JP2011121882A - ヒト酸性繊維芽細胞増殖因子の改変ペプチド - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ヒト酸性繊維芽細胞増殖因子(aFGF)の改変ペプチドであって、該改変ペプチドは、ネイティブなヒトaFGFのN末端から20個のアミノ酸を欠失することにより短化したネイティブヒトaFGF、および該短化ネイティブaFGFの前に付加されたアラニン(Ala)を含み、相対的に高い安定性を持つ。更に、該単離ペプチドおよび医薬上許容し得る担体を含む、医薬組成物。
【選択図】なし
Description
イン・ビトロで様々な細胞型の増殖および分化に影響を及ぼす酸性繊維芽細胞増殖因子(aFGF)は、全脳および視床下部などの神経組織由来の一本鎖タンパク質として最初に単離された。aFGFは、ヘパリン依存性の有糸***促進物質であり、4つ全ての型の既知FGFレセプターおよびそのスプライス形態に強固に結合することができる。それは、運動機能および感覚機能と関連のあるニューロンの特定サブセット内に局在し、成人の脳から精製され得る。精製aFGFは、神経芽細胞に対する有糸***促進物質であり、脊髄ニューロンから伸張する軸索を促進する。
本発明は、aFGF135と称するヒト酸性繊維芽細胞増殖因子(aFGF)改変ペプチドを提供するものであって、ここで該改変ペプチドは、ネイティブなヒトaFGFのN末端から20個のアミノ酸を欠失することにより短化したネイティブヒトaFGF、および該短化ネイティブaFGFの前に付加されたアラニン(Ala)を含んでいる。特に、ペプチドaFGF135は、比較的高い安定性を持っており、また既知のaFGFペプチドよりも優れている配列番号:1のアミノ酸配列を含む。
前記した発明の要旨、ならびに本発明の下記詳細な説明は、添付の図面と併せて読む場合に十分に理解されるであろう。しかし、本発明は、示した正確な配置および手段に限定する意図はないと理解されるべきであろう。
この発明は、aFGF135と称するヒト酸性繊維芽細胞増殖因子(aFGF)の改変ペプチドを提供するものであって、該改変ペプチドは、ネイティブなヒトaFGFのN末端から20個のアミノ酸を欠失することにより短化したネイティブヒトaFGF、および該短化ネイティブaFGFの前に付加されたアラニン(Ala)を含んでいる。特に、ペプチドaFGF135は、配列番号:1のアミノ酸配列を含む。予想外に、ペプチドaFGF135の改変ペプチドは、温度の生理機能の下で比較的高い安定性を有し、その他の既知aFGFとは異なる構造を有する。
完全長のヒトaFGFは、Clontech Laboratories, Incから購入したQuick Clone cDNAの生成物であった。構築前に、2つの特異的プライマー配列を下記のように作成した:
配列番号:2: 5’-ACTG ▼ AATTCATGGCTGAAGGGGAAATCA-3’
配列番号:3: 5’-AAGA ▼ AGCTTCAATCAGAAGAGACTGGCAGG-3’
配列番号:4:5’-GGCA ▼ TATGGCTAATTACAAGAAGCCC-3’
配列番号:5:5’-AAGA ▼ GATCTCTTTAATCAGAAGAGACTGGCAGG-3’
pET3c-haFGFの増幅後に、ベクターを、BL21(DE3)(Novagen, Germany)コンピテント細胞を用いてDNAに形質転換した。アンピシリン耐性のE.coliコロニーを、1mM IPTG(イソプロピル β-D-1-チオガラクトピラノシド)の終濃度を用いて誘導する前に、LB培地で培養してOD600=0.3まで増殖させた。16時間(±2時間)のインキュベーション後に、細菌を回収し、27000 xgで遠心分離して、上清を除去した。集菌した細菌をPBSで2回洗浄し、次いで、高圧ホモジナイザーにより溶菌した(Niro Soavi Model NS2006L, Daken Stainless Products Ltd., UK)。溶菌サンプルを、0.22μmの孔サイズを有するシーブに透過させて、タンパク質単離のために準備した。
(I)ウェスタンブロッティング分析
粗製ペプチドを、4-20または10-20%の勾配ゲルにおけるSDS-PAGEに供し、次いで電気的転移(Polyblot Transfer System, Model SBD-1000; American Bionetics, Emeryville, CA)により、ニトロセルロース膜(0.05 Am; Schleicher & Schuell, Inc., Keene, NH)に移し取った。aFGFペプチドの安定性を調べるために、8M 尿素を添加するか、または添加しない(潜在的凝集物を分解するまで)Laemmli緩衝溶液[1 M Tris(2.4 ml)pH 6.8、0.8 g SDS-ストック、100%グリセロール(4 ml)、0.01%のブロモフェノールブルー、0.02% β-メルカプトエタノール(電気泳動グレード)(1 ml)、および水(2.8 ml)]を、0.0625M トリス塩、SDSストック1%、および15 mMジチオスレイトルを含むスタッキングゲル緩衝溶液として調製した。サンプルを、室温で1時間保持し、その後4℃で終夜保持した。それを煮沸した後に、SDS-PAGE上で泳動させた。
インタクトなaFGFペプチドを、37℃および54℃で各々インキュベートした。この54℃は自己促進性分解温度である。その後、サンプルをウェスタンブロッティングに供した。37℃でのインキュベーション後のサンプルに対する結果を図2Aに示した。該結果は、レーン1-3は各々インキュベーションが6時間、24時間および48時間後の結果であり、レーン4は分子量マーカーであって、また各バンド上部の数字は分子量を表す。54℃で120分間(2時間)のインキュベーション後のペプチドaFGF135に対する結果を図2Bに示した;ここで、レーン1−3は各々10分間、60分間および120分間のインキュベーション後の結果であり、レーン4は分子量マーカーであり、また各バンド上部の数字は分子量を表す。
現在、NMR分光法は、原子分解にて生物学的マクロ分子様タンパク質および核酸の構造を決定することが出来るよく知られている技術である。ペプチドaFGF135についての構造の特徴分析を、High Field Nuclear Magnetic Resonance Center (Academia Sinica, Taiwan)により行った。
b. 二次構造領域はMOLMO選択を基にしている:7-11、16-21、25-29、39-43、48-53、59-62、68-71、80-85、89-94、127-131。
c. Lozano RMら(Biochemistry, 2;39(17):4982-93, 2000)にて選択された領域に対応する選択領域。
Claims (8)
- ヒト酸性繊維芽細胞増殖因子(aFGF)の改変ペプチドであって、
ネイティブなヒトaFGFのN末端から20個のアミノ酸を欠失させることにより短化したネイティブヒトaFGF、および該短化ネイティブaFGFの前に付加されたアラニン(Ala)を含む、ペプチド。 - 配列番号:1のアミノ酸配列を含む、請求項1記載のペプチド。
- 図5Aに示した3D構造を特徴とする、請求項1記載のペプチド。
- 相対的に高い安定性を持っている、請求項1記載のペプチド。
- 請求項1の単離ペプチドおよび医薬上許容し得る担体を含む、医薬組成物。
- 請求項2の単離ペプチドおよび医薬上許容し得る担体を含む、医薬組成物。
- 請求項3の単離ペプチドおよび医薬上許容し得る担体を含む、医薬組成物。
- 請求項4の単離ペプチドおよび医薬上許容し得る担体を含む、医薬組成物。
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