CN109652384B - 一种体外培养戊型肝炎病毒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种体外培养戊型肝炎病毒的方法，该方法采用MDCK细胞对戊型肝炎病毒进行体外培养，利用RT‑nPCR、PT‑qPCR和免疫共聚焦的方法证实戊型肝炎病毒能够在MDCK细胞中大量复制，且能够稳定传代10代以上，该方法在戊型肝炎病毒体外培养方面有了大的突破，为进一步研究戊型肝炎病毒的生物学及免疫学特性，HEV感染及致病机制奠定了良好的基础。

Description

一种体外培养戊型肝炎病毒的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种戊型肝炎病毒在体外成功培养并连续复制的新方法。
背景技术
戊型肝炎病毒（Hepatitis E Virus，HEV）是一种经肠道传播的病毒性肝炎病原体，可以跨种间感染人和多种动物。HEV 为单股正链 RNA 病毒，目前研究发现其主要有8种基因型（HEV-1---HEV-8），在中国主要流行基因4型 HEV 毒株（HEV-4）。现已证实HEV传播途径主要为粪--口途径，也可通过其他途径传播，如血液传播，接触传播，垂直传播，以及器官移植进行传播。
HEV感染一般为急性自限性感染，患者在4-6 周可自行排毒结束后康复。但对于免疫缺陷病人及老年人极易发展为慢性肝炎，并迅速发展为肝硬化和肝癌。据世界卫生组织统计，全球每年约有 2000万人感染HEV，造成约7万人死亡。此外孕妇感染HEV致死率可高达25%，且常发生胎儿早产，流产，死胎及孕妇产后急性肝坏死等症状。戊型肝炎的防控形势已经迫在眉睫，发展有效的戊型肝炎疫苗已成为关系公众健康的急为紧迫的问题，而在这一过程中病毒培养至关重要。
病毒培养是研究病毒生物学特性，致病机理及疫苗研制的基础。一直以来，HEV的体外培养都是研究的热点和难点，但由于HEV不能在体外高效复制，严重阻碍了病毒复制机制的研究，进而阻滞了HEV疫苗的研发。
虽然目前已经利用A549和PLC/PRF/5细胞系成功建立了HEV细胞培养体系。但是还存在很多问题。一方面，目前建立的细胞培养体系所用细胞系均为癌细胞系，不能真实的反应正常机体感染HEV后的相关症状，更不能采用癌细胞系进行HEV疫苗的研发与生产。另一方面在使用现有的细胞培养体系时必须要接种较高滴度的病毒（108拷贝/mL）才能在体外维持培养，此外在后代细胞悬液中病毒滴度会减低，不能稳定连续传代培养。基于HEV细胞培养体系的不足，为了必须建立一种高效且稳定的HEV体外培养体系。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效稳定的戊型肝炎病毒（Hepatitis E Virus，HEV）在体外培养的方法，该方法采用MDCK细胞对HEV毒株进行体外培养，发现病毒能够在MDCK细胞中大量复制，且能够连续传代10次以上，为深入研究 HEV致病性以及疫苗的研发提供有效的体外实验模型。
本发明戊型肝炎病毒体外培养方法，采用如下步骤进行：
（1）将 HEV 病毒悬液依次经 0.45μm 和0.22μm 滤膜过滤除菌后，加入病毒悬液体积2～5%的双抗溶液，4～8℃处理2～3h，液氮中保存备用，经 Real-time qPCR 测定其病毒拷贝数为2.4×104～3.3×105拷贝数/mL，其中双抗溶液为含有400U/mL 青霉素和1000U/mL 链霉素的溶液；
（2）将MDCK细胞按1.8×105～2×105/mL接种至10cm3的细胞培养瓶，用含体积百分比10%胎牛血清的 DMEM培养基在37℃、5% CO2培养箱中静止培养细胞，直至细胞长成单层；
（3）按每瓶0.8～1mL的接种量，将步骤（1）HEV 病毒悬液接种至步骤（2）单层细胞中，置于35～37℃下孵育2～3小时，每15～30min 轻微摇匀一次，使病毒充分吸附到细胞上；2～3小时后加入含体积百分比2%～5%胎牛血清的 DMEM 培养基，同时添加终浓度为0.01mmol/L MgCl2保护病毒颗粒的完整性及增强病毒与细胞的吸附作用，置于37℃、5% CO2培养箱中继续培养；
（4）接种 HEV 病毒后每天观察MDCK细胞是否出现病变现象，当MDCK细胞出现80%-85%病变现象后，反复冻融，收集病变细胞及培养液，-80℃保存待用。
（5）采用上述培养方法发现MDCK细胞可以支持戊型肝炎病毒体外培养并且可以连续传代10代以上，且使病毒复制效率增加至8.0×105拷贝数/mL。
目前公开文献中虽然有关于HEV细胞培养体系建立的报道，但这些已公开的细胞体系均采用癌细胞系，而且采用现有的细胞培养体系进行HEV体外培养时必须要接种较高滴度的病毒（108拷贝/mL）才能在体外维持培养，此外在后代细胞悬液中病毒滴度会减低，不能稳定连续传代培养；另外癌细胞系不能用于HEV疫苗的研发与生产。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
（1）本发明采用MDCK细胞，能够在体外连续传代培养；
（2）本发明采用MDCK细胞进行HEV体外培养后，可以大量检测到HEV抗原，证实MDCK细胞可以支持HEV体外复制；
（3）本发明采用MDCK细胞进行HEV体外培养后，在连续10代以上细胞悬液中均能够检测到HEV RNA，且具有较高的病毒拷贝；
（4）本发明采用MDCK细胞进行HEV体外培养后，在后代细胞悬液中检测到高于接种量的病毒拷贝，证实MDCK细胞可以支持HEV的复制；
（5）本发明采用MDCK细胞体外培养HEV，后期可用于HEV疫苗研发与生产。
附图说明
图1是本发明中RT-nPCR检测培养上清中HEV RNA示意图；其中1为未感染的MDCK细胞；2为HEV感染的MDCK细胞；
图2是本发明中 RT-qPCR检测连续培养10代的培养上清中HEV 病毒拷贝示意图；
图3是本发明中使用的MDCK细胞感染 HEV 的免疫共聚焦示意图；其中上排图为正常MDCK细胞，下排图为 HEV 感染24小时后的MDCK细胞。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容；实施例中主要采用常规的细胞生物学方法，这些方法是本领域普通技术人员所熟知的。按照以下实施例，不难根据具体情况略作修改和变换而成功实施本发明，这些修改和变换均落在本申请权利要求的范围内。
实施例1：MDCK细胞体外培养戊型肝炎病毒
1、自液氮中取出MDCK细胞（购买于美国 ATCC）立即放入37℃的温水中，使细胞悬液快速融化；1500转离心5分钟后，转移至10cm3细胞培养瓶中，加入含有体积百分比10％新生牛血清的 DMEM培养液（购买于 GIBCO Invitrogen Corporation公司），于37℃培养，待长成致密单层后，用PBS（购买于 GIBCO Invitrogen Corporation 公司）洗细胞，胰酶-EDTA（购买于 GIBCO Invitrogen Corporation 公司）消化，加入上述培养液，置于37℃、5%CO2 培养箱中继续培养；
2、将收集到的用于HEV分离的 HEV 阳性粪便制备重量体积比10% 的 PBS（pH7.4）粪便悬液，剧烈震荡，使粪便乳化，经4℃，12000g离心10分钟，收集上清，依次经0.45μm和0.22μm滤膜过滤除菌，加入病毒溶液体积2%的双抗溶液（400U/mL青霉素和1000U/mL链霉素）4℃处理3h，液氮中保存备用，经 Real-time qPCR 测定其病毒拷贝数为2.4×104拷贝数/mL，分离自中国云南昆明市 HEV RNA 阳性猪粪便样品，基因型为4型；
3、将实施例1中细胞（MDCK细胞）按2×105 /mL接种至10cm3细胞培养瓶中，用含体积百分比10%胎牛血清的DMEM 培养基在 37℃、5% CO2培养箱中静止培养细胞，当细胞长至单层的70-80%，弃上清培养基，每个细胞培养瓶加1mL HEV病毒悬液，置于37℃孵育2h，每隔30分钟轻微摇晃一次，使病毒充分吸附到细胞上，2小时后加入含体积百分比2%胎牛血清的DMEM 培养基，同时添加终浓度为 0.01 mmol/L MgCl2保护病毒颗粒的完整性及增强病毒与细胞的吸附作用，置于37℃、5% CO2培养箱中继续培养；当细胞病变达到85%时反复冻融使细胞完全脱落，收获病毒；对应用上述培养方法获得的细胞悬液运用 RT-PCR 检测培养上清中有 HEV的RNA（图1）；结果证实MDCK细胞可以体外培养HEV。
实施例2：MDCK细胞体外连续培养戊型肝炎病毒
1、自液氮中取出MDCK细胞（购买于美国 ATCC）立即放入 37℃的温水中，使细胞悬液快速融化；1500转离心5分钟后，然后转移至10cm3细胞培养瓶中，加入含有体积百分比10％新生牛血清 DMEM（购买于 GIBCO Invitrogen Corporation公司）培养液，置于37℃培养，待长成致密单层后，用 PBS（购买于 GIBCO Invitrogen Corporation 公司）洗细胞，胰酶-EDTA（购买于 GIBCO Invitrogen Corporation 公司）消化，加入上述培养液，置于37℃、5% CO2 培养箱中继续培养；
2、将收集到的用于HEV分离的 HEV 阳性粪便制备重量体积比15%的PBS（pH7.4）粪便悬液，剧烈震荡，使粪便乳化，经4℃，12000g离心10min，收集上清，依次经过0.45μm和0.22μm滤膜过滤除菌，加入病毒溶液体积5%的双抗溶液（400U/mL青霉素和1000U/mL链霉素）6℃处理2h，液氮中保存备用，经 Real-time qPCR 测定其病毒拷贝数为3.1×104拷贝数/mL；
3、将实施例1中细胞（MDCK细胞）按1.8×105 /mL接种至10cm3细胞培养瓶中，用含质量百分比10%胎牛血清的 DMEM 培养基在 37℃、5%CO2培养箱中静止培养细胞，当细胞长至单层的70-80%，弃上清培养基，每个细胞培养瓶中加0.9mL HEV病毒悬液，置36℃孵育2.5h，每隔15分钟轻微摇晃一次，使病毒充分吸附到细胞上，3小时后加入含质量百分比5%胎牛血清的 DMEM 培养基，同时添加终浓度为 0.01 mmol/L MgCl2保护病毒颗粒的完整性，置于37℃、5% CO2培养箱中继续培养；当细胞病变达到83%时反复冻融使细胞完全脱落，收获病毒；
4、用步骤3中获得的HEV MDCK细胞培养上清接种新的MDCK细胞，操作同步骤3，当细胞病变达到85%时反复冻融使细胞完全脱落，收获病毒，连续传代10代；
5、对应用上述培养方法获得的不同代次（10代）的HEV体外细胞培养上清用 RT-qPCR 检测HEV病毒拷贝（图 2）。结果证实MDCK细胞可以体外培养HEV，并且能够有效传代10代以上。
实施例3：荧光共聚焦显微镜观察HEV感染MDCK细胞
1、自液氮中取出MDCK细胞（购买于美国 ATCC）立即放入37℃的温水中，使细胞悬液快速融化；1500转离心5分钟后，然后转移至10cm3细胞培养瓶中，加入含有体积百分比10％新生牛血清 DMEM（购买于 GIBCO Invitrogen Corporation公司）培养液，于37℃培养，待长成致密单层后，用 PBS（购买于 GIBCO Invitrogen Corporation 公司）洗细胞，胰酶-EDTA（购买于 GIBCO Invitrogen Corporation 公司）消化，加入上述培养液，置于37℃、5% CO2 培养箱中继续培养；
2、将收集到的用于HEV分离的 HEV 阳性粪便制备重量体积比15%的PBS（pH7.4）粪便悬液，剧烈震荡，使粪便乳化，经4℃，12000g离心10min，收集上清，依次经过0.45μm和0.22μm滤膜过滤除菌，加入病毒溶液体积5%的双抗溶液（400U/mL青霉素和1000U/mL链霉素）6℃处理2h，液氮中保存备用，经 Real-time qPCR 测定其病毒拷贝数为2.8×104拷贝数/mL；
3、将实施例2中细胞（MDCK细胞）按1.9×105 /mL接种至6孔板中爬片，用含质量百分比10%胎牛血清的 DMEM 培养基在 37℃、5%CO2培养箱中静止培养细胞，当细胞长至单层的70-80%，弃上清培养基，每孔中加0.8mL HEV病毒悬液，置35℃孵育3h，每隔20分钟轻微摇晃一次，使病毒充分吸附到细胞上，2.5小时后加入含质量百分比3%胎牛血清的 DMEM 培养基，同时添加终浓度为 0.01 mmol/L MgCl2保护病毒颗粒的完整性，置于37℃、5% CO2培养箱中继续培养；
4、在培养24小时后，取出玻片，用PBS（购买于 GIBCO Invitrogen Corporation公司）洗3次细胞，4%多聚甲醛，室温固定细胞15分钟，PBS洗三次。加入HEV ORF2单克隆抗体（MAB8003,购买于美国Millipore公司，用PBS 1:200进行稀释），37℃处理1h；PBS洗三次，加入Fluorescein(FITC)-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG荧光二抗 (购买于美国Abcam公司，用PBS 1:1000进行稀释)，室温放置45分钟；PBS洗三次，加入4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI，1 µg/mL)，室温放置15分钟；PBS洗三次，荧光共聚焦显微镜观察HEV ORF2衣壳蛋白表达情况（红色荧光，见图3）；结果证实：MDCK细胞能够体外成功培养HEV。

Claims (1)

1.一种体外培养基因型4型戊型肝炎病毒的方法，其特征在于：采用MDCK细胞对戊基因型4型戊型肝炎病毒进行体外培养；
上述方法具体步骤如下：
（1）将基因型4型戊型肝炎病毒悬液依次经 0.45μm 和0.22μm 滤膜过滤除菌后，加入病毒悬液体积2～5%的双抗溶液，4～8℃处理2～3h，液氮中保存备用，经 Real-time qPCR测定其病毒拷贝数为2.4×104～3.3×105拷贝数/mL，其中双抗溶液为含有400U/mL 青霉素和1000U/mL 链霉素的溶液；
（2）将MDCK细胞按1.8×105～2×105/mL接种至10cm3的细胞培养瓶，用含体积百分比10%胎牛血清的 DMEM培养基在37℃、5% CO2培养箱中静止培养细胞，直至细胞长成单层；
（3）按每瓶0.8～1mL的接种量，将步骤（1）基因型4型戊型肝炎病毒悬液接种至步骤（2）单层细胞中，置于35～37℃下孵育2～3小时，每15～30min 轻微摇匀一次，使病毒充分吸附到细胞上；2～3小时后加入含体积百分比2%～5%胎牛血清的 DMEM 培养基，同时添加终浓度为 0.01mmol/L MgCl2保护病毒颗粒的完整性及增强病毒与细胞的吸附作用，置于37℃、5% CO2培养箱中继续培养；
（4）当MDCK细胞出现80%-85%病变现象后，反复冻融，收集病变细胞及培养液，-80℃保存待用。
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