ES2540753T3 - Vectores de expresión que comprenden secuencias quiméricas de promotor y amplificador de citomegalovirus - Google Patents
Vectores de expresión que comprenden secuencias quiméricas de promotor y amplificador de citomegalovirus Download PDFInfo
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Abstract
Un vector de expresión para la expresión heteróloga de una secuencia de ácido nucleico de interés en células de mamífero, comprendiendo el vector una primera secuencia quimérica reguladora de promotor que está unida operativamente a una primera secuencia de ácido nucleico que se va a expresar, en donde la secuencia quimérica reguladora de promotor comprende: (i) una secuencia promotora del promotor IE1 de citomegalovirus murino y que está unida operativamente al sitio de inicio de la transcripción de la secuencia de ácido nucleico que se va a expresar; y (ii) una secuencia amplificadora de la región IE1 de citomegalovirus humano y/o de simio, estando localizada la secuencia amplificadora 5' y unida operativamente a la secuencia promotora IE1 de citomegalovirus murino; y en donde la secuencia quimérica reguladora de promotor comprende una secuencia de nucleótidos que se selecciona de entre el grupo que consiste en la SEC ID Nº 7, SEC ID Nº 9 y SEC ID Nº 10.
Description
E12185728
24-06-2015
La secuencia quimérica reguladora de promotor de acuerdo con la SEC ID Nº 7 (también denominada en el presente documento “construcción 2”) tiene una longitud total de 1128 pb y está compuesta por 1026 pb de la secuencia amplificadora IE1 de hCMV (que se muestra en cursiva) y 102 pb de la secuencia del “centro” promotor IE1 de mCMV (que se muestra también como la SEC ID Nº 4).
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E12185728
24-06-2015
La secuencia quimérica reguladora de promotor de acuerdo con la SEC ID Nº 8 (denominada también en el presente documento “construcción 3” la cual no es parte de la presente invención) tiene una longitud total de 509 pb y está compuesta por 407 pb de la secuencia amplificadora IE1 de hCMV (que se muestra en cursiva) y 102 pb de la secuencia del “centro” promotor IE1 de mCMV (que se muestra también como la SEC ID Nº 4).
10 La secuencia quimérica reguladora de promotor de acuerdo con la SEC ID Nº 9 (también denominada en el presente documento “construcción 4”) tiene una longitud total de 961 pb y está compuesta por 452 pb de una secuencia amplificadora IE1 de mCMV (que se muestra en negrita; SEC ID Nº 5), 407 pb de la secuencia amplificadora IE1 de hCMV (que se muestra en cursiva) y 102 pb de la secuencia del “centro” promotor IE1 de mCMV (que se muestra también como la SEC ID Nº 4).
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E12185728
24-06-2015
Mannheim, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los vectores plásmidos resultantes se transformaron en células de E. coli DH5α competentes (Invitrogen/Life Technologies GmbH; Darmstadt, Alemania). Las muestras se colocaron en placas en agar Luria-Bertani (LB) suplementado con 50 µg/ml de ampicilina y se incubaron durante una noche a 37 ºC. Las colonias únicas se utilizaron para inocular matraces de 500 ml con
5 agitado que contenían 200 ml de medio LB líquido más 50 µg/ml de ampicilina. Los matraces se incubaron una noche en una incubadora con agitado a 37 ºC, 200 rpm. Los cultivos resultantes se utilizaron para la preparación del plásmido ADN utilizando el kit Maxi Nucleobond (Macherey-Nagel GmbH, Düren, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los plásmidos producidos se verificaron por digestión de restricción diagnóstica.
10 Tabla 2 que muestra el esquema de clonación para generar las construcciones de secuencia quimérica reguladora de promotor 1-5, en donde las construcciones 1 y 3 no forman parte de la presente invención.
- Construcción
- Elemento regulador LC Fragmento intercatenario (derivado de pRY42) Elemento regulador HC Armazón del vector (derivado de pRY42)
- 1
- AatII-PacI PacI-EcoRI EcoRI-XhoI XhoI-AatII
- 2
- PvuI-SacII SacII-EcoRI EcoRI-Bsu36I Bsu36I-PvuI
- 3
- SspI-SacII SacII-EcoRI EcoRI-Bsu36I Bsu36I-SspI
- 4
- SspI-SacII SacII-EcoRI EcoRI-Bsu36I Bsu36I-SspI
- 5
- SspI-SacII SacII-EcoRI EcoRI-Bsu36I Bsu36I-SspI
En una etapa posterior, la LC y HC del anticuerpo monoclonal IgG4 cB72.3 (Whittle, N. et al. (1987) Protein Eng. 1, 499-505) se clonaron en cada uno de los cinco vectores que comprendían las construcciones quiméricas 1-5. Las
15 secuencias de ácido nucleico que codifican las cadenas de anticuerpo se derivaron del vector pRY57 (Figura 2, SEC ID Nº 2) como fragmentos de restricción EcoRI/HindIII (LC) y BamHI/NruI (HC) y se clonaron secuencialmente en los vectores para cada construcción promotora, utilizando las mismas endonucleasas de restricción. Los vectores plásmidos resultantes se verificaron por digestión de restricción diagnóstica y secuenciación del ADN de las regiones promotoras, respectivamente.
20
Se utilizó una línea celular derivada de la suspensión adaptada de la línea celular ovárica de hámster chino CHOK1SV para todos los experimentos (Lonza Ltd., Basilea, Suiza). En esta línea celular, las construcciones de
25 ácido nucleico se insertaron en un locus genómico específico de la célula huésped en un único número de copias por medio de un sistema de integración específica del sitio (SSI).
La selección positiva para la integración se consigue por restauración funcional de un casete de resistencia a la higromicina B en el sitio SSI. La integración de la construcción de expresión en el genoma huésped también retira
30 una copia del gen de timidina quinasa, lo que convierte el profármaco ganciclovir en un nucleótido análogo fosforilado tóxico. Por lo tanto, la adición de higromicina B y ganciclovir durante la construcción de la línea celular proporciona presiones de selección positivas y negativas, respectivamente, por la integración en el locus genómico diana.
35 La línea celular huésped se revivió a partir de viales crioconservados y se sub-cultivó. Todos los cultivos celulares: se llevaron a cabo en medio CD-CHO (Invitrogen/Life Technologies GmbH; Darmstadt, Alemania). Las células se sembraron 48 horas antes de la transfección en 30 ml de medio CD-CHO, a una concentración final de 0,3 x 106 células/ml.
40 El día de la transfección, se aglomeraron 1,2 x 107 células y se resuspendieron en 1 ml de CD-CHO antes de la cotransfección con 45 µg del plásmido pOG44 (Invitrogen/Life Technologies GmbH; Darmstadt, Alemania) y 5 µg de cada uno de los vectores dirigidos LC/HC (que comprendían las construcciones quiméricas 1-5, respectivamente) que se llevó a cabo utilizando electroporación en una cubeta BioRad GenePulser Xcell de 0,4 cm (pulso único de 300 V/900 µF, a tiempo constante de 12-16 mseg). El plásmido pOG44 engloba un casete de expresión para la
45 recombinasa (flipasa) de levaduras que se necesita para facilitar la recombinación en los sitios FRT presentes en el locus diana. Todos los experimentos de transfección se llevaron a cabo al menos por duplicado.
Cada muestra de electroporación se transfirió a 20 ml de medio CD-CHO en un matraz T75 (BD Biosciences, Heidelberg, Alemania) y se incubó en modo estático a 36,5 ºC, en una incubadora humidificada (5 % (v/v) de CO2 en
50 el aire). Las células se aglomeraron 48 h post-transfección (150 x g, 5 min) y se resuspendieron en 20 ml de medio CD-CHO que contenía 200 µg/ml de higromicina B (selección positiva). El cultivo se mantuvo en modo estático y tras 72 h se cambió el medio con CD-CHO recién preparado que contenía 200 µg/ml de higromicina B.
Posteriormente; cada 72 h se determinó la concentración celular viable y se cambió el medio con 20 ml de CD-CHO
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