EA010056B1 - Конструкции нуклеиновых кислот - Google Patents

Конструкции нуклеиновых кислот Download PDF

Info

Publication number
EA010056B1
EA010056B1 EA200600746A EA200600746A EA010056B1 EA 010056 B1 EA010056 B1 EA 010056B1 EA 200600746 A EA200600746 A EA 200600746A EA 200600746 A EA200600746 A EA 200600746A EA 010056 B1 EA010056 B1 EA 010056B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
sequence
nucleic acid
promoter
intron
early
Prior art date
Application number
EA200600746A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200600746A1 (ru
Inventor
Джеймс Фуллер
Original Assignee
Паудерджект Вэксинс, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=34435038&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA010056(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Паудерджект Вэксинс, Инк. filed Critical Паудерджект Вэксинс, Инк.
Publication of EA200600746A1 publication Critical patent/EA200600746A1/ru
Publication of EA010056B1 publication Critical patent/EA010056B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4716—Muscle proteins, e.g. myosin, actin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4741—Keratin; Cytokeratin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
    • C12N2710/16622—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
    • C12N2710/16722—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/15—Vector systems having a special element relevant for transcription chimeric enhancer/promoter combination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/60—Vector systems having a special element relevant for transcription from viruses

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность химерного промотора и сайт для встраивания кодирующей последовательности в функциональной связи с химерным промотором, где последовательность химерного промотора содержит: (а) последовательность предраннего промотора hCMV; (b) экзон 1 и по меньшей мере часть экзона 2 основного предраннего гена hCMV; (с) гетерологичный интрон, расположенный на месте участка интрона А в основном предраннем гене hCMV.

Description

Изобретение относится к областям молекулярной биологии и иммунологии и, в широком смысле, к реагентам, пригодным для использования в технологии иммунизации нуклеиновыми кислотами. Конкретнее, изобретение относится к конструкциям нуклеиновых кислот для экспрессии антигенных полипептидов и к стратегии иммунизации нуклеиновыми кислотами с использованием таких реагентов.
Предшествующий уровень техники
Генная терапия и иммунизация нуклеиновыми кислотами являются многообещающими подходами к лечению и предупреждению и приобретенных и наследственных заболеваний. Эти технологии предполагают внесение соответствующей нуклеиновой кислоты в организм субъекта, с последующей экспрессией ίη νίνο. Это внесение может быть выполнено путем трансфекции клеток или тканей субъекта ех νίνο и возвращения трансформированного материала в клетки хозяина. В качестве альтернативы, нуклеиновая кислота может быть принята ίη νίνο непосредственно субъектом.
Каждая из этих технологий требует эффективной экспрессии нуклеиновой кислоты в трансфицированной клетке для обеспечения достаточного количества терапевтического или антигенного продукта гена. Известно, что некоторые факторы влияют на достигаемый уровень экспрессии, включая эффективность трансфекции и эффективность, с которой ген или представляющая интерес последовательность транскрибируется и их мРНК транслируется.
Ряд экспрессирующих систем описаны в данной области, каждая из которых обычно состоит из вектора, содержащего ген или представляющую интерес нуклеотидную последовательность, функционально связанные с последовательностями, контролирующими экспрессию. Эти контрольные последовательности содержат последовательности промоторов транскрипции и последовательности для начала и окончания транскрипции. В экспрессирующих системах клеток млекопитающих обычно используемые промоторы включают в себя, помимо прочего, ранний промотор 8У40; цитомегаловирусный (СМУ) промотор, такой как предранний промотор СМУ (Сйартап е! а1. (1991), Νιιοί. Ас1бк Век. 19: 3979-3986); промотор длинного концевого повтора (ЬТВ) вируса рака молочной железы мыши; основной поздний аденовирусный промотор (Аб МЬР) и промотор вируса простого герпеса (Н8У). Обычно используют также невирусные промоторы, такие как промотор гена металлотионеина мыши.
Экспрессирующие системы часто содержат элементы-модуляторы транскрипции, упоминаемые как «энхансеры», усилители. Энхансеры в широком смысле определяются как агенты, действующие в цисположении, которые, будучи соединены с последовательностью промотора и гена, ускоряют транскрипцию. Энхансеры могут функционировать из положений, гораздо более удаленных от представляющей интерес последовательности, чем другие контролирующие экспрессию элементы (например, промоторы), и могут оказывать воздействие, будучи расположены в любой ориентации относительно представляющей интерес последовательности (Вапегр е! а1. (1981), Се11 27: 299-308, беУШейк е! а1. (1981), №с1. Ас1бк Век. 9: 6251-6264). Энхансеры были идентифицированы в ряде вирусных источников, включая полиома-вирус, ВК-вирус, цитомегаловирус (СМУ), аденовирус, обезьяний вирус 40 (8У40), вирус саркомы Молони, бычий папиллома-вирус и вирус саркомы Рауса (беУШейк е! а1., выше, Вокеп!йа1.е! а1. (1983), 8е1епее 222: 749-755, Неаппд е! а1. (1983), Се11 33: 695-703, \\еекк е! а1. (1983), Мо1. Се11 Вю1. 3: 1222-1234, кемпкоп е! а1. (1982), Уинге 295: 568-572 и кист е! а1. (1983), Се11 33: 705-716).
В ряде экспрессирующих систем для иммунизации нуклеиновыми кислотами и генной терапии используется предранний промотор цитомегаловируса человека (ЙСМУ). См., например, патенты США № 5168062 и 5385839, выданные Стински, и описание ЕР 0323997 В1. Экспрессирующие векторы, использующие 11СМУ. включают в себя, например, р\ВС7128 (Воу е! а1., Уассте 19: 764-778, 2001), а также рВС12/СМУ и рб\\4303, которые упоминаются в \О 95/20660. Сйартап е! а1. (1991) сообщают о сниженных уровнях экспрессии с 11СМУ предраннего промотора в отсутствие интрона А 11СМУ.
Краткое описание сущности изобретения
Конструкция нуклеиновой кислоты была разработана с использованием видоизмененных вирусных промоторов и экспрессирующихся последовательностей, которые обеспечивают повышенную экспрессию гетерологичных кодирующих последовательностей в клетках хозяина. Конструкция подходит для эффективной экспрессии генов, кодирующих антигены, и может, следовательно, быть использована в иммунизации нуклеиновыми кислотами. В частности, конструкция может быть доставлена на частицах носителя для применения в опосредованной частицами иммунизации нуклеиновыми кислотами.
Соответственно, в настоящем изобретении представлена конструкция нуклеиновой кислоты, включающая в себя последовательность химерного промотора и сайт для клонирования путем встраивания кодирующей последовательности в функциональной связи с химерным промотором, где последовательность химерного промотора содержит:
(a) последовательность предраннего промотора 11СМУ;
(b) экзон 1 и по меньшей мере часть экзона 2 основного предраннего гена 11СМУ;
(c) гетерологичный интрон, расположенный на месте участка интрона А в основном предраннем гене ЙСМУ.
В изобретении представлены также конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая:
- 1 010056 (ί) последовательность химерного промотора, которая содержит:
(a) последовательность предраннего промотора НСМУ.
(b) экзон 1 и по меньшей мере часть экзона 2 основного предраннего гена НСМУ.
(c) гетерологичный интрон. расположенный на месте участка интрона А в основном предраннем гене НСМУ;
(ίί) сайт для клонирования путем встраивания кодирующей последовательности в функциональной связи с химерным промотором:
(ΐϊϊ) последовательности:
(a) нетранслируемую лидерную последовательность. которая является производной от последовательности НВУ пре-82-антигена. последовательности НВУ е-антигена или антигена последовательности Н8У типа 2дИ и которая находится в функциональной связи с химерным промотором; и/или (b) последовательность энхансера. которая является производной от З'-нетранслируемой области (ИТВ) последовательности НВ 5Ад или З'-ИТВ последовательности предраннего гена СМУ обезьян и которая находится в функциональной связи с химерным промотором. где последовательность энхансера расположена ниже сайта для клонирования;
конструкция нуклеиновой кислоты. содержащая:
(ί) последовательность промотора;
(й) нетранслируемую лидерную последовательность. являющуюся производной от последовательности НВУ пре-82-антигена. последовательности НВУ е-антигена или последовательности Н8У типа 2дИ-антигена;
(ΐϊϊ) кодирующую последовательность. функционально связанную с (1) и (и).
где кодирующая последовательность гетерологична нетранслируемой лидерной последовательности; конструкция нуклеиновой кислоты. содержащая:
(ί) последовательность промотора;
(й) кодирующую последовательность. функционально связанную с последовательностью промотора (1);
(ΐϊϊ) последовательность энхансера с З'стороны от кодирующей последовательности. функционально с нею связанная (й).
где последовательность энхансера (ίίί) является производной от З'-ИТВ последовательности НВкАд или З'-ИТВ последовательности предраннего гена СМУ обезьян. и кодирующая последовательность (й) является гетерологичной З'-последовательности энхансера;
способ получения экспрессии в клетках млекопитающих представляющего интерес полипептида. который включает в себя перенос в указанные клетки конструкции нуклеиновой кислоты. представленной в изобретении. причем конструкция содержит последовательность. кодирующую полипептид;
покрытые частицы. пригодные для доставки из устройства для опосредованной частицами доставки. которые содержат частицы носителя. покрытые конструкцией нуклеиновой кислоты. представленной в изобретении. причем конструкция включает в себя последовательность. кодирующую полипептид;
дозирующая емкость для устройства для опосредованной частицами доставки. содержащая покрытые частицы;
устройство для опосредованной частицами доставки. заряженное покрытыми частицами;
способ иммунизации нуклеиновыми кислотами. включающий в себя прием субъектом эффективного количества покрытых частиц. в которых кодирующая последовательность кодирует антиген;
очищенную выделенную последовательность химерного промотора. которая содержит:
(a) последовательность предраннего промотора НСМУ;
(b) экзон 1 и по меньшей мере часть экзона 2 основного предраннего гена НСМУ;
(c) гетерологичный интрон. расположенный на месте участка интрона А в основном предраннем гене НСМУ.
Эти и другие цели. аспекты. варианты осуществления и преимущества согласно изобретению будут легко восприняты рядовыми специалистами в данной области на основании их раскрытия в данном описании.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 иллюстрирует уровни экспрессии поверхностного антигена вируса гепатита В (НВкАд). полученные с применением различных плазмидных экспрессирующих векторов;
на фиг. 2 показано влияние включения интрона на экспрессию НВкАд в клетках 8СС15 и бетагалактозидазы в клетках В16 (среднее по трем экспериментам);
на фиг. З показано влияние интрона А инсулина крысы и НВУ З'-ИТВ на экспрессию бетагалактозидазы в клетках 8СС15 (среднее по трем экспериментам);
на фиг. 4 показано влияние интрона А инсулина крысы и НВУ З'-ИТВ на экспрессию Н8УдЭ в клетках 8СС15 (среднее по трем экспериментам);
на фиг. 5 показано действие интрона А инсулина крысы и НВУ З'-ИТВ на экспрессию 8ЕАР в клетках 8СС15 и В16 (три повтора для каждой линии клеток);
на фиг. 6 показана способность гетерологичных сигнальных пептидов управлять секрецией 8ЕАР
- 2 010056 или йЕс-фрагмента в клетках В16;
на фиг. 7 показаны уровни антител, определяемые в сыворотках мышей, иммунизированных кодирующими антиген нуклеиновыми кислотами, содержащимися в разнообразных плазмидных экспрессирующих векторах;
на фиг. 8 представлен в виде диаграммы экспрессирующий вектор р1У;
на фиг. 9 представлен в виде диаграммы экспрессирующий вектор р1У7389;
на фиг. 10 представлен в виде диаграммы экспрессирующий вектор р1У7400;
на фиг. 11 представлен в виде диаграммы экспрессирующий вектор р1У7468;
на фиг. 12 представлен в виде диаграммы экспрессирующий вектор р1У7563;
на фиг. 13 представлен состав оснований р1У7563.
Краткое описание последовательностей
Последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 1 представляет собой последовательность предраннего промотора йСМУ (СепВапк #М60321, Х17403).
Последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 2 представляет собой последовательность экзонов 1 и 2 основного предраннего гена йСМУ (СепВапк #М60321, Х17403).
Последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 3 представляет собой последовательность интрона А инсулина крысы (СепВапк #100748).
Последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 4 представляет собой последовательность химерного промотора в соответствии с настоящим изобретением.
Последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 5 является лидерной последовательностью 5'-ЛТК. последовательности антигена пре-82 НВУ (СепВапк #М54923).
Последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 6 является лидерной последовательностью 5'-ИТК. последовательности дП-антигена Н8У типа 2 (СепВапк #Ζ86099).
Последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 7 представляет собой лидерную последовательность 5'-ИТК последовательности е-антигена НВУ (СепВапк #М54923).
Последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 8 является 3'-иТК последовательностью НВУепй (СепВапк #АЕ143308).
Последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 9 представляет собой 3'-ИТК последовательность предраннего гена обезьян (СепВапк #М16019).
Последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 10 представляет собой поли-А последовательность β-глобина кролика (СепВапк #К03256).
Последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 11 представляется собой поли-А последовательность §СМУ предраннего гена обезьян (СепВапк #М16019).
Последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 12 представляет собой поли-А последовательность гена дВ Н8У2 (СепВапк #Ζ86099).
Последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 13 представляет собой поли-А последовательность раннего гена НРУ16 (СепВапк #К02718).
Последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 14 является последовательностью вектора экспрессии р1У.
Последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 15 представляет собой ПЦР-праймер 1Е93.
Последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 16 представляет собой ПЦР-праймер Е110.
Последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 17 представляет собой ПЦР-праймер С\УЕ
Последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 18 представляет собой ПЦР-праймер 1Е254.
Последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 19 представляет собой ПЦР-праймер С\УЕ50.
Последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 20 представляет собой ПЦР-праймер 1Е255.
Последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 21 представляет собой ПЦР-праймер Ό81.
Последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 22 представляет собой ПЦР-праймер ΌΑ1.
Последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 23 представляет собой ПЦР-праймер 1Е301.
Последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 24 представляет собой ПЦР-праймер 1Е302.
Последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 25 представляет собой ПЦР-праймер 1Е84.
Последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 26 представляет собой ПЦР-праймер 1Е225.
Последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 27 представляет собой ПЦР-праймер 1Е335.
Последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 28 представляет собой ПЦР-праймер 1Е336.
Последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 29 представляет собой ПЦР-праймер 1Е357.
Последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 30 представляет собой ПЦР-праймер 1Е365.
Последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 31 представляет собой ПЦР-праймер 1Е393.
Последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 32 представляет собой ПЦР-праймер 1Е406.
Последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 33 представляет собой ПЦР-праймер 1Е256.
Последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 34 представляет собой ПЦР-праймер 1Е257.
Последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 35 представляет собой ПЦР-праймер 1Е320.
Последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 36 представляет собой ПЦР-праймер 1Е321.
Последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 37 представляет собой ПЦР-праймер 1Е386.
Последовательность 8ЕС ΙΌ N0: 38 представляет собой ПЦР-праймер ЕсА8.
- 3 010056
Последовательность 8ЕО ΙΌ N0: 39 представляет собой олигонуклеотид 1Е354.
Последовательность 8ЕО ΙΌ N0: 40 представляет собой ПЦР-праймер 1Е355.
Последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 41 представляет собой ПЦР-праймер 1Е356.
Последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 42 представляет собой олигонуклеотид 1Е348.
Последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 43 представляет собой ПЦР-праймер 1Е349.
Последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 44 представляет собой ПЦР-праймер 1Е350.
Последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 45 представляет собой олигонуклеотид 1Е351.
Последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 46 представляет собой ПЦР-праймер 1Е352. Последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 47 представляет собой ПЦР-праймер 1Е353. Последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 48 представляет собой ПЦР-праймер 1Е430. Последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 49 представляет собой ПЦР-праймер 1Е442. Последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 50 представляет собой ПЦР-праймер 1Е421. Последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 51 представляет собой ПЦР-праймер 1Е444.
Последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 52 представляет собой последовательность промотора вируса псевдобешенства (РВУ).
Последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 53 представляет собой последовательность промотора вируса саркомы Рауса (В8У).
Подробное описание
Прежде чем приступать к подробному описанию настоящего изобретения, следует уяснить, что это изобретение не ограничено конкретно приведенными в качестве примеров молекулами или параметрами способа, так как они могут, несомненно, меняться. Также следует понимать, что использованная здесь терминология служит только для описания отдельных вариантов осуществления изобретения и не носит ограничительного характера. К тому же, в практике согласно изобретению будут использоваться, если не указано иначе, традиционные методы вирусологии, микробиологии, молекулярной биологии, методы рекомбинации ДНК и иммунологии, которые всецело доступны рядовым специалистам в данной области. Такие методы подробно раскрыты в литературе. См., например, ЗатЬгоок, с1 а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬогаЮгу Мапиа1 (2пб ЕбШоп, 1989); ЭНА С1ошпд: А Ргасйса1 Арргоасй, νοί. Ι & ΙΙ (Ό. С1оуег, еб.); 01щогшс1еоббе Зуп111еЙ5 (К Сай, еб., 1984); А Ргасйса1 Сшбе Ю Мо1еси1аг С1ошпд (1984); апб Еипбатеп1а1 Уйо1оду, 2пб Ебйюп, νο1.1 & ΙΙ (В.К Е1е1б§ Ь Ό.Μ. Кшре, еб§).
Все публикации, патенты и заявки на патенты, указанные здесь, или выше, или ниже, полностью включены в данное описание в качестве ссылки в их полноте.
Нужно отметить, что в данном описании и в прилагаемой формуле изобретения форма единственного числа относится также и к множественному числу, за исключением тех случаев, когда содержание ясно указывает на обратное.
А. Определения.
За исключением специально оговоренных, все использованные здесь методические и научные термины имеют то же значение, которое является общепринятым среди рядовых специалистов в области, к которой относится изобретение. Хотя ряд способов и материалов, таких же - или эквивалентных - описанных здесь, может быть использован в практике настоящего изобретения, здесь описаны предпочтительные материалы и способы.
В описании согласно изобретению будут использованы следующие термины, которые должны быть определены, как показано ниже.
Термин «иммунизация нуклеиновой кислотой» применяется здесь по отношению к введению молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей одну или более выбранных антигенов, в клетку-хозяина для экспрессии антигена или антигенов ш νί\Ό. Молекула нуклеиновой кислоты может быть введена субъекту непосредственно, как при стандартной внутримышечной или внутрикожной инъекции; чрескожной доставке частицы; ингаляции; локально или при приеме внутрь, интраназально или через слизистую оболочку. Молекула альтернативно может быть введена ех νί\Ό в клетки, которые взяты у субъекта. В этом последнем случае клетки, содержащие представляющую интерес молекулу нуклеиновой кислоты, вводят обратно субъекту, так что может возникать иммунный ответ против антигена, кодируемого молекулой нуклеиновой кислоты. Молекулы нуклеиновой кислоты, используемые для такой иммунизации, как правило, упоминаются здесь как «вакцины нуклеиновой кислоты».
Термин «адъювант» означает материал или композицию, способные к специфическому или неспецифическому изменению, повышению, управлению, переадресации, потенцированию или инициированию специфического иммунного ответа на антиген. Таким образом, совместное введение адъюванта с антигеном может приводить к более низкой или меньшей дозе антигена, необходимого для достижения желаемого иммунного ответа у субъекта, которому введен антиген, или совместное введение может приводить к количественному и/или качественному изменению иммунного ответа субъекта. В частности, введение адъюванта может приводить к усилению иммунного ответа, например, увеличению его силы и продолжительности. Эффективность адъюванта может быть определена путем введения адъюванта вместе с вакцинной композицией параллельно с введением отдельно вакцинной композиции животным и сравнения антител и/или медиаторов клеточного иммунитета в двух группах, применяя стандартный
- 4 010056 анализ, например радиоиммунный анализ, ЕБ18А, СТЬ-анализ.
Под «базовым носителем» подразумевают носитель, на который нанесена чужеродная нуклеиновая кислота (например, ДНК, РНК), чтобы придать определенный размер частице, также как и достаточно высокую плотность, для достижения импульса, необходимого для проникновения через мембрану, так что чужеродная молекула может быть доставлена с использованием опосредованных частицами технологий (см., например, Ра1еп1 И8 № 5100792). Базовые носители обычно включают в себя такие материалы, как вольфрам, золото, платину, феррит полистирол и латекс. См., например, РагОс1е ВотЬагбтеп! Тес11по1оду Тот Сеие ТгапзГег (1994), Уапд, N. еб., ОхГогб Бшуегзбу Ргезз, Νο\ν Уотк, ΝΥ, р. 10-11.
Под «безыгольным шприцем» подразумевают инструмент, который доставляет композицию микрочастиц чрескожно без помощи традиционной иглы для прокалывания кожи. Безыгольный шприц для применения в настоящем изобретении рассмотрен в настоящем описании.
Термин «чрескожная» доставка означает внутрикожное (например, в дерму или эпидермис), чрескожное (например, «перкутанное») введение и введение через слизистую, т.е. доставку посредством переноса агента в кожу или через кожу или слизистую. См., например, Тгапзбегта1 Эгид ОеНуегу: Эеуе1ортеп!а1 1ззиез апб РезеагсЕ Гийгабуез, Набдгай апб Сиу (ебз.), Магсе1 Эеккег, 1пс., (1989); Соп1го11еб Эгид Эейуегу: Бцпбатеп1а1з апб АррНсабоп, РоЫпзоп апб Бее (ебз.), Магзе1 Эеккег 1пс., (1987) и Тгапзбегта1 ЭеНуегу оГ Эгидз, уо1. 1-3, Кубошеиз апб Вегпег (ебз.), СРС Ргезз, (1987). Таким образом, термин заключается в доставке из безыгольного шприца, как описано в патенте США № 5630796, также как и опосредованной частицами доставке, как описано в патенте США № 5865796.
Термин «полипептид» применяется в самом широком смысле в отношении вещества, содержащего две и более субъединицы аминокислот, аналогов аминокислот или других пептидомиметиков. Субъединицы могут быть связаны пептидной связью или другими типами связи, например эфирной, сложноэфирной и т.д.
В данном контексте термин «аминокислота» относится либо к натуральным и/или искусственным, либо к синтетическим аминокислотам, включая глицин и оба, Ό и Б, оптических изомера, аналоги аминокислот и пептидомиметики. Пептид из трех и более аминокислот обычно называется олигопептидом, если пептидная цепь коротка. Если пептидная цепь длинна, пептид, как правило, называется полипептидом или белком.
«Антиген» относится к любому агенту, обычно макромолекуле, которая может вызвать иммунный ответ у индивида. Термин может быть использован в отношении индивидуальных макромолекул или гомогенной или гетерогенной популяции антигенных макромолекул. В этом смысле «антиген», как правило, относится к белковой молекуле или ее части, которая содержит один или более эпитопов. Для целей согласно изобретению антигены могут быть получены или извлечены из любого подходящего источника. Кроме того, для целей, согласно изобретению, понятие «антиген» включает в себя белок, имеющий модификации, такие как делеции, вставки и замены (обычно консервативные по природе) в природной последовательности, при условии, что белок сохраняет достаточную иммуногенность. Эти модификации могут быть намеренными, например, через направленный точечный мутагенез, или могут быть случайными, такими как мутации у хозяев, которые производят антигены.
«Иммунный ответ» на представляющий интерес антиген - это выработка у индивида гуморального и/или клеточного иммунного ответа на антиген. Для целей настоящего изобретения «гуморальный иммунный ответ» относится к иммунному ответу, опосредованному молекулами антител, в то время как «клеточный иммунный ответ» - это ответ, опосредованный Т-лимфоцитами и/или другими клетками белой крови.
Термины «молекула нуклеиновой кислоты» и «полинуклеотид» используются здесь как взаимозаменяемые и относятся к полимерной форме нуклеотидов любой длины как дезоксирибонуклеотидов, так и рибонуклеотидов или их аналогов. Полинуклеотиды могут иметь любую трехмерную структуру и могут выполнять любую функцию, известную или неизвестную.
Неограничивающие примеры полинуклеотидов включают в себя ген, фрагмент гена, экзоны, интроны, матричную РНК (мРНК), транспортную РНК, рибосомную РНК, рибозимы, кДНК, рекомбинантные полинуклеотиды, разветвленные полинуклеотиды, плазмиды, векторы, изолированную ДНК любого происхождения, изолированную РНК любого происхождения, образцы нуклеиновых кислот и праймеры.
Полинуклеотид обычно состоит из специфической последовательности четырех нуклеотидных оснований: аденина (А), цитозина (С), гуанина (С) и тимина (Т) (урацил (И) заменяет тимин (Т), если полинуклеотидом является РНК). Таким образом, понятие последовательности нуклеиновой кислоты заключается в алфавитном изображении полинуклеотидной молекулы. Это алфавитное изображение можно ввести в базы данных компьютера, имеющего центральный процессор, и использовать для биоинформационных приложений, таких как функциональная геномика или поиск гомологии.
«Вектор» обладает способностью переносить последовательности нуклеиновых кислот в клеткимишени (например, вирусные векторы, невирусные векторы, частицы носителя и липосомы). Как правило, «векторная конструкция», «экспрессирующий вектор» и «вектор, переносящий ген» означают любую конструкцию нуклеиновой кислоты, способную направлять экспрессию представляющего интерес гена, которая может переносить последовательности гена в клетки-мишени. Таким образом, термин включает
- 5 010056 в себя средства клонирования и экспрессии, также как и вирусные векторы. «Плазмида» - это вектор в форме внехромосомного генетического элемента.
Последовательность нуклеиновой кислоты, которая «кодирует» отобранный антиген, представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая транскрибируется (в случае ДНК) или транслируется (в случае мРНК) в полипептид ίη νίνο, будучи помещена под контроль подходящих регуляторных последовательностей. Границы кодирующей последовательности определяются стартовым кодоном на 5'(амино)конце и стоп-кодоном на 3'(карбокси)-конце. Для целей изобретения такие последовательности нуклеиновых кислот могут включать в себя (но не ограничиваться ими) кДНК вирусной, прокариотической или эукариотической мРНК, геномные последовательности вирусной или прокариотической ДНК или РНК и даже синтетические последовательности ДНК. Последовательность терминации транскрипции может располагаться с 3'-конца от кодирующей последовательности.
«Промотор» - это нуклеотидная последовательность, которая инициирует и регулирует транскрипцию полинуклеотида, кодирующего полипептид. Промоторы могут включать в себя индуцируемые промоторы (в которых экспрессия полинуклеотидной последовательности, функционально связанной с промотором, индуцируется неким веществом, кофактором, регуляторным белком и т.д.), репрессируемые промоторы (в которых экспрессия полинуклеотидной последовательности, функционально связанной с промотором, репрессируется неким веществом, кофактором, регуляторным белком и т.д.) и конститутивные промоторы. Подразумевается, что термин «промотор» или «контролирующий элемент» включает в себя полноразмерные области промоторов и функциональные (например, контролирующие транскрипцию или трансляцию) сегменты этих областей.
«Функционально связанный» относится к организации элементов, при которой компоненты, описанные таким образом, скомпонованы так, чтобы выполнять свои обычные функции. Таким образом, данный промотор, функционально связанный с последовательностью нуклеиновой кислоты, способен оказывать влияние на экспрессию этой последовательности в присутствии надлежащих ферментов. Промотор не должен граничить с последовательностью при условии, что он управляет ее экспрессией. Таким образом, например, между последовательностью промотора и последовательностью нуклеиновой кислоты могут присутствовать промежуточные нетранслируемые, но транскрибируемые последовательности, при этом последовательность промотора может по-прежнему рассматриваться как «функционально связанная» с кодирующей последовательностью.
Термин «рекомбинантный» используется здесь для описания молекулы нуклеиновой кислоты (полинуклеотида) геномного, кДНК, полусинтетического или синтетического происхождения, которая, в силу своего происхождения или конструирования, не связана полностью или частично с полинуклеотидом, с которым она ассоциирована в природе, и/или связана с полинуклеотидом, отличающимся от того, с которым она связана в природе. Две последовательности нуклеиновых кислот, которые содержатся в одной молекуле рекомбинантной нуклеиновой кислоты, являются «гетерологичными» по отношению друг к другу, если они обычно не ассоциированы друг с другом в природе.
Здесь упоминаются гомологи полинуклеотидов. Как правило, полинуклеотид, который гомологичен другому полинуклеотиду, гомологичен этому полинуклеотиду по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80 или 90% и еще более предпочтительно по меньшей мере на 95, 97 или 99%. Способы измерения гомологии хорошо известны в данной области, и специалистам будет понятно, что в настоящем контексте гомология рассчитывается на основании идентичности нуклеиновых кислот. Такая гомология может покрывать участок по меньшей мере из 15, предпочтительно по меньшей мере из 30, например, по меньшей мере 40, 60 или 100 или более соседних нуклеотидов.
Способы измерения гомологии или идентичности полинуклеотидов известны в данной области. Например, пакет программ и\УССС предоставляет программу ΒΕ8ΤΓΙΤ, которая может быть использована для вычисления уровня гомологии (например, при использовании параметров программы, принятых по умолчанию) (Эеуегепх е! а1. (1984), Ыис1е1с Άοίάδ Кекеагсй 12, р. 387-395).
Алгоритмы Р1ЬЕиР и ВЬЛ§Т также могут быть использованы для определения уровня гомологии или поиска последовательностей (обычно на основе параметров, принятых по умолчанию), например, как описано у А11зсНи1 8.Е. (1993), 1. Μο1. Ενο1. 36: 290-300; АНзсНиГ 8.Е. е! а1. (1990), 1. Μο1. Βίο1. 215: 403-10.
Программное обеспечение для проведения ВЬЛ^Т-анализа является общедоступным в Национальном центре биотехнологической информации (1ιΙΙρ://\ν\ν\ν.ικΝ.η1ιη.ηί1ι.§ον/). Этот алгоритм сначала включает распознавание быстро вычисляемых пар последовательностей (Н8Р§) посредством идентификации коротких слов длиной в запрашиваемой последовательности, которые или точно совпадают, или удовлетворяют некоторому положительному пороговому уровню Τ, когда сравниваются со словами такой же длины в последовательностях базы данных. Τ рассматривается как порог вычисления близких слов (Л1151ш1 е! а1., указано выше). Эти исходные совпадения близких слов выполняют роль источников для первоначального поиска содержащих их Н8Р. От этих совпадающих слов поиск продолжается в обоих направлениях вдоль каждой последовательности, пока суммарный результат совпадения растет. Распространение участка совпадения в каждом направлении прекращается, если суммарный результат совпадения снижается до нуля и ниже, вследствие накопления одного или более несовпадающих остатков в
- 6 010056 выравнивании, или достигается конец последовательности. Параметры Ш, Т и X алгоритма ББА8Т определяют чувствительность и скорость сравнения. По умолчанию в программе ББА8Т используется длина слова (Ш) в 11 знаков, матрица обсчета БЬО8иМ62 (см. Нешко££ апй Неп1ко££ (1992), Ргос. Ναΐΐ. Асай. 8с1. и8А, 89: 10915-10919) для 50 выравниваний (В), с ожиданием (Е), равным 10, М=5, N=4, при этом сравниваются обе цепи.
Алгоритм ББА8Т позволяет проводить статистический анализ сходства между двумя последовательностями; см., например, Кагйп апй А118сйи1 (1993), Ргос. Νοίΐ, Асай. 8с1. И8А, 90: 5873-5877. Результат измерения сходства, выдаваемый алгоритмом ББА8Т, представляет собой наименьшую суммарную вероятность (Ρ(Ν)), которая указывает на вероятность, с которой будет происходить случайное совпадение двух нуклеотидных или аминокислотных последовательностей. Например, последовательность считается сходной с другой последовательностью, если наименьшая суммарная вероятность при сравнении первой последовательности и второй последовательности меньше чем примерно 1, желательно, если меньше чем примерно 0,1, еще более предпочтительно, если меньше чем примерно 0,01 и наиболее предпочтительно, если меньше чем примерно 0,001.
Гомологи обычно гибридизуются с подходящим полинуклеотидом на уровне, значительно превышающем фон. Уровень сигнала, получаемый при взаимодействии между гомологом и полинуклеотидом, обычно превышает «фоновую гибридизацию» по меньшей мере в 10 раз, лучше, если по меньшей мере в 100 раз. Интенсивность взаимодействия может быть измерена, например, путем введения в образец радиоактивных изотопов, например 32Р. Избирательная гибридизация обычно достигается путем применения жестких условий среды (например, 0,03 М хлорид натрия и 0,003 М цитрат натрия при температуре примерно от 50 примерно до 60°С).
Строгие условия гибридизации могут включать в себя 50% формамид, 5-кратный раствор Дэнхардта, 5-кратный раствор 88С, 0,1% 8Ό8 и 100 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося, а условия промывки могут включать в себя промывку 2-кратным раствором 88С, 0,1% 8Ό8, при 37°С, затем 1-кратным раствором 88С, 0,1% 8Ό8, при 68°С. Определение подходящих условий гибридизации находится в рамках данной области. См., например, ссылку 8ашЬгоок е! а1., указанную выше.
Гомолог может отличаться от последовательности рассматриваемого полинуклеотида по 3, 5, 10, 20 или более мутациям (каждая из которых может быть заменой, делецией или вставкой). Эти мутации могут покрывать участок по меньшей мере в 30, например, по меньшей мере в 40, 60 или 100 и более соседних нуклеотидов гомолога. Там, где полинуклеотид кодирует полипептид, замена предпочтительно приводит к «консервативным» изменениям в кодируемых аминокислотах. Они определяются в соответствии со следующей таблицей. Аминокислоты в одной и той же группе во втором столбце и предпочтительно в одной и той же строке в третьем столбце могут быть заменены друг на друга при консервативных изменениях.
Алифатические Неполярные САР
I Ь V
Полярные незаряженные С 3 Т М
Ν <2
Полярные заряженные 0 Е
К К
Ароматические НЕМУ
Термины «индивид» и «субъект» используются здесь как взаимозаменяемые по отношению к любому члену подтипа хордовых, включая, без ограничения, человека и других приматов (включая нечеловекообразных приматов, таких как шимпанзе и другие виды обезьян); сельскохозяйственных животных, таких как крупный рогатый скот, овцы, свиньи, козы и лошади; домашних млекопитающих, таких как собаки и кошки; лабораторных животных, включая грызунов, таких как мыши, крысы и морские свинки; птиц, включая домашних, диких и охотничье-промысловых птиц, таких как куры, индейки и другие птицы отряда куриных, утки, гуси и т.п. Эти термины не относятся к определенному возрасту. Таким образом, подразумевается, что будут включены и взрослые, и новорожденные индивиды. Описанные здесь способы предназначены для применения к любому из указанных выше видов позвоночных, так как иммунные системы у всех этих позвоночных функционируют одинаково.
В. Общий обзор.
Изобретение относится к конструкциям нуклеиновых кислот, которые обеспечивают эффективную экспрессию гетерологичных кодирующих последовательностей и, в частности, генов, кодирующих антигены, в клетках хозяина. Более конкретно, изобретение представляет конструкции нуклеиновых кислот, содержащие или в некоторых вариантах осуществления, по существу, состоящие из последовательности химерного промотора и сайта для клонирования, таким образом, что, когда кодирующая последовательность встроена в сайт для клонирования, кодирующая последовательность находится в функциональной
- 7 010056 связи с химерным промотором.
Химерный промотор содержит, или в некоторых вариантах осуществления, по существу, состоит из:
(a) последовательности предраннего промотора йСМУ;
(b) экзона 1 и по меньшей мере части экзона 2 основного предраннего гена 11СМУ;
(c) гетерологичного интрона, расположенного на месте участка интрона А в основном предраннем гене 11СМУ.
Последовательность (а) предраннего промотора йСМУ может содержать:
(ί) последовательность предраннего промотора нативного ЙСМУ;
(ίί) ее функциональный гомологичный вариант или (ίίί) функциональный фрагмент (ί) или (ίί).
В целом последовательность (а) содержит примерно от 100 до 600, предпочтительно от 200 до 600, например от 400 до 600 нуклеотидов. Обычно последовательность (а) содержит последовательности, представленные в (ί), которые связывают факторы транскрипции или РНК-полимеразу, или, вместо любой из этих последовательностей, гомологи этих последовательностей, способные связывать те же факторы транскрипции и РНК-полимеразу. Обычно такие последовательности или их гомологи представлены в последовательности (а) промотора в том же порядке и/или, по существу, с теми же интервалами, как в (ί).
Как правило, (ί) включает в себя нуклеотиды по меньшей мере от -100 до -1, обычно от -150 до -1, например, от -500 до -1 или от -600 до -1, относительно основного предраннего гена ЙСМУ. Последовательность (ί), как правило, содержит центральную последовательность промотора ЙСМУ и может также включать в себя один или более энхансерных элементов, присутствующих в предраннем промоторе 11СМУ. Например, (ί) может включать в себя нуклеотиды от -118 до -1 или от -524 до -1, как в И8 6218140, или нуклеотиды от -62 до -1 или от -465 до -1, как в И8 5385839.
Как правило, (ί) содержит ТАТА-бокс или СААТ-бокс, в большинстве случаев обнаруживаемые в промоторных последовательностях. Предпочтительно, чтобы последовательность включала в себя одну или более повторяющихся последовательностей предраннего промотора ЙСМУ.
В предпочтительном варианте осуществления (ί) содержит 8ЕО Ш N0: 1.
Последовательность предраннего промотора ЙСМУ может быть получена с применением известных способов. Предранний промотор нативного 11СМУ может быть выделен непосредственно из образца вируса с использованием стандартных методов. В И8 5385839, например, описано клонирование промоторного участка 11СМУ. Последовательность предраннего промотора 11СМУ имеется в ОепЬаик #М60321 (То\упс штамм 11СМУ) и #Х17403 (А6169 штамм ЙСМУ). Нативная последовательность могла поэтому быть выделена посредством ПЦР с применением праймеров для ПЦР, основанных на известной последовательности. См., например, ссылку 8ашЬгоок е1 а1, указанную выше, для описания методов, используемых для получения и очистки ДНК. Подходящая последовательность промотора 11СМУ может также быть изолирована из существующего плазмидного вектора. Последовательность промотора может быть получена также синтетическим путем.
Функциональный вариант (ίί) или фрагмент (ίίί), как правило, сохраняет или дополняет активность нативного промотора (ί). Обычно эта активность представляет собой способность вызывать (включая инициацию и регуляцию) транскрипцию функционально связанного полинуклеотида, в частности основного предраннего гена ЙСМУ. В одном варианте осуществления вариант или фрагмент способны дополнять активность нативного промотора в 11СМУ вирусе, давая вирусу возможность, например, сохранять способность к инфекции и/или репликации в клетках.
Гомологичный вариант (ίί) или фрагмент (ίίί) могут быть оценены по способности сохранять и/или дополнять активность (ί). Например, гомологичный вариант (ίί) или фрагмент (ίίί) могут быть оценены по способности восстанавливать функциональность (такую как способность к инфекции и/или репликации) у мутанта 11СМУ. дефектного по нативному предраннему промотору ЙСМУ.
Гомологичный вариант (ίί) или фрагмент (ίίί) могут быть тестированы на возможность использования с помощью сравнительного анализа экспрессии, описанного ниже. Тестируемая промоторная последовательность заменяет в исходном векторе нативный предранний промотор 11СМУ. Обычно функциональный вариант и/или фрагмент обеспечивает по меньшей мере 50%, например, 60, 70, 80, 90% и более от уровня экспрессии, обеспечиваемого использованием исходного вектора. Обычно экспрессия обеспечивается по меньшей мере в одном, но предпочтительно в двух типах клеток, используемых для оценки. Обычно для оценки используются клетки млекопитающих НЕК 293Т, СНО, НеЬа, ВНК, 3Т3 или С08.
Дополнительно или в качестве альтернативы последовательность промотора может быть протестирована с помощью сравнительного анализа иммуногенности, описанного ниже. Тестируемая промоторная последовательность заменяет в исходном векторе нативный предранний промотор 11СМУ. Функциональная промоторная последовательность обеспечивает титр антител, по меньшей мере, такой же или выше, чем исходный вектор, по меньшей мере для одного, а лучше, если для двух антигенов. Предпочтительно титр антител по меньшей мере на 5, 10, 20, 30 или 40% выше, чем с исходным вектором. Предпочтительными антигенами являются НВкАд, Н8У2дО и Дц-М2 антигены. В соответствии с этим тестом функциональным гомологичным вариантом (ίί) и/или функциональным фрагментом (ίίί) нативной про
- 8 010056 моторной последовательности является такой, который обеспечивает высший титр антител, достигаемый с использованием нативной последовательности.
Как указывалось выше, конструкция может содержать последовательность экзона (Ь), которая включает в себя последовательности, производные от экзона 1 и экзона 2 основного предраннего гена ЙСМУ. Экзоны - это кодирующие последовательности, которые в природе, как правило, разделяются интронами. В нативном основном предраннем гене 11СМУ экзоны 1 и 2 обычно разделены нативным интроном А. В настоящей химерной конструкции последовательность экзона 2 целиком поставлена в 3' положение относительно последовательности экзона 1, без промежуточной последовательности интрона, так что последовательности экзона 1 и экзона 2 граничат.
Последовательность экзона (Ь) может содержать:
(ί) нативную последовательность экзона, в типичном случае, экзона 1 и (целиком или частично) экзона 2;
(ίί) гомологичный вариант (1), который функционален; или (ίίί) функциональный фрагмент (1) или (ΐϊ).
Последовательность (1) может содержать от 50 до 100% нативной последовательности экзона 1 основного предраннего гена 11СМУ. например от 60 до 90% или от 70 до 80%. В типичном случае присутствует по меньшей мере 50% нативного экзона 1, например 60, 70, 80, 90% или более. Последовательность экзона (Ь) может также содержать по меньшей мере часть последовательности экзона 2. В последовательности (1) присутствуют обычно 2 или более оснований нативного экзона 2, например присутствуют основания 2-9, или 2-7, или 3-5. До 100% включительно природной последовательности экзона 2, например, может присутствовать от 5 до 95%, от 20 до 80% или от 40 до 60% природной последовательности экзона 2. Гомологичный вариант имеет обычно любую из указанных для нативной последовательности протяженность.
Предпочтительно (1) содержит последовательность δΕβ ΙΌ N0: 2.
Подходящая последовательность экзона (Ь) может быть получена с использованием известных методов. См., например, ссылку 8атЬгоок с1 а1., указанную выше, для описания методов, используемых для получения и очистки ДНК. Нативную последовательность основного предраннего гена 11СМУ можно изолировать прямо из образца вирусов, используя стандартные методы (см., например, МасЕеап, А. (1998), Ргерагайоп оГ Ηδν-ΌΝΑ апб Ргобисйоп оГ 1пГес1юи5 Уйщ ίη Негрек 81тр1ех У1ги§ РгоЮсоН δ. Вго^п, А. МасЬеап, ебйогк, Нитапа Ргекк, ТоФта, N1, р. 19-26). Последовательность основного предраннего гена ЙСМУ, включая положение экзонов 1 и 2, доступна в СепЬапк #М60321, Х17403. Нативные последовательности экзонов 1 и 2 поэтому могут быть получены посредством вырезания из нативной последовательности основного гена по подходящим сайтам рестрикции или с помощью ПЦР, используя ПЦР-праймеры на основе известной последовательности. Как альтернатива, подходящие последовательности экзонов могут быть изолированы из существующего плазмидного вектора, такого как р\УРС7128. Последовательности экзонов могут также быть синтезированы, скорее, чем клонированы. Вариантные последовательности легко могут быть сконструированы рутинными методами, такими как направленный точечный мутагенез.
В целом, последовательность экзона, присутствуя в конструкции по изобретению, увеличит уровень экспрессии, обычно вызывая сравнимое увеличение нативной последовательности экзона 1 и экзона 2, указанной выше.
Последовательность экзона может быть проверена на функциональность с помощью сравнительного теста экспрессии, описанного ниже. Тестируемая последовательность экзона вставляется в исходный вектор на место уже имеющейся последовательности экзона. Как правило, последовательность экзона функциональна, если она не прекращает экспрессии, но предпочтительно увеличивает экспрессию по меньшей мере в одном, но желательно в двух типах клеток, используемых для оценки, по сравнению с исходным вектором. Как правило, оценка производится в клетках млекопитающих НЕК 293Т, СНО, НеЬа, ВНК, 3Т3 или СОδ. Экспрессия предпочтительно увеличивается по меньшей мере на 5, 10, 20, 30 или 40%. В соответствии с этим тестом функциональным гомологичным вариантом (н) или функциональным фрагментом (ίίί) нативной последовательности экзона (ί) является такой, который обеспечивает усиление экспрессии, составляющее по меньшей мере 50% от уровня, обеспечиваемого природной последовательностью.
Дополнительно или как альтернатива последовательность экзона может быть протестирована сравнительным анализом иммуногенности, описанным ниже. Тестируемая последовательность экзона помещается в исходный вектор на место уже существующей последовательности экзона. Функциональная последовательность экзона обеспечивает титр антител, по меньшей мере, такой же или выше, чем исходный вектор, по меньшей мере для одного, а лучше, если для двух антигенов. Предпочтительно титр антител по меньшей мере на 5, 10, 20, 30 или 40% выше, чем с исходным вектором. Предпочтительными антигенами являются антигены НВкАд, ΗδУ2д^ и Г1и-М2. В соответствии с этим тестом функциональным гомологичным вариантом (ίί) и/или функциональным фрагментом (ίίί) нативной последовательности экзона является такой, который обеспечивает наивысший титр антител, достигаемый с использованием природной последовательности.
- 9 010056
Конструкция химерного промотора содержит гетерологичный интрон (с) на месте нативного участка интрона А основного предраннего гена ЙСМУ. Интрон - это некодирующая последовательность, которая вырезается из пре-мРНК, транскрибированной с гена. Гетерологичным интроном является такой, который не присутствует в кодирующей последовательности в природе.
Гетерологичный интрон (с) заменяет полностью или частично нативный интрон А основного предраннего гена 11СМУ. Природный интрон, как правило, отсутствует.
Обычно гетерологичный интрон (с) помещается в положение 3' относительно последовательности экзона (Ь).
Как правило, гетерологичный интрон (с) содержит:
(ί) природный интрон;
(ίί) функциональный гомологичный вариант (1) или (ίίί) функциональный фрагмент (ί) или (ίί).
Гетерологичный интрон (с) является обычно вирусным или эукариотическим интроном. Предпочтительно, чтобы он был интроном млекопитающих, в частности не человека, а, например, крысы или цыпленка. Предпочтительно интрон является интроном А, например интроном А инсулина крысы, интроном А кератина кур или сердечного актина кур.
Как правило, интрон (с) имеет длину примерно от 50 до примерно 1000 нуклеотидов, например, примерно от 100 до примерно 500 нуклеотидов. Интрон (с) может, для примера, содержать от 50 до 500 нуклеотидов, т.е. до 100, 200, 300 или 400 нуклеотидов. Предпочтительно интрон содержит последовательность, найденную в положении примерно 50-133 нуклеотидов нативного интрона А инсулина крысы, или гомолог этой последовательности.
Предпочтительно гетерологичный интрон (с) способен вырезаться из транскрипта РНК в эукариотической клетке хозяина. Как правило, интрон содержит одну или более донорных последовательностей (таких как ОТ), акцепторную последовательность (такую как АО), 3'-район, богатый пиримидинами и последовательностями, определяющими разветвление. Обычно в химерной конструкции интрон (с) содержит неинтронные фланкирующие последовательности, производные последовательностей экзонов, обнаруженные на границах интрон/экзон в природном интроне (ί). Фланкирующая последовательность экзона может быть нативной последовательностью экзона или гомологом этой последовательности, который в значительной степени сохраняет функцию сплайсинга. Обычно от 5 до 10, предпочтительно от 7 до 10 оснований последовательности экзона включаются по каждому концу интрона.
Интрон (с) может быть искусственным при условии, что интрон функционален. Например, можно использовать рекомбинантный или химерный интрон. Такой интрон может содержать последовательности более чем из одного природного интрона.
В типичном случае интрон (с) содержит последовательности, присутствующие в интроне А 11СМУ. который связывает факторы транскрипции или регуляторные белки, или вместо этих последовательностей гомологи этих последовательностей, способные связывать те же факторы или белки. Как правило, такие последовательности или их гомологи присутствуют в интроне (с) в том же порядке и/или, по существу, с теми же относительными интервалами, что и в интроне А 11СМУ.
Интрон (с) может содержать гомологичный вариант (ίί), в котором последовательность природного интрона (ί) была модифицирована с удалением внутреннего сайта рестрикции. Например, можно использовать гомологичный вариант интрона А инсулина крысы, в котором был разрушен внутренний сайт ΝΒβΙ.
Желательно, чтобы интрон (с) содержал:
(ί) последовательность 8ЕО ΙΌ N0: 3;
(ίί) функциональный гомологичный вариант (ί) или (ίίί) функциональный фрагмент (ί) или (ίί).
Последовательность интрона можно получить с использованием стандартных методов клонирования. Например, последовательность интрона А инсулина крысы доступна в ОепЬапк ТО0748, последовательность интрона А кератина кур - в ОепЬапк ТО0847 и последовательность интрона А сердечного актина кур - в ОепЬапк Х02212. Последовательность интрона можно изолировать из природных источников с использованием праймеров, основанных на известных последовательностях. Последовательность можно приготовить синтетически. Вариантная последовательность может быть получена мутагенезом.
Обычно функциональной последовательностью интрона, например функциональным вариантом (ίί) или функциональным фрагментом (ίίί), является такая, которая обладает, по существу, такой же активностью и/или дополняет активность природного интрона (ί). В определенном варианте осуществления эта активность является активностью в сплайсинге.
Последовательность интрона (с) может быть проверена на активность в сплайсинге с помощью рутинного теста на сплайсинг. Вообще, функциональный гомолог (ίί) или функциональный фрагмент (ίίί) будет проявлять при анализе по меньшей мере 50%, например, 60, 70, 80, 90 и больше 100% или более от эффективности сплайсинга природного интрона (ί).
В целом, гетерологичная последовательность интрона будет, присутствуя в конструкции согласно изобретению, усиливать экспрессию. Как правило, вариант (ίί) или фрагмент (ίίί) интрона будет вызы
- 10 010056 вать усиление, сравнимое с таковым природного интрона (1).
Функциональные возможности потенциальной последовательности интрона (с) могут быть проверены с применением далее сравнительного анализа экспрессии.
Гетерологичный интрон вставляется в исходный вектор. Обычно последовательность гетерологичного интрона является функциональной, если добавление последовательности повышает экспрессию по меньшей мере в одном, но предпочтительно в двух типах клеток, применяемых для оценки, на 25% или больше по сравнению с основным вектором. Обычно клетки образца являются клетками млекопитающих НЕК293Т, СНО, НеЬа, ВНК, 3Т3 или СО8. Повышение экспрессии может быть по меньшей мере на 35, 45, 55% или более. В соответствии с этим анализом функциональный вариант (1) или функциональный фрагмент (ίί) последовательности природного интрона (1) делает возможным повышение более чем на 50% экспрессии, достигаемой природной последовательностью.
Функциональные возможности последовательности гетерологичного интрона (с) могут, дополнительно или альтернативно, быть проверены далее с применением сравнительного анализа иммуногенности. Последовательность интрона (с) добавляется к основному вектору. Функциональная последовательность интрона (с) обеспечивает титры антител, которые выше, чем титры антител, полученные при использовании основного вектора по меньшей мере с одним, предпочтительно двумя антигенами. Предпочтительно, чтобы титры антител были выше по меньшей мере на 5 или 10%, например, на 20, 30 или 40%, чем при использовании основного вектора. Предпочтительными антигенами являются антигены НВкЛд, Н8У2дЭ или Г1и-М2. В соответствии с этим исследованием функциональный вариант (ίί) или функциональный фрагмент (ш) последовательности природного интрона (ί) дает самые высокие титры антител, достигаемые природной последовательностью.
Подходящая последовательность гетерологичного интрона может быть получена с применением стандартных методов клонирования. Например, последовательность интрона А инсулина крыс, имеющаяся в ОепВапк 100748, интрона А кератина кур в ОепВапк 100847 и интрона А сердечного актина кур Х02212. Последовательность интрона может быть выделена из нативного источника с применением праймеров, основанных на известной информации о последовательности. Подходящая последовательность может быть также получена путем синтеза.
Связывание вместе соответствующим образом составляющих последовательностей (а), (Ь) и (с) для того, чтобы формировать химерный промотор, может быть обеспечено применением стандартного клонирования или методов молекулярной биологии. Предпочтительно последовательность интрона (с) стоит к 3' от последовательности экзона (Ь). Конструкция химерного промотора связана с сайтом для клонирования таким образом, что промотор может влиять на экспрессию кодирующей последовательности, встроенной в сайт, при наличии специфических ферментов. Подходящие сайты для клонирования, включая множественные сайты клонирования, известны в данной области, например множественные сайты клонирования рИС19, рВС 8К, рВ1иексг1р( II К8, 0ΌΝΑ3.1, р8Р72, рОЕМ 7Ζ.
Как правило, нуклеиновые кислоты для встраивания (или встроенные) в сайт для клонирования кодируют терапевтически значимые полипептиды. Предпочтительно, чтобы кодирующая последовательность подходила для применения в иммунизации нуклеиновыми кислотами или генной терапии. Вставка нуклеиновой кислоты может, таким образом, содержать последовательность, способную к обеспечению иммунитета, например иммуногенная последовательность, которая вызывает гуморальный и/или клеточный иммунный ответ при введении субъекту. Как альтернатива, нуклеиновая кислота может содержать один или более генов, кодирующих терапевтический полипептид, например белок, дефектный или отсутствующий в геноме клетки-мишени, или ненативный белок, имеющий желаемый биологический или терапевтический эффект (например, антивирусную функцию). Известно, что для лечения генетических нарушений функциональные гены, соответствующие дефицитным генам при данном нарушении, могут быть введены субъекту. Предпочтительно, чтобы нуклеиновая кислота являлась ДНК.
Подходящие для вставки нуклеиновые кислоты включают нуклеиновые кислоты, применяемые для лечения воспалительных заболеваний, аутоиммунных, хронических и инфекционных заболеваний, включая такие нарушения, как СПИД, рак, неврологические заболевания, сердечно-сосудистые заболевания, гиперхолестеринемию; различную патологию крови, включая различные анемии, талассемию и гемофилию; генетические дефекты, такие как кистозный фиброз, болезнь Гошера, дефицит аденозиндиаминазы (ΑΌΑ), эмфизема и т.д.
Например, в способах лечения солидных опухолей гены, кодирующие токсичные пептиды (например, химиотерапевтические агенты, такие как рицин, дифтерийный токсин и действующий агент яда кобры), гены, подавляющие опухоль, такие как р53, гены, кодирующие последовательности мРНК, которые являются антисмысловыми по отношению к трансформирующим онкогенам, противоопухолевые пептиды, такие как фактор некроза опухолей (ФНО) и другие цитокины, или трансдоминантные негативные мутанты трансформирующих онкогенов, могут быть встроены для экспрессии в или рядом с сайтом опухоли.
Подобным образом, нуклеиновые кислоты, кодирующие полипетиды, проявляющие противовирусную и/или антибактериальную активность, или стимулирующие иммунную систему хозяина, могут также быть включены. Нуклеиновая кислота может кодировать один из различных цитокинов (или их функ
- 11 010056 циональных фрагментов), таких как интерлейкины, интерфероны и колониестимулирующие факторы. Нуклеиновая кислота может кодировать антиген для лечения или предотвращения ряда состояний, включающих, но не ограниченных, рак, аллергии, интоксикации и инфекции, вызываемых патогеном, таким как, но не ограниченным, грибы, вирус, включая вирус папилломы человека (ΗΡν), Ηΐν, Н8У2/Н8У1, вирус гриппа (тип А, В и С), вирус полиомиелита, Βδν вирус, риновирусы, ротавирусы, вирус гепатита А, группу вирусов ΝοπναΙΚ. энтеровирусы, астровирусы, вирус кори, вирус парагриппа, вирус свинки, вирус герпеса Зостер, цитомегаловирус, вирус Эпштейна-Барр, аденовирусы, вирус краснухи, вирус Т-клеточной лимфомы человека I типа (ΗΊΈν-Ι), вирус гепатита В (ΗΒν), вирус гепатита С (НСУ), вирус гепатита Ό, поксвирус, Марбург и Эбола; бактерии, включая М.1иЬегси1ок1к, СЫатуФа, Ν.^οπογγΗοοπο, 8Ыде11а, 8а1шоие11а, УФло Сйо1ега, Тгеропета раШйиа, Ркеийотопак, Вогйе1е11а рейикак, Вгисе11а, Ргапс1ксе11а 1и1огепк1к, НейсоЬас1ег ру1оп, Ьер1окрпа 1п1еггодаик, БещопеПа рпиторййа, Уегыша рекйк, 81гер1ососсик (типы А и В), Рпеитососсик, Мептдососсик, НеторЫ1ик тПиепха (тип Ь), Тохор1акта допй1с, Сотр1уЬас1епок1к, Могахе11а са1аггйа11к, Эопоуапок1к и Асйпотусокт; патогенные грибы, включая кандидоз и аспериллез; паразитарные патогены, включая ленточных червей, сосальщиков, круглых червей, амебиаз, лямблиоз, криптоспоридий, шистосом, пневмоцист, трихомониаз и трихинеллеза. Нуклеиновая кислота может также применяться для обеспечения подходящего иммунного ответа против многочисленных ветеринарных заболеваний, таких как ящур, коронавирус, Рак1еиге11а тийоайа, Не1юоЬас1ег, 81гопди1ук уц1дапк, АсйпоЬасШик р1еигорпеитоша, вирус вирусной диареи крупного рогатого скота ^νον), К1еЬк1е1а рпеитошае, Е.сой, Вогйе1е11а репикык, Вогйе1е11а рагарейикык и Вогйе1е11а ЬгопсЫкерйса. Таким образом, в одном аспекте конструкции нуклеиновых кислот согласно изобретению могут находить применение в качестве вакцины.
В некоторых вариантах осуществления конструкция нуклеиновых кислот будет кодировать адъювант. Так, последовательности, встроенные в сайт для клонирования для встраивания кодирующей последовательности, могут кодировать полипептид, способный действовать как адъювант. В предпочтительном примере кодируемый адъювант может представлять собой АЭР-рибозилирующий бактериальный токсин. Он включает в себя дифтерийный токсин (ОТ), коклюшный токсин (РТ), холерный токсин (СТ), тепловой лабильный токсин Е.сой (ЬТ1 и ЬТ2), эндотоксин А Ркеийотопак, эндотоксин 8.Ркеийстопак, экзоэнзим В.сегеик, токсин В.крйаепсик, токсины С2 и С3 С.Ьо1ийшт, экзоэнзим С.йтокит, так же как и токсины С.регТг1пдепк, С.кртГогта и С.йгГйсйе и 81арНу1ососспк аигеик ΕΌΙΝ. Наиболее АЭР-рибозилирующие бактериальные токсины содержат А и В субъединицы. Конструкция может экспрессировать субъединицу А, субъединицу В и/или обе субъединицы.
В предпочтительном примере конструкция нуклеиновых кислот может кодировать теплолабильный токсин Е.сой и/или холерный токсин и, в частности, может экспрессировать теплолабильный токсин Е.сой. Информация ОеиВаик для полных последовательностей СТ субъединиц А и В генов может быть найдена в локусе У1ВСТХАВВ (Ассеккюп № Ό30053), в то время как информация СепВапк для полных последовательностей ЬТ субъединиц А и В генов может быть найдена в локусе АВ0116677 (Ассеккюп № АВ011677).
Конструкция может экспрессировать активные варианты или фрагмент специфического адъюванта. Вариант или фрагмент может считаться активным, если он сохраняет, по меньшей мере, небольшое количество адъювантной активности полипептида, из которого он получен. Таким образом, вариант и/или фрагмент будут по-прежнему способны усиливать иммунный ответ на специфический антиген в сравнении с иммунным ответом, наблюдаемым, когда с антигеном не вводится адъювант. Кодируемая последовательность может быть активными фрагментами или вариантами субъединиц СТ А и/или В и, в частности, может быть активными фрагментами субъединиц ЬТ А и/или В.
Из субъединицы токсина может быть делетирована ее естественно встречающаяся сигнальная последовательность. Естественно встречающаяся субъединица экзотоксина может быть модифицирована с целью детоксикации токсина. Субъединица А может быть модифицирована для того, чтобы разрушить или инактивировать АОР-рибозилтрансферазную активность.
Таким образом, конструкции адъюванта согласно изобретению могут быть использованы для усиления иммунного ответа на отдельный антиген. Усиленный иммунный ответ может включать иммунный ответ большей величины или длительности. Это может означать, что, когда антиген повторно встречается с иммунным ответом, он бывает сильнее, чем если бы адъювант не применялся. Усиление иммунного ответа может выражаться в росте титра антител. В случае некоторых конструкций, и особенно тех, которые экспрессируют субъединицы экзотоксина, адъювант может вызывать увеличенный клеточный ответ и иммунный ответ, подобный ответу Т-хелпера 1, против изучаемого антигена.
Нуклеиновая кислота, которая должна быть вставлена в сайт для клонирования, может содержать последовательность полиаденилирования (поли-А). Такая поли-А последовательность обычно естественно присутствует в кодирующей последовательности. Как альтернатива, конструкция нуклеиновой кислоты согласно изобретению может быть снабжена гетерологичной поли-А последовательностью. В типичном случае поли-А последовательность встраивается после сайта для клонирования, так что она функционально связана с кодирующей последовательностью, помещенной в сайт для клонирования. Любая подходящая поли-А последовательность может быть включена в конструкцию с помощью стандартных
- 12 010056 методов клонирования. Такие поли-А последовательности известны в данной области.
Поли-А последовательность может являться:
(ί) природной поли-А последовательностью;
(ίί) функциональным гомологичным вариантом (1);
(ίίί) функциональным фрагментом (1) или (И).
Природная поли-А последовательность (1) может быть, к примеру, поли-А последовательности гена β-глобина кролика, ранних или поздних генов вируса папилломы человека (НРУ), гена Н8У-2§В, предраннего гена СМУ обезьяны или позднего гена Н8У §0.
Предпочтительно природная поли-А последовательность выбирается из группы, состоящей из 8ЕО ГО N0: 10 (СепВапк К03256), 8ЕО ГО N0: 11 (СепВапк М16019), 8ЕО ГО N0: 12 (СепВапк Ζ80699) и 8ЕО ГО N0: 13 (СепВапк К02718).
Как правило, функциональной является поли-А последовательность, которая сохраняет активность полиаденилирования.
Поли-А последовательность может быть протестирована с помощью рутинного экспрессионного теста на способность осуществлять полиаденилирование транскрипта РНК. Функциональный гомологичный вариант (и) или функциональный фрагмент (ίίί) в таком тесте обычно проявляет по меньшей мере 50%, например, 60, 70, 80% или более поли-А активности природной поли-А последовательности.
Будучи вставлена в конструкцию данного изобретения, поли-А последовательность обычно увеличивает экспрессию до уровня, сравнимого с тем, что дает природная поли-А последовательность (ί), указанная выше.
Поли-А последовательность может быть также проверена на функциональность с помощью сравнительного анализа экспрессии, описанного ниже. Поли-А последовательность помещается в исходный вектор на место КВСрА. Тестируемая поли-А последовательность считается функциональной, если она не прекращает экспрессию, но предпочтительно усиливает экспрессию в одном, но предпочтительно в двух типах клеток, используемых для оценки, по сравнению с исходным вектором. Предпочтительно, когда наблюдается увеличение экспрессии по меньшей мере на 5, 10, 20, 30, 40 или 50% или более. Предпочтение отдается клеткам млекопитающих НЕК 293Т, СН0, НеЬа, ВНК, 3Т3 или С08. В соответствии с тестом гомологичный вариант (ίί) или фрагмент (ίίί) является функциональными, если обеспечивает более 50% улучшение экспрессии от уровня, который дает природная поли-А последовательность (ί).
В качестве альтернативы или дополнительно, поли-А последовательность может быть проверена на активность с помощью сравнительного теста иммуногенности, описанного ниже. Поли-А последовательность вставляют в исходный вектор на место КВСрА. Функциональной считается поли-А последовательность, которая обеспечивает титр антител, по меньшей мере, такой же или превышающий титр, который дает исходный вектор по меньшей мере для одного, предпочтительно двух антигенов. Предпочтительно, если титры антител превышают по меньшей мере на 5, 10, например, 20, 30 или 40% титры, достигаемые с применением исходного вектора. Предпочтение отдается антигенам НВкАд, Н8У2§0 и Е1ц-М2 антигенам. Гомологичный вариант (ίί) или фрагмент (ίίί) являются функциональными, если обеспечивают максимально высокие титры антител, достигаемые с природной поли-А последовательностью (ί).
Конструкция нуклеиновой кислоты может содержать дополнительные контролирующие последовательности, которые влияют на экспрессию кодирующей последовательности, вставленной в сайт для клонирования. Конструкция может включать в себя нетранслируемую лидерную последовательность. Последовательность обеспечивается в конструкции функциональной связью с химерным промотором, а поэтому и с кодирующей последовательностью, вставленной в сайт для клонирования. Лидер обеспечивает сайт начала трансляции для экспрессии встроенной кодирующей последовательности и, как правило, содержит элемент Козака.
В типичном виде нетранслируемая лидерная последовательность представлена:
(ί) естественной нетранслируемой лидерной последовательностью;
(ίί) функциональным гомологичным вариантом (ί) или (ίίί) функциональным фрагментом (ί) или (ίί).
Обычно природная последовательность (ί) - это эукариотическая или вирусная последовательность, в частности, вируса, который инфицирует эукариот. Предпочтительно природной последовательностью (ί) является последовательность НВУ или Н8У, например последовательность пре-82-антигена НВУ, последовательность е-антигена НВУ или последовательность типа 2дБ-антигена Н8У. Наиболее предпочтительно, если (ί) выбирается из группы, состоящей из 8Е0 ГО N0: 5, 8Е0 ГО N0: 6 и 8Е0 ГО N0: 7.
Как правило, лидерная последовательность содержит последовательности, присутствующие в (ί), которые связывают компоненты транскрипции или регуляторные белки, или гомологи этих последовательностей, которые способны связывать те же компоненты или белки. В типичном случае такие последовательности или их гомологи присутствуют в лидерной последовательности в таком же порядке и/или относительном пространственном расположении, как и в (ί). Обычно лидерная последовательность содержит сайт начала трансляции для экспрессии встроенной кодирующей последовательности. Типичная лидерная последовательность включает в себя элемент Козака.
- 13 010056
Нетранслируемая лидерная последовательность имеет, как правило, длину примерно от 10 до примерно 200 нуклеотидов, например, примерно от 15 до 150 нуклеотидов, предпочтительно от 15 до примерно 130 нуклеотидов. Можно использовать лидерные последовательности, содержащие, например, 15, 50, 75 или 100 нуклеотидов.
Функциональной нетранслируемой лидерной последовательностью является обычно такая, которая способна обеспечить сайт начала трансляции для экспрессии кодирующей последовательности в функциональной связи с лидерной последовательностью. В типичном случае функциональный вариант (ίί) или фрагмент (ίίί) имеют такую же активность и/или дополняют активность природной последовательности (ί) обычно путем облегчения или ускорения экспрессии кодирующей последовательности в функциональной связи с этой последовательностью.
Вариант (ίί) или фрагмент (ίίί) могут быть проверены на активность как нетранслируемые лидерные последовательности в сравнении с природной лидерной последовательностью с помощью стандартных протоколов. Например, можно приготовить экспрессирующие векторы, содержащие естественную лидерную последовательность (ί), функционально связанную со своей нативной кодирующей последовательностью, и наблюдать экспрессию в подходящих клетках-хозяевах, например клетках млекопитающих НЕК293Т, СНО, НеЬа, ВНК, 3Т3 или СО8. Можно приготовить также тестовые конструкции, в которых природная лидерная последовательность заменена гомологичным вариантом или фрагментом, и наблюдать экспрессию в клетках-хозяевах тех же типов. Как правило, вариант (ίί) или фрагмент (ίίί) обеспечивают экспрессию по меньшей мере 50%, такую как 60, 70, 80, 90 и 100% или более уровня экспрессии, обеспечиваемого природной последовательностью.
Потенциальная лидерная последовательность может быть проверена также на возможность применения с помощью сравнительного экспрессионного анализа, описанного ниже. Изучаемая лидерная последовательность вставляется в исходный вектор вместо 5'-ИТК пре-82 вируса НВУ. Функциональная лидерная последовательность не прекращает экспрессии, но, предпочтительно, увеличивает уровень экспрессии по меньшей мере в одном, а лучше в двух типах клеток, используемых для оценки, в сравнении с исходным вектором. Обычно экспрессия увеличивается по меньшей мере на 5, 10, 20, 30, 40 или 50. Типами клеток млекопитающих, которым отдается предпочтение, являются НЕК 293Т, СНО, НеЬа, ВНК, 3Т3 или СО8. В соответствии с тестом гомологичный вариант (ίί) или фрагмент (ίίί) являются функциональными, если способствуют более чем 50% увеличению уровня экспрессии по сравнению с достигаемым с природной лидерной последовательностью.
Дополнительно или как альтернатива, лидерная последовательность может быть протестирована с помощью сравнительного анализа иммуногенности, описанного ниже.
Лидерная последовательность вставляется в исходный вектор вместо 5'-ИТК пре-82 вируса НВУ. Функциональная лидерная последовательность обеспечивает титр антител, который, по меньшей мере, также высок или выше, чем титр, достигаемый с исходным вектором для одного или лучше для двух антигенов. Предпочтительно, чтобы титр антител был по меньшей мере на 5, 10, 20, 30 или 40% выше, чем при использовании исходного вектора. Предпочтение отдается антигенам НВ 5Ад, Н8У2дО и Е1и-М2. Гомологичный вариант (ίί) или фрагмент (ίίί) являются функциональными, если они обеспечивают наивысший титр антител, полученный с использованием природной лидерной последовательности (ί).
Подходящая лидерная последовательность может быть получена с помощью стандартных методов. Например, последовательности антигена пре-82 вируса НВУ, е-антигена вируса НВУ и антигена типа вируса Н8У имеются в наличии в СепВапк М54923, М54923 и Ζ86099 соответственно. Праймеры могут быть составлены на основе этих известных последовательностей и использованы для изолирования гомологичных последовательностей. Лидерная последовательность может быть синтезирована на основе известных последовательностей.
Конструкция нуклеиновой кислоты может содержать энхансерную последовательность. Последовательность энхансера помещается с 3' от сайта для клонирования в функциональной связи как с химерным промотором, так и с вставленной кодирующей последовательностью и действует в направлении увеличения уровня транскрипции вставленной последовательности.
Как правило, энхансер представляет собой:
(ί) природный энхансер;
(ίί) функциональный гомологичный вариант (ί) или (ίίί) функциональный фрагмент (ί) или (ίί).
Энхансерная последовательность обычно содержит примерно от 50 до примерно 850 нуклеотидов, например примерно от 75 до примерно 500 нуклеотидов. Могут быть использованы энхансеры длиной примерно 100, 200, 300 или 400 нуклеотидов.
В типичном виде (ί) - это эукариотический или вирусный энхансер, в частности, вируса, инфицирующего эукариот. Обычно такие энхансеры встречаются в 3' нетранслируемой области (3'ИТК) гена. Предпочтительно (ί) является энхансером НВУ или СМУ, например 3'-ИТК НВкАд или 3'-ИТК предраннего гена СМУ обезьян. Предпочтительно (ί) содержит последовательность 8Еф Ш NО: 8 или последовательность 8Еф Ш NО: 9.
- 14 010056
Как правило. энхансер в конструкции содержит последовательности. обнаруженные в (1). которые связывают компоненты транскрипции или регуляторные белки. например факторы транскрипции. или гомологи этих последовательностей. которые связывают те же компоненты или белки. Предпочтительно такие последовательности присутствуют в энхансере в таком же порядке и/или в значительной степени в относительном пространственном расположении. как и в (1).
Функциональным обычно является энхансер. который усиливает или увеличивает экспрессию полинуклеотида. например кодирующей последовательности. которая функционально связана с последовательностью энхансера. В типичном случае функциональные гомологичный вариант (и) или фрагмент (ίίί) обладают в значительной мере такой же активностью (например. увеличение экспрессии) и/или дополняют активность природного энхансера (1).
Активность энхансера можно протестировать. используя метод энхансерной ловушки. Протоколы известны в данной области. Функциональный гомологичный вариант (и) или фрагмент (ίίί) обеспечивают предпочтительно по меньшей мере 50% энхансерной активности. проявленной в таком тесте природным энхансером. В типичном случае активность составляет 60. 70. 80. 90. 100% и более активности природного энхансера. Как правило. функциональный вариант (ίί) или фрагмент (ίίί) способны дополнять активность природного энхансера (ί) в этом тесте.
Применимость энхансера может быть также определена с помощью сравнительного анализа экспрессии. изложенного ниже. Изучаемая З'-ИТВ последовательность вставляется в исходный вектор. З'-ИТВ пригоден для использования. если он не прекращает экспрессии. но. предпочтительно. увеличивает уровень экспрессии по меньшей мере в одном. а лучше в двух типах клеток. используемых для оценки в сравнении с исходным вектором в данном тесте. Предпочтительно. если экспрессия увеличивается по меньшей мере на 5. 10. 20. З0. 40 или 50%. Типами клеток млекопитающих. которым отдается предпочтение. являются НЕК29ЗТ. СНО. НеЬа. ВНК. ЗТЗ или СО8. В соответствии с этим тестом гомологичный вариант (ίί) или фрагмент (ίίί) являются функциональными. если они способствуют более чем 50% увеличению уровня экспрессии по сравнению с достигаемым с природной энхансерной последовательностью (1).
Дополнительно или как альтернатива энхансерные последовательности могут быть протестированы на активность с помощью сравнительного анализа иммуногенности. описанного ниже. З'-ИТВ вставляется в исходный вектор. Функциональная энхансерная последовательность обеспечивает титр антител. который. по меньшей мере. также высок или выше. чем титр. достигаемый с исходным вектором для одного. или лучше. для двух антигенов. Предпочтительно. чтобы титр антител был по меньшей мере на 5. 10. 20. З0 или 40% выше. чем при использовании исходного вектора. Предпочтение отдается антигенам НВкАд. Н8У2дИ и Е1ц-М2. Гомологичный вариант (ίί) или фрагмент (ίίί) являются функциональными. если они обеспечивают наивысший титр антител. полученный с использованием природной энхансерной последовательности (ί).
Подходящая энхансерная последовательность может быть получена с помощью стандартных методов клонирования. Например. З'-ИТВ последовательность НВкАд или З'-ИТВ последовательность предраннего гена СМУ обезьян доступны через ОепБапк АГ14ЗЗ08 и М16019. Праймеры могут быть составлены на основе этих известных последовательностей и использованы для изолирования гомологичных последовательностей.
В предпочтительном варианте осуществления конструкция нуклеиновой кислоты содержит гетерологичную поли-А последовательность. гетерологичную лидерную последовательность и гетерологичный энхансер - все в функциональной связи с химерным промотором для эффективной экспрессии вставленной кодирующей последовательности.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение также представляет конструкцию нуклеиновой кислоты. содержащую или иногда в основном состоящую из следующих последовательностей:
(ί) промоторной последовательности;
(ίί) нетранслируемой лидерной последовательности. производной от последовательности пре-82антигена НВУ. последовательности е-антигена НВУ или последовательности типа 2дИ антигена Н8У;
(ίίί) кодирующей последовательности. функционально связанной с (ί) и (ίί). в которой кодирующая последовательность гетерологична нетранслируемой лидерной последовательности.
В типичном случае промоторная последовательность (ί) является производной от эукариотической или вирусной промоторной последовательности. Промоторная последовательность может быть природной промоторной последовательностью. функциональным гомологом природной последовательности или функциональным фрагментом той или другой. Пригодные природные промоторы включают. например. предранний промотор НСМУ. промотор вируса псевдобешенства (РВУ) и промотор вируса саркомы Рауса (В8У). Предпочтительно природный промотор содержит последовательности 8ЕО ΙΌ N0: 52 или 8ЕО ΙΌ N0: 5З.
Искусственная промоторная конструкция. такая как химерный промотор. описанный выше. может быть использована при условии. что промотор функционален.
Последовательностью функционального промотора обычно является последовательность. которая способна вызывать (включая инициацию и регуляцию) транскрипцию функционально связанной коди
- 15 010056 рующей последовательности в подходящей хозяйской клетке.
Промоторная последовательность может быть проверена на промоторную активность с помощью рутинного экспрессионного анализа. Функциональный гомолог или фрагмент природной промоторной последовательности обычно обеспечивают в таком тесте по меньшей мере 50%, например, по меньшей мере 60, 70, 80 или 90% экспрессии от уровня, обеспечиваемого природной промоторной последовательностью.
Нетранслируемая лидерная последовательность (ίί) такая, как она описана выше. Подходящие кодирующие последовательности (ίίί) включают те, что были уже описаны в связи с конструкцией химерного промотора. Однако в настоящем аспекте изобретения кодирующая последовательность гетерологична нетранслируемой лидерной последовательности. Настоящая конструкция в типичном виде включает в себя поли-А последовательность, которая, как было описано, может быть нативной для кодирующей последовательности или обеспечивается как гетерологичная поли-А последовательность в конструкции. Пригодные поли-А последовательности уже были описаны. Конструкция может дополнительно включать энхансерную последовательность к 3' от кодирующей последовательности. Подходящие энхансерные последовательности описаны выше в связи с конструкцией химерного промотора.
В другом аспекте изобретение представляет конструкцию нуклеиновой кислоты, содержащую или в некоторых вариантах воплощения в основном состоящую из:
(ί) промоторной последовательности;
(ίί) кодирующей последовательности, функционально связанной с промоторной последовательностью (1); и (ίίί) энхансерной последовательности к 3' от кодирующей последовательности (ίί), связанной с ней функционально;
где энхансерная последовательность (ίίί) является производной от 3'-ИТВ последовательности НВ 5 Ад или 3'-ИТВ последовательности предраннего гена СМУ обезьян и кодирующая последовательность (ίί) гетерологична для энхансерной последовательности.
Конструкция может включать в себя нетранслируемую лидерную последовательность, такую как была уже описана выше в связи с конструкцией химерного промотора.
Характерно, что промоторная последовательность (ί) является производной от вирусной или эукариотической промоторной последовательности. Промоторная последовательность может быть природной промоторной последовательностью, функциональным гомологом природной последовательности или функциональным фрагментом той или другой. Пригодные природные промоторы включают, например, предранний промотор ЬСМУ, промотор вируса псевдобешенства (РВУ) или промотор вируса саркомы Рауса (В8У). Предпочтительно природный промотор содержит последовательности δΕβ ΙΌ N0: 52 и δΕβ ΙΌ N0: 53.
Конструкция искусственного промотора, такого как химерный промотор, описанный выше, может быть использована при условии, что промотор функционален.
Функциональной промоторной последовательностью является обычно такая, которая способна вызвать (включая инициацию и регуляцию) транскрипцию функциональной связанной кодирующей последовательности в подходящей клетке-хозяине.
Промоторная последовательность может быть проверена на промоторную активность с помощью рутинного экспрессионного анализа. Функциональный гомолог или фрагмент природной промоторной последовательности обычно обеспечивают в таком тесте по меньшей мере 50%, например, по меньшей мере 60, 70, 80 или 90% от уровня экспрессии, обеспечиваемого природной последовательностью.
Подходящие кодирующие последовательности (ίί) включают те, что уже были указаны в связи с конструкцией химерного промотора. В данном аспекте, однако, кодирующая последовательность является гетерологичной относительно 3' энхансерной последовательности. Энхансерная последовательность (ίίί) конструкции описана выше. Настоящая конструкция также в типичном виде содержит поли-А последовательность. Как и в случае конструкции химерного промотора, этот поли-А участок может быть нативным для кодирущей последовательности (ίί) или может обеспечиваться в конструкции как гетерологичный поли-А компонент.
В соответствии с любым из аспектов данного изобретения конструкция может содержать последовательность сигнального пептида. Последовательность сигнального пептида вставляется в функциональной связи с промотором, так что сигнальный пептид экспрессируется и облегчает секрецию полипептида, кодируемого кодирующей последовательностью, также в функциональной связи с промотором.
В типичном случае последовательность сигнального пептида кодирует пептид из от 10 до 30 аминокислот, например 15-20 аминокислот. Часто аминокислоты являются преимущественно гидрофобными. В типичной ситуации сигнальный пептид направляет растущую полипептидную цепь, несущую сигнальный пептид, в эндоплазматический ретикулюм экспрессирующей клетки. Сигнальный пептид отщепляется в эндоплазматическом ретикулюме, разрешая секрецию полипептида через аппарат Гольджи.
Для использования в изобретении сигнальный пептид может представлять собой:
(ί) природную последовательность сигнального пептида;
(ίί) гомологичный вариант (ί), который сохраняет активность сигнального пептида; или
- 16 010056 (ίίί) фрагмент (ί) или (ίί), который сохраняет активность сигнального пептида.
Последовательность (ί) может быть, например, сигнальным пептидом тканевого активатора плазминогена человека (НТРАкр) (ОепВапк Ь00141), сигнальным пептидом апротинина (ОепВапк ΑΑΌ13685), сигнальным пептидом экстенсина табака (ОепВапк Ш0465) или сигнальным пептидом лизоцима кур (ОепВапк АГ410481).
Сигнальным пептидом, пригодным для использования в данном изобретении, является такой, который будет способствовать секреции гетерологичных белков. Функциональный сигнальный пептид может быть идентифицирован в тесте, который проводит сравнение эффекта изучаемого сигнального пептида с эффектом известного сигнального пептида, например сигнального пептида тканевого активатора плазминогена человека (НТРАкР), и с эффектом отсутствия какого-либо сигнального пептида. Можно использовать сравнительный экспрессирующий анализ, представленный ниже, но со следующими модификациями. Конструируются векторы для экспрессии и секреции, содержащие исходный вектор или исследуемый сигнальный пептид, или с НТРАкр, или без сигнального пептида. Последовательности, кодирующие полипептиды, лишенные своих естественно встречающихся сигнальных пептидов, вставляются в векторы, и векторы трансформируются в хозяйские клетки, выбранные для оценки. Типами клеток млекопитающих, которым отдается предпочтение, являются НЕК293Т, СНО, НеЬа, ВНК, 3Т3 или СО8 клетки. Клеточная среда анализируется на уровень экспрессии полипептида. Функциональный сигнальный пептид способствует секреции полипептида на более высоком уровне, чем вектор, лишенный сигнального пептида, для одного, а лучше, если для двух полипептидов. В типичном случае секреция выше на 5, или еще лучше на 10% или более, например на 20 или 50% или более. Обычно уровни секреции сравнимы с теми, что получаются с применением НТРАкр.
Возможность секреции кодируемого белка за пределы экспрессирующей клетки может иметь ряд преимуществ, в особенности, если белок является антигеном. Например, увеличенная секреция антигена могла бы вызвать большее включение антигена и больший ответ иммунных клеток (макрофагов, клеток Лангенгарса, В-клеток, Т-клеток и т.д.), дала бы возможность антигену достичь кровяного русла и принимать сигналы клеток (цитокинов), находить клеточные лиганды и влиять на функцию (антитела, токсины, такие как холерный токсин, Е.со11 ЬТ) и участвовать в нормальных клеточных биохимических процессах (клеточные рецепторы).
Конструкция нуклеиновой кислоты данного изобретения может быть в форме плазмидного экспрессионного вектора. Вектор может также включать дополнительные элементы, такие как сайт начала репликации, или селективные гены. Такие элементы известны в данной области и могут быть включены с использованием стандартных методов. В одном варианте осуществления плазмидный вектор содержит последовательность 8ЕЦ ΙΌ NО: 14. Как альтернатива конструкция может быть включена в состав вирусного вектора.
В некоторых вариантах воплощения конструкция нуклеиновой кислоты, по изобретению, может содержать два или более химерных промотора, определяемых здесь. Так, конструкция может содержать множество химерных промоторов, и, в частности, конструкция может иметь два, три, четыре, пять или более химерных промоторов. Химерные промоторы, предпочтительно, будут функционально связаны, каждый по отдельности, с сайтом для клонирования, по которому встраивается кодирующая последовательность. Так, конструкция может экспрессировать две, три, четыре, пять или более кодирующих последовательностей. Экспрессируемые кодирующие последовательности могут быть любыми из тех, что указываются здесь. В предпочтительном случае конструкция имеет два химерных промотора, каждый функционально связан с кодирующей последовательностью. В частности, два промотора могут быть транскрибированы на расстоянии друг от друга.
В частности, конструкции с двумя промоторами могут экспрессировать субъединицы А и В АЭР-рибозилирующего бактериального токсина, включая любые из тех, что указаны здесь, и предпочтительно, субъединицы ЬТ-А и -В.
В случаях, когда конструкция имеет множественные химерные промоторы, каждый может содержать или быть функционально связанным с любой из последовательностей, указанных здесь. В особенном предпочтительном случае гетерологичным интроном одного или более промоторов может быть последовательность интрона А гена инсулина крысы. Один или более химерных промоторов могут, предпочтительно, также содержать 5'-иТВ пре-82 Н8У-2дВ. Один или более промоторов могут содержать последовательность полиаденилирования гена бета-глобина крысы.
В предпочтительном случае конструкция нуклеиновой кислоты, согласно изобретению, может содержать две химерные промоторные последовательности, причем каждая промоторная последовательность функционально связана с сайтом для клонирования, в который вставлена кодирующая последовательность, где каждый промотор содержит:
(a) последовательность предраннего промотора НСМУ;
(b) экзон 1 и по меньшей мере часть экзона 2 основного предраннего гена НСМУ;
(c) гетерологичный интрон, вставленный в район интрона А основного предраннего гена НСМУ, с кодирующей последовательностью, функционально связанной с одним химерным промотором, кодирующей субъединицу ЬТ-А, и кодирующей последовательностью, связанной с другим химерным промо
- 17 010056 тором, кодирующей субъединицу ЬТ-В. Конструкция поэтому может экспрессировать обе субъединицы. Предпочтительно, если гетерологичный интрон каждого промотора является последовательностью интрона А гена инсулина крысы;
последовательность, кодирующая каждую субъединицу ЬТ функционально связана с 5'-иТВ пре-82 НВУ; и/или каждая кодирующая ЬТ последовательность функционально связана с последовательностью полиаденилирования гена бета-глобина крысы.
Полинуклеотидная конструкция согласно изобретению может быть в основном свободна от клеток или ассоциирована с клетками или клеточным материалом. Она может быть в значительной степени в изолированном виде или в очищенной форме, в этом случае она, как правило, составляет по меньшей мере 90, например, 95, 98 или 99% полинуклеотида или сухой массы в препарате.
Данные молекулы нуклеиновой кислоты могут быть доставлены в подходящие хозяйские клетки для экспрессии полинуклеотида в функциональной связи с промотором. Предпочтительно, чтобы хозяйские клетки были клетками млекопитающих, в особенности клетками человека. Методы, пригодные для доставки нуклеиновых кислот к таким клеткам, известны в данной области и включают, например, опосредованную декстраном трансфекцию, преципитацию фосфатом кальция, электропорацию и прямую микроинъекцию в ядра.
Как описано выше, последовательность, кодирующая нуклеиновую кислоту в конструкции, может кодировать терапевтически значимый полипептид. В связи с этим настоящие конструкции могут быть использованы для иммунизации нуклеиновыми кислотами или генной терапии с применением стандартных протоколов доставки генов. Подходящие способы для доставки генов известны в этой области, как описано ниже. Молекулы нуклеиновых кислот могут быть доставлены или непосредственно субъекту, или, как альтернатива, доставлены ех νίνο в клетки, полученные у субъекта, после чего клетки реимплантируются субъекту.
Для применения в иммунизации нуклеиновыми кислотами или генной терапии конструкции нуклеиновых кислот могут быть разработаны в качестве стандартных фармацевтических препаратов. Это может быть осуществлено с применением стандартных химических технологий и методик получения фармацевтических композиций, которые доступны специалистам в данной области. Например, композиции, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновых кислот (например, представленные в подходящей векторной форме, такой как ДНК-плазмиды), могут комбинироваться с одной или более фармацевтически пригодными наполнителями или переносчиками с получением жидкого препарата.
Вспомогательные вещества, такие как увлажняющие или эмульгирующие агенты, рН-буферные вещества и т.п., могут быть представлены в наполнителе или переносчике. Эти наполнители, переносчики и вспомогательные вещества являются, как правило, фармацевтическими средствами, которые могут быть введены без неспецифической токсичности и которые, что касается вакцинных композиций, не вызывают иммунный ответ у индивида, получающего композицию. Фармацевтически пригодные наполнители включают, но не ограничивают, жидкости, такие как вода, солевой раствор, полиэтиленгликоль, гиалуроновая кислота, глицерол и этанол. Фармацевтически пригодные соли могут также включать в себя, например, соли неорганических кислот, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты и т.п.; и соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты, бензоаты и т.д. Также предпочтительно, хотя и не обязательно, чтобы препарат содержал фармацевтически подходящий наполнитель, который служит в качестве стабилизатора, в частности, для пептида, белка или других молекул, если они подлежат включению в композицию. Примеры подходящих переносчиков, которые также действуют как стабилизаторы для пептидов, включают в себя, без ограничения, фармацевтические марки декстрозы, сахарозы, лактозы, трегалозы, маннитола, сорбитола, инозитола, декстрана и т.д. Другие подходящие носители включают в себя, также без ограничения, крахмал, целлюлозу, фосфаты натрия или кальция, лимонную кислоту, винную кислоту, глицин, высокомолекулярные полиэтиленгликоли (РЕП) и их комбинации. Подробное описание фармацевтически пригодных наполнителей, переносчиков и вспомогательных веществ можно найти в ВеттдФп'к рйагтасеи!1са1 кс1епсек (Маск РиЬ. СЪ., Ν.Τ 1991), включенном в настоящее описание путем ссылки.
Определенные агенты, облегчающие поглощение и/или экспрессию нуклеиновых кислот («агенты, облегчающие трансфекцию»), могут также быть включены в композиции, например такие облегчающие трансфекцию агенты, как бупивакаин, кардиотоксин и сахароза, и облегчающие трансфекцию агенты, такие как липосомные или липидные препараты, которые обычно используются для доставки молекул нуклеиновых кислот. Анионные и нейтральные липосомы представляют собой широкодоступные и хорошо известные средства для доставки молекул нуклеиновых кислот (см., например, □μοκοιτ^: А Ргасйса1 Арргоасй, (1990), ВРС №\ν Еб., 1ВЬ Ргекк). Катионные липидные препараты также представляют собой хорошо известные переносчики для применения в доставке молекул нуклеиновых кислот. Подходящие липидные препараты включают в себя
ЭОТМА (№[1-(2,3-диолеилокси)пропил]-^^№триметиламмония хлорид), доступный под торговой маркой ^^рοΓесι^η™. и
- 18 010056
ЭОТАР (1,2-бис-(олеилокси)-3-(триметиламмонио)пропан), см., например, Рещпег е! а1. (1987) Ргос. Ыаб. Асаб. 8с1. И8А 84: 7413-7416; МаЕпе е! а1. (1987), Ргос. Ыа!1. Асаб. δα. И8А 86: 6077-6081; Ра!еп! υδ № 5283185 и 5527928 и 1п!егпа!юпа1 РиЫюа!юп XV О 90/11092, νθ 91/15501 и νθ 95/26356.
Эти катионные липиды могут предпочтительно использоваться в соединении с нейтральным липидом, например ЭОРЕ (диолеилфосфатидилэтаноламин).
Дополнительно, композиции посредников трансфекции, к которым могут быть добавлены вышеуказанные липидные или липосомные препараты, включают в себя дериваты спермина (см., например, 1п!егпа1юпа1 РиЫюа1юп νθ 93/18759) и мембрано-пермеабилизующие соединения, такие как СЛЬА. грамицидин δ и катионные желчные соли (см., например, 1п!егпа1юпа1 РиЫюа!юп νθ 93/19768).
В качестве альтернативы, молекулы нуклеиновых кислот согласно изобретению могут быть инкапсулированы, адсорбированы или связаны с носителем в виде частиц. Подходящие твердые носители включают в себя носители, полученные из полимеров полиметилметакрилата, так как микрочастицы РЬС получены из поли(лактидов) и поли(лактид-когликолидов). См., например, 1еГГегу е! а1. (1993), РНагш. Кек 10: 362-368. Другие твердые системы и полимеры могут также применяться, например полимеры, такие как полилизин, полиаргинин, полиорнитин, спермин, спермидин, также как и конъюгаты этих молекул.
Как только композиции составлены, они могут быть доставлены субъекту ш νίνο с применением множества известных путей и методик. Например, жидкие препараты могут быть предоставлены в качестве раствора для инъекций, суспензии или эмульсии и вводиться посредством парентеральных, подкожных, внутрикожных, внутримышечных, внутривенных инъекций с применением стандартных игл и шприцев или с применением систем для безыгольного впрыскивания жидкостей. Жидкие препараты могут также применяться местно на кожу или слизистую оболочку или предоставляться в качестве высокодисперсного спрея, подходящего для дыхательного или легочного введения. Другие методы введения включают в себя пероральный прием, суппозитории и активные или пассивные методы трансдермальной доставки.
В качестве альтернативы, композиции можно вводить ех νίνο, например, известны доставка и реимплантация измененных клеток субъекту (например, трансфекция, опосредованная декстраном, преципитация фосфатом кальция, электропорация и прямые микроинъекции в ядро).
Композиции вводят субъекту в количестве, которое совместимо с определением дозы и которое будет эффективно для профилактики и терапии. Адекватное эффективное количество будет попадать в относительно широкий диапазон, но может быть легко определено специалистами в данной области при помощи рутинных исследований. «Рйуыаапк Эекк КеГегепсе» и «6οοбтаη апб Сбтап'к Тйе РΗа^тасο1ο§№ι1 Вак1к οΓ Тйегареибск» являются полезными для определения необходимого количества. Например, в большинстве случаев ожидается, что эффективная доза полинуклеотида будет попадать в диапазон примерно от 0,001 до 1000 мкг, более предпочтительно от 0,01 до 10,0 мкг.
Например, конструкция нуклеиновых кислот согласно изобретению может применяться в связи с другой конструкцией нуклеиновых кислот. В одном случае конструкция нуклеиновых кислот может быть одной из конструкций, описанных здесь для экспрессии адъюванта, и другая конструкция может представлять собой конструкцию, кодирующую один или более антигенов. В предпочтительной ситуации обе конструкции могут использовать химерный промотор изобретения.
В ситуации, когда одна конструкция экспрессирует адъювант, а другая - антиген или антигены, антигены могут, в частности, быть из Ηδν или вируса гепатита (особенно вируса гепатита В). Антигены могут, в частности, представлять собой антигены Ηδν 1СР0, 1СР4, 1СР22 и 1СР27, предпочтительно все четыре. В случаях, когда экспрессируются такие антигены, адъювантные конструкции будут экспрессировать, в частности, ЬТА и/или ЬТВ и, в особенности, оба.
Две конструкции могут вводиться раздельно, одновременно или последовательно. Две конструкции могут быть введены в одной и той же или различных композициях. В частности, когда одна конструкция обладает адъювантным эффектом, обе будут доставляться таким образом, что будет проявляться адъювантный эффект, так что вызванный иммунный ответ будет сильнее и/или на более длительный период, чем если бы адъювант не вводился антигеном. В предпочтительном примере две конструкции могут быть доставлены в одной и той же композиции, предпочтительно на одних и тех же частицах носителя.
В предпочтительном варианте осуществления конструкции нуклеиновых кислот согласно изобретению доставляются к клеткам-мишеням с использованием опосредованных частицами методов доставки. Опосредованные частицами способы доставки препаратов нуклеиновых кислот известны в этой области техники.
Частицы для опосредованной частицами доставки могут быть сформированы путем нанесения представленных молекул нуклеиновых кислот на частицы носителя (например, ядерных переносчиков) с применением множества методов, известных в этой области техники. Частицы носителя выбираются из материалов, которые имеют подходящую плотность в диапазоне размеров частиц, обычно используемых для внутриклеточной доставки из устройства доставки, опосредованной частицами. Как правило, частицы носителя имеют диаметр от 0,1 до 5 мкм, например от 0,5 до 3 мкм, предпочтительно от 1 до 2 мкм.
- 19 010056
Оптимальный размер частиц носителя будет, конечно, зависеть от диаметра клеток-мишеней. В качестве альтернативы, частицы коллоидного золота могут применяться там, где покрытое коллоидное золото вводится (например, инъецируется) в ткани (например, кожу или мышцу) и впоследствии захватывается иммунокомпетентными клетками.
Обычно частицы носителя выбираются из инертных металлов. Металлы являются инертными в том случае, когда они физиологически не активны. Для целей изобретения могут применяться вольфрамовые, золотые, платиновые и иридиевые частицы носителя. Предпочтение отдается вольфрамовым и золотым частицам. Легко доступны вольфрамовые частицы диаметром в среднем от 0,5 до 2,0 мкм. Хотя такие частицы имеют оптимальную плотность для применения в способах доставки, ускоренной частицами, и обеспечивают высоко эффективное покрытие ДНК, вольфрам потенциально может быть токсичным для различных типов клеток. Частицы золота или микрокристаллическое золото (например, порошок золота А1570, имеющийся в наличии в ЕидеШагй Согр., Еа§! №\\'агк. N1) также находят применение в представленных способах. Частицы золота обеспечивают однородность в размере (имеющиеся в А1рйа Сйешюак частицы 1-3 мкм в размере или имеющиеся в Педина, 8ои!й РЫпйеИ, N1 в диапазоне размеров частиц, включающем 0,95 мкм) и сниженную токсичность. Микрокристаллическое золото обеспечивает различное распределение размеров частиц, обычно в диапазоне 0,1-5 мкм. Однако неправильная поверхность микрокристаллического золота обеспечивает высоко эффективное покрытие нуклеиновыми кислотами.
Известно и описано множество способов покрытия или преципитации ДНК, или РНК на золотые или вольфрамовые частицы. Большинство таких способов в основном комбинируются с заранее определенным количеством золота или вольфрама с ДНК плазмиды, СаС12 и спермидином. Конечный раствор постоянно встряхивается, пока проведение процедуры покрытия не обеспечит однородности реакционной смеси. После преципитации нуклеиновых кислот покрытые частицы могут быть перенесены на подходящие мембраны и высушены перед применением, нанесены на поверхность модуля или кассеты для образцов или помещены в кассету для доставки для применения, в частности в приборах опосредованной частицами доставки.
В качестве альтернативы, полинуклеотиды изобретения могут быть составлены как дисперсная композиция. Соединение может быть выполнено с использованием вышеуказанных стандартных фармацевтических химических технологий. Например, полинуклеотиды могут быть скомбинированы с одним или более фармацевтически пригодным наполнителем или переносчиком для того, чтобы предоставить подходящую композицию. Разработанные композиции затем приготавливаются в виде частиц с применением стандартных методов, таких как простое выпаривание (высушивание на воздухе), вакуумное высушивание, высушивание из распыленного состояния, высушивание из замороженного состояния (лиофилизация), высушивание из распыленного замороженного состояния, напыление, преципитация, сверхкритическое флюидное формирование частиц и т.п. При необходимости конечные частицы могут быть уплотнены с применением методов, описанных в Иетпайопа! РиЫюаБоп \У0 97/48485, которая находится в открытом доступе и включена в настоящее изобретение путем ссылки.
Эти способы могут использоваться для получения частиц нуклеиновых кислот, имеющих размер в диапазоне примерно от 0,01 до примерно 250 мкм, предпочтительно примерно от 10 до 150 мкм и наиболее предпочтительно примерно от 20 до 60 мкм, плотность частицы в диапазоне примерно от 0,1 до примерно 25 г/см3 и удельный вес примерно от 0,5 до примерно 3,0 г/см3 или более.
Сразу после образования частицы, содержащие молекулы нуклеиновых кислот, могут быть упакованы в одиночное приспособление или контейнеры на много доз. Такие контейнеры могут содержать герметично запечатанный контейнер, заключающий в себе подходящее количество частиц. Частицы могут быть упакованы в виде стерильного состава, и герметично запечатанный контейнер может быть сконструирован таким образом, чтобы сохранить стерильность состава до его использования для доставки субъекту. Контейнеры предпочтительно приспособлены для непосредственного применения в устройстве для опосредованной частицами доставки субъекту. Обычно такие контейнеры имеют форму капсул, ячеек из фольги, пакетов-саше, кассет и т.д. Устройства для доставки частиц могут быть также предоставлены в заряженном виде и содержать подходящую дозу частиц. Затем заряженное устройство может быть также упаковано в герметично запечатанный контейнер.
Контейнер, в которой упакованы частицы, может в дальнейшем быть маркирован для того, чтобы обозначить композицию и предоставить информацию о подходящих дозировках. К тому же, контейнер может быть маркирован пометкой в форме, предписанной правительственной организацией, например Управлением по контролю за продуктами и лекарствами, в которой пометка указывает на разрешение организацией, в соответствии с Федеральным законом о производстве, применении или продаже препарата нуклеиновых кислот, содержащегося в нем, для введения человеку.
Устройства для придания скорости частицам, подходящие для опосредованной частицами доставки, известны в этой области техники. Например, существующие устройства типа генного пистолета используют взрывной, электрический или газовый разряд для того, чтобы выстрелить покрытыми частицами носителя по направлению к клеткам-мишеням. Покрытые частицы носителя могут быть обратимо прикреплены к подвижному слою носителя или подвижно фиксированы к поверхности, вдоль которой проходит струя газа, отрывая частицы от поверхности и ускоряя их движение по направлению к цели. При
- 20 010056 мер устройства на основе газового разряда описан в патенте США № 5204253. Устройство взрывного типа описано в патенте США № 4945050. Один пример аппарата с электрическим разрядом, подходящего для применения здесь, описан в патенте США № 5120655. Другой аппарат с электрическим разрядом описан в патенте США № 5149655. Сущность всех этих патентов включена в настоящее изобретение в качестве ссылки во всей их полноте.
Частицы могут также быть введены с применением устройства для безыгольных инъекций, такого как устройства, описанные в патенте США № 5630796 ВеИНоизе е( а1. ((Не Ро\\'бег1ес(® пееб1е1езз зуппде беуке) и в 1п(егпа((опа1 РиЬНсаДоп АО 94/24263, АО 96/04947, АО 96/12513 и АО 96/20022, все из которых включены в настоящее изобретение в качестве ссылки.
Устройства, такие как устройство, описанное в патенте США № 5630796, могут быть представлены как инструмент, имеющий форму ручки, содержащий, в порядке расположения сверху вниз, цилиндр с газом, кассету или пакетик с частицами и ультразвуковой наконечник со связанным с ним глушителем. Частицы заключены в подходящий контейнер, например кассету, формируемую двумя разрываемыми полимерными мембранами, которые припаяны к прокладке, имеющей форму шайбы, с образованием самостоятельной изолированной единицы. Материалы мембраны могут быть выбраны с целью достижения определенного принципа открытия и давления разрыва, которые диктуют условия возникновения ультразвукового потока.
На практике устройство приводится в действие путем высвобождения сжатого газа из цилиндра в камеру расширения устройства. Освобожденный газ контактирует с кассетой для частиц и, когда создается достаточное давление, резко разрывает мембраны кассеты, увлекая частицы в ультразвуковой наконечник для последующей доставки. Наконечник сделан так, чтобы достигнуть определенной скорости и характера движения потока газа для доставки дозы частиц к намеченной поверхности предварительно определенной области. Глушитель применяется для того, чтобы ослабить шум, производимый ультразвуковым током газа.
Система доставки, описанная в 1п(егпа(1опа1 РиЬНсаДоп АО 96/20022, также использует энергию сжатого газа, чтобы ускорить и доставить порошкообразные композиции. Однако она отличается от системы в патенте США № 5630796 применением ударной волны вместо потока газа для ускорения частиц. Более детально, мгновенный подъем давления, обеспеченный ударной волной, генерируемой позади гибкого поршня, давит на поршень, вызывая резкое выталкивание поршня в направлении цели. Катапультирование порошкообразной композиции (которая располагается снаружи от поршня) происходит с достаточной скоростью, создавая таким образом импульс для проникновения в ткань, например в ткань слизистой оболочки ротовой полости. Порошкообразная композиция высвобождается в момент полного выдвижения поршня. Поршень также служит для того, чтобы удержать поток газа с высоким давлением, который таким образом не приходит в контакт с тканью. Так как газ не освобождается в процедуре доставки, система является по определению бесшумной. Эта конструкция может применяться в любых прилагаемых или любых чувствительных применениях, например, для доставки частиц при миниинвазивном хирургическом вмешательстве.
Частицы могут быть доставлены ш у1уо непосредственно субъекту или ех у1уо в клетки, взятые от субъекта, с последующей реимплантацией измененных клеток субъекту. При доставке ш у1уо инъекция частиц обычно подкожная, эпидермальная, внутрикожная, внутрислизистая (например, назально, ректально и/или вагинально), внутрибрюшинная, внутривенная, пероральная или внутримышечная. Предпочтительно, чтобы доставка осуществлялась к высокодифференцированным клеткам; однако частицы могут также быть доставлены к недифференцированным клеткам или частично дифференцированным клеткам, таким как стволовые клетки крови и фибробласты кожи. Более предпочтительно, чтобы доставка осуществлялась к эпидермальным клеткам кожи.
Частицы вводятся субъекту способом, сочетающимся с формой дозирования и в количестве, которое будет профилактически и и/или терапевтически эффективно. «Терапевтически эффективное количество» настоящих дисперсных композиций будет являться необходимым для того, чтобы осуществлять лечение или предотвращение заболевания или симптомов состояния, и будет попадать в относительно широкий диапазон, который может быть определен рутинными способами. Как правило, частицы доставляются в количестве от 0,001 до 1000 мкг, более предпочтительно от 0,01 до 10,0 мкг нуклеиновых кислот в дозе. Однако точное количество обязательно будет изменяться в зависимости от возраста и общего состояния индивида, подлежащего лечению, и отдельной выбранной последовательности нуклеотида, так же, как и от других факторов. Подходящее необходимое количество может быть легко определено путем клинических испытаний. «РНузЮапз Эезк РеГегепсе» и «Сообтап апб СНтап'з ТНе РНагтасо1од1са1 Ваз1з оГ ТНегареиДсз» являются полезными для определения необходимого количества.
Тесты
Сравнительный экспрессирующий анализ
Подходящий тест на возможность использования элемента определяет эффект, который элемент оказывает на экспрессию полипептида. Основой для сравнения по тестируемой пригодности элемента служит «исходный вектор», обычно (если не указано иначе) плазмида с промотором НС МУ, экзоном 1 НСМУ, 9 основаниями экзона 2 НСМУ, 5'-ИТК пре-82 НВУ и участок полиаденилирования бета-глобина
- 21 010056 кролика, расположенные так, чтобы осуществлять экспрессию кодирующей последовательности. Обычно исходным вектором является р1У7384, р1У7401, р1У7450 или р1У7533. Гетерологичные интроны и 3'-ИТК участки добавляются или промоторные последовательности, экзоны, 5'-ИТК участки и поли-А сайты заменяют элементы исходных векторов с образованием векторов для тестирования экспрессии. Таким образом могут проверяться функциональные варианты или фрагменты.
Исходные векторы и тестируемые векторы трансформируются в подходящие хозяйские клетки, и клетки анализируются по уровням экспрессии полипептида. Предпочтительно используются клетки млекопитающих. Пригодные клетки включают клетки НЕК293Т, СНО, НеЬа, ВНК, 3Т3 или СОδ.
В типичном случае функциональный элемент вызывает экспрессию, сравнимую с таковой для исходного вектора, например по меньшей мере такую же или выше. Экспрессия предпочтительно тестируется на более чем одном типе клеток и с более чем одной кодирующей последовательностью.
Подходящие экспериментальные протоколы предоставлены, например, в примерах 1-13, описанных ниже.
Сравнительный тест на иммуногенность
Если полипептид, который должен быть экспрессирован, является антигеном, следующий анализ может быть выполнен для идентификации функциональных или особенно предпочтительных элементов конструкции. В этом анализе определяется влияние элемента на иммунный ответ после доставки экспрессирующего вектора в тестовый организм. Определение уровней антител против антигена - это простейший путь оценить иммунный ответ. Группы мышей вакцинируются исходными векторами или тестовыми векторами, сконструированными, как описано выше. Сыворотки собираются после соответствующего периода времени и анализируются по уровню антител.
Этот эксперимент проводится дважды, и уровни антител от всех групп в двух экспериментах наносятся на график. Функциональные элементы вызовут, по меньшей мере, такие же или большие титры антител против отдельного антигена в обоих экспериментах, чем исходные векторы. Предпочтительно получить результат более чем с одним антигеном для того, чтобы продемонстрировать возможность широкого использования элемента (элементов) в этой экспрессирующей панели.
Подходящие экспериментальные протоколы предоставлены, например, в примере 14, описанном ниже.
Экспериментальная часть.
Ниже приведены примеры специфических воплощений для осуществления согласно изобретению. Примеры предлагаются исключительно в иллюстративных целях и не призваны ограничить каким-либо образом пределы использования данного изобретения.
Были приложены усилия обеспечить достоверность в отношении используемых численных значений (например, количеств, значений температуры и т.д.), но некоторые экспериментальные погрешности и отклонения, конечно, допустимы.
Способы.
Стандартные условия ПЦР.
Стандартные условия ПЦР, использованные при конструировании векторов были следующими: однократный основной буфер с 1,5 мМ МдС12 (Рготеда Согрогайоп, Майкоп, XVI);
0,4 мкМ каждого праймера;
200 мкМ каждого άΝΊΓ (υδΕ, 1пс, С1еуе1апй, ОН);
2,5 ед. Тад полимеразы (Рготеда Согрогайоп, Майкоп, VI);
1,0 нг ДНК-матрицы;
вода до 100 мкл и наслоенное минеральное масло (А1йпсй Сйет1са1, 1пс, Мй^аикее, VI).
Термоблок РТС-200 (М1 Кекеагсй, 1пс, Vа1ΐйат, МА) был настроен на выполнение следующей программы: 4 мин при 95°С, 30 циклов (1 мин при 95°С/1 мин 15 с при 55°С/1 мин при 72°С), 10 мин при 72°С, закончить при 4°С. Перед обработкой ферментами рестрикции (Νονν Епд1апй Вю1аЬ§, Веуег1у, МА) продукты амплификации выделялись из ПЦР-реакционной смеси с использованием набора для очистки О1Ас.|шскаРСИ (01адеп 1пс, Уа1епс1а, СА).
Для гарантии точности амплификации для всех продуктов ПЦР после клонирования были определены последовательности.
Пример 1. Конструирование панелей векторов поверхностного антигена вируса гепатита В (НВкАд).
Ряд плазмидных экспрессирующих векторов был сконструирован для экспрессии НВкАд.
Исходные материалы.
(ί) рVΚ67128 (Коу, М., е1 а1. Уассте (2001), 19: 764-778), который содержит последовательность предраннего промотора ЙСМУ, первый экзон, первый интрон и частично второй экзон основного предраннего гена ЙСМУ, последовательность, кодирующую НВкАд, с фланкирующими районами (последовательностью, производной от 5'-ИТК пре^2 НВУ, и 3' посттранскрипционным респонсивным элементом) и область полиаденилирования гормона роста быка (ВОНрА).
(ίί) р1У7284, производный от рVΚ67128, в котором область полиаденилирования бета-глобина
- 22 010056 кролика (ШВСрА) заменена на ВСНрА.
(a) р1У7384 (СМУ (без интрона), 5'-ИТВ пре-82 НВУ и ШВСрА).
рАРС7128 был размножен в ПЦР с праймерами ΙΕ93 (8ЕЦ ΙΌ N0: 15) и Е110 (8ЕЦ ΙΌ N0: 16) с использованием стандартных условий и разрезан 8а11 и ВатН1 для выделения фрагмента вставки, содержащего СМУ промотор, экзон 1 и частично последовательность экзона 2.
рАМ6 (АТСС, Маппаккак, УА) был разрезан ВатН1 и Вя1Х1 для выделения фрагмента вставки, который содержал 5’-иТВ НВкАд и приблизительно 70% кодирующего района НВкАд.
р1У7284 был разрезан 8а11 и Вк1Х1 для получения фрагмента вектора, с которым были лигированы два фрагмента вставок, давая в результате р1У7293.
рАРС7128 был размножен в ПЦР с праймерами СА1 (8ЕЦ ΙΌ N0: 17) и ΣΕ254 (8ЕЦ ΙΌ N0: 18) и разрезан Вк1Х1 и Вд12 для выделения фрагмента вставки, который содержал 3'-конец кодирующей области НВкАд.
р1У7293 был разрезан Вк(Х1 и Вд12 с образованием фрагмента вектора, с которым был лигирован фрагмент вставки, давая в результате р1У7384.
(b) р1У7382 (СМУ (без интрона), 3'-ИТВ НВкАд, 5'-ИТВ пре-82 НВУ и ШВСрА).
р1У7293 был разрезан Х1ю1 и ХЬа1 для получения фрагмента вставки, содержащего СМУ промотор/экзоны и 5'-ЬТВ с 5'-концом кодирующей последовательности НВкАд.
рАВС7128 был разрезан ХЬа1 и Вс11 для получения фрагмента вставки, содержавшего большую часть кодирующей последовательности НВкАд и 3'-ЬТВ.
р1У7284 был разрезан Х1о1 и Вд12 для получения фрагмента вектора, с которым были лигированы два фрагмента вставок, давая в результате р1У7382.
(c) р1У7389 (СМУ (ША), 3'-ИТВ НВкАд, 5'-ИТВ пре-82 НВУ и ШВСрА).
Интрон А инсулина крысы (ША) был размножен в ПЦР по плазмиде р5'г1пк (неизвестного происхождения) с праймерами СА150 (8ЕЦ ΙΌ N0: 19) и ΣΕ255 (8ЕЦ ΙΌ N0: 20). Продукт ПЦР был вырезан с помощью ВатН1 и вставлен в линеаризованный по ВатН1 р1У7382, что дало в результате р1У7389.
(б) р1У7387 (СМУ (ША), 5'-ИТВ пре-82 НВУ и ШВСрА).
р1У7384 был разрезан Вк1Х1 и ЕсоШ1 для получения фрагмента вставки, содержавшего 3'-конец кодирующей области НВкАд и ШВСрА.
р1У7389 был разрезан Вк1Х1 и ЕсоШ1 для получения фрагмента вектора, с которым был лигирован фрагмент вставки, давая в результате р1У7387.
Пример 2. Конструирование панели векторов антигена Ό гликопротеина вируса простого герпеса (Н8У§0).
Ряд плазмидных экспрессирующих векторов был сконструирован для экспрессии Н8УдЭ.
Исходные материалы.
(a) р1У7334, производный от рАРС7284 (р1У7284), в котором последовательность, кодирующая НВкАд, заменена на сайт ШкЕ в рамке, непосредственно после стартового кодона АТС, за которым следует фрагмент-наполнитель с сайтом ВатН1 непосредственно к 5' от НВУЕп1.
(b) рАРС7202. производный от рСет32 (Рготеда) с фрагментом-наполнителем, который обеспечивает слияние кодирующей последовательности с сигнальным пептидом тканевого активатора плазминогена человека (ТРА) ниже ΜκΙ сайта.
(a) р1У7392 (СМУ (нативный интрон), 3'-ЬТВ НВкАд, 5'-ЬТВ НВкАд и ШВСрА.
Кодирующий район для 2дИ Н8У был размножен в ПЦР по суммарной вирусной ДНК (Абνаηсеб В1о!есй, Шс, Со1итЬ1а, МИ) с использованием праймеров Ό81 (8ЕЦ ΙΌ N0: 21) и ЭА1 (8ЕЦ ΙΌ N0: 22) и разрезан N114 и ЕсоШ1 для получения фрагмента вставки.
рАРС7202 был разрезан ΜκΙ и ЕсоШ1 для получения фрагмента вектора, с которым был лигирован фрагмент вставки с образованием р1У7391.
р1У7391 был разрезан ΜκΙ и Вд12 для получения фрагмента вставки, содержавшего последовательность, кодирующую 2дИ Н8У.
р1У7334 был разрезан ΜκΙ и ВатН1 для получения фрагмента вектора, в который был лигирован фрагмент вставки с образованием р1У7392. Этот вектор содержит следующие экспрессирующие элементы: последовательность предраннего промотора 1СМУ, первый экзон, первый интрон и частично второй экзон основного предраннего гена 1СМУ, 5'-иТШ от НВкАд, кодирующую последовательность гена дИ Н8У2, 3'-ИТВ от НВкАд и ШВСрА.
(b) р1У7399 (СМУ (без интрона), 3'-ИТВ ННкАц, 5'-ИТВ НВкАд и ШВСрА).
Вариант р1У7392, лишенный интрона, был сконструирован следующим образом.
р1У7384 был разрезан Н1пб3 и Нбе1 для выделения фрагмента вставки, содержавшего 5'-концы гена устойчивости к канамицину и промотора СМУ.
р1У7384 был разрезан Ше1 и 8кр1 для выделения фрагмента вставки, содержавшего 3'-конец промотора СМУ, экзоны 1/2 СМУ и 5'-конец 5'-ЬТВ от НВкАд. Эти фрагменты вставок были встроены в р1У7392, из которого был удален фрагмент Н1пб3-8кр1 с образованием р1У7399.
(c) р1У7400 (СМУ (ША), 3'-ИТВ НВкАд, 5'-ИТВ НВкАд и ШВСрА).
- 23 010056
Вариант ША вектора р1У7392 был сконструирован следующим образом.
р1У7384 был разрезан Н1пб3 и Шс1 для выделения фрагмента вставки, содержавшего 5'-концы гена устойчивости к канамицину и промотора СМУ.
р1У7387 был разрезан Шс1 и §8р1 для выделения фрагмента вставки, содержавшего З'-конец промотора СМУ, экзоны 1/2 (частично) СМУ, ΡΙΆ и 5'-конец 5'-ИТК от НВкАд. Эти фрагменты вставок были встроены в р1У7392, из которого был удален фрагмент Нтб3-§8р1 с образованием р1У7400.
(б) р1У7401 (СМУ (без интрона), 5'-ИТК НВкАд и КВСрА).
Вариант р1У7399, лишенный 3'-иТК, был сконструирован следующим образом.
р1У7391 был разрезан Вкр1201 и Вд12 для выделения фрагмента вставки, содержавшего 3'-конец гена дЭ Н8У2.
р1У7284 был разрезан Вд12 и ЕсоК1 для выделения сигнала КВСрА. Эти фрагменты вставок были встроены в р1У7399, из которого был удален фрагмент В§р1201-ЕсоК1 с образованием р1У7401.
(е) р1У7402 (СМУ (ША), 5'-ИТК НВкАд и КВСрА).
Вариант р1У7400, лишенный 3'-ИТК, был сконструирован следующим образом.
р1У7391 был разрезан Вкр1201 и Вд12 для выделения фрагмента вставки, содержавшего 3'-конец гена дЭ Н8У2.
р1У7284 был разрезан Вд12 и ЕсоК1 для выделения сигнала КВСрА. Эти фрагменты вставок были лигированы с р1У7400, из которого был удален фрагмент В§р1201-ЕсоК1 с образованием р1У7402.
Пример 3. Конструирование панели векторов антигена Е1и-М2.
(a) р1У7450 (СМУ (без интрона), 5'-ИТК НВкАд и КВСрА).
Кодирующая область для Е1и-М2 была размножена в ПЦР по плазмиде рЕЬ-М2 (1ое1 Наупек, рТУ) с использованием праймеров 1Е301 (8ЕС ΙΌ N0: 23) и 1Е302 (8ЕС ΙΌ N0: 24) и разрезана Ыйе1 и Вд12 для получения фрагмента вставки.
р1У7401 был разрезан ΝΙκΙ и Вд12 для получения фрагмента вектора, с которым был лигирован фрагмент вставки с образованием р1У7450.
(b) р1У7452 (СМУ (без интрона), 3'-ИТК НВкАд, 5'-ИТК НВкАд и КВСрА).
Фрагмент 3'-ИТК был размножен в ПЦР по матрице р1У7389 с праймерами 1Е84 (8ЕС ΙΌ N0: 25) и 1Е225 (8Е0 ΙΌ N0: 26), разрезан Вкр1201, достроен Т4 ДНК-полимеразой и объединен с Вд12линкерными последовательностями (кат. № 1036, Ееь Епд1апб Вю1аЬ§). Фрагмент был затем разрезан Вд12 и ЕсоК1 для выделения фрагмента вставки, содержавшего 3'-ИТК от НВкАд и район КВСрА.
р1У7450 был разрезан Вд12 и ЕсоК1 для получения фрагмента вектора, с которым был лигирован фрагмент вставки с образованием р1У7452.
(c) р1У7458 (СМУ (ША), 5'-ИТК НВкАд и КВСрА).
Вариант р1У7450, содержавший ΚΙΛ. был сконструирован следующим образом.
р1У7389 был разрезан ВатН1 для выделения фрагмента вставки, содержащего ША.
р1У7450 был разрезан ВатН1 для получения фрагмента вектора, с которым был лигирован фрагмент вставки с образованием р1У7458.
(б) р1У7468 (СМУ (ША), 3'-ИТК НВкАд, 5'-ИТК НВкАд и КВСрА).
Вариант р1У7458, содержавший 3'-ИТК НВкАд, был сконструирован следующим образом.
р1У7452 был разрезан Вд12 и ЕсоК1 для получения фрагмента вставки, содержавшего 3'-ИТК НВкАд и КВСрА.
р1У7458 был разрезан Вд12 и ЕсоК1 для получения фрагмента вектора, с которым был лигирован фрагмент вставки с образованием р1У7468.
Пример 4. Конструирование панелей векторов Ве1а-да1.
(a) р1У7488 (СМУ (без интрона), 3'-ИТК НВкАд, 5'-ИТК НВкАд и КВСрА).
СМУ-Ье1а (С1оп1есй) был размножен в ПЦР с праймерами ΙΕ335 (8ЕС ΙΌ N0: 27) и ΙΕ336 (8ЕС ΙΌ N0: 28) и разрезан NйеI и Вд12 для выделения фрагмента вставки, кодирующего бетагалактозидазу.
р1У7452 был разрезан NйеI и Вд12 для получения фрагмента вектора, с которым был лигирован фрагмент вставки с образованием р1У7488.
(b) р1У7533 (СМУ (без интрона), 5'-ИТК НВкАд и КВСрА.
р1У7450 был разрезан Вд12 и ЕсоК1 для выделения фрагмента вставки, содержавшего КВСрА. р1У7488 был разрезан Вд12 и ЕсоК1 для получения фрагмента вектора, с которым был лигирован фрагмент вставки с образованием р1У7533.
(c) р1У7551 (СМУ (ША^Ш), 3'-ИТК НВкАд, 5'-ИТК НВкАд и КВСрА).
р1У7530 (см. пример 5) был разрезан Х1о1 и ВатН1 для выделения фрагмента вставки, содержавшего участок от промотора СМУ до ША.
р1У7488 был разрезан Х1о1 и ВатН1 для получения фрагмента вектора, с которым был лигирован фрагмент вставки с образованием р1У7551.
(б) р1У7552 (СМУ (ША^Ш), 5'-ИТК НВкАд и КВСрА).
р1У7530 был разрезан Х1о1 и ВатН1 для выделения фрагмента вставки, содержавшего СМУ промотор через ША.
- 24 010056 рТУ7533 был разрезан Х1о1 и ВатН1 для получения фрагмента вектора, с которым был лигирован фрагмент вставки с образованием рТУ7552.
Пример 5. Конструирование экспрессирующих векторов рТУ (р1У7563).
(a) р1У7496.
р1У7389 был размножен в ПЦР с праймерами 1Е357 (8ЕО ΙΌ N0: 29) и 1Е365 (8Е0 ГО N0: 30), обработан Т4 ДНК-полимеразой для того, чтобы затупить концы, и разрезан 8а11 для выделения фрагмента вставки, кодирующего устойчивость к канамицину.
р1У7389 был разрезан Ауа1, обработан Т4 ДНК-полимеразой для затупления концов и разрезан 8а11 для выделения фрагмента вектора, с которым был лигирован фрагмент вставки с образованием р1У7496.
(b) р1У7530.
р1У7389 был размножен в ПЦР с праймерами 1Е393 (8Е0 ГО N0: 31) и 1Е406 (8Е0 ГО N0: 32) и разрезан Вд12 и ВатН1 для выделения фрагмента вставки, содержавшего К1А, лишенного внутреннего сайта №с1.
р1У7496 был разрезан ВатН1 для приготовления фрагмента вектора, с которым был лигирован фрагмент вставки с образованием р1У7530.
(c) р1У7549.
р1У7468 был разрезан ВатН1 и ЕсоК5 для выделения фрагмента вставки, содержавшего М2 и часть 3'ЕИН НВУ.
р1У7530 был разрезан ВатН1 и ЕсоК5 для приготовления фрагмента вектора, с которым был лигирован фрагмент вставки с образованием р1У7549.
(б) р1У7563.
Праймеры 1Е256 (8Е0 ГО N0: 33) и 1Е 257 (8Е0 ГО N0: 34) были подвергнуты отжигу для того, чтобы приготовить фрагмент вставки, содержащий множественный сайт для клонирования.
р1У7549 был разрезан М1е1 и Вд12 для приготовления фрагмента вектора, с которым был лигирован фрагмент вставки с образованием р1У7563. Карта плазмиды р1У7563 показана на фиг. 12. Состав оснований плазмиды р1У7563 показан на фиг. 13. Компоненты и их положение в плазмиде р1У7563 таковы: 1-44 - последовательности транспозона 903;
45-860 - кодирующая последовательность для устойчивости к канамицину от транспозона 903;
861-896 - последовательности транспозона 903;
897-902 - сайт 8а11;
903-1587 - промотор СМУ;
1588-1718 - нетранслируемая лидерная последовательность предраннего гена СМУ;
1719-1724 - слияние рестрикционных ферментов ВатН1 и Вд111;
1725-1857 - интрон А инсулина крысы;
1858-1863 - сайт ВатН1;
1864-1984 - 5'-нетранслируемый лидер поверхностного антигена НВУ;
1985-1993 - синтетический стартовый кодон/сайт М1е1 для клонирования;
1994-2011 - синтетические сайты для клонирования;
2012-2544 - энхансер НВУ;
2545-2555 - бывшая последовательность вектора. Не содержит совпадений с базами данных NСВI;
2556-2686 - участок полиаденилирования бета-глобина кролика;
2687-3759 - последовательность вектора рИС19.
Пример 6. Конструирование набора векторов, экспрессирующих сигнальные пептиды, с использованием в качестве модельных антигенов секретируемую щелочную фосфатазу (8ЕАР) человека и Ес-фрагмент иммуноглобулина человека.
(ί) р1У7507 (йТРАкр и 8ЕАР).
р8ЕАР-Ьа§1с (С1оп1ес11) был размножен в ПЦР с праймерами ΙΕ320 (8Е0 ГО N0: 35) и 1Е321 (8Е0 ГО N0: 36), затем разрезан с помощью М1е1 и Вд12 для выделения фрагмента вставки, содержащей фрагмент 8ЕАР человека.
р1У7079 (Маск11п, е1 а1.) был разрезан М1е1 и Вд12 для приготовления фрагмента вектора, с которым был лигирован фрагмент вставки с образованием р1У7507.
(й) р1У7508 (йТРАзр и 1Ес).
ДНК человека была размножена в ПЦР с праймерами 1Е386 (8Е0 ГО N0: 37) и ЕсА8 (8Е0 ГО N0: 38), затем разрезана М1е1 и Вд12 для выделения фрагмента вставки, содержащего Ес-фрагмент иммуноглобулина человека.
р1У7079 был разрезан М1е1 и Вд12 для приготовления фрагмента вектора, с которым был лигирован фрагмент вставки с образованием р1У7508.
(ίίί) Приготовление последовательности, кодирующей сигнальный пептид апротинина.
Синтетический олигонуклеотид 1Е354 (8Е0 ГО N0: 39) был размножен в ПЦР с праймерами 1Е355 (8Е0 ГО N0: 40) и 1Е356 (8Е0 ГО N0: 41) для получения последовательности, кодирующей сигнальный пептид апротинина.
(ίν) Приготовление последовательности, кодирующей сигнальный пептид экстенсина табака.
- 25 010056
Синтетический олигонуклеотид ΙΕ348 (8Е0 ΙΌ N0: 42) был размножен в ПЦР с праймерами ΙΕ349 (8Е0 ΙΌ N0: 43) и ΙΕ350 (8Е0 ΙΌ N0: 44) для получения кодирующей последовательности для сигнального пептида экстенсина табака.
(ν) Приготовление последовательности, кодирующей сигнальный пептид лизоцима кур.
Синтетический олигонуклеотид ΙΕ351 (8Е0 ΙΌ N0: 45) был размножен в ПЦР с праймерами ΙΕ352 (8Е0 ΙΌ N0: 46) и ΙΕ353 (8Е0 ΙΌ N0: 47) для получения кодирующей последовательности для сигнального пептида лизоцима кур.
(a) Панели сигнального пептида антигена Е1и М2:
р1У7499 (СМУ (без интрона), 5'-ИТК НВкАд, КВСрА, с.п. апротинина), р1У74 97 (СМУ (без интрона), 5'-ИТК НВкАд, КВСрА, с.п. экстенсина табака), р1У7500 (СМУ (без интрона), 5'-ИТК НВкАд, КВСрА, с.п. лизоцима кур).
Кодирующие последовательности для сигнальных пептидов были разрезаны 8ре1 и ΜκΙ для выделения фрагментов вставок.
р1У7450 был разрезан ΜκΙ для приготовления фрагмента вектора, с которым были лигированы фрагменты вставок с образованием р1У7499 (апротинин), р1У7497 (экстенсин табака) и р1У7500 (лизоцим кур).
(b) Панели сигнального пептида 8ЕАР:
р1У7513 (СМУ (без интрона), 5'-ИТК НВкАд, КВСрА, с.п. апротинина), р1У7512 (СМУ (без интрона), 5'-ИТК НВкАд, КВСрА, с.п. экстенсина табака), р1У7510 (СМУ (без интрона), 5'-ИТК НВкАд, КВСрА, с.п. лизоцима кур).
р1У7499, 7497 и 7500 были разрезаны Х1о1 и ΜκΙ для выделения фрагментов вставок, включавших в себя участки плазмид от промотора СМУ до кодирующей последовательности сигнального пептида.
р1У7507 был разрезан Х1ю1 и ΜκΙ для приготовления фрагмента вектора, с которым были лигированы фрагменты вставок с образованием р1У7513 (апротинин), р1У7512 (экстенсин табака) и р1У7510 (лизоцим кур).
(c) Панели сигнального пептида 1Ес:
р1У7524 (СМУ (без интрона), 5'-ИТК НВкАд, КВСрА, с.п. апротинина), р1У7525 (СМУ (без интрона), 5'-ИТК НВкАд, КВСрА, с.п. экстенсина табака), р1У7526 (СМУ (без интрона), 5'-ИТК НВкАд, КВСрА, с.п. лизоцима кур).
р1У7499, 7497 и 7500 были разрезаны Х1ю1 и ΜκΙ для выделения фрагментов вставок, включавших в себя участки плазмид от промотора СМУ до кодирующей последовательности сигнального пептида.
р1У7508 был разрезан Х1о1 и ΜκΙ для приготовления фрагмента вектора, с которым были лигированы фрагменты вставок с образованием р1У7524 (апротинин), р1У7525 (экстенсин табака) и р1У7526 (лизоцим кур).
Пример 7. Конструирование панелей секретируемой щелочной фосфатазы человека (8ЕАР).
(a) р1У7531 (СМУ (без интрона), 5'-ИТК НВкАд, КВСрА, с.п. лизоцима кур).
р1У7510 был разрезан 8а11 и Вд12 для выделения фрагмента вставки, включавшей в себя участок от промотора СМУ до сигнального пептида лизоцима.
р1У7450 был разрезан 8а11 и Вд12 для получения фрагмента вектора, с которым был лигирован фрагмент вставки с образованием р1У7531.
(b) р1У7554 (СМУ (ША/ЫМ), 5'-ИТК НВкАд, КВСрА, с.п. лизоцима кур).
р1У7530 был разрезан Х1о1 и ВатН1 для выделения фрагмента вставки, включавшей в себя участок от промотора СМУ до ΒΙΛ.
р1У7531 был разрезан Х1о1 и ВатН1 для получения фрагмента вектора, с которым был лигирован фрагмент вставки с образованием р1У7554.
(c) р1У7568 (СМУ (без интрона), 3'-ИТК НВкАд, 5'-ИТК НВкАд, КВСрА, с.п. лизоцима кур). р1У7563 был разрезан Вд12 и ЕсоК1 для выделения фрагмента вставки, содержавшей 3'-ИТК НВУ и
КВСрА.
р1У7531 был разрезан Вд12 и ЕсоК1 для получения фрагмента вектора, с которым был лигирован фрагмент вставки с образованием р1У7568.
(й) р1У7572 (СМУ (КТА/КЬе]:), 3'-ИТК НВкАд, 5'-ИТК НВкАд, КВСрА, с.п. лизоцима кур).
р1У7563 был разрезан Вд12 и ЕсоК1 для выделения фрагмента вставки, содержавшей 3'-ИТК НВУ и КВСрА.
р1У7554 был разрезан Вд12 и ЕсоК1 для получения фрагмента вектора, с которым был лигирован фрагмент вставки с образованием р1У7572.
Пример 8. Конструирование векторов Ве!а-да1 и НВкАд с использованием интронов кератина кур и сердечного актина кур.
(а) р1У7557 (Ве!а-да1, СМУ (интрон актина кур), 3'-ИТК НВкАд, 5'-ИТК НВкАд и КВСрА).
ДНК кур была размножена в ПЦР с праймерами ΙΕ430 (8Е0 ΙΌ N0: 48) и ΙΕ442 (8Е0 ΙΌ N0: 49) и разрезана Вд12 и ВатН1 для выделения фрагмента вставки, содержавшей последовательности интрона и фланкирующего экзона сердечного актина кур.
р1У7488 был разрезан ВатН1 для приготовления фрагмента вектора, с которым был лигирован
- 26 010056 фрагмент вставки с образованием р1У7557.
(b) р1У7558 (Ве!а-да1, СМУ (интрон кератина кур), 3'-ИТВ НВкАд, 5'-ИТВ НВкАд и ВВОрА).
ДНК кур была размножена в ПЦР с праймерами ΙΕ421 (8Εβ ΙΌ N0: 50) и ΙΡ444 (8Εβ ΙΌ N0: 51) и разрезана Вд12 и ВатН1 для выделения фрагмента вставки, содержавшей последовательности интрона и фланкирующего экзона гена кератина кур.
р1У7488 был разрезан ВатН1 для приготовления фрагмента вектора, с которым был лигирован фрагмент вставки с образованием р1У7558.
(c) р1У7578 (НВкАд, СМУ (интрон актина кур), 3'-ИТВ НВкАд, 5'-ИТВ НВкАд и ВВОрА).
р1У7557 был разрезан 8а11 и ВатН1 для выделения фрагмента вставки, содержавшей промотор СМУ и участки интронов.
р1У7496 был разрезан 8а11 и ВатН1 для приготовления фрагмента вектора, с которым был лигирован фрагмент вставки с образованием р1У7558.
(б) р1У7579 (НВкАд, СМУ (интрон кератина кур), 3'-ИТВ НВкАд, 5'-ИТВ НВкАд и ВВОрА).
р1У7558 был разрезан 8а11 и ВатН1 для выделения фрагмента вставки, содержавшей промотор СМУ и участки интронов.
р1У7496 был разрезан 8а11 и ВатН1 для приготовления фрагмента вектора, с которым был лигирован фрагмент вставки с образованием р1У7579.
Пример 9. Анализ Ш-Уйго экспрессии антигена панелью векторов НВкАд.
В первый день клетки линий 8СС15 (АТСС) или В16 (происхождение неизвестно, варианты имеются в АТСС) рассаживали в 6-луночные культуральные планшеты с плотностью 20-40% конфлуэнтности и подращивали в течение ночи в инкубаторе.
Хозяйские клетки размножали в средах, рекомендованных АТСС.
На второй день проводили реакцию трансфекции. Для каждого вектора, подлежащего тестированию, 20 мкл реагента ЫроГесбп® (ЫГе ТесЬпо1од1е§ Шс, Огапб [51апН, КУ) добавляли к 130 мкл среды 0рбтет® (ЬгГе ТесЬпо1од1е8 Шс, Огапб [51апб, ИУ) и инкубировали при комнатной температуре в течение 45 мин. Для каждого тестируемого вектора 2 мкг вектора смешивали с 200 мкл 0рбтет® на 40-й мин. На 45-й мин инкубации растворы вектора и ЫроГесбп смешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение еще 10 мин. Во время этой окончательной инкубации клетки-хозяева извлекали из инкубатора и дважды промывали средой 0рбтет®. По прошествии 10 мин 1,6 мл 0рбтет® добавляли к смеси Ь1роГес1атте® и вектора и 1 мл получившейся смеси добавляли к каждой из двух лунок с клетками. Хозяйские клетки возвращали в инкубатор и не тревожили в течение 5 ч, после чего смесь ЫроГес1атте®/вектор удаляли и заменяли стандартной средой для поддержания клеток.
Через 18-24 ч после смены среды из культуральных планшетов отбирали 50-100 мкл среды для поддержания клеток и анализировали ее на экспрессию антигена путем помещения образцов в реакционные флаконы, содержащие Аυ8ΖΥМΕ®.
Моноклональный диагностический набор (АЬЬоб ЬаЬога1опе8, АЬЬоН Рагк, ГЬ).
Объем тестируемых образцов был доведен до 200 мкл буфером РВ8, затем в каждый образец были добавлены 50 мкл конъюгата и реакционных гранул. Флакон инкубировали в течение 80 мин при 40°С, после чего стенки были отмыты от всех жидких реакционных компонентов. Гранулы переносили в новые пробирки, после чего добавляли 300 мкл буфера для развития цветной реакции. Через 30 мин цветную реакцию останавливали добавлением 1 М серной кислоты и измеряли оптическое поглощение реакционной смеси при длине волны 490 нм. Данные, представленные на фиг. 1, - это среднее значение показаний поглощения для двух лунок из двух экспериментов.
Как показано на фиг. 1, добавление ША, 3'-ИТВ НВУ или обоих элементов к исходному вектору (промотор СМУ, экзон и участок полиаденилирования) увеличивало экспрессию НВ 5Ад в клетках 8СС15. Как показано на фиг. 2, добавление интрона или кератина кур или сердечного актина кур к исходному вектору (промотор СМУ, экзон, 3'-ИТВ НВУ и участок полиаденилирования) увеличивало экспрессию НВкАд в клетках 8СС15.
Пример 10. Анализ Ιπ-Уйго экспрессии антигена панелью векторов Ве!а-да1.
Хозяйские клетки 88С15 и В16 были трансфицированы, как описано в примере 9.
Через 18-40 ч после смены среды супернатанты среды удаляли и клетки промывали РВ8. После удаления промывающего раствора клетки лизировали инкубацией в 500 мкл буфера для лизиса (50 мМ NаР04, 0,1% Тгйоп Х-100, рН 7) в течение 5 мин, затем физически соскабливали клетки с пластиковой чашки. Лизаты центрифугировали в течение 2 мин для удаления остатков клеток и по 10-25 мкл осветленного лизата добавляли к 500 мкл реакционного буфера (80 мкг/мл о-нитрофенилгалактопиранозид, 50 мМ NаР04, рН 7) и инкубировали при 37°С в течение 10-20 мин. Реакцию останавливали добавлением 500 мкл 1 М №ьС0з и снимали показания при длине волны 405 нм. Данные представлены в виде отношения экспрессии улучшенного (содержащего интрон, НВУепй, или оба элемента) вектора к экспрессии исходного вектора.
- 27 010056
Добавление К1А, 3'-ИТК НВУ или обоих элементов к исходному вектору (промотор СМУ, экзон и участок полиаденилирования) увеличивало экспрессию Ье!а-да1 в обеих клеточных линиях. Результаты для клеток 8СС15 показаны на фиг. 3. Добавление интрона или кератина кур или сердечного актина кур к исходному вектору (промотор СМУ, экзон, 3'-ИТК НВУ и участок полиаденилирования) увеличивало экспрессию Ье!а-да1 в обеих клеточных линиях. Результаты для клеток В16 показаны на фиг. 2.
Пример 11. Анализ 1п-УИго экспрессии антигена панелью векторов Н8У дЭ.
Хозяйские клетки 8СС15 или В16 были трансфицированы, как описано в примере 9. Через 18 ч после трансфекции планшеты помещали на 15 мин на лед. Каждую лунку затем промывали 2 мл РВ8 (ВщуЫйакег, Ша1кегуШе, МО). Затем клетки фиксировали 0,05% глютаральдегидом (Ро1у5аепсе5 1пс, Шатпд1оп, РА), разведенным на РВ8, и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Все последующие инкубации продолжались в течение 1 ч при комнатной температуре и клетки промывали между инкубациями, как указано выше. Планшеты блокировали с 2 мл 5% сухого молока (Вю-Яай ЬаЬога1опе8, МеМ11е, ΝΥ) на РВ8. За этим следовали инкубации с 1 мл раствора моноклональных антител анти-дЭ (АВ1, Со1ишЫа, МО) в разведении 1:1000 в 2% сухом молоке/РВ8/0,05% Т\уееп-20 (81дша, 8!.Ьош5, МО) и 1 мл раствора козьих антимышиных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена (КРЬ, СаййегкЬигд, МО) в разведении 1:2500 на РВ8/0,1% Т\уееп-20. Цветное окрашивание развивалось с помощью 1 мМ ТМВ субстрата для микропланшетов (ВюЕХ, Оушдк МИк, МО). Реакции останавливали 1 М Н28О4, жидкость переносили в пластиковые кюветы и измеряли оптическую плотность при длине волны 450 нм. Данные представлены в виде отношения экспрессии улучшенного (содержащего интрон, НВУепН, или оба элемента) вектора к экспрессии исходного вектора.
Добавление ША, с или без, 3'-ИТК НВМ к исходному вектору (промотор СМУ, экзон и участок полиаденилирования) увеличивало экспрессию Н8УдЭ в обеих клеточных линиях. Результаты для клеток 8СС15 показаны на фиг. 4.
Пример 12. Анализ 1и-Уйго экспрессии антигена панелью векторов 8ЕАР.
Клетки 8СС15 или В16 были трансфицированы, как описано в примере 9. Через 18-40 ч после смены среды кондиционированные среды отбирали и прогревали при 70°С в течение 30 мин. По 10-25 мкл инактивированных нагреванием супернатантов инкубировали в течение 5 мин с 1/10 объема 100 мМ Ι-гомоаргинина. Затем к лизатам добавляли 500 мкл реакционного буфера для щелочной фосфатазы (кат. № 172-1063, Вю-Яай, приготовленный в соответствии с инструкциями) и инкубировали при 37°С в течение 10-20 мин. Реакцию останавливали добавлением 500 мкл 1 М №ЮН и снимали показания при 405 нм. Данные представлены в виде отношения экспрессии улучшенного (содержащего интрон, НВУепН или оба элемента) вектора к экспрессии исходного вектора или отношения экспрессии экспериментальных сигнальных пептидов к экспрессии вектора с сигнальным пептидом ТРА человека.
Как показано на фиг. 5, добавление ΕΙΛ. 3'-ИТК НВУ или обоих элементов к исходному вектору (промотор СМУ, экзон и участок полиаденилирования) увеличивало экспрессию 8ЕАР в клетках В16. Неожиданно оказалось, что добавление одного только 3'-ИТК НВУ к исходному вектору (промотор СМУ, экзон и участок полиаденилирования) увеличивало экспрессию 8ЕАР в клетках 8СС15.
Добавление сигнальных пептидов от апротинина быка, лизоцима кур или экстенсина табака на Νконец зрелой 8ЕАР приводило к эффективной секреции 8ЕАР в культуральную среду в обеих клеточных линиях. Результаты для клеток В16 показаны на фиг. 6.
Пример 13. Анализ Ш-Уйго экспрессии антигена панелью сигнального пептида Ес-фрагмента иммуноглобулина С человека.
Хозяйские клетки 8СС15 или В16 были трансфицированы, как описано в примере 9. Кондиционированные среды были отобраны через 18-40 ч после смены среды.
Планшеты для ЕЬ18А (Сойаг) инкубировали в течение ночи при 4°С со 100 мкл на лунку раствора козьих антител против иммуноглобулинов С человека (81дша #13382, разведение 1/1000 в карбонатном буфере для нанесения). Все последующие инкубации продолжались в течение 1 ч при комнатной температуре с промыванием между инкубациями (10 мМ Трис, 150 мМ №С1, 0,1% Вгу-35, рН 8,0). Лунки блокировались 100 мкл 5% сухого молока на РВ8, затем инкубировались с серийными разведениями кондиционированных сред в буфере для разведения (2% сухое молоко, РВ8, 0,05% Туееп-20). После этого следовала инкубация с 100 мкл на лунку раствора козьих антител против иммуноглобулинов С человека, конъюгированных с пероксидазой хрена (81дша #А6029, разведение 1:5000 в буфере для разведения), и затем развивалась цветная реакция при добавлении 100 мкл ТМВ субстрата для микропланшетов. Реакции останавливали 100 мкл 1 М Н28О4 и считывали показания при 450 нм. Данные представлены в виде отношения экспрессии экспериментальных сигнальных пептидов к экспрессии вектора с сигнальным пептидом ТРА человека.
Добавление сигнальных пептидов от или апротинина быка, или лизоцима кур, или экстенсина табака на Ν-конец Ес-фрагмента человека делало возможным эффективную секрецию НЕс в культуральную среду для обеих линий клеток. Результаты для клеток В16 показаны на фиг. 6.
- 28 010056
Пример 14. Использование плазмидных экспрессирующих векторов НВхАд. Н8УдО и Е1ц-М2 для иммунизации мышей.
a) Приготовление патронов иммунизации.
Для каждой тестируемой плазмиды в микроцентрифужную пробирку взвешивали 25 мг 2-микронного золотого порошка. После добавления 250 мл порции 50 мМ спермидина (А1бпс11 Сйетюа1 1пс. Мб\уаикее. XVI) пробирку встряхивали и быстро обрабатывали ультразвуком. Золото осаждали в микроцентрифуге. а спермидин заменяли на свежую 100-мкл порцию. Золото ресуспендировали встряхиванием. после чего в пробирку добавляли 25 мкг ДНК и перемешивали. При легком встряхивании добавляли 100 мкл 10% СаС1 (Еирката И8А. 1пс. Оеегйе1б. 1Ь) для осаждения ДНК на гранулы золота. Реакция преципитации проводилась на столе в течение 10 мин. после чего золото собирали быстрым центрифугированием и три раза промывали абсолютным этанолом (8рес1гит ОнаШу Ргобисй. 1пс. Сагбепа. СА) для удаления избытка преципитирующих реагентов. Промытый комплекс золота с ДНК затем ресуспендировался в З.6 мл 0.05 мг/мл поливинилпирролидона (З60 КО. 8ресйит ОнаШу Ргобисй. 1пс. Сагбепа. СА) в абсолютном этаноле. Эта взвесь затем вводилась в ТеГхе1а пробирку (МсМа^ег-Сагг. СН1садо. 1Ь). помещенную во вращатель пробирок (Ро^бег бес1 Уассшех). который изнутри покрывал ТеГхе1а пробирку комплексом золота с ДНК. После окончания процедуры покрытия пробирки она нарезалась на 0.5-дюймовые «дробинки» вакцины. которые загружались в ХВ1 устройство (Ро^бег бе1 Уассшех) для доставки в мышей.
b) Процедура вакцинации.
Мышей в возрасте от 4 до 6 недель анестезировали смесью Ке1а5е1а (Еой Ообде) и Вотрипа (Вауег). Кожу на животе выбривали электрической машинкой для удаления волос и два неперекрывающихся «заряда» вакцины посылались в выбритую область с помощью устройства ХВ1(450 р51). Животных возвращали в их клетки и отбирали у них образцы крови через 6 недель после вакцинации. Для оценки векторов. экспрессирующих НВхАд. использовали мышей Ва1Ь/с. для оценки векторов. экспрессирующих Н8У-дО и Е1ц-М2. использовали мышей 8\\%5 VеЬ5ΐе^.
Анализ сывороток на анти-НВхАд антитела.
Через 6 недель у вакцинированных животных отбирали образцы крови. Порцию сыворотки. выделенной из этих образцов. помещали в лунки реакционного планшета. снабженные АИ8АВ® Е1А диагностическим набором (АЬЬой ЬаЬога1опе5. АЬЬоН Рагк. 1Ь). Объем добавленной сыворотки зависел от титра антител в образце. и образец разводился буфером для разведения для того. чтобы попасть в диапазон значений. которые могли быть получены с помощью количественной панели. Из каждого флакона Аи8АВ® количественной панели (АЬЬой ЬаЬога1опе5. АЬЬой Рагк. 1Ь) 200 мкл добавляли к лункам реакционного планшета. К каждой лунке добавлялись гранулы. после чего планшет герметично закрывали и инкубировали при 40°С в течение 2 ч. Затем лунки отмывали от всех жидких реакционных компонентов. К каждой промытой лунке добавляли 200 мкл смеси конъюгата. после чего планшет герметично закрывали и инкубировали при 40°С в течение 2 ч. Затем лунки опять промывали от всех жидких реакционных компонентов. Гранулы переносили в чистые пробирки. после чего добавляли по З00 мкл буфера для развития цветной реакции. Через З0 мин цветную реакцию останавливали добавлением 1 М серной кислоты и измеряли поглощение реакционной смеси при 490 нм с помощью спектрофотометра ОиаШит II® (АЬЬой ЬаЬога1опе5. АЬЬой Рагк. 1Ь). Этот спектрофотометр рассчитывает уровень антител в образце путем сравнения поглощения образца со стандартной кривой. полученной на количественной панели. Эти уровни антител были затем скорректированы с учетом коэффициентов разведения. Данные. представленные на фиг. 7. представляют собой геометрически среднее значение титров всех животных. вакцинированных определенным вектором.
Анализ сывороток на антитела против антигена Е1ц-М2.
96-луночные Со51аг средней связывающей способностью ЕЫ8А планшеты (Е15Йег 8с1епййс. Р1Й5Ьигд. РА) покрывали синтетическим пептидом Е1ц-М2 (РСВ/Вхохоигсе. Норкш1оп. МА) в концентрации 1 мкг/мл в РВ8 (Вю^Ыйакег. ’№а1кегуШе. МО) и инкубировали в течение ночи при 4°С. Планшеты промывали три раза 10 мМ Трисом (81дта. 81. Ьош5. МО)/150 мМ №1С1 (Е15Йег 8с1еийГ1с)/0.1% Вгу-З5 (81дта). затем блокировали 5% сухим молоком (Вю-Ваб ЬаЬога1опе5. МеМ11е. ΝΥ) в РВ8 в течение 1 ч при комнатной температуре. Все последующие инкубации проводили при комнатной температуре в течение 1 ч. между инкубациями промывали. как описано выше. Образец мышиной сыворотки. стандартный образец (высокий титр. мышиная сыворотка против М2) и отрицательный контроль (мышиная сыворотка против НВхАд) разводили 2% сухим молоком/РВ8/0.05% Т\уееп-20 (81дта) и инкубировали в ЕЫ8А планшетах. Затем следовали инкубации с козьими антимышиными иммуноглобулинами С (Н+Ь). конъюгированными с биотином (8ои111егп В^есНпоЦду А55ос1а1е. Впташдйат. ЛЬ). разведенными 1:8000 в 2% сухом молоке/РВ8/0.05% Т\уееп-20. и с конъюгатом пероксидазы хрена со стрептавидином (8ои111егп В^есНпоЦду). разведенным 1:8000 в РВ8/0.1% Т\уееп-20. Цветная реакция развивалась с ТМВ субстратом (ВюЕХ. О\уш§5 М1115. МО). Реакции останавливали 1 М Н28О4 и снимали показания при 450 нм с помощью прецезионного ридера для микропланшетов (Мо1еси1аг Оеуюех. 8иηиуνа1е. СА). Программа 8ойМах Рго 4.1 (Мо1еси1аг Ое\зсе5) была использована для вычисления предельных значений
- 29 010056 титров с использованием анализа по четырем параметрам. Титры были нормализованы относительно стандартной сыворотки, которая имела заранее определенный титр, для того чтобы свести к минимуму вариации от анализа к анализу и от планшета к планшету. Результаты показаны на фиг. 7.
Анализ сывороток на антитела против антигена Н8УдО.
96-луночные Сок1аг средней связывающей способности ЕЫ8А планшеты (ПкНег 8с1епййс, Р1йкЬигд, РА) покрывали белком Н8УдЭ (У1га1 ТНегареийск, Ийаса, ΝΥ) в концентрации 1 мкг/мл в РВ8 (ВюуЫйакег, ^а1кегуй1е, МО) и инкубировали в течение ночи при 4°С. Планшеты промывали три раза 10 мМ Трисом (81дта, 81. Ьошк, МО)/150 мМ №1С1 (ПкНег 8скпй£к)/0,1% Вгу-35 (81дта), затем блокировали 5% сухим молоком (Вю-Вай ЬаЬога1опек, МеМ11е, ΝΥ) в РВ8 в течение 1 ч при комнатной температуре. Все последующие инкубации проводили при комнатной температуре в течение 1 ч, между инкубациями промывали, как описано выше. Образец мышиной сыворотки, стандартный образец (высокий титр, мышиная сыворотка против др) и отрицательный контроль (мышиная сыворотка против НВкАд) разводили 2% сухим молоком/РВ8/0,05% Т\уееп-20 (81дта) и инкубировали в ЕЫ8А планшетах. Затем следовали инкубации с козьими антимышиными иммуноглобулинами О (Н+Ь), конъюгированными с биотином (8ои111егп Вю1есНпо1оду Аккос1а1е. ВпгатдНат, АЬ), разведенными 1:8000 в 2% сухом молоке/РВ8/0,05% Туееп-20, и с конъюгатом пероксидазы хрена со стрептавидином (8ои111егп Вю1есНпо1оду), разведенным 1:8000 в РВ8/0,1% Т\уееп-20. Цветная реакция развивалась с ТМВ субстратом (ВюГХ, О\утдк М111к, МО). Реакции останавливали 1 М Н28О4 и снимали показания при 450 нм с помощью прецезионного ридера для микропланшетов (Мо1еси1аг Эе^'кек, 8иппууа1е, СА). Программа 8ойМах Рго 4.1 (Мо1еси1аг Оеу1сек) была использована для вычисления предельных значений титров с использованием анализа по четырем параметрам. Титры были нормализованы относительно стандартной сыворотки, которая имела заранее определенный титр, для того чтобы свести к минимуму вариации от анализа к анализу и от планшета к планшету. Результаты показаны на фиг. 7.
Таким образом, описаны новые конструкции нуклеиновых кислот, композиции, содержащие эти конструкции, и методы иммунизации нуклеиновыми кислотами с использованием этих конструкций. Несмотря на то что предпочтительные варианты осуществления изобретения были описаны в деталях, должно быть понятно, что могут быть сделаны очевидные изменения без отступления от смысла и границ применения изобретения, как определено приложенной формулой изобретения.

Claims (48)

1. Конструкция нуклеиновой кислоты, включающая в себя:
(ί) последовательность химерного промотора, которая содержит:
(a) последовательность предраннего промотора НСМУ, (b) экзон 1 и по меньшей мере часть экзона 2 основного предраннего гена НСМУ и (c) гетерологичный интрон, расположенный на месте участка интрона А в основном предраннем гене НСМУ;
(ίί) кодирующую последовательность в функциональной связи с химерным промотором;
(ίίί) нетранслируемую лидерную последовательность, которую выбирают из последовательности НВУ пре-82-антигена, последовательности НВУ е-антигена или последовательности антигена Н8У типа 2дЦ и которая находится в функциональной связи с химерным промотором;
(ίν) последовательность энхансера, которая получена из 3'-нетранслируемой области (ИТВ) последовательности НВкАд или последовательности предраннего гена СМУ обезьян, которая находится в функциональной связи с химерным промотором и которая расположена после кодирующей последовательности.
2. Конструкция нуклеиновой кислоты по п.1, в которой:
(ί) последовательность предраннего промотора НСМУ (а) содержит 8ЕЦ ΙΌ NО: 1, ее функциональный вариант, по меньшей мере на 80% ей гомологичный, или функциональный фрагмент той или другой и/или (ίί) последовательность экзона (Ь) содержит 8ЕЦ ΙΌ NО: 2, ее функциональный вариант, по меньшей мере на 80% ей гомологичный, или функциональный фрагмент одной из них.
3. Конструкция нуклеиновой кислоты по п.1 или 2, в которой гетерологичный интрон (с) включает в себя последовательность, выбранную из последовательности интрона А гена инсулина крыс, последовательности интрона А гена кератина кур и последовательности интрона А гена сердечного актина кур, функциональный вариант, по меньшей мере на 80% гомологичный указанной последовательности интрона А, и функциональный фрагмент указанной последовательности интрона А или ее указанный функциональный вариант.
4. Конструкция нуклеиновой кислоты по п.3, где последовательность интрона А гена инсулина крыс содержит 8ЕЦ ΙΌ NО: 3, ее функциональный вариант по меньшей мере с 80% гомологией или функциональный фрагмент одной из них.
5. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, в которой:
(ί) нетранслируемую лидерную последовательность выбирают из 8ЕЦ ΙΌ NО: 5, 8ЕЦ ΙΌ NО: 6, 8ЕЦ
- 30 010056
ΙΌ N0: 7, функционального варианта, по меньшей мере на 80% гомологичного любой из 8Е0 ΙΌ N0: 5-7, или функционального фрагмента любой из 8Е0 ΙΌ N0: 5-7 или их указанного варианта; и/или (ίί) последовательность энхансера выбирают из 8Е0 ΙΌ N0: 8, 8Е0 ΙΌ N0: 9, функционального варианта, по меньшей мере на 80% гомологичного 8Е0 ΙΌ N0: 8 или 8Е0 ΙΌ N0: 9, или функционального фрагмента 8Е0 ΙΌ N0: 8 или 8Е0 ΙΌ N0: 9 или их указанного варианта.
6. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, которая содержит:
(ί) последовательность полиаденилирования и/или (ίί) последовательность, кодирующую сигнальный пептид.
7. Конструкция нуклеиновой кислоты по п.6, в которой:
(ί) последовательность полиаденилирования представляет собой последовательность полиаденилирования гена, выбранного из гена β-глобина кролика, раннего или позднего гена вируса папилломы человека (НРУ), гена Н8У-2дВ, предраннего гена СМУ обезьян и позднего гена Н8УдП, функционального варианта, по меньшей мере на 80% гомологичного любой из указанных последовательностей, или функционального фрагмента любой из указанных последовательностей полиаденилирования или их указанного варианта; и/или (ίί) сигнальный пептид выбирают из сигнального пептида тканевого активатора плазминогена человека (ИТР Акр), сигнального пептида апротинина, сигнального пептида экстенсина табака, сигнального пептида лизоцима кур, функционального варианта с гомологией, составляющей по меньшей мере 80% по отношению к любой из указанных последовательностей или функциональному фрагменту любой из указанных последовательностей, кодирующих сигнальный пептид, или их указанный функциональный вариант.
8. Конструкция нуклеиновой кислоты по п.7, в которой последовательность полиаденилирования выбирают из 8Е0 ΙΌ N0: 10, 8Е0 ΙΌ N0: 11, 8Е0 ΙΌ N0: 12, 8Е0 ΙΌ N0: 13, функционального варианта, по меньшей мере на 80% гомологичного любой из 8Е0 ΙΌ N0: 10-13, или функционального фрагмента любой из 8Е0 ΙΌ N0: 10-13 или их указанного варианта.
9. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, в которой кодирующая последовательность кодирует антиген.
10. Конструкция нуклеиновой кислоты по п.9, в которой антиген является антигеном вирусного, бактериального, паразитарного или грибкового патогена, аллергическим антигеном или раковым антигеном.
11. Конструкция нуклеиновой кислоты по п.10, в которой вирусный антиген представляет собой антиген НРУ, ШУ, Н8У1, Н8У2, вируса гриппа, вируса гепатита А или вируса гепатита В.
12. Конструкция нуклеиновой кислоты по п.11, в которой антиген представляет собой НВкАд.
13. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-8, в которой кодирующая последовательность кодирует АЭР рибозилирующую бактериальную субъединицу А и/или В, активный гомолог одной или обеих указанных субъединиц, где каждый гомолог имеет по меньшей мере 80% гомологию с соответствующей указанной субъединицей или активным фрагментом указанной субъединицы или ее указанного активного гомолога.
14. Конструкция нуклеиновой кислоты по п.13, в которой бактериальную субъединицу выбирают из субъединицы А холерного токсина, субъединицы В холерного токсина, субъединицы А теплолабильного токсина Β^ο1ί, субъединицы В теплолабильного токсина Е.сο1^, активного гомолога, имеющего по меньшей мере 80% гомологию с любой из указанных субъединиц или с активным фрагментом любой из указанных субъединиц или указанных активных гомологов.
15. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, которая представляет собой ДНК плазмиды.
16. Покрытые частицы, подходящие для доставки из устройства для опосредованной частицами доставки, причем частицы содержат несущие частицы, покрытые конструкцией нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов.
17. Покрытые частицы по п.16, где частицы носителя являются золотыми или вольфрамовыми.
18. Дозирующая емкость для устройства для опосредованной частицами доставки, содержащая покрытые частицы по п.16 или 17.
19. Устройство для опосредованной частицами доставки, заряженное покрытыми частицами по п.16 или 17.
20. Устройство для опосредованной частицами доставки по п.19, которое представляет собой безыгольный шприц.
21. Фармацевтический препарат, содержащий конструкцию нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-15 и фармацевтически приемлемый наполнитель.
22. Вакцина, содержащая конструкцию нуклеиновой кислоты по любому из пп.9-12.
23. Вакцина по п.22, дополнительно содержащая конструкцию адъюванта по п.13 или 14.
24. Способ 1п νίίτο получения экспрессии представляющих интерес полипептидов в клетках млекопитающих, причем способ включает в себя перенос в указанные клетки конструкции нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-15 или покрытых частиц по п.16 или 17.
- 31 010056
25. Применение конструкции нуклеиновой кислоты по любому из пп.9-12 в производстве лекарственных средств для иммунизации.
26. Применение по п.25, где лекарственное средство предназначено для иммунизации против инфицирования патогеном, аллергии или рака.
27. Применение по п.25 или 26, где лекарственное средство предназначено для доставки путем инъекции, чрескожной доставки частиц, ингаляции, местной, пероральной, интраназальной доставки или доставки через слизистую оболочку.
28. Применение по п.27, где конструкцию доставляют путем безыгольной инъекции.
29. Конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность химерного промотора и кодирующую последовательность в функциональной связи с химерным промотором, где последовательность химерного промотора содержит:
(a) последовательность предраннего промотора ЙСМУ;
(b) экзон 1 и по меньшей мере часть экзона 2 основного предраннего гена ЙСМУ и (c) гетерологичный интрон, расположенный на месте участка интрона А в основном предраннем гене ЙСМУ.
30. Конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая:
(ί) последовательность промотора;
(ίί) кодирующую последовательность, функционально связанную с последовательностью промотора (1); и (ΐϊϊ) 3'-последовательность энхансера, функционально связанную с кодирующей последовательностью (ΐΐ);
в которой последовательность энхансера (ίίί) является производной от 3'-ИТК последовательности НВкАд или 3'-ИТК последовательности предраннего гена СМУ обезьян и кодирующая последовательность (ίί) является гетерологичной по отношению к последовательности энхансера.
31. Конструкция нуклеиновой кислоты по п.30, в которой последовательность промотора (1) выбирают из последовательности предраннего промотора ЙСМУ, последовательности промотора вируса псевдобешенства и последовательности промотора вируса саркомы Рауса.
32. Конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая:
(ί) последовательность промотора;
(ίί) нетранслируемую лидерную последовательность, полученную из последовательности пре-82антигена НВУ, последовательности е-антигена НВУ или последовательности дЭ-антигена Н8У типа 2; и (ίίί) кодирующую последовательность, функционально связанную с (ί) и (ίί), где кодирующая последовательность гетерологична нетранслируемой лидерной последовательности.
33. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из пп.29-32, где кодирующие последовательности кодируют антиген, как определено в любом из пп.9-12, или АЭР-рибозилирующую бактериальную субъединицу, активный гомолог или активный фрагмент, как определено по п.13 или 14.
34. Очищенная изолированная последовательность химерного промотора, которая содержит:
(a) последовательность предраннего промотора ЙСМУ;
(b) экзон 1 и по меньшей мере часть экзона 2 основного предраннего гена ЙСМУ и (c) гетерологичный интрон, расположенный на месте участка интрона А в основном предраннем гене ЙСМУ.
35. Покрытые частицы, подходящие для доставки из устройства для опосредованной частицами доставки, причем частицы содержат несущие частицы, покрытые конструкцией нуклеиновой кислоты по любому из пп.29-33.
36. Покрытые частицы по п.35, где частицы носителя являются золотыми или вольфрамовыми.
37. Дозирующая емкость для устройства для опосредованной частицами доставки, содержащая покрытые частицы по п.35 или 36.
38. Устройство для опосредованной частицами доставки, заряженное покрытыми частицами по п.35 или 36.
39. Устройство для опосредованной частицами доставки по п.38, которое представляет собой безыгольный шприц.
40. Фармацевтический препарат, содержащий конструкцию нуклеиновой кислоты по любому из пп.29-33 и фармацевтически приемлемый наполнитель.
41. Вакцина, содержащая конструкцию нуклеиновой кислоты по п.33, которая кодирует антиген.
42. Вакцина по п.41, дополнительно содержащая добавочную конструкцию по п.34, которая кодирует АЭР-рибозилирующую бактериальную субъединицу, ее активный гомолог или ее активный фрагмент.
43. Способ ίπ νίίτο получения экспрессии представляющих интерес полипептидов в клетках млекопитающего, включающий в себя перенос в указанные клетки конструкции нуклеиновой кислоты по любому из пп.29-33 или покрытых частиц по п.35 или 36.
44. Применение конструкции нуклеиновой кислоты по п.33, которая кодирует антиген, в производстве лекарственного средства для иммунизации.
- 32 010056
45. Применение по п.44, где лекарственное средство предназначено для иммунизации против инфицирования патогеном, аллергии или рака.
46. Применение по п.44 или 45, где лекарственное средство предназначено для доставки путем инъекции, чрескожной доставки частиц, ингаляции, местной, пероральной, интраназальной доставки или доставки через слизистую оболочку.
47. Применение по п.46, где конструкцию доставляют путем безыгольной инъекции.
48. Конструкция нуклеиновой кислоты, включающая в себя:
(1) последовательность химерного промотора, которая содержит:
(a) последовательность предраннего промотора НСМУ, (b) экзон 1 и по меньшей мере часть экзона 2 основного предраннего гена НСМУ и (c) гетерологичный интрон, расположенный на месте участка интрона А в основном предраннем гене НСМУ;
(ΐΐ) сайт клонирования для вставки кодирующей последовательности в функциональной связи с химерным промотором;
(ϊίί) нетранслируемую лидерную последовательность, которую выбирают из последовательности пре-82-антигена НВУ, последовательности е-антигена НВУ и последовательности дО-антигена Н8У типа 2 и которая находится в функциональной связи с химерным промотором; и (ΐν) последовательность энхансера, которая получена из 3'-нетранслируемой области (1ТИ) последовательности НВзАд или последовательности предраннего гена СМУ обезьян, которая находится в
EA200600746A 2003-10-10 2004-10-11 Конструкции нуклеиновых кислот EA010056B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US50993603P 2003-10-10 2003-10-10
PCT/GB2004/004279 WO2005035771A2 (en) 2003-10-10 2004-10-11 Nucleic acid constructs

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200600746A1 EA200600746A1 (ru) 2006-10-27
EA010056B1 true EA010056B1 (ru) 2008-06-30

Family

ID=34435038

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200600746A EA010056B1 (ru) 2003-10-10 2004-10-11 Конструкции нуклеиновых кислот

Country Status (21)

Country Link
US (1) US8663657B2 (ru)
EP (1) EP1685251B1 (ru)
JP (1) JP4814099B2 (ru)
KR (2) KR101225395B1 (ru)
CN (1) CN1890375B (ru)
AU (1) AU2004279991B2 (ru)
BR (1) BRPI0415204A (ru)
CA (1) CA2542288A1 (ru)
DK (1) DK1685251T3 (ru)
EA (1) EA010056B1 (ru)
ES (1) ES2457022T3 (ru)
IL (1) IL174848A (ru)
MX (1) MXPA06003978A (ru)
NO (1) NO20062080L (ru)
NZ (1) NZ546554A (ru)
PL (1) PL1685251T3 (ru)
PT (1) PT1685251E (ru)
SG (1) SG147430A1 (ru)
SI (1) SI1685251T1 (ru)
WO (1) WO2005035771A2 (ru)
ZA (1) ZA200603685B (ru)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2651498C2 (ru) * 2012-03-27 2018-04-19 Кьюрвак Аг Молекулы искусственной нуклеиновой кислоты
RU2658490C2 (ru) * 2012-03-27 2018-06-21 Кьюрвак Аг Искусственные молекулы нуклеиновых кислот для улучшенной экспрессии белков или пептидов
RU2660565C2 (ru) * 2012-03-27 2018-07-06 Кьюрвак Аг Молекулы искусственной нуклеиновой кислоты, содержащие 5'utr гена top
RU2717986C2 (ru) * 2013-12-30 2020-03-27 Куревак Аг Искусственные молекулы нуклеиновой кислоты
US11254951B2 (en) 2014-12-30 2022-02-22 Curevac Ag Artificial nucleic acid molecules

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0507997D0 (en) * 2005-02-01 2005-05-25 Powderject Vaccines Inc Nucleic acid constructs
CA2624615A1 (en) * 2005-10-05 2007-04-19 Bayhill Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treatment of autoimmune disease
SG188882A1 (en) 2008-07-23 2013-04-30 Boehringer Ingelheim Pharma Novel regulatory elements
EP3403647A1 (en) * 2009-12-01 2018-11-21 Translate Bio, Inc. Delivery of mrna for the augmentation of proteins and enzymes in human genetic diseases
WO2012019630A1 (en) 2010-08-13 2012-02-16 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded protein
CN101993878B (zh) * 2010-10-14 2012-04-18 南京农业大学 一种rRNA嵌合启动子及含有该嵌合启动子的表达载体
US8853377B2 (en) 2010-11-30 2014-10-07 Shire Human Genetic Therapies, Inc. mRNA for use in treatment of human genetic diseases
RU2013154295A (ru) 2011-06-08 2015-07-20 Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк. КОМПОЗИЦИИ ЛИПИДНЫХ НАНОЧАСТИЦ И СПОСОБЫ ДЛЯ ДОСТАВКИ мРНК
WO2013120498A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded allergenic antigen or an autoimmune self-antigen
WO2013120500A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded tumour antigen
WO2013120499A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly (a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded pathogenic antigen
WO2013120497A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded therapeutic protein
EP2859102A4 (en) 2012-06-08 2016-05-11 Shire Human Genetic Therapies NUCLEASE RESISTANT POLYNUCLEOTIDES AND USES THEREOF
ES2540753T3 (es) * 2012-09-24 2015-07-13 Lonza Biologics Plc. Vectores de expresión que comprenden secuencias quiméricas de promotor y amplificador de citomegalovirus
WO2014102103A2 (en) 2012-12-31 2014-07-03 Boehringer Ingelheim International Gmbh Heterologous intron within a signal peptide
WO2014102104A1 (en) * 2012-12-31 2014-07-03 Boehringer Ingelheim International Gmbh Artificial introns
EP2938725B1 (en) 2012-12-31 2017-08-23 Boehringer Ingelheim International GmbH Heterologous intron within an immunoglobulin domain
WO2014102101A1 (en) * 2012-12-31 2014-07-03 Boehringer Ingelheim International Gmbh Novel intron sequences
LT2968586T (lt) 2013-03-14 2018-11-26 Translate Bio, Inc. Cft mrnr kompozicijos bei su jomis susiję būdai ir panaudojimai
ES2708561T3 (es) 2013-03-14 2019-04-10 Translate Bio Inc Métodos para la purificación de ARN mensajero
EA201690590A1 (ru) 2013-10-22 2016-12-30 Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк. ТЕРАПИЯ НЕДОСТАТОЧНОСТИ АРГИНИНОСУКЦИНАТ-СИНТЕТАЗЫ С ПОМОЩЬЮ мРНК
CA2928186A1 (en) 2013-10-22 2015-04-30 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Mrna therapy for phenylketonuria
CN103901209B (zh) * 2014-02-18 2016-05-25 王明丽 一种重组蛋白ie1包被酶标反应板的制备方法及定量检测人血浆hcmv中和抗体试剂盒
CN117402871A (zh) 2014-04-25 2024-01-16 川斯勒佰尔公司 信使rna的纯化方法
US10563222B2 (en) * 2014-06-18 2020-02-18 Agency For Science, Technology And Research Promoters for high level expression
US10611800B2 (en) 2016-03-11 2020-04-07 Pfizer Inc. Human cytomegalovirus gB polypeptide
WO2018157154A2 (en) 2017-02-27 2018-08-30 Translate Bio, Inc. Novel codon-optimized cftr mrna
MA49138A (fr) 2017-05-16 2020-03-25 Translate Bio Inc Traitement de la fibrose kystique par administration d'arnm à codons optimisés codant pour la cftr
WO2019060649A1 (en) * 2017-09-22 2019-03-28 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING HUNTINGTON'S DISEASE
KR20210060480A (ko) 2018-08-24 2021-05-26 트랜슬레이트 바이오 인코포레이티드 전령 rna의 정제 방법
US11629172B2 (en) 2018-12-21 2023-04-18 Pfizer Inc. Human cytomegalovirus gB polypeptide
US11857622B2 (en) 2020-06-21 2024-01-02 Pfizer Inc. Human cytomegalovirus GB polypeptide

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999003981A1 (en) * 1997-07-17 1999-01-28 Ppl Therapeutics (Scotland) Limited Nucleic acid expression constructs incorporating a heterologous intron whose natural position is within the 5'untranslated region of its gene
CA2425852A1 (en) * 2000-10-13 2002-04-18 Chiron Corporation Cytomegalovirus intron a fragments
WO2002036792A2 (en) * 2000-11-06 2002-05-10 Glaxo Group Limited Dna expression vectors
WO2003011334A1 (en) * 2001-07-27 2003-02-13 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccine comprising gp120 and nef and/or tat for the immunisation against hiv

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3431140A1 (de) * 1984-08-24 1986-03-06 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Enhancer fuer eukaryotische expressionssysteme
US5100792A (en) * 1984-11-13 1992-03-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues
US5168062A (en) * 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
TW404844B (en) * 1993-04-08 2000-09-11 Oxford Biosciences Ltd Needleless syringe
CA2158733C (en) * 1994-01-21 2007-01-16 Dennis E. Mccabe Gas driven gene delivery instrument
EP0740704A1 (en) 1994-01-27 1996-11-06 University Of Massachusetts Medical Center Immunization by inoculation of dna transcription unit
EP0836482B1 (en) * 1995-05-24 2002-11-13 Hawaii Biotechnology Group, Inc. Subunit vaccine against flavivirus infection
US6110707A (en) * 1996-01-19 2000-08-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant expression of proteins from secretory cell lines
US20020106635A1 (en) 1998-05-27 2002-08-08 Bruce Freimark Cytokine resistant cytomegalovirus promoter mutants and related products and methods
WO2000023592A2 (en) 1998-10-19 2000-04-27 Powderject Vaccines, Inc. Minimal promoters and uses thereof
EP1257583A2 (en) 2000-02-08 2002-11-20 The University Of Virginia Patent Foundation METHODS FOR THE PREVENTION AND TREATMENT OF INFECTIONS USING ANTI-C3b(i) ANTIBODIES
US20030124523A1 (en) * 2000-06-22 2003-07-03 Asselbergs Fredericus Alphonsus Maria Organic compounds
AU2001297988B2 (en) 2000-11-27 2006-10-26 Powderject Vaccines, Inc. Nucleic acid adjuvants
US7264810B2 (en) * 2001-01-19 2007-09-04 Cytos Biotechnology Ag Molecular antigen array
WO2002094313A2 (en) 2001-05-18 2002-11-28 Powderject Vaccines, Inc. Vaccine composition
WO2005035779A2 (en) 2003-10-10 2005-04-21 Powderject Vaccines, Inc Method
GB0507997D0 (en) * 2005-02-01 2005-05-25 Powderject Vaccines Inc Nucleic acid constructs

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999003981A1 (en) * 1997-07-17 1999-01-28 Ppl Therapeutics (Scotland) Limited Nucleic acid expression constructs incorporating a heterologous intron whose natural position is within the 5'untranslated region of its gene
CA2425852A1 (en) * 2000-10-13 2002-04-18 Chiron Corporation Cytomegalovirus intron a fragments
WO2002036792A2 (en) * 2000-11-06 2002-05-10 Glaxo Group Limited Dna expression vectors
WO2003011334A1 (en) * 2001-07-27 2003-02-13 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccine comprising gp120 and nef and/or tat for the immunisation against hiv

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LOSER P. et al. Evaluation of promoters for use in hepatic gene therapy, Biol. Chem. HOPPE Seyler. 1996 Mar; 377 (3): 187-93, referat [on-layn] [naydeno 20.09. 2006]. Naydeno iz bazy dannykh PubMed, PMID: 8722320 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2651498C2 (ru) * 2012-03-27 2018-04-19 Кьюрвак Аг Молекулы искусственной нуклеиновой кислоты
RU2658490C2 (ru) * 2012-03-27 2018-06-21 Кьюрвак Аг Искусственные молекулы нуклеиновых кислот для улучшенной экспрессии белков или пептидов
RU2660565C2 (ru) * 2012-03-27 2018-07-06 Кьюрвак Аг Молекулы искусственной нуклеиновой кислоты, содержащие 5'utr гена top
US10080809B2 (en) 2012-03-27 2018-09-25 Curevac Ag Artificial nucleic acid molecules comprising a 5′TOP UTR
RU2750261C2 (ru) * 2012-03-27 2021-06-25 Кьюрвак Аг Искусственные молекулы нуклеиновых кислот для улучшенной экспрессии белков и пептидов
RU2717986C2 (ru) * 2013-12-30 2020-03-27 Куревак Аг Искусственные молекулы нуклеиновой кислоты
US11254951B2 (en) 2014-12-30 2022-02-22 Curevac Ag Artificial nucleic acid molecules

Also Published As

Publication number Publication date
AU2004279991B2 (en) 2010-11-25
PL1685251T3 (pl) 2014-07-31
ES2457022T3 (es) 2014-04-24
MXPA06003978A (es) 2006-06-27
US8663657B2 (en) 2014-03-04
IL174848A (en) 2011-06-30
ZA200603685B (en) 2007-09-26
EP1685251B1 (en) 2014-03-05
NO20062080L (no) 2006-05-09
KR20060125742A (ko) 2006-12-06
CN1890375A (zh) 2007-01-03
US20080160048A1 (en) 2008-07-03
DK1685251T3 (en) 2014-03-24
KR101234981B1 (ko) 2013-02-21
JP4814099B2 (ja) 2011-11-09
PT1685251E (pt) 2014-04-15
SI1685251T1 (sl) 2014-05-30
EA200600746A1 (ru) 2006-10-27
WO2005035771A3 (en) 2005-08-25
KR101225395B1 (ko) 2013-01-28
AU2004279991A1 (en) 2005-04-21
NZ546554A (en) 2009-04-30
BRPI0415204A (pt) 2006-12-05
IL174848A0 (en) 2006-08-20
KR20110120364A (ko) 2011-11-03
SG147430A1 (en) 2008-11-28
EP1685251A2 (en) 2006-08-02
CA2542288A1 (en) 2005-04-21
CN1890375B (zh) 2011-12-07
JP2007509607A (ja) 2007-04-19
WO2005035771A2 (en) 2005-04-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA010056B1 (ru) Конструкции нуклеиновых кислот
JP3250802B2 (ja) 脊椎動物における外因性ポリヌクレオチド配列の発現
ES2228467T3 (es) Particulas terapeuticas de fosfato calcico y metodos de fabricacion y su uso.
US6235523B1 (en) Vectors for DNA immunization against cervical cancer
EA011557B1 (ru) Конструкции нуклеиновых кислот
CN108472354A (zh) 呼吸道合胞病毒疫苗
HU230364B1 (hu) Simian adenovírus nukleinsav és aminosav-szekvencia, azt tartalmazó vektorok, és eljárások annak alkalmazására
WO2021042944A1 (zh) 肌肉靶向的微环dna基因治疗
CN111979268A (zh) 一种高表达mhc-i且具有靶向肝脏潜能的肝肿瘤细胞分泌的外泌体及其制备方法
US20070269451A1 (en) Nucleic Acid Vaccination
US20090011036A1 (en) Drug containing hollow protein nanoparticles of particle-forming protein, fused with disease-treating target-cell-substance
US20230151387A1 (en) Covid-19 vaccine based on the myxoma virus platform
JP2003061693A (ja) ウイルス様粒子、その製造方法およびその使用
US20230414742A1 (en) Novel vaccine for preventing and treating merkel cell carcinoma
JP2000201682A (ja) タンパク質のタ―ゲッティングに使用するためのタンパク質断片
WO2006073503A1 (en) Therapeutic calcium phosphate particles for use in inhibiting expression of a gene
WO2024159517A1 (zh) 一种乙型肝炎mRNA及其疫苗与用途
CN108864300A (zh) 鸡白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白、制备方法及其编码基因、一种鸡长效干扰素
WO2024108955A1 (zh) 乙型肝炎疫苗
US20050026257A1 (en) Production and applications for polyvalent vaccines against diseases caused by papilloma viruses
RU2280691C2 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pCI-neo-ODC-nsP1 И ЕЕ ВАРИАНТЫ pCI-neo-ODC-E2-L И pCI-neo-ODC-E2-M, КОДИРУЮЩИЕ БЕЛКИ ВИРУСА ВЕНЕСУЭЛЬСКОГО ЭНЦЕФАЛОМИЕЛИТА ЛОШАДЕЙ И БЕЛОК ОРНИТИНДЕКАРБОКСИЛАЗЫ, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЕ ДЛЯ РАЗРАБОТКИ СРЕДСТВ ПРОФИЛАКТИКИ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ (НА ПРИМЕРЕ ВИРУСА ВЭЛ)
CN116802282A (zh) 经修饰的基孔肯雅病毒和辛德毕斯病毒及其用途
CN118001384A (zh) 一种非洲猪瘟mRNA疫苗组合及其应用
RU2190018C2 (ru) Молекулярный вектор для доставки генов в клетки-мишени
JPWO2003004065A1 (ja) Ｒｘｐ繰り返し配列を有するタンパク質を用いた生理的高分子の輸送方法

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU