CN108864300A

CN108864300A - 鸡白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白、制备方法及其编码基因、一种鸡长效干扰素

Info

Publication number: CN108864300A
Application number: CN201810750992.8A
Authority: CN
Inventors: 高耀辉; 鲍可兵; 徐慕珍; 杨建伟; 付超; 周炜; 蒋敏之; 刘家炉
Original assignee: ANHUI JIUCHUAN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: ANHUI JIUCHUAN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2017-08-09
Filing date: 2018-07-10
Publication date: 2018-11-23
Also published as: CN107400170A

Abstract

本发明公开了鸡白蛋白‑干扰素α‑白介素2融合蛋白、制备方法及其编码基因、一种鸡长效干扰素，将鸡白蛋白、鸡干扰素α和鸡白介素2通过柔性linker连接，得到鸡白蛋白‑干扰素α‑白介素2融合蛋白，设计优化其编码基因，最终制备得到重组鸡长效干扰素，可显著提高鸡干扰素的半衰期，较普通鸡干扰素的半衰期提高20倍以上，并具有广谱抗病毒作用并能提高鸡自身的免疫应答。

Description

鸡白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白、制备方法及其编码基因、一种鸡长效干扰素

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及鸡白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白、制备方法及其编码基因、一种鸡长效干扰素。将鸡白蛋白、鸡干扰素α和鸡白介素2通过柔性柔性linker连接，得到鸡白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白，设计优化其编码基因，最终制备得到重组鸡长效干扰素。

背景技术

近年来，随着养殖业的规模化和畜禽及其产品流通业迅速的发展，我国家禽业取得长足发展，形成了年产值逾千亿元的巨大产业。然而由于我国薄弱的动物防疫体系，禽病仍然是我国家禽生产面临的严重问题，这已经成为制约我国禽类养殖业发展的重要因素。禽病多、损失大，死亡率高于15％，死淘率达20％～25％(发达国家不足5％)，我国养鸡业每年由于传染病所导致的鸡只死亡数量约为3亿只，直接造成的经济损失约30亿元，造成的间接损失约100亿元。

目前对于鸡病毒性疾病的预防和治疗主要采用的是疫苗免疫和药物治疗，由于疫苗免疫的血清型单一，病毒血清型众多且病毒毒株变异速度快，从而经常导致疫苗免疫失败。尽管一些抗生素和化学合成的抗病毒药物对少数病毒有一些作用，但由于药物残留经食物链给人类健康带来负面影响，我国从16年开始明令禁止一些抗生素和抗菌剂在养殖业中的应用。因此，积极研制生产无毒副作用、无药物残留和不产生耐药性的干扰素制剂，对目前鸡病毒性疾病预防和治疗困境有着重要的临床意义。

血清白蛋白是血浆的重要成分，正常情况下不易透过肾小球，体内分布极广而且没有酶学和免疫学活性，是理想的药物载体。

IFN是一类病毒感染诱导机体产生具有广谱抗病毒、抗肿瘤和具有免疫调节作用的蛋白质，1957年Issacs和Lindeman首先发现，它是一类多功能的细胞因子，与细胞受体结合后，可诱导机体产生多种特异性蛋白质和酶类，主要通过抑制病毒基因转录和降解病毒RNA来抑制病毒的生长繁殖以及发挥抗肿瘤等的活性。现已知，α型IFN在体内可有选择性地作用于病毒等感染细胞，通过抑制受染细胞内的病毒蛋白质的生物合成，发挥广谱和高效抗病毒作用。但对正常宿主细胞无作用或作用微弱。IFN-α主要生物学活性为具有抑制病毒复制、抗寄生虫、抑制多种细胞增殖、刺激免疫细胞的杀伤活性。

细胞因子IL-2即白细胞介素-2，又名T细胞生长因子。主要由活化的T淋巴细胞产生的具有广泛生物活性的细胞因子，既可以促进淋巴细胞增殖，增强免疫功能，又能限制T细胞反应而增强机体的免疫耐受，故可用于***、感染性疾病和自身免疫性疾病。在兽医中，由于IL-2能提高疫苗的免疫应答和减少疾病的发生，也出现广阔的应用前景。IL-2因能增强机体的免疫水平，提高机体的抗病能力，因而用于细菌性、病毒性和寄生虫性疾病的免疫治疗。此外，IL-2还可影响药物的代谢，使药物的代谢时间延长，作用时间增加，从而提高药物疗效。IL-2与其他细胞因子根据基因构建，组成融合蛋白，以增强疫苗的抗体产生和提高细胞免疫水平。

天然干扰素及人工重组干扰素目前普遍存在半衰期短的局限，半衰期一般为2-4个小时。半衰期短给治疗带来了极大的不便，治疗次数的增加，相应的时间成本及经济成本随之增加，而机体的耐受极限也有可能被突破导致不良反应的产生。半衰期短的主要原因有两个：干扰素的分子量过小在体内代谢过快，干扰素尤其是重组干扰素亲和力较差被免疫***清除。

而市面上常见的长效干扰素以聚乙二醇融合干扰素为代表，仅在分子量的层面上部分解决了干扰素分子量小而导致半衰期短的问题，同时聚乙二醇融合干扰素成本非常高，不利于临床上应用。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供鸡白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白及其制备方法，将鸡白蛋白、鸡干扰素α和鸡白介素2通过柔性柔性linker连接，得到鸡白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白。

本发明另一目的在于提供上述鸡白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白的编码基因。

本发明还有一个目的在于提供一种长效鸡干扰素，利用上述鸡白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白与冻干保护剂混合之后，经冷冻干燥制备得到一种鸡长效干扰素，所述鸡长效干扰素可显著提高鸡干扰素的半衰期，较普通鸡干扰素的半衰期提高20倍以上，并具有广谱抗病毒作用并能提高鸡自身的免疫应答。

本发明采取的技术方案为：

一种鸡白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列表如SEQUENCE LISTING 400〈1〉所示。

本发明还提供的编码鸡白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列表如SEQUENCE LISTING 400〈2〉所示，记为基因组1；或如SEQUENCE LISTING 400〈3〉所示，记为基因组2。

所述基因组1和所述基因组2均可编码融合蛋白。基因组2是对基因组1的核苷酸序列进行优化之后的结果，通常密码子适应指数CAI＝1.0时被认为该基因在该表达***中为最优的高效表达状态，CAI值越低表明在宿主中表达水平越低。基因中GC含量最理想分布范围为30～70％，在任何区域内超过该范围均会影响翻译和转率效率。利用软件检测发现鸡白蛋白、鸡IFN-α、鸡IL-2原始基因的密码子在大肠杆菌中密码子适应指数(CAI)分别为0.27、0.31、0.27，GC百分比为43.1％、61.7％、36.1％；而通过对鸡白蛋白、鸡IFN-α、鸡IL-2基因优化后得到各基因在大肠杆菌中密码子适应指数(CAI)为0.99、1.0、1.0，GC百分比49.2％、58.5％、46.2％。通过基因优化显著降低了低密码子的使用率，避免了稀有密码子对蛋白表达的影响，改善了基因的GC含量，提高了转录翻译效率。

本发明还提供了含有基因组1或基因组2的表达载体。

进一步地，所述表达载体为含有基因组1或基因组2的pET-32a大肠杆菌表达载体。

本发明还提供了含有基因组1或基因组2的基因工程菌。

进一步地，所述基因工程菌为pET-32a/rAlb-IFNα-IL2。

含有基因组1或基因组2的宿主细胞也属于本发明的保护范围，进一步地，所述宿主细胞为大肠杆菌宿主细胞，更进一步地，所述大肠杆菌宿主细胞为BL21(DE3)感受态细胞或带有pGro7质粒的BL21(DE3)感受态细胞。

本发明还提供了鸡白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将含有基因组1或基因组2的表达载体导入到大肠杆菌宿主细胞中，获得基因工程菌，基因工程菌经IPTG诱导表达后得到所述融合蛋白的粗品，经纯化后即可得到融合蛋白。

进一步的，所述表达载体为含有基因组1或基因组2的pET-32a大肠杆菌表达载体；

进一步的，所述基因工程菌为pET-32a/rAlb-IFNα-IL2，其制备方法为：

(1)、设计引物，通过反转录获得或人工分别合成连接有柔性linker序列的鸡白蛋白、鸡干扰素α和鸡白细胞介素2的目的基因；通过柔性linker将鸡白蛋白、鸡干扰素α、鸡白细胞介素2的目的基因连接起来，连接后的目的基因的核苷酸序列表如SEQUENCE LISTING400〈2〉所示或如SEQUENCE LISTING 400〈3〉所示；

(2)、将连接后的目的基因连接到pET-32a质粒上获得表达载体；

(3)、将表达载体导入到大肠杆菌宿主细胞中，即可得到基因工程菌pET-32a/rAlb-IFNα-IL2。

进一步的，所述大肠杆菌宿主细胞为BL21(DE3)感受态细胞或带有pGro7质粒的BL21(DE3)感受态细胞。所述带有pGro7质粒的BL21(DE3)感受态细胞购自上海近岸科技有限公司/欣百诺生物，货号为V205。

进一步的，所述纯化的方法为：融合蛋白的粗品先后经亲和层析、阴离子交换层析和分子筛层析纯化。

进一步的，所述基因组1的获取方法为：

a.引物设计

鸡白蛋白(Alb)的引物序列为：

上游Alb-F1：

CCGGAATTCATGAAGTGGGTAACATTA，带有EcoRI酶切位点；

下游Alb-R1：

ACCACCACCAGAACCACCACCACCAGCACCAATTCCTAATG，带有柔性linker；

鸡干扰素α(IFN-α)的引物序列为：

上游IFN-α-F1：

GGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTCCCACCATGGCTGT，带有柔性linker；

下游IFN-α-R1：

ACCACCACCAGAACCACCACCACCGCGCGTGTTGCCT，带有柔性linker；

鸡白细胞介素2(IL-2)的引物序列为：

上游IL-2-F1：

GGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTATGATGTGCAAAGTACT，带有柔性linker；

下游IL-2-R1：CCCTCGAGTTTTTGCAGATATC，带有XhoI酶切位点；

b.从鸡肝脏中提取RNA，通过反转录获得鸡Alb、鸡IFN-α和鸡IL-2的目的基因，三者的基因序列分别如SEQUENCE LISTING 400〈4〉、SEQUENCE LISTING 400〈5〉所示和SEQUENCE LISTING 400〈6〉所示；

分别以鸡Alb、鸡IFN-α和鸡IL-2的目的基因为模板，并分别利用鸡Alb、鸡IFN-α和鸡IL-2的上下游引物进行PCR扩增。

PCR反应体系及条件为：在25μL的总反应体系中，基因组RNA1.5μL，上下游引物各0.5μL，反转录酶2.5μL，dNTP Mix为10μL，加RNase Free水至25μL；所述RT-PCR反应的反应条件为：50℃反转录30min，95℃预变性4min，进入循环；95℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸1kb/min，循环35次，最后72℃延伸10min。

c.利用柔性linker连接鸡Alb和鸡IFNα基因，获得Alb-IFNα基因:

连接的PCR反应体系及反应条件为：在25μL的总反应体系中，连接有柔性linker的Alb基因模板DNA1μL、连接有柔性linker的IFN-α模板DNA 1μL，Alb上游引物0.5μL，IFN-α下游引物0.5μL，Taq DNA聚合酶2.5μL，dNTP Mix为10μL，加RNase Free水至25μL；连接PCR反应条件为：95℃预变性4min，进入循环：94℃变性45s；58℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35个循环；最后72℃延伸10min。

d.利用柔性linker连接Alb-IFNα基因和鸡IL2基因，获得rAlb-IFNα-IL2基因：

连接的PCR反应体系及反应条件为：在25μL的总反应体系中，Alb-IFNα基因模板DNA1μL、连接有柔性linker的IL-2模板DNA1μL，Alb上游引物0.5μL，IL-2下游引物0.5μL，Taq DNA聚合酶2.5μL，dNTP Mix为10μL，加RNase Free水至25μL；连接PCR反应条件为：95℃预变性4min，进入循环：94℃变性45s；58℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35个循环；最后72℃延伸10min。

基因组2是对基因组1进行优化之后，人工合成的基因，所述基因组2的获取方法为：

a.引物设计

鸡白蛋白(Alb)的引物序列为：

上游Alb-F2：CGGGATCCATGAAATGGGTTACCC，带有BamHI酶切位点；

下游Alb-R2：

ACCACCACCAGAACCACCACCACCAGCACCGATACCCA，带有柔性linker；

鸡干扰素α(IFN-α)的引物序列为：

上游IFN-α-F2：

GGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTCCGACCATGGCTG，带有柔性linker；

下游IFN-α-R2：

ACCACCACCAGAACCACCACCACCGGTACGGGTGTTACC，带有柔性linker；

鸡白细胞介素2(IL-2)：

上游IL-2-F2：

GGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTATGATGTGCAAAGTTCT，带有柔性linker；

下游IL-2-R2：

CCCTCGAGTTTCTGCAGGTAACG，带有XhoI酶切位点。

b.所述鸡Alb、鸡IFN-α和鸡IL-2的目的基因，三者的基因序列分别如SEQUENCELISTING 400〈7〉、SEQUENCE LISTING 400〈8〉和SEQUENCE LISTING 400〈9〉所示；

PCR反应体系及条件为：在25μL的总反应体系中，基因组DNA1.0μL，上下游引物各0.5μL，Taq DNA聚合酶2.5μL，dNTP Mix为10μL，加RNase Free水至25μL；所述RT-PCR反应的反应条件为：95℃预变性4min，进入循环；95℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸1kb/min，循环35次，最后72℃延伸10min。

c.利用柔性linker连接鸡Alb和鸡IFNα基因，获得Alb-IFNα基因:

连接的PCR反应体系及反应条件为：在25μL的总反应体系中，连接有柔性linker的Alb基因模板DNA1μL、连接有柔性linker的IFN-α模板DNA1μL，Alb上游引物0.5μL，IFN-α下游引物0.5μL，Taq DNA聚合酶2.5μL，dNTP Mix为10μL，加RNase Free水至25μL；连接PCR反应条件为：95℃预变性4min，进入循环：94℃变性45s；60℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35个循环；最后72℃延伸10min。

连接的PCR反应体系及反应条件为：在25μL的总反应体系中，Alb-IFNα基因模板DNA1μL、连接有柔性linker的IL-2模板DNA1μL，Alb上游引物0.5μL，IL-2下游引物0.5μL，Taq DNA聚合酶2.5μL，dNTP Mix为10μL，加RNase Free水至25μL；连接PCR反应条件为：95℃预变性4min，进入循环：94℃变性45s；60℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35个循环；最后72℃延伸10min。

本发明还提供了一种鸡长效干扰素，所述鸡长效干扰素由所述的鸡白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白与冻干保护剂混配之后，经冷冻干燥而成。

所述冻干保护剂为甘油、甘露醇和蔗糖，用10mmol/L PBS为缓冲液，三者的终浓度为甘油100mL/L、甘露醇0.12g/mL和蔗糖0.025g/mL。

本发明还提供了所述鸡长效干扰素的应用，其半衰期长达80小时以上，具有广谱抗病毒作用并能提高鸡自身的免疫应答。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.通过柔性linker将鸡Alb、鸡IFN-α和鸡IL-2基因实现融合表达，提高了干扰素半衰期，与普通干扰素相比，提高了20倍；与普通聚乙二醇融合干扰素相比，显著降低了成本。

2.通过对鸡Alb、鸡IFN-α和鸡IL-2基因进行优化，提高了鸡Alb、鸡IFN-α和鸡IL-2融合蛋白的表达量。

3.以重组大肠杆菌pET-32a/Alb-IFNα-IL2作为表达菌株，通过引入分子伴侣pGro7质粒，在蛋白表达时产生包涵体较少，形成大量可溶性蛋白，避免了包涵体变性和复性的过程，大大缩短了融合蛋白表达的时间；

4.本发明公开的由鸡Alb、鸡IFN-α和鸡IL-2组成的融合蛋白不仅具有IFN-α的广谱抗病毒作用，同时显著提高了鸡自身的免疫应答。

附图说明

图1为实施例1中的鸡白蛋白基因、鸡干扰素α基因与鸡白细胞介素2基因RT-PCR扩增的结果；泳道M：DNA Marker DL2000；泳道1：鸡白介素2基因RT-PCR扩增产物；泳道2：鸡干扰素α基因RT-PCR扩增产物；泳道3：鸡白蛋白基因RT-PCR扩增产物；

图2为实施例1中的鸡Alb、IFN-α和IL-2的目的基因连接之后的PCR扩增的结果；泳道M：DNA MarkerDL10000；泳道1：鸡白蛋白基因、鸡干扰素α基因与鸡白介素2基因连接扩增产物；

图3为实施例1中的阳性克隆质粒的PCR扩增及双酶切鉴定结果；泳道M：DNAMarker DL10000；泳道1：重组质粒双酶切结果；泳道2：质粒PCR结果；

图4为实施例1中的重组蛋白的SDS-PAGE电泳检查结果；泳道M：蛋白Marker；泳道1：空载对照；泳道1：重组菌诱导后的菌体破碎后上清；泳道2：重组菌诱导后的菌体破碎后沉淀；

图5为实施例1得到的融合蛋白的Western Blot鉴定结果；泳道M：蛋白Marker；泳道1：重组菌诱导破碎后沉淀；泳道2：为重组菌诱导破碎后上清；

图6为实施例5中由实施例1中的融合蛋白制得的重组鸡长效干扰素α对VSV致细胞病变的抑制作用；1为VSV病毒对照孔；2为HEp-2细胞对照孔；A 3-12为梯度稀释(从右向左)的人干扰素标准品处理孔；B 3-12为梯度稀释(从右向左)的重组长效鸡干扰素α处理孔；

图7为实施例8中由实施例1中的融合蛋白制得的重组鸡长效干扰素α肌肉注射血药浓度-时间变化曲线。

具体实施方式

实施例1

鸡白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：

1.鸡白蛋白(Alb)、鸡干扰素α(IFN-α)与鸡白细胞介素2(IL-2)目的基因的获取与扩增

引物设计：

根据Genebank中已报道的目的基因序列设计合成引物见表1，在鸡白蛋白的上游引物中引入EcoRI酶切位点，在下游引物中引入Linker序列，在鸡干扰素α的上游引物和下游引物中分别引入Linker序列，在鸡白细胞介素2的上游引物引入Linker序列，在下游引物中引入XhoI酶切位点。

表1 PCR扩增引物

RT-PCR获取目的基因：

从鸡肝脏组织中提取RNA，通过反转录获得鸡Alb、鸡IFN-α和鸡IL-2的目的基因，三者的基因序列分别如SEQUENCE LISTING 400〈4〉、SEQUENCE LISTING 400〈5〉和SEQUENCELISTING 400〈6〉所示；

RT-PCR反应体系(25μL)见表2

表2 RT-PCR反应体系

RNase Free水	10μL
		dNTP Mix	10μL
反转录酶	2.5μL
		上、下游引物	各0.5μL
基因组RNA	1.5μL

反应参数为：50℃反转录30min，95℃预变性4min，进入循环：95℃变性45s；58℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35个循环；最后72℃延伸10min。

RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳在1870bp、640bp和460bp左右出现特异条带，其结果如图1所示，说明制备得到了鸡Alb、鸡IFN-α和鸡IL-2的目的基因。

2.目的基因的连接

将目的基因均稀释到10ug/mL，利用重叠PCR连接各段目的基因，25μL反应体系如表3、表4所示：

表3 Alb-IFN-αPCR反应体系

表4 Alb-IFN-α-IL-2PCR反应体系

反应参数为：95℃预变性4min，进入循环：94℃变性45s；58℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35个循环；最后72℃延伸10min。

PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳在2920bp左右出现特异条带，其结果如图2所示，图2中出现了Alb-IFNα和IL-2扩增产物条带，这是因为在Alb-IFNα和IL-2基因连接的过程中，出现了非特异反应。得到的目的基因的核苷酸序列如SEQUENCE LISTING 400〈2〉所示。

3.表达载体构建

选择连接后的目的基因经测序无误后，PCR胶回收产物与pET-32a质粒均使用EcoRI和XhoI限制性内切酶进行双酶切和回收，按表5中的20μL体系做双酶切：

表5双酶切体系

通用buffer	2μL
		限制性内切酶(一对)	1μL+1μL
载体或回收片段	2ul
		RNase Free水	14μL

将连接后的目的基因与pET-32a质粒的酶切回收产物按表6中的体系进行连接，4℃过夜连接：

表6酶连体系

目的片段DNA	10μL
		表达载体	3μL
buffer	2μL
		连接酶	1μL
RNase Free水	4μL

转化连接产物至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，将感受态细胞涂布于含氨苄青霉素的LB培养基平板过夜培养；挑取LB平板上的单菌落进行目的基因PCR鉴定，阳性克隆菌质粒经EcoRI和XhoI双酶切鉴定，鉴定为阳性者表示工程菌构建成功，PCR扩增和双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳在2920bp处检测出单一条带，其结果如图3所示。

4.重组蛋白的表达

挑取工程菌于含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃摇床复苏1h，工程菌记为pET-32a/rAlb-IFNα-IL2；在LB培养基(含氨苄青霉素100μg/ml)中放大培养4h(OD≈1.0)，加入终浓度100μg/ml IPTG，32℃诱导表达5h；收集菌体，经SDS-PAGE电泳检测，其结果如图4所示，从图中可以看出，重组菌诱导5h后的菌体破碎后上清和沉淀在125.3KD左右处可见优势表达条带，说明在沉淀和上清中均成功表达了融合蛋白。

加入质量体积比1:1的PBS重悬沉淀；-20℃于室温反复冻融沉淀3次；4℃超声裂解细菌沉淀，工作10s，间隔3S，超声6min，整个过程重复3～4次；4℃，12000r/min离心15min，分别取上清、包涵体(包涵体经溶解、变复性)，得到粗制融合蛋白。

5.融合蛋白纯化

5.1His亲和层析

粗制融合蛋白用0.22μm孔径的滤膜过滤后，上样通过连接在AKTAexplorer 100蛋白纯化***上，用Binding BufferⅠ(PBS)平衡好的His亲和层析柱，用PBS缓冲液洗去未结合的蛋白，直到A280nm稳定，再用Elution bufferⅠ(50mM三羟甲基氨基甲烷，20～500mM咪唑，PH8.0)洗脱，收集rAlb-IFNα-IL2蛋白峰。

5.2DEAE阴离子交换层析

将经过His亲和层析纯化后收集的蛋白置换到Binding BufferⅡ(50mM三羟甲基氨基甲烷，PH6.5)中后，上样通过用Binding BufferⅡ平衡好的DEAE阴离子交换层析柱，再用Binding BufferⅡ过柱至A280nm值稳定后，用Elution BufferⅡ(50mM三羟甲基氨基甲烷，1M NaCl，PH6.5)线性梯度洗脱，收集rAlb-IFNα-IL2蛋白峰。

5.3分子筛层析

将离子交换层析收集到的样品浓缩后上样通过用Binding BufferⅢ(50mMNa₂HPO4，0.15M NaCl，PH7.4)平衡好Superdex 200分子筛层析柱，用Binding BufferⅢ洗脱，收集rAlb-IFNα-IL2蛋白峰。

5.4样品鉴定

测定rAlb-IFNα-IL2效价及比活性，比活性≥10⁷U/mg，蛋白合格；无菌分装，-80℃保存。即可得到由鸡白蛋白、鸡干扰素α与鸡白细胞介素2组成的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQUENCE LISTING 400〈1〉所示。

鸡白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白采用上述方法制备得到。

实施例2

一种鸡白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白的制备方法，制备方法同实施例1，只是将其中的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞替换为了带有pGro7质粒的BL21(DE3)感受态细胞。其融合蛋白的SDS-PAGE电泳结果同实施例1对照，上清液中125.3KD左右处优势表达条带较粗，说明引入分子伴侣pGro7后，目的蛋白在上清液中的表达更好，得到的融合蛋白量更高。大肠杆菌表达的蛋白大部分存在于包涵体中；通过在表达菌株中引入分子伴侣，协同表达蛋白正确折叠，达到蛋白可溶性表达。

所述带有pGro7质粒的BL21(DE3)感受态细胞购自上海近岸科技有限公司/欣百诺生物，货号V205。

实施例3

一种鸡白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白的制备方法，其制备方法如下：

对实施例1中的鸡Alb、鸡IFN-α和鸡IL-2进行优化，人工合成鸡Alb、鸡IFN-α和鸡IL-2目的基因，优化后，三者的核苷酸序列分别如SEQUENCE LISTING 400〈7〉、SEQUENCELISTING 400〈8〉和SEQUENCE LISTING 400〈9〉所示。

1.1密码子优化

遗传密码子有64种，但是绝大多数生物倾向于利用这些密码子中的一部分。那些被最频繁利用的称为最佳密码子(optimal codons)，那些不被经常利用的称为稀有或利用率低的密码子(rare or low-usage codons)。实际上，常用做蛋白表达或生产的每种生物(包括大肠杆菌，酵母，哺乳动物细胞，植物细胞和昆虫细胞)都表现出某种程度的密码子利用的差异或偏爱。大肠杆菌、酵母和果蝇中对含最佳密码子的基因的表达效率明显高于含低利用率的密码子的基因的表达效率。因此，在异源表达***中，密码子的偏爱性很大程度上影响了重组蛋白的表达。利用偏爱密码子(preferred codons)并避免利用稀有的密码子进行基因合成，这种基因的重新设计叫密码子优化。因此，本实施例中对的鸡Alb、鸡IFN-α和鸡IL-2基因密码子进行优化。

1.2密码子优化后结果分析

通常密码子适应指数(CAI)＝1.0时被认为该基因在该表达***中的最优的高效表达状态，CAI值越低表明在宿主中表达水平越低。基因中GC含量最理想分布范围为30～70％，在任何区域内超过该范围均会影响翻译和转率效率。利用软件检测发现鸡Alb、鸡IFN-α和鸡IL-2原始基因的密码子在大肠杆菌中密码子适应指数(CAI)分别为0.27、0.31、0.27，GC百分比为43.1％、61.7％、36.1％；而通过对鸡Alb、鸡IFN-α和鸡IL-2基因优化后得到重组基因在大肠杆菌中密码子适应指数(CAI)均为0.99、1.0、1.0，GC百分比49.2％、58.5％、46.2％。通过基因优化显著降低了低密码子的使用率，避免了稀有密码子对蛋白表达的影响，改善了基因的GC含量，提高了转录翻译效率，进而提高了重组蛋白的表达量。

1.3引物设计：

表7 PCR扩增引物

将优化后的鸡Alb、鸡IFN-α和鸡IL-2的基因组DNA分别稀释至0.05mg/mL。利用PCR扩增获得目的基因，25μL反应体系如表8所示：

表8 PCR反应体系

RNase Free水	10.5μL
		dNTP Mix	10.0μL
Taq DNA聚合酶	2.5μL
		上、下游引物	各0.5μL
基因组DNA	1.0μL

反应参数为：95℃预变性4min，进入循环：95℃变性45s；60℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35个循环；最后72℃延伸10min。

鸡Alb、鸡IFN-α与鸡IL-2的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分别在1870bp、640bp和460bp左右出现特异条带，说明制备得到了优化后的鸡Alb、鸡IFN-α和鸡IL-2的目的基因。

2.目的基因的连接

将目的基因均稀释到10ug/mL，利用重叠PCR连接各段目的基因，25μL反应体系如表9、表10所示：

表9 Alb-IFNαPCR反应体系

表10 rAlb-IFNα-IL2PCR反应体系

反应参数为：95℃预变性4min，进入循环：94℃变性45s；60℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35个循环；最后72℃延伸10min。

PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳在2920bp左右出现特异条带，为Alb-IFNα和IL-2扩增产物条带，这是因为在Alb-IFNα和IL-2基因连接的过程中，出现了非特异反应。得到的目的基因的核苷酸序列如SEQUENCE LISTING 400〈3〉所示。

3.表达载体构建

选择连接后的目的基因经测序后无误的PCR的胶回收产物与pET-32a质粒均使用BamHI、XhoI限制性内切酶进行双酶切和回收，按表11中的20μL体系做双酶切：

表11双酶切体系

将连接后的目的基因与pET-32a质粒的酶切回收产物按表12中的体系进行连接，4℃过夜连接：

表12

转化连接产物至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，将感受态涂布于含氨苄青霉素的LB平板中过夜培养；取LB平板上生长的菌落经PCR鉴定目的基因，阳性克隆菌质粒经BamHI、XhoI双酶切鉴定，鉴定为阳性者表示表达载体构建成功，PCR扩增和双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳在2920bp左右处出现单一条带，说明含有rAlb-IFNα-IL2融合基因的表达载体构建成功。

4.重组蛋白的表达

挑取工程菌于含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃摇床复苏1h，工程菌记为pET-32a/rAlb-IFNα-IL2；在LB培养基(含氨苄青霉素100μg/ml)中放大培养4h(OD≈1.0)，加入终浓度100μg/ml IPTG，32℃诱导表达5h；收集菌体，经SDS-PAGE电泳检测，重组菌诱导5h后的菌体破碎后上清和沉淀在125.3KD左右处可见优势表达条带，说明在上清和沉淀中均得到了重组蛋白。

5.融合蛋白纯化

5.1 His亲和层析

5.2DEAE阴离子交换层析

5.3分子筛层析

5.4样品鉴定

测定rAlb-IFNα-IL2效价及比活性，比活性≥10⁷U/mg，蛋白为合格；无菌分装，-80℃保存。即可得到由鸡白蛋白、鸡干扰素α与鸡白细胞介素2组成的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQUENCE LISTING 400〈1〉所示。

实施例4

一种鸡白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白的制备方法，其他同实施例3，只是将其中的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞替换为了带有pGro7质粒的BL21(DE3)感受态细胞。其融合蛋白的SDS-PAGE电泳结果同实施例3对照，上清液中125.3KD左右处优势表达条带较粗，说明引入分子伴侣pGro7后，目的蛋白在上清液中的表达更好，得到的融合蛋白量更高。大肠杆菌表达的蛋白大部分存在于包涵体中；通过在表达菌株中引入分子伴侣，协同表达蛋白正确折叠，达到蛋白可溶性表达。

实施例5

一种鸡长效干扰素，由实施例1、2、3、4中的融合蛋白分别与冻干保护剂混配之后，经冷冻干燥而成。所述冻干保护剂为甘油、甘露醇和蔗糖，用10mmol/L PBS为缓冲液，三者的终浓度为甘油100mL/L、甘露醇0.12g/mL和蔗糖0.025g/mL。

实施例6

实施例1～4得到的鸡白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白的鉴定

6.1蛋白含量的定量检测

用Lowry法，以中国食品药品生物制品检定院的标准蛋白作标准测定，测定实施例1～4得到的融合蛋白浓度分别2.5mg/ml、2.4mg/ml、2.6mg/ml、2.6mg/ml。

6.2 SDS-PAGE电泳检测

与空菌相比，融合蛋白在125.3KD左右有一条浓染的新增蛋白条带，如图4所示。

6.3 Western Blot结果

分别检测实施例1～4中融合蛋白，以abcam公司鼠抗鸡α干扰素(1:5000稀释)为一抗，以山羊抗小鼠IgG-HRP为二抗(1:10000稀释)。重组长效鸡干扰素样品能与抗鸡干扰素α单克隆抗体发生特异性反应，125.3KD左右处出现特异性条带，如图5所示。

实施例7

实施例5中的四份鸡长效鸡干扰素冻干剂的效价检测

按照微量细胞病变抑制法，用培养基将Hep-2细胞配成5×10⁵细胞/ml细胞悬浮液，每孔接种0.1ml移入96孔细胞培养板。37℃、5％CO₂培养24h，加入不同剂量的重组长效鸡干扰素，24h后吸弃，再分别接种100TCID50VSV病毒。

试验结果

结果表明获得的重组长效鸡干扰素对VSV引起HEp-2细胞的病变具有明显的抑制作用。未经处理的细胞接种病毒后均出现细胞变圆、脱落、崩解等病变。而获得的重组长效鸡干扰素处理后的细胞接种病毒后，在倒置显微镜下连续观察，细胞形态正常，未出现任何病变，测得效价≥10⁷U/ml，如图6所示。

实施例8

实施例5中的分别由实施例1～4的融合蛋白得到的四份重组长效鸡干扰素冻干剂(分别记为A、B、C、D)在鸡体内的半衰期的测定

A为实施例1制备的冻干剂、B为实施例2制备的冻干剂、C为实施例3制备的冻干剂、D为实施例4制备的冻干剂。

细胞病变抑制法测定rAlb-IFNα-IL2的血药浓度与时间关系

取六只体重大致相同的肉鸡(雌雄各半)，颈部皮下注射2mg/ml重组鸡长效干扰素α冻干剂2ml，分别在1h、2h、4h、8h、16h、26h、44h、79h、144h静脉采血，血样4℃凝固，3500rpm低温离心10min分离血清，各时点每只鸡血样于-20℃保存待测。采用细胞病变抑制法测定血清样品中rAlb-IFNα-IL2的浓度，用DAS药动学软件进行曲线拟合并计算参数。参数计算结果见表13。

表13重组长效鸡干扰素α肌肉注射后血清中主要动力学参数

结果表明重组长效鸡干扰素有较长的半衰期。经测定半衰期能达到80h左右，较普通干扰素提高约20倍。

实施例9

实施例5中的四份重组长效鸡干扰素冻干剂对鸡细胞免疫应答影响的测定

取六只体重大致相同的肉鸡分为两组，记为实验组和对照组；实验组颈部皮下注射2mg/ml重组长效鸡干扰素冻干剂2ml，对照组颈部皮下注射2mL的PBS，取注射4周后鸡外周血，之后每周取一次血，使用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，淋巴细胞经过无血清RPMI1640培养基洗2次后，用完全培养基重悬、调整细胞浓度为2×10⁶个/ml，24孔细胞培养板每孔加入1ml淋巴细胞，37℃，5％CO₂培养72h，收集淋巴细胞培养时上清。ELISA检测培养上清中IFNγ、IL-4含量，按试剂盒说明书进行，检测结果如表14所示：

表14 ELISA检测各组鸡细胞免疫应答水平

结果表明注射重组长效鸡干扰素后，能够显著提高鸡外周血中细胞因子IFNγ、IL-4的含量，增强了细胞免疫应答水平，显著提高免疫力水平。

上述参照实施例对一种鸡白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白及其制备方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 安徽九川生物科技有限公司

<120> 鸡白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白、制备方法及其编码基因、一种鸡长

效干扰素

<130> 1

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 973

<212> PRT

<213> 融合蛋白

<400> 1

Met Lys Trp Val Thr Leu Ile Ser Phe Ile Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Thr Ser Arg Asn Leu Gln Arg Phe Ala Arg Asp Ala Glu His Lys Ser

20 25 30

Glu Ile Ala His Arg Tyr Asn Asp Leu Lys Glu Glu Thr Phe Lys Ala

35 40 45

Val Ala Met Ile Thr Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Arg Cys Ser Tyr Glu

50 55 60

Gly Leu Ser Lys Leu Val Lys Asp Val Val Asp Leu Ala Gln Lys Cys

65 70 75 80

Val Ala Asn Glu Asp Ala Pro Glu Cys Ser Lys Pro Leu Pro Ser Ile

85 90 95

Ile Leu Asp Glu Ile Cys Gln Val Glu Lys Leu Arg Asp Ser Tyr Gly

100 105 110

Ala Met Ala Asp Cys Cys Ser Lys Ala Asp Pro Glu Arg Asn Glu Cys

115 120 125

Phe Leu Ser Phe Lys Val Ser Gln Pro Asp Phe Val Gln Pro Tyr Gln

130 135 140

Arg Pro Ala Ser Asp Val Ile Cys Gln Glu Tyr Gln Asp Asn Arg Val

145 150 155 160

Ser Phe Leu Gly His Phe Ile Tyr Ser Val Ala Arg Arg His Pro Phe

165 170 175

Leu Tyr Ala Pro Ala Ile Leu Ser Phe Ala Val Asp Phe Glu His Ala

180 185 190

Leu Gln Ser Cys Cys Lys Glu Ser Asp Val Gly Ala Cys Leu Asp Thr

195 200 205

Lys Glu Ile Val Met Arg Glu Lys Ala Lys Gly Val Ser Val Lys Gln

210 215 220

Gln Tyr Phe Cys Gly Ile Leu Lys Gln Phe Gly Asp Arg Val Phe Gln

225 230 235 240

Ala Arg Gln Leu Ile Tyr Leu Ser Gln Lys Tyr Pro Lys Ala Pro Phe

245 250 255

Ser Glu Val Ser Lys Phe Val His Asp Ser Ile Gly Val His Lys Glu

260 265 270

Cys Cys Glu Gly Asp Met Val Glu Cys Met Asp Asp Met Ala Arg Met

275 280 285

Met Ser Asn Leu Cys Ser Gln Gln Asp Val Phe Ser Gly Lys Ile Lys

290 295 300

Asp Cys Cys Glu Lys Pro Ile Val Glu Arg Ser Gln Cys Ile Met Glu

305 310 315 320

Ala Glu Phe Asp Glu Lys Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Val Glu Lys

325 330 335

Tyr Ile Glu Asp Lys Glu Val Cys Lys Ser Phe Glu Ala Gly His Asp

340 345 350

Ala Phe Met Ala Glu Phe Val Tyr Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Glu

355 360 365

Phe Ser Ile Gln Leu Ile Met Arg Ile Ala Lys Gly Tyr Glu Ser Leu

370 375 380

Leu Glu Lys Cys Cys Lys Thr Asp Asn Pro Ala Glu Cys Tyr Ala Asn

385 390 395 400

Ala Gln Glu Gln Leu Asn Gln His Ile Lys Glu Thr Gln Asp Val Val

405 410 415

Lys Thr Asn Cys Asp Leu Leu His Asp His Gly Glu Ala Asp Phe Leu

420 425 430

Lys Ser Ile Leu Ile Arg Tyr Thr Lys Lys Met Pro Gln Val Pro Thr

435 440 445

Asp Leu Leu Leu Glu Thr Gly Lys Lys Met Thr Thr Ile Gly Thr Lys

450 455 460

Cys Cys Gln Leu Pro Glu Asp Arg Arg Met Ala Cys Ser Glu Gly Tyr

465 470 475 480

Leu Ser Ile Val Ile His Asp Thr Cys Arg Lys Gln Glu Thr Thr Pro

485 490 495

Ile Asn Asp Asn Val Ser Gln Cys Cys Ser Ser Ser Tyr Ala Asn Arg

500 505 510

Arg Pro Cys Phe Thr Ala Met Gly Val Asp Thr Lys Tyr Val Pro Pro

515 520 525

Pro Phe Asn Pro Asp Met Phe Ser Phe Asp Glu Lys Leu Cys Ser Ala

530 535 540

Pro Ala Glu Glu Arg Glu Val Gly Gln Met Lys Leu Leu Ile Asn Leu

545 550 555 560

Ile Lys Arg Lys Pro Gln Met Thr Glu Glu Gln Ile Lys Thr Ile Ala

565 570 575

Asp Gly Phe Thr Ala Met Val Asp Lys Cys Cys Lys Gln Ser Asp Ile

580 585 590

Asn Thr Cys Phe Gly Glu Glu Gly Ala Asn Leu Ile Val Gln Ser Arg

595 600 605

Ala Thr Leu Gly Ile Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

610 615 620

Ser Pro Thr Met Ala Val Pro Ala Ser Pro Gln His Pro Arg Gly Tyr

625 630 635 640

Gly Ile Leu Leu Leu Thr Leu Leu Leu Lys Ala Leu Ala Thr Thr Ala

645 650 655

Ser Ala Cys Asn His Leu Arg Pro Gln Asp Ala Thr Phe Ser His Asp

660 665 670

Ser Leu Gln Leu Leu Arg Asp Met Ala Pro Thr Leu Pro Gln Leu Cys

675 680 685

Pro Gln His Asn Ala Ser Cys Ser Phe Asn Asp Thr Ile Leu Asp Thr

690 695 700

Ser Asn Thr Arg Gln Ala Asp Lys Thr Thr His Asp Ile Leu Gln His

705 710 715 720

Leu Phe Lys Ile Leu Ser Ser Pro Ser Thr Pro Ala His Trp Asn Asp

725 730 735

Ser Gln Arg Gln Ser Leu Leu Asn Arg Ile His Arg Tyr Thr Gln His

740 745 750

Leu Glu Gln Cys Leu Asp Ser Ser Asp Thr Arg Ser Arg Thr Arg Trp

755 760 765

Pro Arg Asn Leu His Leu Thr Ile Lys Lys His Phe Ser Cys Leu His

770 775 780

Thr Phe Leu Gln Asp Asn Asp Tyr Ser Ala Cys Ala Trp Glu His Val

785 790 795 800

Arg Leu Gln Ala Arg Ala Trp Phe Leu His Ile His Asn Leu Thr Gly

805 810 815

Asn Thr Arg Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Met

820 825 830

Cys Lys Val Leu Ile Phe Gly Cys Ile Ser Val Ala Met Leu Met Thr

835 840 845

Thr Ala Tyr Gly Ala Ser Leu Ser Ser Glu Lys Trp Lys Thr Leu Gln

850 855 860

Thr Leu Ile Lys Asp Leu Glu Ile Leu Glu Asn Ile Lys Asn Lys Ile

865 870 875 880

His Leu Glu Leu Tyr Thr Pro Thr Glu Thr Gln Glu Cys Thr Gln Gln

885 890 895

Thr Leu Gln Cys Tyr Leu Gly Glu Val Val Thr Leu Lys Lys Glu Thr

900 905 910

Glu Asp Asp Thr Glu Ile Lys Glu Glu Phe Val Thr Ala Ile Gln Asn

915 920 925

Ile Glu Lys Asn Leu Lys Ser Leu Thr Gly Leu Asn His Thr Gly Ser

930 935 940

Glu Cys Lys Ile Cys Glu Ala Asn Asn Lys Lys Lys Phe Pro Asp Phe

945 950 955 960

Leu His Glu Leu Thr Asn Phe Val Arg Tyr Leu Gln Lys

965 970

<210> 2

<211> 2919

<212> DNA

<213> 基因组1

<400> 2

atgaagtggg taacattaat ttcattcatt ttcctcttca gttcagcaac atccaggaat 60

ctgcaaagat ttgctcgtga tgcagagcac aagagtgaaa ttgcccatcg ctacaatgat 120

ttgaaagaag aaacatttaa ggcagttgcc atgatcacat ttgcccagta tctccagagg 180

tgctcttatg aaggactgtc taagcttgtg aaggatgttg ttgatctggc acaaaaatgt 240

gtagccaatg aagatgctcc tgaatgctca aaaccactgc cttccattat cctggatgaa 300

atctgccaag tggaaaagct ccgtgactct tatggtgcaa tggccgactg ctgtagcaaa 360

gctgatcctg aaagaaatga gtgtttcctg tcatttaaag tttcccaacc agacttcgtt 420

cagccatacc aaagaccagc ttctgatgtg atatgccagg aataccagga caacagagtg 480

tcatttctgg gacatttcat ctattctgtt gcaagaagac accccttctt gtatgcccct 540

gcaatcctta gttttgctgt tgattttgaa catgcacttc aaagctgttg caaagagagt 600

gatgtcggtg cttgcctgga caccaaggaa attgttatga gagaaaaagc caagggagta 660

agtgtgaagc agcagtattt ttgtggaatc ttgaagcagt tcggagatag agttttccaa 720

gcacgacaac ttatttacct aagccaaaaa taccccaagg ctccattctc agaggtttct 780

aaatttgtac atgattctat cggcgtccac aaagagtgct gtgaagggga catggtggag 840

tgcatggatg acatggcacg tatgatgagc aatctgtgct ctcaacaaga tgttttctca 900

ggtaaaatca aagactgctg tgagaagcct attgtggaac gaagccagtg cattatggag 960

gcagaatttg atgagaaacc tgcagatctt ccttcattag ttgaaaagta catagaagat 1020

aaggaagtgt gtaaaagttt tgaagcaggc cacgatgcat tcatggcaga gttcgtttat 1080

gaatactcac gaagacaccc tgagttctcc atacagctta ttatgagaat tgccaaagga 1140

tatgaatcac ttctggaaaa gtgctgcaaa actgataacc ctgctgagtg ctacgcaaat 1200

gctcaagagc aactgaacca acatatcaaa gaaactcagg atgttgtgaa gacaaactgt 1260

gatcttctcc atgaccatgg cgaggcagac ttcctcaagt ccatcctgat ccgctacact 1320

aagaaaatgc ctcaagtacc aactgatctc ctgcttgaaa ctggaaagaa aatgacaact 1380

attggtacta agtgctgcca gcttcctgaa gacagacgca tggcttgttc tgagggttat 1440

ctgagcattg tgattcatga tacgtgcagg aaacaggaga ccacacctat aaatgacaac 1500

gtttcacaat gctgcagcag ctcctatgct aacagaagac catgtttcac tgctatggga 1560

gtagatacca aatatgttcc tccaccattt aatcctgata tgttcagctt tgatgaaaaa 1620

ttgtgcagtg ctcctgctga agaacgagaa gtaggccaga tgaaattgct aatcaacctc 1680

attaaacgca agccccagat gacagaagaa caaataaaga caattgctga tggtttcact 1740

gccatggttg acaagtgctg caagcagtcg gacatcaata catgctttgg agaagagggt 1800

gccaacctaa tagtccaaag cagagccaca ttaggaattg gtgctggtgg tggtggttct 1860

ggtggtggtg gttctcccac catggctgtg cctgcaagcc cacagcaccc acgggggtac 1920

ggcatcctgc tgctcacgct ccttctgaaa gctctcgcca ccaccgcctc cgcctgcaac 1980

caccttcgcc cccaggatgc caccttctct cacgacagcc tccagctcct ccgggacatg 2040

gctcccacac taccccagct gtgcccacag cacaacgcgt cttgctcctt caacgacacc 2100

atcctggaca ccagcaacac ccggcaagcc gacaaaacca cccacgacat ccttcagcac 2160

ctcttcaaaa tcctcagcag ccccagcact ccagcccact ggaacgacag ccaacgccaa 2220

agcctcctca accggatcca ccgctacacc cagcacctcg agcaatgctt ggacagcagc 2280

gacacgcgct cccggacgcg atggcctcgc aaccttcacc tcaccatcaa aaaacacttc 2340

agctgcctcc acaccttcct ccaagacaac gattacagcg cctgcgcctg ggaacacgtc 2400

cgcctgcaag ctcgtgcctg gttcctgcac atccacaacc tcacaggcaa cacgcgcact 2460

ggtggtggtg gttctggtgg tggtggttct atgatgtgca aagtactgat ctttggctgt 2520

atttcggtag caatgctaat gactacagct tatggagcat ctctatcatc agaaaaatgg 2580

aaaactcttc aaacattaat aaaggattta gaaatattgg aaaatatcaa gaataagatt 2640

catctcgagc tctacacacc aactgagacc caggagtgca cccagcaaac tctgcagtgt 2700

tacctgggag aagtggttac tctgaagaaa gaaactgaag atgacactga aattaaagaa 2760

gaatttgtaa ctgctattca aaatatcgaa aagaacctca agagtcttac gggtctaaat 2820

cacaccggaa gtgaatgcaa gatctgtgaa gctaacaaca agaaaaaatt tcctgatttt 2880

ctccatgaac tgaccaactt tgtgagatat ctgcaaaaa 2919

<210> 3

<211> 2919

<212> DNA

<213> 基因组2

<400> 3

atgaaatggg ttaccctgat ctctttcatc ttcctgttct cttctgctac ctctcgtaac 60

ctgcagcgtt tcgctcgtga cgctgaacac aaatctgaaa tcgctcaccg ttacaacgac 120

ctgaaagaag aaaccttcaa agctgttgct atgatcacct tcgctcagta cctgcagcgt 180

tgctcttacg aaggtctgtc taaactggtt aaagacgttg ttgacctggc tcagaaatgc 240

gttgctaacg aagacgctcc ggaatgctct aaaccgctgc cgtctatcat cctggacgaa 300

atctgccagg ttgaaaaact gcgtgactct tacggtgcta tggctgactg ctgctctaaa 360

gctgacccgg aacgtaacga atgcttcctg tctttcaaag tttctcagcc ggacttcgtt 420

cagccgtacc agcgtccggc ttctgacgtt atctgccagg aataccagga caaccgtgtt 480

tctttcctgg gtcacttcat ctactctgtt gctcgtcgtc acccgttcct gtacgctccg 540

gctatcctgt ctttcgctgt tgacttcgaa cacgctctgc agtcttgctg caaagaatct 600

gacgttggtg cttgcctgga caccaaagaa atcgttatgc gtgaaaaagc taaaggtgtt 660

tctgttaaac agcagtactt ctgcggtatc ctgaaacagt tcggtgaccg tgttttccag 720

gctcgtcagc tgatctacct gtctcagaaa tacccgaaag ctccgttctc tgaagtttct 780

aaattcgttc acgactctat cggtgttcac aaagaatgct gcgaaggtga catggttgaa 840

tgcatggacg acatggctcg tatgatgtct aacctgtgct ctcagcagga cgttttctct 900

ggtaaaatca aagactgctg cgaaaaaccg atcgttgaac gttctcagtg catcatggaa 960

gctgaattcg acgaaaaacc ggctgacctg ccgtctctgg ttgaaaaata catcgaagac 1020

aaagaagttt gcaaatcttt cgaagctggt cacgacgctt tcatggctga attcgtttac 1080

gaatactctc gtcgtcaccc ggaattctct atccagctga tcatgcgtat cgctaaaggt 1140

tacgaatctc tgctggaaaa atgctgcaaa accgacaacc cggctgaatg ctacgctaac 1200

gctcaggaac agctgaacca gcacatcaaa gaaacccagg acgttgttaa aaccaactgc 1260

gacctgctgc acgaccacgg tgaagctgac ttcctgaaat ctatcctgat ccgttacacc 1320

aaaaaaatgc cgcaggttcc gaccgacctg ctgctggaaa ccggtaaaaa aatgaccacc 1380

atcggtacca aatgctgcca gctgccggaa gaccgtcgta tggcttgctc tgaaggttac 1440

ctgtctatcg ttatccacga cacctgccgt aaacaggaaa ccaccccgat caacgacaac 1500

gtttctcagt gctgctcttc ttcttacgct aaccgtcgtc cgtgcttcac cgctatgggt 1560

gttgacacca aatacgttcc gccgccgttc aacccggaca tgttctcttt cgacgaaaaa 1620

ctgtgctctg ctccggctga agaacgtgaa gttggtcaga tgaaactgct gatcaacctg 1680

atcaaacgta aaccgcagat gaccgaagaa cagatcaaaa ccatagcgga cggcttcacc 1740

gctatggttg acaaatgctg caaacagtct gacatcaaca cctgcttcgg tgaagaaggt 1800

gctaacctga tcgttcagtc tcgtgctacc ctgggtatcg gtgctggtgg tggtggttct 1860

ggtggtggtg gttctccgac catggctgtt ccggcttctc cgcagcaccc gcgtggttac 1920

ggtatcctgc tgctgaccct gctgctgaaa gctctggcta ccaccgcttc tgcttgcaac 1980

cacctgcgtc cgcaggacgc taccttctct cacgactctc tgcagctgct gcgtgacatg 2040

gctccgaccc tgccgcagct gtgcccgcag cacaacgctt cttgctcttt caacgacacc 2100

atcctggaca cctctaacac ccgtcaggct gacaaaacca cccacgacat cctgcagcac 2160

ctgttcaaaa tcctgtcttc tccgtctacc ccggctcact ggaacgactc tcagcgtcag 2220

tctctgctga accgtatcca ccgttacacc cagcacctgg aacagtgcct ggactcttct 2280

gacacccgtt ctcgtacccg ttggccgcgt aacctgcacc tgaccatcaa aaaacacttc 2340

tcttgcctgc acaccttcct gcaggacaac gactactctg cttgcgcttg ggaacacgtt 2400

cgtctgcagg ctcgtgcttg gttcctgcac atccacaacc tgaccggtaa cacccgtacc 2460

ggtggtggtg gttctggtgg tggtggttct atgatgtgca aagttctgat cttcggttgc 2520

atctctgttg ctatgctgat gaccaccgct tacggtgctt ctctgtcttc tgaaaaatgg 2580

aaaaccctgc agaccctgat caaagacctg gaaatcctgg aaaacatcaa aaacaaaatc 2640

cacctggaac tgtacacccc gaccgaaacc caggaatgca cccagcagac cctgcagtgc 2700

tacctgggtg aagttgttac cctgaaaaaa gaaaccgaag acgacaccga aatcaaagaa 2760

gaattcgtta ccgctatcca gaacatcgaa aaaaacctga aatctctgac cggtctgaac 2820

cacaccggtt ctgaatgcaa aatctgcgaa gctaacaaca aaaaaaaatt cccggacttc 2880

ctgcacgaac tgaccaactt cgttcgttac ctgcagaaa 2919

<210> 4

<211> 1845

<212> DNA

<213> 优化前鸡白蛋白基因序列

<400> 4

atgaagtggg taacattaat ttcattcatt ttcctcttca gttcagcaac atccaggaat 60

ctgcaaagat ttgctcgtga tgcagagcac aagagtgaaa ttgcccatcg ctacaatgat 120

ttgaaagaag aaacatttaa ggcagttgcc atgatcacat ttgcccagta tctccagagg 180

tgctcttatg aaggactgtc taagcttgtg aaggatgttg ttgatctggc acaaaaatgt 240

gtagccaatg aagatgctcc tgaatgctca aaaccactgc cttccattat cctggatgaa 300

atctgccaag tggaaaagct ccgtgactct tatggtgcaa tggccgactg ctgtagcaaa 360

gctgatcctg aaagaaatga gtgtttcctg tcatttaaag tttcccaacc agacttcgtt 420

cagccatacc aaagaccagc ttctgatgtg atatgccagg aataccagga caacagagtg 480

tcatttctgg gacatttcat ctattctgtt gcaagaagac accccttctt gtatgcccct 540

gcaatcctta gttttgctgt tgattttgaa catgcacttc aaagctgttg caaagagagt 600

gatgtcggtg cttgcctgga caccaaggaa attgttatga gagaaaaagc caagggagta 660

agtgtgaagc agcagtattt ttgtggaatc ttgaagcagt tcggagatag agttttccaa 720

gcacgacaac ttatttacct aagccaaaaa taccccaagg ctccattctc agaggtttct 780

aaatttgtac atgattctat cggcgtccac aaagagtgct gtgaagggga catggtggag 840

tgcatggatg acatggcacg tatgatgagc aatctgtgct ctcaacaaga tgttttctca 900

ggtaaaatca aagactgctg tgagaagcct attgtggaac gaagccagtg cattatggag 960

gcagaatttg atgagaaacc tgcagatctt ccttcattag ttgaaaagta catagaagat 1020

aaggaagtgt gtaaaagttt tgaagcaggc cacgatgcat tcatggcaga gttcgtttat 1080

gaatactcac gaagacaccc tgagttctcc atacagctta ttatgagaat tgccaaagga 1140

tatgaatcac ttctggaaaa gtgctgcaaa actgataacc ctgctgagtg ctacgcaaat 1200

gctcaagagc aactgaacca acatatcaaa gaaactcagg atgttgtgaa gacaaactgt 1260

gatcttctcc atgaccatgg cgaggcagac ttcctcaagt ccatcctgat ccgctacact 1320

aagaaaatgc ctcaagtacc aactgatctc ctgcttgaaa ctggaaagaa aatgacaact 1380

attggtacta agtgctgcca gcttcctgaa gacagacgca tggcttgttc tgagggttat 1440

ctgagcattg tgattcatga tacgtgcagg aaacaggaga ccacacctat aaatgacaac 1500

gtttcacaat gctgcagcag ctcctatgct aacagaagac catgtttcac tgctatggga 1560

gtagatacca aatatgttcc tccaccattt aatcctgata tgttcagctt tgatgaaaaa 1620

ttgtgcagtg ctcctgctga agaacgagaa gtaggccaga tgaaattgct aatcaacctc 1680

attaaacgca agccccagat gacagaagaa caaataaaga caattgctga tggtttcact 1740

gccatggttg acaagtgctg caagcagtcg gacatcaata catgctttgg agaagagggt 1800

gccaacctaa tagtccaaag cagagccaca ttaggaattg gtgct 1845

<210> 5

<211> 585

<212> DNA

<213> 优化前鸡IFN-α基因序列

<400> 5

cccaccatgg ctgtgcctgc aagcccacag cacccacggg ggtacggcat cctgctgctc 60

acgctccttc tgaaagctct cgccaccacc gcctccgcct gcaaccacct tcgcccccag 120

gatgccacct tctctcacga cagcctccag ctcctccggg acatggctcc cacactaccc 180

cagctgtgcc cacagcacaa cgcgtcttgc tccttcaacg acaccatcct ggacaccagc 240

aacacccggc aagccgacaa aaccacccac gacatccttc agcacctctt caaaatcctc 300

agcagcccca gcactccagc ccactggaac gacagccaac gccaaagcct cctcaaccgg 360

atccaccgct acacccagca cctcgagcaa tgcttggaca gcagcgacac gcgctcccgg 420

acgcgatggc ctcgcaacct tcacctcacc atcaaaaaac acttcagctg cctccacacc 480

ttcctccaag acaacgatta cagcgcctgc gcctgggaac acgtccgcct gcaagctcgt 540

gcctggttcc tgcacatcca caacctcaca ggcaacacgc gcact 585

<210> 6

<211> 429

<212> DNA

<213> 优化前鸡IL-2基因序列

<400> 6

atgatgtgca aagtactgat ctttggctgt atttcggtag caatgctaat gactacagct 60

tatggagcat ctctatcatc agaaaaatgg aaaactcttc aaacattaat aaaggattta 120

gaaatattgg aaaatatcaa gaataagatt catctcgagc tctacacacc aactgagacc 180

caggagtgca cccagcaaac tctgcagtgt tacctgggag aagtggttac tctgaagaaa 240

gaaactgaag atgacactga aattaaagaa gaatttgtaa ctgctattca aaatatcgaa 300

aagaacctca agagtcttac gggtctaaat cacaccggaa gtgaatgcaa gatctgtgaa 360

gctaacaaca agaaaaaatt tcctgatttt ctccatgaac tgaccaactt tgtgagatat 420

ctgcaaaaa 429

<210> 7

<211> 1845

<212> DNA

<213> 优化后的鸡白蛋白基因序列

<400> 7

atgaaatggg ttaccctgat ctctttcatc ttcctgttct cttctgctac ctctcgtaac 60

ctgcagcgtt tcgctcgtga cgctgaacac aaatctgaaa tcgctcaccg ttacaacgac 120

ctgaaagaag aaaccttcaa agctgttgct atgatcacct tcgctcagta cctgcagcgt 180

tgctcttacg aaggtctgtc taaactggtt aaagacgttg ttgacctggc tcagaaatgc 240

gttgctaacg aagacgctcc ggaatgctct aaaccgctgc cgtctatcat cctggacgaa 300

atctgccagg ttgaaaaact gcgtgactct tacggtgcta tggctgactg ctgctctaaa 360

gctgacccgg aacgtaacga atgcttcctg tctttcaaag tttctcagcc ggacttcgtt 420

cagccgtacc agcgtccggc ttctgacgtt atctgccagg aataccagga caaccgtgtt 480

tctttcctgg gtcacttcat ctactctgtt gctcgtcgtc acccgttcct gtacgctccg 540

gctatcctgt ctttcgctgt tgacttcgaa cacgctctgc agtcttgctg caaagaatct 600

gacgttggtg cttgcctgga caccaaagaa atcgttatgc gtgaaaaagc taaaggtgtt 660

tctgttaaac agcagtactt ctgcggtatc ctgaaacagt tcggtgaccg tgttttccag 720

gctcgtcagc tgatctacct gtctcagaaa tacccgaaag ctccgttctc tgaagtttct 780

aaattcgttc acgactctat cggtgttcac aaagaatgct gcgaaggtga catggttgaa 840

tgcatggacg acatggctcg tatgatgtct aacctgtgct ctcagcagga cgttttctct 900

ggtaaaatca aagactgctg cgaaaaaccg atcgttgaac gttctcagtg catcatggaa 960

gctgaattcg acgaaaaacc ggctgacctg ccgtctctgg ttgaaaaata catcgaagac 1020

aaagaagttt gcaaatcttt cgaagctggt cacgacgctt tcatggctga attcgtttac 1080

gaatactctc gtcgtcaccc ggaattctct atccagctga tcatgcgtat cgctaaaggt 1140

tacgaatctc tgctggaaaa atgctgcaaa accgacaacc cggctgaatg ctacgctaac 1200

gctcaggaac agctgaacca gcacatcaaa gaaacccagg acgttgttaa aaccaactgc 1260

gacctgctgc acgaccacgg tgaagctgac ttcctgaaat ctatcctgat ccgttacacc 1320

aaaaaaatgc cgcaggttcc gaccgacctg ctgctggaaa ccggtaaaaa aatgaccacc 1380

atcggtacca aatgctgcca gctgccggaa gaccgtcgta tggcttgctc tgaaggttac 1440

ctgtctatcg ttatccacga cacctgccgt aaacaggaaa ccaccccgat caacgacaac 1500

gtttctcagt gctgctcttc ttcttacgct aaccgtcgtc cgtgcttcac cgctatgggt 1560

gttgacacca aatacgttcc gccgccgttc aacccggaca tgttctcttt cgacgaaaaa 1620

ctgtgctctg ctccggctga agaacgtgaa gttggtcaga tgaaactgct gatcaacctg 1680

atcaaacgta aaccgcagat gaccgaagaa cagatcaaaa ccatagcgga cggcttcacc 1740

gctatggttg acaaatgctg caaacagtct gacatcaaca cctgcttcgg tgaagaaggt 1800

gctaacctga tcgttcagtc tcgtgctacc ctgggtatcg gtgct 1845

<210> 8

<211> 585

<212> DNA

<213> 优化后的鸡IFN-α基因序列

<400> 8

ccgaccatgg ctgttccggc ttctccgcag cacccgcgtg gttacggtat cctgctgctg 60

accctgctgc tgaaagctct ggctaccacc gcttctgctt gcaaccacct gcgtccgcag 120

gacgctacct tctctcacga ctctctgcag ctgctgcgtg acatggctcc gaccctgccg 180

cagctgtgcc cgcagcacaa cgcttcttgc tctttcaacg acaccatcct ggacacctct 240

aacacccgtc aggctgacaa aaccacccac gacatcctgc agcacctgtt caaaatcctg 300

tcttctccgt ctaccccggc tcactggaac gactctcagc gtcagtctct gctgaaccgt 360

atccaccgtt acacccagca cctggaacag tgcctggact cttctgacac ccgttctcgt 420

acccgttggc cgcgtaacct gcacctgacc atcaaaaaac acttctcttg cctgcacacc 480

ttcctgcagg acaacgacta ctctgcttgc gcttgggaac acgttcgtct gcaggctcgt 540

gcttggttcc tgcacatcca caacctgacc ggtaacaccc gtacc 585

<210> 9

<211> 429

<212> DNA

<213> 优化后鸡IL-2基因序列

<400> 9

atgatgtgca aagttctgat cttcggttgc atctctgttg ctatgctgat gaccaccgct 60

tacggtgctt ctctgtcttc tgaaaaatgg aaaaccctgc agaccctgat caaagacctg 120

gaaatcctgg aaaacatcaa aaacaaaatc cacctggaac tgtacacccc gaccgaaacc 180

caggaatgca cccagcagac cctgcagtgc tacctgggtg aagttgttac cctgaaaaaa 240

gaaaccgaag acgacaccga aatcaaagaa gaattcgtta ccgctatcca gaacatcgaa 300

aaaaacctga aatctctgac cggtctgaac cacaccggtt ctgaatgcaa aatctgcgaa 360

gctaacaaca aaaaaaaatt cccggacttc ctgcacgaac tgaccaactt cgttcgttac 420

ctgcagaaa 429

Claims

1.鸡白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的氨基酸序列表如SEQUENCE LISTING 400〈1〉所示，记为融合蛋白1。

2.一种编码如权利要求1所述的鸡白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列表如SEQUENCE LISTING 400〈2〉所示，记为基因组1；或如SEQUENCE LISTING 400〈3〉所示，记为基因组2。

3.含有如权利要求2所述基因的表达载体。

4.含有如权利要求2所述基因的基因工程菌。

5.权利要求1所述的鸡白蛋白-干扰素α-白介素2融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：将含有核苷酸序列表如SEQUENCE LISTING 400〈2〉所示的基因组1或核苷酸序列表如SEQUENCE LISTING 400〈3〉所示的基因组2的表达载体导入到大肠杆菌宿主细胞中，获得基因工程菌，基因工程菌经IPTG诱导表达后得到所述融合蛋白的粗品，经纯化后即可得到融合蛋白。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述基因工程菌为pET-32a/rAlb-IFNα-IL2，其制备方法为：

(2)、将连接后的目的基因连接到pET-32a质粒上获得表达载体；

7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，所述大肠杆菌宿主细胞为BL21(DE3)感受态细胞或带有pGro7质粒的BL21(DE3)感受态细胞。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述纯化的方法为：融合蛋白的粗品先后经亲和层析、阴离子交换层析和分子筛层析纯化。

9.一种鸡长效干扰素，其特征在于，所述鸡长效干扰素由权利要求1所述的融合蛋白与冻干保护剂混配之后，经冷冻干燥而成。

10.根据权利要求9所述的鸡长效干扰素，其特征在于，所述冻干保护剂为甘油、甘露醇和蔗糖。