている、３０位のＡｌａが、４０kDaのＰＥＧに共有結合しているＣｙｓで置換されている、そしてＣ末端がエキセンディン−４のＣ末端アミノ酸により９個のアミノ酸で延長されている点において、天然ＧＬＰ−１（配列番号６６７）と異なっている。ペプチドＦ−Ｐｅｇは、配列番号６５５のアミノ酸配列を有する。
ペプチドＧ−Ｐｅｇ（「ＧＬＰ ｄｅｓ−ＮＨ２Ｈｉｓ７，Ｓｅｒ８（ｄＦｄＶ），Ｇｌｕ２２−Ｃｅｘ ４０ｋＰｅｇ」と呼ばれる）は、ペプチドＦのプロドラッグであり、そのプロドラッグジペプチド部分（ｄ−Ｐｈｅ−ｄ−Ｖａｌ）は、８位のＳｅｒのヒドロキシル基とｄ−Ｖａｌのカルボキシレートとの間に形成されたエステル結合を介して結合している。ペプチドＧ−Ｐｅｇは、配列番号６５６のアミノ酸配列を有する。
ペプチドのうちの１つ又はビヒクル対照の注射の６０分後（０時点）、２５％(w/v）グリコール食塩溶液を、体重１kgあたり１．５ｇの用量で注射した。マウスの血中グルコース濃度を、ペプチド又はビヒクル対照の注射の時点（−６０時点）、グルコース注射の時点（０時点）、グルコース注射の１５、３０、６０及び１２０分後に測定した。
図１５に示されているように、ペプチドＹ、Ｚ、Ｆ−Ｐｅｇ、Ｇ−Ｐｅｇのいずれかを注射したマウスの群の血中グルコース濃度は、ビヒクル対照を注射したマウスの血中グルコースレベルと比較して低かった。
各群のそれぞれのマウスの体重を、ビヒクル対照又はペプチドの注射の１、３、５及び７日後に測定した。体重の総変化は、ビヒクル又はペプチドの注射の時点の群の平均体重を、注射の７日後の群の平均体重から引いて計算した。マウスの各群の食餌摂取も、１週間の間測定した。総食餌摂取を、ビヒクル対照又はペプチドの注射の７日後に測定した。図１７に示されているように、総食餌摂取は、ペプチドＹ、Ｚ、Ｆ−Ｐｅｇ、Ｇ−Ｐｅｇのいずれかを注射した全てのマウスの群において減少した。ペプチドＹは、食欲の減少及び体重の減少において４つのペプチドのうち最も強力であると思われた。この結果は、天然アミノ酸配列の機能である。Ｓｅｒ１１置換又はデス−アミノＨｉｓ７は全体的な効能を低減する。重要なことには、ペプチドＦ−Ｐｅｇ及びＧ−Ｐｅｇが同様に機能を果たし、エステルプロドラッグのみが導入されたとき、１週間の研究にわたって測定された全体的な効能が同等であることを示している。
〔実施例９〕
以下のアッセイを使用して、生体活性ペプチドの溶解性、受容体結合活性及び安定性について試験する。
グルカゴン溶解性アッセイ：
グルカゴン（又は類縁体）の溶液（１mg/ml又は３mg/ml）を０．０１NのＨＣｌで調製する。１００ulの原液を、０．０１NのＨＣｌで１mlに希釈し、ＵＶ吸光度（２７６nm）を決定する。残りの原液のｐＨを、２００〜２５０μlの０．１M Ｎａ２ＨＯＰ４（ｐＨ９．２）を使用して、ｐＨ７に調整する。溶液を４℃で一晩放置し、次に遠心分離する。次に１００μlの上澄みを、０．０１NのＨＣｌで１mlに希釈し、ＵＶ吸光度を決定する（２回繰り返す）。
初期吸光度の読み取りを容量の増加で補正し、以下の計算を使用して、溶解率を確立する：
最終吸光度／初期吸光度×１００＝溶解率
グルカゴン受容体結合アッセイ
グルカゴン受容体へのペプチドの親和性を、シンチレーション近接アッセイ技術を利用する競争結合アッセイにより測定する。シンチレーション近接アッセイ緩衝剤（０．０５Mのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１５MのＮａＣｌ、０．１％w/vのウシ血清アルブミン）により作製したペプチドの一連の３倍希釈を、０．０５nMの（３−〔１２５Ｉ〕−ヨードチロシル）Ｔｙｒ１０グルカゴン（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）、１ウエルあたり１〜６マイクログラムの、ヒトグルカゴン受容体を過剰発現している細胞から調製した原形質膜画分及び１mg／ウエルのポリエチレンイミン処理ムギ胚芽凝集素Ａ型シンチレーション近接アッセイビーズ（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）を有する、９６ウエル白色／透明底プレート（Corning Inc., Acton, MA）で混合する。ロータリー振とう器により８００rpmで５分間振とうしてから、プレートを室温で１２時間インキュベートし、次にMicroBetal450液体シンチレーションカウンター（Perkin-Elmer, Wellesley, MA）で読み取る。試験試料の最高濃度よりも４倍高い濃度の「コールドの」天然リガンドを入れたウェルで非特異的結合（ＮＳＢ）放射能を測定し、、競合物質を入れなかったウェルで総結合放射能をで検出した。特異的結合の率を以下のように計算する：特異的結合率＝（（結合−ＮＳＢ）／（総結合−ＮＳＢ））×１００。ＩＣ５０値は、Originソフトウェア（OriginLab, Northampton, MA）を使用して決定する。
グルカゴン類縁体の安定性アッセイ
各グルカゴン類縁体を水又はＰＢＳに溶解し、初期ＨＰＬＣ分析を実施する。ｐＨを調整した後（４、５、６、７）、試料を３７℃で特定の時間インキュベートし、ＨＰＬＣにより再び分析して、ペプチドの完全性を決定する。特定の目的のペプチドの濃度を決定し、無傷まま残っている率を初期分析と比較して計算する。
〔実施例１０〕
グルカゴン関連類縁体ペプチドの名称は、以下のように読まれるべきである：語「グルカゴン」の後に続く括弧で示されている範囲は、ペプチドに存在するグルカゴンのアミノ酸を示し、グルカゴンの天然アミノ酸のアミノ酸置換は、語「グルカゴン」の前の、数字が後に続いているアミノ酸の存在（例えば、ＰＬＡ６、Ｅ９、Ｇｌｕ９など）により示されている。アミノ酸の後に続いている数詞（例えば、「ＰＬＡ６」の「６」）は、天然グルカゴン（配列番号６１２）の番号付けによるアミノ酸の位置を示す。
以下の手順を使用して、多様なグルカゴン関連類縁体ペプチドを作製する。
〔ＰＬＡ６，Ｅ９〕グルカゴン（６−２９）アミドの合成
ペプチド配列ＴＳＥＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴ（配列番号９５１；〔Ｅ３〕グルカゴン（７−２９））を、最初に、カップリング試薬として０．１mmolのＤＩＣ／ＨＯＢＴを使用する０．１mmolのRink ＭＢＨＡアミドを用いる０．１mmolのＦｍｏｃ／ＨＯＢＴ／ＤＣＣ化学プログラムを使用した、ABI 433A自動ペプチド合成機により固相合成した。以下のＦｍｏｃアミノ酸を使用した：Ａｌａ、Ａｒｇ（Ｐｍｃ）、Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｍｅｔ、ＰＬＡ、Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）、Ｔｙｒ（ｔＢｕ）及びＶａｌ。
自動合成の後、ペプチジル樹脂を、３フェニル乳酸（８３mg、０．５mmol）及びＤＥＰＢＴ（１５０mg、０．５mmol）と、４mlの５％ＤＩＥＡ／ＤＭＦ中、約２時間手動で結合させて、以下の配列を有するペプチジル樹脂を得た：ＨＯ−ＰＬＡ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−ＮＨ２（配列番号９５０）。
ペプチジル樹脂を、０．５ｇのフェノール、０．５mlの水及び０．５mlのチオアニソールの添加を伴う、８．５mlのＴＦＡにより、室温で２時間処理した。ＴＦＡに溶解したペプチドを濾過し、４０mlのエーテルを加えて、ペプチドを沈殿させた。粗ペプチドを遠心分離し、酢酸水溶液に溶解し、凍結乾燥した。粗ペプチド収量は２００〜２５０mgであり、精製した後、収量は、純度９５％のペプチドが２５〜４０mg（総収率１０〜１５％）であった。ペプチドを一般的な分析ＨＰＬＣで分析したところ７．６６分の保持時間を示し、ＥＳＩ−ＭＳ分析は、ペプチド分子量２９８６．３に相当する所望質量の２９８６．０を示した。
同様の手順を使用して、分析ＨＰＬＣで７．２５分及び計算分子量の２９７３．３に相当するＥＳＩ−ＭＳの２９７３．５を有する〔ＰＬＡ６，Ｄ９〕グルカゴン（６−２９）アミド；分析ＨＰＬＣで７．４６分及び計算分子量の２９７３．３に相当するＥＳＩ−ＭＳの２９７３．０を有する〔ＰＬＡ６，Ｄ９，Ｄ２８〕グルカゴン（６−２９）アミド；分析ＨＰＬＣで７．２０分及び計算分子量の３００２．３に相当するＥＳＩ−ＭＳの３００２．０を有する〔ＰＬＡ６，Ｃ８，Ｅ９〕グルカゴン（６−２９）アミド；分析ＨＰＬＣで７．３８分及び計算分子量の３００２．３に相当するＥＳＩ−ＭＳの３００２．０を有する〔ＰＬＡ６，Ｅ９，Ｃ１６〕グルカゴン（６−２９）アミド；分析ＨＰＬＣで７．３３分及び計算分子量２９６１．３に相当するＥＳＩ−ＭＳの２９６１．０を有する〔ＰＬＡ６，Ｅ９，Ｃ２４〕グルカゴン（６−２９）アミド；分析ＨＰＬＣで７．４３分及び計算分子量の２９４７．３に相当するＥＳＩ−ＭＳの２９４７．０を有する〔ＰＬＡ６，Ｄ９，Ｃ２４〕グルカゴン（６−２９）アミド；分析ＨＰＬＣで７．２８分及び計算分子量の３９２４．３に相当するＭＡＬＤＩ−ＭＳの３９２５．５を有する〔ＰＬＡ６，Ｅ９，Ｃ４０〕グルカゴン（６−４０）アミドのペプチドを合成した。
〔ｈＣｙｓ（ＳＯ３Ｈ）９〕グルカゴン（６−２９）アミドの合成
ペプチド配列ＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮ（配列番号９５１；グルカゴン（１０−２９））を、最初に、カップリング試薬として０．１mmolのＤＩＣ／ＨＯＢＴを使用する０．１mmolのRink ＭＢＨＡアミドを用いる０．１mmolのＦｍｏｃ／ＨＯＢＴ／ＤＣＣ化学プログラムを使用した、ABI 433 A自動ペプチド合成機により固相合成した。
自動合成した後、ペプチジル樹脂を、Ｆｍｏｃ−ホモＣｙｓ（ＳＯ３Ｎａ）−ＯＨ（１３０mg、０．３mmol）、ＨＯＢＴ（４５．２mg、０．３３mol）及びＤＩＣ（５２．０ul、０．３３mol）と、４mlのＤＭＦ中、手動で約２時間結合させた。ニンヒドリン試験の後、半分のペプチジル樹脂（０．０５mmol）を、残りの３つのアミノ酸Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＰｈｅと更に自動的に組み合わせて、以下の配列のペプチジル樹脂を得た：Ｈ２Ｎ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−ホモＣｙｓ（ＳＯ３Ｈ）−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−ＮＨ２（配列番号９５２）。
以下のＦｍｏｃアミノ酸を使用した：Ａｌａ、Ａｒｇ（Ｐｍｃ）、Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、ホモＣｙｓ（ＳＯ３Ｎａ）、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）、Ｔｙｒ（ｔＢｕ）及びＶａｌ。
ペプチジル樹脂を、０．５ｇのフェノール、０．５mlの水及び０．５mlのチオアニソールの添加を伴う、８．５mlのＴＦＡにより、室温で２時間処理した。ＴＦＡに溶解したペプチドを濾過し、４０mlのエーテルを加えて、ペプチドを沈殿させた。粗ペプチドを遠心分離し、酢酸水溶液に溶解し、凍結乾燥した。粗ペプチド収量は１００〜１３０mgであり、精製した後、１５〜２０mg（総収率１０〜１５％）のペプチドを純度９５％で得た。ペプチドを一般的な分析ＨＰＬＣで分析したところ６．７３分の保持時間を示し、ＥＳＩ−ＭＳ分析は、ペプチド分子量３０２１．３に相当する所望質量の３０２１．０を示した。
同様の手順によって、分析ＨＰＬＣで保持時間６．８２分、及びＥＳＩ−ＭＳで計算分子量の３１２２．４に相当する３１２２．５を示す〔ｈＣｙｓ（ＳＯ３Ｈ）９〕グルカゴン（５−２９）アミド；分析ＨＰＬＣで保持時間６．８３分、及びＥＳＩ−ＭＳで計算分子量の３１７９．３に相当する３１７８．５を示す〔ｈＣｙｓ（ＳＯ３Ｈ）９〕グルカゴン（４−２９）アミド；分析ＨＰＬＣで保持時間６．７９分、及びＥＳＩ−ＭＳで計算分子量の３３９４．７に相当する３３９４．５を示す〔ｈＣｙｓ（ＳＯ３Ｈ）９〕グルカゴン（２−２９）アミド；分析ＨＰＬＣで保持時間７．１７分、及びＥＳＩ−ＭＳで計算分子量の３０２２．３に相当する３０２２．０を示す〔ＰＬＡ６，ｈＣｙｓ（ＳＯ３Ｈ）９〕グルカゴン（６−２９）アミドを合成した。
〔ＰＬＡ６，Ｅ９，Ｃ２４（１．２Ｋ）〕グルカゴン（６−２９）アミドの合成
２０mg（０．００６７５mmol）の〔ＰＬＡ６，Ｅ９，Ｃ２４〕グルカゴン（６−２９）アミド及び１２．５mg（０．０１mmol）のｍ−ｄＰＥＧＴＭ２４−ＭＡＬ（分子量１２３９、Quanta biodesign Ltd. Powell, OH）を、９mlの２５％アセトニトリル水及び１mlの１Mトリス塩基緩衝剤（ｐＨ８．０〜８．５に調整）に溶解した。反応物を室温で撹拌し、反応の進行を分析ＨＰＬＣによりモニターした。ＨＰＬＣにより初期生成物が何も検出されなかった後（約２時間後）、反応混合物を分取ＨＰＬＣにより直接精製した。
凍結乾燥した後、分析ＨＰＬＣの分析が保持時間７．４８分を示し、ＥＳＩ−ＭＳで計算値〔Ｍ＋Ｈ２Ｏ〕の４２１８．０に相当する４２１８．５を示した、約１０〜１２mgの〔ＰＬＡ６，Ｅ９，Ｃ２４（１．２Ｋ）〕グルカゴン（６−２９）アミドを得た。
同様の手順を使用して、分析ＨＰＬＣの分析が７．２５分の保持時間を示し、ＥＳＩ−ＭＳが計算分子量の４３２７．８に相当する４３２７．５を示す〔Ｃ５（１．２Ｋ），Ｅ９〕グルカゴン（５−２９）アミド；分析ＨＰＬＣの分析が７．２５分の保持時間を示し、ＥＳＩ−ＭＳが計算〔Ｍ＋Ｈ２Ｏ〕の４２５９．０に相当する４２６０．０を示す〔Ｃ８（１．２Ｋ），Ｅ９〕グルカゴン（６−２９）アミドを合成した。
〔ＰＬＡ６，Ｅ９，Ｃ２４（２０Ｋ）〕グルカゴン（６−２９）アミドの合成
１５mg（０．００５mmol）の〔ＰＬＡ６，Ｅ９，Ｃ２４〕グルカゴン（６−２９）アミド及び１４０mg（０．００６mmol）の２０Ｋ ｍ−ＰＥＧ−ＭＡＬ（分子量約２２Ｋ、Nektar, Huntsville, AL）を、９mlの２５％アセトニトリル水及び１mlの１Mトリス塩基緩衝剤（ｐＨ８．０〜８．５に調整）に溶解した。反応物を室温で撹拌し、反応の進行を分析ＨＰＬＣによりモニターした。ＨＰＬＣにより初期生成物が何も検出されなかった後（約６時間後）、反応混合物を分取ＨＰＬＣにより直接精製した。画分を、２１４nmの分析ＨＰＬＣにより調べ、また、２８０nmのＵＶで測定した。９０％のＨＰＬＣ純度を有し、ＵＶ測定による高吸光度（Ａ２８０nm＝１．０〜２．０）も有する画分をまとめ、凍結乾燥した。分析ＨＰＬＣの分析が８．５〜８．６分の保持時間を示し、ＭＡＬＤＩ−ＭＳが２４Ｋ〜２６Ｋの幅広い質量分析を示す、約６０〜８０mgの〔ＰＬＡ６，Ｅ９，Ｃ２４（２０Ｋ）〕グルカゴン（６−２９）アミドを得た。
同様の手順を使用して、〔ＰＬＡ６，Ｃ８（２０Ｋ），Ｅ９〕グルカゴン（６−２９）アミド、〔ＰＬＡ６，Ｅ９，Ｃ１６（２０ｋDa〕グルカゴン（６−２９）アミド、〔ＰＬＡ６，Ｅ９，Ｃ４０（２０ｋDa）〕グルカゴン（６−４０）アミド、〔ＰＬＡ６，Ｄ９，Ｃ１６（２０Ｋ）〕グルカゴン（６−２９）アミド及び〔ＰＬＡ６，Ｄ９，Ｃ２４（２０Ｋ）〕グルカゴン（６−２９）アミドを合成した。
〔ＰＬＡ６，Ｅ９，Ｃ２４（４０ｋDa）〕グルカゴン（６−２９）アミドの合成
１５mg（０．００５mmol）の〔ＰＬＡ６，Ｅ９，Ｃ２４〕グルカゴン（６−２９）アミド及び２４０mg（０．００６mmol）の４０Ｋ ｍ−ＰＥＧ−ＭＡＬ（分子量約４０Ｋ、Chirotech Technology Ltd., Cambs CB4 OWG, Germany）を、１８mlの２５％アセトニトリル水及び２mlの１Mトリス塩基緩衝剤（ｐＨ８．０〜８．５に調整）に溶解した。反応物を室温で撹拌し、反応の進行を分析ＨＰＬＣによりモニターした。ＨＰＬＣにより初期生成物が何も検出されなかった後（約６時間後）、反応混合物を分取ＨＰＬＣにより直接精製した。画分を、２１４nmの分析ＨＰＬＣにより調べ、また、２８０nmのＵＶで測定した。９０％のＨＰＬＣ純度を有し、ＵＶ測定による高吸光度（Ａ２８０nm＝１．０〜２．０）も有する画分をまとめ、凍結乾燥した。分析ＨＰＬＣの分析が８．６０〜８．８分の保持時間を示す、約１００〜１２０mgの〔ＰＬＡ６，Ｅ９，Ｃ２４（４０Ｋ）〕グルカゴン（６−２９）アミドを得ることができる。
同様の手順を使用して、〔ＰＬＡ６，Ｃ８（４０Ｋ），Ｅ９〕グルカゴン（６−２９）アミド、〔ＰＬＡ６，Ｅ９，Ｃ１６（４０Ｋ）〕グルカゴン（６−２９）アミド、〔ＰＬＡ６，Ｅ９，Ｃ４０（４０Ｋ）〕グルカゴン（６−４０）アミド、〔ＰＬＡ６，Ｄ９，Ｃ１６（４０Ｋ）〕グルカゴン（６−２９）アミド及び〔ＰＬＡ６，Ｄ９，Ｃ２４（４０Ｋ）〕グルカゴン（６−２９）アミドを合成した。
二量体〔ＰＬＡ６，Ｅ９，Ｃ２４〕グルカゴン（６−２９）アミドの合成
２０mg（０．００６７５mmol）の〔ＰＬＡ６，Ｅ９，Ｃ２４〕グルカゴン（６−２９）アミドを６mlのＰＢＳ緩衝剤、１mlの１Mトリス塩基（ｐＨ８．０〜８．５に調整）及び３mlのＤＭＳＯに溶解した。反応混合物を開放容器中で撹拌し、分析ＨＰＬＣにより２時間毎にモニターした。初期生成物（ＨＰＬＣ ＲＴにより７．４分）が無くなった後、そして二量体生成物（ＨＰＬＣ ＲＴにより７．４分）が生成物において優勢になった後（１２時間後）、混合物を０．１％ＴＦＡ １０％アセトニトリル水で希釈し、分取ＨＰＬＣにより直接精製した。凍結乾燥した後、計算分子量の５９２０．６に相当するＥＳＩ−ＭＳの５９２０．０を有する、約６〜８mgの二量体〔ＰＬＡ６，Ｅ９，Ｃ２４〕グルカゴン（６−２９）アミドを得た。
同様の手順を使用して、計算分子量の５９１６．６に相当するＥＳＩ−ＭＳの５９１６．０を有する二量体〔Ｃ９〕グルカゴン（６−２９）アミド及び計算分子量の６１７４．８に相当するＥＳＩ−ＭＳの６１７４．０を有する二量体〔Ｃ５，Ｅ９〕グルカゴン（５−２９）アミドを合成した。
アシル化及び／又はペグ化ペプチドを以下のように調製する。
ペプチドは、CS Bio 4886 Peptide Synthesizer又はApplied Biosystems 430A Peptide Synthesizerのいずれかを使用して、固体支持樹脂上に合成する。Schnolzer et al., Int. J. Peptide Protein Res. 40: 180-193（1992）に記載されている現場中和化学を使用する。アシル化ペプチドでは、アシル化される標的アミノ酸残基（例えば、１０位）をＮε−ＦＭＯＣリシン残基で置換する。ＤＭＦ中の２０％ピペリジンによる、合成の完了したＮ末端ＢＯＣ保護ペプチドの３０分間の処理によって、ＦＭＯＣ／ホルミル基を除去する。遊離ε−アミノＬｙｓ残基への結合は、ＦＭＯＣ保護スペーサーアミノ基（例えば、ＦＭＯＣ−（Ｎ−ＢＯＣ）−トリプトファン−ＯＨ）又はアシル鎖（例えば、Ｃ１７−ＣＯＯＨ）のいずれかの１０倍モル過剰量と、ＤＭＦ／ＤＩＥＡ中のＰｙＢＯＰ又はＤＥＰＢＴカップリング試薬との結合により達成される。その後のスペーサーアミノ酸のＦＭＯＣ基の除去に続いて、アシル鎖との結合が繰り返される。１００％ＴＦＡによる最終処理は、あらゆる側鎖保護基及びＮ末端ＢＯＣ基の除去をもたらす。ペプチド樹脂を、５％ＤＩＥＡ／ＤＭＦで中和し、乾燥し、次にＨＦ／ｐ−クレゾール９５：５を０℃で１時間使用して支持体から切断する。エーテル抽出の後、５％ＨＯＡｃ溶液を使用して粗ペプチドを溶媒和する。次に溶液の試料を、正確な分子量のペプチドを含有しているかについてＥＳＩ−ＭＳにより確認する。正確なペプチドを、１００％ＣＨ３ＣＮ中の１０％ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡから０．１％ＴＦＡの直線勾配を使用してＲＰ−ＨＰＬＣにより精製する。Vydac C18の２２mm×２５０mmタンパク質カラムを精製に使用する。アシル化ペプチド類縁体は、一般に、緩衝剤比率の２０：８０で完全に溶離する。一部を一緒にプールし、分析ＲＰ−ＨＰＬＣにより純度を調べる。純粋な画分を凍結乾燥して、白色の固体ペプチドを得る。
ペプチドがアシル化されるラクタム架橋及び標的残基を含む場合、アシル化は、ペプチド主査へのアミノ酸の付加に加えて、上記に記載されたとおりに実施される。
ペプチドペグ化では、４０kDaのメトキシポリ（エチレングリコール）マレイミド−プロピオンアミド（Chirotech Technology Ltd.）を、ペプチドとＰＥＧの両方を溶解して透明な溶液にするのに必要な最小量の溶媒（一般に、２〜３mgのペプチドを使用する反応において２mL未満）を使用して、７Mの尿素、５０mMのトリス−ＨＣｌ緩衝剤中のモル当量のペプチドと反応させる。室温での激しい撹拌を開始して４〜６時間行い、反応を分析ＲＰ−ＨＰＬＣにより分析する。ペグ化生成物は、保持時間が減少しているので出発物質と異なっていると思われる。精製は、初期ペプチド精製に使用した条件と同じ条件のVydac C4カラムにより実施する。溶離は、緩衝剤比率が５０：５０の付近で生じる。純粋なペグ化ペプチドの画分が見出され、凍結乾燥する。
コレステロール化ペプチドの合成
コレステロール修飾ペプチドは、ラクタム化ペプチドをブロモアセチル化コレステロール誘導体と溶液中で結合することによって調製した。ペプチドは、従来の固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を使用して組み立てた。ＰＬＡ誘導体化ペプチド鎖はラクタム架橋を介して環化した。標準的な切断手順及び精製方法を適用して、所望のデプシペプチドを得た。
〔実施例〕
コレステロール結合ラクタム架橋ペプチド〔ＰＬＡ６，Ｋ１０（ＣＯＣＨ２ＣＨ２Ｓ−Ｃｈｏｌ），Ｅ１６Ｋ２０（ラクタム），Ｄ２８〕Ｇ（２−２９）アミドの合成
配列ＨＯ−ＰＬＡ−ＴＳＤＫＳＫＹＬＤＥＲＲＡＫＤＦＶＱＷＬＭＤＴを有するペプチジル樹脂〔ＰＬＡ６，Ｋ１０，Ｅ１６，Ｋ２０，Ｄ２８〕グルカゴン（６−２９）は、０．２mmolのＭＢＨＡアミド樹脂を用い、カップリング試薬としてＤＥＰＢＴを用いるABI 430A自動ペプチド合成機を使用した固相Ｂｏｃ化学により合成した。以下のＢｏｃアミノ酸を使用した：Ａｌａ、Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ａｓｐ（ＯｃＨｘ）、Ａｓｎ（Ｘａｎ）、Ｇｌｕ（ＯｃＨｘ）、Ｇｌｎ（Ｘａｎ）、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ（２−Ｃｌ−Ｚ）、Ｍｅｔ、ＰＬＡ、Ｓｅｒ（ＯＢｚｌ）、Ｔｈｒ（ＯＢｚｌ）、Ｔｒｐ（ＨＯＣ）、Ｔｙｒ（２，６−ジ−Ｃｌ−Ｂｚｌ）及びＶａｌ（但し、１６位のグルタミン酸は、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＦｍ）−ＯＨにより組み込まれ、２０位のリシンは、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨにより組み込まれ、１０位のリシンは、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨにより組み込まれた）。ＤＭＦ中２０％ピペリジンにより１６及び２０位のＦｍ及びＦｍｏｃ保護基を除去した後、ペプチジル樹脂を１０％ＤＩＥＡ／ＤＭＦ中のＤＥＰＢＴ ３００mg（１mmol）で４時間処理して、ラクタム架橋を形成した。このラクタム架橋ペプチジル樹脂を、１０mLのＣＨＣｌ３中の１００mg（０．４当量）のＰｄ（ＰＰｈ３）４、１２０uLのＰｈＳｉＨ３、０．２５mLのＮ−メチルモルホリン及び０．５mLの酢酸から構成される溶液によりＮ2雰囲気下で約３時間処理して、Ａｌｌｏｃ基を除去した。次に３−トリチルチオプロピオン酸をＤＥＰＢＴと結合して、ＨＯ−ＰＬＡ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＳＨ）−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ＊−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｙｓ＊−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−ＮＨ２（＊はラクタム架橋である）の配列を有するペプチジル樹脂を得た。
ペプチジル樹脂を液体フッ化水素で処理して、固体支持体から粗ペプチドを切断し、全ての保護基を除去した。ペプチドを、分取ＨＰＬＣにより精製し、ＭＳ及び分析ＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。精製したペプチドは、分析ＲＰ−ＨＰＬＣにより単一ピークを示し、ＥＳＩ−ＭＳ分析により、ペプチド〔ＰＬＡ６，Ｋ１０（ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ），Ｅ１６Ｋ２０（ラクタム），Ｄ２８〕Ｇ（６−２９）アミドの計算分子量の３０５１．０ダルトンに相当する所望の質量の３０５０．７を生じた。
コレステロール結合ペプチド〔ＰＬＡ６，Ｋ１０（ＣＯＣＨ２ＣＨ２Ｓ−Ｃｈｏｌ），Ｅ１６Ｋ２０（ラクタム），Ｄ２８〕Ｇ（６−２９）アミドを合成するために、１０mg（３．２８μM）の〔ＰＬＡ６，Ｋ１０（ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＳＨ），Ｅ１６Ｋ２０（ラクタム），Ｄ２８〕Ｇ（６−２９）アミドを、５０mMのトリス−ＨＣｌを含有する７M尿素緩衝剤（ｐＨ８．０）２mLに溶解した。この溶液に、１０mg（９μM）のコレステロール試薬Ｂｒ−Ｏｘａ１２−Ｃｈｏｌ（下記の構造を参照すること）を、室温で加えた。反応をＨＰＬＣによりモニターした。約４時間後、反応溶液をＨＰＬＣにより直接精製した。精製したコレステロール結合ペプチドは、分析クロマトグラフィーにより単一ピークを示し、ＥＳＩ−ＭＳ分析により、ペプチド〔ＰＬＡ６，Ｋ１０（ＣＯＣＨ２ＣＨ２Ｓ−Ｃｈｏｌ），Ｅ１６Ｋ２０（ラクタム），Ｄ２８〕Ｇ（６−２９）アミドの計算分子量の４０７３．０ダルトンに相当する所望の質量の４０７３．０を生じた。
Figure 2011511778
同様の手順を使用して、本出願に報告されている〔ＰＬＡ６，Ｅ１６Ｋ２０（ラクタム），Ｄ２８，Ｋ３０（ＣＯＣＨ２ＣＨ２Ｓ−Ｃｈｏｌ）〕Ｇ（６−３０）アミド及び〔ＰＬＡ６，Ｅ１６Ｋ２０（ラクタム），Ｄ２８，Ｋ４０（ＣＯＣＨ２ＣＨ２Ｓ−Ｃｈｏｌ）〕Ｇ（６−４０）アミドのような他のコレステロール結合及びラクタム架橋ペプチドを合成した。
グルカゴンに基づいたデプシペプチド〔Ｔｈｒ５−Ｏ−ＰＬＡ６，Ｅ９〕グルカゴン（２−２９）アミド及び〔Ｔｈｒ５−Ｏ−ＰＬＡ６，Ｅ９〕グルカゴン（１−２９）アミドの合成
ペプチド配列ＨＯ−ＰＬＡ−ＴＳＥＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴ〔ＰＬＡ６，Ｅ９〕グルカゴン（６−２９）（配列番号９７１）は、０．２mmolのＭＢＨＡアミド樹脂を用い、カップリング試薬としてＤＥＰＢＴを用いるABI 430A自動ペプチド合成機を使用した固相Ｂｏｃ化学により合成した。以下のＢｏｃアミノ酸を使用した：Ａｌａ、Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ａｓｐ（ＯｃＨｘ）、Ａｓｎ（Ｘａｎ）、Ｇｌｕ（ＯｃＨｘ）、Ｇｌｎ（Ｘａｎ）、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ（２−Ｃｌ−Ｚ）、Ｍｅｔ、ＰＬＡ、Ｓｅｒ（ＯＢｚｌ）、Ｔｈｒ（ＯＢｚｌ）、Ｔｒｐ（ＨＯＣ）、Ｔｙｒ（２，６−ジ−Ｃｌ−Ｂｚｌ）及びＶａｌ。このペプチドに、ＤＣＭ中のＢｏｃ−Ｔｈｒ（ＯＢｚｌ）−ＯＨ（２mmol）／ＤＩＣ（１mmol）／ＤＭＡＰ（０．２mmol）から構成される前活性化対称無水溶液を用いて約１６時間手動で結合することによって、樹脂上にデシペプチド（エステル結合）を形成した。残りのアミノ酸を標準的Ｂｏｃ化学により結合して、以下の配列のデシペプチジル樹脂を得た：Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｏ−ＰＬＡ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−ＮＨ２（配列番号９６４）。
ペプチジル樹脂を液体フッ化水素で処理して、固体支持体から粗ペプチドを切断し、全ての保護基を除去した。デプシペプチドを、分取ＨＰＬＣにより精製し、ＭＳ及び分析ＨＰＬＣにより分析した。純粋なペプチドは、分析クロマトグラフィーにより単一ピークを示し、ＥＳＩ−ＭＳ分析により計算分子量の３３５９．０ダルトンに相当する所望の質量の３３５９．６を生じた。
同様の手順を使用して、Ｎ末端ヒスチジン残基の単一付加結合により、デプシペプチド〔Ｔｈｒ５−Ｏ−ＰＬＡ６，Ｅ９〕グルカゴン（１−２９）アミド（配列番号９６５）を合成した。純粋なペプチドは、分析クロマトグラフィーにより単一ピークを示し、ＥＳＩ−ＭＳ分析により計算分子量の３４９６．８ダルトンに相当する所望の質量の３４９５．９を生じた。

Claims (85)

  1. 下記の式Ｉで示される一般構造を含むプロドラッグ。
    Figure 2011511778
     〔式中、
    Ｒ３は、ＮＨ２、アミノ酸配列及び下記：
    Figure 2011511778
     からなる群より選択され、
    Ｒ４は、−ＯＨ、ＮＨ２又はアミノ酸配列であり、
    Ｒ１０は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル及び（ＣＨ２）ｎ（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）からなる群より選択され、
    Ｗは、Ｃ６〜Ｃ１０アリール又は結合であり、
    ｎは、０〜３の整数であり；
    Ｒ１２は、−ＯＨ、Ｈ、又は下記：
    Figure 2011511778
     であり、
    Ｒ１及びＲ２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＳＨ、（Ｃ２〜Ｃ３アルキル）ＳＣＨ３、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨ２、（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ２＋）ＮＨ２、（Ｃ４〜Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ０〜Ｃ４アルキル）（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）Ｒ９及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より独立して選択され、
    Ｒ５は、ＯＨ又はＮＨ２であり、Ｒ９は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、ＮＨ２又はＯＨであり、そして
    Ｒ７は、−Ｏ−アミノ酸又はＯであるが、
    但しＲ１２が、下記：
    Figure 2011511778
     である場合、Ｒ３は、下記：
    Figure 2011511778
     ではなく、
    更に、Ｒ３が、ＮＨ２又はアミノ酸配列である場合、Ｒ１２は下記：
    Figure 2011511778
     である〕
  2. Ｒ３が、下記：
    Figure 2011511778
     であり、そして
    Ｒ７及びＲ４が、それぞれ、グルカゴン、ＧＬＰ−１又はインスリンの生体活性ペプチドから選択されるアミノ酸配列を表す、請求項１記載のプロドラッグ。
  3. Ｒ３及びＲ４が、それぞれ、グルカゴン、ＧＬＰ−１又はインスリンの生体活性ペプチドから選択されるアミノ酸配列を表し、そして
    Ｒ１２が、下記：
    Figure 2011511778
     である、請求項１記載のプロドラッグ。
  4. アミノ酸の側鎖に共有結合している親水性部分を更に含む、請求項２又は３記載のプロドラッグ。
  5. 前記親水性部分がポリエチレングリコールである、請求項４記載のプロドラッグ。
  6. 下記の式ＩＩＩで示される一般構造を含むプロドラッグ。
    Figure 2011511778
     〔式中、
    Ｒ１及びＲ２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より独立して選択され、
    Ｒ３は、生体活性タンパク質のアミノ酸であって、前記生体活性タンパク質に存在するセリン残基のＮ末端側に配置されているアミノ酸を含み、
    Ｒ４は、前記生体活性タンパク質のアミノ酸であって、前記生体活性タンパク質に存在するセリン残基のＣ末端側に配置されているアミノ酸を含み、そして
    Ｒ５は、ＯＨ又はＮＨ２である〕
  7. Ｒ１が、ＣＨ２（ＣＨ３）２、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より選択され、Ｒ２が、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より選択される、請求項６記載のプロドラッグ。
  8. 前記生体活性ペプチドが、グルカゴン、ＧＬＰ−１からなる群より選択され、前記修飾されたセリン残基が、対応する天然配列に対して、グルカゴン又はＧＬＰ−１の２、５、７、８又は１１位に配置されている、請求項６記載のプロドラッグ。
  9. 前記生体活性ペプチドがインスリンであり、前記修飾されたセリン残基が、天然インスリンＡ及びＢ鎖配列に対して、Ａ４、Ａ２１、Ｂ５又はＢ９位に配置されている、請求項６記載のプロドラッグ。
  10. 親水性部分を更に含み、前記親水性部分は、対応する天然配列に対して、グルカゴン又はＧＬＰ−１プロドラッグの２０、２１又は２４位のアミノ酸に共有結合しているか、或いは追加のアミノ酸がプロドラッグのカルボキシ末端に付加されており、前記親水性部分が前記付加されたアミノ酸に共有結合している、請求項８記載のプロドラッグ。
  11. 天然インスリンＢ鎖配列に対して、Ｂ鎖のアミノ末端又はＢ鎖のＢ２９位のアミノ酸に共有結合している親水性部分を更に含む、請求項９記載のプロドラッグ。
  12. 前記親水性部分が、血漿タンパク質、ポリエチレングリコール鎖及び免疫グロブリンのＦｃ部分からなる群より選択される、請求項１０又は１１記載のプロドラッグ。
  13. Ａ鎖と、
    Ｂ鎖と、
    下記の式：
    Figure 2011511778
     のジペプチドとを含むインスリンプロドラッグであって、
    前記Ａ鎖が、Ｘ５ＩＶＸ６ＱＣＣＸ７ＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＸ８（配列番号６２６）の配列を含み、前記Ｂ鎖が、Ｘ１３ＬＣＧＸ９Ｘ１０ＬＶＥＡＬＸ１１ＬＶＣＧＥＲＧＦＸ１２（配列番号６２８）の配列を含み、前記ジペプチドが、エステル結合を介して、配列番号６２６の１、４若しくは２１位又は配列番号６２８の１、５、１２若しくは２１位に配置されているアミノ酸の側鎖に結合しており、
    更に、
    Ｘ５が、グリシン又はデスアミノ−グリシンであり；
    Ｘ６が、グルタミン酸、セリン又はトレオニンであり；
    Ｘ７が、トレオニン、ヒスチジン、アルギニン又はリシンであり；
    Ｘ８が、アスパラギン、セリン、トレオニン又はグリシンであり；
    Ｘ９が、セリン又はトレオニンであり；
    Ｘ１０が、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸又はシステイン酸であり；
    Ｘ１１及びＸ１２が、Ｔｙｒ、フェニルアラニン及び４−ヒドロキシメチルＰｈｅからなる群より独立して選択され；
    Ｘ１３が、ヒスチジン、セリン又はトレオニンであり；
    Ｒ１及びＲ２が、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より独立して選択され、そしてＲ５が、ＯＨ又はＮＨ２である、
    インスリンプロドラッグ。
  14. Ｘ６がグルタミン酸であり、Ｘ７が、トレオニン、ヒスチジン、アルギニン及びリシンからなる群より選択され、Ｘ８がアスパラギンであり、Ｘ９がセリンであり、Ｘ１０が、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸及びシステイン酸からなる群より選択され、Ｘ１１及びＸ１２が、両方ともチロシンであり、そしてＸ５が、下記構造：
    Figure 2011511778
     を有し、式中、Ｒ１が、ＣＨ２（ＣＨ３）２、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ６ヘテロアリール）からなる群より選択され、Ｒ２が、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ６ヘテロアリール）からなる群より選択され、そしてＲ５が、ＯＨ又はＮＨ２である、
    請求項１３記載のインスリンプロドラッグ。
  15. Ｘ５がグリシンであり、Ｘ７が、トレオニン、ヒスチジン、アルギニン及びリシンからなる群より選択され、Ｘ１０が、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸及びシステイン酸からなる群より選択され、Ｘ１１及びＸ１２が、両方ともチロシンであり、そしてＸ６、Ｘ８又はＸ９の１つが、下記構造：
    Figure 2011511778
     を有し、式中、Ｒ１０が、Ｈ又はＣＨ３からなる群より選択され、ｎが、０又は３であり、Ｒ１が、ＣＨ２（ＣＨ３）２、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ６ヘテロアリール）からなる群より選択され、Ｒ２が、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ６ヘテロアリール）からなる群より選択され、そしてＲ５が、ＯＨ又はＮＨ２である、
    請求項１３記載のインスリンプロドラッグ。
  16. Ｘ５がグリシンであり、Ｘ６がグルタミン酸であり、Ｘ７が、トレオニン、ヒスチジン、アルギニン及びリシンからなる群より選択され、Ｘ８がアスパラギンであり、Ｘ９がセリンであり、Ｘ１０が、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸及びシステイン酸からなる群より選択され、Ｘ１１及びＸ１２の一方がチロシンであり、他方が、下記構造：
    Figure 2011511778
     を有し、式中、Ｒ１が、ＣＨ２（ＣＨ３）２、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ６ヘテロアリール）からなる群より選択され、Ｒ２が、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ６ヘテロアリール）からなる群より選択され、そしてＲ５が、ＯＨ又はＮＨ２である、
    請求項１３記載のインスリンプロドラッグ。
  17. 一般構造：
    Ｒ３−Ｙ−Ｒ４
    のポリペプチドを含む、ＧＬＰ−１又はグルカゴンのプロドラッグ誘導体。
    〔式中、Ｙは、下記：
    Figure 2011511778
     からなる群より選択される構造であり、
    ｎは、０〜３から選択される整数であり、ｍは、１〜４から選択される整数であり、Ｒ３は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｇ−（配列番号６２１）又は下記：
    Figure 2011511778
     からなる群より選択されるアミノ酸を含み、
    Ｘ１は、ヒスチジン、デスアミノヒスチジン、ホモ−ヒスチジン、チロシン及びフェニルアラニンからなる群より選択され；
    Ｘ２は、グリシン、アラニン、セリン、バリン、Ｄ−アラニン、アミノイソ酪酸、Ｎ−メチルアラニンからなる群より選択されるアミノ酸であり；
    Ｘ３は、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン及びアスパラギンからなる群より選択され；
    Ｘ４は、デスアミノヒスチジン、デスアミノホモ−ヒスチジン、デスアミノチロシン及びデスアミノフェニルアラニンからなる群より選択され；
    Ｒ４は、配列番号６１５、配列番号６１６、配列番号６１７、配列番号６１８及び配列番号６１９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み；
    Ｒ５は、ＮＨ２又はＨＯであり；
    Ｒ６は、Ｈであるか、又は下記：
    Figure 2011511778
     であり；
    Ｒ７は、Ｏ又はＯＸ４Ｘ２Ｘ３Ｇ（配列番号６３４）であり；
    Ｒ１及びＲ２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より独立して選択されるが、
    但し、Ｒ３が下記：
    Figure 2011511778
     である場合、Ｒ６はＨであり、そして
    Ｒ６がＨである場合、Ｒ３はＸ１Ｘ２Ｘ３Ｇ−（配列番号６２１）ではない〕
  18. Ｒ４が、下記：
    ＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧ（配列番号６０３）、
    ＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ−アミド（配列番号６０４）、
    ＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＸｌ４ＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−アミド（配列番号６０５）（ここでＸ１４は、Ａｒｇ又はＧｌｙである）、
    ＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴ（配列番号６１８）及び
    ＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−アミド（配列番号６２０）
    からなる群より選択されるペプチドを含む、請求項１７記載のプロドラッグ誘導体。
  19. Ｒ１が、ＣＨ２（ＣＨ３）２、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ６ヘテロアリール）からなる群より選択され、Ｒ２が、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６アリール）からなる群より選択され、そしてＲ５が、ＯＨ又はＮＨ２である、請求項１８記載のプロドラッグ誘導体。
  20. 下記の式ＩＩＩで示される構造を含む、請求項１７記載のプロドラッグ誘導体。
    Figure 2011511778
     〔式中、
    Ｒ４は、Ｒ１４ＨＡＥＧ（配列番号６４３）、Ｒ１４ＨＡＱＧ−（配列番号６３９）、Ｒ１４ＦＡＥＧ（配列番号６４４）、Ｒ１４ＦＡＱＧ（配列番号６４０）からなる群より選択されるアミノ酸配列であり；
    Ｒ４は、下記：
    ＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧ（配列番号６０３）、
    ＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ−アミド（配列番号６０４）及び
    ＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＸ１４ＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−アミド（配列番号６０５）（ここでＸ１４は、Ａｒｇ又はＧｌｙである）
    からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み；
    Ｒ５及びＲ１４は、独立して、ＮＨ２又はＨＯであり；
    Ｒ１及びＲ２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ６ヘテロアリール）からなる群より独立して選択され、そして
    Ｒ５は、ＯＨ又はＮＨ２である〕
  21. Ｒ５がＯＨである、請求項２０記載のプロドラッグ誘導体。
  22. Ｒ１が、ＣＨ２（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）からなる群より選択され、そしてＲ２が、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ６ヘテロアリール）からなる群より選択される、請求項２０又は２１記載のプロドラッグ誘導体。
  23. Ｒ１が、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ６ヘテロアリール）からなる群より選択され、そしてＲ２が、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ６ヘテロアリール）からなる群より選択される、請求項２０又は２１記載のプロドラッグ誘導体。
  24. Ｒ１が、ＣＨ２（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２及びＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）からなる群より選択され、Ｒ２が、Ｈ及びＣ１〜Ｃ３アルキルからなる群より選択され、そしてＲ５がＮＨ２である、請求項２０記載のプロドラッグ誘導体。
  25. Ｒ１が、ＣＨ２（ＣＨ３）２、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ６ヘテロアリール）からなる群より選択され、そしてＲ２が、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６アリール）からなる群より選択される、請求項２０記載のプロドラッグ誘導体。
  26. 親水性部分を更に含み、前記親水性部分は、ＧＬＰ−１又はグルカゴンペプチドの天然配列に対して、前記プロドラッグの２０、２１又は２４位のアミノ酸残基に共有結合しているか、或いは、追加のアミノ酸がプロドラッグのカルボキシ末端に付加されており、前記親水性部分は前記付加アミノ酸に共有結合している、請求項２０記載のプロドラッグ。
  27. 前記親水性部分がポリエチレングリコールである、請求項２６記載のプロドラッグ誘導体。
  28. ポリエチレングリコールが、少なくとも約４０，０００ダルトンの分子量を有する、請求項２７記載のプロドラッグ誘導体。
  29. 前記親水性部分が、血漿タンパク質又は免疫グロブリンのＦｃ部分である、請求項２６記載のプロドラッグ誘導体。
  30. 下記構造を有する、請求項１７記載のプロドラッグ誘導体。
    Figure 2011511778
     〔式中、
    Ｒ４は、下記：
    ＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧ（配列番号６０３）、
    ＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ−アミド（配列番号６０４）、
    ＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＸ１４ＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−アミド（配列番号６０５）（ここでＸ１４は、Ａｒｇ又はＧｌｙである）及び
    ＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧＫＲＮＲＮＮＩＡ（配列番号６０６）
    からなる群より選択されるアミノ酸配列であり；
    Ｒ５は、ＮＨ２又はＨＯであり；
    Ｒ７は、Ｏ−ＨＡＥＧ−（配列番号６４０）、Ｏ−ＨＡＱＧ−（配列番号６３９）、Ｏ−ＦＡＥＧ−（配列番号６４４）及びＯ−ＦＡＱＧ−（配列番号６４０）からなる群より選択されるアミノ酸配列であり；そして
    Ｒ１及びＲ２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ９ヘテロアリール）からなる群より独立して選択される〕
  31. Ｒ５がＯＨである、請求項３０記載のプロドラッグ誘導体。
  32. Ｒ１が、ＣＨ２（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）からなる群より選択され、そしてＲ２が、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ６ヘテロアリール）からなる群より選択される、請求項３０又は３１記載のプロドラッグ誘導体。
  33. Ｒ１が、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ６ヘテロアリール）からなる群より選択され、そしてＲ２が、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ６ヘテロアリール）からなる群より選択される、請求項３０又は３１記載のプロドラッグ誘導体。
  34. Ｒ１が、ＣＨ２（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２及びＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）からなる群より選択され、Ｒ２が、Ｈ及びＣ１〜Ｃ３アルキルからなる群より選択され、そしてＲ５がＮＨ２である、請求項３０記載のプロドラッグ誘導体。
  35. Ｒ１が、ＣＨ２（ＣＨ３）２及びＣＨ２（Ｃ６アリール）からなる群より選択され、Ｒ２がＣＨ２（Ｃ６アリール）であり、そしてＲ５がＯＨである、請求項３０記載のプロドラッグ誘導体。
  36. Ｒ１がＣＨ２（ＣＨ３）２であり、Ｒ２が、Ｈ又はＣＨ２（Ｃ６アリール）であり、そしてＲ５が、ＮＨ２である、請求項３０記載のプロドラッグ誘導体。
  37. 請求項１記載のプロドラッグと薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
  38. 糖尿病を治療する方法であって、請求項２又は３記載のプロドラッグを含む医薬組成物の有効量を投与することを含む方法。
  39. 食欲を抑制する、体重増加を減少する又は減量を誘導する方法であって、請求項２又は３記載のプロドラッグの有効量を投与することを含む方法。
  40. 配列番号６２２又は配列番号６２３の配列と、
    前記配列番号６２２又は配列番号６２３の１、２、５、７、８及び１１位から選択される位置のアミノ酸におけるエステル結合を介して結合している、下記の式：
    Figure 2011511778
     のジペプチドとを含み、
    式中、Ｒ１及びＲ２が、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２ＣＨ３）、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ６ヘテロアリール）からなる群より独立して選択され、そしてＲ５が、ＯＨ又はＮＨ２である、
    生体活性ペプチドプロドラッグ。
  41. Ｒ１が、ＣＨ２（ＣＨ３）２、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６アリール）及びＣＨ２（Ｃ５〜Ｃ６ヘテロアリール）からなる群より選択され、そしてＲ２が、（Ｃ４〜Ｃ５）シクロアルキル、ＣＨ２（Ｃ６〜Ｃ１０アリール）からなる群より選択される、請求項４０記載の生体活性ペプチドプロドラッグ。
  42. ２、５、７、８又は１１位のアミノ酸が、セリン残基であり、ジペプチドが、セリン側鎖と形成したエステル結合を介して結合している、請求項４０記載の生体活性ペプチドプロドラッグ。
  43. カルボキシ末端延長ペプチドを更に含み、前記延長ペプチドがＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号６２４）の配列を含む、請求項４０記載の生体活性ペプチドプロドラッグ。
  44. ２０、２１、２４位のアミノ酸残基の一つ、又は配列番号６２４のカルボキシ末端に付加されている単一アミノ酸に共有結合している親水性部分を更に含む、請求項４３記載の生体活性ペプチドプロドラッグ。
  45. 前記親水性部分がポリエチレングリコール鎖である、請求項４４記載の生体活性ペプチドプロドラッグ。
  46. ２つ以上のポリエチレン鎖が、２０、２１、２４の群から選択される位置の２つ以上のアミノ酸側鎖、又は配列番号６２４のカルボキシ末端に付加されている単一アミノ酸に共有結合している、請求項４５記載の生体活性ペプチドプロドラッグ。
  47. 配列番号６２４のカルボキシ末端に付加されている単一アミノ酸がシステインである、請求項４４又は４６記載の生体活性ペプチドプロドラッグ。
  48. Ｒ３又はＲ４が、生体活性ペプチドのアミノ酸配列である、請求項１記載のプロドラッグ。
  49. Ｒ３が、下記構造：
    Figure 2011511778
     の側鎖を含む生体活性ペプチドのアミノ酸のＮ末端側のアミノ酸配列であり、そしてＲ４が、前記生体活性ペプチドのアミノ酸のＣ末端側のアミノ酸配列である、請求項４８記載のプロドラッグ。
  50. Ｒ３が、下記：
    Figure 2011511778
     であり、そしてＲ７がＯ−アミノ酸である場合、Ｒ７が、下記構造：
    Figure 2011511778
     の側鎖を含む生体活性ペプチドのアミノ酸のＮ末端側のアミノ酸配列であり、そしてＲ４が、前記生体活性ペプチドのアミノ酸のＣ末端側のアミノ酸配列である、請求項１記載のプロドラッグ。
  51. 前記生体活性ペプチドが、グルカゴンスーパーファミリーペプチド、オステオカルシン、インスリン、及び前記のうちの１つの類縁体、誘導体又は結合体からなる群より選択される、請求項６、７及び４８〜５０のいずれか１項記載のプロドラッグ。
  52. 前記グルカゴンスーパーファミリーペプチドが、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ；配列番号６５７）、血管作用性小腸ペプチド（ＶＩＰ；配列番号６５８）、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド２７（ＰＡＣＡＰ−２７；配列番号６５９）、ペプチドヒスチジンメチオニン（ＰＨＭ；配列番号６６０）、セクレチン（配列番号６６１）、グルカゴン関連類縁体ペプチド、及び前記のうちの１つの類縁体、誘導体又は結合体からなる群より選択される、請求項５１記載のプロドラッグ。
  53. 前記グルカゴン関連類縁体ペプチドが、グルカゴン（配列番号６１２）、オキシントモジュリン（配列番号６６５）、エキセンディン−４（配列番号６６２）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）（配列番号６０１として提示されるアミノ酸７〜３７）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）（配列番号６６３）、ＧＩＰ（配列番号６６４）、及び前記のうちの１つの類縁体、誘導体又は結合体からなる群より選択される、請求項５２記載のプロドラッグ。
  54. 前記グルカゴン関連類縁体ペプチドが、配列番号６１２のアミノ酸１２〜２９に対応するアミノ酸のアルファ−ヘリカル立体配座を保持する天然グルカゴン（配列番号６１２）に対して、少なくとも約５０％の同一性があるアミノ酸配列を含む、請求項５３記載のプロドラッグ。
  55. 前記グルカゴン関連類縁体ペプチドが、１〜３個のアミノ酸修飾を有するアミノ酸配列：
    Ｘ１−Ｘ２−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｚ（配列番号７３９）を含み、
    Ｘ１及び／又はＸ２が、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断に対する前記グルカゴン関連類縁体ペプチドの感受性を低減する非天然（配列番号６１２に対して）アミノ酸であり、
    Ｚが、−ＣＯＯＨ、−Ａｓｎ−ＣＯＯＨ、Ａｓｎ−Ｔｈｒ−ＣＯＯＨ及びＹ−ＣＯＯＨからなる群より選択され、Ｙが１〜２個のアミノ酸であり、
    ここで、（１）ラクタム架橋がｉの位置のアミノ酸及びｉ＋４の位置のアミノ酸の側鎖を連結するか（ここでｉは、１２、１６、２０若しくは２４である）又は（２）グルカゴン関連類縁体ペプチドの１６、２０、２１及び２４位の１、２、３個又は全てのアミノ酸がα，α−二置換アミノ酸で置換されており；
    グルカゴン関連類縁体ペプチドが、グルカゴンアゴニスト活性を示す、
    請求項５３又は５４記載のプロドラッグ。
  56. 前記グルカゴン関連類縁体ペプチドが、
    下記からなる群より選択される少なくとも１個のアミノ酸修飾を有する、配列番号６１２のアミノ酸配列を含み：
    荷電アミノ酸による２８位のＡｓｎの置換；
    Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸及びホモシステイン酸からなる群より選択される荷電アミノ酸による２８位のＡｓｎの置換；
    Ａｓｎ、Ａｓｐ又はＧｌｕによる２８位での置換；
    Ａｓｐによる２８位での置換；
    Ｇｌｕによる２８位での置換；
    荷電アミノ酸による２９位のＴｈｒの置換；
    Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸及びホモシステイン酸からなる群より選択される荷電アミノ酸による２９位のＴｈｒの置換；
    Ａｓｎ、Ｇｌｕ又はＬｙｓによる２９位での置換；
    Ｇｌｕによる２９位での置換；
    ２９位の後への１〜３個の荷電アミノ酸の挿入；
    ２９位の後へのＧｌｕ又はＬｙｓの挿入；
    ２９位の後へのＧｌｕ−Ｌｙｓ又はＬｙｓ−Ｌｙｓの挿入；或いは
    これらの組み合わせ、
    並びに、
    Ａ群若しくはＢ群又はこれらの組み合わせから選択される少なくとも１個のアミノ酸修飾
    〔ここで、Ａ群は、Ｇｌｕによる１５位のＡｓｐの置換及びＴｈｒ又はＡＩＢによる１６位のＳｅｒの置換からなる群より選択されるアミノ酸修飾であり；
    Ｂ群は、下記からなる群より選択されるアミノ酸修飾を含む：
    ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断に対するグルカゴンペプチドの感受性を低減する、非天然アミノ酸による１位のＨｉｓの置換；
    ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断に対するグルカゴンペプチドの感受性を低減する、非天然アミノ酸による２位のＳｅｒの置換；
    Ｐｈｅ又はＶａｌによる１０位のＴｙｒの置換；
    Ａｒｇによる１２位のＬｙｓの置換；
    Ａｌａ又はＡＩＢによる２０位のＧｌｎの置換；
    Ｇｌｕによる２１位のＡｓｐの置換；
    Ａｌａ又はＡＩＢによる２４位のＧｌｎの置換；
    Ｌｅｕ又はＮｌｅによる２７位のＭｅｔの置換；
    ２７〜２９位のアミノ酸の欠失；
    ２８〜２９位のアミノ酸の欠失；
    ２９位のアミノ酸の欠失；或いは
    これらの組み合わせ〕；
    そして、前記グルカゴン関連類縁体ペプチドが、グルカゴンアゴニスト活性を示す、
    請求項５３又は５４記載のプロドラッグ。
  57. 前記グルカゴン関連類縁体ペプチドが、以下の修飾：
    （ａ）ＧＩＰアゴニスト活性を付与する１位でのアミノ酸修飾、
    （ｂ）（１）ｉ及びｉ＋４の位置のアミノ酸の側鎖の間又はｊ及びｊ＋３の位置のアミノ酸の側鎖の間のラクタム架橋（ここで、ｉは、１２、１３、１６、１７、２０又は２４であり、ｊは１７である）、或いは（２）グルカゴン関連類縁体ペプチドの１６、２０、２１及び２４位の１、２、３つ又は全てのアミノ酸がα，α−二置換アミノ酸で置換されている、
    （ｃ）２７、２８及び２９の１、２つ又は全てにおけるアミノ酸修飾、並びに
    （ｄ）１〜６個の更なるアミノ酸修飾、
    を有する配列番号６１２のアミノ酸配列を含み、
    ＧＩＰ受容体活性化についての前記グルカゴン関連類縁体ペプチドのＥＣ５０が約１０nM以下である、
    請求項５３又は５４記載のプロドラッグ。
  58. 前記グルカゴン関連類縁体ペプチドが、配列番号５５の配列又は配列番号５５の類縁体を含み、前記類縁体が、１、２、３、５、７、１０、１１、１３、１４、１７、１８、１９、２１、２４、２７、２８及び２９位から選択される１〜３個のアミノ酸修飾により配列番号５５と異なっており、前記グルカゴン関連類縁体ペプチドが、ＧＬＰ−１受容体において天然ＧＬＰ−１の活性の少なくとも２０％を示す、請求項５３又は５４記載のプロドラッグ。
  59. 前記グルカゴン関連類縁体ペプチドが、１０個以下のアミノ酸修飾により配列番号６１２と異なるアミノ酸配列を含み、前記修飾が、１６、２０、２１、及び／又は２４位でのＡＩＢによる１個以上のアミノ酸置換、並びに、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断に対する感受性の低減をもたらす、１及び／又は２位でのアミノ酸修飾を含み、前記グルカゴン関連類縁体ペプチドが、ＧＬＰ−１受容体において天然ＧＬＰ−１の活性の少なくとも２０％を示す、請求項５３又は５４記載のプロドラッグ。
  60. 前記グルカゴン関連類縁体ペプチドが、配列番号９４２の配列又はそのオキシ誘導体を含み、前記グルカゴン関連類縁体ペプチドがグルカゴンアンタゴニスト活性を示す、請求項５３又は５４記載のプロドラッグ。
  61. 前記グルカゴン関連類縁体ペプチドが、配列番号６１２のＮ末端からの２〜５個のアミノ酸残基の欠失、及び、配列番号６１２の９位のアスパラギン残基の、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、β−ホモグルタミン酸、システインのスルホン酸誘導体、又は下記構造：
    Figure 2011511778
     を有するシステインのアルキル化誘導体による置換、によって修飾されている天然グルカゴンのアミノ酸配列を含み、
    式中、Ｘ５が、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ２〜Ｃ４アルケニル又はＣ２〜Ｃ４アルキニルであり、そして、グルカゴン関連類縁体ペプチドがグルカゴンアゴニスト活性を示す、
    請求項５３又は５４記載のプロドラッグ。
  62. 前記グルカゴン関連類縁体ペプチドが、一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含み、
    Ａが、下記：
    （ｉ）フェニル乳酸（ＰＬＡ）；
    （ｉｉ）ＰＬＡのオキシ誘導体；
    （ｉｉｉ）連続した２個のアミノ酸がエステル又はエーテル結合を介して結合しているアミノ酸２〜６個のペプチド、
    からなる群より選択され、
    Ｂが、配列番号６１２のアミノ酸ｉ〜２６を表し（ここでｉは、３、４，５、６又は７である）、更に、下記（ｉｖ）〜（ｉｘ）からなる群より選択される１個以上のアミノ酸置換を含んでもよく：
    （ｉｖ）Ｇｌｕ、Ｃｙｓのスルホン酸誘導体、ホモグルタミン酸、β−ホモグルタミン酸、又は下記構造：
    Figure 2011511778
     〔式中、Ｘ５は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ２〜Ｃ４アルケニル若しくはＣ２〜Ｃ４アルキニルである〕
    を有するシステインのアルキル化誘導体による、９位（配列番号６１２のアミノ酸番号付けによる）のＡｓｐの置換；
    （ｖ）エステル、エーテル、チオエーテル、アミド又はアルキルアミン結合を介してアシル又はアルキル基に共有結合しているアミノ酸による１０、２０及び２４位（配列番号６１２のアミノ酸番号付けによる）の１又は２個のアミノ酸の置換；
    （ｖｉ）Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、オルチニン、ホモシステイン及びアセチル−フェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）からなる群より選択されるアミノ酸による１６、１７、２０、２１及び２４位（配列番号６１２のアミノ酸番号付けによる）の１又は２個のアミノ酸の置換（ここでアミノ酸の群は親水性部分に共有結合している）；
    （ｖｉｉ）システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸及びホモシステイン酸による１５位（配列番号６１２の番号付けによる）のＡｓｐの置換；
    （ｖｉｉｉ）システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸及びホモシステイン酸による１６位（配列番号６１２の番号付けによる）のＳｅｒの置換；
    （ｉｘ）配列番号６１２のアミノ酸番号付けによる１６、２０、２１及び２４位の１つ以上の位置でのＡＩＢによる置換；
    そして、
    Ｃが、
    （ｘ）Ｘ；
    （ｘｉ）Ｘ−Ｙ；
    （ｘｉｉ）Ｘ−Ｙ−Ｚ；
    （ｘｉｉｉ）Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ１０
    （ここでＸは、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ又はＮｌｅであり；Ｙは、Ａｓｎ又は荷電アミノ酸であり；Ｚは、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、オルニチン（Ｏｒｎ）、ホモシステイン、アセチル−フェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）又は荷電アミノ酸であり、Ｒ１０は、配列番号９１９〜９２１及び９５３からなる群より選択される）；
    （ｘｉｖ）Ｃ末端カルボキシレートがアミドで置換されている（ｘ）〜（ｘｉｉｉ）のいずれか、
    からなる群より選択され、
    前記グルカゴン関連類縁体ペプチドが、グルカゴンアンタゴニスト活性を示す、
    請求項５３又は５４記載のプロドラッグ。
  63. 前記グルカゴン関連類縁体ペプチドが、配列番号１０５１の配列を含み、配列番号１０５１の４と７位、７と１１位、１１と１５位、１５と１９位又は１９と２３位のアミノ酸が、ラクタム架橋を介して又はそのオキシ誘導体を介して結合しており、前記グルカゴン関連類縁体ペプチドが、グルカゴンアンタゴニスト活性及びＧＬＰ−１アゴニスト活性を示す、請求項５３又は５４記載のプロドラッグ。
  64. 前記グルカゴン関連類縁体ペプチドが、（１）分子内架橋若しくはアルファ，アルファ−二置換アミノ酸若しくは１６位（配列番号６１２の番号付けによる）の酸性アミノ酸又はそれらの組み合わせ、（２）Ｃ末端カルボキシレートの代わりにＣ末端アミド又はエステル、及び（３）一般構造Ａ−Ｂ−Ｃを含むペプチド、を含み、
    Ａが、下記：
    （ｉ）ＰＬＡ；
    （ｉｉ）ＰＬＡのオキシ誘導体；及び
    （ｉｉｉ）連続した２個のアミノ酸がエステル又はエーテル結合を介して結合しているアミノ酸２〜６個のペプチド、
    からなる群より選択され、
    Ｂが、配列番号６１２のアミノ酸ｐ〜２６を表し（ここでｐは、３、４、５、６又は７である）、更に、下記（ｉｖ）〜（ｘ）からなる群より選択される１個以上のアミノ酸修飾を含んでもよく：
    （ｉｖ）Ｇｌｕ、Ｃｙｓのスルホン酸誘導体、ホモグルタミン酸、β−ホモグルタミン酸、又は下記構造：
    Figure 2011511778
     〔式中、Ｘ５は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ２〜Ｃ４アルケニル若しくはＣ２〜Ｃ４アルキニルである〕
    を有するシステインのアルキル化誘導体による、９位（配列番号６１２のアミノ酸番号付けによる）のＡｓｐの置換；
    （ｖ）エステル、エーテル、チオエーテル、アミド又はアルキルアミン結合を介してアシル又はアルキル基に共有結合しているアミノ酸による１０、２０及び２４位（配列番号６１２のアミノ酸番号付けによる）の１又は２個のアミノ酸の置換；
    （ｖｉ）Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、オルチニン、ホモシステイン及びアセチル−フェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）からなる群より選択されるアミノ酸による１６、１７、２０、２１及び２４位（配列番号６１２のアミノ酸番号付けによる）のうちの１又は２個のアミノ酸の置換（ここでアミノ酸の群は親水性部分に共有結合している）；
    （ｖｉｉ）システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸及びホモシステイン酸による１５位（配列番号６１２の番号付けによる）のＡｓｐの置換；
    （ｖｉｉｉ）システイン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸及びホモシステイン酸による１６位（配列番号６１２の番号付けによる）のＳｅｒの置換；
    （ｉｘ）Ｇｌｎによる１７位のＡｒｇの交換、Ａｌａによる１８位のＡｒｇの交換、Ｇｌｕによる２１位のＡｓｐの交換、Ｉｌｅによる２３位のＶａｌの交換及びＡｌａによる２４位のＧｌｎの交換（配列番号６１２のアミノ酸番号付けによる）；
    （ｘ）Ｇｌｕによる１６位のＳｅｒの交換、Ｇｌｕによる２０位のＧｌｎの交換又はＧｌｕによる２４位のＧｌｎの交換（配列番号６１２のアミノ酸番号付けによる）、
    そして、
    Ｃが、
    （ｖｉｉ）Ｘ；
    （ｖｉｉｉ）Ｘ−Ｙ；
    （ｉｘ）Ｘ−Ｙ−Ｚ；
    （ｘ）Ｘ−Ｙ−Ｚ−Ｒ１０
    〔式中、Ｘは、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ又はＮｌｅであり；Ｙは、Ａｓｎ又は荷電アミノ酸であり；Ｚは、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ、オルニチン（Ｏｒｎ）、ホモシステイン、アセチル−フェニルアラニン（Ａｃ−Ｐｈｅ）又は荷電アミノ酸であり、Ｒ１０は、配列番号１０２１、１０２６、１０２７及び１０５０からなる群より選択される〕
    からなる群より選択され、
    前記グルカゴン関連類縁体ペプチドが、グルカゴンアンタゴニスト活性及びＧＬＰ−１アゴニスト活性を示す、
    請求項５３又は５４記載のプロドラッグ。
  65. 前記グルカゴン関連類縁体ペプチドの１６、２０、２１及び２４位のうちの１、２、３つ又は全てが、α，α−二置換アミノ酸で置換されている、請求項５５又は５７記載のプロドラッグ。
  66. 前記グルカゴン関連類縁体ペプチドが、ＡＩＢによる１６、２０若しくは２４位のアミノ酸の置換、２７〜２９位での、２８及び２９位での、若しくは２９位でのアミノ酸の欠失、又はこれらの組み合わせを含む、請求項５６記載のプロドラッグ。
  67. 前記グルカゴン関連類縁体ペプチドが配列番号９４２のオキシ誘導体である、請求項６０記載のプロドラッグ。
  68. 前記グルカゴン関連類縁体ペプチドが、β−ホモグルタミン酸、又は下記構造：
    Figure 2011511778
     〔式中、Ｘ５は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ２〜Ｃ４アルケニル又はＣ２〜Ｃ４アルキニルである〕
    を有するシステインのアルキル化誘導体による、配列番号６１２の９位のＡｓｐの置換を含む、請求項６１記載のプロドラッグ。
  69. 下記の少なくとも１つが当てはまることを特徴とする、請求項６２記載のプロドラッグ：
    Ａが、ＰＬＡのオキシ誘導体であるか、又は、連続した２個のアミノ酸がエステル又はエーテル結合を介して結合しているアミノ酸２〜６個のペプチドである；
    Ｂが、下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）からなる群より選択される１個以上のアミノ酸修飾を含む：
    （ｉ）β−ホモグルタミン酸、又は下記構造：
    Figure 2011511778
     〔式中、Ｘ５は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ２〜Ｃ４アルケニル若しくはＣ２〜Ｃ４アルキニルである〕
    を有するシステインのアルキル化誘導体による、９位（配列番号６１２のアミノ酸番号付けによる）のＡｓｐの置換；
    （ｉｉ）エステル、エーテル、チオエーテル、アミド又はアルキルアミン結合を介してアシル又はアルキル基に共有結合しているアミノ酸による、１０、２０及び２４位（配列番号６１２のアミノ酸番号付けによる）のうちの１又は２個のアミノ酸の置換；
    （ｉｉｉ）配列番号６１２のアミノ酸番号付けによる１６、２０、２１及び２４位のうちの１つ以上の位置でのＡＩＢによる置換；或いは
    Ｃが、Ｘ又はＸ−Ｙである。
  70. 前記グルカゴン関連類縁体ペプチドが、ラクタム架橋を介して結合している配列番号１０５１の配列を含むグルカゴン関連類縁体ペプチドのオキシ誘導体である、請求項６３記載のプロドラッグ。
  71. 下記の少なくとも１つが当てはまることを特徴とする、請求項６４記載のプロドラッグ：
    前記グルカゴン関連類縁体ペプチドが、アルファ，アルファ−二置換アミノ酸を含む；
    Ａが、ＰＬＡのオキシ誘導体であるか、又は、連続した２個のアミノ酸がエステル若しくはエーテル結合を介して結合しているアミノ酸２〜６個のペプチドである；
    Ｂが、下記（ｉ）〜（ｉｉ）からなる群より選択される１個以上のアミノ酸修飾を含む：
    （ｉ）β−ホモグルタミン酸、又は下記構造：
    Figure 2011511778
     〔式中、Ｘ５は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ２〜Ｃ４アルケニル若しくはＣ２〜Ｃ４アルキニルである〕
    を有するシステインのアルキル化誘導体による、９位（配列番号６１２のアミノ酸番号付けによる）のＡｓｐの置換；
    （ｉｉ）エステル、エーテル、チオエーテル、アミド又はアルキルアミン結合を介してアシル又はアルキル基に共有結合しているアミノ酸による、１０、２０及び２４位（配列番号６１２のアミノ酸番号付けによる）のうちの１又は２個のアミノ酸の置換
    ；或いは、
    Ｃが、Ｘ又はＸ−Ｙである。
  72. 請求項４８〜７３のいずれか１項記載のプロドラッグと薬学的に許容される担体とを含む滅菌医薬組成物。
  73. 高血糖症又は糖尿病を治療する方法であって、請求項７２記載の医薬組成物の有効量を投与することを含む方法。
  74. 食欲を抑制する、体重増加を減少する又は減量を誘導する方法であって、請求項７２記載の医薬組成物の有効量を投与することを含む方法。
  75. 腸管の一過性麻痺を、そのような必要性のある患者において起こす方法であって、請求項７２記載の医薬組成物の有効量を投与することを含む方法。
  76. 低血糖症の治療又は予防を、そのような必要性のある患者において行う方法であって、請求項７２記載の医薬組成物の有効量を投与することを含む方法。
  77. 第２治療剤を投与することを更に含む、請求項７３〜７６のいずれか１項記載の方法。
  78. 第２治療剤が、グルカゴン関連類縁体ペプチド又は第２プロドラッグである、請求項７７記載の方法。
  79. 一般構造：
    Ａ−Ｂ−Ｑ
    を含む複合体。
    〔式中、
    Ｑは、生体活性ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質であり、
    Ａは、アミノ酸又はヒドロキシル酸であり、
    Ｂはアミノ酸であり、Ａ−Ｂは、ＢとＱのヒドロキシル基との間のエステル結合の形成によりＱに結合しているジペプチドであり、ここで、ＱからのＡ−Ｂの化学切断半減期（ｔ１／２）は、生理学的条件下で標準的ＰＢＳ溶液中において、少なくとも約１時間から約１週間である〕
  80. Ａ、Ｂ、又はＡ−Ｂが結合しているＱのアミノ基が、非標準アミノ酸（non-coded amino acid）である、
    請求項７９記載の複合体。
  81. デポ・ポリマーがＡ又はＢの側鎖に結合している、請求項７９又は８０記載の複合体。
  82. 前記デポ・ポリマーが、ポリエチレングリコール、デキストラン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、及び乳酸とグリコール酸のコポリマーからなる群より選択される、請求項８１記載の複合体。
  83. 前記デポ・ポリマーの分子量が、約２０，０００〜約１２０，０００ダルトンの範囲から選択される、請求項８１記載の複合体。
  84. 前記デポ・ポリマーが、４０，０００〜８０，０００ダルトンの範囲から選択される分子量を有するポリエチレングリコールである、請求項８１記載の複合体。
  85. 前記デポ・ポリマーが、共有結合Ｃ１６又はＣ１８アシル又はアルキル基への結合を介してＡ又はＢの側鎖に結合している、請求項８１記載の複合体。
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