DE3750451T2 - Rekombinanter menschlicher endothelzellenwachstumsfaktor. - Google Patents

Description

• Die Erfindung bezieht sich auf Endothelzellwachstumsfaktor (ECGF) seine durch rekombinante DNA gesteuerte Synthese und die Verwendung von ECGF bei der Behandlung von Endothelzellschäden und/oder der Regeneration.
• Endothelzellwachstumsfaktor, der hier als "ECGF" bezeichnet wird, ist in vitro ein Mitogen für Endothelzellen. Das Wachstum von Endothelzellen ist ein notwendiger Schritt während des Prozesses der Angiogenese [Maciag, Proci. Hemostasis and Thromb., 7: 167-182 (1984); Maciag, T., Hoover, G.A., und Weinstein, R., J. Biol. Chem., 257: 5333-5336 (1982)]. Rinder-ECGF ist von Maciag et al. [Science 225: 932-935 (1984)] unter Verwendung einer Streptomycinsulfat-Präzipitation, Gelausschlußchromatographie, Ammoniumsulfat-Präzipitation und Heparin-Sepharose Affinitätschromatographie isoliert worden. Auf diese Weise gereinigtes Rinder-ECGF ergibt ein Einzelkettenpolypeptid, das einen anionischen isoelektrischen Punkt und ein apparentes Molekulargewicht von 20000 hat [Maciag, s. o.; Schreiber et al., J. Cell Biol., 101: 1623-1626 (1985); und Schreiber et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 82: 6138-6142 (1985)]. Kürzlich sind multiple Formen von Rinder-ECGF von Burgess et al. [J. Biol. Chem. 260: 11389-11392 (1985)] durch Natriumchlorid-Gradientenelution von Rinder-ECGF aus einer Heparin-Sepharose®-Säule oder durch Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) isoliert worden. Die beiden isolierten Polypeptide, die als α- und β-ECGF bezeichnet werden, haben apparente Molekulargewichte von 17000 bzw. 20000. Unter Verwendung dieses Verfahrens wird in 8500 ml Rinderhirnextrakt enthaltenes Rinder-ECGF (6,25·10&sup7; Gesamteinheiten) auf ein Gesamtvolumen von 6 ml α- ECGF (3,0 x10&sup6; Einheiten) und 3 ml β-ECGF (5,2·10&sup5; Einheiten) konzentriert. Dies ist eine 9300fache Reinigung von α- ECGF und eine 16300fache Reinigung von β-ECGF (Burgess, s. o.). Kürzlich sind monoklonale Mausantikörper gegen Rinder- ECGF hergestellt worden (Maciag et al., s. o.), die für die Reinigung von Rinder-ECGF auf eine Weise nützlich sein können, die der von Zimmermann und Fulcher im US-Patent Nr. 4,361,509 beschriebenen Reinigung von Faktor VIIIC mit monoklonalen Antikörpern ähnlich ist.
• Die Reinigung von zwei Formen von Endothelzellwachstumsfaktor (ECGF) aus menschlichem Gehirn ist ebenso schon offenbart [Conn & Hatcher, Biochem. Biophys. Res. Commun., Band 24, Seiten 262-268 (1984)]. Wie jedoch von der gleichen Gruppe in einer späteren Publikation zugegeben wurde [Gimenez- Gallego et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., Band 135, Seiten 541-548 (1986)] waren die nach Conn & Hatcher gereinigten Wachstumsfaktoren tatsächlich eine Mischung von Peptiden. Von einer dieser Mischungen, "Gipfel I", konnte durch weitere Reinigung und Aminosäuresequenzanalyse gezeigt werden, daß sie zwei mikroheterogene Formen von saurem Fibroblastenwachstumsfaktor sowie einen nicht identifizierten Bestandteil enthält. Von der anderen Mischung, "Gipfel II", wurde gezeigt, daß sie zwei elektrophoretisch distinkte Formen von basischem Fibroblastenwachstumsfaktor enthielt.
• Giminez-Gallego et al., [Science, Band 230; S. 1385-1388, (1985)] offenbaren einen sauren Fibroblastenwachstumsfaktor aFGF, der aus Rindergehirnen abgeleitet ist, und die Aminosäureseguenzen von zwei mikroheterogenen Formen, nämlich aFGF-1 und aFGF-2.
• Rekombinante DNA-Verfahren sind allgemein bekannt. Siehe Methods in Enzymolociv (Academic Press, New York), Bände 65 und 68 (1979); 100 und 101 (1983) und die darin zitierten Referenzen, die alle hier durch Verweis einbezogen werden. Eine ausführliche technische Diskussion betreffend die am häufigsten verwendeten rekombinanten DNA-Verfahren kann in Maniatis et al., Molecular Cloninci, Cold Spring Harbor Laboratory (1982), gefunden werden. Für verschiedene Polypeptide kodierende Gene können durch Einbauen eines DNA-Fragmentes, das für das Polypeptid kodiert, in ein rekombinantes DNA-Vehikel, z. B. einen bakteriellen oder viralen Vektor, und Transformieren eines geeigneten Wirtes kloniert werden. Dieser Wirt ist typischerweise ein Escherichia coli-(E. coli-)Stamm, jedoch können, abhängig vom gewünschten Produkt, eukaryontische Wirte verwendet werden. Die die rekombinanten Vektoren enthaltenden Klone werden isoliert und können wachsengelassen und verwendet werden, um das gewünschte Polypeptid in einem größeren Maßstab zu erzeugen.
• Verschiedene Gruppen von Forschern haben Mischungen von messenger-(Boten-)RNA (mRNA) aus eukaryontischen Zellen isoliert und eine Reihe von enzymatischen Reaktionen angewendet, um doppelsträngige DNA-Kopien zu synthetisieren, die zu dieser mRNA-Mischung komplementär sind. In der ersten Reaktion wird die mRNA durch eine RNA-abhängige DNA-Polymerase, die auch reverse Transkriptase genannt wird, in eine einzelsträngige komplementäre DNA (cDNA) transkribiert. Die reverse Transkriptase synthetisiert DNA in 5'-3'-Richtung, verwendet Desoxyribonukleosid-5'-Triphosphate als Vorläufer und braucht sowohl eine Matrize als auch einen Primerstrang, wobei letzterer ein freies 3'-Hydroxylende haben muß. Reverse Transkriptaseprodukte, gleich, ob Teil- oder vollständige Kopien der mRNA-Matrize, weisen oft kurze, teilweise doppelsträngige Haarnadelschlaufen ("Loops" - Schlaufen) an ihren 3'-Enden auf. In der zweiten Reaktion können diese Haarnadelschlaufen als Primer für die DNA-Polymerase ausgenutzt werden. Vorgeformte DNA ist sowohl als Matrize als auch als Primer bei der Wirkung der DNA-Polymerase erforderlich. Die DNA-Polymerase erfordert die Gegenwart eines DNA-Stranges mit einer freien 3'-Hydroxylgruppe, an die neue Nukleotide angefügt werden, um die Kette in 5'-3'- Richtung zu verlängern. Die Produkte einer solchen sequentiellen Reaktion von reverser Transkriptase und DNA-Polymerase besitzen immer noch eine Schlaufe am Ende. Der Apex der Schlaufe oder "Faltpunkt" der doppelsträngigen DNA, der so erzeugt worden ist, ist im wesentlichen ein einzelsträngiges Segment. In der dritten Reaktion wird das einzelsträngige DNA-Segment durch die einzelstrangspezifische Nuklease S1 gespalten, um ein "stumpfendiges" Duplex-DNA-Segment zu erzeugen. Dieses allgemeine Verfahren ist auf jede mRNA-Mischung anwendbar und ist von Buell et al., J. Biol. Chem., 253 :2483 (1978), beschrieben.
• Die resultierende doppelsträngige cDNA-Mischung (ds-cDNA) wird durch eines von vielen bekannten Verfahren, die zumindest teilweise von dem jeweils verwendeten Vehikel abhängen, in Klonierungsvehikel insertiert. Verschiedene Insertionsverfahren sind im Detail in Methods In Enzymolociv 68: 16-18 (1980), und den darin zitierten Literaturstellen diskutiert.
• Sobald die DNA-Segmente insertiert sind, wird das Klonierungsvehikel zur Transformation eines geeigneten Wirtes verwendet. Diese Klonierungsvehikel verleihen dem Wirt gewöhnlich die Eigenschaft einer Antibiotikaresistenz. Solche Wirte sind im allgemeinen prokaryontische Zellen. An diesem Punkt enthalten nur wenige der transformierten oder transfizierten Wirte die gewünschte cDNA. Die Summe aller transformierten oder transfizierten Wirte stellt eine Genbank dar. Die gesamte ds-cDNA- Bank, die mit diesem Verfahren geschaffen wird, stellt eine repräsentative Probe der in der mRNA-Mischung, die als Ausgangsmaterial verwendet wird, vorhandenen kodierenden Information dar.
• Wenn eine geeignete Oligonukleotidseguenz verfügbar ist, kann sie zur Identifizierung von interessierenden Klonen auf die folgende Weise verwendet werden. Einzelne transformierte oder transfizierte Zellen werden als Kolönien auf einem Nitrozellulosefilterpapier wachsengelassen. Diese Kolonien werden lysiert; die freigesetzte DNA wird durch Erwärmen fest an das Filterpapier gebunden. Das Filterpapier wird dann mit einer markierten Oligonukleotidsonde inkubiert, die dem interessierenden Strukturgen komplementär ist. Die Sonde hybridisiert mit der cDNA, zu der sie komplementär ist, und wird durch Autoradiographie identifiziert. Die korrespondierenden Klone werden charakterisiert, um einen oder eine Kombination von Klonen zu identifizieren, die die gesamte Strukturinformation für das gewünschte Protein enthalten. Die für das interessierende Protein kodierende Nukleinsäuresequenz wird isoliert und wiederum in einen Expressionsvektor insertiert. Der Expressionsvektor bringt das klonierte Gen unter die regulatorische Kontrolle spezifischer prokaryontischer oder eukaryontischer Kontrollelemente, die die effiziente Expression (Transkription und Translation) der ds-cDNA erlauben. Diese allgemeine Technik ist daher nur für solche Proteine verwendbar, für die mindestens ein Teil ihrer Aminosäure- oder DNA-Sequenz bekannt ist, für die eine Oligonukleotidsonde verfügbar ist. Siehe allgemein Maniatis et al., s. o.
• In jüngerer Zeit sind Verfahren entwickelt worden, um spezifische ,Klone durch Testen von bakteriellen Kolonien oder von Phagenplaques mit für das kodierte interessierende Protein spezifischen Antikörpern zu testen. Dieses Verfahren kann nur mit "Expressionsvektor"-Klonierungsvehikeln durchgeführt werden, da eine Herstellung des Proteinproduktes erforderlich ist. Das Strukturgen wird benachbart zu regulatorischen Gensequenzen, die die Expression des Proteines kontrollieren, in den Vektor insertiert. Die Zellen werden lysiert, entweder durch chemische Methoden oder durch eine von der Wirtszelle oder dem Vektor zur Verfügung gestellte Funktion, und das Protein wird durch einen spezifischen Antikörper und ein Nachweissystem, beispielsweise einen Enzymimmuntest, nachgewiesen. Ein Beispiel dafür ist das Lambda gt&sub1;&sub1;-System, das von Young und Davis, Proc. Nat'1. Acad. Sci. USA, 80: 1194-1198 (1983) und Young und Davis, Science, 222: 778 (1983), beschrieben wird.
• Die vorliegende Erfindung hat es möglich gemacht, leicht verfügbare, große Mengen ECGF oder ECGF-Fragmente zur Verfügung zu stellen. Dies ist mit Oligonukleotiden erreicht worden, deren Design auf der Kenntnis der Aminosäuresequenz von Rinder- ECGF beruhte und die spezifisch mit ECGF-cDNA reagieren. Die Erzeugung von ECGF wird durch die Anwendung von rekombinanter DNA-Technologie zur Herstellung von Klonierungsvehikeln, die für ECGF-Protein kodieren, und Verfahren zum Gewinnen von ECGF-Protein, das im wesentlichen von anderen Proteinen humanen Ursprungs frei ist, erreicht.
• Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ECGF oder seine Fragmente zur Verfügung, die im wesentlichen frei von anderen Proteinen menschlichen Ursprungs sind. ECGF wird durch rekombinante DNA-Verfahren in Wirtszellen oder anderen selbst replizierenden Systemen erzeugt und in im wesentlichen reiner Form zur Verfügung gestellt. Die Erfindung stellt weiter replizierfähige Expressionsvektoren zur Verfügung, die eine DNA-Sequenz einbauen, die für ECGF kodiert, und ein selbstreplizierendes Wirtszellsystem, das damit transformiert oder transfiziert ist. Das Wirtssystem ist gewöhnlich aus prokaryontischen, z. B. E. coli oder B. subtilis, oder eukaryontischen Zellen.
• Das ECGF wird durch ein Verfahren erzeugt, das umfaßt: (a) das Herstellen eines replizierfähigen Expressionvektors, der die für ECGF kodierende DNA-Sequenz in einem geeigneten Wirtszellsystem exprimieren kann; (b) das Transformieren des Wirtssystemes, um ein rekombinantes Wirtssystem zu erhalten; (c) das Halten des rekombinanten Wirtssystemes unter Bedingungen, die die Expression der für ECGF kodierenden DNA-Sequenz erlauben, um ECGF-Protein zu erzeugen; und (d) das Gewinnen des ECGF- Proteins, wobei der humane Endothelzellwachstumsfaktor die Sequenz von α-ECGF oder β-ECGF, wie gezeigt in Fig. 8 dieser Anmeldung, hat, oder eine allelische Variation, Modifikation oder ein Analog des α-ECGFs oder β-ECGFs ist, das die biologisch aktiven Eigenschaften von nativem ECGF beibehält. Bevorzugt wird der für ECGF kodierende replizierfähige Expressionsvektor durch Herstellen einer ds-cDNA-Präparation, die für ECGF-mRNA repräsentativ ist, und Einbauen der ds-cDNA in replizierfähige Expressionsvektoren gemacht. Die bevorzugte Art, ECGF zu gewinnen, umfaßt das Reagieren des durch das rekombinante Wirtssystem exprimierten Proteines mit einer Reagenzzusammensetzung, wobei mindestens ein für ECGF spezifischer Bindungsschritt umfaßt ist. ECGF kann als therapeutisches Mittel bei der Behandlung von beschädigten oder regenerierenden Blutgefäßen und anderen mit Endothelzellen ausgekleideten Strukturen verwendet werden.
Kurze Beschreibung der Figuren
• Fig. 1 zeigt ein allgemeines Verfahren für enzymatische Reaktionen zur Erzeugung von cDNA-Klonen.
• Fig. 2 zeigt die Herstellung einer Bank, die in Lambda gt&sub1;&sub1; insertierte DNA-Fragmente enthält.
• Fig. 3 zeigt eine Teil-Aminosäuresequenz von Rinder-α- und -H-ECGF.
• Zeile a: Aminoterminale Aminosäuresequenz von Rinder-α-ECGF.
• Zeile b: Aminoterminale Aminosäuresequenz von Rinder-β-ECGF.
• Der Teil in Klammern entspricht dem NH&sub2;-terminalen Segment, für das eine Sequenz nicht bestimmt werden konnte; anstelle dessen ist die Aminosäurezusammensetzung gezeigt. Die mit PheAsnLeu . . . beginnende Sequenz wurde aus Trypsin-gespaltenem Rinder-β-ECGF bestimmt.
• Zeile c: Aminosäuresequenz von Bromcyan-gespaltenem Rinder-α- ECGF.
• Zeile d: Aminosäuresequenz von Bromcyan-gespaltenem Rinder-β- ECGF.
• Fig. 4 zeigt Wasserstoffbrücken-gebundene Basenpaare.
• Fig. 5 zeigt das Entwerfen einer Oligonukleotidsonde für humanen Endothelzellwachstumsfaktor.
• Fig. 6 zeigt ein schematisches Diagramm der menschlichen ECGF-cDNA-Klone 1 und 29. Das Kästchen stellt das für humanes β-ECGF kodierende offene Leseraster dar. Die EcoRI-Stellen entsprechen den synthetischen Oligonukleotidlinkern, die bei der Konstruktion der cDNA-Bank verwendet wurden. Der Poly-(A)- Schwanz am 3'-Ende des Klones 1 wird von A&sub1;&sub7; gezeigt.
• Fig. 7 zeigt die Homologie zwischen cDNA-Sequenzen von humanem ECGF und den Oligonukleotidsonden.
• Zeile a: Rindertrypsin- oder Bromcyan-gespaltene β-ECGF-Aminosäuresequenz.
• Zeile b: Einzelne Oligonukleotidsonden.
• Zeile c: Humane ECGF-cDNA-Sequenz (bestimmt aus den Lambda-ECGF-Klonen 1 und 29).
• Zeile d: Aminosäuresequenz für humanes ECGF, abgeleitet aus der cDNA-Sequenzanalyse.
• Fig. 8 zeigt die vollständige cDNA-Sequenz von humanem ECGF. Die dDNA-Inserts der ECGF-Klone 1 und 29 wurden in M13mp18 subkloniert und das für ECGF kodierende offene Leseraster und die flankierenden Bereiche mit dem Kettenterminationsverfahren sequenziert. Im Leseraster liegende Stopkodons am 5'- und 3'-Ende des für ECGF kodierenden offenen Leserasters werden durch unterstrichene Sequenzen bzw. kleine Buchstaben trm angezeigt. Für die Aminosäuren wird die Einbuchstabenbezeichnung verwendet: A, Ala; C, Cys; D, Asp; E, Glu; F, Phe; G, Gly; H, His; I, Ile; K, Bys; L, Leu; M, Met; N, Asn; P, Pro; Q, Gln; R, Arg; S, 5er; T, Thr; V, Val; W, Trp; Y, Tyr.
• Fig. 9 zeigt die Northern-Blot-Analyse von ECGF-mRNA. Die RNA wurde in 2,2 M Formaldehyd und 50% Formamid denaturiert und durch Elektrophorese in einem 1,25%igen Aciarosegel, das 2,2 M Formaldehyd enthielt, fraktioniert. -Dieses wurde auf Gene- Screen Plus (New England Nuclear) durch Blotten mit 10·SSPE übertragen. Die Blots wurden 16 Stunden bei 65ºC mit einer ³²P-markierten, Nick-translatierten Sonde vom ECGF-Klon 1 in einer Mischung, die 2·SSPE, 20·Denhardt's Lösung, Hefe- Transfer-RNA (200 ug/ml) und 0,2% SDS enthielt, hybridisiert. Die Membran wurde anschließend zweimal mit 2·SSPE und 0,2% SDS, dann zweimal mit 0,2·SSPE und 0,2% SDS, bei 65ºC gewaschen, an der Luft getrocknet und über Nacht mit einem Kodak- XAR-Film und einer Verstärkerfolie exponiert. Die Wanderung der 285- und 18S-RNA wurde notiert.
• Spur 1: 10 ug Poly-(A)-enthaltende RNA aus menschlichem Gehirn
• Spur 2: 10 ug Poly-(A)-enthaltende RNA aus der Leber menschlicher Erwachsener.
• So, wie es hier verwendet wird, bezeichnet "ECGF" den Endothelzellwachstumsfaktor oder seine durch eine Zelle oder ein zellfreies Kultursystem hergestellten Fragmente in bioaktiven Formen, die die Fähigkeit haben, zelluläres Wachstum, Differenzierung und Migration in vitro zu beeinflussen, wie es ECGF beim menschlichen Angiogeneseprozeß tut.
• In der Natur können verschiedene Allele von ECGF existieren. Diese Variationen können durch Unterschiede in der Nukleotidsequenz des Strukturgenes, das für Proteine mit identischer biologischer Funktion kodiert, charakterisiert sein. Es ist möglich, Analoge zu erzeugen, die einzelne oder vielfache Aminosäuresubstitutionen, Deletionen, Additionen oder Austausche haben. All solche allelischen Variationen, Modifikationen und Analoge, die zu Derivaten von ECGF gemäß Fig. 8 führen, die die biologisch aktiven Eigenschaften von nativem ECGF beibehalten, liegen im Schutzbereich der vorliegenden Erfindung.
• "Expressionsvektoren" bezeichnen Vektoren, die zur Transkription und Translation von darin enthaltenen DNA-Sequenzen fähig sind, wenn solche Sequenzen mit anderen regulatorischen Sequenzen verbunden werden, die ihre Expression beeinflussen können. Diese Expressionsvektoren müssen in den Wirtsorganismen oder Systemen entweder als Episomen, Bakteriophagen oder als integraler Teil der chromosomalen DNA replizierfähig sein. Eine Form von Expressionsvektor, die für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung besonders geeignet ist, sind Bakteriophagen, Viren, die normalerweise in Bakterien wohnen und replizieren. Besonders wünschenswerte Phagen für diesen Zweck sind Lambda gt&sub1;&sub0;- und -gt&sub1;&sub1;-Phagen, die von Young und Davis, s. o., beschrieben sind. Lambda gt&sub1;&sub1; ist ein allgemeiner rekombinanter Expressionsvektor, der durch eine insertierte DNA spezifizierte Polypeptide erzeugen kann.
• Um einen Abbau so gering wie möglich zu halten, werden fremde Proteine oder Teile davon nach Induktion mit einem synthetischen Analog von Lactose (IPTG) mit dem prokaryontischen Protein β-Galaktosidase fusioniert synthetisiert. Die Verwendung von Wirtszellen, die in ihrem Proteinabbaustoffwechselwegen defekt sind, kann die Lebenszeit neuer Proteine, die in den induzierten Lambda gt&sub1;&sub1;-Klonen erzeugt werden, ebenso erhöhen. Eine korrekte Expression der fremden DNA in Lambda gt&sub1;&sub1;-Klonen hängt von der richtigen Orientierung und dem Leseraster der insertierten DNA hinsichtlich des β-Galaktosidasepromotors und des translationsinitiierenden Kodons ab.
• Eine andere Form von Expressionsvektor, die in rekombinanten DNA-Verfahren nützlich ist, ist das Plasmid - eine zirkuläre, nicht integrierte (extra-chromosomale), doppelsträngige DNA- Schlaufe. Jede andere Form von Expressionsvektor, die einer gleichwertigen Funktion dient, ist für die Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren geeignet.
• Die hier offenbarten rekombinanten Vektoren und Verfahren sind für die Verwendung in Wirtszellen, die einen weiten Bereich von prokaryontischen und eukaryontischen Organismen abdecken, geeignet. Prokaryontische Zellen sind für die Klonierung von DNA-Sequenzen und die Konstruktion von Vektoren bevorzugt. Beispielsweise ist E. coli K12 Stamm HB101 (ATCC Nr. 33694) besonders nützlich. Selbstverständlich können andere mikrobielle Stämme verwendet werden. In Verbindung mit diesen Wirten werden Vektoren verwendet, die Replikations- und Kontrollsequenzen enthalten, die von einer mit der Wirtszelle oder dem System kompatiblen Art abgeleitet sind. Der Vektor trägt gewöhnlich einen Replikationsursprung sowie Merkmale, die eine phänotypische Selektion in transformierten Zellen ermöglichen. Beispielsweise kann E. coli unter Verwendung des Vektors pBR322 transformiert werden, der Gene für Ampicillin- und Tetracyclinresistenz enthält [Bolivar et al., Gene 2: 95 (1977)
• Diese Antibiotika-Resistenzgene stellen ein Mittel zum Identifizieren transformierter Zellen zur Verfügung. Der Expressionsvektor kann außerdem Kontrollelemente enthalten, die für die Expression des interessierenden Genes verwendet werden. Gewöhnliche prokaryontische Kontrollelemente, die zur Expression von Fremd-DNA-Sequenzen in E. coli verwendet werden, umfassen die Promotoren und regulatorischen Sequenzen, die von β-Galak- tosidase- und Tryptophan-(trp)-Operon von E. coli abgeleitet sind, sowie die pR- und pL-Promotoren des Bakteriophagen Lambda. Kombinationen dieser Elemente sind ebenfalls verwendet worden (z. B. TAC, das eine Fusion zwischen dem trp-Promotor und dem Lactose-Operator ist). Andere Promotoren sind auch entdeckt und verwendet worden und Einzelheiten hinsichtlich ihrer Nukleotidsequenzen sind veröffentlicht worden, so daß es dem Fachmann möglich ist, sie zu kombinieren und funktionell zu nutzen.
• Zusätzlich zu Prokaryonten können eukaryontische Mikroben, beispielsweise Hefekulturen, ebenfalls verwendet werden. Saccharomyces cerevisiae, oder gewöhnliche Bäckerhefe, ist der unter den eukaryontischen Mikroorganismen am häufigsten verwendete, obgleich eine Anzahl von anderen Stämmen allgemein verfügbar ist. Hefepromotoren, die für die Expression von fremden DNA-Sequenzen in Hefe geeignet sind, umfassen die Promotoren für 3-Phosphoglyceratkinase oder andere glykolytische Enzyme. Geeignete Expressionsvektoren können Terminationssignale enthalten, die für die Polyadenylierung und die Termination des mRNA-Transkriptes des klonierten Genes sorgen. Jeder Vektor, der einen hefekompatiblen Promotor, einen Replikationsursprung und eine geeignete Terminationssequenz enthält, ist für die Expression von ECGF geeignet.
• Von multizellulären Organismen abgeleitete Zellinien können ebenfalls als Wirte verwendet werden. Im Prinzip kann mit einer jeden solchen Zellkultur gearbeitet werden, gleich, ob sie von Vertebraten oder Invertebraten stammt. Das Interesse in Vertebraten-Zellen ist jedoch am größten gewesen, und die Propagation von Vertebraten-Zellen in Kultur (Gewebekultur) ist in den vergangenen Jahren zu einem Routineverfahren geworden. Beispiele für solche nützlichen Wirte sind die Zellinien VERO, HeLa, Maus C127, Chinese hamster ovary (CHO), WI38, BHK, COS-7 und NDCK. Expressionsvektoren für solche Ze11en umfassen normalerweise einen Replikationsursprung, einen vor dem zu exprimierenden Gen angeordneten Promotor, RNA-Spleiß-Stellen (falls notwendig) und Transkriptionsterminationssequenzen.
• Für die Verwendung in Säugerzellen werden die Kontrollfunktionen (Promotoren und Enhancer) auf den Expressionsvektoren oft von viralem Material zur Verfügung gestellt. Beispielsweise sind gemeinhin verwendete Promotoren vom Polyomavirus, Adenovirus 2 und am häufigsten vom Affenvirus 40 (SV40) abgeleitet. Eukaryontische Promotoren, beispielsweise der Promotor des Maus-Me-tallothioneingenes [Paulakis und Harmer, Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 397-401 (1983)] können ebenfalls verwendet werden. Weiterhin ist es auch möglich und oft wünschenswert, die mit der gewünschten Gensequenz natürlicherweise assoziierten Promotor- oder Kontrollsequenzen zu verwenden, vorausgesetzt, solche Kontrollsequenzen sind mit dem Wirtssystem kompatibel. Um die Transkriptionsrate zu steigern, können der Konstruktion eukaryontische Enhancersequenzen zugefügt werden. Diese Sequenzen können von einer Vielzahl von Animalzellen oder onkogenen Retroviren, beispielsweise dem Maussarkomvirus, erhalten werden.
• Ein Replikationsursprung kann entweder zur Verfügung gestellt werden, indem der Vektor so konstruiert wird, daß er einen exogenen Ursprung enthält, beispielsweise den von SV40 oder einer anderen viralen Quelle bereitgestellten, oder er kann durch den chromosomalen Replikationsmechanismus der Wirtszelle zur Verfügung gestellt werden. Wenn der Vektor in das Wirtszellchromosom integriert wird, ist Letzteres oft ausreichend.
• Die Wirtszellen können ECGF herstellen, das eine Vielzahl chemischer Zusammensetzungen haben kann. Das Protein wird mit Methionin als seiner ersten Aminosäure erzeugt. Dieses Methionin ist vorhanden infolge des natürlicherweise am Beginn des Strukturgenes vorhandenen ATG-Startkodons oder indem es planmäßig vor ein Segment des Strukturgenes eingesetzt wird. Das Protein kann außerdem intrazellulär oder extrazellulär gespalten werden, was zu der Aminosäuresequenz führt, die natürlicherweise am Aminoterminus des Proteines gefunden wird. Das Protein kann zusammen mit entweder seinem eigenen oder einem heterologen Signalpeptid erzeugt werden, wobei das Signalpolypeptid in intra- oder extrazellulärer Umgebung spezifisch abspaltbar ist. Schließlich kann ECGF durch direkte Expression in reifer Form ohne die Notwendigkeit des Abspaltens irgendeines zusätzlichen Polypeptides erzeugt werden.
• Rekombinante Wirtszellen bezeichnen Zellen, die mit Vektoren transformiert sind, die unter Verwendung rekombinanter DNA- Verfahren konstruiert worden sind. So wie es hier definiert wird, wird ECGF als Folge dieser Transformation erzeugt. ECGF oder seine Fragmente, die von solchen Zellen erzeugt werden, werden als "rekombinantes ECGF" bezeichnet.
• Die unten angegebenen Verfahren sind nur einige einer großen Vielzahl von gut etablierten Verfahren, um für das erfindungsgemäße Verfahren nützliche spezifische Reagenzien zu erzeugen. Das allgemeine Verfahren zum Erhalten einer mRNA-Mischung ist es, eine Gewebeprobe oder Kulturzellen, die das gewünschte Protein erzeugen, zu erhalten, und die RNA durch ein Verfahren, beispielsweise das von Chirgwin et al., Biochemistry, 18: 5294 (1979) offenbarte, zu extrahieren. Aus der mRNA wird Poly-(A)-mRNA enthaltendes Material durch Chromatographie an Oligo-(dT)-Zellulose oder Poly-(U)-Sepharose, gefolgt von Elution der Poly-(A)-enthaltenden RNA-Fraktionen, angereichert.
• Die oben erwähnte, für Poly-(A)-enthaltende mRNA angereicherte Fraktion wird verwendet, um eine einzelsträngige komplementäre cDNA (ss-cDNA) unter Verwendung von reverser Transkriptase zu synthetisieren. Als Folge der DNA-Synthese bildet sich eine Haarnadelschlaufe am 3'-Ende der DNA, die die Zweitstrangsynthese starten wird. Unter geeigneten Bedingungen wird die Haarnadelschlaufe verwendet, um die Synthese der ds-cDNA in Gegenwart von DNA-Polymerase und Desoxyribonukleotid-Triphosphaten zu bewirken.
• Die resultierende ds-cDNA wird durch eines einer Vielzahl bekannter Verfahren in den Expressionsvektor insertiert. Im allgemeinen können die Verfahren in Maniatis et al., s. o., und Meth6ds in Enzymolociy, Band 65 und 68 (1980) und 100 und 101 (1983) gefunden werden. Im allgemeinen wird der Vektor durch mindestens eine Restriktionsendonuklease linearisiert, was zu mindestens zwei stumpfen oder kohäsiven Enden führt. Die dscDNA wird in die Vektorinsertionsstelle ligiert oder damit verbunden.
• Wenn prokaryontische oder andere Zellen, die wesentliches Zellwallmaterial enthalten, verwendet werden, ist das üblichste Verfahren der Transformation mit dem Expressionsvektor die Kalziumchlorid-Vorbehandlung, wie von Cohen, R.N. et al., Proc. Nat'1. Acad. Sci. USA. 69: 2110 (1972), beschrieben. Wenn Zellen ohne Zellwallbarrieren als Wirtszellen verwendet werden, wird die Transfektion mit dem von Graham und Van der Eb, Virolociv, 52: 456 (1973) beschriebenen Kalziumphosphat- Präzipitationsverfahren durchgeführt. Andere Verfahren zum Einführen von DNA in Zellen, beispielsweise Injektion in den Kern, virale Infektion oder Protoplastenfusion, können erfolgreich verwendet werden. Die Zellen werden dann auf einem selektiven Medium kultiviert, und Proteine, für die der Expressionsvektor kodiert, werden erzeugt.
• Klone, die einen Teil oder die gesamte cDNA für ECGF enthalten, werden mit spezifischen Oligonukleotidsonden identifiziert, die von der Teilaminosäuresequenzbestimmung von ECGF abgeleitet sind. Dieses Identifikationsverfahren erfordert, daß die nicht degenerierte Oligonukleotidprobe so ausgewählt ist, daß sie spezifisch mit ECGF-ds-cDNA hybridisiert. ECGF- cDNA-Sequenzen enthaltende Klone werden durch radioaktive Markierung der Oligonukleotidsonde mit ³²P-ATP, Hybridisieren der radioaktiven Oligonukleotidsonde mit der DNA einzelner Klone einer cDNA-Bank, die ECGF-cDNA enthält, und Nachweisen und Isolierung der Klone, die in der Autoradiographie hybridisieren, isoliert. Ein solches Klonierungssystem kann auf das von Young und Davis, s. o., beschriebene Lambda gt&sub1;&sub1;-System angewendet werden.
• Klone, die die ECGF-Sequenz enthalten, werden identifiziert, indem als Sonde das cDNA-Insert der ECGF-Rekombinanten verwendet wird, die während des ersten Durchmusterung der rekombinanten Lambda gt&sub1;&sub1;-cDNA-Bank mit ECGF-spezifischen Oligonukleotiden isoliert wurde. Zur Bestimmung der Sequenz der durch die cDNA-Fragmente kodierten Aminosäuren werden Nukleotidsequenzierungsverfahren verwendet. Diese Information kann verwendet werden, um die Identität des mutmaßlichen ECGF-cDNA- Klones durch Vergleich mit der bekannten Aminosäuresequenz des Aminoterminus von Rinder-ECGF und eines Peptides, das durch Bromcyanspaltung von ECGF abgeleitet wurde, zu bestimmen.
Beispiel A. Herstellung von Gesamt-RNA
• Gesamt-RNA (Messenger-, ribosomale und Transfer-RNA) wurde aus frischem 2 Tage alten menschlichem Hirnstamm im wesentlichen wie von Chirgwin, s. o. (1979), beschrieben, extrahiert. Die Zellniederschläge wurden in 5 Volumen einer Lösung homogenisiert die 4 M Guanidinthiocyanat und 25 mM Antifoam A (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) enthielt. Das Homogenat wurde 15 Minuten bei 10ºC und 6000 rpm in einem Sorvall-GSA-Rotor zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde durch Zufügen von Essigsäure auf pH 5,0 eingestellt und die RNA durch 0,75 Volumen Ethanol bei -20ºC 2 Stunden präzipitiert. Die RNA wurde durch Zentrifugation gesammelt und in 7,5 M Guanidinhydrochlorid, enthaltend 2 mM Natriumzitrat und 5 mM Dithiothreitol, gelöst. Nach zwei zusätzlichen Präzipitationen unter Verwendung von 0,5 Volumen Ethanol wurde das restliche Guanidinhydrochlorid aus dem Präzipitat mit absolutem Ethanol extrahiert. Die RNA wurde in sterilem Wasser gelöst, unlösliches Material durch Zentrifugation entfernt und die Niederschläge erneut mit Wasser extrahiert. Die RNA wurde auf 0,2 M Kaliumacetat eingestellt und durch Zufügen von 2,5 Volumen Ethanol bei -20ºC über Nacht präzipitiert.
B. Herstellung von Poly-(A)-enthaltender RNA
• Das Gesamt-RNA-Präzipitat, das wie oben beschrieben hergestellt wurde, wurde in 20 mM Hepespuffer (pH 7,2), enthaltend 10 mM EDTA und 1% SDS, gelöst, 10 Minuten auf 65ºC erwärmt und dann rasch auf 25ºC abgekühlt. Die RNA-Lösung wurde dann mit einem gleichen Volumen Wasser verdünnt und NaCl zugesetzt, um eine Endkonzentration von 300 mM NaCl zu erreichen. Bis zu 240 A&sub2;&sub6;&sub0;-Einheiten RNA enthaltende Proben wurden auf Poly- (U)-Sepharose unter Verwendung von Standardverfahren chromatographiert. Die Poly-(A)-enthaltende RNA wurde mit 70% Formamid, enthaltend 1 mM Hepespuffer (pH 7,2) und 2 mM EDTA, eluiert. Das Eluat wurde auf 0,24 M NaCl eingestellt und die RNA durch 2,5 Volumen Ethanol bei -20ºC präzipitiert.
C. Konstruktion von cDNA-Klonen in Lambda gt&sub1;&sub1;
• Das Verfahren, dem für die enzymatischen Reaktionen gefolgt wurde, ist in Fig. 1 gezeigt. Die mRNA (20 ug) wurde mit reverser Transkriptase und DNA-Polymerase I in ds-cDNA genauso kopiert, wie von Buell et al., s. o., und Wilkensen et al., J. Biol. Chem. 253: 2483 (1978), beschrieben. Die ds-cDNA wurde auf Sephadex G-50 entsalzt und die Ausschlußvolumenfraktion weiter auf einer Elutip-D®-Säule (Schleicher δ Schuell, Keene, NH) nach den Vorschriften des Herstellers gereinigt. Die ds-cDNA wurde durch Inkubation mit Sl-Nuklease stumpfendig gemacht [Ricca et al., J. Biol. Chem. , 256: 10362 (1981)]. Die Reaktionsmischung bestand aus 0,2 M Natriumacetat (pH 4,5), 0,4 M Natriumchlorid, 2,5 mM Zinkacetat und 0,1 Einheit S1-Nuklease pro ng ds-cDNA, aufgefüllt auf ein Reaktionsendvolumen von 100 ul. Die ds-cDNA wurde 1 Stunde bei 37ºC inkubiert, mit Phenyl:Chloroform extrahiert und dann auf einer Sephadex®-G-50-Säule wie oben beschrieben entsalzt.
• Die ds-cDNA wurde dann mit EcoRI-Methylase und dem Klenow- Fragment von DNA-Polymerase I unter Verwendung der in Maniatis et al., Molecular Cloninci s. o. beschriebenen Reaktionsbedingungen behandelt. Die cDNA wurde wiederum auf Sephadex®-G-50 entsalzt, wie oben beschrieben, und dann mit 0,5 ug phosphoryliertem EcoRI-Linker unter Verwendung von T&sub4;-DNA-Ligase (Maniatis et al., s. o.) ligiert. Die Mischung wurde mit EcoRI gespalten und auf einem 8%-Acrylamidgel in Trisboratpuffer fraktioniert (Maniatis et al., s. o.). DNA mit einer Größe von mehr als 1 Kilobase wurde aus dem Gel eluiert und durch Binden an Elutip-D®-Säulen wiedergewonnen, mit 1 M NaCl eluiert und dann durch Ethanolpräzipitation gesammelt.
• Wie in Fig. 2 gezeigt, wurden die DNA-Fragmente dann in EcoRI-gespaltenen und Phosphatase-behandelten Lambda gt&sub1;&sub1; unter Verwendung von T&sub4;-DNA-Ligase insertiert. Eine Bank von 5,7·10&sup6; Phagen wurde erzeugt, von denen ungefähr 65% rekombinante Phagen waren. Die Bank wurde durch Herstellen von Stammplatten bei 42ºC auf E. coli Y1088 [supE supF metB trpR hsdR hsdM+ tonA21 strA 1acU169 (proC::Tn5) (pMC9)] amplifiziert. Die Amplifikationsverfahren sind in Maniatis et al., s. o., beschrieben. Wichtige Merkmale dieses Stammes, beschrieben von Young und Davis, s. o., umfassen (1) supF (erfordert die Supression der Ambermutation des Phagen im 5-Gen), (2) hsdR hsdM+ (notwendig, um die Restriktion der fremden DNA vor der Modifikation durch den Wirt zu verhindern), und (3) lacU169 (proC::Tn5) und (4) (pMC9) (ein lacl-tragendes pBR322- Derivat, das in Abwesenheit eines Induktors die Expression von Fremdgenen, die für das Phagen- und/oder Zellwachstum schädlich sein können, reprimiert.
D. Identifizierung von ECGF-Seciuenzen enthaltenden Klonen
• Um die Bank auf rekombinante Phagen, die ECGF-cDNA enthalten, zu durchmustern, wurden 1,5·10&sup6; Phagen auf einem Rasen von E. coli Y1090 [ΔlacU169 proAΔ lon araD139 strA supF (trpC22::Tn10) (pMC9)] plattiert und 6 Stunden bei 42ºC inkubiert. Nachdem die Platten über Nacht kühlgestellt worden waren, wurde ein Nitrozellulosefilter auf die Platten aufgelegt. Die Position des Filters wurde mit einer Nadel markiert. Der Filter wurde nach einer Minute entfernt und bei Raumtemperatur trocknengelassen. Von jeder Platte wurde genau wie zuvor beschrieben ein Duplikatfilter hergestellt, mit der Ausnahme, daß der Filter mit der Platte 5 Minuten in Kontakt gelassen wurde. Alle Filter wurden dann für die Hybridisierung vorbereitet, wie in Maniatis et al., s. o., beschrieben. Dies umfaßte eine DNA-Denaturierung in 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl, eine Neutralisierung in 1 M Tris-HCl, pH 7,5, 1,5 M NaCl, und 2 Stunden Erhitzen des Filters auf 80ºC im Vakuum.
• Um die menschliche Hirnstamm-cDNA-Bank auf Klone, die ECGF-Inserts enthalten, zu durchmustern, wurde ein spezifisches Oligonukleotid entworfen. Dieses Oligonukleotid beruhte auf einer Teilaminosäuresequenzanalyse des Aminoterminus von ECGF. Wie in Fig. 3, Zeilen a+b, gezeigt, werden zwei Arten von Rinder-ECGF isoliert, die α- und β-ECGF genannt werden, und sich nur in Aminosäuren unterscheiden, die am jeweiligen Aminoterminus gefunden werden. Wie in Fig. 3, Zeile b, gezeigt, ist β-ECGF eine leicht größere Art als α-ECGF. Die exakte Aminosäuresequenz vom Aminoterminus von β-ECGF ist nicht bestimmt, jedoch wird eine Sequenz gezeigt, die aus einer Fast-Atom-Bombardment-Massenspektrumsanalyse und der Aminosäurezusammensetzung des aminoterminalen tryptischen Peptides von Rinder-β- ECGF abgeleitet ist. Die aminoterminal blockierende Gruppe scheint Acetyl zu sein. Wenn intaktes β-ECGF mit Trypsin gespalten wird, wird eine zweite Aminosäuresequenz, die in β-, aber nicht in (H-ECGF gefunden wird und mit PheAsnLeu . . . beginnt, festgestellt. Diese Sequenz findet sich auch am Aminoterminus von saurem Fibroblasten-Wachstumsfaktor [(Thomas, K.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 82: 6409-6413 (1985)]. Der Aminoterminus von H-ECGF ist AsnTyrLys . . . (Fig. 3, Zeile a) und ist das Äquivalent von β-ECGF minus einer aminoterminalen Verlängerung. Fig. 3, Zeilen c und d, zeigen zum Vergleich die Aminosäuresequenz von Bromcyan-gespaltenem Rinderα- bzw. -β-ECGF.
• Zum Entwerfen des Oligonukleotides wurde die Aminosäuresequenz IleLeuProAspGlyThrValAspG1yThrLys gewählt, die den H-ECGF- Aminosäuren 19 bis 29 einschließ1ich entspricht. Anstatt eine Mischung von Oligonukleotiden zu entwerfen, die alle möglichen kodierenden Sequenzen (die sich aus der Degeneration des genetischen Kodes ergeben) abdeckt, wurde ein langes, einzelnes Oligonukleotid entworfen. Solche Oligonukleotidsonden haben sich zuvor beim Durchmustern komplexer cDNA [Jaye et al., Nucleic Acids Research 11: 2325-2335, (1983)] und genomischer Banken [Gitschier et al., Nature, 312: 326-330 (1984)] als erfolgreiche Sonden erwiesen. Drei Kriterien wurden beim Entwerfen der ECGF-Sonde angewendet: (1) Das Dinukleotid CG wurde vermieden. Diese Strategie beruht auf der beobachteten Unterrepräsentation des Dinukleotides CG in eukaryontischer DNA [Josse et al., J. Biol. Chem. 236: 864-875 (1961)]; (2) es wurden, wo immer möglich, die bevorzugten Kodons verwendet. Eine neuere und umfassende Analyse der Kodonverwendung in Menschen wurde in Lathe, J. Mol. Biol. , 183: 1-12 (1985) gefunden; und (3) wo immer die Strategien bezügl. CG-Dinukleotid und bevorzugter Kodonverwendung nicht informativ waren, wurden ungewöhnliche Basenpaarungen zugelassen. Diese Strategie beruht auf dem natürlichen Auftreten von G:T-, I:T-, I:A- und I:C-Basenpaaren, die bei der Wechselwirkung zwischen tRNA-Antikodons und mRNA-Kodons auftreten [Crick, J. Mol. Biol., 19: 548-555, (1966)]. Ein Diagramm gewöhnlicher und ungewöhnlicher Basenpaare ist in Fig. 4 gezeigt. Die Verwendung von I (Inosin) in einer Hybridisierungsprobe wurde zuerst von Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. , 260: 2605-2608 (1985) in einem Modeilexperiment gezeigt. Die Gesamtstrategie und die Wahl beim Entwerfen des zum Durchmustern der menschlichen Hirnstamm-cDNA-Bank auf ECGF verwendeten Oligonukleotids ist in Fig. 5 gezeigt. Zusätzlich wurden zwei weitere Oligonukleotide, die nach der gleichen Strategie entworfen worden waren, konstruiert.
• Ungefähr 30 pmol des in Fig. 5 gezeigten Oligonukleotids wurden durch Inkubation mit ³²P-Gamma-ATP und T4-Polynukleotidkinase im wesentlichen wie von Maniatis et al., s. o., beschrieben, radioaktiv markiert. Wie oben beschrieben hergestellte Nitrozellulosefilter wurden bei 42ºC in 6·SSPE (1·SSPE = 0,18 M NaCl, 0,01 M NaHPO&sub4; pH 7,2, 0,001 M EDTA), 2·Denhardt's Lösung (1·Denhardt's Lösung - je 0,02% Ficoll®, Polyvinylpyrrolidon, Rinderserumalbumin), 5% Dextransulfat und 100 ug/ml denaturierter Lachssperma-DNA vorhybridisiert. Das 32 P-markierte Oligonukleotid wurde nach 4 Stunden Vorhybridisieren zugefügt und die Hybridisierung über Nacht bei 42ºC fortgesetzt. Nicht hybridisierte Sonde wurde durch aufeinanderfolgendes Waschen bei 37ºC in 2·SSPE, 0,1% SDS entfernt. Von 1,5·10&sup6; durchmusterten Plaques ergaben zwei Plaques positive Autoradiographiesignale nach Übernacht-Exposition. Diese Klone wurden durch wiederholte Reinigungszyklen, bei denen das oben beschriebenen Oligonukleotid als Hybridisierungssonde verwendet wurde, zur Homogenität gereinigt.
• Die beiden isolierten Klone, die ECGF-Klone 1 und 29, wurden im Detail weiter analysiert. Nach Verdauen mit EcoRI ergaben die Klone 1 und 29 cDNA-Inserts von 2,2 bzw. 3,0 kb. Eine Nick-Translation der klonierten cDNA und deren anschließende Verwendung als radiomarkierte Sonde bei der Southern-Blot- Analyse (Maniatis et al., s. o.) zeigte, daß die Klone 1 und 29 verwandte und sich überlappende Klone waren. Die überlappende Natur der beiden Klone ist in Fig. 6 gezeigt.
• Die Klone 1 und 29 wurden im Detail weiter wie folgt analysiert: Es wurden auf der Grundlage der Aminosäuresequenz von Rinder-ECGF zwei weitere Oligonukleotide entworfen. Diese Oligonukleotide wurden auf der Grundlage der gleichen Erwägungen wie der beim Entwerfen des zur Isolierung der Klone 1 und 29 verwendeten Oligonukleotide entworfen. Diese Oligonukleotide (ECGF-Oligonukleotide II und III) sind in Fig. 7 gezeigt. Diese beiden Oligonukleotide sowie Oligo(dT)&sub1;&sub8; wurden in einer Kinasereaktion wie oben beschrieben radioaktiv markiert und als Hybridisierungssonden in Southern-Blot-Experimenten verwendet. Die Ergebnisse dieser Experiment zeigten, daß das 0,3- kb-cDNA-Insert von Klon 29 mit den ECGF-Oligonukleotiden I und II hybridisierte, aber nicht mit den ECGF-Oligonukleotiden III oder Oligo(dT)&sub1;&sub8;; das 2,2-kb-cDNA-Insert von Klon 1 hybridisierte mit Oligonukleotid I, II, III sowie mit Oligo(dT)&sub1;&sub8;. Diese Daten und die anschließende Nukleotidsequenzbestimmung der Klone 1 und 29 zeigten, daß das 3'-Ende von Klon 1 mit einem Poly-(A)-Schwanz endet. Die Hybridisierung von Klon 1 mit ECGF-Oligonukleotid III, das auf einem Bromcyan-Spaltprodukt von Rinder-ECGF beruht, sowie mit Oligo(dT)&sub1;&sub8; legt sehr stark nahe, daß dieser Klon den Rest der kodierenden Sequenz sowohl für α- als auch β-ECGFs sowie eine große (größer als 1 kb) 3'-flankierende Sequenz enthält.
• Die cDNA-Inserts aus den Klonen 1 und 29 wurden isoliert, in M13mp18 subkloniert und das für ECGF kodierende offene Leseraster und die flankierenden Bereiche nach dem Kettenterminalionsverfahren [Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467 (1977)] sequenziert. Die Nukleotidsequenz dieser Klone und die Aminosäuresequenz, die von der Nukleinsäuresequenz abgeleitet ist, ist in Fig. 8 gezeigt. Die Überprüfung der Nukleotidsequenz zeigt ein offenes Leseraster von 465 Nukleotiden, das für humanes ECGF kodiert. Es wurde festgestellt, daß die 155 Aminosäuren des menschlichen ECGFs von Translationsstopkodons flankiert werden. Die NH&sub2;-terminale Aminosäure von humanem β-ECGF, die aus der cDNA-Sequenz abgeleitet ist, ist Methionin, das höchstwahrscheinlich als Translationsinitiationsrest dient. Diese Daten zusammen mit der relativ wenig hydrophoben Natur der ersten 15 bis 20 aminoterminalen Reste legt stark nahe, daß humanes β-ECGF ohne ein NH&sub2;-terminales Signalpeptid synthetisiert wird. Ein Vergleich der Fig. 3 und 8 zeigt, daß die aminoterminalen Aminosäuresequenzen von Trypsin-gespaltenem Rinder-β-ECGF sowie die von Rinder-β-ECGF nahezu identisch mit den Aminosäuresequenzen sind, die aus der Nukleotidsequenz der Lambda-ECGF- Klone 1 und 29 vorhergesagt wird. Es wird eine allgemeine Homologie von über 95% zwischen den beiden Arten beobachtet.
• Eine Northern-Blot-Analyse (Maniatis et al., s. o.) zeigt, daß ECGF-mRNA eine einzelne molekulare Spezies ist, die mit der 28S-rRNA komigriert (Fig. 9). Unter Berücksichtigung der Variation bei der geschätzten Größe der 28S-rRNA beträgt die ungefähre Größe von ECGF-mRNA 4,8±1,4 kb. Die gesamte Sequenz, die für die reifen Formen von sowohl α- als auch β-ECGF kodiert, ist innerhalb der ECGF-Klone 1 und 29 kodiert, die zusammen ungefähr 2,3 kb umfassen. Diese Daten zeigen daher, daß der 5' und die ECGF-kodierenden Sequenzen flankierende Bereich sehr groß ist (ungefähr 2,5±1 4 kb).
• Aus den Klonen 1 und 29 wurden cDNA-Inserts durch Verdau mit EcoRI ausgeschnitten und in die EcoRI-Stelle von pUC8 subkloniert. Das aus Klon I gebildete Plasmid wurde pDH15 genannt, und das aus Klon 29 gebildete Plasmid wurde pDH14 genannt. Diese Plasmide wurden bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 hinterlegt. Das Plasmid von Klon 1, pDH15, wurde ATCC 53336 und das Plasmid von Klon 29, pDH14, wurde ATCC 53335 genannt.
• Dieses Beispiel beschreibt daher experimentelle Verfahren, die humanen Endothelzellwachstumsfaktor, der im wesentlichen frei von anderen Proteinen menschlichen Ursprungs ist, ergeben.
• ECGF kann beim Wachstum und der Amplifikation von Endothelzellen in Kultur verwendet werden. Derzeit wird ECGF für die Verwendung in Zellkulturen aus Rindergehirn nach dem Protokoll von Maciag et al., [Proc. Natl. Acad. Sci. , 76: 11, 5674-5678 (1978)] extrahiert. Dieser rohe Rinder-ECGF ist mitogen für humane Endothelzellen aus Nabelschnur [Maciag et al., J. Biol. Chem. 257: 5333-5336 (1982)] und Endothelzellen aus anderen Arten. Die Verwendung von Heparin mit ECGF und eine Fibronektinmatrix erlaubt die Etablierung von stabilen Endothelzellklonen. Die empfohlene Konzentration des rohen Rinder- ECGFs für die Verwendung als Mitogen in vitro ist 150 Mikrogramm pro Milliliter des Wachstumsmediums.
• Von rekombinanter DNA abgeleitetes humanes ECGF hat daher eine Verwendbarkeit als ein verbessertes Substitut für rohes Rinder-ECGF bei der in-vitro-Kultivierung von humanen Endothelzellen und anderen mesenchymalen Zellen für Forschungszwecke. Es wird erwartet, daß die Aktivität von humanem ECGF bei der Verstärkung des Endothelzellwachstums infolge des hohen Grades von Homologie bei den Aminosäuresequenzen beider Proteine gleich oder besser als die von Rinder-ECGF ist. Der erwartete effektive Dosisbereich für das Verstärken der Zellteilung und des Wachstums in vitro beträgt 5 bis 10 ng gereinigtes ECGF pro Milliliter des Kulturmediums. Die Erzeugung von ECGF via rekombinanter DNA-Technologie, wie in dieser Patentanmeldung beschrieben, und die anschließende Reinigung, wie beschrieben von Burgess et al. [J. Biol. Chem. , 260: 11389-11392 (1985)] wird größere Mengen des reinen Produktes menschlichen Ursprungs (die zuvor in keiner Menge oder Reinheit verfügbar waren) zur Verfügung stellen, mit denen Modelle für die humane Homöostase und Angiogenese entwickelt werden können.
• Von rekombinanter DNA abgeleitetes humanes ECGF kann außerdem bei der Verstärkung des Zellwachstums auf einer prosthetischen Vorrichtung anstelle einer Gewebekulturflasche oder eines -gefäßes verwendet werden. Diese Vorrichtung kann oder kann nicht mit anderen Molekülen beschichtet sein, die das Anheften der Endothelzellen an die Vorrichtung erleichtern würden. Diese erleichternden Moleküle könne extrazelluläre Matrixproteine (z. B. Fibronektin, Laminin oder eines der Kollagene) , humanes Serumalbumin, Heparin oder andere Glycosaminoglycane oder inerte organische Moleküle umfassen. Endothelzellen würden auf diesen Oberflächen unter Verwendung wirksamer Dosen von ECGF in dem Kulturmedium kultiviert werden, wobei sie letztendlich die Vorrichtung mit einer Einzelschicht von Endothelzellen bedecken. Diese Vorrichtung würde dann eine nicht-thrombogene Oberfläche auf der prosthetischen Vorrichtung bereitstellen, was das Risiko möglicherweise lebensbedrohlicher thrombogener Vorfälle nach Implantation der prosthetischen Vorrichtung verringert.
• ECGF ist für diagnostische Verwendungen brauchbar. Schreiber et al. [Proc. Natl. Acad. Sci., 82: 6138 (1985)] haben einen 2-fach-Antikörperimmuntest für Rinder-ECGF entwickelt. In diesem Test wurden Polyvinylchloridplatten mit 96 Vertiefungen mit Kaninchen-anti-ECGF beschichtet und die verbleibenden Bindungsstellen anschließend mit 10% normalem Kaninchenserum blockiert. ECGF-Proben wurden dann den Vertiefungen zugesetzt und inkubiert. Nach dem Waschen wurde monoklonaler Maus-anti- ECGF-Antikörper zugefügt. Nach Inkubation und mehreren Waschschritten wurde Kaninchen-anti-Maus-IgG, gekoppelt mit Peroxidase, zugefügt. Das Reaktionsprodukt wurde spektrophotometrisch nach Konversion von o-Phenylendiamin in Gegenwart von Wasserstoffperoxid quantifiziert. Ein ähnlich konstruierter Immuntest kann für das Beobachten humaner ECGF-Spiegel in Krankheitszuständen mit beeinträchtigtem Endothelzellwachstum nützlich sein. Gereinigter, von rekombinanter DNA abgeleiteter ECGF wäre als Standardreagenz bei der Quantifizierung unbekannter ECGF-Proben nützlich.
• ECGF kann außerdem Möglichkeiten bei der Behandlung von beschädigten Blutgefäßen und der Regeneration von Blutgefäßen und anderen mit Endothelzellen ausgekleideten Strukturen haben.
• Es sollte anerkannt werden, daß die vorliegende Erfindung nicht als durch die veranschaulichten Ausführungsformen beschränkt verstanden werden soll. Es ist möglich, weitere Ausführungsformen zu erzeugen, ohne von dem hier offenbarten erfinderischen Konzept abzuweichen. Solche Ausführungsformen liegen innerhalb der Fähigkeiten des Fachmanns.

Claims (21)

1. Verfahren zum Erzeugen von humanem Endothelzellwachstumsfaktor, umfassend das Bereitstellen eines replikationsfähigen Expressionsvektors, der zur Expression der DNA-Sequenz, die für humanen Endothelzellwachstumsfaktor kodiert, in einem geeigneten Wirt fähig ist, das Transformieren des Wirtes zum Erhalten eines rekombinanten Wirtes und das Halten des rekombinanten Wirtes unter Bedingungen, die die Expression der für den Endothelzellwachstumsfaktor kodierenden cDNA- Sequenz erlauben, um Endothelzellwachstumsfaktor zu erzeugen, wobei der humane Endothelzellwachstumsfaktor die Sequenz von α-ECGF oder β-ECGF hat, die in Fig. 8 gezeigt ist, oder eine allelische Variante, eine Modifikation oder ein Analog des α-ECGFs oder β-ECGFs ist, das die biologisch aktiven Eigenschaften von nativem ECGF beibehält.

2. Verfahren nach Anspruch 1 einschließlich des weiteren Schritts der Wiedergewinnung des Endothelzellwachstumsfaktors.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin der Expressionsvektor ein Bakteriophage ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, worin der Bakteriophage ein Mitglied der aus Lambda gt&sub1;&sub0; und Lambda gt&sub1;&sub1; bestehenden Gruppe ist.

5. Verfahren nach Anspruch 2, worin der Expressionsvektor ein Plasmid ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, worin das Plasmid von pBR322 abgeleitet ist.

7. Verfahren nach Anspruch 2, worin die Kontrollfunktion auf dem Expressionsvektor durch virales Material bereitgestellt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin das virale Material von einem Mitglied der aus Rinderpapillomavirus, Epstein-Barr- Virus, Adenovirus, Affenvirus 40 (SV40) und Bakulovirus bestehenden Gruppe abgeleitet ist.

9. Endothelzellwachstumsfaktor, erhältlich durch das Verfahren nach Anspruch 2.

10. Replizierbarer Expressionsvektor, der zur Expression von Endothelzellwachstumsfaktor, wie definiert in Anspruch 9, in einem selbstreplizierenden rekombinanten System fähig ist.

11. Selbstreplizierendes rekombinantes System, transformiert mit dem Vektor nach Anspruch 10.

12. Rekombinantes System nach Anspruch 11, worin das System in einer Zelle ist.

13. Rekombinantes System nach Anspruch 11, worin das System zellfrei ist.

14. Rekombinantes System nach Anspruch 11, das durch Transformieren oder Infizieren eines Mitgliedes der aus E. coli, B. subtilis, Insekten, Hefe oder Vertebratenzellen bestehenden Gruppe erhältlich ist.

15. Rekombinantes System nach Anspruch 11, erhalten durch Transformation von Eukaryonten.

16. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Wiedergewinnen des Endothelzellwachstumsfaktors die Reaktion der von dem rekombinanten Wirtssystem exprimierten Proteine mit einer Reagenzzusammensetzung umfaßt, die mindestens ein Bindeprotein umfaßt, das für Endothelzellwachstumsfaktor spezifisch ist.

17. Humaner Endothelzellwachstumsfaktor mit der Sequenz von αECGF oder β-ECGF, gezeigt in Fig. 8, oder eine allelische Variante, eine Modifikation oder ein Analog des α-ECGF oder β-ECGF, das die biologisch aktiven Eigenschaften von nativem ECGF beibehält, wobei der humane Endothelzellwachstumsfaktor im wesentlichen frei von anderen Proteinen humanen Ursprungs ist.

18. Endothelzellwachstumsfaktor nach Anspruch 17, umfassend eine Polypeptidsequenz, die sich von der NH&sub2;-terminalen Aminosäure des Endothelzellwachstumsfaktors erstreckt.

19. cDNA-Klon, umfassend die vollständige kodierende Sequenz für humanen Endothelzellwachstumsfaktor, wobei die cDNA eine DNA-Sequenz hat, die für α-ECGF oder β-ECGF, gezeigt in Fig. 8, kodiert, oder eine allelische Variante, eine Modifikation oder ein Analog dieser DNA-Sequenz ist, die (das) für ein Protein kodiert, das die biologisch aktiven Eigenschaften von nativem ECGF beibehält.

20. cDNA-Klon nach Anspruch 19, enthaltend untranslatierte Nukleotidsequenzen, die 5' und 3' von der kodierenden Sequenz des humanen Endothelzellwachstumsfaktors angeordnet sind, definiert durch die mRNA für Endothelzellwachstumsfaktor.

21. Zusammensetzung, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge von humanem Endothelzellwachstumsfaktor, wie in Anspruch 17 oder 18 definiert, zur Förderung der Wundheilung in einer Mischung mit einem verträglichen Träger.