ES2769647T3 - Antígenos estafilocócicos mutantes - Google Patents

Abstract

Un antígeno SpA mutante que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende o que consiste en la SEQ ID NO: 49, en que los dipéptidos XX en las posiciones 7-8, 60-61, 68-69, 126-127, 184-185 y 242-243 de la SEQ ID NO: 49 son KK, RR, RK o KR, y los dipéptidos XX en las posiciones 34-35, 95-96, 153-154, 211-212 y 269-270 de la SEQ ID NO: 49 son AA..

Description

DESCRIPCIÓN

Antígenos estafilocócicos mutantes

Campo técnico

La presente invención se refiere a la inmunización frente a la infección por S. aureus.

Técnica anterior

Staphylococcus aureus es una bacteria esférica grampositiva. La mortalidad anual en EE. UU. supera la de cualquier otra enfermedad infecciosa, incluyendo VIH/sida, y S. aureus es la causa principal de septicemia, infección respiratoria de vías bajas, infección de piel y partes blandas. También es la causa predominante de infecciones óseas en todo el mundo, y estas infecciones son dolorosas, debilitantes y difíciles de tratar.

El tratamiento de S. aureus está siendo cada vez más problemático debido al desarrollo de resistencia a antibióticos de muchas cepas de S. aureus. S. aureus resistente a la meticilina (SARM) se encuentra en más de la mitad de las infecciones hospitalarias y extrahospitalarias totales. Los últimos años han presenciado la aparición de cepas de SARM que también son resistentes a la vancomicina, el antibiótico de último recurso, y que son esencialmente intratables.

Actualmente no existe una vacuna autorizada. Una vacuna basada en una mezcla de polisacáridos de superficie de tipos bacterianos 5 y 8, StaphVAX™, no logró reducir las infecciones en comparación con el grupo de placebo en un ensayo clínico de fase III. Del mismo modo, la vacuna V710 [1], basada en el antígeno IsdB [2], no logró reducir la tasa de infecciones posoperatorias por S. aureus [3].

La necesidad de obtener una vacuna es particularmente acuciante debido al problema de la resistencia a antibióticos y el hecho de que la infección por S. aureus no proporciona inmunidad de futura infección gracias a sus bien desarrolladas capacidades de evasión inmunitaria. A su vez, las propiedades de evasión inmunitaria de S. aureus hacen que el desarrollo de vacunas eficaces sea más difícil. Los mecanismos de evasión inmunitaria no se entienden completamente, pero al menos se deben en parte a la proteína A estafilocócica (SpA), una molécula de superficie de S. aureus que se une al Fc de la inmunoglobulina (Ig) y a la porción Fab de los receptores de linfocitos B de tipo VH3. La interacción de SpA con los receptores de linfocitos B da lugar a expansión clonal y posterior muerte celular de las poblaciones de linfocitos B, dando lugar a la destrucción de la respuesta inmunitaria adaptativa. La unión de SpA al Fc de Ig interfiere en el aclaramiento opsonofagocítico de estafilococos mediante leucocitos polimorfonucleares.

Se han desarrollado formas mutantes de SpA con afinidad reducida por las inmunoglobulinas. El documento WO2011/005341 describe una SpA con mutaciones puntuales en cada uno de los cinco dominios de unión a Ig que reducen la capacidad de la proteína para unirse a IgG.

La referencia 4 desvela diversos enfoques para proporcionar vacunas contra S. aureus mejoradas, incluyendo dos combinaciones de inmunógenos preferentes denominados “Combo-1” y “Combo-2”. "Combo-1" incluyó cinco antígenos EsxA, EsxB, un Hla mutante, FhuD2 y Sta011, mientras que "Combo-2" usó un fragmento de IsdA en vez del Hla mutante. Ambas de estas combinaciones se sometieron a prueba con adyuvantes de hidróxido de aluminio e incrementaron la mediana del tiempo de supervivencia en un modelo murino de infección en comparación con tampón solo o con el antígeno IsdB. También se ha sometido a prueba "Combo-1" con un adyuvante de hidróxido de aluminio y un agonista de TLR7, y la adición del agonista de TLR7 mejoró las respuestas [5].

A pesar de los resultados positivos con "Combo-1" y "Combo-2", sigue existiendo una necesidad de composiciones adicionales y mejoradas para inmunizar frente a S. aureus.

Divulgación de la invención

La proteína A (SpA) (SEQ ID NO: 43), una proteína de superficie anclada a la pared celular de Staphylococcus aureus, proporciona la evasión bacteriana de las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas. La proteína A se une a las inmunoglobulinas en su porción Fc, interacciona con el dominio VH3 de los receptores de linfocitos B estimulando de manera inapropiada la apoptosis y proliferación de linfocitos B, se une a los dominios AI del factor de Von Willebrand para activar la coagulación intracelular y también se une al receptor 1 del TNF para contribuir a la patogenia de la neumonía estafilocócica. Debido al hecho de que la proteína A captura inmunoglobulina y presenta cualidades tóxicas, no se ha explorado con rigor la posibilidad de que esta molécula de superficie pueda funcionar como una vacuna en seres humanos. Aquí los inventores demuestran que las variantes de la proteína A que ya no se pueden unir a inmunoglobulinas, de las que así se elimina su potencial toxinógeno, es decir, son no toxinógenas, estimulan las respuestas inmunitarias humorales que protegen frente a la enfermedad estafilocócica.

Por lo tanto, la invención proporciona antígenos SpA mutantes como se define en las reivindicaciones. Dichos mutantes tienen preferentemente afinidad disminuida por la porción Fcy de IgG humana con respecto a SpA no modificada. Los mutantes también pueden tener afinidad disminuida, con respecto a SpA no modificada, por la porción Fab de los receptores de linfocitos B humanos que contienen Vh3.

Los inventores han comprobado que la conocida vacuna "Combo-1" se puede mejorar añadiendo una proteína A estafilocócica (SpA) mutante que se ha modificado para que disminuya su afinidad por la porción Fcy de IgG humana y por la porción Fab de los receptores de linfocitos B que contienen Vh3. Este antígeno adicional incrementa la eficacia protectora de la combinación y proporciona resultados sorprendentes en un modelo de absceso renal. Ninguna de las combinaciones de antígenos sometida a prueba en la referencia 4 incluyó un antígeno SpA.

Por lo tanto, la invención proporciona adicionalmente una composición inmunogénica que comprende los antígenos EsxA, EsxB, FhuD2, Sta011 y Hla, caracterizada por que la composición incluye adicionalmente un antígeno SpA mutante de la invención, en la que el mutante tiene afinidad disminuida, con respecto a SpA no modificada, por la porción Fcy de IgG humana y por la porción Fab de receptores de linfocitos B humanos que contienen Vh3.

La invención también proporciona una composición inmunogénica que comprende: (i) al menos un antígeno seleccionado del grupo que consiste en los antígenos EsxA, EsxB, FhuD2, Sta011 y Hla; y (ii) un antígeno SpA mutante como se define en las reivindicaciones que tiene afinidad disminuida, con respecto a SpA no modificada, por la porción Fcy de IgG humana y por la porción Fab de receptores de linfocitos B humanos que contienen Vh3. De esta manera, se pueden usar 1, 2, 3, 4 o los 5 de EsxA, EsxB, FhuD2, Sta011 y Hla en combinación con la SpA mutante.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la técnica pertinente.

Por conveniencia, se proporcionan el significado de determinados términos y expresiones empleados en la memoria descriptiva, los ejemplos y las reivindicaciones.

Antígenos de S. aureus

La invención se refiere a un antígeno SpA mutante. La SpA natural (proteína A estafilocócica) es una proteína de superficie anclada a la pared celular que es un factor de virulencia clave para las infecciones pulmonares, septicemia y desarrollo de abscesos y se expresa por la mayoría de las cepas aisladas clínicas de S. aureus. La SpA natural se une a la porción Fc de la IgG humana, a receptores de linfocitos B que contienen Vh3, al factor de Von Willebrand en su dominio A1 y al receptor 1 del TNF-a. La interacción de SpA con receptores de linfocitos B da lugar a la expansión clonal y posterior muerte celular de poblaciones de linfocitos B con efectos sobre las respuestas inmunitarias adaptativa e innata, mientras que su unión al Fcy de IgG interfiere en el aclaramiento opsonofagocítico de estafilococos mediante leucocitos polimorfonucleares. La parte terminal del extremo N de la SpA madura comprende cuatro o cinco dominios de unión a Ig de 56-61 restos, que se pliegan en empaquetamientos helicoidales triples conectados mediante enlazadores cortos y se designan en el orden E, D, A, B y C [6]. Estos dominios presentan ~ un 80 % de identidad a nivel de aminoácidos, son de 56 a 61 restos de longitud y están organizados como repeticiones en tándem [7]. La región terminal del extremo C comprende "Xr", un octapéptido altamente repetitivo, aunque variable, y "Xc", un dominio adyacente a la estructura de anclaje de la pared celular de la SpA.

En la cepa NCTC 8325, la spa es SAOUHSC_00069 y tiene la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 43 (GI:88193885). En la cepa Newman, es nwmn_0055 (GI:151220267). Los antígenos SpA usados con la divulgación pueden inducir un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconozca la SEQ ID NO: 43 y/o pueden comprender una secuencia aminoacídica: (a) que tenga un 50% o más de identidad (por ejemplo, un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 43; y/o (b) que comprenda un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 43, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estos antígenos SpA incluyen variantes de la SEQ ID NO: 43. Los fragmentos preferentes de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 43. Otros fragmentos preferentes carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 43, mientras que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 43. Por utilidad, se pueden omitir los últimos 35 aminoácidos terminales del extremo C de la SEQ ID NO: 43. Por utilidad, se pueden omitir los primeros 36 aminoácidos terminales del extremo N de la SEQ ID NO: 43. La referencia 8 sugiere que los dominios de unión a IgG individuales pueden ser inmunógenos útiles, solos o en combinación.

Un fragmento útil de SEQ ID NO: 43 es los aminoácidos 37 a 325. Este fragmento contiene todos los cinco dominios de unión a Ig de la SpA (que están dispuestos de manera natural desde el extremo N al C en el orden E, D, A, B, C) e incluye el dominio más expuesto de la SpA. También reduce la similitud del antígeno con las proteínas humanas. Otros fragmentos útiles pueden omitir 1,2, 3 o 4 de los dominios A, B, C, D y/o E naturales para prevenir la expansión excesiva de linfocitos B y entonces la apoptosis que se puede producir si la spa funciona como un superantígeno de linfocitos B. Como se señala en la referencia 18, otros fragmentos útiles pueden incluir únicamente 1, 2, 3 o 4 de los dominios A, B, C, D y/o E naturales, por ejemplo, comprender únicamente el dominio SpA(A), pero no de B a E, o comprender únicamente el dominio SpA(D), pero no A, B, C o E, etc. De esta manera, un antígeno spa útil puede incluir 1, 2, 3, 4 o 5 dominios de unión a IgG, pero idealmente tiene 4 o menos

De esta manera, otro fragmento útil de SpA comprende o consiste en la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO: 50, en la que el doblete de aminoácidos en las posiciones 60 y 61 no es Gln-Gln. Dicho doblete se puede mutar como se describe a continuación, por ejemplo, a Lys-Arg. De esta manera, dicho fragmento puede comprender o consistir en la SEQ ID NO: 51 o 52.

Si un antígeno incluye únicamente un tipo de dominio de spa (por ejemplo, únicamente el dominio Spa(A), SpA(D) o Spa(E)), puede incluir más de una copia de este dominio, por ejemplo, múltiples dominios SpA(E) en una cadena polipeptídica única. También puede incluir un tipo de dominio de SpA y otra proteína o polipéptido. De esta manera, un antígeno de la divulgación puede ser una proteína de fusión que comprenda únicamente un tipo de dominio de SpA, tal como el dominio SpA(E), y otro antígeno proteico, tal como EsxA; EsxB; FhuD2; Sta011; y Hla.

Los antígenos SpA de la invención se mutan con respecto a la SEQ ID NO: 43, de tal manera que tengan afinidad disminuida por la porción Fcy de IgG humana. Por ejemplo, se muta el dipéptido QQ en los restos 60-61 de la SEQ ID NO: 43 para reducir la afinidad por las inmunoglobulinas. A continuación, se analizan las sustituciones de dipéptidos útiles para un dipéptido QQ, y una sustitución preferente es el dipéptido KR. De esta manera, un antígeno SpA útil puede comprender la SEQ ID NO: 49, en la todos los dipéptidos 11 XX difieren de los dipéptidos correspondientes en la SEQ ID NO: 43. Por ejemplo, el antígeno SpA puede comprender la SEQ ID NO: 46 y un ejemplo preferente de la SEQ ID NO: 46 es la SEQ ID NO: 47. Cuando se expresa con una metionina terminal del extremo N, el antígeno SpA que comprende la SEQ ID NO: 47 puede consistir en la SEQ ID NO: 48.

Los antígenos SpA usados con la divulgación se pueden mutar adicionalmente con respecto a la SEQ ID NO: 43, de tal manera que tengan afinidad disminuida por la porción Fcy de IgG humana y por la porción Fab de receptores de linfocitos B humanos que contienen Vh3. Por ejemplo, esto se puede conseguir y evaluar siguiendo la indicación en la referencia 9. De esta manera, se puede mutar al menos un dipéptido Gln-Gln en SpA natural (por ejemplo, a Lys-Lys; otras mutaciones posibles incluyen Arg-Arg, Arg-Lys, Lys-Arg, Ala-Ala, Ser-Ser, Ser-Thr, Thr-Thr, etc.) y/o se puede mutar al menos un dipéptido Asp-Asp en SpA natural (por ejemplo, a Ala-Ala; otras mutaciones posibles incluyen Lys-Lys, Arg-Arg, Lys-Arg, Arg-Lys, His-His, Val-Val, etc.). Estas secuencias diana para la mutación están subrayadas a continuación, donde los guiones separan los cinco dominios de unión a Ig:

MKKKNIYSIRKLGVGIASVTLGTLLISGGVTP-AANAAQHDEAQQNAFYQVLNMPNLNADQRNGF

IQSLKDDPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK-ADAQQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQS

LKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPK-ADNNFNKEQQNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKDDPS

QSANLLSEAKKLNESQAPK-ADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLL

AEAKKLNDAQAPK-ADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKDDPSVSKEILAEAKKL

NDAQAPK-EEDNNKPGKEDNNKPGKEDNNKPGKEDNNKPGKEDNNKPGKEDGNKPGKEDNKKPGK

EDGNKPGKEDNKKPGKEDGNKPGKEDGNKPGKEDGNGVHVVKPGDTVNDIAKANGTTADKIAADN

KLADKNMIKPGQELWDKKQPANHADANKAQALPETGEENPFIGTTVFGGLSLALGAALLAGRRR

EL (SEQ ID NO: 43)

Un dominio individual en el antígeno SpA desvelado en el presente documento se puede mutar en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más aminoácidos con respecto a la SEQ ID NO: 43 (por ejemplo, véase anteriormente en relación con las secuencias Gln-Gln y Asp-Asp, pero también las mutaciones en los restos 3 y/o 24 del dominio D, en el resto 46 y/o 53 del dominio A, etc.). Dichas mutaciones no deberían eliminar la capacidad del antígeno de inducir un anticuerpo que reconozca la SEQ ID NO: 43, pero eliminarán la unión del antígeno a IgG y/u otras proteínas humanas (tales como proteínas de la sangre humana) como se advierte anteriormente. Particularmente, el antígeno SpA mutante es de la secuencia que comprende o que consiste en la SEQ ID NO: 43 mutada en al menos 1, más particularmente al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 e incluso más particularmente 20 aminoácidos en la posición 43, 44, 70, 71, 104, 105, 131, 132, 162, 163, 190, 191, 220, 221, 247, 248, 278, 279, 305 y/o 306 de la SEQ ID NO: 43. Las sustituciones útiles para estas posiciones se mencionan anteriormente.

Además, se puede eliminar el extremo N natural y, por utilidad, se pueden omitir los primeros 36 aminoácidos de la SEQ ID NO: 43. Del mismo modo, se puede eliminar el extremo C natural, y, por utilidad, se puede omitir la secuencia corriente abajo del quinto dominio de unión a Ig (es decir, corriente abajo de Lys-327 en la SEQ ID NO: 43). De esta manera, un antígeno SpA útil comprende la SEQ ID NO: 44:

AQHDEAXXHAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKXXPSQSAHVLGEAQKLNDSQAPKADAQQNNFN

KDXXSAFYEILHMPNLNEAQRNGFIQSLKXXPSQ5TNVLGEAKKLMESQAPKADHNFHKEXXHAF

YEILMMPMLNEEQRNGFIQSLKXXPSQSANLLSEAKKLNESQAPKADHKFMKEXXNAFYEILHLP

NLNEEQRNGFIQSLKXXPSQSANLLAEAKKLHDAQAFKADHKFHKEXXHAFYEILHLPNLTEEQR

HGFIQSLKXXPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK

en la que los 10 dipéptidos XX subrayados difieren de los dipéptidos correspondientes en la SEQ ID NO: 43. De esta manera, un QQ en estas posiciones en la SEQ ID NO: 43 no es QQ en la SEQ ID NO: 44, e idealmente no incluye ningún resto de glutamina, por ejemplo, es KK. Del mismo modo, un DD en estas posiciones en la SEQ ID NO: 43 no es DD en la SEQ ID NO: 44, e idealmente no incluye ningún resto de aspartato, por ejemplo, es AA. De esta manera, una SpA para su uso con la divulgación comprende la SEQ ID NO: 45.

Además de las sustituciones en los dipéptidos XX en la SEQ ID NO: 44, es posible modificar la secuencia aminoacídica con hasta 5 cambios amino únicos, siempre que la secuencia modificada pueda inducir anticuerpos que todavía se unan a un polipéptido que consiste en la SEQ ID NO: 44. De esta manera, se puede modificar la SEQ ID NO: 45 mediante 1, 2 o 3 sustituciones en las posiciones fuera de los dipéptidos XX en la SEQ ID NO: 44. Por ejemplo, se puede mutar el dipéptido QQ en los restos 60-61 de la SEQ ID NO: 44 para reducir adicionalmente la afinidad por las inmunoglobulinas. Anteriormente se han analizado las sustituciones de dipéptidos útiles para un dipéptido QQ, y una sustitución preferente es el dipéptido KR. De esta manera, un antígeno SpA útil puede comprender la SEQ ID NO: 49, en la que uno o más (preferentemente todos) los dipéptidos 11 XX difieren de los dipéptidos correspondientes en la SEQ ID NO: 43. Por ejemplo, el antígeno SpA puede comprender la SEQ ID NO: 46 y un ejemplo preferente de la SEQ ID NO: 46 es la SEQ ID NO: 47. Cuando se expresa con una metionina terminal del extremo N, el antígeno SpA que comprende la SEQ ID NO: 47 puede consistir en la SEQ ID NO: 48.

Como se ha analizado anteriormente, un fragmento útil de SpA puede incluir únicamente 1, 2, 3 o 4 de los dominios A, B, C, D y/o E naturales, por ejemplo, comprender únicamente el dominio SpA(E), pero no D, A, B o C. De esta manera, un antígeno SpA puede comprender únicamente el dominio SpA(E) mutado como se describe anteriormente, es decir, la secuencia aminoacídica que comprende o que consiste en la SEQ ID NO: 54 mutada en al menos 1 aminoácido en las posiciones 60 y 61 de la SEQ ID NO: 54, aminoácidos de 1 a 67 de la SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 o SEQ ID NO: 49, aminoácidos de 1 a 68 de la SEQ ID NO: 48. Por ejemplo, dicho antígeno puede comprender la SEQ ID NO. 50, SEQ ID NO. 51, SEQ ID NO. 52 o SEQ ID NO. 53. Dicho antígeno no incluye preferentemente otra secuencia de SpA. Puede incluir más de una copia del dominio SpA(E), y/o comprender adicionalmente otro antígeno proteico, tal como un antígeno EsxA, EsxB, FhuD2, Sta011 o Hla como se describe en el presente documento.

Las combinaciones de antígenos de la divulgación usan 1, 2, 3, 4 o todos los 5 de los siguientes antígenos: EsxA; EsxB; FhuD2; Sta011; y Hla. Estos cinco antígenos ya se conocen en la técnica (por ejemplo, véanse las referencias ¡Error! Marcador no definido.-51011 121314) y, a continuación, se facilitan detalles adicionales. Una composición particularmente útil incluye todos los cinco de estos antígenos (preferentemente donde e1Hla es una forma mutante no tóxica (es decir, destoxificada)).

El antígeno 'EsxA' en la cepa NCTC 8325 tiene la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 (GI:88194063). Los antígenos EsxA usados con la presente invención pueden inducir un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconozca la SEQ ID NO: 1 y/o pueden comprender una secuencia aminoacídica: (a) que tenga un 50% o más de identidad (por ejemplo, un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97%, 98%, 99%, 99,5% o más) con la SEQ ID NO: 1; y/o (b) que comprenda un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 1, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o más). Estos polipéptidos EsxA incluyen variantes de la SEQ ID NO: 1. Los fragmentos preferentes de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 1. Otros fragmentos preferentes carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ^{ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID} nO: ^{1, mientras que conservan al} menos un epítopo de la SEQ ID NO: 1.

El antígeno 'EsxB' en la cepa NCTC 8325 tiene la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 2 (GI:88194070). El EsxB usado con la presente invención puede inducir un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administra a un ser humano) que reconozca la SEQ ID NO: 2 y/o puede comprender una secuencia aminoacídica: (a) que tenga un 50% o más de identidad (por ejemplo, un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 2; y/o (b) que comprenda un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 2, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más). Estos polipéptidos EsxB incluyen variantes de la SEQ ID NO: 2. Los fragmentos preferentes de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 2. Otros fragmentos preferentes carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 2, mientras que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 2. Un antígeno EsxB útil carece del resto de cisteína interno de la SEQ ID NO: 2, por ejemplo, comprende la SEQ ID NO: 35, en la que el resto X en la posición 30 está ausente o bien es un resto aminoacídico sin un grupo tiol libre (en condiciones reductoras), por ejemplo, es cualquier aminoácido natural excepto cisteína.

El antígeno 'FhuD2' se anota como 'proteína de unión a ferricromo' y también se ha estudiado en la literatura [15]. También se ha conocido como 'Sta006' (por ejemplo, en las referencias ¡Error! Marcador no definido.-¡Error! Marcador no definido.). En la cepa NCTC 8325, FhuD2 tiene la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 3 (GI:88196199). El FhuD2 usado con la presente invención puede inducir un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administra a un ser humano) que reconozca la SEQ ID NO: 3 y/o puede comprender una secuencia aminoacídica: (a) que tenga un 50% o más de identidad (por ejemplo, un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 3; y/o (b) que comprenda un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 3, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estos polipéptidos FhuD2 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 3. Los fragmentos preferentes de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 3. Otros fragmentos preferentes carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 3, mientras que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 3. Por utilidad, se pueden omitir los primeros ^{17 aminoácidos terminales del extremo N de la SEQ ID NO: 3 (para proporcionar la} sEq ^{ID NO: 6). Las formas} mutantes de FhuD2 se señalan en la referencia 16. Un antígeno FhuD2 útil carece del resto de cisteína de la SEQ ID NO: 3, por ejemplo, comprende la SEQ ID NO: 34 y no incluye ningún resto aminoacídico con un grupo tiol libre (en condiciones reductoras), por ejemplo, está libre de cisteína. Por ejemplo, se puede lipidar un antígeno FhuD2 con una cisteína del extremo N acilada. Una secuencia de FhuD2 útil es la SEQ ID NO: 7, que tiene una secuencia Met-Ala-Ser- en el extremo N; la SEQ ID NO: 37 es otra de dichas secuencias, pero carece de la cisteína presente en la SEQ ID NO: 7.

El antígeno 'Sta011' tiene la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 4 (GI:88193872) en la cepa NCTC 8325. Los antígenos Sta011 usados con la invención pueden inducir un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconozca la SEQ ID NO: 4 y/o pueden comprender una secuencia aminoacídica: (a) que tenga un 50% o más de identidad (por ejemplo, un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 4; y/o (b) que comprenda un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 4, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estos polipéptidos Sta011 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 4. Los fragmentos preferentes de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 4. Otros fragmentos preferentes carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 4, mientras que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 4. Por utilidad, se pueden omitir los primeros 23 aminoácidos terminales del extremo N de la SEQ ID NO: 4 (para proporcionar la SEQ ID NO: 33). Un antígeno Sta011 útil carece del resto de cisteína de la SEQ ID NO: 4, por ejemplo, comprende la SEQ ID NO: 36 y no incluye ningún resto aminoacídico con un grupo tiol libre (en condiciones reductoras), por ejemplo, está libre de cisteína. Por ejemplo, se puede lipidar un antígeno Sta011 con una cisteína del extremo N acilada. Una secuencia de Sta011 útil es la SEQ ID NO: 8, que tiene una metionina del extremo N; la SEQ ID NO: 39 es otra de dichas secuencias, pero carece de la cisteína presente en la SEQ ID NO: 8. Las formas variantes de la SEQ ID NO: 4 que se pueden usar como o para preparar antígenos Sta011 incluyen, pero no se limitan a, las SEQ ID NO: 9, 10 y 11 con diversas sustituciones Ile/Val/Leu (y también se pueden usar variantes libres de Cys de estas secuencias con la invención). Sta011 puede existir como un monómero o un oligómero, con iones de Ca++ que favorecen la oligomerización. Pueden utilizarse monómeros y/u oligómeros de Sta011.

El antígeno 'Hla' es el "precursor de hemolisina alfa", también conocido como 'toxina alfa' o simplemente 'hemolisina'. En la cepa NCTC 8325, Hla tiene la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 5 (GI:88194865). Hla es un importante determinante de virulencia producido por la mayoría de las cepas de S. aureus, que tiene actividad hemolítica y de formación de poros. Los anticuerpos anti-Hla pueden neutralizar los efectos perjudiciales de la toxina en modelos animales, y Hla es particularmente útil para proteger frente a la neumonía.

Los antígenos Hla útiles pueden inducir un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconozca la SEQ ID NO: 5 y/o pueden comprender una secuencia aminoacídica: (a) que tenga un 50% o más de identidad (por ejemplo, un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 5; y/o (b) que comprenda un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 5, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estos antígenos Hla incluyen variantes de la SEQ ID NO: 5. Los fragmentos preferentes de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 5. Otros fragmentos preferentes carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID nO: ^{5, mientras que conservan al} menos un epítopo de la SEQ ID NO: 5. Por utilidad, se pueden omitir los primeros 26 aminoácidos terminales del extremo N de la SEQ ID NO: 5 (por ejemplo, para dar la SEQ ID NO: 12). También se puede usar el truncamiento en el extremo C, por ejemplo, dejando únicamente 50 aminoácidos (restos 27-76 de la SEQ ID NO: 5) [17].

Particularmente, el antígeno Hla es un antígeno Hla destoxificado, es decir, una forma mutante de Hla, en la que se ha eliminado la toxicidad natural de Hla. Se puede evitar la toxicidad de Hla mediante inactivación química (por ejemplo, usando formaldehído, glutaral u otros reactivos de reticulación). En cambio, sin embargo, es preferente usar formas mutantes de Hla que eliminen su actividad tóxica mientras se conserva su inmunogenia. Más particularmente, el antígeno Hla destoxificado es una forma mutante de Hla, en la que se ha eliminado la toxicidad de Hla, mientras que se ha conservado la inmunogenia de Hla. Dichos mutantes destoxificados ya se conocen en la técnica. Un antígeno Hla preferente es una hemolisina de S. aureus mutante que tiene una mutación en el resto 61 de la SEQ ID NO: 5, que es el resto 35 del antígeno maduro (es decir, después de omitir los primeros 26 aminoácidos terminales del extremo N = resto 35 de la SEQ ID NO: 12). De esta manera, puede que el resto 61 no sea histidina, y, en cambio, sea, por ejemplo, Ile, Val o preferentemente Leu. También se puede usar una mutación His-Arg en esta posición. Por ^{ejemplo, la} sEq ^{ID NO: 13 es la secuencia de la forma mutante H35L madura de Hla (es decir, la SEQ ID NO: 12 con} una mutación H35L) y un antígeno Hla destoxificado útil es de la secuencia que comprende o que consiste en la SEQ ID NO: 13. Otra mutación útil reemplaza un bucle largo por una secuencia corta, por ejemplo, para reemplazar el 39mero en los restos 136-174 de la SEQ ID NO: 5 por un tetrámero, tal como PSGS (SEQ ID NO: 14), como en la SEQ ID NO: 15 (que también incluye la mutación H35L) y la SEQ ID NO: 16 (que no incluye la mutación H35L). Otra mutación útil reemplaza el resto Y101, por ejemplo, por una leucina (SEQ ID NO: 17). Otra mutación útil reemplaza el resto D152, por ejemplo, por una leucina (SEQ ID NO: 18). Otro mutante útil reemplaza los restos H35 e Y101, por ejemplo, por una leucina (SEQ ID NO: 19). Otro mutante útil reemplaza los restos H35 y D152, por ejemplo, por una leucina (SEQ ID NO: 20).

Se desvelan antígenos Hla útiles adicionales en las referencias 18 y 19.

Las SEQ ID NO: 21, 22 y 23 son tres fragmentos útiles de la SEQ ID NO: 5 ('Hla27-7a', 'Hla27-89 y 'Hla27-79', respectivamente). Las SEQ ID NO: 24, 25 y 26 son los fragmentos correspondientes de la SEQ ID NO: 13.

Una secuencia Hla útil es la SEQ ID NO: 27. Tiene una Met terminal del extremo N, a continuación, un dipéptido Ala-Ser del vector de expresión, a continuación, la SEQ ID NO: 13 (de la cepa NCTC8325) que incluye la mutación H35L.

Si una composición incluye ambos antígenos EsxA y EsxB, estos pueden estar presentes como un polipéptido único (es decir, como un polipéptido de fusión que comprende o que consiste tanto en EsxA como en EsxB). De esta manera, un polipéptido único puede inducir anticuerpos (por ejemplo, cuando se administra a un ser humano) que reconozcan tanto la SEQ ID NO: 1 como la SEQ ID NO: 2. El polipéptido único puede incluir: (i) una primera secuencia polipeptídica que tenga un 50 % o más de identidad (por ejemplo, un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 1 y/o que comprenda un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 1, como se ha definido anteriormente para EsxA; y (ii) una segunda secuencia polipeptídica que tenga un 50 % o más de identidad (por ejemplo, un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 2 y/o que comprenda un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 2, como se ha definido anteriormente para EsxB. Las primera y segunda secuencias polipeptídicas pueden estar en cualquier orden, del extremo N al C. Las SEQ ID NO: 28 ('EsxAB') y 29 ('EsxBA') son ejemplos de dichos polipéptidos, teniendo ambos ^{enlazadores de hexapéptidos} ASGgGs ^{(SEQ ID} nO: ^{30). Otro híbrido 'EsxAB' comprende la SEQ ID NO: 31, que} puede estar provista de una metionina del extremo N (por ejemplo, la SEQ ID NO: 32). Una variante útil de EsxAB carece del resto de cisteína interno de EsxB, por ejemplo, comprende la SEQ ID NO: 40, en la que el resto X en la posición 132 está ausente o bien es un resto aminoacídico sin un grupo tiol libre (en condiciones reductoras), por ejemplo, es cualquier aminoácido natural excepto cisteína. De esta manera, un antígeno EsxAB preferente para uso con la invención tiene la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 38.

De esta manera, un polipéptido útil comprende una secuencia aminoacídica (a) que tiene un 80 % o más de identidad (por ejemplo, un 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 31; y/o (b) que comprende tanto un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de los aminoácidos 1-96 de la SEQ ID NO: 31 como un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de los aminoácidos 103-205 de la SEQ ID NO: 31, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estos polipéptidos (por ejemplo, la SEQ ID NO: 32) pueden inducir anticuerpos (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconocen tanto la proteína estafilocócica natural que comprende la SEQ ID NO: 1 como la proteína estafilocócica natural que comprende la SEQ ID NO: 2. De esta manera, la respuesta inmunitaria reconoce ambos antígenos EsxA y EsxB. Los fragmentos preferentes de (b) proporcionan un epítopo de la SEQ ID NO: 1 y un epítopo de la SEQ ID NO: 2.

La divulgación usa 1, 2, 3, 4 o todos los 5 de EsxA, EsxB, FhuD2, Sta011 y Hla (preferentemente un Hla mutante no tóxico). Como se menciona anteriormente, una composición particularmente útil incluye todos los cinco de estos antígenos, pero en algunos modos de realización la composición incluye únicamente 1, 2, 3 o 4 de estos cinco antígenos, es decir, 1, 2, 3 o 4 de EsxA, EsxB, FhuD2, Sta011 y Hla está ausente de la composición.

Una composición puede incluir todos los cuatro de: (i) un polipéptido único que incluye tanto un antígeno EsxA como un antígeno EsxB, por ejemplo, que comprende la SEQ ID NO: 31; (ii) un antígeno FhuD2, por ejemplo, que comprende la SEQ ID NO: 6; (iii) un antígeno Sta011, por ejemplo, que comprende la SEQ ID NO: 33; y (iv) una forma mutante H35L de Hla, por ejemplo, que comprende la SEQ ID NO: 13.

Aunque las SEQ ID NO: 31, 6, 33 y 13 son secuencias aminoacídicas útiles en una combinación, la divulgación no se limita a estas secuencias precisas. De esta manera, se pueden modificar independientemente 1, 2, 3 o todas las 4 de estas secuencias con hasta 5 cambios amino únicos (es decir, 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, deleciones y/o sustituciones de aminoácidos únicos), siempre que la secuencia modificada pueda inducir anticuerpos que todavía se unan a un polipéptido que consiste en la secuencia no modificada.

Otra composición útil incluye todos los cuatro de: (i) un primer polipéptido que tiene la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 32; (ii) un segundo polipéptido que tiene la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 7; (iii) un tercer polipéptido que tiene la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 8; y (iv) un cuarto polipéptido que tiene la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 27.

Aunque las SEQ ID NO: 32, 7, 8 y 27 son secuencias aminoacídicas útiles en una combinación, la divulgación no se limita a estas secuencias precisas. De esta manera, se pueden modificar independientemente 1,2, 3 o todas las 4 de estas cuatro secuencias con 1,2, 3, 4 o 5 cambios amino únicos (es decir, 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, deleciones y/o sustituciones de aminoácidos únicos), siempre que la secuencia modificada pueda inducir anticuerpos que todavía se unan a un polipéptido que consiste en la secuencia no modificada. De esta manera, en un modo de realización preferente una composición incluye estos cuatro polipéptidos especificados con 1, 2, 3 o todas las 4 de la SEQ ID NO: 32, 7, 8 y 27 modificadas independientemente mediante 1 inserción, deleción y/o sustitución de aminoácidos únicos.

Por ejemplo, cada una de las secuencias polipeptídicas de FhuD2, Sta011 y EsxAB natural (por ejemplo, las SEQ ID NO: 6, 31 y 33) incluye un resto de cisteína único que puede dar lugar a puentes disulfuro interpolipeptídicos, formando tanto homodímeros como heterodímeros. Dichos polipéptidos interconectados no son deseables y, de este modo, se pueden modificar las secuencias de Sta006, Sta011 y EsxB para eliminar sus restos de cisteína natural, de tal manera que no contengan grupos tiol libres (en condiciones reductoras). La cisteína natural se puede suprimir o se puede sustituir con un aminoácido diferente.

De esta manera, un antígeno FhuD2 puede comprender la SEQ ID NO: 34; un antígeno Sta011 puede comprender la SEQ ID NO: 36; y un antígeno EsxB puede comprender la SEQ ID NO: 35 (por ejemplo, como un híbrido EsxAB que comprende la SEQ ID NO: 40). Los ejemplos de dichas secuencias incluyen, pero no se limitan a, las SEQ ID NO: 37, 39 y 38. Estas secuencias se pueden usar únicamente, como sustitutos para las secuencias naturales correspondientes, o en combinación. De esta manera, una composición particularmente útil incluye todos los cuatro de: (i) un primer polipéptido que tiene la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 38; (ii) un segundo polipéptido que tiene la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 37; (iii) un tercer polipéptido que tiene la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 39; y (iv) un cuarto polipéptido que tiene la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 27.

De esta manera, una composición de la invención puede comprender todos los cinco de: (i) un polipéptido único que incluye tanto un antígeno EsxA como un antígeno EsxB, por ejemplo, que comprende la SEQ ID NO: 31; (ii) un antígeno FhuD2, por ejemplo, que comprende la SEQ ID NO: 6; (iii) un antígeno Sta011, por ejemplo, que comprende la SEQ ID NO: 33; (iv) una forma mutante H35L de Hla, por ejemplo, que comprende la SEQ iD n O: 13; y (v) una SpA mutante, como se define en las reivindicaciones. De este modo, la composición de acuerdo con la invención puede comprender en particular:

(i) un polipéptido único que incluye tanto un antígeno EsxA como un antígeno EsxB, particularmente de la secuencia que comprende o que consiste en la SEQ ID NO: 31;

(ii) un antígeno FhuD2, particularmente de la secuencia que comprende o que consiste en la SEQ ID NO: 6; (iii) un antígeno Sta011, particularmente de la secuencia que comprende o que consiste en la SEQ ID NO: 33; (iv) una forma mutante H35L de Hla, particularmente de la secuencia que comprende o que consiste en la SEQ ID NO: 13; y

(v) un antígeno SpA mutante, como se define en las reivindicaciones.

Otra composición de acuerdo con la divulgación comprende:

(i) un primer polipéptido de la secuencia que comprende o que consiste en la SEQ ID NO: 32, más particularmente que consiste en la SEQ ID NO: 32;

(ii) un segundo polipéptido de la secuencia que comprende o que consiste en la SEQ ID NO: 7, más particularmente que consiste en la s Eq ID NO: 7;

(iii) un tercer polipéptido de la secuencia que comprende o que consiste en la SEQ ID NO: 8, más particularmente que consiste en la Se Q ID NO: 8;

(iv) un cuarto polipéptido de la secuencia que comprende o que consiste en la SEQ ID NO: 27, más particularmente que consiste en la Se Q ID NO: 27; y

(v) un quinto polipéptido de la secuencia que comprende o que consiste en la SEQ ID NO. 52, más particularmente que comprende o que consiste en la SEQ ID NO: 45 modificada con hasta 3 sustituciones de aminoácidos (por ejemplo, que comprende la SEQ ID NO: 47 o que consiste en la SEQ ID NO: 48).

Otra composición preferente de acuerdo con la divulgación comprende:

(i) un primer polipéptido de la secuencia que comprende o que consiste en la SEQ ID NO: 38, más particularmente que consiste en la SEQ ID NO: 38;

(ii) un segundo polipéptido de la secuencia que comprende o que consiste en la SEQ ID NO: 37, más particularmente que consiste en la SEQ ID NO: 37;

(iii) un tercer polipéptido de la secuencia que comprende o que consiste en la SEQ ID NO: 39, más particularmente que consiste en la SEQ ID NO: 39;

(iv) un cuarto polipéptido de la secuencia que comprende o que consiste en la SEQ ID NO: 27, más particularmente que consiste en la Se Q ID NO: 27; y

(v) un quinto polipéptido de la secuencia que comprende o que consiste en la SEQ ID NO: 52, más particularmente la SEQ ID NO: 45 modificada con hasta 3 sustituciones de aminoácidos (por ejemplo, que comprende la SEQ ID NO: 47 o que consiste en la SEQ ID NO: 48).

Como se explica anteriormente, las proteínas (i) a (v) en estas combinaciones se pueden modificar independientemente con hasta 5 cambios de amino únicos, siempre que la secuencia modificada pueda inducir anticuerpos que todavía se unan a un polipéptido que consiste en la secuencia no modificada. En algunos ejemplos, una composición puede incluir uno o más polipéptidos adicionales; en otros ejemplos, los únicos polipéptidos en una composición son estos cinco polipéptidos especificados, y estos polipéptidos incluso pueden ser los únicos componentes inmunogénicos en una composición.

Cuando está presente más de un polipéptido, pueden estar presentes en masas sustancialmente iguales, es decir, la masa de cada uno de ellos está en un 5 % de la masa media de todos los polipéptidos. De esta manera, cuando están presentes cinco polipéptidos, pueden estar presentes en una proporción en masa de a:b:c:d:e, donde cada uno de a-e es de entre 0,95 y 1,05.

Aparte de EsxA, EsxB, Hla, FhuD2, Sta011 y SpA, existen otros antígenos de S. aureus, y una composición puede incluir opcionalmente uno o más antígenos de S. aureus adicionales. Por ejemplo, se conocen ambos antígenos polipeptídicos y sacáridos para S. aureus. De esta manera, una composición puede incluir un antígeno sacárido de S. aureus, por ejemplo, los antígenos sacáridos conocidos incluyen el exopolisacárido de S. aureus, que es una poli-N-acetilglucosamina (PNAG), y los sacáridos capsulares de S. aureus, que, por ejemplo, pueden ser de tipo 5, tipo 8 o tipo 336. Una composición también puede incluir un antígeno ClfA, un antígeno IsdA, un antígeno IsdB, un antígeno IsdC y/o un antígeno IsdH (cada uno como se define en las páginas 15-17 de la referencia ¡Error! Marcador no definido.).

En algunos ejemplos, una composición incluye un antígeno de S. aureus como se ha definido anteriormente y también un antígeno de un organismo diferente (por ejemplo, de un virus o de otra bacteria).

Composiciones inmunogénicas y medicamentos

Las composiciones inmunogénicas de acuerdo con la invención pueden ser útiles como vacunas. Las vacunas de acuerdo con la invención pueden ser profilácticas (es decir, para prevenir la infección) o bien terapéuticas (es decir, para tratar la infección), pero son típicamente profilácticas.

De esta manera, las composiciones pueden ser farmacéuticamente aceptables. Habitualmente incluyen componentes además de los antígenos, por ejemplo, típicamente incluyen uno o más vehículos y/o excipientes farmacéuticos. Un análisis minucioso de dichos componentes está disponible en la referencia 121.

Las composiciones se administran generalmente a un mamífero en forma acuosa. Sin embargo, antes de la administración, la composición puede haber estado en forma no acuosa. Por ejemplo, aunque algunas vacunas se fabrican en forma acuosa, a continuación, también se cargan y distribuyen y administran en forma acuosa, otras vacunas se liofilizan durante su fabricación y se reconstituyen en forma acuosa en el momento de su uso. De esta manera, una composición se puede secar, tal como una formulación liofilizada. La referencia 6 desvela el uso de la liofilización con composiciones inmunogénicas de S. aureus.

Una composición puede incluir conservantes, tales como tiomersal o 2-fenoxietanol. Sin embargo, es preferente que la vacuna esté sustancialmente libre de (es decir, menos de 5 |jg/ml) material mercurial, por ejemplo, tiomersal libre. Son más preferentes las vacunas que no contienen mercurio. Son particularmente preferentes las vacunas libres de conservantes.

Para mejorar la estabilidad térmica, una composición puede incluir un agente protector frente a la temperatura (véase a continuación).

Para controlar la tonicidad, es preferente incluir una sal fisiológica, tal como una sal de sodio. Es preferente cloruro de sodio (NaCl), que puede estar presente entre 1 y 20 mg/ml, por ejemplo, aproximadamente 10+2 mg/ml de NaCl. Otras sales que pueden estar presentes incluyen cloruro de potasio, dihidrógeno fosfato de potasio, fosfato de disodio dihidratado, cloruro de magnesio, cloruro de calcio, etc.

Las composiciones tienen generalmente una osmolalidad de entre 200 mOsm/kg y 400 mOsm/kg, preferentemente entre 240-360 mOsm/kg, y más preferentemente se encuentran en el intervalo de 290-310 mOsm/kg.

Las composiciones pueden incluir uno o más tampones. Los tampones típicos incluyen: un tampón fosfato; un tampón Tris; un tampón borato; un tampón succinato; un tampón histidina (particularmente con un adyuvante de hidróxido de aluminio); o un tampón citrato. Los tampones típicamente se incluyen en el intervalo 5-20 mM.

Las composiciones pueden incluir un quelante de iones de metal, en particular, un quelante de iones de metal divalentes, tal como EDTA. La referencia 6 desvela que la inclusión de EDTA puede mejorar la estabilidad de las composiciones descritas en el presente documento. La concentración final de EDTa en una composición inmunogénica puede ser de aproximadamente 1-50 mM, de aproximadamente 1-10 mM o de aproximadamente 1­ 5 mM, preferentemente de aproximadamente 2,5 mM.

El pH de una composición está generalmente entre 5,0 y 8,1, y más típicamente entre 6,0 y 8,0, por ejemplo, 6,5 y 7,5, o entre 7,0 y 7,8.

La composición es preferentemente estéril. La composición es preferentemente no pirógena, por ejemplo, que contiene < 1 UE (unidad de endotoxina, una medida estándar) por dosis, y preferentemente < 0,1 UE por dosis. La composición esta preferentemente libre de gluten.

La composición puede incluir material para una inmunización única o puede incluir material para inmunizaciones múltiples (es decir, un kit 'multidosis'). Es preferente la inclusión de un conservante en las configuraciones multidosis. Como alternativa a (o además de) incluir un conservante en las composiciones multidosis, las composiciones pueden estar contenidas en un recipiente que tenga un adaptador aséptico para la eliminación de material.

Las infecciones por S. aureus pueden afectar a diversas zonas del cuerpo y, de este modo, se puede preparar una composición en diversas formas. Por ejemplo, se puede preparar una composición como inyectables, como suspensiones o bien soluciones líquidas. También se pueden preparar formas sólidas para su solución o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección (por ejemplo, una composición liofilizada o una composición criodesecada por pulverización). Se puede preparar una composición para su administración tópica, por ejemplo, como una pomada, crema o polvo. Se puede preparar una composición para su administración oral, por ejemplo, como un comprimido o cápsula, como una pulverización o como un jarabe (opcionalmente saborizado). Se puede preparar una composición para su administración pulmonar, por ejemplo, como un inhalador, usando un polvo fino o una pulverización. Se puede preparar una composición como un supositorio u óvulo vaginal. Se puede preparar una composición para su administración nasal, ótica u ocular, por ejemplo, como gotas. Una composición puede estar en forma de kit, diseñado de tal manera que se reconstituya una composición combinada justo antes de su administración a un paciente. Dichos kits pueden comprender uno o más antígenos en forma líquida y uno o más antígenos liofilizados.

Si se va a preparar una composición extemporáneamente antes de su uso (por ejemplo, si un componente se presenta en forma liofilizada) y se presenta como un kit, el kit puede comprender dos viales, o puede comprender una jeringuilla ya cargada y un vial, usándose el contenido de la jeringuilla para reactivar el contenido del vial antes de la inyección.

Las vacunas humanas se administran típicamente en un volumen de dosificación de aproximadamente 0,5 ml, aunque también puede ser útil la mitad del volumen (es decir, aproximadamente 0,25 ml), por ejemplo, para los niños.

Las composiciones inmunogénicas administradas de acuerdo con la divulgación también pueden comprender uno o más agentes inmunorreguladores. Preferentemente, uno o más de los agentes inmunorreguladores incluye uno o más adyuvantes (véase a continuación).

Las composiciones pueden inducir tanto una respuesta inmunitaria mediada por células, así como una respuesta inmunitaria humoral. Esta respuesta inmunitaria desencadena preferentemente anticuerpos (por ejemplo, neutralizantes) de larga duración y una inmunidad mediada por células que pueden responder rápidamente a la exposición a S. aureus.

Las composiciones inmunogénicas usadas como vacunas comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de antígeno(s), así como cualquier otro componente, según sea necesario. Por 'cantidad inmunológicamente eficaz', se quiere decir que la administración de esa cantidad a un sujeto, en una dosis única o bien como parte de una serie, es eficaz para el tratamiento o prevención. Esta cantidad varía dependiendo del estado físico y de salud del sujeto que se va a tratar, edad, el grupo taxonómico del sujeto que se va a tratar (por ejemplo, primate no humano, primate etc.), la capacidad del sistema inmunitario del sujeto para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la valoración del médico de la situación médica y otros factores pertinentes. Se espera que la cantidad se encuentre en un intervalo relativamente amplio que se pueda determinar mediante ensayos rutinarios. Si se incluye más de un antígeno en una composición, entonces pueden estar presentes dos antígenos en la misma dosis uno y otro o en dosis diferentes.

Como se menciona anteriormente, una composición puede incluir un agente protector frente a la temperatura, y este componente puede ser particularmente útil en composiciones adyuvadas (particularmente las que contienen un adyuvante mineral, tal como una sal de aluminio). Como se describe en la referencia 20, se puede añadir un agente protector frente a la temperatura líquido a una composición de vacuna acuosa para rebajar su punto de congelación, por ejemplo, para reducir el punto de congelación por debajo de 0 °C. De esta manera, la composición se puede almacenar por debajo de 0 °C, pero por encima de su punto de congelación, para inhibir la descomposición térmica. El agente protector frente a la temperatura también permite congelar la composición mientras que protege a los adyuvantes de sales minerales frente a la aglomeración o sedimentación después de la congelación y descongelación, y también puede proteger a la composición a temperaturas elevadas, por ejemplo, por encima de 40 °C. Una vacuna acuosa de partida y el agente protector frente a la temperatura líquido se pueden mezclar de tal manera que el agente protector frente a la temperatura líquido forme desde un 1-80 % en volumen de la mezcla final. Los agentes protectores frente a la temperatura adecuados deberían ser seguros para su administración a seres humanos, fácilmente miscibles/solubles en agua, y no deberían dañar otros componentes (por ejemplo, antígeno y adyuvante) en la composición. Los ejemplos incluyen glicerina, propilenglicol y/o polietilenglicol (p Eg ). Los PEG adecuados pueden tener un peso molecular promedio que oscila desde 200-20000 Da. En un modo de realización preferente, el polietilenglicol puede tener un peso molecular promedio de aproximadamente 300 Da ('PEG-300').

Procedimientos de tratamiento y administración de una composición inmunogénica

La invención se refiere a las composiciones inmunogénicas de acuerdo con la invención para su uso como un medicamento.

La invención también se refiere a la composición inmunogénica de acuerdo con la invención para su uso como medicamento en la prevención y/o tratamiento de una infección por S. aureus.

La divulgación también proporciona un procedimiento para la prevención y/o tratamiento de una infección por S. aureus en un mamífero que comprende la etapa de administrar a un mamífero que lo necesita una cantidad inmunológicamente eficaz de una composición inmunogénica de acuerdo con la invención como se ha definido anteriormente. Los modos de realización ventajosos son como se han definido anteriormente.

La divulgación también proporciona el uso de (i) al menos un antígeno seleccionado del grupo que consiste en los antígenos EsxA, EsxB, FhuD2, Sta011 y Hla, y (ii) un antígeno SpA mutante que tiene afinidad disminuida, con respecto a SpA no modificada, por la porción Fcy de IgG humana y por la porción Fab de receptores de linfocitos B humanos que contienen Vh3, en la fabricación de un medicamento para prevenir o tratar una infección por S. aureus en un mamífero. Los modos de realización ventajosos son como se han definido anteriormente.

La divulgación también proporciona (i) al menos un antígeno seleccionado del grupo que consiste en antígenos EsxA, EsxB, FhuD2, Sta011 y Hla, y (ii) un antígeno mutante SpA que tiene una afinidad disminuida, en relación con SpA no modificado, para la porción Fcy de IgG humana y para la porción Fab de receptores de linfocitos B humanos que contienen Vh3, para su uso en la inmunización de un mamífero para prevenir o tratar la infección por S. aureus. Los modos de realización ventajosos son como se han definido anteriormente.

La divulgación también proporciona (i) al menos un antígeno seleccionado del grupo que consiste en los antígenos EsxA, EsxB, FhuD2, StaOll y Hla, y (ii) un antígeno SpA mutante que tiene afinidad disminuida, con respecto a SpA no modificada, por la porción Fcy de IgG humana y por la porción Fab de receptores de linfocitos B humanos que contienen Vh3, para uso en un procedimiento de inmunización de un mamífero para prevenir o tratar una infección por S. aureus administrando una cantidad terapéuticamente eficaz de antígenos al mamífero. Los modos de realización ventajosos son como se han definido anteriormente.

Como se advierte anteriormente, se pueden usar 1, 2, 3, 4 o preferentemente todos los 5 de EsxA, EsxB, FhuD2, Sta011 y Hla en combinación con la SpA mutante. De esta manera los procedimientos, usos, composiciones y combinaciones de antígenos de la divulgación inducen una respuesta inmunitaria que es eficaz para prevenir o tratar infecciones por S. aureus. La respuesta inmunitaria puede implicar anticuerpos y/o inmunidad mediada por células. Al aumentar una respuesta inmunitaria en el mamífero mediante estos usos y procedimientos, se puede proteger al mamífero frente a una infección por S. aureus, incluyendo una infección nosocomial. Más particularmente, se puede proteger al mamífero frente a una infección de piel, neumonía, meningitis, osteomielitis, endocarditis, síndrome del choque tóxico y/o septicemia. La invención también es útil para proteger frente a una infección por S. aureus de los huesos y articulaciones de un mamífero (y, de esta manera, para prevenir trastornos incluyendo, pero no limitados a, osteomielitis, artritis séptica e infección articular protésica). En muchos casos, estos trastornos se pueden asociar con la formación de una biopelícula de S. aureus.

S. aureus infecta a diversos mamíferos (incluyendo vacas, perros, caballos y cerdos), pero el mamífero preferente para su uso con las composiciones de la invención es un ser humano. El ser humano puede ser un niño (por ejemplo, un lactante mayor o lactante menor), un adolescente o un adulto. En algunos modos de realización, el ser humano puede tener una articulación o hueso protésico, o puede ser un receptor destinatario de dichas prótesis (por ejemplo, un paciente de cirugía ortopédica preoperatoria). Una vacuna destinada a niños también se puede administrar a adultos, por ejemplo, para evaluar la seguridad, dosificación, inmunogenia, etc. Sin embargo, las vacunas no son solamente adecuadas para estos grupos y se pueden usar más generalmente en una población humana.

Una manera de comprobar la eficacia del tratamiento terapéutico implica supervisar la infección por S. aureus después de la administración de las composiciones o antígenos de acuerdo con la invención. Una manera de comprobar la eficacia del tratamiento profiláctico implica supervisar las respuestas inmunitarias, por vía sistémica (tal como supervisar el nivel de producción de IgG1 e IgG2a) y/o por vía mucosa (tal como supervisar el nivel de producción de IgA), frente a los antígenos en la composición administrada después de su administración. Otra manera de evaluar la inmunogenia de las composiciones es expresar los antígenos de forma recombinante para cribar sueros de pacientes o secreciones mucosas mediante inmunotransferencia y/o micromatrices. Una reacción positiva entre la proteína y la muestra del paciente indica que el paciente ha reforzado una respuesta inmunitaria respecto a la proteína en cuestión.

También se puede determinar la eficacia de las composiciones de vacuna in vivo exponiendo modelos animales de infección por S. aureus, por ejemplo, cobayas o ratones, a las composiciones de vacuna. Hay tres modelos animales generalmente útiles para el estudio de la enfermedad infecciosa por S. aureus, en concreto: (i) el modelo murino de abscesos [21], (ii) el modelo murino de infección letal [21] y (iii) el modelo murino de neumonía [22]. El modelo de absceso examina los abscesos en los riñones de ratones después de la exposición intravenosa. El modelo de infección letal examina el número de ratones que sobreviven después de ser infectados con una dosis normalmente letal de S. aureus por vía intravenosa o intraperitoneal. El modelo de neumonía también examina la tasa de supervivencia, pero usa infección intranasal. Se desvelan modelos útiles adicionales en la referencia 23 para estudiar tanto la enfermedad por S. aureus en relación con la infección de implante mediada por biopelículas, infección de piel y partes blandas (IPPB) como sepsis. Una vacuna útil puede ser eficaz en uno o más de estos modelos. Por ejemplo, para algunas situaciones clínicas, puede ser deseable proteger frente a la neumonía, sin necesidad de prevenir la diseminación hemática o promover la opsonización; en otras situaciones, el deseo principal puede ser prevenir la diseminación hemática o sepsis. Los antígenos diferentes y combinaciones de antígenos diferentes pueden contribuir a aspectos diferentes de una vacuna eficaz.

Las composiciones generalmente se administran directamente a un paciente. La administración directa se puede alcanzar mediante inyección parenteral (por ejemplo, por vía subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular o al espacio intersticial de un tejido), o por vía mucosa, tal como mediante administración rectal, oral (por ejemplo, comprimido, pulverización), vaginal, tópica, transdérmica o transcutánea, intranasal, ocular, ótica, pulmonar u otra administración mucosa. La inyección intramuscular es la vía más típica para administrar composiciones de acuerdo con la invención.

Se puede usar la invención para inducir inmunidad sistémica y/o mucosa, preferentemente para inducir una inmunidad sistémica y/o mucosa potenciada. Preferentemente, la inmunidad sistémica y/o mucosa potenciada se refleja en una respuesta inmunitaria TH1 y/o TH2 potenciada. Preferentemente, la respuesta inmunitaria potenciada incluye un incremento en la producción de IgG1 y/o IgG2a y/o IgA.

La dosificación puede ser mediante una pauta de dosis única o una pauta de dosis múltiples. Se pueden usar dosis múltiples en un programa de vacunación primaria y/o en un programa de vacunación de refuerzo. En una pauta de dosis múltiples, las diversas dosis se pueden administrar mediante las mismas vías o diferentes, por ejemplo, una primovacunación parenteral y refuerzo mucosal, una primovacunación mucosa y refuerzo parenteral, etc. Las dosis múltiples se administran típicamente con al menos 1 semana de diferencia (por ejemplo, de aproximadamente 2 semanas, de aproximadamente 3 semanas, de aproximadamente 4 semanas, de aproximadamente 6 semanas, de aproximadamente 8 semanas, de aproximadamente 10 semanas, de aproximadamente 12 semanas, de aproximadamente 16 semanas, etc.).

Las composiciones inmunogénicas se pueden administrar a pacientes sustancialmente al mismo tiempo que (por ejemplo, durante la misma interconsulta o visita a un profesional sanitario o centro de vacunación) otras vacunas.

Las composiciones inmunogénicas se pueden administrar a pacientes en combinación con un antibiótico. Por ejemplo, se pueden administrar sustancialmente al mismo tiempo que un antibiótico. Del mismo modo, se pueden administrar a un sujeto que está recibiendo tratamiento con antibióticos. Del mismo modo, se pueden administrar como parte de un tratamiento simultáneo que implica la administración de tanto una composición como se analiza en el presente documento como de un antibiótico. El antibiótico es eficaz frente a una bacteria de S. aureus, por ejemplo, una betalactama.

Cepas y variantes

Los antígenos se han analizado anteriormente con referencia a la nomenclatura existente (por ejemplo, “EsxA”) y las secuencias ejemplares se dan como números GI y también en el listado de secuencias. La divulgación no se limita a estas precisas secuencias. Las secuencias genómicas de varias cepas de S. aureus están disponibles, incluyendo las cepas de SARM N315 y Mu50 [24], MW2, N315, COL, MRSA252, MSSA476, RF122, USA300 (muy virulenta), JH1, JH9, NCTC 8325, y Newman. Se pueden usar técnicas de búsqueda y alineación estándar para identificar en cualquiera de estas (u otras) secuencias genómicas adicionales el homólogo de cualquier secuencia particular mencionada en el presente documento. Por otra parte, se pueden usar las secuencias específicas desveladas en el presente documento para diseñar cebadores para la amplificación de secuencias homólogas de otras cepas. De esta manera, la divulgación abarca dichas variantes y homólogos de cualquier cepa de S. aureus, así como variantes no naturales. En general, las variantes adecuadas de una SEQ ID NO particular incluyen sus variantes alélicas, sus formas polimórficas, sus homólogos, sus ortólogos, sus parálogos, sus mutantes, etc.

De esta manera, por ejemplo, los polipéptidos usados con la divulgación, en comparación con la SEQ ID NO en el presente documento, pueden incluir una o más (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, etc.) sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservadoras (es decir, sustituciones de un aminoácido con otro que tenga una cadena lateral relacionada). Los aminoácidos codificados genéticamente se dividen generalmente en cuatro familias: (1) ácido, es decir, aspartato, glutamato; (2) básico, es decir, lisina, arginina, histidina; (3) no polar, es decir, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano y (4) polar no cargado, es decir, glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Fenilalanina, triptófano y tirosina se clasifican a veces conjuntamente como aminoácidos aromáticos. En general, la sustitución de aminoácidos únicos en estas familias no tiene un efecto importante sobre la actividad biológica. Los polipéptidos también pueden incluir una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, etc.) deleciones de aminoácidos únicos con respecto a las secuencias SEQ ID NO. Los polipéptidos también pueden incluir una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, etc.) inserciones (por ejemplo, cada una de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos) con respecto a las secuencias SEQ ID NO.

Del mismo modo, un polipéptido usado con la divulgación puede comprender una secuencia aminoacídica que:

(a) sea idéntica (es decir, un 100 % idéntica) a una secuencia desvelada en el listado de secuencias;

(b) comparta identidad de secuencia (por ejemplo, un 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con una secuencia desvelada en el listado de secuencias (idealmente sobre toda la longitud de dicha secuencia);

(c) tenga 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 (o más) alteraciones de aminoácidos únicos (deleciones, inserciones, sustituciones), que pueden estar en ubicaciones separadas o pueden ser contiguas, en comparación con las secuencias de (a) o (b); o

(d) cuando esté alineada con una secuencia particular del listado de secuencias usando un algoritmo de alineación por pares, cada ventana móvil de x aminoácidos desde el extremo N al extremo C (de tal manera que para una alineación que se extiende a p aminoácidos, donde p>x, hay p-x+1 de dichas ventanas) tiene al menos x y aminoácidos alineados idénticos, donde: x se selecciona de 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200; y se selecciona de 0,50, 0,60, 0,70, 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, 0,91, 0,92, 0,93, 0,94, 0,95, 0,96, 0,97, 0,98, 0,99; y si x y no es un número entero, entonces se redondea al número entero más próximo. El algoritmo de alineación por pares preferente es el algoritmo de alineación global de Needleman-Wunsch [25], que usa parámetros predeterminados (por ejemplo, con penalización por abertura de hueco = 10,0 y con penalización por extensión de hueco = 0,5, que usa la matriz de puntuación EBLOSUM62). Este algoritmo está convenientemente implementado en la herramienta needle en el paquete EMBOSS [26].

Si se usan polipéptidos híbridos, los antígenos individuales en el híbrido (es decir, fracciones -X- individuales) pueden ser de una o más cepas. Si n=2, por ejemplo, X2 puede ser de la misma cepa que X1 o de una cepa diferente. Si n=3, las cepas pueden ser (i) X-i=X2=X3 (ii) X-FX2/X3, (iii) X-|/X2=X3 (iv) X1/X2/X3 o (v) X-FX3/X2, etc.

En el grupo (c), las deleciones o sustituciones pueden ser en el extremo N y/o extremo C, o pueden estar entre los dos extremos. De esta manera, un truncamiento es un ejemplo de una deleción. Los truncamientos pueden implicar la deleción de hasta 40 (o más) aminoácidos en el extremo N y/o extremo C. El truncamiento en el extremo N puede eliminar péptidos líder, por ejemplo, para facilitar la expresión recombinante en un huésped heterógeno. El truncamiento en el extremo C puede eliminar las secuencias de anclaje, por ejemplo, para facilitar la expresión recombinante en un huésped heterógeno.

En general, cuando un antígeno comprende una secuencia que no es idéntica a una secuencia de S. aureus completa del listado de secuencias (por ejemplo, cuando comprende un listado de secuencias con < 100% de identidad de secuencia con la misma, o cuando comprende un fragmento de la misma), es preferente en cada caso individual que el antígeno pueda inducir un anticuerpo que reconozca la secuencia de S. aureus completa respectiva.

Polipéptidos usados con la invención

Los polipéptidos usados con la invención pueden adoptar diversas formas (por ejemplo, natural, fusiones, glucosilada, no glucosilada, lipidada, no lipidada, fosforilada, no fosforilada, miristoilada, no miristoilada, monomérica, multimérica, etc.).

Los polipéptidos usados con la invención se pueden preparar mediante diversos medios (por ejemplo, expresión recombinante, purificación a partir de cultivo celular, síntesis química, etc.). Son preferentes las proteínas expresadas de manera recombinante, particularmente para polipéptidos híbridos.

Los polipéptidos usados con la invención se proporcionan preferentemente en forma purificada o sustancialmente purificada, es decir, sustancialmente libres de otros polipéptidos (por ejemplo, libres de polipéptidos naturales), particularmente de otros polipéptidos de células huésped o estafilocócicos, y que son generalmente al menos aproximadamente un 50 % puros (en peso), y habitualmente al menos aproximadamente un 90 % puros, es decir, menos de aproximadamente un 50 %, y más preferentemente menos de aproximadamente un 10 % (por ejemplo, un 5 %) de una composición hecha de otros polipéptidos expresados. De esta manera, los antígenos en las composiciones se separan de todo el organismo con el que se expresa la molécula.

El término "polipéptido" se refiere a polímeros aminoacídicos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados y se puede interrumpir por no aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero aminoacídico que se ha modificado de manera natural o mediante intervención; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glucosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, como la conjugación con un componente de marcaje. Por ejemplo, también se incluyen polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Se pueden producir polipéptidos como cadenas únicas o cadenas asociadas.

Aunque la expresión de los polipéptidos de la invención puede tener lugar en una Staphylococcus, la invención usa habitualmente un huésped heterógeno para la expresión (expresión recombinante). El huésped heterógeno puede ser procariota (por ejemplo, una bacteria) o eucariota. Puede ser E. coli, pero otros huéspedes adecuados incluyen Bacillus subtilis, Vibrio cholerae, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Neisseria lactamica, Neisseria cinerea, Mycobacteria (por ejemplo, M. tuberculosis), levaduras, etc. En comparación con los genes de S. aureus natural, que codifican polipéptidos de la invención, es útil cambiar codones para optimizar la eficiencia de la expresión en dichos huéspedes sin afectar a los aminoácidos codificados.

Adyuvantes

Como se menciona anteriormente, las composiciones inmunogénicas usadas de acuerdo con la invención pueden incluir uno o más adyuvantes. Los adyuvantes que se pueden usar con la invención incluyen, pero no se limitan a: A. Composiciones que contienen minerales

Las composiciones que contienen minerales adecuadas para uso como adyuvantes en la invención incluyen sales minerales, tales como sales de aluminio y sales de calcio (o mezclas de las mismas). Las sales de calcio incluyen fosfato de calcio (por ejemplo, las partículas de "CAP" desveladas en la ref. 27). Las sales de aluminio incluyen hidróxidos y fosfatos etc., adoptando las sales cualquier forma adecuada (por ejemplo, de gel, cristalina, amorfa, etc.). Es preferente la adsorción en estas sales (por ejemplo, se pueden adsorber todos los antígenos). Las composiciones que contienen minerales también se pueden formular como una partícula de sal de metal [28].

Se pueden usar los adyuvantes conocidos como hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio. Estos nombres son convencionales, pero se usan únicamente por conveniencia, puesto que ninguno es una descripción precisa del compuesto químico real que está presente (por ejemplo, véase el capítulo 9 de la referencia 29). Las composiciones de la invención pueden usar cualquiera de los adyuvantes de “hidróxido” o “fosfato” que son de uso general como adyuvantes. Los adyuvantes conocidos como "hidróxido de aluminio" son típicamente sales de oxihidróxido de aluminio, que son habitualmente al menos parcialmente cristalinas. Los adyuvantes conocidos como "fosfato de aluminio" son típicamente hidroxifosfatos de aluminio, que a menudo también contienen una pequeña cantidad de sulfato (es decir, sulfato de hidroxifosfato de aluminio). Se pueden obtener mediante precipitación, y las condiciones de reacción y las concentraciones durante la precipitación influyen en el grado de sustitución de fosfato con hidroxilo en la sal.

Una morfología fibrosa (por ejemplo, como se observa en micrografías electrónicas de transmisión) es típica para los adyuvantes de hidróxido de aluminio. El pI de los adyuvantes de hidróxido de aluminio es típicamente de aproximadamente 11, es decir, el adyuvante de por sí tiene una carga superficial positiva a pH fisiológico. Se han señalado capacidades de adsorción de entre 1,8-2,6 mg de proteína por mg de Al+++ a pH 7,4 para adyuvantes de hidróxido de aluminio.

Los adyuvantes de fosfato de aluminio tienen generalmente una proporción molar PO^Al de entre 0,3 y 1,2, preferentemente de entre 0,8 y 1,2, y más preferentemente de 0,95+0,1. El fosfato de aluminio es generalmente amorfo, particularmente para las sales de hidroxifosfato. Un adyuvante típico es hidroxifosfato de aluminio amorfo con una proporción molar PO^Al de entre 0,84 y 0,92, incluida a 0,6 mg de Al3+/ml. El fosfato de aluminio está generalmente particulado (por ejemplo, morfología similar a placa, como como se observa en micrografías electrónicas de transmisión). Los diámetros típicos de las partículas están en el intervalo de 0,5-20 pm (por ejemplo, de aproximadamente 5-10 pm) después de cualquier adsorción de antígeno. Se han señalado capacidades de adsorción de entre 0,7-1,5 mg de proteína por mg de Al+++ a pH 7,4 para adyuvantes de fosfato de aluminio.

El punto de carga cero (PZC) del fosfato de aluminio está relacionado inversamente con el grado de sustitución de fosfato con hidroxilo, y este grado de sustitución puede variar dependiendo de las condiciones de reacción y concentración de los reactivos usados para preparar la sal mediante precipitación. El PZC también se altera al cambiar la concentración de iones fosfato libres en solución (más fosfato = PZC más ácido) o al añadir un tampón, tal como un tampón histidina (hace el PZC más básico). Los fosfatos de aluminio usados de acuerdo con la divulgación tienen generalmente un PZC de entre 4,0 y 7,0, más preferentemente de entre 5,0 y 6,5, por ejemplo, de aproximadamente 5,7.

Las suspensiones de sales de aluminio usadas para preparar las composiciones de la invención pueden contener un tampón (por ejemplo, un fosfato o una histidina o un tampón Tris), pero esto no siempre es necesario. Las suspensiones son preferentemente estériles y libres de pirógenos. Una suspensión puede incluir iones fosfato acuosos libres, por ejemplo, presentes en una concentración entre 1,0 y 20 mM, preferentemente entre 5 y 15 mM, y más preferentemente de aproximadamente 10 mM. Las suspensiones también pueden comprender cloruro de sodio.

Las composiciones de la invención pueden usar una mezcla tanto de un hidróxido de aluminio como de un fosfato de aluminio. En este caso, puede haber más fosfato de aluminio que hidróxido, por ejemplo, una proporción en peso de al menos 2:1, por ejemplo, >5:1, >6:1, >7:1, > 8:1, > 9:1, etc.

La concentración de Al+++ en una composición para su administración a un paciente es preferentemente menos de 10 mg/ml, por ejemplo, <_5 mg/ml, <_4 mg/ml, < 3 mg/ml, < 2 mg/ml, < 1 mg/ml, etc. Un intervalo preferente está entre 0,3 y 1 mg/ml. Es preferente un máximo de 0,85 mg/dosis.

B. Emulsiones de aceite en agua

Las composiciones de emulsiones de aceite en agua adecuadas para su uso como adyuvantes en las composiciones de la invención incluyen emulsiones de escualeno en agua, tales como MF59 (véase el capítulo 10 de la ref. 29; véase también la ref. 30) y AS03 [31].

Se conocen diversos adyuvantes de emulsiones de aceite en agua e incluyen típicamente al menos un aceite y al menos un tensioactivo, siendo el/los aceite(s) y tensioactivo(s) biodegradable(s) (metabolizable(s)) y biocompatible(s). La emulsión incluye gotitas de aceite submicrométricas, y son preferentes las emulsiones con gotitas que tienen un diámetro de menos de 220 nm, puesto que se pueden someter a esterilización por filtrado.

La emulsión comprende uno o más aceites. El/los aceite(s) adecuado(s) incluye(n), por ejemplo, los de un animal (tal como pescado) o una fuente vegetal. El aceite es idealmente biodegradable (metabolizable) y biocompatible. Las fuentes de aceites vegetales incluyen frutos secos, semillas y granos. El aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite de coco y aceite de oliva, los más comúnmente disponibles, ejemplifican los aceites de frutos secos. Se puede usar aceite de jojoba, por ejemplo, obtenido de la semilla de jojoba. Los aceites de semillas incluyen el aceite de cártamo, aceite de semilla de algodón, aceite de semilla de girasol, aceite de semilla de sésamo y similares. En el grupo de los granos, el aceite de maíz es el más fácilmente disponible, pero también se puede usar el aceite de otros granos de cereales, tales como trigo, avena, centeno, arroz, tef, triticale y similares. Los ésteres de ácidos grasos de 6-10 carbonos de glicerol y 1,2-propanodiol, aunque no se producen de manera natural en los aceites de semillas, se pueden preparar mediante hidrólisis, separación y esterificación de los materiales apropiados a partir de los aceites de frutos secos y semillas. Las grasas y aceites de la leche de mamífero son metabolizables y, de este modo, se pueden usar. Los procedimientos para la separación, purificación, saponificación y otros medios necesarios para obtener aceites puros a partir de fuentes animales se conocen bien en la técnica.

La mayoría de los peces contienen aceites metabolizables que se pueden recuperar fácilmente. Por ejemplo, el aceite de hígado de bacalao, los aceites de hígado de tiburón y el aceite de ballena, tal como esperma de ballena, ejemplifican varios de los aceites de pescado que se pueden usar en el presente documento. Una serie de aceites de cadena ramificada se sintetizan bioquímicamente en unidades de isopreno de 5 carbonos y se denominan generalmente terpenoides. Las emulsiones preferentes comprenden escualeno, un aceite de hígado de tiburón que es un terpenoide insaturado ramificado. También se puede usar escualano, el análogo saturado del escualeno. Los aceites de pescado, incluyendo escualeno y escualano, están disponibles fácilmente a partir de fuentes comerciales o se pueden obtener mediante procedimientos conocidos en la técnica.

Otros aceites útiles son los tocoferoles, particularmente en combinación con escualeno. Cuando la fase oleosa de una emulsión incluye un tocoferol, se puede usar cualquiera de los tocoferoles a, p, y, 6, £ o £, pero son preferentes los a-tocoferoles. Se pueden usar ambos D-a-tocoferol y DL-a-tocoferol. Un a-tocoferol preferente es DL-a-tocoferol. Se puede usar una combinación oleosa que comprenda escualeno y un tocoferol (por ejemplo, DL-a-tocoferol).

El aceite en la emulsión puede comprender una combinación de aceites, por ejemplo, escualeno y al menos otro aceite.

El componente acuoso de la emulsión puede ser agua corriente (por ejemplo, a.p.i.) o puede incluir componentes adicionales, por ejemplo, solutos. Por ejemplo, puede incluir sales para formar un tampón, por ejemplo, sales de citrato o fosfato, tales como sales de sodio. Los tampones típicos incluyen: un tampón fosfato; un tampón Tris; un tampón borato; un tampón succinato; un tampón histidina; o un tampón citrato. Es preferente una fase acuosa tamponada, y los tampones se incluyen típicamente en el intervalo de 5-20 mM.

Además del aceite y lípido catiónico, una emulsión puede incluir un tensioactivo no iónico y/o un tensioactivo de ion dipolar. Dichos tensioactivos incluyen, pero no se limitan a: los tensioactivos de ésteres de sorbitán polioxietilenado (comúnmente denominados los Tween), especialmente polisorbato 20 y polisorbato 80; copolímeros de óxido de etileno (OE), óxido de propileno (OP) y/o óxido de butileno (OB), en venta con el nombre comercial DOWFAX™, tales como copolímeros de bloque de OE/Op lineales; octoxinoles, que pueden variar en el número de grupos etoxi (oxi-1,2-etanodiilo) de repetición, siendo octoxinol-9 (Tritón X-100 o t-octilfenoxipolietoxietanol) de interés particular; (octilfenoxi)polietoxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfolípidos, tales como fosfatidilcolina (lecitina); éteres grasos polioxietilenados derivados de los alcoholes laúrico, cetílico, estearílico y oleílico (conocidos como tensioactivos de Brij), tales como trietilenglicol monolauril éter (Brij 30); polioxietilen-9-lauril éter; y ésteres de sorbitán (comúnmente conocidos como los Spans), tales como trioleato de sorbitán (Span 85) y monolaurato de sorbitán. Los tensioactivos preferentes para incluirse en la emulsión son polisorbato 80 (Tween 80; monooleato de sorbitán polioxietilenado), Span 85 (trioleato de sorbitán), lecitina y Tritón X-100.

Se pueden usar mezclas de tensioactivos, por ejemplo, mezclas de Tween 80/Span 85 o mezclas de Tween 80/Tritón-X100. También es adecuada una combinación de un éster de sorbitán polioxietilenado, tal como monooleato de sorbitán polioxietilenado (Tween 80), y un octoxinol, tal como t-octilfenoxi-polietoxietanol (Tritón X-100). Otra combinación útil comprende laureth 9 más un éster de sorbitán polioxietilenado y/o un octoxinol. Las mezclas útiles pueden comprender un tensioactivo con un valor de EHL en el intervalo de 10-20 (por ejemplo, polisorbato 80, con un EHL de 15,0) y un tensioactivo con un valor de EHL en el intervalo de 1-10 (por ejemplo, trioleato de sorbitán, con un EHL de 1,8).

Las cantidades preferentes de aceite (% en volumen) en la emulsión final están entre un 2-20 %, por ejemplo, un 5­ 15 %, 6-14 %, 7-13 %, 8-12 %. Es particularmente útil un contenido en escualeno de aproximadamente un 4-6 % o de aproximadamente un 9-11 %.

Las cantidades preferentes de tensioactivos (% en peso) en la emulsión final están entre un 0,001 % y un 8 %. Por ejemplo: ésteres de sorbitán polioxietilenado (tales como polisorbato 80) de un 0,2 a un 4 %, en particular entre un 0,4-0,6 %, entre un 0,45-0,55 %, de aproximadamente un 0,5 % o entre un 1,5-2 %, entre un 1,8-2,2 %, entre un 1,9­ 2,1 %, de aproximadamente un 2 %, o un 0,85-0,95 %, o se aproximadamente un 1 %; ésteres de sorbitán (tales como trioleato de sorbitán) de un 0,02 a un 2 %, en particular de aproximadamente un 0,5 % o de aproximadamente un 1 %; octil- o nonilfenoxi polioxietanoles (tales como Tritón X-100) de un 0,001 a un 0,1 %, en particular un 0,005-0,02 %; éteres de polioxietileno (tales como laureth 9) de un 0,1 a un 8 %, preferentemente de un 0,1 a un 10 % y en particular de un 0,1 a un 1 % o de aproximadamente 0,5 %.

Las cantidades absolutas de aceite y tensioactivo, y su proporción, se pueden variar en amplios límites, mientras que todavía se forma una emulsión. Un experto en la técnica puede variar fácilmente las proporciones relativas de los componentes para obtener una emulsión deseada, pero es típica una proporción en peso de entre 4:1 y 5:1 para el aceite y el tensioactivo (exceso de aceite).

Un parámetro importante para garantizar la actividad inmunoestimulante de una emulsión, particularmente en animales grandes, es el tamaño de gotita de aceite (diámetro). Las emulsiones más eficaces tienen un tamaño de gotita en el intervalo submicrométrico. Adecuadamente, los tamaños de gotita están en el intervalo 50-750 nm. Con más utilidad, el tamaño de gotita promedio es menos de 250 nm, por ejemplo, menos de 200 nm, menos de 150 nm. Con utilidad, el tamaño de gotita promedio está en el intervalo de 80-180 nm. Idealmente, al menos un 80 % (en número) de las gotitas de aceite de la emulsión son de menos de 250 nm de diámetro, y preferentemente al menos un 90 %. Se pueden conseguir convenientemente estos tamaños de gotita mediante técnicas, tales como microfluidización. Los aparatos para determinar el tamaño de gotita promedio en una emulsión y la distribución de tamaños están disponibles comercialmente. Estos usan típicamente las técnicas de dispersión dinámica de la luz y/o detección óptica de partículas individuales, por ejemplo, las series de instrumentos Accusizer™ y Nicomp™ disponibles de Particle Sizing Systems (Santa Barbara, EE. UU.), o los instrumentos Zetasizer™ de Malvern Instruments (Reino Unido), o los instrumentos de analizadores de distribución de tamaños de partícula de Horiba (Kyoto, Japón).

Idealmente, la distribución de tamaños de gotita (en número) tiene únicamente un máximo, es decir, hay una población única de gotitas distribuidas alrededor de un promedio (moda), en lugar de tener dos máximos. Las emulsiones preferentes tienen una polidispersidad de < 0,4, por ejemplo, 0,3, 0,2, o menos.

Los adyuvantes de emulsiones de aceite en agua específicos útiles con la invención incluyen, pero no se limitan a:

• Una emulsión submicrométrica de escualeno, Tween 80 y Span 85. La composición de la emulsión en volumen puede ser de aproximadamente un 5 % de escualeno, de aproximadamente un 0,5 % de polisorbato 80 y de aproximadamente un 0,5 % de Span 85. En términos de peso, estas proporciones se convierten en un 4,3 % de escualeno, un 0,5 % de polisorbato 80 y un 0,48 % de Span 85. Este adyuvante se conoce como 'MF59' [32-33 34], como se describe en más detalle en el capítulo 10 de la ref. 35 y el capítulo 12 de la ref.36. La emulsión MF59 incluye ventajosamente iones citrato, por ejemplo, tampón citrato de sodio 10 mM.

• Una emulsión que comprende escualeno, un tocoferol y polisorbato 80. La emulsión puede incluir solución salina tamponada con fosfato. Estas emulsiones pueden tener en volumen desde un 2 a un 10 % de escualeno, desde un 2 a un 10% de tocoferol y desde un 0,3 a un 3% de polisorbato 80, y la proporción en peso de escualeno:tocoferol es preferentemente < 1 (por ejemplo, 0,90), puesto que esto puede proporcionar una emulsión más estable. El escualeno y el polisorbato 80 pueden estar presentes en una proporción en volumen de aproximadamente 5:2 o en una proporción en peso de aproximadamente 11:5. De esta manera, los tres componentes (escualeno, tocoferol, polisorbato 80) pueden estar presentes en una proporción en peso de 1068:1186:485 o alrededor de 55:61:25. Una de dichas emulsiones ('AS03') se puede hacer disolviendo Tween 80 en PBS para dar una solución al 2 %, a continuación, mezclando 90 ml de esta solución con una mezcla de (5 g de DL a tocoferol y 5 ml de escualeno), a continuación, microfluidizando la mezcla. La emulsión resultante puede tener gotitas de aceite submicrométricas, por ejemplo, con un diámetro promedio de entre 100 y 250 nm, preferentemente de aproximadamente 180 nm. La emulsión también puede incluir un monofosforil lípido A 3-de-O-acilado (3d MPL). Otra emulsión útil de este tipo puede comprender, por dosis en seres humanos, 0,5-10 mg de escualeno, 0,5-11 mg de tocoferol y 0,1-4 mg de polisorbato 80 [37], por ejemplo, en las proporciones analizadas anteriormente.

• Una emulsión de escualeno, un tocoferol y un detergente Tritón (por ejemplo, Tritón X-100). La emulsión también puede incluir un 3d-MPL (véase a continuación). La emulsión puede contener un tampón fosfato.

• Una emulsión que comprende un polisorbato (por ejemplo, polisorbato 80), un detergente Tritón (por ejemplo, Tritón X-100) y un tocoferol (por ejemplo, un succinato de a-tocoferol). La emulsión puede incluir estos tres componentes en una proporción en masa de aproximadamente 75:11:10 (por ejemplo, 750 pg/ml de polisorbato 80, 110 pg/ml de Tritón X-100 y 100 pg/ml de succinato de a-tocoferol), y estas concentraciones deberían incluir cualquier contribución de estos componentes de los antígenos. La emulsión también puede incluir escualeno. La emulsión también puede incluir un 3d-MPL (véase a continuación). La fase acuosa puede contener un tampón fosfato.

• Una emulsión de escualeno, polisorbato 80 y poloxámero 401 (“Pluronic™ L121”). La emulsión se puede formular en solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4. Esta emulsión es un vehículo de administración útil para dipéptidos de muramilo, y se ha usado con treonil-MDP en el adyuvante “SAF-1” [38] (un 0,05-1 % de Thr-MDP, un 5 % de escualeno, un 2,5 % de Pluronic L121 y un 0,2 % de polisorbato 80). También se puede usar sin el Thr-MDP, como en el adyuvante “AF” [39] (un 5% de escualano, un 1,25% de Pluronic L121 y un 0,2% de polisorbato 80). Es preferente la microfluidización.

• Una emulsión que comprende escualeno, un disolvente acuoso, un tensioactivo no iónico hidrófilo de polioxietilen alquil éter (por ejemplo, polioxietilen (12) cetoestearil éter) y un tensioactivo no iónico hidrófobo (por ejemplo, un éster de sorbitán o éster de manida, tal como monooleato de sorbitán o Span 80'). La emulsión es preferentemente termorreversible y/o tiene al menos un 90 % de las gotitas de aceite (en volumen) con un tamaño de menos de 200 nm [40]. La emulsión también puede incluir uno o más de: alditol; un agente crioprotector (por ejemplo, un azúcar, tal como dodecilmaltósido y/o sacarosa); y/o un alquilpoliglucósido. La emulsión puede incluir un agonista de TLR4 [41]. Dichas emulsiones se pueden liofilizar.

• Una emulsión de escualeno, poloxámero 105 y Abil-Care [42]. La concentración final (peso) de estos componentes en vacunas adyuvadas es de un 5 % de escualeno, un 4 % de poloxámero 105 (poliol de pluronic) y un 2 % de Abil-Care 85 (Bis-PEG/PPG-16/16 PEG/PPG-16/16 dimeticona; triglicérido cáprico/caprílico).

• Una emulsión que tiene desde un 0,5-50% de un aceite, un 0,1-10% de un fosfolípido y un 0,05-5% de un tensioactivo no iónico. Como se describe en la referencia 43, los componentes fosfolipídicos preferentes son fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosfatidilglicerol, ácido fosfatídico, esfingomielina y cardiolipina. Son ventajosos los tamaños de gotita submicrométrica.

• Una emulsión de aceite en agua submicrométrica de un aceite no metabolizable (tal como aceite mineral ligero) y al menos un tensioactivo (tal como lecitina, Tween 80 o Span 80). Se pueden incluir aditivos, tales como saponina QuilA, colesterol, un conjugado de saponina-lipófilo (tal como GPI-0100, descrito en la referencia 44, producido mediante adición de amina alifática a desacilsaponina por medio del grupo carboxilo del ácido glucurónico), bromuro de dimetil-dioctadecil-amonio y/o N,N-dioctadecil-N,N-bis(2-hidroxietil)propanodiamina.

• Una emulsión en la que una saponina (por ejemplo, QuilA o QS21) y un esterol (por ejemplo, un colesterol) se asocian como micelas helicoidales [45].

• Una emulsión que comprende un aceite mineral, un alcohol graso etoxilado lipófilo no iónico y un tensioactivo hidrófilo no iónico (por ejemplo, un alcohol graso etoxilado y/o copolímero de bloque de polioxietilenopolioxipropileno)[46].

• Una emulsión que comprende un aceite mineral, un alcohol graso etoxilado hidrófilo no iónico, y un tensioactivo lipófilo no iónico (por ejemplo, un alcohol graso etoxilado y/o copolímero de bloque de polioxietilenopolioxipropileno) [46].

En algunos modos de realización, se puede mezclar en el momento una emulsión con el/los antígeno(s), en el momento de administración, y, de esta manera, el adyuvante y el/los antígeno(s) se puede(n) mantener por separado en una vacuna distribuida o envasada, lista para la formulación final en el momento de su uso. En otros modos de realización, se mezcla una emulsión con el antígeno durante la fabricación, y, de esta manera, la composición se envasa en una forma adyuvada líquida. El antígeno está generalmente en forma acuosa, de tal manera que la vacuna se prepara finalmente mezclando dos líquidos. La proporción en volumen de los dos líquidos para mezclar puede variar (por ejemplo, entre 5:1 y 1:5), pero es generalmente de aproximadamente 1:1. Cuando las concentraciones de los componentes se dan en las descripciones anteriores de emulsiones específicas, estas concentraciones son típicamente para una composición sin diluir, y la concentración después de la mezcla con una solución de antígeno, de esta manera, disminuye.

C. Formulaciones de saponina [capítulo 22 de la ref.29]

También se pueden usar formulaciones de saponina como adyuvantes en las composiciones de la invención. Las saponinas son un grupo heterogéneo de glucósidos de esterol y glucósidos de triterpenoides que se encuentran en la corteza, hojas, tallos, raíces e incluso flores de una amplia gama de especies de plantas. La saponina de la corteza del árbol de Quillaia saponaria Molina se ha estudiado ampliamente como adyuvante. La saponina también se puede obtener comercialmente a partir de Smilax ornata (sarsaprilla), Gypsophilla paniculata (velo de novia) y Saponaria officianalis (hierba jabonera). Las formulaciones de adyuvante de saponina incluyen formulaciones purificadas, tales como QS21, así como formulaciones lipídicas, tales como ISCOM. La QS21 se comercializa como Stimulon™.

Las composiciones de saponina se han purificado usando HPLC y RP-HPLC. Las fracciones purificadas específicas ^{que usan estas técnicas se han identificado, incluyendo QS7, QS17, QS18, QS21,} Qh-A, ^{QH-B y QH-C.} Preferentemente, la saponina es QS21. Un procedimiento de producción de QS21 se desvela en la ref. 47. Las formulaciones de saponina también pueden comprender un esterol, tal como colesterol [48].

También se pueden usar combinaciones de saponinas y colesteroles para formar partículas denominadas ISCOM (capítulo 23 de la ref. 29). Los ISCOM también incluyen típicamente un fosfolípido, tal como fosfatidiletanolamina o fosfatidilcolina. Se puede usar cualquier saponina conocida en los ISCOM. Preferentemente, el ISCOM incluye una o más de QuilA, QHA y QHC. Los ISCOM se describen adicionalmente en las refs. 48-4950. Opcionalmente, los ISCOM pueden estar desprovistos de detergentes adicionales [51].

Una revisión del desarrollo de los adyuvantes basados en saponina se puede encontrar en las refs. 52 y 53.

D. Derivados bacterianos o microbianos

Los adyuvantes adecuados para su uso en las composiciones de la invención incluyen derivados bacterianos o microbianos, tales como derivados no tóxicos de lipopolisacárido (LPS) enterobacteriano, derivados del lípido A, oligonucleótidos inmunoestimulantes y toxinas de ADP-ribosilación y derivados destoxificados de las mismas.

Los derivados no tóxicos de LPS incluyen monofosforil lípido A (MPL) y MPL 3-O-desacilado (3dMPL). El 3dMPL es una mezcla de monofosforil lípido A 3-de-O-acilado con 4, 5 o 6 cadenas aciladas. Se describe una forma de "partícula pequeña" preferente de monofosforil lípido A 3-de-O-acilado en la ref. 54. Dichas "partículas pequeñas" de 3dMPL son lo suficientemente pequeñas como para filtrarse de manera estéril a través de una membrana 0,22 pm [54]. Otros derivados de LPS no tóxicos incluyen miméticos de monofosforil lípido A, tales como derivados de fosfato de aminoalquilglucosaminida, por ejemplo, RC-529 (véase a continuación).

Los derivados de lípido A incluyen derivados de lípido A de Escherichia coli, tales como OM-174. Por ejemplo, se describe OM-174 en las refs. 55 y 56.

Los oligonucleótidos inmunoestimulantes adecuados para su uso como adyuvantes en las composiciones de la invención incluyen secuencias nucleotídicas que contienen un motivo CpG (una secuencia dinucleotídica que contiene una citosina no metilada enlazada mediante un enlace fosfato a una guanosina). Los ARN bicatenarios y los oligonucleótidos que contienen secuencias palindrómicas o poli(dG) también han demostrado ser inmunoestimulantes.

Los CpG pueden incluir análogos/modificaciones nucleotídicas, tales como modificaciones de fosforotioato, y pueden ser bicatenarios o monocatenarios. Las referencias 57, 58 y 59 desvelan posibles sustituciones de análogos, por ejemplo, el reemplazo de guanosina por 2'-desoxi-7-desazaguanosina. El efecto adyuvante de los oligonucleótidos con CpG se analiza adicionalmente en las refs. 60-61 62636465.

La secuencia de CpG se puede dirigir a TLR9, tal como el motivo GTCGTT o TTCGTT [28]. La secuencia de CpG puede ser específica para inducir una respuesta inmunitaria Th1, tal como un ODN con CpG-A, o puede ser más específica para inducir una respuesta de linfocitos B, tal como un ODN con CpG-B. Los ODN con CpG-A y CpG-B se analizan en las refs. 67-6869. Preferentemente, el CpG es un ODN con CpG-A.

Preferentemente, el oligonucleótido con CpG se construye de modo que el extremo 5' sea accesible para el reconocimiento del receptor. Opcionalmente, se pueden unir dos secuencias oligonucleotídicas con CpG en sus extremos 3' para formar "inmunómeros". Por ejemplo, véanse las refs. 66 y 70-71 72.

Un adyuvante con CpG útil es CpG7909, también conocido como ProMune™ (Coley Pharmaceutical Group, Inc.). Otro es CpG1826. Como alternativa a, o además de, usar secuencias de CpG, se pueden usar secuencias de TpG [73], y estos oligonucleótidos pueden estar libres de motivos CpG no metilados. El oligonucleótido inmunoestimulante puede ser rico en pirimidina. Por ejemplo, puede comprender más de un nucleótido de timidina consecutivo (por ejemplo, TTTT, como se desvela en la ref. 73), y/o puede tener una composición nucleotídica con > 25 % de timidina (por ejemplo, > 35 %, > 40 %, > 50 %, > 60 %, > 80 %, etc.). Por ejemplo, puede comprender más de un nucleótido de citosina consecutivo (por ejemplo, CCCC, como se desvela en la ref. 73), y/o puede tener una composición nucleotídica con > 25 % de citosina (por ejemplo, > 35 %, > 40 %, > 50 %, > 60 %, > 80 %, etc.). Estos oligonucleótidos pueden estar libres de motivos CpG no metilados. Los oligonucleótidos inmunoestimulantes típicamente comprenden al menos 20 nucleótidos. Pueden comprender menos de 100 nucleótidos.

Un adyuvante particularmente útil basado en torno a los oligonucleótidos inmunoestimulantes se conoce como IC-31™ [74]. De esta manera, un adyuvante usado con la invención puede comprender una mezcla de (i) un oligonucleótido (por ejemplo, de entre 15-40 nucleótidos) que incluya al menos un (y preferentemente múltiples) motivo(s) Cpl (es decir, una citosina enlazada a una inosina para formar un dinucleótido) y (ii) un polímero policatiónico, tal como un oligopéptido (por ejemplo, de entre 5-20 aminoácidos), que incluya al menos una (y preferentemente múltiples) secuencia(s) de tripéptidos Lys-Arg-Lys. El oligonucleótido puede ser un desoxinucleótido que comprenda la secuencia 26-mérica 5'-(IC)¹³-3' (SEQ ID NO: 41). El polímero policatiónico puede ser un péptido que comprenda la secuencia aminoacídica 11-mérica KLKLLLLLKLK (s Eq ID NO: 42). El oligonucleótido y el polímero pueden formar complejos, por ejemplo, como se desvela en las referencias 75 y 76.

Se pueden usar toxinas de ADP-ribosilación bacterianas y derivados destoxificados de las mismas como adyuvantes en las composiciones de la invención. Preferentemente, la proteína deriva de E.coli (enterotoxina termolábil de E.coli “LT”), cólera (“CT”) o tosferina ("PT"). Se describe el uso de toxinas de ADP-ribosilación destoxificadas como adyuvantes mucosal en la ref. 77 y como adyuvantes parenterales en la ref. 78. La toxina o el toxoide está preferentemente en forma de una holotoxina, que comprende ambas subunidades A y B. Preferentemente, la subunidad A contiene una mutación destoxificante; preferentemente la subunidad B no está mutada. Preferentemente, el adyuvante es un mutante de LT destoxificada, tal como LT-K63, LT-R72 y LT-G192. El uso de toxinas de ADP-ribosilación y derivados destoxificados de las mismas, particularmente LT-K63 y LT-R72, como adyuvantes se puede encontrar en las refs. 79-80 81 8283848586. Un mutante de CT útil es CT-E29H [87]. La referencia numérica para las sustituciones de aminoácidos se basa preferentemente en las alineaciones de las subunidades A y B de las toxinas de ADP-ribosilación expuestas en la ref. 88, incorporadas específicamente en el presente documento por referencia en su totalidad.

E. Agonistas de TLR

Las composiciones pueden incluir un agonista de TLR, es decir, un compuesto que puede actuar como agonista de un receptor de tipo Toll. Lo más preferentemente, un agonista de TLR es un agonista de un TLR humano. El agonista de TLR puede activar cualquiera de TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9 o TLR11; preferentemente puede activar el TLR4 humano o el TLR7 humano.

Se puede determinar la actividad agonista de un compuesto frente a cualquier receptor de tipo Toll particular mediante ensayos estándar. Las compañías, tales como Imgenex and Invivogen, suministran líneas celulares que están establemente cotransfectadas con NFkB y genes de TLR humanos, más genes indicadores adecuados, para medir las vías de activación de TLR. Están diseñados para la sensibilidad, la dinámica en un amplio intervalo de trabajo y se pueden usar el cribado ultrarrápido. La expresión constitutiva de uno o dos TLR específicos es típica en dichas líneas celulares. Véase también la referencia 89. Se conocen muchos agonistas de TLR en la técnica, por ejemplo, la referencia 90 describe determinadas moléculas de lipopéptidos que son agonistas de TLR2, cada una de las referencias 91 a 92 93 94 describen clases de agonistas de pequeñas moléculas de TLR7 y las referencias 95 y 96 describen agonistas de TLR7 y TLR8 para el tratamiento de enfermedades.

Un agonista de TLR usado con la invención incluye idealmente al menos una fracción de adsorción. La inclusión de dichas fracciones en los agonistas de TLR les permite adsorberse en sales de aluminio insolubles (por ejemplo, mediante intercambio de ligandos o cualquier otro mecanismo adecuado) y mejora su comportamiento inmunológico [97]. Las fracciones de adsorción que contienen fósforo son particularmente útiles, y, de este modo, una fracción de adsorción puede comprender un fosfato, un fosfonato, un fosfinato, un fosfonito, un fosfinito, etc. Preferentemente, el agonista de TLR incluye al menos un grupo fosfonato.

De esta manera, en modos de realización preferentes, una composición incluye un agonista de TLR (más preferentemente un agonista de TLR7) que incluye un grupo fosfonato. Este grupo fosfonato puede permitir la adsorción del agonista en una sal de aluminio insoluble [97].

Los agonistas de TLR útiles con la invención pueden incluir una fracción de adsorción único, o pueden incluir más de un, por ejemplo, entre 2 y 15, fracciones de adsorción. Típicamente un compuesto incluye 1, 2 o 3 fracciones de adsorción.

Los agonistas de TLR que contienen fósforo útiles se pueden representar por la fórmula (A1):

en la que:

RX y RY se seleccionan independientemente de H y alquilo C1-C6;

X se selecciona de un enlace covalente, O y NH;

Y se selecciona de un enlace covalente, O, C(O), S y NH;

L es un enlazador seleccionado, por ejemplo, de alquileno C1-C6, alquenileno C1-C6, arileno, heteroarileno, alquilenoxi C1 -C6 y -((CH2)pO)q(CH2)p- cada uno sustituido opcionalmente con de 1 a 4 sustituyentes seleccionados ^{independientemente de halo,} Oh, ^{alquilo C1-C4, -OP(O)(oH)2 y -P(O)(OH)2 ;}

cada p se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4, 5 y 6;

q se selecciona de 1, 2, 3 y 4;

n se selecciona de 1, 2 y 3; y

A es una fracción de agonista de TLR.

En un modo de realización, el agonista de TLR de acuerdo con la fórmula (A1) es como sigue: RX y RY son H; X es O; L se selecciona de alquileno C1-C6 y -((CH2)pO)q(CH2)p- cada uno sustituido opcionalmente con de 1 a 2 átomos de halógeno; p se selecciona de 1, 2 y 3; q se selecciona de 1 y 2; y n es 1. De esta manera, en estos modos de realización, la fracción de adsorción comprende un grupo fosfato.

Se desvelan otros agonistas de TLR útiles de fórmula (A1) en las páginas 6-13 de la referencia 98.

Las composiciones pueden incluir un compuesto de imidazoquinolona, tal como imiquimod (“R-837”) [99, 100], resiquimod (“R-848”) [101] y sus análogos; y sales de los mismos (por ejemplo, las sales de clorhidrato). Se pueden encontrar detalles adicionales acerca de las imidazoquinolinas inmunoestimulantes en las referencias 102 a 103 104 105 106.

Las composiciones pueden incluir un agonista de TLR4 y lo más preferentemente un agonista de TLR4 humano. TLR4 se expresa mediante las células del sistema inmunitario innato, incluyendo los macrófagos y las células dendríticas convencionales [107]. La iniciación por medio del TLR4 desencadena una cascada de señalización que utiliza ambas vías dependientes de TRIF y MyD88, dando lugar a la activación de NF-kB e IRF3/7, respectivamente. La activación de TLR4 desencadena típicamente una intensa producción de IL-12p70 y potencia fuertemente las respuestas inmunitarias celulares y humorales Th1.

Se conocen en la técnica diversos agonistas de TLR4 útiles, muchos de los cuales son análogos de endotoxina o lipopolisacárido (LPS). Por ejemplo, el agonista de TLR4 puede ser 3d-MPL (es decir, monofosforil lípido A 3-de-O-desacilado; presente en el adyuvante 'AS04' de GSK, con detalles adicionales en las referencias 108 a 109110111), glucopiranosil lípido A (GLA) [112] o su sal de amonio; un fosfato de aminoalquilglucosaminida, tal como RC-529 o CRX-524 [113-114 115]; E5564 [116, 117]; o un compuesto de fórmula I, II o III como se define en la referencia 118, o una sal del mismo, tal como los compuestos ER 803058', 'ER 803732', 'ER 804053', 'ER 804058', 'ER 804059', 'ER 804442', 'ER 804680', 'ER 803022', 'ER 804764' o 'ER 804057' (también conocido como E6020).

La invención es útil cuando se usan los agonistas de TLR7 humano, tal como un compuesto de fórmula (K). Estos agonistas se analizan en detalle en la referencia 119:

en la que:

R¹ es H, alquilo C1-C6, -C(R⁵)2OH, -L¹R⁵ , -L¹R⁶ , -L²R⁵ , -L²R⁶ , -OL²R⁵ o -OL²R⁶ ;

L¹ es -C(O)- o -O-;

L² es alquileno C1-C6, alquenileno C2-C6, arileno, heteroarileno o -((CR⁴R⁴)pO)q(CH2)p-, en la que el alquileno C1 -C⁶ y alquenileno C2-C6 de L² se sustituyen opcionalmente con de 1 a 4 grupos fluoro;

cada L³ se selecciona independientemente de alquileno C1-C6 y -((CR⁴R⁴)pO)q(CH2)p-, en la que el alquileno C1-C6 de L³ se sustituye opcionalmente con de 1 a 4 grupos fluoro;

L⁴ es arileno o heteroarileno;

R² es H o alquilo C1-C6;

R³ se selecciona de alquilo C1 -C4, -L ³R⁵ , -L¹R⁵ , -L³R⁷ , -L³L⁴L³R⁷ , -L³L⁴R⁵, -L³L⁴L³R⁵ , -OL³R⁵, -OL³R⁷, -OL³L⁴R⁷, -OL³L⁴L³R⁷ , -OR⁸, -OL³L⁴R⁵, -OL³L⁴L³R⁵ y -C(R⁵)2OH;

cada R⁴ se selecciona independientemente de H y fluoro;

R⁵ es -P(O)(OR⁹)2,

R⁶ es -C F 2P(O)(OR⁹)2 o -C(O)OR¹⁰;

R⁷ es -C F 2P(O)(OR⁹)2 o -C(O)OR¹⁰;

R⁸ es H o alquilo C1-C4;

cada R⁹ se selecciona independientemente de H y alquilo C1 -C6;

R¹⁰ es H o alquilo C1 -C4;

cada p se selecciona independientemente de 1,2, 3, 4, 5 y 6, y

q es 1, 2, 3 o 4.

El compuesto de fórmula (K) es preferentemente de fórmula (K'):

en la que:

P¹ se selecciona de H, alquilo C1-C6 sustituido opcionalmente con COOH y -Y-L-X-P(O)(ORX )(ORY );

P² se selecciona de H, alquilo C1-C6, alcoxi C1-C6 y -Y-L-X-P(O)(ORX )(ORY );

con la condición de que al menos uno de P¹ y P² sea -Y-L-X-P(O)(ORX )(ORY );

RB se selecciona de H y alquilo C1-C6;

RX y RY se seleccionan independientemente de H y alquilo C1-C6;

X se selecciona de un enlace covalente, O y NH;

Y se selecciona de un enlace covalente, O, C(O), S y NH;

L se selecciona de un enlace covalente de alquileno C1-C6, alquenileno C1-C6, arileno, heteroarileno, alquilenoxi C1 -C6 y -((CH2)pO)q(CH2)p- cada uno sustituido opcionalmente con de 1 a 4 sustituyentes seleccionados independientemente de halo, OH, alquilo C1-C4, -OP(O)(OH)2 y -P(O)(OH)2;

cada p se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4, 5 y 6; y

q se selecciona de 1, 2, 3 y 4.

En algunos modos de realización de fórmula (K'): P ¹ se selecciona de alquilo C1 -C6 sustituido opcionalmente con COOH y -Y-L-X-P(O)(ORX )(ORY ); P² se selecciona de alcoxi C1 -C6 y -Y-L-X-P(O)(ORX )(ORY ); RB es alquilo C1-C6; X es un enlace covalente; L se selecciona de alquileno C1-C6 y -((CH2)pO)q(CH2)p- cada uno sustituido opcionalmente con de 1 a 4 sustituyentes seleccionados independientemente de halo, OH, C1-C4alkyl, -OP(O)(OH)2 and -P(O)(OH)2; cada p se selecciona independientemente de 1, 2 y 3; q se selecciona de 1 y 2.

Un compuesto preferente de fórmula (K) para su uso con la invención es ácido 3-(5-amino-2-(2-metil-4-(2-(2-(2-fosfonoetoxi)etoxi)etoxi)fenetil)benzo[f][1,7]naftiridin-8-il)propanoico, o compuesto 'K1':

Se puede usar este compuesto como base libre o en forma de una sal farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, una sal de arginina [120].

F. Micropartículas

También se pueden usar micropartículas como adyuvantes en las composiciones de la invención. Son preferentes las micropartículas (es decir, una partícula de ~ 100 nm a ~ 150 pm de diámetro, más preferentemente de ~ 200 nm a ~ 30 pm de diámetro y lo más preferentemente de ~ 500 nm a ~ 10 pm de diámetro) formadas a partir de materiales que son biodegradables y no tóxicos (por ejemplo, un poli(a-hidroxi ácido), un ácido polihidroxibutírico, un poliortoéster, un polianhídrido, una policaprolactona, etc.), con poli(láctido-co-glicólido), opcionalmente tratadas para que tengan una superficie cargada negativamente (por ejemplo, con SDS) o una superficie cargada positivamente (por ejemplo, con un detergente catiónico, tal como CTAB).

Combinaciones de adyuvantes

También se pueden incluir en las combinaciones los adyuvantes individuales enumerados anteriormente. Por ejemplo, se puede usar una combinación de un hidróxido de aluminio y un adyuvante de fosfato de aluminio. Del mismo modo, se puede usar una combinación de fosfato de aluminio y 3dMPL.

Una combinación de adyuvantes particularmente preferente es una sal de metal insoluble (por ejemplo, una sal de aluminio, tal como un hidróxido de aluminio) y un agonista de TLR (por ejemplo, un agonista de TLR7 humano, tal como el compuesto 'K1' identificado anteriormente), como se desvela en las referencias 5 y 97. De este modo, en particular, dicho adyuvante se selecciona del grupo que consiste en:

- sales de aluminio, particularmente hidróxidos de aluminio y fosfatos de aluminio;

- agonistas de TLR humano, particularmente agonistas de TLR7; y

- una mezcla de los mismos.

El agonista de TLR se adsorbe preferentemente en la sal de metal y el/los antígeno(s) de S. aureus también se pueden adsorber en la sal de metal.

Una composición que incluye un agonista de TLR de la divulgación adsorbido en una sal de metal también puede incluir un tampón (por ejemplo, un fosfato o una histidina o un tampón Tris). Sin embargo, cuando dicha composición incluye un tampón fosfato es preferente que la concentración de iones fosfato en el tampón sea de menos de 50 mM, por ejemplo, < 40 mM, < 30 mM, < 20 mM, < 10 mM o < 5 mM o entre 1-15 mM. Es preferente un tampón histidina, por ejemplo, de entre 1-50 mM, de entre 5-25 mM o de aproximadamente 10 mM.

Una composición puede incluir una mezcla de tanto un oxihidróxido de aluminio como un hidroxifosfato de aluminio, y un agonista de TLR se puede adsorber en una o ambas de estas sales.

Como se menciona anteriormente, es preferente un máximo de 0,85 mg/dosis de Al+++. A causa de que la inclusión de un agonista de TLR puede mejorar el efecto adyuvante de las sales de aluminio, esto permite ventajosamente cantidades más bajas de Al+++ por dosis, y, de este modo, una composición puede incluir con utilidad entre 10 y 250 pg de Al+++ por dosis unitaria. Las vacunas pediátricas actuales incluyen típicamente al menos 300 pg de Al+++. En términos de concentración, una composición puede tener una concentración de Al+++ de entre 10 y 500 pg/ml, por ejemplo, de entre 10-300 pg/ml, de entre 10-200 pg/ml, o de entre 10-100 pg/ml.

En general, cuando una composición incluye tanto un agonista de TLR como una sal de aluminio, la proporción en peso de agonista con respecto a Al+++ es de menos de 5:1, por ejemplo, de menos de 4:1, de menos de 3:1, de menos de 2:1 o de menos de 1:1. De esta manera, por ejemplo, con una concentración de Al+++ de 0,5 mg/ml, la concentración máxima de agonista de TLR es 1,5 mg/ml. Pero se pueden usar niveles más altos o más bajos.

Si una composición incluye un agonista de TLR y una sal de metal insoluble, es preferente que al menos un 50 % (en masa) del agonista en la composición sea adsorbido en la sal de metal, por ejemplo, > 60 %, >70 %, > 80 %, > 85 %, > 90 %, > 92 %, >94 %, > 95 %, >96 %, > 97 %, > 98 % >99 % o incluso un 100 %.

De esta manera, en un modo de realización, la divulgación usa una composición inmunogénica que comprende:

un adyuvante de hidróxido de aluminio;

un agonista de TLR7 de fórmula (K), tal como el compuesto K1;

un primer polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 6 o una secuencia aminoacídica modificada que difiere de la SEQ iD NO: 6 en hasta 5 cambios amino únicos, siempre que la secuencia modificada pueda inducir anticuerpos que se unan a un polipéptido que consiste en la SEQ ID NO: 6;

un segundo polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 13 o una secuencia aminoacídica modificada que difiere de la SEQ ID NO: 13 en hasta 5 cambios amino únicos, siempre que la secuencia modificada pueda inducir anticuerpos que se unan a un polipéptido que consiste en la SEQ ID NO: 13;

un tercer polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 31 o una secuencia aminoacídica modificada que difiere de la SEQ ID NO: 31 en hasta 5 cambios amino únicos, siempre que la secuencia modificada pueda inducir anticuerpos que se unan a un polipéptido que consiste en la SEQ ID NO: 31;

un cuarto polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 33 o una secuencia aminoacídica modificada que difiere de la SEQ ID NO: 33 en hasta 5 cambios amino únicos, siempre que la secuencia modificada pueda inducir anticuerpos que se unan a un polipéptido que consiste en la SEQ ID NO: 33; y

un quinto polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 45 o una secuencia aminoacídica modificada que difiere de la SEQ ID NO: 45 en hasta 5 cambios amino únicos, siempre que la secuencia modificada pueda inducir anticuerpos que se unan a un polipéptido que consiste en la SEQ ID NO: 43; y,

en la que el agonista de TLR7 y/o al menos uno de los polipéptidos se adsorbe(n) en el adyuvante de hidróxido de aluminio.

Por ejemplo, como se explica en más detalle en otra parte en el presente documento: el primer polipéptido puede comprender la SEQ ID NO: 34; el segundo polipéptido puede comprender la SEQ ID NO: 13; el tercer polipéptido puede comprender la SEQ ID NO: 40; el cuarto polipéptido puede comprender la SEQ ID NO: 36; y el quinto polipéptido puede comprender la SEQ ID NO: 45, modificada opcionalmente con hasta 3 sustituciones de aminoácidos (distintas de aquellas en las posiciones que son X en la SEQ ID NO: 44). De esta manera, la composición puede usar una mezcla de cinco polipéptidos que tienen las SEQ ID NO: 37, 27, 38, 39 y 45 (excepto porque la SEQ ID NO: 45 se puede modificar con hasta 3 sustituciones de aminoácidos, como se ha analizado anteriormente).

Grupos químicos

A menos que se defina específicamente en otra parte, los grupos químicos analizados en el presente documento tienen el siguiente significado cuando se usan en la presente memoria descriptiva:

El término "alquilo" incluye restos de hidrocarburos saturados que incluyen:

- grupos lineales de hasta 10 átomos (C1-C10) o de hasta 6 átomos (C-i-Ca) o de hasta 4 átomos (C1 -C4). Los ejemplos de dichos grupos alquilo incluyen, pero no se limitan a C1 - metilo, C2 - etilo, C3 - propilo y C4 - n-butilo. - grupos ramificados de entre 3 y 10 átomos (C3-C10) o de hasta 7 átomos (C3-C7) o de hasta 4 átomos (C3-C4). Los ejemplos de dichos grupos alquilo incluyen, pero no se limitan a C3 - iso-propilo, C4 - sec-butilo, C4 - iso-butilo, C4 - terc-butilo y C5 - neo-pentilo.

El término "alquileno" se refiere al radical hidrocarburo divalente derivado de un grupo alquilo y se debe interpretar de conformidad con la definición anterior.

El término "alquenilo" incluye restos de hidrocarburos monoinsaturados que incluyen:

- grupos lineales de entre 2 y 6 átomos (C2-Ca). Los ejemplos de dichos grupos alquenilo incluyen, pero no se limitan a C2 - vinilo, C3 - 1-propenilo, C3 - alilo, C4 - 2-butenilo.

- grupos ramificados de entre 3 y 8 átomos (C3-C8). Los ejemplos de dichos grupos alquenilo incluyen, pero no se limitan a C4 - 2-metil-2-propenilo y Ca - 2,3-dimetil-2-butenilo.

El término alquenileno se refiere al radical hidrocarburo divalente derivado de un grupo alquenilo y se debe interpretar de conformidad con la definición anterior.

El término "alcoxi" incluye restos de hidrocarburos enlazados a O que incluyen:

- grupos lineales de entre 1 y 6 átomos (C1-Ca) o de entre 1 y 4 átomos (C1-C4). Los ejemplos de dichos grupos alcoxi incluyen, pero no se limitan a C1 - metoxi, C2 - etoxi, C3 - n-propoxi y C4 - n-butoxi.

- grupos ramificados de entre 3 y 6 átomos (C3-C6) o de entre 3 y 4 átomos (C3-C4). Los ejemplos de dichos grupos alcoxi incluyen, pero no se limitan a C3 - iso-propoxi y C4 - sec-butoxi y terc-butoxi.

Halo se selecciona de Cl, F, Br y I. Halo es preferentemente F.

El término "arilo" incluye un sistema de anillo aromático simple o condensado que contiene 6 o 10 átomos de carbono; en el que, a menos que se indique de otro modo, cada aparición de arilo se puede sustituir opcionalmente con hasta 5 sustituyentes seleccionados independientemente de alquilo (C1-C6), alcoxi (C1-C6), OH, halo, CN, COOR¹⁴, CF3 y NR¹⁴R¹⁵ como se ha definido anteriormente. Típicamente, arilo se sustituye opcionalmente con 1, 2 o 3 sustituyentes. Los sustituyentes opcionales se seleccionan de los indicados anteriormente. Los ejemplos de grupos arilo adecuados incluyen fenilo y naftilo (cada uno sustituido opcionalmente como se indica anteriormente). Arileno se refiere al radical divalente derivado de un grupo arilo y se debe interpretar de conformidad con la definición anterior.

El término "heteroarilo" incluye un anillo aromático mono o bicíclico de 5, 6, 9 o 10 miembros, que contiene 1 o 2 átomos de N y, opcionalmente, un átomo de NR¹⁴, o un átomo de NR¹⁴ y un átomo de S o un O, o un átomo de S, o un átomo de O; en el que, a menos que se indique de otro modo, dicho heteroarilo se puede sustituir opcionalmente con 1,2 o 3 sustituyentes seleccionados independientemente de alquilo (C1 -C6), alcoxi (C1-C6), OH, halo, CN, COOR¹⁴, CF3 y NR¹⁴R¹⁵ como se define a continuación. Los ejemplos de grupos heteroarilo adecuados incluyen tienilo, furanilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiazolilo, isotiazolilo, triazolilo, oxadiazolilo, tiadiazolilo, tetrazolilo, piridinilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, indolilo, bencimidazolilo, benzotriazolilo, quinolinilo e isoquinolinilo (sustituidos opcionalmente como se indica anteriormente). Heteroarileno se refiere al radical divalente derivado de heteroarilo y se debe interpretar de conformidad con la definición anterior.

El término "heterociclilo" es un anillo mono o bicíclico no aromático de 3 a 10 miembros enlazado a C o enlazado a N, en el que dicho anillo heterocicloalquilo contiene, cuando sea posible, 1, 2 o 3 heteroátomos seleccionados independientemente de N, NR14, S(O)q y O; y dicho anillo heterocicloalquilo contiene opcionalmente, cuando sea posible, 1 o 2 dobles enlaces, y se sustituye opcionalmente en el carbono con 1 o 2 sustituyentes seleccionados independientemente de alquilo (C1-Ca), alcoxi (CrCa), OH, CN, CF3, halo, COOR14, NR14R15 y arilo.

En las definiciones anteriores, R14 y R15 se seleccionan independientemente de H y alquilo (CrCa).

Cuando una fórmula estructural se define con un sustituyente unido al núcleo de la molécula mediante un enlace no especificado o "flotante", por ejemplo, como el grupo P3 en el caso de la fórmula (C), esta definición abarca los casos donde el sustituyente no especificado se une a cualquiera de los átomos en el anillo en el que se ubica el enlace flotante, mientras se cumpla con la valencia permitida para ese átomo.

En el caso de compuestos de la divulgación, que pueden existir en formas tautómeras (es decir, en las formas ceto o enol), por ejemplo, los compuestos de fórmula (C) o (H), la referencia a un compuesto particular incluye opcionalmente todas de dichas formas tautómeras.

General

La práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique de otro modo, procedimientos convencionales de química, bioquímica, biología molecular, inmunología y farmacología, en la experiencia de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la literatura. Véanse, por ejemplo, las referencias 121-122 123 124 125 126 127 128, etc.

Anteriormente se usa la numeración "GI". Un número GI, o "identificador GenInfo", es una serie de dígitos asignados consecutivamente a cada registro de secuencia procesada por el NCBI cuando se añaden secuencias a sus bases de datos. El número GI no guarda semejanza con el número de referencia del registro de secuencia. Cuando se actualiza una secuencia (por ejemplo, para corregir o para añadir más información o anotación), entonces recibe un número GI nuevo. De esta manera, la secuencia asociada con un número GI dado nunca se cambia.

Si la divulgación se refiere a un "epítopo", este epítopo puede ser un epítopo de linfocitos B y/o un epítopo de linfocitos T. Dichos epítopos se pueden identificar empíricamente (por ejemplo, usando PEPSCAN [129, 130] o procedimientos similares) o se pueden predecir (por ejemplo, usando el índice antigénico de Jameson-Wolf [131], los enfoques basados en matrices [132], MAPITOPE [133], TEPITOPE [134, 135], redes neuronales [136], OptiMer y EpiMer [138, 137], ADEPT [139], Tsites [140], hidrofilia [141], índice antigénico [142] o los procedimientos divulgados en las referencias 143-144 145146 147, etc.). Los epítopos son las partes de un antígeno que se reconocen por y se unen a los sitios de unión a antígeno de los anticuerpos o receptores de linfocitos T, y también se pueden denominar "determinantes antigénicos".

Si un "dominio" antigénico se omite, esto puede implicar la omisión de un péptido señal, de un dominio citoplásmico, de un dominio transmembranario, de un dominio extracelular, etc.

El término "que comprende" abarca "que incluye", así como "que consiste en", por ejemplo, una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional, por ejemplo, X Y.

El término "aproximadamente" en relación con un valor numérico x es opcional y quiere decir, por ejemplo, x un 10 %.

Las referencias a una identidad de secuencia en porcentaje entre dos secuencias aminoacídicas quiere decir que, cuando se alinean, el porcentaje de aminoácidos es el mismo al comparar las dos secuencias. Se pueden determinar esta alineación y la homología o identidad de secuencia en porcentaje usando programas de software conocidos en la técnica, por ejemplo, los descritos en la sección 7.7.18 de la ref.148. Una alineación preferente se determina mediante el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman usando una búsqueda de huecos afines con una penalización por abertura de hueco de 12 y una penalización por extensión de hueco de 2, matriz BLOSUM de 62. Se desvela el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman en la ref. 149. La identidad en porcentaje con respecto a cualquier secuencia particular (por ejemplo, con respecto a una SEQ ID particular) se calcula idealmente sobre toda la longitud de esa secuencia.

Se puede determinar la afinidad de unión mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica, incluyendo resistencia de plasmón superficial, calorimetría isotérmica de titulación, ensayos de unión competitiva, ensayo de desplazamiento térmico, etc. Aunque las cifras absolutas obtenidas usando procedimientos diferentes pueden variar, se concibe que la determinación de la afinidad de unión relativa de una proteína en comparación con otra no debería depender del procedimiento usado.

Los adyuvantes que contienen fósforo usados con la invención pueden existir en un número de formas protonadas y desprotonadas dependiendo del pH del ambiente circundante, por ejemplo, el pH del disolvente en el que se disuelven. Por lo tanto, aunque se puede ilustrar una forma particular, se pretende que estas ilustraciones sean meramente representativas y no limitantes de una forma protonada o desprotonada específica. Por ejemplo, en el caso de un grupo fosfato, este se ha ilustrado como -OP(O)(OH)2, pero la definición incluye las formas protonadas [OP(O)(OH2)(OH)]+ y -[OP(O)(OH)2]2+ que pueden existir en condiciones ácidas y las formas desprotonadas -[Op (O)(OH)(O)]- que pueden existir en condiciones básicas.

Los compuestos pueden existir como sales farmacéuticamente aceptables. De esta manera, se pueden usar los compuestos (por ejemplo, adyuvantes) en forma de sus sales farmacéuticamente aceptables, es decir, sal fisiológicamente o toxicológicamente tolerable (que incluye, si procede, sales de adición de bases farmacéuticamente aceptables y sales de adición de ácidos farmacéuticamente aceptables).

La expresión “sustancialmente” no excluye "completamente", por ejemplo, una composición que está "sustancialmente libre” de Y puede estar completamente libre de Y. Cuando sea necesario, se puede omitir la expresión “sustancialmente” de la definición.

Modos para llevar a cabo la invención

Mutante SpAkR

SpA es un factor de virulencia clave en S. aureus y actúa interfiriendo en el aclaramiento opsonofagocítico de la bacteria y destruyendo las respuestas inmunitarias adaptativas. La secuencia SEQ ID NO: 43 natural incluye cinco dominios de unión a Ig (IgBD), como se muestra anteriormente, y se sabe que muta los restos aminoacídicos en estos dominios para anular la actividad de unión a Fc/Fab mientras se conserva la inmunogenia, por ejemplo, véase el reemplazo de dipéptidos Gln-Gln por Lys-Lys y/o el reemplazó de dipéptidos Asp-Asp por Ala-Ala.

Se ha producido una nueva SpA mutante en la que un dipéptido Gln-Gln adicional se muta a Lys-Arg. Se identificó este dipéptido basándose en las predicciones y análisis de bioinformática de un sitio adicional implicado en la unión a Ig. En particular, se planteaba la hipótesis de que los restos 96 y 97 de la SEQ ID NO: 43 estuvieran implicados en la unión a Ig. Este sitio se pasó por alto en el trabajo anterior a causa de que está fuera del IgBD conservado y no es parte de las estructuras resueltas. El nuevo mutante se denomina 'SpAkR' y tiene la siguiente secuencia aminoacídica, donde se encuadra la sustitución QQ/KR adicional con respecto al mutante 'SpAkkAA' previo:

m a q h d e a k k n a f y q v l h m p h l n a d q r n g f iq s l k a a p s q s a n v l g e a q k l n d s q a p k a d a |k r |n n f

NKDKKSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKAAPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKADNNFNKEKKNA

FYEILNM PNLNEEQ RNG FIQ SLKAAPSQ SANLLSEAKKLNESQ APKADNKFNKEKKNAFYEILHL

PNLNEEQRNGFIQ SLKAAPSQ SANLLAEAKKLNDAQAPKADNKFNKEKKNAFYEILHLPNLTEEQ

RNG FIQ SLKAAPSVSKEILAEAKKLN DAQ APK (SEQ ID NO: 48 )

Se ha confirmado que el mutante SpAkR tiene afinidad reducida por las inmunoglobulinas con respecto a los mutantes conocidos, mientras se conserva la inmunogenia.

El análisis de CDB y DC mostraron que la introducción del mutante KR no afectó materialmente a la estructura de SpA. Los espectros de DC de SpAkkAA y SpAKR fueron idénticos. Tm1 y Tm2 del análisis de CDB fueron como sigue. Tm1: SpAkkAA 48,9 °C; SpAKR 51,1 °C. Tm2: SpAkkAA 68,1 °C; SpAKR 68,0 °C.

Se sometió a prueba la afinidad de SpA natural y de los mutantes SpAkkAA y SpAkR, para IgG, IgA e IgM humanas usando resonancia de plasmón superficial. Se inmovilizaron las proteínas en un chip de sensor y se usaron IgG, IgA e IgM humanas como analitos. Ambos mutantes presentaron una capacidad de unión enormemente reducida en comparación con la natural, pero mientras que SpAkkAA mostró unión residual a IgG e IgM, no se observaron interacciones detectables con cualquier inmunoglobulina con SpAkR. Las actividades de unión residual de SpAkkAA hacia IgG e IgM fueron muy bajas (11-12 veces más bajas que la natural), pero reproducibles y dependientes de la concentración.

Se evaluó la supervivencia de S. aureus en presencia de SpA (natural, SpAkkAA y SpAkR) a través del ensayo de supervivencia de sangre entera (WBA). Se incubó 1 ml de sangre entera de donantes sanos, complementada con 50 mg/l de anticoagulante lepirudina (10 pl/ml de sangre), con 0,15 pM de SpA o con PBS, durante 15 min a 37 °C, antes de añadir aproximadamente 2,5 x 105 de UFC de LAC USA300 de S. aureus (DO600, 0,4) diluida en BHI. Se sembraron en una placa alícuotas de este cultivo sobre BHI-agar para determinar las UFC de entrada. Después de la incubación a 37 °C durante 2 h con agitación (180 rpm), se lisaron los neutrófilos en PBS-saponina al 0,5 % durante 3 min en hielo. Se determinó el número de bacterias viables mediante diez diluciones en serie en BHI y se sembraron en una placa sobre placas de agar nutritivo. Se contaron las colonias después de la incubación de las placas a 37 °C durante 18 h. El control fue la muestra de sangre preincubada con PBS. Se calculó la supervivencia relativa basada en las UFC de entrada en comparación con las UFC posincubación. Se realizaron por triplicado los experimentos; hubo poca variación entre los experimentos.

En el WBA, la supervivencia relativa de S aureus en sangre entera humana fue considerablemente más baja cuando se incubó con SpAKR que con la SpA natural (p < 0,001, Mann-Whitney) o con SpAkkAA (p < 0,05). La incubación con SpA-natural dio como resultado una supervivencia de S aureus incrementada en comparación con el control (p < 0,001), mientras que la supervivencia en el WBA incubado con SpAkkAA fue comparable al control. La incubación con SpAkR redujo la supervivencia a aproximadamente la mitad de la del control.

Se descubrió que SpAkkAA o SpAkR formulados con adyuvante de hidróxido de aluminio fueron débilmente inmunogénicos por sí solos en ratones, pero la inclusión del agonista de TLR7 adsorbido 'K1' incrementó significativamente los títulos de anticuerpos. A causa de que el mecanismo de acción asociado con la inmunización frente a SpA parece estar motivado principalmente por anticuerpos, esto es una mejora importante.

Vacunas de S. aureus

Se sometieron a prueba el dominio E de SpAkR, SpAkkAA, SpAkR solo y el dominio E de SpAkR unido a HlaH35L en el modelo de absceso renal, adyuvados con hidróxido de aluminio (Al-H) a 2 mg/ml (sal total). Cada antígeno estuvo presente en 10 pg en una dosis de 100 pl para inyección intramuscular.

Se inmunizaron por vía intramuscular (IM) ratones de cuatro o cinco semanas de edad (DC1) con inyecciones de primovacunación-refuerzo con un intervalo de 14 días. Los ratones de control recibieron cantidades iguales de adyuvantes solos. Se recogió suero de los ratones tanto durante la pre- como la posvacunación para documentar los títulos de anticuerpos en suero con respecto a cada componente de proteína en la vacuna de combinación. Se midieron estos títulos mediante tecnología Luminex usando los antígenos de vacuna recombinantes conjugados con microesferas.

Modelo de absceso renal: Se expusieron los animales inmunizados en el día 24 mediante inyección intravenosa de una dosis subletal de la cepa Newman de S. aureus (~ 2-6 x107 UFC). En el día 28, se sacrificaron los ratones y los riñones se extrajeron y homogeneizaron en 2 ml de PBS y se sembraron en una placa por duplicado en medio de agar para la determinación de las unidades formadoras de colonias (UFC).

Se obtuvo una reducción comparable en log-10 de UFC/ml (alrededor de una reducción de 1 en escala logarítmica) en la vacunación con el dominio E de SpAKR, SpAkkAA, SpAkR solo y el dominio E de SpAkR unido a HlaH35L, en comparación con el adyuvante solo.

Vacunas de S. aureus de combinación

Se prepararon una vacuna 5-valente y 6-valente. La vacuna 5-valente incluyó antígenos que consistían en las SEQ ID NO: 7, 8, 27 y 32 (FhuD2, Sta011, Hla-H35L y EsxAB); la vacuna 6-valente también incluyó el mutante SpAkR. Las vacunas se adyuvaron con: (i) hidróxido de aluminio, Al-H; (ii) Al-H agonista de TLR7 adsorbido K1; o (iii) la emulsión de aceite en agua MF59. Se usó Al-H en 2 mg/ml (sal total), K1 estuvo presente en 50 pg por dosis, y se mezcló MF59 con los antígenos en una proporción en volumen de 1:1. Cada antígeno estuvo presente en 10 pg en una dosis de 100 pl para inyección intramuscular.

Se inmunizaron ratones de cuatro o cinco semanas de edad (DC1) con inyecciones de primovacunación-refuerzo con un intervalo de 14 días. Los ratones de control recibieron cantidades iguales de adyuvantes solos. Se recogió suero de los ratones tanto durante la pre- como posvacunación para documentar los títulos de anticuerpos en suero con respecto a cada componente de proteína en la vacuna de combinación. Se midieron estos títulos mediante tecnología Luminex usando los antígenos de vacuna recombinantes conjugados con microesferas.

Modelo de absceso renal: Se expusieron los animales inmunizados en el día 24 mediante inyección intravenosa de una dosis subletal de S. aureus (~ 2-6 x107 UFC, donde el inóculo específico varió dependiendo de la cepa de exposición). En el día 28, se sacrificaron los ratones y los riñones se extrajeron y homogeneizaron en 2 ml de PBS y se sembraron en una placa por duplicado en medio de agar para la determinación de las unidades formadoras de colonias (UFC). También se procesaron los riñones para la histopatología.

Modelo de peritonitis: Por separado, se expusieron los animales inmunizados en día 24 mediante inyección intraperitoneal de una dosis letal de S. aureus. (~ 2-5x108 UFC) y entonces se supervisaron diariamente durante 14 días.

Modelo de infección de piel: Se inocularon los ratones inmunizados mediante inyección subcutánea en el flanco derecho afeitado con 2x107 UFC de cepa LAC de S. aureus (clon USA300, que es uno de los clones más importantes en todo el mundo y está altamente asociado con las infecciones cutáneas extrahospitalarias). Se supervisaron la formación de masas y abscesos (tamaño y dermonecrosis) en intervalos de 24 horas durante el transcurso de 7 días. Se determinó el tamaño de un absceso y lesión dermonecrótica suprayacente asociada usando software de análisis de imágenes. Se recogieron la piel de ratón y los abscesos en el día 7 posinoculación para la enumeración de UFC. Se usó este modelo únicamente con el adyuvante Al-H/K1.

Los resultados fueron como sigue:

En el modelo de peritonitis, la vacuna 6-valente con AI-H/K1 fue estadísticamente superior en comparación con el control negativo (véase la tabla anterior) y también en comparación con la vacuna con Al-H 5-valente. En el modelo de absceso, la vacuna 6-valente con Al-H/K1 fue estadísticamente superior en comparación con el control negativo (véase la tabla anterior), con respecto a la vacuna con Al-H/K1 5-valente, y con respecto a la vacuna con Al-H/K1 5-valente, mostrando, de esta manera, que la contribución de la SpA mutante va más allá de la potenciación que se debía solamente al agonista K1.

En el modelo de infección de piel, ambas vacunas 5-valente y 6-valente reducen significativamente la formación de abscesos y recuentos de UFC (véase la tabla anterior). La dermonecrosis estuvo ausente en los ratones vacunados, mientras que se observó en todos los ratones que recibieron adyuvante solo ('N/A' en la tabla). Además, se mejoró significativamente la reducción de UFC por la inclusión de SpAkR en la vacuna, y se observaron menos ratones con abscesos distinguibles a un nivel macroscópico (un 71 % frente a un 88 %).

Los títulos de anti-SpA también se compararon para los tres adyuvantes. La mediana de títulos que usaron Al-H o MF59 no fue significativamente diferente, pero el título que usó Al-H/K1 fue significativamente más alto que con Al-H solo (p = 0,0047, prueba de Mann-Whitney) y que con MF59 (p = 0,01). De esta manera, la formulación que dio mejores resultados en los ensayos funcionales fue la que indujo los títulos de anticuerpos anti-SpA más altos, en línea con la hipótesis de que la actividad de la SpA como un antígeno de vacuna dependa de anticuerpos, que se pueden unir a ella e inhibir su actividad de evasión inmunitaria.

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Listado de secuencias

SEQ ID NO: 1 (EsxA)

MAMIKMSPEEIRAKSQSYGQGSDQIRQILSDLTRAQGEIAANWEGQAFSRFEEQFQQLSPKVEKFAQLLE EIKQQLNSTADAVQEQDQQLSNNFGLQ

SEQ ID NO: 2 (EsxB)

MGGYKGIKADGGKVDQAKQLAAKTAKDIEACQKQTQQLAEYIEGSDWEGQFANKVKDVLLIMAKFQEELV QPMADHQKAIDNLSQNLAKYDTLSIKQGLDRVNP

SEQ ID NO: 3 (FhuD2)

MKKLLLPLIIMLLVLAACGNQGEKNNKAETKSYKMDDGKTVDIPKDPKRIAWAPTYAGGLKKLGANIVA VNQQVDQSKVLKDKFKGVTKIGDGDVEKVAKEKPDLIIVYSTDKDIKKYQKVAPTVWDYNKHKYLEQQE MLGKIVGKEDKVKAWKKDWEETTAKDGKEIKKAIGQDATVSLFDEFDKKLYTYGDNWGRGGEVLYQAFGL KMQPEQQKLTAKAGWAEVKQEEIEKYAGDYIVSTSEGKPTPGYESTNMWKNLKATKEGHIVKVDAGTYWY NDPYTLDFMRKDLKEKLIKAAK

SEQ ID NO: 4 (Sta011)

MMKRLNKLVLGIIFLFLVISITAGCGIGKEAEVKKSFEKTLSMYPIKNLEDLYDKEGYRDDQFDKNDKGT WIINSEMVIQPNNEDMVAKGMVLYMNRNTKTTNGYYYVDVTKDEDEGKPHDNEKRYPVKMVDNKIIPTKE IKDEKIKKEIENFKFFVQYGDFKNLKNYKDGDISYNPEVPSYSAKYQLTNDDYNVKQLRKRYDIPTSKAP KLLLKGSGNLKGSSVGYKDIEFTFVEKKEENIYFSDSLDYKKSGDV

SEQ ID NO: 5 (Hla)

MKTRIVSSVTTTLLLGSILMNPVANAADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMHKKVFYSFID DKNHNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMS TLTYGFNGNVTGDDTGKIGGLIGANVSIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVNQNWGPYDR DSWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRD DYQLHWTSTNWKGTNTKDKWIDRSSERYKIDWEKEEMTN

SEQ ID NO: 6 (FhuD2 truncado de manera terminal en el extremo N de la SEQ ID NO: 3)

CGNQGEKNNKAETKSYKMDDGKTVDIPKDPKRIAWAPTYAGGLKKLGANIVAVNQQVDQSKVLKDKFKG VTKIGDGDVEKVAKEKPDLIIVYSTDKDIKKYQKVAPTWVDYNKHKYLEQQEMLGKIVGKEDKVKAWKK DWEETTAKDGKEIKKAIGQDATVSLFDEFDKKLYTYGDNWGRGGEVLYQAFGLKMQPEQQKLTAKAGWAE VKQEEIEKYAGDYIVSTSEGKPTPGYESTNMWKNLKATKEGHIVKVDAGTYWYNDPYTLDFMRKDLKEKL IKAAK

SEQ ID NO: 7 (Secuencia de FhuD2 de ejemplo)

MASCGNQGEKNNKAETKSYKMDDGKTVDIPKDPKRIAWAPTYAGGLKKLGANIVAVNQQVDQSKVLKDK FKGVTKIGDGDVEKVAKEKPDLIIVYSTDKDIKKYQKVAPTVWDYNKHKYLEQQEMLGKIVGKEDKVKA WKKDWEETTAKDGKEIKKAIGQDATVSLFDEFDKKLYTYGDNWGRGGEVLYQAFGLKMQPEQQKLTAKAG WAEVKQEEIEKYAGDYIVSTSEGKPTPGYESTNMWKNLKATKEGHIVKVDAGTYWYNDPYTLDFMRKDLK EKLIKAAK

SEQ ID NO: 8 (Secuencia de Sta011 de ejemplo)

MGCGIGKEAEVKKSFEKTLSMYPIKNLEDLYDKEGYRDDQFDKNDKGTWIINSEMVIQPNNEDMVAKGMV LYMNRNTKTTNGYYYVDVTKDEDEGKPHDNEKRYPVKMVDNKIIPTKEIKDEKIKKEIENFKFFVQYGDF KNLKNYKDGDISYNPEVPSYSAKYQLTNDDYNVKQLRKRYDIPTSKAPKLLLKGSGNLKGSSVGYKDIEF TFVEKKEENIYFSDSLDYKKSGDV

SEQ ID NO: 9 (Secuencia de Sta011 de ejemplo)

MMKRLNKLVLGIIFLFLVISITAGCGIGKEAEVKKSFEKTLSMYPIKNLEDLYDKEGYRDDQFDKNDKGT WIINSEMVIQPNNEDMVAKGMVLYMNRNTKTTNGYYYVDVTKDEDEGKPHDNEKRYPVKMVDNKIIPTKE IKDEKLKKEIENFKFFVQYGDFKNIKNYKDGDISYNPEVPSYSAKYQLTNDDYNVKQLRKRYDIPTSKAP KLLLKGSGNLKGSSVGYKDIEFTFVEKKEENIYFSDSLDYKKSGDV

SEQ ID NO: 10 (Secuencia de Sta011 de ejemplo)

MMKRLNKLVLGIIFLFLVISITAGCGIGKEAEVKKSFEKTLSMYPIKNLEDLYDKEGYRDDQFDKNDKGT WIINSEMVIQPNNEDMVAKGMVLYMNRNTKTTNGYYYVDVTKDEDEGKPHDNEKRYPVKMVDNKIIPTKE IKDEKVKKEIENFKFFVQYGDFKNIKNYKDGDISYNPEVPSYSAKYQLTNDDYNVKQLRKRYDIPTSKAP KLLLKGSGNLKGSSVGYKDIEFTFVEKKEENIYFSDSLDYKKSGDV

SEQ ID NO: 11 (Secuencia de Sta011 de ejemplo)

MMKRLNKLVLGIIFLFLVISITAGCGIGKEAEVKKSFEKTLSMYPIKNLEDLYDKEGYRDDQFDKNDKGT WIINSEMVIQPNNEDMVAKGMVLYMNRNTKTTNGYYYVDVTKDEDEGKPHDNEKRYPVKMVDNKIIPTKE IKDEKLKKEIENFKFFVQYGDFKNVKNYKDGDISYNPEVPSYSAKYQLTNDDYNVKQLRKRYDIPTSKAP KLLLKGSGNLKGSSVGYKDIEFTFVEKKEENIYFSDSLDYKKSGDV

SEQ ID NO: 12 (Hla truncado de manera terminal en el extremo N de SEQ ID NO: 5)

ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSE EGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNGNVTGDDTGKIGGLIGANV SIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVNQNWGPYDRDSWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNF LDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWIDRSSE RYKIDWEKEEMTN

SEQ ID NO: 13 (Hla-H35L maduro)

ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMLKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSE EGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNGNVTGDDTGKIGGLIGANV SIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVNQNWGPYDRDSWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNF LDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWIDRSSE RYKIDWEKEEMTN

SEQ ID NO: 14 (tetrámero)

PSGS

SEQ ID NO: 15 (Hla-H35L con sustitución PSGS)

ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMLKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSE EGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTPSGSVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMV NQNWGPYDRDSWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNI DVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWIDRSSERYKIDWEKEEMTN

SEQ ID NO: 16 (Hla con sustitución PSGS)

ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSE EGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTPSGSVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMV NQNWGPYDRDSWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNI DVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWIDRSSERYKIDWEKEEMTN

SEQ ID NO: 17 (Hla con mutación Y101)

ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSE EGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDLYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNGNVTGDDTGKIGGLIGANV SIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVNQNWGPYDRDSWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNF LDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWIDRSSE RYKIDWEKEEMTN

SEQ ID NO: 18 (Hla con mutación D152)

ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSE EGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNGNVTGDDTGKIGGLIGANV SIGHTLKYVQPLFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVNQNWGPYDRDSWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNF LDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWIDRSSE RYKIDWEKEEMTN

SEQ ID NO: 19 (Hla con mutaciones H35 y Y101)

ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMLKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSE EGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDLYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNGNVTGDDTGKIGGLIGANV SIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVNQNWGPYDRDSWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNF LDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWIDRSSE RYKIDWEKEEMTN

SEQ ID NO: 20 (Hla con mutaciones H53 y D152)

ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMLKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSE EGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNGNVTGDDTGKIGGLIGANV SIGHTLKYVQPLFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVNQNWGPYDRDSWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAADNF LDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWIDRSSE RYKIDWEKEEMTN

SEQ ID NO: 21 (Fragmento de Hla)

ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHNK

SEQ ID NO: 22 (Fragmento de Hla)

ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTIAG

SEQ ID NO: 23 (Fragmento de Hla)

ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMHKKVFYSFIDDKNHNKKLL

SEQ ID NO: 24 (Fragmento de Hla-H35L)

ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMLKKVFYSFIDDKNHNK

SEQ ID NO: 25 (Fragmento de Hla-H35L)

ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMLKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTIAG

SEQ ID NO: 26 (Fragmento de Hla-H35L)

ADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMLKKVFYSFIDDKNHNKKLL

SEQ ID NO: 27 (Secuencia de HLA útil con mutación H35L)

MASADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKENGMLKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTIAGQYRV YSEEGANKSGLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTLTYGFNGNVTGDDTGKIGGLIG ANVSIGHTLKYVQPDFKTILESPTDKKVGWKVIFNNMVNQNWGPYDRDSWNPVYGNQLFMKTRNGSMKAA DNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRDDYQLHWTSTNWKGTNTKDKWIDR SSERYKIDWEKEEMTN

SEQ ID NO: 28 (Ejemplo de EsxAB)

MAMIKMSPEEIRAKSQSYGQGSDQIRQILSDLTRAQGEIAANWEGQAFSRFEEQFQQLSPKVEKFAQLLE EIKQQLNSTADAVQEQDQQLSNNFGLQASGGGSMGGYKGIKADGGKVDQAKQLAAKTAKDIEACQKQTQQ LAEYIEGSDWEGQFANKVKDVLLIMAKFQEELVQPMADHQKAIDNLSQNLAKYDTLSIKQGLDRVNP

SEQ ID NO: 29 (Ejemplo de EsxBA)

MGGYKGIKADGGKVDQAKQLAAKTAKDIEACQKQTQQLAEYIEGSDWEGQFANKVKDVLLIMAKFQEELV QPMADHQKAIDNLSQNLAKYDTLSIKQGLDRVNPASGGGSMAMIKMSPEEIRAKSQSYGQGSDQIRQILS DLTRAQGEIAANWEGQAFSRFEEQFQQLSPKVEKFAQLLEEIKQQLNSTADAVQEQDQQLSNNFGLQ

SEQ ID NO: 30 (engarce)

ASGGGS

SEQ ID NO: 31 (Ejemplo de EsxAB)

AMIKMSPEEIRAKSQSYGQGSDQIRQILSDLTRAQGEIAANWEGQAFSRFEEQFQQLSPKVEKFAQLLEE IKQQLNSTADAVQEQDQQLSNNFGLQASGGGSGGYKGIKADGGKVDQAKQLAAKTAKDIEACQKQTQQLA EYIEGSDWEGQFANKVKDVLLIMAKFQEELVQPMADHQKAIDNLSQNLAKYDTLSIKQGLDRVNP

SEQ ID NO: 32 (Ejemplo de EsxAB)

MAMIKMSPEEIRAKSQSYGQGSDQIRQILSDLTRAQGEIAANWEGQAFSRFEEQFQQLSPKVEKFAQLLE EIKQQLNSTADAVQEQDQQLSNNFGLQASGGGSGGYKGIKADGGKVDQAKQLAAKTAKDIEACQKQTQQL AEYIEGSDWEGQFANKVKDVLLIMAKFQEELVQPMADHQKAIDNLSQNLAKYDTLSIKQGLDRVNP

SEQ ID NO: 33 (SEQ ID NO: 4 truncada de manera terminal en el extremo N)

GCGIGKEAEVKKSFEKTLSMYPIKNLEDLYDKEGYRDDQFDKNDKGTWIINSEMVIQPNNEDMVAKGMVL YMNRNTKTTNGYYYVDVTKDEDEGKPHDNEKRYPVKMVDNKIIPTKEIKDEKIKKEIENFKFFVQYGDFK NLKNYKDGDISYNPEVPSYSAKYQLTNDDYNVKQLRKRYDIPTSKAPKLLLKGSGNLKGSSVGYKDIEFT FVEKKEENIYFSDSLDYKKSGDV

SEQ ID NO: 34 (FhuD2)

GNQGEKNNKAETKSYKMDDGKTVDIPKDPKRIAWAPTYAGGLKKLGANIVAVNQQVDQSKVLKDKFKGV TKIGDGDVEKVAKEKPDLIIVYSTDKDIKKYQKVAPTVWDYNKHKYLEQQEMLGKIVGKEDKVKAWKKD WEETTAKDGKEIKKAIGQDATVSLFDEFDKKLYTYGDNWGRGGEVLYQAFGLKMQPEQQKLTAKAGWAEV KQEEIEKYAGDYIVSTSEGKPTPGYESTNMWKNLKATKEGHIVKVDAGTYWYNDPYTLDFMRKDLKEKLI KAAK

SEQ ID NO: 35 (Secuencia de EsxB libre de Cys)

GGYKGIKADGGKVDQAKQLAAKTAKDIEAXQKQTQQLAEYIEGSDWEGQFANKVKDVLLIMAKFQEELVQ PMADHQKAIDNLSQNLAKYDTLSIKQGLDRVNP

SEQ ID NO: 36 (Versión libre de Cys de SEQ ID NO: 4 de Sta011)

GIGKEAEVKKSFEKTLSMYPIKNLEDLYDKEGYRDDQFDKNDKGTWIINSEMVIQPNNEDMVAKGMVLYM NRNTKTTNGYYYVDVTKDEDEGKPHDNEKRYPVKMVDNKIIPTKEIKDEKIKKEIENFKFFVQYGDFKNL KNYKDGDISYNPEVPSYSAKYQLTNDDYNVKQLRKRYDIPTSKAPKLLLKGSGNLKGSSVGYKDIEFTFV EKKEENIYFSDSLDYKKSGDV

SEQ ID NO: 37 (Versión libre de Cys de SEQ ID NO: 7 de FhuD2)

MASGNQGEKNNKAETKSYKMDDGKTVDIPKDPKRIAWAPTYAGGLKKLGANIVAVNQQVDQSKVLKDKF KGVTKIGDGDVEKVAKEKPDLIIVYSTDKDIKKYQKVAPTWVDYNKHKYLEQQEMLGKIVGKEDKVKAW KKDWEETTAKDGKEIKKAIGQDATVSLFDEFDKKLYTYGDNWGRGGEVLYQAFGLKMQPEQQKLTAKAGW AEVKQEEIEKYAGDYIVSTSEGKPTPGYESTNMWKNLKATKEGHIVKVDAGTYWYNDPYTLDFMRKDLKE KLIKAAK

SEQ ID NO: 38 (Mutante Cys-Ala de EsxAB)

MAMIKMSPEEIRAKSQSYGQGSDQIRQILSDLTRAQGEIAANWEGQAFSRFEEQFQQLSPKVEKFAQLLE EIKQQLNSTADAVQEQDQQLSNNFGLQASGGGSGGYKGIKADGGKVDQAKQLAAKTAKDIEAAQKQTQQL AEYIEGSDWEGQFANKVKDVLLIMAKFQEELVQPMADHQKAIDNLSQNLAKYDTLSIKQGLDRVNP SEQ ID NO: 39 (secuencia de Sta011 útil)

MGSGIGKEAEVKKSFEKTLSMYPIKNLEDLYDKEGYRDDQFDKNDKGTWIINSEMVIQPNNEDMVAKGMV LYMNRNTKTTNGYYYVDVTKDEDEGKPHDNEKRYPVKMVDNKIIPTKEIKDEKIKKEIENFKFFVQYGDF KNLKNYKDGDISYNPEVPSYSAKYQLTNDDYNVKQLRKRYDIPTSKAPKLLLKGSGNLKGSSVGYKDIEF TFVEKKEENIYFSDSLDYKKSGDV

SEQ ID NO: 40 (Ejemplo de EsxAB libre de Cys)

AMIKMSPEEIRAKSQSYGQGSDQIRQILSDLTRAQGEIAANWEGQAFSRFEEQFQQLSPKVEKFAQLLEE IKQQLNSTADAVQEQDQQLSNNFGLQASGGGSGGYKGIKADGGKVDQAKQLAAKTAKDIEAXQKQTQQLA EYIEGSDWEGQFANKVKDVLLIMAKFQEELVQPMADHQKAIDNLSQNLAKYDTLSIKQGLDRVNP

SEQ ID NO: 41

icicicicicicicicicicicicic

SEQ ID NO: 42

KLKLLLLLKLK

SEQ ID NO: 43 (SpA)

MKKKNIYSIRKLGVGIASVTLGTLLISGGVTPAANAAQHDEAQQNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKD DPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADAQQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVL GEAKKLNESQAPKADNNFNKEQQNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLSEAKKLNESQAP KADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKADNKFNKEQQN AFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKDDPSVSKEILAEAKKLNDAQAPKEEDNNKPGKEDNNKPGKEDNNKP GKEDNNKPGKEDNNKPGKEDGNKPGKEDNKKPGKEDGNKPGKEDNKKPGKEDGNKPGKEDGNKPGKEDGN GVHWKPGDTVNDIAKANGTTADKIAADNKLADKNMIKPGQELWDKKQPANHADANKAQALPETGEENP FIGTTVFGGLSLALGAALLAGRRREL

SEQ ID NO: 44 (SpAkkAA)

AQHDEAXXNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKXXPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADAQQNNFNKDXXS AFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKXXPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKADNNFNKEXXNAFYEILNMPNLN EEQRNGFIQSLKXXPSQSANLLSEAKKLNESQAPKADNKFNKEXXNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLK XXPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKADNKFNKEXXNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKXXPSVSKEILAE AKKLNDAQAPK

SEQ ID NO: 45 (SpAkkAA)

AQHDEAKKNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKAAPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADAQQNNFNKDKKS AFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKAAPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKADNNFNKEKKNAFYEILNMPNLN EEQRNGFIQSLKAAPSQSANLLSEAKKLNESQAPKADNKFNKEKKNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLK AAPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKADNKFNKEKKNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKAAPSVSKEILAE AKKLNDAQAPK

SEQ ID NO: 46 (SpAkR)

AQHDEAKKNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKAAPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADAXXNNFNKDKKS AFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKAAPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKADNNFNKEKKNAFYEILNMPNLN EEQRNGFIQSLKAAPSQSANLLSEAKKLNESQAPKADNKFNKEKKNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLK AAPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKADNKFNKEKKNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKAAPSVSKEILAE AKKLNDAQAPK

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un antígeno SpA mutante que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende o que consiste en la SEQ ID NO: 49, en que los dipéptidos XX en las posiciones 7-8, 60-61, 68-69, 126-127, 184-185 y 242-243 de la SEQ ID NO: 49 son KK, RR, RK o KR, y los dipéptidos XX en las posiciones 34-35, 95-96, 153-154, 211-212 y 269-270 de la SEQ ID NO: 49 son AA..

2. Un antígeno SpA mutante de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el dipéptido en las posiciones 60 y 61 es KK o KR.

3. Un antígeno SpA mutante de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicha secuencia de aminoácidos es la SEQ ID NO: 47.

4. Un antígeno SpA mutante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el antígeno induce anticuerpos en un mamífero que reconocen la SEQ ID NO: 43 y/o la SEQ ID NO: 54.

5. Un antígeno SpA mutante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que tiene afinidad disminuida, con respecto a SpA no modificada, por la porción Fcy de IgG humana.

6. Un antígeno SpA mutante de acuerdo con la reivindicación 5, que tiene afinidad disminuida, con respecto a SpA no modificada, por la porción Fab de receptores de linfocitos B humanos que contienen Vh3.

7. Un antígeno SpA mutante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende la SEQ ID NO: 48.

8. Una proteína de fusión que comprende un antígeno SpA mutante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Una composición inmunogénica que comprende un antígeno SpA mutante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 8.

10. Una composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 9, que comprende adicionalmente al menos un antígeno seleccionado del grupo que consiste en antígenos EsxA, EsxB, FhuD2, Sta011 y Hla.

11. Una composición inmunogénica que comprende un antígeno SpA mutante que comprende una secuencia que tiene el 90 % o más de identidad con los aminoácidos 37-325 de la SEQ ID NO: 43, en la que todos los dipéptidos Qq están mutados a KK, RK o KR y todos los dipéptidos DD están mutados a AA; en el que el antígeno SpA mutante tiene una afinidad disminuida, con respecto a SpA no modificada, por la porción Fcy de IgG humana y por la porción Fab de receptores de linfocitos B humanos que contienen Vh3.

12. Una composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 11, que comprende adicionalmente al menos un antígeno seleccionado del grupo que consiste en antígenos EsxA, EsxB, FhuD2, Sta011 y Hla.

13. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en la que la composición también comprende un adyuvante; en la que dicho adyuvante se selecciona opcionalmente del grupo que consiste en:

- sales de aluminio, particularmente hidróxidos de aluminio y fosfatos de aluminio,

- agonistas de TLR humano, particularmente agonistas de TLR7,

- una emulsión de aceite en agua,

- una formulación de saponina,

- un derivado no tóxico de LPS enterobacteriano, particularmente MPL (monofosforil lípido A (MPL) o 3d-MPL (monofosforil lípido A 3- O-desacetilado),

- un derivado de lípido A;

y

- una mezcla de los mismos;

en la que dicho agonista de TLR7 es opcionalmente un compuesto de la siguiente fórmula (K):

en la que:

R1 es H, alquilo Ci-Ca, -C(R5)2OH, -L1R5, -L1R6, -L2R5, -L2R6, -OL2R5 o -OL2R6;

L1 es -C(O)- o -O-;

L2 es alquileno Ci-Ca, alquenileno C2-Ca, arileno, heteroarileno o -((CR4R4)pO)q(CH2)p-, en la que el alquileno Ci-Ca y alquenileno C2-Ca de L2 se sustituyen opcionalmente con de 1 a 4 grupos fluoro;

cada L3 se selecciona independientemente de alquileno Ci-Ca y -((CR4R4)pO)q(CH2)p-, en la que el alquileno Ci-Ca de L3 se sustituye opcionalmente con de 1 a 4 grupos fluoro;

L4 es arileno o heteroarileno;

R2 es H o alquilo C1-Ca;

R3 se selecciona de alquilo C1-C4, -L3R5, -L1R5, -L3R7, -L3L4L3R7, -L3L4R5, -L3L4L3R5, -OL3R5, -OL3R7, -OL3L4R7, -OL3L4L3R7, -OR8, -OL3L4R5, -OL3L4L3R5 y -C(R5)2OH;

cada R4 se selecciona independientemente de H y fluoro;

R5 es -P(O)(OR9)2,

Ra es -CF2P(O)(OR9)2 o -C(O)OR10;

R7 es -CF2P(O)(OR9)2 o -C(O)OR10;

R8 es H o alquilo C1-C4;

cada R9 se selecciona independientemente de H y alquilo Ci-Ca;

R10 es H o alquilo C1-C4;

cada p se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4, 5 y a, y

q es 1, 2, 3 o 4;

particularmente ácido 3-(5-amino-2-(2-metil-4-(2-(2-(2-fosfonoetoxi)etoxi)etoxi)fenetil)benzo[f][1,7]naftiridin-8-il)propanoico (K1).

14. La composición de acuerdo con la reivindicación 13, en la que el adyuvante comprende un agonista de TLR humano adsorbido en una sal de aluminio.

15. La composición inmunogénica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, para su uso como un medicamento.

ia . La composición inmunogénica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15, para uso como un medicamento en la prevención y/o el tratamiento de una infección por S. aureus, opcionalmente en un ser humano.