CN1890375A - 核酸构建体 - Google Patents

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Abstract

一种核酸构建体，含有嵌合启动子序列和用于***与嵌合启动子有效连接的编码序列的克隆位点，其中，嵌合启动子序列包括：(a)hCMV立即早期启动子序列；(b)hCMV主要立即早期基因的外显子1和至少一部分外显子2；(c)置换hCMV主要立即早期基因的内含子A区的异源内含子。

Description

核酸构建体
                        技术领域
本发明涉及分子生物学和免疫学领域，一般还涉及用于核酸免疫接种的试剂。更具体地，本发明涉及表达抗原多肽的核酸构建体，还涉及使用这类试剂进行核酸免疫接种的方法。
                        背景技术
基因治疗和核酸免疫接种在治疗和预防获得性和遗传性疾病上是颇有发展前景的方法。这类技术能将所需核酸转移到受试者内，并随后在体内表达。转移可通过离体转染来自受试者的细胞或组织，并将转化物质再导入宿主中完成。或者，可将核酸直接给药到受试者体内。
这类技术中的每种技术均要求核酸在转染细胞中高效表达，以提供足量的治疗基因产物或抗原基因产物。已知几种因子影响到表达水平，包括转染率，以及所研究基因或序列转录和mRNA翻译的效率。
本领域已描述多种表达***，每种表达***一般都由含所研究基因或核苷酸序列的载体组成，该基因或核苷酸序列与表达调控序列有效连接。这类调控序列包括转录启动子序列和转录起始和终止序列。一般用于哺乳动物细胞表达***的启动子包括SV40早期启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子，如CMV立即早期启动子(Chapman et al(1991)Nucl.Acids Res. 19：3979-3986)、小鼠乳腺癌病毒长末端重复(LTR)启动子、腺病毒主要晚期启动子(Ad MLP)以及单纯疱疹病毒(HSV)启动子等。通常也使用非病毒启动子，如来源于鼠金属硫蛋白基因的启动子。
表达***通常包括转录调制元件，即指“增强子”。增强子被广义定义为顺式作用序列(cis-acting agent)，它在同启动子/基因序列有效连接时，将会提高该基因序列的转录。增强子离所研究序列的有效作用距离比其他表达调控元件(如启动子)要远很多，并且可位于所研究序列的任何方向(Banerji et al.(1981)Cell  27：299-308，deVilleirs etal.(1981)Nucl.Acids Res. 9：6251-6264)。增强子已从多种病毒源中被识别出来，包括多形瘤病毒(polyoma virus)、BK病毒(BK virus)、巨细胞病毒(cytomegalovirus virus，CMV)、腺病毒(adenovirus)、猿猴病毒40(simian virus 40，SV40)、莫洛尼肉瘤病毒(Moloney sarcomavirus)、牛***状瘤病毒(bovine papilloma virus)和劳氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)(deVilleirs et al同上，Rosenthal et al.(1983)Science  222：749-755，Hearing et al.(1983)Cell  33：695-703，Weeks et al.(1983)Mol.Cell.Biol. 3：1222-1234，Levinson et al.(1982)Nature295：568-572，和Luciw et al.(1983)Cell  33：705-716)。
许多用于核酸免疫接种和基因治疗的表达***均使用hCMV立即早期启动子。见如授权予Stinski的美国专利No.5168062和5385839，和欧洲专利说明书0323997B1。使用hCMV立即早期启动子的表达载体包括，例如pWRG7128(Roy et al，Vaccine  19，764-778，2001)和pBC12/CMV和pJW4303(在WO95/20660中提及)。Chapman et al(1991)已报道：不含hCMV内含子A时，hCMV立即早期启动子表达量降低。
                        发明内容
使用可控(manipulated)病毒启动子/表达序列已开发出一种核酸构建体，它使宿主细胞中的异源编码序列表达得以提高。该构建体适合抗原编码基因的高效表达，因此能使用于核酸免疫接种中。特别地，该构建体能提供到载体颗粒上，用于颗粒介导的核酸免疫接种。
因此，本发明提供一种核酸构建体，它包含嵌合启动子序列和***与嵌合启动子有效连接的编码序列的克隆位点，其中，该嵌合启动子序列包括：
(a)hCMV立即早期启动子序列；
(b)hCMV主要立即早期基因的外显子1和至少一部分外显子2；和
(c)置换hCMV主要立即早期基因的内含子A区的异源内含子。
本发明还提供：
—一种核酸构建体，其包括：
(i)嵌合启动子序列，其包括：
(a)hCMV立即早期启动子序列；
(b)hCMV主要立即早期基因的外显子1和至少一部分外显子2；和
(c)置换hCMV主要立即早期基因的内含子A区的异源内含子；和
(ii)***与嵌合启动子有效连接的编码序列的克隆位点；和
(iii)(a)非翻译前导序列，其来源于HBV preS2抗原序列、HBV e-抗原序列或HSV型2gD抗原序列，并与嵌合启动子有效连接；和/或
(b)增强子序列，其来源于HBsAg序列的3′非翻译区(UTR)，或猿CMV立即早期基因序列的3′UTR，并与嵌合启动子有效连接，其中，增强子序列位于克隆位点下游；
—一种核酸构建体，其包括：
(i)启动子序列；
(ii)非翻译前导序列，其来源于HBV preS2抗原序列、HBV e-抗原序列或HSV型2gD抗原序列；和
(iii)有效连接于(i)和(ii)的编码序列
其中，编码序列对非翻译前导序列是异源的；
—一种核酸构建体，其包括：
(i)启动子序列；
(ii)编码序列，其与启动子序列(i)有效连接；和
(iii)增强子序列，位于编码序列(ii)的3′端，并与之有效连接；
其中，增强子序列(iii)来源于HBsAg序列的3′UTR或猿CMV立即早期基因序列的3′UTR，并且编码序列(ii)对3′端增强子序列是异源的；
—一种在哺乳动物细胞中表达所研究多肽的方法，该方法包括将本发明的核酸构建体转移到所述细胞中，该构建体包括编码所述多肽的编码序列；
—适合于由颗粒介导的释放装置释放的包被颗粒，该包被颗粒包括由本发明的核酸构建体包被的载体颗粒，该构建体包括编码所述多肽的编码序列；
—用于颗粒介导的释放装置的剂量容器，包含包被颗粒；
—一种负载包被颗粒的颗粒介导的释放装置；
—一种核酸免疫接种的方法，包括给予受试者有效剂量的包被颗粒，在颗粒中编码序列编码抗原；
—一种经纯化、分离的嵌合启动子序列，其包括：
(a)hCMV立即早期启动子序列；
(b)hCMV主要立即早期基因的外显子1和至少一部分外显子2；和
(c)置换hCMV主要立即早期基因的内含子A区的异源内含子。
由于在此公开，本发明上述和其他主题、方面、实施方案和优点易于呈现给本领域普通技术人员。
                        附图说明
图1示出使用多种质粒表达载体获得的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的表达水平。
图2示出加入内含子对SCC15细胞中HBsAg和B16细胞中β-gal表达的影响(三次实验的平均值)。
图3示出大鼠胰岛素内含子A和HBV3′UTR对SCC15细胞中β-gal表达的影响(三次实验的平均值)。
图4示出大鼠胰岛素内含子A和HBV3′UTR对SCC15细胞中HSVgD表达的影响(三次实验的平均值)。
图5示出大鼠胰岛素内含子A和HBV3′UTR对SCC15和B16细胞中SEAP表达的影响(每个细胞系重复三次)。
图6示出异源信号肽指导B16细胞中SEAP或hFc片段分泌的能力。
图7示出使用包含于多种质粒表达载体的抗原编码核酸免疫接种的小鼠血清中检测到的抗体水平。
图8是pJV表达载体的示意图。
图9是pJV7389的示意图。
图10是pJV7400的示意图。
图11是pJV7468的示意图。
图12是pJV7563的示意图。
图13列出pJV7563的碱基组成。
                       序列说明
SEQ ID NO：1是hCMV立即早期启动子序列(GenBank#M60321，X17403)。
SEQ ID NO：2是hCMV主要立即早期基因的外显子1和2的序列(GenBank#M60321，X17403)。
SEQ ID NO：3是大鼠胰岛素内含子A的序列(GenBank#J00748)。
SEQ ID NO：4是本发明的嵌合启动子的序列。
SEQ ID NO：5是HBV preS2抗原5′UTR序列的前导序列(GenBank#M54923)。
SEQ ID NO：6是HSV型2gD 5′UTR序列的前导序列(GenBank#Z86099)。
SEQ ID NO：7是HBV e抗原5′UTR序列的前导序列(GenBank#M54923)。
SEQ ID NO：8是HBVenh 3′UTR的序列(GenBank#AF143308)。
SEQ ID NO：9是猿立即早期基因3′UTR的序列(GenBank#M16019)。
SEQ ID NO：10是兔β-珠蛋白的聚腺苷酸序列(GenBank#K03256)。
SEQ ID NO：11是猿sCMV立即早期基因的聚腺苷酸序列(GenBank#M16019)。
SEQ ID NO：12是HSV2 gB基因的聚腺苷酸序列(GenBank#Z86099)。
SEQ ID NO：13是HPV16早期基因的聚腺苷酸序列(GenBank#K02718)。
SEQ ID NO：14是pJV表达载体的序列
SEQ ID NO：15是PCR引物JF93
SEQ ID NO：16是PCR引物F110
SEQ ID NO：17是PCR引物GW1
SEQ ID NO：18是PCR引物JF254
SEQ ID NO：19是PCR引物GW150
SEQ ID NO：20是PCR引物JF255
SEQ ID NO：21是PCR引物DS1
SEQ ID NO：22是PCR引物DA1
SEQ ID NO：23是PCR引物JF301
SEQ ID NO：24是PCR引物JF302
SEQ ID NO：25是PCR引物JF84
SEQ ID NO：26是PCR引物JF225
SEQ ID NO：27是PCR引物JF335
SEQ ID NO：28是PCR引物JF336
SEQ ID NO：29是PCR引物JF357
SEQ ID NO：30是PCR引物JF365
SEQ ID NO：31是PCR引物JF393
SEQ ID NO：32是PCR引物JF406
SEQ ID NO：33是PCR引物JF256
SEQ ID NO：34是PCR引物JF257
SEQ ID NO：35是PCR引物JF320
SEQ ID NO：36是PCR引物JF321
SEQ ID NO：37是PCR引物JF386
EQ ID NO：38是PCR引物FcAS
SEQ ID NO：39是寡核苷酸JF354
SEQ ID NO：40是PCR引物JF355
SEQ ID NO：41是PCR引物JF356
SEQ ID NO：42是寡核苷酸JF348
SEQ ID NO：43是PCR引物JF349
SEQ ID NO：44是PCR引物JF350
SEQ ID NO：45是寡核苷酸JF351
SEQ ID NO：46是PCR引物JF352
SEQ ID NO：47是PCR引物JF353
SEQ ID NO：48是PCR引物JF430
SEQ ID NO：49是PCR引物JF442
SEQ ID NO：50是PCR引物JF421
SEQ ID NO：51是PCR引物JF444
SEQ ID NO：52是伪狂犬病病毒(PRV)启动子序列
SEQ ID NO：53是劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子序列
                     发明内容
在详细描述本发明前，应该理解的是：本发明并不限定于特别示例的分子或者方法参数，因其毫无疑问地可有多种变化形式。同样应该理解的是：本文所用术语只是出于描述本发明具体实施方案的目的，而非意在限制。另外，若无另外指出，本发明的实施将采用病毒学、微生物学、分子生物学、重组DNA技术和免疫学中的常规方法，所有这些方法为本领域普通技术人员所熟知。这些技术在文献中有完整的描述，见如Sambrook等人编著的《分子克隆：实验室手册》(第二版，1989)(Sambrook，et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2nd Edition，1989))，《DNA克隆：一种实验方法》第I卷和II卷(DNACloning：A Practical Approach，vol.I & II(D.Glover，ed.))，《寡核苷酸合成》(Oligonucleotide Synthesis(N.Gait，ed.，1984))，《分子克隆实验指南》(A Practical Guide to Molecular Cloning(1984))和《基础病毒学》第二版第I卷和II卷(Fundamental Virology，2nd Edition，vol.I &II(B.N.Fields and D.M.Knipe，eds.))。
本文所引用的全部出版物、专利和专利申请，不管是上文还是下文，均在此通过引用全文纳入本说明书中。
必须注意的是：如在说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式的“一”、“一种”和“该”包括复数指代对象，除非上下文中另外明确指出。
A.定义
若无另外定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有本发明所属技术领域普通技术人员通常理解的相同含义。尽管许多与本文所描述的相似或等同的方法和材料可用于本发明的实施，但本文只描述了优选的材料和方法。
在描述本发明中将使用如下术语，并被定义为具有如下含义。
在本文中，术语“核酸免疫接种”用来指将编码一个或多个所选抗原的核酸分子导入宿主细胞中，以实现抗原在体内表达。核酸分子可直接导入受试者，如通过标准的肌肉注射或皮内注射、透皮颗粒释放、吸入、局部给药、或通过口服、鼻腔或粘膜方式给药。或者，分子也可在体外导入从受试者取出的细胞中。在后一种情况下，含有所研究核酸分子的细胞被再导入受试者，这样针对核酸分子编码抗原的免疫应答得以启动。在该免疫接种中所使用的核酸分子在本文中一般指“核酸疫苗”。
术语“佐剂”是指能特异性或非特异性改变、提高、引导、再引导、增强或启动抗原特异的免疫应答的物质或组合物。因此，佐剂和抗原的共同给药能使给予抗原的受试者获得所需免疫应答必要的抗原剂量降低或减少，或者，共同给药也能在受试者内产生在定性和/或定量上不同的免疫应答。特别地，佐剂的给予能增强免疫应答，如增大强度和/或延长持续时间。通过以下方法测定佐剂效果：将佐剂和疫苗组合物，以及疫苗组合物本身给予动物，并且通过使用标准检测方法如放射免疫法、ELISA，和CTL分析，比较两组抗体和/或细胞介导的免疫性。
“核心载体”是指被客体核酸(guest nucleic acid)(如DNA、RNA)包被的载体，是为给予规定的颗粒大小和足够高的密度，以获得穿入细胞膜所需动量。因此客体分子能使用颗粒介导的技术被释放(见如美国专利No.5,100,792)。核心载体一般包括如钨、金、铂、铁氧体、聚苯乙烯和乳胶的物质。见如《基因转移的粒子轰击技术》(ParticleBombardment Technology for Gene Transfer，(1994)Yang，N.ed.，OxfordUniversity Press，New York，NY pages 10-11)。
“无针注射器”是指一种仪器，它不借助于常规的针来穿刺皮肤就能透皮释放微粒组合物。本发明所使用的无针注射器会在本文中详细说明。
术语“透皮”释放是指皮内(如进入真皮或表皮)、透皮(如“经皮肤的”)和跨粘膜给药，如，通过将试剂注入或穿过皮肤或粘膜组织释放。见，如Transdermal Drug Delivery：Developmental Issues and ResearchInitiatives，Hadgraft and Guy(eds.)，Marcel Dekker，Inc.，(1989)；Controlled Drug Delivery：Fundamentals and Applications，Robinson andLee(eds.)，Marcel Dekker Inc.，(1987)；和Transdermal Delivery of Drugs，Vols.1-3，Kydonieus and Berner(eds.)，CRC Press，(1987)。因此，本术语包括从无针注射器释放(在美国专利No.5,630,796中描述)和颗粒介导的释放(在美国专利No.5,865,796中描述)中释放。
“多肽”在最广义上被用来指两个或多个氨基酸亚基、氨基酸类似物，或其它假肽(peptidomimetics)的化合物。该亚基可通过肽键或其它键，如脂键、醚键等连接。在本文中使用的术语“氨基酸”指天然的和/或非天然的或合成的氨基酸，包括甘氨酸和两种D型或L型旋光异构体，和氨基酸类似物和假肽。如果肽链较短，三个或多个氨基酸的肽一般被称为寡肽。如果肽链较长，该肽一般被称为多肽或蛋白。
“抗原”指任何物质，一般指大分子，它能在个体中引发免疫应答。该术语可用来指单个大分子或指一组同质或异质的抗原大分子。本文中使用的“抗原”一般用来指包含一个或多个表位的蛋白分子或其一部分。基于本发明的目的，抗原可从任何合适的来源中获得或得到。另外，基于本发明的目的，“抗原”包括经修饰的蛋白，如天然序列的缺失、***和置换(一般在本质上是保守的)，只要蛋白保持足够的免疫原性。这些修饰可是刻意的，如通过定向诱变，或者也可是偶然的，如通过产生抗原的宿主的突变。
针对所研究抗原的“免疫应答”是在个体中产生针对该抗原的体液和/或细胞免疫应答。基于本发明的目的，“体液免疫应答”是指由抗体分子介导的免疫应答，而“细胞免疫应答”是指由T-淋巴细胞和/或其它白细胞介导的免疫应答。
术语“核酸分子”和“多核苷酸”在本文中互换使用，指任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物)的聚合形式。多核苷酸可具有任何三维结构，并能发挥任何已知或未知的功能。多核苷酸的非限制性实例包括基因、基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA，核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分枝多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。
多核苷酸一般由四种核苷酸碱基(腺嘌呤(A)，胞嘧啶(C)，鸟嘌呤(G)，和胸腺嘧啶(T)(当多核苷酸是RNA时为尿嘧啶(U)))的特定序列组成。因此，术语核酸序列是多核苷酸分子的字母表示。这种字母表示能输入具有中央处理单元的计算机的数据库中，用于生物信息学应用，如功能基因组学和同源性查询。
“载体”能将核酸序列转移到靶细胞(如病毒载体、非病毒载体、微粒载体和脂质体)。一般地，“载体构建体”“表达载体”和“基因转移载体”指任何能指导所研究基因的表达的核酸构建体，它能将基因序列转移到靶细胞。因此，该术语包括克隆和表达载体，以及病毒载体。“质粒”是由染色体外的遗传因子构成的载体。
“编码”所选抗原的核酸序列是指在合适的调节序列的调控下，在体内转录(在DNA的情况下)和翻译(在mRNA的情况下)成为多肽的核酸分子。编码序列的边界由5’端(氨基端)的起始密码子和3’端(羧基端)的翻译终止密码子决定。基于本发明的目的，这些核酸序列包括，但不限于病毒cDNA、原核或真核mRNA、病毒基因组序列或原核DNA或RNA，甚至还包括合成DNA序列。转录终止序列可位于编码序列的3’端。
“启动子”是启动和调节编码多肽的多核苷酸的转录的核苷酸序列。启动子包括诱导型启动子(与启动子有效连接的多核苷酸序列的表达被分析物、辅助因子、调节蛋白等诱导)、阻抑型启动子(与启动子有效连接的多核苷酸序列的表达被分析物、辅助因子、调节蛋白等阻抑)、和组成型启动子。术语“启动子”或“调控元件”包括全长启动子区和这些区域的功能(如调控转录或翻译)片段。
“有效连接”指元件的排列，其中以该术语描述的组分被装配以执行其一般功能。因此，与核酸序列有效连接的指定启动子在恰当的酶存在时能影响该序列的表达。启动子无需与该序列毗邻，只要其能指导该序列表达即可。因此例如，间隔的非翻译但被转录的序列可出现在启动子序列和核酸序列间，并且启动子序列仍然被认为与编码序列“有效连接”。
本文中“重组”是用来描述基因组、cDNA、半合成或合成来源的核酸分子(多核苷酸)，根据其来源或操作法，该核酸分子不与自然状态下与其连接的全部或部分多核苷酸连接，和/或与自然状态下不与其连接的多核苷酸连接。单个重组核酸分子中的两个核酸序列自然状态下一般彼此没有关联时，它们相对于彼此而言是“异源的”。
本文提到了多核苷酸的同源物。一般地，与另一多核苷酸同源的多核苷酸至少与该多核苷酸70％同源，优选至少80％或90％，并更优选至少与其95％、97％或99％同源。检测同源性的方法为本领域所熟知，并且本领域普通技术人员应该理解的是：在本文上下文中，同源性是以核酸的同一性为基础来计算的。该同源性可能存在于至少15个，优选至少30个，比如至少40个、60个或100个或更多个连续核苷酸的区域。
检测多核苷酸的同源性或同一性的方法已为本领域所熟知。如，UWGCG程序包提供了BESTFIT程序，它可用于计算同源性(如以默认设置使用)(Devereux et al(1984)Nucleic Acids Research 12.p387-395)。
PILEUP和BLAST算法也可用于计算同源性或比对序列(一般以默认设置)，如在Altschul S.F.(1993)J Mol Evol 36：290-300；Altschul，S，F etal(1990)J Mol Biol 215：403-10中描述。
执行BLAST分析的软件通过美国国家生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)可公开获得。该算法首先要识别高比值序列对(high scoring sequence pair，HSP)，这通过识别待查询的序列中长度为W的短字段实现，该字段在与数据库序列中相同长度的字段比对时，匹配或满足某些正值的阈得分T。T指相邻字段得分阈(Altschul etal，同上)。这些最初的相邻字段命中结果作为启动检索的种子，以查找含有它们的HSPs。字段命中结果沿每个序列的两个方向延伸，使累积比对得分尽量增加。出现以下情形即停止字段命中结果沿两个方向的延伸：当累积比对得分为零或小于零时，这是由于一个或多个负分残基比对的累积，或到达了任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的敏感性和速度。BLAST程序使用默认值：字段长度(W)为11，BLOSUM62得分矩阵(见Henikoff and Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-10919)比对值(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝4，两条链比较。
BLAST算法进行两个序列间相似性的统计分析，见如Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl，Acad.Sci.USA 90：5873-5787。由BLAST算法提供的相似性的一个量度是最小和概率(smallest sum probability(P(N)))，它提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间随机出现匹配的概率的指标。例如，若一个序列和另一个序列相比较时，最小和概率小于大约1，优选小于大约0.1，更优选小于大约0.01，最优选小于大约0.001，则第一个序列被认为同第二个序列是相似的。
同源物一般与相关的多核苷酸以显著高于本底的水平杂交。由同源物和多核苷酸间的相互作用所形成的信号水平一般强于“本底杂交”至少10倍，优选至少100倍。相互作用的强度可使用诸如放射性标记的探针来检测，如32P。选择性杂交一般通过使用中度到高度严格条件来实现，如，在大约50℃到大约60℃的0.03M氯化钠和0.003M柠檬酸钠的条件下。
严格杂交条件包括50％甲酰胺、5×Denhardt溶液、5×SSC、0.1％SDS和100μg/ml变性鲑精DNA，洗涤条件包括在37℃下2×SSC，0.1％SDS洗涤，随后在68℃下1×SSC，0.1％SDS洗涤。确定的合适的杂交条件已为本领域普通技术人员所熟知，见如Sambrook，et al.，同上.
同源物与相关多核苷酸中的序列不同在于少于3、5、10、15、20或更多个突变(每一种均可为置换、缺失或***)。这些突变可在同源物的至少30，比如至少40、60或100或更多个连续核苷酸的区域测定。在多核苷酸编码多肽处，优选地，置换在所编码的氨基酸中形成“保守”变化。保守变化根据下表定义。在保守变化中，第二列的同一区域的氨基酸，优选第三列的同一行的氨基酸彼此置换。
  脂肪族   非极性   GAP
  ILV
  极性-不带电   CSTM
  NQ
  极性-带电   DE
  KR
  芳香族   HFWY
在本文中互换使用的术语“个体”和“受试者”是指脊椎动物亚门(subphylum chordata)中的任一成员，包括但不限于人和其它灵长类，包括非人灵长类如黑猩猩以及其它猿和猴种；家畜如牛、绵羊、猪、山羊和马；驯养哺乳动物如狗和猫；实验动物包括啮齿类如小鼠、大鼠和豚鼠；鸟类，包括驯养鸟类，野生鸟类和诸如鸡、火鸡的猎鸟和其它鹑鸡类，鸭，鹅等等。本术语并不指特定年龄。因此，成年和新生个体均包括在内。由于所有这些脊椎动物的免疫***作用方式相似，因此本文中所描述的方法用于上述的脊椎动物种中的任一动物。
B.概述
本发明涉及核酸构建体，它为宿主细胞中的异源编码序列，特别是抗原编码基因的高效表达提供了可能。更具体地，本发明提供了核酸构建体，它包含嵌合启动子序列和克隆位点，或在某些具体实施方案中基本由嵌合启动子序列和克隆位点组成，因此在克隆序列***克隆位点时，克隆序列与嵌合启动子有效连接。
嵌合启动子包括，或在某些具体实施方案中基本由下列元件组成：
(a)hCMV立即早期启动子序列；
(b)hCMV主要立即早期基因的外显子1和至少一部分外显子2；和
(c)置换hCMV主要立即早期基因的内含子A区的异源内含子。
hCMV立即早期启动子序列(a)可包括：
(i)天然hCMV立即早期启动子序列；
(ii)其功能同源变体；或
(iii)(i)或(ii)的功能片段。
一般地，序列(a)包括大约100到600，优选200到600，例如400到600个核苷酸。一般地，序列(a)包括出现在(i)中的序列，它与转录因子或RNA聚合酶连接，或能与相同转录因子和RNA聚合酶连接的这些序列的同源物，而非这些序列。一般地，这些序列或其同源物以与(i)相同的顺序和/或基本相同的相对位置出现在启动子序列(a)中。
一般地，(i)包括hCMV主要立即早期基因至少从-100到-1，一般-150到-1，如-500到-1或-600到-1的核苷酸。序列(i)一般包括hCMV核心启动子序列，并且还包括hCMV立即早期启动子中的一个或多个增强子元件。例如，(i)可包括从-118到-1，或-524到-1的核苷酸(US6218140)或从-62到-1，或-465到-1的核苷酸(US 538 5839)。
一般地，(i)包括一般出现于启动子序列的TATA框或CAAT框。优选地，该序列包括hCMV立即早期启动子中的一个或多个重复序列。
在一个优选的实施方案中，(i)包括SEQ ID NO：1。
使用已知方法可获得hCMV立即早期启动子序列。使用标准技术，可直接从病毒样本中分离出天然的hCMV立即早期启动子，例如US5385839描述了hCMV启动子区的克隆。hCMV立即早期启动子序列可从Genebank#M60321(hCMV Towne株)和X17403(hCMV Ad169株)获得。因此，天然序列可通过使用基于已知序列的PCR引物，采用PCR分离得到。见如Sambrook et al，同上中用于获得和分离DNA的技术的描述。合适的hCMV启动子序列也可从现存质粒载体分离得到。启动子序列也可通过合成产生。
功能变体(ii)或片段(iii)一般可维持和/或补充天然启动子(i)的活性。一般地，这种活性是指引起(包括启动和调控)有效连接的多核苷酸，特别是hCMV主要立即早期基因的转录的能力。在一个实施方案中，片段的变体能补充hCMV病毒中的天然启动子的活性，比如允许病毒维持在细胞内感染和/或复制的能力。
可检测同源变体(ii)或片段(iii)维持和/或补充(i)的活性的能力。例如，可检测变体或片段恢复突变体hCMV功能(如感染和/或复制能力)的能力，在突变体中，天然hCMV立即早期启动子是缺损的。
同源变体(ii)或片段(iii)可使用下面的差异表达分析(ComparativeExpression Assay)检测其可用性。待测启动子序列被导入基本载体(basevector)中，置换天然hCMV立即早期启动子。一般地，功能变体或片段允许使用基本载体所提供的表达的至少50％，如，60％、70％、80％、90％或更高。一般地，表达发生在至少一种，但优选两种参照细胞类型中。一般地，参照细胞为哺乳动物HEK293T、CHO、HeLa、BHK、3T3或COS细胞。
另外或者作为另一种选择，下面的差异免疫原性分析(ComparativeImmunogenicity Assay)可检测启动子序列。待测启动子序列被导入基本载体中，置换天然hCMV立即早期启动子。功能启动子序列提供较基本载体获得的抗体滴度相同或较高的抗体滴度，其中该基本载体具有至少一个、优选两个抗原。优选地，抗体滴度较基本载体至少高5％、10％、20％、30％或40％。优选的抗原是HBsAg，HSV 2gD和flu-M2抗原。根据本检测，天然启动子序列(i)的功能同源变体(ii)或功能片段(iii)允许天然序列获得的最高抗体滴度。
如上所述，构建体可包括外显子序列(b)，它包括来源于hCMV主要立即早期基因的外显子1和外显子2的序列。外显子是编码序列，它们天然状态下一般被内含子分隔。在天然hCMV主要立即早期基因中，外显子1和2一般被天然内含子A分隔。在本发明的嵌合构建体中，外显子2序列一般位于外显子1序列3’端，没有内含子序列间隔，因此外显子1和外显子2序列是连续的。
外显子序列(b)可包括：
(i)天然外显子序列，一般为外显子1和(全部或部分)外显子2；
(ii)(i)的功能同源变体；或
(iii)(i)或(ii)的功能片段。
序列(i)可包括大约50％到100％的天然hCMV主要立即早期基因外显子1序列，如，60％到90％，或70％到80％。一般至少有50％的天然外显子1序列，如60％、70％、80％、90％或更多。外显子序列(b)也包括至少部分外显子2序列。在序列(i)中，一般有天然外显子2的两个或多个碱基，如2到9、2到7、或3到5个碱基。有最高达并且包括100％的天然外显子2序列，如5％到95％、20％到80％或40％到60％的天然外显子2序列。一般地，同源变体具有上面就天然序列所提到的任何长度。
优选地，(i)包含SEQ ID No.2。
通过已知方法能获得合适的外显子序列(b)。见如Sambrook et al.，同上，关于用于获得和分离DNA的技术的描述。通过使用标准技术(见，例如，Maclean，A(1998)“Preparation of HSV-DNA and Production ofInfectious Virus”in Herpes Simplex Virus Protocols(在单纯疱疹病毒试验方案中的“感染病毒的HSV-DNA和产物的制备”)S.Brown，A Maclean，editors，Humana Press，Totowa，NJ，pp.19-26)，天然hCMV主要立即早期基因序列能直接从病毒样本中分离得到。hCMV主要立即早期基因的序列，包括外显子1和外显子2的位置，可在Genebank#M60321，X17403获得。因此，天然外显子1和2序列能通过在合适的限制酶切位点切去天然主要基因序列，或通过使用基于已知序列的PCR引物采用PCR分离得到。或者，合适的外显子序列可从现存的质粒载体中分离得到，如pWRG7128。外显子序列也可通过合成，而非克隆制备。变体序列易于通过常规方法，如定向诱变构建得到。
一般地，当外显子存在于本发明的构建体中时，它能提高表达，一般能引起与上述天然外显子1和外显子2序列相当的提高。
可使用下面的差异表达分析检测外显子序列的功能性。待测外显子序列被导入基本载体中，置换已有外显子序列。一般地，与基本载体相比，若外显子序列在至少一种、优选两种参照细胞类型中其表达非但不停止，反而进一步提高，则该序列是功能性的。一般地，参照细胞是哺乳动物的HEK293T、CHO、HeLa、BHK、3T3或COS细胞。优选地，表达提高了至少5％、10％、20％、30％或40％。根据本检测，天然外显子序列(i)的功能同源变体(ii)或功能片段(iii)为天然序列表达至少提高50％提供了可能。
另外或者作为另一种选择，可使用下面的差异免疫原性分析检测外显子序列。待测外显子序列被导入基本载体，置换已有外显子序列。功能外显子序列提供较基本载体所获得的抗体滴度相等或者较高的抗体滴度，其中该基本载体具有至少一个、优选两个抗原。优选地，抗体滴度较基本载体至少高5％、10％、20％、30％或40％。优选的抗原是HBsAg、HSV 2gD和flu-M2抗原。根据本检测，天然外显子序列(i)的功能同源变体(ii)或功能片段(iii)允许由天然序列获得的最高抗体滴度。
嵌合启动子构建体包括异源内含子(c)，它置换hCMV主要立即早期基因的天然内含子A区。内含子是从由基因转录得到的hnRNA剪接得到的非编码序列。天然状态下异源内含子不存在于编码序列中。
异源内含子(c)全部或部分置换hCMV主要立即早期基因的天然内含子(A)。一般地，不存在天然内含子A。
一般地，异源内含子(c)为外显子序列(b)3’端。
一般地，异源内含子(c)包括：
(i)天然内含子；
(ii)(i)的功能同源变体；或
(iii)(i)或(ii)的功能片段。
异源内含子(c)一般为病毒或真核生物的内含子。优选地，内含子是哺乳动物的内含子，特别是非人类的内含子，如大鼠或鸡的内含子。优选地，内含子为内含子A，如，大鼠胰岛素内含子A，鸡角蛋白内含子A或鸡心脏的肌动蛋白内含子A。
一般地，内含子(c)长度为大约50个核苷酸到大约1000个核苷酸，如大约100到大约500个核苷酸。例如，内含子(c)可包括50到500个核苷酸，如高达100、200、300或400个核苷酸。优选地，内含子包括天然大鼠胰岛素内含子A的第50到133位的核苷酸，或该序列的同源物。
优选地，异源内含子(c)能从真核宿主细胞的RNA转录产物中剪接。一般地，内含子包括一个或多个供体序列(如GT)、受体序列(如AG)、3’嘧啶富集区和分枝点序列。若含嘧啶富集区，该区可包括，如至少5、8、10或更多嘧啶。优选地，内含子包括至少一个供体序列、一个受体序列和一个分枝点序列。一般地，在嵌合构建体中，内含子(c)包括来源于外显子序列的非内含子侧翼序列，该外显子序列发现于天然内含子(i)的内含子/外显子边界。侧翼外显子序列可为天然外显子序列或该序列的同源物，该同源物基本保持天然序列相同活性，如保持剪接功能。一般在内含子的两端均包括外显子序列的5到10、优选7到10个碱基。
内含子(c)可是人工内含子，只要内含子是功能性的。例如，可使用重组或嵌合内含子。这种内含子可包括一个以上天然内含子的序列。
一般地，内含子(c)包括存在于hCMV内含子A的序列，它与转录因子或调控蛋白结合，或能与相同转录因子或蛋白结合的这些序列的同源物，而非这些序列。一般地，这些序列或其同源物以与hCMV内含子A中相同的顺序和/或基本相同的相对位置出现在内含子(c)中。
内含子(c)包括同源变体(ii)，其中天然内含子(i)的序列经修饰以除去内部的限制酶切位点。如，可使用大鼠胰岛素内含子A的同源变体，其内部的Nhel位点已被破坏。
优选地，内含子(c)包括：
(i)SEQ ID No.3；
(ii)(i)的功能同源变体；或
(iii)(i)或(ii)的功能片段。
内含子序列(c)可使用标准克隆技术获得。例如，大鼠胰岛素内含子A序列在GeneBank J00748，鸡角蛋白内含子序列在GeneBankJ00847以及鸡心脏的(肌动蛋白)内含子A序列在GeneBank X02212中可得。内含子序列可使用基于已知序列的引物从天然来源中分离得到。序列也可合成制备。变体序列可通过突变获得。
一般地，诸如功能变体(ii)或功能片段(iii)的功能内含子序列基本具有与天然内含子(i)相同的活性，和/或补充其活性。在一个实施方案中，该活性是指剪接活性。
可使用常规剪接分析检测内含子(c)序列的剪接活性。一般地，在该检测中，功能同源物(ii)或功能片段(iii)显示出至少50％，如60％、70％、80％、90％到高达100％或更高天然内含子(i)的剪接率。
一般地，异源内含子序列出现在本发明的构建体中时，它能提高表达。一般地，变体(ii)或片段(iii)内含子较天然内含子(i)能产生相当的提高。
潜在的内含子序列(c)的功能可使用下面的差异表达分析检测。异源内含子被导入基本载体中。一般地，在与基本载体进行比较时，若异源内含子序列在至少一种、优选两种参照细胞类型中其表达提高25％或更高，则该序列是功能性的。一般地，参照细胞是哺乳动物HEK293T、CHO、HeLa、BHK、3T3或COS细胞。表达提高至少35％、45％、55％或更高。根据本检测，天然内含子序列(i)的功能变体(i)或功能片段(ii)为天然序列表达提高50％以上提供了可能。
另外或者作为另一种选择，可使用下面的差异免疫原性分析检测异源内含子(c)序列的功能性。内含子(c)序列被导入基本载体中。功能内含子(c)序列提供与基本载体所获得的抗体滴度相同或者较高的抗体滴度，该基本载体具有至少一个、优选两个抗原。优选地，抗体滴度较基本载体至少提高5％或10％，如20％、30％或40％。优选的抗原是HBsAg、HSV2gD和flu-M2抗原。根据本检测，天然内含子序列(i)的功能变体(ii)或功能片段(iii)允许由天然序列获得的最高抗体滴度。
可使用标准克隆技术获得合适的异源内含子序列。例如，大鼠胰岛素内含子A序列在GeneBank J00748，鸡角蛋白内含子A在GeneBankJ00847以及鸡心脏的肌动蛋白内含子A序列在GeneBank X02212中可得。内含子序列可使用基于已知序列数据的引物从天然来源中分离得到。合适的序列还可通过合成制备。
可使用标准克隆或分子生物学技术，将组成序列(a)、(b)和(c)适当地连接在一起以形成嵌合启动子。优选地，内含子序列(c)位于外显子序列(b)的3’端。嵌合启动子构建体与克隆位点相连接，在有合适的酶参与下，通过这种方式启动子会影响***到该位点的编码序列的表达。合适的克隆位点，包括多克隆位点，已为本领域所熟知，如pUC19，pBC SK，pBluescript II KS，cDNA3.1，pSP72，pGEM 7Z多克隆位点。
一般地，用于***(或已经***)克隆位点的核酸编码与治疗相关的多肽。优选编码序列适用于核酸免疫接种或基因治疗中。因此，核酸***序列可包括能提供免疫性的序列，例如免疫原性序列，它在释放给受试者时能引起体液和/或细胞免疫应答。或者，核酸可包括一个或多个编码治疗性多肽(如靶细胞基因组缺损或缺少的蛋白，或具有所需生物或治疗效应(如抗病毒功能)的非天然蛋白)的基因。对于遗传病的治疗，能将对应于已知在具体病症中缺失的基因的功能性基因给予受试者。优选地，核酸是DNA。
用于***的合适的核酸包括那些用于治疗炎性疾病、自身免疫疾病、慢性病和传染病的核酸，包括病症如艾滋病、癌症、神经***疾病、心血管***疾病、高胆固醇血症(hypercholestemia)；各种血液病包括各种贫血(anemias)、地中海贫血(thalassemia)和血友病(hemophilia)；遗传缺陷如囊肿性纤维化(cystic fibrosis)、Gaucher疾病、腺苷脱氨酶(ADA)缺乏症(adenosine deaminasedeficiency)、肺气肿(emphysema)等。
例如，在治疗实体瘤(solid tumor)的方法中，如下基因可在肿瘤位点或其附近***表达：编码毒性肽的基因(即诸如篦麻毒素(ricin)、白喉毒素(diphtheria toxin)和眼镜蛇毒因子(cobra venomfactor)的化学治疗剂)、诸如p53的肿瘤抑制基因，编码转化癌基因的反义链的mRNA序列的基因，编码抗肿瘤肽如肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)和其它细胞因子的基因，或转化癌基因的反式显性阴性突变体(transdominant negative mutant)。
同样，也包括编码多肽的核酸，已知该多肽表现出抗病毒和/或抗细菌活性、或刺激宿主免疫***。核酸可编码多种细胞因子(或其功能片段)中的一种，如白细胞介素(interleukin)、干扰素(interferon)和集落刺激因子(colony stimulating factor)。核酸可编码治疗或预防许多疾病的抗原，包括但不限于癌症、过敏、中毒和被病原体感染。该病原体包括但不限于真菌、病毒；病毒包括人乳状瘤病毒(HumanPapilloma virus，HPV)、HIV、HSV2/HSV1，流感病毒(influenza virus，甲型、乙型和丙型)、脊髓灰质炎病毒(Polio virus)、RSV病毒(RSVvirus)、鼻病毒(Rhinovirus)、轮状病毒(Rotavirus)、甲型肝炎病毒(Heptatitis A virus)、诺瓦克病毒组(Norwalk Virus Group)、肠道病毒(Enterovirus)、星状病毒(Astrovirus)、麻疹病毒(Measlesvirus)、Par流感病毒(Par Influenza Virus)，腮腺炎病毒(MumpsVirus)、水痘-带状疱疹病毒(Varicella-zoster virus)、巨细胞病毒(cytomegalovirus)、非洲淋巴细胞瘤病毒(Epstein-Barr Virus)、腺病毒(Adenovirus)、德国麻疹病毒(Rubella virus)、人T细胞淋巴瘤I型病毒(Human T-cell Lymphoma type I virus，HTLV-I)、乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)、丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)、丁型肝炎病毒(Hepatitis D virus)、痘病毒(Pox virus)、马尔病毒和埃博拉病毒(Marburg and Ebola)；细菌包括：结核杆菌(M.tuberculosis)、衣原体(Chlamydia)、淋病菌(N.gonorrhoeae)、志贺氏杆菌(Shigella)、沙门氏菌(Salmonella)、霍乱弧菌(VibrioCholera)、苍白密螺旋体(Treponema Pallidua)、假单胞菌(Pseudomonas)、百日咳杆菌(Bordetella Pertussis)、布鲁氏菌(Brucella)、土拉热弗朗西施氏菌(Franciscella tularensis)、幽门螺旋菌(Meningococcus)、问号钩端螺旋体(Leptospria interrogaus)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersiniapestis)、链球菌(Streptococcus)(A和B型)、肺炎球菌(Pneumococcus)、脑膜炎球菌(Meningococcus)、流感嗜血杆菌(Hemophilus influenza)(b型)、刚地弓形虫(Toxoplama gondic)、Complybacteriosis、粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、***(Donovanosis)和放线菌(Actinomycosis)；真菌病原体包括念珠菌(Candidiasis)和曲霉(Aspergillosis)；寄生虫病原体包括绦虫(Taenia)、吸虫(Flukes)、蛔虫(Roundmorms)、变形虫(Amebiasis)、贾第虫(Giardiasis)、隐孢子虫属(Cryptosporidium)、血吸虫(Schitosoma)、卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)，匐滴虫(Trichomoniasis)和旋毛虫(Trichinosis)。该核酸也可用来针对多种畜禽疾病提供合适的免疫应答，如***(Foot and MouthDisease)、冠状病毒(Coronavirus)、出血败血性巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、缠绕杆菌属(Helicobacter)、寻常圆线虫(Strongylus vulgaris)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumonia)、牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)、肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)、大肠杆菌(E.Coli)、百日咳杆菌(Bordetella pertussis)、副百日咳杆菌(Bordetellaparapertussis)和支气管败血性博德特氏菌(Bordetella brochiseptica)。因此，一方面，本发明的核酸构建体可在疫苗中使用。
在一些实施方案中，核酸构建体编码佐剂。因此，***克隆位点(用于***编码序列)的序列可编码作为佐剂的多肽。在优选的实例中，所编码佐剂可为ADP-核糖基化的细菌毒素。这些毒素包括白喉毒素(diphtheria toxin，DT)、百日咳毒素(pertussis toxin，PT)、霍乱毒素(cholera toxin，CT)、大肠杆菌不耐热肠毒素(E.coli heat labile toxins，LT1和LT2)、假单胞杆菌内毒素A(Pseudomona endotoxin A)、假单胞菌外毒素S(Pseudomonas extoxin S)、仙人掌杆菌胞外酶(B cereusexoenzyme)、球形芽孢杆菌毒素(B.sphaericus toxin)、肉毒梭菌C2和C3毒素(C botulinum C2 and C3 toxin)，泥渣梭菌胞外酶(C.limosumexoenzyme)，以及来自产气荚膜梭菌(C.perfringens)、螺状梭菌(Cspiroforma)和艰难梭菌(C difficile)的毒素和金黄色葡萄球菌EDIN(Staphylococcus aureus EDIN)。大部分ADP-核糖基化的细菌毒素包含A亚基和B亚基。构建体可表达A亚基、B亚基和/或两个亚基一起表达。
在一个优选的实例中，核酸构建体可编码大肠杆菌不耐热毒素和/或霍乱毒素，并特别表达大肠杆菌不耐热毒素。CT的A亚基和B亚基基因的完整序列的GenBank条目见于基因位点(Locus)VIBCTXABB(基因存取号No.D30053)，而LT的A亚基和B亚基基因的完整序列的GenBank条目见于基因位点AB0116677(基因存取号No.AB011677)。
构建体能表达特定佐剂的活性变体或片段。若变体或片段保持所来源多肽的至少部分佐剂活性，则说其具有活性。因此，与没有佐剂同抗原一起给药时观察到的免疫应答相比，变体和/或片段仍然能增强针对特定抗原的免疫应答。被编码序列可是CT的A亚基和/或B亚基的活性片段或变体，并特别为LT的A亚基和/或B亚基的活性片段。
毒素亚基可缺失天然存在的信号序列。天然存在的外毒素亚基可被修饰以将毒素解毒。A亚基可被修饰以干扰ADP-核糖基转移酶的活性或将该酶失活。
因此，本发明的佐剂构建体可用于提高针对特定抗原的免疫应答。增强的免疫应答包括强度更大或时间更长的免疫应答。这意味着当再次遇到抗原时，免疫应答比未给予佐剂时更强。增强的免疫应答可产生更高的抗体滴度。在一些构建体中，特别是在那些表达外毒素亚基的构建体中，佐剂可产生针对所研究抗原的放大的细胞应答，和T辅助细胞1样免疫应答。
***克隆位点的核酸可包括聚腺苷酸化(polyA)序列。这种PolyA序列一般来源于编码序列。或者，异源polyA序列出现在本发明的核酸构建体中。一般地，polyA序列可位于克隆位点下游，这样可有效连接于***克隆位点的编码序列。使用标准克隆技术可将任何合适的polyA序列导入构建体中。该polyA序列为本领域所熟知。
polyA序列可为：
(i)天然polyA序列；
(ii)(i)的功能同源变体；或
(iii)(i)或(ii)的功能片段。
天然polyA序列(i)可为，例如兔β-珠蛋白基因polyA，人***状瘤病毒(HPV)早期或晚期基因polyA，HSV-2gB基因polyA，猿CMV立即早期基因polyA或HSVgD晚期基因polyA。
优选地，天然polyA序列(i)选自SEQ ID No.10(GenBankK03256)、SEQ ID No.11(GenBank M16019)、SEQ ID No.12(GenBankZ80699)和SEQ ID No.13(GenBank K02718)。
一般地，功能polyA序列是保留聚腺苷酸化活性的序列。
可使用常规表达分析检测polyA序列将RNA转录产物聚腺苷化的能力。在检测中发现：功能同源变体(ii)或功能片段(iii)一般具有天然polyA序列的至少50％，例如60％、70％、80％或更高polyA活性。
一般地，在polyA序列出现在本发明的构建体中时，会提高表达，一般会产生相对于上述天然polyA序列(i)相当的提高。
可使用下述差异表达分析检测polyA序列的功能性。待测polyA区被导入基本载体，以置换RBGpA。和基本载体相比，若polyA在至少一种(优选两种)参照细胞类型中非但不停止表达，反而(优选)提高表达，则认为待测polyA是功能性的。优选地，表达提高至少5％、10％、20％、30％、40％或50％或更高。优选的细胞类型为哺乳动物的HEK293T、CHO、HeLa、BHK、3T3或COS细胞。根据本检测，若同源变体(ii)或片段(iii)能获得高于天然polyA序列(i)表达量的50％，则认为其是功能性的。
另外或者作为另一种选择，可使用如下差异免疫原性分析检测polyA序列的活性。polyA序列被导入基本载体中，以置换RBCpA。功能性polyA序列提供较基本载体所获得的抗体滴度至少相同或更高的抗体滴度，该基本载体含至少一个、优选含两个抗原。优选地，该抗体滴度至少高于基本载体所获得的抗体滴度的至少5％、10％，如20％、30％或40％。优选的抗原是HBsAg、HSV2gD和Flu-M2抗原。若同源变体(ii)或片段(iii)能获得天然polyA序列所获得的最高抗体滴度，则认为其是功能性的。
核酸构建体还包括另外的调控序列，它影响***克隆位点的编码序列的表达。该构建体可包括非翻译前导序列。该序列在构建体中与嵌合启动子有效连接，因此它同样与***克隆位点的编码序列有效连接。前导序列提供表达***编码序列的翻译起始位点，并一般含Kozak序列。
一般地，非翻译前导序列包括：
(i)天然非翻译前导序列；
(ii)(i)的功能同源变体；或
(iii)(i)或(ii)的功能片段。
一般地，天然序列(i)是真核生物的序列或病毒序列，特别是感染真核生物的病毒。优选地，天然序列(i)是HBV或HSV序列，如HBV preS2抗原序列，HBV e-抗原序列，或HSV型2gD抗原序列。特别优选地，(i)选自SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7。
一般地，前导序列包括(i)中的序列，它能结合转录元件或调节蛋白，或者能结合相同元件或蛋白的这些序列的同源物。一般地，这些序列或其同源物以与(i)中相同的顺序和/或基本相同的相对位置出现在前导序列中。一般地，前导序列包含表达***的编码序列的翻译起始位点。一般地，前导序列包含Kozak序列。
一般地，非翻译前导序列长为大约10个到大约200个核苷酸，例如大约15个到150个核苷酸，优选15个到大约130个核苷酸的长度。例如，可使用含15、50、75或100个核苷酸的前导序列。
一般地，功能性非翻译前导序列可提供编码序列表达的翻译起始位点，所述编码序列与前导序列有效连接。一般地，功能变体(ii)或片段(iii)具有基本与天然序列(i)相同的活性和/或补充其活性，该天然序列通常促进或增强与该序列有效连接的编码序列的表达。
使用标准方法可检测变体(ii)或片段(iii)作为非翻译前导序列相对于天然前导序列的活性。例如，可制备含与天然编码序列有效连接的天然前导序列(i)的表达载体，并且在合适的宿主细胞，如哺乳动物HEK293T、CHO、HeLa、BHK、3T3或COS细胞中监测其表达。可制备待测构建体，其中天然前导序列被同源变体或片段置换，并再监测在相同宿主细胞中的表达。一般地，变体(ii)或片段(iii)具有天然序列表达量的至少50％，如60％、70％、80％、90％或100％或更高。
可在下面的差异表达分析中检测潜在的前导序列的可利用性。待测前导序列被导入基本载体，以置换HBV preS2 5’UTR。与基本载体相比，功能性前导序列在至少一种(并优选二种)参照细胞类型中非但不停止表达，反而(优选)提高表达。一般地，表达提高了至少5％、10％、20％、30％、40％或50％。优选的细胞类型是哺乳动物HEK293T、CHO、HeLa、BHK、3T3或COS细胞。根据本检测，若同源变体(ii)或片段(iii)较天然前导序列所获得的表达高过50％，则认为其是功能性的。
另外或者作为另一种选择，可在下面的差异免疫原性分析中检测前导序列的活性。前导序列被导入基本载体，以置换HBV preS2 5’UTR。功能性前导序列提供与基本载体获得的抗体滴度至少相同或更高的抗体滴度，该基本载体含有至少一个、优选两个抗原。优选地，抗体滴度至少高于基本载体的5％、10％、20％、30％或40％。优选的抗原是HBsAg、HSV 2gD和Flu-M2抗原。若同源变体(ii)或片段(iii)具有天然前导序列(i)所具有的最高抗体滴度，则认为其是功能性的。
使用标准方法可获得合适的前导序列。例如，HBV preS2抗原序列、HBV e-抗原序列和HSV型2gD抗原序列分别可在GenBank M54923、M54923和Z86099获得。可基于该已知序列设计引物，并用于分离同源序列。前导序列可基于已知序列合成。
核酸构建体可包括增强子序列。一般地，增强子序列位于克隆位点的3′端，并与嵌合启动子和***编码序列有效连接，并起到提高***序列的转录水平的作用。
一般地，增强子包括：
(i)天然增强子；
(ii)(i)的功能同源变体；或
(iii)(i)或(ii)的功能片段。
一般增强子序列包括大约50到大约850个核苷酸，如大约75个到大约500个核苷酸。可使用大约100、200、300或400个核苷酸的增强子。
一般地，(i)是真核生物的增强子或病毒的增强子，特别是感染真核生物的病毒的增强子。通常这种增强子出现在基因的3’非翻译区(3’UTR)。优选地，(i)是HBV或CMV增强子，如HBs Ag 3’UTR或猿CMV立即早期基因3’UTR。优选地，(i)含有SEQ ID No.8或SEQID No.9。
一般地，构建体中的增强子含有(i)中的序列，它结合转录元件或调节蛋白如转录因子，或者结合相同元件或蛋白的该序列的同源物。优选地，这些序列以与(i)中相同的顺序和/或基本相同的相对位置存在。
一般地，功能性增强子可增强或提高多核苷酸的表达，如与增强子序列有效连接的编码序列。一般地，功能同源变体(ii)或片段(iii)具有与天然增强子(i)基本相同的活性(如增强表达)或补充其活性。
使用增强子捕获分析(enhancer trap assay)可检测增强子活性。实验方法已为本领域所熟知。在该分析中，功能同源变体(ii)或片段(iii)优选具有天然增强子所具有的至少50％的增强子活性。一般地，该活性为天然增强子的至少60％、70％、80％、90％、100％或更高。一般地，在该分析中功能变体(ii)或片段(iii)能补充天然增强子(i)的活性。
使用下述差异表达分析可检测增强子的可利用性。待测3’UTR序列被导入基本载体中。在本分析中，与基本载体相比，若3’UTR在至少一种(更优选两种)参照细胞类型中非但不停止表达，反而(优选)提高表达，则认为其具有可利用性。优选地，表达提高了至少5％、10％、20％、30％、40％或50％。优选的细胞类型为哺乳动物的HEK293T、CHO、HeLa、BHK、3T3或COS细胞。根据本分析，若同源变体(ii)或片段(iii)较天然增强子序列(i)所获得的表达提高了50％以上，则认为其具有功能性。
另外或者作为另一种选择，可在下述差异免疫原性分析中检测增强子序列的活性。3’UTR被导入基本载体中。功能性增强子序列具有较基本载体所获得的抗体滴度相同或更高的抗体滴度，该基本载体含至少一个、优选两个抗原。优选地，该抗体滴度较基本载体提高至少5％、10％、20％、30％或40％。优选的抗原是HBs Ag、HSV2gD和Flu-M2抗原。若同源变体(ii)或片段(iii)具有天然增强子序列(i)的最高抗体滴度，则认为其是功能性的。
使用标准克隆方法可获得合适的增强子序列。例如，可在GenBankAF143308和M16019获得HBs Ag 3’UTR序列、或猿CMV立即早期基因3’UTR序列。引物可基于已知序列设计，并用于分离同源序列。
在一个优选的实施方案中，核酸构建体包括异源polyA序列，异源前导序列和异源增强子，均与嵌合启动子有效连接，以高效表达***的编码序列。
在另外一方面，本发明还提供一种核酸构建体，包括如下元件或基本由如下元件组成：
(i)启动子序列；
(ii)非翻译前导序列，其来源于HBV preS2抗原序列、HBV e-抗原序列或HSV型2gD抗原序列；和
(iii)与(i)和(ii)有效连接的编码序列
其中，该编码序列对非翻译前导序列是异源的。
一般地，启动子序列(i)来源于病毒或真核生物的启动子序列。该启动子序列可为天然的启动子序列、天然序列的功能性同源物或两者的功能片段。合适的天然启动子包括，如，hCMV立即早期启动子、伪狂犬病病毒(PRV)启动子或劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子。优选地，该天然启动子包括SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：53。
可使用诸如上述嵌合启动子的人工启动子构建体，只要该启动子是功能性的。
一般地，功能性启动子序列可引起(包括启动和调控)适当的宿主细胞中有效连接的编码序列的转录。
可使用常规表达分析检测启动子序列的启动子活性。一般地，在此分析中，天然启动子序列的功能性同源物或片段具有天然序列的表达量的至少50％，例如至少60％、70％、80％或90％。
非翻译前导序列(ii)如上所述。合适的编码序列(iii)包括已在嵌合启动子构建体中描述的编码序列。但是，在本发明的此方面，编码序列对非翻译前导序列是异源的。一般地，本构建体包括polyA序列(已描述)可来自编码序列，或在构建体中作为异源polyA序列。已描述了合适的polyA序列。该构建体还包括位于编码序列3’端的增强子序列。在嵌合启动子构建体中已描述了合适的增强子序列。
在另一方面，本发明提供了一种核酸构建体，包括下述组分或在某些实施方案中基本由下述组分组成：
(i)启动子序列；
(ii)编码序列，其与启动子序列(i)有效连接；和
(iii)增强子序列，位于编码序列(ii)的3’端，并与之有效连接。
其中，增强子序列(iii)来源于HBsAg序列的3’UTR或猿CMV立即早期基因序列的3’UTR，并且编码序列(ii)对增强子序列是异源的。
构建体可包括非翻译前导序列，如在嵌合启动子构建体中已经描述的那些前导序列。
一般地，启动子序列(i)来源于病毒或真核生物的启动子序列。启动子序列可为天然启动子序列、天然序列的功能性同源物或两者的功能片段。例如，合适的天然启动子包括hCMV立即早期启动子、伪狂犬病病毒(PRV)启动子或劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子。优选地，天然启动子包括SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：53。
可使用诸如上述嵌合启动子的人工启动子构建体，只要该启动子是功能性的。
功能性启动子序列一般可引起(包括启动和调节)合适的宿主细胞中有效连接的编码序列的转录。
使用常规表达分析可检测启动子序列的启动子活性。一般地，在该分析中，天然启动子序列的功能性同源物或片段具有天然序列的表达的至少50％，例如至少60％、70％、80％或90％。
合适的编码序列(ii)包括已在嵌合启动子构建体中提及的序列。但是，在此方面，编码序列与对3′增强子序列是异源的。该构建体的增强子序列(iii)如上所述。一般地，本构建体也包括polyA序列。如在嵌合启动子构建体中一样，该polyA区可来自编码序列(ii)或可作为该构建体中的异源polyA元件。
根据本发明的任何一方面的构建体可包括信号肽序列。***与启动子有效连接的信号肽序，这样信号肽就能表达，并辅助由编码序列(也与启动子有效连接)编码的多肽的分泌。
一般地，信号肽序列编码10到30个氨基酸的肽，如15到20个氨基酸。通常氨基酸主要为疏水的。通常情况下，信号肽将带有该信号肽的正在合成的多肽链引导至表达细胞的内质网中。该信号肽在内质网中被切除，并通过高尔基体分泌多肽。
用于本发明的信号肽可包括：
(i)天然信号肽序列；
(ii)(i)的同源变体，它保留信号肽活性；或
(iii)(i)或(ii)的片段，它保留信号肽活性。
例如，序列(i)可为人组织纤溶酶原激活剂信号肽(hTPAsp)(GenBank L00141)、抑肽酶信号肽(GenBank AAD13685)、烟草伸展蛋白信号肽(GenBank JU0465)、或鸡溶菌酶信号肽(GenBankAF410481)。
适用于本发明的信号肽是能分泌异源蛋白的信号肽。功能性信号肽可在下述分析中被鉴定：比较待测信号肽的效果和已知信号肽的效果-如人组织纤溶酶原激活剂信号肽(hTPAsp)-和没有信号肽的效果。可使用下述差异表达分析，但需要有如下修改。构建分泌表达载体，其包括具有待测信号肽、hTPAsp或没有信号肽的基本载体。缺少天然信号肽的多肽编码序列被***载体，并将该载体转化进入参照宿主细胞中。优选的细胞是哺乳动物HEK293T、CHO、HeLa、BHK、3T3或COS细胞。细胞培养液用于分析多肽表达水平。与缺少信号肽，具有至少一种、优选两种多肽的载体相比，功能性信号肽能使多肽在较高水平上分泌。一般地，分泌量提高5％，或更优选提高10％或更高，如提高20％或50％或更高。一般地，分泌水平与使用hTPAsp获得的分泌水平相当。
编码蛋白能在表达细胞外分泌具有诸多优点，特别是在该蛋白为抗原时。比如，抗原分泌量提高为由免疫细胞(巨噬细胞、Langehan细胞、B细胞、T细胞等)引起的更高抗原摄入和应答提供了可能，使抗原具有到达血流和信号分子(细胞因子)的能力、使抗原能找到细胞配体并发挥作用(抗体，毒素如霍乱毒素、大肠杆菌LT)，并参与普通的细胞生物化学过程(细胞受体)。
本发明的核酸构建体可为质粒表达载体的形式。因此该载体可包括其它元件，如复制起点或选择子基因。这些元件为本领域所熟知，并可通过使用标准技术被纳入其中。在一个实施方案中，质粒载体具有SEQ ID NO：14的序列。或者，该构建体可包括在病毒载体构建体中。
在某些实施方案中，本发明的核酸构建体可包括在此定义的两个或多个嵌合启动子。因此，构建体可包括多个嵌合启动子，并且特别地，该构建体可具有两个、三个、四个、五个或多个嵌合启动子。优选地，嵌合启动子分别与用于***编码序列的克隆位点有效连接。因此，该构建体可表达两个、三个、四个、五个或多个编码序列。所表达的编码序列可为在此具体描述的任何序列。在一个优选的实例中，构建体具有两个嵌合启动子，它们分别具有与它们有效连接的编码序列。特别地，这两种启动子可彼此独立地转录。
特别地，具有两个启动子的构建体可表达ADP-核糖基化细菌毒素的A亚基和B亚基，包括本文所述的任何一种，并优选LTA亚基和B亚基。
在构建体具有多个嵌合启动子的情况下，每个启动子均包括，或有效连接到本文提及的任何序列。在一个特别优选的实例中，一个或多个启动子的异源内含子可为大鼠胰岛素基因内含子A序列。一个或多个嵌合启动子也可优选包括HSV-2gB pre-S2的5’UTR。一个或多个启动子可包括大鼠β珠蛋白基因的聚腺苷酸化序列。
在一优选的实例中，本发明的核酸构建体可包括两个嵌合启动子序列，且每个启动子序列有效连接到***编码序列的克隆位点，其中，每个嵌合启动子包含：
(a)hCMV立即早期启动子序列；
(b)hCMV主要立即早期基因的外显子1和至少一部分外显子2；和
(c)置换hCMV主要立即早期基因的内含子A区的异源内含子。
与一个嵌合启动子有效连接的编码序列编码LTA亚基，与另一启动子连接的编码序列编码LTB亚基。因此，构建体能表达两种亚基。优选地：
—每个启动子的异源内含子是大鼠胰岛素基因内含子A序列；
—编码每个LT亚基的序列有效连接到HBV pre-S2的5’UTR；和/或
—每个LT编码序列与大鼠β珠蛋白基因聚腺苷酸化序列有效连接。
本发明的多核苷酸构建体基本不含细胞或细胞物质或与其一起存在。它可以是基本分离的形式，或基本纯化的形式，在每种形式下，它在制剂中一般包括至少90％，如至少95％、98％或99％的多核苷酸或干物质。
本核酸分子可被释放到适合的宿主细胞中，以表达与启动子有效连接的多核苷酸。优选地，宿主细胞是哺乳动物细胞，特别是人的细胞。释放核酸到这些细胞中的适合的方法为本领域所熟知，包括，如葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、电穿孔和直接显微注射到细胞核。
如上所述，构建体中的核酸编码序列可编码治疗相关的多肽。因此，使用标准基因释放方法，本构建体可用于核酸免疫接种或基因治疗。用于基因释放的合适方法已为本领域所熟知，如下所详细说明。核酸分子可直接释放到受试者，或者，离体释放到来自受试者的细胞，然后将细胞重新植入受试者。
就在核酸免疫接种或基因治疗中的使用方法而言，核酸构建体能如常规药物制剂那样制备。可使用本领域普通技术人员可得的标准药理配方化学和方法制备。例如，含有一个或多个核酸序列(如以合适的载体形式如DNA质粒形式存在)的组合物能与一种或多种药理学上可接受的赋形剂或载体联合，以提供一种液体制剂。
辅助物质，如湿润剂或乳化剂，pH缓冲物质等等，可存在于赋形剂或载体中。这些赋形剂、载体和辅助物质一般是药剂，它可给药，没有异常毒性，并且在作为疫苗组合物时不会在接受该组合物的个体内引起免疫应答。药理学上可接受的赋形剂包括，但不限于液体，如水、盐水、聚乙二醇、透明质酸、丙三醇和乙醇。其中还可包括药理学上可接受的盐，例如，无机酸盐，如氢氯化物、氢溴化物、磷酸盐、硫酸盐等，有机酸盐，如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、安息香酸盐等。尽管没有要求，但优选制剂包括起着稳定剂的作用的、在药理学上可接受的赋形剂，特别是针对肽、蛋白或其它分子，如果它们包括在组合物中。同样起着肽的稳定剂作用的合适的载体的实例包括，但不限于药品级的葡萄糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、纤维醇、葡聚糖等。其它合适的载体还包括，但不限于淀粉、纤维素、磷酸钠或磷酸钙、柠檬酸、酒石酸、甘氨酸、高分子量聚乙二醇(PEG)和其组合。在REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES(MarkPub.Co.，N.J.1991)中非常详细地描述了药理学上可以接受的赋形剂、载体和辅助物质，在此通过引用被纳入本申请中。
在组合物中也可包括核酸摄入和/或表达的某些促进剂(facilitator)(“转染促进剂”，transfection facilitating agent)，例如促进剂如布比卡因(bupivacaine)、心脏毒素(cardiotoxin)和蔗糖，转染易化载体如一般用于释放核酸分子的脂质体制剂或脂质制剂。阴离子脂质体和中性脂质体来源广泛，并且其可释放核酸分子是广为人知的(见如Liposomes：A practical Approach，(1990)RPC New Ed.，IRL Press)。阳离子脂质制剂也是公知的用于释放核酸分子的载体。合适的脂质制剂包括DOTMA(N-[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N-三甲基氯化胺，N-[1-(2，3-dioleyloxy)propyl]-N，N，N-trimethylammonium chloride)，其商品名为LipofectinTM，和DOTAP(1，2-二(油酰氧)-3-(三甲铵基)丙烷，1，2-bis(dioleoyloxy)-3-(trimethylammonio)propane)，见如Felgneret al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA  84：7413-7416；Malone et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA  86：6077-6081；美国专利No 5,283,185和5,527,928，和国际公布No WO90/11092、WO91/15501和WO95/26356。这些阳离子脂质可优选与中性脂质联合使用，如DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺，dioleoyl phosphatidylethanolamine)。可加入上述脂质或脂质体制剂中的其他转染促进组合物包括精胺衍生物(见如国际公布No.WO93/18759)和透膜化合物如GALA、短杆菌肽(Gramicidine S)和阳离子胆盐(见如国际公布No.WO93/19768)。
或者，本发明的核酸分子可被包入、被吸入或结合至微粒载体。合适的微粒载体包括来源于聚甲基丙烯酸甲酯聚合物(polymethylmethacrylate polymer)的微粒载体，和来源于聚(丙交酯)(poly(lactide))和聚(丙交酯-乙交酯)(poly(lactide-co-glycolide))的PLG微粒。见如Jeffery et al.(1993)Pharm.Res.10：362-368。也可使用其它微粒***和聚合物，如聚合物如聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸、精胺、亚精胺，和这些分子的缀合物。
组合物一旦形成，能通过诸多已知方法和技术释放至受试者体内。例如，液体制剂可为可注射溶液、悬浮液或乳液，并使用普通针头和注射器、或液体喷射注射***，通过非肠道注射、皮下注射、皮内注射、肌肉注射、静脉注射给药。液体制剂也可局部给药至皮肤或粘膜组织，或为磨碎的喷雾剂，适合用于呼吸或肺部给药。其它给药方式包括口服给药、栓剂和主动或被动透皮释放技术。
或者，组合物可离体给药，如已知将转化细胞释放和重新植入受试者内(如葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、电穿孔和直接显微注射到细胞核)。
组合物以与药剂相容剂量给药给受试者，该剂量在预防和/或治疗上是有效的。合适的有效剂量将会落入相对较宽的范围内，但容易为本领域普通技术人员采用常规试验测定。就测定所需剂量的目的而言，《医师药学参考书》(Physicians Desk Reference)和Goodman和Gilman的《治疗的药理学基础》(The Pharmacological Basis ofTherapeutic)是有用的。例如，一般地，多核苷酸的有效剂量在大约0.001到1000μg，更优选在0.01到10.0μg的范围内。
在一个实例中，本发明的核酸构建体可与另一个核酸构建体联合使用。在某种情况下，核酸构建体可为本文所描述的一种表达佐剂的构建体，另外一种构建体可为编码一个或多个抗原的构建体。在一个优选的实例中，两种构建体均采用本发明的嵌合启动子。
在一种构建体表达佐剂，另一种构建体表达一个抗原或多个抗原时，抗原可特别来自HSV或肝炎病毒(特别是乙型肝炎病毒)。特别地，抗原可为HSV ICP0、ICP4、ICP22和/ICP 27抗原，并优选所有这四种。在这种抗原表达时，佐剂构建体特别表达LTA和/或LTB，并特别共同表达。
两种构建体可分别、同时或连续给药。这两种构建体可在同一组合物或不同组合物中给药。特别地，在一种构建体具有佐剂效应时，两种构建体将被释放，这样可观察到佐剂效应，即：和若佐剂不与抗原一起给药相比，佐剂和抗原一起给药所形成的免疫应答增强和/或时间延长。在一个优选的实例中，两种构建体在同一组合物中释放，优选在相同的载体颗粒上。
在一个优选的实施方案中，使用颗粒介导的释放技术将本发明的核酸构建体释放给靶细胞。释放核酸制剂的颗粒介导的方法为本领域所熟知。
采用各种本领域已熟知的技术，通过将本发明的核酸分子包被到载体颗粒(如核心载体)上可形成用于颗粒介导的释放***的颗粒。载体颗粒选自在颗粒大小范围内具有合适密度的物质，该颗粒大小一般用于从颗粒介导的释放装置的细胞内释放。一般地，载体颗粒的直径为0.1到5μm，如0.5到3μm，优选1到2μm。最佳载体颗粒大小当然取决于靶细胞的直径。或者，可使用胶体金颗粒，其中包被的胶体金被给药(如注射)到组织(如皮肤或肌肉)，随后被具有免疫能力的细胞摄入。
通常，载体颗粒选自惰性金属。该金属是惰性的是因为他们没有生理学活性。基于本发明的目的，可使用钨、金、铂和铱载体颗粒。优选钨和金颗粒。平均直径为0.5到2.0μm的钨颗粒易于得到。尽管这种颗粒在用于颗粒加速释放方法中有着最佳密度，并为使用DNA进行高效包被提供可能，但是，钨对于某些细胞类型具有潜在的毒性。金颗粒或微晶金(microcrystalline gold)(如金粉A1570，可从EngelhardCorp.获得，East Newark，NJ)也发现可采用本方法使用。金颗粒大小均一(从Alpha Chemicals获得，颗粒大小为1-3μm，或从Degussa，South Plainfield，NJ获得，颗粒大小在一定范围内，包括0.95μm)，并且降低了毒性。微晶金具有不同的颗粒大小分布，一般在范围0.1-5μm间。但是，微晶金(microcrystalline gold)的不规则表面积为使用核酸高效包被提供了可能。
将DNA或RNA包被或沉淀在金或钨颗粒上的多种方法为公知，并且已经进行了描述。一般地，其中大部分方法将质粒DNA、CaCl2和亚精胺结合在定量的金或钨上。在包被处理过程中将产生的溶液一直搅拌以确保反应混合物的均一性。在核酸沉淀后，包被颗粒可转移到合适的膜上并在使用前干燥，然后包被到样本模块(sample module)或样本盒(cassette)的表面，或负载到特别是用于颗粒介导的释放装置的释放盒(delivery cassette)中。
或者，本发明的多核苷酸可制备成微粒组合物。使用上述标准药理配方化学进行制备。例如，多核苷酸可结合一种或多种在药理学上可接受的赋形剂或载体，以提供合适的组合物。然后，使用标准技术，如通过简单蒸发(风干)、真空干燥、喷雾干燥、冷冻干燥(冻干)、喷雾-冷冻干燥、喷雾包被、沉淀、超临界流体颗粒制备等，将制备得到的组合物制备成颗粒。如果需要，可使用在国际公布No.WO97/48485(通过引用纳入本发明)中描述的技术将得到的颗粒致密。
这些方法可用来获得核酸颗粒，该核酸颗粒大小范围在大约0.01到大约250μm，优选大约10到大约150μm，并最优选大约20到大约60μm；并且颗粒密度范围在大约0.1到大约25g/cm3，堆密度在大约0.5到大约3.0g/cm3，或更大。
含核酸分子的颗粒一旦形成，可包装到一单位剂量或多单位剂量的容器中。该容器可包含装有合适量颗粒的密封紧密的容器。该颗粒可包装成无菌制剂，因此，该密封紧密的容器可经专门设计，以使制剂在释放给受试者之前保持其无菌性。该容器优选经改装，以直接用于颗粒介导的释放装置。一般地，该容器为胶囊、铝箔包装(foil pouches)、囊剂、药盒等形式。含合适剂量颗粒的颗粒释放装置可以预负载的形式提供。然后，预负载装置也可在紧密封闭的容器中预先安装。
包装颗粒的容器可进一步标记，以识别组合物，并提供相关剂量信息。另外，容器可用标签标记，该标签的形式由政府机关，如食品药品管理局规定，该标签表明其中所装的人用核酸制剂的使用或销售得到制造业的联邦法律下属机构的许可。
适用于颗粒介导的释放装置的颗粒加速装置已为本领域所熟知。例如，现在的基因枪装置使用爆发性的、电的或气体的释放方法推进包被载体颗粒到靶细胞。包被载体颗粒能以可释放的方式附着在可移动载体片层上，或以可除去的方式附着在气流通过的表面上，将该颗粒抬离表面并加速到靶标。气体释放装置的实例在美国专利No.5,204,253中描述。爆发型装置在美国专利No.4,945,050中描述。适用于本文的电释放装置的实例在美国专利No.5,120,657中描述。另外一种电释放装置在美国专利No.5,149,655种描述。所有这些专利的公开以引用的方式全文纳入本文。
颗粒也可使用无针注射装置给药，如在授权给Bellhouse等人的美国专利No.5,630,796(“the powderJectneedleless syringe device”)和国际公布No.WO 94/24263，WO 96/04947，WO 96/12513和WO96/20022中描述，并全部以引用的方式纳入本文。
如在美国专利No.5,630,796中描述的装置可为笔状装置，以从上到下的线性顺序依次包括贮气筒、颗粒盒或颗粒包，和与***相连的超声喷嘴。颗粒在合适的容器中，如由两张可破聚合膜形成的盒，该聚合膜被热封闭成一垫圈状隔圈以形成完备的封闭单位。可选择膜材料以获得特定的开口模式和破裂压力，这指明了超音流启动的条件。
运行时，促使装置将压缩气体从贮气筒释放到装置内的膨胀室。被释放的气体与颗粒盒接触，并在达到足够压力时，突然突破盒膜将颗粒导入超声喷嘴用以随后的释放。喷嘴被设计以获得特定的气体速度和流动方式以释放一定量颗粒到靶表面的预定区域。***用来减弱由超声气流所产生的噪音。
国际公布No.WO 96/20022中所描述的释放***也使用压缩气体源的能量来加速和释放粉状组合物。但是，不同于美国专利No.5,630,796中的***，它采用冲击波代替气体流加速颗粒。更具体地说，由冲击波在弹性圆顶(flexible dome)后面所形成的瞬时压力的升高撞击圆顶的背部，在沿靶表面方向引起弹性圆顶的突然外翻。这种突然外翻效应以足够的速度和动量发射出粉状组合物(其位于圆顶的外侧)，以穿透靶组织，如口腔粘膜组织。粉状组合物在圆顶完全外翻瞬间释放。该圆顶也完全包含高压气流，因此它并不与组织相接触。由于气体在该释放操作中并不释放，因此该***在本质上是安静的。这种设计可在其它密闭或其它非常敏感的应用中使用，例如以将颗粒释放到最小受损的手术部位。
颗粒可在体内直接释放给受试者，或体外释放给来自受试者的细胞，然后将转化细胞重新植入受试者。就在体内释放而言，颗粒注射一般是皮下注射、表皮注射、皮内注射、粘膜内注射(如鼻腔注射、直肠注射和/或***注射)、腹膜内注射、静脉注射、口腔注射或肌肉注射。优选地，释放到最终分化的细胞；但是，颗粒也可释放到未分化，或部分分化的细胞如血液和皮肤成纤维细胞的干细胞。最优选地，释放到皮肤表皮细胞。
颗粒以与剂量制剂相容的方式、并以在预防和/或治疗上有效的剂量被释放给受试者。该微粒组合物的“治疗有效剂量”是指足够治疗或预防疾病或病症症状，并将落入采用常规方法可测定的相对宽的范围内。一般地，颗粒以每单位剂量0.001到1000μg，更优选0.01到10.0μg的核酸剂量释放。但是，所需精确剂量根据接受治疗的个体的年龄和全身状况以及所选择的具体核酸序列，以及其它因素的不同而不同。通过临床检测可非常容易确定合适的有效剂量。就确定所需含量而言，《医师药学参考书》和Goodman和Gilman的《治疗的药理学基础》是有用的。
分析
差异表达分析
适当的元件有效性试验可确定元件对多肽表达的影响。检测元件有效性的比较基础是“基本载体”，一般(除非另外提及)是指质粒，它含hCMV启动子、hCMV外显子1、hCMV外显子2的9个碱基、HBVpreS2的5’UTR和兔β-珠蛋白_聚腺苷酸化区，它位于驱动编码序列表达处。一般地，基本载体是pJV7384、pJV7401、pJV7450或pJV7533。导入异源内含子和3’UTR，或将启动子序列、外显子、5’UTR和polyA位点导入基本载体中形成待测表达载体。因此，可检测功能变体或片段。
基本载体和待测载体被转化进入合适的宿主细胞和用于分析多肽表达水平的细胞中。优选地，使用哺乳动物宿主细胞。合适的细胞包括哺乳动物HEK 293T、CHO、HeLa、BHK、3T3或COS细胞。
一般地，功能元件会产生与基本载体相当的表达量，如至少相同或更高。优选地，在一种以上细胞类型并使用一个以上编码序列检测表达。
提供了合适的实验方法，例如下面的实施例1到13。
差异免疫原性分析
若所表达的多肽为抗原，进行另一检测以鉴定功能性构建体元件或特别优选的构建体元件。在此分析中，元件对免疫应答的影响在将表达载体释放到待测机体后测定。针对抗原的抗体水平是判断免疫应答的最为简单的方式。将不同组次的小鼠用如上构建的基本载体或待测载体接种。在恰当的时间后收集血清并分析抗体水平。
该实验进行了两次，并用两次实验所有组次中获得的抗体水平作坐标图。和基本载体相比，在两次实验中，功能元件针对一特定抗原将产生至少相同或更高的抗体滴度。优选地，可使用一个以上抗原观察到该结果，表明了在该表达系列中元件有效性的宽度。
提供了合适的实验方法，如下面的实施例14。
C.实验
下面是实施本发明的具体实施方案的实施例。这些实施例仅供说明，并非意在以任何方式限制本发明的范围。
已努力确保所使用的数字(如含量、温度等)的准确性，但是毫无疑问也应允许某些实验误差和偏差。
方法
标准PCR条件
下面是用于构建载体的标准PCR条件：1×PCR核心缓冲液w/1.5mM MgCl2(Promega Corporation，Madison，WI)，每种引物各0.400μM，每种dNTP(USB，Inc，Cleveland，OH)各200μM，2.5μTaq聚合酶(Promega Corporation，Madison，WI)，1.0ng模板DNA，加水到100μl，并用矿物油(Aldrich Chemical，Inc，Milwaukee，WI)覆盖。PTC-200热循环器(thermocycler)(MJ Research，Inc.Waltham，MA)被编程执行如下程序：4’@95℃，30个循环(1’@95℃/1’15”@55℃/1’@72℃)，10’@72℃，4℃保持)。在限制性内切酶(New EnglandBiolabs，Beverly，MA)剪切前，使用QIAquickPCR纯化试剂盒(Qiagen Inc，Valencia，CA)从PCR反应中取出扩增产物。
所有PCR产物在克隆后被测序以确定扩增的保真度。
实施例1.乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)载体系列的构建
构建了许多表达HBsAg的质粒表达载体。
原材料
(i)pWRG7128(Roy，M，et.al.Vaccine(2001) 19：764-778)，它含有hCMV立即早期启动子序列，hCMV主要立即早期基因的第一外显子、第一内含子和部分第二外显子，含侧翼区(来源于HBV preS25’UTR的序列和3′转录后应答元件)的HBsAg编码序列和牛生长激素聚腺苷酸化区(BGHpA)。
(ii)pJV7284，pWRG7128的衍生物，它用兔β珠蛋白聚腺苷酸化区(RBGpA)替换BGHpA。
(a)pJV7384(CMV(无内含子)、HBV preS2 5’UTR和RBGpA)
采用标准条件，用JF93(SEQ ID NO：15)和F110(SEQ ID NO：16)扩增pWRG7128，Sal 1和BamH 1剪切，以分离含CMV启动子、外显子1和部分外显子2序列的***片段。BamH 1和BstX 1剪切pAM6(ATCC，Mannassas，VA)，以分离含HBsAg 5’UTR和大概70％HBsAg编码区的***片段。Sal 1和BstX 1剪切pJV7284，以形成一载体片段，将两个***片段连接到该载体片段，得到pJV7293。
用引物GW1(SEQ ID NO：17)和JF254(SEQ ID NO：18)PCR扩增pWRG7128，并用BstX 1和Bgl2剪切以分离含HBsAg编码区3’端的***片段。BstX 1和Bgl2剪切pJV7293，以形成一载体片段，将***片段连接到载体片段，得到载体pJV7384。
(b)pJV7382(CMV(无内含子)、HBsAg 3’UTR、HBV preS2 5’UTR和RBGpA)
Xho 1和Xba 1剪切pJV7293，以形成含CMV启动子/外显子和具有HBsAg编码序列5’端的5’-UTR的***片段。Xba 1和Bcl 1剪切pWRG7128，以形成含大部分HBsAg编码序列和其3’-UTR的***片段。Xho 1和Bgl 2剪切pJV7284，以形成一载体片段，将两个***片段连接到该载体片段，得到载体pJV7382。
(c)pJV7389(CMV(RIA))、HBsAg 3’UTR、HBV preS2 5’UTR和RBGpA)
使用引物GW150(SEQ ID NO：19)和JF255(SEQ ID NO：20)将大鼠胰岛素内含子A(RIA)从质粒p5’rlns(来源未知)PCR扩增。BamH 1剪切PCR产物，并***经BamH 1线性化的pJV7382，得到pJV7389。
(d)pJV7387(CMV(RIA))、HBV preS2 5’UTR和RBGpA)
BstX 1和EcoR 1剪切pJV7384，以形成含HBsAg编码区的3’端和RBGpA的***片段。BstX 1和EcoR 1剪切pJV7389，以形成一载体片段，将***片段连接到该载体片段，得到载体pJV7387。
实施例2.单纯疱疹病毒糖蛋白D抗原(HSVgD)载体系列的构建
构建了许多表达HSVgD的质粒表达载体。
原材料
(a)pJV7334，pWRG7284(pJV 7284)的衍生物，紧邻ATG起始密码子下游的框内Nhe 1置换HBsAg编码序列，后继带有BamH1的填充片段，紧接HBC Enh的5’端。
(b)pWRG7202，含填充片段的pGem3Z(Promega)的衍生物，该填充片段为编码序列融合到Nhe 1位点下游的人组织纤溶酶原激活剂(TPA)信号肽提供了可能。
(a)pJV7392(CMV(天然内含子)、HBsAg 3’UTR、HBsAg 5’UTR和RBGpA)
用引物DS1(SEQ ID NO：21)和DA1(SEQ ID NO：22)从病毒DNA原种(Adcanced Biotech，Inc，Columbia，MD)PCR扩增HSV2gD的编码区，并用Nhe 1和EcoR 1剪切，以形成一***片段。Nhe 1和EcoR 1剪切pJV7202，以形成一载体片段，将***片段连接到该载体片段，产生载体pJV7391。
Nhe 1和Bgl 2剪切pJV7391，以形成含HSV2gD编码序列的***片段。Nhe 1和BamH 1剪切pJV7334，以形成一载体片段，将***片段连接到该载体片段，产生载体pJV7392。该载体由下列表达元件组成：hCMV立即早期启动子序列，hCMV主要立即早期基因的第一外显子、第一内含子和部分第二外显子，HBsAg 5’-UTR、HSV2gD基因的编码序列、HBsAg 3’-UTR和RBGpA。
(b)pJV7399(CMV(无内含子)、HBsAg 3’UTR、HBsAg 5’UTR和RBGpA)
按如下方法构建无内含子的pJV7392。Hind 3和Nde 1剪切pJV7384，以分离含卡那霉素抗性基因5’端和CMV启动子的***片段。Nde 1和Ssp 1剪切pJV7384，以分离含CMV启动子3’端、CMV外显子1/2和HBsAg 5’-UTR的5’端的***片段。该***片段***pJV7392中，并且除去Hind 3-Ssp 1片段，得到pJV7399。
(c)pJV7400(CMV(RIA)、HBsAg 3’UTR、HBsAg 5’UTR和RBGpA)
按如下方法构建含RIA的pJV7392。Hind 3和Nde 1剪切pJV7384，以分离含卡那霉素抗性基因5’端和CMV启动子的***片段。Nde 1和Ssp 1剪切pJV7387，以分离含CMV启动子3’端、CMV外显子1/2(部分)、RIA和HBsAg 5’-UTR 5’端的***片段。该***片段***pJV7392中，并且除去Hind 3-Ssp 1片段，得到pJV7400。
(d)pJV7401(CMV(无内含子)、HBsAg 5’UTR和RBGpA)
按如下方法构建无3’-UTR的pJV7399。Bsp 120I和Bgl 2剪切pJV7391，以分离含HSV2 gD基因的3’端的***片段。Bgl 2和EcoR 1剪切pJV7284，以分离RBGpA信号。该***片段***pJV7399中，并且除去Bsp 120I-EcoR 1片段，得到pJV7401。
(e)pJV7402(CMV(RIA)、HBsAg 5’UTR和RBGpA)
按如下方法构建无3’-UTR的pJV7400。Bsp 1201和Bgl 2剪切pJV7391，以分离含HSV2 gD基因3’端的***片段。Bgl 2和EcoR 1剪切pJV7284，以分离RBGpA信号。该***片段连接到pJV7400中，并且除去Bsp 120I-EcoR 1片段，得到pJV7402。
实施例3.Flu M2抗原载体系列的构建
(a)pJV7450(CMV(无内含子)、HBsAg 5’UTR和RBGpA)
使用引物JF301(SEQ ID NO：23)和JF302(SEQ ID NO：24)从质粒pFL-M2(Joel Haynes，PJV)PCR扩增Flu M2编码区，并用Nhe 1和Bgl2剪切，以形成一***片段。Nhe 1和Bgl2剪切pJV7401，以形成一载体片段，***片段连接到其中，得到pJV7450。
(b)pJV7452(CMV(无内含子)、HBsAg 3’UTR、HBsAg 5’UTR和RBGpA)
使用引物JF84(SEQ ID NO：25)和JF225(SEQ ID NO：26)从pJV7389 PCR扩增3’UTR片段，Bsp 120I剪切、T4 DNA聚合酶填充，Bgl 2接头(cat# 1036，New England Biolabs)连接。Bgl2和EcoR1剪切该片段，以分离含HBsAg 3’UTR和RBGpA区的***片段。Bgl2和EcoR1剪切pJV7450，以形成一载体片段，***片段连接到其中，得到pJV7452。
(c)pJV7458(CMV(RIA)、HBsAg 5’UTR和RBGpA)
按如下方法构建含RIA的pJV7450：BamH 1剪切pJV7389，以分离含RIA的***片段。BamH 1剪切pJV7450，以形成载体片段，***片段连接到其中，得到pJV7458。
(d)pJV7468(CMV(RIA)、HBsAg 3’UTR、HBsAg 5’UTR和RBGpA)
按如下方法构建含HBsAg 3’UTR的pJV7458。Bgl2和EcoR1剪切pJV7452，以制备含HBsAg 3’UTR和RBGpA的***片段。Bgl 2和EcoR 1剪切pJV7458，以形成一载体片段，***片段连接到其中，得到pJV7468。
实施例4.β-gal载体系列的构建
(a)pJV7488(CMV(无内含子)、HBsAg 3’UTR、HBsAg 5’UTR和RBGpA)
使用引物JF335(SEQ ID NO：27)和JF336(SEQ ID NO：28)扩增CMV-(Clontech)，并用Nhe 1和Bgl 2剪切，以分离编码β-半乳糖苷酶的***片段。Nhe 1和Bgl 2剪切pJV7452，以形成一载体片段，***片段连接到其中，得到pJV7488。
(b)pJV7533(CMV(无内含子)、HBsAg 5’UTR和RBGpA)
Bgl2和EcoR 1剪切pJV7450，以分离含RBGpA的***片段。Bgl2和EcoR 1剪切pJV7488，以形成一载体片段，***片段连接到其中，得到pJV7533。
(c)pJV7551(CMV(RIA/Nhel)、HBsAg 3’UTR、HBsAg 5’UTR和RBGpA)
Xho 1和BamH 1剪切pJV7530(见实施例5)，以分离含穿过RIA的CMV启动子的***片段。Xho 1和BamH 1剪切pJV7488，以形成一载体片段，***片段连接到其中，得到pJV7551。
(d)pJV7552(CMV(RIA/Nhel)、HBsAg 5’UTR和RBGpA)
Xho 1和BamH 1剪切pJV7530，以分离含穿过RIA的CMV启动子的***片段。Xho 1和BamH 1剪切pJV7533，以形成一载体片段，***片段连接到其中，得到pJV7552。
实施例5.pJV表达载体(pJV7563)的构建
(a)pJV7496
使用引物JF357(SEQ ID NO：29)和JF365(SEQ ID NO：30)PCR扩增pJV7389，T4 DNA聚合酶处理钝化末端，Sal 1剪切，以分离编码卡那霉素抗性基因的***片段。Ava 1剪切pJV7389，T4 DNA聚合酶处理钝化末端，Sal 1剪切，以分离一载体片段，***片段连接到其中，得到pJV7496。
(b)pJV7530
使用引物JF393(SEQ ID NO：31)和JF406(SEQ ID NO：32)PCR扩增pJV7389，Bgl2和BamH 1剪切，以分离含RIA(缺失内部Nhe1位点)的***片段。BamH 1剪切pJV7496，以制备一载体片段，***片段连接到其中，得到pJV7530。
(c)pJV7549
BamH 1和EcoR5剪切pJV7468，以分离含M2和部分HBV 3’ENH的***片段。BamH 1和EcoR5剪切pJV7530，以制备一载体片段，***片段连接到其中，得到pJV7549。
(d)pJV7563
将引物JF256(SEQ ID NO：33)和JF257(SEQ ID NO：34)退火以制备由多克隆位点组成的***片段。Nhe 1和Bgl2剪切pJV7549，以制备一载体片段，***片段连接到其中，得到pJV7563。图12示出pJV7563质粒图谱。图13给出质粒pJV7563的碱基组成。质粒pJV7563中的元件及其位置如下所示：
1-44转座子903序列
45-860来自转座子903的卡那霉素抗性编码序列
861-896转座子903序列
897-902 Sal1位点
903-1587 CMV启动子
1588-1718来自CMV立即早期基因的非翻译前导序列
1719-1724 BamH1和Bglll限制性酶的融合
1725-1857大鼠胰岛素内含子A
1858-1863 BamH1位点
1864-1984 HBV表面抗原5’非翻译前导序列
1985-1993合成起始密码子/Nhe1克隆位点
1994-2011合成克隆位点
2012-2544 HBV增强子
2545-2555原载体序列。NCBI数据库中没有命中结果
2556-2686兔β-珠蛋白聚腺苷酸化区
2687-3759 pUC19载体序列
实施例6.使用人分泌型碱性磷酸酶(SEAP)和人IgG Fc片段(hFc)作为模型抗原，构建信号肽表达载体系列
(i)pJV7507(hTPAsp和SEAP)
使用引物JF320(SEQ ID NO：35)和JF321(SEQ ID NO：36)PCR扩增pSEAP-Basic(Clontech)，Nhe 1和Bgl 2剪切，以分离由人SEAP片段组成的***片段。Nhe 1和Bgl 2剪切pJV7079(Macklin，et.al.)，以制备一载体片段，***片段连接到其中，得到pJV7507。
(ii)pJV7508(hTPAsp和hFc)
使用引物JF386(SEQ ID NO：37)和FcAS(SEQ ID NO：38)PCR扩增人DNA，Nhe 1和Bgl 2剪切，以分离由人IgG Fc片段组成的***片段。Nhe 1和Bgl 2剪切pJV7079，以制备一载体片段，***片段连接到其中，得到pJV7508。
(iii)抑肽酶信号肽编码序列的制备
使用引物JF355(SEQ ID NO：40)和JF356(SEQ ID NO：41)PCR扩增合成的寡核苷酸JF354(SEQ ID NO：39)，以形成抑肽酶信号肽的编码序列。
(iv)烟草伸展蛋白信号肽编码序列的制备
使用引物JF349(SEQ ID NO：43)和JF350(SEQ ID NO：44)PCR扩增合成的寡核苷酸JF348(SEQ ID NO：42)，以形成烟草伸展蛋白信号肽的编码序列。
(v)鸡溶菌酶信号肽编码序列的制备
使用引物JF352(SEQ ID NO：46)和JF353(SEQ ID NO：47)PCR扩增合成的寡核苷酸JF351(SEQ ID NO：45)，以形成鸡溶菌酶信号肽的编码序列。
(a)Flu M2抗原信号肽系列
pJV7499(CMV(无内含子)、HBsAg5’UTR、RBGpA、抑肽酶信号肽)
pJV7497(CMV(无内含子)、HBsAg5’UTR、RBGpA、烟草伸展蛋白信号肽)
pJV7500(CMV(无内含子)、HBsAg5’UTR、RBGpA、鸡溶菌酶信号肽)
SPe 1和Nhe 1剪切信号肽编码序列，以分离***片段。Nhe 1剪切pJV7450，以制备载体片段，***片段连接到其中，得到pJV7499(抑肽酶)、pJV7497(烟草伸展蛋白)和pJV7500(鸡溶菌酶)。
(b)SEAP信号肽系列
pJV7513(CMV(无内含子)、HBsAg5’UTR、RBGpA、抑肽酶信号肽)
pJV7512(CMV(无内含子)、HBsAg5’UTR、RBGpA、烟草伸展蛋白信号肽)
pJV7510(CMV(无内含子)、HBsAg5’UTR、RBGpA、鸡溶菌酶信号肽)
Xho 1和Nhe 1剪切pJV7499、7497和7500，以分离由穿过质粒的信号肽编码序列的CMV启动子组成的***片段。Xho 1和Nhe 1剪切pJV7507，以制备载体片段，***片段连接到其中，得到pJV7513(抑肽酶)、pJV7512(烟草伸展蛋白)和pJV7510(鸡溶菌酶)。
(c)hFc信号肽系列
pJV7524(CMV(无内含子)、HBsAg5’UTR、RBGpA、抑肽酶信号肽)
pJV7525(CMV(无内含子)、HBsAg5’UTR、RBGpA、烟草伸展蛋白信号肽)
pJV7526(CMV(无内含子)、HBsAg5’UTR、RBGpA、鸡溶菌酶信号肽)
Xho 1和Nhe 1剪切pJV7499、7497和7500，以分离由穿过质粒的信号肽编码序列的CMV启动子组成的***片段。Xho 1和Nhe 1剪切pJV7508，以制备载体片段，***片段连接到其中，得到pJV7524(抑肽酶)、pJV7525(烟草伸展蛋白)和pJV7526(鸡溶菌酶)。
实施例7.人分泌型碱性磷酸酶(SEAP)系列的构建
(a)pJV7531(CMV(无内含子)、HBsAg5’UTR、RBGpA、鸡溶菌酶信号肽)
Sal 1和Bgl 2剪切pJV7510，以分离含穿过溶菌酶信号肽的CMV启动子的***片段。Sal 1和Bgl 2剪切pJV7450，以形成载体片段，***片段连接到其中，得到pJV7531。
(b)pJV7554(CMV(RIA/Nhe1)、HBsAg5’UTR、RBGpA、鸡溶菌酶信号肽)
Xho 1和BamH 1剪切pJV7530，以分离含穿过RIA的CMV启动子的***片段。Xho 1和BamH 1剪切pJV7531，以形成载体片段，***片段连接到其中，得到pJV7554。
(c)pJV7568(CMV(无内含子)、HBsAg 3’UTR、HBsAg5’UTR、RBGpA、鸡溶菌酶信号肽)
Bgl 2和EcoR 1剪切pJV7563，以分离含HBV 3’UTR和RBGpA的***片段。Bgl 2和EcoR 1剪切pJV7531，以形成载体片段，***片段连接到其中，得到pJV7568。
(d)pJV7572(CMV(RIA/Nhel)、HBsAg 3’UTR、HBsAg5’UTR、RBGpA、鸡溶菌酶信号肽)
Bgl 2和EcoR 1剪切pJV7563，以分离含HBV 3’UTR和RBGpA的***片段。Bgl 2和EcoR 1剪切pJV7554，以形成载体片段，***片段连接到其中，得到pJV7572。
实施例8.使用鸡角蛋白和鸡心脏的肌动蛋白内含子构建β-gal和HBsAg载体
(a)pJV7557(β-gal、CMV(cA内含子)、HBsAg3’UTR、HBsAg5’UTR和RBGpA)
使用引物JF430(SEQ ID NO：48)和JF442(SEQ ID NO：49)PCR扩增鸡DNA，Bgl 2和BamH 1剪切，以分离由鸡心脏的肌动蛋白的内含子和侧翼外显子序列组成的***片段。BamH 1剪切pJV7488，以制备载体片段，***片段连接到其中，得到pJV7557。
(b)pJV7558(β-gal、CMV(cK内含子)、HBsAg3’UTR、HBsAg5’UTR和RBGpA)
使用引物JF421(SEQ ID NO：50)和JF444(SEQ ID NO：51)PCR扩增鸡DNA，Bgl 2和BamH 1剪切，以分离由鸡角蛋白基因的内含子和侧翼外显子序列组成的***片段。BamH 1剪切pJV7488，以制备载体片段，***片段连接到其中，得到pJV7558。
(c)pJV7578(HBsAg、CMV(cA内含子)、HBsAg3’UTR、HBsAg5’UTR和RBGpA)
Sal 1和BamH 1剪切pJV7557，以分离由穿过内含子区的CMV启动子组成的***片段。Sal 1和BamH 1剪切pJV7496，以制备载体片段，***片段连接到其中，得到pJV7558。
(d)pJV7579(HBsAg、CMV(cA内含子)、HBsAg3’UTR、HBsAg5’UTR和RBGpA)
Sal 1和BamH 1剪切pJV7558，以分离由穿过内含子区的CMV启动子组成的***片段。Sal 1和BamH 1剪切pJV7496，以制备载体片段，***片段连接到其中，得到pJV7579。
实施例9.HBsAg载体系列抗原表达的离体分析
在第一天，SCC15(ATCC)或B16(来源未知，ATCC可得)细胞以20％-40％汇合(confluency)接种到6孔组织培养板，并在培养箱中过夜生长。宿主细胞在ATCC推荐的培养液中增殖。
在第二天，实施转染反应。对每种待测载体而言，将20μlLipofectin试剂(Life Technologies Inc，Grand Island，NY)加入180μl Optimem培养液(Life Technologies Inc，Grand Island，NY)，并在室温下孵育45min。对每种待测载体，在40min时，2μg载体与200μl Optimem混合。在45min时，将载体和Lipofection溶液混合在一起，并在室温下再静置10分钟。在最后孵育期间，将接种的宿主细胞从培养箱中取出并用Optimem培养液洗涤两次。在10min时，将1.6mlOptimem加入Lipofectin/载体混合物，并将1ml所得混合物加到两个细胞孔中。将宿主细胞再次放入培养箱并静置5小时，在5小时时，去除Lipofectin/载体混合物，并换上标准细胞生长液。
在更换培养液后18到24小时，从组织培养板中取出从50到100μl的细胞生长液，将该样本放入AUSZYMEMonoc Ional诊断试剂盒(Abbott Laboratories，Abbott Park，IL)中的反应池，分析抗原表达水平。待测样本的体积用PBS调至200μl，然后每个样本中加入50μl缀合物和反应微球。反应池在40℃孵育80min，此后，洗去孔中所有液体反应组分。将反应微球转移到新的试管中，此后加入300μl显色反应缓冲液。30分钟后加入1M硫酸终止显色反应，并在490nm测定反应的吸光度。图1中示出的数据是两次实验中两个孔的平均吸光度。
如图1所示，将RIA、HBV 3’UTR或两者共同导入基本载体(CMV启动子、外显子和聚腺苷酸化区)提高了SCC15细胞中HBsAg的表达。如图2所示，将鸡角蛋白或鸡心脏的肌动蛋白内含子导入基本载体(CMV启动子、外显子、HBV 3’UTR和聚腺苷酸化区)提高了SCC15细胞中HBsAg的表达。
实施例10.β-gal载体系列抗原表达的离体分析
如实施例9所述，转染SSC-15或B16宿主细胞。
在更换培养液后的18到40小时，去除培养液上清，并用PBS洗涤细胞。去除洗涤液后，用500μl裂解缓冲液(50mM NaPO4、0.1％Triton X-100，pH7)孵育细胞5min，以裂解细胞，然后采用物理方法将细胞刮离塑料皿。将裂解液离心两分钟以除去细胞碎片，并将10到25μl澄清裂解液加入到500μl反应缓冲液(80ug/ml邻硝基苯-吡喃半乳糖苷(o-nitrophenyl galactopyranoside)、50mM NaPO4，pH7)并在37℃孵育10到20分钟。加入500μl 1M Na2CO3中止反应并在405nm读取吸光度。数据用增强载体(含有内含子、HBVenh或两者均含有)的表达量与基本载体的表达量的比率表示。
RIA、HBV 3’UTR或两者共同加入基本载体(CMV启动子、外显子和聚腺苷酸化区)提高了β-gal在两种细胞系中的表达。图3示出了SCC15细胞得到的结果。将鸡角蛋白或鸡心脏的肌动蛋白内含子加到基本载体(CMV启动子、外显子、HBV 3’UTR和聚腺苷酸化区)提高了β-gal在两种细胞系中的表达。图2示出了B16细胞得到的结果。
实施例11.HSV gD载体系列抗原表达的离体分析
如实施例9所述，转染SSC15或B16宿主细胞。转染18小时后，将板冰浴15min。然后用2ml PBS(Biowhittaker，Walkwille，MD)洗涤各孔。0.05％ PBS稀释的戊二醛(Polysciences Inc，Warrington，PA)固定细胞，并在室温下孵育30min。随后所有的孵育在室温下持续1小时并在每次孵育之间，进行如上所述的洗涤。用2ml 5％奶粉(溶于PBS)(Bio Rad Laboratories，Melville，NY)封闭板中的细胞。随后用2％奶粉/PBS/0.05％Tween-20(Sigma，St.Louis，MO)1∶1000稀释的抗gD单克隆抗体(ABI，Columbia，MD)1ml和用PBS/0.1％Tween-20 1∶2500稀释的山羊抗小鼠HRP(KPL，Gaithersburg，MD)1ml孵育。用1ml TMB微孔底物(BioFX，OwingsMills，MD)进行显色反应。1M H2SO4终止反应，将液体转移到塑料比色皿中并在450nm读取光密度值。数据用增强载体(含有内含子、HBVenh或两者均含有)的表达量与基本载体的表达量的比率表示。
将含或不含HBV 3’UTR的RIA导入到基本载体(CMV启动子、外显子和聚腺苷酸化区)，提高了HSV gD在两种细胞中的表达。图4示出了SC15得到的结果。
实施例12.SEAP载体系列抗原表达的离体分析
如实施例9所述，转染SSC-15或B16宿主细胞。在更换培养液后18到40小时，去除培养液上清，并将上清在70℃加热30min。将10-25μl热灭活的上清与1/10体积的100mM I-高精氨酸一起孵育5min。将500μl碱性磷酸酶反应缓冲液(cat#172-1063，Bio-Rad，根据说明书制备)加入该裂解液并在37℃孵育10到20min。加入500μl 1M NaOH终止反应并在405nm读取吸光度。数据用增强载体(含有内含子、HBVenh或两者均含有)的表达量与基本载体的表达量的比率，或实验组信号肽的表达量与人TPA信号肽载体的表达量的比率表示。
如图5所示，RIA、HBV 3’UTR或两者一起导入基本载体(CMV启动子、外显子和聚腺苷酸化区)提高了SEAP在B16细胞中的表达。出乎意料的是，仅仅将HBV 3’UTR导入基本载体(CMV启动子、外显子和聚腺苷酸化区)提高了SEAP在SCC15细胞中的表达。
将牛抑肽酶、鸡溶菌酶或烟草伸展蛋白的信号肽加入到成熟的SEAP的N端，为SEAP有效分泌进入两种细胞系的细胞培养液上清提供了可能。图6示出B16细胞的结果。
实施例13.人IgG Fc片段信号肽系列抗原表达的离体分析
如实施例9所述，转染SSC-15或B16宿主细胞。在更换培养液后的18到40小时，去除培养液上清。
ELISA板(Costar)每孔加入100μl山羊抗人IgG(Sigma#I3382，用碳酸盐包被缓冲液1/1000稀释)，并在4℃过夜孵育。随后所有的孵育均在室温下持续1小时，并在每次孵育之间用洗涤液(10mM Tris、150mM NaCl、0.1％Brij-35，pH8.0)洗涤。然后用100μl 5％奶粉(溶于PBS)封闭，随后与用稀释缓冲液(2％奶粉、PBS、0.05％Tween-20)系列稀释的培养液上清一起孵育。然后与100μl每孔的山羊抗人IgG/HRP(Sigma#A6029，稀释缓冲液1/5000稀释)一起孵育，然后用100μl TMB微孔底物进行显色反应。用100μl 1M H2SO4终止反应，并在405读取吸光度。数据用实验组信号肽的表达量与人TPA信号肽载体的表达量的比率表示。
将牛抑肽酶、鸡溶菌酶或烟草伸展蛋白的信号肽加入到人Fc片段的N端，为hFc有效分泌进入两种细胞系的细胞培养液上清提供了可能。图6示出B16细胞的结果。
实施例14.HBsAg、HSVgD和Flu-M2质粒表达载体在小鼠的免疫接种中的应用
a.免疫接种药筒的制备
对每个待测质粒而言，称取25mg 2微米金粉到离心管中，在加入250μl等份50mM亚精胺(Aldrich Chemical，Inc，Milwaukee，WI)后，振荡试管并经短时间的超声破碎。离心去除金粉，换上100μl新鲜的亚精胺。振荡使金粉重新悬浮，然后将25μg DNA加入试管中混合。边轻轻振荡试管，边加入100μl 10％CaCl2(Fujisawa USA，Inc，Deerfield，IL)，以在金珠上沉淀DNA。沉淀反应可在工作台面上进行10min，随后通过短时间离心收集金珠并用无水乙醇(SpectrumQuality Products，Inc，Gardena，CA)洗涤三次，以除去过量的沉淀试剂。然后用溶于无水乙醇的3.6ml 0.05mg/ml聚乙烯吡咯烷酮(360KD，Spectrum Quality Products，Inc，Gardena，CA)重悬洗涤后的金珠/DNA复合物。然后将此浆液注入位于旋管器(tube turner，PowderJect Vaccines)中的Tefzel管(McMaster-Carr，Chicago，IL)中，用金珠/DNA复合物包被Tefzel管内侧。在旋管过程完成后，试管被切成0.5”的疫苗“针剂”，该针剂被负载于XR1装置(PowderJectVaccines)中，以释放给小鼠。
b.接种程序
用Ketaset(Fort Dodge)和Rompun(Bayer)的混合物麻醉4到6周龄的小鼠。用电动剪毛机剃腹部以除去体毛，通过XR1装置(450psi)将两个疫苗“针剂”无交叠地释放到剃毛区。将动物放回笼中并在接种后6周采血。Balb/c小鼠用于评估HBsAg表达载体，SwissWebster小鼠用于评估HSV-gD和Flu M2表达载体。
血清中抗-HBsAg抗体的分析
在第六周从接种动物获取血样。将从血样中分离的血清放入AUSABEIA诊断试剂盒(Abbott Laboratories，Abbott Park，IL)的反应池的孔中。所加血清的体积取决于样本的抗体滴度，将样本用样本稀释缓冲液稀释以落入用定量分析板可获得的值内。从AUSAB定量分析板(Abbott Laboratories，Abbott Park，IL)每个小瓶中取出200μl加入到反应池的孔中。每孔中加入一个微球，随后密封反应池并在40℃孵育二小时，然后洗去孔中所有的液体反应组分。每孔加入200μl缀合物混合物，随后密封反应池并在40℃孵育二小时，然后洗去孔中所有的液体反应组分。珠被转移到新的试管，随后加入300μl显色反应缓冲液。30分钟时加入1M硫酸终止显色反应，并用Quantum II分光光度计(Abbott Laboratories，Abbott Park，IL)490nm检测反应物的吸光度。通过将样本的吸光度与由定量板产生的标准曲线相比较，分光光度计可以计算样本的抗体水平。然后用稀释因子矫正抗体水平。图7所示数据是用某一特定载体接种的所有动物的几何平均滴度。
血清中抗Flu M2抗原抗体的分析
用浓度为1μg/ml的合成Flu M2肽(QCB/Biosource，Hopkinton，MA)(溶于PBS(Biowhittaker，Walkerville，MD))包被96孔Costar培养液结合ELISA板(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)，并在4℃过夜孵育。10mM Tris(Sigma，St.Louis，MO)/150mM NaCl(FisherScientific)/0.1％Brij-35(Sigma)将板洗涤三次，然后用5％奶粉(BioRad Laboratories，Melville，NY)(溶于PBS)室温封闭1小时。随后所有的孵育均在室温下进行1小时，并如上所述在每次孵育之间洗涤。2％奶粉/PBS/0.05％Tween-20(Sigma)稀释样本小鼠血清、标准品(高滴度，抗M2小鼠血清)和阴性对照(抗HBsAg小鼠血清)，并在ELISA板中孵育。用2％奶粉/PBS/0.05％Tween-20 1∶8000稀释山羊抗小鼠IgG(H+L)生物素缀合的抗体(Southern BiotechnologyAssociate，Birmingham，AL)，随后用PBS/0.1％Tween-20 1∶8000稀释链霉亲和素-辣根过氧化物酶缀合物(Southern Biotechnology)。用底物TMB(BioFX，Owings Mills，MD)进行显色反应。用1M H2SO4终止反应并用超精酶标仪(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)在450nm读取吸光度。使用SoftMax Pro 4.1软件(Molecular Devices)，四参数分析计算端点滴度，并将滴度根据具有已知滴度的标准血清进行标准化，以将组间和组内的变异最小化。结果如图7所示。
血清中抗HSV gD抗原抗体的分析
用浓度为1μg/ml的HSV gD(Viral Therapeutics，Ithaca，NY)蛋白(溶于PBS(Biowhittaker，Walkerville，MD))包被96孔Costar培养液结合ELISA板(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)，并在4℃过夜孵育。10mM Tris(Sigma，St.Louis，MO)/150mM NaCl(FisherScientific)/0.1％Brij-35(Sigma)将板洗涤三次，然后用5％奶粉(BioRad Laboratories，Melville，NY)(溶于PBS)室温封闭1小时。随后所有的孵育均在室温下进行1小时，并如上所述在每次孵育之间洗涤。2％奶粉/PBS/0.05％Tween-20(Sigma)稀释样本小鼠血清、标准品(高滴度，抗gD小鼠血清)和阴性对照(抗HBsAg小鼠血清)，并在ELISA板中孵育。用2％奶粉/PBS/0.05％Tween-20 1∶8000稀释山羊抗小鼠IgG(H+L)生物素缀合的抗体(Southern BiotechnologyAssociate，Birmingham，AL)，随后用PBS/0.1％Tween-20 1∶8000稀释链霉亲和素-辣根过氧化物酶缀合物(Southern Biotechnology)。用底物TMB(BioFX，Owings Mills，MD)进行显色反应。用1M H2SO4终止反应并用超精酶标仪(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)在450nm读取吸光度。使用SoftMax Pro 4.1软件(Molecular Devices)，四参数分析计算端点滴度，并将滴度根据具有已知滴度的标准血清进行标准化，以将组间和组内的变异最小化。结果如图7所示。
因此，描述了新的核酸构建体、含有这些构建体的组合物以及使用这些组合物的核酸免疫接种技术。尽管本发明的优选的实施方案已经详细描述，应该理解的是：可进行明显的修改，但并不背离本发明的宗旨以及所附权利要求书中所定义的本发明的范围。
                           序列表
<110>宝德杰克特疫苗有限公司等
<120>核酸构建体
<130>N.90070A GCW/DP
<140>PCT/GB2004/004279
<141>2004-10-11
<150>US 60/509,936
<151>2003-10-10
<160>53
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>685
<212>DNA
<213>人巨细胞病毒
<400>1
aatattggct attggccatt gcatacgttg tatctatatc ataatatgta catttatatt    60
ggctcatgtc caatatgacc gccatgttga cattgattat tgactagtta ttaatagtaa    120
tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac ataacttacg    180
gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg    240
tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta    300
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ataagcagag ctcgtttagt gaacc                                          685
<210>2
<211>131
<212>DNA
<213>人巨细胞病毒
<400>2
gtcagatcgc ctggagacgc catccacgct gttttgacct ccatagaaga caccgggacc    60
gatccagcct ccgcggccgg gaacggtgca ttggaacgcg gattccccgt gccaagagtg    120
actcaccgtc c                                                         131
<210>3
<211>135
<212>DNA
<213>大鼠(Rattus rattus)
<400>3
atcagcaagc aggtatgtac tctccagggt gggcctggct tccccagtca agactccagg    60
gatttgaggg acgctgtggg ctcttctctt acatgtacct tttgctagcc tcaaccctga    120
ctatcttcca ggtca                                                     135
<210>4
<211>955
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合启动子序列
<400>4
aatattggct attggccatt gcatacgttg tatctatatc ataatatgta catttatatt    60
ggctcatgtc caatatgacc gccatgttga cattgattat tgactagtta ttaatagtaa    120
tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac ataacttacg    180
gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg    240
tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta    300
cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtcc gccccctatt    360
gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac cttacgggac    420
tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt gatgcggttt    480
tggcagtaca ccaatgggcg tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc aagtctccac    540
cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc aacgggactt tccaaaatgt    600
cgtaataacc ccgccccgtt gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg ggaggtctat    660
ataagcagag ctcgtttagt gaaccgtcag atcgcctgga gacgccatcc acgctgtttt    720
gacctccata gaagacaccg ggaccgatcc agcctccgcg gccgggaacg gtgcattgga    780
acgcggattc cccgtgccaa gagtgactca ccgtccggat ctcagcaagc aggtatgtac    840
tctccagggt gggcctggct tccccagtca agactccagg gatttgaggg acgctgtggg    900
ctcttctctt acatgtacct tttgcttgcc tcaaccctga ctatcttcca ggtca         955
<210>5
<211>121
<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒
<400>5
cagagtcagg ggtctgtatt ttcctgctgg tggctccagt tcaggaacag taaaccctgc    60
tccgaatatt gcctctcaca tctcgtcaat ctccgcgagg actggggacc ctgtgacgaa    120
c                                                                    121
<210>6
<211>57
<212>DNA
<213>单纯疱疹病毒
<400>6
ataagctgca ttgcgaacca ctagtcgccg tttttcgtgt gcatcgcgta tcacggc       57
<210>7
<211>48
<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒
<400>7
ctttgtacta ggaggctgta ggcataaatt ggtctgttca ccagcacc                 48
<210>8
<211>533
<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒
<400>8
taacaaaaca aaaagatggg gttattccct aaacttcatg ggttacgtaa ttggaagttg    60
ggggacattg ccacaagatc atattgtaca aaagatcaaa cactgtttta gaaaacttcc    120
tgtaaacagg cctattgatt ggaaagtatg tcaaaggatt gtgggtcttt tgggctttgc    180
tgctccattt acacaatgtg gatatcctgc cttaatgcct ttgtatgcat gtatacaagc    240
taaacaggct ttcactttct cgccaactta caaggccttt ctaagtaaac agtacatgaa    300
cctttacccc gttgctcggc aacggcctgg tctgtgccaa gtgtttgctg acgcaacccc    360
cactggctgg ggcttggcca taggccatca gcgcatgcgt ggaacctttg tggctcctct    420
gccgatccat actgcggaac tcctagccgc ttgttttgct cgcagccggt ctggagcaaa    480
gctcatagga actgacaatt ctgtcgtcct ctcgcggaaa tatacatcgt ttc           533
<210>9
<211>158
<212>DNA
<213>猿巨细胞病毒
<400>9
gtcagacaga cagacagtta tatgggctgg tccctataac tctgccattg taaccccata    60
tagccagaca gttagcattg catctattga tgatgtacta atgtattgta acccccccta    120
tgccattgtc taactgtact aatgtatgat attatacc                            158
<210>10
<211>131
<212>DNA
<213>家兔(Oryctolagus cuniculus)
<400>10
gatctttttc cctctgccaa aaattatggg gacatcatga agccccttga gcatctgact    60
tctggctaat aaaggaaatt tattttcatt gcaatagtgt gttggaattt tttgtgtctc    120
tcactcggaa g                                                         131
<210>11
<211>204
<212>DNA
<213>猿巨细胞病毒
<400>11
atatatactc tatgttatac tctatgatat acaatatata ctcatgaaca ctatgtactt    60
ggtgtatgac tcattattgt ctgggacttg gttgggactt ggttggttgg gaagaatgtt    120
gtgcctgtac ttgtgctgtg ctgtggatct caataaatgt gactatgttc aaaacactaa    180
gtgcccccgt gtcttcttta acta                                           204
<210>12
<211>163
<212>DNA
<213>单纯疱疹病毒2
<400>12
gaagacgagc tctaagggag gggaggggag ctgggcttgt gtataaataa aaagacaccg    60
atgttcaaaa atacacatga cttctggtat tgttttgcct tggtttttat ttgggggggg    120
gggggcgtgt gactagaaaa acaaatgcag acatgtgcta acg                      163
<210>13
<211>191
<212>DNA
<213>人***状瘤病毒16型
<400>13
aattgttaca tataattgtt gtataccata acttactatt ttttcttttt tattttcata    60
tataattttt ttttttgttt gtttgtttgt tttttaataa actgttatta cttaacaatg    12
cgacacaaac gttctgcaaa acgcacaaaa cgtgcatcgg ctacccaact ttataaaaca    180
tgcaaacagg c                                                         191
<210>14
<211>3759
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>pJV表达载体
<220>
<221>内含子
<222>(1725)..(1857)
<223>大鼠胰岛素内含子A
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(44)
<223>Tn903，pUC4K残余
<220>
<221>misc_feature
<222>(861)..(896)
<223>Tn903，pUC4K残余
<220>
<221>misc_feature
<222>(897)..(902)
<223>pUC19 MCS
<220>
<221>聚腺苷酸化—信号
<222>(2556)..(2686)
<223>rGLOB pA
<220>
<221>聚腺苷酸化_位点
<222>(2647)..(2647)
<223>聚腺苷酸化_位点_1
<220>
<221>启动子
<222>(903)..(1587)
<223>CMV Pro
<220>
<221>3’UTR
<222>(2012)..(2544)
<223>HBVenh
<220>
<221>5’UTR
<222>(1864)..(1984)
<223>HBV pre-S2 5’-UTR
<220>
<221>misc_feature
<222>(1719)..(1724)
<223>Bam/Bgl融合物
<220>
<221>misc_feature
<222>(1985)..(1987)
<223>ATG-Nhe
<220>
<221>misc_feature
<222>(1988)..(2011)
<223>CDS***位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(2545)..(2555)
<223>未知
<220>
<221>外显子
<222>(1588)..(1718)
<223>CMV外显子1/2
<220>
<221>misc_feature
<222>(2693)..(3759)
<223>pUC19
<220>
<221>misc_feature
<222>(45)..(860)
<223>KanR(Tn903)互补物
<400>14
ggcgtaatgc tctgccagtg ttacaaccaa ttaaccaatt ctgattagaa aaactcatcg    60
agcatcaaat gaaactgcaa tttattcata tcaggattat caataccata tttttgaaaa    120
agccgtttct gtaatgaagg agaaaactca ccgaggcagt tccataggat ggcaagatcc    180
tggtatcggt ctgcgattcc gactcgtcca acatcaatac aacctattaa tttcccctcg    240
tcaaaaataa ggttatcaag tgagaaatca ccatgagtga cgactgaatc cggtgagaat    300
ggcaaaagct tatgcatttc tttccagact tgttcaacag gccagccatt acgctcgtca    360
tcaaaatcac tcgcatcaac caaaccgtta ttcattcgtg attgcgcctg agcgagacga    420
aatacgcgat cgctgttaaa aggacaatta caaacaggaa tcgaatgcaa ccggcgcagg    480
aacactgcca gcgcatcaac aatattttca cctgaatcag gatattcttc taatacctgg    540
aatgctgttt tcccggggat cgcagtggtg agtaaccatg catcatcagg agtacggata    600
aaatgcttga tggtcggaag aggcataaat tccgtcagcc agtttagtct gaccatctca    660
tctgtaacat cattggcaac gctacctttg ccatgtttca gaaacaactc tggcgcatcg    720
ggcttcccat acaatcgata gattgtcgca cctgattgcc cgacattatc gcgagcccat    780
ttatacccat ataaatcagc atccatgttg gaatttaatc gcggcctcga gcaagacgtt    840
tcccgttgaa tatggctcat aacacccctt gtattactgt ttatgtaagc agacaggtcg    900
acaatattgg ctattggcca ttgcatacgt tgtatctata tcataatatg tacatttata    960
ttggctcatg tccaatatga ccgccatgtt gacattgatt attgactagt tattaatagt    1020
aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga gttccgcgtt acataactta    1080
cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga    1140
cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt    1200
tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt ccgcccccta    1260
ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttacggg    1320
actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt    1380
tttggcagta caccaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc    1440
accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat    1500
gtcgtaataa ccccgccccg ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct    1560
atataagcag agctcgttta gtgaacc gtc aga tcg cct gga gac gcc atc cac    1614
                              Val Arg Ser Pro Gly Asp Ala Ile His
                              1               5
gct gtt ttg acc tcc ata gaa gac acc ggg acc gat cca gcc tcc gcg      1662
Ala Val Leu Thr Ser Ile Glu Asp Thr Gly Thr Asp Pro Ala Ser Ala
10                  15                  20                  25
gcc ggg aac ggt gca ttg gaa cgc gga ttc ccc gtg cca aga gtg act      1710
Ala Gly Asn Gly Ala Leu Glu Arg Gly Phe Pro Val Pro Arg Val Thr
                30                  35                  40
cac cgt cc ggatctcagc aagcaggtat gtactctcca gggtgggcct ggcttcccca    1768
His Arg
gtcaagactc cagggatttg agggacgctg tgggctcttc tcttacatgt accttttgct    1828
tgcctcaacc ctgactatct tccaggtcag gatcccagag tcaggggtct gtattttcct    1888
gctggtggct ccagttcagg aacagtaaac cctgctccga atattgcctc tcacatctcg    1948
tcaatctccg cgaggactgg ggaccctgtg acgaacatgg ctagcgggcc cagatctggg    2008
ccctaacaaa acaaaaagat ggggttattc cctaaacttc atgggttacg taattggaag    2068
ttgggggaca ttgccacaag atcatattgt acaaaagatc aaacactgtt ttagaaaact    2128
tcctgtaaac aggcctattg attggaaagt atgtcaaagg attgtgggtc ttttgggctt    2188
tgctgctcca tttacacaat gtggatatcc tgccttaatg cctttgtatg catgtataca    2248
agctaaacag gctttcactt tctcgccaac ttacaaggcc tttctaagta aacagtacat    2308
gaacctttac cccgttgctc ggcaacggcc tggtctgtgc caagtgtttg ctgacgcaac    2368
ccccactggc tggggcttgg ccataggcca tcagcgcatg cgtggaacct ttgtggctcc    2428
tctgccgatc catactgcgg aactcctagc cgcttgtttt gctcgcagcc ggtctggagc    2488
aaagctcata ggaactgaca attctgtcgt cctctcgcgg aaatatacat cgtttcgatc    2548
tacgtatgat ctttttccct ctgccaaaaa ttatggggac atcatgaagc cccttgagca    2608
tctgacttct ggctaataaa ggaaatttat tttcattgca atagtgtgtt ggaatttttt    2668
gtgtctctca ctcggaagga attctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg    2728
gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc    2788
ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag    2848
gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa    2908
aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc    2968
gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc    3028
ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg    3088
cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt    3148
cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc    3208
gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc    3268
cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag    3328
agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg    3388
ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa    3448
ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag    3508
gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact    3568
cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa    3628
attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt    3688
accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag    3748
ttgcctgact c                                                         3759
<210>15
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>15
ggaggatccg gacggtgagt cactcttggc acggggaatc cg                       42
<210>16
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>16
ggtgaatatg gctcataaca c                                              2l
<210>17
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>17
ccgccgaaca tggagaacat cgc                                            23
<210>18
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>18
cacagatctt ttgttagggt ttaaatgtat acc                                 33
<210>19
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>19
ggaggatcct gacctggaag atagtcacc                                      29
<210>20
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>20
ggaggatcca tcagcaagca ggtatg                                         26
<210>21
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>21
ggagctagcg ggcgtttgac ctccggcgtc ggg                                 33
<210>22
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>22
ggagaattca gatctcctct agtaaaacaa tggctgg                             37
<210>23
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>23
ggagctagcc ttctaaccga ggtcg                                          25
<210>24
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>24
ggaagatctc cttactccag ctctatgctg                                     30
<210>25
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>25
ggcgaattcc ttccgagtga gagacac                                        27
<210>26
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>26
ggagtataca tttaaagggc cctaacaaaa caaaaagatg ggg                      43
<210>27
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>27
ggagctagct cgtttacttt gaccaagaac g                                   31
<210>28
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>28
ggaagatctc cttatttttg acaccagacc aactgg                              36
<210>29
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>29
ggagtcgacc tgtctgctta cataaacag                                      29
<210>30
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>30
cgtaatgctc tgccagtgtt acaacc                                         26
<210>31
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>31
gaaagatctc agcaagcagg                                                20
<210>32
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>32
ggaggatcct gacctggaag atagtcaggg ttgaggcaag caaaagg                  47
<210>33
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>33
ctagcgggcc ca                                                        12
<210>34
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>34
gatctgggcc cg                                                        12
<210>35
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>35
ggagctagca tcatcccagt tgaggagg                                       28
<210>36
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>36
ggtagatctc ctcatgtctg ctcgaagc                                       28
<210>37
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>37
ccaagctagc gacaaaactc acacatgcc                                      29
<210>38
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>38
ggaagatctc gtttacccct gtcatttacc cggagacagg gagag                    45
<210>39
<211>57
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>39
aagatgtcca gactctgtct ctccgtggcc ctcctcgtgc tcctcgggac actcgcc       57
<210>40
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>40
ggaactagta agatgtccag actc                                           24
<210>41
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>41
ggaagctagc ggcgagtgtc ccgag                                          25
<210>42
<211>75
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>42
ggaaagatgg ccagcctctt tgccacattt ctcgtggtgc tcgtgagcct cagcctcgcc    60
agcgaaagca gcgcc                                                     75
<210>43
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>43
ggaactagtg gaaagatggc cagc                                           24
<210>44
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>44
ggaagctagc ggcgctgctt tcgctg                                         26
<210>45
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>45
aggtctttgc taatcttggt gctttgcttc ctgcccctgg ctgctctggg g             51
<210>46
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>46
ggaactagta ggtctttgct aatc                                           24
<210>47
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>47
ggaagctagc ccccagagca gccag                                          25
<210>48
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>48
ggagctagct cgtttacttt gaccaagaac g                                   31
<210>49
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>49
ggaagatctc cggtgagtgg tgctg                                          25
<210>50
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>50
gcaggatcca gtagacctgg agagaggaca ag                                  32
<210>51
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>51
ggaagatcta caaggtgagc tgctgtggc                                      29
<210>52
<211>490
<212>DNA
<213>伪狂犬病病毒
<400>52
tggccgcaga gcgggccggg catgcaaatc agaggcgcgc gggagacgcc tccgcgcgcc    60
cattggcccg ggcgagccga gatggccgcc gcgggggccg gacatgcaaa gtagacgcga    120
gaggaagtag ggagagaaat cccattggcc gtcgaggggc caagatggcg ccctcggggc    180
cggacatgca aagtagacgc gagaggaagt gggcgagaga aatcccattg gccgtcgatg    240
gggcaagatg gccgccgcgg gggccgggca tgcaaatggt cctcgcgagg aagttcctcg    300
cgaaatccca ttggccggcg gccgccatct tgggccgggc atgcaaagca gacggcagag    360
gaagcgggcg agaaaaatcc cattggccgg ccgtcgggga agtccgcggc gaaaatcggc    420
cattggtccg cttacctggg ggcgggctct cctcggggcg cttataagcg cggtctccat    480
cgtagcactt                                                           490
<210>53
<211>495
<212>DNA
<213>劳氏肉瘤病毒
<400>53
ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg cgagcaaaat ttaagctaca    60
acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc ttagggttag gcgttttgcg    120
ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgtatctgag gggactaggg tgtgtttagg    180
cgaaaagcgg ggcttcggtt gtacgcggtt aggagttccc tcaggatata gtagtttcgc    240
ttttgcatag ggagggggaa atgtagtctt atgcaataca cttgtagtct tgcaacatgg    300
taacgatgag ttagcaacat gccttacaag gagagaaaaa gcaccgtgca tgccgattgg    360
tggaagtaag gtggtacgat cgtgccttat taggaaggca acagacaggt ctgacatgga    420
ttggacgaac cactgaattc cgcattgcag agataattgt atttaagtgc ctagctcgat    480
acaataaacg ccatt                                                     495

Claims (84)

1.一种核酸构建体，含有嵌合启动子序列和用于***与嵌合启动子有效连接的编码序列的克隆位点，其中，所述嵌合启动子序列包括：
(a)hCMV立即早期启动子序列；
(b)hCMV主要立即早期基因的外显子1和至少一部分外显子2；和
(c)置换hCMV主要立即早期基因的内含子A区的异源内含子。
2.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中，所述hCMV立即早期启动子序列(a)是SEQ ID No.1。
3.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中，所述外显子序列(b)是SEQ ID No.2。
4.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中，所述异源内含子(c)包括选自大鼠胰岛素基因内含子A序列、鸡角蛋白基因内含子A序列和鸡心脏的肌动蛋白基因内含子A序列中的序列。
5.根据权利要求4所述的核酸构建体，其中，所述大鼠胰岛素基因内含子A序列包括SEQ ID No.3。
6.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中，所述嵌合启动子序列为SEQ ID No.4。
7.根据权利要求1所述的核酸构建体，包括聚腺苷酸化序列。
8.根据权利要求7所述的核酸构建体，其中，所述聚腺苷酸化序列来源于选自兔β-珠蛋白基因、人***状瘤病毒(HPV)早期或晚期基因、HSV-2gB基因、猿CMV立即早期基因和HSVgD晚期基因中的基因的聚腺苷酸化序列。
9.根据权利要求8所述的核酸构建体，其中，所述聚腺苷酸化序列选自SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13中。
10.根据权利要求1所述的核酸构建体，进一步包括信号肽。
11.根据权利要求10所述的核酸构建体，其中，所述信号肽选自人组织纤溶酶原激活剂信号肽(hTPAsp)、抑肽酶信号肽、烟草伸展蛋白信号肽和鸡溶菌酶信号肽。
12.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中，编码序列位于所述克隆位点。
13.根据权利要求12所述的核酸构建体，其中，所述编码序列编码抗原。
14.根据权利要求13所述的核酸构建体，其中，所述抗原是病毒、细菌、寄生虫或真菌病原体的抗原。
15.根据权利要求14所述的核酸构建体，其中，所述抗原是HBsAg。
16.根据权利要求1所述的核酸构建体，所述核酸构建体是质粒载体。
17.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中，所述核酸是DNA。
18.一种核酸构建体，包括：
(i)嵌合启动子序列，包括：
(a)hCMV立即早期启动子序列；
(b)hCMV主要立即早期基因的外显子1和至少一部分外显子2；和
(c)置换hCMV主要立即早期基因的内含子A区的异源内含子；和
(ii)克隆位点，用于***与嵌合启动子有效连接的编码序列；和
(iii)(a)非翻译前导序列，来源于HBVpreS2抗原序列、HBV e-抗原序列或HSV型2gD抗原序列，并与嵌合启动子有效连接；和/或
(b)增强子序列，来源于HBsAg序列的3’非翻译区(UTR)，或猿CMV立即早期基因序列的3’UTR，并与嵌合启动子有效连接，其中，所述增强子序列位于克隆位点下游。
19.根据权利要求18所述的核酸构建体，其中，所述hCMV立即早期启动子序列(a)是SEQ ID No.1。
20.根据权利要求18所述的核酸构建体，其中，所述外显子序列(b)是SEQ ID No.2。
21.根据权利要求18所述的核酸构建体，其中，所述异源内含子(c)包括选自大鼠胰岛素基因内含子A序列、鸡角蛋白基因内含子A序列和鸡心脏的肌动蛋白基因内含子A序列中的序列。
22.根据权利要求21所述的核酸构建体，其中，所述大鼠胰岛素基因内含子A序列包括SEQ ID No.3。
23.根据权利要求18所述的核酸构建体，其中，所述嵌合启动子序列是SEQ ID No.4。
24.根据权利要求24所述的核酸构建体，所述核酸构建体包括聚腺苷酸化序列。
25.根据权利要求24所述的核酸构建体，其中，所述聚腺苷酸化序列来源于选自兔β-珠蛋白基因、人***状瘤病毒(HPV)早期或晚期基因、HSV-2gB基因、猿CMV立即早期基因和HSVgD晚期基因中的基因的聚腺苷酸化序列。
26.根据权利要求25所述的核酸构建体，其中，所述聚腺苷酸化序列选自SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ IDNO：13。
27.根据权利要求18所述的核酸构建体，所述核酸构建体进一步包括信号肽。
28.根据权利要求27所述的核酸构建体，其中，所述信号肽选自人组织纤溶酶原激活剂信号肽(hTPAsp)、抑肽酶信号肽、烟草伸展蛋白信号肽和鸡溶菌酶信号肽。
29.根据权利要求18所述的核酸构建体，其中，编码序列位于所述克隆位点。
30.根据权利要求29所述的核酸构建体，其中，所述编码序列编码抗原。
31.根据权利要求30所述的核酸构建体，其中，所述抗原是病毒、细菌、寄生虫或真菌病原体的抗原。
32.根据权利要求31所述的核酸构建体，其中，所述抗原是HBsAg。
33.根据权利要求18所述的核酸构建体，所述核酸构建体是质粒载体。
34.根据权利要求33所述的核酸构建体，所述核酸构建体具有SEQID No.14中的序列。
35.根据权利要求18所述的核酸构建体，其中，所述核酸为DNA。
36.根据权利要求18所述的核酸构建体，其中，所述非翻译前导序列选自SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7。
37.根据权利要求18所述的核酸构建体，其中，所述增强子序列选自SEQ ID No.8和SEQ ID No.9。
38.一种获得在哺乳动物细胞中表达所研究多肽的方法，所述方法包括将核酸构建体转移到所述细胞中，所述核酸构建体含有嵌合启动子序列和与嵌合启动子有效连接的编码多肽的编码序列，其中，所述嵌合启动子序列包括：
(a)hCMV立即早期启动子序列；
(b)hCMV主要立即早期基因的外显子1和至少一部分外显子2；和
(c)置换hCMV主要立即早期基因的内含子A区的异源内含子。
39.根据权利要求38所述的方法，其中，所述构建体直接释放给受试者。
40.根据权利要求39所述的方法，其中，所述构建体通过注射、透皮颗粒释放、吸入、局部、口服、鼻腔或跨粘膜释放。
41.根据权利要求40所述的方法，其中，所述构建体通过无针注射释放。
42.根据权利要求38所述的方法，其中，所述构建体离体释放给来自受试者的细胞，并且所述细胞再导入受试者。
43.根据权利要求38所述的方法，其中，所述核酸构建体包被在载体颗粒上。
44.包被颗粒，适合于由颗粒介导的释放装置释放，所述包被颗粒包括核酸构建体包被的载体颗粒，其中，所述构建体包括嵌合启动子序列和与嵌合启动子有效连接的编码序列，并且其中，所述嵌合启动子序列包括：
(a)hCMV立即早期启动子序列；
(b)hCMV主要立即早期基因的外显子1和至少一部分外显子2；和
(c)置换hCMV主要立即早期基因的内含子A区的异源内含子。
45.根据权利要求44所述的包被颗粒，其中，所述载体颗粒为金或钨。
46.剂量容器，用于含根据权利要求44所述的包被颗粒的颗粒介导的释放装置。
47.一种颗粒介导的释放装置，所述装置负载根据权利要求44所述的包被颗粒。
48.根据权利要求47所述的颗粒介导的释放装置，所述装置是无针注射器。
49.一种核酸免疫接种的方法，包括给予受试者有效剂量的包被颗粒，所述包被颗粒适合由颗粒介导的释放装置释放，所述颗粒包括核酸构建体包被的载体颗粒，其中，所述构建体包括嵌合启动子序列和与嵌合启动子序列有效连接的编码抗原的编码序列，并且其中，所述嵌合启动子序列包括：
(a)hCMV立即早期启动子序列；
(b)hCMV主要立即早期基因的外显子1和至少一部分外显子2；以及
(c)置换hCMV主要立即早期基因的内含子A区的异源内含子。
50.一种核酸构建体，包括：
(i)启动子序列；
(ii)非翻译前导序列，来源于HBVpreS2抗原序列、HBV e-抗原序列或HSV型2gD抗原序列；和
(iii)有效连接于(i)和(ii)的编码序列，
其中，所述编码序列对非翻译前导序列是异源的。
51.根据权利要求50所述的核酸构建体，其中，所述启动子序列(i)选自hCMV立即早期启动子序列、伪狂犬病病毒启动子序列和劳氏肉瘤病毒启动子序列。
52.根据权利要求50所述的核酸构建体，其中，所述编码序列编码抗原。
53.根据权利要求52所述的核酸构建体，其中，所述抗原是病毒、细菌、寄生虫或真菌病原体的抗原。
54.根据权利要求50所述的核酸构建体，所述核酸构建体是质粒载体。
55.一种在哺乳动物细胞中表达所研究多肽的方法，所述方法包括将核酸构建体转移到所述细胞中，所述核酸构建体包括：
(i)启动子序列；
(ii)非翻译前导序列，来源于HBVpreS2抗原序列、HBV e-抗原序列或HSV型2gD抗原序列；和
(iii)有效连接于(i)和(ii)的编码多肽的编码序列，
其中，所述编码序列对所述非翻译前导序列是异源的。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述构建体直接释放给受试者。
57.根据权利要求56所述的方法，其中，所述构建体通过注射、透皮颗粒释放、吸入、局部、口服、鼻腔或跨粘膜给药。
58.根据权利要求57所述的方法，其中，所述构建体通过无针注射给药。
59.根据权利要求55所述的方法，其中，所述构建体离体释放给来自受试者的细胞，并且所述细胞再导入受试者。
60.根据权利要求55所述的方法，其中，所述核酸构建体包被在载体颗粒上。
61.包被颗粒，适合于从颗粒介导的释放装置释放，该颗粒包括由核酸构建体包被的载体颗粒，所述核酸构建体包括：
(i)启动子序列；
(ii)非翻译前导序列，来源于HBVpreS2抗原序列、HBV e-抗原序列或HSV型2gD抗原序列；和
(iii)有效连接于(i)和(ii)的编码所研究多肽的编码序列，
其中，所述编码序列对所述非翻译前导序列是异源的。
62.根据权利要求61所述的包被颗粒，其中，所述载体颗粒为金或钨。
63.剂量容器，用于含根据权利要求61所述的包被颗粒的颗粒介导的释放装置。
64.一种颗粒介导的释放装置，所述装置负载根据权利要求61所述的包被颗粒。
65.根据权利要求64所述的颗粒介导的释放装置，所述装置为无针注射器。
66.一种核酸免疫接种的方法，包括给予受试者有效剂量的包被颗粒，所述包被颗粒适合由颗粒介导的释放装置释放，所述颗粒包括核酸构建体包被的载体颗粒，其中，所述核酸构建体包括：
(i)启动子序列；
(ii)非翻译前导序列，来源于HBVpreS2抗原序列、HBV e-抗原序列或HSV型2gD抗原序列；和
(iii)有效连接于(i)和(ii)的编码抗原的编码序列，其中，所述编码序列对所述非翻译前导序列是异源的。
67.一种核酸构建体，包括：
(i)启动子序列；
(ii)编码序列，与所述启动子序列(i)有效连接；和
(iii)增强子序列，位于编码序列(ii)的3’端，并与之有效连接；
其中，所述增强子序列(iii)来源于HBsAg序列的3’UTR或猿CMV立即早期基因序列的3’UTR，并且所述编码序列(ii)对3’端增强子序列是异源的。
68.根据权利要求67所述的核酸构建体，其中，所述启动子序列(i)选自hCMV立即早期启动子序列、伪狂犬病病毒启动子序列和劳氏肉瘤病毒启动子序列。
69.根据权利要求67所述的核酸构建体，其中，所述编码序列编码抗原。
70.根据权利要求69所述的核酸构建体，其中，所述抗原是病毒、细菌、寄生虫或真菌病原体的抗原。
71.根据权利要求67所述的核酸构建体，所述核酸构建体是质粒载体。
72.一种在哺乳动物细胞中表达所研究多肽的方法，其中，所述方法包括将核酸构建体转移到所述细胞中，其中所述核酸构建体包括：
(i)启动子序列；
(ii)编码多肽的编码序列，与所述启动子序列(i)有效连接，和
(iii)增强子序列，位于编码序列(ii)的3’端，并与之有效连接；其中，所述增强子序列(iii)来源于HBsAg序列的3’UTR或猿CMV立即早期基因序列的3’UTR，并且所述编码序列(ii)对所述3’增强子序列是异源的。
73.根据权利要求72所述的方法，其中，所述构建体直接释放给受试者。
74.根据权利要求73所述的方法，其中，所述构建体通过注射、透皮颗粒释放、吸入、局部、口服、鼻腔或跨粘膜给药。
75.根据权利要求74所述的方法，其中，所述构建体通过无针注射释放。
76.根据权利要求72所述的方法，其中，所述构建体离体释放给来自受试者的细胞，并且所述细胞再导入受试者。
77.根据权利要求72所述的方法，其中，所述核酸构建体包被在载体颗粒上。
78.包被颗粒，适合于由颗粒介导的释放装置释放，所述颗粒包括由核酸构建体包被的载体颗粒，所述核酸构建体包括：
(i)启动子序列；
(ii)编码所研究多肽的编码序列，与所述启动子(i)有效连接；和
(iii)增强子序列，位于编码序列(ii)的3’端，并与之有效连接。其中，所述增强子序列(iii)来源于HBsAg序列的3’UTR或猿CMV立即早期基因序列的3’UTR，并且所述编码序列(ii)与所述3’增强子序列是异源的。
79.根据权利要求78所述的包被颗粒，其中所述的载体颗粒为金或钨。
80.剂量容器，用于含根据权利要求78所述的包被颗粒的颗粒介导的释放装置。
81.一种颗粒介导的释放装置，所述装置负载根据权利要求78所述的包被颗粒。
82.根据权利要求81所述的颗粒介导的释放装置，所述装置为无针注射器。
83.一种核酸免疫接种的方法，包括给予受试者有效量的包被颗粒，所述颗粒适合由颗粒介导的释放装置给药，所述颗粒包括核酸构建体包被的载体颗粒，其中，所述构建体包括：
(i)启动子序列；
(ii)编码抗原的编码序列，与所述启动子序列(c)有效连接；和
(iii)增强子序列，位于编码序列(iii)的3’端，并与之有效连接；其中，所述增强子序列(iii)来源于HBsAg序列的3’UTR或猿CMV立即早期基因序列的3’UTR，并且所述编码序列(ii)对所述3’增强子序列是异源的。
84.一种经纯化、分离的嵌合启动子序列，包括：
(a)hCMV立即早期启动子序列；
(b)hCMV主要立即早期基因的外显子1和至少一部分外显子2；和
(c)置换hCMV主要立即早期基因的内含子A区的异源内含子。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101993878A (zh) * 2010-10-14 2011-03-30 南京农业大学 一种rRNA嵌合启动子及含有该嵌合启动子的表达载体
CN103901209A (zh) * 2014-02-18 2014-07-02 王明丽 一种重组蛋白ie1包被酶标反应板的制备方法及定量检测人血浆hcmv中和抗体试剂盒

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0507997D0 (en) * 2005-02-01 2005-05-25 Powderject Vaccines Inc Nucleic acid constructs
AU2006302477A1 (en) * 2005-10-05 2007-04-19 Bayhill Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treatment of autoimmune disease
PT2310501E (pt) 2008-07-23 2013-07-18 Boehringer Ingelheim Pharma Novos elementos reguladores
NZ700688A (en) 2009-12-01 2016-02-26 Shire Human Genetic Therapies Delivery of mrna for the augmentation of proteins and enzymes in human genetic diseases
WO2012019630A1 (en) 2010-08-13 2012-02-16 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded protein
US8853377B2 (en) 2010-11-30 2014-10-07 Shire Human Genetic Therapies, Inc. mRNA for use in treatment of human genetic diseases
JP6184945B2 (ja) 2011-06-08 2017-08-23 シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド ｍＲＮＡ送達のための脂質ナノ粒子組成物および方法
WO2013120497A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded therapeutic protein
WO2013120499A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly (a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded pathogenic antigen
WO2013120500A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded tumour antigen
WO2013120498A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded allergenic antigen or an autoimmune self-antigen
DK3578659T3 (da) * 2012-03-27 2024-02-05 CureVac SE Kunstige nukelinsyremolekyler til forbedret protein- eller peptidekspression
MX358706B (es) * 2012-03-27 2018-08-31 Curevac Ag Moleculas de acido nucleico artificiales que comprenden un top 5´utr.
SG10201607962RA (en) * 2012-03-27 2016-11-29 Curevac Ag Artificial nucleic acid molecules
EP3536787A1 (en) 2012-06-08 2019-09-11 Translate Bio, Inc. Nuclease resistant polynucleotides and uses thereof
ES2540753T3 (es) * 2012-09-24 2015-07-13 Lonza Biologics Plc. Vectores de expresión que comprenden secuencias quiméricas de promotor y amplificador de citomegalovirus
WO2014102101A1 (en) * 2012-12-31 2014-07-03 Boehringer Ingelheim International Gmbh Novel intron sequences
WO2014102100A1 (en) 2012-12-31 2014-07-03 Boehringer Ingelheim International Gmbh Heterologous intron within an immunoglobulin domain
WO2014102103A2 (en) 2012-12-31 2014-07-03 Boehringer Ingelheim International Gmbh Heterologous intron within a signal peptide
EP2938728B1 (en) * 2012-12-31 2020-12-09 Boehringer Ingelheim International GmbH Artificial introns
EA037922B1 (ru) 2013-03-14 2021-06-07 Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк. мРНК CFTR И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ МУКОВИСЦИДОЗА У МЛЕКОПИТАЮЩЕГО
EP2970955B1 (en) 2013-03-14 2018-11-14 Translate Bio, Inc. Methods for purification of messenger rna
ES2954366T3 (es) 2013-10-22 2023-11-21 Translate Bio Inc Terapia de ácido ribonucleico mensajero para la deficiencia de argininosuccinato sintetasa
CA2928186A1 (en) 2013-10-22 2015-04-30 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Mrna therapy for phenylketonuria
KR102399799B1 (ko) * 2013-12-30 2022-05-18 큐어백 아게 인공 핵산 분자
US11254951B2 (en) 2014-12-30 2022-02-22 Curevac Ag Artificial nucleic acid molecules
ES2750661T3 (es) 2014-04-25 2020-03-26 Translate Bio Inc Métodos para la purificación de ARN mensajero
WO2015195049A1 (en) * 2014-06-18 2015-12-23 Agency For Science, Technology And Research Novel promoters for high level expression
US10611800B2 (en) 2016-03-11 2020-04-07 Pfizer Inc. Human cytomegalovirus gB polypeptide
MX2019010155A (es) 2017-02-27 2020-12-10 Translate Bio Inc Arnm de cftr optimizado por codón novedoso.
IL270631B2 (en) 2017-05-16 2024-03-01 Translate Bio Inc Treatment of cystic fibrosis through the administration of mRNA with an optimal codon encoding ctfr
US20200377887A1 (en) * 2017-09-22 2020-12-03 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating huntington's disease
CN112930396B (zh) 2018-08-24 2024-05-24 川斯勒佰尔公司 用于纯化信使rna的方法
US11629172B2 (en) 2018-12-21 2023-04-18 Pfizer Inc. Human cytomegalovirus gB polypeptide
US11857622B2 (en) 2020-06-21 2024-01-02 Pfizer Inc. Human cytomegalovirus GB polypeptide

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3431140A1 (de) * 1984-08-24 1986-03-06 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Enhancer fuer eukaryotische expressionssysteme
US5100792A (en) * 1984-11-13 1992-03-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues
US5168062A (en) * 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
TW360548B (en) * 1993-04-08 1999-06-11 Powderject Res Ltd Products for therapeutic use
DK0690732T3 (da) * 1994-01-21 2003-05-19 Powderject Vaccines Inc Gasdrevet genindførselsinstrument
DE69536091D1 (de) 1994-01-27 2010-09-09 Univ Massachusetts Medical Immunisierung durch Impfung von DNS Transkriptionseinheit
PT836482E (pt) * 1995-05-24 2003-02-28 Hawaii Biotech Group Vacina subunitaria contra infeccao por flavirus
US6110707A (en) * 1996-01-19 2000-08-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant expression of proteins from secretory cell lines
GB9715064D0 (en) * 1997-07-17 1997-09-24 Ppl Therapeutics Scotland Ltd Protein expression
US20020106635A1 (en) 1998-05-27 2002-08-08 Bruce Freimark Cytokine resistant cytomegalovirus promoter mutants and related products and methods
JP2002527527A (ja) * 1998-10-19 2002-08-27 パウダージェクト ヴァクシンズ，インコーポレイテッド 最小プロモーターおよびその使用
AU2001234925A1 (en) 2000-02-08 2001-08-20 The University Of Virginia Patent Foundation Methods for the prevention and treatment of infections using anti-C3b(i) antibodies
GB0027088D0 (en) * 2000-11-06 2000-12-20 Glaxo Group Ltd DNA expression vectors
US20030124523A1 (en) * 2000-06-22 2003-07-03 Asselbergs Fredericus Alphonsus Maria Organic compounds
CA2425852C (en) * 2000-10-13 2009-09-29 Chiron Corporation Cytomegalovirus intron a fragments
AU2001297988B2 (en) 2000-11-27 2006-10-26 Powderject Vaccines, Inc. Nucleic acid adjuvants
US7320793B2 (en) * 2001-01-19 2008-01-22 Cytos Biotechnology Ag Molecular antigen array
US20030124718A1 (en) * 2001-05-18 2003-07-03 Deborah Fuller Vaccine composition
GB0118367D0 (en) * 2001-07-27 2001-09-19 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel use
KR20060123138A (ko) 2003-10-10 2006-12-01 파우더젝트 백신, 인코포레이티드 방법
GB0507997D0 (en) * 2005-02-01 2005-05-25 Powderject Vaccines Inc Nucleic acid constructs

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101993878A (zh) * 2010-10-14 2011-03-30 南京农业大学 一种rRNA嵌合启动子及含有该嵌合启动子的表达载体
CN101993878B (zh) * 2010-10-14 2012-04-18 南京农业大学 一种rRNA嵌合启动子及含有该嵌合启动子的表达载体
CN103901209A (zh) * 2014-02-18 2014-07-02 王明丽 一种重组蛋白ie1包被酶标反应板的制备方法及定量检测人血浆hcmv中和抗体试剂盒
CN103901209B (zh) * 2014-02-18 2016-05-25 王明丽 一种重组蛋白ie1包被酶标反应板的制备方法及定量检测人血浆hcmv中和抗体试剂盒

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