EA003090B1 - Ферментированный высушенный материал, способ его получения и его применение для получения фармацевтической композиции и диетической добавки, а также фармацевтическая композиция и диетическая добавка, содержащие указанный материал - Google Patents

Ферментированный высушенный материал, способ его получения и его применение для получения фармацевтической композиции и диетической добавки, а также фармацевтическая композиция и диетическая добавка, содержащие указанный материал Download PDF

Info

Publication number
EA003090B1
EA003090B1 EA200000212A EA200000212A EA003090B1 EA 003090 B1 EA003090 B1 EA 003090B1 EA 200000212 A EA200000212 A EA 200000212A EA 200000212 A EA200000212 A EA 200000212A EA 003090 B1 EA003090 B1 EA 003090B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
fermentation
fermented
aqueous medium
dried material
dietary supplement
Prior art date
Application number
EA200000212A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200000212A1 (ru
Inventor
Мате Хидвеги
Фаркаш Рита Темешкезине
Карой Лапиш
Эржебет Рашо
Бела Сенде
Original Assignee
Мате Хидвеги
Фаркаш Рита Темешкезине
Карой Лапиш
Эржебет Рашо
Бела Сенде
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from HU9701392A external-priority patent/HUP9701392D0/hu
Application filed by Мате Хидвеги, Фаркаш Рита Темешкезине, Карой Лапиш, Эржебет Рашо, Бела Сенде filed Critical Мате Хидвеги
Publication of EA200000212A1 publication Critical patent/EA200000212A1/ru
Publication of EA003090B1 publication Critical patent/EA003090B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/06—Fungi, e.g. yeasts
    • A61K36/062—Ascomycota
    • A61K36/064—Saccharomycetales, e.g. baker's yeast
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L7/00—Cereal-derived products; Malt products; Preparation or treatment thereof
    • A23L7/20—Malt products
    • A23L7/25—Fermentation of cereal malt or of cereal by malting
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/14—Yeasts or derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L7/00—Cereal-derived products; Malt products; Preparation or treatment thereof
    • A23L7/10—Cereal-derived products
    • A23L7/152—Cereal germ products
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/88—Liliopsida (monocotyledons)
    • A61K36/899—Poaceae or Gramineae (Grass family), e.g. bamboo, corn or sugar cane
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/308—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on cancer prevention

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
  • Grain Derivatives (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)

Abstract

Данное изобретение касается ферментированного высушенного вегетативного материала, который является иммуностимулятором и ингибирует метастазы, содержащих его фармацевтических композиций, способа получения и применения этого сухого материала в производстве диетической добавки и фармацевтических композиций, являющихся иммуностимуляторами и ингибирующих метастазы. Согласно данному изобретению данный материал можно получить посредством ферментации семян пшеницы в водной среде в присутствии Saccharomyces cerevisiae и высушивания сбраживаемой жидкости.

Description

Данное изобретение касается ферментированного и высушенного вегетативного материала, являющегося иммуностимулятором и ингибирующего метастазы, содержащих его фармацевтических композиций, способа получения этого материала и применения сухого вегетативного материала в качестве диетической добавки и в производстве иммуностимуляторных фармацевтических композиций, в особенности фармацевтических композиций, ингибирующих метастазы.
Одной из основных целей лечения опухолей является ингибирование метастазов, так как первичная опухоль, вызванная злокачественным ростом клеток, распространяется посредством метастазов в соседние клетки и органы и вызывает впоследствии вторичные опухоли, которые не могут быть удалены хирургически и могут быть невосприимчивы к химиотерапии.
Все более и более исследователи концентрируются на разработке иммуномодуляторных материалов и интенсивно исследуют материалы природного, в основном растительного, происхождения.
Хорошо известен факт, что соединения со структурой хинона играют важную биологическую роль. В растениях обнаружены некоторые производные хинона, такие как убихиноны, пластохиноны, менахиноны, которые играют определенную роль в фотосинтезе, а также в клеточной дыхательной системе позвоночных животных, в том числе человека, и при коагуляции крови и др. Для медицинских целей применяют также некоторые производные бензохинона. Адриамицин, даунорубицин и митомицин С представляют собой производные хинона с цитостатическим действием, тогда как бензо- и гидрохиноны оказывают противомикробное действие и являются активными компонентами антибиотиков, подходящих для лечения бактериальных инфекций, таких как Тетран-В (Те1тал-В), метациклин (Ме1асус1т) и доксициклин (Бохусусйл).
В литературе сообщается, что 2,6диметоксипарабензохинон (2.6-БМВО) и 2метоксипарабензохинон (2-МВО) обладают фунгицидным и бактериостатическим эффектом, а также являются цитотоксичными для злокачественных опухолевых клеток [Ιηΐ. Риал!. Сйет.: Риал!. Вю1. 8утр. 1, 217-222 (1980), 9, 27-30 (1982) и 12, 257-261 (1985); Рйу1осйет151ту 27, 225 (1971) и 1. Л§ис. Еооб Сйет. 39, 266 (1991)]. Показано, что смесь 2,6-диметоксипара-бензохинона и аскорбиновой кислоты ингибирует рост асцитных опухолевых клеток Эрлиха (ΈΙιιΊχΙι аксйек 1итот сеШ) у мышей [Ргос. ЫаЙ. Асаб. 8οΐ. И8А 81, 2088-2091 (1984) и 82, 1439-1442 (1985)]. 2,6-Диметоксипарабензохинон и 2-метоксипарабензохинон найдены и выделены из некоторых растений [Маду. Кегл. Ро1уопа1 103/7, 320-325 (1996)]. Эти два соединения в глюкозидной форме можно найти в больших количествах в пшенице (Тпсйит уи1дат15), точнее, в пшеничном зерне. Соединение выделяли в пятидесятых годах из пшеничного зерна, ферментированного при помощи дрожжей и идентифицированного с целью проверки ухудшения качества хлеба, к которому это пшеничное зерно добавляли [Не1у. Н1т. Ас!а. 33, 433 (1950); 1. Сйет. 8ос. Ьолбол 1952, 48214823].
Согласно литературе, в пшеничном зерне количество 2-МВО составляет около 0,05 вес.%, а 2,6-БМВр - около 0,01 вес .% (в виде глюкозида). Присутствие хинонов в виде глюкозидов объясняется тем фактом, что хиноны, в особенности метоксизамещенные пара-бензохиноны реактивны, тогда как их гидрохинон-глюкозиды более стабильны и инертны.
Во время экспериментов, касающихся исследования ферментации пшеничного зерна, авторы сделали вывод, что сухой экстракт из сбраживаемой жидкости, полученной при ферментации пшеничного зерна с использованием пекарных дрожжей (Зассйатоткек сетеу151ае), оказывает удивительное иммуностимулирующее действие и действие, ингибирующее метастазы, и может успешно использоваться в качестве активного агента фармацевтических композиций, являющихся иммуностимуляторами и ингибирующих метастазы.
Этот вывод удивителен, так как, хотя в литературе и сообщается [Ргос. Ν;·ι11. Асаб. 8ст И8А 80, 129 (1983)] о том, что смесь 2,6-БМВр и аскорбиновой кислоты ингибирует рост асцитных опухолевых клеток Эрлиха (ЕШюй а§сйек 1итот се1к) - она замечательным образом подходит для количественного анализа роста опухолей и для изучения их биохимических функций - доказано, что экстракт, описанный в данном изобретении, который, кроме неопределимых компонентов, содержит 2,6-БМВО и 2МВО, практически неэффективен относительно клеток этой первичной опухоли, даже при соединении с аскорбиновой кислотой (как правило, относительно всех первичных опухолей) и доказано, что он эффективен только при лечении метастазов. Аспекты лечения первичных опухолей и развивающихся из них метастазов в основном различны, таким образом, для исследователя не очевидно, что растительный экстракт, содержащий компоненты, которые, как известно, эффективны при лечении первичных опухолей и пока не полностью идентифицируемы по своему химическому составу, должен оказывать иммуностимуляторное действие и ингибировать метастазы [Салсег. Рппс1р1е5 алб Ртасбсе о! Олсо1оду, т. 1, изд. 4-ое, ЕВ.Ырршсой Сотралу, РЫ1абе1рЫа, 1993].
Таким образом, настоящее изобретение касается ферментированного и высушенного вегетативного материала, являющегося иммуностимулятором и ингибирующего метастазы, который можно получить посредством ферментации пшеничного зерна в водной среде с использованием пекарных дрожжей, фильтрования сбраживаемой жидкости, не содержащей клеток, и ее сушки.
Настоящее изобретение касается также фармацевтической композиции, являющейся иммуностимулятором и ингибирующей метастазы, активный агент которой содержит ферментированный, высушенный вегетативный материал, описанный в данном изобретении.
Настоящее изобретение касается также применения указанного выше ферментированного и высушенного вегетативного материала в получении фармацевтических композиций, являющихся иммуностимуляторами и ингибирующих метастазы.
Настоящее изобретение касается также способа лечения млекопитающих с целью стимуляции иммунной системы и ингибирования метастазов при помощи фармацевтической композиции, описанной в данном изобретении.
Кроме того, данное изобретение касается диетической добавки, включающей в себя ферментированный сухой вегетативный материал, описанный в данном изобретении, и мальтодекстрин.
Ферментированный сухой вегетативный материал согласно изобретению идентифицируют и исследуют на основе содержания в нем 2.6-ЭМВО. Здесь нам хотелось бы отметить, что полная идентификация химического состава этого экстракта доступными методами невозможна, таким образом, все данные касаются содержания 2,6-ЭМВр как основы.
Доказано, что для получения ферментированного сухого вегетативного материала, описанного в настоящем изобретении, удобно использовать пшеничное зерно (которое является побочным продуктом мукомольного производства и имеется в больших количествах), размолотое до муки, в его исходном состоянии либо обезжиренное. Использование обезжиренного пшеничного зерна не имеет особых преимуществ. Ферментацию проводят с использованием пекарных дрожжей (8ассйаготусс5 ссгссыас). Этот тип дрожжей доступен коммерчески. Период ферментации составляет примерно 10-24 ч, предпочтительно 15-20 ч или около 18 ч. Температура ферментации составляет примерно 25-35°С, предпочтительно около 30°С. Весовое соотношение пшеничного зерна и дрожжей составляет 4:1 - 2:1, предпочтительно примерно 3:1, весовое соотношение сухого вещества и воды составляет 1:6 -1:12, предпочтительно 1:9.
Ферментацию (в лабораторном масштабе) можно проводить, например, добавляя в стеклянный бродильный аппарат к свежемолотому пшеничному зерну суспензию дрожжей в воде и перемешивая или встряхивая эту смесь. Сбраживаемая жидкость дает пену.
После ферментации смесь центрифугируют в течение 5-15 мин при 2000-4500 об./мин., предпочтительно примерно 3000 об./мин. Супернатант кипятят, охлаждают и сушат подходящим способом, например, посредством лиофилизации или распыления.
Продукт, красно-коричневый порошок, представляет собой материал согласно изобретению. Целесообразно хранить этот материал до следующего использования охлажденным и в закупоренном контейнере вследствие его гигроскопичности. Содержание 2,6-ЭМВр в полученном сухом материале составляет примерно 0,4 мг/г.
В случае ферментации в большом масштабе (например, 4 м3) удобно применять непрерывную аэрацию, например, 0,5 л воздуха/л сбраживаемой жидкости/в минуту, и медленное перемешивание. Время ферментации составляет примерно 18 ч. Для ингибирования пенообразования можно применять обычные добавки (предпочтительно использовать подсолнечное масло). В конце процесса ферментации прекращают аэрацию и перемешивание и обычным образом отделяют сбраживаемую жидкость от пшеничного зерна - суспензии дрожжей, например, в шнековом отстойнике, затем в сепараторе и фильтр-прессе. Если необходимо, можно добавить вспомогательный фильтровальный материал. Удобно использовать 5-10 кг фильтрующего перлита на кубический метр сбраживаемой жидкости. Сброженную жидкость тщательно фильтруют и проверяют качество фильтрования при помощи микроскопа. Отфильтрованная сброженная жидкость практически не содержит клеток, это означает, что обнаруживают не более 1 клетки дрожжей на 10 полей зрения под микроскопом. Полученную сброженную жидкость, которая содержит примерно 1,5 вес.% сухого продукта, выпаривают в вакуумном конденсоре, предпочтительно при температуре около 40-50°С, и после снятия вакуума кипятят при атмосферном давлении примерно в течение 15 мин. В результате этого снижаются вредные активности фермента. Затем смесь сушат посредством распыления, например, во вращающемся аппарате для распыления. Если применяют описанный выше способ ферментации, содержание 2,6-ЭМВО в полученном сухом вегетативном материале составляет 0,12-0,52 мг/г сухого материала, а содержание 2-МВО составляет 0,05-0,28 мг/г сухого материала (в зависимости от содержания бензохинона в использованном пшеничном зерне).
Так как конечный продукт гигроскопичен, для повышения эффективности распылительной сушки и применения конечного продукта можно использовать при распылительной сушке одну из обычных добавок, например, мальтодекстрин, аравийскую камедь, кизельгуровую смолу, ксантан, муку из плодов робинии (1оси§1 Ьсал) и др. Предпочтительно использовать мальтодек стрин. Удобно определить содержание сухого материала в выпаренной в вакуумном конденсаторе и прокипяченной смеси и добавить мальтодекстрин в таком количестве, чтобы содержание сухого материала в подлежащей высушиванию смеси составляло примерно 30 вес.%. Удобно растворить мальтодекстрин в горячей воде и добавлять его к выпаренной смеси охлажденным. После сушки конечный продукт (порошок) содержит примерно 60 вес.% ферментированного сухого вегетативного материала и примерно 40 вес.% мальтодекстрина.
Стабильность полученного материала можно проверить, следя за изменениями концентрации 2.6-ΩΜΒΟ. Количественный анализ можно выполнить методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Полученный в соответствии с описанным выше способом порошок остается стабильным примерно в течение 3 лет при комнатной температуре.
Ферментированный высушенный вегетативный материал согласно изобретению можно применять в качестве активного агента фармацевтических композиций, являющихся иммуностимуляторами и ингибирующих метастазы. Кроме указанного активного агента, эти фармацевтические композиции могут также содержать аскорбиновую кислоту или другие цитостатические материалы.
Ферментированный сухой вегетативный материал можно перерабатывать в обычные твердые или жидкие фармацевтические композиции для перорального или парентерального использования. При получении фармацевтических композиций необходимо принимать во внимание гигроскопичность ферментированного сухого вегетативного материала. Подходящей формой является капсула, которая защищает активный агент от влажности воздуха.
При получении фармацевтических композиций можно использовать вспомогательные вещества, обычно применяемые в фармацевтической практике. Так как такие вещества и их возможные применения подробно описаны в фармацевтической литературе, выбор и получение подходящих форм представляет собой рутинную задачу. Разовую дозу активного агента можно варьировать в широких пределах, в зависимости от состояния пациента, а ответственность за выбор подходящей эффективной дозировки всегда несет лечащий врач. Как правило, хорошие результаты можно получить при дозировке 0,001-100 г, предпочтительно 0,01-50 г, более предпочтительно 0,1-40 г на кг веса тела, например, при дозировках 0,1-10, 1-25 или 10-30 г.
Ферментированный высушенный вегетативный материал согласно изобретению можно также смешать с аскорбиновой кислотой (Витамин С). Согласно опыту авторов, аскорбиновая кислота может усиливать эффект ингибирования метастазов материала согласно изобретению.
Весовое соотношение ферментированного высушенного вегетативного материала и аскорбиновой кислоты может составлять, например, 10:1 - 1:1, предпочтительно 6:1 - 2:1, более предпочтительно 3:1, 4:1 или 5:1.
Данное изобретение касается также лечения в плане иммуностимуляции и/или ингибирования метастазов при помощи ферментированного высушенного вегетативного материала согласно изобретению. Главным в таком лечении является прием пациентом эффективной дозы ферментированного высушенного вегетативного материала.
Ферментированный высушенный вегетативный материал можно также использовать в качестве диетической добавки для млекопитающих. В этом случае предпочтительно применять смесь, содержащую мальтодекстрин и обычные вспомогательные вещества, применяемые в пищевой промышленности, например, ароматические вещества, подслащивающие агенты, красители и др. Диетическую добавку можно, например, получить посредством гранулирования смеси, содержащей 60 вес.% сухого продукта и 40 вес.% мальтодекстрина плюс ароматические вещества и подслащивающие агенты в жидком носителе, и упаковки гранулята быстрого применения, например, в пакетики.
Ниже описаны приложенные фигуры.
Фиг. 1 - калибровочный график определения 2,6-ΌΜΒΟ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ);
фиг. 2 - ВЭЖХ-хроматограмма хлороформного экстракта данного материала;
фиг. 3 - ВЭЖХ-хроматограмма этанольного экстракта данного материала;
фиг. 4 - связывание опухолевых клеток В16 в присутствии лиофилизатов разных концентраций через 60 и 90 мин после посева (каждое значение представляет собой среднее из 8 параллельных определений ± стандартное отклонение, оценка по спектрофотометрическим данным);
фиг. 5 - эффект различных доз лиофилизата на пролиферацию клеток В16 через 24 и 48 ч после начала обработки (каждое значение представляет собой среднее из 8 параллельных определений ± стандартное отклонение, оценка по спектрофотометрическим данным);
фиг. 6 - развитие меланомы человека А2058 в присутствии различных доз лиофилизата через 24 ч после начала обработки. Оценку культур проводили на основе белковой (8ΚΒ) и дегидрогеназной активности (МТТ) путем параллельных спектрофотометрических измерений (каждое значение представляет собой среднее из 8 параллельных определений ± стандартное отклонение);
фиг. 7 - соотношение апоптотических клеток (РАС8 - анализ с применением клеточного сортера с возбуждением флуоресценции) ίη νίίτο в культурах клеток меланомы человека А2058 после обработки различными дозами лиофилизата.
Следующие далее примеры приведены с целью иллюстрации ферментированного высушенного вегетативного материала согласно изобретению, его получения и фармакологических эффектов.
Пример 1. Ферментация пшеничного зерна в лабораторном масштабе.
Суспензию 33,3 г дрожжей (Зассйатотусек ссгсуыас) и 1000 мл питьевой воды добавляют к 100 г свежего пшеничного зерна (в соответствии со стандартом Венгрии Μ8Ζ-081361-80), размолотого до состояния муки. Смесь встряхивают в шейкере в течение 18 ч при 30°С. В это время сбраживаемая жидкость дает пену и увеличивает исходный объем в три раза. После ферментации смесь центрифугируют в течение 15 мин при 3000 об./мин. После кипячения и охлаждения супернатант сушат посредством лиофилизации и полученный лиофилизованный продукт хранят до следующего применения в морозильной камере (-10°С). Содержание 2.6-ΩΜΒΟ в полученном лиофилизате составляет 0,4 мг/г сухого материала (0,04% по весу).
Пример 2. Ферментация пшеничного зерна в большом масштабе.
300 кг пшеничного зерна, размолотого до состояния муки (в соответствии со стандартом Венгрии), и 100 кг дрожжей помещают в бродильный чан на 5 м3 и добавляют питьевую воду до объема 4000 л. Время ферментации составляет 18 ч, при этом применяют непрерывную аэрацию (0,5 л воздуха/л сбраживаемой жидкости/мин.) и медленное перемешивание (30 об./мин). Для ингибирования пенообразования к смеси добавляют подсолнечное масло, 1 л/м3. После ферментации прекращают аэрацию и перемешивание и сбраживаемую жидкость отделяют сначала в шнековом осадителе, затем в сепараторе и в заключение на фильтр-прессе с текстильным фильтром. Добавляют 10 кг фильтрующего перлита/м3. Сбраживаемую жидкость четко фильтруют и проверяют точность фильтрования при помощи микроскопа. Отфильтрованная сброженная жидкость практически не содержит клеток, это означает, что обнаруживают не более 1 клетки дрожжей на 10 полей зрения под микроскопом. Полученную сброженную жидкость, которая содержит примерно 1,5 вес.% сухого материала, выпаривают в вакуумном конденсаторе при температуре 4050°С, и после снятия вакуума кипятят при атмосферном давлении примерно в течение 15 мин. После этого определяют содержание в растворе сухого материала и добавляют такое количество мальтодекстрина (который сначала растворяют в горячей воде и затем охлаждают), что содержание в растворе сухого материала становится примерно 30 мас.%. После этого раствор сушат распылением во вращающемся распылительном сушительном аппарате, снабженном сдвигаю щейся форсункой (кйеат пох/1е го1а11пд вргау Шпет), в котором температура выходящего воздуха составляет 90°С. Полученный конечный продукт (порошок) содержит 60 вес.% ферментированного вегетативного материала согласно изобретению и 40 вес.% мальтодекстрина. Содержание 2,6-ΌΜΒρ (определяемое методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в соответствии со способом, описанным в следующем примере) составляет 0,4 мг/г сухого материала.
Пример 3. Характеристики материала данного изобретения.
Материал согласно изобретению можно охарактеризовать двумя способами, либо определяя в нем содержание 2,6-ΌΜΒρ, либо посредством так называемой характеристической хроматограммы (пептидная карта, фингерпринт). В обоих случаях используют метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Проводят исследование на обоих материалах: полученном, как описано в примере 1, и полученном, как описано в примере 2. В обоих случаях результаты идентичны.
А. Количественный и качественный анализ производных бензохинона.
Получение образцов
Перед проведением анализа необходимо увеличить концентрацию бензохинонов в лиофилизате. Для достижения этой цели лиофилизат разбавляют дистиллированной водой до исходной концентрации (содержание сухого материала 1 вес.%) - (0,5 г лиофилизата, 50 мл дистиллированной воды). Раствор три раза экстрагируют хлороформом 3 х 25 мл. Возможную влагу, остающуюся в хлороформной фазе, удаляют при помощи безводного сульфата натрия. После фильтрования хлороформную фазу выпаривают, к остатку добавляют хлороформ до общего объема 5 мл. Этот образец вводят при проведении анализа ВЭЖХ.
Качественный и количественный анализ производных бензохинона проводят методом ВЭЖХ.
Описание метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Применяемое оборудование ВЭЖХ состоит из помпы (Весктап тоШе1 114Μ ритр), УФдетектора (ЬаЬотМ1ш υν, а Μе^ск-Η^ΐасЫ-^Α^ тоШ. 4500 Фоб аггау Ше1ес1ог) и блока интегратора (\Уа1ег5 740 1уре йИедгаЮг ипй). Для определений используют колонку СйтотШ С18 (250 х 4 мм) 10 μ. УФ-детектирование осуществляют на частоте 290 нм, скорость потока составляет 2 мл/мин. Состав применяемого элюента следующий: Ыа2НРО4 25 ммоль, ЫаН2РО4 25 ммоль, №2ЕЭТЛ 25 ммоль, ИН2ОН-НС1 20 ммоль, 10 об.% метанола, рН = 6,05.
Описанным выше способом анализируют три различных бензо- и гидрохинона. Различие между временами удерживания этих соединений существует, но оно мало. Уменьшая силу элюента (органическая фаза до 10%), увеличивают селективность до более высокой степени. Анализ данных по удерживанию показывает, что пара-бензохиноны демонстрируют большее удерживание, чем соответствующие гидрохиноны, и удерживание увеличивается с количеством метоксигрупп. Концентрация трех стандартов составляет 0,1 мг/мл. В табл. 2 показаны данные по временам удерживания (Тк) и коэффициентам производительности (к'). Целью измерений является детектирование и количественное определение 2,6-диметоксипарабензохинона, поэтому после этой части определения будут обсуждены подробно. Определяют, подходит ли разработанный способ для количественного анализа 2,6-диметоксипарабензохинона. Используемый калибровочный график показан на фиг. 1. Результаты ложатся на прямую линию с коэффициентом корреляции 0,99. Проверяют также, можно ли воспроизвести измерения, на каждом образце проводят по три параллельных определения и рассчитывают разброс результатов. В табл. 1 показаны параллельные результаты определений, проведенных на образцах за период в шесть месяцев, и их разброс. Результаты авторов показывают, что способ определения подходит для точного и воспроизводимого определения 2,6-диметоксипара-бензохинона.
Таблица 1. Параллельные значения количественного анализа 2,6ЭМВЦ и разброс результатов
Дата Содержание 2,6-ЭМВр (мг/50 г образца) (σ-%)
04.27 3,45 3,54 3,66 0,08-2
04.28 3,27 3,68 3,31 0,18-5
05.10 1,56 1,49 1,48 0,03-1,9
05.10 3,65 3,42 0,12-3
06.08 3,00 2,98 2,86 0,06-2
06.09 2,92 3,06 2,87 0,08-2,3
06.10 3,34 3,23 3,36 0,05-1,5
Таблица 2. Значения времен удерживания (1К) и коэффициентов производительности (к') исследованных материалов
Стандарт ίκ к'
2,6-1)МВ(.) 13,4 5,0
2,6-1)МВ(.) 5,1 1,2
2-МВБ 8,5 2,7
На фиг. 2 показана ВЭЖХ-хроматограмма образца в хлороформе, приготовленного, как описано выше. Хроматограмма дает только один пик, характерный для 2.6-БМВО. Содержание 2.6-БМВО в образце определяют на основе последнего.
В. Характеристическая хроматограмма (фингерпринт)
Получение образца мл 96% (по объему) этанола добавляют к 5 г высушенного распылением материала (полученного, как описано в примере 2). Смесь встряхивают в течение 30 мин при температуре 50°С и 200 раз/мин. После этого смесь фильт руют, выпаривают досуха, и оставшийся материал растворяют в 10 мл метанола. Профильтрованный раствор вводят в колонку.
Метод ВЭЖХ
Здесь тоже используют колонку и условия ВЭЖХ, описанные выше, но состав элюента следующий: Να2ΗΡΟ4 1,25 ммоль, ΝαΗ2ΡΟ4 1,25 ммоль, №12ЕБТЛ 1,25 ммоль, ИН4ОН-НС1 2,50 ммоль, 5 объемных % метанола.
На фиг. 3 приведена ВЭЖХ-хроматограмма. Показано, что в этих условиях появляются два характеристических пика, один около 4,7 мин (5) и другой при 5,8 мин (6). Быстро, друг за другом выходят два пика (7,8) с временами удерживания 7,3 и 7,7 мин, соответственно, которые нельзя полностью разделить. Пик меньшей интенсивности появляется при 9,8 мин (9), а за ним характеристический интенсивный пик (11) около 13,1 мин. При 15 мин появляется меньший пик (12) и другой интенсивный пик (14) при 18 мин. При 21,8 мин хроматограф показывает меньший пик (15) и около 31 мин широкий пик, содержащий несколько материалов.
С. Исследование стабильности
Разложение материала данного изобретения проверяют путем проверки изменения концентрации 2,6-диметоксипарабензохинона. Авторы проводят эксперименты по исследованию хранения при трех различных температурах (комнатной температуре 20, 40 и 60°С). Лиофилизат (около 1 г) хранят в плотно закупоренных пробирках для исследования. Продолжительность экспериментов составляет 8 недель, каждую неделю проводят три параллельных определения на образцах, взятых из всех трех серий, хранящихся при разных температурах. Количественный анализ производных бензохинона осуществляют методом ВЭЖХ.
Исследования показывают, что сухой материал данного изобретения остается стабильным даже через три года хранения при комнатной температуре, то есть содержание 2/>-БМВО остается практически неизменным. В то же время материал нестабилен при 40°С (2,6-ИМВр разлагается через несколько недель), а при 60°С (2,6-ИМВр разлагается через несколько недель), а при 60°С содержание 2/>-БМВО быстро снижается за несколько дней.
В обоих последних сериях экспериментов исследуют разложение 2-метокси-парабензохинона. Это соединение более нестабильно, чем 2,6-диметоксипарабензохинон, и, как следствие этого, его присутствие в образцах не обнаруживают через одну неделю хранения при 40 или 60°С. При комнатной температуре концентрация этого соединения также остается неизменной.
Пример 4. Исследование эффективности.
Лиофилизат, полученный, как описано в примере 1, и высушенный распылением материал, полученный, как описано в примере 2, исследуют на эффективность. Используют стандартизиро ванные образцы сухого материала с содержанием 2.6-ЭМВО 0,4 мг/г сухого материала и хроматограмму ВЭЖХ, представленную на фиг. 2. Оба материала дают одинаковые результаты, поэтому материал данного изобретения далее будем называть просто лиофилизатом. Далее будут обсуждаться результаты биологических и токсикологических исследований, касающиеся этого лиофилизата, со специальным упором на эффекты восстановления иммунной системы и ингибирования роста опухоли и метастазов.
1. Эффект ингибирования роста опухолей и метастазов (исследования ίη νίνο).
Для исследований используют следующие типы вводимых опухолевых клеток, способствующих развитию опухолей у мышей или крыс: вариант легочной карциномы Льюиса (рак легкого мыши) с сильным образованием метастазов (3ЬЬНН), меланома мыши В16 и ксенотрансплантат карциномы толстой кишки человека НСК-25.
Подтверждают наличие опухолей 3ЬЬ-НН (ЬЬТ-НН) и В16 у инбредных мышей С57В1/6. Вводят ксенотрансплантат НСК-25 мышам СВА/СА, у которых заранее подавляют иммунитет посредством тимэктомии и полного облучения тела. В случае опухолей 3ЬЬ-НН и НСК-25 трансплантируют опухолевые клетки в селезенку, в случае меланомы В16 - в мышцы левой нижней конечности. Животным обработанной и контрольной групп с введенной опухолью НСК-25 на 21 день после трансплантации опухоли делают спленэктомию.
Обработку описанным в данном изобретении лиофилизатом начинают через 24 ч после введения опухоли. Ежедневно вводят через рот при помощи желудочного зонда дозы 3 г/кг веса тела в виде водной суспензии 0,6 г/мл.
Исследования заканчивают, умерщвляя животных под наркозом путем кровопускания, через 14 дней после трансплантации в случае опухоли ЗЕЬ-НН, через 21 день после трансплантации в случае опухоли В16 и через 51 день после трансплантации в случае опухоли НСК-25.
В табл. 3, 4 и 5 суммированы результаты этих исследований.
Таблица 3. Влияние обработки лиофилизатом согласно изобретению на количество метастазов в печени для случая введенных в селезенку клеток рака легкого мышей 3ЬЬ-НН
Обработка Количество введенных клеток Количество метастазов в печени
Контроль 3 х 103 104,0 ± 28,2
Лиофилизат 3 х 103 29,8 ± 16,4*
* р < 0,01 Каждая исследованная группа содержит 10 животных.
Таблица 4. Влияние обработки лиофилизатом согласно изобретению на количество метастазов в печени через 51 день после введения клеток карциномы толстой кишки человека в селезенку мышей СВА/СА с подавленным иммунитетом
Обработка Вес селезенки с опухолью (г) Количество метастазов в печени
Контроль, спленэктомию не делают 1,02 ± 0,59 42,0 ± 25,8
Лиофилизат, спленэктомию не делают 0,62 ± 0,47 19,5 ± 19,0
Контроль, делают спленэктомию* 0,10 ± 0,02 19,1 ± 13,5
Лиофилизат, делают спленэктомию* 0,08 ± 0,02 10,6 ± 11,6
* Спленэктомию делают через 21 день после введения в селезенку опухоли.
Каждая исследованная группа содержит 12 животных.
Таблица 5. Влияние обработки лиофилизатом согласно изобретению на вес конечности с введенной опухолью и количество метастазов в легких через 21 день после введения в мышцы конечности клеток меланомы В 16
Обработка Вес конечности с опухолью (среднее значение) Количество метастазов в легких (среднее значение)
Контроль 7,6 ± 0,43 42,4 ± 10,2
Лиофилизат 7,2 ± 0,43 6,2 ± 3,7*
* р < 0,01
Каждая исследованная группа содержит 10 животных.
Представленные выше результаты показывают, что обработка лиофилизатом, описанным в данном изобретении, существенно снижает (на 71%) количество метастазов в легких при введении в селезенку клеток опухоли 3ЕЕ-НН (табл. 3).
В случае карциномы толстой кишки человека НСК-25 лечение в течение 50 дней снижает и вес селезенки с опухолью, и количество метастазов в печени. Количество метастазов по сравнению с контрольной группой составляет примерно 50% и в группе, где делали спленэктомию, и в группе, где спленэктомию не делали (табл. 4).
В случае введенных в мышцу клеток меланомы В16 вес растущей в мышце опухоли не изменяется в результате обработки, но количество метастазов в легких снижается очень значительно, на 85% по сравнению с контрольной группой (табл. 5).
II. Исследование ίη νίίτο
Как недвусмысленно показано в представленных выше исследованиях, описанный в данном изобретении лиофилизат может существенно снижать образование метастазов злокачественных опухолей, исследованы также эффекты этих продуктов на различные фазы образования метастазов. Образование метастазов включает в себя несколько фаз, в которых, кроме пролиферации клеток и апоптотической активности первичной опухоли, играет роль адгезивный потенциал опухолевых клеток и защитные механизмы организма против опухолевых клеток. В исследованиях ίη νίνο исследуют влияние лиофилизата на пролиферацию и апоптоз клеток.
Большую часть исследований ίη νίίτο проводят на клетках меланомы мышей В16, для исследования лиофилизата используют эту опухоль на первой стадии.
1. Исследование адгезии
Адгезию опухолевых клеток изучают на микропластине с 96 ячейками. Дозы лиофилиза та составляют 300, 3000 и 30000 мкг/мл. Используют питательную среду ВРМ1, без сыворотки и при наличии 10% бычьей эмбриональной сыворотки (ЕС8). Адгезию исследуют через 10, 30, 60, 90 и 120 мин инкубации в обычных условиях. Определения производят колориметрически на основе 8КБ-исследования (Моззтапп, Т., 1. 1ттипо1. №111. 65, 55-63 /1983/). Исследование основано на окрашивании сульфородамином В всего белка культуры, поглощение определяют спектрофотометрически при 570 нм. На фиг. 4 показаны только два момента времени, которые, однако, адекватно представляют эффект лиофилизата. Показано, что если доза лиофилизата составляет 3000 мкг/мл или в десять раз больше, он драматическим образом снижает адгезию опухолевых клеток при наличии и в отсутствие сыворотки. Если доза составляет 300 мкг/мл, такого эффекта не наблюдают.
2. Исследование пролиферации
В этом исследовании опухолевые клетки высевают на микропластину с 96-ячейками за 24 ч до обработки. После обработки подходящими дозами лиофилизата также проверяют пролиферативную активность посредством 8КВисследования через 24, 48 и 72 ч после обработки. Результаты повторных исследований показывают, что в результате обработки дозами в диапазоне 900-15000 мкг/мл опухолевые клетки выходят к поверхности монослоя и, как показано методом исключения с красителем трипановым-синим, гибнут (Ра11спЬае11. 1.Р. и др., Ехр. Се11. Вез. 15, 112-117 /1985/) (фиг. 5).
Исследования на беспигментной меланоме человека (клетки опухоли А2058 - Тобаго, О.1. и др., Ргос. №11. Асай. 8οΐ. И8А 77, 5258-5262 /1980/) показывают такие же результаты, как исследования на меланотической меланоме мыши (фиг. 6). В случае этой опухоли параллельно 8ΚΒ -исследованию проводят МТТисследование, представляющее метаболическую активность клеток (Со1е, 8.Р.С.: Сапсег Сйето1йег. Рйагтасо1. 17, 259-263 /1986/). Это исследование основано на явлении, что метаболически активная клетка трансформирует соль тетразолия в окрашенный фармазановый продукт, главным образом, посредством своей дегидрогеназной активности. Цветную реакцию, которая пропорциональна этой активности, можно фиксировать спектрофотометрически при 570 нм, МТТ-исследование ясно показывает, что функциональная активность опухолевых клеток снижается даже при дозе 300 мкг/мл (фиг. 4). Как и в случае, когда клетки подходят к поверхности, причина апоптоза неизвестна, активность по утрате клеток всей клеточной популяции исследуют посредством проточной цитометрии (ЕАС8) (фиг. 7). Как показано на фиг. 7, опухолевые клетки утрачиваются (в зависимости от дозы) в необычайно большой степени.
III. Исследование влияний на иммунную реакцию.
Эффект описанного в данном изобретении лиофилизата изучают на двух различных моделях. В одной серии экспериментов исследуют бласттрансформацию моноядерных клеток, выделенных из селезенки животных, обработанных лиофилизатом, тогда как в другой серии на модели трансплантации аллотрансплантата кожи исследуют общее связывание трансплантированной кожи в области спины у мышей.
1. Исследование бласттрансформации Тлимфоцитов.
Обработка описанным в данном изобретении лиофилизатом значительно повышает бласттрансформацию Т-лимфоцитов, играющих важную роль в иммунной реакции. Это показано в следующем эксперименте.
Мышей С5-В116 обрабатывают описанным в данном изобретении лиофилизатом в течение шести недель пять раз в неделю при дозе 3 г/кг (водная суспензия 0,6 г/мл) через рот при помощи желудочного зонда. По завершении обработки лимфоциты, выделенные путем перфузии из селезенки животных, пересевают на клеточную культуру, обработанную 1 мкг/мл СопА. Через 48 ч клетки, производящие синтез ΌΝ8, метят 0,4 мкС1 (микроКюри) 3Н-тимидином. Степень маркировки определяют при помощи жидкостного сцинтилляционного счетчика (Весктап). Как показано в табл. 6, обработка Соп А значительно увеличивает (по сравнению с контролем) включение 3Н-ТйВ, то есть бласттрансформацию.
Таблица 6. Включение 3Н-тимидина в лимфоциты селезенки контрольных и обработанных лиофилизатом мышей
Обработка 1 мкг/мл СопА
Среднее (имп./мин) Среднеквадратичн. откл.
Контроль 3760,6 583,3
Лиофилизат 8041,8 957,1
2. Исследование иммуностимулирующего эффекта на модели трансплантации аллотрансплантата кожи.
Лучшей моделью для иллюстрации восстановления нарушенной иммунной реакции является исследование трансплантации аллотрансплантата кожи у мышей, которым сообщают частичную иммунную недостаточность посредством тимэктомии (хирургическое удаление тимуса). Группы мышей С57В110 и В10ЬР различаются только локусом Н-3, поэтому кожа, трансплантированная от представителя одной группы представителю другой группы, не отторгается на протяжении 7 дней, а только примерно через 3 недели. Если реципиенту делают тимэктомию, отторжение происходит в среднем через 50 дней. Все материалы, которые ускоряют созревание и дифференцировку лимфоцитов костного мозга (как гормоны тимуса), уменьшают время, необходимое для отторжения трансплантированной кожи (I. 1ттипрйагта со1оду 7, 67-78 /1985/). Такой же эффект можно наблюдать в исследованиях, когда применяют обработку описанным в данном изобретении лиофилизатом.
В качестве реципиентов используют мышей С57В110, а в качестве доноров-мышей В1С1ЬР. Мышам-реципиентам делают тимэктомию и через 7 недель трансплантацию кожи. Через одну неделю после тимэктомии начинают обработку лиофилизатом (через рот, 5 раз в неделю, 30 мг/кг). Обработку завершают через 70 дней после трансплантации кожи. Ежедневно следят за возможным отторжением кожи. В табл. 7 показано, что время отторжения у мышей без тимэктомии составляет 21 день (самцы) и 28,7 (самки), соответственно. У мышей с тимэктомией время отторжения увеличивается до 52,4 и 41,6 дней, соответственно. Обработка лиофилизатом согласно изобретению существенно укорачивает продолжительность существования трансплантатов кожи у мышей с тимэктомией и обработанных. Это показывает, что иммунная недостаточность, вызванная тимэктомией, восстанавливается в значительной степени в результате обработки, это означает, что лиофилизат оказывает иммуностимулирующее действие.
Таблица 7. Влияние обработки лиофилизатом согласно изобретению на отторжение трансплантатов кожи (реципиенты - мыши С57ВЦ0, доноры - мыши ВщЬР)
Обработка Время отторжения
Самцы Самки
Средн. значение (дни) Среднеквадратичн. откл. Средн. значение (дни) Среднеквадратичн. откл
Контроль (без тимэктомии) 21,0 3,1 28,7 4,5
Контроль (с тимэктомией) 52,4 5,0 41, 6 5,5
Лиофилизат (30 мг/кг) 28,8* 8,6 32,6** 4,5
* 0,001 < р < 0,01 относительно контроля с тимэктомией ** 0,01 < р < 0,05 относительно контроля без тимэктомии
Исследования ίη νίνο и ίη νίίτο с лиофилизатом согласно изобретению на нескольких исследованных моделях животных показывают, что этот продукт оказывает существенное антиметастатическое действие. Этот эффект, повидимому, связан с иммуностимулирующим действием, наблюдаемым в исследованиях ίη νίνο и ίη νίίτο, но возможно, что на снижение количества метастазов влияют также антипролиферативные эффекты, являющиеся причиной апоптоза, эффект исследованного материала на адгезию и эффект, вызывающий образование свободных радикалов.
IV. Исследование активности по связыванию радикалов.
Так как бензохиноны оказывают хорошо известный эффект на образование свободных радикалов, исследовали также активность описанного в данном изобретении лиофилизата по связыванию радикалов. При помощи метода электронного парамагнитного резонанса определяли связывание супероксида (8 8 А) и связывание гидроксильного радикала (ОН-8А). Лиофилизат обладает существенной активностью 88А, активность связывания 1 мг чистого радикала соответствует активности 5,64 мкг супероксиддисмутазы (8ΟΌ). Лиофилизат не обладает активностью ОН-8А, но он разрушает систему перекиси водорода/Ре, образующую гидроксильный радикал, таким образом, можно предположить, что он обладает так называемой нехелатирующей активностью.
V. Токсикологические исследования (подострые).
Согласно рекомендациям РефЧгу οί Ιηбийпа1 Τοχκοίο^ Ашта1-ба1а (ΒΙΤΑ), проводили 77-дневные токсикологические исследования (Εχρ. ΤοχΕ. Ра11ю1. 47, 247-266 /1995/) на крысах Р344 и мышах С5-В1]6. Животных ежедневно обрабатывали дозой 3 г/кг (водная суспензия 0,6 г/мл). Во время обработки наблюдали за изменением веса животных, возможными патологическими физическими изменениями, спонтанной гибелью животных. По завершении исследования определяли вес сердца, легких, тимуса, селезенки, печени, почек и яичек и исследовали 34 органа на предмет возможных патологических изменений, предписанных Κ.ΙΤΑ. Спонтанной гибели не наблюдали, вес животных изменялся так же, как и в контрольной группе. В результате исследования вес различных органов не показал изменений по сравнению с контрольной группой. При патологическом исследовании обработанных животных не наблюдали изменений, которые могли бы быть вызваны лиофилизатом.
Представленные выше результаты показывают, что ферментированный вегетативный материал согласно изобретению не является токсичным, и вследствие своего иммуностимулирующего действия он показан при всех состояниях, когда поражена иммунная система. Вследствие своих описанных выше биологических характеристик он может иметь дополнительные применения при лечении злокачественных опухолей, в основном при ингибировании метастазов.

Claims (10)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ.
    1. Ферментированный высушенный материал, являющийся иммуностимулятором и ингибирующий метастазы, который получают из сбраживаемой жидкости посредством ферментации пшеничного зерна с применением 8асс11аготусек сегеуыае в водной среде, который имеет ВЭЖХ-хроматограмму, по существу соответствующую представленной на фиг. 3, и содержание в нем 2,6-диметоксипарабензохинона составляет 0,12-0,52 мг/г сухого материала, а содержание 2-метоксипарабензохинона составляет 0,05-0,28 мг/г сухого материала, определяемого путем ВЭЖХ.
  2. 2. Материал по п.1, отличающийся тем, что содержание в нем 2,6-диметоксипарабензохинона составляет 0,4 мг/г сухого материала.
  3. 3. Способ получения ферментированного высушенного материала по любому из пп.1-2, являющегося иммуностимулятором и ингибирующего метастазы, отличающийся тем, что размолотое пшеничное зерно ферментируют в водной среде в присутствии 8ассЪагошусе8 сегеУ1§1ае и сбраживаемую жидкость отделяют, тщательно фильтруют, выпаривают, кипятят и сушат как есть или в присутствии вспомогательных осушающих материалов.
  4. 4. Способ по п.3, отличающийся тем, что ферментацию проводят при температуре 30°С примерно в течение 18 ч в условиях аэрации и перемешивания.
  5. 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что сушку проводят в присутствии мальтодекстрина.
  6. 6. Фармацевтический продукт, являющийся иммуностимулятором и ингибирующий метастазы, отличающийся тем, что содержит в качестве активного агента высушенный материал по любому из пп.1-2, полученный из сбраживаемой жидкости посредством ферментации пшеничного зерна в водной среде в присутствии
    ЗассЪагошусез сегеу1§1ае.
  7. 7. Диетическая добавка для млекопитающих, отличающаяся тем, что содержит высушенный материал по любому из пп.1-2, полученный из сбраживаемой жидкости посредством ферментации пшеничного зерна в водной среде в присутствии ЗассЪагошусез сегеу181ае.
  8. 8. Диетическая добавка по п.7, отличающаяся тем, что содержит ферментированный высушенный материал в количестве 60 вес.% и дополнительно мальтодекстрин в количестве 40 вес.%.
  9. 9. Применение высушенного материала по любому из пп.1-2, полученного из сбраживаемой жидкости посредством ферментации пшеничного зерна в водной среде в присутствии 8ассЪагошусе8 сегеу181ае, для получения иммуностимуляторной и ингибирующей метастазы фармацевтической композиции.
  10. 10. Применение высушенного материала по любому из пп.1-2, полученного из сбраживаемой жидкости посредством ферментации пшеничного зерна в водной среде в присутствии 8ассЪагошусе8 сегеу181ае, для получения диетической добавки для млекопитающих.
EA200000212A 1997-08-13 1998-08-11 Ферментированный высушенный материал, способ его получения и его применение для получения фармацевтической композиции и диетической добавки, а также фармацевтическая композиция и диетическая добавка, содержащие указанный материал EA003090B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HU9701392A HUP9701392D0 (en) 1997-08-13 1997-08-13 Immunostimulating and methastasis-inhibiting plant extract, pharmaceutical compositions containing thereof, process for production of plant extract and use for production of immunostimulating and metastasis-inhibiting pharmaceutical composition thereof
HU9801797A HU223344B1 (hu) 1997-08-13 1998-08-05 Immunstimuláns és metasztázist gátló fermentált, szárított anyag, ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények, eljárás az előállítására és alkalmazásai
PCT/HU1998/000077 WO1999008694A1 (en) 1997-08-13 1998-08-11 Immunostimulatory and metastasis inhibiting fermented vegetal material

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200000212A1 EA200000212A1 (ru) 2000-08-28
EA003090B1 true EA003090B1 (ru) 2002-12-26

Family

ID=90014226

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200000212A EA003090B1 (ru) 1997-08-13 1998-08-11 Ферментированный высушенный материал, способ его получения и его применение для получения фармацевтической композиции и диетической добавки, а также фармацевтическая композиция и диетическая добавка, содержащие указанный материал

Country Status (31)

Country Link
US (1) US6355474B1 (ru)
EP (1) EP1003536B1 (ru)
JP (3) JP4387586B2 (ru)
KR (2) KR100544376B1 (ru)
CN (1) CN1192099C (ru)
AT (1) ATE227580T1 (ru)
AU (1) AU754815B2 (ru)
BG (1) BG64038B1 (ru)
BR (1) BR9811936B1 (ru)
CA (1) CA2300208C (ru)
CZ (1) CZ298654B6 (ru)
DE (1) DE69809434T2 (ru)
DK (1) DK1003536T3 (ru)
EA (1) EA003090B1 (ru)
EE (1) EE04222B1 (ru)
ES (1) ES2186208T3 (ru)
GE (1) GEP20032988B (ru)
HK (1) HK1033097A1 (ru)
HU (1) HU223344B1 (ru)
ID (1) ID25515A (ru)
IL (1) IL134493A (ru)
ME (1) ME00638B (ru)
NO (1) NO323562B1 (ru)
PL (1) PL191414B1 (ru)
PT (1) PT1003536E (ru)
RS (1) RS49692B (ru)
SK (2) SK282917B6 (ru)
TR (1) TR200000404T2 (ru)
UA (1) UA67747C2 (ru)
WO (1) WO1999008694A1 (ru)
YU (1) YU7200A (ru)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1235931C (zh) 1998-04-24 2006-01-11 Ck威特科有限公司 使用硅烷或硅烷处理的填料的粉末涂料或粘合剂
FR2815822B1 (fr) * 2000-10-30 2004-08-27 Roquette Freres Additif carbone pour fermentations alimentaires et compositions alimentaires le contenant
FR2834718B1 (fr) * 2002-01-15 2004-12-24 Cognis France Sa Substances actives cosmetiques et/ou pharmaceutiques
US20040043084A1 (en) * 2002-05-02 2004-03-04 George Cioca Method of enhancing biological activity of plant extracts
HUP0202638A3 (en) * 2002-08-09 2007-08-28 Hidvegi Mate Dr Use of fermented wheat-germ extract for preparation of antiphlogistic compositions
BR0215836A (pt) * 2002-08-13 2005-06-07 Mate Hidvegi Uso de germe de trigo fermentado na alimentação e na prática veterinária
EA009170B1 (ru) * 2002-08-13 2007-10-26 Мате Хидвеги Применение ферментированных зародышей пшеницы в ветеринарной практике
WO2007140277A1 (en) 2006-05-24 2007-12-06 Vitality Concepts Corporation Method for embedding and targeted release of micronutrients in activated dietary fibers
US7365102B1 (en) 2007-02-26 2008-04-29 Delphi Technologies, Inc. Process for pre-reforming hydrocarbon fuels
HUP0900614A2 (en) 2009-09-29 2011-05-30 Mate Dr Hidvegi Preparation comprising dehydrated, fermented material with amorphous crystaline structure and process for its production
WO2010100515A2 (en) * 2009-03-06 2010-09-10 Hidvegi Mate Fractions of wheat germ ferment
JPWO2011083768A1 (ja) * 2010-01-08 2013-05-13 住友ベークライト株式会社 細胞凝集塊形成用培養容器
US20120164132A1 (en) * 2010-08-02 2012-06-28 Mate Hidvegi Anticancer and immunomodulating molecules and fractions containing said molecules, and process for preparing said fractions and said molecules from fermented vegetal material, and their uses
GB201108560D0 (en) 2011-05-20 2011-07-06 3 Ch Ltd Use of fermented wheat germ in the treatment of inflammatory bowel disease
GB201110746D0 (en) 2011-06-23 2011-08-10 Biropharma Uk Ltd Wheat germ derived material
US11090353B2 (en) 2013-04-22 2021-08-17 David Wales Gluten-free grain-concentrate substitute for fermented wheat germ drug product and method preparation
US11129389B2 (en) 2013-04-22 2021-09-28 David Wales Gluten-free grain-concentrate substitute for fermented wheat germ food product and method of preparation
JP2017033691A (ja) * 2015-07-30 2017-02-09 三菱自動車工業株式会社 車載電池パック、リチウムイオン補充装置、及びリチウムイオン補充方法
CN107455551A (zh) * 2016-06-06 2017-12-12 铜陵安尔生物科技有限公司 麦胚发酵黄酮提取物及其制备方法与在动物饲养中的应用
JP6739774B2 (ja) * 2018-06-25 2020-08-12 学校法人立命館 がんの治療、予防、改善、抑制又は転移抑制用組成物
HUE065477T2 (hu) 2018-11-27 2024-05-28 Gyula Bencze Fermentált búzacsíra élelmiszer termék helyettestésére alkalmas gluténmentes gabonakoncentrátum és eljárás annak elõállítására
WO2022091075A1 (en) * 2020-11-01 2022-05-05 Aili Life Sciences Ltd. Combination compositions of probiotics with fermented wheat germ extract and uses thereof

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS63230774A (ja) * 1987-03-19 1988-09-27 Seinosuke Ueda 紫青系色素の製法
JP2618286B2 (ja) * 1990-10-25 1997-06-11 免疫代謝薬製造株式会社 降圧酵母製剤及びその製造法
KR940001544B1 (ko) * 1990-11-21 1994-02-24 강권중 은행잎을 위시한 천연약재로부터 미생물의 공서배양에 의한 건강식품의 제조방법
JP3296433B2 (ja) * 1990-11-30 2002-07-02 日本食品化工株式会社 酒類の製造法
US5231017A (en) 1991-05-17 1993-07-27 Solvay Enzymes, Inc. Process for producing ethanol
EP0625187B1 (en) * 1992-02-06 1997-04-23 Bio-Technical Resources, Inc. Concentrated beer flavor product
KR100340091B1 (ko) * 1993-08-09 2002-09-27 베르찌 이스트반 킬러세포개재세포용해를위한암세포감작용약학적제제
JPH07155136A (ja) * 1993-12-03 1995-06-20 Nippon Mektron Ltd 植物発酵エキス粉末の製造方法
EP1090553A3 (en) * 1993-12-24 2001-04-18 Dsm N.V. Dry yeast compositions
ES2163430T3 (es) * 1994-01-06 2002-02-01 Hyd Kutato Fejleszto Ktf Productos alimenticios para la prevencion del desarrollo de enfermedades y procedimiento para su preparacion.
JP3471879B2 (ja) * 1994-01-20 2003-12-02 ルードヴィッヒ インスティテュート フォー キャンサー リサーチ セリンキナーゼ活性の抑制方法、ｐｉ３−キナーゼのサブユニット間の結合活性の調整方法、ｐｉ３−キナーゼのサブユニット結合抗体、この抗体を生成するハイブリドーマ細胞系、核酸分子、プラスミド、アゴニスト、アンタゴニスト、ｐｉ３−キナーゼ活性を抑制するサブユニット結合分子、サブユニットの存在検出方法、ｐｉ３−キナーゼ活性の抑制剤製造方法、およびｐｉ３−キナーゼ活性の抑制剤
JP2875739B2 (ja) * 1994-04-27 1999-03-31 エーザイ株式会社 ＮＦκＢ活性阻害剤
DK0684306T4 (da) * 1994-05-27 2004-05-10 Agrano Ag Fremgangsmåde til fremstilling af en biomasse ud fra et kornsubstrat, anvendelse af de ved fremgangsmåden opnåede produkter, samt brödbagningsgærstof
JP4167733B2 (ja) * 1996-12-16 2008-10-22 花王株式会社 ＮＦ−κＢ活性化抑制剤

Also Published As

Publication number Publication date
PT1003536E (pt) 2003-02-28
CA2300208C (en) 2009-12-29
RS49692B (sr) 2007-12-31
EE200000078A (et) 2000-10-16
US6355474B1 (en) 2002-03-12
CZ2000418A3 (cs) 2000-06-14
PL338891A1 (en) 2000-11-20
ATE227580T1 (de) 2002-11-15
HU223344B1 (hu) 2004-06-28
SK282917B6 (sk) 2003-01-09
UA67747C2 (ru) 2004-07-15
CZ298654B6 (cs) 2007-12-05
IL134493A0 (en) 2001-04-30
BG104220A (en) 2000-11-30
AU8880298A (en) 1999-03-08
CA2300208A1 (en) 1999-02-25
KR100544377B1 (ko) 2006-01-23
IL134493A (en) 2003-07-31
ES2186208T3 (es) 2003-05-01
DE69809434D1 (de) 2002-12-19
HUP9801797D0 (en) 1998-09-28
NO20000675D0 (no) 2000-02-10
JP4387586B2 (ja) 2009-12-16
EE04222B1 (et) 2004-02-16
JP4886087B2 (ja) 2012-02-29
EA200000212A1 (ru) 2000-08-28
CN1192099C (zh) 2005-03-09
JP2009240327A (ja) 2009-10-22
WO1999008694A1 (en) 1999-02-25
EP1003536B1 (en) 2002-11-13
AU754815B2 (en) 2002-11-28
KR100544376B1 (ko) 2006-01-24
HUP9801797A3 (en) 1999-06-28
PL191414B1 (pl) 2006-05-31
NO20000675L (no) 2000-03-30
JP4861458B2 (ja) 2012-01-25
ID25515A (id) 2000-10-05
BG64038B1 (bg) 2003-11-28
HK1033097A1 (en) 2001-08-17
SK1822000A3 (en) 2000-09-12
CN1275915A (zh) 2000-12-06
KR20010022857A (ko) 2001-03-26
TR200000404T2 (tr) 2000-09-21
NO323562B1 (no) 2007-06-11
BR9811936B1 (pt) 2014-02-11
GEP20032988B (en) 2003-06-25
JP2011236245A (ja) 2011-11-24
JP2001515043A (ja) 2001-09-18
KR20050084539A (ko) 2005-08-26
DK1003536T3 (da) 2003-03-03
DE69809434T2 (de) 2003-07-17
BR9811936A (pt) 2000-09-05
ME00638B (me) 2007-12-31
EP1003536A1 (en) 2000-05-31
HUP9801797A2 (hu) 1999-05-28
YU7200A (sh) 2001-05-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA003090B1 (ru) Ферментированный высушенный материал, способ его получения и его применение для получения фармацевтической композиции и диетической добавки, а также фармацевтическая композиция и диетическая добавка, содержащие указанный материал
Khwaja et al. Recent studies on the anticancer activities of mistletoe (Viscum album) and its alkaloids
Giri et al. In vitro production of phenolic compounds and antioxidant activity in callus suspension cultures of Habenaria edgeworthii: A rare Himalayan medicinal orchid
KR101409194B1 (ko) 에쿠올 농도 조절제
WO2003074062A2 (en) Isolation, purification and structural identification of a bioactive component of a water soluble extract of a botanical species for enhancing immune, anti-inflammatory, anti-tumor and dna repair processes of warm blooded animals
DK166806B1 (da) Anvendelse af plantepollenekstrakter til fremstilling af farmaceutiske, tumorcellevaeksthaemmende praeparater
BG98956A (bg) Съединения и продукти на реакцията на амаdоri,метод за тяхното производство и използването им
EP2127647A1 (en) Composition for inhibiting muscle damage
US6616928B1 (en) Active oxygen scavenger and cancer chemopreventer from Grifola
KR20160058201A (ko) 발효 미생물을 이용한 수경재배 인삼 잎 분말의 제조 방법 및 이에 따라 제조된 수경재배 인삼 잎 분말
RU2818479C1 (ru) Способ получения биопрепарата из вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus), обладающего противоопухолевой активностью
MXPA00001557A (en) Immunostimulatory and metastasis inhibiting fermented vegetal material
Demirci et al. The moisture determination of bee pollen from Sivas Province in Anatolia and their antiproliferative activities in MCF-7 cell line
KR20050076325A (ko) 솔잎 투명 액기스를 유효성분으로 함유하는 건강식품
KR102275715B1 (ko) 먹물버섯 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항암용 약학적 조성물 및 이의 제조방법
JP2003095976A (ja) 抗酸化組成物、発癌予防剤及び食酢分離組成物
CN114470150A (zh) 一种鸡源性小分子肽在制备预防和改善肝损伤及其继发症状产品中的应用及该产品
Golderova et al. Effect of Phlojodicarpus sibiricus on the proliferative activity of the HepG2 cell line

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU

NF4A Restoration of lapsed right to a eurasian patent

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU

NF4A Restoration of lapsed right to a eurasian patent

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU

TK4A Corrections in published eurasian patents
PC4A Registration of transfer of a eurasian patent by assignment
QB4A Registration of a licence in a contracting state
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU