ES2708561T3 - Métodos para la purificación de ARN mensajero - Google Patents

Abstract

Un método de purificación de ARN mensajero (ARNm), que comprende (a) sintetizar ARNm mediante transcripción In Vitro utilizando los siguientes reactivos: (i) una plantilla de ADN lineal o circular que contiene un promotor; (ii) un conjunto de trifosfatos de ribonucleósido; (iii) un sistema tampón que incluye opcionalmente DTT e iones de magnesio; y (iv) una polimerasa de ARN; y opcionalmente (v) una ADNasa I, una pirofosfatasa y/o un inhibidor de ARNasa; (b) añadir un agente desnaturalizante de proteínas a la preparación de la etapa (a), que comprende el ARNm sintetizado In Vitro, en el que el agente desnaturalizante de proteínas es un agente caotrópico o una alta concentración de sal; y (c) purificar el ARNm de la preparación de la etapa (b) mediante filtración de flujo tangencial, en donde la filtración de flujo tangencial comprende: (i) una presión transmembrana entre 1 y 30 libras por pulgada cuadrada; (ii) una velocidad de alimentación entre 50 y 500 mL/minuto; (iii) un caudal entre 10 y 100 mL/minuto; y (iv) un filtro que tiene un límite de peso molecular nominal de entre 200 kDa y 700 kDa, en donde el ARNm purificado de la etapa (c) contiene niveles indetectables de secuencias de ARN abortadas prematuramente y reactivos enzimáticos usados en síntesis In Vitro según lo determinado por electroforesis en gel de agarosa o métodos cromatográficos.

Description

DESCRIPCION

Metodos para la purificacion de ARN mensajero

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

[0001] La terapia de ARN mensajero se esta convirtiendo en un enfoque cada vez mas importante para el tratamiento de una variedad de enfermedades. La terapia de ARN mensajero implica la administracion de ARN mensajero (ARNm) en un paciente que necesita la terapia y la produccion de la protema codificada por el ARNm dentro del cuerpo del paciente. Por lo tanto, es importante garantizar la produccion de un producto de ARNm altamente puro y seguro. Tradicionalmente, la purificacion de ARN emplea columnas de giro e implica el uso de disolventes causticos o inflamables, como el etanol, que es indeseable para la administracion terapeutica y la produccion a gran escala.

SUMARIO DE LA INVENCION

[0002] La presente invencion proporciona metodos mejorados de ARNm de purificacion que es adecuado para la administracion como un producto farmaceutico basado en la filtracion de flujo tangencial (TFF). Antes de la presente invencion, la purificacion de ARN emplea tipicamente columnas de hilado e implica el uso de disolventes causticos o inflamables, como el etanol, que es indeseable para la administracion terapeutica y la produccion a gran escala. Ademas, el metodo de la tecnica anterior tfpicamente no permite la separacion de transcripciones incompletas conocidas como abortos prematuros o "shortmers", que se informa que son altamente inmunoestimulantes y cuya presencia puede alterar en gran medida la toxicidad y el perfil de tolerabilidad del ARNm como ingrediente farmaceutico activo (API). El documento WO 98/05673 describe la purificacion del ADN plasmfdico por filtracion de flujo tangencial. El documento WO 2012/077080 describe un metodo para purificar sustancias diana unidas a partmulas de contaminantes mediante filtracion de flujo tangencial. La presente invencion se basa, en parte, en el descubrimiento de que la filtracion de flujo tangencial es sorprendentemente eficaz para eliminar reactivos, enzimas, subproductos, en particular, los shortmers, de la mezcla de produccion de ARNm. Como se describe aqrn, la filtracion de flujo tangencial, particularmente en combinacion con un tratamiento previo que usa un agente desnaturalizante, puede eliminar de manera efectiva los reactivos, enzimas y subproductos que incluyen secuencias de ARN abortadas prematuramente (es decir, shortmers), mientras que se mantiene la integridad del ARNm. Mas sorprendentemente, los presentes inventores han demostrado que la filtracion de flujo tangencial se puede realizar con exito usando solo tampones acuosos como disolventes sin usar ningun disolvente caustico o inflamable. Por lo tanto, la presente invencion proporciona un metodo mas eficaz, confiable y mas seguro para purificar ARNm de aplicaciones terapeuticas a gran escala del proceso de fabricacion.

[0003] La presente invencion proporciona metodos de purificacion de ARN mensajero (ARNm), incluyendo las etapas de (a) sintetizar ARNm mediante transcripcion In Vitro usando los siguientes reactivos: (i) una plantilla de ADN circular que contiene un promotor lineal o; (ii) un conjunto de trifosfatos de ribonucleosido; (iii) un sistema tampon que incluye opcionalmente DTT y iones de magnesio; y (iv) una polimerasa de ARN; y opcionalmente (v) una ADNasa I, una pirofosfatasa y/o un inhibidor de ARNasa; (b) agregar un agente desnaturalizante de protemas a la preparacion de la etapa (a), que comprende el ARNm sintetizado In Vitro, en donde el agente desnaturalizante de protemas es un agente caotropico o una alta concentracion de sal; y (c) purificar el ARNm de la preparacion de la etapa (b) por filtracion de flujo tangencial, en donde la filtracion de flujo tangencial comprende (i) una presion transmembrana entre 1 y 30 libras por pulgada cuadrada; (ii) una velocidad de alimentacion entre 50 y 500 mL/minuto; (iii) un caudal entre 10 y l00 mL/minuto; y (iv) un filtro que tiene un lfmite de peso molecular nominal de entre 200 kDa y 700 kDa, en el que el ARNm purificado de la etapa (c) contiene niveles indetectables de secuencias de ARN abortadas prematuramente y reactivos enzimaticos utilizados en la smtesis In Vitro segun lo determinado por electroforesis de gel de agarosa o metodos cromatograficos.

[0004] La etapa (b) comprende anadir un agente desnaturalizante de protemas a la preparacion impura. En algunas realizaciones, la etapa (b) comprende incubar la preparacion impura con el agente desnaturalizante de protemas agregado a temperatura ambiente durante aproximadamente 1-10 minutos (por ejemplo, aproximadamente 2-9, 2-8, 2-7, 3-10, 3-9, 3-8, 3-7. 3-6, 4-10, 4-9, 4-8, 4-7, 4-6 minutos). En algunas realizaciones, la etapa (b) comprende incubar la preparacion impura con el agente desnaturalizante de protemas agregado a temperatura ambiente durante aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 minutos. En algunas realizaciones, la etapa (b) comprende incubar la preparacion impura con el agente desnaturalizante de protemas anadido a temperatura ambiente durante aproximadamente 5 minutos. En algunas realizaciones, un agente desnaturalizante de protemas adecuado se selecciona del grupo que consiste en urea, tiocianato de guanidinio, KCl, dodecilsulfato de sodio, otros detergentes y combinaciones de los mismos.

[0005] En algunas realizaciones, la etapa (b) comprende la adicion de urea a la preparacion impura para lograr una concentracion de urea resultante de alrededor de 1 M o mas. En algunas realizaciones, la concentracion de urea resultante es de aproximadamente 2 M o mas, 3 M o mas, 4 M o mas, 5 M o mas, 6 M o mas, 7 Mo mas, 8 M o mas, 9 M o mas, o 10 M o mas.

[0006] En algunas realizaciones, la etapa (b) comprende la adicion de tiocianato de guanidinio a la preparacion impura para lograr una concentracion de tiocianato de guanidinio resultante de alrededor de 1 M o mas. En algunas realizaciones, la concentracion de tiocianato de guanidinio resultante es aproximadamente 2 M o mas, 3 M o mas, 4 M o mas, 5 M o mas, 6 M o mas, 7 M o mas, 8 M o mas, 9 M o mas, o 10 M o mas.

[0007] En algunas realizaciones, la etapa (b) comprende la adicion de KCl a la preparacion impura para conseguir una concentracion de KCl resultante de alrededor de 1 M o mas. En algunas realizaciones, la concentracion de KCl resultante es aproximadamente 2 M o mas, 3 M o mas, 4 M o mas, o 5 M o mas.

[0008] En algunas realizaciones, la filtracion de flujo tangencial se realiza utilizando disolventes solamente acuosos. En algunas realizaciones, la filtracion de flujo tangencial se realiza utilizando agua como disolvente. En algunas realizaciones, la filtracion de flujo tangencial se realiza a una velocidad de alimentacion de aproximadamente 100­ 200 mL/minuto (por ejemplo, aproximadamente 100-180 mL/minuto, 100-160 mL/minuto, 100-140 mL/minuto, 110­ 190 mL/minuto, 110-170 mL/minuto, o 110-150 mL/minuto) y/o un caudal de aproximadamente 10-50 mL/minuto (por ejemplo, aproximadamente 10-40 mL/minuto, 10-30 mL/minuto, 20-50 mL/minuto, o 20-40 mL/minuto). En algunas realizaciones, la filtracion de flujo tangencial se realiza a una velocidad de alimentacion de aproximadamente 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o 200 mL/minuto y/o una velocidad de flujo de aproximadamente 10, 20, 30, 40 o 50 mL/minuto.

[0009] En algunas realizaciones, el ARNm purificado de la etapa (c) contiene secuencias indetectables de ARN prematuramente abortadas y/o reactivos enzimaticos utilizados en la smtesis In Vitro como se determina por el bromuro de etidio y/o tincion de Coomassie.

[0010] En algunas realizaciones, las secuencias de ARN prematuramente abortadas comprenden menos de 15 bases (por ejemplo, menos de 14, 13, 12, 11, 10, 9 u 8 bases). En algunas realizaciones, las secuencias de ARN abortadas prematuramente comprenden aproximadamente 8-12 bases.

[0011] En algunas realizaciones, los reactivos enzimaticos utilizados en la smtesis In Vitro comprenden polimerasa ARN T7, ADNasa I, pirofosfatasa, e/o inhibidor de RNasa. En algunas realizaciones, los reactivos enzimaticos usados en la smtesis In Vitro comprenden polimerasa de ARN T7.

[0012] En algunas realizaciones, la filtracion de flujo tangencial se realiza antes de un casquillo y cola poli-A se anaden al ARNm sintetizado In Vitro. En algunas realizaciones, la filtracion de flujo tangencial se realiza despues de agregar una tapa y una cola de poli-A al ARNm sintetizado In Vitro. En algunas realizaciones, la filtracion de flujo tangencial se realiza antes y despues de que se agreguen una tapa y una cola de poli-A al ARNm sintetizado In Vitro.

[0013] En algunas realizaciones, el ARNm sintetizado In Vitro es mayor que aproximadamente 1 kb, 1,5 kb, 2 kb, 2,5 kb, 3 kb, 3,5 kb, 4 kb, 4,5 kb, o 5 kb de longitud. En algunas realizaciones, el ARNm sintetizado In Vitro comprende una o mas modificaciones para mejorar la estabilidad. En algunas realizaciones, una o mas modificaciones se seleccionan de nucleotidos modificados, esqueletos de fosfato de azucar modificados, region 5' y/o 3' no traducida. En algunas realizaciones, el ARNm sintetizado In Vitro no esta modificado.

[0014] En algunas realizaciones, el ARNm purificado de la etapa (c) tiene una integridad mayor que aproximadamente 95% (por ejemplo, mayor que aproximadamente 96%, 97%, 98%, 99% o mas). En algunas realizaciones, el ARNm purificado de la etapa (c) tiene una integridad superior al 98%. En algunas realizaciones, el ARNm purificado a partir de la etapa (c) tiene una integridad superior al 99%. En algunas realizaciones, el ARNm purificado a partir de la etapa (c) tiene una integridad de aproximadamente el 100%.

[0015] La presente invencion tambien proporciona metodos para la fabricacion de RNA mensajero (ARNm) incluye las etapas de la smtesis de ARNm In Vitro, y purificar los ARNm sintetizados In Vitro de acuerdo con los metodos descritos anteriormente.

[0016] Como se usa en el presente documento, los terminos "alrededor de" y "aproximadamente" se utilizan como equivalentes. Cualquier numero utilizado en esta solicitud con o sin aproximadamente/alrededor de esta destinado a cubrir cualquier fluctuacion normal apreciada por un experto en la tecnica relevante.

[0017] Otras caractensticas, objetos, y ventajas de la presente invencion son evidentes en la descripcion detallada que sigue. Debe entenderse, sin embargo, que la descripcion detallada, si bien indica realizaciones de la presente invencion, se proporciona solo a modo de ilustracion, no de limitacion.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS.

[0018] Las siguientes figuras son para propositos de ilustracion y no para limitacion.

La Figura 1 muestra niveles de protemas ejemplares en la transcripcion In Vitro de muestras de ARNm de FFL purificadas de acuerdo con los metodos proporcionados, incluida la exposicion a la urea, junto con varios controles como se muestra por electroforesis en gel y tincion con Coomassie.

La Figura 2 muestra los niveles de ARNm de luciferasa de luciernaga (FFL) a modo de ejemplo en muestras de transcripcion In Vitro purificadas de acuerdo con los metodos proporcionados en comparacion con el ARNm purificado de acuerdo con metodos tradicionales como se muestra mediante electroforesis en gel de agarosa y tincion con bromuro de etidio.

La Figura 3 muestra niveles de protemas ejemplares en muestras de transcripcion In Vitro de ARNm de FFL purificado de acuerdo con los metodos proporcionados, que incluyen TFF con y sin exposicion a urea 5M, en comparacion con ARNm purificado de acuerdo con metodos tradicionales de electroforesis en gel y tincion con Coomassie.

La Figura 4 representa los datos de fluorescencia ejemplares reunidos a partir de ARNm de FFL purificado traducido a partir de metodos proporcionados en comparacion con ARNm purificado proporcionado de metodos tradicionales.

La Figura 5 muestra niveles de protema ejemplares de muestras de transcripcion In Vitro de ARNm de Factor IX (FIX) purificado de acuerdo con los metodos proporcionados, incluida la exposicion a proteinasa K y/o urea 5M, en comparacion con ARNm purificado de acuerdo con los metodos tradicionales de electroforesis en gel y tincion con Coomassie.

La Figura 6 muestra los niveles de ARNm de FIX a modo de ejemplo en muestras de transcripcion In Vitro purificadas de acuerdo con los metodos proporcionados como se muestra mediante electroforesis en gel de agarosa y tincion con bromuro de etidio.

La Figura 7 muestra niveles de protemas ejemplares en muestras de transcripcion In Vitro de ARNm regulador de conductancia transmembrana de fibrosis qmstica (CFTR) purificado segun los metodos proporcionados, incluida la exposicion a KCl 2M, en comparacion con ARNm purificado segun metodos tradicionales de electroforesis en gel y tincion con Coomassie.

La Figura 8 muestra los niveles de ARNm de CFTR a modo de ejemplo en muestras de transcripcion In Vitro purificadas segun los metodos proporcionados, incluida la exposicion a KCl 2M, como se muestra mediante electroforesis en gel de agarosa y tincion con bromuro de etidio.

La Figura 9 muestra los niveles de ARNm de CFTR a modo de ejemplo en muestras de transcripcion In Vitro purificadas de acuerdo con los metodos proporcionados, incluida la exposicion a KCl 2M, en comparacion con el ARNm purificado de acuerdo con los metodos tradicionales, como se muestra por electroforesis en gel de agarosa y tincion con bromuro de etidio.

DEFINICIONES

[0019] A fin de que la presente invencion se entendera mas facilmente, ciertos terminos se definen primero a continuacion. Las definiciones adicionales para los siguientes terminos y otros terminos se establecen a lo largo de la especificacion.

[0020] Animal: Como se usa aqrn, el termino "animal" se refiere a cualquier miembro del reino animal. En algunas realizaciones, "animal" se refiere a los humanos, en cualquier etapa de desarrollo. En algunas realizaciones, "animal" se refiere a animales no humanos, en cualquier etapa de desarrollo. En ciertas realizaciones, el animal no humano es un mairnfero (por ejemplo, un roedor, un raton, una rata, un conejo, un mono, un perro, un gato, una oveja, ganado, un primate y/o un cerdo). En algunas realizaciones, los animales incluyen, pero no se limitan a, mamfferos, aves, reptiles, anfibios, peces, insectos y/o gusanos. En algunas realizaciones, un animal puede ser un animal transgenico, un animal manipulado geneticamente y/o un clon.

[0021] Aproximadamente o alrededor de: Como se usa aqrn, el termino "aproximadamente” o “alrededor de", tal como se aplica a uno o mas valores de interes, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia establecido. En ciertas realizaciones, el termino "aproximadamente” o “alrededor de" se refiere a un rango de valores que se encuentran dentro del 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12 %, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% o menos en cualquier direccion (mayor o menor que) del valor de referencia indicado a menos que se indique lo contrario o sea evidente en el contexto (excepto cuando dicho numero supere el 100% de un valor posible).

[0022] Biologicamente activo: Como se usa aqrn, la frase "biologicamente activo" se refiere a una caractenstica de cualquier agente que tiene actividad en un sistema biologico, y en particular en un organismo. Por ejemplo, un agente que, cuando se administra a un organismo, tiene un efecto biologico en ese organismo, se considera biologicamente activo.

[0023] Expresion: Como se usa en el presente documento, "expresion" de una secuencia de acido nucleico se refiere a la traduccion de un ARNm en un polipeptido (por ejemplo, cadena pesada o cadena ligera de anticuerpo), montar multiples polipeptidos (por ejemplo, cadena pesada o cadena ligera de anticuerpo) en una protema intacta (por ejemplo, anticuerpo) y/o modificacion postraduccional de un polipeptido o protema completamente ensamblada (por ejemplo, anticuerpo). En esta aplicacion, los terminos "expresion" y "produccion", y su equivalente gramatical, se usan de manera intercambiable.

[0024] Funcional: Como se usa en este documento, una molecula biologica "funcional" es una molecula biologica en una forma en la que se exhibe una propiedad y/o la actividad por la que se caracteriza.

[0025] Mejorar, aumentar o reducir: Como se usa en el presente documento, los terminos "mejorar", "aumentar" o "reducir", o equivalentes gramaticales, indican valores relativos a una medicion de lmea de base, tales como una medicion en el mismo individuo antes de iniciar el tratamiento descrito en este documento, o una medicion en un sujeto de control (o sujeto de control multiple) en ausencia del tratamiento descrito en este documento. Un "sujeto de control" es un sujeto que padece la misma forma de enfermedad que el sujeto que esta siendo tratado, que tiene aproximadamente la misma edad que el sujeto que esta siendo tratado.

[0026] Impurezas: como se usa en este documento, el termino "impurezas" se refiere a sustancias dentro de una cantidad limitada de lfquido, gas o solido, que difieren de la composicion qmmica del material o compuesto diana. Las impurezas tambien se conocen como contaminantes.

[0027] In Vitro: Como se usa aqrn, el termino "In Vitro" se refiere a eventos que se producen en un entorno artificial, por ejemplo, en un recipiente de tubo de ensayo o reaccion, en cultivo celular, etc, en lugar de dentro de un organismo multi-celular.

[0028] In Vivo: Como se usa aqrn, el termino "In Vivo" se refiere a eventos que se producen dentro de un organismo multicelular, como un un animal no humano y humanos. En el contexto de los sistemas basados en celulas, el termino puede usarse para referirse a eventos que ocurren dentro de una celula viva (en oposicion a, por ejemplo, sistemas In Vitro).

[0029] Aislado: Como se usa aqrn, el termino "aislado" se refiere a una sustancia y/o entidad que ha sido (1) separada de al menos algunos de los componentes con los que se asocio cuando se produjo inicialmente (ya sea en la naturaleza y/o en un entorno experimental), y/o (2) producido, preparado y/o fabricado por la mano del hombre. Las sustancias y/o entidades aisladas pueden separarse de aproximadamente el 10%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 30%, aproximadamente el 40%, aproximadamente el 50%, aproximadamente el 60%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 91%, aproximadamente el 92%, aproximadamente el 93%, aproximadamente el 94%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 96%, aproximadamente el 97%, aproximadamente el 98%, aproximadamente el 99%, o mas de aproximadamente el 99% de los otros componentes con los que se asociaron inicialmente. En algunas realizaciones, los agentes aislados son aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente el 99%, o mas del 99% de pureza. Como se usa en este documento, una sustancia es "pura" si esta sustancialmente libre de otros componentes. Como se usa en el presente documento, el calculo del porcentaje de pureza de sustancias y/o entidades aisladas no debe incluir excipientes (por ejemplo, tampon, disolvente, agua, etc.).

[0030] ARN mensajero (ARNm): como se usa en el presente documento, el termino "ARN mensajero (ARNm)" se refiere a un polinucleotido que codifica al menos un polipeptido. El ARNm como se usa en este documento abarca tanto el ARN modificado como el no modificado. El ARNm puede contener una o mas regiones codificantes y no codificantes.

[0031] Integridad de ARNm: Como se usa aqrn, el termino "integridad de ARNm" generalmente se refiere a la calidad de ARNm. En algunas realizaciones, la integridad del ARNm se refiere al porcentaje de ARNm que no se degrada despues de un proceso de purificacion (por ejemplo, filtracion de flujo tangencial). La integridad del ARNm se puede determinar utilizando metodos bien conocidos en la tecnica, por ejemplo, mediante electroforesis en gel de agarosa de ARN (por ejemplo, Ausubel y otros, John Weley & Sons, Inc., 1997. Current Protocols in Molecular Biology).

[0032] Acido nucleico: Como se usa aqrn, el termino "acido nucleico", en su sentido mas amplio, se refiere a cualquier compuesto y/o sustancia que es o puede ser incorporado en una cadena de polinucleotido. En algunas realizaciones, un acido nucleico es un compuesto y/o sustancia que es o puede incorporarse a una cadena de polinucleotido a traves de un enlace fosfodiester. En algunas realizaciones, "acido nucleico" se refiere a residuos de acido nucleico individuales (por ejemplo, nucleotidos y/o nucleosidos). En algunas realizaciones, "acido nucleico" se refiere a una cadena de polinucleotido que comprende residuos de acido nucleico individuales. En algunas realizaciones, el "acido nucleico" abarca el ARN, asf como el ADN y/o el ADNc de cadena simple y/o de doble cadena. Ademas, los terminos "acido nucleico", "ADN", "ARN" y/o terminos similares incluyen analogos de acido nucleico, es decir, analogos que tienen un esqueleto de fosfodiester distinto al de la columna vertebral. Por ejemplo, los denominados "acidos nucleicos peptidicos", que son conocidos en la tecnica y tienen enlaces peptidicos en lugar de enlaces fosfodiester en el esqueleto, se consideran dentro del alcance de la presente divulgacion. El termino "secuencia de nucleotidos que codifica una secuencia de aminoacidos" incluye todas las secuencias de nucleotidos que son versiones degeneradas entre sf y/o codifican la misma secuencia de aminoacidos. Las secuencias de nucleotidos que codifican protemas y/o ARN pueden incluir intrones. Los acidos nucleicos pueden purificarse a partir de fuentes naturales, producirse usando sistemas de expresion recombinantes y opcionalmente purificarse, sintetizarse qmmicamente, etc. Cuando sea apropiado, por ejemplo, en el caso de moleculas sintetizadas qmmicamente, los acidos nucleicos pueden comprender analogos de nucleosidos tales como analogos que tienen bases modificadas qmmicamente o azucares, modificaciones del esqueleto, etc. Una secuencia de acido nucleico se presenta en la direccion 5' a 3' a menos que se indique lo contrario. En algunas realizaciones, un acido nucleico es o comprende nucleosidos naturales (por ejemplo, adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxiguanosina y desoxicitidina); analogos de nucleosidos (p. ej., 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolo-pirimidina, 3-metilo adenosina, 5-metilcitidina, C-5 propinilo-citidina, C-5 propinilo-uridina, 2-aminoadenosina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-yodouridina, C5-propinilo-uridina, C5-propinilo-citidina, C5-metilcitidina, 2-aminoadenosina, 7-deazaadenosina, 7-deazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxogadenosina, O(6)-metilguanina y 2-tiocitidina); bases qmmicamente modificadas; bases biologicamente modificadas (por ejemplo, bases metiladas); bases intercaladas; azucares modificados (por ejemplo, 2'-fluororibosa, ribosa, 2'-desoxirribosa, arabinosa y hexosa); y/o grupos fosfato modificados (por ejemplo, fosforotioatos y enlaces 5'-N-fosforamidita). En algunas realizaciones, la presente invencion se dirige espedficamente a "acidos nucleicos no modificados", es decir, acidos nucleicos (por ejemplo, polinucleotidos y residuos, incluidos nucleotidos y/o nucleosidos) que no se han modificado qmmicamente para facilitar o lograr el suministro.

[0033] Paciente:. Tal como se utiliza aqm, el termino "paciente" o "sujeto" se refiere a cualquier organismo al que se puede administrar una composicion proporcionada, por ejemplo, para propositos experimental, diagnostico, profilactico, cosmetico, y/o terapeutico. Los pacientes tfpicos incluyen animales (por ejemplo, mairnferos como ratones, ratas, conejos, primates no humanos y/o humanos). En algunas realizaciones, un paciente es un humano. Un humano incluye formas pre y post natales.

[0034] Farmaceuticamente aceptable: El termino "farmaceuticamente aceptable" como se usa aqm, se refiere a sustancias que, dentro del alcance del juicio medico, son adecuadas para uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritacion, alergica respuesta u otro problema o complicacion, proporcional a una relacion razonable entre beneficio y riesgo.

[0035] Secuencias de ARN prematuramente abortadas: El termino "secuencias de ARN prematuramente abortadas", como se usa aqm, se refiere a los productos incompletos de una reaccion de smtesis de ARNm (por ejemplo, una reaccion de smtesis In Vitro). Por diversas razones, polimerasas de ARN no siempre completan la transcripcion de una plantilla de ADN; Es decir, la smtesis de ARN termina prematuramente. Las posibles causas de la terminacion prematura de la smtesis de ARN incluyen la calidad de la plantilla de ADN, las secuencias terminadoras de polimerasa para una polimerasa particular presente en la plantilla, los tampones degradados, la temperatura, el agotamiento de ribonucleotidos y las estructuras secundarias de ARNm. Las secuencias de ARN abortadas prematuramente pueden tener cualquier longitud que sea menor que la longitud prevista del producto transcripcional deseado. Por ejemplo, las secuencias de ARNm abortadas prematuramente pueden ser menos de 1.000 bases, menos de 500 bases, menos de 100 bases, menos de 50 bases, menos de 40 bases, menos de 30 bases, menos de 20 bases, menos de 15 bases, menos de 10 bases o menos.

[0036] Sal: Como se usa aqm, el termino "sal" se refiere a un compuesto ionico que resulta o puede resultar de una reaccion de neutralizacion entre un acido y una base.

[0037] Sujeto: Como se usa aqm, el termino "sujeto" se refiere a cualquier animal no humano (por ejemplo, raton, rata, conejo, perro, gato, ganado, cerdos, oveja, caballo, humano o primate). Un humano incluye formas pre y post natales. En muchas realizaciones, un sujeto es un ser humano. Un sujeto puede ser un paciente, que se refiere a un ser humano que se presenta a un proveedor medico para el diagnostico o tratamiento de una enfermedad. El termino "sujeto" se usa aqm de manera intercambiable con "individual" o "paciente". Un sujeto puede padecer o es susceptible a una enfermedad o trastorno, pero puede o no mostrar smtomas de la enfermedad o trastorno.

[0038] Sustancialmente: Como se usa aqm, el termino "sustancialmente" se refiere a la condicion cualitativa de exhibir extension o grado de una propiedad caractenstica o de interes total o casi total. Una persona con experiencia ordinaria en las artes biologicas entendera que los fenomenos biologicos y qmmicos rara vez, o nunca, se completan y/o proceden a completarse o logran o evitan un resultado absoluto. Por lo tanto, el termino "sustancialmente" se usa en el presente documento para capturar la posible falta de integridad inherente en muchos fenomenos biologicos y qmmicos.

[0039] Sustancialmente libre: Como se usa aqm, el termino "sustancialmente libre" se refiere a un estado en el que sea retirada relativamente poca o ninguna cantidad de una sustancia (por ejemplo, secuencias de ARN prematuramente abortadas) estan presentes. Por ejemplo, "sustancialmente libre de secuencias de ARN abortadas prematuramente" significa que las secuencias de ^a Rⁿ abortadas prematuramente estan presentes a un nivel inferior a aproximadamente el 5%, 4%, 3%, 2%, 1,0%, 0,9%, 0,8%, 0,7% %, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2%, 0,1% o menos (p/p) de la impureza. Alternativamente, "sustancialmente libre de secuencias de ARN abortadas prematuramente" significa que las secuencias de ARN abortadas prematuramente estan presentes a un nivel inferior a aproximadamente 100 ng, 90 ng, 80 ng, 70 ng, 60 ng, 50 ng, 40 ng, 30 ng, 20 ng, 10 qg, 1 ng, 500 pg, 100 pg, 50 pg, 10 pg, o menos.

DESCRIPCION DETALLADA

[0040] La presente invencion proporciona metodos mejorados para la purificacion de ARNm a partir de una preparacion impura (por ejemplo, mezcla de reaccion de smtesis In Vitro) basada en la filtracion de flujo tangencial. El metodo de la invencion de acuerdo con la presente invencion incluye las etapas de (a) sintetizar ARNm mediante transcripcion In Vitro usando los siguientes reactivos: (i) una plantilla de ADN lineal o circular que contiene un promotor; (ii) un conjunto de trifosfatos de ribonucleosido; (iii) un sistema tampon que incluye opcionalmente DTT e iones de magnesio; y (iv) una polimerasa de ARN; y opcionalmente (v) una ADNasa I, una pirofosfatasa y/o un inhibidor de ARNasa; (b) agregar un agente desnaturalizante de protemas a la preparacion de la etapa (a), que comprende el ARNm sintetizado In Vitro, en donde el agente desnaturalizante de protemas es un agente caotropico o una alta concentracion de sal; y (c) purificar el ARNm de la preparacion de la etapa (b) por filtracion de flujo tangencial, en donde el ARNm purificado de la etapa (c) en donde la filtracion de flujo tangencial comprende (i) una presion transmembrana entre 1 y 30 libras por pulgada cuadrada; (ii) una velocidad de alimentacion entre 50 y 500 mL/minuto; y (iii) un caudal entre 10 y 100 mL/minuto, en el que el ARNm purificado de la etapa (c) contiene niveles no detectables de secuencias de ARN abortadas prematuramente y reactivos enzimaticos utilizados en la smtesis In Vitro segun lo determinado por electroforesis en gel de agarosa o metodos cromatograficos.

[0041] Se describen varios aspectos de la invencion en detalle en las siguientes secciones. El uso de secciones no pretende limitar la invencion. Cada seccion puede aplicarse a cualquier aspecto de la invencion. El uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario.

Smtesis de ARNm

[0042] El ARNm se suele considerar como el tipo de ARN que transporta informacion del ADN al ribosoma. La existencia de ARNm suele ser muy breve e incluye el procesamiento y la traduccion, seguidos de la degradacion. Tfpicamente, en los organismos eucarioticos, el procesamiento del ARNm comprende la adicion de una "tapa" en el extremo N-terminal (5'), y una "cola" en el extremo C-terminal (3'). Una capsula tfpica es una capsula de 7-metilguanosina, que es una guanosina que esta unida a traves de un enlace 5-5-trifosfato al primer nucleotido transcrito. La presencia de la tapa es importante para proporcionar resistencia a las nucleasas que se encuentran en la mayona de las celulas eucarioticas. La cola es tfpicamente un evento de poliadenilacion por el cual se agrega un resto poliadenililo al extremo 3' de la molecula de ARNm. La presencia de esta "cola" sirve para proteger el ARNm de la degradacion de la exonucleasa. El ARN mensajero es traducido por los ribosomas en una serie de aminoacidos que forman una protema.

[0043] Los ARNm se sintetizan a traves de la transcripcion In Vitro (TIV). En resumen, la TIV se realiza tfpicamente con una plantilla de ADN lineal o circular que contiene un promotor, un conjunto de trifosfatos de ribonucleotido, un sistema de tampon que puede incluir DTT e iones de magnesio, y una polimerasa de ARN apropiada (por ejemplo, polimerasa de ARN T3, T7 o SP6), ADNasa I, pirofosfatasa e/o inhibidor de ARNasa. Las condiciones exactas variaran segun la aplicacion espedfica. La presencia de estos reactivos es indeseable en el producto final de acuerdo con varias realizaciones y, por lo tanto, puede denominarse impurezas y una preparacion que contiene una o mas de estas impurezas puede denominarse una preparacion impura.

[0044] Los ARNm pueden purificarse a escala comercial. En algunas realizaciones, el ARNm se purifica en una escala de 0,1 gramos, 0,5 gramos, 1 gramo, 2 gramos, 3 gramos, 4 gramos, 5 gramos, 6 gramos, 7 gramos, 8 gramos, 9 gramos, 10 gramos, 20 gramos, 30 gramos, 40 gramos, 50 gramos, 60 gramos, 70 gramos, 80 gramos, 90 gramos, 100 gramos, 200 gramos, 300 gramos, 400 gramos, 500 gramos, 600 gramos, 700 gramos, 800 gramos, 900 gramos, o 1.000 gramos por lote.

[0045] De acuerdo con diversas realizaciones, la presente invencion puede usarse para purificar ARNm sintetizado In Vitro de una variedad de longitudes. En algunas realizaciones, la presente invencion se puede usar para purificar ARNm sintetizado In Vitro de mas de aproximadamente 1 kb, 1,5 kb, 2 kb, 2,5 kb, 3 kb, 3,5 kb, 4 kb, 4,5 kb, 5 kb, 6 kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 11 kb, 12 kb, 13 kb, 14 kb o 15 kb de longitud. En algunas realizaciones, la presente invencion se puede usar para purificar ARNm que contiene una o mas modificaciones que tfpicamente mejoran la estabilidad. En algunas realizaciones, una o mas modificaciones se seleccionan de nucleotidos modificados, esqueletos de fosfato de azucar modificados, region 5' y/o 3' no traducida. En algunas realizaciones, la presente invencion se puede usar para purificar ARNm sintetizado In Vitro que no esta modificado.

[0046] Tfpicamente, los ARNm se modifican para mejorar la estabilidad. Las modificaciones del ARNm pueden incluir, por ejemplo, modificaciones de los nucleotidos del ARN. Un ARNm modificado puede incluir, por ejemplo, modificaciones de la estructura principal, modificaciones de azucar o modificaciones de base. En algunas realizaciones, el anticuerpo que codifica ARNm (por ejemplo, cadena pesada y cadena ligera que codifica ARNm) puede sintetizarse a partir de nucleotidos naturales y/o analogos de nucleotidos (nucleotidos modificados) que incluyen, entre otros, purinas (adenina (A), guanina (G)) o pirimidinas (timina (T), citosina (C), uracilo (U)) y analogos de nucleotidos modificados o derivados de purinas y pirimidinas, como por ejemplo 1-metilo-adenina, 2-metiloadenina, 2-metiltio-N-6-isopentenil-adenina, N6-metilo-adenina, N6-isopentenilo-adenina, 2-tio-citosina, 3-metilocitosina, 4-acetilo-citosina, 5-metilo-citosina, 2,6-diaminopurina, 1-metilo-guanina, 2-metilo-guanina, 2,2-dimetiloguanina, 7-metilo-guanina, inosina, 1-metilo-inosina, pseudouracilo (5-uracilo), dihidro-uracilo, 2-tio-uracilo, 4-tiouracilo, 5-carboximetilaminometilo-2-tio-uracilo, 5-(carboxihidroximetilo)-uracilo, 5-fluoro-uracilo, 5-bromo-urilo, 5-carboximetilaminometilo-uracilo, 5-metilo-2-tio-uracilo, 5-metilo-uracilo, N-uracil-5 ester metflico del acido oxiacetico, 5-metilaminometil-uracilo, 5-metoxiaminometil-2-tio-uracilo, 5'-metoxicarbonilmetil-uracilo, 5-metoxi-uracilo, acido uracil-5-oxiacetico, ester metilico, acido uracil-5-oxiacetico (v), 1-metilo-pseudouracilo, queosina, p-D-manosiloqueosina, wybutoxosina y fosforamidatos, fosforotioatos, nucleotidos peptfdicos, metilfosfonatos, 7-deazaguanosina, 5-metilcitosina e inosina. La preparacion de tales analogos es conocida por un experto en la tecnica, por ejemplo, de la patente de EE.UU. N° 4.373.071, Patente de EE.UU. N° 4.401.796, Patente de EE.UU. N° 4.415.732, Patente de EE.UU. N° 4.458.066, Patente de EE.UU. N° 4.500.707. Patente de EE.UU. N° 4.668.777. Patente de EE.UU. N° 4.973.679, Patente de EE.UU. N° 5.047.524, Patente de EE.UU. N° 5.132.418, Patente de EE.UU. N° 5.153.319, Patente de EE.UU. Nos 5.262.530 y 5.700.642.

[0047] Tfpicamente, la smtesis de ARNm incluye la adicion de un "tope" en el extremo de N-terminal (5'), y una 'cola' en el extremo de C-terminal (3'). La presencia de la tapa es importante para proporcionar resistencia a las nucleasas que se encuentran en la mayona de las celulas eucarioticas. La presencia de una "cola" sirve para proteger el ARNm de la degradacion de la exonucleasa.

[0048] Por lo tanto, en algunas realizaciones, los ARNm incluyen una estructura de tapa 5'. Una tapa 5' se agrega tipicamente de la siguiente manera: primero, una fosfatasa terminal de ARN elimina uno de los grupos fosfato terminales del nucleotido 5', dejando dos fosfatos terminales; el trifosfato de guanosina (GTP) se agrega luego a los fosfatos terminales a traves de una transferasa de guanililo, produciendo un enlace 5'5'5 trifosfato; y el 7-nitrogeno de la guanina se metila luego por una metiltransferasa. Los ejemplos de estructuras de tapa incluyen, pero no se limitan a, m7G(5')ppp (5'(A,G(5')ppp(5')A y G(5')ppp(5')G.

[0049] En algunas realizaciones, los ARNm incluyen una region no traducida 5' y/o 3'. En algunas realizaciones, una region 5' no traducida incluye uno o mas elementos que afectan la estabilidad o traduccion de un ARNm, por ejemplo, un elemento sensible al hierro. En algunas realizaciones, una region no traducida 5' puede tener una longitud de aproximadamente 50 a 500 nucleotidos.

[0050] En algunas realizaciones, una region no traducida 3' incluye uno o mas de una senal de poliadenilacion, un sitio de union para las protemas que afectan la estabilidad de la ubicacion de un ARNm en una celula, o uno o mas sitios de union para ARNmi. En algunas realizaciones, una region 3' no traducida puede tener una longitud de entre 50 y 500 nucleotidos o mas.

[0051] La presente invencion puede usarse para purificar los ARNm que codifican una variedad de protemas. Los ejemplos no limitantes de la purificacion de los ARNm que codifican luciferasa de luciernaga, Factor IX y CFTR, se describen en detalle en la seccion de Ejemplos.

Condiciones de desnaturalizacion y agentes de desnaturalizacion

[0052] Tfpicamente, el cambio de la conformacion de un acido nucleico o protema, ya sea temporal o permanentemente mediante la interrupcion de las fuerzas intermoleculares se llama desnaturalizacion. La desnaturalizacion resulta en un cambio estructural y, a menudo, en una perdida de actividad. Dado que la conformacion nativa de una molecula suele ser la mas soluble en agua, la ruptura de las estructuras secundarias y terciarias de una molecula puede causar cambios en la solubilidad y puede provocar la precipitacion de la protema o del acido nucleico de la solucion. Sorprendentemente, como se describe en el presente documento, el uso de una condicion de desnaturalizacion en combinacion con la filtracion de flujo tangencial (TFF) puede facilitar la purificacion del ARNm mientras que se mantiene la integridad del ARNm.

[0053] Tal como se utiliza aqrn, el termino "condicion desnaturalizante" se refiere a cualquier condiciones qmmicas o ffsicas que puede causar la desnaturalizacion. Condiciones desnaturalizantes de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, reactivos qmmicos, altas temperaturas, pH extremo, etc.

[0054] En algunas realizaciones de la descripcion, una condicion de desnaturalizacion se logra mediante la adicion de uno o mas agentes desnaturalizantes a una preparacion impura contiene ARNm para ser purificado. En algunas realizaciones, un agente desnaturalizante adecuado es una protema y/o un agente desnaturalizante de ADN. En algunas realizaciones, un agente desnaturalizante puede ser: 1) una enzima (tal como una proteinasa de serina o una ADNasa), 2) un acido, 3) un disolvente, 4) un agente de reticulacion, 5) un agente caotropico, 6) un agente reductor, y/o 7) alta fuerza ionica a traves de concentraciones de alto contenido de sal. En algunas realizaciones, un agente particular puede caer en mas de una de estas categonas.

[0055] En algunas realizaciones de la descripcion, una o mas enzimas se pueden usar como agentes desnaturalizantes para degradar las protemas y las plantillas de ADN utilizadas en la smtesis de ARNm. En algunas realizaciones, las enzimas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, proteasas de serina tales como proteasas de serina de quimotripsina y similares a quimotripsina, proteasas de serina de tripsina y similares a tripsina, proteasas de serina similares a elastasa y similares a elastasa, y combinaciones de las mismas, desoxirribonucleasas (DNasas) tales como desoxirribonucleasa I, II y/o IV, enzimas de restriccion tales como EcoRI, EcoRII, BamHI, HindIII, SpeI, SphI, StuI, XbaI y combinaciones de las mismas.

[0056] En algunas realizaciones de la descripcion, un acido puede ser utilizado como un agente desnaturalizante. En algunas realizaciones, un acido adecuado puede ser acido acetico, acido formico, acido oxalico, acido cftrico, acido benzoico, acido cloroacetico, acido dicloroacetico, acido tricloroacetico, acido ascorbico, acido sulfosalidlico y combinaciones de los mismos.

[0057] En algunas realizaciones de la descripcion, un disolvente puede usarse como un agente desnaturalizante. En algunas realizaciones, un disolvente puede ser alcohol isopropflico, acetona, cetona de etilo de metilo, cetona de isobutilo de metilo, etanol, metanol, denatonio y combinaciones de los mismos.

[0058] En algunas realizaciones de la invencion, un agente caotropico puede ser demandado como un agente desnaturalizante. Los agentes coatropicos son sustancias que alteran la estructura de macromoleculas como las protemas y los acidos nucleicos al interferir con fuerzas no covalentes, como los enlaces de hidrogeno y las fuerzas de van der Waals. En algunas realizaciones, un agente caotropico puede ser urea, tiourea, cloruro de guanidinio, tiocianato de guanidinio, isotiocianato de guanidinio, acetato de litio, cloruro de magnesio, dodecilo sulfato de sodio, perclorato de litio y combinaciones de los mismos.

[0059] En algunas realizaciones de la invencion, una preparacion impura que contiene ARNm para purificarse se trata con urea. En algunas realizaciones, se agrega una cantidad de urea de modo que la concentracion de urea resultante sea aproximadamente 1M o mas. En algunas realizaciones, la urea se agrega de tal manera que la concentracion de urea resultante sea aproximadamente 2 M o mas, 3 M o mas, 4 M o mas, 5 M o mas, 6 M o mas, 7 M o mas, 8 M o mas, 9 M o mas, o 10 M o mas. En algunas realizaciones, una preparacion impura que contiene ARNm a purificar se trata con tiocianato de guanidinio. En algunas realizaciones, se agrega una cantidad de tiocianato de guanidinio de manera que la concentracion de tiocianato de guanidinio resultante sea aproximadamente 1M o mas. En algunas realizaciones, se agrega tiocianato de guanidinio de modo que la concentracion de tiocianato de guanidinio resultante sea aproximadamente 2 M o mas, 3 M o mas, 4 M o mas, 5 M o mas, 6 M o mas, 7 M o mas, 8 M o mas, 9 M o mas, o 10 M o mas.

[0060] En algunas realizaciones de la descripcion, un agente reductor puede usarse como un agente desnaturalizante. Los agentes reductores son compuestos que donan un electron a otra especie y se oxidan. En algunas realizaciones, un agente reductor puede ser hidruro de litio y aluminio, amalgama de sodio, diborano, borohidruro de sodio, sulfitos, hidruro de diisobutilaluminio, fosfitos, monoxido de carbono, 2-mercaptoetanol, ditiotreitol o fosfato de tris(2-carboxietilo) y combinaciones de los mismos.

[0061] En algunas realizaciones de la descripcion, uno o mas de pH, calor, y/o metales pesados (tales como plomo, mercurio y cadmio) tambien se pueden utilizar unos agentes desnaturalizantes. Se sabe que los extremos del pH causan que se desnaturalice una protema. Aunque el esqueleto de una cadena de protema es neutral, los residuos de aminoacidos que comprenden la protema a menudo contienen grupos acidos y basicos. Estos grupos suelen estar cargados y pueden formar puentes de sal con un grupo de carga opuesta. En consecuencia, los extremos del pH pueden cambiar las cargas en estos grupos acidos y basicos, interrumpiendo los puentes salinos.

[0062] En algunas realizaciones de la descripcion, los cambios menos drasticos en el pH pueden tambien afectar a la actividad y la solubilidad de una protema. Al igual que los aminoacidos individuales, las protemas tienen un punto isoelectrico en el que el numero de cargas negativas es igual al numero de cargas positivas. Esto es frecuentemente el punto de minima solubilidad en agua. En el pH isoelectrico, no hay carga neta en la molecula. Las moleculas individuales tienden a acercarse unas a otras, a coagularse y a precipitarse fuera de la solucion. A un pH por encima o por debajo del pH isoelectrico, las moleculas tienen una carga neta negativa o positiva, respectivamente. Asf, cuando las moleculas de protema se aproximan unas a otras, tienen la misma carga general y se rechazan unas a otras.

[0063] En algunas realizaciones de la descripcion, el calor se puede utilizar como un agente desnaturalizante. El calor puede suministrar energfa cinetica a las moleculas de protema, haciendo que sus atomos vibren mas rapidamente. En algunas realizaciones, esto interrumpira fuerzas relativamente debiles, tales como enlaces de hidrogeno e interacciones hidrofobas. El calor tambien se usa en la esterilizacion para desnaturalizar y, por lo tanto, destruir las enzimas en las bacterias.

[0064] En algunas realizaciones de la descripcion, las sales de iones metalicos tales como el mercurio (II), plomo (II), y la plata se puede usar como agentes de desnaturalizacion debido a su capacidad para formar enlaces fuertes con los grupos disulfuro y con los iones carboxilato de los aminoacidos acidos. Por lo tanto, interrumpen los puentes disulfuro y los enlaces salinos y hacen que la protema se precipite fuera de la solucion como una sal metal-protema insoluble.

[0065] En algunas realizaciones de la invencion, las altas concentraciones de sal (elevada salinidad) tambien pueden usarse como un agente desnaturalizante. Se sabe que las altas concentraciones de sales causan que tanto las protemas como los acidos nucleicos se precipitan de una solucion acuosa. En algunas realizaciones, una alta concentracion de sal puede estar entre 1M y 10M, inclusive. En algunas realizaciones, una alta concentracion de sal puede estar entre 2M y 9M, inclusive. En algunas realizaciones, una alta concentracion de sal puede estar entre 2M y 8M, inclusive. En algunas realizaciones, una alta concentracion de sal puede estar entre 2M y 5M, inclusive. En algunas realizaciones, una alta concentracion de sal puede ser mayor que la concentracion 1M. En algunas realizaciones, una alta concentracion de sal puede ser mayor que la concentracion 2M. En algunas realizaciones, una alta concentracion de sal puede ser mayor que la concentracion 3M. En algunas realizaciones, una alta concentracion de sal puede ser mayor que la concentracion 4M. En algunas realizaciones, una alta concentracion de sal puede ser mayor que la concentracion 5M. En algunas realizaciones, una alta concentracion de sal puede ser mayor que la concentracion 6M. En algunas realizaciones, una alta concentracion de sal puede ser mayor que la concentracion 7M. En algunas realizaciones, una alta concentracion de sal puede ser mayor que la concentracion 8M. En algunas realizaciones, se usa una sola sal como agente desnaturalizante. En algunas realizaciones, se usa mas de una sal como agente desnaturalizante.

[0066] En algunas realizaciones de la invencion, una sal que se usa como un agente desnaturalizante puede ser una sal de calcio, una sal de hierro, una sal de magnesio, una sal de potasio, una sal de sodio, o una combinacion de los mismos. Las sales espedficas ejemplares adecuadas para uso como agentes desnaturalizantes en algunas realizaciones incluyen, pero no se limitan a, cloruro de potasio (KCl), cloruro de sodio (NaCl), cloruro de litio (LiCl), cloruro de calcio (CaCh), bromuro de potasio (KBr), bromuro de sodio (NaBr), bromuro de litio (LiBr). En algunas realizaciones, el agente desnaturalizante al que se somete la preparacion impura es cloruro de potasio (KCl). En algunas realizaciones, se agrega KCl de tal manera que la concentracion de KCl resultante es aproximadamente 1M o mas. En algunas realizaciones, se agrega KCl de tal manera que la concentracion de KCl resultante es de aproximadamente 2 M o mas, 3 M o mas, 4 M o mas, o 5 M o mas.

[0067] En algunas realizaciones de la invencion, puede ser deseable incubar la preparacion impura con uno o mas agentes desnaturalizantes para un penodo de tiempo. En algunas realizaciones, la preparacion impura se incuba con un agente desnaturalizante durante menos de un minuto. En algunas realizaciones, la preparacion impura se incuba con un agente desnaturalizante durante un minuto. En algunas realizaciones, la preparacion impura se incuba con un agente desnaturalizante durante dos minutos. En algunas realizaciones, la preparacion impura se incuba con un agente desnaturalizante durante tres minutos. En algunas realizaciones, la preparacion impura se incuba con un agente desnaturalizante durante cuatro minutos. En algunas realizaciones, la preparacion impura se incuba con un agente desnaturalizante durante cinco minutos. En algunas realizaciones, la preparacion impura se incuba con un agente desnaturalizante durante diez minutos. En algunas realizaciones, la preparacion impura se incuba con un agente desnaturalizante durante una hora. En algunas realizaciones, la preparacion impura se incuba con un agente desnaturalizante durante dos horas.

[0068] En algunas realizaciones de la invencion, se incuba la preparacion impura con uno o mas agentes desnaturalizantes a temperatura ambiente (por ejemplo, aproximadamente 20-25°C). En algunas realizaciones, la preparacion impura se incuba con uno o mas agentes desnaturalizantes a una temperatura por debajo de la temperatura ambiente. En algunas realizaciones, la preparacion impura se incuba con uno o mas agentes desnaturalizantes a una temperatura superior a la temperatura ambiente.

Purificacion

[0069] En varias realizaciones, antes y/o despues de la exposicion a una condicion de desnaturalizacion, filtracion de flujo tangencial se utiliza para purificar el ARNm a partir de una preparacion impura. En algunas realizaciones, la filtracion de flujo tangencial se realiza antes de agregar una tapa y una cola de poli-A al ARNm sintetizado In Vitro. En algunas realizaciones, la filtracion de flujo tangencial se realiza despues de agregar una tapa y una cola de poli-A al ARNm sintetizado In Vitro. En algunas realizaciones, la filtracion de flujo tangencial se realiza antes y despues de que se agreguen una tapa y una cola de poli-A al ARNm sintetizado In Vitro.

Filtracion de membrana tradicional

[0070] En general, filtracion de membrana implica separar solidos de lfquidos utilizando una o mas interpuestas membranas permeables. La filtracion por membrana tambien se puede usar para filtrar partfculas de una muestra gaseosa. Hay dos formas principales de filtracion por membrana: la filtracion pasiva que se produce unicamente debido a la difusion de la solucion y la filtracion activa que utiliza presion positiva o presion negativa (es decir, vado) para forzar el Ifquido o gas a traves de la membrana.

[0071] La filtracion de membrana tradicional es tambien conocida como filtracion "punto muerto". En este formato, la alimentacion se carga en una membrana y se fuerza mediante presion positiva o negativa. La filtracion sin salida tiende a ser barata y simple, y los principales inconvenientes son el ensuciamiento o la obstruccion de la membrana con soluto que no penetra lentamente o que se permea lentamente (tambien denominado retenido), y la polarizacion de la concentracion. En general, las membranas tienden a obstruirse o ensuciarse mas rapidamente a medida que aumentan las fuerzas motrices. Cuando una membrana se atasca, la velocidad de filtracion se reduce y, finalmente, ningun permeado puede pasar hasta que el filtro se cambie o se limpie. La polarizacion de la concentracion es un fenomeno en el que el soluto no permeable se acumula en la superficie de un filtro y eventualmente forma un tipo de membrana secundaria, que impide el desplazamiento del soluto permeable a traves de la membrana. Como resultado, la filtracion sin salida se utiliza normalmente en procesos de tipo de lote.

Filtracion de flujo tangencial

[0072] Filtracion de flujo tangencial (TFF), tambien conocida como filtracion de flujo cruzado, es un tipo de filtracion en la que el material a filtrar se pasa tangencialmente a traves de un filtro en lugar de a traves del mismo. En TFF, el permeado no deseado pasa a traves del filtro, mientras que el retenido deseado pasa a lo largo del filtro y se recoge aguas abajo. Es importante tener en cuenta que el material deseado suele estar contenido en el retenido en TFF, que es lo opuesto a lo que normalmente se encuentra en la filtracion tradicional sin salida.

[0073] Dependiendo del material a filtrar, TFF se utiliza generalmente, ya sea para microfiltracion o ultrafiltracion. La microfiltracion se define rtpicamente como casos en los que el filtro tiene un tamano de poro de entre 0,05 pm y 1,0 pm, inclusive, mientras que la ultrafiltracion rtpicamente involucra filtros con un tamano de poro de menos de 0,05 pm. El tamano del poro tambien determina los lfmites de peso molecular nominal (NMWL), tambien conocido como corte de peso molecular (MWCO) para un filtro particular, con membranas de microfiltracion que tienen NMWL de mas de 1.000 kilodaltons (kDa) y filtros de ultrafiltracion que tienen NMWL de entre 1 kDa y 1.000 kDa.

[0074] Una ventaja principal de filtracion de flujo tangencial es que las partfculas no permeables que pueden agregarse en y bloquear el filtro (a veces denominadas "torta de filtro") durante la filtracion de "punto muerto" tradicional, se desplazan a lo largo de la superficie del filtro. Esta ventaja permite que la filtracion de flujo tangencial se use ampliamente en procesos industriales que requieren un funcionamiento continuo, ya que el tiempo de inactividad se reduce significativamente porque, por lo general, no es necesario retirar y limpiar los filtros.

[0075] La filtracion de flujo tangencial se puede utilizar para varios propositos, incluyendo la concentracion y la diafiltracion, entre otros. La concentracion es un proceso mediante el cual se elimina el solvente de una solucion mientras que se retienen las moleculas de soluto. Para concentrar efectivamente una muestra, se usa una membrana que tiene un NMWL o MWCO que es sustancialmente mas bajo que el peso molecular de las moleculas de soluto a retener. En general, un experto puede seleccionar un filtro que tenga un NMWL o MWCO de tres a seis veces por debajo del peso molecular de la(s) molecula(s) diana.

[0076] La diafiltracion es un proceso de fraccionamiento mediante el cual se pasan pequenas partfculas no deseadas a traves de un filtro, mientras que las moleculas mas grandes deseadas se mantienen en el retenido sin cambiar la concentracion de esas moleculas en solucion. La diafiltracion se usa a menudo para eliminar sales o tampones de reaccion de una solucion. La diafiltracion puede ser continua o discontinua. En la diafiltracion continua, se agrega una solucion de diafiltracion a la alimentacion de la muestra a la misma velocidad que se genera el filtrado. En la diafiltracion discontinua, la solucion se diluye primero y luego se concentra de nuevo a la concentracion de partida. La diafiltracion discontinua se puede repetir hasta alcanzar la concentracion deseada de las moleculas de soluto.

[0077] Por lo menos tres variables de proceso que son importantes en un proceso de TFF tfpica: la presion transmembrana, la velocidad de alimentacion y la velocidad del permeado de flujo. La presion transmembrana es la fuerza que impulsa el fluido a traves del filtro, llevando consigo moleculas permeables. En algunas realizaciones, la presion transmembrana esta entre 1 y 30 libras por pulgada cuadrada (psi), inclusive.

[0078] La velocidad de alimentacion (tambien denominada la velocidad de flujo transversal) es la tasa del flujo de solucion a traves del canal de alimentacion y a traves del filtro. La velocidad de alimentacion determina la fuerza que arrastra las moleculas que, de otro modo, pueden obstruir o ensuciar el filtro y, por lo tanto, restringir el flujo de filtrado. En algunas realizaciones, la velocidad de alimentacion esta entre 50 y 500 mL/minuto. En algunas realizaciones, la velocidad de alimentacion esta entre 50 y 400 mL/minuto. En algunas realizaciones, la velocidad de alimentacion esta entre 50 y 300 mL/minuto. En algunas realizaciones, la velocidad de alimentacion esta entre 50 y 200 mL/minuto. En algunas realizaciones, la velocidad de alimentacion esta entre 75 y 200 mL/minuto. En algunas realizaciones, la velocidad de alimentacion esta entre 100 y 200 mL/minuto. En algunas realizaciones, la velocidad de alimentacion esta entre 125 y 175 mL/minuto. En algunas realizaciones, la velocidad de alimentacion es de 130 mL/minuto. En algunas realizaciones, la velocidad de alimentacion esta entre 60 mL/min y 220 mL/min. En algunas realizaciones, la velocidad de alimentacion es de 60 mL/min o mas. En algunas realizaciones, la velocidad de alimentacion es de 100 mL/min o mas. En algunas realizaciones, la velocidad de alimentacion es de 150 mL/min o mas. En algunas realizaciones, la velocidad de alimentacion es de 200 mL/min o mas. En algunas realizaciones, la velocidad de alimentacion es de 220 mL/min o mas.

[0079] La velocidad de flujo del permeado es la velocidad a la que se retira el permeado del sistema. Para una velocidad de alimentacion constante, el aumento de las tasas de flujo de permeado puede aumentar la presion a traves del filtro, lo que lleva a tasas de filtracion mejoradas, mientras que tambien aumenta potencialmente el riesgo de obstruccion o ensuciamiento del filtro. Los principios, la teona y los dispositivos utilizados para TFF se describen en Michaels et al., "Tangential Flow Filtration" in Separations Technology, Pharmaceutical and Biotech- nology Applications (WP Olson, editor, Interpharm Press, Inc., Buffalo Grove, Illinois). 1995). Vease tambien la patente de EE.UU. Nos 5.256.294 y 5.490.937 para una descripcion de la filtracion de flujo tangencial de alto rendimiento (HP-TFF), que representa una mejora de TFF. En algunas realizaciones, el caudal esta entre 10 y 100 mL/minuto. En algunas realizaciones, el caudal esta entre 10 y 90 mL/minuto. En algunas realizaciones, el caudal esta entre 10 y 80 mL/minuto. En algunas realizaciones, el caudal esta entre 10 y 70 mL/minuto. En algunas realizaciones, el caudal esta entre 10 y 60 mL/minuto. En algunas realizaciones, el caudal esta entre 10 y 50 mL/minuto. En algunas realizaciones, el caudal esta entre 10 y 40 mL/minuto. En algunas realizaciones, el caudal esta entre 20 y 40 mL/minuto. En algunas realizaciones, el caudal es de 30 mL/minuto.

[0080] Puede ser utilizada cualquier combinacion de diferentes variables de proceso descritas en este documento. En algunas realizaciones, la filtracion de flujo tangencial se realiza a una velocidad de alimentacion de aproximadamente 100-200 mL/minuto (por ejemplo, aproximadamente 100-180 mL/minuto, 100-160 mL/minuto, 100­ 140 mL/minuto, 110-190 mL/minuto, 110-170 mL/minuto, o 110-150 mL/minuto) y/o un caudal de aproximadamente 10-50 mL/minuto (por ejemplo, aproximadamente 10-40 mL/minuto, 10-30 mL/minuto, 20-50 mL/minuto, o 20-40 mL/minuto). En algunas realizaciones, la filtracion de flujo tangencial se realiza a una velocidad de alimentacion de aproximadamente 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o 200 mL/minuto y/o una velocidad de flujo de aproximadamente 10, 20, 30, 40 o 50 mL/minuto.

[0081] Otras tasas de flujo para acomodar gran escala de purificacion (comercial) implicanan la filtracion de flujo tangencial que se llevan a cabo a una velocidad de alimentacion de aproximadamente 10 L-200 L/minuto (por ejemplo, aproximadamente 10-180 L/minuto, 100-160 L/minuto, 100-140 L/minuto, 110-190 L/minuto, 110-170 L/minuto, o 110-150 L/minuto) y/o un caudal de aproximadamente 10-50 L/minuto (por ejemplo, aproximadamente 10-40 L/minuto, 10-30 L/minuto, 20-50 L/minuto o 20-40 L/minuto). En algunas realizaciones, la filtracion de flujo tangencial se realiza a una velocidad de alimentacion de aproximadamente 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o 200 L/minuto y/o una velocidad de flujo de aproximadamente 10, 20, 30, 40 o 50 L/minuto.

[0082] Como se describio anteriormente, los filtros utilizados en TFF pueden tener cualquiera de una variedad de tamanos de poros, y por lo tanto NMWL. El filtro tiene un NMWL de entre 200 kDa y 700 kDa. En algunas realizaciones, un filtro tendra un NMWL entre 200 kDa y 500kDa. En algunas realizaciones, un filtro tiene un NMWL de 300 kDa. En algunas realizaciones, un filtro tiene un NMWL de 500 kDa.

[0083] En algunas realizaciones, una filtracion de flujo tangencial de acuerdo con la invencion se lleva a cabo utilizando disolventes solamente acuosos. En algunas realizaciones, una filtracion de flujo tangencial de acuerdo con la invencion se realiza usando agua como disolvente.

Caracterizacion del ARNm purificado.

[0084] En diversas realizaciones, el ARNm purificado de acuerdo con la presente invencion esta sustancialmente libre de impurezas de proceso de la smtesis de ARNm, incluyendo, pero no limitado a, las secuencias prematuramente abortadas de ARN, las plantillas de ADN, y/o reactivos enzimaticos utilizados en smtesis In Vitro.

[0085] Una ventaja particular proporcionada por la presente invencion es la capacidad para retirar o eliminar un alto grado de secuencias de a Rn prematuramente abortadas (tambien conocidos como "shortmers"). El ARNm purificado de acuerdo con la presente invencion contiene secuencias de ARN abortadas prematuramente no detectables como se determina, por ejemplo, mediante tincion con bromuro de eitidio y/o Coomassie. En algunas realizaciones, las secuencias de ARN abortadas prematuramente comprenden menos de 15 bases (por ejemplo, menos de 14, 13, 12, 11, 10, 9 u 8 bases). En algunas realizaciones, las secuencias de ARN abortadas prematuramente comprenden aproximadamente 8-12 bases.

[0086] Un metodo de acuerdo con la presente invencion elimina un alto grado de reactivos de enzima usados en smtesis In Vitro incluyendo, pero no limitado a polimerasa de ARN de T7, ADNasa I, pirofosfatasa, y/o el inhibidor de ARNasa. En algunas realizaciones, la presente invencion es particularmente eficaz para eliminar la polimerasa de ARN de T7. El ARNm purificado de acuerdo con la presente invencion contiene reactivos enzimaticos indetectables utilizados en la smtesis In Vitro, incluidos los determinados, por ejemplo, mediante tincion con bromuro de etidio y/o Coomassie.

[0087] En diversas realizaciones, el ARNm purificado utilizando un metodo descrito en el presente documento mantiene un alto grado de integridad. Como se usa en el presente documento, el termino "integridad del ARNm" generalmente se refiere a la calidad del ARNm despues de la purificacion. En algunas realizaciones, la integridad del ARNm se refiere al porcentaje de ARNm que no se degrada despues de la filtracion de flujo tangencial. La integridad del ARNm se puede determinar utilizando metodos bien conocidos en la tecnica, por ejemplo, mediante electroforesis en gel de agarosa de ARN (por ejemplo, Ausubel y otros, John Weley & Sons, Inc., 1997. Current Protocols in Molecular Biology). En algunas realizaciones, el ARNm purificado segun la presente invencion tiene una integridad mayor que aproximadamente el 95% (por ejemplo, mayor que aproximadamente el 96%, 97%, 98%, 99% o mas). En algunas realizaciones, el ARNm purificado de acuerdo con la presente invencion tiene una integridad superior al 98%. En algunas realizaciones, el ARNm purificado de acuerdo con la presente invencion tiene una integridad superior al 99%. En algunas realizaciones, el ARNm purificado de acuerdo con la presente invencion tiene una integridad de aproximadamente el 100%.

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Generacion y purificacion de ARN mensajero (ARNm)

Smtesis de ARNm

[0088] En cada uno de los ejemplos siguientes, la smtesis de ARNm se llevo a cabo bajo condiciones completas RNasa libre. Todos los tubos, viales, puntas de pipeta, pipetas, tampones, etc. debfan estar libres de nucleasas, a menos que se indique explfcitamente lo contrario.

[0089] En los siguientes ejemplos, a menos que se describa lo contrario, el ARNm se sintetizo mediante transcripcion in vitro de una plantilla de ADN linealizado. Para producir el constructo de precursor de ARNm (TIV) deseado, una mezcla de ~ 100 ug de ADN linealizado, rNTP (3,33 mM), DTT (1 0 mM), polimerasa de ARN T7. inhibidor de la ARNasa, pirofosfatasa y tampon de reaccion (10x, 800 mM Hepes. (pH 8,0), 20 mM espermidina, 250 mM de MgCh, pH 7,7) se preparo con agua libre de ARNasa hasta un volumen final de 2,24 ml. La mezcla de reaccion se incuba a 37°C durante un intervalo de tiempo entre 20 minutos y 120 minutos. Una vez completado, la mezcla se trata con DNasa I durante 15 minutos adicionales y se apaga en consecuencia.

Adicion de tapa 5’ y cola 3'

[0090] El producto de ARNm purificado de la etapa de TIV mencionada (y posiblemente filtracion TFF inicial tambien) se desnaturalizo a 65°C durante 10 minutos. Por separado, porciones de GTP (20 mM), S-adenosilo metionina, inhibidor de la ARNsa, 2'-O-metiltransferasa y transferasa de guanililo se mezclan con tampon de reaccion (10x, Tris-HCl 500 mM (pH 8,0), KCl 60 mM, MgCh 12,5 mM) a una concentracion final de 8,3 mL. Tras la desnaturalizacion, el ARNm se enfna en hielo y luego se agrega a la mezcla de reaccion. La solucion combinada se incuba durante un intervalo de tiempo a 37°C durante 20-90 minutos. Al finalizar, se agregan partes almuotas de ATP (20 mM), polimerasa poliA y tampon de reaccion de colas (10x, Tris-HCl 500 mM (pH 8,0), NaCl 2,5 M, MgCh 100 mM) y la mezcla de reaccion total se incuba adicionalmente a 37°C°C por un intervalo de tiempo de 20-45 minutos. Una vez completada, la mezcla de reaccion final se apaga y se purifica en consecuencia.

Purificacion a traves de filtracion de flujo tangencial

[0091] En los siguientes ejemplos, a menos que se describa lo contrario, el sistema de filtracion de flujo tangencial (TFF) consistfa en una membrana de filtracion y una bomba peristaltica (sistema Millipore Labscale TFF) con la circulacion tangencial del fluido a traves de la membrana a una velocidad de alimentacion de ~ 130 mL/min con un caudal de 30 mL/min para el permeado. La membrana TFF empleada fue una MidiKros 500kDa mPES 115cm2 (Spectrum Labs). Antes del uso, el cartucho de filtro se lavo con agua libre de nucleasas y se limpio adicionalmente con NaOH 0,2N. Finalmente, el sistema se limpio con agua libre de nucleasas hasta que el pH del permeado y el retenido alcanzo un pH ~6.

Eiemplo 2. Analisis de ARNm purificado.

Pruebas de presencia de enzimas en ARNm purificado

[0092] A menos que se describa lo contrario, se realizaron geles de protemas tenidas con Coomassie estandar para determinar la presencia de cualquier enzima de reactivos residuales presentes antes y despues de purificaciones. En algunos casos, tambien se realizaron los ensayos de BCA.

Evaluacion de la integridad del ARNm mediante ensayos de electroforesis en gel de agarosa

[0093] A menos que se describa lo contrario, el tamano y la integridad del ARN mensajero se evaluaron mediante electroforesis en gel. Se emplearon geles de agarosa al 1,0% autovertidos o geles de agarosa de 1,2% prefabricados de Invitrogen E-Gel. El ARN mensajero se cargo a 1,0-1,5 |jg de cantidades por pocillo. Una vez completadas, las bandas de ARN mensajero se visualizaron utilizando bromuro de etidio.

Ensayos de integridad de ARNm In Vitro

[0094] A menos que se describa lo contrario, transfecciones In Vitro de ARNm de luciferasa de luciernaga se realizaron utilizando celulas HEK293T. Las transfecciones de un microgramo de cada construccion de ARNm se realizaron en pocillos separados utilizando lipofectamina. Las celulas se recolectaron en puntos de tiempo seleccionados (por ejemplo, 4 horas, 8 horas, etc.) y se analizo la produccion de protema respectiva. Para el ARNm de FFL, los lisados celulares se analizaron para determinar la produccion de luciferasa mediante ensayos de bioluminiscencia.

Analisis de bioluminiscencia

[0095] En los ejemplos que incluyen una evaluacion fluorescente de ARN proporcionada, el ensayo de bioluminiscencia se llevo a cabo utilizando un Sistema de Ensayo de Luciferasa Promega (Item # E1500), a menos que se especifique lo contrario. El reactivo de ensayo de luciferasa se preparo anadiendo 10 ml de tampon de ensayo de luciferasa a sustrato de ensayo de luciferasa y se mezclo mediante vortice. Aproximadamente 20 uL de muestras de homogeneizado se cargaron en una placa de 96 pocillos, seguido de 20 uL de control de placa en cada muestra. Por separado, se agregaron 120 uL de reactivo de ensayo de luciferasa (preparado como se describe anteriormente) a cada pocillo de una placa de fondo plano de 96 pocillos. A continuacion, cada placa se inserto en las camaras apropiadas con un instrumento Molecular Device Flex Station y se midio la luminiscencia (medida en unidades de luz relativa (RLU)).

Ejemplo 3. Generacion y purificacion del ARN mensajero (ARNm) de luciferasa de luciernaga (FFL)

[0096] Este ejemplo ilustra que, de acuerdo con diversas realizaciones, una combinacion de filtracion de flujo tangencial (TFF) y un agente desnaturalizante puede ser utilizado de acuerdo con metodos proporcionados para producir un producto de ARNm altamente purificado. En este ejemplo, la urea se utiliza como agente desnaturalizante de protemas.

[0097] En este ejemplo, un lote de cinco miligramo de ARN de luciferasa de luciernaga (FFL) (SEQ ID NO: 1, a continuacion) fue transcrita a traves de los metodos In Vitro descritos anteriormente para producir el constructo intermedio antes mencionado sin tapa y sin cola poliA. Esta reaccion mantuvo un volumen total de 2,24 ml y se detuvo al finalizar con un volumen equivalente de urea 10M, llevando la concentracion final de urea 5M. La solucion resultante se incubo durante cinco minutos a temperatura ambiente y se transfirio al deposito del sistema de filtracion de flujo tangencial (TFF). La muestra se diluyo a 200 ml con agua libre de nucleasas y se lavo con 1200 ml de agua libre de nucleasas mediante ultrafiltracion de 200 ml cada vez. Despues de esto, la muestra se trato con 200 ml de citrato de sodio 10 mM (pH 6,4) seguido de 600 ml de lavado con agua libre de nucleasa. Finalmente la muestra se concentro hasta ~ 2 ml y se determino la concentracion final a traves de la absorcion a 260 nm (Amax). ARNm de luciferasa de luciernaga optimizado por codon (FFL) (SEQ ID NO: 1)

[0098]

XjAUGGAAGAUGCCAAAAACAUUAAGAAGGGCCCAGCGCCAUUCUACCCACUCGA

AGACGGGACCGCCGGCGAGCAGCUGCACAAAGCCAUGAAGCGCUACGCCCUGGUG

CCCGGCACCAUCGCCUUUACCGACGCACAUAUCGAGGUGGACAUUACCUACGCCG

AGUACUUCGAGAUGAGCGUUCGGCUGGCAGAAGCUAUGAAGCGCUAUGGGCUGA

AUACAAACCAUCGGAUCGUGGUGUGCAGCGAGAAUAGCUUGCAGirUCUUCAUGC

CCGUGUUGGGUGCCCUGUUCAUCGGUGUGGCUGUGGCCCCAGCUAACGACAUCUA

CAACGAGCGCGAGCUGCUGAACAGCAUGGGCAUCAGCCAGCCCACCGUCGUAUUC

GUGAGCAAGAAAGGGCUGCAAAAGAUCCUCAACGUGCAAAAGAAGCUACCGAUC

AUACAAAAGAUCAUCAUCAUGGAUAGCAAGACCGACUACCAGGGCUUCCAAAGCA

UGUACACCUUCGUGACUUCCCAUUUGCCACCCGGCUUCAACGAGUACGACUUCGU

GCCCGAGAGCUUCGACCGGGACAAAACCAUCGCCCUGAUCAUGAACAGUAGUGGC

AGUACCGGAUUGCCCAAGGGCGUAGCCCUACCGCACCGCACCGCUUGUGUCCGAU

UCAGUCAUGCCCGCGACCCCAUCUUCGGCAACCAGAUCAUCCCCGACACCGCUAU

CCUCAGCGUGGUGCCAUUUCACCACGGCUUCGGCAUGUUCACCACGCUGGGCUAC

UUGAUCUGCGGCUUUCGGGUCGUGCUCAUGUACCGCUUCGAGGAGGAGCUAUUC

UUGCGCAGCUUGCAAGACUAUAAGAUUCAAUCUGCCCUGCUGGUGCCCACACUAU

UUAGCUUCUUCGCUAAGAGCACUCUCAUCGACAAGUACGACCUAAGCAACUUGCA

CGAGAUCGCCAGCGGCGGGGCGCCGCUCAGCAAGGAGGUAGGUGAGGCCGUGGCC

AAACGCUUCCACCUACCAGGCAUCCGCCAGGGCUACGGCCUGACAGAAACAACCA

GCGCCAUUCUGAUCACCCCCGAAGGGGACGACAAGCCUGGCGCAGUAGGCAAGGU

GGUGCCCUUCUUCGAGGCUAAGGUGGUGGACUUGGACACCGGUAAGACACUGGG

UGUGAACCAGCGCGGCGAGCUGUGCGUCCGUGGCCCCAUGAUCAUGAGCGGCUAC

GUUAACAACCCCGAGGCUACAAACGCUCUCAUCGACAAGGACGGCUGGCUGCACA

GCGGCGACAUCGCCUACUGGGACGAGGACGAGCACUUCUUCAUCGUGGACCGGCU

GAAGAGCCUGAUCAAAUACAAGGGCUACCAGGUAGCCCCAGCCGAACUGGAGAGC

AUCCUGCUGCAACACCCCAACAUCUUCGACGCCGGGGUCGCCGGCCUGCCCGACG

ACGAUGCCGGCGAGCUGCCCGCCGCAGUCGUCGUGCUGGAACACGGUAAAACCAU

GACCGAGAAGGAGAUCGUGGACUAUGUGGCCAGCCAGGUUACAACCGCCAAGAA

GCUGCGCGGUGGUGUUGUGUUCGUGGACGAGGUGCCUAAAGGACUGACCGGCAA

GUUGGACGCCCGCAAGAUCCGCGAGAUUCUCAUUAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAG

AUCGCCGUGUAY2

Secuencias UTR 5' y 3':

[0099]

X2 =

GGGAUCCUACC (SEQ ID NO: 2)

Y2 =

UUUGAAUU (SEQ ID NO: 3)

[0100] Aproximadamente 5 mg de ARN de luciferasa de luciernaga purificado con TFF se tapo y se colo en un volumen final de reaccion de 9 ml, como se describio anteriormente. Una porcion de esta mezcla de reaccion (6,7 ml) se trato con urea 5 M durante 5 minutos a temperatura ambiente (RT) y se purifico utilizando TFF. Aproximadamente 1,5 mg de la mezcla de reaccion tapa/cola se purifico mediante TFF utilizando unicamente agua y se aislo. Por separado, otra pequena porcion de la mezcla de reaccion tapa/cola se purifico utilizando un kit de purificacion Qiagen RNeasy de acuerdo con el protocolo publicado. Los tres lotes de ARNm de FFL finales aislados se separaron y transfectaron en celulas HEK293T como se describe a continuacion. Los lisados celulares se analizaron para determinar la presencia de protema FFL a traves de la deteccion de fluorescencia (actividad FFL).

[0101] En este ejemplo, a fin de eliminar las enzimas de reaccion en este ejemplo, una porcion de la mezcla de reaccion FFL ARNm TIV se sometio a urea 10M que resulta en una concentracion final de urea 5M. Esta solucion se incubo durante cinco minutos a temperatura ambiente y luego se purifico mediante TFF como se describe anteriormente. La Figura 1 muestra un gel de protema tenido con Coomassie que muestra el ARNm resultante aislado despues de TFF empleando las condiciones de urea mencionadas anteriormente. No hay una enzima detectable presente al finalizar.

[0102] Despues de producir el producto de ARNm de FFL tapado y colado, se emplearon metodos de TFF para purificar el ARNm diana final. Partes de la misma mezcla de reaccion tapa/cola se dividieron en partes almuotas por separado y se purificaron mediante TFF sin urea o mediante metodos de columna de hilatura (Qiagen RNeasy Kit) para comparacion. Se realizo una comparacion del ARNm final aislado mediante TFF o columna de hilatura usando electroforesis en gel y se muestra en la Figura 2. Ademas, los niveles de enzimas residuales se monitorizaron a traves del gel de protemas (Figura 3). En la Figura 2, se pueden ver claramente las respectivas bandas de ARNm del FFL "TIV" que migran a ~1900 nt con el ARNm final cubierto y atado (C/T) de aproximadamente 2100 nt de largo. La banda "mas corta" tipicamente observada usando aislamiento de columna de giro despues de la etapa de tapa/cola se observa de hecho en el carril 4.

[0103] Es evidente que la banda mas corta no se presenta despues de la etapa tapa/cola cuando se emplea ARNm purificado por TFF. Si bien pueden eliminarse cantidades sustanciales de reactivos enzimaticos utilizando cualquiera de los dos metodos de purificacion, las impurezas mas cortas no pueden eliminarse. Esto demostro que los metodos de filtracion de flujo tangencial descritos aqrn son un metodo exitoso y eficiente para la purificacion de secuencias abortadas prematuramente durante la transcripcion del ARNm.

[0104] Con el fin de determinar si ARNm proporcionado se puede traducir en la protema deseada, se hizo una comparacion de cada uno de los constructos ARNm FFL aislados (TFF vs columna de giro). Cada una de los tres constructos enumerados a continuacion se transfectaron en celulas HEK293T y la produccion de protema FFL correspondiente se evaluo mediante la actividad de la protema FFL en forma de luminiscencia de FFL tras la exposicion a luciferina (vida supra).

Constructos FFL:

[0105]

1. FFL TIV purificada a traves de TFF (urea) y paso C/T a traves de TFF (sin urea)

2. FFL TIV purificada a traves de TFF (urea) y paso C/T a traves de TFF (urea)

3. FFL TIV purificada a traves de columna de centrifugacion y paso C/T a traves de la columna de giro

[0106] Una comparacion de la produccion de luminiscencia de la protema FFL producida a partir se representa en la Figura 4. La integridad del ARNm FFL purificado por TFF se mantiene durante todo el proceso de filtracion de flujo tangencial en las condiciones descritas (exposicion a urea 5M).

Ejemplo 4. Generacion y purificacion del ARNm del factor IX (FIX)

[0107] Este ejemplo ilustra ademas que, de acuerdo con diversas realizaciones, una combinacion de filtracion de flujo tangencial (TFF) y un agente desnaturalizante puede ser utilizado de acuerdo con metodos proporcionados para producir un producto de ARNm altamente purificado. En este ejemplo, se usa tiocianato de guanidinio como agente desnaturalizante de protemas.

[0108] En este ejemplo, una segunda especie de ARNm fue producida y purificada, este tiempo de codificacion para el Factor IX (SEQ ID NO: 4, a continuacion). Inicialmente, se transcribio un lote de cinco miligramos de ARN del Factor IX (FIX) a traves de metodos In Vitro como se describio anteriormente para producir el ARN mencionado anteriormente sin tapa y sin cola poliA. Esta reaccion mantuvo un volumen total de 2,24 ml y se detuvo al completarse mediante la adicion de proteinasa K (4mg/ml reaccion de TIV) que se incubo en la mezcla de reaccion a 37°C durante 5 minutos. Una vez completado, se anadio tiocianato de guanidinio 6M (4,3 ml, final ~ 4M) y la solucion resultante se incubo durante cinco minutos a temperatura ambiente y se transfirio al deposito del sistema TFF. La muestra se diluyo a 200 ml con agua libre de nucleasas y se lavo con 1600 ml de agua libre de nucleasas mediante ultrafiltracion de 200 ml a la vez. Tras la finalizacion, la muestra se concentro hasta ~ 2 ml y se determino la concentracion final a traves de la absorcion a 260 nm (Amax).

ARNm del factor humano IX (FIX) (SEQ ID NO: 4)

XiAUGCAGCGCGUGAACAUGAUCAUGGCAGAAUCACCAGGCCUCAUCACCAUCUG

CCUUUUAGGAUAUCUACUCAGUGCUGAAUGUACAGUUUUUCUUGAUCAUGAAAA

CGCCAACAAAAU UC UGAGGCGGAGAAGGAGG UAUAAUUCAGGUAAAUUGGAAGA

GUUUGUUCAAGGGAACCUUGAGAGAGAAUGUAUGGAAGAAAAGUGUAGUUUUGA

AGAAGCAC GAGAAG U UUU UGAAAACACUGAAAGAACAACUG AAUUUUGGAAGCA

GUAUGUUGAUGGAGAUCAGUGUGAGUCCAAUCCAUGUUUAAAUGGCGGCAGUUG

CAAGGAUGACAUUAAUUCCUAUGAAUGUUGGUGUCCCUUUGGAUUUGAAGGAAA

GAACUGUGAAUUAGAUGUAACAUGUAACAUUAAGAAUGGCAGAUGCGAGCAGUU

UUGUAAAAAUAGUGCUGAUAACAAGGUGGUUUGCUCCUGUACUGAGGGAUAUCG

ACUUGCAGAAAACCAGAAGUCCUGUGAACCAGCAGUGCCAUUUCCAUGUGGAAG

AGUUUCUGUUUCACAAACUUCUAAGCUCACCCGUGCUGAGGCUGUUUUUCCUGAU

GUGGACUAUGUAAAUUCUACUGAAGCUGAAACCAUUUUGGAUAACAUCACUCAA

AGCACCCAAUCAUUUAAUGACUUCACUCGGGUUGUUGGUGGAGAAGAUGCCAAA

CCAGGUCAAUUCCCUUGGCAGGUUGUUUUGAAUGGUAAAGUUGAUGCAUUCUGU

GGAGGCUCUAUCGUUAAUGAAAAAUGGAUUGUAACUGCUGCCCACUGUGUUGAA

ACUGGUGUUAAAAUUACAGUUGUCGCAGGUGAACAUAAUAUUGAGGAGACAGAA

CA UACAGAGCAAAAGCGAAAUGUGA U UCGAAUUAU UCCUCACCACAAC UACAA U

GCAGCUAUUAAUAAGUACAACCAUGACAUUGCCCUUCUGGAACUGGACGAACCCU

UAGUGCUAAACAGCUACGUUACACCUAUUUGCAUUGCUGACAAGGAAUACACGA

ACAUCUUCCUCAAAUUUGGAUCUGGCUAUGUAAGUGGCUGGGGAAGAGUCUUCC

ACAAAGGGAGAUCAGCUUUAGUUCUUCAGUACCUUAGAGUUCCACUUGUUGACC

GAGCCACAUGUCUUCGAUCLACAAAGUUCACCAUCUAUAACAACAUGUUCUGUGC

UGGCUUCCAUGAAGGAGGUAGAGAUUCAUGUCAAGGAGAUAGUGGGGGACCCCA

UGUUACUGAAGUGGAAGGGACCAGUUUCUUAACUGGAAUUAUUAGCUGGGGUGA

AGAGUGUGCAAUGAAAGGCAAAUAUGGAAUAUAUACCAAGGUAUCCCGGUAUGU

CA ACU GG A U U AAGGAAAAAACAAAGCU CAC U U AAY,

Secuencias UTR 5' y 3':

[0109]

X , = GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACC GGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCG UGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG (SEQ ID NO: 5)

Y i =

CGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCC ACUCC AGUGCCCACC AGCCUUGUCCU A AUA A A A UUAAGUUGC AUC (SEQ ID NO: 6)

[0110] Tambien se realizo el metodo anterior como se describe anteriormente, con la adicion de actinomicina D (10 |jg/ml de reaccion TIV) durante la etapa de proteinasa K. Al apagar la reaccion de la TIV con proteinasa K (con o sin actinomicina D), tambien se puede lograr la eliminacion exitosa de todas las enzimas (Figura 5). Mientras que la Proteinasa K puede facilitar la eliminacion, la fabricacion a gran escala de una sustancia farmacologica de ARNm requerina que esta enzima se produzca a gran escala incurriendo en costos adicionales innecesarios, y por lo tanto, puede que no sea un enfoque deseado en algunas realizaciones. Como se muestra en la Figura 6, el ARNm de FIX producido como se describio anteriormente (con y sin actinomicina D), asf como el ARNm de FIX purificado usando urea 5M, no contiene niveles detectables de shortmers, similares a los resultados para el ARNm de FFL como se describe en el Ejemplo 3.

Ejemplo 5. Generacion y purificacion del ARNm del regulador de conductancia transmembrana de la fibrosis quistica (CFTR)

[0111] Este ejemplo ilustra ademas que, de acuerdo con diversas realizaciones, una combinacion de filtracion de flujo tangencial (TFF) y un agente desnaturalizante puede ser utilizado de acuerdo con metodos proporcionados para producir un producto de ARNm altamente purificado. En este ejemplo, se usa cloruro de potasio como agente desnaturalizante de protemas.

[0112] En este ejemplo, una tercera especie de ARNm fue producida y purificada, esta vez codificando para el regulador de conductancia transmembrana de fibrosis qrnstica (CFTR, s Eq ID NO: 7, a continuacion). Inicialmente, se transcribio un lote de cinco miligramos de ARN de CFTR a traves de metodos In Vitro como se describe anteriormente para producir el ARN mencionado anteriormente sin tapa y sin cola de poliA. Esta reaccion mantiene un volumen total de 2,24 ml y se detuvo una vez completada mediante la adicion de KCl 2M (~ 200 ml). La solucion resultante se incubo durante cinco minutos a temperatura ambiente y se transfirio al deposito del sistema TFF. La muestra se diafiltro a un volumen constante de 200 ml con KCl 2M en agua libre de nucleasas durante tres a cuatro diavolumenes. Despues de este tiempo, la solucion resultante se lavo con 400 ml de agua libre de nucleasas mediante ultrafiltracion de 200 ml a la vez. Despues de esto, la muestra se trato con 200 ml de citrato de sodio 1 mM (pH 6,4) seguido de 600 ml de lavado con agua libre de nucleasa. Finalmente, la muestra se concentro hasta ~ 2 ml y se determino la concentracion final a traves de la absorcion a 260 nm (Amax).

ARNm del regulador de conductancia transmembrana de fibrosis qû stica optimizado por codon (CFTR) (SEQ ID NO: 7)

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Secuencias UTR 5' y 3':

[0113]

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[0114] En este ejemplo, con el fin de eliminar las enzimas de la reaccion, se utilizo diafiltracion de KCl 2M. La exposicion a grandes volumenes de KCl 2M dio como resultado la eliminacion exitosa de todas las enzimas presentes en la mezcla de reaccion (incluida la polimerasa T7) segun se determino mediante electroforesis de gel de proternas (Figura 7). Como se muestra a traves de la electroforesis en gel de agarosa, el ARN mensajero diana permanece intacto despues de la exposicion a tales condiciones (Figura 8).

[0115] Ademas, tras taponado y colado de la construccion CFTR TIV, se puede purificar con exito la transcripcion CFTR final (tapado y colado) a traves de TFF usando KCl 2M. Cuando se compara este producto aislado final con el mismo producto purificado mediante los metodos de columna giratoria, se observa una banda "mas corta" muy disminuida segun se determina mediante electroforesis en gel (Figura 9).

Claims (1)

1. Reivindicaciones

   1. Un metodo de purificacion de ARN mensajero (ARNm), que comprende

   (a) sintetizar ARNm mediante transcripcion In Vitro utilizando los siguientes reactivos:

   (i) una plantilla de ADN lineal o circular que contiene un promotor;

   (ii) un conjunto de trifosfatos de ribonucleosido;

   (iii) un sistema tampon que incluye opcionalmente DTT e iones de magnesio; y

   (iv) una polimerasa de ARN; y opcionalmente

   (v) una ADNasa I, una pirofosfatasa y/o un inhibidor de ARNasa;

   (b) anadir un agente desnaturalizante de protemas a la preparacion de la etapa (a), que comprende el ARNm sintetizado In Vitro, en el que el agente desnaturalizante de protemas es un agente caotropico o una alta concentracion de sal; y

   (c) purificar el ARNm de la preparacion de la etapa (b) mediante filtracion de flujo tangencial, en donde la filtracion de flujo tangencial comprende:

   (i) una presion transmembrana entre 1 y 30 libras por pulgada cuadrada;

   (ii) una velocidad de alimentacion entre 50 y 500 mL/minuto;

   (iii) un caudal entre 10 y 100 mL/minuto; y

   (iv) un filtro que tiene un lfmite de peso molecular nominal de entre 200 kDa y 700 kDa,

   en donde el ARNm purificado de la etapa (c) contiene niveles indetectables de secuencias de ARN abortadas prematuramente y reactivos enzimaticos usados en smtesis In Vitro segun lo determinado por electroforesis en gel de agarosa o metodos cromatograficos.

   2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la etapa (b) comprende

   (i) agregar un agente desnaturalizante de protemas a la preparacion impura, opcionalmente en donde la preparacion impura con el agente desnaturalizante de protemas agregado se incuba a temperatura ambiente durante aproximadamente 5 minutos, en donde opcionalmente el agente desnaturalizante de protemas se selecciona del grupo que consiste en urea, tiocianato de guanidinio, KCl, dodecilo sulfato de sodio y sus combinaciones; y/o

   (ii) agregar urea a la preparacion impura para lograr una concentracion de urea resultante de aproximadamente 1 M o mas, opcionalmente, en donde la concentracion de urea resultante es de aproximadamente 2 M o mas, 3 M o mas, 4 M o mas, 5 M o mas, 6 M o mas, 7 M o mas, 8 M o mas, 9 M o mas, o 10 M o mas; y/o

   (iii) agregar tiocianato de guanidinio a la preparacion impura para lograr una concentracion de tiocianato de guanidinio resultante de aproximadamente 4 M o mas, en donde opcionalmente la concentracion de tiocianato de guanidinio resultante es de aproximadamente 4 M o mas, 5 M o mas, 6 M o mas, 7 M o mas, 8 M o mas, 9 M o mas, o 10 M o mas; y/o

   (iv) agregar KCl a la preparacion impura para lograr una concentracion de KCl resultante de aproximadamente 1 M o mas, opcionalmente, en donde la concentracion de KCl resultante es de aproximadamente 2 M o mas, 3 M o mas, 4 M o mas, o 5 M o mas.

   3. El metodo de la reivindicacion 1 o 2, en el que la filtracion de flujo tangencial se realiza usando solo disolventes acuosos, opcionalmente en el que la filtracion de flujo tangencial se realiza usando agua como disolvente.

   4. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el ARNm se purifica a una escala de o mas de 0,1 gramos, 1 gramo, 10 gramos, 100 gramos o 1.000 gramos por lote.

   5. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las secuencias de ARN abortadas prematuramente comprenden menos de 15 bases o aproximadamente 8-12 bases.

   6. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que los reactivos enzimaticos usados en la smtesis In Vitro comprenden polimerasa de ARN T7. ADNasa I, pirofosfatasa e/o inhibidor de ARNasa.

   7. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la filtracion de flujo tangencial se realiza ademas despues de que se hayan agregado una tapa y una cola de poli-A al ARNm sintetizado In Vitro. 8. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el ARNm sintetizado In Vitro es mayor que aproximadamente 1 kb, 1,5 kb, 2 kb, 2,5 kb, 3 kb, 3,5 kb, 4 kb, 4,5 kb o 5 kb de longitud.

   9. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el ARNm sintetizado In Vitro comprende una o mas modificaciones para mejorar la estabilidad, opcionalmente en el que una o mas modificaciones se seleccionan de nucleotidos modificados, esqueletos de fosfato de azucar modificado, region 5' y/o 3' no traducida.

   10. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que el ARNm sintetizado In Vitro no esta modificado.

   11. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el ARNm purificado de la etapa (c) tiene una integridad mayor que el 95%, mayor que el 98% o mayor que el 99%.

   12. Un metodo para fabricar ARN mensajero (ARNm) que comprende:

   sintetizar ARNm In Vitro; y

   purificar el ARNm sintetizado In Vitro usando un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.