JP2013067646A

JP2013067646A - 水中油型エマルジョンアジュバントを含むワクチン

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Publication number: JP2013067646A
Application number: JP2012272452A
Authority: JP
Inventors: William Ripley Ballou Jr; バルー，ウィリアム，リプリー，ジュニア; Emmanuel Jules Hanon; ハノン，エマニュエル，ジュール
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2006-10-12
Filing date: 2012-12-13
Publication date: 2013-04-18
Anticipated expiration: 2027-10-10
Also published as: PT2086582E; MA30866B1; JP5767201B2; US20150359863A1; KR101151202B1; CR10726A; IL197512A0; BRPI0717219A2; AU2007306381A1; CN101522218B; MX2009003325A; AU2007306381B2; CA2664619C; JP5230632B2; ES2397714T3; US9700605B2; HRP20130023T1; BRPI0717219B8; EA200900350A1; IL197512A

Abstract

【課題】改良されたワクチンおよび免疫原性組成物ならびに医学におけるその使用法の提供。
【解決手段】、抗原または抗原組成物と、水中油型エマルジョンがヒト用量あたり0.5〜10 mgの代謝可能油、0.5〜11 mgのトコールおよび0.1〜4 mgの乳化剤を含む、該水中油型エマルジョンを含むアジュバント組成物とを含む免疫原性組成物。
【選択図】なし

Description

本発明は、改良されたワクチンおよび免疫原性組成物ならびに医学におけるその使用に関する。特に、本発明は、水中油型エマルジョンがトコール、代謝可能油および乳化剤を含む、該水中油型エマルジョンアジュバントを含むワクチンまたは免疫原性製剤および医学におけるその使用、特に、様々な抗原に対する免疫応答の増加におけるその使用、ならびに調製の方法に関する。

改良された免疫原性を有する新規組成物またはワクチンは常に必要とされている。1つの戦略として、アジュバントを用いて、任意の所与の抗原に対する免疫応答を改良し、および／または宿主における反応原性／毒性を低下させようとすることである。

水中油型エマルジョン自体は当業界で公知であり、アジュバント組成物として有用であると提唱されている(EP 399843；WO 95/17210)。

WO 95/17210は、2〜10％のスクアレン、2〜10％のα-トコフェロールおよび0.3〜3％のtween 80を含む水中油型エマルジョンならびに単独で、またはQS21および／もしくは3D-MPLとの組合せにおけるその使用を開示している。

WO 99/12565は、代謝可能油、サポニンおよびステロールを含む水中油型エマルジョン組成物を開示している。この水中油型エマルジョンは、3D-MPLをさらに含む。

WO 99/11241は、代謝可能油とサポニンが1:1〜200:1の比率で存在する、代謝可能油とサポニンを含む水中油型エマルジョンを開示している。

好適な免疫応答を提供し、宿主における反応原性が低い改良されたワクチンおよび免疫原性組成物の必要性が依然として存在する。

本発明者らは、組成物内で抗原または抗原性組成物に対する比較可能な免疫応答を依然として維持しながら、水中油型エマルジョンの各成分の少ない容量を含むワクチンまたは免疫原性組成物を用いることができることを見出した。これは、宿主レシピエント内の反応原性を低下させながら、抗原に対する免疫原性のレベルを維持する利点を有する。

従って、本発明の第1の態様においては、抗原または抗原性組成物と、水中油型エマルジョンがヒト用量あたり、0.5〜10 mgの代謝可能油、0.5〜11 mgのトコールおよび0.4〜4 mgの乳化剤を含む、該水中油型エマルジョンを含むアジュバント組成物とを含む免疫原性組成物が提供される。

本発明の別の態様においては、抗原または抗原性組成物と、水中油型エマルジョンがヒト用量あたり0.5〜10 mgの代謝可能油、0.5〜11 mgのトコールおよび0.4〜4 mgの乳化剤を含む、該水中油型エマルジョンを含むアジュバント組成物とを含むワクチン組成物が提供される。

本発明のさらなる態様においては、感染および／または疾患の予防のための免疫原性組成物の製造における、抗原または抗原性組成物と、水中油型エマルジョンが0.5〜10 mgの代謝可能油、0.5〜11 mgのトコールおよび0.4〜4 mgの乳化剤を含む、該水中油型エマルジョンを含むアジュバント組成物とを含むワクチンまたは免疫原性組成物の使用が提供される。

さらなる態様においては、免疫原性組成物中の抗原が由来する病原体の変異体である病原体により引き起こされる感染または疾患に対する防御のための、上記で定義された方法または使用が提供される。別の実施形態においては、免疫原性組成物中のその抗原の変異体である抗原を含む病原体により引き起こされる感染または疾患に対する防御のための上記で定義された方法または使用が提供される。

臨床試験：様々な時点での抗HA抗体に関する幾何学的平均力価(GMT)(免疫原性に関するATPコホート)を示す。臨床試験：0日目および21日目での95％信頼区間を有するHI抗体力価に関する血清防御率(SPR)(免疫原性に関するATPコホート)を示す。臨床試験：21日目での95％信頼区間を有するHI抗体力価に関する血清変換率(SCR)(免疫原性に関するATPコホート)を示す。臨床試験：21日目での95％信頼区間を有するHI抗体力価に関する血清変換係数(SCF)(免疫原性に関するATPコホート)を示す。マウス試験：ヘテロサブタイプ株(用量範囲AS03)でプライミングされたBALB/cマウスにおける血球凝集抑制試験(GMT +/- IC95)を示す。図5A：抗A/ニューカレドニア/20/99 HI力価；図5B：抗A/パナマ/2007/99 HI力価；図5C：抗B/山東/7/97 HI力価。図５−１の続きである。マウス試験：ヘテロサブタイプ株(用量範囲AS03)でプライミングされたC57Bl/6マウスにおける血球凝集抑制試験(GMT +/- IC95)を示す。マウス試験：ヘテロサブタイプ株(用量範囲AS03)でプライミングされたC57Bl/6マウスに由来するPBMCにおける細胞性免疫応答(CD4+ T細胞)を示す。マウス試験：ヘテロサブタイプ株でプライミングされ、用量範囲AS03でアジュバント化された低用量抗原(0.5μg)で免疫されたC57Bl/6マウスに由来するPBMCにおける細胞性免疫応答(CD4+ T細胞)を示す。マウス試験：2種の異なる抗原用量：1.5μg(A、CおよびE)または0.38μg(B、DおよびF)に関する、免疫後14日目のH5N1特異的血清Ig ELISA力価(AおよびB)ならびに抗H5N1 IgG1(CおよびD)およびIgG2b(EおよびF)アイソタイプ応答(GMT +/- IC95)を示す。図９−１の続きである。図９−２の続きである。マウス試験：2種の異なる抗原用量：1.5μg(A)または0.38μg(B)に関する、免疫後21日目(GMT +/- IC95)の血球凝集抑制試験(GMT +/- IC95)を示す。マウス試験：用量範囲AS03でアジュバント化された異なる用量のH5N1ワクチン(1.5または0.38μg)((A)1.5μgのHA Ag(抗原)または(B)0.38μgのHA Ag(抗原))で免疫されたナイーブなC57Bl/6マウスにおける細胞性免疫応答(CD4+ T細胞)を示す。図１１−１の続きである。ブタ試験：相同株(用量範囲AS03)でプライミングされたブタにおける血球凝集抑制試験(GMT +/- IC95)を示す。

本明細書における用語「含む(comprising)」、「含む(comprise)」および「含む(comprises)」は、全ての例において、それぞれ、用語「からなる(consisting of)」、「からなる(consist of)」および「からなる(consists of)」と必要に応じて置換可能であることが本発明者らにより意図される。

本発明の「ワクチン組成物」に関する本明細書に記載の実施形態はまた、本発明の「免疫原性組成物」に関する実施形態、およびその逆に対しても適用可能である。

本発明の一実施形態においては、抗原または抗原組成物と、水中油型エマルジョンがヒト用量あたり0.5〜10 mgの代謝可能油、0.5〜11 mgのトコールおよび0.4〜4 mgの乳化剤を含む、該水中油型エマルジョンからなるアジュバント組成物とを含むワクチンまたは免疫原性組成物が提供される。

本発明のさらなる実施形態においては、抗原または抗原組成物と、水中油型エマルジョンがヒト用量あたり0.5〜10 mgの代謝可能油(スクアレンなど)、0.5〜11 mgのトコール(α-トコフェロールなど)および0.4〜4 mgの乳化剤(ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートなど)を含む、該水中油型エマルジョンを含むアジュバント組成物とを含むワクチンまたは免疫原性組成物が提供される。

水中油型エマルジョン成分
本発明のアジュバント組成物は、水中油型エマルジョンアジュバントを含み、好ましくは、該エマルジョンは0.5〜10 mgの量の代謝可能油、0.5〜11 mgの量のトコールおよび0.4〜4 mgの量の乳化剤を含み、強度少なくとも70％の油滴が1μm未満の直径を有する。

任意の水中油型組成物をヒト投与にとって好適なものとするために、エマルジョン系の油相は代謝可能油を含む必要がある。用語「代謝可能油」の意味は当業界でよく知られている。代謝可能性を、「代謝により変換され得ること」と定義することができる(Dorland's Illustrated Medical Dictionary, W.B. Sanders Company、第25版(1974))。この油は、レシピエントに対して毒性的ではなく、代謝により変換され得る任意の野菜油、魚油、動物油または合成油であってよい。ナッツ、種子、および穀物は、野菜油の一般的な起源である。合成油もまた本発明の一部であり、NEOBEE(登録商標)および他のものなどの市販の油が挙げられる。特に好適な代謝可能油は、スクアレンである。スクアレン(2,6,10,15,19,23-ヘキサメチル-2,6,10,14,18,22-テトラコサヘキサエン)は、サメの肝油中に大量に認められ、オリーブ油、小麦胚種油、ぬか油、および酵母中に少量に認められる不飽和の油であり、本発明における使用にとって特に好ましい油である。スクアレンは、それがコレステロールの生合成における中間体であるという事実により、代謝可能油である(Merck index、第10版、エントリー番号8619)。

好適には、代謝可能油は、0.5〜10 mg、好ましくは、1〜10、2〜10、3〜9、4〜8、5〜7、または5〜6 mg(例えば、2〜3、5〜6、または9〜10 mg)、具体的には、5.35 mgまたは2.14 mgの量でアジュバント組成物中に存在する。本発明のさらなる実施形態においては、代謝可能油は、0.5〜10 mg、好ましくは、1〜10、2〜10、3〜9、4〜8、5〜7、または5〜6 mg(例えば、2〜3、5〜6、または9〜10 mg)、具体的には、5.35 mgまたは2.14 mgの量でワクチン(または免疫原性)組成物中に存在する。

ワクチンまたは免疫原性組成物中の代謝可能油の量を、全組成物の割合として表すことができる。好適には、代謝可能油は、全組成物容量の0.5％〜2％、好ましくは0.25〜2、または0.25〜1.75、または0.5〜1.65、または0.6〜1.5、または0.8〜1.4または1〜1.25％(v/v)の油の量でワクチン組成物中に存在する。

別の特定の実施形態においては、代謝可能油は、ワクチン(または免疫原性)組成物の全量の約1.25％の最終量で存在する。別の特定の実施形態においては、代謝可能油は、全組成物容量の0.25％(v/v)の最終量で存在する。

明確にするために、v/vで与えられる濃度を、以下の変換係数：5％(v/v)のスクアレン濃度は4.28％(w/v)スクアレン濃度と等価である、を適用することにより、w/vでの濃度に変換することができる。

水中油型エマルジョンは、トコールを含む。トコールは当業界でよく知られており、EP0382271に記載されている。好適には、トコールはα-トコフェロールまたはコハク酸α-トコフェロール(コハク酸ビタミンEとしても知られる)などのその誘導体である。好適には、前記トコールは、0.5〜11 mg、好ましくは1〜11、2〜10、3〜9、4〜8、5〜7、5〜6(例えば、10〜11、5〜6、2.5〜3.5または1〜3 mg)の量でアジュバント組成物中に存在する。特定の実施形態においては、トコールは5.94 mgまたは2.38 mgの量で存在する。さらなる実施形態においては、好適には、前記トコールは0.5〜11 mg、好ましくは1〜11、2〜10、3〜9、4〜8、5〜7、5〜6(例えば、10〜11、5〜6、2.5〜3.5または1〜3 mg)の量でワクチン(または免疫原性)組成物中に存在する。特定の実施形態においては、トコールは5.94 mgまたは2.38 mgの量で存在する。

トコールの量を、全ワクチンまたは免疫原性組成物容量の割合として表すことができる。好適には、トコールは免疫原性組成物の全量の0.25％〜2％(v/v)の量でワクチン組成物中に存在し、好ましくは、0.25〜2で、全量の0.25〜2、または0.25〜1.75、または0.5〜1.65、または0.6〜1.5、または0.8〜1.4または1〜1.25％(v/v)のトコールを含む。

好ましくは、トコールはワクチン(または免疫原性)組成物の全量の0.2％〜2％(v/v)の量で存在し、より好ましくは、0.5 ml用量中に1.25％(v/v)の量で存在する。

特定の実施形態においては、トコールはワクチンまたは免疫原性組成物の全量の約1.25％の最終量で存在する。別の特定の実施形態においては、トコールは全量の0.25％(v/v)または0.5 ml用量中の1.25％(v/v)または0.7 ml用量中の0.9％(v/v)、または0.5 ml用量中の0.5％(v/v)または0.7 mlのワクチンもしくは免疫原性用量中の0.35〜0.37％、好ましくは0.36％の最終量で存在する。

明確にするために、v/vで与えられる濃度を、以下の変換係数：5％(v/v)のα-トコフェロール濃度は4.8％(w/v)α-トコフェロール濃度と等価である、を適用することにより、w/vでの濃度に変換することができる。

水中油型エマルジョンはさらに、乳化剤を含む。好適には、乳化剤はポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートであってよい。特定の実施形態においては、乳化剤をPolysorbate(登録商標)80またはTween(登録商標)80を含む群より選択することができる。

前記乳化剤は、好適には0.1〜5、0.2〜5、0.3〜4、0.4〜3または2〜3 mg(例えば、0.4〜1.2、2〜3または4〜5 mg)の乳化剤の量でアジュバント組成物中に存在する。特定の実施形態においては、乳化剤は0.97 mgまたは2.425 mgの量で存在する。

さらに、前記乳化剤は、好適には0.1〜5、0.2〜5、0.3〜4、0.4〜3または2〜3 mg(例えば、0.4〜1.2、2〜3または4〜5 mg)の乳化剤の量でワクチンまたは免疫原性組成物中に存在する。特定の実施形態においては、乳化剤は0.97 mgまたは2.425 mgの量で存在する。

乳化剤の量を、全ワクチンまたは免疫原性組成物容量の割合として表すことができる。好適には、乳化剤は、前記組成物の全量の0.125〜0.8％(v/v)の量、好ましくは、全量の0.08〜0.5、または0.1〜0.7、または0.2〜0.6、または0.25〜0.55、または0.3〜0.52または0.4〜0.5％(v/v)でワクチン(または免疫原性)組成物中に存在する。特定の実施形態においては、乳化剤は全ワクチンまたは免疫原性組成物容量の1％、0.5％または0.2％(v/v)の量で存在する。

明確にするために、v/vで与えられる濃度を、以下の変換係数：1.8％(v/v)のポリソルベート80濃度は1.91％(w/v)のポリソルベート80濃度と等価である、を適用することにより、w/vでの濃度に変換することができる。

特定の実施形態においては、0.5 mlのワクチンまたは免疫原性用量は、0.45％(v/v)のTween 80を含み、0.7 mlの用量は0.315％(v/v)のTween 80を含む。別の特定の実施形態においては、0.5 mlの用量は0.18％(v/v)の乳化剤を含み、0.7 mlのワクチンまたは免疫原性組成物用量は0.126％(v/v)の乳化剤を含む。

用語「ヒト用量」とは、ヒトにおける使用にとって好適な容量にある用量を意味する。一般的には、これは0.25〜1.5 mlである。一実施形態においては、ヒト用量は0.5 mlである。さらなる実施形態においては、ヒト用量は0.5 mlより高く、例えば、0.6、0.7、0.8、0.9または1 mlである。さらなる実施形態においては、ヒト用量は1 ml〜1.5 mlである。別の実施形態においては、特に、免疫原性組成物が小児集団のためのものである場合、ヒト用量は0.25〜0.5 mlなどの0.5 ml未満であってよい。本発明は、免疫原性組成物内のアジュバントの個々の成分の各々または全部が、以前には有用であると考えられていたものよりも低いレベルであり、典型的には上記で引用されたものであることを特徴とする。特に好適な組成物は、0.5 mlのヒト用量の最終容量にある以下の量の以下のアジュバント成分を含む。

（表１）

本発明はさらに、例えば、表1に例示されたものだけでない、上記で定義された量の上記で定義された個々の成分を含むアジュバント組成物を提供する。典型的には、そのようなアジュバント組成物は、ヒト用量に好適な容量にあるであろう。アジュバントが液体形態の抗原性組成物と混合される液体形態にある場合、アジュバント組成物は、例えば、ヒト用量の意図される最終容量の約半分、例えば、0.7 mlの意図されるヒト用量については350μl容量、または0.5 mlの意図されるヒト用量については250μl容量などの、ヒト用量の意図される最終容量の画分であるヒト用量に好適な容量にあるであろう。抗原組成物と混合して最終ヒト用量のワクチンを提供する場合、アジュバント組成物を希釈する。そのような用量の最終容量は勿論、アジュバント組成物の最初の容量およびアジュバント組成物に添加される抗原組成物の容量に依存して変化するであろう。代替的な実施形態においては、液体アジュバントを用いて、凍結乾燥された抗原組成物を再構成する。この実施形態においては、アジュバント組成物のヒト用量に好適な容量は、ヒト用量の最終容量とほぼ等しい。液体アジュバント組成物を、凍結乾燥された抗原組成物を含むバイアルに添加する。最終ヒト用量は0.5〜1.5 mlの間で変化してもよい。

水中油型エマルジョンを製造する方法は当業者にはよく知られている。一般的には、その方法は、トコールを含有する油相と、PBS/TWEEN80(商標)溶液などの界面活性剤とを混合した後、ホモジェナイザーを用いて均質化することを含み、少量の液体を均質化するには、シリンジ針を通して混合物を2回通過させることを含む方法が好適であることが当業者には明らかであろう。同じく、マイクロフルイダイザー(M110S Microfluidics装置、最大50回通過、6バールの最大圧入力(約850バールの出力圧)で2分間)における乳化プロセスを当業者により適合させて、少量または大量のエマルジョンを製造することができる。この適合化を、調製が必要な直径の油滴と共に達成されるまで、得られるエマルジョンの測定を含む日常的な実験により達成することができる。

水中油型エマルジョンにおいては、油と乳化剤は水性担体中にあるべきである。水性担体は、例えば、リン酸緩衝生理食塩水であってよい。

好ましくは、本発明の水中油型エマルジョン系は、マイクロメートル以下の範囲の小さい油滴サイズを有する。好適には、液滴サイズは直径120〜750 nm、より好ましくは120〜600 nmの範囲にあるであろう。最も好ましくは、水中油型エマルジョンは、強度少なくとも70％の油滴が直径500 nm未満であり、より好ましくは、強度少なくとも80％が直径300 nm未満であり、より好ましくは強度少なくとも90％が直径120〜200 nmの範囲にある、当該油滴を含有する。

本発明に従う油滴サイズ、すなわち、直径を、強度により与える。油滴サイズの直径を強度により決定するいくつかの方法が存在する。強度を、サイズ決定装置の使用、好適には、Malvern Zetasizer 4000または好ましくはMalvern Zetasizer 3000HSなどの動的光散乱により測定する。詳細な手順を実施例II.2に与える。第1の可能性は、動的光散乱によりz平均直径ZADを決定することである(PCS-光子相関分光法)；この方法はさらに、多分散性指数(PDI)を与え、ZADおよびPDIは共にキュムラントアルゴリズムを用いて算出される。これらの値は粒子屈折率の知識を必要としない。第2の手段は、別のアルゴリズム、ContinもしくはNNLS、または自動「Malvern」のもの(サイズ決定装置により提供されるデフォルトアルゴリズム)により全粒子径分布を決定することにより、油滴の直径を算出することである。多くの場合、複合体組成物の粒子屈折率は未知であるので、強度分布のみを考慮に入れ、必要に応じて、強度はこの分布から生じることを意味する。

任意的な免疫刺激剤
本発明のさらなる実施形態においては、抗原または抗原組成物と、水中油型エマルジョンが0.5〜10 mgの代謝可能油、0.5〜11 mgのトコールおよび0.4〜4 mgの乳化剤を含む、該水中油型エマルジョンおよび必要に応じて、1種以上のさらなる免疫刺激剤を含むアジュバント組成物とを含むワクチンまたは免疫原性組成物が提供される。

一実施形態においては、アジュバント組成物は、本明細書に記載の油および水のエマルジョンを含む。さらなる実施形態においては、アジュバント組成物はさらに、1種以上のさらなるアジュバントまたは免疫刺激剤を含んでもよい。さらなる実施形態においては、アジュバント組成物は、必要に応じてQS21および／もしくはMPL以外の1種以上のさらなるアジュバントまたは免疫刺激剤を含む。

任意的な追加のアジュバントを、サポニン、リピドAもしくはその誘導体、免疫刺激オリゴヌクレオチド、アルキルグルコサミニドホスフェート、金属塩、toll様受容体アゴニストまたはその組合せからなる群より選択する。このアジュバントは、Toll様受容体アゴニスト、特に、Toll様受容体2、3、4、7、8もしくは9のアゴニスト、またはサポニンである。アジュバント系は上記一覧からの2種以上のアジュバントを含むことがさらに好ましい。好ましくは、組合せはサポニン(特に、QS21)アジュバントおよび／または3D-MPLなどのToll様受容体4アゴニストもしくはCpG含有免疫刺激オリゴヌクレオチドなどのToll様受容体9アゴニストを含む。他の好ましい組合せは、サポニン(特に、QS21)ならびにサポニン(特に、QS21)などのToll様受容体4アゴニストおよび3D-MPLまたはアルキルグルコサミニドホスフェートなどのToll様受容体4リガンドを含む。

一実施形態においては、追加のアジュバントは、Toll様受容体(TLR)4リガンド、好ましくは、リピドA誘導体、特にモノホスホリルリピドAまたはより具体的には3-脱アシル化モノホスホリルリピドA(3D-MPL)などのアゴニストである。

3D-MPLは、GlaxoSmithKline Biologicals North Americaにより商標MPL(登録商標)の下で入手可能であり、主にIFN-g(Th1)表現型を有するCD4+ T細胞応答を促進する。それを、GB 2 220 211 Aに開示された方法に従って製造することができる。化学的には、それは3-脱アシル化モノホスホリルリピドAと、3、4、5または6アシル化鎖との混合物である。好ましくは、本発明の組成物においては、小粒子3D-MPLを用いる。小粒子3D-MPLは、それを0.22μmフィルターを通して滅菌濾過することができるような粒子径を有する。そのような調製物は国際特許出願WO 94/21292に記載されている。リピドAの合成誘導体は公知であり、限定されるものではないが、
OM174(2-デオキシ-6-o-[2-デオキシ-2-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラ-デカノイルアミノ]-4-o-ホスホノ-β-D-グルコピラノシル]-2-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]-α-D-グルコピラノシルジヒドロゲンホスフェート) (WO 95/14026)、
OM 294 DP (3S, 9 R)-3--[(R)-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9(R)-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]デカン-1,10-ジオール,1,10-ビス(ジヒドロゲンホスフェート) (WO99 /64301およびWO 00/0462)、
OM 197 MP-Ac DP (3S-, 9R)-3-[(R)-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]デカン-1,10-ジオール,1-ジヒドロゲンホスフェート10-(6-アミノヘキサノエート) (WO 01/46127)、
などのTLR4アゴニストであると考えられる。

用いることができる他のTLR4リガンドは、WO 9850399もしくはUS6303347(AGPの調製のためのプロセスも開示されている)に開示されたものなどのアルキルグルコサミニドホスフェート(AGP)、またはUS6764840に開示されたAGPの製薬上許容し得る塩である。いくつかのAGPはTLR4アゴニストであり、いくつかはTLR4アンタゴニストである。両方ともアジュバントとして有用であると考えられる。

TLR-4を介するシグナリング応答を引き起こすことができる他の好適なTLR-4リガンド(Sabroeら、JI 2003 p1630-5)は、例えば、グラム陰性細菌に由来するリポ多糖およびその誘導体、またはその断片、特に、LPSの非毒性誘導体(3D-MPLなど)である。他の好適なTLRアゴニストは、熱ショックタンパク質(HSP)10、60、65、70、75もしくは90；界面活性剤プロテインA、ヒアルロン酸オリゴ糖、ヘパラン硫酸断片、フィブロネクチン断片、フィブリノゲンペプチドおよびb-デフェンシン-2、ムラミルジペプチド(MDP)または呼吸器合胞体ウイルスのFタンパク質である。一実施形態においては、TLRアゴニストはHSP 60、70または90である。

Toll様受容体(TLR)は、昆虫とヒトの間で進化的に保存されたI型膜貫通受容体である。今までのところ、10種のTLR(TLR 1-10)が確立されている(Sabroeら、JI 2003 p1630-5)。TLRファミリーのメンバーは類似する細胞外および細胞内ドメインを有する；その細胞外ドメインはロイシンに富む反復配列を有することが示されており、その細胞内ドメインはインターロイキン-1受容体(IL-1R)の細胞内領域と類似している。TLR細胞は免疫細胞および他の細胞(血管上皮細胞、脂肪細胞、心筋細胞および腸上皮細胞など)の間で示差的に発現される。TLRの細胞内ドメインはアダプタータンパク質Myd88と相互作用し、その細胞質領域中にIL-1Rドメインをも有し、サイトカインのNF-KB活性化を誘導することができる；このMyd88経路は、サイトカイン放出がTLR活性化により行われる一方通行である。TLRは、抗原提示細胞(例えば、樹状細胞、マクロファージなど)などの細胞型において主に発現される。

TLRを介する刺激による樹状細胞の活性化は、樹状細胞の成熟、およびIL-12などの炎症性サイトカインの産生を誘導する。今までのところ行われた研究により、TLRは異なる型のアゴニストを認識するが、いくつかのアゴニストはいくつかのTLRにとって共通であることが見出された。TLRアゴニストは主に細菌またはウイルスから誘導され、フラゲリンまたは細菌リポ多糖(LPS)などの分子が挙げられる。

「TLRアゴニスト」とは、直接的リガンドとして、または内因性もしくは外因性リガンドの生成を介して間接的に、TLRシグナリング経路を介してシグナリング応答を引き起こすことができる成分を意味する(Sabroeら、JI 2003 p1630-5)。

別の実施形態においては、TLR分子の他の天然または合成アゴニストを、任意的な追加の免疫刺激剤として用いる。これらのものとしては、限定されるものではないが、TLR2、TLR3、TLR7、TLR8およびTLR9に対するアゴニストが挙げられる。

本発明の一実施形態においては、TLR-1を介してシグナリング応答を引き起こすことができるTLRアゴニストを用いる(Sabroeら、JI 2003 p1630-5)。好適には、TLR-1を介してシグナリング応答を引き起こすことができるTLRアゴニストを、トリアシル化リポペプチド(LP)；フェノール可溶性モジュリン；マイコバクテリウム・ツベルクロシスのLP；S-(2,3-ビス(パルミトイルオキシ)-(2-RS)-プロピル)-N-パルミトイル-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys(4)-OH、細菌リポタンパク質のアセチル化アミノ末端を模倣するトリヒドロクロリド(Pam₃Cys)LPおよびボレリア・ブルグドルフェリに由来するOspA LPから選択する。

代替的な実施形態においては、TLR-2を介してシグナリング応答を引き起こすことができるTLRアゴニストを用いる(Sabroeら、JI 2003 p1630-5)。好適には、TLR-2を介してシグナリング応答を引き起こすことができるTLRアゴニストは、1種以上のリポタンパク質、ペプチドグリカン、M. tuberculosis、B. burgdorferi、T. pallidumに由来する細菌リポペプチド；スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)などの種に由来するペプチドグリカン；リポテイコ酸、マンヌロン酸、ナイセリアポリン、細菌線毛、エルシニアビルレンス因子、CMVビリオン、麻疹ヘマグルチニン、および酵母由来ザイモサンである。

代替的な実施形態においては、TLR-3を介してシグナリング応答を引き起こすことができるTLRアゴニストを用いる(Sabroeら、JI 2003 p1630-5)。好適には、TLR-3を介してシグナリング応答を引き起こすことができるTLRアゴニストは、二本鎖RNA(dsRNA)、またはポリイノシン-ポリシチジル酸(ポリIC)、ウイルス感染に関連する分子核酸パターンである。

代替的な実施形態においては、TLR-5を介してシグナリング応答を引き起こすことができるTLRアゴニストを用いる(Sabroeら、JI 2003 p1630-5)。好適には、TLR-5を介してシグナリング応答を引き起こすことができるTLRアゴニストは、細菌線毛である。

代替的な実施形態においては、TLR-6を介してシグナリング応答を引き起こすことができるTLRアゴニストを用いる(Sabroeら、JI 2003 p1630-5)。好適には、TLR-6を介してシグナリング応答を引き起こすことができるTLRアゴニストは、マイコバクテリアリポタンパク質、ジアシル化LP、およびフェノール可溶性モジュリンである。さらなるTLR6アゴニストはWO2003043572に記載されている。

代替的な実施形態においては、TLR-7を介してシグナリング応答を引き起こすことができるTLRアゴニストを用いる(Sabroeら、JI 2003 p1630-5)。好適には、TLR-7を介してシグナリング応答を引き起こすことができるTLRアゴニストは、一本鎖RNA(ssRNA)、ロキソリビン、N7およびC8位でのグアノシン類似体、もしくはイミダゾキノリン化合物、またはその誘導体である。一実施形態においては、TLRアゴニストはイミキモッドである。さらなるTLR7アゴニストはWO02085905に記載されている。

代替的な実施形態においては、TLR-8を介してシグナリング応答を引き起こすことができるTLRアゴニストを用いる(Sabroeら、JI 2003 p1630-5)。好適には、TLR-8を介してシグナリング応答を引き起こすことができるTLRアゴニストは、一本鎖RNA(ssRNA)、抗ウイルス活性を有するイミダゾキノリン分子、例えば、レシキモッド(R848)である；レシキモッドもTLR-7により認識することができる。用いることができる他のTLR-8アゴニストとしては、WO2004071459に記載のものが挙げられる。

免疫刺激オリゴヌクレオチドまたは任意の他のToll様受容体(TLR)9アゴニストを用いることもできる。本発明のアジュバントまたはワクチンもしくは免疫原性組成物における使用にとって好ましいオリゴヌクレオチドは、CpG含有オリゴヌクレオチド、好ましくは、少なくとも3個、より好ましくは、少なくとも6個以上のヌクレオチドにより分離された2個以上のジヌクレオチドCpGモチーフを含有するオリゴヌクレオチドである。CpGモチーフは、シトシンヌクレオチド、次いで、グアニンヌクレオチドである。本発明のCpGオリゴヌクレオチドは、典型的にはデオキシヌクレオチドである。好ましい実施形態においては、オリゴヌクレオチド中のインターヌクレオチドは、ホスホロジチオエート、またはより好ましくは、ホスホロチオエート結合であるが、ホスホジエステルおよび他のヌクレオチド間結合も本発明の範囲内にある。また、混合ヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドも本発明の範囲内に含まれる。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドまたはホスホロジチオエートを製造する方法は、米国特許第5,666,153号、5,278,302号およびWO 95/26204に記載されている。

好ましいオリゴヌクレオチドの例は、以下の配列を有する。この配列は好ましくは、ホスホロチオエート改変ヌクレオチド間結合を含む：
OLIGO 1 (配列番号1): TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826)
OLIGO 2 (配列番号2): TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758)
OLIGO 3 (配列番号3): ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG
OLIGO 4 (配列番号4): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006)
OLIGO 5 (配列番号5): TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668)
OLIGO 6 (配列番号6): TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G (CpG 5456)。

代替的なCpGオリゴヌクレオチドは、それらが重要でない欠失または付加を有する点で上記の好ましい配列を含んでもよい。本発明において用いられるCpGオリゴヌクレオチドを、当業界で公知の任意の方法(例えば、EP 468520)により合成することができる。便利には、そのようなオリゴヌクレオチドを自動化合成装置を用いて合成することができる。

従って、別の実施形態においては、アジュバント組成物はさらに、TLR-1アゴニスト、TLR-2アゴニスト、TLR-3アゴニスト、TLR-4アゴニスト、TLR-5アゴニスト、TLR-6アゴニスト、TLR-7アゴニスト、TLR-8アゴニスト、TLR-9アゴニスト、またはその組合せからなる群より選択される追加の免疫刺激剤を含む。

本発明における使用のための別の好ましい免疫刺激剤は、Quil Aおよびその誘導体である。Quil Aは、南米の樹木キラヤ・サポナリア・モリナ(Quilaja Saponaria Molina)から単離されたサポニン調製物であり、Dalsgaardら、1974(「サポニンアジュバント」、Archiv. fur die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlin, p243-254)によってアジュバント活性を有すると初めて記載された。Quil Aの精製断片、例えば、QS7およびQS21(QA7およびQA21としても知られる)は、Quil Aに関連する毒性なしにアジュバント活性を保持するHPLCにより単離された(EP 0 362 278)。QS-21は、CD8+細胞傷害性T細胞(CTL)、Th1細胞および主なIgG2a抗体応答を誘導するキラヤ・サポナリア・モリナの樹皮から誘導された天然サポニンであり、本発明の内容において好ましいサポニンである。

特に好ましいものであるQS21の特定の製剤が記載されており、これらの製剤はさらにステロールを含む(WO 96/33739)。スクアレンおよびサポニン(必要に応じて、QS21)を含有させる場合、エマルジョン中の油の全体レベルを減少させることができるため、ステロール(必要に応じて、コレステロール)を製剤に含有させることも有益である。これは、製造費用の削減、ワクチン接種の全体的な快適性の改善、ならびにまた、IFN-γ産生の改善などの、得られる免疫応答の定性的および定量的改善をもたらす。従って、本発明のアジュバント系は、典型的には、200:1〜300:1の範囲の比の代謝可能油：サポニン(w/w)を含み、また、本発明を1:1〜200:1、必要に応じて20:1〜100:1、または実質的には48:1である任意の範囲の「低い油」において用いることができ、このワクチンは、かなり低下した反応原性プロフィールを有する、全ての成分の有益なアジュバント特性を保持する。従って、いくつかの実施形態は、1:1〜250:1、または20:1〜200:1、または20:1〜100:1、または実質的には48:1の範囲のスクアレン：QS21(w/w)の比率を有する。必要に応じて、本明細書に記載のサポニン：ステロール比で存在するステロール(例えば、コレステロール)も含有させる。

抗原および抗原組成物
前記ワクチンまたは免疫原性製剤は、ヒトまたは動物病原体に対する免疫応答を引き出すことができる抗原または抗原性組成物を含むであろう。

好適には、前記抗原または抗原性組成物は、HIV-1(gagまたはp24、tat、nef、gp120もしくはgp160などのその断片またはこれらのいずれかの断片)、ヒトヘルペスウイルス(gDもしくはその誘導体またはHSV1もしくはHSV2に由来するICP27などの極初期タンパク質など)、サイトメガロウイルス((特にヒト)(gBもしくはその誘導体など)、ロタウイルス(生弱毒化ウイルスなど)、エプスタイン・バーウイルス(gp350もしくはその誘導体など)、帯状疱疹ウイルス(gpI、IIおよびIE63など)、またはB型肝炎ウイルス(例えば、B型肝炎表面抗原もしくはその誘導体)、A型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルスおよびE型肝炎ウイルスなどの肝炎ウイルス、または他のウイルス病原体、例えば、パラミクソウイルス：呼吸器合胞体ウイルス(F、N、MおよびGタンパク質もしくはその誘導体など)、SARSウイルス、パラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ヒトパピローマウイルス(例えば、HPV6、11、16、18)、フラビウイルス(例えば、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス)もしくはインフルエンザウイルス(全生もしくは不活化ウイルス、卵もしくはMDCK細胞中で増殖させたスプリットインフルエンザウイルス、または全フルービロソーム(R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920により記載)、またはHA、NP、NAもしくはMタンパク質またはその組合せ等のそれらの精製または組換えタンパク質)の1種以上から誘導されるか、またはナイセリア・ゴノレア(N. gonorrhea)およびナイセリア・メニンギティディス(N. meningitidis)などのナイセリア種 (例えば、夾膜多糖およびそのコンジュゲート、トランスフェリン結合タンパク質、ラクトフェリン結合タンパク質、PilC、アドヘシン)；S. pyogenes(例えば、Mタンパク質もしくはその断片、C5Aプロテアーゼ、リポテイコ酸)、S. agalactiae、S. mutans；H. ducreyi；ブランハメラ・カタラリス(Branhamella catarrhalis)としても知られるモラクセラ・カタラリス(M. catarrhalis)(例えば、高分子量および低分子量アドヘシンおよびインベイシン)などのモラクセラ種；ボルデテラ・ペルツシス(B. pertussis)(例えば、ペルタクチン、ペルツシス毒素もしくはその誘導体、繊維性ヘマグルチニン、アデニル酸シクラーゼ、線毛)、ボルデテラ・パラペルツシス(B. parapertussis)およびボルデテラ・ブロンキセプティカ(B. bronchiseptica)などのボルデテラ種；マイコバクテリウム・ツベルクロシス(M. tuberculosis)(例えば、ESAT6、85A、BもしくはC抗原)、マイコバクテリウム・ボビス(M. bovis)、マイコバクテリウム・レプラ(M. leprae)、マイコバクテリウム・アビウム(M. avium)、マイコバクテリウム・パラツベルクロシス(M. paratuberculosis)、マイコバクテリウム・スメグマティス(M. smegmatis)などのマイコバクテリウム種；レジオネラ・ニューモフィラ(L. pneumophila)などのレジオネラ種; 腸毒性大腸菌 (例えば、コロニー形成因子、熱不安定毒素もしくはその誘導体、熱安定性毒素もしくはその誘導体)、腸出血性大腸菌、腸病原性大腸菌(例えば、志賀毒素様毒素もしくはその誘導体)などのエシェリキア種;ビブリオ・コレラ(V. cholera) (例えば、コレラ毒素もしくはその誘導体)などのビブリオ種;シゲラ・ソネイ(S. sonnei)、シゲラ・ディセンテリア(S. dysenteriae)、シゲラ・フレクスネリ(S. flexnerii)などのシゲラ種;エルシニア・エンテロコリティカ(Y. enterocolitica) (例えば、Yopタンパク質)、エルシニア・ペスティス(Y. pestis)、エルシニア・シュードツベルクロシス(Y. pseudotuberculosis)などのエルシニア種;カンピロバクター・ジェジュニ(C. jejuni)(例えば、毒素、アドヘシンおよびインベイシン)およびカンピロバクター・コリ(C. coli)などのカンピロバクター種; サルモネラ・ティフィ(S. typhi)、サルモネラ・パラティフィ(S. paratyphi)、サルモネラ・コレラスイス(S. choleraesuis)、サルモネラ・エンテリティディス(S. enteritidis)などのサルモネラ種;リステリア・モノサイトジェネス(L. monocytogenes)などのリステリア種; Helicobacter spp, including ヘリコバクター・ピロリ(H. pylori)(例えば、ウレアーゼ、カタラーゼ、空胞化毒素)などのヘリコバクター種;シュードモナス・エルギノーサ(P. aeruginosa)などのシュードモナス種;スタフィロコッカス・オーレウス(S. aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(S. epidermidis)などのスタフィロコッカス種;エンテロコッカス・フェカリス(E. faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(E. faecium)などのエンテロコッカス種; クロストリジウム・テタニ(C. tetani)(例えば、破傷風毒素およびその誘導体)、クロストリジウム・ボツリナム(C. botulinum) (例えば、ボツリヌス毒素およびその誘導体)、クロストリジウム・ディフィシル(C. difficile) (例えば、クロストリジウム毒素AもしくはBおよびその誘導体)などのクロストリジウム種; Bacillus spp., including バチルス・アントラシス(B. anthracis) (例えば、ボツリヌス毒素およびその誘導体)などのバチルス種;コリネバクテリウム・ジフテリア(C. diphtheriae) (例えば、ジフテリア毒素およびその誘導体)などのコリネバクテリウム種;ボレリア・ブルグドルフェリ(B. burgdorferi) (例えば、OspA、OspC、DbpA、DbpB)、ボレリア・ガリニ(B. garinii) (例えば、OspA、OspC、DbpA、DbpB)、ボレリア・アフゼリ(B. afzelii) (例えば、OspA、OspC、DbpA、DbpB)、ボレリア・アンダーソニ(B. andersonii) (例えば、OspA、OspC、DbpA、DbpB)、ボレリア・ヘルムシ(B. hermsii)などのボレリア種;エールリヒア・エクイ(E. equi)などのエールリヒア種およびヒト顆粒球エールリヒア症の因子;リケッチア・リケッチ(R. rickettsii)などのリケッチア種;クラミジア・トラコマティス(C. trachomatis) (例えば、MOMP、ヘパリン結合タンパク質)、クラミジア・ニューモニア(C. pneumoniae) (例えば、MOMP、ヘパリン結合タンパク質)、クラミジア・シッタシ(C. psittaci)などのクラミジア種;レプトスピラ・インテロガンス(L. interrogans)などのレプトスピラ種; トレポネマ・パリダム(T. pallidum) (例えば、稀な外膜タンパク質)、トレポネマ・デンティコラ(T. denticola)、トレポネマ・ヒオディセンテリア(T. hyodysenteriae)などのトレポネマ種などの細菌病原体から誘導されるか、またはプラスモジウム・ファルシパルム(P. falciparum)などのプラスモジウム種;トキソプラズマ・ゴンジ(T. gondii)(例えば、SAG2、SAG3、Tg34)などのトキソプラズマ種; エントアメーバ・ヒストリティカ(E. histolytica)などのエントアメーバ種;バベシア・ミクロッティ(B. microti)などのバベシア種;トリパノソーマ・クルージ(T. cruzi)などのトリパノソーマ種;ジアルディア・ランブリア(G. lamblia)などのジアルディア種;レーシュマニア・メジャー(L. major)などのレーシュマニア種;ニューモシスティス・カリニ(P. carinii)などのニューモシスティス種;トリコモナス・バジナリス(T. vaginalis)などのトリコモナス種;シソストーマ・マンソニ(S. mansoni)などのシソストーマ種などの寄生虫から誘導されるか、またはカンジダ・アルビカンス(C. albicans)などのカンジダ種; クリプトコッカス・ネオフォーマンス(C. neoformans)などのクリプトコッカス種などの酵母から誘導される。

本発明の組成物を、アレルギーの予防または治療に用いることができる。そのようなワクチンは、アレルゲン特異的およびアレルゲン非特異的抗原を含むであろう。

M.tuberculosisのための他の好ましい特異的抗原は、例えば、Tb Ra12、Tb H9、Tb Ra35、Tb38-1、Erd 14、DPV、MTI、MSL、mTTC2およびhTCC1(WO 99/51748)である。M. tuberculosisのためのタンパク質としては、M. tuberculosisの少なくとも2個、好ましくは3個のポリペプチドがより大きいタンパク質に融合された融合タンパク質およびその変異体も挙げられる。好ましい融合物としては、Ra12-TbH9-Ra35、Erd14-DPV-MTI、DPV-MTI-MSL、Erd14-DPV-MTI-MSL-mTCC2、Erd14-DPV-MTI-MSL、DPV-MTI-MSL-mTCC2、TbH9-DPV-MTI (WO 99/51748)が挙げられる。

クラミジアのための最も好ましい抗原としては、例えば、高分子量タンパク質(HMW) (WO 99/17741)、ORF3 (EP 366 412)、および推定膜タンパク質(Pmps)が挙げられる。ワクチン製剤の他のクラミジア抗原を、WO 99/28475に記載の群より選択することができる。

好ましい細菌ワクチンは、ストレプトコッカス・ニューモニアなどのストレプトコッカス種に由来する抗原(例えば、PsaA、PspA、ストレプトリシン、コリン結合タンパク質)およびタンパク質抗原ニューモリシン(Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1007; Rubinsら、Microbial Pathogenesis, 25, 337-342)、ならびにその突然変異解毒化誘導体(WO 90/06951; WO 99/03884)を含む。他の好ましい細菌ワクチンは、ヘモフィルス・インフルエンザB型、非分類型ヘモフィルス・インフルエンザなどのヘモフィルス種に由来する抗原、例えば、OMP26、高分子量アドヘシン、P5、P6、Dタンパク質およびリポタンパク質D、ならびにフィンブリンおよびフィンブリン由来ペプチド(米国特許第5,843,464号)またはその多コピー変異体もしくは融合タンパク質を含む。

B型肝炎表面抗原の誘導体は当業界でよく知られており、特に、欧州特許出願EP-A-414 374、EP-A-0304 578、およびEP 198-474に記載されたPreS1、PreS2 S抗原が挙げられる。1つの好ましい態様においては、本発明のワクチン製剤は、特にCHO細胞中で発現される場合、HIV-1抗原、gp120を含む。さらなる実施形態においては、本発明のワクチン製剤は、上記で定義されたgD2tを含む。

本発明の好ましい実施形態においては、特許請求されるアジュバントを含むワクチンは、生殖器疣の原因となると考えられるヒトパピローマウイルス(HPV)(HPV 6またはHPV 11など)ならびに頸部癌の原因となるHPVウイルス(HPV16、HPV18など)から誘導される抗原を含む。

生殖器疣の予防または治療のためのワクチンの特に好ましい形態は、L1タンパク質、ならびにHPVタンパク質E1、E2、E5、E6、E7、L1およびL2から選択される1個以上の抗原を含む融合タンパク質を含む。

融合タンパク質の最も好ましい形態は、WO 96/26277に開示されたL2E7、およびWO 99/10375に開示されたタンパク質D(1/3)-E7である。

好ましいHPV頸部感染または癌の予防または治療のためのワクチン組成物は、HPV16または18抗原を含んでもよい。

特に好ましいHPV16抗原は、Dタンパク質-HPV16由来E6もしくはE7融合物、またはその組合せ；またはE6もしくはE7とL2との組合せ(WO 96/26277)を形成する、Dタンパク質担体との融合物中の初期タンパク質E6またはE7を含む。

あるいは、HPV16もしくは18の初期タンパク質E6およびE7を、単一の分子、好ましくは、Dタンパク質-E6/E7融合物中で提供することができる。必要に応じて、そのようなワクチンは、好ましくは、Dタンパク質-E6もしくはDタンパク質-E7融合タンパク質もしくはDタンパク質 E6/E7融合タンパク質の形態の、HPV18に由来するE6およびE7タンパク質のいずれか、または両方を含んでもよい。

本発明のワクチンはさらに、他のHPV株、好ましくはHPV31または33株に由来する抗原を含んでもよい。

本発明のワクチンまたは免疫原性組成物はさらに、マラリアを引き起こす寄生虫に由来する抗原、例えば、スポロゾイト周囲タンパク質(CSタンパク質)、RTS,S、MSP1、MSP3、LSA1、LSA3、AMA1およびTRAPなどのプラスモジア・ファルシパルム(Plasmodia falciparum)に由来する抗原を含む。RTSは、B型肝炎ウイルスの表面(S)抗原に、B型肝炎表面抗原のpreS2部分の4個のアミノ酸を介して連結されたP.falciparumのスポロゾイト周囲(CS)タンパク質の実質的に全部のC末端部分を含むハイブリッドタンパク質である。その完全な構造は、英国特許出願第9124390.7号から優先権を主張しているWO 93/10152の下で公開された、国際特許出願第PCT/EP92/02591号に開示されている。酵母中で発現された場合、RTSはリポタンパク質粒子として産生されるが、HBVに由来するS抗原と同時に発現される場合、それはRTS,Sとして知られる混合粒子を産生する。TRAP抗原は、WO 90/01496の下で公開された、国際特許出願第PCT/GB89/00895に記載されている。多段階マラリアワクチンの成分の候補の可能性があるプラスモジア抗原は、P.falciparumのMSP1、AMA1、MSP3、EBA、GLURP、RAP1、RAP2、セクエストリン、PfEMP1、Pf332、LSA1、LSA3、STARP、SALSA、PfEXP1、Pfs25、Pfs28、PFS27/25、Pfs16、Pfs48/45、Pfs230およびプラスモジウム種におけるその類似体である。本発明の一実施形態は、抗原調製物がRTS,SもしくはCSタンパク質またはRTS,SのCS部分などのその断片と、1種以上のさらなるマラリア抗原とを含み、そのいずれか、または両方を本発明に従って志賀毒素Bサブユニットに結合させることができるマラリアワクチンである。1種以上のさらなるマラリア抗原を、例えば、MPS1、MSP3、AMA1、LSA1またはLSA3からなる群より選択することができる。

前記製剤はまた、抗腫瘍抗原を含んでもよく、癌の免疫治療的治療にとって有用である。例えば、前記アジュバント製剤は、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、腎臓癌またはメラノーマ癌などに対する腫瘍拒絶抗原として有用である。抗原の例としては、MAGE 1およびMAGE 3または他のMAGE抗原(メラノーマの治療のため)、PRAME、BAGE、もしくはGAGE (RobbinsおよびKawakami, 1996, Current Opinions in Immunology 8, pps 628-636; Van den Eyndeら、International Journal of Clinical & Laboratory Research (1997年提出); Correaleら(1997)、Journal of the National Cancer Institute 89, p293)が挙げられる。実際、これらの抗原は、メラノーマ、肺癌、肉腫および膀胱癌などの様々な腫瘍型において発現される。他の腫瘍特異的抗原は、本発明のアジュバントと共に使用するのに好適であり、限定されるものではないが、腫瘍特異的ガングリオシド、前立腺特異的抗原(PSA)またはHer-2/neu、KSA(GA733)、PAP、マンマグロビン、MUC-1、癌胎児性抗原(CEA)、p501S(プロステイン)が挙げられる。従って、本発明の一態様においては、本発明に従うアジュバント組成物と腫瘍拒絶抗原とを含むワクチンが提供される。一態様においては、腫瘍抗原はHer-2/neuである。

本発明の一態様は、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、腎臓癌、卵巣癌またはメラノーマ癌などの腫瘍抗原を含むワクチンを提供する。従って、前記製剤は、腫瘍関連抗原、ならびに腫瘍支援機構(例えば、血管新生、腫瘍侵襲)に関連する抗原を含んでもよい。さらに、癌の治療におけるワクチンについて特に関連する抗原は、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、p501S(プロステイン)、チロシナーゼ、スルビビン、NY-ESO1、プロスターゼ、PS108(WO 98/50567)、RAGE、LAGE、HAGEも含む。さらに、前記抗原は、多くの癌の治療、または免疫去勢において有用な、短い10アミノ酸長のペプチドである全長ゴナドトロピンホルモン放出ホルモン(GnRH、WO 95/20600)などの自己ペプチドホルモンであってよい。

ワクチン接種
本発明の免疫原性組成物を含むワクチン調製物を用いて、全身または粘膜経路を介して該ワクチンを投与することにより、感染に罹りやすい哺乳動物を保護または治療することができる。これらの投与としては、筋肉内、腹腔内、皮内もしくは皮下経路を介する注入；または口／消化器、呼吸器もしくは尿生殖器経路への粘膜投与が挙げられる。本発明のワクチンを単回用量として投与することができるが、その成分を同時に、または異なる時間で一緒に当時投与してもよい(例えば、肺炎球菌糖類コンジュゲートを、別々に、同時に、または互いに関して免疫応答の最適な調整のためにワクチンの任意の細菌タンパク質成分の投与の1〜2週間後に投与することができる)。さらに、本発明のワクチンを、初回(プライミング)用量についてはIMで、追加用量についてはINで投与することができる。

ワクチン中のタンパク質抗原の含量は、典型的には1〜100μg、好ましくは5〜50μg、最も典型的には5〜25μgの範囲にあるであろう。初回ワクチン接種後、被験体は十分に間隔を空けた1回または数回の追加免疫を受けてもよい。

ワクチン調製物は、一般的にはVaccine Design (「サブユニットおよびアジュバント手法(The subunit and adjuvant approach)」)(Powell M.F. & Newman M.J.(編)) (1995) Plenum Press New York)に記載されている。リポソーム内の封入は、Fullerton, 米国特許第4,235,877号により記載されている。

本発明のワクチンを溶液中で保存するか、または凍結乾燥することができる。好ましくは、この溶液をスクロースまたはラクトースなどの糖の存在下で凍結乾燥する。それらを凍結乾燥し、使用前に即席で再構成させるのがさらに好ましい。

本発明の一態様においては、必要に応じて凍結乾燥形態の本発明の免疫原性組成物を含むバイアル、および本明細書に記載のアジュバントを含むバイアルを含むワクチンキットが提供される。本発明のこの態様においては、アジュバントを用いて凍結乾燥された免疫原性組成物を再構成することができると想定される。

本発明のワクチンを任意の経路により投与することができるが、皮膚への記載のワクチンの投与(ID)は、本発明の一実施形態を形成する。ヒトの皮膚は、表皮の上にある角質層と呼ばれる外側の「角質」クチクラを含む。この表皮の下は、真皮と呼ばれる層であり、次いで皮下組織がある。研究者らにより、皮膚、特に真皮へのワクチンの注入が免疫応答を刺激し、いくつかのさらなる利点と関連することも示された。本明細書に記載のワクチンを用いる皮内ワクチン接種は、本発明の好ましい特徴を形成する。

皮内注入の従来技術である「マントゥー手順」は、皮膚を洗浄した後、一方の手を伸ばし、狭いゲージの針(26-31ゲージ)の斜角を上に向け、針を10〜15°の角度で挿入する工程を含む。一度、針の斜角が挿入されたら、針の円筒部を低くし、皮膚の下でそれを上昇させるためにわずかに圧力をかけながらさらに進行させる。次いで、液体を非常にゆっくりと注入することによって、皮膚表面上に水疱または***を形成させた後、針をゆっくりと引き抜く。

より最近では、液体薬剤を皮膚の中または皮膚を横切って投与するように特異的に設計された装置、例えば、WO 99/34850およびEP 1092444に記載の装置、また、例えばWO 01/13977; 米国特許第5,480,381号、第5,599,302号、第5,334,144号、第5,993,412号、第5,649,912号、第5,569,189号、第5,704,911号、第5,383,851号、第5,893,397号、第5,466,220号、第5,339,163号、第5,312,335号、第5,503,627号、第5,064,413号、第5,520, 639号、第4,596,556号、第4,790,824号、第4,941,880号、第4,940,460号、WO 97/37705およびWO 97/13537に記載のジェット注入装置が記載されている。ワクチン調製物の皮内投与の代替的な方法は、従来のシリンジおよび針、または固体ワクチンの弾道送達のために設計された装置(WO 99/27961)、または経皮パッチ(WO 97/48440; WO 98/28037)；または皮膚の表面への適用(経皮もしくは経皮下送達、WO 98/20734；WO 98/28037)を含んでもよい。

本発明のワクチンを皮膚、またはより具体的には真皮に投与しようとする場合、ワクチンは少ない液体容量、特に、約0.05 ml〜0.2 mlの容量にある。

本発明の皮膚または皮内ワクチン中の抗原の含量は、筋肉内ワクチンに認められるものと類似する従来用量であってよい(上記参照)。しかしながら、製剤が「低用量」であってよいことが皮膚または皮内ワクチンの特徴である。従って、「低用量」ワクチン中のタンパク質抗原は、用量あたり0.1〜10μg、好ましくは0.1〜5μgのできるだけ少ない量で存在する；糖類(好ましくは、コンジュゲートされた)抗原は、用量あたり0.01〜1μg、および好ましくは0.01〜0.5μgの範囲の糖類で存在してもよい。

本明細書で用いられる用語「皮内送達」とは、皮膚中の真皮の領域へのワクチンの送達を意味する。しかしながら、ワクチンは真皮のみに局在化される必要はない。真皮はヒトの皮膚中の表面から約1.0〜約2.0 mmに位置する皮膚中の層であるが、個体間および身体の異なる部分において特定量の変動が存在する。一般的には、皮膚の表面から1.5 mm下に行くことにより真皮に到達すると期待することができる。真皮は表面の角質層と表皮と、下の皮下層との間に位置する。送達の様式に応じて、究極的にはワクチンを真皮内にのみ、もしくは主に真皮内に局在化させるか、または究極的には表皮と真皮内に分布させることができる。

各ワクチン用量中の各抗原の量を、典型的なワクチン被接種者において有意な有害副作用をもたらさずに免疫防御応答を誘導する量として選択する。そのような量は、特定の免疫原を使用し、それを提供する方法に応じて変化するであろう。

さらなる実施形態においては、実質的に本明細書に記載の組成物の投与による、疾患に罹りやすいか、または疾患に罹患する個体の治療の方法が提供される。

また、個体が、感染性細菌およびウイルス疾患、寄生虫疾患、特に、細胞内病原体疾患、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、腎臓癌、卵巣癌もしくはメラノーマ癌などの増殖性疾患；非癌性慢性障害、アレルギーを含む群から選択される疾患に罹ることを防止する方法であって、該個体への実質的に本明細書に記載の組成物の投与を含む前記方法も提供される。

さらなる実施形態においては、ワクチン組成物が、抗原または抗原組成物と、ヒト用量あたり0.5〜10 mgの代謝可能油、0.5〜11 mgのトコールおよび0.1〜4 mgの乳化剤を含む水中油型エマルジョンからなるアジュバント組成物とを含む、症状または疾患の予防的治療または治療における使用のための該ワクチン組成物が提供される。

さらなる実施形態においては、ワクチン組成物が、抗原または抗原組成物と、ヒト用量あたり0.5〜10 mgの代謝可能油、0.5〜11 mgのトコールおよび0.1〜4 mgの乳化剤を含む水中油型エマルジョンからなるアジュバント組成物とを含む、症状または疾患の予防的治療または治療における使用のための医薬の製造における該ワクチン組成物の使用が提供される。

（実施例）
本発明を、以下の、非限定的な実施例を参照することによりさらに説明する。

実施例Iは、マウス、フェレット、ブタおよびヒト試験において用いられる免疫学的読み出し方法を記載する。

実施例IIは、例示された試験において用いられた水中油型エマルジョンおよびアジュバント製剤の調製を記載する。

実施例IIIは、スプリットインフルエンザ抗原調製物および様々な用量のAS03アジュバントを含むワクチンを用いた18〜59歳の成人集団における臨床試験を示す。

実施例IVは、初回投与(プライミング)されたBALB/cマウスにおけるアジュバント化および非アジュバント化スプリットインフルエンザワクチン(様々な用量のAS03アジュバントを含む)の前臨床評価を示す。

実施例Vは、初回投与されたC57Bl/6マウスにおけるアジュバント化および非アジュバント化スプリットインフルエンザワクチン(様々な用量のAS03アジュバントを含む)の前臨床評価を示す。

実施例VIは、初回投与されたC57Bl/6マウスにおけるアジュバント化および非アジュバント化スプリットインフルエンザワクチン(様々な用量のAS03アジュバントおよび低用量の抗原を含む)の前臨床評価を示す。

実施例VIIは、ナイーブなC57Bl/6マウスにおけるアジュバント化および非アジュバント化スプリットH5N1ワクチン(様々な用量のAS03アジュバントおよび抗原を含む)の前臨床評価を示す。

実施例VIIIは、初回投与された巨大白ブタにおけるアジュバント化および非アジュバント化インフルエンザワクチンの前臨床評価を示す。

実施例I−免疫学的読み出し方法
I.1. マウス方法
I.1.1. 血球凝集抑制試験
試験原理(古典的手順)
3種(季節的)のインフルエンザウイルス株に対する抗ヘマグルチニン抗体力価を、血球凝集抑制試験(HI)を用いて決定する。HI試験の原理は、インフルエンザウイルスヘマグルチニン(HA)による赤血球(RBC)の血球凝集を阻害する特定の抗インフルエンザ抗体の能力に基づく。熱不活化血清をKaolinおよびRBCにより処理して、非特異的阻害因子を除去する。予備処理後、血清の2倍希釈液を、4血球凝集単位の各インフルエンザ株と共にインキュベートする。次いで、赤血球を添加し、凝集の阻害をスコア化する。血球凝集を完全に阻害した血清の最も高い希釈率の逆数として、力価を表す。血清の最初の希釈率が1:20である場合、検出不可能なレベルを10に等しい力価としてスコア化する。

H5N1への適合(ウマ赤血球を用いるHIの具体的説明)：
抗HA抗体を決定するための古典的HIアッセイはH5N1株についてはよく機能しないと記録されているため、ウマRBCを用いて適合化されたプロトコルを用いた。ウマの赤血球を、H5N1流行株のために用いた。0.5％BSA(ウシ血清アルブミン、最終濃度)を含むリン酸バッファー中の0.5％(最終濃度)のウマ赤血球細胞懸濁液。この懸濁液を、同じリン酸バッファーを用いて赤血球を洗浄、次いで遠心分離工程(10分、2000 rpm)により毎日調製する。この洗浄工程を、1回繰り返す必要がある。血清とウイルス懸濁液の反応混合物へのウマ赤血球の添加後、ウマ赤血球の低い沈降速度に起因して、室温(RT、20℃+/-2℃)で2時間、プレートをインキュベートする必要がある。

統計学的分析
統計学的分析を、UNISTATを用いてワクチン接種後のHI力価に対して実施した。分散の分析のために適用したプロトコルを、以下のように簡単に説明することができる：
・データのLog変換、
・群分布の正規性を検証するための各集団(群)に対するShapiro-Wilk検定、
・異なる集団(群)間の分散の均一性を検証するためのCochran検定、
・選択されたデータに対する分散の分析、
・2方向ANOVAの相互作用に関する検定、
・複数比較のためのTukey-HSD検定。

I.1.2. 細胞内サイトカイン染色
この技術は、サイトカイン産生に基づいて抗原特異的Tリンパ球の定量化を可能にする：エフェクターT細胞および／もしくはエフェクター記憶T細胞はIFN-γを産生し、ならびに／または中央記憶T細胞はIL-2を産生する。PBMCを、免疫の7日後に収穫する。

リンパ球を、分泌阻害剤(Brefeldine)の存在下でin vitroで再刺激する。次いで、これらの細胞を、蛍光抗体(CD4、CD8、IFN-γおよびIL-2)を用いる従来の免疫蛍光手順により処理する。結果を、CD4/CD8 T細胞内のサイトカイン陽性細胞の頻度として表す。T細胞のサイトカインの細胞内染色を、2回目の免疫の7日後にPBMCに対して実施した。血液をマウスから回収し、ヘパリン化培地RPMI+Add中にプールした。血液については、RPMI+Addで希釈されたPBL懸濁液を、推奨されたプロトコルに従ってLympholyte-Mammal勾配(2500 rpm、室温で20分間遠心分離)上で層化した。境界面の単核細胞を取り出し、RPMI+Add中で2回洗浄し、PBMC懸濁液をRPMI 5％ウシ胎仔血清中、2 x 10⁶細胞/mlに調整した。

PBMCのin vitroでの抗原刺激を、Whole FI (1μgHA/株)と共に1 x 10⁷細胞/ml(チューブFACS)の最終濃度で実行した後、抗CD28および抗CD49d(両方とも1μg/ml)を添加して37℃で2時間インキュベートした。

抗原再刺激工程の後、PBMCを、37℃のBrefeldin(1μg/ml)の存在下で37℃で一晩インキュベートして、サイトカイン分泌を阻害する。IFN-γ/IL-2/CD4/CD8染色を以下のように実施した：細胞懸濁液を洗浄し、2％Fcブロッキング試薬(1/50；2.4G2)を含む50μlのPBS 1％FCS中に再懸濁した。4℃で10分間インキュベートした後、抗CD4-PE(2/50)および抗CD8 perCp(3/50)の混合物50μlを添加し、4℃で30分間インキュベートした。PBS 1％FCS中で洗浄した後、200μlのCytofix-Cytoperm(Kit BD)中に再懸濁することにより細胞を透過処理し、4℃で20分間インキュベートした。次いで、細胞をPerm Wash (Kit BD)で洗浄し、Perm Wash中に希釈した抗IFN-γAPC(1/50)+抗IL-2 FITC(1/50)の混合物50μlで再懸濁した。4℃で最小で2時間、最大で一晩インキュベートした後、細胞をPerm Washで洗浄し、PBS 1％FCS + 1％パラホルムアルデヒド中に再懸濁した。サンプル分析をFACSにより実施した。生細胞をゲート化し(FSC/SSC)、CD4+T細胞上で約20,000事象(リンパ球)または35,000事象に対して獲得を実施した。IFN-γ+またはIL2+の割合を、CD4+およびCD8+ゲート化集団上で算出した。

I.1.3. 抗H5N1 ELISA
抗H5N1 Ig、IgG1およびIgG2b抗体力価の定量を、コーティングとしてスプリットH5N1を用いるELISAにより実施した。ウイルスおよび抗体溶液を、100μl/ウェルで用いた。スプリットウイルスH5N1を、PBS中、1μg/mlの最終濃度で希釈し、96穴マイクロタイタープレート(Maxisorb Immunoplate Nunc 439454)のウェルに4℃で一晩吸着させた。次いで、プレートを、200μl/ウェルの1％BSAおよび0.1％Tween 20(飽和バッファー)を含むPBSと共に37℃で1時間インキュベートした。飽和バッファー中の血清の12個の2倍希釈液をH5N1被覆プレートに添加し、37℃で1時間30分インキュベートした。プレートをPBS 0.1％Tween 20で4回洗浄した。1/500に希釈されたビオチン化コンジュゲート化抗マウスIg (Prozan-E0413)もしくはビオチン化コンジュゲート化抗マウスIgG1 (Imtech 1070-08)、またはPBS 1％BSA 0.1％Tween 20中に1/4000に希釈されたビオチン化抗マウスIgG2b (Imtech 1090-08)を各ウェルに添加し、37℃で1時間30分インキュベートした；洗浄工程の後、PBS 1％BSA Tween 20中で1/10000に希釈されたストレプトアビジン-ビオチン-プレオキシダーゼコンジュゲート(Prozan P0397)と共に30分間インキュベートした。

比色的明示のために、プレートを、0.1 Mクエン酸バッファーpH 4.2中の0.04％ o-フェニルジアミン(Sigma P4664)および0.03％ H₂O₂の溶液と共に22℃で20分間インキュベートした。反応を2N H₂SO₄を用いて停止させ、マイクロプレートを490-630 nmで読み取った。

I.2. フェレット方法
I.2.1. 血球凝集抑制試験(HI)
試験手順
3種のインフルエンザウイルス株に対する抗ヘマグルチニン抗体力価を、血球凝集抑制試験(HI)を用いて決定した。HI試験の原理は、インフルエンザウイルスヘマグルチニン(HA)によるニワトリ赤血球(RBC)の血球凝集を阻害する特定の抗インフルエンザ抗体の能力に基づく。最初に血清を25％ノイラミニダーゼ溶液(RDE)で処理し、熱不活化して、非特異的阻害因子を除去した。予備処理後、血清の2倍希釈液を、4血球凝集単位の各インフルエンザ株と共にインキュベートした。次いで、ニワトリ赤血球を添加し、凝集の阻害をスコア化した。血球凝集を完全に阻害した血清の最も高い希釈率の逆数として、力価を表した。血清の最初の希釈率が1:10である場合、検出不可能なレベルを5に等しい力価としてスコア化した。

統計学的分析
統計学的分析を、UNISTATを用いてHI力価(41日目、チャレンジ前)に対して実施した。分散の分析のために適用したプロトコルを、以下のように簡単に説明することができる：
・データのLog変換、
・群分布の正規性を検証するための各集団(群)に対するShapiro-Wilk検定、
・異なる集団(群)間の分散の均一性を検証するためのCochran検定、
・1方向ANOVAの相互作用に関する検定、
・複数比較のためのTuckey-HSD検定。

I.2.2. 体温モニタリング
個体の温度を、トランスミッターを用いて、およびテレメトリー記録によりチャレンジ期間の間にモニターした。全ての埋込み物を調べ、改造し、新しい補正をDSI(Data Sciences International, Centaurusweg 123, 5015 TC Tilburg, The Netherlands)により実施した後、腹腔中に入れた。全ての動物を、これらの実験の間に1個のケージ中で個々に飼育した。温度をチャレンジの4日前からチャレンジの7日後まで15分毎に記録した。

I.2.3. 鼻洗浄
覚醒した動物の両方の鼻孔に5 mlのPBSを投与することにより、鼻洗浄を行った。接種物をペトリ皿中に回収し、ドライアイス上のサンプル容器中に入れた。

鼻洗浄液中のウイルス滴定
全ての鼻サンプルを最初にSpin Xフィルター(Costar)を通して滅菌濾過して、任意の細菌夾雑物を除去した。鼻洗浄液の連続10倍希釈液50μlを、50μlの培地を含むマイクロタイタープレート(10ウェル／希釈液)に移した。100μlのMDCK細胞(2.4 x 10⁵細胞/ml)を各ウェルに添加し、35℃で5〜7日間インキュベートした。

インキュベーションの5〜7日後、培養培地を穏やかに除去し、100μlの1/20 WST-1を含有する培地を添加し、さらに18時間インキュベートした。

生細胞によるWST-1の還元の際に産生された黄色ホルマザン染料の強度は、ウイルス滴定アッセイの終わりにウェル中に存在する生細胞数に比例し、好適な波長(450ナノメートル)での各ウェルの吸光度を測定することにより定量する。カットオフを、未感染対照細胞のOD平均と定義する-0.3 OD(0.3 ODは未感染対照細胞のODの+/-3 StDevに対応する)。ODがカットオフより小さい場合、正のスコアを定義し、対照的に、ODがカットオフより大きい場合、負のスコアを定義する。ウイルス出芽力価を、「ReenおよびMuench」により決定し、Log TCID50/mlとして表した。

I.3. ブタ方法
I.3.1. 血球凝集抑制試験(HI)
試験手順
3種のインフルエンザウイルス株に対する抗ヘマグルチニン抗体力価を、血球凝集抑制試験(HI)を用いて決定した。HI試験の原理は、インフルエンザウイルスヘマグルチニン(HA)によるニワトリ赤血球(RBC)の血球凝集を阻害する特定の抗インフルエンザ抗体の能力に基づく。最初に血清を25％ノイラミニダーゼ溶液(RDE)で処理し、熱不活化して、非特異的阻害因子を除去した。予備処理後、血清の2倍希釈液を、4血球凝集単位の各インフルエンザ株と共にインキュベートした。次いで、ニワトリ赤血球を添加し、凝集の阻害をスコア化した。血球凝集を完全に阻害した血清の最も高い希釈率の逆数として、力価を表した。血清の最初の希釈率が1:10である場合、検出不可能なレベルを5に等しい力価としてスコア化した。

I.4. ヒトにおける免疫応答を評価するためのアッセイ
I.4.1. 血球凝集抑制アッセイ
免疫応答を、WHO Collaborating Centre for influenza, Centres for Disease Control, Atlanta, USA (1991)により記載された方法を用いてHI抗体を測定することにより決定した。

4血球凝集抑制単位(4 HIU)の好適な抗原および0.5％トリ赤血球懸濁液を用いる標準化され、徹底的に検証された微小化方法を用いて、解凍された凍結血清サンプル上で抗体力価測定を行った。非特異的血清阻害因子を、熱処理および受容体破壊酵素により除去した。

得られた血清を、HI抗体レベルについて評価した。最初の1:10の希釈率から開始して、連続希釈液(2倍ずつ)を、1:20480の最終希釈率まで調製した。

滴定の終点を、血球凝集の完全な阻害(100％)を示す最も高い希釈率として取った。全てのアッセイを二重で行った。

I.4.2. ノイラミニダーゼ阻害アッセイ
このアッセイをフェツイン被覆マイクロタイタープレート中で実施した。抗血清の2倍連続希釈液を調製し、標準化された量のインフルエンザA H3N2、H1N1またはインフルエンザBウイルスと混合した。この試験は、フェツインからノイラミン酸を酵素的に放出するノイラミニダーゼの生物学的活性に基づくものであった。末端ノイラミン酸の切断後、β-D-ガラクトース-N-アセチル-ガラクトサミンを脱マスキングした。ガラクトース構造に特異的に結合する、西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)標識ラッカセイ由来ピーナッツ凝集素をウェルに添加した。結合した凝集素の量を検出し、テトラメチルベンズイジン(TMB)との基質反応において定量することができる。ウイルスノイラミニダーゼ活性を依然として少なくとも50％阻害する最も高い抗体希釈率を示し、これがNI力価である。

I.4.3. 中和抗体アッセイ
中和抗体測定を、解凍された凍結血清サンプル上で行った。血清中に含まれる抗体によるウイルス中和を、微小中和アッセイにおいて決定した。該アッセイにおけるさらなる処理を用いずに、血清を用いた。各血清を3回試験した。標準化された量のウイルスを、血清の連続希釈液と混合し、抗体とウイルスとの結合を可能にするためにインキュベートした。次いで、規定量のMDCK細胞を含む細胞懸濁液をウイルスと抗血清の混合物に添加し、33℃でインキュベートした。インキュベーション期間の後、ウイルスの複製を、ニワトリ赤血球の血球凝集により可視化した。血清の50％の中和力価を、ReedおよびMuenchの方法により算出した。

I.4.4. 細胞媒介性免疫をサイトカインフローサイトメトリー(CFC)により評価した
末梢血抗原特異的CD4およびCD8 T細胞をin vitroで再刺激して、その対応する抗原と共にインキュベートした場合、IL-2、CD40L、TNF-αおよびIFNを産生することができる。結果として、抗原特異的CD4およびCD8 T細胞を、細胞表現型ならびに細胞内サイトカイン産生の従来の免疫蛍光標識に従うフローサイトメトリーにより数えることができる。本研究においては、インフルエンザワクチン抗原ならびに特定のインフルエンザタンパク質から誘導されたペプチドを抗原として用いて、インフルエンザ特異的T細胞を再刺激した。結果を、CD4またはCD8 T細胞サブ集団内のサイトカイン陽性CD4またはCD8 T細胞の頻度として表した。

I.4.5. 統計学的方法
I.4.5.1. 主要評価項目
・ワクチン接種後の7日間の追跡期間(すなわち、ワクチン接種日およびその後の6日間)と全体の間の応答型局所および全身兆候および徴候の割合、強度およびワクチン接種との関係。
・ワクチン接種後の21日間の追跡期間(すなわち、ワクチン接種日およびその後の20日間)と全体の間の非応答型局所および全身兆候および徴候の割合、強度およびワクチン接種との関係。
・試験全体の間の重篤な有害事象の発生。

I.4.5.2. 二次評価項目
体液性免疫応答について：
観察される変数：
・0および21日目：ワクチン中に示される3種のインフルエンザウイルス株(抗H1N1、抗H3N2および抗B抗体)の各々に対して別々に試験された、血清血球凝集抑制(HI)およびNI抗体力価。
・0および21日目：ワクチン中に示される3種のインフルエンザウイルス株の各々に対して別々に試験された、中和抗体力価。

誘導される変数(95％信頼区間と共に)：
・ワクチン接種の前後での95％信頼区間(95％CI)を有する血清HI抗体の幾何学的平均力価(GMT)
・21日目での95％CIを有する血清変換率^*
・21日目での95％CIを有する変換係数^**
・21日目での95％CIを有する血清防御率^***
・全ての時点での血清NI抗体GMT(95％信頼区間と共に)。
^*各ワクチン株につき、0日目と比較した21日目での血清HI力価における少なくとも4倍の増加を有するワクチン被接種者の割合として定義された血清変換率。
^**各ワクチン株につき、0日目と比較した21日目での血清HI GMTにおける倍数増加として定義された変換係数。
^***通常は防御を示すと許容されるワクチン接種後(各ワクチン株につき)の血清HI力価＝40であるワクチン被接種者の割合として定義された防御率。

いくつかの臨床試験については、反応原性／安全性が二次評価項目であり、免疫原性が主要評価項目であってよいことが理解されるべきである。

細胞媒介性免疫(CMI)応答について：
観察される変数：
0および21日目：異なる試験における10⁶個あたりのサイトカイン陽性CD4/CD8細胞の頻度。
各試験は以下のものに対するCD4/CD8 T細胞の応答を定量するものである：
・ペプチドインフルエンザ(pf)抗原(これらの抗原の正確な性質および起源を与える／説明する必要がある)
・スプリットインフルエンザ(sf)抗原
・全インフルエンザ(wf)抗原。

誘導される変数：
・少なくとも2種の異なるサイトカイン(CD40L、IL-2、IFNγ、TNFα)を産生する細胞
・少なくともCD40Lおよび別のサイトカイン(IL-2、TNFα、IFNγ)を産生する細胞
・少なくともIL-2および別のサイトカイン(CD40L、TNFα、IFNγ)を産生する細胞
・少なくともIFNγおよび別のサイトカイン(IL-2、TNFα、CD40L)を産生する細胞
・少なくともTNFαおよび別のサイトカイン(IL-2、CD40L、IFNγ)を産生する細胞。

I.3.5.3. 免疫原性の分析
免疫原性分析は全ワクチン接種コホートに基づいていた。各処理群について、以下のパラメーター(95％信頼区間と共に)を算出した：
・0および21日目でのHIおよびNI抗体の幾何学的平均力価(GMT)
・0および21日目での中和抗体力価の幾何学的平均力価(GMT)
・21日目での変換係数
・0日目と比較した21日目での血清HI力価における少なくとも4倍の増加を有するワクチン被接種者の割合として定義された21日目での血清変換率(SC)
・血清HI力価＝1:40を有するワクチン被接種者の割合として定義された21日目の防御率
・各ワクチン接種群、各時点(0日目、21日目)および各抗原(ペプチドインフルエンザ(pf)、スプリットインフルエンザ(sf)および全インフルエンザ(wf))について、応答におけるCD4/CD8 Tリンパ球分泌の頻度をまとめた(記述統計)
・それぞれ5つの異なる試験における各ワクチン接種群および各抗原(pf、sf、およびwf)に関する時点(前後)間応答の個々の差異における記述統計
・非パラメーター検定(Kruskall-Wallis検定)を用いて3群間の位置の差異を比較し、それぞれ5つの異なる試験において各抗原について統計学的p値を算出した。全ての有意差検定は両側検定であった。0.05以下のP値を、統計学的に有意であると考えた。

実施例II−水中油型エマルジョンおよびアジュバント製剤の調製
特に指摘しない限り、以後の実施例で用いられる油／水型エマルジョンは、2つの油(α-トコフェロールおよびスクアレン)からなる有機相、ならびに乳化剤としてTween 80を含むPBSの水相から構成される。特に指摘しない限り、以下の水中油型エマルジョン成分(最終濃度で与えられる)：2.5％スクアレン(v/v)、2.5％α-トコフェロール(v/v)、0.9％ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(v/v)(Tween 80)(WO 95/17210を参照)を含む、以後の実施例で用いられる水中油型エマルジョンアジュバント製剤を作製した。以後の実施例においてはAS03と呼ばれるこのエマルジョンを、2倍濃縮物として以下のように調製した。

II.1. エマルジョンSB62の調製
この方法を、臨床および前臨床実施例の節で報告される試験において用いた。SB62エマルジョンの調製物を、疎水性成分(DL-α-トコフェロールおよびスクアレン)から構成される油相ならびに水溶性成分(陰イオン界面活性剤Tween 80およびPBS mod(改変)、pH 6.8)を含有する水相の強力な攪拌下での混合により作製する。攪拌しながら、油相(1/10全量)を水相(9/10全量)に移し、混合物を室温で15分間攪拌する。次いで、得られる混合物を、マイクロフルイダイザー(15000 PSI-実施例IIIに報告される臨床試験において用いられるアジュバント中で8サイクル、または3サイクル)の相互作用チャンバー中で剪断、衝撃およびキャビテーション力にかけて、マイクロメートル以下の液滴(100〜200 nmの分布)を製造する。得られるpHは6.8±0.1である。次いで、SB62エマルジョンを0.22μmの膜を通す濾過により滅菌し、滅菌バルクエマルジョンを2〜8℃でCupac容器中で冷蔵して保存する。滅菌不活性ガス(窒素またはアルゴン)を、少なくとも15秒間、SB62エマルジョンの最終バルク容器の死容積中にフラッシュする。

SB62エマルジョンの最終的な組成は以下の通りである：
Tween 80：1.8％(v/v) 19.4 mg/ml；スクアレン：5％(v/v) 42.8 mg/ml；α-トコフェロール：5％(v/v) 47.5 mg/ml；PBS-mod：NaCl 121 mM、KCl 2.38 mM、Na₂HPO₄ 7.14 mM、KH₂PO₄ 1.3 mM；pH 6.8±0.1。

実施例III−スプリットインフルエンザ抗原調製物と種々の用量のAS03アジュバントを含むワクチン(Flu-LD-004)を用いる18〜59歳の成人集団における臨床試験
III.1. はじめに
第II相、制御化、無作為化、単盲検を、2006年に18〜59歳の成人集団において行って、2用量のAS03アジュバントを含むGlaxoSmithKline Biologicalsの低用量インフルエンザ候補ワクチン(すなわち、株あたり5μgのHAを含む)の免疫原性、安全性および反応原性を評価した。体液性免疫応答(すなわち、抗ヘマグルチニン)を、1用量のAS03アジュバント化ワクチンの筋肉内投与の21日後に測定した。Fluarix(商標)を参照として用いた。

III.2. 試験設計
3群の被験者は平行して以下のワクチンを筋肉内で受容した：
・100人の被験者の1群は、AS03でアジュバント化された5μgのHAを含む低用量のスプリットウイルスインフルエンザワクチン(FluLD1/1)の1回の注入を受ける
・100人の被験者の1群は、半量のAS03(AD03 1/2)でアジュバント化された5μgのHAを含む低用量のスプリットウイルスインフルエンザワクチン(FluLD1/2)の1回の注入を受ける
・100人の被験者の1群は、1用量のFluarix(商標)(Fluarix)を受ける。

スケジュール：0日目にインフルエンザワクチンの1回のIM注入、0日目および21日目に試験部位訪問、血液サンプル回収(HI抗体決定)および30日目にさらに電話連絡(試験結果)。

この試験において用いた標準三価スプリットインフルエンザワクチン-Fluarix(商標)は、GlaxoSmithKline Biologicalsにより開発および製造され、2006年から市販されているワクチンである。

III.3. 試験評価項目
III.3.1. 主要評価項目
・抗ヘマグルチニン抗体力価に関して試験ワクチンにより誘導される体液性免疫応答を評価すること：
0および21日目の観察される変数：血清血球凝集抑制抗体力価
誘導される変数(95％信頼区間と共に)：
・0および21日目の血清抗体の幾何学的平均力価(GMT)
・21日目の血清変換率^*
・21日目の変換係数^**
・0および21日目の防御率^***
^*ヘマグルチニン抗体応答の血清変換率を、ワクチン接種前の力価1:10未満かつワクチン接種後の力価1:40以上を有するか、またはワクチン接種前の力価1:10以上かつワクチン接種後の力価における少なくとも4倍の増加を有するワクチン被接種者の割合と定義する。
^**0日目と比較してワクチン接種後の血清HI GMTにおける倍数増加として定義された変換係数；
^***通常は防御を示すと許容されるワクチン接種後、40以上の血清HI力価を有するワクチン被接種者の割合として定義される防御率。

III.3.2. 二次評価項目
・応答型局所および全身有害事象、非応答型有害事象および重篤な有害事象に関して試験ワクチンの安全性および反応原性を評価すること：
1. 各群における各ワクチン接種後の7日間の追跡期間(すなわち、ワクチン接種日およびその後の6日間)の間の応答型局所および全身兆候および徴候の発生、強度およびワクチン接種との関係、
2. 各群における各ワクチン接種後の30日間の追跡期間(すなわち、ワクチン接種日およびその後の29日間)の間の非応答型局所および全身兆候および徴候の発生、強度およびワクチン接種との関係、
3. 各群における全試験期間の間の重篤な有害事象の発生および関係。

III.4. ワクチン組成物および投与
III.4.1. ワクチン調製物
非アジュバント化インフルエンザワクチンは、3種の一価ウイルス抗原バルク(それぞれ、インフルエンザ株A/H1N1、A/H3N2およびBから調製)からなる三価スプリットビリオン不活化インフルエンザワクチンである。このワクチン中に存在する抗原は、1992年以来Fluarix(商標)(α-Rix(登録商標))として市場で入手可能であるライセンス化されたFluarix(商標)ワクチンと同じであり、用量あたり15μgのHA/株を含む。FluLD臨床ロットに含まれるインフルエンザ株は、2006/2007年の北半球のために選択された株である：
・A/ニューカレドニア/20/99(H1N1)様株：A/ニューカレドニア/20/99(H1N1)IVR-116
・A/ウィスコンシン/67/2005(H3N2)様株：A/ウィスコンシン/67/2005(H3N2)NYMCX-161
・B/マレーシア/2506/2004。

抗原は卵中で増殖させたウイルスから誘導されたものである。スプリッティングをデオキシコール酸ナトリウムを用いて実行した後、不活化工程を行って、デオキシコール酸ナトリウムおよびホルムアルデヒドのその後の作用を介して実施する。

AS03アジュバント化低用量インフルエンザ(FluLD)ワクチン(臨床ロット)は、市販のFluarix(商標)ワクチン(それぞれ、インフルエンザ株A/H1N1、A/H3N2およびBから調製)に基づくものであるが、より少量の抗原含量を有し、GSKアジュバント系AS03を用いてアジュバント化されたものである。AS03は、2種の生分解性油、スクアレンおよびα-トコフェロール(ビタミンE)、ならびに界面活性剤ポリソルベート80(Tween 80)を含む水中油型エマルジョン(SB62)からなる。インフルエンザ抗原を、エマルジョンと単純に混合することによりアジュバント系の水相中に組み入れる。ワクチンロット中のFlu抗原を用いて導入されたアジュバントの量が異なる2種の製剤を試験した。アジュバント化ワクチンは、アジュバント系AS03の全用量(AS03)または半分の用量(AS03 1/2)と混合された、用量あたり各インフルエンザウイルス株の5μgのヘマグルチニン(HA)を含む。賦形剤は以下のもの：ポリソルベート80(Tween 80)、オクトキシノール10(Triton X-100)、コハク酸水素α-トコフェリル、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウム、塩化カリウム、注入用の水である。AS03アジュバント化低用量インフルエンザワクチン(FluLD、AS03の全用量または半用量)は保存剤を含まないワクチンである。しかしながら、それらは、初期段階の製造プロセスに由来する微量のチオメルサール(用量あたり1.25μg未満のHg)を含む。それらを両方とも、0.5 ml／用量の容量で予備充填されたガラス(I型)シリンジ中の単回用量ワクチンとして提供する。

III.4.1.1. AS03アジュバント化インフルエンザワクチンの組成
1用量のFluLD(AS03の全用量または半用量)は0.5 mlに一致する。その組成を表3に提供する。用量あたりのHA含量は、両製剤について5μgであり、唯一の差異は最終的な容器中に存在するAS03の量である。

（表３）

III.4.1.2. スプリット不活化インフルエンザ抗原調製物の製造
インフルエンザ抗原は、Fluarix(商標)(インフルエンザウイルスワクチン)に含まれるものと同一である。一価バルクは、孵化鶏卵中に個々に増殖させた、インフルエンザウイルスの3種の株、A型(H1N1およびH3N2)ならびにB型の種株から調製された精製不活化スプリットウイルスからなる。これらの種株は、年1回のWHO推奨後にWHO共同センターから受領した株に由来する。抗原参照物を調製するためのプロセスについては、例えば、WO 02/097072に与えられている。3種の一価バルクの容量は、製剤化の前の各一価バルク中で測定されたHA含量および標的製造容量に基づく。

10倍濃縮されたリン酸緩衝生理食塩水(1倍濃縮の場合、pH 7.4)ならびにTween 80とコハク酸水素α-トコフェリルの予備混合物を、注入用の水に希釈した後、室温で5〜30分間攪拌する。次いで、3種の濃縮された一価バルクを、得られるリン酸緩衝生理食塩水／Tween 80-コハク酸水素α-トコフェリル溶液中、中間三価バルク1 mLあたり、
それぞれA 1価バルク(H1N1、H3N2)の20μgのHA
B 1価バルクの23.32μgのHA
の濃度に連続希釈する(5μg HAの各A一価バルクおよび5.83μg HAのB/500μl三価最終バルク)。

各一価バルクの添加の間に、混合物を室温で10〜30分間攪拌し、最後の一価バルクの添加後15〜30分間攪拌する。「プレプール」とも呼ばれるこの中間三価バルクを+2〜+8℃で保持するか、または同じ日に最後の製剤化工程に加工することができる。プレプールの最終容量は、用量あたり250μlである。

III.4.1.3. AS03アジュバントを含むワクチン組成物の調製
アジュバント化ワクチン：LD AS03 1/1(表4)
PBS mod 10倍濃縮液(1倍濃縮の場合、pH 7.4；137 mM NaCl、2.7 mM KCl、8.1 mM Na₂HPO₄、1.47 mM KH₂PO₄、pH 7.4)ならびにTween 80、Triton X-100およびVESを含む混合物(株中に存在する界面活性剤を考慮に入れた量)を、注入用の水に添加する。5〜30分間攪拌した後、1 mlの各株H1N1およびH3N2あたり20μgのHAならびに1 mlのB株あたり23.32μgのHAを、各添加の間に10〜30分間攪拌しながら添加する。15〜30分間攪拌した後、少量のいわゆる「中間バルク」を分析のために廃棄し、+2〜+8℃で保存する。中間バルクはPBS mod中、1倍濃縮されたものである。標的の界面活性剤濃度は、1 mlあたり488μgのTween 80、1 mlあたり73.6μgのTriton X-100および1 mlあたり66.6μgのVESである。

次いで、最終的な製剤を調製する：等量のSB62(実施例IIにおける調製を参照)を、それぞれ250μlのプレプール中間バルクに添加し、室温で30〜60分間混合する。pHを、6.8〜7.5の範囲であるように調べる。製剤を窒素でフラッシュした後、+2〜8℃で保存した後、充填する。

（表４）

アジュバント化ワクチン：LD AS03 1/2(表5)
PBS modの10倍濃縮液(1倍濃縮の場合、pH 7.4-上記組成を参照)ならびにTween 80、Triton X-100およびVESを含む混合物(株中に存在する界面活性剤を考慮に入れた量)を、注入用の水に添加する。5〜30分間攪拌した後、1 mlの各株H1N1およびH3N2あたり20μgのHAならびに1 mlのB株あたり23.32μgのHAを、各添加の間に10〜30分間攪拌しながら添加する。15〜30分間攪拌した後、少量のいわゆる「中間バルク」を分析のために廃棄し、+2〜+8℃で保存する。PBS modは中間バルク中、1倍濃縮されたものである。標的の界面活性剤濃度は、1 mlあたり488μgのTween 80、1 mlあたり73.6μgのTriton X-100および1 mlあたり66.6μgのVESである。

次いで、最終製剤を調製する：SB62をPBS modバッファーで最初に希釈し、RTで15〜30分間攪拌する。次いで、等量のこの希釈されたSB62を、それぞれ250μlの中間バルクのプレプールに添加する。RTで30〜60分間攪拌した後、6.8〜7.5の範囲にあるようにpHを調べる。製剤を窒素でフラッシュした後、+2〜8℃で保存した後、充填する。

両製剤の最終容量は、用量あたり500μlであり、最終HA濃度は、三価最終バルク1 mlあたり、10μgの各A一価バルクおよび11.66μgのB一価バルクである。最終的なTween 80、Triton X-100(H3N2一価バルク製造の残留物)およびコハク酸水素α-トコフェロール(コハク酸水素α-トコフェリルはRRR(D異性体)-α-トコフェリルのエステル型である)標的濃度は、それぞれ、244μg/ml、58.6μg/mlおよび33.3μg/mlである。

（表５）

III.4.2. ワクチン投与
ワクチンを、1.25 mlの滅菌I型(Ph. Eur.)ガラスシリンジ中に充填する。各シリンジを、0.57 mlの標的に充填する(範囲：0.54〜0.60 ml)。ワクチンを、利き腕と逆の腕の三角筋領域中に筋肉内投与した。全てのワクチンを、予め充填されたシリンジ(0.5 ml)として提供した。ワクチンの適切なIM注入を確保するために、少なくとも25Gおよび少なくとも長さ2.5 cmの針を用いた。

III.5 試験集団結果
合計300人の被験者をこの試験に登録した：それぞれ3群の100人の被験者。ワクチン接種の時点での全ワクチン接種コホートの平均年齢は、13.67歳の標準偏差を有する36.7歳であった。3つのワクチン群を横断する被験者の平均年齢および性別分布は類似していた。

III.6. 免疫原性結果
免疫原性の分析を、免疫原性に関するATPコホートに対して実施した(297人の被験者)。

体液性免疫応答
AS03でアジュバント化された低用量インフルエンザ候補ワクチンにより誘導された体液性免疫応答を評価するために、以下のパラメーター(95％信頼区間と共に)を各処理群について算出した：
・0および21日目でのHI抗体力価の幾何学的平均力価(GMT)；
・21日目での血清変換率(SC)；
・21日目での変換係数；
・0および21日目での防御率。

III.6.1 HI幾何学的平均力価(GMT)
95％CIを有するHI抗体のGMTを表10および図1に示す。群間で調整されたGMT比を表11に示す。

全部で3種のワクチン株に関するHI抗体のワクチン接種前のGMTは、3つの処理群において同じ範囲内にあった。アジュバント化された群について21日目に観察されるGMTは、A/ウィスコンシンワクチン株についてFluLD1/1およびFluarix間で統計学的差異(95％CIの重複なし、調整されたGMT比は値1を含まなかった)を有する全部で3種の株について、Fluarix群よりも高い傾向を有する。B/マレーシアワクチン株についてFluLD1/2とFluarixの間でも統計学的差異(調整されたGMT比は値1を含まなかった)が観察された。

（表１０）

（表１１）

III.6.2. 抗HI抗体力価の変換係数、血清防御率および血清変換率(ヒトにおけるインフルエンザワクチンについて確立された防御について相関する)
結果を、血清防御率については表6-図2、血清変換率については表7-図3に、および変換係数については表8-図4に提供する。

全ての群において、血清防御率に関する欧州当局により要求される閾値(70％)に到達した(少なくとも94.9％)。各ワクチン株について、3群に関する21日目の血清防御率は同じ範囲内にあった。

全ての群において、血清変換率に関する欧州当局により要求される閾値(40％)に到達した(少なくとも65％)。

A/ニューカレドニアワクチン株について、3群に関する21日目のSCRは同じ範囲内にあった。

A/ウィスコンシンワクチン株について、FluLD1/1群に関する21日目のSCRは、Fluarix群と比較してより高い傾向があった。FluLD1/2群に関する21日目のSCRは、Fluarix群と比較して同じ範囲内にあった。

B/マレーシアワクチン株について、FluLD1/2群に関する21日目のSCRは、Fluarix群と比較してより高い傾向があった。FluLD1/1群に関する21日目のSCRは、Fluarix群と比較して同じ範囲内にあった。

全ての群において、血清変換係数(2.5)に関する欧州当局により要求される閾値に到達した(少なくとも6.2)。

A/ニューカレドニアワクチン株について、3群に関する21日目のSCFは、同じ範囲内にあるようであった。FluLD1/2群について観察された値は、Fluarix群について観察された値より低かったが、FluLD1/2群における高い方のワクチン接種前の血清防御率により説明することができた。

A/ウィスコンシンワクチン株について、FluLD1/1群に関する21日目のSCFは、Fluarix群と比較してより高い傾向があった。FluLD1/2群に関する21日目のSCFは、Fluarix群と比較して同じ範囲内にあった。

B/マレーシアワクチン株について、2つのアジュバント化群に関する21日目のSCFは、Fluarix群と比較してより高いものである傾向があった。

（表６）

（表７）

（表８）

III.7. 安全性結論
Fluarix群と比較したアジュバント化ワクチン群における応答型(局所／全身)および非応答型徴候に関するより高い反応原性は、この試験において観察された全体的な傾向であった。

アジュバント化ワクチン中のAS03含量の低下は、全ての全身および局所等級3徴候に対する有意な影響を有する。

非応答型徴候の発生は、Fluarix群(35％)と比較して、アジュバント化ワクチン群(55％および47％の被験者)においてより高い傾向があった。

これらの結果から、候補ワクチンの反応原性および安全性プロフィールが満足のいくものであり、臨床的に許容し得ると結論付けることができる。

III.8. 全体の結論
III.8.1. 免疫原性結果
この試験の主要評価項目は、2つの異なる濃度のAS03アジュバントを含む低用量のインフルエンザワクチン、およびFluarixにより引き出される体液性免疫応答(抗HI抗体力価)を評価することであった。

21日目に、3種のワクチンは、スプリットビリオンインフルエンザワクチンの毎年の登録に関する欧州当局の要件を超えた(毎年の株の変化の免疫学的評価に関する「Note for Guidance on Harmonisation of Requirements for influenza Vaccines」-CPMP/BWP/214/96)。GMTは、A/ウィスコンシン(FluLD1/1対Fluarix)およびB/マレーシアワクチン株(FluLD1/2対Fluarix)について観察された統計学的に有意な差異と共に、Fluarix群と比較してアジュバント化群においてより高い傾向にあった。3種全部のワクチン群において、94.9％〜99％の範囲で、同様の血清防御率が観察された。血清変換率および血清変換係数は、Fluarix群におけるよりもアジュバント化群においてより高いことが観察された。この試験からのデータはまた、AS03アジュバントの用量の半分を含むワクチンにより誘導された免疫原性が、当該アジュバントの全用量により誘導されるものに匹敵することを明らかにした。

III.8.2. 反応原性および安全性結果
AS03でアジュバント化された低用量インフルエンザ候補ワクチンの投与は安全であり、試験集団、すなわち、18〜59歳の年齢の成人において臨床的によく寛容された。半量のアジュバント化ワクチンは、全用量のアジュバント化ワクチンと比較して、応答型局所および全身徴候の発生の顕著な低下を示した。

実施例IV−初回免疫されたBALB/cマウスにおけるアジュバント化および非アジュバント化スプリットインフルエンザワクチン(様々な用量のAS03アジュバントを含む)の前臨床評価
IV.1. 実験設計および評価項目
インフルエンザで初回免疫されたマウスにおける実験を実施して、この水中油型アジュバントを用いて製剤化されたインフルエンザワクチンにより誘導されたAS03による体液性応答の増加を評価した。ヒトの状況をシミュレートするために、ヘテロサブタイプ株で初回免疫されたマウスを用いて実験を行った。

IV.1.1. 処理／群(表9)
27匹の成体雌BALB/cマウスの群を、三価全ホルマリン不活化インフルエンザウイルス(各株につき5μgのHA)を用いて0日目に鼻内的に(20μl容量)初回免疫した。初回免疫株は、ワクチン中に含まれるものよりも早いドリフト変異体(5μgのHA全不活化H1N1 A/ヨハネスブルグ/82/96、H3N2 A/シドニー/5/97、B/ハルビン/7/94)からなっていた。28日後、合計容量50μlで筋肉内的に単回用量のワクチン候補をマウスにワクチン接種した。スプリット抗原のみ(三価スプリットプレーン)を含む製剤または2種の用量のAS03(完全もしくは1/5)でアジュバント化されたスプリット抗原を含む製剤を用いて、マウスを免疫した。免疫に用いた株は、H1N1 A/ニューカレドニア/20/99、H3N2 A/パナマ/2007/99、B/山東/7/97ウイルス抗原(1.5μg/株、ヒト用量の1/10)を含んでいた。

（表９）

IV.1.2. ワクチン製剤の調製
Tween 80、Triton X-100およびコハク酸ビタミンE(VES)のプレミックスを調製して、750μg/mlのTween 80、110μg/mlのTriton X100および100μg/mlのVESのワクチン中の最終濃度を達成する。プレミックス中で用いられる量を、株中に既に存在する界面活性剤およびVESの量を考慮に入れて算出する。

1リットルの10倍濃縮された塩水バッファー(PBS pH 7.4)の調製：0.800 lの注入用の水に、NaCl 80 g、KCl 2 g、Na₂HPO₄ 11.44 g、KH₂PO₄ 2 gを添加する。溶解させた後、注入用の水で1.0 Lに調整する。10倍希釈した場合、pHは7.4であろう。

三価スプリット／プレーン
1回分の50μl用量の製剤を、以下の順番に従って即席で調製する：注入用の水＋塩水バッファー(10倍濃縮されたPBS pH 7.4)＋プレミックス、室温で5分間、磁気攪拌、＋1.5μg HA H1N1株、室温で10分間、磁気攪拌、＋1.5μg HA H3N2株、室温で10分間、磁気攪拌、＋1.5μg HA B株、室温で15分間、磁気攪拌。この製剤を、その調製の終わりの後1時間以内に注入する。

三価スプリット／AS03
Tween 80、Triton X100およびコハク酸ビタミンE(VES)のプレミックスを調製して、750μg/mlのTween 80、110μg/mlのTriton X100および100μg/mlのVESのワクチン中の最終濃度を達成する。プレミックス中で用いられる量を、株中に既に存在する界面活性剤およびVESの量を考慮に入れて算出する。

1回分の50μl用量の製剤を、以下の順番に従って即席で調製する：注入用の水＋塩水バッファー(10倍濃縮されたPBS pH 7.4)＋プレミックス、室温で5分間、磁気攪拌、＋1.5μg HA H1N1株、室温で10分間、磁気攪拌、＋1.5μg HA H3N2株、室温で10分間、磁気攪拌、＋1.5μg HA B株、室温で15分間、磁気攪拌、＋全用量AS03については25μlのSB62エマルジョンまたは1/5用量のAS03については5μlのSB62エマルジョン、室温で15分間、磁気攪拌。この製剤を、その調製の終わりの後1時間以内に注入する。

IV.1.3. 読み出し(表10)
ワクチン接種に対する体液性免疫応答を、免疫の前(28日目)および免疫の14日後に測定した(27匹のマウス／群)。血清サンプルを、血球凝集抑制(HI)試験により試験した。

（表１０）

IV.2. 結果
IV.2.1. 体液性免疫
結果を図5に提供する。ヘテロサブタイプ初回免疫、次いで1回のワクチン接種のこのマウスモデルにおいては、AS03およびその希釈液はプレーンワクチンと比較してより高いHI力価を誘導することが示された。全てのインフルエンザA株について、HI力価の統計学的に有意な増加が観察された(p<0.05)。また、H1N1株については、HI力価の有意差がAS03とAS03 1/5の間で観察された(p<0.05)。少量のAS03は、プレーンワクチンと比較して3種全部の株についてHI力価を増加させることができなかった。B株(B/山東)に対しては、非常に低い応答が観察された；これは、初回免疫に用いられたB株とワクチンとの間での有意な抗原ドリフトに起因するものである可能性がある。

IV.3. 結果および結論のまとめ
結論においては、プレーンワクチンと比較して、AS03アジュバント化ワクチンを用いる場合、ヘテロサブタイプ株で初回免疫された動物において、HI力価の増加が観察された。全用量のAS03は、3種全部のインフルエンザワクチン株に対して強固なHI力価を得るのに最適であった。

実施例V−初回免疫されたC57Bl/6マウスにおけるアジュバント化および非アジュバント化スプリットインフルエンザワクチン(様々な用量のAS03アジュバントを含む)の前臨床評価
V.1. 実験設計および評価項目
インフルエンザで初回免疫されたマウスにおける実験を実施して、この水中油型アジュバントを用いて製剤化されたAS03誘導インフルエンザワクチンによる体液性および細胞性応答の増加を評価した。

ヒトの状況をシミュレートするために、ヘテロサブタイプ株で初回免疫されたマウスを用いて実験を行った。

V.1.1. 処理／群(表11)
25匹の成体雌C57Bl/6マウスの群を、三価全ホルマリン不活化インフルエンザウイルス(各株につき5μgのHA)を用いて0日目に鼻内的(20μl容量)に初回免疫した。初回免疫株は、ワクチンに含まれるものよりも早いドリフト変異体(5μg HA全不活化H1N1 A/北京/262/95、H3N2 A/パナマ/2007/99、B/山東/7/97)からなっていた。28日後、合計容量100μlで筋肉内的に単回用量のワクチン候補をマウスにワクチン接種した。スプリット抗原のみ(三価スプリットプレーン)を含む製剤または3種の用量のAS03(完全、1/2もしくは1/5)でアジュバント化されたスプリット抗原を含む製剤を用いて、マウスを免疫した。免疫に用いた株は、H1N1 A/ニューカレドニア/20/99、H3N2 A/ニューヨーク/55/2004、B/江蘇/10/2003ウイルス抗原(1.5μg/株、ヒト用量の1/10)を含んでいた。

（表１１）

V.1.2. ワクチン製剤の調製
三価スプリット／プレーン
100μl用量の製剤を、以下の順番に従って即席に調製する：注入用の水＋塩水バッファー(実施例IVに教示されたように調製された10倍濃縮されたPBS pH 7.4)＋Fluarix Clinical Lot DFLUA014(最終用量中に、株あたり1.5μg)。

三価スプリット／AS03
100μl用量の製剤を、以下の順番に従って即席に調製する：注入用の水＋塩水バッファー(実施例IVに教示されたように調製された10倍濃縮されたPBS pH 7.4)＋Fluarix Clinical Lot DFLUA014(最終用量中に、株あたり1.5μg)＋全用量については25μlのSB62エマルジョンまたは1/2用量については12.5μlのSB62エマルジョンまたは1/5用量については5μlのSB62エマルジョン。この製剤を、調製の終わりの後1時間以内に注入する。

V.1.3. 読み出し(表12)
ワクチン接種に対する体液性免疫応答を、免疫の21日後に測定し(10匹のマウス／群)、血清サンプルを、血球凝集抑制(HI)試験により試験した。細胞性免疫応答を、細胞内サイトカイン染色(ICS)により免疫の7日後に試験した。

（表１２）

V.2. 結果
V.2.1. 体液性免疫(10匹のマウス／群)
結果を図6に提供する。ヘテロサブタイプ初回免疫、次いで1回のワクチン接種のこのマウスモデルにおいては、AS03およびその希釈液(1/2および1/5)はプレーンワクチンと比較してより高いHI力価を誘導することが示された。3種全部の株について、全用量AS03または低用量のAS03でアジュバント化されたワクチンを受容するマウス間でHI力価の差異は観察されなかった。

V.2.2. 細胞性免疫(15匹のマウス／群)
結果を図7に提供する。AS03の希釈率に関わらず、三価スプリットプレーンで免疫されたマウスと比較して、AS03でアジュバント化された三価スプリットワクチンで免疫されたマウスにおいて、より高いCD4+ T細胞応答が観察された。全用量AS03でアジュバント化された三価スプリットで免疫されたマウスにおいて誘導された応答と比較して、マウスをより低用量のAS03でアジュバント化された三価スプリットで免疫した場合、より少ない細胞性応答の傾向が観察された。

V.3. 結果および結論のまとめ
結論において、プレーンワクチンと比較して、AS03アジュバント化ワクチンを用いる場合、ヘテロサブタイプ株で初回免疫された動物において、体液性および細胞性応答の増加が観察された。全用量または分画用量のAS03アジュバントで免疫されたマウス間で、類似する規模の体液性応答が観察された。しかしながら、アジュバント用量の減少は、CD4+ T細胞応答の低下した規模に関する傾向と関連していた。

実施例VI−初回免疫されたC57Bl/6マウスにおけるアジュバント化および非アジュバント化スプリットインフルエンザワクチン(様々な用量のAS03アジュバントおよび低用量の抗原を含む)により誘導される細胞性免疫応答の前臨床評価
VI.1. 実験設計および評価項目
インフルエンザで初回免疫されたマウスにおける実験を実施して、低用量の抗原(0.5μg/株、1/30ヒト用量)を含み、この水中油型アジュバントと共に製剤化されたインフルエンザワクチンにより誘導されるAS03による細胞性免疫応答の増加を評価した。ヒトの状況をシミュレートするために、ヘテロサブタイプ株で初回免疫されたマウスを用いて実験を行った。

VI.1.1. 処理／群(表13)
15匹の成体雌C57Bl/6マウスの群を、三価全ホルマリン不活化インフルエンザウイルス(各株につき5μg HA)を用いて0日目に鼻内的に(20μl容量)初回免疫した。初回免疫株は、ワクチンに含まれるものよりも早いドリフト変異体(5μg HA全不活化H1N1 A/北京/262/95、H3N2 A/パナマ/2007/99、B/山東/7/97)からなっていた。28日後、合計容量50μlで筋肉内的に単回用量のワクチン候補をマウスにワクチン接種した。スプリット抗原のみ(三価スプリットプレーン)を含む製剤または3種の用量のAS03(完全、1/2もしくは1/5)でアジュバント化されたスプリット抗原を含む製剤を用いて、マウスを免疫した。免疫に用いた株は、H1N1 A/ニューカレドニア/20/99、H3N2 A/ニューヨーク/55/2004、B/江蘇/10/2003ウイルス抗原(1.5μg/株、ヒト用量の1/30)を含んでいた。

（表１３）

VI.1.2. ワクチン製剤の調製
三価スプリット／プレーン
50μl用量の製剤を、以下の順番に従って即席に調製する：注入用の水＋塩水バッファー(実施例IVに教示されたように調製された10倍濃縮されたPBS pH 7.4)＋Fluarix Clinical Lot DFLUA014(最終用量中に、株あたり0.5μg)。

三価スプリット／AS03
50μl用量の製剤を、以下の順番に従って即席に調製する：注入用の水＋塩水バッファー(実施例IVに教示されたように調製された10倍濃縮されたPBS pH 7.4)＋Fluarix Clinical Lot DFLUA014(最終用量中に、株あたり0.5μg)＋全用量については25μlのSB62エマルジョンまたは1/2用量については12.5μlのSB62エマルジョンまたは1/5用量については5μlのSB62エマルジョン。この製剤を、調製の終わりの後1時間以内に注入する。

V.1.3. 読み出し(表14)
細胞性免疫応答を、細胞内サイトカイン染色により免疫の7日後に試験した。

（表１４）

VI.2. 結果
VI.2.1. 細胞性免疫
結果を図8に提供する。三価スプリットプレーンで免疫したマウスと比較して、AS03(全用量もしくは1/2用量)でアジュバント化された三価スプリットワクチンで免疫したマウスにおいて、わずかにより高いCD4+ T細胞応答が観察された。三価スプリットプレーンまたは全用量もしくは半量のAS03でアジュバント化されたワクチンで免疫されたマウスにおいて誘導された応答と比較して、マウスを1/5用量のAS03でアジュバント化された三価スプリットで免疫した場合、より高い細胞性応答が観察された。

VI.3. 結果および結論のまとめ
結論においては、プレーンワクチンと比較して、AS03でアジュバント化されたワクチンを用いる場合、ヘテロサブタイプ初回免疫動物において、CD4+ T細胞応答の最小的な増加が観察された。この実験においては、アジュバント用量応答は観察されなかったが、実際に1/5のAS03用量により、より高いアジュバント用量を用いる場合に認められるものよりも高い頻度の抗原特異的CD4+ T細胞が誘導された。これらのデータは、全体として他の前臨床試験と一致しなかったが、これはこの特定の実験に関する技術的な問題を示唆しうるものである。

実施例VII−ナイーブなC57Bl/6マウスにおけるアジュバント化および非アジュバント化スプリットH5N1ワクチン(様々な用量のAS03アジュバントおよび抗原を含む)の前臨床評価
VII.1. 実験設計および評価項目
H5N1にナイーブなマウスにおける実験を実施して、この水中油型アジュバントと共に製剤化されたH5N1スプリットワクチンにより誘導されるAS03による体液性および細胞性免疫応答の増加を評価した。流行の場合、世界全体の集団が新規に循環する流行インフルエンザ株に対して免疫学的にナイーブであると予想される。このナイーブな状態に起因して、流行ワクチンは新しいインフルエンザ株により引き起こされる感染および重篤な疾患から個人を防御するための2種のワクチン用量を必要とする可能性が高い。以前の曝露のこの欠如を表すために、ナイーブなマウスモデルを開発して、ワクチンの免疫原性を評価した。

VII.1.1. 処理／群(表15)
15匹の成体雌ナイーブC57Bl/6マウスの群を、全量50μlで筋肉内的に流行H5N1ワクチン候補を用いて0日目および28日目に免疫した。マウスを、スプリットH5N1抗原のみ(H5N1スプリットプレーン)を含む製剤または様々な用量のAS03(2倍、全、1/2もしくは1/5)でアジュバント化されたスプリット抗原を含む製剤で免疫した。免疫に用いた株は、H5N1 A/ベトナム/1194/04ウイルス抗原(ヒト用量の1/10に対応する1.5または0.38μg/株)を含んでいた。1回の50μlのH5N1スプリット/AS03全用量＋1回の50μlのAS03用量の同時注入よりもむしろ、2倍のAS03用量を用いて製剤化を行わなかった。

（表１５）

VII.1.2. ワクチン製剤の調製
1リットルの最終バルクバッファー(PBS pH 7.2±0.2)の調製：0.800 lの注入用の水に、NaCl 7.699 g、KCl 0.200 g、MgCl₂ x 6H₂O 0.100 g、Na₂HPO₄ x 12 H₂O 2.600 g、KH₂PO₄ 0.373 gを添加する。溶解後、注入用の水で1.0 Lに調整する。

H5N1スプリット／プレーン
50μl用量の調製：
チオメルサール(株中でのその濃度を考慮に入れた量)およびTriton X100を、最終バルクバッファーに添加する。Tween 80を内容物として添加せず、製剤中の標的を、株のTween濃度により達成する。最終濃度は、1.5μg製剤用量中、10μg/mlのチオメルサール、368μg/mlのTween 80および35μg/mlのTriton X100である。それらは、0.38μgの製剤用量中では、チオメルサールについては10μg/ml、Tween 80については93μg/mlおよびTriton X100については8.9μg/mlである。5〜30分間磁気攪拌した後、1.5または0.38μgのHA (H5N1株)を添加する。製剤を30〜60分間攪拌する。pHを調べる。製剤化の終わりの後1時間以内に注入を行う。

H5N1スプリット/AS03
50μl用量の調製：
チオメルサール(株中でのその濃度を考慮に入れた量)およびTriton X100を、最終バルクバッファーに添加する。Tween 80を内容物として添加せず、製剤中の標的を、株のTween濃度により達成する。最終濃度は、1.5μg製剤用量中、10μg/mlのチオメルサール、368μg/mlのTween 80および35μg/mlのTriton X100である。それらは、0.38μgの製剤用量中では、チオメルサールについては10μg/ml、Tween 80については93μg/mlおよびTriton X100については8.9μg/mlである。5〜30分間磁気攪拌した後、1.5または0.38μgのHA (H5N1株)を添加する。30〜60分間攪拌した後、25または12.5または5μlのSB62エマルジョンを添加する。製剤を30〜60分間攪拌する。pHを調べる。製剤化の終わりの後1時間以内に注入を行う。

VII.1.3. 読み出し(表16)
抗Ig、IgG1およびIgG2b抗体力価(図9、A-F)により、免疫の14日後(10匹のマウス／群)に体液性免疫応答を測定した。また、抗H5N1血球凝集抑制アッセイにより、免疫の21日後(10匹のマウス／群)に体液性免疫応答を測定した(図10、A-B)。

細胞性免疫応答を、フローサイトメトリーにより数えられた抗原特異的CD4+ T細胞の細胞内サイトカイン染色(ICS)により免疫の6日後(3匹のマウス／群の5つのプール)に細胞性免疫応答を試験した(図11、A-B)。

（表１６）

VII.2. 結果
VII.2.1. 体液性免疫応答：ELISAおよびアイソタイプ
結果を図9に提供する。

各用量のH5N1スプリットワクチンで、全てのアジュバント化群は、非アジュバント化H5N1スプリットワクチンと比較して、より高い抗H5N1 Ig、IgG1およびIgG2b抗体力価を誘導した(図9-A〜F)。

各用量のH5N1スプリットワクチンで、抗H5N1 IgG1抗体応答は、抗H5N1 IgG2b抗体応答よりも4〜5倍高かった(図9-C〜F)。1.5μg HA用量のH5N1スプリットワクチンと各用量のアジュバントを混合した場合、抗H5N1 Ig、IgG1およびIgG2b抗体応答の差異は観察されなかった(図9-A、CおよびE)。

0.38μg HA用量のH5N1スプリットワクチンを用いる場合、AS03/2(p=0.7315)およびAS03 1/5(p=0.9744)でアジュバント化されたH5N1スプリットワクチンにより誘導される応答と比較して、2倍〜全用量でアジュバント化されたH5N1スプリットワクチンを用いる免疫後に、より高い抗H5N1 Ig力価に関する傾向が得られた(図9-B)。また、この傾向は抗H5N1 IgG1抗体応答についても観察された(図9-D)。しかしながら、この力は統計学的有意差を観察するには十分ではなかった(1.7倍の差異については25％の力、または2倍の差異については47％)。

VII.2.2. 体液性免疫応答：HI力価
1.5μg HA用量／マウスの場合
各アジュバント用量で、AS03でアジュバント化されたH5N1スプリットワクチンで免疫された全てのマウスは、非アジュバント化H5N1スプリットワクチンで免疫されたマウスにおいて得られる応答と比較して、より高いHI力価を誘導した(図10A)。H5N1スプリットワクチンを一定用量範囲のAS03でアジュバント化した場合、HI力価の差異は観察されなかった(図10A)。

0.38μg HA用量／用量の場合
各アジュバント用量で、AS03でアジュバント化されたH5N1スプリットワクチンで免疫された全てのマウスは、非アジュバント化H5N1スプリットワクチンで免疫されたマウスにおいて得られる応答と比較して、より高いHI力価を誘導した(図10B)。

AS03/2でアジュバント化されたH5N1スプリットワクチンを用いて得られる応答と比較して、2倍全用量のAS03でアジュバント化されたH5N1スプリットワクチンを用いる場合、有意により高いHI力価が観察された(4倍の差異についてはp=0.032)(図10B)。

2倍全用量のAS03もしくは全用量のAS03でアジュバント化されたH5N1スプリットワクチンで免疫されたマウスにおいて、またはAS03/2もしくはAS03/5でアジュバント化されたH5N1スプリットワクチンで免疫されたマウス間で、HI力価の差異は観察されなかった(図10B)。

抗原用量間での比較(1.5μgまたは0.38μg)
AS03/5でアジュバント化された1.5μg HAスプリットH5N1で免疫されたマウスと、2倍全用量のAS03でアジュバント化された0.38μg HAスプリットH5N1で免疫されたマウスとの間を除いて、AS03、AS03/2またはAS03/5でアジュバント化されたそれぞれのHA用量のH5N1スプリットワクチンで免疫されたマウス間で、HI力価の差異は観察されなかった(図10)。より低いアジュバント化用量と混合したより高い抗原用量と比較して、2倍全用量のAS03でアジュバント化された0.38μg HAスプリットH5N1を用いる免疫後に、HI力価は有意により高かった(AS03/5について1.5μg HA、4倍の差異についてはp=0.0193)(図10)。

VII.2.3. 細胞性免疫応答
結果を図11に提供する。

各用量のH5N1スプリットワクチン(1.5または0.38μg)で、非アジュバント化H5N1スプリットワクチンで免疫されたマウスと比較して、様々な用量のAS03でアジュバント化されたH5N1スプリットワクチンで免疫されたマウスにおいて、より高いCD4+ T細胞応答が観察された(図11)。

1.5μg用量のH5N1スプリットワクチンで、AS03用量の減少はCD4+ T細胞頻度の低下に一致した(図11A)。しかしながら、0.38μg用量のH5N1スプリットワクチンで、AS03でアジュバント化されたH5N1スプリットワクチンで免疫されたマウスにおける異なるアジュバント用量間でCD4+ T細胞応答の差異は観察されなかった。

VII.3. 結果および結論のまとめ
マウスにおける免疫原性試験により、アジュバント化されたH5N1スプリットワクチンは、非アジュバント化されたH5N1スプリットワクチンにより誘導されるものよりも、有意により高い体液性(抗H5N1 ELISAおよびHI力価)および細胞性(CD4+ T細胞)応答を誘導することが示された。

1.5μgおよび0.38μgのアジュバント化されたH5N1スプリットワクチンで免疫されたマウス間で、体液性免疫応答について抗原用量応答効果は観察されなかったが、これは、このモデルにおいて用量応答効果を観察するためには、アジュバントの存在下で、より低用量のHAでも必要であることを示唆している。

プレーンH5N1ワクチンと比較して、AS03アジュバント化H5N1流行ワクチンを用いる場合、ナイーブなマウスにおいてCD4+ T細胞応答の強力な増加が観察された。0.38μg用量のH5N1スプリットワクチンをワクチン候補として用いる場合、AS03希釈液の影響は観察されなかったが、1.5μgのH5N1スプリットワクチンを少量のAS03でアジュバント化した場合、CD4 T細胞応答の低下が観察された。

以前に観察されたように、全用量のAS03またはAS03/2でアジュバント化されたH5N1スプリットワクチン(いずれかの抗原用量)で免疫されたマウス間で、体液性および細胞性免疫応答の差異は観察されなかった。2倍全用量のAS03をワクチン製剤中で用いる場合、免疫応答のいくらかの増強が検出され、従って、AS03/5をワクチン製剤中で用いる場合、免疫応答の低下が検出された。

全体として、ここで報告されたデータは、このワクチン製剤におけるこの新規アジュバント系の効力を支持している。

実施例VIII−初回免疫された巨大白ブタにおけるアジュバント化および非アジュバント化インフルエンザワクチンの前臨床評価
VIII.1. 実験設計および評価項目
インフルエンザで初回免疫されたブタにおける実験を実施して、この水中油型アジュバントと共に製剤化されたAS03により誘導されたインフルエンザワクチンによる体液性応答の増加を評価した。

ヒトに近い動物モデルにおけるAS03の用量範囲を評価するために、ブタを用いた。ブタは、ごくわずかの例外を除いて、ヒトに生理学的に最も近いものとしてこの動物を確立する長い一覧の生物学的類似性を示す(Douglas R., 1972)。さらに、ブタにおけるインフルエンザ感染の徴候が一般的に観察される。

VIII.1.1. 処理／群(表17)
10匹の成体巨大白ブタの群を、全量200μlで鼻内的に、三価全ホルマリン不活化インフルエンザウイルス(各株につき25μg HA)を用いて0日目に初回免疫した。初回免疫株は、ワクチン株と相同な株(25μg HA全不活化H1N1 A/ニューカレドニア/20/99、H3N2 A/パナマ/2007/99およびB/山東/7/97)からなっていた。28日後、全量500μlで筋肉内的に、単回用量のワクチン候補をブタにワクチン接種した。ブタを、スプリット抗原のみ(三価スプリットプレーン)を含む製剤または一定用量範囲のAS03(全、1/2もしくは1/5)でアジュバント化されたスプリット抗原を含む製剤で免疫した。免疫に用いた株は、H1N1 A/ニューカレドニア/20/99、H3N2 A/パナマ/2007/99およびB/山東/7/97ウイルス抗原(H1N1 A/ニューカレドニア/20/99、H3N2 A/パナマ/2007/99株については15μg HAおよび1回ヒト用量において17.5μgのB/山東/7/97株)を含んでいた。

群(10匹のブタ／群)：
（表１７）

VIII.1.2. ワクチン製剤の調製
三価スプリット／プレーン
Tween 80、Triton X100およびコハク酸ビタミンE(VES)のプレミックスを、750μg/mlのTween 80、110μg/mlのTriton X100および100μg/mlのVESのワクチン中の最終濃度を達成するために調製する。プレミックス中で用いられる量は、株中でのそれらの含量を考慮に入れる。

1回の500μl用量の製剤を、以下の順序に従って即席で調製する：注入用の水＋塩水バッファー(実施例IVに教示されたように調製された10倍濃縮されたPBS pH 7.4)＋プレミックス、室温で5分間磁気攪拌、＋15μg HA H1N1株、室温で10分間磁気攪拌、＋15μg HA H3N2株、室温で10分間磁気攪拌、＋17.5μg HA B株、室温で15分間磁気攪拌。この製剤をその調製の終わりの後1時間以内に注入する。

三価スプリット／AS03
Tween 80、Triton X100およびコハク酸ビタミンE(VES)のプレミックスを、750μg/mlのTween 80、110μg/mlのTriton X100および100μg/mlのVESのワクチン中の最終濃度を達成するために調製する。プレミックス中で用いられる量は、株中でのそれらの含量を考慮に入れる。

1回の500μl用量の製剤を、以下の順序に従って即席で調製する：注入用の水＋塩水バッファー(実施例IVに教示されたように調製された10倍濃縮されたPBS pH 7.4)＋プレミックス、室温で5分間磁気攪拌、＋15μg HA H1N1株、室温で10分間磁気攪拌、＋15μg HA H3N2株、室温で10分間磁気攪拌、＋17.5μg HA B株、室温で15分間磁気攪拌、＋全用量AS03については250μlのSB62エマルジョンもしくは1/2用量のAS03については125μlのSB62エマルジョンもしくは1/5用量のAS03については50μlのSB62エマルジョン、室温で15分間磁気攪拌。この製剤をその調製の終わりの後1時間以内に注入する。

VIII.1.3. 読み出し(表18)
ワクチン接種に対する体液性免疫応答を、鼻内初回免疫の前(0日目)、免疫の前(28日目)および免疫の14日後に測定した(10匹のブタ／群)。血清サンプルを、血球凝集抑制(HI)試験により試験した。

（表１８）

VIII.2. 結果および結論
VIII.2.1. 体液性免疫
結果を図12に提供する。アジュバントの希釈率に関わらず、AS03でアジュバント化された三価スプリット製剤は、相同初回免疫のこのモデルにおいて、プレーン三価製剤よりも、全ての株に対してより強力なHI応答を誘導したが、3種全部の株について、統計学的有意差は常に達成されるわけではなかった。アジュバント用量効果は、株間でわずかな差異と共に観察された。B/山東などの免疫原性の低い株については、全用量のAS03でアジュバント化された三価スプリットワクチンのみが、プレーンワクチンと有意に異なっていた。全用量のAS03でアジュバント化された三価スプリットワクチンと対照的に、少量のAS03は、プレーンワクチンについて認められたものと比較して上記の3種の全部の株についてHI力価を増加させることができなかった。

Claims

抗原または抗原組成物と、水中油型エマルジョンを含むアジュバント組成物とを含む免疫原性組成物であって、該水中油型エマルジョンがヒト用量あたり0.5〜10 mgの代謝可能油、0.5〜11 mgのトコールおよび0.1〜4 mgの乳化剤を含む、前記免疫原性組成物。
抗原または抗原組成物と、水中油型エマルジョンからなるアジュバント組成物とを含む免疫原性組成物であって、該水中油型エマルジョンがヒト用量あたり0.5〜10 mgの代謝可能油、0.5〜11 mgのトコールおよび0.1〜4 mgの乳化剤を含む、前記免疫原性組成物。
抗原または抗原組成物と、水中油型エマルジョンを含むアジュバント組成物とを含む免疫原性組成物であって、該水中油型エマルジョンが1種以上のさらなる免疫刺激剤を含み、ヒト用量あたり0.5〜10 mgの代謝可能油、0.5〜11 mgのトコールおよび0.1〜4 mgの乳化剤を含む、前記免疫原性組成物。
抗原または抗原組成物と、水中油型エマルジョンを含むアジュバント組成物とを含むワクチン組成物であって、該水中油型エマルジョンがヒト用量あたり0.5〜10 mgの代謝可能油、0.5〜11 mgのトコールおよび0.1〜4 mgの乳化剤を含む、前記ワクチン組成物。
水中油型エマルジョンがヒト用量あたり、1〜10、2〜10、3〜9、4〜8、5〜7、または5〜6 mg(例えば、2〜3、5〜6、または9〜10 mg)の代謝可能油を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
水中油型エマルジョンがヒト用量あたり、0.5〜11、1〜11、2〜10、3〜9、4〜8、5〜7、5〜6 mg(例えば、10〜11、5〜6、2.5〜3.5または1〜3 mg)のトコールを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
水中油型エマルジョンがヒト用量あたり、0.1〜5、0.2〜5、0.3〜4、0.4〜3または2〜3 mg (例えば、0.4〜1.2、2〜3または4〜5 mg)の乳化剤を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
代謝可能油の量がヒト用量あたり5.35 mgである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
代謝可能油の量がヒト用量あたり2.14 mgである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
トコールの量がヒト用量あたり5.94 mgである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
トコールの量がヒト用量あたり2.38 mgである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
乳化剤の量がヒト用量あたり2.425 mgである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
乳化剤の量がヒト用量あたり0.97 mgである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
代謝可能油がスクアレンである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
トコールがα-トコフェロールである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
乳化剤がポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートがPolysorbate(登録商標)80またはTween(登録商標)80を含む群より選択される、請求項１６に記載の免疫原性組成物。
ワクチン組成物容量が0.4〜1.5 mlである、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
前記用量容量が0.5 mlである、請求項１８に記載の免疫原性組成物。
前記用量容量が0.7 mlである、請求項１８に記載の免疫原性組成物。
前記用量容量が1.0 mlである、請求項１８に記載の免疫原性組成物。
抗原または抗原組成物が、HIV-1、ヒトヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、SARSコロナウイルス、ロタウイルス、エプスタイン・バーウイルス(gp350もしくはその誘導体など)、帯状疱疹ウイルス、B型肝炎ウイルス、A型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルスおよびE型肝炎ウイルス、パラミクソウイルス：呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ヒトパピローマウイルス、フラビウイルス、インフルエンザウイルス(卵もしくはMDCK細胞中で増殖させた、全生もしくは不活化ウイルス、スプリットインフルエンザウイルス、または全フルービロソーム(R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920に記載)またはその精製もしくは組換えタンパク質、例えば、HA、NP、NA、もしくはMタンパク質、またはその組合せ)、またはナイセリア種；S. pyogenes、S. agalactiae、S. mutans；H. ducreyi；モラクセラ種；ボルデテラ種；マイコバクテリウム種；レジオネラ種；エシェリキア種；ビブリオ種；シゲラ種；エルシニア種；カンピロバクター種；サルモネラ種；リステリア種；ヘリコバクター種；シュードモナス種；スタフィロコッカス種；エンテロコッカス種；クロストリジウム種；バチルス種；コリネバクテリウム種；ボレリア種；リケッチア種；クラミジア種；レプトスピラ種；トレポネマ種；プラスモジウム種；トキソプラズマ種；エントアメーバ種；バベシア種；トリパノソーマ種；ジアルディア種；レーシュマニア種；ニューモシスティス種；トリコモナス種；シゾストーマ種；カンジダ種；クリプトコッカス種などの細菌病原体に由来する抗原、アレルゲン特異的およびアレルゲン非特異的抗原、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、腎臓癌、卵巣癌もしくはメラノーマ癌抗原などの腫瘍抗原を含む群より選択される1種以上の抗原から調製されるものである、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
請求項１〜２２のいずれか１項に記載の免疫原性組成物を、疾患に罹患しているか、または疾患に罹りやすい患者に投与することを含む、疾患を治療または予防する方法。
症状または疾患の予防的治療または治療における使用のための請求項１〜２３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
症状または疾患の予防的治療または治療における使用のための医薬の製造における、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の免疫原性組成物の使用。
アジュバント組成物が1種以上の免疫刺激剤をさらに含む、請求項２４または２５に記載の使用。
水中油型エマルジョンがヒト用量あたり0.5〜10 mgの代謝可能油、0.5〜11 mgのトコールおよび0.1〜4 mgの乳化剤を含む、該水中油型エマルジョンを含むアジュバント組成物。
水中油型エマルジョンがヒト用量あたり0.5〜10 mgの代謝可能油、0.5〜11 mgのトコールおよび0.1〜4 mgの乳化剤を含む、該水中油型エマルジョンからなるアジュバント組成物。
水中油型エマルジョンが1種以上のさらなる免疫刺激剤を含み、ヒト用量あたり0.5〜10 mgの代謝可能油、0.5〜11 mgのトコールおよび0.1〜4 mgの乳化剤を含む、該水中油型エマルジョンを含むアジュバント組成物。
水中油型エマルジョンが、ヒト用量あたり、1〜10、2〜10、3〜9、4〜8、5〜7または5〜6 mg(例えば、2〜3、5〜6または9〜10 mg)の代謝可能油を含む、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載のアジュバント組成物。
水中油型エマルジョンが、ヒト用量あたり、0.5〜11、1〜11、2〜10、3〜9、4〜8、5〜7、5〜6(例えば、10〜11、5〜6、2.5〜3.5または1〜3 mg)のトコールを含む、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載のアジュバント組成物。
水中油型エマルジョンが、ヒト用量あたり、0.1〜5、0.2〜5、0.3〜4、0.4〜3まあは2〜3 mg(例えば、0.4〜1.2、2〜3または4〜5 mg)の乳化剤を含む、請求項２７〜３１のいずれか１項に記載のアジュバント組成物。
代謝可能油の量がヒト用量あたり5.35 mgである、請求項２７〜３２のいずれか１項に記載のアジュバント組成物。
代謝可能油の量がヒト用量あたり2.14 mgである、請求項２７〜３３のいずれか１項に記載のアジュバント組成物。
トコールの量がヒト用量あたり5.94 mgである、請求項２７〜３４のいずれか１項に記載のアジュバント組成物。
トコールの量がヒト用量あたり2.38 mgである、請求項２７〜３５のいずれか１項に記載のアジュバント組成物。
乳化剤の量がヒト用量あたり2.425 mgである、請求項２７〜３６のいずれか１項に記載のアジュバント組成物。
乳化剤の量がヒト用量あたり0.97 mgである、請求項２７〜３７のいずれか１項に記載のアジュバント組成物。
代謝可能油がスクアレンである、請求項２７〜３８のいずれか１項に記載のアジュバント組成物。
トコールがα-トコフェロールである、請求項２７〜３９のいずれか１項に記載のアジュバント組成物。
乳化剤がポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートである、請求項２７〜４０のいずれか１項に記載のアジュバント組成物。
ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートが、Polysorbate(登録商標)80またはTween(登録商標)80を含む群より選択される、請求項４１に記載のアジュバント組成物。