DK175807B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af human vækstfaktor fra endotheliale celler - Google Patents

Description

DK 175807 B1 γν— x i!------1. —c—i -» ___i. —»---l :___a r-\M λ __a ._a___ ucii luicn^vjciiuc υμιιι lucoc αι iyai icAuiiiLyinaiu oymcso«? ai human endothelial cellevækstfaktor (ECGF), den rekombinante DNA-dirigerede syntese og anvendelse af ECGF som præparater ved behandling af endothelial celleødelæggelse og/eller regeneration.

5

Endothelial cellevækstfaktor i det efterfølgende betegnet "ECGF" er et mitogen for endotheliale celler in vitro. Væksten af endotheliale celler er et nødvendigt trin under angiogenese [Maciag, Prog. Hemostasis and Thromb, 7:167-182 (1984); Maciag, T., Hoover, G.A., og Weinstein, R„ J. Biol. Chem., 10 257:5333-5336 (1982)]. Bovint ECGF er blevet isoleret af Maciag, et al., [Science 225:932-935 (1984)] under anvendelse af streptomycinsulfatud-fældning, geleksklusionskromatografi, ammoniumsulfatudfældning og hepa-rin-sepharoseaffinitetskromatografi. Bovint ECGF renset på denne måde giver et enkeltkædet polypeptid, der er i besiddelse af et anionisk isoelektrisk 15 punkt og en tilsyneladende molekylvægt på 20.000 [Maciag, supra; Schrei- ber, et al., J. Cell Biol., 101:1623-1626 (1985); og Schreiber, et al., Proc.

i : Natl. Acad. Sci., 82:6138-6142 (1985)]. For nylig er multiple former af bovint | ECGF blevet isoleret af Burgess, et al., [J. Biol. Chem. 260:11389-11392 I (1985)] ved natriumchloridgradienteluering af bovint ECGF fra heparin- ! 20 sepharosesøjlen eller ved omvendt fase højtryksvæskekromatografi (HPLC).

De to isolerede polypeptider, betegnet a- og β-ECGF har en tilsyneladende molekylvægt på henholdsvis 17.000 og 20.000. Under anvendelse af denne metode koncentreres bovint ECGF indeholdt i 8500 ml bovin hjerneekstrakt (6,25 x 107 totale enheder) til et total rumfang på 6 ml a-ECGF (3,0 x 106 en-25 heder) og 3 ml a-ECGF (5,2 x 105 enheder). Dette er en 9300 gange rensning af α-ECGF og 16.300 gange rensning af β-ECGF (Burgess, supra). For nylig er der blevet fremstillet murine monoklonale antistoffer over for bovint ECGF (Maciag, et al., supra), der kan være af værdi ved oprensning af bovint I ECGF på samme måde som monoklonal antistofrensning af faktor VIIIC be- 30 skrevet af Zimmerman og Fulcher i USA patentskrift nr. 4 361 509.

Generelt er rekombinante DNA metoder velkendte. Se f.eks. Methods In En- zymology. (Academic Press, New York) bind 65 og 68 (1979); 100 og 101

' I

DK 175807 B1 I

(1983) og referencer angivet heri, som der herved henvises til. En udtøm- · H

mende teknisk diskussion, der omfatter de mest almindelige anvendte re- H

kombinante DNA metodologier kan findes i Maniatis, et al., Molecular Clo- H

ning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982). Gener kodende for forskellige

5 polypeptider kan klones ved inkorporering af et DNA fragment, der koder for H

polypeptidet, i et rekombinant DNA vehikel som f.eks. bakterielle eller virale H

vektorer og omdanne en passende vært. Denne vært er typisk en Escheri- H

chia coli (E. coli) stamme, imidlertid kan afhængigt af det pågældende pro- H

dukt anvendes eukaryotiske værter. Kloner indeholdende de rekombinante H

10 vektorer isoleres og kan dyrkes og anvendes til frembringelse af det ønskede H

polypeptid i stor målestok. , H

Adskillige grupper videnskabsmænd har isoleret blandinger af messenger H

RNA (mRNA) fra eukaryotiske celler og anvendt en række enzymatiske reak- H

15 tioner til at syntetisere dobbelstrengede DNA kopier, der er komplementære H

med denne mRNA blanding. Ved den første reaktion transscriberes mRNA H

ind i et enkeltstrenget komplementært DNA (cDNA) ved hjælp af en RNA- H

dirigeret DNA polymerase, også betegnet omvendt transcriptase. Omvendt H

transscriptase syntetiserer DNA i 5'-3' retningen, under anvendelse af deoxy- H

20 ribonucleocid 5'-triphosphater som precursorer og kræver både en skabelon H

og en primerstreng, i det sidstnævnte skal have en fri 3'-hydroxylendestilling. H

Omvendte transcriptaseprodukter, hvad enten det er delvise eller fuldstændi- H

ge kopier af mRNA skabelonen, er ofte i besiddelse af delvis dobbeltstrenge- H

de hårnålesving ("loops") ved deres 3-endestilling. Ved en anden reaktion H

25 kan disse "hårnålesving" anvendes som primere for DNA polymeraser. H

Foruddannet DNA er nødvendig både som en skabelon og som en primer H

ved virkningen af DNA polymerase. DNA polymerasen kræver tilstedeværel- H

sen af en DNA-streng med en fri 3'-hydroxylgruppe, hvortil nye nucleotider H

kan sættes ved at udstrække kæden i 5-3' retningen. Slutprodukterne af dis-30 se trinvise omvendt transscriptase og DNA polymease reaktioner har stadig- H

væk et sving ved den ene ende. Spidsen af dette sving eller "foldepunktet" af H

det dobbeltstrengede DNA, der er frembragt på denne måde, er i det væsent- H

lige et enkeltstrenget stykke. Ved den tredje reaktion spaltes dette enkelt- H

3 DK 175807 B1 ctrPnnpHo ctukko rnoH onkoltetrannot οηβΛΪΙίΙτ m irlooca ΟΙ fminhrinnele·« -if ---- ς;---- - -J---------— —---------- "· σ--"K'''·'" ' ' · '-'"-’V.WW W · .. V.M^.H igwiww Ml et "stump afsluttet" dobbelt DNA stykke. Denne generelle metode kan anvendes på en hvilken som helst mRNA blanding og beskrevet af Bueil, et al., J. Biol. Chem., 253:2483 (1978).

5

Den fremstillede dobbeltstrengede cDNA blanding (ds-cDNA) indføres i kloningsvehikler ved en vilkårlig af en hel række kendte metoder afhængig i det mindste delvis af det specielt anvendte vehikel. Forskellige indførelsesmetoder er detaljeret diskuteret i Methods In Enzymology, 68:16-18 (1980), som i 10 der herved henvises til.

Når DNA stykkerne er indført anvendes kloningsvehiklet til at transformer en passende vært. Disse kloningsvehikler tildeler sædvanligvis et antibiotisk resistenstræk til værten. Sådanne værter er sædvanligvis prokaryotiske celler.

15 På dette punkt indeholder kun nogle få af de transformerede eller transfererede værter det ønskede cDNA. Summen af alle transformerede eller transfererede værter udgør et gen "bibliotek". Det totale ds-cDNA bibliotek frembragt på denne måde tilvejebringer en repræsentativ prøve på kodeinforma-tionen, der forefindes i den mRNA blanding, der anvendtes som udgangsma-20 terialet.

Dersom en passende oligonucleotidsekvens er tilgængelig, kan den anvendes til at identificere de pågældende kloner på følgende måde. Individuelle transformerede eller tranfekterede celler dyrkes som kolonier på et nitrocellu-25 losefiltrerpapir. Disse kolonier lyseres; den frigjorte DNA bindes kraftigt til filtrerpapiret ved opvarmning. Herefter inkuberes papiret med en mærket oli-gonucleotidprobe, der er komplementærtil det pågældende strukturelle gen.

Proben hybridiseres med cDNA, som den er komplementær til, og identificeres ved autoradiografi. De tilsvarende kloner karakteriseres forat identificere 30 en eller en kombination af kloner, der indeholder hele den strukturelle infor-! mation for det ønskede protein. Nucleotidsyresekvensen, der koder for det protein, man har interesse i, isoleres og genindføres i en ekspressionsvektor. Ekspressionsvektoren bringer det klonede gen under den regulerende kontrol

I DK 175807 B1 I

I I

I af specifikke prokaryotiske eller eukaryotiske kontrolelementer, der muliggør I

I effektiv ekspression (transscription og translation) af ds-cDNA'et. Denne ge- I

I nerelle metode er således kun anvendelig til de proteiner, hvor i det mindst I

en del af deres aminosyre eller DNA sekvens er kendt, for hvilke en oligo- I

I 5 nucleotidprobe er tilgængelig. Se generelt Maniatis, et al., supra.

I For nyligt er der blevet udviklet metoder til at identificere specifikke kloner I

I ved at probeundersøge bakterielle kolonier eller fag plaque med antistoffer I

I specifikke for det ønskede indkodede protein. Denne metode kan kun an- I

I 10 vendes med "ekspressionsvektor”-kloningsvehikler, da oparbejdning af prote- I

I inproduktet er nødvendig. Det strukturelle gen indføres i vektoren nabostillet ! I

I til de regulerende gensekvenser, der kontrollerer ekspression af proteinet. I

I Cellerne lyseres, enten kemisk eller ved hjælp af en funktion leveret af I

I værtscellen eller vektoren, og proteinet afsløres ved hjælp af et specifikt anti- I

I 15 stof og et afsløringssystem som f.eks. enzymimmunoforsøg. Et eksempel I

I herpå er Xgtn systemet beskrevet af Young and Davis, Proc. Nat'l. Acad. Sci. ' I

I ; USA, 80:1194-1198 (1983) og Young and Davis, Science, 222:778 (1983). I

I Den foreliggende opfindelse tilvejebringer let i store mængder ECGF eller I

I i 20 ECGF fragmenter. Dette er opnået med oligonucleotider, hvis opbygning er I

I ; baseret på kendskabet til aminosyresekvensen af bovint ECGF, og som rea- I

I ; gerer specifikt med ECGF cDNA. Produktion af ECGF opnås ved anvendel- I

sen af rekombinant DNA teknologi til fremstilling af kloningsvehikler, der ko-

I der ECGF proteinet, og metoder til at udvinde ECGF protein i det væsentlige I

I 25 uden andre proteiner af human oprindelse. I

I Den foreliggende opfindelse tilvejebringer således ECGF eller fragmentet I

I heraf i det væsentlige uden andre proteiner af human oprindelse. ECGF

frembringes ved hjælp af rekombinante DNA metoder i værtsceller eller an- I

I 30 dre selvreproducerende systemer og opnås i det væsentlige i ren form. Her- I

I ; udover tilvejebringer opfindelse replicerbare ekspressionsvektorer indehol- I

I dende en DNA sekvens, der koder for ECGF, og et selvreproducerende I

I , . værtscellesystem transformeret eller tranfekteret hermed. Værtssystemet er I

5 DK 175807 B1 caoHtfanlinuic nmlarNfriticl· f otc P rv\li olier P eiihtilic οΙΙοΓβ·ιΙ/3ηιη>ί0ΐο nol --------------------J------------------------— -------------- ------ } —------ --.

ler.

ECGF frembringes ved en metode der er ejendommelig ved at man (a) frem-5 stiller en replicerbar ekspressionsvektor, der er i stand til at udtrykke DNA sekvensen, der koder for ECGF, i et passende værtscellesystem; (b) at man transformerer værtssystemet til opnåelse af et rekombinant værtssystem; (c) at man opretholder det rekombinante værtssystem under betingelser, der muliggør ekspression af den ECGF-kodende DNA sekvens til frembringelse 10 af ECGF protein, hvilken human endothelial cellevækstfaktor med a-ECGF eller β-ECGF-sekvensen vist i figur 8, eller er en alle) variant, modifikation eller endog af nævnte α-ECGF eller β-ECGF, som bevarer de biologiske aktive egenskaber af naturlig ECGF; og (d) at man udvinder ECGF proteinet. Fortrinsvis fremstilles den ÉCGF-kodende reproducerbare ekspressionsvek-15 tor ved at fremstille et ds-cDNA præparat, der er repræsentativt for ECGF mRNA og indarbejdet ds-cDNA i reproducerbare ekspressionsvektorer. Den foretrukne metode til at udvinde ECGF omfatter omsætning af proteinerne udtrykt af det rekombinante værtssystem med en reagensblanding, der omfatter mindst et bindingstrin, der er specifikt for ECGF. Den foreliggende op-20 findelse tilvejebringer endvidere ECGF, som kan anvendes som terapeutisk middel til behandling af beskadigede blodkar eller til at regenerere disse og andre endotheliale celle-afhængige strukturer.

På tegningen viser ! 25 fig. 1 den generelle metode for enzymatiske reaktioner til frembringelse af cDNA kloner, fig. 2 fremstilling af et bibliotek indeholdende DNA fragmenter indskudt i 30 Xgtn, fig. 3 en delvis aminosyresekvens af bovint α og β ECGF, idet i

DK 175807 B1 I

linie a: amino-endestillet aminosyresekvens af bovint aECGF, I

linie b: amino-endestillet aminosyresekvens af bovint pECGF. Delen i paren- I

tes svarer til NH2-endestillet del, hvilket sekvens ikke kunne be- I

5 stemmes; aminosyresammensætningen er angivet i stedet for. Se- I

kvensen begyndende med PheAsnLeu... bestemtes ud fra tryp- I

sinspaltet bovint pECGF,

linie c: aminosyresekvens af cyanbromidspaltet bovint aECGF, I

linie d: aminosyresekvens af cyanbromidspaltet bovint pECGF, I

fig. 4 hydrogenbundne basepar, I

15 fig. 5 opbygningen af en oligonucleotidprobe for human endothelial celle- I

vækstfaktor, I

fig. 6 et skematisk diagram af humane ECGF cDNA kloner 1 og 29. Den åb- I

ne aflæsningskasse repræsenterer den åbne aflæsningsramme, der koder I

20 humant β ECGF. EcoRI pladserne svarer til syntetiske oligonucleotidlinkere I

anvendt ved opbygningen af cDNA biblioteket. Poly (A) halen ved 3’ enden af I

klon 1 er angivet ved Αι7, I

fig. 7 homologien mellem human ECGF cDNA sekvens og oligonucleotidpro- I

25 ber, I

linie a; bovin trypsin- eller cyanbromidspaltet β ECGF aminosyresekvens, I

linie b: speciel oligonucleotidprobe, I

30 I

linie c: human ECGF cDNA sekvens (bestemt ud fra λ ECGF kloner 1 og I

29), I

7 DK 175807 B1 iinie u. human ECGF amn lusyi eseKveiia a Tied i na uuNA »crwenaanalystJ, fig. 8 den fuldstændige cDNA sekvens af human ECGF. cDNA indskuddene fra ECGF kloner 1 og 29 subklonedes i M13mp18, og den ECGF-kodende 5 åbne aflæsningsramme og omgivende områder sekvensbedømtes ved kædeafslutningsmetoden. I ramme er stopcodoner ved 5' og 3' enderne af den ECGF kodende åbne aflæsningsramme angivet ved henholdsvis den understregede sekvens og trm. De anvendte enkeltbogstaver for aminosyreme er følgende: A, Ala; C, Cys; D, Asp; E, Glu; F, Phe; G, Gly; H, His; I, Ile; K, Lys, 10 L, Leu; M, Met; N, Asn; P, Pro; Q, Gin; R, Arg; S, Ser; T, Thr; V, Val; W, Trp; V, Tyr, og fig. 9 Northern blotanalyse af ECGF mRNA. RNA denatureredes i 2,2 M formaldehyd og 50 % formamid og fraktioneredes ved elektrophorese i en 15 1,25 % agarosegel indeholdende 2,2 M formaldehyd. Denne overførtes til

GeneScreen Plus (New England Nuclear) ved blotting med 10 x SSPE. Blottene blev hybridiseret til 32P-mærket nick-translaterede prober af ECGF klon 1 ved 65 °C i 16 timer i en blanding indeholdende 2 x SSPE, 20 x Denhardts opløsning, gæroverførsels RNA (200 pg/ml) og 0,2 % SDS. Membranen 20 vaskedes herefter ved 65 °C, to gange med 2 x SSPE og 0,2 % SDS, herefter to gange med 0,2 x SSPE og 0,2 % SDS, lufttørredes og eksponeredes natten over på en Kodak XAR film med forstørrelsesskærm. Vandringen af 28S og 18S RNA bemærkes, i 25 Bane 1: 10 pg humant hjerne poly(A)-holdig RNA.

Bane 2: 10 pg humant voksenlever poly(A)-holdig RNA.

j I foreliggende beskrivelse med krav betyder "ECGF" endothelial cellevækst- 30 faktor eller fragmenter heraf produceret af celle eller cellefri dyrkningssystemer, i bioaktive former med evne til at influere cellevækst, differentiering og vandring in vitro således som oprindelig ECGF gør ved humane angiogene processer.

DK 175807 B1 I

' I

Forskellige alleler af ECGF kan findes i naturen. Disse variationer kan karak- teriseres ved forskelle i nucleotidsekvensen af det strukturelle gen, der koder

for proteiner med identisk biologisk funktion. Det er muligt at frembringe ana- I

5 loge med enkle eller multiple aminosyresubstitioner, deletioner, additioner eller ombygninger. Alle sådanne alleliske variationer, modifikationer og ana- loge, der resulterer i derivater af ECGF, der bibeholder de biologisk aktive

egenskaber ved det oprindelige ECGF, falder inden for den foreliggende op- I

findelses rammer. I

"Ekspressionsvektorer" betyder vektorer, der er i stand til at transscribere og I

; translatere DNA sekvenser indeholdt deri, hvor sådanne sekvenser er knyttet I

til andre regulerende sekvenser, der er i stand til at påvirke deres ekspressi- I

on. Disse ekspressionsvektorer skal være reproducerbare i værtsorganis- I

15 merne eller systemerne enten som episomer, bakteriofager eller som en in- 1 I

tegreret del af det kromosomale DNA. En form for ekspressionsvektor, der er I

specielt velegnet til den foreliggende opfindelse, er bakteriofagen, vira, der I

normalt bor i og opformeres i bakterier. Særligt anvendelige fag til dette for- I

mål er Xgt10 og gtn fagen beskrevet af Young og Davis, supra, λgt11 er en I

20 generel rekombinant DNA ekspressionsvektor, der er i stand til at frembringe I

polypeptider specificeret af det indførte DNA. I

For at formindske nedbrydning ved induktion med en syntetisk analog af lac- I

tose (IPTG) syntetiseres fremmede proteiner eller dele heraf koblet til proka- I

25 ryotisk protein B-galactosidase. Anvendelsen af defektive værtsceller under I

proteinnedbrydningen kan også forøge levetiden af de omhandlede proteiner I

frembragt fra de inducerede Xgtn kloner. Korrekt ekspression af fremmed I

DNA i λgt11kloner vil afhænge af den korrekte orientering og aflæsningsram- I

i me af det indførte DNA i forhold til β-galactosidase promotoren og transla- I

30 tionsinitiationscodonen. I

En anden form for ekspressionvektor, der kan anvendes ved rekombinant I

DNA metoder, er plasmidet - en cirkulær uintegreret (ekstra-kromosomal) I

DK 175807 B1 I

Is

dobbeltstrenget DNA slynge. En hvilken som helst anden rorm ror ekspiessi- S

onsvektor, der tjener en lignende funktion, er velegnet til anvendelse ved den I

omhandlede fremgangsmåde. I

5 Rekombinante vektorer og metodologien i foreliggende beskrivelse med krav I

er velegnet til at anvendes i værtsceller, der dækker et bredt område af pro- I

karyotiske og eukaryotiske organismer. Prokaryotiske celler foretrækkes til . I

kloning af DNA sekvenser og ved opbygningen af vektorer. F.eks. er E. coli ! I

K12 stamme HB101 (ATCC nr. 33694) specielt velegnet. Naturligvis kan an- : I

10 dre mikrobielle stammer anvendes. Vektorer indeholdende replikations- og I

kontrolsekvenser, der stammer fra arter, der er forenelige med værtscellen I

eller systemet, anvendes i forbindelse med disse værter. Vektoren bærer I

sædvanligvis en origin for replikation, såvel som karakteristika, der er i stand I

til at tilvejebringe phenotypisk selektion i transformerede celler. F.eks. kan E. : I

15 coli transformeres under anvendelse af vektoren pBR322, der indeholder I

gener for ampicillin og tetracyclin resistens [Bolivar, et al., Gene. 2:95 I

(1977)]. I

Disse antibiotiske resistensgener tilvejebringer en metode til identifikation af I

20 transformerede celler. Ekspressionsvektoren kan også indeholde kontrolele- I

menter, der kan anvendes til ekspression af det pågældende gen. Fælles I

prokaryotiske kontrolelementer anvendt til ekspression af fremmede DNA I

sekvenser i E. coli omfatter promotorer og regulerende sekvenser stammen- I

de fra B. galactosidase og tryptophan (trp) operoner af E. coli såvel som pR I

! 25 og pL promotorer af bakteriofag λ. Kombinationer af disse elementer er også I

blevet anvendt (f.eks. TAC, der er en fusion af trp promotoren med lactoseo- I

peratoren). Andre promotorer er også blevet opdaget og anvendt, og detaljer med hensyn til deres nucleotidsekvenser er blevet offentliggjort, hvilket muliggør at fagmanden kan kombinere og anvende dem funktionelt.

Udover prokaryoter kan eukaryotiske mikrober som f.eks. gærkulturer anvendes. Saccharomyces cerevisiae, eller almindelig bagerigær, er den mest almindeligt anvendte blandt eukaryotiske mikroorganismer, skønt en hel H DK 175807 B1 Η række andre stammer er almindeligt tilgængelige. Gærpromotorer velegnet til ekspression af fremmede DNA sekvenser i gær omfatter promotorerne for 3-phosphoglyceratkinase eller andre glycolytiske enzymer. Velegnede eks-pressionsvektorer kan indeholde afslutningssignaler, der tilvejebringer polya-5 denylering og afslutning af mRNA transscriptionen af det klonede gen. En , H hvilken som helst vektor indeholdende en gærforenelig promotor, origin for replikation og passende afslutningssekvens er velegnet til ekspression af I ECGF.

H 10 Cellelinier stammende fra multicellulære organismer kan også anvendes som j værter. Specielt kan en hvilken som helst cellekultur anvendes, hvad enten den er fra et hvirveldyr eller fra et ikke-hvirveldyr. Imidlertid har man især in- teresseret sig for hvirveldyrceller, og propagering af disse celler i vævskultu- rer er blevet rutineprocedure inden for de senere år. Eksempler på sådanne 15 anvendelige værter er VERO, HeLa, muse C127, kinesisk hamsterovarie (CHO), WI38, BHK, COS-7 og MDCK cellelinier. Ekspressionsvektorer for sådanne celler omfatter sædvanligvis en origin for replikation, en promotor anbragt foran det gen, der skal udtrykkes, RNA opsplitningspladser (eventu- elt) og transscriptionelle afslutningssekvenser.

20 I Når anvendelsen skal ske i pattedyrceller tilvejebringes kontrolfunktionerne (promotorer og fremmere) på ekspressionsvektoreme ofte af viralt materiale.

I F.eks. stammer almindeligt anvendte promotorer fra polyoma, adenovirus I 2 og oftest fra simian virus 40 (SV40). Eukaryotiske promotorer som f.eks.

I 25 promotoren af det murine metallothioneingen [Paulakis og Hamer, Proc. Natl.

I Acad. Sci. 80:397-401 (1983)] kan også anvendes. Yderligere er det muligt og også ofte ønskeligt at anvende promotor eller kontrolsekvenser, der er I naturligt associeret ved den ønskede gensekvens, forudsat at sådanne kon- trolsekvenser er forenelige med værtssystemet. For at forøge hastigheden af I 30 transscription kan eukaryotiske forøgersekvenser også sættes til opbygnin- I gen. Disse sekvenser kan fås fra en hel række dyreceller eller oncogene re- trovira som f.eks. musesarcomavirus.

11 DK 175807 B1 I En origin for replikation kan tilvejebringes enten ved opbygniriy af VcktOlCH i således at den indeholder en exogen origin således som den der tilvejebringes af SV40 eller andre virale kilder eller kan tilvejebringes ved hjælp af den værtscellekromosomale replikationsmekanisme. Dersom vektoren er integre-5 ret i værtscellekromosomet, er sidstnævnte ofte tilstrækkelig.

Værtsceller kan fremstille ECGF, der kan være af en hel række kemiske sammensætninger. Proteinet frembringes med methionin som den første aminosyre. Dette methionin findes på grund af, at ECGF startcodonen natur-10 ligt eksisterer ved originen af det oprindelige gen eller ved at være fabrikeret inden en del af det strukturelle gen. Proteinet kan også være intracellulært eller ekstracellulært spaltet, hvilket giver anledning til aminosyren, der findes naturligt ved proteinets aminoendestilling. Proteinet kan være frembragt sammen med enten dets eget eller et heterologt signalpeptid, idet signalpo-15 lypeptidet specifikt kan spaltes i et intra- eller ekstracellulært miljø. Endelige kan ECGF frembringes ved direkte ekspression i moden form, uden at det er nødvendigt at bortspalte noget fremmed polypeptid.

I Rekombinante værtsceller betyder celler, der er transformeret med vektorer 20 opbygget under anvendelse af rekombinante DNA metoder. Som defineret i foreliggende beskrivelse med krav frembringes ECGF som en konsekvens af denne transformation. ECGF eller dets fragmenter frembragt af disse celler omtales som "rekombinant ECGF".

25 Metoderne angivet neden for er en hel række forskellige veletablerede metoder til at frembringe specifikke reagenser, der anvendes ved den omhandlede fremgangsmåde. Den generelle metode til at opnå en mRNA blanding er at opnå en vævsprøve eller at dyrke celler, der frembringer det pågældende protein, og at ekstrahere RNA ved en fremgangsmåde således som f.eks.

30 den der er beskrevet af Chirgwin, et al., Biochemistry, 18:5294 (1979).

mRNA beriges med poly(A)mRNA-holdigt materiale ved kromatografi på oli-go (dT) cellulose eller poly(U) sepharose efterfulgt af eluering af den poly(A) holdige mRNA fraktion.

H DK 175807 B1 H Ovennævnte poly(A)-holdige mRNA-berigede fraktion anvendes til at synteti- H sere et enkeltstrenget komplementært cDNA (ss-cDNA) under anvendelse af H omvendt transscriptase. Som en følge af DNA syntese dannes et håmåle- H 5 sving ved 3’ enden af DNA, der vil påbegynde den anden strengs DNA syn- , H tese. Under passende betingelser anvendes dette hårnålesving til at bevirke H syntese af ds-cDNA i nærværelsen af DNA polymerase og deoxyribonucleo- H tidtriphosphater.

10 Det fremstillede ds-cDNA indføres i ekspressionsvektoren ved hjælp af en hvilken som helst af en række kendte metoder. Disse metoder omtales gene-relt i Maniatis, et al., supra, og i Methods In Enzymology, bind 65 og 68 II (1980); og 100 og 1010 (1983). Generelt linieariseres vektoren ved hjælp af I1 . mindst en restriktionsendonuclease, der vil frembringe mindst to stumpafslut- H J 15 tede eller kohæsive ender. ds-cDNA ligeres med eller knyttes i vektorind- H skudspladsen.

H Dersom prokaryotiske celler eller andre celler, der indeholder væsentligt cel- H levækstmateriale, anvendes, er den mest almindelige metode til transforma- H 20 tion med ekspressionsvektoren calciumchlorid forbehandling således som I beskrevet af Cohen, R.N., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69:2110 (1972).

H Dersom celler uden cellevægsbarriere anvendes som værtsceller udføres transfektionen ved hjælp af calciumphosphat udfældningsmetoden således som beskrevet af Graham og Van der Eb, Virology, 52:456 (1973). Andre H 25 metoder til at indføre DNA i celler som f.eks. kemeinjektion, viral infektion eller protoplastfusion kan også anvendes med held. Herefter dyrkes cellerne på selektive substrater, og der produceres proteiner, som ekspressionsvekto- H rerne koder for.

I 30 Kloner indeholdende en del eller hele cDNA af ECGF identificeres ved hjælp af specifikke oligonucleotidprober afledt fra en delvis aminosyresekvensbe- stemmelse af ECGF. Denne identifikationsmetode kræver, at den ikke- degenererede oligonucleotidprobe er således designet, at den specifikt hy- DK 175807 B1 13 !

Ibridiserer til ECGF ds-cDNA. Kloner indeholdende ECGF cDNA sekvenser j

isoleres ved hjælp af radioaktivitetsmærkning af oligonucleotidproben med I

22P-ATP, hybridisering af den radioaktive oligonucleotidprobe til DNA fra de I

enkelte kloner fra et cDNA bibliotek indeholdende ECGF-cDNA og afsløring I

5 og isolering af de kloner, der hybridiserer ved autoradiografi. Et sådant klo- I

ningssystem kan anvendes over for Xgtn systemet beskrevet af Young and I

Davis, supra. I

Kloner indeholdende hele sekvensen af ECGF identificeres under anvendel- I

10 se af som probe cDNA indskuddet af ECGF rekombinanterne isoleret under I

den første undersøgelse af det rekombinante λgt11 cDNA bibliotek med EC- I

GF specifikke oligonucleotider. Nucleotidsekvensbedømmelsesmetodeme I

anvendes til at bestemme sekvensen af aminosyrer kodet af cDNA fragmen- I

terne. Denne information kan anvendes til at bestemme identiteten af de for- I

15 modede ECGF cDNA kloner ved sammenligning med den kendte aminosy- ! I

resekvens af det amino-endestillede bovine ECGF og af et peptid afledt ved I

cyanbromidspaltning af ECGF. I

EKSEMPEL

I A. Fremstilling af totalt RNA I

Totalt RNA (messenger, ribosomalt og overførsel) ekstraheredes fra friske to . I

dage gamle humane hjemestammeceller i det væsentlige som beskrevet af I

25 Chirgwin, supra, (1979). Cellepelleten blev homogeniseret i 5 rumfang af en I

opløsning indeholdende 4 M guanidinthiocyanat og 25 mM antifoam A (Sig- I

ma Chemical Co., St. Louis, Mo.). Homogenatet centrifugeredes ved 6000 omdrejninger pr. minut i en Sorvall GSA rotor i 15 minutter ved 10 °C. Den supematante væske indstilledes til pH 5,0 ved tilsætning af eddikesyre, og 30 RNA udfældedes med 0,75 rumfang ethanol ved -20 °C i 2 timer. RNA blev opsamlet ved centrifugering og opløst i 7,5 M guanidinhydrochlorid indeholdende 2 mM natriumcitrat og 5 mM dithiothreitol. Efter to yderligere udfældninger under anvendelse af 0,5 rumfang ethanol ekstraheredes restguanidin- H DK 175807 B1 Η hydrochloridet fra bundfaldet med absolut ethanol. RNA opløstes i sterilt vand, det uopløselige materiale fracentrifugeredes, og pellet blev atter eks- traheret med vand. RNA indstilledes til 0,2 M kaliumacetat og udfældedes ved tilsætning af 2,5 rumfang ethanol ved -20 °C natten over.

B. Fremstilling polvfAt-holdia RNA

H i

j Det totale RNA bundfald fremstillet som beskrevet ovenfor opløstes i 20 mM

hepespuffer (pH 7,2) indeholdende 10 mM EDTA og 1 % SDS, opvarmedes 10 10 minutter ved 65 °C og afkøledes dernæst hurtigt til 25 °C. Herefter fortyn- H dedes RNA opløsningen med lige dele vand, og NaCI tilsattes til en slutkon- centration på 300 mM NaCI. Prøver indeholdende indtil 240 A260 enheder H RNA kromatograferedes på poly(U)-sepharose under anvendelse af stan- H dardmetoder. Poly(A)-holdig RNA elueredes med 70 % formamid indehol- 15 dende 1 mM hepespuffer (pH 7,2) og 2 mM EDTA. Eluatet indstilledes til 0,24 M NaCI, og RNA udfældedes med 2,5 rumfang ethanol ved -20 °C.

C. Konstruktion af cDNA kloner i λαΐ-η 20 Fremgangsmåden anvendt den enzymatiske reaktioner angivet i fig. 1.

mRNA (20 pg) kopieredes i ds-cDNA med omvendt transscriptase og DNA

polymerase I nøjagtigt som beskrevet af Bueli, et al., supra og Wilkensen, et I al., J. Biol. Chem. 253:2483 (1978). ds-cDNA'en afsaltedes på Sephadex® G-50, og de tomme-rumfangsfraktioner rensedes ydertigere på en Elutip-D® I 25 søjle (Schleicher & Schuell, Keene, NH) således som anbefalet af fabrikan- ten. ds-cDNA blev stumpafsluttet ved inkubering med S1 nuclease [Ricca, et

I al., J. Biol. Chem, 256:10362 (1981)}. Reaktionsblandingen bestod af 0,2 M

natriumacetat (pH 4,5), 0,4 M natriumchlorid, 2,5 mM zinkacetat og 0,1 en- I hed SI nuclease pr. ng ds-cDNA indtillet til et slutreaktionsrumfang på 100 μΙ.

I 30 ds-cDNA inkuberedes 1 time ved 37 °C, ekstraheredes med phe- I nol:chloroform og afsaltedes derefter på en Sephadex® G-50 søjle som be- skrevet ovenfor.

15 DK 175807 B1 «Ja K I Λ UMUnr%«JI/\rJ Λ η «>| «« ι»λΛλ^ CaaDI ·ΑΑα4Κα· <1 AAA AA I/IaAA* t> frAArVlAM^ A# U«7~Ub/i ir\ ι/vi iui luiwuug vvi vuui 11 ιννι www· > · is/u ijiww ννι ·ν *· ·· * ·νι it u· DNA polymerase I under anvendelse af de reaktionsbetingelser, der er beskrevet af Maniatis, et al., Molecular Cloning, supra. cDNA afsaltedes atter på Sephadex® G-50 som beskrevet ovenfor og ligeredes dernæst til 0,5 pg 5 phosphoryleret EcoRI linkere under anvendelse af T4 DNA ligase (Maniatis, et al., supra). Blandingen spaltedes med EcoRI og fraktioneredes på en 8 % acrylamidgel i Tris-boratpuffer (Maniatis, et al., supra). DNA med en størrelse på mere 1 kilobase elueredes fra gelen og udvandtes ved binding til en Elu-tip-D® søjle, der elueredes med 1 mM NaCI og herefter opsamledes ved 10 hjælp af ethanoludfældning.

Som angivet i fig. 2 indførtes DNA fragmenterne herefter i EcoRI spaltet og phosphatasebehandlet \gtn under anvendelse af T4 DNA ligase. Et bibliotek på 5,7 bx 106 fag frembragtes, af hvilket omtrent 65 % var rekombinant fag.

15 Biblioteket forstørredes ved at frembringe pladestammængder ved 42 °C på E. coli Y1088 [supE supF metB trpR hsdR' hsdM+ tonA21 strA lacU169 (proC::Tn5) (pMC9)]. Opformeringsmetoderne er beskrevet i Maniatis, et al., supra. Vigtige træk ved denne stamme beskrevet af Young og Davis, supra, omfatter (1) supF (nødvendig undertrykkelse af fag amber mutation i S-20 genet), (2) hsdR' hsdM+ (nødvendig for at forhindre restriktion af fremmed DNA inden værtsmodifikation) og (3) lacU169 (proC::Tn5), og (4) (pMC9) (et lac l-bærende pBR322 derivat, der undertrykker, uden en inducer, ekspressionen af fremmede gener, der kan være ødelæggende for fagen og/eller cellevæksten).

25 D. Identifikation af kloner indeholdende ECGF sekvens

For at afsøge biblioteket for rekombinant fag indeholdende ECGF cDNA blev 1,5 x 106 fag udstrøget på en plæne af E. coli Y1090 [AlacU169 proAAlon 30 araD139 strA supF (trpC22::Tn10) (pmC9)] og inkuberedes i 6 timer ved 42 °C. Herefter afkøledes pladerne natten over, og et nitrocellulosefilter blev lagt oven på pladerne. Stillingen af filteret blev markeret med en nål. Filteret fjernedes efter 1 minut og henstod for at tørre ved stuetemperatur. Fra hver pla-

I DK 175807 B1 I

I 16 I

I de blev fremstillet to filtre nøjagtigt som beskrevet, bortset fra at filteret blev I

I efterladt i kontakt med pladen i 5 minutter. Alle filtre blev herefter præpareret I

I til hybridisering, således som beskrevet af Maniatis, et al., supra. Dette inde- I

I bærer DNA denaturering i 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCI, neutralisering i 1 M Tris- ' I

I 5 HCI, pH 7,5,1,5 M NaCI og opvarmning af filtrene i 2 timer i vakuum ved 80 I

I I

I For at afsøge det humane hjernestamme cDNA bibliotek for kloner indehol-

I dende ECGF indskud, opbyggedes et specifikt oligonucleotid. Dette oligo- I

I 10 nucleotid var baseret på en delvis aminosyresekvensanalyse af det ami- I

I noendestillede ECGF. Som angivet i fig. 3 linie a og b isoleres bovint ECGF I

I som to arter, betegnet α og β-ECGF, der kun er forskellig fra hinanden i de I

I aminosyrer, der findes ved de respektive aminoendestillinger. Som angivet i I

I fig. 3, linie b er β-ECGF en lidt større art end α-ECGF. Den nøjagtige amino- I

I 15 syresekvens ved aminoendestillingen af β-ECGF er ikke bestemt, imidlertid I

I er angivet en sekvens stammende fra hurtigt atombombardementsmasse- I

I spektralanalyse og aminosyresammensætningen af det aminoendestillede I

I tryptiske peptid af bovint β-ECGF. Den aminoendestillede blokeringsgruppe I

I synes at være acetyl. Dersom intakt β-ECGF spaltes med trypsin, bestem- I

I 20 mes en anden aminosyresekvens i β-, men ikke i α-ECGF, der starter med I

I PheAsnLeu... Denne sekvens findes også ved aminoendestillingen af sur I

I fibroblastvækstfaktor [Thomas, K.A. et al., Prac. Natl. Acad. Sci., 82:6409- I

I 6413 (1985)]. Aminoendestillingen af α-ECGF er AsnTyrLys... (fig. 3, linie a) I

I og er den ækvivalente af β-ECGF minus en aminoendestillet forlængelse. I I

I 25 fig. 3 linie c og d er for sammenligning angivet aminosyresekvensen af cyan- I

I bromidspaltet henholdsvis bovint a- og β-ECGF. I

I Til opbyggelse af oligonucleotidet blev udvalgt aminosyresekvensen Ile- I

I , LeuProAspGIyThrValAspGIyThr, svarende til α-ECGF aminosyrerne 19-29 I

30 inklusive. I stedet for en egentlig opbygning designedes en blanding af oligo- I

I nucleotider, der dækkede alle mulige kodesekvenser (på grund af degenera- I

tionen af den genetiske kode) et langt specielt oligonucleotid. Sådanne oligo- I

I nucleotidprober har tidligere vist sig at være velanvendelige prober til at af- I

17 DK 175807 B1 ~r\Kt a ru... «ι «i m. ,.u:. a _:j_ i-*____4 4 .λλορ oo o c ok/v^c r\umpicAd vunn joajrc, cl ai.t inmvicic nuuo ixcocaiui 1 y (1983)] og genome [Gitschier, et al., Nature, 312:326-330 (1984)] biblioteker.

Tre kriterier anvendtes til at designe ECG proben: (1) dinucleotidet CG blev undgået. Dette skyldtes, at man havde observeret underrepræsentation af 5 CG dinucleotidet i eukaryotisk DNA [Josse, et al., J. Biol. Chem. 236:864-875, (1961)]; (2) foretrukne codonanvendelsesdata blev anvendt, hvor det var muligt. En nylig foretaget og omfattende analyse af human codonanven-delse kan ses i Lathe, J. Mol. Biol. 183:1-12 (1985); og (3) hvor strategierne for CG dinucleotid og foretrukken codonanvendelse ikke var opgivet, tillod 10 man usædvanlig baseparring. Denne strategi var baseret på den naturlige forekomst af G:T, l:T, l:A og l:C basepar, der forekommer ved den gensidige indvirkning mellem rRNA anticodoner og mRNA codoner [Crick, J. Mol. Biol. i 19:548-555, (1966)]. Et diagram over sædvanlige og usædvanlige basepar er angivet i fig. 4. Anvendelse af I (Inosin) i en hybridiseringsprobe demonstre- , 15 redes først i et modelforsøg af Ohtsuka, et al., J. Biol. Chem.I 260:2605-2608 (1985). Den totale strategi og valget foretaget ved designet af oligonucleoti-det anvendt til at afsøge det humane hjernestamme cDNA bibliotek for ECGF er angivet i fig. 5. Herudover konstrueredes to andre oligonucleotider, designet med den samme strategi.

20

Omtrent 30 pmol af oligonucleotidet vist i fig, 5 blev radioaktivt mærket ved inkubering med 32P-gamma-ATP og T4 polynucleotidkinase, i det væsentlige som beskrevet af Maniatis, et al., supra. Nitrocellulosefiltre, fremstillet som beskrevet ovenfor, prehybridiseredes ved 42 °C i 6 x SSPE (1 x SSPE = 0,18 25 M NaCI, 0,01 M NaHP04 pH 7,2, 0,001 M EDTA), 2 x Denhardts (1 x Den-hardts - 0,02% af både Ficoll®, polyvinylpyrrolidon, bovint serumalbumin), 5% dextransulfat og 100 pg/ml denatureret laksesperma DNA. 32P-mærket oligonucleotid tilsattes efter 4 timer præhybridisering, og hybridisering fortsatte natten over ved 42 °C. Uhybridiseret probe fjernedes ved vask efter hinan-30 den ved 37 °C med 2 x SSPE, 0,1 % SDS.

Ud fra 1,5 x 106 afsøgte plaques, gav 2 plaques positive autoradiografiske signaler efter eksponering natten over. Disse kloner rensedes indtil homoge- i

DK 175807 B1 I

nicitet ved gentagne rensningscycler, under anvendelse af ovennævnte oli- H

gonucleotid som hybridiseringsprobe. I

De to kloner, der isoleredes, ECGF klon 1 og 29 analyseredes yderligere. I

5 Efter nedbrydning med EcoRI afslørede klon 1 og 29 cDNA indskud på hen- I

holdsvis 2,2 og 0,3 kb. Nick-translation af klonet cDNA og dens efterfølgende H

anvendelse som en radiomærket probe ved Southern blot analyse (Maniatis, H

et al., supra) afslørede, at klon 1 og 29 var beslægtede og overlappende klo- H

ner. Den overlappende natur af disse to kloner er angivet i fig. 6. H

Kloner 1 og 29 analyseredes yderligere på følgende måde: Yderligere to oli- H

gonucleotider designedes, baseret på aminosyresekvensen af bovint ECGF. I

Disse oligonucleotider blev designet baseret på samme antagelser som dem, H

der anvendes ved designet af oligonucleotidet anvendt til isolering af klon 1 I

15 og 29. Disse oligonucleotider (ECGF oligonucleotider II og III) er vist i fig. 7. I

Disse to oligonucleotider såvel som oligo(dT)ie mærkedes radioaktivt ved en H

kinasebehandlingsreaktion som beskrevet ovenfor og anvendtes som hybri- H

diseringsprober i Southern blottingseksperimenter. Resultaterne af disse for- H

søg viste, at 0,3 kb cDNA indskuddet af klon 29 hybridiserer til ECGF oligo- I

20 nucleotideme I og II, men ikke til ECGF oligonucleotideme III eller oli- I

go(dT)ie; 2,2 kb cDNA indskuddet af klon 1 hybridiserer med oligonucleotid I, I

II og III såvel som oligo(dt)i8. Disse resultater og efterfølgende nucleotidse- I

kvensbedømmelse af kloner 1 og 29 viste, at 3' enden af klon 1 ender med H

en poly(A)hale. Hybridisering af klon 1 til ECGF oligonucleotid III, der er ba- I

25 seret på et cyanbromidspaltningsprodukt af bovint ECGF, såvel som til oli- I

go(dT)i8 antyder kraftigt, at denne klon indeholder resten af kodesekvensen I

for både a- og β-ECGF-forbindelser såvel som en stor (større end 1 kb) 3' I

omgivende sekvens. H

30 cDNA indskuddene fra klon 1 og 29 isoleredes, subklonedes i M13mp18, og H

den ECGF-kodende åbne aflæsningsramme og de omgivne regioner se- H

kvensbedømtes ved hjælp af kædeafslutningsmetoden [Sanger et al., Proc. H

Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467 (1977)]. Nucleotidsekvensen af disse I

19 DK 175807 B1 tjnnor 05 ap^inncyroQojiwoneon afledt fr? nijr.jpjneyrpftpkvpnspn pr pnnivpt i fig. 8. Undersøgelse af nucleotidsekvensen afslører en åben aflæsningsramme på 465 nucleotider, der koder humant ECGF. 155 aminosyrer af humant ECGF viste sig at være omgivet af translationsstopcodoner. Den NH2-5 endestillede aminosyre af humant β-ECGF afledt af cDNA sekvenser er methionin, der sandsynligvis tjener som translationsinitiationsrest. Disse resultater, sammen med den forholdsvis ikke-hydrophobe natur af de første 15-20 aminoendestillede rester, antyder kraftigt, at human β-ECGF syntetiseres uden et NH2-endestillet signalpeptid. En sammenligning af fig. 3 og 8 viser, at 10 den aminoendestillede aminosyresekvens af trypsin-spaltet bovint β-ECGF såvel som sekvensen af bovint α-ECGF er næsten identisk med aminosyre-sekvensen forudsagt ud fra nucleotidsekvensen af λ-ECGF kloner 1 og 29.

Der observeres en total homologi mellem de to arter på mere end 95 %.

15 Northern blotanalyse (Maniatis, et al., supra) afslører, at ECGF mRNA er en molekylart, der vandrer sammen med 28S rRNA (fig. 9). Når man tager variationen i den skønnede størrelse af 28S rRNA i betragtning, er den omtrentlige størrelse af ECGF mRNA 4,8 ± 1,4 Kb. Hele sekvensen, der koder de modne former af både a- og β-ECGF, er kodet i ECGF kloner 1 og 29, der 20 sammen omfatter omtrent 2,3 kb. Disse resultater viser således, at regionen 5' og omgivende de ECGF-kodende sekvenser er meget stor (omtrent 2,5 ± 1,4 kb).

cDNA indskud fra klon 1 og klon 29 blev udskåret ved nedbrydning med 25 EcoRI og subklonet i pUC8 på EcoRI pladsen. Plasmidet dannet fra klon 1 blev betegnet pDH15, og plasmidet dannet fra klon 29 blev betegnet pDH14. Plasmideme blev deponeret i American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD20852. Plasmidet fra klon 1, pDH15, blev givet nummeret ATCC 53336 og plasmidet fra klon 29, pDH14, blevet givet num-30 meret ATCC 53335.

Dette eksempel beskriver således de eksperimentelle procedurer, der tilvejebringer human endothelial cellevækstfaktor i det væsentlige uden andre pro- i Μ

I DK 175807 B1 I

20 I

I teiner af human oprindelse. I

I ECGF finder anvendelse ved dyrkning og opformeringen af endotheliale cel- I

ler i kultur. For nylig er ECGF til celledyrkningsanvendelse ekstraheret fra I

I 5 oksehjerne således som beskrevet af Maniatis, et al., [Proc. Natl. Acad. Sci., I

I 76:11, 5674-5678 (1978)]. Dette urensede bovine ECGF er mitogent for hu- I

I mane umbilicale veneendotheliale celler [Maniatis, et al., J. Biol. Chem. I

I 257:5333-5336 (1982)] og endotheliale celler fra andre arter. Anvendelsen af I

heparin med ECGF og en fibronektinmatrix muliggør etablering af stabile en- I

I 10 dotheliale cellekloner. Den anbefalede koncentration af dette urensede bovi- I

I ne ECGF til anvendelse som et mitogen in vitro er 150 mikrogram pr. ml ; I

I vækstsubstrat. I

I i I

' Rekombinant DNA-afledt human ECGF har derfor anvendelse som en for-

I | 15 bedret erstatning for urenset bovint ECGF i in vitro dyrkning af humane en- I

I dotheliale celler og andre mesenchymale celler til videnskabelige formål. Ak- I

I tiviteten af humant ECGF antages at være den samme eller bedre end aktivi- I

teten af bovint ECGF til at potentiere den endotheliale cellevækst på grund af I

I j den høje grad af homologi i aminosyresekvensen for begge proteiner. Den I

I 20 forventede effektive dosis for potentieret celledeling og vækst in vitro er 5-10 I

I ng renset ECGF pr. ml dyrkningssubstrat. Produktion af ECGF via rekombi- I

I nant-DNA teknologier som beskrevet i nærværende ansøgning og den efter- I

I følgende rensning som beskrevet af Burgess et al., [J. Biol. Chem. I

I 260:11389-11392 (1985)] vil give store mængder rent produkt af human op- I

25 rindelse (hidtil utilgængeligt i nogen som helst form for mængde eller ren-

hed), med hvilke der kan frembringes modeller af human homeostase og an- I

I giogenese. I

I Rekombinant DNA-afledt humant ECGF kan også anvendes til at fremme I

I 30 cellevæksten på en protese, i stedet for i vævsdyrkningskolber eller -flasker. I

En sådan anordning kan eller kan ikke være dækket med andre molekyler, I

I der vil lette fastgørelsen af endotheliale celler til anordningen. Disse frem- I

I mende molekyler kan omfatte ekstracellulære matrixproteiner (f.eks. fibro- I

i 21 DK 175807 B1 nectin. laminin filler andre af rollanpnfirnfil humant sen imalhnmin henarin * v * *· * · ...., - (- ------ eller en glycosaminoglycaner eller inerte organiske molekyler. Endotheliale celler kan dyrkes på disse overflader under anvendelse af effektive doser af ECGF i dyrkningssubstratet, der til sidst vil dække anordningen med et en-5 dothelialt cellemonolag. Denne anordning vil herefter have en ikke- thrombogen overflade på protesen, hvorved risikoen for potentielt livstruende thrombogene tildragelser efter implantering af protesen kan undgås.

i ECGF kan anvendes til diagnostiske formål. Schreiber, et al., [Proc. Natl.

10 Acad. Sci. 82:6138 (1985)] har udviklet et dobbelt antistof immunoforsøg for bovint ECGF. I dette forsøg blev 96-brønds polyvinylchloridplader dækket med kaninanti-ECGF og de øvrige bindingspladser blev herefter blokeret med 10 % normalt kaninserum. Prøver af ECGF blev herefter sat til brøndene og inkuberet. Efter vask tilsattes murint monoklonalt anti-ECGF. Efter in-15 kubation og adskillige afvaskninger tilsattes kaninanti-muse IgG koblende peroxidase. Reaktionsproduktet kvantificeredes spektrofotometrisk efter omdannelse af O-phenylendiamin i nærværelse af hydrogenperoxid. Et lignende opbygget immunoforsøg kan anvendes til at kontrollere humane ECGF niveauer i sygdomstilfælde, der påvirker endothelial cellevækst. Renset re-20 kombinant-DNA afledt ECGF kan anvendes som standardreagens til at kvantificere ukendte ECGF prøver.

ECGF kan også have potentiale ved behandling af beskadigede blodkar eller ved regeneringen af blodkar og andre endotheliale celle-liniestrukturer.

25

For fagmanden vil det være klart, at der kan foreligge andre udførelsesformer uden at gå uden for opfindelsens område.

Claims (16)

1. Fremgangsmåde til at frembringe human endothelial cellevækstfaktor, kendetegnet ved, at man tilvejebringer en reproducerbar ekspressi- I I 5 onsvektor, der er i stand til at udtrykke DNA sekvensen, der koder human I I endothelial cellevækstfaktor, i en passende vært, at man transformerer vær- I I ten til opnåelse af en rekombinant vært, og at man bibeholder den rekombi- I nante vært under betingelser, der muliggør ekspression af den endothelial I I cellevækstfaktor-kodende cDNA sekvens til frembringelse af endothelial cel- I I 10 levækstfaktor, hvilken human endothelial cellevækstfaktor med α-ECGF- el- I I ler β-ECGF-sekvensen vist i figur 8, eller er en allel variant, modifikation eller H I analog af nævnte α-ECGF eller β-ECGF, som bevarer de biologisk aktive I egenskaber af naturlig ECGF. I I 15 2. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kendetegnet ved, at den yderligere I omfatter et trin til at udvinde endothelial cellevækstfaktoren. I

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at ekspressions- I I vektoren er en bakteriofag. I I 20 I

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at bakteriofagen er I et medlem af gruppen lambda-gt10 og lambda-gtn. I

5. Fremgangsmåde ifølge krav 2,kendetegnet ved, at ekspressions- I I 25 vektoren er et plasmid.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, k e n d e t e g n e t ved, at plasmidet er I I afledt af pBR322. ‘ I I 30 7. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kendetegnet ved, at kontrolfunktio- I nen på ekspressionsvektoren er tilvejebragt af viralt materiale. I

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at det virale mate- I i DK 175807 B1 23 rialo or afloHt fra ot moHIom af nrimrion \/alnt KlonHt Κλ\»π r>or»»llr\rr>ia\/iri i c* ------ ...------·— - ----------— · c?· —r r — · ·—·{»·—»·— ” · r—r~··— · · *’ * Epstein Barr-virus, adenovirus, Simian virus 40 og baculovirus.

9. Endothelial cellevækstfaktor som kan opnås ved fremgangsmåden ifølge 5 krav 2.

10. Reproducerbar ekspressionsvektor der er i stand til at udtrykke endothelial cellevækstfaktor som defineret i krav 9 i et selv-reproducerende rekombi-nantsystem. 10

11. Selv-reproducerende rekombinantsystem transformeret med vektoren ifølge krav 10.

12. Rekombinant system ifølge krav 11,kendetegnet ved, at systemet 15 er en celle.

13. Rekombinant system ifølge krav 11,kendetegnet ved, at systemet er cellefrit.

14. Rekombinant system ifølge krav 11, som er opnået ved at transformere eller inficere et medlem af gruppen valgt blandt E. coli, B. subtilis, insekt-, gær- og vertebratceller.

15. Rekombinant system ifølge krav 11, som er opnået ved transformation af 25 eukaryoter.

16. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kendetegnet ved, at indvindingen af den endotheliale cellevækstfaktor, omfatter at man omsætter proteinerne udtrykt med det rekombinante værtssystem med et reagens omfattende 30 mindst et bindingsprotein specifikt for endothelial cellevækstfaktor.

17. Human endothelial cellevækstfaktor med α-ECGF- eller β-ECGF-sekvensen vist i figur 8, eller en allel variant, modifikation eller analog af I DK 175807 B1 I I 24 I I nævnte α-ECGF eller β-ECGF, som bevarer de biologisk aktive egenskaber I I af naturligt ECGF, hvilken human endothelial cellevækstfaktor er i det væ- ; I I sentlige fri for andre proteiner af human oprindelse. I I 5 18. Endothelial cellevækstfaktor ifølge krav 17, kendetegnet ved, at I den omfatter en polypeptidsekvens, der strækker sig fra den NH2- I I endestillede aminosyre af endothelial cellevækstfaktor. i I 19. cDNA klon, kendetegnet ved, at den omfatter den komplette kode- I I 10 sekvens for human endothelial cellevækstfaktor, hvilket cDNA har DNA- I sekvensen som koder for α-ECGF- eller β-ECGF vist i figur 8, eller en allel I I variant, modifikation eller analog af nævnte DNA-sekvens, som koder for et I I protein som bevarer de biologisk aktive egenskaber af naturlig ECGF. I I 15 20. cDNA klon ifølge krav 19 indeholdende utranslaterede nucleotidsekven- I I ser beliggende 5' og 3’ for den kodende sekvens af human endothelial celle- I I vækstfaktor som defineret ved det endotheliale cellevækstfaktor-mRNA. I

21. Præparat, kendetegnet ved, at den omfatter en terapeutisk effektiv I I 20 mængde af human endothelial cellevækstfaktor som defineret i krav 17 eller I I 18, til at fremme sårheling i blanding med et acceptabelt bærestof. I