KR101335765B1 - 지속형 에리스로포이에틴 결합체의 액상 제제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 생체 내 지속성 및 안정성이 향상된 지속형 에리스로포이에틴(EPO) 결합체가 장기간 안정하게 유지될 수 있는 액상 제제에 관한 것으로, 본 발명에 따른 액상 제제는 완충용액 및 만니톨을 함유하는 안정화제를 포함하고, 인간 혈청 알부민 및 인체에 잠재적으로 유해한 인자를 포함하지 않아 바이러스 감염의 우려가 없이 우수한 저장 안정성을 나타낸다.

Description

지속형 에리스로포이에틴 결합체의 액상 제제{Liquid formulation for long-acting erythropoietin conjugate}
본 발명은 에리스로포이에틴(Erythropoietin, EPO), 비펩타이드성 중합체 및 면역글로불린 Fc 영역이 결합되어 천연형에 비해 생리활성 지속기간이 증가된 지속형 에리스로포이에틴 결합체가 장기간 안정적으로 유지될 수 있는 지속형 에리스로포이에틴 결합체의 액상 제제에 관한 것이다.
에리스로포이에틴(Erythropoietin, EPO)은 골수에서 적혈구 모세포의 분화를 촉진하여 적혈구를 생성하는 당 단백질로 165개의 아미노산으로 이루어져 있다. 이것은 주로 신장에서 생성되며, 간에서도 소량 생성되는 것으로 알려져 있다. 만성 신부전증(CRF)에서 볼 수 있듯이 신장 기능의 손실은, 예를 들어 전형적으로 EPO 생성의 감소 및 그에 수반하는 적혈구의 감소를 일으킨다. EPO는 만성 신부전증에 의한 빈혈과 다양한 원인에 의한 각종 빈혈의 치료 및 그 외에 외과수술 보조 등 각종 조혈 작용에 탁월한 효과가 있음이 밝혀졌다(Mijake 등, J. Biol. Chem. 25: 5558-5564, 1977;, Eschbach 등, New Engl. J. Med. 316: 73-78, 1987; Sanford B.K, Blood, 177: 419-434, 1991; 국제출원 공개 WO 85-02610호).
인간 비뇨기 EPO는 재생 불량성 빈혈 환자로부터 미야케 등(Miyake 등, J. Biol. Chem., 252: 5558, 1977)에 의해 최초로 정제되었으나, 이 공급원으로부터 얻어진 정제된 EPO 단백질의 양은 치료 용도로 사용하기에는 부족하였다. 인간 EPO를 암호화하는 유전자의 동정 및 클론화, 및 재조합 단백질의 발현은 미국 특허 제4,703,008호에 개시된 이후, 다양한 유전자 조작을 통해 EPO의 대량생산이 가능하게 되었다.
EPO와 같은 폴리펩타이드는 일반적으로 안정성이 낮아 쉽게 변성되고 혈액 내 단백질 가수분해효소에 의해 분해되어 신장이나 간을 통해 쉽게 제거되기 때문에, 약리성분으로 폴리펩타이드를 포함하는 단백질 의약품의 혈중 농도 및 역가를 유지하기 위해서는 단백질 약물을 환자에게 자주 투여할 필요가 있다. 그러나, 대부분 주사제 형태로 환자에게 투여되는 단백질 의약품의 경우, 활성 폴리펩타이드의 혈중 농도를 유지하기 위해 자주 주사를 놓는 것은 환자에게 고통을 야기하게 된다.
이러한 문제점을 해결하기 위해, 단백질 약물의 혈중 안정성을 증가시키고 혈중 약물 농도를 오랫동안 높게 지속시켜 약효를 극대화하려는 노력이 계속되어 왔다. 이러한 단백질 약물의 지속성 제제는 단백질 약물의 안정성을 높이는 동시에 약물 자체의 역가가 충분히 높게 유지되어야 하고 환자에게 면역반응을 유발하지 않아야 한다.
단백질을 안정화시키고 프로테아제 접촉 및 신장 손실을 억제하기 위한 방법으로, 종래에는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)과 같이 용해도가 높은 고분자를 단백질 약물 표면에 화학적으로 부가시키는 방법이 사용되어 왔다. PEG는 목적 단백질의 특정 부위 또는 다양한 부위에 비특이적으로 결합하여 용해도를 높임으로써 단백질을 안정화시키고, 단백질의 가수분해를 방지하는 데에 효과가 있으며 특별한 부작용도 일으키지 않는 것으로 알려져 있다(Sada 등, J. Fermentation Bioengineering, 71: 137-139, 1991). 그러나, PEG를 결합시키는 경우에 단백질의 안정성은 증가할 수 있지만 생리활성 단백질의 역가가 현저히 낮아지고, PEG의 분자량이 증가할수록 단백질과의 반응성이 낮아져 수율이 감소하는 문제가 있다.
생리활성 단백질의 생체 내 안정성을 높이는 또 다른 방법으로서, 유전자 재조합에 의해 혈중 안정성이 높은 단백질 유전자와 생리활성 단백질 유전자를 연결한 후, 상기 재조합 유전자로 형질전환된 동물세포 등을 배양하여 융합 단백질을 생산하는 방법이 개발되어 있다. 예를 들어, 단백질의 안정성 증가에 효과가 높은 것으로 알려져 있는 알부민 또는 그 단편을 유전자 재조합에 의해 목적하는 생리활성 단백질에 결합시켜 생산한 융합 단백질이 보고되어 있다(국제출원 공개 WO 93/15199호 및 WO 93/15200호, 유럽 특허 공개 EP 413,622).
또한, 면역글로불린을 이용하는 방법으로서, 미국 특허 제5,045,312호는 교차결합체를 이용하여 인간 성장호르몬에 소 혈청 알부민(bovine serum albumin: BSA) 또는 쥐의 면역글로불린을 결합시킴으로써 변형되지 않은 성장호르몬에 비해 성장호르몬의 활성을 증가시킬 수 있음을 개시하고 있다. 그러나, 상기 특허에서는 교차결합체로서 카보디이미드(carbodiimide) 또는 글루타르알데히드(glutaraldehyde)와 같은 저분자량의 화학물질만을 개시하고 있을 뿐이다. 이러한 저분자량의 교차결합체를 사용할 경우 비특이적 결합으로 인해 균질한 조성물을 얻기 어려우며, 생체 내 독성을 갖는 문제가 있다. 또한 상기 특허에서는 성장호르몬의 화학적 커플링에 의해 그 활성을 증가시킬 수 있음을 보여줄 뿐이어서, 다양한 종류의 폴리펩타이드 약물에 대해서는 활성 증가의 효과가 나타날 것인지조차 불명확하여, 지속시간 및 혈중 반감기 증가와 같은 단백질의 안정성과의 관련성에 대해서는 전혀 인식조차 못하고 있다.
최근에 활성 감소 최소화와 안정성 증가를 동시에 이룰 수 있는 지속성 단백질 약물 제제로, 면역글로불린 Fc 영역, 비펩타이드성 중합체 및 생리활성 폴리펩타이드를 결합시켜 제조한 결합체가 개시되었다(한국특허 등록 제10-0567902호 및 제10-0725315호).
상기 방법으로 생리활성 폴리펩타이드로서 EPO를 적용시켜 지속형 EPO 결합체를 제조할 수 있는데, 지속형 EPO 결합체가 포함된 약물을 제품으로 공급하기 위해서는 저장 운송 과정에서 빛, 열, 또는 첨가제 내 불순물에 의해 유도된 열화에 의한 변성, 응집, 흡착 또는 가수분해 등의 물리화학적인 변화를 억제하면서 생체 내 효력을 유지시키는 것이 필수적이다. 지속형 EPO 결합체는 폴리펩타이드 상의 EPO에 비해 부피가 커지고, 분자량이 증가하여 안정화하는데 어려움이 있다.
일반적으로, 단백질은 그 반감기가 무척 짧으며 적당하지 않은 온도, 물-공기의 계면에의 노출, 고압, 물리적/기계적 스트레스, 유기용매, 미생물에 의한 오염 등에 노출시, 단량체의 응집, 응집에 의한 침전, 용기 표면에의 흡착 등의 변성 현상을 나타낸다. 변성된 단백질은 원래의 물리화학적 성질 및 생리활성 효과를 소실하게 되는데, 이러한 단백질의 변성 현상은 비가역적이기 때문에, 한번 변성된 단백질은 원래의 특성을 거의 회복할 수 없다. 특히, 에리스로포이에틴과 같이 1회에 수백 마이크로그램 이하의 미량으로 투여되는 단백질의 경우, 그 안정성이 소실되어 용기 내 표면 흡착 시 그 손실이 상대적으로 더 크다는 문제점이 있다. 또한, 흡착된 단백질은 변성 과정에 의하여 쉽게 응집되며, 이렇게 응집된 변성 단백질은 인체에 투여 시, 인체 내에서 자연적으로 생산되는 단백질 자체에 대하여 항체 형성의 원인으로 작용하게 되므로, 단백질이 충분히 안정한 상태가 되도록 투여하여야 한다. 따라서, 용액 중의 단백질의 변성을 막기 위한 여러 가지 방법들이 연구되어 왔다(John Geigert, J. Parenteral Sci. Tech., 43(5): 220-224, 1989; David Wong, Pharm. Tech., 34-48, 1997; Wei Wang., Int. J. Pharm., 185: 129-188, 1999; Willem Norde, Adv. Colloid Interface Sci., 25: 267-340, 1986; Michelle 등, Int. J. Pharm. 120: 179-188, 1995).
일부 단백질 약품은 동결 건조방법으로 안정성 문제를 해결하고 있으나, 동결 건조 제품은 사용할 때 다시 주사용수에 녹여야 하는 불편이 있고, 동결 건조과정이 생산 공정에 포함되어 있어서, 대용량의 동결 건조기를 사용해야만 하는 등 대규모의 투자가 필요하다. 분무 건조기를 사용하여 단백질을 분말화하는 방법도 사용되고 있는데, 이 경우 낮은 수율로 인하여 경제성이 떨어지는 단점이 있고, 고온에 노출되기 때문에 단백질 자체의 안정성에 악영향을 미칠 수도 있다.
이러한 한계를 해결하는 대안으로, 용액 상태인 단백질에 안정화제를 첨가하여 단백질 약물의 물리화학적 변화를 억제하면서 장기간 저장을 통해서도 생체 내 효력을 유지시키는 연구를 수행하였는데, 이러한 안정화제는 구체적으로 탄수화물, 아미노산, 단백질, 계면활성제, 고분자 및 염류 등이 사용되고 있다. 이 중 단백질의 일종인 인간 혈청 알부민은 여러 단백질 약물의 안정화제로서 폭 넓게 사용되고 있으며 그 성능을 입증 받아왔다(Edward Tarelli 등, Biologicals, 26: 331-346, 1998).
그러나, 인간 혈청 알부민은 정제 과정에서 미코플라스마, 프리온, 박테리아 및 바이러스 등의 생물학적 오염물에 대한 불활성 공정 또는 하나 이상의 생물학적 오염물 또는 병원체에 대한 생물학적 물질을 스크린 하거나 검사하는 방법들을 포함하고 있지만, 이들이 완전히 제거 또는 불활성 되지 않은 채 환자에게 노출될 위험이 존재한다. 예를 들어, 스크린 공정은 혈액 기증자로부터의 인간 혈액에서 특정 바이러스에 대한 검사를 포함하지만, 이러한 공정은 항상 신뢰할 수 있는 것은 아니며, 특히 매우 적은 수로 존재하는 특정 바이러스를 검출할 수 없다.
따라서, 이러한 문제점들을 해결하기 위해 최근 들어 인간 혈청 알부민을 대신한 재조합 알부민(한국특허 공개 제10-2004-0111351호)을 이용하거나, 알부민-비함유 에리스로포이에틴 제제(한국특허 등록 제10-0560697호 및 제10-0596610호)를 제시하고 있다.
그러나, 알부민을 함유하지 않는 안정화제를 사용한다고 하더라도, 상이한 단백질들은 그들의 화학적 차이점으로 인해 저장기간 동안 상이한 비율 및 상이한 조건하에서 점진적으로 비활성화될 수 있다. 즉, 안정화를 위해 사용되는 물질에 의한 저장기간 연장 효과는 상이한 단백질에 대해서 동등하지 않으며, 이로 인해 저장 안정성을 부여하기 위해 사용되는 안정화제는 목적 단백질의 물리화학적 특성에 따라 사용되는 비율 및 종류가 다양하다.
또한 안정화제들을 병용할 경우 상호간의 경쟁 및 부작용으로 인하여 목적한 바와 다른 역효과를 가져올 수 있으며, 저장하는 동안 저장 단백질의 본질이 변화하거나 농도가 변화하기 때문에 상이한 효과를 나타낼 수 있다. 단백질을 안정화하는데 적합한 범위의 농도가 존재하므로, 안정화를 위한 안정화제의 종류 및 이들의 적정농도로서의 조합을 위해서는 많은 노력과 주의가 필요하다.
특히, 생체 내 지속성 및 안정성을 높인 지속형 EPO 결합체의 경우, 생리활성 펩타이드인 에리스로포이에틴, 비펩타이드성 중합체 및 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 형태이므로 분자량 및 부피가 일반적인 에리스로포이에틴과 확연하게 달라, EPO의 안정화제와 다른 특별한 조성의 안정화제가 요구된다.
이에 본 발명자들은 EPO를 바이러스 오염의 우려 없이 장기간 동안 효능을 유지시킬 수 있는 지속형 EPO 결합체의 안정한 액상 제제를 개발하기 위해 예의 연구 노력한 결과, 완충용액 및 고농도의 만니톨을 포함하는 안정화제를 이용하여 지속형 EPO 결합체의 안정성을 증대시킴으로써, 경제적이고 안정한 액상 제제를 완성할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 에리스로포이에틴(Erythropoietin, EPO), 비펩타이드성 중합체 및 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 지속형 에리스로포이에틴 결합체, 및 완충용액, 및 만니톨을 포함하는 알부민-비함유 안정화제를 포함하는 지속형 에리스로포이에틴 결합체의 액상 제제를 제공하는 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 에리스로포이에틴(EPO), 비펩타이드성 중합체 및 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 약리학적 유효량의 지속형 에리스로포이에틴 결합체, 및 완충용액, 및 만니톨을 포함하는 알부민-비함유 안정화제를 포함하는 지속형 에리스로포이에틴 결합체의 액상 제제를 제공한다.
본 발명에서 사용된 "지속형 에리스로포이에틴 결합체" 및 "지속형 EPO 결합체"는 생리활성 펩타이드인 에리스로포이에틴(EPO)과 면역글로불린 Fc 영역이 연결된 형태의 단백질로서, 천연형 EPO에 비해 생리활성 지속기간이 증가된 특징을 갖는다.
본 발명의 용어 "지속형"이란 생리활성 지속기간이 천연형에 비해 증대된 것을 의미하는 것이며, "결합체"란 에리스로포이에틴, 비펩타이드성 중합체 및 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 형태를 의미한다.
본 발명에 유용한 EPO는 인간 에리스로포이에틴, 또는 그의 밀접하게 관련된 유사체의 서열을 갖는다. EPO는 천연 또는 재조합 기원 중 어떠한 방법으로 제조된 것이나 모두 가능하며, 생물학적 활성에 크게 영향을 미치지 않는 범위에서 아미노산의 치환, 제거 또는 삽입에 의한 유도체도 가능하다.
본 발명에 유용한 인간 EPO 및 그의 유도체는 포유동물로부터 추출되거나, 화학적으로 합성될 수 있다. 또한, 유전자 재조합 기법을 이용하여 EPO 및 그의 유도체를 코딩하는 DNA로 형질전환된 원핵 또는 진핵생물로부터 수득할 수도 있는데, 숙주로서 대장균(예를 들어, E. coli) 또는 효모(예를 들어, S. cerevisiae) 및 포유동물 세포(예를 들어, 중국 햄스터 난소세포, 원숭이 세포)를 사용할 수 다. 사용한 숙주에 따라, EPO 및 그의 유도체 발현산물은 포유동물 또는 다른 진핵 탄수화물과 당쇄화될 수 있거나, 비-당쇄화될 수 있다. 또한, 원핵생물에서 발현시킬 경우에는 EPO 및 그의 유도체 발현산물은 초기 메티오닌 잔기를 포함(위치 -1)할 수 있다. 바람직하게는 중국 햄스터 난소세포를 숙주세포로 이용하여 제조한 재조합 인간 EPO(HuEPO)이다.
또한, 본 발명에 유용한 면역글로불린 Fc는 인간 면역글로불린 Fc, 그의 밀접하게 관련된 유사체의 서열을 갖는 것으로, 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트 또는 기니아 픽 등의 동물기원일 수 있다. 또한, 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE 또는 IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 하이브리드(hybrid)에 의한 Fc 영역일 수 있다. 바람직하게는 인간 혈액에 가장 풍부한 IgG 또는 IgM 유래이며, 가장 바람직하게는 리간드 결합 단백질의 반감기를 향상시키는 것으로 공지된 IgG 유래이다. 면역글로불린 Fc는 천연 IgG를 특정 단백질 분해 효소로 처리하여 제조할 수 있으며, 재조합 기술을 이용하여 형질 전환된 세포로부터도 제조할 수 있다. 바람직하게는 대장균(E. coli) 형질전환체로부터 제조한 재조합 인간 면역글로불린 Fc이다.
한편, IgG 역시 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 서브클래스로 나눌 수 있고, 본 발명에서는 이들의 조합 또는 이들의 하이브리드도 가능하다. 바람직하게는 IgG2 및 IgG4 서브클래스이며, 가장 바람직하게는 보체 의존적 독성(CDC, Complementdependent cytotoxicity)과 같은 이펙터 기능(effector function)이 거의 없는 IgG4의 Fc 영역이다. 즉, 가장 바람직한 본 발명의 약물의 캐리어용 면역글로불린 Fc 영역은, 인간 IgG4 유래의 비-당쇄화된 Fc 영역이다. 인간 유래의 Fc 영역은 인간 생체에서 항원으로 작용하여 이에 대한 새로운 항체를 생성하는 등의 바람직하지 않은 면역 반응을 일으킬 수 있는 비-인간 유래의 Fc 영역에 비하여 바람직하다.
본 발명에서 사용되는 지속형 EPO 결합체는 상기된 방법으로 제조한 EPO와 면역글로불린 Fc 영역을 결합시켜 제조한다. 이때 이용되는 결합 방법으로, EPO와 면역글로불린 Fc 영역을 비펩타이드성 중합체를 이용하여 교차 결합시키거나, 재조합 기술을 이용하여 EPO와 면역글로불린 Fc 영역이 연결된 형태의 융합 단백질로 제조할 수 있다.
교차 결합 시 사용되는 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, PLA(폴리락트산, polylactic acid) 및 PLGA(폴리락틱-글리콜산, polylactic-glycolic acid)와 같은 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜이다. 당해 분야에 이미 알려진 이들의 유도체 및 당해 분야의 기술 수준에서 용이하게 제조할 수 있는 유도체들도 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명에서 사용되는 지속형 EPO 결합체는 한국특허 등록 제10-0725315호 의 기재에 따라 유전공학적으로 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 지속형 EPO 결합체의 액상 제제는 치료학적 유효량의 지속형 EPO 결합체를 포함한다. 일반적으로, EPO의 치료학적 유효량은 1회용 바이알(single-use vial) 내에 약 2000 내지 10000 국제단위(international unit, IU) 정도가 함유된 양이다. 본 발명에서 사용되는 지속형 EPO 결합체의 농도는 1 내지 5000 μg/ml이고, 바람직하게는 50 내지 3000 μg/ml이다.
본 발명의 용어 "안정화제"는 지속형 EPO 결합체가 안정하게 저장될 수 있도록 하는 물질을 의미하는데, "안정화"는 일정한 시간 동안 특정 저장 조건 하에서 활성 성분의 손실이 특정량 미만, 일반적으로 10% 미만임을 의미한다. 보통, 10℃에서 2년, 25℃에서 6개월 또는 40℃에서 1 내지 2주간 EPO가 90% 이상, 바람직하게는 약 95% 정도의 잔존율을 유지하는 경우, 이러한 제제는 안정한 것으로 이해된다. EPO와 같은 단백질에 있어서, 저장 안정성은 정확한 투여량을 보장하기 위해서뿐만 아니라, EPO에 대한 항원성 형태 물질의 잠재적인 생성을 억제하기 위해서 중요하다. 저장기간 동안 EPO가 10% 정도의 손실을 나타내는 것은 조성물 내에서 응집체나 단편 등을 야기하여 항원성 화합물로 전환되지 않는 한 실질적인 투여 시 허용할 만한 것으로 이해될 수 있다.
본 발명에 적합한 안정화제는 지속형 EPO 결합체에 안정성을 부여하기 위해 고안된 특이적인 조성의 완충용액 및 만니톨을 함유한다.
또한, 본 발명에 적합한 안정화제는 알부민을 함유하지 않는 것이 바람직하다. 단백질의 안정화제로 이용될 수 있는 인간 혈청 알부민은 인체의 혈액으로부터 제조되므로, 인간 유래의 병원성 바이러스에 의한 오염 가능성이 존재하며, 젤라틴이나 소 혈청 알부민은 질환을 야기하거나, 일부 환자의 경우에는 알러지 반응을 유발할 가능성이 있다. 본 발명의 알부민-비함유 안정화제는 인간 또는 동물 유래의 혈청 알부민 또는 정제된 젤라틴 등의 이종 단백질을 함유하지 않아 바이러스 감염의 우려가 없다.
상기 안정화제에 포함되는 만니톨은 당 알코올의 일종으로 지속형 EPO 결합체의 안정성을 증대시키는 역할을 하는데, 본 발명에 사용되는 만니톨의 농도는 바람직하게는 전체 용액 대비 1 내지 20 %(w/v), 더욱 바람직하게는 3 내지 12 %(w/v), 가장 바람직하게는 5 내지 10 %(w/v)이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 인산 완충용액 존재 하에서 안정화제로 만니톨을 포함하는 경우, 액상 제제의 안정화제로 알려진 소르비톨, 당류인 말토오스, 다가 알코올인 PEG400, 및 아미노산을 안정화제로 사용한 경우보다 지속형 EPO 결합체의 저장 안정성을 증가시키는 결과가 확인되었다(표 1 참고). 또한, 일본특허 공개 제2009-249292호에서 EPO의 안정화제로 사용하고 있는 말토오스를 본 발명의 지속형 EPO 결합체의 안정화제로 사용한 결과, 보관 기간이 길어질수록 말토오스는 지속형 EPO 결합체의 안정성을 감소시키는 것으로 나타났다(표 8 참고).
이는 만니톨이 다른 안정화 물질에 비해 지속형 EPO 결합체에 특별한 안정성을 부여함을 나타내며, 안정화 대상에 따라 사용되는 안정화제도 다르게 적용되어야 함을 나타내는 것이다.
상기 안정화제에 포함되는 완충용액은 액상 제제의 pH가 급격히 변화하지 않게 용액의 pH를 유지시켜 지속형 EPO 결합체를 안정화시키는 역할을 한다. 완충용액은 알칼리 염(나트륨 또는 칼륨 포스페이트 또는 이들의 수소 또는 이수소 염), 구연산나트륨/시트르산, 나트륨 아세테이트/아세트산을 비롯하여 당업계에 공지된 임의의 다른 제약상 허용 가능한 pH 완충제를 포함할 수 있으며, 이들 완충제의 혼합물도 사용될 수 있다. 본 발명에 적합한 완충용액으로는 구연산, 인산, 주석산, 탄산, 석신산, 젖산, 아세트산 완충용액 등을 예로 들 수 있으며, 이들 중 인산 완충용액(phosphate buffer) 및 구연산 완충용액(citrate buffer)이 바람직하고, 인산 완충용액이 특히 바람직하다. 인산 완충용액을 구성하는 인산염의 농도는 바람직하게는 5 내지 100 mM 이고, 더욱 바람직하게는 10 내지 50 mM이다. 완충용액의 pH는 바람직하게는 4.0 내지 8.0, 더욱 바람직하게는 5.0 내지 7.0이다.
또 다른 양태로서, 본 발명에 적합한 안정화제는 완충용액 및 만니톨 이외에 등장화제, 다가 알코올, 당류, 비이온성 계면활성제 및 중성 아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 성분을 추가로 포함할 수 있다.
등장화제는 지속형 EPO 결합체를 용액 상에서 체내에 투여할 때 삼투압을 적절하게 유지하는 역할을 하며, 지속형 EPO 결합체를 용액 상에서 더욱 안정화시키는 부수적인 효과도 나타낸다. 그러한 등장화제로는 수용성 무기염을 예로 들 수 있으며, 바람직하게는 염화나트륨, 황산나트륨, 구연산나트륨, 염화칼슘 등이 사용될 수 있다. 이들은 하나 또는 둘 이상의 조합 형태로 사용될 수 있으며, 가장 바람직하게는 염화나트륨이 사용될 수 있다.
등장화제의 농도는 바람직하게는 5 내지 200 mM이며, 제형에 포함된 성분들의 종류 및 양 등에 따라 각각의 혼합물이 모두 포함된 액상 제제가 등장액이 되도록 적절한 함량으로 조절될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 완충용액 존재 하에 다양한 종류의 염이 지속형 EPO 결합체의 안정성에 미치는 영향을 조사한 결과, 인산 완충용액 조건 하에서, 염을 첨가하지 않은 대조군에 비해 황산나트륨, 염화나트륨, 구연산나트륨을 각각 첨가하거나, 또는 황산나트륨 및 염화나트륨을 함께 첨가한 액상 제제에서 지속형 EPO 결합체의 안정성이 증대된 것으로 나타났다(표 2 참고). 상기 결과로부터, 본 발명에 따른 지속형 EPO 결합체는 염의 종류에 따라 안정화되는 정도가 다르며, 특정한 염에 대해 더 큰 안정성을 나타내는 것을 알 수 있다.
또한, 지속형 EPO 결합체의 저장 안정성을 증대시키기 위해 추가로 포함될 수 있는 당류의 바람직한 예로는 만노오스, 글루코오스, 푸코오스 및 크실로오스 등의 단당류와 락토오스, 말토오스, 수크로오스, 라피노오스 및 덱스트란 등의 다당류 등을 들 수 있고, 상기 당류의 농도는 전체 용액 대비 1 내지 20 %(w/v)가 바람직하며, 더 바람직하게는 5 내지 20 %(w/v)이다. 또한, 다가 알코올의 바람직한 예로는 프로필렌글리콜, 저분자량의 폴리에틸렌글리콜, 글리세롤, 저분자량의 폴리프로필렌글리콜 등을 들 수 있으며, 이들의 하나 또는 둘 이상의 조합 형태로 사용할 수 있다. 상기 다가 알코올의 농도는 전체 용액 대비 1 내지 15 %(w/v)가 바람직하며, 더 바람직하게는 5 내지 15 %(w/v)이다.
비이온성 계면활성제는 단백질 용액의 표면장력을 낮추어 소수성 표면에 단백질이 흡착하거나 응집되는 것을 방지하여 준다. 본 발명에 적합한 비이온성 계면활성제의 바람직한 예로는 폴리소르베이트계 비이온성 계면활성제 및 폴록사머계 비이온성 계면활성제를 들 수 있고, 이들의 하나 또는 둘 이상의 조합 형태로 사용될 수 있으며, 그 중에서도 폴리소르베이트계 비이온성 계면활성제가 더욱 바람직하다. 폴리소르베이트계 비이온성 계면활성제의 예로는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60 및 폴리소르베이트 80이 있으며, 그 중에서도 폴리소르베이트 80이 바람직하다.
상기 비이온성 계면활성제를 액상 제제에 고농도로 사용하는 것은 적절하지 않은데, 고농도의 비이온성 계면활성제는 UV-분광법이나 등초점법과 같은 분석법으로 단백질의 농도 측정이나 안정성을 평가할 때에 간섭효과를 유발하여, 단백질의 안정성을 정확하게 평가하기가 어렵기 때문이다. 따라서, 본 발명의 액상 제제에는 상기 비이온성 계면활성제가 바람직하게는 0.1 %(w/v) 이하의 저농도, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 0.05 %(w/v)로 포함된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 안정화제로서 인산 완충용액 존재 하에 비이온성 계면활성제가 지속형 EPO 결합체의 안정성에 미치는 영향을 조사한 결과, 비이온성 계면활성제가 1주일간의 짧은 저장기간 동안에는 본 발명에 따른 지속형 EPO 결합체의 안정성에 별다른 영향을 미치지 않음을 확인하였다(표 3 참고). 또한, 비이온성 계면활성제로 폴리소르베이트 80을 사용하는 경우, 본 발명에 따른 지속형 EPO 결합체의 안정성은 0.1% 폴리소르베이트 80 보다는 0.01%의 폴리소르베이트 80을 포함하는 안정화제 조성에서 더 높은 저장 안정성을 유지하였다(표 4 참고).
상기 액상 제제의 안정화제로서 아미노산은 용액 상태에서 에리스로포이에틴 주위에 더 많은 물 분자가 존재하도록 하여 에리스로포이에틴을 구성하는 아미노산들 중 최외곽에 존재하는 친수성 아미노산을 더욱 안정화시켜 EPO가 안정화되도록 하는 효과가 있다(Wang, Int. J. Pharm. 185: 129-188, 1999). 이때, 전하를 가진 아미노산은 EPO와의 정전기적 결합으로 인해 EPO의 응집을 촉진할 수 있으므로, 일반적으로 글리신, 알라닌, 류신 및 이소류신 등의 중성 아미노산을 안정화제로 첨가하여 사용한다. 중성 아미노산의 농도는 바람직하게 전체 용액 대비 0.1 내지 10 %(w/v)이다.
본 발명의 일 실시예에서는, 안정화제로서 말토오스를 단독으로 사용한 경우보다 말토오스와 함께 글리신을 처리한 경우에 지속형 EPO 결합체의 저장 안정성이 증대되지만, 만니톨을 3 내지 12 %(w/v)의 고농도로 처리한 경우에는 중성 아미노산을 첨가하지 않아도 말토오스와 글리신을 함께 처리한 군보다 안정성이 더 높음을 확인하였다(표 10 참고).
따라서 본 발명은 만니톨을 고농도로 처리함으로써 중성 아미노산의 첨가 없이도 지속형 EPO 결합체의 높은 안정성을 부여하는 액상 제제를 제공할 수 있다. 그러나, 20 %(w/v) 이상의 고농도 만니톨을 사용하게 되면 등장범위를 벗어날 수 있으므로, 만니톨은 전체 용액 대비 1 내지 20 %(w/v), 바람직하게는 3 내지 12 %(w/v), 더욱 바람직하게는 5 내지 10 %(w/v)로 사용한다.
본 발명의 액상 제제에는 상기 설명한 완충용액, 등장화제, 당 알코올, 중성 아미노산 및 비이온성 계면활성제 이외에, 본 발명의 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 당업계에 공지되어 있는 기타의 성분 내지 물질들이 선택적으로 더 포함될 수도 있다.
발명의 바람직한 일 양태에서, 본 발명에 따른 지속형 EPO 결합체의 액상 제제는 알부민을 함유하지 않으며, 완충용액, 만니톨, 등장화제 및 비이온성 계면활성제를 포함하는 조성을 가질 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명은 인산 또는 구연산 완충용액, 만니톨, 염화나트륨, 황산나트륨 및 구연산나트륨으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 등장화제, 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 지속형 EPO 결합체의 액상 제제를 제공한다. 바람직하게는, 상기 액상 제제는 5 내지 100 mM의 인산 또는 구연산 완충용액, 1 내지 20 %(w/v)의 만니톨, 5 내지 200 mM의 염화나트륨, 황산나트륨 및 구연산나트륨으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 등장화제, 및 0.001 내지 0.05 %(w/v)의 폴리소르베이트 80을 함유할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 액상 제제는 5 내지 100 mM의 인산 완충용액, 3 내지 12 %(w/v)의 만니톨, 100 내지 200 mM의 염화나트륨, 및 0.001 내지 0.05 %(w/v)의 폴리소르베이트 80을 함유할 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 액상 제제는 10 mM의 나트륨-인산 완충용액(pH 6.5), 5 내지 10 %(w/v)의 만니톨, 100 내지 200 mM의 염화나트륨, 및 0.001 내지 0.05 %(w/v)의 폴리소르베이트 80을 함유할 수 있으며, 이때 중성 아미노산을 포함하지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 10 mM의 나트륨-인산 완충용액(pH 6.5), 5 내지 10 %(w/v)의 만니톨, 100 내지 200 mM의 염화나트륨, 및 0.001 내지0.05 %(w/v)의 폴리소르베이트 80을 함유하는 지속형 EPO 결합체의 액상 제제의 저장 안정성을 공지의 EPO 액상 제제인 로슈사의 레코몬(Recormon)과 비교하였다. 그 결과, 본 발명의 지속형 EPO 액상 제제가 다양한 종류의 중성 아미노산을 포함하고 있는 레코몬보다 더 안정함을 확인하였다(표 6 및 14 참고).
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기한 조성의 지속형 EPO 결합체의 액상 제제의 저장 안정성을 현재 빈혈 치료제로 사용되고 있는 암젠사의 아라네스프(Aranesp) 제형, 류마티스 관절염 치료제로 사용되고 있는 암젠사의 엔브렐(Enbrel, TNFR-Fc)의 제형, 및 PBS만이 함유된 제형과 비교한 결과, 다른 제형보다 본 발명의 지속형 EPO 결합체의 액상 제제가 가장 높은 안정성을 나타냄을 확인하였다(표 17 참고).
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명의 지속형 EPO 결합체의 액상 제제의 장기 보존 안정성 시험 결과, 지속형 EPO 결합체가 최종 액상 제제에서 12개월 동안 변함없이 안정하며, 가속 조건에서 6개월 동안 보관하여도 92.5% 이상 잔존함을 확인하였다(표 19 내지 21 참고).
상기 결과로부터, 본 발명의 전체 용액 대비 1 내지 20 %(w/v)의 고농도 만니톨 및 완충용액을 포함하는 액상 제제는 중성 아미노산의 첨가 없이도 지속형 EPO 결합체가 12개월 이상 안정하게 저장될 수 있음을 알 수 있다.
본 발명에 따른 지속형 에리스로포이에틴 결합체의 액상 제제는 완충용액 및 만니톨을 함유하는 안정화제를 포함하고, 인간 혈청 알부민 및 인체에 잠재적으로 유해한 인자를 포함하지 않아 바이러스 감염의 우려가 없으며, EPO와 면역글로불린 Fc 영역의 결합으로 이루어져 천연형에 비해 분자량이 크고 생리활성 지속기간이 증대된 지속형 EPO 결합체에 대해 우수한 저장 안정성을 제공한다. 또한, 중성 아미노산을 첨가하지 않은 간단한 제형으로도 우수한 저장 안정성을 나타내므로 다른 안정화제나 동결 건조 제제에 비해 경제적인 제공이 가능하다.
도 1은 안정화제의 조성을 달리한 지속형 EPO 결합체의 액상 제제와 EPO 액상 제제인 레코몬(Recormon)을 40℃에서 4주간 보관하면서 일주일 간격으로 EPO의 안정성을 역상 크로마토그래피를 통해 분석한 그래프이다.
도 2는 pH 6.5의 인산 완충용액, 염화나트륨, 만니톨 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 지속형 EPO 결합체의 액상 제제를 4℃에서 12개월간 보관하면서 2개월 간격으로 지속형 EPO 결합체의 안정성을 역상 크로마토그로피 및 크기 배제 크로마토그래피를 통해 분석한 그래프이다.
도 3은 pH 6.5의 인산 완충용액, 염화나트륨, 만니톨 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 지속형 EPO 결합체의 액상 제제를 4℃에서 12개월간 보관하면서 2개월 간격으로 지속형 EPO 결합체의 안정성을 시험관 내(in vitro)에서 확인한 결과이다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 좀 더 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 지속형 EPO 결합체의 제조
<1-1> 면역글로불린을 이용한 면역글로불린 Fc 영역의 제조
본 실시예에 사용된 면역글로불린 Fc 영역은 인간 비당쇄화 IgG4 Fc 영역으로, 대한민국 특허등록 제725314호에 기재된 방법에 따라 대장균 형질전환체로부터 발현시켜 정제하였다.
<1-2> 재조합 인간 에리스로포이에틴 (EPO)의 제조
본 실시예에 사용된 인간 에리스로포이에틴은 디하이드로폴레이트 환원효소(Dihyrofolate redutase)의 전사조절 부위인 프로모터를 인위적으로 약화시켜 유전자의 증폭 효율을 크게 개선시킬 수 있는 벡터를 이용하여 형질전환된 동물 세포주를 제작한 것으로, 대한민국 특허등록 제 880509호에 기재된 방법에 따라 재조합 동물세포주에서 단백질을 발현시키고 발현된 단백질 중에서 고당쇄화형만을 정제하였다.
<1-3> 면역글로불린 Fc 영역을 이용한 지속형 EPO 결합체 제조
본 실시예에 사용된 지속형 EPO 결합체는 위 인간 에리스로포이에틴과 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체에 의해 상호 공유 결합된 형태로, 대한민국 특허등록 제725315호 및 제775343호에 기재된 방법에 따라 제조, 정제하였다.
실시예 2: 다양한 안정화제에 따른 지속형 EPO 결합체의 안정성 평가
본 발명에 따른 안정화제로서 인산 완충용액 존재 하에 다양한 종류의 물질들, 즉, 당류, 당 알코올, 다가 알코올 및 아미노산이 지속형 EPO 결합체의 안정성에 미치는 영향을 실험하였다.
완충용액은 인산나트륨(Na-phosphate) 완충제를 이용하였으며(pH 6.5), 당 알코올로서 만니톨(mannitol) 또는 소르비톨(sorbitol), 아미노산으로서 히스티딘(histidine) 또는 메티오닌(methionine)을, 당류로서 말토오스(maltose)를, 다가 알코올로서 PEG 400을 이용하여 상기 각 물질의 지속형 EPO 결합체의 안정성에 대해 미치는 영향을 알아보았다.
하기의 표 1과 같은 조성을 각각 지속형 EPO 결합체의 안정화제로 사용하여 40℃에서 1주일간 보관 후 역상 크로마토그래피법(reverse phase chromatography, RPC)을 이용해 분석하였다. 결과를 하기 표 1에 나타내었으며, 표 1의 RPC(%)는 (면적%/출발 면적%)로서 초기 결과 값에 대비한 지속형 EPO 결합체의 잔존율을 나타낸다.
번호 EPO 완충용액 안정화 물질 RPC(%)
1 200 ㎍/㎖ 10mM Na-Phosphate, pH 6.5 1% Mannitol 95.2
2 200 ㎍/㎖ 10mM Na-Phosphate, pH 6.5 1mM Histidine 86.2
3 200 ㎍/㎖ 10mM Na-Phosphate, pH 6.5 1mM Methionine 76.1
4 200 ㎍/㎖ 10mM Na-Phosphate, pH 6.5 10% Maltose 93.5
5 200 ㎍/㎖ 10mM Na-Phosphate, pH 6.5 1% PEG 400 92.8
6 200 ㎍/㎖ 10mM Na-Phosphate, pH 6.5 1% Sorbitol 92.7
표 1에 나타난 바와 같이, 통상적인 완충용액 조건 하에서, 안정화 물질로서 만니톨을 첨가하였을 때 지속형 EPO 결합체가 가장 안정하게 유지되는 것으로 나타났다.
실시예 3: 염의 종류에 따른 지속형 EPO 결합체의 안정성 평가
완충용액 존재 하에 다양한 종류의 염이 지속형 EPO 결합체의 안정성에 미치는 영향을 조사하기 위해 하기 실험을 수행하였다. 알칼리염, 무기염 등의 다양한 종류의 염은 pH 완충제로서 완충용액에 부가적인 pH 안정성을 부여하거나, 등장화제로서 삼투압을 적절히 유지시키는 역할을 한다.
이에 하기 표 2와 같은 조성을 각각 지속형 EPO 결합체의 안정화제로 사용하여 40℃에서 1주일간 보관 후 역상 크로마토그래피법을 이용해 분석하였다. 완충용액은 인산나트륨 완충제(pH 6.5)를 이용하였으며, 염으로는 염화구리(Ⅱ), 황산나트륨, 염화나트륨, 구연산나트륨 및 탄산나트륨을 이용하였다. 결과를 하기 표 2에 나타내었으며, 표 2의 RP-HPLC(%)는 초기 결과 값에 대비한 지속형 EPO 결합체의 잔존율을 나타낸다.
번호 EPO 완충용액 염 RP-HPLC (%)
1 200 ㎍/㎖ 10mM Na-Phosphate, pH 6.5 - 94.6
2 200 ㎍/㎖ 10mM Na-Phosphate, pH 6.5 30mM CuCl2 81.6
3 200 ㎍/㎖ 10mM Na-Phosphate, pH 6.5 40mM Na2SO4 98.1
4 200 ㎍/㎖ 10mM Na-Phosphate, pH 6.5 200mM NaCl 97.0
5 200 ㎍/㎖ 10mM Na-Phosphate, pH 6.5 10mM Na-Citrate 97.5
6 200 ㎍/㎖ 10mM Na-Phosphate, pH 6.5 10mM Na2CO3 83.2
7 200 ㎍/㎖ 10mM Na-Phosphate, pH 6.5 20mM Na2SO4 /
100mM NaCl		 97.7
표 2에 나타난 바와 같이, 인산 완충용액 조건 하에서, 염을 첨가하지 않은 대조군에 비해 황산나트륨, 염화나트륨, 구연산나트륨을 각각 첨가하거나, 또는 황산나트륨 및 염화나트륨을 함께 첨가한 액상 제제에서 지속형 EPO 결합체의 안정성이 증대된 것으로 나타났다. 그러나 염화구리(Ⅱ)를 첨가한 경우에는 오히려 대조군에 비해 지속형 EPO 결합체의 안정성이 저하되는 것을 확인하였다.
이를 통해, 지속형 EPO 결합체는 염의 종류에 따라 안정화되는 정도가 다르며, 특정한 염에 대해 더 큰 안정성을 나타내는 것을 알 수 있다.
실시예 4: 비이온성 계면활성제에 따른 지속형 EPO 결합체의 안정성 평가
본 발명에 따른 안정화제로서 인산 완충용액 존재 하에 비이온성 계면활성제가 지속형 EPO 결합체의 안정성에 미치는 영향을 조사하기 위해 하기 실험을 수행하였다.
계면활성제로는 폴리소르베이트계 비이온성 계면활성제의 하나인 폴리소르베이트 80을 이용하였다. 계면활성제 이외의 안정화제 조성은 상기 실시예 2 및 3에서 지속형 EPO 결합체에 안정성을 부여하는 것으로 나타난 염과 당알코올 및 당류 등을 적절히 조합하였다.
염은 상기 실시예 3에서 EPO의 안정성을 증가시키는 것으로 확인된 염화나트륨, 황산나트륨 및 구연산나트륨 중 염화나트륨을 사용하였고, 다른 안정화 물질로는 상기 실시예 1에서 가장 높은 안정성을 나타낸 것으로 확인된 만니톨을 사용하였다. EPO의 농도를 200 μg/ml로, 완충용액으로 10 mM 인산나트륨(pH 6.5)을 사용하는 동일한 조건 하에서 하기 표 3과 같은 조성을 각각 지속형 EPO 결합체의 안정화제로 사용하여 40℃에서 1주일간 보관 후 역상 크로마토그래피법을 이용해 분석하였다. 결과를 하기 표 3에 나타내었으며, 표 3의 RP-HPLC(%)는 초기 결과 값에 대비한 지속형 EPO 결합체의 잔존율을 나타낸다.
번호 계면활성제 염 안정화제 RP-HPLC (%)
1 - 100mM NaCl 10% Mannitol 96.5
2 0.005% polysorbate 80 100mM NaCl 10% Mannitol 97.8
표 3에 나타난 바와 같이, 인산 완충용액 조건 하에서, 비이온성 계면활성제의 유무는 EPO의 안정성에 크게 영향을 주지 않은 것으로 나타났다. 이는 비이온성 계면활성제가 1주일간의 짧은 저장기간 동안에는 EPO 안정성에 별다른 영향을 미치지 않는다는 것을 보여주는 결과이다.
또한, 첨가되는 비이온성 계면활성제의 농도가 지속형 EPO 결합체의 안정성에 미치는 영향을 실험하였다. EPO의 농도를 200 μg/ml로, 완충용액으로 10 mM 인산나트륨(pH 6.5)을 사용하는 동일한 조건 하에서 하기 표 4와 같은 조성을 각각 지속형 EPO 결합체의 안정화제로 사용하여 40℃에서 2주일간 보관 후 역상 크로마토그래피법을 이용해 분석하였다. 결과를 하기 표 4에 나타내었으며, 표 4의 RP-HPLC(%)는 초기 결과 값에 대비한 지속형 EPO 결합체의 잔존율을 나타낸다.
번호 계면활성제 염 안정화제 1W(%) 2W(%)
1 0.1% polysorbate 80 150mM NaCl 5% Mannitol 95.9 91.8
2 0.01% polysorbate 80 150mM NaCl 5% Mannitol 98.4 93.7
표 4에 나타난 바와 같이, 10 mM 인산나트륨(pH 6.5) 완충용액에 5% 만니톨 및 150 mM의 염화나트륨이 첨가된 지속형 EPO 결합체의 액상 제제에서 0.1% 폴리소르베이트 80 보다는 0.01%의 폴리소르베이트 80을 첨가하는 것이 2주의 저장기간 동안 안정성이 보다 높았다.
실시예 5: 지속형 EPO 결합체의 액상 제제의 저장 안정성 비교 I
시판 중인 EPO 액상 제제인 로슈사의 레코몬(Recormon)과 본 발명의 지속형 EPO 결합체의 액상 제제의 저장 안정성을 비교하는 실험을 수행하였다. 레코몬의 정확한 제제 조성은 알려져 있지 않지만, 첨가된 성분명은 완충용액으로서 인산나트륨, 계면활성제로 폴리소르베이트 20, 염으로서 염화나트륨, 안정화 물질로 우레아(Urea), 염화칼슘(CaCl) 뿐만 아니라 아미노산인 글리신(glycine), 류신(leucine), 아이소류신(isoleucine), 트레오닌(threonine), 글루탐산(glutamic acid) 및 페닐알라닌(phenylalanine)을 포함한다.
본 발명의 지속형 EPO 결합체의 액상 제제는 계면활성제로 폴리소르베이트 80을 0.1 내지 0.005%로 농도를 달리하여 사용하고, 염으로는 150 및 200 mM의 염화나트륨을, 안정화제로는 1 내지 10 %(w/v)의 만니톨 또는 우레아를 사용하여 제조되었다. 하기 표 5와 같은 조성을 각각 지속형 EPO 결합체의 안정화제로 사용하여 40℃에서 2주일간 보관 후 역상 크로마토그래피법과 크기 배제 크로마토그래피법(Size exclusion chromatography, SE-HPLC)을 이용해 분석하였다. 이때, 비교군으로 레코몬을 동일한 조건에서 실험하였다. 결과를 하기 표 6에 나타내었으며, 표 6의 RP-HPLC(%) 및 SE-HPLC(%)는 초기 결과 값에 대비한 지속형 EPO 결합체의 잔존율을 나타낸다.
성분명 농도 완충용액 계면활성제 안정화제 염
1 레코몬 138 mcg/ml Na-Phosphate P.S 20 Urea, CaCl, Gly, Leu, Ile, Thr, Glu, Phe NaCl
2 지속형 EPO 결합체 200㎍/㎖ 10mM Na-Phosphate
pH 6.5		 0.005% P.S80 10% 만니톨 200mM NaCl
3 지속형 EPO 결합체 200㎍/㎖ 10mM Na-Phosphate
pH 6.5		 0.005% P.S80 1% 만니톨 150mM NaCl
4 지속형 EPO 결합체 200㎍/㎖ 10mM Na-Phosphate
pH 6.5		 0.01% P.S80 5% 만니톨 150mM NaCl
5 지속형 EPO 결합체 200㎍/㎖ 10mM Na-Phosphate
pH 6.5		 0.1% P.S80 5% 만니톨 150mM NaCl
6 지속형 EPO 결합체 200㎍/㎖ 10mM Na-Citrate
pH 6.5		 0.01% P.S80 5% 만니톨 150mM NaCl
7 지속형 EPO 결합체 200㎍/㎖ 10mM Na-Phosphate
pH 6.5		 0.01% P.S80 25mM Urea, 5% 만니톨 150mM NaCl
RP-HPLC (%) SE-HPLC (%)
Start 1 Week 2 Week Start 1 Week 2 Week
1 100 95.7 92.7 100 99.5 98.3
2 100 98.7 100 99.3
3 100 98.3 93.3 100 99.8 99.0
4 100 98.4 93.7 100 100.7 100.0
5 100 95.9 91.8 100 97.4(tailing) 91.5
6 100 98.8 93.9 100 100.7 100.1
7 100 98.6 79.0 100 100.4 99.5
표 6에 나타난 바와 같이, 본 발명의 지속형 EPO 결합체의 액상 제제 중에서, 2주 저장기간 동안 0.1% 폴리소르베이트 80의 비이온성 계면활성제를 5번 액상 제제와 안정화제로 우레아를 첨가한 7번 액상 제제를 제외하고는, 본 발명의 모든 지속형 EPO 결합체의 액상 제제가 레코몬보다 높은 저장 안정성을 나타냄을 확인하였다.
실시예 6: 지속형 EPO 결합체에 장기간 저장 안정성을 부여하는 안정화제의 탐색
지속형 EPO 결합체에 장기간 저장 안정성을 부여하는 안정화제를 탐색하기 위해, 하기 표 7과 같은 조성을 안정화제로 사용하여 지속형 EPO 결합체의 액상 제제를 제조하였다. 이때, 안정화제로서 아미노산이 장기간 저장 안정성에 어떠한 영향을 미치는지 조사하기 위해 계면활성제-염화나트륨-말토오스 조성에 글리신과 메티오닌을 각각 첨가하여 제제화하였다. 또한, 상기 액상 제제에서 EPO의 농도는 200 μg/ml이고, 10 mM 인산나트륨(pH 6.5)을 완충용액으로 사용하였다.
상기와 같이 제조된 지속형 EPO 결합체의 액상 제제를 40℃에서 4주간 보관하면서 일주일마다 역상 크로마토그래피법을 이용해 분석하였다. 결과를 하기 표 8에 나타내었으며, 표 8의 RP-HPLC(%)는 초기 결과 값에 대비한 지속형 EPO 결합체의 잔존율을 나타낸다.
계면활성제 염 안정화 물질
1 0.005% polysorbate 80 200mM NaCl 10% Maltose
2 0.005% polysorbate 80 200mM NaCl 10% Maltose + 1% glycine
3 0.005% polysorbate 80 200mM NaCl 10% Maltose + 1mM Methionine
RP-HPLC (%)
1 week 2 week 3 week 4 week
1 99.12 94.26 94.27 70.66
2 97.81 96.60 95.29 92.43
3 70.14 57.46 28.34 15.40
표 8에 나타난 바와 같이, 본 발명의 지속형 EPO 결합체의 액상 제제를 40℃에서 4주간 보관하였을 때, 안정화제로서 염화나트륨 염과 함께 말토오스와 글리신을 첨가한 액상 제제에서 지속형 EPO 결합체의 안정성이 가장 높게 유지되는 것으로 나타났다. 지속형 EPO 결합체의 액상 제제를 2주간 보관하였을 때, 안정화제로 10% 말토오스를 단독으로 사용한 액상 제제는 10% 말토오스 및 1% 글리신을 사용한 액상 제제와 유사한 수준으로 저장 안정성을 나타내었으나, 4주의 장기 보관 시에는 저장 안정성이 현저히 저하됨을 확인하였다. 반면, 10% 말토오스 및 1% 글리신을 사용한 액상 제제는 4주간의 장기 보관 시에도 높은 안정성을 유지하였다.
또한, 2번 및 3번 액상 제제의 결과를 비교해 보면, 동일한 조건에서 글리신 대신 메티오닌을 첨가한 경우 지속형 EPO 결합체의 안정성을 크게 저하시켰는데, 이는 지속형 EPO 결합체의 장기 저장 시에는 중성 아미노산, 특히 글리신이 특이적으로 EPO의 안정성을 크게 증대시킴을 보여주는 결과이다.
실시예 7: 만니톨 및 말토오스가 지속형 EPO 결합체의 장기간 저장 안정성에 미치는 영향 평가
상기 실시예 6에서 지속형 EPO 결합체의 장기 저장 시 가장 큰 안정성을 나타낸 말토오스-글리신을 포함하는 액상 제제, 동일 조건에서 말토오스 대신 만니톨을 포함하는 액상 제제, 및 글리신을 함유하지 않고 만니톨만을 포함하는 액상 제제의 3가지 제형을 하기의 표 9와 같이 각각 제조한 후 이들의 장기간 저장 안정성을 평가하였다. 이때, 지속형 EPO 결합체의 농도는 200 μg/ml이고, 10 mM 인산나트륨(pH 6.5)을 사용하였다.
준비된 지속형 EPO 결합체의 액상 제제를 각각 40℃에서 5주간 보관하면서 일주일 마다 역상 크로마토그래피법을 이용해 분석하였다. 결과를 하기 표 10에 나타내었으며, 표 10의 RP-HPLC(%)는 초기 결과 값에 대비한 지속형 EPO 결합체의 잔존율을 나타낸다. 또한, 표 10의 결과를 도 1에 그래프로 나타내었으며, 이때 시판 중인 EPO 액상 제제인 레코몬의 결과를 외삽하여 나타내었다.
계면활성제 염 안정화 물질
1 0.005% Polysorbate 80 200mM NaCl 10% Maltose, 1% Glycine
2 0.005% Polysorbate 80 200mM NaCl 10% Mannitol, 1% Glycine
3 0.005% Polysorbate 80 200mM NaCl 10% Mannitol
RP-HPLC (%)
Start 1 week 2 week 3 week 5 week
1 100 96.6 94.7 93.9 92.0
2 100 97.8 95.5 95.8 93.5
3 100 97.8 96.0 95.1 93.4
표 10에 나타난 바와 같이, 지속형 EPO 결합체를 5주간 장기 보관한 경우, 안정화제로서 말토오스-글리신을 사용한 액상 제제보다 만니톨-글리신을 사용한 액상 제제의 저장 안정성이 더 높은 것으로 나타났다. 또한, 글리신을 함유하지 않고 만니톨만을 포함한 액상 제제도 글리신 함유 액상 제제와 대등한 수준의 저장 안정성을 나타내었다.
상기 결과는 실시예 6에서 말토오스를 글리신 없이 포함하는 액상 제제가 말토오스-글리신 제제에 비해 저장 안정성이 크게 저하된 것과 큰 차이를 보여준다. 결론적으로, 이는 만니톨이 중성 아미노산의 도움 없이도 지속형 EPO 결합체에 장기간 저장 안정성을 부여해주는 중요한 물질임을 나타내는 것이다. 또한, 지속형 EPO 결합체의 안정화제로서 만니톨을 5 내지 15 %(w/v)의 고농도로 사용하게 되면 중성 아미노산을 첨가하지 않아도 EPO 결합체를 높은 안정성으로 장기간 저장할 수 있음을 보여준다.
실시예 8: 완충용액에 따른 지속형 EPO 결합체의 장기간 저장 안정성 평가
완충용액에 의한 저장 안정성 변화 및 염과 당 알코올의 용량을 감소시킴에 따른 저장 안정성의 변화를 조사하기 위해 하기 실험을 수행하였다.
먼저, 완충용액에 의한 지속형 EPO 결합체의 안정성 변화를 확인하기 위해, 0.01% 폴리소르베이트 및 150 mM의 염화나트륨을 첨가하고, 완충용액으로 인산 완충용액 또는 구연산 완충용액을 이용하여 하기 표 11(No.1 및 2)과 같은 안정화제 조성으로 지속형 EPO 결합체의 액상 제제를 제조하였다. 하기 표 11의 안정화제 조성에는 고농도(5%)의 만니톨을 사용함으로써 중성 아미노산은 첨가하지 않았고, 지속형 EPO 결합체는 200 μg/ml의 농도로 첨가하였다. 준비된 지속형 EPO 결합체의 액상 제제를 각각 40℃에서 4주간 보관하면서 1주 및 4주 경과 후 역상 크로마토그래피법을 이용해 분석하였다. 결과를 하기 표 12(No.1 및 2)에 나타내었으며, 표 12의 RP-HPLC(%)는 초기 결과 값에 대비한 지속형 EPO 결합체의 잔존율을 나타낸다.
또한, 상기 실시예 7의 만니톨을 포함하는 제제 및 동일 조건에서 완충용액을 인산 완충용액 대신 구연산 완충용액을 사용하는 경우와, 염과 당 알코올의 용량을 절반으로 감소시킨 경우, 지속형 EPO 결합체의 저장기간이 증가함에 따라 이들이 지속형 EPO 결합체의 안정성에 어떠한 영향을 주는지를 실험하였다.
200 μg/ml의 농도로 지속형 EPO 결합체를 첨가하고, 하기 표 11과 같은 안정화제 조성으로 지속형 EPO 결합체의 액상 제제를 제조한 후 이를 40℃에서 4주간 보관하면서 1주 및 4주 경과 후 역상 크로마토그래피법을 이용해 분석하였다. 결과를 하기 표 12에 나타내었으며, 표 12의 RP-HPLC(%)는 초기 결과 값에 대비한 지속형 EPO 결합체의 잔존율을 나타낸다.
완충용액 계면활성제 염 안정화 물질
1 10mM Na-Phosphate,
pH 6.5		 0.01% Polysorbate80 150mM NaCl 5% Mannitol
2 10mM Na-Citrate,
pH 6.5		 0.01% Polysorbate80 150mM NaCl 5% Mannitol
3 10mM Na-Phosphate,
pH 6.5		 0.005% Polysorbate80 200mM NaCl 10% Mannitol
4 10mM Na-Citrate,
pH 6.0		 0.01% Polysorbate80 100mM NaCl 5% Mannitol
RP-HPLC (%)
Start 1 Week 4 Week
1 100 98.4 93.7
2 100 98.8 93.9
3 100 98.7 94.3
4 100 99.5 95.0
표 12에 나타난 바와 같이, 만니톨을 포함하는 액상 제제의 지속형 EPO 결합체에 대한 저장 안정성 수준은 액상 제제에 포함된 완충용액의 종류에 크게 영향을 받지 않는 것으로 나타났다. 상기 결과는 인산 완충용액 이외의 통상적인 완충용액을 이용하더라도 지속형 EPO 결합체에 장기간 저장 안정성을 부여할 수 있는 액상 제제를 만들 수 있음을 의미한다.
실시예 9: 지속형 EPO 결합체의 액상 제제의 저장 안정성 비교 평가 II
상기 실시예 2 내지 8의 저장 안정성 실험을 통해 선택된 인산 완충용액(pH 6.5), 염화나트륨, 만니톨 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 안정화제 조성을 사용하여 제조된 지속형 EPO 결합체의 액상 제제의 저장 안정성을 확인하기 위해 시판 중인 EPO 액상 제제인 로슈사의 레코몬과 비교 실험을 수행하였다. 실험에 사용된 본 발명의 지속형 EPO 결합체의 액상 제제와 레코몬의 조성은 하기 표 13에 나타낸 바와 같다. 이들을 40℃에서 4주간 보관하면서 2주 및 4주 경과 후 역상 크로마토그래피법과 크기 배제 크로마토그래피법을 이용해 분석하였다. 결과를 하기 표 14에 나타내었으며, 표 14의 RP-HPLC(%)와 SE-HPLC(%)는 초기 결과 값에 대비한 지속형 EPO 결합체의 잔존율을 나타낸다.
농도 완충용액 계면활성제 염 안정화 물질
Recormon EPO
138mcg/mL		 Na-Phosphate Polysorbate 20 NaCl Urea, CaCl, Gly, Leu, Ile, Thr, Glu, Phe
지속형 EPO EPO 200mcg/mL 10mM Na-Phorphate(pH6.5) 0.005% Polysorbate 80 200mM NaCl 10% Mannitol
성분 명 RP-HPLC (%) SE-HPLC (%)
Start 2 Week 4 Week Start 2 Week 4 Week
Recormon 100 96.1 91.6 100 98.4 93.1
지속형 EPO 100 95.5 93.3 100 98.1 96.4
표 14에 나타난 바와 같이, 장기 보관 시 안정화제로서 고농도의 만니톨을 포함하는 본 발명에 따른 지속형 EPO 결합체의 액상 제제가 다양한 종류의 중성 아미노산을 포함하고 있는 EPO 액상 제제인 레코몬보다 더욱 우수한 저장 안정성을 나타냄을 확인하였다. 상기 결과로부터 본 발명의 지속형 EPO 결합체의 액상 제제는 지속형 EPO 결합체 특이적으로 우수한 저장 안정성을 제공할 수 있는 안정한 조성임을 알 수 있다.
실시예 10: 다양한 제제 조성의 저장 안정성 비교
상기 실시예 2 내지 8의 저장 안정성 실험을 통해 선택된 인산 완충용액(pH 6.5), 염화나트륨, 만니톨 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 안정화제 조성을 사용하여 제조된 지속형 EPO 결합체의 액상 제제의 저장 안정성을 현재 시판되고 있는 다양한 종류의 제형 조성을 지속형 EPO 결합체에 적용하여 제조된 액상 제제와 비교하였다.
구체적으로, 하기 표 15에 개시된 조성으로 액상 제제를 제조하였는데, 표 15에서 1번 제제는 대조군으로 현재 빈혈 치료제로 사용되고 있는 암젠사의 아르네스프(Aranesp) 제제이고, 2번의 제제는 인산 완충용액(pH 6.5), 염화나트륨, 만니톨 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 안정화제 조성을 사용하여 제조된 지속형 EPO 결합체의 액상 제제이고, 3번 제제는 아르네스프 제제에서 약물을 본 발명의 지속형 EPO 결합체로 대체한 것이고, 4번 제제는 류마티스 관절염 치료제로 사용되고 있는 암젠사의 엔브렐(Enbrel, TNFR-Fc) 제제의 조성에서 약물을 본 발명의 지속형 EPO 결합체로 대체한 것이고, 5번 제형은 PBS만을 포함하는 지속형 EPO 결합체의 액상 제제이다.
상기와 같이 제조된 각각의 액상 제제를 하기 표 16의 조건으로 40℃에서 3주간 보관하면서 1, 2, 및 3주 경과 후 역상 크로마토그래피법과 크기 배제 크로마토그래피법을 이용해 분석하였다. 결과를 하기 표 17에 나타내었으며, 표 17의 RP-HPLC(%)와 SE-HPLC(%)는 초기 결과 값에 대비한 지속형 EPO 결합체의 잔존율을 나타낸다.
단백질 농도 완충용액 계면활성제 안정화제 염
1 Aranesp 200 μg/ml 20 mM Na-Phosphate (pH 6.2) 0.005 % P.S 80 ―― 140 mM NaCl
2 지속형 EPO 결합체 0.526 mg/ml 10 mM Na-Phosphate (pH 6.5) 0.005% P.S 80 10% Mannitol 200 mM NaCl
3 지속형 EPO 결합체 0.526 mg/ml 20 mM Na-Phosphate (pH 6.2) 0.005% P.S 80 ―― 140 mM NaCl
4 지속형 EPO 결합체 0.526 mg/ml 25 mM Na-Phosphate (pH 6.3) ―― 1% Sucrose
25mM L-arginine hydrochloride		 100mM NaCl
5 지속형 EPO 결합체 0.526 mg/ml PBS
배치 번호(Batch Number) HM10760A B10098 LGL211 (Research Center batch)
온도(Temperature) 40℃
저장 조건(Storage Condition) Glass Syringe, 500 μl
분석방법(Analysis Method) SEC, RPC
샘플 빈도(Sample Frequency) Start, 1W, 2W, 3W
Start 1W 2W 3W
1 Aranesp SEC(면적%) 99.7 99.4 98.6 Aggregated
SEC(면적%/출발 면적%) % 100.0 99.7 98.9
SEC(면적/출발 면적) % 100.0 100.1 99.8
RPC(면적%) 94.0 92.5 91.6
RPC(면적%/출발 면적%) % 100.0 98.4 97.4
RPC(면적/출발 면적) % 100.0 99.9 98.7
2 지속형 EPO 결합체 SEC(면적%) 98.8 97.8 96.6 91.6
SEC(면적%/출발 면적%) % 100.0 99.0 97.8 92.7
SEC(면적/출발 면적) % 100.0 97.3 92.1 88.9
RPC(면적%) 96.0 92.6 87.9 83.9
RPC(면적%/출발 면적%) % 100.0 96.5 91.6 87.4
RPC(면적/출발 면적) % 100.0 94.4 89.9 85.4
3 지속형 EPO 결합체 SEC(면적%) 98.8 98.0 96.7 Aggregated
SEC(면적%/출발 면적%) % 100.0 99.2 97.9
SEC(면적/출발 면적) % 100.0 96.3 91.2
RPC(면적%) 95.0 92.3 87.5
RPC(면적%/출발 면적%) % 100.0 97.2 92.1
RPC(면적/출발 면적) % 100.0 95.3 91.4
4 지속형 EPO 결합체 SEC(면적%) 98.9 96.5 Aggregated Aggregated
SEC(면적%/출발 면적%) % 100.0 97.6
SEC(면적/출발 면적) % 100.0 94.2
RPC(면적%) 94.4 90.8
RPC(면적%/출발 면적%) % 100.0 96.2
RPC(면적/출발 면적) % 100.0 93.3
5 지속형 EPO 결합체 SEC(면적%) 98.8 97.4 Aggregated Aggregated
SEC(면적%/출발 면적%) % 100.0 98.6
SEC(면적/출발 면적) % 100.0 96.5
RPC(면적%) 94.6 91.6
RPC(면적%/출발 면적%) % 100.0 96.8
RPC(면적/출발 면적) % 100.0 95.5
표 17에 나타난 바와 같이, 10 mM 나트륨-인산 완충용액(pH 6.5), 0.005% 폴리소르베이트 80, 10% 만니톨 및 200 nM 염화나트륨을 포함하는 본 발명의 지속형 EPO 결합체의 액상 제제를 제외한 다른 액상 제제에서는 3주간의 저장 시 모두 응집(aggregation)이 발생하였다. 따라서, 지속형 EPO 결합체의 장기 보관에는 본 발명에 따른 안정화제 조성으로서 10 mM 나트륨-인산 완충용액(pH 6.5), 0.005% 폴리소르베이트 80, 10% 만니톨 및 200 nM 염화나트륨을 사용하는 것이 가장 바람직하고 안정함을 알 수 있다.
실시예 11: 지속형 EPO 결합체의 액상 제제의 장기 보존 및 가속 안정성 시험
가장 우수한 저장 안정성을 나타내는 안정화제 조성인 인산 완충용액(pH 6.5), 염화나트륨, 만니톨 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 지속형 EPO 결합체의 액상 제제의 장기 보존 안정성 및 가속 안정성을 확인하기 위해 상기 액상 제제를 4℃에서 12개월간 보관하면서 시료의 저장 안정성을 분석하였다. 이때, 보관 조건은 하기 표 18에 나타낸 바와 같으며, 12개월간의 저장 안정성 평가 결과를 하기 표 19 및 도 2에 나타내었다. 표 19의 RP-HPLC(%) 및 SE-HPLC(%)은 초기 결과 값에 대비한 지속형 EPO 결합체 잔존율을 나타낸다.
또한, 상기한 바와 같은 지속형 EPO 결합체의 액상 제제를 4℃에서 12개월간 보관한 시료의 저장 안정성을 시험관 내(in vitro)에서 확인하였다(도 3)
본 실시예에 사용된 시험관 내 지속형 EPO 결합체의 역가 확인 시험은 TF-1 세포주(erythroleukemia cell, ATCC CRL 2003)을 사용하였다. TF-1 세포는 질소 탱크에 저장되어 세포를 일정 양 이상으로 배양하고 세포수를 측정하였다. BRP-EPO와 지속형 EPO 결합체를 일정비율로 희석하여 50μL씩 96 웰 플레이트(well plate)에 넣어 주고 이미 세포수가 확인된 세포를 이용하여 40000/mL이 되도록 분석배지를 사용하여 희석하고 이를 50μL씩 96 웰 플레이트에 넣어 주었다. 37℃ CO2 인큐베이터(incubator)에서 72시간 배양한 후, 96 웰 플레이트에 CellTiter 96 Aqueous One Solution Reagent(PROMEGA, G358B)를 15μL씩 첨가하였다. 다시 37℃ CO2 인큐베이터에서 4시간 배양하고 약하게 pipetting 하여 염색시약을 제거한 후 490 nm에서 흡광도를 측정하여 EC50를 계산하였다. 계산된 EC50 값을 이용하여 specific activity를 측정하였다.
배치 번호(Batch Number) HM10760A B10098 LGL071
농도(Concentration) 0.352 mg/ml protein
온도(Temperature) 4℃
저장 조건(Storage condition) Glass syringe 500 ml
분석 방법(Analysis method) SEC, RPC
제형(Formulation) 10mM Na-P (pH 6.5) / 0.005% Polysorbate 80 / 10% Mannitol / 200mM NaCl
샘플링 빈도(Sampling frequency) Start, 1M, 3M, 6M, 9M, 12M,
Start 1M 3M 6M 9M 12M
지속형 EPO 결합체-
4℃ 보관		 SEC(면적%) 98.1 97.8 97.9 98.2 98.0 97.9
SEC(면적%/출발 면적%) % 100.0 99.7 99.8 100.1 99.9 99.8
SEC(면적/출발 면적) % 100.0 97.5 89.7 91.8 92.2 92.6
RPC(면적%) 97.1 97.1 97.1 97.1 97.1 97.0
RPC(면적%/출발 면적%) % 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 99.9
RPC(면적/출발 면적) % 100.0 100.4 98.3 99.2 99.3 99.7
Specific Activity (U/mg) 5.97E+04 ― 6.31E+04 5.90E+04 5.88E+04
VS Start (%) 100.0 ― 105.8 98.8 98.5
표 19에 나타난 바와 같이, 장기 보존 안정성 시험 결과, 지속형 EPO 결합체는 본 발명에 따른 안정화제 조성의 액상 제제에서 12개월 동안 높은 안정성을 유지함을 확인하였다.
또한, 상기한 바와 같은 안정화제 조성을 갖는 본 발명에 따른 지속형 EPO 결합체의 액상 제제의 가속 안정성을 확인하기 위해, 이를 4℃에서 12개월간, 이어서 25℃에서 6개월간 보관하면서 시료의 저장 안정성을 분석하였다. 결과를 하기 표 20 및 21에 나타내었으며, 표 20 및 21의 RP-HPLC(%), SE-HPLC(%), 단백질 함량(%) 및 생물학적 비활성 시험(%)은 초기 결과 값에 대비한 지속형 EPO 결합체 잔존율을 나타낸다.
장기 보존 안정성 시험 (4℃ 보관)
보관기간 성상 pH 확인시험 순도시험 단백질 함량
시험(%)		 생물학적 비활성 시험 (%)
HPLC 웨스턴블롯 SDS-PAGE RP-HPLC
(%)		 SE-HPLC
(%)
Start 무색 투명 6.3 일치 적합 적합 100.0 100.0 100.0 100.0
3개월 무색 투명 6.5 일치 적합 적합 100.0 101.1 100.0 122.7
6개월 무색 투명 6.4 일치 적합 적합 99.5 101.0 98.3 121.2
9개월 무색 투명 6.4 일치 적합 적합 99.3 101.1 103.9 131.1
12개월 무색 투명 6.5 일치 적합 적합 99.1 100.1 99.2 124.4
가속 안정성 시험 (25℃ 보관)
보관기간 성상 pH 확인시험 순도시험 단백질 함량
시험(%)		 생물학적 비활성 시험 (%)
HPLC 웨스턴블롯 SDS-PAGE RP-HPLC
(%)		 SE-HPLC
(%)
Start 무색 투명 6.3 일치 적합 적합 100.0 100.0 100.0 100.0
2개월 무색 투명 N.A 일치 적합 적합 97.6 99.7 N.A 91.3
4개월 무색 투명 N.A 일치 적합 적합 96.2 99.7 N.A 106.4
6개월 무색 투명 6.5 일치 적합 적합 92.5 94.0 100.0 101.5
표 20 및 21에 나타난 바와 같이, 지속형 EPO 결합체는 본 발명에 따른 안정화제 조성의 액상 제제에서 12개월 동안 높은 안정성을 유지하였고, 가속 조건에서 6개월간 보관하여도 92.5% 이상 잔존하는 것이 확인되어 본 발명에 따른 지속형 EPO 결합체의 액상 제제의 효과적인 저장 안정성이 재차 확인되었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있음을 이해할 수 있다. 이와 관련하여, 전술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 본 발명을 제한하는 것으로 이해되지 않음은 당업자에게 자명할 것이다. 본 발명의 범위는 전술한 상세한 설명보다는 후술되는 특허청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포섭되는 것으로 해석되어야 한다.
지속형 EPO 결합체에 특이적으로 저장 안정성을 제공하는 본 발명에 따른 알부민-비함유 액상 제제는 바이러스 감염의 우려가 없을 뿐만 아니라, 간단한 제형으로 우수한 저장 안정성을 나타내므로 다른 안정화제나 동결-건조 제제에 비해 경제적인 제공이 가능한 장점이 있다. 또한, 본 발명에 따른 액상 제제는 천연형에 비해 생리활성 지속기간이 증대된 지속형 EPO 결합체를 포함하고 있으므로, 통상적인 EPO 제제에 비해 인체 내에서 단백질 활성을 장기간 유지할 수 있어 효율적인 약물 제제로 이용할 수 있다.

Claims (28)

  1. 에리스로포이에틴(Erythropoietin, EPO), 생분해성 고분자 및 면역글로불린 Fc 영역이 결합된 약리학적 유효량의 지속형 에리스로포이에틴 결합체; 완충용액; 및 3 내지 20%(w/v)의 만니톨을 포함하는 알부민-비함유 안정화제를 포함하고, 상기 알부민-비함유 안정화제가 중성 아미노산을 포함하지 않는 것인, 지속형 에리스로포이에틴 결합체의 안정화용 액상 제제.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 완충용액이 구연산, 인산, 주석산, 탄산, 석신산, 젖산 및 아세트산 완충용액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 지속형 에리스로포이에틴 결합체의 안정화용 액상 제제.
  4. 제1항에 있어서, 상기 완충용액의 농도가 5 내지 100 mM인 것인 지속형 에리스로포이에틴 결합체의 안정화용 액상 제제.
  5. 제1항에 있어서, 상기 완충용액의 pH가 4 내지 8인 것인 지속형 에리스로포이에틴 결합체의 안정화용 액상 제제.
  6. 제1항에 있어서, 상기 알부민-비함유 안정화제가 염화나트륨, 황산나트륨 및 구연산나트륨으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 염인 등장화제, 말토오스 또는 수크로오스인 당류, 및 폴리소르베이트계 비이온성 계면활성제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 성분을 추가로 포함하는 것인 지속형 에리스로포이에틴 결합체의 안정화용 액상 제제.
  7. 삭제
  8. 제6항에 있어서, 상기 등장화제의 농도가 5 내지 200 mM인 것인 지속형 에리스로포이에틴 결합체의 안정화용 액상 제제.
  9. 삭제
  10. 제6항에 있어서, 상기 폴리소르베이트계 비이온성 계면활성제가 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60 및 폴리소르베이트 80으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 지속형 에리스로포이에틴 결합체 안정화용 액상 제제.
  11. 제6항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제의 농도가 전체 용액 대비 0.001 내지 0.05 %(w/v)인 것인 지속형 에리스로포이에틴 결합체의 안정화용 액상 제제.
  12. 삭제
  13. 제6항에 있어서, 상기 당류의 농도가 전체 용액 대비 1 내지 20 %(w/v)인 것인 지속형 에리스로포이에틴 결합체의 안정화용 액상 제제.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 제1항에 있어서, 상기 알부민-비함유 안정화제가 5 내지 100 mM의 인산 완충용액, 1 내지 20 %(w/v)의 만니톨, 5 내지 200 mM의 염화나트륨 및 0.001 내지 0.05 %(w/v)의 폴리소르베이트 80을 포함하는 것인 지속형 에리스로포이에틴 결합체의 안정화용 액상 제제.
  20. 삭제
  21. 제1항에 있어서, 상기 지속형 에리스로포이에틴 결합체의 농도가 1 내지 500 ㎍/㎖인 것인 지속형 에리스로포이에틴 결합체의 안정화용 액상 제제
  22. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 및 이들의 조합의 Fc 영역으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 지속형 에리스로포이에틴 결합체의 안정화용 액상 제제.
  23. 삭제
  24. 제22항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 동일한 기원의 도메인으로 이루어진 단쇄 면역글로불린으로 구성된 이량체 또는 다량체 형태인 것인 지속형 에리스로포이에틴 결합체의 안정화용 액상 제제.
  25. 제22항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 IgG4 Fc 영역인 것인 지속형 에리스로포이에틴 결합체의 안정화용 액상 제제.
  26. 제25항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 인간 비당쇄화 IgG4 Fc 영역인 것인 지속형 에리스로포이에틴 결합체의 안정화용 액상 제제.
  27. 삭제
  28. 제1항에 있어서, 상기 생분해성 고분자가 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸에테르, PLA(폴리락트산, polylactic acid) 및 PLGA(폴리락틱-글리콜산, polylactic-glycolic acid) 로 이루어진 군에서 선택된 것인 지속형 에리스로포이에틴 결합체의 안정화용 액상 제제.
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