NO874552L - Rekombinant human endotelial cellevekstfaktor. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår rekombinant DNA-rettet syntese av visse proteiner. Nærmere bestemt angår oppfinnelsen endotelial cellevekstfaktor (ECGF), dens rekombinante DNA-rettede syntese og ECGF's anvendelse ved behandling av endotelial celleskade og/eller regenerering.

Endotelial cellevekstfaktor, angitt her som "ECGF", er et mitogen for endoteliale celler in vitro. Vekst av endoteliale celler er et nødvendig trinn under angioqenesis-prosessen [Maciag, Prog. Hemostasis and Thromb., 2:167-182

(1984), Maciag, T., Hoover, G.A., og Weinstein, R.,

J. Biol. Chem., 257:5333-5336 (1982)]. Kveg ECGF er blitt isolert av Maciag, et al., [Science 225:932-935 (1984)]

under anvendelse av streptomycinsulfatutfelling, geleks-klusjonskromatografi, ammoniumsulfatutfelling og heparin-Sepharose<®>affinitetskromatografi. Kveg ECGF renset på denne måte, gir et enkelkjedet polypeptid som utviser et anionisk, isoelektrisk punkt og en tilsynelatende molekyl-vekt på 20.000 [Maciag, supra; Schreiber, et al., J. Cell. Biol., 101:1623-1626 (1985); og Schreiber, et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 8_2 : 613 8-614 2 (1985)]. Mer nylig er multiple former av kveg ECGF blitt isolert av Burgess, et al., [J. Biol. Chem. 260:11389-11392 (1985)] ved natriumklorid-gradienteluering av kveg ECGF fra heparin-Sepharose<®->kolonnen eller ved revers-fase høytrykksvæskekromatografi (HPLC) . De to isolerte polypeptider, betegnet som a- og (3-ECGF, har tilsynelatende molekylvekter på 17.000 og 20.000. Under anvendelse av denne prosedyre konsentreres kveg ECGF inneholdt i 8.500 ml kveghjerneekstrakt (6,25 x 10 7 totale enheter) til totalt 6 ml oc-ECGF (3,0 x 10 enheter) og 3 ml (3-ECGF (5,2 x IO<5>enheter). Dette er en 9.300 gangers rensing av a-ECGF og 16.300 gangers rensing av /3-ECGF (Burgess, supra). Nylig er murine, monoklonale antistoffer mot kveg ECGF blitt produsert (Maciag, et al., supra) som kan være anvendbare ved rensing av kveg ECGF på en måte lik den monoklonale antistoffrensing av faktor VIIIC beskrevet av Zimmerman og Fulcher i U.S. patentskrift 4.361.509.

Generelt er rekombinante DNA-teknikker kjent. Se Methods In Enzymology. (Academic Press, New York), vol. 65 og 68 (1979); 100 og 101 (1983) og referanser angitt deri, som alle inkorporeres her som henvisninger. En grundig teknisk diskusjon som tar for seg de mest vanlig anvendte rekombinante DNA-metoder, kan finnes i Maniatis, et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982). Gener som koder for forskjellige polypeptider, kan klones ved inkorporering av et DNA-fragment som koder for poly-peptidet i en rekombinant DNA-bærer, f.eks. bakterielle eller virale vektorer, og transformering av en egnet vert. Denne vert er typisk en Escherichia coli-(E. coli) stamme, men avhengig av detønskede produkt kan imidlertid eukaryotiske verter anvendes. Kloner som inkorporerer de rekombinante vektorer, isoleres og kan dyrkes og anvendes for å produsere det ønskede polypeptid i stor målestokk.

Flere grupper av forskere har isolert blandinger

av meddeler-RNA (mRNA) fra eukaryotiske celler og anvendt en serie av enzymatiske reaksjoner for å syntetisere dobbeltstrengede DNA-kopier som er komplementære til denne mRNA-blanding. I den første reaksjon transkriberes mRNA til et enkeltstrenget, komplementært DNA (cDNA) med en RNA-rettet DNA-poly-merase, også kalt revers transkriptase. Revers transkriptase syntetiserer DNA i 5<1->3'-retningen, anvender deoxyribonucleosid-5'-trifosfater som forløpere, og krever både et templat og en primerstreng hvor den sistnevnte må

ha en fri 3'-hydroxylende. Revers transkriptaseprodukter - hvorvidt de er delvise eller komplette kopier av mRNA-templatet - utviser ofte korte, delvis dobbeltstrengede hårnåler ("slynger") ved sin 3'-ende. I den andre reaksjon kan disse "hårnålslynger" utnyttes som primere for DNA-polymeraser. Fordannet DNA kreves både som et templat og som en primer ved virkningen av DNA-polymerase. DNA-poly-merase krever nærvær av en DNA-streng som har en fri 3'-hydroxylgruppe, til hvilken nye nucleotider tilsettes for å forlenge kjeden i 5<1->3'-retning. Produktene av slike sekvensvise revers transkriptase og DNA-polymerase-reaksjoner utviser fremdeles en slynge ved en ende. Spissen av slyngen eller "foldepunktet" av det dobbeltstrengede DNA som således er blitt dannet, er hovedsakelig et enkelt-

strenget segment. I den tredje reaksjon splittes dette enkeltstrengede segment med det enkeltstrengede, spesifikke nuclease Sl for å utvikle et "butt ende" duplekst DNA-segment. Denne generelle metode er anvendbar på enhver mRNA-blanding og er beskrevet av Buell, et al., J. Biol. Chem. , 253^: 2483 (1978).

Den resulterende dobbeltstrengede cDNA-blanding (ds-cDNA) innføyes i kloningsbærere ved en hvilken som helst av mange kjente teknikker, avhengig i det minste delvis av den bestemte bærer som anvendes. Forskjellige innføynings-metoder er diskutert i betydelig detalj i Methods In Enzymology, 6_8:16-18 (1980) og referanser angitt der.

Så snart DNA-segmentene er innføyd, anvendes klon-ingsbæreren til å transformere en egnet vert. Disse kloningsbærere bibringer vanligvis en ahtibiotisk resistens-egenskap til verten. Slike verter er generelt prokaryotiske celler. Ved dette punkt inneholder bare noen få av de transformerte eller transfiserte verter det ønskede cDNA. Summen av alle transformerte eller transfiserte verter ut-gjør et gen-"bibliotek". Det totale ds-cDNA-bibliotek skapt ved denne metode, gir en representativ prøve på kod-ingsinformasjonen tilstedeværende i mRNA-blandingen anvendt som utgangsmaterialet.

Hvis en egnet oligonucleotidsekvens er tilgjengelig, kan den anvendes for å identifisere kloner av interesse på følgende måte. Individuelt transformerte eller transfiserte celler dyrkes som kolonier på et nitrocellulose-filterpapir. Disse kolonier lyseres, det frigitte DNA bindes tett til filterpapiret ved oppvarming. Filterpapiret inkuberes deretter med en merket oligonucleotidprobe som er komplementær til det strukturelle gen av interesse. Proben hybridiseres med cDNA for hvilket den er komplementær, og identifiseres ved autoradiografi. De til-svarende kloner karakteriseres for å identifisere en eller en kombinasjon av kloner som inneholder all den strukturelle informasjon for det ønskede protein. Nucleinsyresekvensen som koder for proteinet av interesse, isoleres og innføyes på nytt i en ekspresjonsvektor. Ekspresjonsvektoren bringer det klonede gen under den regulerende kontroll av spesifikke prokaryotiske eller eukaryotiske kontrollelementer som tillater effektiv ekspresjon (transkripsjon og translasjon) av ds-cDNA. Denne generelle teknikk er således bare anvendbar på de proteiner for hvilke minst en del av deres aminosyre eller DNA-sekvens er kjent, for hvilken en oligonucleotidprobe er tilgjengelig. Se generelt Maniatis, et al., supra.

Mer nylig er metoder blitt utviklet for å identifisere spesifikke kloner ved probing av bakterielle kolonier eller fagplakker med antistoffer som er spesifikke for det kodede protein av interesse. Denne metode kan bare anvendes med "ekspresjonsvektor" kloningsbærere da utarbeidelse av proteinproduktet er nødvendig. Det strukturelle gen inn-føyes i vektoren tilstøtende de regulerende gensekvenser som kontrollerer ekspresjon av proteinet. Cellene lyseres, enten ved kjemiske metoder eller ved en funksjon tilført av vertcellen eller vektoren, og proteinet påvises ved et spesifikt antistoff og et påvisningssystem slik som enzym-immunobestemmelse. Et eksempel på dette er lambda gen-systemet beskrevet av Young og Davis, Proe. Nat<1>1. Acad. Sei. USA, 80:1194-1198 (1983) og Young og Davis, Science, _2_2_2:778 (1983).

Foreliggende oppfinnelse har gjort det mulig å tilveiebringe lett tilgjengelige, store mengder av ECGF eller ECGF-fragmenter. Dette er blitt oppnådd med oligonucleotider hvis konstruksjon var basert på kunnskap om aminosyresekvensen av kveg ECGF og som reagerer spesifikt med ECGF cDNA. Produksjon av ECGF oppnås gjennom anvendelse av rekombinant DNA-teknologi for å fremstille kloningsbærere som koder ECGF-proteinet, og prosedyrer for gjenvinning av ECGF-protein hovedsakelig fritt for andre proteiner av human opprinnelse.

Følgelig tilveiebringer oppfinnelsen ECGF eller dets fragmenter hovedsakelig frie for andre proteiner av human opprinnelse. ECGF produseres ved rekombinante DNA-teknikker i vertceller eller andre selv-replikerende systemer og tilveiebringes i hovedsakelig ren form. Oppfinnelsen tilveiebringer enn videre replikerbare ekspresjonsvektorer innbe-fattende en DNA-sekvens som koder ECGF, og et selvreplikerende vertcellesystem transformert eller transfisert derved. Vertsystemet er vanligvis av prokaryotiske, eksempelvis

E. coli eller B. subtilis, eller eukaryotiske celler.

ECGF produseres ved en fremgangsmåte som omfatter (a) fremstilling av en replikerbar ekspresjonsvektor som er i stand til å uttrykke DNA-sekvensen som koder for ECGF i et egnet vertcellesystem; (b) transformering av angitte vertsystem under dannelse av et rekombinant vertsystem; (c) opprettholdelse av angitte rekombinante vertsystem under betingelser som tillater ekspresjon av angitte ECGF-kodende DNA-sekvens for å produsere ECGF-protein; og (d) gjenvinning av angitte ECGF-protein. Fortrinnsvis fremstilles den ECGF-kodende, replikerbare ekspresjonsvektor ved fremstilling av et ds-cDNA-preparat som er representa-tivt for ECGF mRNA og inkorporering av ds-cDNA i replikerbare ekspresjonsvektorer. Den foretrukne metode for gjenvinning av ECGF omfatter omsetning av proteinene uttrykt av det rekombinante vertsystem med en reagenssammensetning omfattende minst ett bindingstrinn som er spesifikt for ECGF. ECGF kan anvendes som et terapeutisk middel ved behandling av skade eller ved regenerering av blodkar og andre endoteliale celle-forede strukturer.

Kort beskrivelse av tegningene

Figur 1 illustrerer en generell prosedyre for enzymatiske reaksjoner for å fremstille cDNA-kloner. Figur 2 illustrerer produksjonen av et bibliotek inneholdende DNA-fragmenter innføyd i lambda9^^. Figur 3 illustrerer en partiell aminosyresekvens av kveg a- og (3-ECGF.

Linje a: Aminoterminal aminosyresekvens av kveg cc-ECGF. Linje b: Aminoterminal aminosyresekvens av kveg (3-ECGF.

Delen i parentes svarer til NH2-terminalsegmentet for hvilket sekvensen ikke kunne bestemmes; amino- syresamraensetningen er vist i stedet. Sekvensen som starter med PheAsnLeu..., ble bestemt fra

trypsin-spaltet kveg 3-ECGF.

Linje c: Aminosyresekvens av cyanogenbromid-spaltet kveg

a-ECGF.

Linje d: Aminosyresekvens av cyanogenbromid-spaltet kveg (3-ECGF.

Figur 4 illustrerer hydrogenbundne basepar.

Figur 5 illustrerer konstruksjonen av en oligonucleotidprobe for human endotelial cellevekstfaktor. Figur 6 illustrerer et skjematisk diagram av humane ECGF cDNA-kloner 1 og 29. Den åpne leseboks representerer den åpne leseramme som koder for humant 3-ECGF. EcoRI-stedene tilsvarer syntetiske oligonucleotidkjedere anvendt ved konstruksjon av cDNA-biblioteket. Poly-(A) halen ved 3'-enden av klon 1 er vist ved . Figur 7 illustrerer homologi mellom human ECGF cDNA-sekvens og oligonucleotidprober.

Linje a: Kvegtrypsin- eller cyanogenbromid-spaltet G-ECGF

aminosyresekvens.

Linje b: Unik oligonucleotidprobe.

Linje c: Human ECGF cDNA-sekvens (bestemt fra lambda ECGF-kloner 1 og 29).

Linje d: Human ECGF aminosyresekvens, utledet fra cDNA-sekvensanalyse.

Figur 8 illustrerer den komplette cDNA-sekvens av humant ECGF. cDNA-innføyninger fra ECGF-klon 1 og 29 ble subklonet til Ml3mpl8, og den ECGF-kodende, åpne leseramme og flankerende regioner ble sekvensert ved kjedeterminer-ingsmetoden. I rammen er stoppkodon ved 5'- og 3'-endene av den ECGF-kodende, åpne leseramme, indikert ved den under-strekede sekvens og trm. Énbokstavsangivelsen for aminosyrene er som følger: A, Ala; C, Cys; D, Asp; E, Glu; F, Phe; G, Gly; H, His; I, Ile; K, Lys; L, Leu; M, Met; N, Asn; P, Pro; Q, Gin; R, Arg; S, Ser; T, Thr; V, Val; W, Trp;

Y, Tyr.

Figur 9 illustrerer Northern blot analyse av ECGF mRNA. RNA ble denaturert i 2,2 M formaldehyd og 50% formamid og fraksjonert ved elektroforese i en 1,25% agarosegel inneholdende 2,2 M formaldehyd. Dette ble overført til GeneScreen Plus (New England Nuclear) ved blotting med

10X SSPE. Blots ble hybridisert til<32>p-merket innsnitt-translaterte prober av ECGF klon 1 ved 65°C i 16 timer i en blanding inneholdende 2X SSPE, 20X Denhardfs løsning, gjæroverførings RNA (200 ug/ml) og 0,2% SDS. Membranen ble deretter vasket ved 65°C, to ganger med 2X SSPE og 0,2%

SDS, og deretter to ganger med 0,2X SSPE og 0,2% SDS, ble lufttørket og eksponert over natten til Kodak XAR film med en intensiverende skjerm. Vandringen av 28S og 18S RNA ble notert.

Spor 1: 10 ug humant hjerne poly(A)-holdig RNA.

Spor 2: 10 ug humant, voksent lever poly(A)-holdig RNA.

Som anvendt her, angir "ECGF" endotelial cellevekstfaktor eller dens fragmenter produsert av celle- eller celle-frie dyrkningssystemer, i bioaktive former som har kapasitet til å influere på cellevekst, differensiering og vandring in vitro slik som naturlig ECGF overfor den humane angiogeniske prosess.

Forskjellige alleler av ECGF kan eksistere i naturen. Disse variasjoner kan karakteriseres ved for-skjeller i nucleotidsekvensen av det strukturelle gen som koder for proteiner med identisk biologisk funksjon. Det er mulig å produsere analoger med enkle eller multiple aminosyresubstitusjoner, utelatelser, addisjoner eller erstatninger. Alle slike alleliske variasjoner, modifika-sjoner og analoger som resulterer i derivater av ECGF som bibeholder de biologisk aktive egenskaper av naturlig ECGF, er innbefattet innen oppfinnelsens ramme.

"Ekspresjonsvektorer" angir vektorer som er i stand til å transkribere og translatere DNA-sekvenser inneholdt deri, hvor slike sekvenser er kjedet til andre regulerende sekvenser som er i stand til å påvirke deres ekspresjon. Disse ekspresjonsvektorer må være replikerbare i vert-

organismene eller systemene enten som episomer, bakteriofag eller som en integrert del av det kromosomale DNA. En form for ekspresjonsvektor som er særlig egnet for anvendelse ifølge oppfinnelsen, er bakteriofag, viruser som normalt bebor og replikeres i bakterier. En særlig fordelaktig fag for dette formål er lambda q<? gt^-fag beskrevet av Young og Davis, supra. Lambda gt^^er en generell rekombinant DNA-ekspresjonsvektor som er i stand til å produsere polypeptider spesifisert ved det innføyde DNA.

Ved induksjon med en syntetisk analog av lactose (IPTG) syntetiseres fremmede proteiner eller deler derav fusert til det prokaryotiske protein B-galactosidase for å minimere nedbrytning. Anvendelse av vertceller som mangler proteinnedbrytningsbaner, kan også øke levetiden av nye proteiner produsert fra de induserte lambda gt^-kloner. Riktig ekspresjon av fremmed DNA i lambda gt-^-kloner vil avhenge av den riktige orientering og leseramme av det inn-føyde DNA med hensyn til (3-galactosidasepromoteren og translasjonsinitierende kodon.

En annen form for ekspresjonsvektor som er anvendbar i rekombinante DNA-teknikker, er plasmidet - en sirkulær uintegrert (ekstra-kromosomal), dobbeltstrenget DNA-slynge. En hvilken som helst annen form for ekspresjonsvektor som tjener en ekvivalentfunksjon, er egnet for anvendelse ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

Rekombinante vektorer og metodologi beskrevet her, er egnet for anvendelse i vertceller som dekker et vidt om-råde av prokaryotiske og eukaryotiske organismer. Prokaryotiske celler foretrekkes for kloning av DNA-sekvenser og ved konstruksjonen av vektorer. Eksempelvis er E. coli K12 stamme HB101 (ATCC nr. 33694) særlig egnet. Selvsagt kan andre mikrobielle stammer anvendes. Vektorer inneholdende replikasjons- og kontrollsekvenser som er avledet fra arter som er forenlige med vertcellen eller systemet, anvendes i forbindelse med disse verter. Vektoren bærer vanligvis en replikasjonsopprinnelse, såvel som karakteristika som er i stand til å tilveiebringe fenotypisk utvelgelse i de transformerte celler. Eksempelvis kan E. coli transformeres under anvendelse av vektoren pBR322 som inneholder gener for ampicillin-og tetracyclinresistens [Bolivar, et al., Gene, 2:95 (1977)].

Disse antibiotikaresistente gener gir et middel for identifisering av transformerte celler. Ekspresjonsvektoren kan også inneholde kontrollelementer som kan anvendes for ekspresjon av genet av interesse. Vanlige prokaryotiske kontrollelementer anvendt for ekspresjon av fremmede DNA-sekvenser i E. coli, innbefatter promoterene og regulerende sekvenser avledet fra (3-galactosidase og tryptofan-(trp) operoner av E. coli såvel som pR-og pL-promotere av bakteriofagen lambda. Kombinasjoner av disse elementer er også blitt anvendt (f.eks. TAC som er en fusjon av trp-promoteren med lactoseoperator). Andre promotere er også blitt oppdaget og anvendt, og detaljer vedrørende deres nucleotidsekvenser er blitt publisert, hvilket gjør det mulig for fagmannen å kombinere og utnytte disse funk-sjonelt .

I tillegg til prokaryoter kan eukaryotiske mikrober slik som gjærkulturer, også anvendes. Saccharomyces cerevisiae eller vanlig brødgjær, er mest vanlig anvendt blant eukaryotiske mikroorganismer selv om et utall av andre stammer er vanlig tilgjengelige. Gjærpromotere egnet for ekspresjon av fremmede DNA-sekvenser i gjær, innbefatter promoterne for 3-fosfoglyceratkinase eller andre glyco-lyttiske enzymer. Egnede ekspresjonsvektorer kan inneholde termineringssignaler som tilveiebringer polyadenylering og terminering av mRNA-transkriptet av det klonede gen. Enhver vektor inneholdende en gjærforenlig promoter, replikasjonsopprinnelse og egnet termineringssekvens, er egnet for ekspresjon av ECGF.

Cellelinjer avledet fra multicellulære organismer, kan også anvendes som verter. I prinsippet er en hvilken som helst slik cellekultur anvendbar, enten denne kommer fra en hvirveldyrkilde eller en hvirvelløs kilde. Imidlertid har interessen vært størst i hvirveldyrceller, og formering av hvirveldyrceller i kultur (vevkultur) er blitt en rutine- prosedyre i de senere år. Eksempler på slike anvendbare verter er VERO, HeLa, mus C127, kinesisk hamsterovarie (CHO), WI38-, BHK-, COS-7- og MDCK-cellelinjer. Ekspresjonsvektorer for slike celler innbefatter vanligvis en replikasjonsopprinnelse, en promoter lokalisert i fronten av det gen som skål uttrykkes, RNA skjøtesteder (om nødvendig) og transkripsjonale termineringssekvenser.

For anvendelse i pattedyrceller er kontrollfunk-sjonene (promotere og forøkere (enhancers)) på ekspresjons-vektorene ofte tilveiebrakt av viralt materiale. Vanlig anvendte promotere er eksempelvis avledet fra polyoma, Adenovirus 2, og mest hyppig, Simian-virus 40 (SV40). Eukaryotiske promoterer slik som promoteren av det murine metallothioneingen [Paulakis og Hamer, Proe. Nati. Acad. Sei. 80:397-401 (1983)], kan også anvendes. Enn videre er det også mulig, og ofte ønskelig, å anvende promoter-eller kontrollsekvensene som er naturlig assosiert med den ønskede gensekvens, forutsatt at slike kontrollsekvenser er forenlige med vertsystemet. For å øke graden av transkripsjon kan eukaryotiske forøkersekvenser også adderes til konstruksjonen. Disse sekvenser kan erholdes fra et utall av animalske celler eller oncogeniske retroviruser slik som musesarcomaviruset.

En replikasjonsopprinnelse kan tilveiebringes enten ved konstruksjon av vektoren for å innbefatte en exogen opprinnelse slik som den som tilveiebringes av SV40 eller andre virale kilder, eller kan tilveiebringes av vertcellens kromosomale replikasjonsmekanisme. Hvis vektoren er integrert i vertcellekromosomet, er det sistnevnte ofte til-strekkelig.

Vertceller kan fremstille ECGF som kan ha et utall av kjemiske sammensetninger. Proteinet produseres med methionin som den første aminosyre. Dette methionin er til stede i kraft av ATG-startkodonet som naturlig eksisterer ved opprinnelsen av det strukturelle gen, eller ved å ha vært konstruert foran et segment av det strukturelle gen. Proteinet kan også være intracellulært eller ekstracellulært spaltet, og gi opphav til den aminosyre som finnes naturlig ved aminoenden av proteinet. Proteinet kan være produsert sammen med enten et egnet eller et heterologt signalpeptid hvor signalpolypeptidet spesifikt er splittbart i et intra-eller ekstracellulært miljø. Sluttelig kan ECGF produseres ved direkte ekspresjon i moden form uten nødvendigheten av å splitte bort noe fremmed polypeptid.

Rekombinante vertceller angir celler som er blitt transformert med vektorer konstruert under anvendelse av rekombinante DNA-teknikker. Som definert her, produseres ECGF som en konsekvens av denne transformasjon. ECGF eller dets fragmenter produsert av slike celler, angis som "rekombinant ECGF".

Prosedyrene i det etterfølgende er bare enkelte av et vidt antall av vel etablerte prosedyrer for å fremstille spesifikke reagenser som er anvendbare ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Den generelle prosedyre for oppnåelse av en mRNA-blanding er å oppnå en vevprøve eller å dyrke celler som produserer det ønskede protein, og ekstrahere RNA ved en fremgangsmåte slik som den som er beskrevet av Chirgwin, et al., Biochemistry, _18 : 5294 (1979). mRNA an-rikes med poly(A)mRNA-holdig materiale ved kromatografi på oligo-(dT) cellulose eller poly(U) Sepharose<®>, etterfulgt av eluering av den poly(A)-holdige mRNA-fraksjon.

Den ovenfor angitte poly(A)-holdige mRNA-anrikede fraksjon anvendes for å syntetisere et enkeltstrenget, komplementært cDNA (ss-cDNA) under anvendelse av revers transkriptase. Som en konsekvens av DNA-syntesen dannes en hårnålsslynge ved 3'-enden av DNA som vil initiere syntesen av dobbeltstrenget DNA. Under egnede betingelser anvendes denne hårnålsslynge for å bevirke syntese av ds-cDNA i nærvær av DNA-polymerase og deoxyribonucleotid-trifosfater.

Det resulterende ds-cDNA innføyes i ekspresjonsvektoren ved hvilken som helst av mange kjente teknikker. Generelt kan metoder finnes i Maniatis, et al., supra,

og Methods In Enzymology, vol. 65 og 68 (1980); og 100 og 101

(1983). Generelt lineariseres vektoren med minst én restriksjonsendonuclease som vil produsere minst to butte eller cohesive ender. ds-cDNA ligeres med eller forbindes i vektorinnføyningsstedet.

Hvis prokaryotiske celler eller andre celler som inneholder betydelig celleveggmateriale anvendes, er den mest vanlige metode for transformasjon med ekspresjonsvektoren calciumklorid-forbehandling som beskrevet av Cohen, R.N., et al., Proe. Nat'1. Acad. Sei. USA, 69:2110

(1972). Hvis celler uten celleveggbarrierer anvendes som vertceller, utføres transfeksjon med calciumfosfat-utf elningsmetoden beskrevet av Graham og Van der Eb, Virology, 5_2 : 456 (1973). Andre metoder for innføring av DNA i celler slik som kjerneinjeksjon, viral infeksjon eller protoplastfusjon, kan med hell anvendes. Cellene dyrkes deretter på selektive media, og proteiner for hvilke ekspresjonsvektoren koder, produseres.

Kloner inneholdende en del eller hele cDNA for ECGF, identifiseres med spesifikke oligonucleotidprober utledet fra en partiell aminosyresekvensbestemmelse av ECGF. Denne identifiseringsmetode krever at den ikke-degenererte oligonucleotidprobe kan konstrueres slik at den spesifikt hybridiseres til ECGF ds-cDNA. Kloner inneholdende ECGF cDNA-sekvenser, isoleres ved radioaktiv merking av oligo-3 2

nucleotidproben med P-ATP, hybridisering av den radio-aktive oligonucleotidprove til DNA av individuelle kloner av et cDNA-bibliotek inneholdende ECGF-cDNA, og påvisning og isolering av klonene som hybridiserer ved autoradiografi.

Et slikt kloningssystem er anvendbart på lambda gt-^-systemet beskrevet av Young og Davis, supra.

Kloner inneholdende hele sekvensen av ECGF, identifiseres under anvendelse som probe av cDNA-innføyningen av ECGF-rekombinanter isolert under begynnelsesscreeningen av det rekombinante lambda gt.^cDNA-bibliotek med ECGF-spesifikke oligonucleotider. Nucleotidsekvensteknikker anvendes for å bestemme sekvensen av aminosyrer kodet av cDNA-fragmentene. Denne informasjon kan anvendes for å bestemme identiteten av de antatte ECGF cDNA-kloner ved sammenligning med den kjente aminosyresekvens av aminoenden av kveg ECGF og av et peptid avledet ved cyanogenbromid-splitting av ECGF.

Eksempel

A. Fremstilling av totalt RNA

Totalt RNA (meddeler, ribosomalt og overførings)

ble ekstrahert fra frisk, to-dager gammel human hjernestamme hovedsakelig som beskrevet av Chirgwin, supra, (1979). Cellepellets ble homogenisert i 5 volumer av en løsning inneholdende 4 M guanidinthiocyanat og 25 mM "Antifoam" A (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.). Homogenatet ble sentrifugert ved 6.000 opm i en Sorvall GSA rotor i 15 minutter ved 10°C. Supernatantvæsken ble justert til pH 5,0 ved tilsetning av eddiksyre, og RNA ble utfelt med 0,75 volumer ethanol ved -20°C i 2 timer. RNA ble oppsamlet ved sentrifugering og oppløst i 7,5 M guanidin-hydroklorid inneholdende 2 mM natriumcitrat og 5 mM dithiothreitol. Etter to ytterligere utfellinger under anvendelse av

0,5 volumer ethanol, ble det gjenværende guanidin-hydroklorid ekstrahert fra bunnfallet med absolutt ethanol. RNA ble oppløst i sterilt vann, uløselig materiale ble fjernet ved sentrifugering, og pelletene ble reekstrahert med vann.

RNA ble justert til 0,2 M kaliumacetat og utfelt ved tilsetning av 2,5 volumer ethanol ved -20°C over natten.

B. Fremstilling av poly( A)- holdig RNA

Den totale RNA-utfelling, fremstilt som beskrevet ovenfor, ble oppløst i 20 mM Hepes-buffer (pH 7,2) inneholdende 10 mM EDTA og 1% SDS, ble oppvarmet til 65°C i 10 minutter og ble deretter hurtig avkjølt til 25°C. RNA-løsningen ble deretter fortynnet med et likt volum vann, og NaCl ble tilsatt for å bringe sluttkonsentrasjonen til

300 mM NaCl. Prøver inneholdende opptil 240 A26Qenheter

av RNA, ble kromatografert på poly(U)-Sepharose<®>under anvendelse av standardprosedyrer. Poly(A)-holdig RNA ble eluert med 70% formamid inneholdende 1 mM Hepes-buffer

(pH 7,2), og 2 mM EDTA. Eluatet ble justert til 0,24 M NaCl,

og RNA ble utfelt med 2,5 volumer ethanol ved -20°C.

C. Konstruksjon av cDNA- kloner i lambda gt-^

Prosedyren fulgt for den enzymatiske reaksjon, er vist i figur 1. mRNA (20 jag) ble kopiert i ds-cDNA med revers transkriptase og DNA-polymerase I nøyaktig som beskrevet av Buell, et al., supra, og Wilkensen, et al.,

J. Biol. Chem., 253:2483 (1978). ds-cDNA ble avsaltet på Sephadex<®>G-50, og tomromsfraksjonene ble ytterligere renset på en"Elutip"-D-kolonne (Schleicher&Schuell, Keene, NH) etter fabrikantens retningslinjer. ds-cDNA ble gjort stump-endet ved inkubering med Sl nuclease (Ricca,

et al., J. Biol. Chem., 256:10362 (1981)]. Reaksjons-blandingen besto av 0,2 M natriumacetat (pH 4,5), 0,4 M natriumklorid, 2,5 mM sinkacetat og 0,1 enhet Sl nuclease pr. ng ds-cDNA, brakt til et sluttelig reaksjonsvolum på 100 ul. ds-cDNA ble inkubert ved 37°C i 1 time, ble ekstrahert med fenol:kloroform og ble deretter avsaltet på en Sephadex<®>G-50 kolonne som ovenfor beskrevet.

ds-cDNA ble deretter behandlet med EcoRI-methylase og Klenow-fragmentet av DNA-polymerase I under anvendelse av de reaksjonsbetingelser som er beskrevet i Maniatis, et al., Molecular Cloning, supra. cDNA ble igjen avsaltet på Sephadex<®>G-50 som ovenfor beskrevet, og ble deretter ligert til 0,5 ug fosforylerte EcoRI-kjedere under anvendelse av T"4 DNA-ligase (Maniatis, et al., supra). Blandingen ble spaltet med EcoRI og fraksjonert på en 8% acryl-amidgel i Tris-boratbuffer (Maniatis, et al., supra). DNA med en størrelse større enn 1 kilobase, ble eluert fra gelen og gjenvunnet ved binding til en "Elutip"-D-kolonne, ble eluert med 1 M NaCl og deretter oppsamlet ved ethanol-utfelling.

Som vist i figur 2, ble DNA-fragmentene deretter innføyd i EcoRI-spaltet og fosfatase-behandlet lambda gt-^under anvendelse av T. DNA-ligase. Et bibliotek på 5,7 x 10 fag ble dannet, hvorav ca. 65% var rekombinant fag. Biblioteket ble forsterket ved fremstilling av platearkiv ved 42°C på E. coli Y1088 [supE supF metB trpR hsdR~ hsdM<+>tonA21 strA lacUl69 (proC::Tn5) (pMC9)]. Forsterknings-prosedyrer er beskrevet i Maniatis, et al., supra. Viktige trekk ved denne stamme, beskrevet av Young og Davis, supra, innbefatter (1) supF (nødvendig undertrykkelse av fag "amber" mutasjon i S-genet), (2) hsdR<->hsdM<+>(nødvendig for å forhindre restriksjon av fremmed DNA før vert-modifisering), og (3) lacUl69 (proC::Tn5), og (4) (pMC9)

(et lac I-bærende pBR322-derivat som undertrykker, i fra-vær av en fremkaller, ekspresjonen av fremmede gener som kan være skadelige for fag og/eller cellevekst).

D. Identifisering av kloner inneholdende ECGF- sekvens

For å screene biblioteket med hensyn til rekombinant fag inneholdende ECGF cDNA, ble 1,5 x 10 fag anbrakt på et spor av E. coli Y1090 [AlacUl69 proA A lon araDl39 strA supF (trpC22::TnlO) (pMC9)] og inkubert ved 42°C i 6 timer. Etter at platene var kjølt over natten, ble et nitrocellu-losefilter lagt over platene. Stillingen av filteret ble markert med en nål. Filteret ble fjernet etter 1 minutt og fikk tørke ved romtemperatur. Fra hver plate ble et duplikatfilter fremstilt nøyaktig som beskrevet, med det unntak at filteret fikk være i kontakt med platen i 5 minutter. Alle filtere ble deretter preparert for hybridisering som beskrevet i Maniatis, et al., supra. Dette involverte DNA-denaturering i 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl, nøytralisering

i 1 M Tris-HCl, pH 7,5, 1,5 M NaCl, og oppvarming av filtrene i 2 timer til 80°C i vakuum.

For å screene det humane hjernestamme-cDNA-bibliotek med hensyn til kloner inneholdende ECGF-innføyninger, ble et spesifikt oligonucleotid konstruert. Dette oligonucleotid var basert på en delvis aminosyresekvensanalyse av aminoenden av ECGF. Som vist i figur 3, linje a & b, ble kveg ECGF isolert som to arter, betegnet a-og 3-ECGF, som avviker bare i aminosyrene funnet ved de respektive amino-ender. Som vist i figur 3, linje 5, er 3-ECGF en ube-tydelig større art enn a-ECGF. Den nøyaktige aminosyre sekvens ved aminoenden av 3-ECGF er ikke bestemt, imidlertid er sekvensen avledet fra massespektralanalyse ved hurtig atombombardement, og aminosyresammensetningen av det aminoterminale, tryptiske peptid av kveg 3-ECGF er vist. De aminoterminale, blokkerende grupper synes å være acetyl. Hvis intakt 3-ECGF spaltes av trypsin, bestemmes en andre aminosyresekvens funnet i pr, men ikke i a-ACGF som starter med PheAsnLeu... Denne sekvens finnes også ved aminoenden av sur fibroblast-vekstfaktor [Thomas, K.A. et al., Prae. Nati. Acad. Sei., 8_2: 6409-6413 (1985)]. Aminoenden av oc-ECGF er AsnTyrLys... (figur 3, linje a) og er ekvivalent med 3-ECGF minus en aminoterminal forlengelse. I figur 3

er linje c og d angitt for sammenligning av aminosyresekvensen av cyanogenbromid-spaltet kveg a- og 3-ECGF.

For oligonucleotidutforming ble aminosyresekvensen IleLeuProAspGlyThrValAspGlyThrLys svarende til a-ECGF-aminosyrer 19-29, valgt. Snarere enn utforming av en blanding av oligonucleotider som dekker alle de mulige kodende sekvenser (på grunn av degenerering av den genetiske kode) ble et langt, unikt oligonucleotid konstruert. Slike oligonucleotidprober har tidligere vist seg å være vellykkede prober ved screening av komplekse cDNA-[Jaye, et al., Nucleic Acids Research 11:2325-2335, (1983)] og genomiske [Gitschier, et al., Nature, 312:326-330 (1984)] biblioteker. Tre kriterier ble anvendt ved utforming av ECGF-proben: (1) Det nucleotide CG ble unngått. Denne strategi var basert på den observerte underrepresentasjon av CG-dinucleotidet i eukaryotisk DNA [Josse, et al., J. Biol. Chem. 236:864-875,

(1961)]; (2) foretrukne kodon-utnyttelsesdata ble anvendt hvor dette var mulig. En nylig og grundig analyse av human kodonutnyttelse ble funnet i Lathe, J. Mol. Biol. 183:1-12

(1985); og (3) hvor strategiene med hensyn til CG-dinucleo-tid og foretrukket kodonutnyttelse var uinformative, ble uvanlig baseparing tillatt. Denne strategi var basert på den naturlige forekomst av G:T, I:T, I:A og I:C basepar som oppstår ved interaksjon mellom tRNA-antikodon og mRNA-kodon [Crick, J. Mol. Biol. 19^: 548-555, (1966)]. Et diagram over vanlige og uvanlige basepar er vist i figur 4. Anvendelse av I (Inosin) i en hybridiseringsprobe ble først demonstrert i et modellforsøk av Ohtsuka, et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985). Den totale strategi og foretatte valg ved konstruksjonen av oligonucleotidet anvendt for å screene det humane hjernestamme cDNA-bibliotek med hensyn til ECGF er vist i figur 5. I tillegg ble to andre oligonucleotider, utformet under anvendelse av samme strategi, konstruert.

Ca. 30 pmol av oligonucleotidet vist i figur 5,

3 2

ble radioaktivt merket ved inkubering med P-gamma-ATP og T4 polynucleotid-kinase, hovedsakelig som beskrevet av Maniatis, et al., supra. Nitrocellulosefiltere, fremstilt

som ovenfor beskrevet, ble prehybridisert ved 42°C i 6X SSPE (IX SSPE = 0,18M NaCl, 0,01M NaHP04pH 7,2,

0,001M EDTA), 2X Denhardt1 s (IX Denhardfs - 0,02% hvorav Ficoll, polyvinylpyrrolidon, kvegserumalbumin), 5% dextran-3 2

sulfat og 100 ug/ml denaturert laksesperm-DNA. Det P-merkede oligonucleotid ble tilsatt etter 4 timers prehybri-disering, og hybridiseringen ble fortsatt over natten ved 42°C. Uhybridisert probe ble fjernet ved sekvensvis vasking ved 37°C i 2X SSPE, 0,1% SDS.

Fra 1,5 x 10 screenede plakker ga 2 plakker positive autoradiografe signaler etter eksponering over natten.

Disse kloner ble renset til homogenitet ved gjentatte rense-sykluser under anvendelse av det ovenfor angitte oligonucleotid som hybridiseringsprobe.

De to kloner som ble isolert, ECGF-kloner 1 og 29,

ble ytterligere analysert i detalj. Etter oppslutning med EcoRI utviste klon 1 og 29 cDNA-innføyninger på 2,2 og 0,3 Kb. Innsnitt-translasjon av klonet cDNA og dets etterfølgende anvendelse som en radiomerket probe i Southern blot-analyse (Maniatis, et al., supra) viste at klon 1 og 29 var be-slektede og overlappende kloner. Den overlappende art av disse to kloner er vist i figur 6.

Klon 1 og 29 ble analysert i ytterligere detalj

som følger: Ytterligere to oligonucleotider ble konstruert, basert på aminosyresekvensen av kveg-ECGF. Disse oligo-

nucleotider ble utformet, basert på samme betraktninger som de som ble anvendt ved utformingen av oligonucleotidet anvendt for å isolere klon 1 og 29. Disse oligonucleotider (ECGF-oligonucleotid II og III) er vist i figur 7. Disse to oligonucleotider såvel som oligo(dT),Q, ble radioaktivt merket i en kineringsreaksjon som ovenfor beskrevet, og ble anvendt som hybridiseringsprober i Southern blotting-forsøk. Resultatene av disse forsøk viste at 0,3 Kb cDNA-innføyningen av klon 29 hybridiserte til ECGF-oligonucleotid I og II, men ikke til ECGF-oligonucleotid III eller oligo (dT)-^g; 2,2 Kb cDNA-innf øyningen av klon 1 hybridiserte til oligonucleotid I, II, III såvel som oligo(dT)lg. Disse data og etterfølgende nucleotidsekvensbestemmelse av klon 1 og 29 viste at 3<1->enden av klon 1 ender med en poly(A)-hale. Hybridisering av klon 1 til ECGF-oligonucleotid III som er basert på et cyanogenbromid-spaltningsprodukt av kveg ECGF, såvel som til oligo(dT)^g, antyder sterkt at dette klon inneholder resten av den kodende sekvens for både a- og P-ECGF såvel som en stor (større enn 1 Kb) 3'-flankerende sekvens.

cDNA-innføyningene fra klon 1 og 29 ble isolert, subklonet i Ml3mpl8, og den ECGF-kodende, åpne leseramme og flankerende regioner ble sekvensert ved kjedeterminer-ingsmetoden [Sanger et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 7_4:5463-5467 (1977)]. Nucleotidsekvensen av disse kloner og aminosyresekvensen utledet fra nucleinsyresekvensen, er vist i figur 8. Undersøkelse av nucleotidsekvensen åpen-barte en åpen leseramme på 465 nucleotider som koder for humant ECGF. De 155 aminosyrer av humant ECGF ble funnet å være flankert av translasjons-stoppkodon. Den NH2~terminale aminosyre av humant [3-ECGF utledet fra cDNA-sekvensen, er methionin som mest sannsynlig tjener som en translasjons-initieringsrest. Disse data, sammen med den relativt ikke-hydrofobe art av de første 15-20 aminoterminale rester, antyder sterkt at humant (3-ECGF syntetiseres uten et NH2-terminalt signalpeptid. En sammenligning av figur 3 og 8 viser at den aminoterminale aminosyresekvens av trypsin-

spaltet kveg (3-ECGF, såvel som den av kveg a-ECGF, er nærmest identisk med aminosyresekvensen forutsagt fra nucleotidsekvensen av lambda ECGF klon 1 og 29. En total homologi mellom de to arter på over 95% ble observert.

Northern blot-analyse (Maniatis, et al., supra) viser at ECGF mRNA er en enkel molekylær art som kovandrer med 28S rRNA (figur 9). Ved å ta i betraktning variasjonen i den beregnede størrelse av 2 8S rRNA er den tilnærmede størrelse av ECGF mRNA 4,8 - 1,4 Kb. Alt av sekvensen som koder for de modne former av både a- og (3-ECGF, er kodet innen ECGF-klon 1 og 29 som omfatter tilnærmet 2,3 Kb. Disse data demonstrerer således at regionen 5' og som flankerer de ECGF-kodende sekvenser, er meget stor (ca.

2,5 - 1,4 Kb).

cDNA-innføyninger fra klon 1 og klon 29 ble fjernet ved oppslutning med EcoRI og subklonet i pUC8 ved EcoRI-stedet. Plasmidet dannet fra klon 1, ble betegnet som pDHl5, og plasmidet dannet fra klon 29, ble betegnet som pDHl4. Plasmidene ble deponert i American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852. Plasmidet fra klon 1, pDHl5, ble betegnet som ATCC 53336,

og plasmidet fra klon 29, pDH 14, ble betegnet som ATCC 53335.

Dette eksempel beskriver således eksperimentelle prosedyrer som tilveiebringer human endotelial cellevekstfaktor hovedsakelig fri fra andre proteiner av human opprinnelse .

ECGF finner anvendelse ved vekst og forsterkning

av endoteliale celler i kultur. For tiden ekstraheres ECGF for cellekulturbruk fra kveghjerne ved den protokoll som er beskrevet av Maciag, et al., [Proe. Nati. Acad. Sei., 7_6: 11, 5674-5678 (1978)]. Dette urene kveg ECGF er mitogenisk for humane umbilicale vene-endotelialceller [Maciag, et al., J. Biol. Chem. 257:5333-5336 (1982)] og endoteliale celler fra andre arter. Anvendelse av heparin med ECGF

og en fibronectinmatriks tillater etablering av stabile endoteliale cellekloner. Den anbefalte konsentrasjon av

dette urene kveg ECGF for bruk som et mitogen in vitro, er 150 ug pr. ml vekstmedium.

Rekombinant DNA-avledet, humant ECGF har derfor anvendelighet som et forbedret substitutt for urent kveg ECGF i in vitro-dyrkning av humane, endoteliale celler og andre mesenchymale celler for forskning. Aktiviteten av humant ECGF er forventet å være den samme eller bedre enn kveg ECGF i potensiering av endotelial cellevekst på grunn av den høye grad av homologi i aminosyresekvensene av begge proteiner. Det forventede effektive doseområde for potensiering av celledeling og vekst in vitro er 5 - 10 ng av renset ECGF pr. ml kulturmedium. Produksjon av ECGF via rekombinant-DNA teknologier som beskrevet i foreliggende patentsøknad, og etterfølgende rensing som beskrevet av Burgess, et al., [J. Biol. Chem. 260:11389-11392 (1985]),

vil tilveiebringe store mengder av et rent produkt av human opprinnelse (hittil utilgjengelig i noen mengde eller renhet) for å kunne utvikle modeller av human homeostasis og antiogenesis.

Rekombinant DNA-avledet humant ECGF har også anvendelse ved potensiering av cellevekst på en protetisk anordning, snarere enn en vevdyrkningskolbe eller flaske.

Denne anordning kan eller kan ikke være belagt med andre molekyler som vil kunne lette festingen av endoteliale celler til anordningen. Disse hjelpemolekyler kan innbefatte ekstracellulære matriksproteiner (f.eks. fibronectin, laminin eller en av collagenene), humant serumalbumin, heparin eller andre glycosaminoglycaner eller inerte, organ-iske molekyler. Endoteliale celler vil kunne dyrkes på disse overflater under anvendelse av effektive doser av ECGF i dyrkningsmediet som til slutt dekker anordningen med et endotelialt cellemonolag. Denne anordning ville deretter gi en ikke-trombogenisk overflate på den protetiske anordning og således redusere sjansen for potensielt livs-truende trombogeniske tilstander etter implantasjon av den protetiske anordning.

ECGF har anvendelse innen diagnostiske anvendelsesområder. Schreiber, et al., [Proe. Nati. Acad. Sei., 8_2:6138 (1985)] utviklet en dobbel antistoff-immunobestemm-else for kveg ECGF. I denne bestemmelse ble 96-brønns polyvinylkloridplater belagt med kanin anti-ECGF, og de gjenværende bindingssteder ble deretter blokkert med 10% normalt kaninserum. Prøver av ECGF ble deretter tilsatt til brønnene og inkubert. Etter vasking ble murint, mono-klonalt anti-ECGF tilsatt. Etter inkubering og flere vaskinger ble kanin anti-mus IgG koblet med peroxydase, tilsatt. Reaksjonsproduktet ble kvantifisert spektrofoto-metrisk etter omdannelse av 0-fenylendiamin i nærvær av hydrogenperoxyd. En lignende konstruert immunobestemmeIse kan være anvendbar for overvåkning av humane ECGF-nivåer i sykdomstilstander som påvirker endotelial cellevekst. Renset, rekombinant-DNA-avledetECGF kan være anvendbart som et standardreagens ved kvantifisering av ukjente ECGF-prøver.

ECGF kan også være mulig ved behandling av skadede, eller ved regenering av blodkar og andre endoteliale celle-forede strukturer.

Det skal bemerkes at foreliggende oppfinnelse ikke er beregnet på å være begrenset av den illustrative ut-førelsesform. Det er mulig å produsere ytterligere utfør-elsesformer uten å avvike fra oppfinnelsens ramme. Slike utførelsesformer fører inn under fagmannens dyktighet.

Claims (21)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av human endotelial cellevekstfaktor, karakterisert ved at det tilveiebringes en replikerbar ekspresjonsvektor som er i stand til å uttrykke DNA-sekvensen som koder for human endotelial cellevekstfaktor i en egnet vert, angitte vert transformeres under dannelse av en rekombinant vert, og angitte rekombinante vert opprettholdes under betingelser som tillater ekspresjon av angitte endoteliale cellevekstfaktor - kodende cDNA-sekvens for å produsere endotelial cellevekstfaktor.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den innbefatter ytterligere trinn for gjenvinning av angitte endoteliale cellevekstfaktor.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at ekspresjonsvektoren er en bakteriofag.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at angitte bakteriofag er et medlem av gruppen bestående av lambda 9^-^_ o°9 lambda gt^.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at angitte ekspresjonsvektor er et plasmid.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at plasmidet er avledet fra pBR322.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at kontrollfunksjonen på angitte ekspresjonsvektor er tilveiebragt av viralt materiale.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at angitte, virale materiale er et medlem av gruppen bestående av kveg-papillomavirus, Epstein Barr-virus, adenovirus, Simian-virus 40 og bacculovirus.

9. Endotelial cellevekstfaktor produsert i henhold til fremgangsmåten ifølge krav 2.

10. Replikerbar ekspresjonsvektor som er i stand til å uttrykke endotelial cellevekstfaktor i et selv-replikerende, rekombinant system.

11. Selvreplikerende, rekombinant system transformert med vektoren ifølge krav 10.

12. Rekombinant system ifølge krav 11, karakterisert ved at systemet er i en celle.

13. Rekombinant system ifølge krav 11, karakterisert ved at angitte system er cellefritt.

14. Rekombinant system ifølge krav 11, erholdt ved transformering eller infisering av et medlem av gruppen bestående av E. coli, B. subtilis, insekt, gjær og hvirvel-dyrcelle.

15. Rekombinant system ifølge krav 11, erholdt ved transformering av eukaryoter.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at gjenvinning av angitte endoteliale cellevekstfaktor omfatter reaksjonen av proteinene uttrykt av det rekombinante vertsystem med en reagenssammensetning omfattende minst ett bindingsprotein som er spesifikt for endotelial cellevekstfaktor.

17. Human endotelial cellevekstfaktor hovedsakelig fri for andre proteiner av human opprinnelse.

18. Endotelial cellevekstfaktor ifølge krav 17, omfattende en polypeptidsekvens som strekker seg fra den NH2 -terminale aminosyre av endotelial cellevekstfaktor.

19. En cDNA-klon omfattende den komplette kodende sekvens for human endotelial cellevekstfaktor.

20. En cDNA-klon inneholdende utranslaterte nucleotidsekvenser lokalisert 5' og 3' til den kodende sekvens av human endotelial cellevekstfaktor som definert ved det endoteliale cellevekstfaktor-mRNA.

21. Sammensetning omfattende en terapeutisk effektiv mengde av human endotelial cellevekstfaktor for å aktivere sårlegning i blanding med en akseptabel bærer.