EA009676B1

EA009676B1 - Водный препарат эритропоэтина человека

Info

Publication number: EA009676B1
Application number: EA200501789A
Authority: EA
Inventors: Киу Чан Квон; Сук Янг Чой; Янг Чеол Канг; Хоон Сунг Дзех; Сеунг Дзоо Ли; Миунг Дзин Ким; Дзи Еон Ким; Дзин-Сеок Ох
Original assignee: Эл Джи Лайф Сайенсиз Лтд.
Priority date: 2003-06-10
Filing date: 2004-06-07
Publication date: 2008-02-28
Also published as: WO2004108152A1; US20070293419A1; US8119595B2; ZA200509222B; KR20040110994A; MXPA05013398A; CA2528988A1; NO20055747L; EP1641486A4; BRPI0411114B1; BRPI0411114B8; JP4871720B2; CA2528988C; PL379272A1; AU2004244920A1; ES2385888T3; CN1802171B; EA200501789A1; UA82241C2; ATE553747T1

Abstract

Настоящее изобретение относится к водному препарату эритропоэтина человека, имеющему стабильность при хранении в течение продолжительного периода времени, без сывороточного альбумина, в котором препарат содержит фармацевтически эффективное количество эритропоэтина человека; неионное поверхностно-активное вещество, многоатомный спирт, нейтральную аминокислоту и сахарный спирт в качестве стабилизаторов; изотонический реагент и буферный реагент.

Description

Настоящее изобретение относится к водному препарату эритропоэтина человека, имеющего стабильность при хранении в течение продолжительного периода времени, без сывороточного альбумина. Более конкретно, настоящее изобретение относится к препарату, содержащему фармацевтически эффективное количество эритропоэтина человека; неионное поверхностно-активное вещество, многоатомный спирт, нейтральную аминокислоту и сахарный спирт в качестве стабилизаторов; изотонический реагент и буферный реагент.

Уровень техники

Эритропоэтин (ЕРО) представляет собой гликопротеин, который индуцирует производство эритроцитов в костном мозге посредством стимулирования дифференциации эритроидных прогениторных клеток. ЕРО состоит из 165 аминокислот. После выделения эритропоэтина из мочи человека Мраке в 1977 стало возможным производство больших количеств посредством технологий генной инженерии. Обнаружено, что эритропоэтин способен эффективно индуцировать различные виды гематопоэза при лечении анемии, возникающей в результате хронической почечной недостаточности и различных типов анемии, вызванной несколькими причинами, и при использовании во время определенных хирургических процедур (Мраке е! а1., 1. Вю1. Сйеш. 25, 5558-5564, 1977; ЕзсйЬасй е! а1., Хеи Еи§1. 1. Меб. 316, 73-78, 1987; Баибкотб Β.Κ., В1ооб, 111, 419-434, 1991; заявка на международный патент \УО 85-02610). По этой причине эритропоэтин используется в качестве фармацевтического препарата при различных заболеваниях в течение продолжительного времени. Однако подобно другим белковым фармацевтическим препаратам белок эритропоэтин также должен приготавливаться осторожно для предотвращения денатурации, вызываемой потерей стабильности, для его эффективного использования.

Как правило, белки имеют короткое время полужизни и легко денатурируют, например, вследствие агрегации мономеров, преципитации посредством агрегации и адсорбции на стенках ампулы, при воздействии экстремальных температур, на разделе фаз воды и воздуха, при воздействии высокого давления, физических и механических напряжений, органических растворителей, загрязнения микроорганизмами и т.п. Денатурированные белки теряют свои нативные физико-химические свойства и физиологическую активность, и денатурация белка является, как правило, необратимой. Таким образом, белки не могут восстановить их нативные свойства после денатурации. В частности, в случае таких белков, как эритропоэтин, который вводится отдельными малыми дозами, насчитывающими всего несколько микрограммов, когда они адсорбируются на стенке ампулы в силу утраты стабильности, потери, связанные с этим, бывают относительно большими. Кроме того, белок, адсорбированный таким образом, легко агрегирует в результате денатурации, а введение денатурированного белка вызывает формирование антител, как спонтанно продуцируемых белков, против этого денатурированного белка в организме, таким образом, белок должен вводиться, по существу, в стабильной форме. Соответственно, изучаются различные способы предотвращения денатурации белка в водном растворе (Ιοίιη СещеП. 1. Раге Шега 1 8ск Тесй., 43, Νο. 5, 220-224, 1989; 1Х1\1б \\о1щ Рйатш. Тесй. Ос!оЬег, 34-48, 1997; №е1 Аапе, Ιηΐ. 1. Рйатш., 185, 129-188, 1999; ^Шеш Хогбе, Лбу. Со11о1б 1п!егТасе 8ск, 25, 267-340, 1986; Мюйейе е! а1., Ιηΐ. 1. Рйагш., 120, 179-188, 1995).

В некоторых препаратах белков проблема денатурации решается с помощью способа лиофилизации. Однако лиофилизированные продукты являются неудобными, поскольку они должны восстанавливаться перед инъекцией, и для обработки необходима сушилка-морозильник большой емкости; поэтому необходимы значительные капиталовложения. Также используется способ производства порошкообразных форм белка с использованием технологии сушки распылением; однако его недостатком является то, что экономическая эффективность уменьшается из-за низкого выхода, а под воздействием высокой температуры во время процесса может происходить денатурация белка.

В качестве альтернативного пути для преодоления ограничения указанных выше способов имеется способ повышения стабильности белка посредством добавления стабилизаторов к водному раствору белка. В качестве стабилизаторов белков известны поверхностно-активные вещества, сывороточный альбумин, полисахариды, аминокислоты, макромолекулы и соли (1о1т Сещегк 1. Рагеп!ега1 8ск Тесй., 43, Хо. 5, 220224, 1989; Эау|б ^опд, Рйатш. Тесй., Ос!оЬег, 34-48, 1997; \Уе1 ^аид., Ιηΐ. 1. Рйатш., 185, 129-188, 1999). Однако пригодные для использования стабилизаторы должны выбираться в соответствии с физико-химическими характеристиками каждого белка; иначе, например, когда стабилизаторы используются в определенных сочетаниях, может произойти конкурентное взаимодействие или побочная реакция, приводя к отрицательным воздействиям, отличным от предполагаемых. Кроме того, поскольку для каждого стабилизатора существует соответствующий диапазон концентраций, необходимо множество усилий и предосторожностей для стабилизации водных растворов белков (\Ме1 ^тд, Ιηΐ. 1. Рйатш., 185, 129-188, 1999).

Среди стабилизаторов белков сывороточный альбумин и желатин, получаемые от человека или животных, как правило, используются в качестве стабилизаторов водных препаратов белков и, как показано, являются эффективными. Однако имеется риск вирусного загрязнения сывороточного альбумина, получаемого от человека, а желатин и бычий сывороточный альбумин могут переносить болезни, подобные Передающимся губчатым энцефалопатиям, или вызывать аллергии у некоторых пациентов; по этой причине в Европе использование материалов из человеческих и животных источников в качестве фармацевтических добавок ограничивается во все возрастающей степени (ЕМЕЛ/СРМР/В^Р/450/01 Керой

- 1 009676

Ггот Ехрсгк ^огкзйор оп Нитап Т8Е§ апб Мсбюта1 ргобиск бспусб Ггот Нитап В1ооб апб Р1а§та (1 ЭссстЬсг 2000), СРМР/Р8/201/98 Роййоп §1акстспк оп Ысте Уапапк СТО апб РНкта-Эспусб Мсб1ста1 Ргобиск (Зирсгасбсб Ьу СРМР/В^Р/2879/02). Таким образом, необходима разработка способов получения стабильных белковых препаратов без сывороточного альбумина от человека или животных для решения проблемы существующих препаратов эритропоэтина, содержащих сывороточный альбумин.

В патенте США № 4879272 описывается добавление сывороточного альбумина человека/быка, лецитина, декстрана и целлюлозы в качестве агентов для ингибирования прилипания белка к стенкам ампул. В соответствии с этим патентом выход восстановленного эритропоэтина является хорошим, при 69~98%, после хранения примерно в течение 2 ч при 20°С, по сравнению только с 16% без такого добавления, но имеется та проблема, что потери, связанные с адсорбцией, могут быть значительными.

В патенте США № 4806524 описываются лиофилизированный препарат и водный препарат эритропоэтина, в которых используют полиэтиленгликоль, белок, сахариды, аминокислоты, органические соли и неорганические соли в качестве стабилизаторов для эритропоэтина. В соответствии с этим патентом после хранения примерно в течение 7 дней при 25°С лиофилизированный препарат имеет высокий уровень восстановления, 87~98%, но водный препарат имеет низкий уровень восстановления, только лишь 60~70%, таким образом, водный препарат является относительно менее стабильным.

В патенте США № 4992419 описываются водный препарат и лиофилизированный препарат эритропоэтина, в котором используется 0,5-5 г/л неионного поверхностно-активного вещества в качестве противоадсорбционного агента и 5-50 г/л мочевины и 5-25 г/л аминокислот в качестве стабилизаторов. Однако этот патент имеет те проблемы, что водный препарат демонстрирует ограниченную стабильность по сравнению с препаратами, содержащими сывороточный альбумин человека, и лиофилизированный препарат требует процесса восстановления с тем, чтобы поддерживать достаточную активность.

В патенте США № 5376632 описываются водный препарат, лиофилизированный препарат и порошкообразный препарат эритропоэтина, полученные сушкой распылением, содержащие β- или γ-циклодекстрины, но не содержащие другого дополнительного фармацевтического наполнителя. Однако препараты, в которых используются циклодекстрины, являются непрактичными из-за их почечной токсичности.

В патенте США № 5661125 описываются препараты эритропоэтина, содержащие бензиловый спирт, парабены, фенол и их смеси, и эксперимент, демонстрирующий их стабильность по сравнению с препаратом эритропоэтина, содержащим сывороточный альбумин человека. Однако препарат согласно этому патенту демонстрирует низкую стабильность и значительную преципитацию эритропоэтина даже при низкой температуре.

В международный заявке на патент νΟ 01/87329 А1 описываются водные препараты эритропоэтина и многозарядного неорганического аниона в фармацевтически приемлемом буфере для поддержания рН раствора в пределах примерно от 5,5 примерно до 7,0. Эта заявка демонстрирует сравнительный эксперимент относительно стабильности, в котором после хранения ЕРО и ПЭГилированного ЕРО при различных температурах в течение 6 месяцев измерялись содержание сиаловой кислоты и стандартная биологическая активность (%) каждого ЕРО в различных препаратах; однако поскольку количество мономеров ЕРО не измерялось, выход (%) извлечения мономеров ЕРО не может быть точно определен.

Поэтому является желательным создание нового водного препарата, который имел бы долговременную стабильность, без использования белковых компонентов, полученных от животных, таких как сывороточный альбумин.

Сущность изобретения

Целью настоящего изобретения является создание водного препарата эритропоэтина, который мог бы поддерживать биологическую активность в течение продолжительного периода ш у1уо, без использования сывороточного альбумина, полученного от человека или животного.

Посредством множества экспериментов и интенсивных исследований, авторы обнаружили водный препарат эритропоэтина человека, предотвращающий адгезию на стенке ампулы и денатурацию белка, происходящие при хранении в течение продолжительных периодов, когда фармацевтически эффективное количество эритропоэтина объединяется с особыми компонентами в качестве стабилизаторов, изотонического реагента и буферного реагента, и осуществили настоящее изобретение.

Подробное описание изобретения

Следовательно, настоящее изобретение относится к водному препарату эритропоэтина человека, содержащему фармацевтически эффективное количество эритропоэтина человека; неионное поверхностно-активное вещество, многоатомный спирт, нейтральные аминокислоты, сахарный спирт в качестве стабилизаторов; изотонический реагент и буферный реагент.

Эритропоэтин человека, который может использоваться в водном препарате по настоящему изобретению, включает в себя любые типы эритропоэтина, получаемые путем выделения из животных клеток и очистки посредством нативного и/или генетического рекомбинантного способа. Количество эритропоэтина в водном препарате предпочтительно составляет от 100 до 120000 М.Е./мл.

Водный препарат по настоящему изобретению содержит неионное поверхностно-активное вещество для стабилизации препарата, что предотвращает адгезию на стенках ампулы, при этом неионное поверхностно-активное вещество уменьшает поверхностное натяжение белков для предотвращения адгезии

- 2 009676 или агрегации белков на гидрофобных поверхностях. Предпочтительный пример неионного поверхностно-активного вещества для использования в настоящем изобретении включает в себя неионные поверхностно-активные вещества на основе полисорбата и на основе полоксамера, и они могут использоваться индивидуально или в виде комбинации двух или более из них. Среди них неионные поверхностно-активные вещества на основе полисорбатов являются более предпочтительными. Пример этих неионных поверхностно-активных веществ на основе полисорбатов включает в себя полисорбат 20, полисорбат 40, полисорбат 60 и полисорбат 80, и среди них полисорбат 20 является особенно предпочтительным. Полисорбат 20 ингибирует химическое деградирование белка, а также уменьшает или предотвращает адгезию белков при низкой концентрации, поскольку его критическая концентрация мицеллообразования является относительно низкой. Использование высоких концентраций неионного поверхностно-активного вещества в водном препарате не является предпочтительным, поскольку такая концентрация искажает результаты УФ-спектроскопии и изоэлектрической фокусировки при исследовании стабильности и концентрации белка, так что является трудной оценка стабильности белка. По этой причине в водном препарате по настоящему изобретению неионное поверхностно-активное вещество предпочтительно включается в количествах менее 0,01%, более предпочтительно от 0,0001 до 0,01% (мас./об.).

Нейтральные аминокислоты делают возможным присутствие гораздо большего количества молекул воды вокруг эритропоэтина, так что крайние наружные гидрофильные аминокислоты эритропоэтина могут стабилизироваться, при этом стабилизируя и сам эритропоэтин (^апд, Ιηΐ. 1. Рйатш. 185 (1999) 129188). Поскольку заряженные аминокислоты могут облегчить агрегацию эритропоэтина посредством электростатического взаимодействия, нейтральная аминокислота используется в водном препарате по настоящему изобретению. Предпочтительный пример нейтральной аминокислоты, которая может использоваться в настоящем изобретении, включает в себя глицин, аланин, лейцин, изолейцин и т.п., и среди них глицин является более предпочтительным. Эти нейтральные аминокислоты могут использоваться индивидуально или в виде комбинации из двух или более из них; однако в соответствии с экспериментами, осуществленными авторами настоящего изобретения, глицин является более эффективным, когда он используется индивидуально, чем в случае его использования в сочетании с другими аминокислотами. Однако водный препарат по настоящему изобретению не предполагается ограничивать использованием только одного вида нейтральной аминокислоты. Количество нейтральной аминокислоты для использования в настоящем изобретении предпочтительно составляет от 0,001 до 2% (мас./об.). Если количество находится ниже этих пределов, может отсутствовать эффект увеличения стабильности. С другой стороны, если количество выше этих пределов, высокая концентрация эритропоэтина не может быть достигнута из-за увеличения осмотического давления, влияющего на растворимость эритропоэтина.

В водном препарате по настоящему изобретению многоатомный спирт используется в качестве одного из стабилизаторов эритропоэтина в растворе. Предпочтительный пример многоатомного спирта включает пропиленгликоль, полиэтиленгликоль с низкой молекулярной массой, глицерин и полипропиленгликоль с низкой молекулярной массой и может использоваться один из них или сочетание двух или более из них. В частности, среди них пропиленгликоль является более предпочтительным. Пропиленгликоль широко используется в фармацевтических препаратах, вводимых парентеральным или непарентеральным путем в качестве растворителя гидрофобных материалов, экстрагента и консерванта, и он считается нетоксичным. Кроме того, он используется в качестве эмульгатора или носителя в пищевых продуктах и косметике. В дополнение к указанному выше, он может также использоваться в качестве стабилизатора фармацевтических препаратов, для увеличения растворимости фосфолипида, когда фосфолипид используется в качестве стабилизатора водных препаратов. Пропиленгликоль также может использоваться для увеличения стабильности водных препаратов белка, и он, как правило, дополнительно улучшает стабильность водных препаратов, когда используется в сочетании с другими стабилизаторами при соответствующих концентрациях, по сравнению со случаями, когда используется индивидуально. Однако необходимо отметить, что, как установлено авторами настоящего изобретения, несмотря на использование полипропиленгликоля, стабильность водного препарата неожиданно понижается в случае неверного выбора видов и пределов концентраций других стабилизаторов, которые используются в сочетании с пропиленгликолем. Количество многоатомного спирта предпочтительно составляет от 0,0001 до 0,1% (мас./об.). Если количество находится ниже этих пределов, эффект увеличения стабильности может отсутствовать. С другой стороны, если количество находится выше этих пределов, может возникнуть проблема с увеличением осмотического давления.

Сахарный спирт, в качестве одного из стабилизаторов водных препаратов по настоящему изобретению, играет роль стабилизатора эритропоэтина, когда поступает в раствор с неионным поверхностно-активным веществом, нейтральной аминокислотой и многоатомным спиртом, как рассмотрено выше. Предпочтительный пример сахарного спирта включает в себя маннит, сорбит, циклит, инозит и т.п., которые могут использоваться индивидуально или в виде комбинации двух или более из них. Среди них маннит является более предпочтительным. Количество сахарного спирта предпочтительно составляет от 0,1 до 1,0% (мас./об.). Если количество находится ниже этих пределов, эффект увеличения стабильности может отсутствовать. С другой стороны, если количество находится выше этих пределов, может возникать проблема с увеличением осмотического давления.

- 3 009676

Некоторые стабилизаторы, например сахарный спирт и т.п., не ограничиваются буквальным значением самого термина, но в некоторых случаях могут также играть другие роли при приготовлении водного препарата в соответствии с настоящим изобретением, например роль изотонического реагента.

Изотонический реагент, используемый как другой компонент в водном препарате по настоящему изобретению, служит для поддержания осмотического давления, когда эритропоэтин вводится в организм в форме раствора, и также имеет дополнительное воздействие дальнейшей стабилизации эритропоэтина в форме раствора. Репрезентативный пример изотонического реагента включает в себя водорастворимые неорганические соли, и эти соли включают в себя, например, хлорид натрия, хлорид кальция, сульфат натрия и т.п. Эти соли могут использоваться индивидуально или в виде комбинации двух или более из них, и среди них хлорид натрия является более предпочтительным. Количество водорастворимой неорганической соли предпочтительно составляет от 0,001 до 0,7% (мас./об.) и может устанавливаться соответствующим образом для придания изотоничности водного препарата, содержащего различные компоненты, как описано выше.

Сочетание указанных выше стабилизаторов с изотоническим реагентом, которые содержатся в водном препарате, стабилизирует эритропоэтин в растворе синэргическим образом, но не конкурентным образом по отношению друг к другу. В соответствии с исследованиями авторов настоящего изобретения обнаружено, что, например, в то время как пропиленгликоль обладает эффектом стабилизации эритропоэтина в растворе до определенной степени, даже когда используется индивидуально, эффект стабильности может дополнительно увеличиваться, когда он используется в сочетании с нейтральными аминокислотами. Обнаружено также, что использование нейтральных аминокислот вместе со стабилизаторами, исключая полипропиленгликоль, приводит к меньшему эффекту стабильности, чем использование нейтральных аминокислот вместе со стабилизаторами, включая полипропиленгликоль. По этой причине в случае отсутствия любого из стабилизаторов или изотонических реагентов, как рассмотрено выше, результатом является заметное уменьшение стабильности эритропоэтина. Это доказывается посредством примеров и сравнительных примеров, которые приведены далее.

В водных препаратах по настоящему изобретению буферный реагент служит для поддержания рН раствора для стабилизации эритропоэтина. Предпочтительный пример буферного реагента включает в себя фосфатный буфер, цитратный буфер и т.п., и среди них фосфатный буфер является более предпочтительным. Например, концентрация фосфата, составляющего реагент фосфатного буфера, предпочтительно составляет от 5 до 50 мМ, а рН раствора предпочтительно составляет примерно от 6,0 до 8,0, при этом диапазон примерно 6,5~7,5 является более предпочтительным.

В водном препарате по настоящему изобретению могут селективно присутствовать любые другие вещества или материалы, известные в данной области, кроме стабилизаторов, изотонического реагента и буферного реагента, при условии, что они не влияют отрицательно на эффекты настоящего изобретения.

Примерные препараты по настоящему изобретению будут иллюстрироваться ниже более подробно, однако примерные препараты ниже являются только примерами настоящего изобретения, поэтому настоящее изобретение не ограничивается приведенными примерами.

Пример 1. Приготовление водного препарата эритропоэтина человека - 1.

Изотонический раствор получают посредством добавления 0,003% полисорбата 20, 0,1% пропиленгликоля, 1,5% глицина, 0,1% хлорида натрия и 1,0% маннита к 10 мМ раствору фосфатного буфера и эритропоэтин (ЬО Ы£е 8с1еисе Со., Ь1б.) добавляют примерно до 4000 М.Е./мл. 2 Мл аликвоты полученного раствора осторожно переносят в 3 мл стеклянные флаконы и герметизируют, затем хранят при 25 и 37°С, соответственно.

Сравнительный пример 1. Приготовление водного препарата эритропоэтина человека без добавок.

Эритропоэтин добавляют в количестве 4000 М.Е./мл в 10 мМ раствор фосфатного буфера. 2 Мл аликвоты полученного раствора осторожно переносят в 3 мл стеклянные флаконы и герметизируют, затем хранят при 25 и 37°С, соответственно.

Сравнительный пример 2. Приготовление водного препарата эритропоэтина человека, содержащего только полисорбат 20.

Эритропоэтин добавляют в количестве 4000 М.Е./мл в 10 мМ раствор фосфатного буфера, содержащий 0,003% полисорбата 20. 2 Мл аликвоты полученного раствора осторожно переносят в 3 мл стеклянные флаконы и герметизируют, затем хранят при 25 и 37° С, соответственно.

Сравнительный пример 3. Приготовление водного препарата эритропоэтина человека без пропиленгликоля.

Изотонический раствор получают посредством добавления 0,003% полисорбата 20, 1,5% глицина, 0,1% хлорида натрия и 1,0% маннита к 10 мМ раствору фосфатного буфера и эритропоэтин добавляют примерно до 4000 М. Е./мл. 2 Мл аликвоты полученного раствора осторожно переносят в 3 мл стеклянные флаконы и герметизируют, затем хранят при 25 и 37°С, соответственно.

Сравнительный пример 4. Приготовление водного препарата эритропоэтина человека без глицина.

Изотонический раствор получают посредством добавления 0,003% полисорбата 20, 0,5% пропиленгликоля, 0,1% хлорида натрия и 1,0% маннита к 10 мМ раствору фосфатного буфера и эритропоэтин

- 4 009676 добавляют примерно до 4000 М.Е./мл. 2 Мл аликвоты полученного раствора осторожно переносят в 3 мл стеклянные флаконы и герметизируют, затем хранят при 25 и 37°С, соответственно.

Сравнительный пример 5. Приготовление водного препарата эритропоэтина человека без хлорида натрия.

Изотонический раствор получают посредством добавления 0,003% полисорбата 20, 1,7% глицина, 0,5% пропиленгликоля и 1,0% маннита к 10 мМ фосфатному солевому раствору и эритропоэтин добавляют примерно до 4000 М.Е./мл. 2 Мл аликвоты полученного раствора осторожно переносят в 3 мл стеклянные флаконы и герметизируют, затем хранят при 25 и 37°С, соответственно.

Сравнительный пример 6. Приготовление водного препарата эритропоэтина человека без маннита.

Изотонический раствор получают посредством добавления 0,003% полисорбата 20, 0,5% пропиленгликоля, 1,5% глицина и 0,1% хлорида натрия к 10 мМ раствору фосфатного буфера и эритропоэтин добавляют примерно до 4000 М.Е./мл. 2 Мл аликвоты полученного раствора осторожно переносят в 3 мл стеклянные флаконы и герметизируют, затем хранят при 37°С.

Экспериментальный пример 1. Стабильность водных препаратов эритропоэтина человека.

Отношение мономера и димера эритропоэтина из водных препаратов примера 1 и сравнительных примеров 1-6 определяют с использованием ЭХ-ВЭЖХ после хранения в течение 3 и 5 недель, соответственно. Результат описывается ниже в табл. 1.

Таблица 1

	Выход извлечения (%)	Димер	(%)
	25°С	37°С	25°С	37°С
	3	5	3	5	3	5	3	5
	неде	неде	неде	неде	неде	неде	недели	недель
	ли	ль	ли	ль	ли	ль
Пр. 1	100	98, 9	94,2	93,5	0,0	0,0	0,0	0,0
Ср.пр.1	87,1	86, 5	78, 6	75, 6	0,0	0,0	0,0	0,0
Ср.пр.2	91,1	92,4	83, 4	82, 6	0,0	0,0	11,0	13,1
Ср.пр.3	93, 4	93, 0	85,5	83,7	0,0	0,0	7,2	9,8
Ср.пр.4	94,1	93, 5	87,2	85,1	0,0	0,0	4,3	6, 5
Ср.пр.5	95,2	94,8	90,2	88,3	0,0	0,0	1,35	2,4
Ср.пр.6	-	-	85, 1	81,1	-	-	8,3	5,5

Как можно увидеть выше в табл. 1, пример 1, в качестве водного препарата эритропоэтина в соответствии с настоящим изобретением, демонстрирует выход извлечения более 92% после хранения в течение 5 недель при 37°С, димеры не детектируются. С другой стороны, сравнительный пример 2, содержащий в препарате только полисорбат 20, демонстрирует высокий выход по сравнению со сравнительным примером 1, не содержащим добавок, но детектируются димеры. В сравнительных примерах 3-6, не содержащих в препарате никаких компонентов в соответствии с настоящим изобретением, димеры детектируются при 37°С, 3 неделях и выход извлечения понижается примерно до 80%. Кроме того, в сравнительных примерах 3 и 4, не содержащих в препарате пропиленгликоля и глицина, соответственно, выход извлечения является низким по сравнению с препаратом примера 1 и детектируется множество димеров. Согласно приведенным выше результатам подтверждается, что пропиленгликоль, и все другие стабилизаторы, и изотонический реагент, предусматриваемые по настоящему изобретению, обладают синэргическими эффектами, когда используются в их сочетании. Можно увидеть, что, в то время как каждый из этих компонентов, добавляемый в препарат по настоящему изобретению, производит стабилизирующий эффект, противодействие адгезии эритропоэтина в растворе и стабильность водного раствора эритропоэтина могут синэргически улучшаться посредством объединенных эффектов каждого ингредиента.

Пример 2. Приготовление водного препарата эритропоэтина человека - 2.

Изотонический раствор получают посредством добавления 0,01% полисорбата 20, 0,1% пропиленгликоля, 0,1% глицина, 0,55% хлорида натрия и 1,0% маннита к 10 мМ раствору фосфатного буфера и эритропоэтин добавляют к примерно 4000 М.Е./мл. 0,5 Мл аликвоты полученного раствора собирают в 1 мл предварительно наполненный шприц (Вес(оп-О|ск|п5оп) и хранят при 40°С в течение 4 недель.

Сравнительный пример 7. Приготовление водного препарата эритропоэтина человека без пропиленгликоля и маннита.

К раствору, содержащему 4,38 мг/мл хлорида натрия, 1,16 мг/мл мононатрийфосфата (дигидрата), 2,23 мг/мл динатрийфосфата (дигидрата), 5 мг/мл глицина и 0,3 мг/мл полисорбата 80, добавляют эри

- 5 009676 тропоэтин примерно до 4000 М.Е./мл. 0,5 Мл аликвоты полученного раствора собирают в 1 мл предварительно наполненный шприц (Вес1оп-П1ск1п8оп) и хранят при 40°С в течение 4 недель.

Экспериментальный пример 2. Стабильность водных препаратов эритропоэтина человека - 2.

Чистоту и выход извлечения эритропоэтина из водных препаратов примера 2 и сравнительного примера 7 определяют с использованием ЭХ-ВЭЖХ при 0, 1, 3 и 4 неделях, соответственно. Результат описывается ниже в табл. 2.

Таблица 2

	Выход извлечения мономера (%)
	0 неделя	1 неделя	3 недели	4 недели
Пр. 2	100,0	95,8	89,9	92, 9
Срав. пр.7	100,0	93, 9	85,2	86, 2

Как видно в табл. 2 выше, препарат по настоящему изобретению демонстрирует высокий выход извлечения 92,9% после инкубирования в течение 4 недель по сравнению с 86,4% для эталонного препарата. Таким образом, обнаружено, что препарат по настоящему изобретению улучшает стабильность эритропоэтина в растворе.

Сравнительные примеры 9-13. Приготовление различных водных препаратов эритропоэтина человека.

Водные препараты табл. 3 ниже, отличающиеся по некоторым компонентам от водных препаратов в примере 1, получают и хранят при 25 и 37°С, соответственно, при тех же условиях, что и в примере 1.

Таблица 3

	Композиция препаратов
Ср.пр. 9	ЕРО 4000 М.Е./мл в РВ, 0,5% РС, 0,003% Тиееп 20, 0,5 мМ сахарозы, 1 мг/мл ИаС1
Ср.пр. 10	ЕРО 4000 М.Е./мл в Тг1з, 0,5% РС, 0,003% Тиееп 20, 1,5% С1у, 1 мг/мл ЫаС1
Ср.пр. 11	ЕРО 4000 М.Е./мл в РВ, 0,5% РУР 15К, 0,003% Тиееп 20, 1,5% С1у, 0,1% ИаС1, 1% маннита
Ср.пр. 12	ЕРО 4000 М.Е./мл в РВ, 0,5% РО, 0,003%, Тиееп 20, 1,5% С1у, 1 мг/мл ИаС1, 0,00001% карбоксиметилцеллюлозы
Ср.пр. 13	ЕРО 2000 М.Е./мл в РВ, 2% РС, 2% глюкозы, 0,002% лецитина, 0,001% Тиееп 20

РВ: фосфатный буфер

РО: пропиленгликоль

РУР: поливинилпирролидон

Экспериментальный пример 3. Стабильность водных препаратов эритропоэтина человека - 3.

Отношение мономера и димера эритропоэтина из водных препаратов сравнительных примеров 9-13 определяют с использованием ЭХ-ВЭЖХ при 3 и 5 неделях, соответственно. Результат описывается в табл. 4 ниже в сравнении с результатами водных препаратов примера 1.

Таблица 4

	Выход извлечения, %	Димер, %
25°С	37°С	25°С	37°С
3 недели	5 недель	3 недели	5 недель	3 недели	5 недель	3 недели	5 недель
Пример 1	100	98,9	94,2	93,5	0,0	0,0	0,0	0,0
Ср.пр. 9	ΝΑ	ΝΑ	68,1	72,9	ΝΑ	ΝΑ	5,8	12,5
Ср.пр. 10	ΝΑ	ΝΑ	48,2	*	ΝΑ	ΝΑ	21,0	*
Ср.пр. 11	**	**	**	**	**	**	**	**
Ср.пр. 12	***	***	***	***	***	***	***	***
Ср.пр. 13	ΝΑ	ΝΑ	ΝΑ	ΝΑ	46,6	56,6	59,2	58,9

*: Стоп-тест для преципитации.

**: Стоп-тест для преципитации после приготовления препаратов. ***: Стоп-тест для преципитации после приготовления препаратов. ΝΑ: не применим.

- 6 009676

Сравнительный пример 13. Результаты, полученные при 30 и 50°С.

Как видно выше в табл. 4, желаемые результаты не получаются, когда некоторые компоненты в водных препаратах примера 1 в соответствии с настоящим изобретением заменяются другими соединениями.

Пример 3. Приготовление водного препарата эритропоэтина человека - 3.

Для приготовления водных препаратов с использованием многоатомных спиртов, иных, чем пропиленгликоль, водные препараты эритропоэтина человека получают таким же способом, как и в примере 1, за исключением использования 0,025% РЕС 300 (полиэтиленгликоль, Мп=300), вместо пропиленгликоля. Полученный раствор помещают в стеклянный флакон и герметизируют, затем хранят при 37°С.

Экспериментальный пример 4. Стабильность водного препарата эритропоэтина человека - 4.

Отношение мономера и димера эритропоэтина из водных препаратов примера 3 определяют с использованием ЭХ-ВЭЖХ при 3 и 5 неделях, соответственно. Для сравнения водный препарат сравнительного примера 3, не содержащий многоатомного спирта, также исследуется, и результаты описываются в табл. 5.

Таблица 5

	Выход извлечения (%)	Димер (%)
	3 недели	5 недель	3 недели	5 недель
Пр. 3	100,0	97,2	0,0	0,0
Ср.пр.3	85, 5	83,7	7,2	9,8

Как видно в табл. 5 выше, пример 3, который представляет собой водный препарат эритропоэтина в соответствии с настоящим изобретением, использующий полиэтиленгликоль в качестве многоатомного спирта, имеет выход извлечения мономеров 97% и димеры не детектируются. Этот результат сильно отличается от водного препарата сравнительного примера 3, не использующего многоатомный спирт.

Пример 4. Стабильность водного препарата с высокой концентрацией эритропоэтина.

Изотонический раствор получают посредством добавления 0,003% полисорбата 20, 0,1% пропиленгликоля, 1,5% глицина, 1,0% маннита и 0,1% хлорида натрия к 10 мМ раствору фосфатного буфера и эритропоэтин добавляют примерно до 12000 М.Е./мл. 0,5 Мл аликвоты полученного раствора собирают в 1 мл предварительно наполненный шприц (ВееФоп-Оюктзоп) и хранят при 5, 25 и 40°С в течение 3 месяцев, соответственно.

Экспериментальный пример 5. Стабильность водных препаратов с высокой концентрацией эритропоэтина.

Для подтверждения стабильности водных препаратов с высокой концентрацией эритропоэтина выход извлечения и чистота препарата, полученного в примере 3, определяются после хранения в течение 0, 6 и 12 месяцев хранения при 5°С, и после хранения в течение 2, 4 и 6 месяцев при 25°С, и после хранения в течение 1, 2 и 3 месяцев при 40°С, соответственно, с использованием ЭХ-ВЭЖХ и ОФ-ВЭЖХ. Уровень физиологической активности оценивают посредством введения препаратов мышам Β6Ό2Ε1 и измерения увеличения уровня ретикулоцитов. Результаты описаны ниже в табл. 6.

Таблица 6

	Хранение при 5°С	Хранение 25°С	при	Хранение 40°С	при
Время хранения (месяцы)	0	6	12	2	4	6	1	2	3
Выход извлечения (%)	100, 0	107, 8	104, 9	100, 0	100 ,0	103 , 9	100, 0	96, 1	94, 1
Чистота (%)	100, 0	99,9	99, 9	100, 0	99, 8	99, 3	99, 8	99, 3	99, 2
Физиология еская активность (%)	89,7	90,8	ΝΤ	90,4	90, 8	93, 8	105, 3	82, 8	91, 8

- 7 009676

Как видно в табл. 6 выше, высокая концентрация эритропоэтина в водных препаратах демонстрирует полный выход извлечения, чистоту и физиологическую активность до хранения в течение 12 месяцев при 5°С и также до хранения в течение 6 месяцев при 25°С. Кроме того, выход извлечения 94% наблюдается до хранения в течение 3 месяцев при 40°С, при небольшом уменьшении чистоты и физиологической активности. По этой причине, подтверждается, что препараты в соответствии с примером 2 являются очень стабильными.

Экспериментальный пример 6. Стабильность в зависимости от эффектов рН.

0,003% полисорбата 20, 0,5% пропиленгликоля, 1,5% глицина, 1,0% маннита и 0,1% хлорида натрия добавляют к 10 мМ раствору фосфатного буфера и эритропоэтин добавляют до 4000 М.Е./мл, а затем рН устанавливают с использованием ацетата и гидроксида натрия. Полученный раствор помещают аликвотами по 2 мл в 3 мл пробирки, и герметизируют, и подвергают хранению при 40°С в течение 3 недель, а затем измеряют отношение мономера и димера эритропоэтина. Результат описывается ниже в табл. 7.

Таблица 7 рН Выход извлечения (%) Димер (%)

6,0	94,4	0,0
6, 5	95,2	0, 0
7,0	94,3	0, 0
7,5	90,3	О, о¹
8,0	81,7	0, 0
8,5	69,8	0,0
9,0	55,3	11,8

Как видно в табл. 7 выше, выход извлечения мономера составляет выше 90% даже после 3 недель хранения при 40°С в случае рН от 6,0 до 7,5. Из этого результата можно увидеть, что водные препараты эритропоэтина в соответствии с настоящим изобретением, содержащие неионное поверхностно-активное вещество, пропиленгликоль, нейтральную аминокислоту, хлорид натрия и изотонический реагент, являются очень стабильными при рН 6,0-7,5.

Промышленная применимость

Как описано выше, водный препарат эритропоэтина в соответствии с настоящим изобретением, содержащий эритропоэтин человека и неионное поверхностно-активное вещество, многоатомный спирт, нейтральную аминокислоту, сахарный спирт в качестве стабилизатора, изотонический реагент и буферный реагент, облегчают проблему понижения физиологической активности, связанную с денатурацией при продолжительном хранении в растворе; и, в дополнение к этому, имеет эффект предотвращения прилипания белков эритропоэтина к стенкам ампулы.

Другие примеры и применения согласно изобретению будут понятны специалистам в данной области из рассмотрения описания и осуществления изобретения, описанного здесь. Предполагается, что описание и примеры должны рассматриваться только в качестве иллюстративных, при этом рамки конкретных примеров изобретения указываются посредством следующей далее формулы изобретения.

Claims

1. Водный препарат эритропоэтина человека, содержащий эритропоэтин человека, неионное поверхностно-активное вещество, многоатомный спирт, нейтральную аминокислоту и сахарный спирт в качестве стабилизаторов; изотонический реагент и буферный реагент.

2. Водный препарат эритропоэтина человека по п.1, в котором указанный эритропоэтин человека представляет собой нативный или рекомбинантный эритропоэтин.

3. Водный препарат эритропоэтина человека по п.1, в котором указанное неионное поверхностно-активное вещество представляет собой неионное поверхностноактивное вещество на основе полисорбата или неионное поверхностно-активное вещество на основе полоксамера или их комбинацию;

указанный многоатомный спирт представляет собой один или несколько спиртов, выбранных из группы, состоящей из пропиленгликоля, полиэтиленгликоля с низкой молекулярной массой, глицерина и полипропиленгликоля с низкой молекулярной массой;

указанная нейтральная аминокислота представляет собой одну или несколько кислот, выбранных из группы, состоящей из глицина, аланина, лейцина и изолейцина;

указанный сахарный спирт представляет собой один или несколько спиртов, выбранных из группы, состоящей из маннита, сорбита, циклита и инозита;

указанный изотонический реагент представляет собой один или несколько реагентов, выбранных из группы, состоящей из хлорида натрия, хлорида кальция и сульфата натрия; и

- 8 009676 указанный буферный реагент представляет собой один или несколько реагентов, выбранных из группы, состоящей из фосфатного буфера и нитратного буфера.

4. Водный препарат эритропоэтина человека по п.3, в котором указанное неионное поверхностноактивное вещество представляет собой полисорбат 20, и указанный многоатомный спирт представляет собой пропиленгликоль, и указанная нейтральная аминокислота представляет собой глицин, и указанный сахарный спирт представляет собой маннит, и указанный изотонический реагент представляет собой хлорид натрия, и указанный буферный реагент представляет собой фосфатный буфер.

5. Водный препарат эритропоэтина человека по п.1, в котором содержание неионного поверхностно-активного вещества находится в пределах от 0,0001 до 0,01% (мас./об.).

6. Водный препарат эритропоэтина человека по п.1, в котором содержание многоатомного спирта находится в пределах от 0,001 до 0,1% (мас./об.).

7. Водный препарат эритропоэтина человека по п.1, в котором содержание нейтральной аминокислоты находится в пределах от 0,001 до 2% (мас./об.).

8. Водный препарат эритропоэтина человека по п.1, в котором содержание сахарного спирта находится в пределах от 0,1 до 1,0% (мас./об.).

9. Водный препарат эритропоэтина человека по п.1, в котором содержание указанного изотонического реагента находится в пределах от 0,001 до 0,7% (мас./об.).

10. Водный препарат эритропоэтина человека по п.1, в котором концентрация соли в буферном реагенте находится в пределах от 1 до 50 мМ и его рН находится в пределах от 6,0 до 7,5.

11. Водный препарат эритропоэтина человека по п.1, в котором содержание эритропоэтина находится в пределах от 100 до 120000 М.Е./мл.