EA015817B1 - Иммуногенная композиция, содержащая адъювант в виде эмульсии "масло в воде" - Google Patents

Иммуногенная композиция, содержащая адъювант в виде эмульсии "масло в воде" Download PDF

Info

Publication number
EA015817B1
EA015817B1 EA200900350A EA200900350A EA015817B1 EA 015817 B1 EA015817 B1 EA 015817B1 EA 200900350 A EA200900350 A EA 200900350A EA 200900350 A EA200900350 A EA 200900350A EA 015817 B1 EA015817 B1 EA 015817B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
dose
vaccine
adjuvant
antigen
composition
Prior art date
Application number
EA200900350A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200900350A1 (ru
Inventor
Уилльям Рипли мл. Баллоу
Эммануэль Жюль Ханон
Original Assignee
Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB0620336.8A external-priority patent/GB0620336D0/en
Priority claimed from GB0620337A external-priority patent/GB0620337D0/en
Priority claimed from GB0620816A external-priority patent/GB0620816D0/en
Priority claimed from GB0620815A external-priority patent/GB0620815D0/en
Priority claimed from PCT/EP2006/069977 external-priority patent/WO2007071710A2/en
Priority claimed from GB0707697A external-priority patent/GB0707697D0/en
Priority claimed from GB0711357A external-priority patent/GB0711357D0/en
Priority claimed from GB0712062A external-priority patent/GB0712062D0/en
Application filed by Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А. filed Critical Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А.
Publication of EA200900350A1 publication Critical patent/EA200900350A1/ru
Publication of EA015817B1 publication Critical patent/EA015817B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/295—Polyvalent viral antigens; Mixtures of viral and bacterial antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

В настоящем изобретении предлагается иммуногенная композиция, содержащая антиген или антигенную композицию и адъювантную композицию, состоящую из эмульсии ″масло в воде″, где указанная эмульсия ″масло в воде″ содержит 0,25-1,25% (об./об.) сквалена, 0,25-1,25% (об./об.) токола и 0,1-0,7% (об./об.) эмульгатора от общего объема композиции, а также ее применение при изготовлении лекарственного средства для использования в профилактической терапии или терапии состояния или заболевания человека. Также предложен способ лечения или предупреждения заболевания, включающий введение пациенту, страдающему от заболевания или подверженному ему, иммуногенной композиции по изобретению.

Description

Настоящее изобретение относится к улучшенной вакцине и иммуногенным композициям и к их применению в медицине. В частности, изобретение относится к иммуногенным композициям, содержащим адъювант в виде эмульсии масло в воде, и их применению в медицине, в частности их применению для усиления иммунных ответов на различные антигены, и к способам получения, где эмульсия масло в воде содержит токол, сквален и эмульгатор.
Предшествующий уровень техники
Существует неизменная потребность в новых композициях или вакцинах с улучшенной иммуногенностью. В качестве одной стратегии адъюванты использовали для достижения и улучшения иммунного ответа, генерируемого на какой-либо заданный антиген и/или для снижения реактогенности/токсичности в организме хозяина.
Эмульсии масло в воде сами по себе хорошо известны в данной области техники и предложены как полезные в качестве адъювантных композиций (ЕР 399843; νθ 95/17210).
В νθ 95/17210 раскрыты эмульсии масло в воде, содержащие 2-10% сквалена, 2-10% αтокоферола и 0,3-3% Твин 80 и их применение самих по себе или в комбинации с ^821 и/или 3Ό-ΜΡΤ (3-де-О-ацилированный монофосфориллипид А).
В νθ 99/12565 раскрыты эмульсионные композиции масло в воде, содержащие метаболизируемое масло, сапонин и стерол. Эмульсии масло в воде дополнительно содержат 3Ό-ΜΡΤ.
В νθ 99/11241 раскрыты эмульсии масло в воде, содержащие метаболизируемое масло и сапонин, где масло и сапонин присутствуют в соотношении от 1:1 до 200:1.
Все еще существует потребность в улучшенных вакцинных и иммуногенных композициях, которые обеспечивают подходящий иммунный ответ и являются менее реактогенными в организме хозяина.
Краткое изложение сущности изобретения
Авторы изобретения обнаружили, что можно использовать вакцинные или иммуногенные композиции, содержащие более низкие количества каждого компонента эмульсии масло в воде, поддерживая сравнимый иммунный ответ против антигена или антигенной композиции в указанной композиции. Преимуществом этого является поддержание уровня иммуногенности к антигену, в то время как реактогенность в организме хозяина-реципиента понижена.
Соответственно в первом аспекте настоящего изобретения предлагается иммуногенная композиция, содержащая антиген или антигенную композицию и адъювантную композицию, состоящую из эмульсии масло в воде, где указанная эмульсия масло в воде содержит 0,25-1,25% (об./об.) сквалена, 0,251,25% (об /об.) токола и 0,1-0,7% (об./об.) эмульгатора от общего объема композиции.
Предпочтительно токол представляет собой α-токоферол.
Предпочтительно эмульгатор представляет собой полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат, наиболее предпочтительно полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат выбран из группы, включающей Ро1у8ОтЬа1е® 80 или Т\гееп® 80.
Предпочтительно антиген или антигенную композицию получают из вируса гриппа.
Предпочтительно доза иммуногенной композиции согласно настоящему изобретению, предназначенная для введения человеку, составляет 0,4-1,5 мл, более предпочтительно объем дозы составляет 0,5, 0,7 или 1,0 мл.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предлагается применение иммуногенной композиции по изобретению в качестве лекарственного средствоа для использования в профилактической терапии или терапии состояния или заболевания человека.
В дополнительном аспекте изобретения предлагается применение иммуногенной композиции по настоящему изобретению при изготовлении лекарственного средства для использования в профилактической терапии или терапии состояния или заболевания человека.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предлагается способ лечения или предупреждения заболевания, включающий введение пациенту, страдающему от заболевания или подверженному ему, иммуногенной композиции по изобретению.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1: Клиническое испытание: средние геометрические значения титров (СМТ§) анти-НА антител в разные моменты времени (АТР (Ассотбшд 1о рго!оео1 (согласно протоколу))-группа исследования иммуногенности).
Фиг. 2: Клиническое испытание: уровень серопротекции (8РК.) для титра Н1-антител с 95% доверительным интервалом на 0 и 21 сутки (АТР-группа исследования иммуногенности).
Фиг. 3: Клиническое испытание: уровень сероконверсии (8СК.) для титра Н1-антител с доверительным интервалом 95% на 21 сутки (АТР-группа исследования иммуногенности).
Фиг. 4: Клиническое испытание: фактор сероконверсии (8СЕ) для титра Н1-антител с 95% доверительным интервалом на 21 сутки (АТР-группа исследования иммуногенности).
Фиг. 5: Исследование на мышах: Тест ингибирования гемагглютинина (СМТ+/-1С95) у мыши ВАТВ/с, праймированной гетеросубтипическими штаммами (интервал доз А803).
- 1 015817
Фиг. 5А: Титры анти-А/Ыете Са1ейоша/20/99 ΗΙ; Фиг. 5Б: Титры анти-А/Рапата/2007/99 ΗΙ. Фиг. 5В: Титры анти-В/§йапйопд/7/97 ΗΙ.
Фиг. 6: Исследование на мышах: Тест ингибирования гемагглютинина (СМТ +/- 1С95) у С57В1/6 мыши, праймированной гетеросубтипическими штаммами (интервал доз АБ03).
Фиг. 7: Исследование на мышах: Клеточный иммунный ответ (СИ4+ Т се11) в РВМС (мононуклеары периферической крови) из мыши С57В1/6, праймированной гетеросубтипическими штаммами (интервал доз АБ03).
Фиг. 8: Исследование на мышах: Клеточный иммунный ответ (СИ4+Т-клетки) в РВМС от мыши С57В1/6, праймированной гетеросубтипическими штаммами и иммунизированной низкой дозой антигена (0,5 мкг), адъювантированного интервалом доз АБ03.
Фиг. 9: Исследование на мышах: ЕЬ1§А Титры (А и Б) Н5Ы1-специфического сывороточного 1д и анти-Н5Ы1 1дС1 (В и Г) и 1дС2Ь (Д и Е) изотипических ответов на 14 сутки после иммунизации (СМТ+/1С95) для двух разных доз антигена: 1,5 мкг (А, В и Д) или 0,38 мкг (Б, Г и Е).
Фиг. 10: Исследование на мышах: Тест ингибирования гемагглютинации (СМТ +/- 1С95) на 21 сутки после иммунизации (СМТ+/-1С95) для двух разных доз антигена: 1,5 мкг (А) или 0,38 мкг (Б).
Фиг. 11: Исследование на мышах: Клеточный иммунный ответ (СИ4+ Т-клетки) у ранее не подвергавшейся воздействию мыши С57В1/6, иммунизированной разными дозами Н5И1-вакцины (1,5 или 0,38 мкг), адъювантированной интервалом доз АБ03: (А) 1,5 мкг НА Ад (антиген) или (Б) 0,38 мкг НА Ад (антиген).
Фиг. 12: Исследования на свиньях. Тест ингибирования гемагглютинина (СМТ+/-1С95) у свиней, праймированных гомологичными штаммами (интервал доз АБ03).
Подробное описание изобретения
Термины содержащий, содержат и содержит в данном описании изобретения, как предполагается авторами, в каждом случае являются возможно заменяемыми терминами состоящий из, состоят из и состоит из соответственно.
Воплощения в данном описании изобретения, относящиеся к вакцинным композициям по изобретению, также применимы к воплощениям, относящимся к иммунногенным композициям по изобретению, и наоборот.
Компонент в виде эмульсии масло в воде
Сквален (2,6,10,15,19,23-гексаметил-2,6,10,14,18,22-тетракозагексаен) представляет собой ненасыщенное масло, которое обнаруживается в больших количествах в жире из печени акулы, и в более низких количествах в оливковом масле, масле зародышей пшеницы, масле рисовых отрубей и в дрожжах, и является особенно предпочтительным маслом для применения в данном изобретении. Сквален является метаболизируемым маслом, поскольку представляет собой промежуточный продукт в биосинтезе холестерина (Мегск шйех, 10(11 ΕάίΙίοη. еп1гу по.8619).
Количество сквалена в иммунногенной композиции может быть выражено в виде процента от общей композиции. Подходящим образом сквален присутствует в иммуногенной композиции в количестве 0,25-1,25% (об./об.) от общего объема композиции.
В еще одном конкретном воплощении метаболизируемое масло присутствует в конечном количестве 1,25% от общего объема иммунногенной композиции. В еще одном конкретном воплощении метаболизируемое масло присутствует в конечном количестве 0,25% (об./об.) от общего объема композиции.
С целью пояснения, концентрации, приведенные в об./об., могут быть переведены в концентрацию в мас./об. путем применения следующего переводного коэффициента: концентрация сквалена 5% (об./об.) эквивалентна концентрации сквалена 4,28% (мас./об.).
Эмульсия масло в воде содержит токол. Токолы хорошо известны в данной области техники и описаны в ЕР0382271. Подходящим образом токол представляет собой α-токоферол или его производное, такое как α-токоферола сукцинат (также известный как сукцинат витамина Е).
Количество токола может быть представлено в виде процента от общего объема иммунногенной композиции. Подходящим образом токол присутствует в имууногенной композиции в количестве от 0,25 до 1,25% (об./об.) от общего объема иммуногенной композиции.
В конкретном воплощении токол присутствует в конечном количестве примерно 1,25% от общего объема вакцинной или иммунногенной композиции. В еще одном конкретном воплощении токол присутствует в конечном количестве 0,25% (об./об.) общего объема или 1,25% (об./об.) в объеме дозы 0,5 мл, или 0,9% (об./об.) в объеме дозы 0,7 мл, или 0,5% (об./об.) в 0,5 мл дозе или 0,35-0,37%, предпочтительно 0,36%, в 0,7 мл вакцинной или иммунногенной дозе.
С целью пояснения, концентрации, приведенные в об./об., могут быть переведены в концентрацию в мас./об. путем применения следующего переводного коэффициента: концентрация α-токоферола 5% (об./об.) эквивалентна концентрации α-токоферола 4,8% (мас./об.).
Эмульсия масло в воде дополнительно содержит эмульгатор. Эмульгатор подходящим образом может представлять собой полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат. В конкретном воплощении эмульгатор может быть выбран из группы, содержащей Ро1узогЬа1е® 80 или Т\гееп® 80.
- 2 015817
Количество эмульгатора может быть выражено в виде процента от общего объема иммуногенной композиции. Подходящим образом эмульгатор присутствует в иммунногенной композиции в количестве 0,125-0,7% (об./об.) от общего объема композиции, предпочтительно 0,08-0,05, или 0,1-0,7, или 0,2-0,6, или 0,25-0,55, или 0,3-0,52, или 0,4-0,5% (об./об.) от общего объема. В конкретном воплощении эмульгатор присутствует в количестве 0,7, 0,5 или 0,2% (об./об.) от общего объема вакцинной или иммунногенной композиции.
С целью пояснения, концентрации, указанные в об./об., могут быть переведены в концентрацию в мас./об. путем применения следующего переводного коэффициента: концентрация полисорбата 80 1,8% (об./об.) эквивалентна концентрации полисорбата 80 1,91% (мас./об.).
В конкретном воплощении 0,5 мл объем вакцинной или иммуногенной содержит 0,45% (об./об.) Т\тссп 80, и 0,7 мл объем дозы содержит 0,315% (об./об.) Т\уссп 80. В еще одном конкретном воплощении 0,5 мл доза содержит 0,18% (об./об.) эмульгатора и 0,7 мл доза вакцинной или иммунногенной композиции содержит 0,126% (об./об.) эмульгатора.
Под термином доза, предназначенная для человека подразумевается доза, которая представлена в объеме, пригодном для применения у человека. Как правило, она составляет от 0,25 до 1,5 мл. В одном воплощении доза, предназначенная для человека, составляет 0,5 мл. В дополнительном воплощении доза, предназначенная для человека, выше 0,5 мл, например 0,6; 0,7; 0,8; 0,9 или 1 мл. В дополнительном воплощении доза, предназначенная для человека, составляет от 1 до 1,5 мл. В еще одном воплощении, в частности, если иммуногенная композиция предназначена для педиатрической популяции, доза, предназначенная для человека, может быть меньше 0,5 мл, такой как 0,25-0,5 мл. Изобретение отличается тем, что каждый или все отдельные компоненты адъюванта в составе иммуногенной композиции присутствует/присутствуют на более низком уровне, чем считалось пригодным ранее, и обычно представляет/представляют собой перечисленные выше. Особенно подходящие композиции содержат следующие адъювантные компоненты в следующих количествах в конечном объеме дозы, предназначенной для человека, 0,5 мл:
Таблица 1
Н· X со т § << Адъювант В Адъювант Адъювант Адъювант С Адъювант С Адъювант Э
Эмульсия м/в 125 мкл 100 мкл 83,33 мкл 62,5 мкл 50 мкл 31,25 мкл 25 мкл
Компоненты:
Токоферол 5,94 мг 4,28 мг 3,57 мг 2,68 мг 2,38 мг 1,34 мг 1,19 мг
Сквален 5,35 мг 4,75 мг 3,96 мг 2,97 мг 2,14 мг 1,49 мг 1,07 мг
Полисорбат 80 2,43 мг 1,94 мг 1,62 мг 1,21 мг 0,97 мг 0,61 мг 0,48 мг
В изобретении дополнительно предлагается адъювантная композиция, содержащая отдельные компоненты, как определено выше в данном описании изобретения, и в количестве, определенном выше, например, но исключительно так, как поясняется в табл. 1. Обычно такая адъювантная композиция будет представлена в объеме, подходящем для дозы, предназначенной для человека. Если адъювант находится в жидкой форме для объединения с жидкой формой антигенной композиции, то адъювантная композиция будет представлена в объеме, подходящем для дозы, предназначенной для человека, который представляет собой часть предполагаемого конечного объема дозы, предназначенной для человека, например, приблизительно половину предполагаемого конечного объема дозы, предназначенной для человека, например объем 350 мкл для предполагаемой дозы, предназначенной для человека, 0,7 мл, или объем 250 мкл для предполагаемой дозы, предназначенной для человека, 0,5 мл. Адъювантную композицию разбавляют при объединении с антигенной композицией с получением конечной дозы вакцины, предназначенной для человека. Конечный объем такой дозы будет, конечно, варьироваться в зависимости от начального объема адъювантной композиции и объема антигенной композиции, добавленной к адъювантной композиции. В альтернативном воплощении жидкий адъювант используют для разведения лиофилизированной антигенной композиции. В данном воплощении подходящий объем дозы, предназначенной для человека, адъювантной композиции приблизительно равен конечному объему дозы, предназначенной для человека. Жидкую адъювантную композицию добавляют во флакон, содержащий лиофилизированную антигенную композицию. Конечная доза, предназначенная для человека, может варьироваться между 0,5 и 1,5 мл.
Способ изготовления эмульсий масло в воде хорошо известен специалисту в данной области техники. Обычно такой способ включает смешивание токолсодержащей масляной фазы с поверхностноактивным веществом, таким как раствор ΡΒ8/ΤΨΕΕΝ80™, с последующей гомогенизацией с применением гомогенизатора, специалисту в данной области техники понятно, что способ, включающий пропуска
- 3 015817 ние смеси дважды через иглу шприца будет пригодным для гомогенизации небольших объемов жидкости. В равной степени процесс эмульгирования в микрофлюидизаторе (аппарат М1 108 МюгоПшбюк. максимум 50 проходов в течение 2 мин при максимальном давлении на входе 6 бар (6х 105 Па) (выходное давление примерно 850 бар (8.5х107 Па))) может быть адаптирован специалистом в данной области техники для получения меньших или больших объемов эмульсии. Адаптирование может быть выполнено посредством обычного экспериментирования. включающего проведение замеров в образующейся эмульсии до тех пор. пока не получают препарат с масляными каплями требуемого диаметра.
В эмульсии масло в воде масло и эмульгирующее вещество должны быть в водном носителе. Водный носитель может представлять собой. например. фосфатно-солевой буферный раствор.
Предпочтительно эмульсионные системы масло в воде по настоящему изобретению имеют небольшой размер масляной капли в субмикронном диапазоне. Подходящие размеры капель находятся в диапазоне 120-750 нм. более предпочтительны размеры от 120 до 600 нм в диаметре. Более предпочтительно эмульсия масло в воде содержит масляные капли при интенсивности. из которых по меньшей мере 70% по количеству имеют менее диаметр 500 нм. более предпочтительно по меньшей мере 80% по интенсивности имеют диаметр менее 300 нм. более предпочтительно по меньшей мере 90% по интенсивности находятся в диапазоне от 120 до 200 нм диаметром.
Размер масляной капли. то есть диаметр. согласно настоящему изобретению приведен по интенсивности. Существует несколько способов определения диаметра размера масляной капли посредством интенсивности. Интенсивность измеряют. используя устройство для определения размера. удобно посредством динамического рассеяния света. такого как Макет ΖοΙηκίζοΓ 4000 или предпочтительно Макет ΖοΙηκίζοΓ 3000Н8. Подробная методика приведена в примере П.2. Первая возможность состоит в определении ΖΆΌ - среднего диаметра по ζ. посредством динамического рассеяния света (РС8-фотонкорреляционная спектроскопия); такой способ дополнительно дает индекс полидисперсности (РБ1). и ΖΆΌ и РБ1 рассчитывают при помощи кумулянтного алгоритма. Данные значения не требуют знания показателя преломления частицы. Второй способ состоит в расчете диаметра масляной капли путем определения полного распределения частиц по размерам посредством другого алгоритма. либо СопБп. либо ΝΝΕ8. либо автоматического алгоритма Макет (алгоритма по умолчанию. предусмотренного для устройства для измерения размера). Большей частью. так как показатель преломления частиц сложной композиции неизвестен. принимают во внимание только распределение интенсивности. и в случае необходимости среднее значение интенсивности. возникающее из этого распределения.
Антигены и антигенная композиция
Иммуногенные композиции содержат антиген или антигенную композицию. способную вызывать иммунный ответ против человеческого или животного патогена.
Соответственно. указанный антиген или антигенная композиция происходит из одного или более из нижеперечисленного: Н1У-1 (такого как дад или его фрагменты. такие как р24. 1а(. пеГ. др120 или др160 или фрагменты любого из них). вирусы герпеса человека. такие как дБ или его производные. или предранний белок. такой как 1СР27 из Н8У1 или Н8У2. цитомегаловирус ((особенно человеческий) (такой как дВ или его производные). ротавирус (включая живые аттенуированные вирусы). вирус ЭпштейнаБарр (такой как др350 или его производные). вирус ветряной оспы (такой как др1. II и ΙΕ63). или вируса гепатита. такого как вирус гепатита В (например поверхностный антиген гепатита В или его производное). вирус гепатита А. вирус гепатита С и вирус гепатита Ε. или из других вирусных патогенов. таких как парамиксовирусы: респираторно-синцитиальный вирус (такой как белки Е. N. М и С или их производные). вирус 8АП8 (тяжелый острый респираторный синдром). вирус парагриппа. вирус кори. вирус эпидемического паротита. вирусы папилломы человека (например НРУ6. 11. 16. 18). флавивирусы (например. вирус желтой лихорадки. вирус Денге. вирус клещевого энцефалита. вирус японского энцефалита) или вирус гриппа (цельный живой или инактивированный вирус. расщепленный вирус гриппа. выращенный в яйцах или в МБСК-клетках (клетки почек собак Мабш-БагЬу). или цельные виросомы гриппа (как описано у П. С1иск. Уаееше. 1992. 10. 915-920) или их очищенные или рекомбинантные белки. такие как белки НА. №. ΝΑ. или М. или их комбинации). или происходящие из бактериальных патогенов. таких как виды №бкепа. включая Ν. доиоггйеа и Ν. тепшдШбб (например. капсулярные сахариды и их конъюгаты. трансферрин-связывающие белки. лактоферрин-связывающие белки. Р11С. адгезины); 8. руодепек (например. М-белки или их фрагменты. протеаза С5А. липотейхоевые кислоты). 8. ада1асБае. 8. ти1аи8; Н. бисгеуц виды Могахе11а. включая М. са1агг11аНк. также известную как ВгапбатеПа са1агг11ак (например. высокомолекулярные и низкомолекулярные адгезины и инвазины); виды Вогбе1е11а. включая В. регШккб (например. пертактин. токсин коклюша или их производные. нитевидный гемагглютинин. аденилатциклаза. фимбрии). В. рагарегШккб и В. ЬгопсЫкерйса; виды МусоЬас1егшт. включая М. 1иЬегси1ок1к (например Е8АТ6. антиген 85А. -В или -С). М. Ьог1к. М. 1ергае. М. аущт. М. рагаШЬегси1окб. М. ктедтак; виды Бедюпе11а. включая Ь. рпеиторНПа; виды ЕксНепсЫа. включая энтеротоксичную Е. сой (например. факторы колонизации. термолабильный токсин или его производные. термостабильный токсин или его производные). энтерогеморрагическую Е. сой. энтеропатогенную Е. сой (например шигаподобный токсин или его производные); виды У1Ьгю. включая V. с1ю1ега (например. токсин холеры или его
- 4 015817 производные); виды 8Ыдс11а, включая 8. коппст 8. буксШспас, 8, Псхпсги; виды Усташа, включая Υ. сп!егосо1й1еа (например, Υορ-белок), Υ. рскбк, Υ. рксибо!иЬсгси1ок1к; виды Сатру1оЬае!сг, включая С. )с)ши (например токсины, адгезины и инвазины) и С. сой; виды 8а1топс11а, включая 8. (урНт 8. рата!урЫ, 8. сйо1сгаскшк, 8. сп1спЦб1к; виды ЫкВпа, включая Ь. топосуЮдспсх; виды НсисоЬас!сг, включая Н. ру1оп (например уреаза, каталаза, вакуолизирующий токсин); виды Рксиботопак, включая Р. астидшока; виды 8!арйу1ососсик, включая 8. аитсик, 8. ср|бспшб1к; виды Еп1стососсик, включая Е. ГассаНз, Е. Гассшт; виды С1ок!п6шш, включая С. 1с1ап1 (например, столбнячный токсин и его производные), С. Ьо!и1шит (например, ботулотоксин и его производные,), С. бйГтсбс (например, клостридиальные токсины А или В и их производные); виды ВасШик, включая В. апЮтаак (например, ботулотоксин и его производные); виды СогупсЬас!стшт, включая С. б|р11111спас (например, дифтерийный токсин и его производные); виды Вогтсйа, включая В. ЬигдбогГсп (например, ОкрА, ОкрС, ОЬрА, ЭЬрВ), В. датши (например, ОкрА, ОкрС, ОЬрА, ЭЬрВ), В. аГхсЫ (например, ОкрА, ОкрС, ОЬрА, ОЬрВ,), В. апбсткопй (например, ОкрА, ОкрС, ОЬрА, ОЬрВ), В. йсттки; виды ЕйтйсЫа крр., включая Е. сс.|ш и агент гранулоцитарного эрлихиоза человека; виды Ктсксйыа, включая В. псксИкп; виды СЫатуФа, включая С. йасйотайк (например, МОМР, гепарин-связывающие белки), С. рпситошас (например, МОМР, гепарин-связывающие белки), С. ркШаск виды Еср!окр1га, включая Ь. ш1стгодапк; виды Тгсропста, включая Т. раШбит (например, минорные белки наружной мембраны), Т. бспбсо1а, Т. 11уобуксп1спас; или происходящие из паразитов, таких как виды Р1актоб1ит, включая Р. ГаШрагит; виды Тохор1акта, включая Т. допби (например, 8А62, 8А63, Тд34); виды Еп!атосЬа, включая Е. 1ик1о1уйса; виды ВаЬсыа, включая В. тюгоб; виды Тгурапокота, включая Т. сги/ί; виды 61агб1а, включая 6. 1атЬ11а; виды Ескйтап1а, включая Ь. та)ог, виды Рпситосукбк, включая Р. саппи; виды Тг1сйотопак, включая Т. уадшайк; виды 8сЫкок!ота, включая 8. тапкош, или происходящие из дрожжей, таких как виды Сапб1ба, включая С. а1Ысапк; виды Сгур!ососсик, включая С. псоГогтапк.
Композиции по настоящему изобретению можно использовать для профилактики или лечения аллергии. Такие вакцины должны содержать аллергенспецифические и аллергеннеспецифические антигены.
Другие предпочтительные конкретные антигены для М. 1иЬсгси1ок1к представляют собой, например, ТЬ Ва12, ТЬ Н9, ТЬ Ва35, ТЬ38-1, Егб 14, ПРУ, МТ1, М8Ь, тТТС2 и 11ТСС1 (№О 99/51748). Белки для М. !иЬсгси1ок1к также включают слитые белки и их варианты, где по меньшей мере два, предпочтительно три полипептида М. 1иЬсгси1ок1к слиты в более крупный белок. Предпочтительные слитые белки содержат Ва12-ТЬН9-Ва35, Етб14-ОРУ-МТ1, ПРУ-МТ1-М8Ь, Егб14-ПРУ-МТ1-М8Ь-тТСС2, Етб14-ПРУ-МТ1-М8Ь, ПРУ-МТ1-М8Ь-шТСС2, ТЬН9-ПРУ-МТ1 (№О 99/51748).
Наиболее предпочтительные антигены для С111атуб1а включают, например, высокомолекулярный белок (НМ^) (\УО 99/17741), ОВР3 (ЕР 366 412), и предполагаемые мембранные белки (Ртрк). Другие антигены С111атуб1а в вакцинной композиции могут быть выбраны из группы, описанной в \УО 99/28475.
Предпочтительные бактериальные вакцины содержат антигены, происходящие из 8!гср!ососсик крр., включая 8. рпситошас (например, РкаА, РкрА, стрептолизин, холин-связывающие белки) и белковый антиген пневмолизин (ВюсЬст ВюрЬук Ас!а, 1989, 67, 1007; ВиЬшк с! а1., МютоЬ1а1 Ра!йодспск1к, 25, 337-342) и их мутантные детоксифицированные производные (\УО 90/06951; XVО 99/03884). Другие предпочтительные бактериальные вакцины содержат антигены, происходящие из НасторЫ1ик крр., включая Н. тПисп/ас типа В, нетипичную Н. шПиспгас, например ОМР26, высокомолекулярные адгезины, Р5, Р6, белок Ό и липопротеин Ό, и фимбрин и происходящие от фимбрина пептиды (И8 5843464) или их многократно копированные варианты или слитые белки.
Производные поверхностного антигена гепатита В хорошо известны в данной области техники и включают, в частности, антигены Рге81, Ргс82 8, описанные в заявках на европейский патент ЕР-А414374; ЕР-А-0304578 и ЕР 198-474. В одном предпочтительном аспекте вакцинная композиция по изобретению содержит антиген Н1У-1, др120, особенно при экспрессии в клетках СНО (яичника китайского хомяка). В дополнительном воплощении вакцинная композиция по изобретению содержит дО21, как определено выше в данном описании изобретения.
В предпочтительном воплощении настоящего изобретения вакцины, содержащие заявленный адъювант, содержат антиген, происходящий из вируса папилломы человека (НРУ), считающийся ответственным за остроконечные кондиломы (НРУ 6 или НРУ 11 и другие) и вирусов НРУ, ответственных за рак шейки матки (НРУ16, НРУ18 и другие).
Особенно предпочтительные формы профилактической или терапевтической вакцины для остроконечной кондиломы содержат белок Ь1 и слитые белки, содержащие один или более антигенов, выбранных из НРУ белков Е1 , Е2, Е5, Е6, Е7, Ь1 и Ь2.
Наиболее предпочтительные формы слитого белка представляют собой Ь2Е7, раскрытый в VО 96/26277, и белок О(1/3)-Е7, раскрытый в №О99/10375.
Предпочтительная НРУ инфекция шейки матки или рак, профилактическая или терапевтическая вакцина, композиция может содержать антигены НРУ 16 или 18.
Особенно предпочтительные НРУ 16 антигены содержат ранние белки Е6 или Е7 в слиянии с носителем белка Ό с образованием слияний белок О-Е6 или Е7 из НРУ 16 или их комбинаций; или комбина
- 5 015817 ций Е6 или Е7 с Ь2 (УО 96/26277).
Альтернативно ранние белки Е6 и Е7 НРУ 16 или 18 могут быть представлены единственной молекулой, предпочтительно слиянием белок Э-Е6/Е7. Такая вакцина возможно может содержать любой из двух или оба из белков Е6 и Е7 из НРУ 18, предпочтительно в форме слитых белков белок Ό -Е6 или белок Ό - Е7 или слитого белка белок Э-Е6/Е7.
Вакцина по настоящему изобретению может дополнительно содержать антигены из других штаммов НРУ, предпочтительно из штаммов НРУ 31 или 33.
Вакцины или иммуногенные композиции по настоящему изобретению дополнительно содержат антигены, происходящие из паразитов, которые вызывают малярию, например антигены из Р1актоб1а ίαίοίрагит, включая белок циркумспорозоита (С8-белок), КТ8,8, М8Р1, М8Р3, Ь8А1, Ь8А3, АМА1 и ТКАР. КТ8 представляет собой гибридный белок, содержащий, по существу, весь С-концевой участок белка циркумспорозоита (С8) из Р. £а1с1ратит, присоединенный с помощью четырех аминокислот области рге82 поверхностного антигена гепатита В к поверхностному (8) антигену вируса гепатита В. Его полная структура раскрыта в международной патентной заявке №РСТ/ЕР92/02591, опубликованной под номером УО 93/10152, с заявленным приоритетом патентной заявки ИК 9124390.7. При экспрессии в дрожжах КТ8 продуцируется в виде липопротеиновой частицы, и когда его коэкспрессируют с антигеном 8 из НВУ, то получают смешанную частицу, известную как КТ8,8. Антигены ТКАР описаны в международной патентной заявке №РСТ/СВ89/00895, опубликованной в рамках УО 90/01496. Антигены Р1актоб1а, которые являются подходящими кандидатами в компоненты мультистадийной противомалярийной вакцины, представляют собой Р. £а1с1ратит М8Р1, АМА1, М8Р3, ЕВА, СЬиКР, КАРЕ КАР2, 8ес.|иек1пп. РЕЕМР1, Р1332, Ь8А1, Ь8А3, 8ТАКР, 8АЬ8А, РЕЕХР1, Р£к25, Р£к28, РЕ827/25, Р£к16, РЖ48/45, РЖ230 и их аналоги в Р1актобшт крр. Одно воплощение настоящего изобретения представляет собой малярийную вакцину, где антигенный препарат содержит белок КТ88 или С8 или его фрагмент, такой как С8-участок из КТ8,8, в комбинации с одним или более дополнительными малярийными антигенами, причем любой из них или оба вместе могут быть прикреплены к субъединице шигатоксина В согласно изобретению. Один или более чем один дополнительный малярийный антиген может быть выбран, например, из группы, состоящей из МР81, М8Р3, АМА1, Ь8А1 или Ь8А3.
Композиции могут также содержать противоопухолевый антиген и быть полезными для иммунотерапевтического лечения раковых заболеваний. Например, адъювантная композиция находит применение с антигенами отторжения опухоли, такими как антигены для раков простаты, молочной железы, прямой и ободочной кишки, легкого, поджелудочной железы, почки или меланомы. Типичные антигены включают МАСЕ 1 и МАСЕ 3 или другие антигены МАСЕ (для лечения меланомы), РКАМЕ, ВАСЕ или САСЕ (КоЬЬшк и Каиакат!, 1996, Сштеи! Оршюик ίη 1ттиио1оду 8, стр. 628-636; Уап беи Еуибе е( а1., 1п1егпа(1опа1 1оитиа1 о£ Сйшса1 & БаЬогаЮгу Кекеагсй (киЬтЖеб 1997); Соггеа1е е( а1. (1997), 1оита1 о£ 1Пе №1юиа1 Сапсег 1пк111и1е 89, р. 293. В действительности такие антигены экспрессируют в широком спектре типов опухолей, таких как меланома, карцинома легкого, саркома и карцинома мочевого пузыря. Другие опухолеспецифические антигены подходят для использования с адъювантами по настоящему изобретению и включают, но без ограничения ими, опухолеспецифические ганглиозиды, простатоспецифический антиген (Р8А) или Нег-2/иеи, К8А (СА733), РАР, маммаглобин, МИС-1, раковоэмбриональный антиген (СЕА), р5018 (простеин). Согласно одному аспекту настоящего изобретения предложена вакцина, содержащая адъювантную композицию по изобретению и антиген отторжения опухоли. В одном аспекте опухолевый антиген представляет собой Нег-2/иеи.
В одном аспекте настоящего изобретения предложены вакцины, содержащие опухолевый антиген таких видов рака, как рак простаты, молочной железы, прямой и ободочной кишки, легкого, поджелудочной железы, почки, яичника или меланому. Соответственно, композиции могут содержать опухолеассоциированный антиген, а также антигены, ассоциированные с опухолеподдерживающими механизмами (например, ангиогенез, инвазия опухоли). Кроме того, антигены, особенно подходящие для вакцин в терапии рака, также содержат простатоспецифический мембранный антиген (Р8МА), антиген стволовых клеток простаты (Р8СА), р5018 (постеин), тирозиназу, сурвивин, ПУ-Е8О1, простазу, Р8108 (УО 98/50567), КАСЕ, ЬАСЕ, НАСЕ. Кроме того, указанный антиген может представлять собой аутологичный пептидный гормон, такой как полноразмерный гонадотропинвысвобождающий гормон (СиКН, УО 95/20600), короткий пептид, длиной 10 аминокислот, полезный в лечении многих видов рака, или в иммунокастрации.
Вакцинация
Вакцинные препараты, содержащие иммуногенные композиции по настоящему изобретению, можно использовать для защиты или лечения млекопитающего, подверженного инфекции, посредством введения указанной вакцины системным или мукозальным путем. Такие введения могут включать инъекцию посредством внутримышечного, внутрибрюшинного, интрадермального или подкожного способов; или посредством мукозального введения в пероральный/пищевой, дыхательный, мочеполовой тракты. Хотя вакцина по изобретению может быть введена в виде однократной дозы, ее компоненты также могут быть введены вместе одновременно или в разные моменты времени (например, конъюгаты пневмококкового сахарида можно вводить раздельно, одновременно или через 1-2 недели после введения любого бак
- 6 015817 термального белкового компонента вакцины для оптимальной координации иммунных ответов по отношению друг к другу). Кроме того, вакцины по изобретению можно вводить ΙΜ в праймирующих дозах и ΙΝ в бустерных дозах.
Содержание белковых антигенов в вакцине типично находится в диапазоне 1-100 мкг, предпочтительно 5-50 мкг, более типично в диапазоне 5-25 мкг. После первичной вакцинации субъекты могут получить одну или несколько повторных иммунизации, надлежащим образом разделенных во времени.
Вакцинный препарат в целом описан в Уассше Ωοδίβη (ТНе киЬиш! аиб абщгагИ арргоасН (еб§ Ρο\νе11 Μ. Р. & №\\шап Μ.Ρ) (1995) Р1еиит Рге§8 №\ν Уогк). Инкапсуляция в липосомы описана РиНейои, патент И8 4235877.
Вакцины по настоящему изобретению можно хранить в растворе или лиофилизировать. Предпочтительно раствор лиофилизируют в присутствии сахара, такого как сахароза или лактоза. Кроме того, предпочтительно их лиофилизировать и восстанавливать непосредственно перед применением.
В одном аспекте изобретения предлагается вакцинный набор, включающий флакон, содержащий иммуногенную композицию по изобретению, возможно в лиофилизированной форме, и дополнительно включающий флакон, содержащий адъювант, как описано в данном описании изобретения. В этом аспекте изобретения предусматривается, что адьювант будет использоваться для восстановления лиофилизированной иммуногенной композиции.
Хотя вакцины по настоящему изобретению можно вводить любым путем, введение описанных вакцин в кожу (ΙΌ) образует одно воплощение настоящего изобретения. Кожа человека содержит наружную загрубевшую кутикулу, называемую роговым слоем, которая покрывает эпидермис. Под поверхностью этого эпидермиса находится слой, называемый дермой, который, в свою очередь, покрывает подкожную ткань. Исследователи показали, что инъекция вакцины в кожу, и в частности в дерму, стимулирует иммунный ответ, который также может быть связан с рядом дополнительных преимуществ. Внутридермальная вакцинация вакцинами, описанными в данном описании изобретения, образует предпочтительный аспект настоящего изобретения.
Обычная техника внутридермальной инъекции, методика Манту, включает стадии очистки кожи и затем натягивание одной рукой, затем с фаской малоразмерной иглы (26-31 размер), направленной вверх, иглу вводят под углом в 10-15°. Как только фаска иглы введена, корпус иглы опускают и продвигают дальше, обеспечивая небольшое давление для повышения его под кожей. Затем жидкость очень медленно инъецируют, образуя таким образом пузырек или выпуклость на поверхности кожи, затем иглу медленно извлекают.
Совсем недавно были описаны устройства, которые спроектированы специально для введения жидких агентов в или через кожу, например устройства, описанные в №О 99/34850 и ЕР 1092444, также устройства безыгольного впрыскивания, описанные, например, в №О 01/13977; И8 5480381, И8 5599302, И8 5334144, И8 5993412, И8 5649912, И8 5569189, И8 5704911, И8 5383851, И8 5893397, И8 5466220, И8 5339163, И8 5312,335, И8 5503627, И8 5064413 И8 5520639, И8 4596556, И8 4790824, И8 4941880, И8 4940460, №О 97/37705 и №О 97/13537. Альтернативные способы интрадермального введения вакцинных препаратов могут включать обычные шприцы и иглы, или устройства, предназначенные для баллистической доставки твердых вакцин (№О 99/27961), или трансдермальные пластыри (№О 97/48440; XVО 98/28037); или нанесение на поверхность кожи (трансдермальная или чрескожная доставка №О 98/20734; \ν() 98/28037).
Если вакцины по настоящему изобретению предназначены для введения в кожу, или более конкретно внутрь дермы, такая вакцина находится в малом объеме жидкости, конкретно в объеме между примерно 0,05 мл и 0,2 мл.
Содержание антигенов в кожных или интрадермальных вакцинах по настоящему изобретению может быть аналогично обычным дозам, найденным для внутримышечных вакцин (см. выше). Однако особенностью кожных или интрадермальных вакцин является то, что композиции могут быть низкодозовыми. Соответственно, белковые антигены в низкодозовых вакцинах предпочтительно присутствуют в концентрации, достигающей от 0,1 до 10 мкг, предпочтительно от 0,1 до 5 мкг на дозу; и сахаридные (предпочтительно конъюгированные) антигены могут присутствовать в диапазоне 0,01-1 мкг, и предпочтительно от 0,01 до 0,5 мкг сахарида на дозу.
При использовании в данном описании изобретения термин интрадермальная доставка означает доставку вакцины к области дермы в коже. Однако вакцина необязательно должна быть локализована исключительно в дерме. Дерма представляет собой слой в коже, расположенный между примерно 1,0 и примерно 2,0 мм от поверхности кожи человека, но существует некоторая величина изменчивости между индивидуумами и в разных частях тела. Как правило, можно ожидать, что она достигнет дермы, проходя 1,5 мм ниже поверхности кожи. Дерма расположена между роговым слоем и эпидермисом на поверхности и подкожным слоем ниже. В зависимости от способа доставки вакцина в конечном итоге может быть локализована исключительно или в основном в пределах дермы, или в конечном итоге она может быть распределена внутри эпидермиса и дермы.
Количество каждого антигена в каждой дозе вакцины выбирают как количество, которое индуцирует иммунопротективный ответ без значительных вредных побочных эффектов типичных вакцин. Такое
- 7 015817 количество будет варьироваться в зависимости от того, какой конкретный иммуноген используется и как он представлен.
В дополнительном воплощении предложен способ лечения индивидуума, подверженного заболеванию или страдающего от него, путем введения композиции, как, по существу, описано в данном описании изобретения.
Также предложен способ профилактики человека от заболевания, выбранного из группы, включающей инфекционные бактериальные и вирусные заболевания, паразитарные заболевания, в частности внутриклеточное патогенное заболевание, пролиферативные заболевания, такие как рак простаты, молочной железы, прямой и ободочной кишки, легкого, поджелудочной железы, почки, яичника или меланома; нераковые хронические расстройства, аллергию, включающий введение указанному человеку композиции, как, по существу, описано в данном описании изобретения.
Данное изобретение дополнительно описано посредством ссылки на следующие неограничивающие примеры:
пример I описывает способы иммунологического считывания, использованные в исследованиях на мышах, хорьках, свиньях и человеке;
пример II описывает приготовление эмульсии масло в воде и адъювантных композиций, использованных в приведенных в качестве примера исследованиях;
пример III демонстрирует клиническое испытание во взрослой популяции с возрастом 18-59 лет вакциной, содержащей препарат антигена расщепленного вируса гриппа и различные дозы адъюванта Л803;
пример IV показывает доклиническую оценку адъювантных и неадъювантных вакцин расщепленного вируса гриппа (содержащих различные дозы адъюванта Л803) в праймированных мышах ВЛЬВ/с;
пример V показывает доклиническую оценку адъювантных и неадъювантных вакцин расщепленного вируса (содержащих различные дозы адъюванта Л803) в праймированных мышах С57ВI/6;
пример VI показывает доклиническую оценку адъювантных и неадъювантных вакцин расщепленного вируса (содержащих различные дозы адъюванта Л803 и низкую дозу антигена) в праймированных мышах С57ВI/6;
пример VII показывает доклиническую оценку адъювантных и неадъювантных вакцин расщепленного вируса Η5Ν1 (содержащих различные дозы адъюванта Л803 и антигена) у неподвергавшихся воздействию С57В1/6 мышей;
пример VIII показывает доклиническую оценку адъювантных и неадъювантных гриппозных вакцин в праймированных свиньях Ьатде А1Шс (Крупная белая).
Пример I. Иммунологические способы считывания.
1.1. Способы исследования на мышах
11.1. Тест ингибирования гемагглютинации
Принцип проведения испытаний (классический способ).
Титры антител к гемагглютинину для трех (сезонных) штаммов вируса гриппа определяют, используя тест ингибирования гемагглютинации (Ш). Принцип теста Ш основан на способности специфических антигриппозных антител ингибировать гемагглютинацию эритроцитов (ВВС) с помощью гемагглютинина вируса гриппа (ΗΑ). Инактивированную нагреванием сыворотку обрабатывают каолином и ВВС для удаления неспецифических ингибиторов. После предварительной обработки двукратные разведения сыворотки инкубируют с 4 гемагглютинирующими единицами каждого штамма вируса гриппа. Затем добавляют эритроциты и оценивают ингибирование агглютинации. Титры выражают как эквивалент самого высокого разведения сыворотки, который полностью подавлял гемагглютинацию. Так как первое разведение сыворотки составляет 1:20, неопределяемый уровень оценивают как титр, равный 10.
Адаптация для Η5Ν1 (частное описание Ш с использованием эритроцитов лошадей).
Так как установлено, что классический анализ Ш для определения анти-ΗΑ антител функционирует должным образом для штамма Η5Ν1, использовали адаптированный протокол с использованием лошадиных ВВС. Для пандемических штаммов Η5Ν1 используют эритроциты лошадей. 0,5% (конечная концентрация) суспензии эритроцитов лошади в фосфатном буфере, содержащем 0,5% В8А (бычий сывороточный альбумин, конечная концентрация). Эту суспензию готовят ежедневно, промывая эритроциты тем же фосфатным буфером и с последующей стадией центрифугования (10 мин, 2000 об./мин). Данную стадию промывания следует повторить еще раз. После добавления лошадиных эритроцитов к реакционной смеси сыворотки и вирусной суспензии планшеты следует инкубировать при комнатной температуре (комнатная температура, 20°С +/- 2°С) в течение 2 ч из-за низкой скорости осаждения лошадиных эритроцитов.
Статистический анализ
Статистический анализ выполняли на поствакционных титрах Ш, используя ϋΝΊδΤΑΤ. Протокол, применяемый для дисперсионного анализа, может быть кратко описан следующим образом:
логарифмическое преобразование данных;
тест Шапиро-Уилка для каждой популяции (группы) для того, чтобы удостовериться в нормально
- 8 015817 сти распределения групп;
тест Кохрана, чтобы подтвердить равномерность отклонений в разных популяциях (группах); дисперсионный анализ выбранных данных;
тест взаимодействия двухфакторного ΑΝΟνΑ (дисперсионного анализа);
тест Тьюки (Η8Ό) для множественных сравнений.
1.1.2. Окрашивание внутриклеточных цитокинов
Данный способ позволяет количественно оценить антигенспецифические Т-лимфоциты на основе продукции цитокинов: эффекторные Т-клетки и/или эффекторные Т-клетки памяти продуцируют ΙΡΝ-γ и/или центральные Т-клетки памяти продуцируют 1Ь-2. РВМС/ собирают на 7 сутки после иммунизации.
Лимфоидные клетки еще раз стимулируют ίη νίΐτο в присутствии ингибитора секреции (брефелдин). Затем эти клетки обрабатывают с помощью традиционного иммунофлуоресцентного способа, используя флуоресцентные антитела (СЭ4. СЭ8. ΙΡΝ-γ и 1Ь-2). Результаты представляют как частоту встречаемости цитокинположительных клеток среди СЭ4/СЭ8 Т-клеток. Внутриклеточное окрашивание цитокинов Тклеток выполняли на РВМС через 7 суток после второй иммунизации. Кровь собирали от мышей и объединяли в гепаринированной среде ВРМЕ Абб. Для крови ВРМ1 + Абб-разбавляющие РВЬ суспензии наслаивали на градиент Ьутр11о1у1с-Матта1 согласно рекомендуемому протоколу (центрифугирование 20 мин при 2500 об./мин и комнатной температуре). Мононуклеарные клетки на поверхности удаляли. промывали 2 раза в КРМ1 + Абб и РВМСк суспензии доводили до 2х106 клеток/мл в КРМ1 5% фетальной телячьей сыворотке.
Антигенную стимуляцию РВМС/ ίη νίΐτο осуществляли при конечной концентрации 1х107 клеток/мл (пробирка РАС8) с цельным ΡΙ (1 мкг ΗΑ/штамм) и затем инкубировали 2 ч при 37°С с добавлением анти-СО28 и анти-СЭ49б (1 мкг/мл для каждого).
После стадии антигенной повторной стимуляции РВМС инкубировали в течение ночи при 37°С в присутствии брефелдина (1 мкг/мл) при 37°С для ингибирования секреции цитокина.
Окрашивание ΙΡΝ-γ /ΙΤ-2/ΟΟ4/ΟΟ8 выполняли следующим образом: клеточные суспензии промывали. ресуспендировали в 50 мкл РВ8 1% РС8. содержащего 2% Рс-блокирующего реагента (1/50; 2.402). Через 10 мин инкубирования при 4°С. добавляли 50 мкл смеси анти-СЭ4-РЕ (2/50) и анти-СЭ8 регСр (3/50) и инкубировали 30 мин при 4°С. После промывания в РВ8 1% РС8. клетки пермеабилизировали путем ресуспенидования в 200 мкл СуЮПх-СуЮрегт (набор ВО) и инкубировали 20 мин при 4°С. Затем клетки промывали Регт ^акй (набор ВО) и ресуспендировали с 50 мкл смеси анти-ШЫ^АРС (1/50) + анти-1Ь-2Р1ТС (1/50). разведенной в Регт \Са511. После инкубирования в течение минимум 2 ч. максимум в течение ночи при 4°С. клетки промывали Регт \Са511 и ресуспендировали в РВ8 1% РС8 + 1% параформальдегида. Анализ образцов выполняли посредством РАС8. Живые клетки пропускали (Р8С/88С). и обнаружение осуществляли на -20000 событий (лимфоциты) или 35000 событий на СЭ4+ Т-клетках. Процентное содержание ГРЫ-γ + или 1Ь2+ рассчитывали на СЭ4+ и СЭ8+ на популяциях клеток. дающих сигнал выше порогового значения.
1.1.3. Анти-Н5Ы1 ЕЫ8А.
Количественную оценку титров анти-Н5Ы1 1д. 1дО 1 и 1дО2Ь антител выполняли при помощи ЕЫ8А. используя расщепленный вирус Η5Ν1 в качестве покрытия. Растворы вируса и антител использовали в количестве 100 мкл на лунку. Расщепленный вирус Η5Ν1 разводили с конечной концентрации 1 мкг/мл в РВ8 и адсорбировали в течение ночи при 4°С на лунки 96-луночного микротитровального планшета (МахЬогЬ 1тшипор1а1е Мшс 439454). Затем планшеты инкубировали в течение 1 ч при 37°С с 200 мкл на лунку РВ8. содержащего 1% В8А и 0.1% Твин 20 (насыщенный буфер). Двенадцать двукратных разведений сыворотки в насыщенном буфере добавляли к планшетам. покрытым Η5Ν1. и инкубировали в течение 1 ч 30 мин при 37°С. Планшеты промывали четыре раза РВ8 0.1% Твин 20. Биотинилированный-конъюгированный антимышиный 1д (Прозан-Е0413). разведенный 1/500. или биотинилированный-конъюгированный антимышиный 1дО 1 (1т1ес11 1070-08). или биотинилированный антимышиный 1дО2Ь (1т1есй 1090-08). разведенный 1/4000 в РВ8 с 1% В8А. 0.1% Т\гееп 20. добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 1.30 ч при 37°С; после стадии промывания. планшеты инкубировали 30 мин со конъюгированной стрептавидин-биотин-пероксидазой (Прозан Р0397). разведенной 1/10000 в РВ8 с 1% В8А Твин 20.
Для колориметрического обнаружения планшеты инкубировали 20 мин при 22°С с раствором ортофенилдиамина (8щта Р4664) 0.04% Η2Ο2 0.03% в 0.1 М цитратном буфере рН 4.2. Реакцию останавливали 2 н. Η2δΟ4 и считывали микропланшеты при 490-630 нм.
1.2. Методы с использованием хорьков.
1.2.1. Тест ингибирования гемагглютинации (ΗΙ)
Способ проведения испытаний.
Титры антигемагглютининовых антител к трем штаммам вируса гриппа определяли. используя тест ингибирования гемагглютинации (ΗΙ). Принцип теста ΗΙ основывают на способности специфических противогриппозных антител ингибировать гемагглютинацию куриных эритроцитов (ВВС) гемагглюти
- 9 015817 нином вируса гриппа (НА). Сыворотку сначала обрабатывали 25% раствором нейраминидазы (ВОЕ) и инактивировали нагреванием для удаления неспецифических ингибиторов. После предварительной обработки двукратные разведения сыворотки инкубировали с 4 гемагглютинирующими единицами каждого штамма гриппа. Затем добавляли куриные эритроциты и рассчитывали ингибирование агглютинации. Титры выражали как эквивалент самого высокого разведения сыворотки, которое полностью ингибировало гемагглютинацию. Так как первое разведение сыворотки составляло 1:10, неопределяемый уровень рассчитывали как титр, равный 5.
Статистический анализ
Статистический анализ выполняли на титрах Н1 (41 сутки, до контрольного заражения), используя ΚΝΊ8Ί АТ. Протокол, используемый для дисперсионного анализа, может быть кратко описан следующим образом:
логарифмическое преобразование данных;
тест Шапиро-Уилка для каждой популяции (группы) для того, чтобы удостовериться в нормальности распределения групп;
тест Кохрана, чтобы подтвердить равномерность отклонений в разных популяциях (группах); дисперсионный анализ выбранных данных;
тест взаимодействия двухфакторного ΑΝΟνΑ (дисперсионного анализа);
тест Тьюки (Ηδϋ) для множественных сравнений.
1.2.2. Мониторинг температуры тела
Индивидуальные температуры контролировали в течение периода контрольного заражения с датчиками и при помощи телеметрической регистрации. Все импланты проверяли и обновляли, и новую калибровку выполняли с помощью Ό8Ι (Эа1а 8е1спес5 1п1етаИопа1, СеШаиги^ед 123, 5015 ТС ТбЬигд, Тйе №1йег1апб8) перед помещением во внутрибрюшинную полость. Все животные были размещены по отдельности в индивидуальных клетках во время данных исследований.
Температуры регистрировали каждые 15 мин, начиная с 4 суток до контрольного заражения вплоть до 7 суток после контрольного заражения.
1.2.3. Назальные промывания.
Назальные промывания выполняли путем введения 5 мл РВ8 в обе ноздри проснувшимся животным. Инокулят собирали в чашки Петри и помещали в контейнеры для образцов на сухой лед.
Титрование вирусов в назальных промываниях
Все назальные образцы сначала стерильно фильтровали через δρίη X фильтры (Сойаг) для удаления любого бактериального загрязнения. 50 мкл последовательных десятикратных разведений назальных промываний переносили в микротитровальные планшеты, содержащие 50 мкл среды (10 лунок/разведение). Затем добавляли в каждую лунку 100 мкл клеток МОСК (2,4х105 клеток/мл) и инкубировали при 35°С в течение 5-7 суток.
Через 5-7 суток инкубирования культуральную среду осторожно удаляли и добавляли 100 мкл среды, содержащей 1/20 νδΤ-1, и инкубировали в течение еще 18 ч.
Интенсивность желтого формазанового окрашивания, получаемого при восстановлении \У8Т-1 жизнеспособными клетками, пропорциональна количеству жизнеспособных клеток, присутствующих в лунке в конце анализа по титрованию вирусов, и количественно определяется путем измерения поглощения каждой лунки при подходящей длине волны (450 нм). Пороговое значение определяют как среднее значение ΟΏ неинфицированных контрольных клеток - 0,3 ΟΏ (0,3 ΟΏ соответствует +/-3 81Оеу (стандарное отклонение) ΟΏ неинфицированных контрольных клеток). Положительную оценку определяют, когда ΟΏ ниже порогового значения и, наоборот, негативную оценку определяют, когда ΟΏ выше порогового значения. Титры вирусного шеддинга определяли с помощью Вееб апб Миеисй и представляли в виде Ьод ТСГО50/мл.
1.3. Методики с использованием свиней.
1.3.1. Тест ингибирования гемагглютинации (ΗΙ).
Методика проведения испытаний.
Титры антигемагглютининовых антител к трем штаммам вируса гриппа определяли, используя тест ингибирования гемагглютинации (ΗΙ). Принцип теста ΗΙ основан на способности специфических противогриппозных антител ингибировать гемагглютинацию куриных эритроцитов (ВВС) гемагглютинином вируса гриппа (НА). Сыворотку сначала нагревали с 25% раствором нейраминидазы (ВОЕ) и инактивировали нагреванием для удаления неспецифических ингибиторов. После предварительной обработки двукратные разведения сыворотки инкубировали с 4 гемагглютинирующими единицами каждого штамма гриппа. Затем добавляли куриные эритроциты и оценивали ингибирование агглютинации. Титры представляли в виде обратной величины наибольшего разведения иммунной сыворотки, которое полностью ингибировало гемагглютинацию. Так как первое разведение сыворотки составляло 1:10, неопределяемый уровень рассчитывали как титр, равный 5.
Статистический анализ.
Статистический анализ выполняли на титрах ΗΙ (41 сутки, до контрольного заражения), используя
- 10 015817 υΝΙδΤΑΤ. Протокол, применяемый для дисперсионного анализа, может быть кратко описан следующим образом:
логарифмическое преобразование данных;
тест Шапиро-Уилка для каждой популяции (группы) для того, чтобы удостовериться в нормальности распределения групп;
тест Кохрана, чтобы подтвердить равномерность отклонений в разных популяциях (группах);
тест взаимодействия однофакторного ΑΝΟνΑ;
тест Тьюки (Н8И) для множественных сравнений.
1.4. Анализы для оценки иммунного ответа у людей.
1.4.1. Анализ ингибирования гемагглютинации.
Иммунный ответ определяли путем измерения ΗΙ антител, используя способ, описанный в νΗΟ Со11аЬога1шд СсШгс £ог ίηΠιιοηζη. СегИгек £ог Ищеаке Сои!го1, ΑΐΙαηΙα, υδΑ (1991).
Измерения титра антител производили на оттаявших образцах замороженной иммунной сыворотки стандартизованным и полностью утвержденным микрометодом, используя 4 ингибирующие гемагглютинацию единицы (4 Ηΐυ) соответствующих антигенов и 0,5% суспензию эритроцитов домашней птицы. Неспецифические сывороточные ингибиторы удаляли при помощи тепловой обработки и фермента, разрушающего рецептор.
Полученную сыворотку оценивали на уровни антител ΗΙ. Начиная с первого разведения 1:10, серии разведений (с коэффициентом 2) готовили вплоть до конечного разведения 1:20480.
За конечную точку титрования принимается стадия наибольшего разведения, которая показала полное ингибирование (100%) гемагглютинации. Все анализы выполняли в двух экземплярах.
1.4.2. Анализ ингибирования нейраминидазы.
Анализ выполняли в микротитровальных планшетах, покрытых фетуином. Получали серии 2кратных разведений антисыворотки и смешивали со стандартизованным количеством вируса гриппа Α Η3Ν2, Η1Ν1 или вируса гриппа В. Тест был основан на биологической активности нейраминидазы, которая ферментативно высвобождает нейраминовую кислоту из фетуина. После отщепления терминальной нейраминовой кислоты в-О-галактоза-Н-ацетилгалактозамин был демаскирован. В лунки добавляли меченный пероксидазой хрена (НКР) арахисовый агглютинин из ЛгасЫк йуродаеа, который специфически связывается с галактозными структурами. Количество связанного агглютинина может быть детектировано и количественно определено в субстратной реакции с тетраметилбензидином (ТМВ). Было показано, что самое высокое разведение антител, которое все еще ингибирует активность вирусной нейраминидазы по меньшей мере на 50%, представляет собой титр ΝΙ.
1.4.3. Анализ нейтрализующих антител.
Определение нейтрализующих антител проводили на оттаявших образцах замороженной сыворотки. Нейтрализацию вирусов антителами, содержащимися в иммунной сыворотке, определяли в анализе микронейтрализации. Сыворотку использовали в анализе без дополнительной обработки. Каждую сыворотку тестировали в трех параллелях. Стандартное количество вируса смешивали с последовательными разведениями сыворотки и инкубировали, чтобы обеспечить связывание антител с вирусом. Затем клеточную суспензию, содержащую определенное количество клеток МОСК, добавляли к смеси вируса и антисыворотки и инкубировали при 33 °С. После инкубационного периода вирусную репликацию визуализировали с помощью гемагглютинации куриных эритроцитов. Титр сыворотки с 50% нейтрализации рассчитывали способом Рида и Мюнха (Кееб апб Миеисй).
1.4.4. Клеточно-опосредованный иммунитет оценивали посредством проточной цитометрии цитокинов (СРС).
Антигенспецифические Т-клетки СИ4 и СИ8 из периферической крови можно повторно стимулировать ίη уйго для продуцирования Ш-2, СО40Б, ΤΝΡ-альфа и ΙΡΝ при инкубировании с соответствующим антигеном. Затем антигенспецифические Т-клетки СИ4 и СИ8 можно пересчитать посредством проточной цитометрии после обычного иммунофлуоресцентного маркирования клеточного фенотипа, а также внутриклеточного продуцирования цитокинов. В настоящем исследовании антиген гриппозной вакцины, а также пептиды, происходящие из специфического белка вируса гриппа, использовали в качестве антигена для повторного стимулирования Т-клеток, специфичных к вирусу гриппа. Результаты выражают в виде количества цитокин(цитокины)-положительных Т-клеток СИ4 или СИ8 в субпопуляции Т-клеток СИ4 или СИ8.
1.4.5. Статистические способы.
1.4.5.1. Первичные конечные точки.
Процентное содержание, интенсивность и отношение к вакцинации ожидаемых местных и генерализованных признаков и симптомов в течение 7-дневного последующего периода (то есть день вакцинации и 6 последующих суток) после вакцинации и в целом.
Процентное содержание, интенсивность и отношение к вакцинации неожидаемых местных и генерализованных признаков и симптомов в течение 21-дневного последующего периода (то есть день вакцинации и 20 последующих суток) после вакцинации и в целом.
- 11 015817
Частота серьезных нежелательных явлений в течение всего исследования.
1.4.5.2. Вторичные конечные точки.
Для гуморального иммунного ответа:
Наблюдаемые показатели:
в сутки 0 и 21: титры ингибирования сывороточной гемагглютинации (Н1) и титры ИТ-антител, исследованные отдельно против каждого из трех штаммов вируса гриппа, представленных в вакцине (антиН1И1, анти-Н3И2 и анти-В-антитела);
в сутки 0 и 21: титры нейтрализующих антител, исследованные отдельно против каждого из трех штаммов вируса гриппа, представленных в вакцине.
Производные показатели (с 95%-ными доверительными интервалами):
среднее геометрическое титров (СМТ§) сывороточных Н1-антител (с 95%-ными доверительными интервалами): (95% ДИ) перед и после вакцинации;
уровни сероконверсии* с 95% ДИ на 21 сутки;
факторы конверсии** с ДИ 95% на 21 сутки;
уровни серопротекции *** с ДИ 95% на 21 сутки;
СМТк' сывороточных антител к N1 (с 95%-ными доверительными интервалами) во всех точках времени.
*Уровень сероконверсии, определенный как процент вакцинированных, у которых имеется по меньшей мере 4-кратное увеличение сывороточных титров Н1 на 21 сутки по сравнению с 0 сутками для каждого вакцинного штамма.
**Фактор конверсии, определенный как кратное увеличение сывороточных Н1 СМТ§ на 21 сутки по сравнению с сутками 0 для каждого вакцинного штамма.
***Уровень серопротекции определяли как процент вакцинированных с титром сыворотки Н1 равным 40 после вакцинации (для каждого вакцинного штамма), который обычно принимается как указывающий на протекцию.
Следует понимать, что для некоторых клинических испытаний реактогенность/безопасность могут являться вторичными конечными точками, и иммуногенность может являться первичной конечной точкой.
Для клеточно-опосредованного иммунного ответа (СМ1).
Наблюдаемый показатель.
В сутки 0 и 21: количество цитокин-положительных клеток СЭ4/СЭ8 на 106 в разных тестах.
Каждый тест определяет в количественном выражении ответ Т-клеток СЭ4/СЭ8 на:
пептидный антиген вируса гриппа (ρί) (точная природа и происхождение этих антигенов нуждаются в установлении/объяснении);
антиген расщепленного вируса гриппа (δί);
антиген целого вируса гриппа (\\ί).
Производные показатели:
клетки, продуцирующие по меньшей мере два разных цитокина (СО40Ь, 1Ь-2, ΙΕΝγ, ΪΝΕα);
клетки, продуцирующие, по меньшей мере, СО40Ь и другой цитокин (1Ь-2, ТИЕа, ΙΕΝγ);
клетки, продуцирующие по меньшей мере 1Ь-2 и другой цитокин (СО40Ь, ΊΝΕα, ΙΕΝγ);
клетки, продуцирующие по меньшей мере ΙΕΝγ и другой цитокин (1Ь-2, ΙΝΕα, СО40Ь);
клетки, продуцирующие по меньшей мере Т№а и другой цитокин (1Ь-2, СО40Ь, ΙΕΝγ).
1.3.5.3. Анализ иммуногенности.
Анализ иммуногенности был основан на всей вакцинированной группе. Для каждой обработанной группы рассчитывали следующие параметры (с 95%-ными доверительными интервалами):
среднее геометрическое титров (СМТ§) Ш и ΝΙ антител в 0 и 21 сутки;
среднее геометрическое титров (СМТ§) нейтрализующих антител в 0 и 21 сутки;
факторы конверсии на 21 сутки;
уровни сероконверсии (8С) на 21 сутки, определенные как процент вакцинированных, у которых имеется по меньшей мере 4-кратное увеличение сывороточных титров Ш на 21 сутки по сравнению с 0 сутками;
уровни протекции на 21 сутки, определенные в виде процента вакцинированных с сывороточным Ш титром =1:40;
количество Т-лимфоцитов ί.Ό4/ί.Ό8. секретируемых в ответ, обобщали (описательная статистика) для каждой вакцинированной группы в каждый контрольный момент времени (сутки 0, сутки 21) и для каждого антигена (пептида вируса гриппа (ρί), расщепленного вируса гриппа (δί) и цельного вируса гриппа (νί));
описательная статистика индивидуальной разности между ответами в контрольные моменты времени (Ро81-Рге) для каждой вакцинированной группы и каждого антигена (ρί, δί, и \\Т) в каждом из 5 разных тестов;
непараметрический тест (тест Крускал-Уоллиса) использовали для сравнения значений локальной
- 12 015817 разницы между 3 группами, и статистическое значение р рассчитывали для каждого антигена в каждом из 5 разных тестов. Все критерии значимости были двусторонними. Значения р меньше или равные 0,05 рассматривали как статистически значимые.
Пример II. Получение эмульсии масло в воде и адъювантных композиций.
Если не оговаривается иное, эмульсию масло/вода, используемую в следующих примерах, составляют органическая фаза, приготовленная из 2 масел (α-токоферола и сквалена), и водная фаза РВ8 (фосфатно-солевой буферный раствор), содержащая Твин 80 в качестве эмульгатора. Если не оговаривается иное, эмульсионные масло в воде адъювантные композиции, используемые в следующих примерах, готовили содержащими следующий эмульсионный масло в воде компонент (приведены конечные концентрации): 2,5% сквалена (об./об.), 2,5% α-токоферола (об./об.), 0,9% полиоксиэтиленсорбитанмоноолеата (об./об.) (Твин 80), см. \УО 95/17210. Такую эмульсию, называемую А803 в следующих примерах, получали, как указано ниже в виде концентрата двукратного сгущения.
2.1. Получение эмульсии 8В62.
Данный способ использовали в исследованиях, описанных в разделах клинических и доклинических примеров. Препарат эмульсии 8В62 изготавливают посредством смешивания при энергичном перемешивании масляной фазы, состоящей из гидрофобных компонентов (ΌΕ-α-токоферол и сквален), и водной фазы, содержащей водорастворимые компоненты (анионный детергент Твин 80 и РВ8 тоб (модифицированный), рН 6,8). Во время перемешивания масляную фазу (1/10 общего объема) переносят в водную фазу (9/10 общего объема) и смесь перемешивают в течение 15 мин при комнатной температуре. Затем полученную смесь подвергали воздействию усилия сдвига, ударной силы и кавитации в камере для взаимодействия микрофлуидайзер (15000 Р81 - 8 циклов, или 3 цикла в адъюванте, используемом в клиническом испытании, описанном в примере III) для получения субмикронных капель (распределение между 100-200 нм). Полученный рН составляет 6,8±0,1. Затем эмульсию 8В62 стерилизовали фильтрацией через мембрану 0,22 мкм, и стерильную нерасфасованную эмульсию хранили замороженной в контейнерах Сирас при 2-8°С. Стерильным инертным газом (азотом или аргоном) продували мертвый объем конечного наливного контейнера для эмульсии 8В62 в течение по меньшей мере 15 с.
Конечная композиция эмульсии 8В62 является следующей;
Твин 80: 1,8% (об./об.) 19,4 мг/мл; сквален: 5% (об./об.) 42,8 мг/мл; α -токоферол: 5% (об./об.) 47,5 мг/мл; РВ8: ЫаС1 121 мМ, КС1 2,38 мМ, Ыа2НРО4 7,14 мМ, КН2РО4 1,3 мМ; рН 6,8 ± 0,1.
Пример III. Клиническое испытание вакцины, содержащей антигенный препарат расщепленного вируса гриппа и различные дозы адъюванта А803 (Е1и-ЬП-004) на взрослой популяции в возрасте 18-59 лет.
3.1. Введение.
II фазу контролируемого рандомизированного простого слепого исследования проводили в 2006 г. на взрослой популяции в возрасте 18-59 лет, чтобы оценить иммуногенность, безопасность и реактогенность низкодозовой (то есть содержащей 5 мкг НА на штамм) кандидатной вакцины против гриппа с двумя дозами адъюванта А803 от С1ахо8тййК1ше Вю1од1сак.
Гуморальный иммунный ответ (то есть анти-гемагглютинин) определяли на 21 сутки после внутримышечного введения одной дозы адъювантной вакцины А803. Ниапх™ использовали в качестве эталона.
3.2. Дизайн исследования.
Три группы субъектов параллельно внутримышечно получали следующую вакцину:
одна группа из 100 субъектов, получающая одну инъекцию низкодозовой вакцины на основе расщепленного вируса гриппа, содержащей 5 мкг НА, адъювантированной А803 (Е1иЬП1/1);
одна группа из 100 субъектов, получающая одну инъекцию низкодозовой вакцины на основе расщепленного вируса гриппа, содержащей 5 мкг НА, адъювантированной половиной дозы А803 (АЭ03 1/2) (Е1иЬП1/2);
одна группа из 100 субъектов, получающая одну дозу Ниапх™ (Флюарикс).
Режим: одна ΣΜ инъекция гриппозной вакцины в сутки 0, посещения центра клинических исследований в сутки 0 и сутки 21 с отбором образца крови (определение Ш-антител) и дополнительный телефонный контакт в сутки 30 (завершение исследования).
Стандартная расщепленная трехвалентная гриппозная вакцина Е1иапх™, используемая в данном исследовании, представляет собой имеющуюся в продаже вакцину, разработанную и производимую С1ахо8тЦ11К1те Вю1офса15 с 2006 г.
3.3. Цели исследования.
3.3.1. Первичная цель.
Оценить гуморальный иммунный ответ, индуцируемый исследуемыми вакцинами, в единицах титров антител к гемагглютинину:
Наблюдаемые показатели в сутки 0 и 21: титры сывороточных антител, ингибирующих гемагглютинацию.
Производные показатели (с 95%-ными доверительными интервалами):
- 13 015817 среднее геометрическое титров (СМТ§) сывороточных антител в сутки 0 и 21;
уровни сероконверсии* на 21 сутки; факторы конверсии* на 21 сутки;
уровни протекции*** на сутки 0 и 21.
*Уровень сероконверсии иммунного ответа на гемагглютинин определяют как процент вакцинированных, которые имеют либо довакционный титр менее 1:10 и поствакционный титр больше или равный 1:40, либо довакционный титр больше или равный 1:10 и по меньшей мере четырехкратное увеличение поствакционного титра.
**Фактор конверсии определяют как кратность увеличения сывороточных ΗΙ СМТ§ после вакцинации по сравнению с сутками 0.
***Уровень протекции определяют как процент вакцинированных с титром сывороточного ΗΙ более 40 после вакцинации, что обычно принимают как индикатор защиты.
3.3.2. Вторичная цель.
Оценить безопасность и реактогенность исследуемых вакцин с точки зрения ожидаемых местных и генерализованных нежелательных явлений, неожидаемых нежелательных явлений и серьезных нежелательных явлений:
1. Появление, интенсивность и отношение к вакцинации ожидаемых местных и генерализованных признаков и симптомов в продолжение 7-дневного последующего периода (то есть день вакцинации и 6 последующих суток) после каждой вакцинации в каждой группе.
2. Появление, интенсивность и отношение к вакцинации неожидаемых местных и генерализованных признаков и симптомов в течение 30-дневного последующего периода (то есть день вакцинации и 29 последующих суток) после вакцинации в каждой группе.
3. Появление и взаимосвязь серьезных нежелательных явлений в течение всего периода исследования в каждой группе.
3.4. Вакцинная композиция и введение.
3.4.1. Вакцинный препарат.
Неадъювантная вакцина против гриппа представляет собой трехвалентный расщепленный вирион, инактивированную вакцину против гриппа, состоящую из смесей трех моновалентных вирусных антигенных продуктов (полученных соответственно из штаммов гриппа Α/Η1Ν1, Α/Η3Ν2 и В). Антигены, присутствующие в такой вакцине, являются такими же, что и в лицензированной вакцине Р1иапх™, которая продается под торговой маркой Р1иапх™ (α-Ктх®) с 1992 г и содержит 15 мкг ΗΑ/штамм на дозу. Штаммы гриппа, включенные в клинические партии Р1иБ0. представляют собой штаммы, которые были выбраны для 2006/2007 Северного полушария:
- Α/Νο\ν Са1ейоша/20/99 (ШМ^подобный штамм: Α/Νο\ν Са1ейоша/20/99 (Η1Ν1 ) ГУК-116;
- А/^18соп81п/67/2005 (Η3N2)-подобный штамм: АЖ18СОП8ш/67/2005 (Η3Ν2) РГУМСХ-161;
- В/Ма1ауыа/2506/2004.
Антигены производят из вирусов, выращенных в яйцах. Расщепление выполняют дезоксихолатом натрия перед стадией инактивации, которую выполняют посредством последовательного воздействия дезоксихолата натрия и формальдегида.
Низкодозовая вакцина против гриппа (ПиБЭ) (клинические серии), адъювантированная Α803, основана на имеющейся в продаже вакцине Р1иапх™ (полученной соответственно из штаммов гриппа Α/Η1Ν1, Α/Η3Ν2 и В), но с более низким содержанием антигена и адъювантированной С8К адъювантной системе Α803. Α803 состоит из эмульсии масло в воде (8В62), которая содержит два биоразлагаемых масла, сквален и α-токоферол (витамин Е), и поверхностно-активное вещество полисорбат 80 (Твин 80). Антигены вируса гриппа включены в водную фазу адъювантной системы посредством простого смешивания с эмульсией. Были испытаны две композиции, отличающиеся количеством адъюванта, введенного с антигенами Р1и в партию вакцины. Адъювантные вакцины содержат 5 мкг гемагглютинина (ΗΑ) каждого штамма вируса гриппа на дозу, объединенных с полной дозой (Α803) или половиной дозы (Α803 1/2) адъювантной системы Α803. Эксципиенты следующие: полисорбат 80 (Твин 80), октоксинол 10 (Тритон Х-100), α-токоферилгидросукцинат, хлорид натрия, натрия гидрофосфат, дигидрофосфат калия, хлорид калия, вода для инъекций. Низкодозовые вакцины против гриппа, адъювантированные Α803 (Р1иЕЭ, полная или половинная доза Α803), представляют собой вакцины, не содержащие консерванта. Однако они содержат следовые количества тиомерсала (<1,25 мкг Η§ на дозу) с ранних стадий производственного процесса. Они обе присутствуют в виде однодозовых вакцин в стеклянных (тип 1) предварительно наполненных шприцах с объемом 0,5 мл/доза.
3.4.1.1. Композиция гриппозной вакцины, адъювантированной Α803
Одна доза РРВЭ (полная или половинная доза Α803) соответствует 0,5 мл. Композиция представлена в табл. 3. Содержание ΗΑ на дозу составляет 5 мкг для обеих композиций, единственным огличием является количество Α803, присутствующего в конечных контейнерах.
- 14 015817
Таблица 3. Композиция низкодозовой гриппозной вакцины, адъювантированной Л803 (полная доза и половина дозы Л803)
Компонент Количество на дозу (0,5 мл)
Инактивированные расщепленные вирионы - А/Νθνν Са1ебота/20/90 (Η1Ν1) ΐνί4-116 - АЛМзсопз1п/67/2005 (Η3Ν2) ΝΥΜΟΧ-161 - В/Ма1ауз1а/2506/2004 5 мкг НА 5 мкг НА 5 мкг НА
Адъювант (полная доза/половина дозы) 0,250 мл 10,70 мг/5,35 мг 11,88 мг/5,94 мг 4,85 мг/2,425 мг
- эмульсия 8В62 (общий объем) • сквален • ОЬа-токоферол • полисорбат 80 (Твин 80)
Полисорбат 80 (Твин 80) 0,122 мг
Октоксинол 10 (Тритон Х-100) 0,0283 мг
α-Токоферил гидросукцинат 0,01665 мг
Хлорид натрия 4 мг
Натрия фосфат двузамещенный 0,575 мг
Калий дигидрофосфат 0,100 мг
Хлорид калия 0,101 мг
Вода для инъекций до 0,50 мл
Сокращения: НА = гемагглютинин.
Общее содержание в Полисорбате 80 соответствует 4,972 мг на дозу, когда используют полную дозу А803, и 2,547 мг на дозу, когда используют половину дозы А803.
3.4.1.2. Получение антигенного препарата расщепленного инактивированного вируса гриппа.
Вирусы гриппа идентичны вирусам, включенным в Е1иапх™ (вакцина против вируса гриппа). Моновалентные продукты состоят из очищенных инактивированных расщепленных вирусов, которые получают из рабочих посевов трех штаммов вируса гриппа, типа А (Η1Ν1 и Η3Ν2) и типа Β, которые выращивают по отдельности в куриных яйцах с развивающимся эмбрионом. Такие рабочие посевы происходят из штаммов, которые получают из Центра сотрудничества ВОЗ, следуя ежегодным рекомендациям ВОЗ. Информация по способу получения антигенов, в качестве иллюстрации, дается в XVО 02/097072. Объемы трех моновалентных продуктов основаны на содержании НА, измеренном в каждом моновалентном продукте перед приготовлением препарата, и на нужном объеме производства.
10-Кратно концентрированный фосфатно-солевой буферный раствор (рН 7,4 при однократной концентрировании) и премикс Твин 80 и α-токоферилгидросукцината разводят в воде для инъекций, затем перемешивают в течение 5-30 мин при комнатной температуре.
Затем три концентрированных моновалентных продукта последовательно разводят в полученном растворе из фосфатно-солевого буферного раствора/Твин 80-а-токоферилгидросукцината до концентрации 20 мкг НА каждого моновалентного продукта А (Η1Ν1, Η3Ν2) 23,32 мкг НА моновалентного продукта Β на миллилитр промежуточного трехвалентного продукта (5 мкг НА каждого моновалентного продукта А и 5,83 мкг НА В/500 мкл трехвалентного конечного продукта).
Между добавлениями каждого моновалентного продукта смесь перемешивают в течение 10-30 мин при комнатной температуре и в течение 15-30 мин после добавления последнего моновалентного продукта. Данный трехвалентный промежуточный продукт, упоминаемый также как предварительный пул, может храниться при +2 - +8°С или далее перерабатываться на конечной стадии получения препарата в тот же день. Конечный объем предварительного пула составляет 250 мкл на дозу.
3.4.1.3. Получение вакцинных композиций с адъювантом А803.
Адъювантная вакцина: ЬИ А803 1/1 (табл. 4).
10-кратно концентрированный ΡΒ8 тоб (рН 7,4 при однократном концентрировании; 137 мМ №С1, 2,7 мМ КС1, 8,1 мМ №ьНРО4. 1,47 мМ КН2РО4, рН 7,4), а также смесь, содержащую Твин 80, Тритон X100 и УЕЗ (количества с учетом поверхностно-активного вещества, присутствующего в штаммах) добавляют к воде для инъекций. Через 5-30 мин перемешивания добавляют 20 мкг НА на мл каждого штамма НШ1 и 43Ν2 и 23,32 мкг НА на мл штамма В с 10-30 минутным перемешиванием между каждым добавлением. Через 15-30 мин перемешивания небольшой объем так называемого промежуточного продукта отбирали для анализа и хранили между +2 и +8°С. Промежуточную смесь помещают в РВ8 тоб 1-кратно концентрированный. Целевые концентрации поверхностно-активных веществ составляют 488 мкг Твин
- 15 015817 на мл, 73,6 мкг Тритон Х-100 на мл и 66,6 мкг УЕЗ на мл.
Затем получают конечную композицию: эквивалентный объем 8В62 (получение смотри в примере 2) добавляют к каждым 250 мкл предварительно объединенной промежуточной смеси и смешивают в течение 30-60 мин при комнатной температуре. рН сверяют с диапазоном 6,8-7,5. Композицию продувают азотом и затем хранят при +2 - +8°С перед заполнением.
Таблица 4. Низкодозовая вакцина, адъювантированная А803
Компонент Концентрация Объем(мл)
Стадия 1: Предварительное объединение
моновалентная продукт Α/Νβνν Са!ейоп1а 104 мкг/мл 302,88
моновалентная продукт ΑΛΛ/ίδοοπείη 85 мкг/мл 370,59
моновалентная продукт В/Ма1ауз1а 110 мкг/мл 333,90
РВЗ той(1) Смотри пояснение 56,76
Твин 80 48000 мкг/мл 5,24
Тритон Х-100 Остаток от штамма Η3Ν2
α-токоферола гидросукцинат 26480 мкг/мл 1,2
Фильтрованная вода 504,43
Общий объем=1575 (мл) 65 мл предварительно объединенного образца отбирают для исследования Остающийся объем предварительно объединенного =1500 (мл)
Стадия 2: добавление к предварительно объединенному
Эмульсия ЗВ62 1500
Общий объем конечной смеси=3000 (мл)
(1): Буферная композиция конечной смеси представляет собой: 137 мМ ЫаС1, 2,7 мМ КС1,
8,1 мМ Ыа2НРО4, 1,47 мМ КН2РО4, рН 7,4.
Адъювантная вакцина. БЭ А803 1/2 (табл. 5).
10-кратно концентрированный РВ8 той (рН 7,4 при однократном концентрировании (см. вышеуказанную композицию), а также смесь, содержащую Твин 80, Тритон Х-100 и УЕ8 (количества, взятые с учетом поверхностно-активного вещества, присутствующего в штаммах), добавляют к воде для инъекций. Через 5-30 мин перемешивания добавляют 20 мкг НА на мл каждого штамма Н1Ы1 и Н3Ы2 и 23,32 мкг НА на мл штамма В с 10-30-минутным перемешиванием после каждого добавления. Через 15-30 мин перемешивания небольшой объем так называемой промежуточной смеси исключают для анализа и хранят при +2 и +8°С. РВ8 той 1-кратно концентрируют в промежуточной смеси. Целевые концентрации поверхностно-активных веществ составляют 488 мкг Твин 80 на мл, 73,6 мг Тритон Х-100 на мл и
66,6 мкг УЕ8 на мл.
Затем получают конечную композицию: 8В62 сначала разводят буфером РВ8 той и перемешивают в течение 15-30 мин при комнатной температуре. Эквивалентный объем такой разведенной 8В62 добавляют затем к каждым 250 мкл предварительно объединенной промежуточной смеси. Через 30-60 мин перемешивания при комнатной температуре рН сверяют с диапазоном 6,8-7,5. Композицию продувают азотом и затем хранят при +2 -+ 8°С перед заполнением.
Конечный объем обеих композиций составляет 500 мкл на дозу и конечная концентрация НА составляет 10 мкг каждой моновалентной продукта А и 11,66 мкг моновалентной продукта В на мл трехвалентной конечной продукта. Конечные целевые концентрации Твин 80, Тритон Х-100 (остаток от производства монопродукта Н3Ы2) и α-токоферила гидросукцината (α-токоферола гидросукцинат представляет собой эфирную форму ΒΒΒ (Ό изомера^-токоферола) составляют 244, 58,6 и 33,3 мкг/мл соответственно.
- 16 015817
Таблица 5. Низкодозовая вакцина, адъювантированная А803 (половина дозы адъюванта)
Компонент Концентрация Объем (мл)
Стадия 1: Предварительное объединение
Стадия 1: Предварительное объединение
моновалентная продукт Α/Νβνν Са1ебоп1а 105 мкг/мл 300,96
моновалентная продукт ΑΛΛ/ίεοοηείη 85 мкг/мл 368,24
моновалентная продукт В/Ма1аув1а 110 мкг/мл 331,78
РВ8 тоб(1) Смотри пояснение 56,4
Твин 80 48000 мкг/мл 5,2
Тритон Х-100 Остаток от штамма Η3Ν2
α-токоферола гидросукцинат 26480 мкг/мл 1,2
Фильтрованная вода 501,22
Общий объем=1565 (мл) 65 мл предварительно объединенного образца отбирают для исследования Остающийся объем предварительно объединенного =1500 (мл)
Стадия 2: добавление к предварительно объединенному
Эмульсия 8В62 750
РВ8 тоб(1) Смотри пояснение 75
Фильтрованная вода 675
Общий объем конечной смеси=3000 (мл)
(1): Буферная композиция конечной смеси представляет сооои: 137 мМ Να&, 2,7 мМ КС1,
8,1 мМ \а;11РСГ. 1,47 мМ ΚΗ2ΡΟ4, ρΗ 7,4.
3.4.2. Введение вакцины.
Вакцину заполняют в 1,25-мл стерильные стеклянные шприцы типа 1 (Евр. Фарм). Каждый шприц заполняют до целевого объема 0,57 мл (интервал: 0,54-0,60 мл). Вакцины вводили внутримышечно в дельтовидную область недоминирующей руки. Все вакцины были представлены в виде предварительно заполненных шприцев (0,5 мл). Чтобы обеспечить правильную ГМ инъекцию вакцины использовали иглу по меньшей мере 256 и длиной по меньшей мере 2,5 см.
3.5 Результаты исследования популяции.
В данное исследование зачислили всего 300 субъектов: по 100 субъектов в каждой из 3 групп. Среднее значение возраста общей вакцинированной когорты на момент вакцинации составляло 36,7 лет со стандартным отклонением 13,67 лет. Средний возраст и тендерное распределение субъектов по 3 группам вакцин было аналогичным.
3.6 Результаты по иммуногенности.
Анализ иммуногенности выполняли на АТР-группе исследования иммуногенности (297 субъектов).
Гуморальный иммунный ответ
Чтобы оценить гуморальный иммунный ответ, индуцируемый низкодозовой кандидатной вакцины против гриппа, адъювантированной А803, рассчитывали следующие параметры (с 95%-ными доверительными интервалами) для каждой группы обработки:
среднее геометрическое титров (6МТ5) титров антител Ш в сутки 0 и 21;
уровни сероконверсии (8С) в сутки 21;
факторы конверсии в сутки 21;
уровни протекции в сутки 0 и 21.
3.6.1 Среднее геометрическое титров Ш (6МТ).
6МТ для Ш-антител с 95% ДИ показаны в табл. I и на фиг. 1. Скорректированные соотношения 6МТ между группами показаны в табл. II.
Довакционные 6МТ5 Ш-антител для всех 3 вакцинных штаммов находились в одном диапазоне в 3 группах обработки. Наблюдаемые 6МТ на 21 сутки для адъювантированных групп обычно были более высокими, чем в группе Ниапх, для всех 3 штаммов со статистическим расхождением (без перекрывания 95% ДИ, и скорректированное соотношение 6МТ не включает значение 1) между ИиЬЭШ и Ниапх для
- 17 015817 вакцинного штамма А/№18СОИ8Ш. Статистическое расхождение (скорректированное отношение СМТ не включает значение 1) наблюдали также между Р1иЬП1/2 и Р1иапх для вакцинного штамма В/Ма1ау81а.
Таблица I. Коэффициенты серопозитивности и среднее геометрическое титров (СМТ) для анти-НА антител в сутки 0 и 21 (АТР-группа исследования иммуногенности)
Антитело Группа Срок N £10 1/Ц11_ ΘΜΤ Μίη Мах
п % 95%ДИ 1ЛЛ. 95%ДИ
и. иь и. иь
А/Цеад Р1иЬ01/1 РПЕ 99 80 80,8 71,7 88,0 31,9 23,5 43.4 <10,0 2560,0
Са1ейогна ΡΙ(ϋ21) 99 99 100 96,3 100 475,4 352,2 641,6 20,0 7240,0
ΡΙυΙΟΊ/2 РПЕ Ρί(ϋ21) 99 99 80 98 80,8 99,0 71,7 94,5 88.0 100 36,1 399,0 26,9 294,7 48,5 540,2 <10,0 <10,0 3620,0 7240,0
Яиапх РПЕ ΡΙ(ϋ21) 98 98 85 98 86,7 100 78,4 96,3 92.7 100 26,1 380,6 20,5 274,2 33,2 528,4 <10,0 10,0 1280,0 7240,0
Α/ννίεεοηεϊη НиШ1/1 РНЕ Р|(021) 99 99 Θ1 99 61,6 100 51.3 96.3 71,2 100 16,8 276,2 13,1 223,5 21,5 341,3 <10,0 28,0 453,0 5120,0
ΕΙιιΙ-01/2 Ь>НЁ Р1(О21) 99 99 68 99 66,7 100 56,5 96,3 75,8 100 19.9 241.9 15,2 192 9 25,9 303,4 <10,0 20,0 640,0 520,0
Яиапх РНЕ Р1(О21) 98 98 58 97 59,2 99,0 48,8 94,4 69,0 100 14,7 172,3 11,6 136,4 18,6 217,6 <10,0 <10,0 320,0 5220.0
В/Ма1аув1а ЯиЮ1/1 РНЕ Р1(О21) 99 99 72 99 72,7 100 62,9 96,3 81,2 100 20,4 268,6 15,9 221,3 26,1 326,0 <10,0 28,0 453,0 2560,0
Е1иЮ1/2 РНЕ Р1(О21) 99 99 76 99 76,8 100 67.2 96.3 84,7 100 22,2 301,5 17.6 246.1 27,9 369,4 <10,0 28.0 320,0 3620,0
Яиапх РНЕ Р1(О21) 98 98 76 97 77,6 99,0 68,0 94,4 85,4 100 26,5 219,2 20,9 171,4 33,6 280,2 <10,0 <10,0 320,0 5120.0
Р1иЬП1/1 = низкодозовая вакцина против гриппа (5 мкг НА/штамм) с полной дозой адъюванта А803; Р1иЬП1/2 = низкодозовая вакцина против гриппа (5 мкг НА/ штамм) с половиной дозы адъюванта А803; Р1иапх = вакцина Флюарикс;
СМТ = среднее геометрическое титра антител;
N = число субъектов с действительными результатами;
и/% = число/процент серопозитивных субъектов (титр ΗΙ >1:10);
95% ДИ = 95%-ный доверительный интервал, ЬЬ = нижний предел, ИЬ = верхний предел; ΜΙΝ/МАХ = минимум/максимум;
РВЕ = до вакцинации в сутки 0;
РI (021) = после вакцинации в сутки 21.
Таблица ΙΙ. Скорректированные соотношения СΜТ между группами для каждого вакцинного штамма на 21 сутки (АТР-группа исследования иммуногенности)
Антитело Описание группы N Скорректированное СМТ Описание группы N Скорректированное дат Скорректированное соотношение СМТ
пород* соотношения значе- ние 95%Д И ΊΖ “
и
1 2 3 4
РШ31/1 99 472,4 РШЛЕ 99 385,0 РШ31Л 123 0,80 138
Са1ес1опв /РШИЙ
(1ЮЬ) РШИЛ 99 4723 Ниви 98 3969 ЕШ31/1/Ниагй 1.19 0,78 132
НШМ2 99 3855 Низгос 98 3970 ЕШИйНиак 0,97 053 1,49
АМЛзсопап РШИЛ 99 2773 РШЭ1Й 99 230,0 РШЭ1/1/ 121 0,90 132
(1®р РШЭ12
РШЭ1/1 99 2775 Яиапк 98 1803 НиЮ1Л/Ниак 154 1,14 206
Ницца 99 230,0 АиаНк 38 1803 РШЖУНиапх 127 0,95 1.71
ВШауза РЫВ1Л 39 275,1 РШ31Д 39 303,4 РШЭ1Л 051 0,68 122
(1ОЦ /РШЭ1Й
РШЭ1Л Ниагк 129 096 1,74
НиЦИЙ 39 2752 Аиагк Зв 212,7 НиШ1/1/Ниаги 1,43 1,06 132
39 303.4 93 212,6 РШЛЭНиапх
Р1иЬО1/1 = низкодозовая вакцина против гриппа (5 мкг НА/штамм) с полной дозой адъюванта А803; Р1иЬО1/2 = низкодозовая вакцина против гриппа (5 мкг НА/ штамм) с половиной дозы адъюванта А803; Р1иапх = вакцина Флюарикс;
Скорректированное СΜТ = среднее геометрическое титра антител, скорректированное с учетом исходного титра;
- 18 015817
N = нисло субъектов с действительными как довакционными, так и поствакционными результатами;
95% ДИ = 95%-ный доверительный интервал для скорректированного соотношения СМТ (модель ΆΝΟΟνΆ: корректировка с учетом исходного титра - объединенная дисперсия для более чем 2 групп);
ЬЬ = нижний предел, ИЬ = верхний предел.
3.6.2 Факторы конверсии титров антител ΗΙ, коэффициенты серопротекции и уровни сероконверсии (коррелирует с защитой, как установлено для гриппозной вакцины у людей).
Результаты представлены в табл. 6 - на фиг. 2 для уровней серопротекции, в табл. 7 - на фиг. 3 для уровней сероконверсии и в табл. 8 - на фиг. 4 для факторов конверсии.
Пороговое значение, указанное европейскими организациями для уровней серопротекции (70%), достигалось во всех группах (по меньшей мере 94,9%). Для каждого вакцинного штамма уровни серопротекции на 21 сутки для 3 групп находились в таком же диапазоне.
Пороговое значение, указанное европейскими организациями для уровней сероконверсии (40%), достигалось во всех группах (по меньшей мере 65%).
Для вакцинного штамма Λ/Νο\ν Са1ебоша 8СК. на 21 сутки для 3 групп находились в таком же диапазоне.
Для вакцинного штамма ААУйсопйп 8СР на 21 сутки для группы Р1иБИ1/1 обычно были более высокими по сравнению с группой Ииапх. 8СК. на 21 сутки для группы ИиЬП1/2 находились в таком же диапазоне по сравнению с группой Ииапх.
Для вакцинного штамма В/Ма1ау51а 8СР на 21 сутки для группы ИиЬП1/2 обычно были более высоким по сравнению с группой Ииапх. 8СР в 21 сутки для группы Ии1ЬП1/1 находились в таком же диапазоне по сравнению с группой Ииапх.
Пороговое значение, указанное европейскими организациями для факторов сероконверсии (2,5), достигалось во всех группах (по меньшей мере 6,2).
Для вакцинного штамма А/№\т Са1ебоша 8СР на 21 сутки для 3 групп находились в таком же диапазоне. Значение, наблюдаемое для группы ИиЬП1/2, было ниже значения, наблюдаемого для группы Ииапх, но может быть объяснено более высоким уровнем серопротекции до вакцинации в группе ИиЬП1/2.
Для вакцинного штамма АЛУйсопмп 8СР на 21 сутки для группы ИиЬП1/1 обычно были более высоким по сравнению с группой Ииапх. 8СР в 21 сутки для группы ИиЬП1/2 находился в таком же диапазоне по сравнению с группой Ииапх.
Для вакцинного штамма В/Ма1ау51а 8СР на 21 сутки для двух адъювантированных групп обычно были более высоким по сравнению с группой Ииапх.
Таблица 6. Уровни серопротекции (8РК.) для титра ΗΙ-антител в сутки 0 и сутки 21 (АТР-группа исследования иммуногенности).
Вакцинный штамм Группа Время N 5РК
η % 95%ДИ
и. иь
Α/Νβνν Са1ес1ота Е1и1_О1/1 РКЕ 99 41 41,4 31,6 51,8
ΡΙ(ϋ21) 99 95 96,0 90,0 98,9
Ни1ДЭ1/2 РКЕ 99 55 55,6 45,2 65,5
ΡΙ(ϋ21) 99 97 98,0 92,9 99,8
Пиапх РКЕ 98 35 35,7 26,3 46,0
Р1(О21) 98 93 94,9 88,5 98,3
АЛМзсопзт Р1иЮ1/1 РКЕ 99 32 32,3 23,3 42,5
Р1(О21) 99 97 98.0 92,9 99,8
НиШ1/2 РКЕ 99 37 37,4 27,9 47,7
Р1(О21) 99 97 98,0 92,9 99,8
Пиапх РКЕ 98 25 25,5 17,2 35,3
ΡΙ(ϋ21) 98 93 94,9 *
8,5
В/Ма1ауз1а Р1иБ01/1 РКЕ 99 31 31,3 22,4 41,4
Ρ1(ϋ21) 99 97 98,0 92,9 99,8
Р1иБ01/2 РКЕ 99 39 39,4 29,7 49,7
Р1(О21) 99 98 99,0 94,5 100
Ииапх РКЕ 98 44 44,9 34,8 55,3
ΡΙ(ϋ21) 98 94 95,9 89,9 98,9
ИиЬП1/1 = низкодозовая вакцина против гриппа (5 мкг НА/штамм) с полной дозой адъюванта А803; ИиЬП1/2 = низкодозовая вакцина против гриппа (5 мкг НА/штамм) с половиной дозы адъюванта А803; Ииапх = вакцина Ииапх;
N = число субъектов с действительными результатами;
п/% = число/процент субъектов с серопротекцией (титр ΗΙ >40 1/И1Б);
95% ДИ = 95%-ный доверительный интервал, ЬЬ = нижний предел, ИЬ = верхний предел;
РКЕ = до вакцинации в сутки 0;
ΡΙ (Ό1) = после вакцинации в сутки 21.
Источник данных = табл. 3А приложения.
- 19 015817
Таблица 7. Уровень сероконверсии (8СВ) для титра ΗΙ-антител на 21 сутки (АТР-группа исследования иммуногенности)
Вакцинный штамм Г руппа N зек
η % 95%ДИ ίί υι.
Α/Νβνν Са1е6ота Яи1_О1/1 99 69 69,7 59,6 78,5
Яи1_О1/2 99 64 64,6 54,4 74,0
Яиапх 98 66 67,3 57,1 76,5
А/1Л/|2СОП51П Е1иШ1/1 99 88 88,9 81,0 94,3
Р1иЮ1/2 99 79 79,8 70,5 87,2
Яиапх 98 73 74,5 64,7 82,8
В/Ма1ау8!а Аи1_О1/1 99 76 76,8 67,2 84,7
Р1иШ1/2 99 82 82,8 73,9 89,7
Яиапх 98 65 66,3 56,1 75,6
Е1иЬО1/1 = низкодозовая вакцина против гриппа (5 мкг ΗΑ/штамм) с полной дозой адъюванта А803. Е1иЬО1/2 = низкодозовая вакцина против гриппа (5 мкг НА/ штамм) с половиной дозы адъюванта А803. Ииапх = вакцина Флюарикс.
Сероконверсию определяли как:
для изначально серонегативных субъектов титр антител > 40 1/ΌΙΕ после вакцинации;
для изначально серопозитивных субъектов, титр антител после вакцинации в > 4 раза выше титра антител до вакцинации;
Ν= число субъектов с действительными результатами до и после вакцинации;
п/% = число/процент субъектов с сероконверсией;
95% ДИ = 95%-ный доверительный интервал, ЬЬ = нижний предел, иь = верхний предел.
Таблица 8. Фактор сероконверсии (8СИ) для титра ΗΙ-антител на 21 сутки (АТР-группа исследования иммуногенности)
Вакцинный штамм Группа N ЗСР
значение 95°/ и. »ДИ иь
Α/Νθνν Са1ес1оп1а ЯиЮ1/1 Яи1_О1/2 Яиапх 99 99 98 14,9 11,0 14,6 10,4 θ'θ 21,3 15,9 21,6
ДЛЛ/13СОП81П Яи1_О1/1 ЯиГО1/2 Яиапх 99 99 98 16,5 12,2 11,7 13,0 9,2 8,8 20,9 16,1 А
В/Ма1ауз1а ЯиЮ1/1 ПиЮ1/2 Яиапх 99 99 98 13,2 13,6 8,3 10,0 10,2 6,2 17,4 18,0 11,0
И1иБО1/1 = низкодозовая вакцина против гриппа (о мкг ΗΑ/штамм) с полной дозой адъюванта А803; И1иБО1/2 = низкодозовая вакцина против гриппа (5 мкг ΗΑ/штамм) с половиной дозы адъюванта А803; Ииапх = вакцина Флюарикс;
N = число субъектов с действительными результатами до и после вакцинации;
8СИ = фактор сероконверсии или среднее геометрическое отношения (значение [1ο§10(ΡΙ(Ό21)/ΡΒΕ)]);
95% ДИ = 95%-ный доверительный интервал, ЬЬ = нижний предел, иь = верхний предел.
3.7 Выводы по безопасности.
Более высокая реактогенность в показателях ожидаемых (местных/генерализованных) и неожидаемых симптомов в группах адъювантных вакцин по сравнению с группой Ииапх являлась общей тенденцией, наблюдаемой в данном исследовании.
Понижение содержания А803 в адъювантной вакцине оказывает значительное влияние на степень всех генерализованных и на 3 локальных симптома.
Появление неожидаемых симптомов обычно было более высоким в группах адъювантных вакцин (55 и 47% субъектов) по сравнению с группой Ииапх (35%).
Из этих результатов можно заключить, что реактогенность и профиль безопасности кандидатных вакцин является удовлетворительным и клинически приемлемым.
3.8. Общие выводы.
3.8.1. Результаты по иммуногенности.
Главной целью данного исследования было оценить гуморальный иммунный ответ (титры анти-ΗΙ антител), вызываемый низкодозовой вакциной против гриппа с двумя разными концентрациями адъюванта А803 и вакциной Ииапх.
На 21 сутки три вакцины превысили требования европейских организаций для ежегодной регистрации вакцин против гриппа на основе расщепленного вириона (№1е Гог Ошбапсе оп ИагтопШиоп οί Ве
- 20 015817
с.|шгетеп^ Гог тПиеп/а Уассп^ для иммунологической оценки ежегодных изменений штаммов СΡΜΡ/ВVΡ/214/96). СМТ обычно были более высокими в адъювантных группах по сравнению с группой Είπατίχ, со статистически значимым различием, наблюдаемым для вирусных штаммов ΛΛνίδ^ηδίη (Ε1πΤΌ1/1 по сравнению с Εΐιιαπ.χ) и В/Ма1ауъ1а (Ε1πΤΌ1/2 по сравнению с ΕΙυαΓίχ), Аналогичные уровни серопротекции наблюдались во всех трех группах вакцин, в интервале от 94,9 до 99%. Наблюдаемые уровни сероконверсии и факторы сероконверсии были выше в адъювантных группах, чем в группе Ε1παΓίχ. Данные, полученные в этом испытании, также выявили, что иммуногенность, индуцированная вакциной с половиной дозы адъюванта А803, была сравнима с иммуногенностью, индуцированной полной дозой адъюванта
3.8.2. Результаты по реактогенности и безопасности.
Введение низкодозовой противогриппозной кандидатной вакцины, адъювантированной А803, было безопасным и клинически хорошо переносилось в вошедшей в исследование популяции, то есть у взрослых людей в возрасте 18-59 лет. Вакцина с половиной дозы адъюванта показала значительное уменьшение частоты возникновения ожидаемых местных и генерализованных симптомов по сравнению с вакциной с полной дозой адъюванта.
Пример ГУ. Доклиническая оценка адъювантированных и неадъювантированных расщепленных противогриппозных вакцин (содержащих различные дозы адъюванта А803) на праймированных мышах ВАЬВ/с.
4.1. Дизайн и цель эксперимента.
Эксперименты на праймированных гриппом мышах выполняли для того, чтобы оценить усиление посредством А803 гуморальных ответов, индуцированных противогриппозными вакцинами, приготовленными с данным адъювантом масло-в-воде. Для моделирования ситуации у человека эксперимент выполняли, используя мышей, праймированных гетеросубтипируемыми штаммами.
4.1.1. Обработка/группа (табл. 9).
Группы из 27 взрослых мышей ВАЬВ/с женского пола праймировали интраназально (объем 20 мкл) в 0 сутки трехвалентным целым вирусом гриппа, инактивированным формалином (5 мкг НА на каждый штамм). Праймирующие штаммы состояли из более ранних дрейфующих вариантов (5 мкг НА целого инактивированного Н1М А/^ойаηηеδЬи^д/82/96, №Ν2 А/8убпеу/5/97, В/НагЫп/7/94) штаммов, включенных в вакцину. Через двадцать восемь суток мышей вакцинировали однократной дозой кандидатной вакцины внутримышечно с общим объемом 50 мкл. Мышей иммунизировали композициями, содержащими только расщепленные антигены (трехвалентные расщепленные простые), или композициями, содержащими расщепленные антигены, адъювантированные двумя дозами А803 (полной или 1/5). Штаммы, использованные для иммунизации, включали вирусные антигены НШ1 А/№\\· Са1ебоша/20/99, №Ν2 А/Рапата/2007/99, В/8йапдбопд/7/97 (1,5 мкг/штамм, 1/10 дозы, предназначенной для человека).
Таблица 9
Г руппа Ί Антиген/Композиция Трехеалентный расщепленный/Простая (неадъювантная) Другая обработка Г етерологическое праймирование СО
2 Трехвалентный расщепленный/АЗОЗ Г етерологическое праймирование СО
3 Трехвалентный расщепленный/АЗОЗ 1/5 Гетерологическое праймирование ϋθ
4.1.2. Получение вакцинных композиций.
Готовят премикс Твин 80, Тритон Х100 и Витамина Е сукцината (УЕ8) для того, чтобы достичь конечной концентрации в вакцине 750 мкг/мл Твин 80, 110 мкг/мл Тритон Х100 и 100 мкг/мл УЕ8. Количества, использованные в премиксе, рассчитывают, принимая во внимание количества поверхностноактивного вещества и УЕ8, уже присутствующее в штаммах.
Получение 1 л 10-кратно концентрированного солевого буфера (РВ8 рН 7,4): к 0,800 л воды для инъекций добавляют 80 г №С1, 2 г КС1, 11,44 г №2НРО4, 2 г КН2РО4. После растворения доводят до 1,0 л водой для инъекций. При 10-кратном разведении рН будет составлять 7,4.
- 21 015817
Трехвалентный расщепленный/простой
Композицию одной 50 мкл дозы готовят для немедленного применения согласно следующей последовательности: вода для инъекций + солевой буфер (10-кратно концентрированный РВ8 рН 7,4) + премикс, 5 мин перемешивания магнитной мешалкой при комнатной температуре, + 1,5 мкг ΗΑ штамма Η1Ν1, 10 мин перемешивания на магнитной мешалке при комнатной температуре, + 1,5 мкг ΗΑ штамма Η3Ν2, 10 мин перемешивания на магнитной мешалке при комнатной температуре, + 1,5 мкг ΗΑ штамма В, 15 мин перемешивания на магнитной мешалке при комнатной температуре. Композиции вводят в течение часа после окончания их приготовления.
Трехвалентный расщепленный /А803
Готовили премикс Твин 80, Тритон Х100 и Витамин Е сукцината (νΕδ) с достижением конечной концентрации в вакцине 750 мкг/мл Твин 80, 110 мкг/мл Тритона Х100 и 100 мкг/мл νΕδ. Количества, используемые в премиксе, рассчитывают, учитывая количества поверхностно-активного вещества и νΕδ, уже присутствующих в штаммах.
Композицию однократной 50 мкл дозы готовят для немедленного применения согласно следующей последовательности: вода для инъекций + солевой буфер (10-кратно концентрированный ΡΒδ рН 7,4) + премикс, 5 мин перемешивания на магнитной мешалке при комнатной температуре, + 1,5 мкг ΗΑ штамма Η1Ν1, 10 мин перемешивания на магнитной мешалке при комнатной температуре, + 1,5 мкг ΗΑ штамма Η3Ν2, 10 мин перемешивания на магнитной мешалке при комнатной температуре, + 1,5 мкг ΗΑ штамма В, 15 мин перемешивания на магнитной мешалке при комнатной температуре, + 25 мкл эмульсии δΒ62 для полной дозы Αδ03 или 5 мкл эмульсии δΒ62 для 1/5 дозы Αδ03, 15 мин перемешивания на магнитной мешалке при комнатной температуре. Композиции вводят в течение часа после окончания их приготовления.
4.1.3. Считывания (табл. 10).
Гуморальный иммунный ответ на вакцинацию оценивали перед иммунизацией (28 сутки) и через 14 суток после иммунизации (27 мышей/группа). Образцы сыворотки испытывали с помощью теста ингибирования гемагглютинации (ΗΙ).
Таблица 10
4.2. Результаты.
4.2.1. Гуморальный иммунитет.
Результаты представлены на фиг. 5. В данной модели гетеросубтипируемого заражения мышей с последующей однократной вакцинацией, было показано, что Αδ03 и его разведения индуцировали более высокие титры ΗΙ по сравнению с простой вакциной. Для всех штаммов вируса гриппа Α наблюдалось статистически значимое увеличение ΗΙ-титров (р<0,05). Для штамма Η1Ν1 также наблюдалось значимое различие ΗΙ-титров между Αδ03 и Αδ03 1/5 (р<0,05). Пониженная доза Αδ03 не увеличивала титры ΗΙ для всех трех штаммов по сравнению с простой вакциной. Очень низкие ответы наблюдались против штамма В (Β/δйаηдбоид); это, вероятно, может быть обусловлено значительным антигенным дрейфом штаммов В, использованных для праймирования, и вакцины.
4.3. Краткое изложение результатов и выводы.
В заключение, увеличение ΗΙ-титров наблюдалось у животных, праймированных гетеросубтипируемыми штаммами, при использовании вакцин, адъювантированных Αδ03, по сравнению с простой вакциной. Полная доза Αδ03 была оптимальной для получения устойчивых ΗΙ-титров против трех штаммов гриппозной вакцины.
Пример ν. Доклиническая оценка адъювантных и неадъювантных расщепленных гриппозных вакцин (содержащих различные дозы адъюванта Αδ03) у праймированных мышей С57ВЕ8
5.1. Дизайн и цель эксперимента.
Эксперименты на мышах, праймированных вирусом гриппа, выполняли, чтобы оценить усиление посредством Αδ03 гуморального и клеточного ответов, индуцированных гриппозными вакцинами, приготовленными с данным адъювантом масло-в-воде.
Для моделирования ситуации у человека эксперимент проводили, используя мышей, праймированных гетеросубтипируемыми штаммами.
5.1.1. Обработка/группа (табл. 11).
Группы из 25 взрослых самок мышей С57ВЕ6 праймировали интраназально (объем 20 мкл) в сутки 0 трехвалентным цельным вирусом гриппа, инактивированным формалином (5 мкг ΗΑ на каждый штамм). Праймирующие штаммы состояли из более ранних дрейфующих вариантов (5 мкг ΗΑ цельного инактивированного Η1Ν1 Λ/Βе^^^ид/262/95, Η3Ν2 Л/Раиата/2007/99, Β/δйаидбоид/7/97) штаммов, включенных в вакцину. Через двадцать восемь суток мышей вакцинировали однократной дозой вакциныкандидата внутримышечно с общим объемом 100 мкл. Мышей иммунизировали композициями, содержащими только расщепленные антигены (трехвалентный расщепленный простой), или композициями,
- 22 015817 содержащими расщепленные антигены. адъювантированные тремя дозами А803 (полная. 1/2 или 1/5). Штаммы. использованные для иммунизации. включали вирусные антигены Н1М Λ/№\ν Са1ебоша/20/99. №N2 Λ/№\ν Уогк/55/2004. В/Лапд8и/10/2003 (1.5 мкг/штамм. 1/10 дозы. предназначенной для человека).
Таблица 11
Группа Антиген/Композиция Другая обработка
1 Трехвалентный расщепленный/простая (неадъювантная) Г етерологическое праймирование ОО
2 Трехвалентный расщепленный/ 803 Гетерологическое праймирование ОО
3 Трехвалентный расщепленный/А803 1/2 Гетерологическое праймирование Э0
4 Трехвалентный расщепленный/А803 1/5 Гетерологическое праймирование ϋθ
5 РВ8 Гетерологическое праймирование ОО
5.1.2. Получение вакцинных композиций.
Трехвалентная расщепленная/простая.
Композицию 100 мкл дозы готовят для немедленного применения согласно следующей последовательности: вода для инъекций + солевой буфер (10-кратно концентрированный РВ8 рН 7.4. полученный. как указано в примере IV) + Флюарикс клиническая серия ПЕЬиА014 (1.5 мкг на штамм в конечной дозе).
Трехвалентная расщепленная/А803.
Композиции 100 мкл дозы готовят для немедленного применения согласно следующей последовательности: вода для инъекций + солевой буфер (10-кратно концентрированный РВ8 рН 7.4. полученный. как указано в примере IV) + Флюарикс клиническая серия ПЕЬиА014 (1.5 мкг на штамм в конечной дозе) + 25 мкл эмульсии 8В62 для полной дозы или 12.5 мкл эмульсии 8В 62 для 1/2 дозы или 5 мкл эмульсии 8В62 для 1/5 дозы. Композиции вводят в течение 1 ч после окончания приготовления.
5.1.3. Считывания (табл. 12).
Гуморальный иммунный ответ на вакцинацию оценивали через 21 сутки после иммунизации (10 мышей/группа). и образцы сыворотки испытывали с помощью теста ингибирования гемагглютинации (Ш). Клеточный иммунный ответ проверяли через 7 суток после иммунизации с помощью внутриклеточного окрашивания цитокинов ЦС8).
Таблица 12
Считывание Момент времени Тип образца I Метод анализа
Гуморальный ответ 049 Сыворотка I ΙΗΑ
Клеточный ответ 035 РВМСа | !С5
5.2. Результаты.
5.2.1. Гуморальный иммунитет (10 мышей/группа).
Результаты представлены на фиг. 6. В данной модели на мышах было показано. что гетеросубтипическое праймирование с последующей однократной вакцинацией. А803 и его разведениями (1/2 и 1/5). индуцировали более высоких титры Ш по сравнению с простой вакциной. Для всех трех штаммов не наблюдалось различия Ш-титров между мышами. получавшими вакцину. адъювантированную полной дозой А803 или уменьшенными дозами А803.
5.2.2. Клеточный иммунитет (15 мышей/группа).
Результаты представлены на фиг. 7. Независимо от разведения А803. более высокие СБ4+Тклеточные ответы наблюдались у мышей. иммунизированных А803-адъювантной трехвалентной расщепленной вакциной. по сравнению с мышами. иммунизированными трехвалентной расщепленной простой вакциной. По сравнению с ответом. индуцированным у мышей. иммунизированных трехвалентной расщепленной вакциной. адъювантированной полной дозой А803. обычно наблюдались более низкие клеточные ответы. когда мышей иммунизировали трехвалентной расщепленной вакциной. адъювантированной более низкими дозами А803.
5.3. Краткое изложение результатов и выводы.
В заключение. усиление гуморального и клеточного ответов наблюдали у животных. праймированных гетеросубтипируемыми штаммами. при использовании А803-адъювантных вакцин по сравнению с простой вакциной. Аналогичную величину иммунного ответа наблюдали у мышей. иммунизированных полной дозой или дробными дозами адъюванта А803. Однако уменьшение дозы адъюванта было связано с обычно пониженной величиной СБ4+ Т-клеточного ответа.
- 23 015817
Пример УГ. Доклиническая оценка клеточного иммунного ответа, индуцированного адъювантными и неадъювантными расщепленными гриппозными вакцинами (содержащими различные дозы адъюванта А803 и низкую дозу антигена) у праймированных мышей С57В9/6.
6.1. Дизайн и цель эксперимента.
Эксперименты на мышах, праймированных вирусом гриппа, выполняли для того, чтобы оценить усиление посредством А803 клеточных иммунных ответов, индуцированных гриппозными вакцинами, содержащими низкую дозу антигена (0,5 мкг/штамм, 1/30 дозы, предназначенной для человека) и приготовленными с указанным адъювантом масло-в-воде. Для моделирования ситуации у человека эксперимент проводили, используя мышей, праймированных гетеросубтипируемыми штаммами.
6.1.1. Обработка/группа (табл. 13).
Группы из 15 самок мышей С57В1/6 праймировали интраназально (объем 20 мкл) в 0 сутки трехвалентным цельным вирусом гриппа, инактивированным формалином (5 мкг НА для каждого штамма). Праймирующие штаммы состояли из более ранних дрейфующих вариантов (5 мкг НА цельного инактивированного Н1Ν1 А/Ве1)1ид/262/95, Н3Ы2 А/Раиата/2007/99, В/8йаидбоид/7/97) штаммов, включенных в вакцину. Через двадцать восемь суток мышей вакцинировали однократной дозой вакцины-кандидата внутримышечно с общим объемом 50 мкл. Мышей иммунизировали композициями, содержащими только расщепленные антигены (трехвалентными расщепленными простыми), или композициями, содержащими расщепленные антигены, адъювантированные тремя дозами А803 (полной, 1/2 или 1/5). Штаммы, использованные для иммунизации, включали вирусные антигены Н1М Λ/№\ν Са1ебоша/20/99, №N2 Λ/№\ν Уотк/55/2004, В/йаидки/10/2003 (0,5 мкг/штамм, 1/30 дозы, предназначенной для человека).
Таблица 13
Г руппа Антиген/Композиция Другая обработка
1 Трехвалентный расщепленный /Простая (неадъювантная) Гетерологическое праймирование ϋθ
2 Трехвалентный расщепленный / А503 Гетерологическое праймирование ϋθ
3 Трехвалентный расщепленный /А803 1/2 Г етерологическое праймирование ϋθ
4 Трехвалентный расщепленный/АЗОЗ 1/5 Г етерологическое праймирование ϋθ
5 РВ8 Г етерологическое праймирование ϋθ
6.1.2. Получение вакцинных композиций.
Трехвалентный расщепленный/беспримесная.
Композиции для 50 мкл дозы готовят для немедленного применения согласно следующей последовательности: вода для инъекций + солевой буфер (10-кратно концентрированный РВ8 рН 7,4, полученный как указано в примере ГУ) + Е1иапх, клиническая серия ЭЕЬиА014 (0,5 мкг на штамм в конечной дозе).
Трехвалентный расщепленный/А803.
Композиции для дозы 50 мкл готовят для немедленного применения согласно следующей последовательности: вода для инъекций + солевой буфер (10-кратно концентрированный РВ8 рН 7,4, полученный как указано в примере ГУ) + Флюарикс, клиническая серия ЭЕЬиА014 (0,5 мкг на штамм в конечной дозе) + 25 мкл эмульсии 8В62 для полной дозы или 12,5 мкл эмульсии 8В 62 для 1/2 дозы или 5 мкл эмульсии 8В62 для 1/5 дозы. Композиции вводят в течение 1 ч после завершения приготовления.
6.1.3. Считывания (табл. 14).
Клеточный иммунный ответ испытывали через 7 суток после иммунизации с помощью внутриклеточного окрашивания цитокина.
Таблица 14
Считывание Момент времени I Тип образца Метод анализа I
Клеточный ответ □35 РВМС 1СЗ
6.2. Результаты.
6.2.1. Клеточный иммунитет.
Результаты представлены на фиг. 8. Незначительно более высокие ответы СЭ4+ Т-клеток наблюдались у мышей, иммунизированных трехвалентной расщепленной вакциной, адъювантированной А803 (полная доза или 1/2 дозы), по сравнению с мышами, иммунизированными трехвалентной расщепленной простой вакциной. По сравнению с ответом, индуцированным у мышей, иммунизированных трехвалентной расщепленной простой или адъювантированной полной дозой или половиной дозы А803 вакциной, более высокие клеточные ответы наблюдались, когда мышей иммунизировали трехвалентной расщепленной вакциной, адъювантированной 1/5 дозы А803.
6.3. Краткое изложение результатов и выводы.
В заключение, минимальное усиление ответов СЭ4+ Т-клеток наблюдали у гетеросубтипически
- 24 015817 праймированных животных при использовании А803-адъювантных вакцин по сравнению с простой вакциной. В данном эксперименте не наблюдалось ответа на дозу адъюванта, и действительно, 1/5 дозы А803 индуцировала более высокую концентрацию антигенспецифических СО4+Т-клеток, чем наблюдалось при более высоких дозах адъюванта. В целом эти данные не согласуются с другими доклиническими экспериментами и могут указывать на техническую проблему данного конкретного эксперимента.
Пример VII. Доклиническая оценка адъювантных и неадъювантных вакцин на основе расщепленного Н5Ы1 (включающих различные дозы адъюванта А803 и антигена) у мышей С57В1/6, ранее не подверженных воздействию.
7.1. Схема и цель эксперимента.
Эксперименты на мышах, ранее не подверженных воздействию Н5Ы1, выполняли, чтобы оценить усиление гуморального и клеточного иммунных ответов под влиянием А803, индуцированных вакцинами на основе расщепленного Н5Ы1, приготовленных в виде препарата с указанным адъювантом маслов-воде. В случае пандемии ожидается, что вся мировая популяция иммунологически будет представлять собой ранее не подверженную воздействию нового циркулирующего пандемического штамма гриппа. Вследствие такого, ранее не подверженного воздействию иммунного статуса для пандемической вакцины возможно потребуются две вакцинные дозы для защиты субъектов от инфекции и тяжелого заболевания, вызванного новым штаммом гриппа. Чтобы представлять данное отсутствие предшествующего воздействия, для определения иммуногенности вакцины была разработана модель на мышах, ранее не подверженных воздействию.
7.1.1. Обработка/группа (табл. 15).
Группы из 15 взрослых самок мышей С57В1/6, ранее не подверженных воздействию, иммунизировали в сутки 0 и 28 пандемической Н5Ы1 вакциной-кандидатом внутримышечно общим объемом 50 мкл. Мышей иммунизировали композициями, содержащими только расщепленные антигены Н5Ы1 (Ή5Ν1 расщепленная простая), или композициями, содержащими расщепленные антигены, адъювантированные разными дозами А803 (двойной, полной, 1/2 или 1/5). Штаммы, использованные для иммунизации, включали вирусный антиген 45Ν1 А/^еШат/1194/04 (1,5 или 0,38 мкг/штамм, соответствующие 1/10 дозы, предназначенной для человека).
Композицию с двойной дозой А803 не готовили, но делали одновременную инъекцию 50 мкл 45Ν1 расщепленной/полная доза А803 + доза 50 мкл А803.
Таблица 15
Группа Антиген/Композиция Доза антигена
1 Расщепленный НбЫЙПростая (неадъювантная) 1,5 мкг
2 Расщепленный Н5Ы1/двойная доза А803 1,5 мкг
3 Расщепленный Η5Ν1/Α803 1,5 мкг
4 Расщепленный Η5Ν1/Α803 1/2 1,5 мкг
5 Расщепленный Η5Ν1/Α803 1/5 1,5 мкг
6 Расщепленный ΗδΝΙ/Простая (неадъювантная) 0,38 мкг
7 Расщепленный ΗδΝΙ/двойная доза А803 0,38 мкг
8 Расщепленный Η5Ν1/Α803 0,38 мкг
9 Расщепленный Η5Ν1/Α803 1/2 0,38 мкг
10 Расщепленный Η5Ν1/Α803 1/5 0,38 мкг
11 РВ8
7.1.2. Получение вакцинных композиций.
Получение одного литра конечного основного буфера (РВ8 рН 7,2±0,2): к 0,800 л воды для инъекций добавить 7,699 г №С1, 0,200 КС1 г, 0,100 г МдС12х 6Н2О, 2,600 г №2НРО4х 12Н2О, 0,373 г КН2РО4. После растворения довести до 1,0 л водой для инъекций.
Расщепленный Н5Ю/простая.
Приготовление дозы 50 мкл:
Тиомерсал (количества с учетом его концентрации в штамме) и Тритон Х100 добавляли к конечному основному буферу. Твин 80 не добавляют, так как заданное значение содержания в композиции достигается посредством концентрации Твина в штамме. Конечные концентрации составляют 10 мкг/мл для тиомерсала, 368 мкг/мл для Твина 80 и 35 мкг/мл для Тритона Х100 в 1,5 мкг дозе композиции. Они составляют 10 мкг/мл для тиомерсала, 93 мкг/мл для Твина 80 и 8,9 мкг/мл для Тритона Х100 в 0,38 мкг дозе композиции. Через 5-30 мин перемешивания на магнитной мешалке добавляют 1,5 или 0,38 мкг НА (штамм 45Ν1). Композиции перемешивают в течение 30-60 мин. Проверяют рН. Инъекции осуществляют в течение 1 ч после окончания приготовления композиции.
Расщепленный Н5№/А§03.
Получение дозы 50 мкл:
Тиомерсал (количества с учетом его концентрации в штамме) и Тритон Х100 добавляют к конечно
- 25 015817 му основному буферу. Твин 80 не добавляют. так как заданное значение содержания в композиции достигается посредством концентрации Твин в штамме. Конечные концентрации составляют 10 мкг/мл для тиомерсала. 368 мкг/мл для Твина 80 и 35 мкг/мл для Тритона Х100 в 1.5 мкг дозы композиции. Они составляют 10 мкг/мл для тиомерсала. 93 мкг/мл для Твина 80 и 8.9 мкг/мл для Тритона Х100 в 0.38 мкг дозе композиции. Через 5-30 мин перемешивания на магнитной мешалке добавляли 1.5 или 0.38 мкг ΗΑ (штамм Η5Ν1). Через 30-60 мин перемешивания на магнитной мешалке добавляют 25 или 12.5 или 5 мкл эмульсии 8В62. Композиции перемешивают в течение 30-60 мин. Проверяют рН. Инъекции осуществляют в течение 1 ч после окончания приготовления композиции.
7.1.3. Считывания (табл. 16).
Гуморальный иммунный ответ оценивали через 14 суток после иммунизации (10 мышей/группа) по титрам анти-1д. 1дО1 и 1дС2Ь антител (фиг. 9 А-Р). Гуморальный иммунный ответ оценивали также через 21 день после иммунизации (10 мышей/группа) с помощью анализа ингибирования гемагглютинации анти-ШМ (фиг. 10 А-В).
Клеточный иммунный ответ испытывали через 6 суток после иммунизации (5 пулов из 3 мышей на группу) с помощью внутриклеточного окрашивания цитокина (Ю8) антигенспецифических СЭ4+ Тклеток. количественно определяемого при помощи поточной цитометрии (фиг. 11 А-В).
Таблица16
Считывание Момент времени Тип образца Метод анализа
Гуморальный ответ Сыворотка ЕИ8А. изотипы и ΗΙ титры
Клеточный ответ ϋ34 РВМС 1С8
7.2. Результаты.
7.2.1. Гуморальный иммунный ответ: ЕЫ8А и изотипы.
Результаты представлены на фиг. 9.
Для каждой дозы расщепленной Η5Ν1 вакцины все адъювантные группы индуцировали более высокие титры анти-Н5Х11д. 1дС 1 и 1дС2Ь антител по сравнению с неадъювантной расщепленной Η5Ν1 вакциной (фиг. 9А-Р).
Для каждой дозы расщепленной Η5Ν1 вакцины; образование анти-Н5Х1 1дС1 антител было в 4-5 раз выше. чем образование анти-1д62Ь Η5Ν1 антител (фиг. 9 С-Р). При дозе 1.5 мкг ΗΑ расщепленной Η5Ν1 вакцины и комбинированной для каждой дозы адъюванта не наблюдалось различий анти-Η5N 1 1д. 1дО1 и 1д62Ь ответов антител (фиг. 9А. С и Е).
При дозе 0.38 мкг ΗΑ расщепленной Η5Ν1 вакцины. обычно были получены более высокие антиΗ5Ν1 1д титры после иммунизации расщепленной Η5Ν1 вакциной. адъювантированной двумя полными дозами. по сравнению с ответом. индуцированным расщепленной Η5Ν1 вакциной. адъювантированной А803/2 (р = 0.7315) и А803 1/5 (р = 0.9744) (фиг. 9-В). Данная тенденция также наблюдалась для антиΗ5Ν1 1дС1 антител (фиг. 9Ό). Однако сила не была достаточной для наблюдения статистически значимого различия (25% силы для 1.7-кратного различия. или 47% для 2-кратного различия).
7.2.2. Гуморальный иммунный ответ: титры ΗΙ.
С дозой 1.5 мкг ΗΑ/мышь:
Для каждой дозы адъюванта все мыши. иммунизированные А803-адъювантной расщепленной Η5Ν1 вакциной. индуцировали более высокие титры ΗΙ по сравнению с ответом. полученным у мышей. иммунизированных неадъювантной расщепленной Η5Ν1 вакциной (фиг. 10А). Не наблюдалось различия титров ΗΙ. когда расщепленную Η5Ν1 вакцину адъювантировали с диапазоном доз А803 (фиг. 10А).
С дозой 0.38 мкг ΗΑ/дозу.
Для каждой дозы адъюванта у всех мышей. иммунизированных А803-адъювантной расщепленной Η5Ν1 вакциной. индуцировались более высокие титры ΗΙ по сравнению с ответом. полученным у мышей. иммунизированных неадъювантной расщепленной Η5Ν1 вакциной (фиг. 10Б).
Значительно более высокие титры ΗΙ наблюдались в случае расщепленной Η5Ν1 вакцины. адъювантированной двумя полными дозами А803 по сравнению с ответом. полученным в случае расщепленной Η5Ν1 вакцины. адъювантированной А803/2 (р=0.032 для 4-кратного отличия) (фиг. 10Б).
Не наблюдалось различия титров ΗΙ у мышей. иммунизированных вакциной на основе расщепленного Η5Ν1. адъювантированной двумя полными дозами А803 или полной дозой А803. или мышей. иммунизированных вакциной на основе расщепленного Η5Ν1. адъювантированной А803/2 или А803/5 (фиг. 10Б).
Сравнение доз антигенов (1.5 мкг или 0.38 мкг):
Не наблюдалось различия титров ΗΙ мышей. иммунизированных любой ΗΑ дозой расщепленной Η5Ν1 вакцины. адъювантированной А803. А803/2 или А803/5. за исключением мышей. иммунизированных 1.5 мкг ΗΑ расщепленного Η5Ν1. адъювантированного А803/5. и мышей. иммунизированных 0.38 мкг ΗΑ расщепленного Η5Ν1. адъювантированного двумя полными дозами А803 (фиг. 10). Титры ΗΙ были значительно бо
- 26 015817 лее высокими после иммунизации 0,38 мкг НА расщепленного Н5Ы1, адъювантированного двумя полными дозами А803, по сравнению с более высокой дозой антигена, комбинированной с более низкой дозой адъюванта (1,5 мкг НА в случае А803/5, р=0,0193 для 4-кратного различия) (фиг. 10).
7.2.3. Клеточный иммунный ответ.
Результаты представлены на фиг. 11.
Для каждой дозы расщепленной Н5Ы1 вакцины (1,5 или 0,38 мкг) наблюдались более высокие ответы СЭ4+ Т-клеток у мышей, иммунизированных расщепленной Н5Ы1 вакциной, адъювантированной различными дозами А803, по сравнению с мышами, иммунизированными неадъювантной расщепленной Н5Ы1 вакциной (фиг. 11).
При дозе 1,5 мкг расщепленной Н5Ы1 вакцины понижение доз А803 соответствовало снижению концентрации СЭ4+ Т-клеток (фиг. 11А). Однако при дозе 0,38 мкг расщепленной Н5Ы1 вакцины у мышей, иммунизированных А803-адъювантными расщепленными Н5Ы1 вакцинами (фиг. 11В), не наблюдалось различия в ответах СЭ4+ Т-клеток между разными дозами адъюванта.
7.3. Краткое изложение результатов и выводы.
Исследования иммуногенности на мышах показали, что адъювантная расщепленная Н5Ы1 вакцина индуцировала значительно более высокие гуморальный (анти-Н5М1 БЫ8А и титры Ш) и клеточный (СИ4+Т-клетки) ответы, чем ответы, индуцированные неадъювантной расщепленной Н5Ы1 вакциной.
Не наблюдалось отсутствия влияния дозы антигена на гуморальный иммунный ответ у мышей, иммунизированных 1,5 и 0,38 мкг адъювантной расщепленной Н5Ы1 вакцины, что позволило предположить, что в данной модели в присутствии адъюванта могут требоваться даже более низкие дозы НА для наблюдения влияния дозы на ответ.
Наблюдалось значительное усиление ответов СИ4+ Т-клеток у мышей, ранее не поверженных воздействию, при использовании А803-адъювантной пандемической Н5Ы1 вакцины по сравнению с простой Н5Ы1 вакциной. Не наблюдалось влияния разведения А803, когда дозу 0,38 мкг Н5Ы1 расщепленной вакцины использовали в качестве вакцины-кандидата, в то время как наблюдалось уменьшение ответов СИ4+ Т-клеток, когда 1,5 мкг расщепленной Н5Ы1 вакцины адъювантировали пониженной дозой А803.
Как отмечалось ранее, не наблюдалось различия гуморального и клеточного иммунных ответов у мышей, иммунизированных расщепленной Н5Ы1 вакциной (при любой дозе антигена), адъювантированной полной дозой А803 или А803/2. Некоторое усиление иммунного ответа было обнаружено, когда в вакцинной композиции использовали двойную полную дозу А803 и, соответственно, было обнаружено снижение иммунного ответа, когда в вакцинной композиции использовали А803/5.
В целом, данные, представленные в данном описании изобретения, подтверждают эффективность данной новой адъювантной системы в данной вакцинной композиции.
Пример VIII. Доклиническая оценка адъювантных и неадъювантных вакцин против гриппа у праймированных свиней Ьатде \У1Ше.
8.1. Дизайн и цель эксперимента.
Эксперимент на мышах, праймированных вирусом гриппа, проводили для оценки усиления посредством А803 гуморальных ответов, индуцированных вакцинами против гриппа, приготовленных в виде препарата с указанным адъювантом масло-в-воде.
Свиней использовали, чтобы оценить диапазон доз А803 в модели на животных, близкой человеку. Свиньи демонстрируют длинный перечень биологических аналогий, что определяет это животное как физиологически наиболее близкое к человеку с очень незначительными исключениями (Иоид1а8 К, 1972). Кроме того, у свиней обычно наблюдается проявление гриппозной инфекции.
8.1.1. Обработка/группа (табл. 17).
Группы из 10 взрослых самок большой белой свиньи праймировали в сутки 0 трехвалентным цельным вирусом гриппа, инактивированным формалином (25 мкг НА для каждого штамма), интраназально, общим объемом 200 мкл. Праймирующие штаммы состояли из штаммов, гомологичных вакцинным штаммам (25 мкг НА цельного инактивированного Н1Ы1 А/Ыете Са1ебоша/20/99, Н3Ы2 А/Рапата/2007/99 и В/81апдбопд/7/97). Через двадцать восемь суток свиней вакцинировали одной дозой вакцины-кандидата внутримышечно общим объемом 500 мкл. Свиней иммунизировали композициями, содержащими только расщепленные антигены (трехвалентная расщепленная простая), или композициями, содержащими расщепленные антигены, адъювантированные диапазоном доз А803 (полная, 1/2 или 1/5). Штаммы, использованные для иммунизаций, включали вирусные антигены Н1Ы1 А/Ыете Са1ебоша/20/99, Н3Ы2 А/Рапата/2007/99 и В/81апдбопд/7/97 (15 мкг НА для штаммов НШ1 А/Ыете Са1ебоша/20/99, Н3Ы2 А/Рапата/2007/99 и 17,5 мкг штамма В/81апдбопд/7/97 в качестве одной дозы, предназначенной для человека).
Группы (10 свиней/группа):
- 27 015817
Таблица 17
Группа Антиген/Композиция Другая обработка
1 Трехвалентный расщепленный /Простая (неадъювантная) Гетерологическое праймирование ϋθ
2 Трехвалентный расщепленный / А803 Гетерологическое праймирование □0
3 Трехвалентный расщепленный /А803 1/2 Гетерологическое праймирование ОО
4 Трехвалентный расщепленный/АЗОЗ 1/5 Гетерологическое праймирование □0
8.1.2. Получение вакцинных композиций.
Трехвалентная расщепленная/простая.
Премикс Твина 80, Тритона Х100 и Витамина Е сукцината (УЕ8) готовят для достижения конечной концентрации в вакцине 750 мкг/мл Твина 80, 110 мкг/мл Тритона Х100 и 100 мкг/мл УЕ8. В количествах, использованных в премиксе, учитывают их содержание в штаммах.
Композицию одной дозы 500 мкл получают для немедленного применения согласно следующей последовательности: вода для инъекций + солевой буфер (10-кратно концентрированный РВ8 ρΗ 7,4, полученный как указано в примере IV) + премикс, 5 мин перемешивания на магнитной мешалке при комнатной температуре, + 15 мкг ΗΑ штамма Η1Ν1, 10 мин перемешивания на магнитной мешалке при комнатной температуре, + 15 мкг ΗΑ штамма Η3Ν2, 10 мин перемешивания на магнитной мешалке при комнатной температуре, + 17,5 мкг ΗΑ штамма В, 15 мин перемешивания на магнитной мешалке при комнатной температуре. Композиции вводят в течение часа после окончания их приготовления.
Трехвалентная расщепленная /Α803.
Премикс Твина 80, Тритона Х100 и Витамина Е сукцината (АЕ8) готовят для достижения конечной концентрации в вакцине 750 мкг/мл Твина 80, 110 мкг/мл Тритона Х100 и 100 мкг/мл АЕ8. В количествах, использованных в премиксе, учитывают их содержание в штаммах.
Композицию одной дозы 500 мкл получают для немедленного применения согласно следующей последовательности: вода для инъекций + солевой буфер (10-кратно концентрированный РВ8 ρΗ 7,4 получали, как указано в примере IV) + премикс, 5 мин перемешивания на магнитной мешалке при комнатной температуре, + 15 мкг ΗΑ штамма Η1Ν1, 10 мин перемешивания на магнитной мешалке при комнатной температуре, + 15 мкг ΗΑ штамма Η3Ν2, 10 мин перемешивания на магнитной мешалке при комнатной температуре, + 17,5 мкг ΗΑ штамма В, 15 мин перемешивания на магнитной мешалке при комнатной температуре, + 250 мкл эмульсии 8В62 для полной дозы Α803 или 125 мкл эмульсии 8В62 для 1/2 дозы Α803 или 50 мкл эмульсии 8В62 для 1/5 дозы Α803, 15 мин перемешивания на магнитной мешалке при комнатной температуре. Композиции вводят в течение часа после окончания их приготовления.
8.1.3. Считывания (табл. 18).
Гуморальный иммунный ответ на вакцинацию измеряли перед интраназальным праймированием (сутки 0), перед иммунизацией (сутки 28) и через 14 суток после иммунизации (10 свиней/группа). Образцы сыворотки тестировали посредством теста ингибирования гемагглютинации (ΗΙ).
Таблица 18
Считывание Время контроля Тип образца Метод анализа
Гуморальные ответы □0, 028, ϋ42 Сыворотка ΙΗΑ
8.2. Результаты и выводы.
8.2.1. Гуморальный иммунитет.
Результаты представлены на фиг. 12. Независимо от разведения адъюванта Α803-адъювантные трехвалентные расщепленные композиции индуцировали более сильный ΗΙ-ответ на все штаммы, чем простая трехвалентная композиция в данной модели гомологичного праймирования, хотя статистическая значимость не всегда достигалась для всех трех штаммов. Влияние дозы адъюванта наблюдалось с незначительными различиями между штаммами. Для менее иммуногенных штаммов, таких как В/8Ьаидйоид, только трехвалентная расщепленная вакцина, адъювантированная полной дозой Α803, была значимо отличной от простой вакцины в отличие от трехвалентной расщепленной вакцины, адъювантированной полной дозой Α803, пониженная доза Α803 не увеличивала ΗΙ-титры для всех трех штаммов выше, чем простая вакцина.

Claims (12)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Иммуногенная композиция, содержащая антиген или антигенную композицию и адъювантную композицию, состоящую из эмульсии масло в воде, где указанная эмульсия масло в воде содержит 0,25-1,25% (об./об.) сквалена, 0,25-1,25% (об./об.) токола и 0,1-0,7% (об./об.) эмульгатора от общего объ
    - 28 015817 ема композиции.
  2. 2. Иммуногенная композиция по п.1, где токол представляет собой α-токоферол.
  3. 3. Иммуногенная композиция по любому из пп.1 или 2, где эмульгатор представляет собой полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат.
  4. 4. Иммуногенная композиция по п.3, где полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат выбран из группы, включающей Ро1увогЬа!е® 80 или Т\уееп® 80.
  5. 5. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-4, где антиген или антигенную композицию получают из вируса гриппа.
  6. 6. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-5, доза которой, предназначенная для введения человеку, составляет 0,4-1,5 мл.
  7. 7. Иммуногенная композиция по п.6, где объем дозы составляет 0,5 мл.
  8. 8. Иммуногенная композиция по п.6, где объем дозы составляет 0,7 мл.
  9. 9. Иммуногенная композиция по п.6, где объем дозы составляет 1,0 мл.
  10. 10. Применение иммуногенной композиции по любому из пп.1-9 в качестве лекарственного средства для использования в профилактической терапии или терапии состояния или заболевания человека.
  11. 11. Применение иммуногенной композиции по любому из пп.1-9 при изготовлении лекарственного средства для использования в профилактической терапии или терапии состояния или заболевания человека.
  12. 12. Способ лечения или предупреждения заболевания, включающий введение пациенту, страдающему от заболевания или подверженному ему, иммуногенной композиции по любому из пп.1-9.
EA200900350A 2006-10-12 2007-10-10 Иммуногенная композиция, содержащая адъювант в виде эмульсии "масло в воде" EA015817B1 (ru)

Applications Claiming Priority (10)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB0620336.8A GB0620336D0 (en) 2006-10-12 2006-10-12 Vaccine
GB0620337A GB0620337D0 (en) 2006-10-12 2006-10-12 Vaccine
GB0620816A GB0620816D0 (en) 2006-10-19 2006-10-19 vaccine
GB0620815A GB0620815D0 (en) 2006-10-19 2006-10-19 Vaccine
PCT/EP2006/069977 WO2007071710A2 (en) 2005-12-22 2006-12-20 Vaccine comprising streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide conjugates
PCT/EP2006/069979 WO2007071711A2 (en) 2005-12-22 2006-12-20 Vaccine
GB0707697A GB0707697D0 (en) 2007-04-20 2007-04-20 Vaccine
GB0711357A GB0711357D0 (en) 2007-06-12 2007-06-12 Vaccine
GB0712062A GB0712062D0 (en) 2007-06-21 2007-06-21 Vaccine
PCT/EP2007/060743 WO2008043774A1 (en) 2006-10-12 2007-10-10 Vaccine comprising an oil in water emulsion adjuvant

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200900350A1 EA200900350A1 (ru) 2009-10-30
EA015817B1 true EA015817B1 (ru) 2011-12-30

Family

ID=40551582

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200900350A EA015817B1 (ru) 2006-10-12 2007-10-10 Иммуногенная композиция, содержащая адъювант в виде эмульсии "масло в воде"

Country Status (18)

Country Link
US (2) US20100183667A1 (ru)
JP (2) JP5230632B2 (ru)
KR (1) KR101151202B1 (ru)
CN (1) CN101522218B (ru)
AU (1) AU2007306381B2 (ru)
BR (1) BRPI0717219B8 (ru)
CA (1) CA2664619C (ru)
CR (1) CR10726A (ru)
DK (1) DK2086582T3 (ru)
EA (1) EA015817B1 (ru)
ES (1) ES2397714T3 (ru)
HR (1) HRP20130023T1 (ru)
IL (1) IL197512A (ru)
MA (1) MA30866B1 (ru)
MX (1) MX2009003325A (ru)
NO (1) NO20091022L (ru)
PT (1) PT2086582E (ru)
WO (1) WO2008043774A1 (ru)

Families Citing this family (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE60015084T2 (de) * 1999-02-26 2006-02-16 Chiron S.R.L. Verbesserung der bakterizidaktivität von neisseria antigenen mit cg enthaltende oligonukleotiden
DE10144906B4 (de) 2001-09-12 2013-11-28 Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh Verfahren zur großtechnischen Herstellung von Impfstoffen
PL1861120T3 (pl) * 2005-03-23 2016-11-30 Zastosowanie wirusa grypy i adiuwantu emulsji olej-w-wodzie do indukcji komórek t cd4+ i/lub ulepszonej odpowiedzi komórek b pamięci
MX2009000660A (es) 2006-07-17 2009-04-08 Glaxosmithkline Biolog Sa Vacuna de influenza.
KR101151202B1 (ko) 2006-10-12 2012-06-11 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 수중유 에멀젼 애주번트를 포함하는 백신
RU2460538C2 (ru) 2006-11-03 2012-09-10 Шеринг-Плоу Лтд. Вакцина против лаймской болезни собак
AR066405A1 (es) 2007-04-20 2009-08-19 Glaxosmithkline Biolog Sa Vacuna
GB0714963D0 (en) 2007-08-01 2007-09-12 Novartis Ag Compositions comprising antigens
US20110014230A1 (en) 2008-03-18 2011-01-20 Novartis Ag preparation of influenza virus vaccine antigens
KR20110009158A (ko) * 2008-04-16 2011-01-27 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 백신
RS54306B1 (en) * 2008-04-16 2016-02-29 Glaxosmithkline Biologicals S.A. THE VACCINE
RS51999B (en) 2008-08-28 2012-04-30 Novartis Ag Obtaining squalene from hyperproductive yeasts
EP2331127A2 (en) 2008-09-18 2011-06-15 Novartis AG Vaccine adjuvant combinations
CA2752041A1 (en) 2009-02-10 2010-08-19 Novartis Ag Influenza vaccines with increased amounts of h3 antigen
AU2010212547B2 (en) 2009-02-10 2015-03-12 Seqirus UK Limited Influenza vaccine regimens for pandemic-associated strains
CA2751379C (en) * 2009-02-10 2018-06-12 Novartis Ag Influenza vaccines with reduced amounts of squalene
NZ700477A (en) 2009-02-17 2016-04-29 Glaxosmithkline Biolog Sa Inactivated dengue virus vaccine with aluminium-free adjuvant
WO2010109324A1 (en) 2009-03-24 2010-09-30 Novartis Ag Combinations of meningococcal factor h binding protein and pneumococcal saccharide conjugates
NZ612315A (en) 2009-04-14 2014-10-31 Novartis Ag Compositions for immunising against staphylococcus aureus
NZ596432A (en) 2009-05-21 2013-05-31 Novartis Ag Reverse genetics using non-endogenous pol i promoters
AU2010277310B2 (en) 2009-07-31 2015-01-15 Seqirus UK Limited Reverse genetics systems
GB0918392D0 (en) 2009-10-20 2009-12-02 Novartis Ag Diagnostic and therapeutic methods
SI2491117T1 (sl) 2009-10-20 2014-03-31 Novartis Ag Izboljšani postopki reverzne genetike za pridobivanje virusov
GB0919117D0 (en) 2009-10-30 2009-12-16 Glaxosmithkline Biolog Sa Process
GB0919690D0 (en) 2009-11-10 2009-12-23 Guy S And St Thomas S Nhs Foun compositions for immunising against staphylococcus aureus
SG182573A1 (en) 2010-01-27 2012-08-30 Glaxosmithkline Biolog Sa Modified tuberculosis antigens
US20130071422A1 (en) 2010-03-18 2013-03-21 Michele Pallaoro Adjuvanted vaccines for serogroup b meningococcus
JP5946188B2 (ja) 2010-05-12 2016-07-05 ノバルティス アーゲー スクアレンを調製するための改良された方法
AU2011254204B2 (en) 2010-05-21 2015-08-20 Seqirus UK Limited Influenza virus reassortment method
GB201009861D0 (en) 2010-06-11 2010-07-21 Novartis Ag OMV vaccines
AU2012222883A1 (en) 2011-03-02 2013-10-17 Novartis Ag Combination vaccines with lower doses of antigen and/or adjuvant
WO2013057715A1 (en) 2011-10-20 2013-04-25 Novartis Ag Adjuvanted influenza b virus vaccines for pediatric priming
EP3023790A1 (en) 2011-12-12 2016-05-25 Novartis AG Assay for influenza virus hemagglutinins
JP2015500864A (ja) 2011-12-23 2015-01-08 ノバルティス アーゲー 黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）に対して免疫するための安定な組成物
WO2013087945A2 (en) 2012-03-02 2013-06-20 Novartis Ag Influenza virus reassortment
RU2014140521A (ru) 2012-03-08 2016-04-27 Новартис Аг Адъювантные составы бустерных вакцин
TR201910573T4 (tr) 2012-08-31 2019-08-21 Glaxosmithkline Biologicals Sa Staphylococcus aureus'a karşı bağışıklık kazandırmak için stabilize edilmiş proteinler.
US20150203543A1 (en) 2012-08-31 2015-07-23 Novartis Ag Stabilised proteins for immunising against staphylococcus aureus
RU2015106930A (ru) 2012-09-06 2016-10-20 Новартис Аг Комбинированные вакцины с менингококком серогруппы в и к/д/с
GB201218195D0 (en) 2012-10-10 2012-11-21 Istituto Zooprofilattico Sperimentale Delle Venezie Composition
JP6440619B2 (ja) 2012-10-12 2018-12-19 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 混合ワクチン用の架橋されていない無細胞百日咳抗原
ES2656510T3 (es) 2012-11-30 2018-02-27 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Antígenos de Pseudomonas y combinación de antigenos
WO2014086732A2 (en) 2012-12-03 2014-06-12 Novartis Ag Influenza virus reassortment
WO2014086787A1 (en) 2012-12-05 2014-06-12 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Immunogenic composition
CN105007935A (zh) 2012-12-18 2015-10-28 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 用于保护免于白喉和/或破伤风的缀合物
CA2905612A1 (en) 2013-03-13 2014-09-18 Novartis Ag Influenza virus reassortment
JP6419775B2 (ja) * 2013-03-19 2018-11-07 バイオテック ツールズ エスエー アレルゲン調製物
KR20160030097A (ko) 2013-05-10 2016-03-16 노파르티스 아게 인플루엔자 백신에서 기면증 위험의 방지
PL3542819T3 (pl) * 2013-05-14 2022-01-10 Zoetis Services Llc Nowe kompozycje szczepionek zawierających oligonukleotydy immunostymulujące
DE202013005100U1 (de) 2013-06-05 2013-08-26 Novartis Ag Influenza Virus Reassortierung
DE202013005130U1 (de) 2013-06-05 2013-09-10 Novartis Ag Influenza Virus Reassortierung
JP2016521553A (ja) 2013-06-06 2016-07-25 ノバルティス アーゲー インフルエンザウイルス再集合
EP3957321A3 (en) 2014-01-21 2022-07-13 Pfizer Inc. Streptococcus pneumoniae capsular polysaccharides and conjugates thereof
ES2769647T3 (es) 2014-03-26 2020-06-26 Glaxosmithkline Biologicals Sa Antígenos estafilocócicos mutantes
RU2684400C2 (ru) * 2014-05-26 2019-04-09 Бектон Дикинсон Франс Способ хранения вакцины с эмульсионным адъювантом в смазанном медицинском инъекционном устройстве
US10238739B2 (en) 2014-12-02 2019-03-26 Novartis Ag Manufacture of surfactant-containing compositions with enhanced stability
HUE060924T2 (hu) 2015-07-07 2023-04-28 Seqirus Uk Ltd Influenza elleni hatásosság vizsgálata
BE1024160A9 (fr) 2015-12-22 2017-12-06 Glaxosmithkline Biologicals Sa Formulation immunogène
JP7125197B2 (ja) 2016-09-27 2022-08-24 イミューノヴァクシーン テクノロジーズ インコーポレイテッド ヒト対象において抗体免疫応答を誘導するために低投与体積ｂ細胞エピトープ組成物を使用する方法
CN106511996B (zh) * 2016-11-04 2019-09-10 江苏省农业科学院 用于***疫苗的复乳型佐剂及其制备方法
KR102650073B1 (ko) 2017-01-31 2024-03-20 머크 샤프 앤드 돔 엘엘씨 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형 19f 유래의 협막 다당류 단백질 접합체의 제조 방법
CN109652384B (zh) * 2019-02-21 2021-10-26 昆明理工大学 一种体外培养戊型肝炎病毒的方法
BR112022009545A2 (pt) 2019-11-18 2022-10-11 Seqirus Pty Ltd Método para produzir vírus influenza recombinantes
KR20210117832A (ko) * 2020-03-20 2021-09-29 강원대학교산학협력단 Gla-se를 포함하는 수족구병 백신 조성물
WO2022002783A1 (en) 2020-06-29 2022-01-06 Glaxosmithkline Biologicals Sa Adjuvants
BR112023002804A2 (pt) 2020-08-24 2023-03-14 Sanofi Pasteur Inc Vacinas para covid-19 com adjuvantes em emulsão de esqualeno contendo tocoferol
US20240165224A1 (en) 2021-03-26 2024-05-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic compositions
WO2023020994A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel methods
WO2023020992A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel methods
WO2023020993A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel methods
KR20240033309A (ko) * 2022-09-05 2024-03-12 주식회사 차백신연구소 에멀전 제형의 면역증강제 조성물 및 이의 제조 방법

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0399843A2 (en) * 1989-05-25 1990-11-28 Chiron Corporation Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion
WO1995017210A1 (en) * 1993-12-23 1995-06-29 Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) Vaccines
US20030133944A1 (en) * 2001-04-05 2003-07-17 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Vaccine composition against malaria
WO2006100110A1 (en) * 2005-03-23 2006-09-28 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Novel composition

Family Cites Families (62)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2905287A1 (de) 1979-02-12 1980-08-21 Siemens Ag Verfahren zur automatischen elektrochemischen endpunktsbestimmung einer titration
US4235877A (en) 1979-06-27 1980-11-25 Merck & Co., Inc. Liposome particle containing viral or bacterial antigenic subunit
US4454119A (en) 1981-06-29 1984-06-12 Mitsubishi Chemical Industries Limited Therapeutic agents
FI69639C (fi) * 1982-07-02 1986-03-10 Orion Yhtymae Oy Preparat foer anvaendning vid klamydia-diagnostik
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
FI861417A0 (fi) 1985-04-15 1986-04-01 Endotronics Inc Hepatitis b ytantigen framstaelld med rekombinant-dna-teknik, vaccin, diagnostiskt medel och cellinjer samt foerfaranden foer framstaellning daerav.
AU614755B2 (en) 1987-06-05 1991-09-12 United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The Autocrine motility factors in cancer diagnosis and management
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4940460A (en) 1987-06-19 1990-07-10 Bioject, Inc. Patient-fillable and non-invasive hypodermic injection device assembly
EP0304578B1 (en) 1987-06-22 2001-10-24 Medeva Holdings Bv Peptide comprising hepatitis B surface antigen
US5339163A (en) 1988-03-16 1994-08-16 Canon Kabushiki Kaisha Automatic exposure control device using plural image plane detection areas
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
GB8819209D0 (en) 1988-08-12 1988-09-14 Research Corp Ltd Polypeptide & dna encoding same
US4999403A (en) 1988-10-28 1991-03-12 Exxon Chemical Patents Inc. Graft polymers of functionalized ethylene-alpha-olefin copolymer with polypropylene, methods of preparation, and use in polypropylene compositions
ES2160570T3 (es) 1988-12-16 2001-11-16 Nederlanden Staat Mutantes de neumolisina y vacunas de neumococos fabricadas a partir de los mismos.
DE69015222T2 (de) 1989-02-04 1995-05-04 Akzo Nv Tocole als Impfstoffadjuvans.
ES2109921T3 (es) 1989-07-25 1998-02-01 Smithkline Beecham Biolog Nuevos antigenos y procedimientos para su preparacion.
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
EP0468520A3 (en) 1990-07-27 1992-07-01 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Immunostimulatory remedies containing palindromic dna sequences
GB9118204D0 (en) 1991-08-23 1991-10-09 Weston Terence E Needle-less injector
ATE177755T1 (de) 1991-11-16 1999-04-15 Smithkline Beecham Biolog Hybrides protein zwischen cs aus plasmodium und hbsag
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5569189A (en) 1992-09-28 1996-10-29 Equidyne Systems, Inc. hypodermic jet injector
US5334144A (en) 1992-10-30 1994-08-02 Becton, Dickinson And Company Single use disposable needleless injector
ATE157882T1 (de) 1993-03-23 1997-09-15 Smithkline Beecham Biolog 3-0-deazylierte monophosphoryl lipid a enthaltende impfstoff-zusammensetzungen
US5688506A (en) 1994-01-27 1997-11-18 Aphton Corp. Immunogens against gonadotropin releasing hormone
WO1995024176A1 (en) 1994-03-07 1995-09-14 Bioject, Inc. Ampule filling device
US5466220A (en) 1994-03-08 1995-11-14 Bioject, Inc. Drug vial mixing and transfer device
WO1995026204A1 (en) 1994-03-25 1995-10-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US5599302A (en) 1995-01-09 1997-02-04 Medi-Ject Corporation Medical injection system and method, gas spring thereof and launching device using gas spring
EP0812358A1 (en) 1995-02-24 1997-12-17 Cantab Pharmaceuticals Research Limited Polypeptides useful as immunotherapeutic agents and methods of polypeptide preparation
UA56132C2 (ru) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиция вакцины (варианты), способ стабилизации qs21 по отношению к гидролизу (варианты), способ приготовления вакцины
US5730723A (en) 1995-10-10 1998-03-24 Visionary Medical Products Corporation, Inc. Gas pressured needle-less injection device and method
US5843464A (en) 1995-06-02 1998-12-01 The Ohio State University Synthetic chimeric fimbrin peptides
US5666153A (en) 1995-10-03 1997-09-09 Virtual Shopping, Inc. Retractable teleconferencing apparatus
US5893397A (en) 1996-01-12 1999-04-13 Bioject Inc. Medication vial/syringe liquid-transfer apparatus
GB9607549D0 (en) 1996-04-11 1996-06-12 Weston Medical Ltd Spring-powered dispensing device
US7184826B2 (en) 1996-06-18 2007-02-27 Alza Corporation Device and method for enhancing transdermal flux of agents being delivered or sampled
US5980898A (en) 1996-11-14 1999-11-09 The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command Adjuvant for transcutaneous immunization
KR100453132B1 (ko) 1996-12-20 2004-10-15 앨자 코포레이션 경피 약제 플럭스를 향상시키기 위한 장치 및 방법
US6130043A (en) 1997-05-02 2000-10-10 Abbott Laboratories Reagents and methods useful for detecting diseases of the prostate
US5993412A (en) 1997-05-19 1999-11-30 Bioject, Inc. Injection apparatus
JP2001510031A (ja) 1997-07-21 2001-07-31 ノース・アメリカン・ヴァクシン・インコーポレーテッド ワクチンとしての修飾された免疫原ニューモリシン組成物
GB9717953D0 (en) 1997-08-22 1997-10-29 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
GB9718901D0 (en) 1997-09-05 1997-11-12 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
DE69815692T2 (de) 1997-09-05 2004-04-29 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Öl in wasser emulsionen mit saponinen
US7459524B1 (en) 1997-10-02 2008-12-02 Emergent Product Development Gaithersburg Inc. Chlamydia protein, sequence and uses thereof
EP2218730A1 (en) 1997-11-28 2010-08-18 Merck Serono Biodevelopment Chlamydia trachomatis genomic sequence and polypeptides, fragments thereof and uses thereof, in particular for the diagnosis, prevention and treatment of infection
CA2312900A1 (en) 1997-12-02 1999-06-10 Powderject Vaccines, Inc. Transdermal delivery of particulate vaccine compositions
IT1298087B1 (it) 1998-01-08 1999-12-20 Fiderm S R L Dispositivo per il controllo della profondita' di penetrazione di un ago, in particolare applicabile ad una siringa per iniezioni
HU228354B1 (en) 1998-04-07 2013-03-28 Corixa Corp Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis antigens and their uses
US6319224B1 (en) 1999-08-20 2001-11-20 Bioject Medical Technologies Inc. Intradermal injection system for injecting DNA-based injectables into humans
GB9923176D0 (en) * 1999-09-30 1999-12-01 Smithkline Beecham Biolog Novel composition
US6494865B1 (en) 1999-10-14 2002-12-17 Becton Dickinson And Company Intradermal delivery device including a needle assembly
JP2001316251A (ja) * 2000-02-24 2001-11-13 Fuairudo Kk 炭素燃焼残査の超微粒子を含むスクワラン及びその製造方法
GB0025577D0 (en) * 2000-10-18 2000-12-06 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
AU2002343728A1 (en) 2001-11-16 2003-06-10 3M Innovative Properties Company Methods and compositions related to irm compounds and toll-like receptor pathways
US20090304742A1 (en) * 2005-11-04 2009-12-10 Novartis Vaccines And Diagnostics Srl Influenza vaccines with reduced amount of emulsion adjuvant
KR101151202B1 (ko) 2006-10-12 2012-06-11 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 수중유 에멀젼 애주번트를 포함하는 백신
AR066405A1 (es) * 2007-04-20 2009-08-19 Glaxosmithkline Biolog Sa Vacuna

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0399843A2 (en) * 1989-05-25 1990-11-28 Chiron Corporation Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion
WO1995017210A1 (en) * 1993-12-23 1995-06-29 Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) Vaccines
US20030133944A1 (en) * 2001-04-05 2003-07-17 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Vaccine composition against malaria
WO2006100110A1 (en) * 2005-03-23 2006-09-28 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Novel composition

Also Published As

Publication number Publication date
JP2013067646A (ja) 2013-04-18
PT2086582E (pt) 2013-01-25
MA30866B1 (fr) 2009-11-02
JP5767201B2 (ja) 2015-08-19
US20150359863A1 (en) 2015-12-17
KR101151202B1 (ko) 2012-06-11
CR10726A (es) 2009-05-25
IL197512A0 (en) 2011-08-01
BRPI0717219A2 (pt) 2015-05-26
AU2007306381A1 (en) 2008-04-17
CN101522218B (zh) 2012-09-26
MX2009003325A (es) 2009-04-09
AU2007306381B2 (en) 2011-12-08
CA2664619C (en) 2012-12-11
JP5230632B2 (ja) 2013-07-10
ES2397714T3 (es) 2013-03-08
US9700605B2 (en) 2017-07-11
HRP20130023T1 (hr) 2013-02-28
BRPI0717219B8 (pt) 2021-05-25
EA200900350A1 (ru) 2009-10-30
IL197512A (en) 2013-10-31
KR20090066323A (ko) 2009-06-23
JP2010505907A (ja) 2010-02-25
BRPI0717219B1 (pt) 2021-01-19
WO2008043774A1 (en) 2008-04-17
US20100183667A1 (en) 2010-07-22
NO20091022L (no) 2009-04-27
DK2086582T3 (da) 2013-02-04
CN101522218A (zh) 2009-09-02
CA2664619A1 (en) 2008-04-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA015817B1 (ru) Иммуногенная композиция, содержащая адъювант в виде эмульсии &#34;масло в воде&#34;
KR101916787B1 (ko) Ｃｄ4 ｔ－세포 및/또는 개선된 ｂ－메모리 세포 반응을 유도하는 인플루엔자 바이러스 및 수중유 에멀젼 애주번트의 용도
JP5461015B2 (ja) サポニンアジュバントを含むワクチン組成物
CN101815505B (zh) 包含来自细胞系产生的流感病毒的红血球凝聚素的病毒颗粒、组合物、制造方法和它们的应用
ES2307494T3 (es) Vacuna del virus de la gripe inactivo para su administracion via nasalu oral.
Metzger et al. Impact of vector-priming on the immunogenicity of a live recombinant Salmonella enterica serovar typhi Ty21a vaccine expressing urease A and B from Helicobacter pylori in human volunteers
Couch et al. Improvement of inactivated influenza virus vaccines
ES2553113T3 (es) Vacuna
EA024250B1 (ru) Дозированная форма иммуногенного препарата против гриппа для применения у человека и содержащая её вакцина, способы их приготовления и их применение для лечения или предупреждения заболеваний, вызываемых вирусом гриппа у людей
JP2015508803A (ja) インフルエンザに対する改善されたワクチン接種
CN101330924A (zh) 包含皂苷佐剂的疫苗组合物
EP2086582B1 (en) Vaccine comprising an oil in water emulsion adjuvant
BRPI0609519A2 (pt) composição, uso de uma composição, método de vacinação, uso de um antìgeno, e, método para a preparação de uma composição imunogênica
BRPI0609772A2 (pt) composição imunogênica multivalente de influenza, método para a produção de uma composição imunogência de influenza para uma situação pandêmica, e, usos de um vìrus de influenza ou preparação antigênica do mesmo e um adjuvante de emulsão óleo-em-água, e de um antìgeno ou preparação antigênica de uma primeira cepa de influenza

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KG MD TJ TM