KR101303388B1 - 지속형 인터페론 알파 결합체의 액상 제제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 생체 내 지속성 및 안정성이 향상된 지속형 인터페론 알파 결합체가 장기간 안정하게 유지될 수 있도록 하는 액상 제제에 관한 것으로, 본 발명에 따른 액상 제제는 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제 및 등장화제를 포함하고, 인간 혈청 알부민 및 인체에 잠재적으로 유해한 인자를 포함하지 않아 바이러스 감염의 우려가 없이 우수한 저장 안정성을 나타낸다.

Description

지속형 인터페론 알파 결합체의 액상 제제{Liquid formulations of long acting interferon alpha conjugate}
본 발명은 약리학적 유효량의 지속형 인터페론 알파 결합체 및 알부민 비함유 안정화제를 포함하며, 상기 안정화제는 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제 및 등장화제를 함유하는 지속형 인터페론 알파 결합체의 액상 제제에 관한 것이다.
인터페론은 1957년 이삭스(Isaacs)와 린덴만(Lindenmann)이 닭을 인플루엔자 A 바이러스로 감염시키면 바이러스를 억제하는 인자가 있음을 발견하여 알려지게 되었다 (Isaacs, K. and Lindenmann, J., Proc. R. Soc. Lond., B147, 258-267 (1957)). 인간 인터페론은 일종의 싸이토카인으로 생체내 면역반응 또는 바이러스의 증식을 저해하는 단백질로서 이들은 생성되는 세포의 종류에 따라 인터페론 알파, 인터페론 베타 및 인터페론 감마로 나누어진다 (Kirchner, H., et al., Tex. Rep. Biol. Med., 41, 89-93(1981) : Stanton, G. J., et al., Tex. Rep. Biol. Med., 41, 84-88(1981)). 즉, 인터페론 알파는 B 임파구 세포 (B lymphocytes), 눌 임파구세포 (Null lymphocytes) 및 거식세포 (Macrophage)에 의해 생성되며, 인터페론 감마는 거식세포의 도움으로 T 임파구 세포에서 생성된다.
인터페론은 항바이러스 기능, 항암기능, NK (Natural Killer) 세포의 활성화 및 골수세포의 억제 기능에 서로 상승작용을 갖고 있는 것으로 알려져 있다(Klimpel, et al., J. Immunol., 129, 76-78(1982); Fleischmann, W. R., et al., J. Natl. Cancer Inst., 65, 863-966(1980); Weigent., et al., Infec. Immun., 40, 35-38(1980)). 그 후 수많은 연구 결과에서 인터페론이 항바이러스 기능뿐 만 아니라 세포내 유전자의 발현, 구조 그리고 기능의 조절인자로 작용함이 알려졌으며, 직접적인 항증식효과 (Antiproliferative effect) 가 있음이 밝혀졌다. 또한 인터페론들은 여러 가지 바이러스성 질병 등에 효과적으로 작용하며, 여러 가지 암에 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
인터페론 알파는 B 세포 분열인자 (mitogen), 바이러스 또는 암세포 등에 의해 백혈구가 자극 받았을 때 생성되는 것으로 현재까지 20 여종 이상의 인터페론 유전자가 존재함이 밝혀졌고, 이들은 대부분 165 또는 166개의 아미노산으로 구성된 것으로 알려져 있다.
재조합 인간 인터페론 알파를 이용한 임상시험 결과 여러 고형암의 치료에 효과가 있는 것으로 알려졌다. 특히, 방광암, 신장암과 후천성 면역결핍증에 관련된 카포시육종 등에 효과가 있는 것으로 알려졌다 (Torti, F.M., J. Clin. Oncol., 6, 476-483(1988); Vugrin, D., et al., Cancer Treat. Rep., 69, 817-820(1985); Rios, A., et al., J. Clin. Oncol., 3, 506-512(1985)). 또한 최근에는 C형 간염바이러스의 치료에도 효과가 있는 것으로 알려지는 등 (Davis, G. G., et al., N. Engl. J. Med., 321, 1501-1506(1989)) 의약품 치료제로서의 적용 범위가 날로 확대되고 있다.
인터페론 알파와 같은 폴리펩타이드는 일반적으로 안정성이 낮아 쉽게 변성되고 혈액 내 단백질 가수분해효소에 의해 분해되어 신장이나 간을 통해 쉽게 제거되기 때문에, 약리성분으로 폴리펩타이드를 포함하는 단백질 의약품의 혈중 농도 및 역가를 유지하기 위해서는 단백질 약물을 환자에게 자주 투여할 필요가 있다. 그러나, 대부분 주사제 형태로 환자에게 투여되는 단백질 의약품의 경우, 활성 폴리펩타이드의 혈중 농도를 유지하기 위해 자주 주사를 놓는 것은 환자에게 고통을 야기하게 된다.
이러한 문제점을 해결하기 위해, 단백질 약물의 혈중 안정성을 증가시키고 혈중 약물 농도를 오랫동안 높게 지속시켜 약효를 극대화하려는 노력이 계속되어 왔다. 이러한 단백질 약물의 지속성 제제는 단백질 약물의 안정성을 높이는 동시에 약물 자체의 역가가 충분히 높게 유지되어야 하고 환자에게 면역반응을 유발하지 않아야 한다.
단백질을 안정화시키고 프로테아제 접촉 및 신장 손실을 억제하기 위한 방법으로, 종래에는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)과 같이 용해도가 높은 고분자를 단백질 약물 표면에 화학적으로 부가시키는 방법이 사용되어 왔다. PEG는 목적 단백질의 특정 부위 또는 다양한 부위에 비특이적으로 결합하여 용해도를 높임으로써 단백질을 안정화시키고, 단백질의 가수분해를 방지하는 데에 효과가 있으며 특별한 부작용도 일으키지 않는 것으로 알려져 있다(Sada 등, J. Fermentation Bioengineering, 1991, 71:137-139). 그러나, PEG를 결합시키는 경우에 단백질의 안정성은 증가할 수 있지만 생리활성 단백질의 역가가 현저히 낮아지고, PEG의 분자량이 증가할수록 단백질과의 반응성이 낮아져 수율이 감소하는 문제가 있다.
생리활성 단백질의 생체내 안정성을 높이는 또 다른 방법으로서, 유전자 재조합에 의해 혈중 안정성이 높은 단백질 유전자와 생리활성 단백질 유전자를 연결한 후, 상기 재조합 유전자로 형질전환된 동물세포 등을 배양하여 융합 단백질을 생산하는 방법이 개발되어 있다. 예를 들어, 단백질의 안정성 증가에 효과가 높은 것으로 알려져 있는 알부민 또는 그 단편을 유전자 재조합에 의해 목적하는 생리활성 단백질에 결합시켜 생산한 융합 단백질이 보고되어 있다(국제공개공보 WO 93/15199 및 WO 93/15200, 유럽특허공개 EP 413,622).
또한, 면역글로불린을 이용하는 방법으로서, 미국 특허 제5,045,312호는 교차결합체를 이용하여 인간 성장호르몬에 소 혈청 알부민(bovine serum albumin: BSA) 또는 쥐의 면역글로불린을 결합시킴으로써 변형되지 않은 성장호르몬에 비해 성장호르몬의 활성을 증가시킬 수 있음을 개사하고 있다. 그러나, 상기 특허에서는 교차결합체로서 카보디이미드(carbodiimide) 또는 글루타르알데히드(glutaraldehyde)와 같은 저분자량의 화학물질만을 개시하고 있을 뿐이다. 이러한 저분자량의 교차결합체를 사용할 경우 비특이적 결합으로 인해 균질한 조성물을 얻기 어려우며, 생체 내 독성을 갖는 문제가 있다. 또한 상기 특허에서는 성장호르몬의 화학적 커플링에 의해 그 활성을 증가시킬 수 있음을 보여줄 뿐이어서, 다양한 종류의 폴리펩타이드 약물에 대해서는 활성 증가의 효과가 나타날 것인지조차 불명확하여, 지속시간 및 혈중 반감기 증가와 같은 단백질의 안정성과의 관련성에 대해서는 전혀 인식조차 못하고 있다.
최근에 활성 감소 최소화와 안정성 증가를 동시에 이룰 수 있는 지속성 단백질 약물 제제로, 면역글로불린 Fc 영역, 비펩타이드성 중합체 및 생리활성 폴리펩타이드를 결합시켜 제조한 결합체가 한국등록특허 10-0567902(생체내 지속성이 증가된 생리활성 폴리펩타이드 결합체) 및 한국등록특허 10-0725315(면역글로불린단편을 이용한 단백질 결합체 및 그의 제조방법)에 개시되었다.
상기 지속형 인터페론 알파 결합체가 포함된 약물을 제품으로 공급하기 위해서는 저장 운송 과정에서 빛, 열, 또는 첨가제 내 불순물에 의해 유도된 열화에 의한 변성, 응집, 흡착 또는 가수분해 등의 물리화학적인 변화를 억제하면서 생체 내 효력을 유지시키는 것이 필수적이다. 지속형 인터페론 알파는 폴리펩타이드 상의 인터페론 알파에 비해 부피가 커지고, 분자량이 증가하여 안정화하는데 어려움이 있다.
일반적으로, 단백질은 그 반감기가 무척 짧으며 적당하지 않은 온도, 물-공기의 계면에의 노출, 고압, 물리적/기계적 스트레스, 유기용매, 미생물에 의한 오염 등에 노출시, 단량체의 응집, 응집에 의한 침전, 용기 표면에의 흡착 등의 변성 현상을 나타낸다. 변성된 단백질은 원래의 물리화학적 성질 및 생리활성 효과를 소실하게 되는데, 이러한 단백질의 변성 현상은 비가역적이기 때문에, 한번 변성된 단백질은 원래의 특성을 거의 회복할 수 없다. 특히, 인터페론 알파와 같이 1회에 수백 마이크로그램 이하의 미량으로 투여되는 단백질의 경우, 그 안정성이 소실되어 용기 내 표면 흡착 시 그 손실이 상대적으로 더 크다는 문제점이 있다. 또한, 흡착된 단백질은 변성 과정에 의하여 쉽게 응집되며, 이렇게 응집된 변성 단백질은 인체에 투여시, 인체 내에서 자연적으로 생산되는 단백질 자체에 대하여 항체 형성의 원인으로 작용하게 되므로, 단백질이 충분히 안정한 상태가 되도록 투여하여야 한다.
따라서, 용액 중의 단백질의 변성을 막기 위한 여러 가지 방법들이 연구되어 왔다(John Geigert, J.Parenteral Sci. Tech., 43, No5, 220-224, 1989, David Wong, Pharm.Tech. october, 34-48, 1997, Wei Wang., Int.J.Pharm.,185, 129-188, 1999, Willem Norde, Adv.Colloid Interface Sci., 25, 267-340, 1986, Michelle et al., Int.J.Pharm. 120, 179-188, 1995).
그 중 하나의 방법으로서, 일부 단백질 약품은 동결 건조방법으로 안정성 문제를 해결하고 있으나, 동결 건조 제품은 사용할 때 다시 주사용수에 녹여야 하는 불편이 있고, 동결 건조과정이 생산 공정에 포함되어 있어서, 대용량의 동결 건조기를 사용해야만 하는 등 대규모의 투자가 필요하다. 분무 건조기를 사용하여 단백질을 분말화하는 방법도 사용되고 있는데, 이 경우 낮은 수율로 인하여 경제성이 떨어지는 단점이 있고, 고온에 노출되기 때문에 단백질 자체의 안정성에 악영향을 미칠 수도 있다.
이러한 한계를 해결하는 대안으로, 용액 상태인 단백질에 안정화제를 첨가하여 단백질 약물의 물리화학적 변화를 억제하면서 장기간 저장을 통해서도 생체 내 효력을 유지시키는 연구를 수행하였는데, 이러한 안정화제는 구체적으로 탄수화물, 아미노산, 단백질, 계면활성제, 고분자 및 염류 등이 사용되고 있다. 이 중 단백질의 일종인 인간 혈청 알부민은 여러 단백질 약물의 안정화제로서 폭 넓게 사용되고 있으며 그 성능을 입증 받아왔다(Edward Tarelli et al., Biologicals (1998) 26, 331-346).
그러나, 인간 혈청 알부민은 정제 과정에서 미코플라스마, 프리온, 박테리아 및 바이러스 등의 생물학적 오염물에 대한 불활성 공정 또는 하나 이상의 생물학적 오염물 또는 병원체에 대한 생물학적 물질을 스크린 하거나 검사하는 방법들을 포함하고 있지만, 이들이 완전히 제거 또는 불활성 되지 않은 채 환자에게 노출될 위험이 존재한다. 예를 들어, 스크린 공정은 혈액 기증자로부터의 인간 혈액에서 특정 바이러스에 대한 검사를 포함하지만, 이러한 공정은 항상 신뢰할 수 있는 것은 아니며, 특히 매우 적은 수로 존재하는 특정 바이러스를 검출할 수 없다.
또한, 상이한 단백질들은 그들의 화학적 차이점으로 인해 저장기간 동안 상이한 비율 및 상이한 조건하에서 점진적으로 비활성화될 수 있다. 즉, 안정화를 위해 사용되는 물질에 의한 저장기간 연장 효과는 상이한 단백질에 대해서 동등하지 않으며, 이로 인해 저장 안정성을 부여하기 위해 사용되는 안정화제는 목적 단백질의 물리화학적 특성에 따라 사용되는 비율 및 종류가 다양하다. 안정화제들을 병용할 경우 상호 간의 경쟁 작용 및 부작용으로 인하여 목적한 바와 다른 역효과를 가져올 수 있으며, 저장하는 동안 저장 단백질의 본질이 변화하거나 농도가 변화하기 때문에 상이한 효과를 나타낼 수 있다. 단백질을 안정화하는데 적합한 범위의 농도가 존재하므로, 용액중의 단백질을 안정화하기 위해서는 많은 노력과 주의가 필요하다.
특히, 생체내 지속성 및 안정성을 높인 지속형 인터페론 알파 결합체의 경우, 생리활성 펩타이드인 인터페론 알파, 비펩타이드성 중합체 및 면역글로불린 Fc영역이 결합된 형태이므로 분자량 및 부피가 일반적인 인터페론 알파와 확연하게 달라, 단백질을 안정화하기 위한 특별한 조성이 요구된다. 또한, 생리활성 펩타이드인 인터페론 알파와 면역글로불린 Fc영역은 각각 물리 화학적 특성이 다른 펩타이드 또는 단백질이므로, 생리활성 펩타이드인 인터페론 알파와 면역글로불린 Fc영역을 동시에 안정화하여야 한다.
그러나, 상기 설명한 바와 같이, 상이한 펩타이드 또는 단백질들은 그들의 물리 화학적 차이점으로 인해 저장 동안 상이한 비율 및 상이한 조건 하에서 점진적으로 비활성화 될 수 있고, 각각의 펩타이드 또는 단백질에 적합한 안정화제들을 병용하는 경우 상호 간의 경쟁 작용 및 부작용으로 인하여 목적한 바와 다른 역효과를 가져올 수 있다.
따라서, 지속형 인터페론 알파 결합체의 경우 생리활성 펩타이드인 인터페론 알파와 면역글로불린 Fc영역을 동시에 안정화하는 안정화제의 조성을 찾는 것에 많은 어려움이 있었다.
이에, 본 발명자들은 지속형 인터페론 알파를 바이러스 오염의 우려 없이 장기간 동안 효능을 유지시킬 수 있도록 하는 안정한 액상 제제를 제공하기 위하여 연구한 결과, 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제 및 등장화제를 포함하고 알부민은 포함하지 않는 안정화제가 지속형 인터페론 알파 결합체의 안정성을 증대시킴을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 인터페론 알파 및 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 약리학적 유효량의 지속형 인터페론 알파 결합체 및 알부민 비함유 안정화제를 포함하며, 상기 안정화제는 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제 및 등장화제를 포함하는 것인 지속형 인터페론 알파 결합체의 액상 제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 a) 지속형 인터페론 알파 결합체를 제조하는 단계; 및 b) a) 단계에서 제조된 지속형 인터페론 알파 결합체를 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제 및 등장화제를 포함하고 알부민은 포함하지 않는 안정화제와 혼합하는 단계를 포함하는 제1항의 지속형 인터페론 알파 결합체의 액상 제제를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제 및 등장화제를 포함하고 알부민은 포함하지 않는 인터페론 알파 및 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 지속형 인터페론 알파 결합체 안정화용 안정화제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제 및 등장화제를 포함하고 알부민은 포함하지 않는 안정화제를 동시 또는 순차적으로 첨가하여 인터페론 알파 및 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 지속형 인터페론 알파 결합체를 안정화시키는 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명은 하나의 양태로서, 인터페론 알파 및 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 약리학적 유효량의 지속형 인터페론 알파 결합체 및 알부민 비함유 안정화제를 포함하며, 상기 안정화제는 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제 및 등장화제를 포함하는 것인 지속형 인터페론 알파 결합체의 액상 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 또 하나의 양태로서, 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제 및 등장화제를 포함하고 알부민은 포함하지 않는 인터페론 알파 및 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 지속형 인터페론 알파 결합체 안정화용 안정화제를 제공한다.
또한, 본 발명은 또 하나의 양태로서, 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제 및 등장화제를 포함하고 알부민은 포함하지 않는 안정화제를 동시 또는 순차적으로 첨가하여 인터페론 알파 및 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 지속형 인터페론 알파 결합체를 안정화시키는 방법을 제공한다.
상기 "지속형 인터페론 알파 결합체"는 생리활성 펩타이드인 인터페론 알파(interferon α, IFNα)와 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 형태의 단백질로서, 인터페론 알파, 양 말단에 반응기를 갖는 하나 이상의 비펩타이드성 중합체 및 하나 이상의 면역글로불린 Fc 영역을 포함하고, 이들 구성요소가 공유결합으로 상호 연결되어 있는 것을 포함한다.
따라서, 본 발명에서 용어 "지속형"이란 생리활성 지속기간이 천연형 인터페론 알파에 비해 증대된 것을 의미하며, "결합체"란 인터페론 알파와 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체를 통해 공유결합 되는 등의 형태로 연결된 것을 의미한다.
상기 지속형 인터페론 알파 결합체는 단백질 약물의 생리활성 감소를 최소화하고 생체내 지속성을 최대한 증진시키기 위한 단백질 약물의 변형체로 본 발명에서는 면역글로불린 Fc 영역을 결합시킴을 특징으로 한다.
본 발명의 인터페론 알파는 바람직하게는 인간 인터페론 알파일 수 있으며, 천연형 IFNα, 천연형 IFNα 유도체 또는 천연형 IFNα와 유사한 활성을 나타내는 펩타이드일 수 있다. 즉, 본 발명의 인터페론 알파는 천연형 인터페론 알파의 아미노산 서열뿐만 아니라 이의 서열 유도체(mutant)를 포함할 수 있다. 아미노산 서열 유도체란 천연 아미노산 서열중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다.
인터페론 알파는 천연 또는 재조합 기원 중 어떠한 방법으로 제조된 것이나 모두 가능하며, 바람직하게는 대장균을 숙주 세포로 이용하여 제조한 재조합 인간 인터페론 알파(HuIFNα)일 수 있으며, 생물학적 활성에 크게 영향을 미치지 않는 범위에서 아미노산의 치환, 제거, 삽입에 의한 유도체도 포함한다.
본 발명에서 "면역글로불린 Fc 영역"은 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역, 중쇄 불변영역 1(CH1)과 경쇄 불변영역 1(CL1)을 제외한, 중쇄 불변영역 2(CH 2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3)부분을 의미하며, 중쇄 불변영역에 힌지(hinge) 부분을 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형과 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄 불변영역 1(CL1)을 포함한 확장된 Fc 영역일 수 있다. 또한, CH2 및/또는 CH3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 영역일 수 도 있다.
즉, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 1) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인, 2) CH1 도메인 및 CH2 도메인, 3) CH1 도메인 및 CH3 도메인, 4) CH2 도메인 및 CH3 도메인, 5) 1개 또는 2개의 이상의 도메인과 면역글로불린 힌지 영역(또는 힌지 영역의 일부)와의 조합, 6) 중쇄 불변영역 각 도메인과 경쇄 불변영역의 이량체일 수 있다.
또한, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 아미노산 서열뿐만 아니라 이의 서열 유도체(mutant)를 포함한다. 아미노산 서열 유도체란 천연 아미노산 서열중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다. 예를 들면, IgG Fc의 경우 결합에 중요하다고 알려진 214 내지 238, 297 내지 299, 318 내지 322 또는 327 내지 331번 아미노산 잔기들이 변형을 위해 적당한 부위로서 이용될 수 있다.
또한, 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가될 수도 있는 등 다양한 종류의 유도체가 가능하다. 또한, 이펙터 기능을 없애기 위해 보체결합부위, 예로 C1q 결합부위가 제거될 수도 있고, ADCC 부위가 제거될 수도 있다. 이러한 면역글로불린 Fc영역의 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제특허공개 제WO 97/34631호, 국제특허공개 제96/32478호 등에 개시되어 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation), 아밀화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
상기 기술한 Fc 유도체는 본 발명의 Fc 영역과 동일한 생물학적 활성을 나타내나 Fc 영역의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성을 증대시킨 유도체다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 여기서, Fc에서 당쇄가 제거된 면역글로불린 Fc 영역은 보체(c1q)의 결합력이 현저히 저하되고, 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포독성이 감소 또는 제거되므로, 생체내에서 불필요한 면역반응을 유발하지 않는다. 이런 점에서 약물의 캐리어로서의 본래의 목적에 보다 부합하는 형태는 당쇄가 제거되거나 비당쇄화된 면역글로불린 Fc 영역이라 할 것이다.
본 발명에서 "당쇄의 제거(Deglycosylation)"는 효소로 당을 제거한 Fc 영역을 말하며, "비당쇄화(Aglycosylation)"는 원핵동물, 바람직하게는 대장균에서 생산하여 당쇄화되지 않은 Fc 영역을 의미한다.
또한, 본 발명의 면역글로불린 Fc는 인간 면역글로불린 Fc, 그의 밀접하게 관련된 유사체의 서열을 갖는 것, 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물기원일 수 있다. 또한, 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성 (hybrid)에 의한 Fc 영역일 수 있다. 바람직하게는 인간 혈액에 가장 풍부한 IgG 또는 IgM 유래이며 가장 바람직하게는 리간드 결합 단백질의 반감기를 향상시키는 것으로 공지된 IgG 유래이다. 면역글로불린 Fc는 천연 IgG를 특정 단백질 분해 효소로 처리하여 제조할 수 있으며, 재조합 기술을 이용하여 형질 전환된 세포로부터도 제조할 수 있다. 바람직하게는 E.coli에서 제조한 재조합 인간 면역글로불린 IgG 유래의 Fc이다.
한편, IgG 역시 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 서브클래스로 나눌 수 있고 본 발명에서는 이들의 조합 또는 이들의 혼성화도 가능하다. 바람직하게는 IgG2 및 IgG4 서브클래스일 수 있으며, 보다 바람직하게는 보체 의존적 독성(CDC, Complementdependent cytotoxicity)과 같은 이펙터 기능(effector function)이 거의 없는 IgG4의 Fc 영역일 수 있다. 또한, 가장 바람직한 본 발명의 약물의 캐리어용 면역글로불린 Fc 영역은, 인간 IgG4 유래의 비-당쇄화된 Fc 영역일 수 있다.
인간 유래의 Fc 영역은 인간 생체에서 항원으로 작용하여 이에 대한 새로운 항체를 생성하는 등의 바람직하지 않은 면역 반응을 일으킬 수 있는 비-인간 유래의 Fc 영역에 비하여 바람직하다.
본 발명의 지속형 인터페론 알파 결합체는 인터페론 알파와 면역글로불린 Fc 영역을 결합시켜 제조된다. 이용되는 결합 방법으로, 인터페론 알파와 면역글로불린 Fc 영역을 비펩타이드성 중합체를 이용하여 교차 결합시키거나, 재조합기술을 이용하여 인터페론 알파와 면역글로불린 Fc 영역이 연결된 형태의 융합 단백질로 제조할 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용되는 지속형 인터페론 알파 결합체는 대한민국 등록특허 제0725315호에 개시된 방법으로 제조할 수 있다.
교차 결합시 사용되는 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, PLA(폴리락트산, polylactic acid) 및 PLGA(폴리락틱-글리콜산, polylactic-glycolic acid)와 같은 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜이다. 당해 분야에 이미 알려진 이들의 유도체 및 당해 분야의 기술수준에서 용이하게 제조할 수 있는 유도체들도 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 지속형 인터페론 알파 결합체의 액상 제제에는 지속형 인터페론 알파 결합체가 약리학적 유효량으로 포함된다.
용어 "약리학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학/약학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 일반적으로, 인터페론 알파의 약리학적 유효량은 1회용 바이알 (single-use vial) 내에 약 30 내지 200 ㎍ 정도가 함유된 양이다. 본 발명에서 사용되는 지속형 인터페론 알파 결합체의 농도는 0.1 mg/mL 내지 50 mg/mL이고, 바람직하게는 0.1 mg/mL 내지 5.0 mg/mL이다.
상기 생체내 지속성 및 안정성을 높인 지속형 인터페론 알파 결합체의 경우, 인터페론 알파 및 면역글로불린 Fc영역이 결합된 형태이므로 분자량 및 부피가 일반적인 인터페론 알파와 확연하게 달라, 단백질을 안정화하기 위한 특별한 조성이 요구된다. 또한, 생리활성 펩타이드인 인터페론 알파와 면역글로불린 Fc영역은 각각 물리 화학적 특성이 다른 펩타이드 또는 단백질이므로, 생리활성 펩타이드인 인터페론 알파와 면역글로불린 Fc영역을 동시에 안정화하여야 한다.
따라서, 본 발명은 이러한 목적을 위하여 안정화제를 제공하는데, 본 발명에서 "안정화제"는 지속형 인터페론 알파 결합체가 안정하게 저장될 수 있도록 하는 물질을 의미하며, '안정화'는 일정한 시간 동안 특정 저장 조건하에서 활성 성분의 손실이 특정량 미만, 일반적으로 10% 미만임을 의미한다. 보통, 5±3℃에서 2년, 25±2℃에서 6개월 또는 40±2℃에서 1 내지 2주 동안 지속형 인터페론 알파 결합체가 90% 이상, 바람직하게는 약 95% 정도의 잔존율을 유지하는 경우 이러한 제제는 안정한 것으로 이해할 수 있다.
지속형 인터페론 알파 결합체와 같은 단백질에 있어서, 저장 안정성은 정확한 투여량을 보장하기 위해서 뿐만 아니라, 지속형 인터페론 알파 결합체에 대한 항원성 형태 물질의 잠재적인 생성을 억제하기 위해서 중요하다. 저장하는 동안 지속형 인터페론 알파 결합체가 10% 정도의 손실을 나타내는 것은 조성물 내에서 응집체나 단편 등을 야기하여 항원성 화합물로 전환되지 않는 한 실질적인 투여시 허용할 만한 것으로 이해될 수 있다.
본 발명의 상기 안정화제는 지속형 인터페론 알파 결합체에 안정성을 부여하기 위해 완충용액, 당알코올, 등장화제 및 비이온성 계면 활성제를 포함할 수 있고, 바람직하게는 메티오닌을 더 포함할 수 있다.
상기 완충용액은 지속형 인터페론 알파 결합체가 안정해지도록 용액 제형의 pH가 급격히 변화하지 않게 용액의 pH를 유지시키는 역할을 한다. 완충용액은 알칼리 염(나트륨 또는 칼륨 포스페이트 또는 이들의 수소 또는 이수소 염), 나트륨 시트레이트/시트르산, 나트륨 아세테이트/아세트산을 비롯하여 당업계에 공지된 임의의 다른 제약상 허용 가능한 pH 완충제를 포함할 수 있으며, 이들 완충제의 혼합물도 사용될 수 있다.
본 발명의 실시예를 보면 지속형 인터페론 알파 결합체는 완충액의 pH에 따라 안정화되는 정도가 다르며, pH 5.5의 구연산 완충용액 하에서 지속형 인터페론 알파 결합체의 안정성이 증대됨을 알 수 있었다(실시예 2).
완충용액은 바람직하게는 인산 완충용액(Phosphate buffer) 또는 구연산 완충용액(Citrate buffer)일 수 있으며, 보다 바람직하게는 구연산 완충용액일 수 있다.
구연산 완충용액을 구성하는 구연산염의 농도는 바람직하게는 5 mM 내지 100 mM 일 수 있고, 보다 바람직하게는 10 mM 내지 50mM일 수 있다.
완충용액의 pH는 바람직하게는 4.0 내지 7.0, 보다 바람직하게는 5.0 내지 7.0, 더욱 바람직하게는 5.2 내지 7.0, 더욱 더 바람직하게는 5.2 내지 6.0일 수 있다.
상기 당 알코올(sugar alcohol)은 단당류의 유도체로서 당을 접촉 환원시켜 당이 갖고 있는 카보닐(carbonyl)기(=CO)가 수산기(-OH)로 된 것을 의미하는 것으로서 지속형 인터페론 알파 결합체의 안정성을 증대시키는 역할을 한다.
본 발명의 당 알코올의 농도는 바람직하게는 전체 용액 대비 1 내지 10%(w/v), 더욱 바람직하게는 5%(w/v)일 수 있다.
상기 당 알코올은 에리트리톨(Erythritol) 갈락티톨(Galactitol) 아라비톨(Arabitol), 자일리톨(Xylitol), 소르비톨(Sorbitol), 리비톨(Ribitol), 말티톨(Maltitol), 솔비톨(Sorbitol), 락티톨(Lactitol), 만니톨(Mannitol)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 만니톨 및 소르비톨로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 실시예를 보면, 통상적인 완충용액 조건 하에서 안정화 물질로서 만니톨을 첨가하였을 때, 지속형 인터페론 알파 결합체가 안정한 것을 알 수 있었다(실시예 1).
상기 등장화제는 지속형 인터페론 알파 결합체를 용액 상에서 체내에 투여할 때에 삼투압을 적절하게 유지하는 역할을 하며, 지속형 인터페론 알파 결합체를 용액 상에서 더욱 안정화시키는 부수적인 효과도 나타낸다. 그러한 등장화제의 대표적인 예로는 수용성 무기염을 들 수 있으며, 바람직하게는 염화나트륨일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 완충용액, 당알코올 및 비이온성 계면활성제 존재 하에서, 등장화제로서의 염화나트륨을 포함시키는 경우 지속형 인터페론 알파 결합체의 저장 안정성을 증가시키는 결과가 나타났다. 이는 완충용액, 당알코올 및 비이온성 계면활성제와 등장화제로서의 염화나트륨의 동시 사용이 시너지 효과를 나타내어 지속형 인터페론 알파 결합체에 특별한 안정성을 부여한다는 것을 나타낸다.
상기 염화나트륨의 농도는 전체 용액 대비 바람직하게 5 내지 200 mM, 보다 바람직하게는 150 mM 일 수 있으며, 제형에 포함된 성분들의 종류 및 양 등에 따라 각각의 혼합물이 모두 포함된 용액 제형이 등장액이 되도록 적절한 함량으로 조절될 수 있다.
상기 비이온 계면활성제는 단백질 용액의 표면장력을 낮추어 소수성 표면에 단백질이 흡착하거나 응집되는 것을 방지하여 주는 역할을 한다. 본 발명에 사용될 수 있는 비이온 계면활성제의 바람직한 예로는 폴리솔베이트계 비이온 계면활성제 및 폴록사머계 비이온 계면활성제 등을 들 수 있고, 이들의 하나 또는 둘 이상의 조합 형태로 사용될 수 있으며, 그 중에서도 폴리솔베이트계 비이온 계면활성제가 더욱 바람직하다. 폴리솔베이트계 비이온 계면활성제의 예로는 폴리솔베이트 20, 폴리솔베이트 40, 폴리솔베이트 60 및 폴리솔베이트 80 등이 있으며, 그 중에서도 폴리솔베이트 80이 바람직하다.
본 발명의 실시예를 보면, 폴리솔베이트 80을 포함하는 지속형 인터페론 알파 결합체의 액상 제제가 폴록사머 188을 포함하는 액상제제에 비해 유사하거나 약간 안정했으며, 0.005% 폴리솔베이트 80을 포함하는 액상 제제보다 높은 농도인 0.02% 폴리솔베이트 80을 포함하는 지속형 인터페론 알파 결합체의 액상 제제가 안정성에 있어 더 뛰어남이 알 수 있었다(실시예 3).
상기 비이온 계면활성제를 용액 제형에 고농도로 사용하는 것은 고농도의 비이온 계면활성제는 UV-분광법이나 등초점법과 같은 분석법으로 단백질의 농도 측정이나 안정성을 평가할 때에 간섭효과를 유발하여, 단백질의 안정성을 정확하게 평가하기가 어렵기 때문에 적절하지 못하다.
따라서, 본 발명의 용액 제형에는 상기 비이온 계면활성제가 바람직하게는 0.1%(w/v) 이하의 저농도, 보다 바람직하게는 0.001 내지 0.05%(w/v), 보다 더 바람직하게는 0.02%(w/v)로 포함될 수 있다.
본 발명의 안정화제는 메티오닌을 추가로 포함할 수 있다. 상기 메티오닌은 용액 상태에서 단백질의 산화 반응 등에 의해 일어날 수 있는 불순물 생성을 억제시켜 대상 단백질을 더욱 안정화시키는 효과가 있다. 메티오닌의 농도는 바람직하게는 0.05 내지 0.1%(w/v), 보다 바람직하게 전체 용액 대비 0.01 내지 0.1%(w/v)일 수 있다.
본 발명의 실시예를 보면, 메티오닌이 포함되지 않은 액상 제제에서는 산화된 지속형 인터페론 알파 결합체가 증가하였고, 0.01% 메티오닌이 포함된 액상 제제에서는 증가하지 않았으며, 이러한 결과는 메티오닌이 포함된 액상 제제가 지속형 인터페론 알파 결합체의 안정성을 더욱 효과적으로 제공한다는 것을 나타낸다(실시예 5).
본 발명의 상기 안정화제는 알부민을 함유하지 않는 것이 바람직하다. 단백질의 안정화제로 이용될 수 있는 인간 혈청 알부민은 인체의 혈액으로부터 제조되므로, 인간 유래의 병원성 바이러스에 의한 오염 가능성이 존재하며, 젤라틴이나 소 혈청 알부민은 질환을 야기하거나, 또는 일부 환자의 경우에는 알러지 반응을 유발할 가능성이 있다. 따라서, 본 발명의 알부민-비함유 안정화제는 인간 또는 동물 유래의 혈청 알부민 또는 정제된 젤라틴 등의 이종 단백질을 함유하지 않아 바이러스 감염의 우려가 없다.
또한, 본 발명의 안정화제는 당류 또는 다가 알코올을 추가로 포함할 수 있다. 지속형 인터페론 알파 결합체의 저장 안정성을 증대시키기 위해 추가로 포함될 수 있는 당류 및 다가 알코올 중 당류의 바람직한 예로는 만노오스, 글루코오스, 푸코오스 및 크실로오스 등의 단당류와 락토오스, 말토오스, 수크로오즈, 라피노오스 및 덱스트란 등의 다당류 등을 들 수 있고, 다가 알코올의 바람직한 예로는, 프로필렌글리콜 및 저분자량의 폴리에틸렌글리콜, 글리세롤, 저분자량의 폴리프로필렌글리콜 등을 들 수 있으며, 이들의 하나 또는 둘 이상의 조합 형태로 사용될 수 있다.
본 발명의 액상 제제에는 상기 완충용액, 등장화제, 당 알코올, 비이온 계면활성제 및 메티오닌 이외에 본 발명의 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 당업계에 공지되어 있는 기타의 성분 내지 물질들이 선택적으로 더 포함될 수도 있다.
본 발명은 또 하나의 양태로서, a) 지속형 인터페론 알파 결합체를 제조하는 단계; 및 b) a) 단계에서 제조된 지속형 인터페론 알파 결합체를 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제 및 등장화제를 포함하는 안정화제와 혼합하는 단계를 포함하는 지속형 인터페론 알파 결합체의 액상 제제를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 a) 지속형 인터페론 알파 결합체를 제조하는 단계는 인터페론 알파와 면역글로불린 Fc 영역을 비펩타이드성 중합체를 이용하여 교차 결합시키거나, 재조합기술을 이용하여 인터페론 알파와 면역글로불린 Fc 영역이 연결된 형태의 융합 단백질로 제조할 수 있다.
비펩타이드성 중합체를 이용한 인터페론 알파와 면역글로불린 Fc 영역의 교차 결합은 양 말단에 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체, 인터페론 알파 및 면역글로불린 Fc 영역을 반응시켜 이들을 상호 공유결합에 의해 연결시키는 단계; 및 비펩타이드성 중합체의 양 말단에 인터페론 알파 및 면역글로불린 Fc 영역이 각각 공유결합에 의해 연결된 결합체를 분리하는 단계를 포함한다.
상기 세 구성요소의 공유결합은 순차적으로 또는 동시에 일어날 수 있다. 예를 들어, 비펩타이드성 중합체의 양쪽 말단에 각각 인터페론 알파 및 면역글로불린 Fc 영역을 결합시키는 경우에는 인터페론 알파와 면역글로불린 Fc 영역 중 어느 하나를 먼저 비펩타이드성 중합체의 한쪽 말단에 결합시킨 후, 나머지 성분을 비펩타이드성 중합체의 다른 쪽 말단에 결합시키는 방식으로 순차적으로 반응을 진행하는 것이 목적하는 단백질 결합체 외의 부산물 생성을 최소화하는데 유리하다.
상기 a) 단계에서 제조된 지속형 인터페론 알파 결합체를 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제 및 등장화제를 포함하는 안정화제와 혼합하여 본 발명의 지속형 인터페론 알파 결합체의 액상 제제를 제조할 수 있다.
상기 안정화제는 바람직하게는 등장화제로서 염화나트륨을 포함할 수 있으며, 메티오닌, 당류 및 다가알코올로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 성분을 더 포함 할 수 있다.
본 발명에 따른 지속형 인터페론 알파 결합체의 액상 제제는 안정화제로서 인간 혈청 알부민 및 인체에 잠재적으로 유해한 인자를 포함하지 않아 바이러스 감염의 우려가 없고, 인터페론 알파 폴리펩티드 및 면역글로불린 Fc 영역의 결합으로 이루어져 천연형에 비해 분자량이 크고 생리활성 지속기간이 증대된 지속형 인터페론 알파 결합체에 대한 우수한 저장 안정성을 제공하므로 지속형 인터페론 결합체를 안정하게 보존하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 실시예 6을 통해 최종 선택된 pH 5.5의 지속형 인터페론 알파 결합체 액상제제의 4℃ 장기보존 안정성 시험을 통해 6개월간 지속형 인터페론 알파 결합체를 보관하면서 시료의 안정성을 RP-HPLC를 통해 분석한 그래프이다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[제조예 1] 지속형 인터페론 알파 결합체의 제조
<단계 1> 면역글로불린을 이용한 면역글로불린 Fc 영역의 제조
면역글로불린 Fc 영역을 제조하기 위하여, 10 mM 인산염 완충액에 용해된 분자량 150 kDa의 면역글로불린 G(Immunoglobulin G; IgG, 녹십자) 200 ㎎에 단백질 가수분해효소 파파인(Papain, Sigma사)을 2 ㎎ 처리하여 37℃에서 2시간 동안 천천히 교반하면서 반응시켰다. 효소반응 후, 생성된 면역글로불린 Fc 영역을 정제하기 위하여 슈퍼덱스 컬럼, 단백질 A 컬럼 및 양이온 교환수지 컬럼 크로마토그래피를 순차적으로 수행하였다. 구체적으로, 반응액을 10 mM 인산나트륨 완충액(PBS, pH 7.3)으로 평형화시킨 슈퍼덱스 200 컬럼(Superdex 200, Pharmacia사)에 점적하였으며, 동일한 완충액을 이용하여 유속 1 ㎖/분으로 용출시켰다. 면역글로불린 Fc 영역보다 분자량이 상대적으로 큰 미반응 면역글로불린(IgG)과 F(ab')2 등은 앞쪽에서 용출되므로 이를 먼저 제거하였다. 면역글로불린 Fc 영역과 분자량이 유사한 Fab는 다음과 같이 단백질 A 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 제거하였다. 20 mM 인산염 완충액(pH 7.0)으로 평형화시킨 단백질 A 컬럼(Pharmacia사)에 슈퍼덱스 200 컬럼에서 용출된 면역글로불린 Fc 영역 함유 분획을 5 ㎖/분의 유속으로 부하한 후 컬럼에 결합하지 않은 단백질을 제거하기 위해 동일 완충액으로 충분히 세척하였다. 여기에 100 mM 시트르산 나트륨(Na citrate, pH 3.0) 완충액을 흘려주어 순도가 높은 면역글로불린 Fc 영역을 용출시켰다. 단백질 A 컬럼으로 정제된 Fc 분획을 마지막으로 양이온 교환수지 컬럼(polyCAT, PolyLC사)을 사용하여 최종 정제하였는데, 10 mM 아세테이트 완충액(pH 4.5)을 직선 농도구배(염화나트륨 농도 0.15 M → 0.4 M) 방법으로 흘려 고순도의 Fc 분획을 얻었다.
<단계 2> IFNα-PEG 연결체의 제조
양쪽 말단에 알데히드 반응기를 가진 분자량 3.4 kDa의 폴리에틸렌 글리콜인 ALD-PEG-ALD(Shearwater사)를 인간 인터페론 알파-2b(hIFNα-2b, 분자량 20 kDa)가 5 ㎎/㎖ 농도로 용해된 100 mM 인산염 완충액에 IFNα:PEG의 몰비가 1:1, 1:2.5, 1:5, 1:10 및 1:20이 되도록 첨가하였다. 여기에 환원제인 나트륨 시아노 보로하이드라이드(NaCNBH3, Sigma사)를 최종 농도 20 mM이 되도록 첨가하고, 4℃에서 천천히 교반하면서 3시간 동안 반응시켰다. 인터페론 알파의 아미노 말단 부위에 선택적으로 PEG가 연결되고, PEG와 인터페론 알파가 1:1로 결합된 연결체를 얻기 위하여, 상기 반응 혼합물을 가지고 슈퍼덱스(SuperdexR, Pharmacia사) 크기 배제(size exclusion) 크로마토그래피를 실시하였다. 용출액으로 10 mM 칼륨-포스페이트 완충액(pH 6.0)을 사용하여 IFNα-PEG 연결체를 정제하였고, PEG와 결합하지 않은 인터페론 알파, 미반응 PEG 및 2개의 인터페론 알파가 PEG와 연결된 이량체 부산물을 제거하였다. 정제된 IFNα-PEG 연결체를 5 ㎎/㎖ 농도로 농축하였다. 이로부터 반응성이 가장 좋고 이량체 등과 같은 부산물이 적은 IFNα:PEG의 최적 반응 몰비는 1:2.5 내지 1:5임을 확인하였다.
<단계 3> IFNα-PEG-Fc 결합체 형성
상기 단계 2에서 정제된 IFNα-PEG 연결체를 면역글로블린 Fc 영역 N 말단에 결합시키기 위하여, 단계 1에서 준비된 면역글로불린 Fc 영역(약 53 kDa)을 10 mM 인산염 완충액에 용해시킨 후, IFNα-PEG 연결체:Fc의 몰비가 각각 1:1, 1:2, 1:4 및 1:8이 되도록 IFNα-PEG 연결체와 혼합하여 반응시켰다. 반응액을 100 mM 인산염 완충액 상태로 만들었고, 환원제로서 NaCNBH3를 최종 농도가 20 mM이 되도록 첨가한 후 4℃에서 20시간 동안 천천히 교반하면서 반응시켰다. 이로부터 반응성이 가장 좋고 이량체 등과 같은 부산물이 적은 IFNα-PEG 연결체:Fc의 최적 반응 몰비는 1:2임을 확인하였다.
<단계 4> IFNα-PEG-Fc 결합체의 분리 및 정제
상기 단계 3의 결합반응 후 미반응 물질 및 부산물을 제거하고 생성된 IFNα-PEG-Fc 단백질 결합체를 정제하기 위하여 슈퍼덱스 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다. 반응 혼합물을 농축한 후 10 mM 인산염 완충액(pH 7.3)을 이용하여 유속 2.5 ㎖/분으로 컬럼에 통과시켜 결합되지 않은 Fc 및 미반응 물질을 제거하고 IFNα-PEG-Fc 단백질 결합체 분획을 얻었다. 얻어진 IFNα-PEG-Fc 단백질 결합체 분획에는 불순물로서 소량의 미반응 Fc 및 인터페론 알파 이량체가 혼재되어 있기 때문에 이를 제거하기 위해 추가로 양이온 교환수지 크로마토그래피를 수행하였다. IFNα-PEG-Fc 단백질 결합체 분획을 10 mM 아세트산 나트륨(pH 4.5)으로 평형화시킨 PolyCAT LP 컬럼(PolyLC사)에 넣고 1 M 염화나트륨(NaCl)을 포함하는 10 mM 아세트산 나트륨(pH 4.5) 완충액을 직선 농도구배(염화나트륨 농도 0 M → 0.5 M) 방법으로 흘려 추가로 정제하였다. 마지막으로 음이온 교환컬럼을 사용하여 IFNα-PEG-Fc 단백질 결합체를 순수하게 획득하였다.
PolyWAX LP 컬럼(PolyLC사)을 10 mM Tris-HCl(pH 7.5) 완충액으로 평형화시킨 후 정제된 IFNα-PEG-Fc 단백질 결합체 분획을 부하하고 1 M 염화나트륨을 포함하는 10 mM Tris-HCl(pH 7.5) 완충액을 직선 농도구배(염화나트륨 농도 0M → 0.3 M) 방법으로 흘려 순수한 IFNα-PEG-Fc 단백질 결합체를 정제하였다.
[실시예 1] 다양한 안정화제에 따른 지속형 인터페론 알파 결합체의 안정성 평가
본 발명에 따른 안정화제로서 구연산 완충용액 존재 하에 다양한 종류의 물질들, 즉, 당류, 당 알코올, 및 아미노산이 지속형 인터페론 알파 결합체의 안정성에 미치는 영향을 실험하였다.
완충용액은 구연산(나트륨-사이트레이트) 완충제를 이용하였으며(pH 5.5), 당 알코올로서 만니톨, 아미노산으로서 알지닌 또는 글리신을, 당류로서 슈크로스를 이용하였다.
하기의 표 1과 같은 조성을 각각 지속형 인터페론 알파 결합체의 안정화제로 사용하여 40℃에서 1 주일간 보관 후 RP-HPLC 및 SE-HPLC를 이용하여 분석하였다. 표 1의 RP-HPC(%) 및 SE-HPLC(%)는 Area%(/Start Area%)로서 초기 결과 값에 대비한 지속형 인터페론 알파 결합체의 잔존율을 나타낸다.
Figure 112010069118246-pat00001
Figure 112010069118246-pat00002
표 2를 보면, 통상적인 완충용액 조건 하에서 안정화 물질로서 만니톨을 첨가하였을 때, 지속형 인터페론 알파 결합체가 가장 안정한 것으로 나타났다.
[실시예 2] 완충액의 pH에 따른 지속형 인터페론 알파 결합체의 안정성 평가
다양한 pH의 완충용액에서 지속형 인터페론 알파 결합체의 안정성을 비교하였다.
하기의 표 3와 같은 조성을 각각 지속형 인터페론 알파 결합체의 완충용액으로 사용하여 40℃에서 2 주일간 보관 후 역상 크로마토그래피법을 이용해 분석하였다. 안정화제로서 만니톨, 계면 활성제로서 폴리소르베이트 80을 사용하여 40℃에서 2 주일간 보관 후 RP-HPLC 및 SE-HPLC를 이용하여 분석하였다. 표 4의 RP-HPLC(%) 및 SE-HPLC(%)는 초기 결과 값에 대비한 지속형 인터페론 알파 결합체의 잔존율을 나타낸다.
Figure 112010069118246-pat00003
Figure 112010069118246-pat00004
표 3 및 표 4를 보면, pH 5.2일 때 1주 분석시 시료의 침전 발생이 확인되었으며, pH 6.0보다 pH 5.5의 구연산 완충용액 하에서 지속형 인터페론 알파 결합체의 안정성이 증대됨을 확인 하였다.
이를 통해, 지속형 인터페론 알파 결합체는 완충액의 pH에 따라 안정화되는 정도가 다르며, 특정 pH 범위에서 더 큰 안정성을 나타낸다는 것을 알 수 있다.
[실시예 3] 비이온 계면활성제에 따른 지속형 인터페론 알파 결합체의 안정성 평 가
본 발명에 따른 안정화제로서 구연산 완충용액 존재 하에 비이온 계면활성제의 종류 및 농도가 지속형 인터페론 알파 결합체의 안정성에 미치는 영향을 실험하였다.
계면활성제로는 폴리솔베이트 80과 폴록사머 188을 이용하였다. 계면활성제 이외의 안정화제 조성은 상기 실시예 1에서 높은 안정성을 나타내는 만니톨을 사용하였다.
인터페론 알파의 농도는 360 μg/ml, 완충용액은 20mM Na-Citrate, pH5.5을 이용한 동일한 조건에 하기 표 5와 같은 조성을 각각 부가하여 이를 지속형 인터페론 알파 결합체의 안정화제로 사용하여, 25ㅁ 2℃에서 4주일간 보관 후 RP-HPLC 및 SE-HPLC를 이용하여 분석하였다. 표 5의 RP-HPLC (%) 및 SE-HPLC (%)는 초기 결과 값에 대비한 지속형 인터페론 알파 결합체의 잔존율을 나타낸다.
Figure 112010069118246-pat00005
Figure 112010069118246-pat00006
표 5 및 표 6을 보면, SE-HPLC 결과에서는 계면 활성제 종류 및 농도에 따른 지속형 인터페론 알파 결합체의 안정성에 차이가 거의 없었으나, RP-HPLC 결과에서는 폴리솔베이트 80이 폴록사머 188에 비해 유사하거나 약간 안정했다. 또한, 0.005% 폴리솔베이트 80을 포함하는 액상 제제보다 높은 농도인 0.02% 폴리솔베이트 80을 포함하는 지속형 인터페론 알파 결합체의 액상 제제가 안정성에 있어 더 뛰어남이 확인되었다.
[실시예 4] 지속형 인터페론 알파 결합체의 액상 제제와 시판중인 인터페론 알파 약물의 액상 제제에 지속형 인터페론 알파 결합체를 적용한 액상 제제와의 안정성 비교 평가
실시예 1 내지 3의 안정성 실험을 통해 선택한 pH 5.5의 구연산 완충용액과 염화나트륨, 만니톨, 그리고 폴리솔베이트 80으로 이루어진 지속형 인터페론 알파 결합체의 안정성을 확인하기 위해, 시판 중인 인터페론 알파 약물 (INF α2a, Pegasysⓡ) 액상 제제의 안정화제 조성에 지속형 인터페론 알파 결합체를 적용한 액상 제제의 안정성 비교 실험을 진행하였다.
하기 표 7과 같은 조성으로 지속형 인터페론 알파 결합체(액상제제 #1)를 조제하고, 인터페론 알파 약물 (IFN α2a, Pegasysⓡ) 액상 제제의 안정화제 조성에 지속형 인터페론 알파 결합체를 적용한 액상제제(액상제제 #2)를 조제하였다. 그 후, 25±2℃에서 2주간 보관 후 RP-HPLC를 이용하여 분석하였다. 표 8의 RP-HPLC (%)는 초기 결과 값에 대비한 지속형 인터페론 알파 결합체의 잔존율을 나타낸다.
Figure 112010069118246-pat00007
Figure 112010069118246-pat00008
안정성 시험 결과, 시판 중인 인터페론 알파 약물 (IFN α2a, Pegasysⓡ)의 액상 제제의 안정화제 조성을 적용한 지속형 인터페론 알파 결합체 보다 본 발명의 지속형 인터페론 알파 결합체의 액상 제제가 더 안정한 조성임을 확인할 수 있었다.
[ 실시예 5] 메티오닌이 더 포함된 지속형 인터페론 알파 결합체의 액상제제의 안정성 평가
기존 실시예를 통해 선택한 pH 5.5의 구연산 완충용액, 염화나트륨, 만니톨, 그리고 폴리솔베이트 80 외에 산화반응 방지를 위해 메티오닌을 추가한 액상 제제의 가속 안정성을 확인하기 위해 25±2℃에서 4주간 보관한 시료의 안정성을 분석하였다.
하기 표 9와 같은 조성으로 지속형 인터페론 알파 결합체의 액상 제제를 조제하여 분석하였으며. 표 10 및 표 11의 RP-HPLC(%) 및 SE-HPLC(%)는 각 시점의 지속형 인터페론 알파 결합체 및 불순물의 함량을 나타낸다. 표 10은 가속 안정성 시험 (25±2℃)의 RP-HPLC 결과, 표 11은 가속 안정성 시험 (25±2℃)의 SE-HPLC 결과를 나타내고, 불순물 #6이 산화된 지속형 인터페론 알파 결합체이다. 다만, SE-HPLC 는 시료의 분자량을 이용하여 분리하는 방법이고, 산화된 형태와 산화되지 않은 형태는 분자량의 차이가 매우 작기 때문에, SE-HPLC를 통해서는 산화된 형태의 지속형 인터페론 알파 결합체를 분리할 수 없었다.
Figure 112010069118246-pat00009
Figure 112010069118246-pat00010
Figure 112010069118246-pat00011
가속 안정성 시험 결과, 메티오닌이 포함되지 않은 액상 제제에서는 산화된 지속형 인터페론 알파 결합체(RP-HPLC에서의 불순물 #6)가 증가하는 것을 확인하였고, 0.01% 메티오닌이 포함된 액상 제제에서는 증가하지 않는 것을 확인하였다.
이러한 결과는 메티오닌이 포함된 액상 제제가 지속형 인터페론 알파 결합체의 안정성을 더욱 효과적으로 제공한다는 것을 나타낸다.
[실시예 6] 지속형 인터페론 알파 결합체 액상 제제의 장기 보존 안정성 시험
실시예를 통해 최종 선택한 pH 5.5의 구연산 완충용액, 염화나트륨, 만니톨, 폴리솔베이트 80, 그리고 메티오닌으로 이루어진 액상 제제의 장기 보존 안정성을 확인하기 위해 5±3℃에서 6개월 보관한 시료의 안정성을 분석하였다. 그 결과를 도 1 및 표 12에 나타냈으며, RP-HPLC(%), SE-HPLC(%), 단백질 함량(%)은 초기 결과 값에 대비한 잔존율을 나타낸다.
Figure 112010069118246-pat00012
장기 보존 안정성 시험 결과, 지속형 인터페론 알파 결합체는 본 발명의 액상제제에서 6개월 이상 안정하다는 것을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있음을 이해할 수 있다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 제한적인 것이 아닌 것으로 이해하여야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 상세한 설명보다는 후술되는 특허 청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포섭되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (26)

  1. 인터페론 알파(IFNα)-2 및 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 약리학적 유효량의 지속형 인터페론 알파 결합체 및 알부민 비함유 안정화제를 포함하며, 상기 안정화제는 구연산 또는 아세트산 완충용액으로부터 선택되는 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제 및 등장화제를 포함하는 것인 지속형 인터페론 알파 결합체의 액상 제제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 인터페론 알파-2는 천연형 IFNα-2, 또는 재조합 IFNα-2인 것인 지속형 인터페론 알파 결합체의 액상 제제.
  3. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 IgG, IgA, IgD, IgE 또는 IgM에서 유래된 Fc 영역인 지속형 인터페론 알파 결합체의 액상 제제.
  4. 제3항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 각각의 도메인이 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM로 이루어진 군에서 선택되는 면역글로불린에서 유래된 상이한 기원을 가진 도메인의 하이브리드인 지속형 인터페론 알파 결합체의 액상 제제.
  5. 제3항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 동일한 기원의 도메인으로 이루어진 단쇄 면역글로불린으로 구성된 이량체 또는 다량체인 지속형 인터페론 알파 결합체의 액상 제제.
  6. 제3항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 IgG4 Fc 영역인 지속형 인터페론 알파 결합체의 액상 제제.
  7. 제6항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 인간 비당쇄화 IgG4 Fc 영역인 지속형 인터페론 알파 결합체의 액상 제제.
  8. 제1항에 있어서, 상기 지속형 인터페론 알파 결합체는 인터페론 알파-2 및 면역글로불린 Fc 영역이 폴리에틸렌 글리콜 단독 중합체, 폴리프로필렌 글리콜 단독 중합체, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 비펩타이드성 중합체를 통해 공유결합으로 연결된 것인 지속형 인터페론 알파 결합체의 액상 제제.
  9. 삭제
  10. 제1항에 있어서, 상기 당알코올이 만니톨 및 소르비톨로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 것인 지속형 인터페론 알파 결합체 액상 제제.
  11. 제10항에 있어서, 상기 당알코올의 농도가 전체 용액 대비 1 내지 10%(w/v)인 것인 지속형 인터페론 알파 결합체의 액상 제제.
  12. 제1항에 있어서, 상기 완충용액이 구연산 완충용액인 것인 지속형 인터페론 알파 결합체의 액상 제제.
  13. 제12항에 있어서, 상기 완충용액의 pH 범위가 4 내지 7인 것인 지속형 인터페론 알파 결합체의 액상 제제.
  14. 제12항에 있어서, 상기 완충용액의 pH 범위가 5.2 내지 7인 것인 지속형 인터페론 알파 결합체의 액상 제제.
  15. 제1항에 있어서, 상기 등장화제는 염화나트륨인 것인 지속형 인터페론 알파 결합체의 액상 제제.
  16. 제15항에 있어서, 상기 염화나트륨의 농도가 5 내지 200mM인 것인 지속형 인터페론 알파 결합체의 액상 제제.
  17. 제1항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제가 폴리솔베이트 80인 것인 지속형 인터페론 알파 결합체의 액상 제제.
  18. 제17항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제의 농도가 전체 용액 대비 0.001 내지 0.05%(w/v)인 것인 지속형 인터페론 알파 결합체의 액상 제제.
  19. 제1항에 있어서, 상기 안정화제는 메티오닌을 더 포함하는 것인 지속형 인터페론 알파 결합체의 액상 제제.
  20. 제19항에 있어서, 상기 메티오닌의 농도가 전체 용액 대비 0.005 내지 0.1%(w/v)인 것인 지속형 인터페론 알파 결합체의 액상 제제.
  21. 제1항에 있어서, 상기 안정화제는 당류 및 다가알코올로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 성분을 더 포함하는 것인 지속형 인터페론 알파 결합체의 액상 제제.
  22. 인터페론 알파-2 및 면역글로불린 Fc 영역이 폴리에틸렌 글리콜을 통해 연결된 약리학적 유효량의 지속형 인터페론 알파 결합체 및 안정화제를 포함하며, 상기 안정화제는 구연산 완충용액, 만니톨, 폴리솔베이트 80, 염화나트륨 및 메티오닌을 포함하는 것인 지속형 인터페론 알파 결합체의 액상 제제.
  23. a) 인터페론 알파-2 및 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 지속형 인터페론 알파 결합체를 제조하는 단계; 및
    b) a) 단계에서 제조된 지속형 인터페론 알파 결합체를 구연산 또는 아세트산 완충용액으로부터 선택되는 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제 및 등장화제를 포함하고 알부민은 포함하지 않는 안정화제와 혼합하는 단계를 포함하는 제1항의 지속형 인터페론 알파 결합체의 액상 제제를 제조하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 단계 b)의 등장화제는 염화나트륨인 것인 액상 제제를 제조하는 방법.
  25. 구연산 또는 아세트산 완충용액으로부터 선택되는 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제 및 등장화제를 포함하고 알부민은 포함하지 않는, 인터페론 알파-2 및 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 지속형 인터페론 알파 결합체 안정화용 안정화제.
  26. 구연산 또는 아세트산 완충용액으로부터 선택되는 완충용액, 당알코올, 비이온성 계면활성제 및 등장화제를 포함하고 알부민은 포함하지 않는 안정화제를 동시 또는 순차적으로 첨가하여 인터페론 알파-2 및 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 지속형 인터페론 알파 결합체를 안정화시키는 방법.
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