DK175243B1 - Ekspressionsvektor, der er i stand til at styre ekspression af heterologe gener eller cDNA i gær, gærværtscelle samt fremgangsmåde til öget produktion af proteiner i gærværtsceller - Google Patents

Description

i DK 175243 B1

Den foreliggende ansøgning er en "continuation-in-part" af U.S. patentansøgning serie nr. 029.867, indleveret 23. marts 1987, hvilken patentansøgning endnu ikke er færdigbehandlet.

5 Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til øget produktion af proteiner i gærværtsceller i almindelighed og nærmere be- 1 stemt en forbedret fremgangsmåde til at øge produktionen af α-1-antitrypsin samt andre proteiner. i 10 Nuværende teknologi inden for gensplejsningsområdet har lettet

ekspressionen af fremmede gener i gær. Produktionen af eukaryote (f.eks. mammale) genprodukter i gær har fordele i forhold til pro- I

duktion under anvendelse af pattedyrceller eller bakteriecellekulturer. En af hovedulemperne ved anvendelse af bakterier som en 15 værtscelle til produktion af heterologe proteiner er produktionen af endotoxiner, som skal fjernes fuldstændigt, før produktet kan anvendes som et farmaceutisk middel. Heterologe proteiner, som er frembragt i bakterier, har vist sig at udvise lav opløselighed, et problem, som, med mindre det overvindes, alvorligt begrænser anven- ' 20 del sen som farmaceutiske midler. Anvendelsen af mammale celler til | ekspression af et proteinprodukt på kommercielle niveauer er endvi- | i

dere meget dyrere. I modsætning hertil er fermentering af gær i I

kommerciel skala velkendt, hvilket tillader produktionen af store mængder af heterologe proteinprodukter. Gær er en eukaryotisk orga-25 nisme, som har større lighed med pattedyrceller end bakterier har.

j i

Den seneste interesse i at anvende humane væskeafledte produkter samt vanskeligheden og udgifterne, som ledsager oprensningen af sådanne proteiner, har tilvejebragt en interesse i at producere 30 rekombinerede proteiner i gær. Et eksempel på et protein, som er j blevet udtrykt i gær, er or-1-antitrypsin (AAT) (Kawasaki, U.S. pa- i tent nr. 4.599.311 samt Kawasaki et al., U.S. patent nr. 4.711.848). j

Proteasehæmmeren, AAT, som også er kendt som a-l-proteasehæmmer, er 35 en komponent i pattedyrblod og virker som en hæmmer af proteolytiske enzymer, såsom serinproteaser. Hos pattedyr er den væsentligste fysiologiske funktion af a-1-antitrypsin hæmningen af elastase, en kraftig protease, som hydrolyserer strukturproteiner. Elastase virker med til at hjælpe på nedbrydningen af inhalerede,

I DK 175243 B1 I

I 2 I

parti kel formede materialer i lungerne. Den hæmmende virkning, som I

I α-1-antitrypsin udviser, er baggrunden for den hypotese, at den er I

I en defensiv, selvregulerende mekanisme, som beskytter kroppens væv I

I mod angreb af elastase samt af andre proteolytiske enzymer, som I

I 5 frigøres under et inflammatorisk svar. I

I Genetiske mangler, som resulterer i nedsatte niveauer af I

α-1-antitrypsin, er blevet identificeret hos mennesker. Genetiske I

I varianter, betegnet Z og S, er mutantalleler, som frembringer ned- I

I 10 satte niveauer af α-1-antitrypsin hos individer, som bærer kombina- I

I tioner af disse alleler (f.eks. SS, SZ). Disse genetiske mangler kan I

I være ledsaget af degenerative lungesygdomme og i nogle tilfælde af I

leversygdomme. De lave niveauer af a:-l-antitrypsinaktivitet, som er I

forbundet med mutantallelerne, kan blive yderligere nedsatte ved I

I 15 miljøforurenende produkters inaktiverende oxidation af or-1 -ant i - I

H trypsin, herunder tobaksrøg. Det er også blevet postuleret, at I

emphysema hos rygere, som er homozygote for det normale all el, I

skyldes resultatet af røginduceret oxidation af normal α-1-anti- I

trypsin. I

I 20

I Erstatningsterapi er med held blevet anvendt til at behandle pati- I

I enter med mangel på α-1-antitrypsin (Gadek et al., J. Cl in. Invest. I

I 68:1158-1165, 1981). Indgivelsen O'-l-antitrypsin, som er koncentre- I ret ud fra sammenhældt humant hepatitisfrit donorplasma, viste I 25 anti-elastateaktivitet i alveolestrukturer og fremkaldte ingen „ uheldige bivirkninger. 1

Ekspressionen af α-1-antitrypsin samt andre heterologe proteiner i I gær har almindeligvis resulteret i ekspressionsniveauer, som ligger I 30 P3 fra ca. 1% til 5% af det totale protein. I modsætning kan gær- I proteiner, som kodes af gener på nuværende multi kopi pi asmider, pro- | I duceres på niveauer så høje som fra 50% til 80% af det totale ud- I trykte protein (Mellor et al., Gene 33:215-226, 1985). Det synes derfor som om, at ekspressionsniveauer af heterologe DNA-sekvenser i 35 9®r kan reguleres, i det mindste ved naturen af den heterologe se- I kvens i sig selv og ved omsætningshastigheden af det indkodede pro- I tein (Mellor et al., se ovenfor). Mellor et al. har foreslået, at I fremmede proteiner er ustabile i gær, og at ligevægtsniveauer af heterologe mRNA er relativt lave. På den anden side har Kramer et 3 DK 175243 B1

al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:367-370, 1984) samt Kniskern et I

al. (Gene 46:135-141, 1986) vist, at 1igevægtsniveauer af heterologe mRNA er høje i forhold til mængden af det udtrykte heterologe protein, og i tilfælde med hepatitis B-kerneantigen er det heterologe 5 protein mere stabilt end gærproteiner.

Andre faktorer kan også påvirke gærekspressionsniveauer af heterologe gener, men manipuleringen af disse faktorer har ikke generelt forøget heterologe proteinekspressionsniveauer til over ca. 5% af 10 det totalt udtrykte protein. Selv når disse faktorer optimeres, nærmer ekspressionsniveauerne af fremmede gener sig ikke niveauerne, der opnås med klonede gærgener.

Adskillige eksempler på lavt ekspressionsniveau af fremmede gener i j 15 gær har forekommet i litteraturen. F.eks. α-interferon er blevet udtrykt i gær ved, at mange forskere har anvendt en række promoto- i rer. Mellor et al. (se ovenfor), Tuite et al. (EMBO J. 1:603-608, 1982) samt Hitzeman et al. (Science 219:620-625, 1983) anvendte i gærphosphorglyceratkinase-genpromotoren (PGK1-genpromotoren) til at 20 frembringe ot-interferon i niveauer på mellem 1% og 3% af det totale celleprotein. I hvert tilfælde blev PGKl-promotor-a-interferon-eks- i pressionsenheden anvendt i vektorer hidrørende fra gær-2-micron-plasmid. Den konstitutive promotor fra gærgenet ADH1 blev anvendt af Hitzeman et al. (Nature 293:717-722, 1981) til at udtrykke a- 25 interferon i gærvektoren YRp7. Disse konstruktioner gav ¢-interferon i et niveau på 0,4% af totalt celleprotein. Bitter og Egan (Gene 32:263-274, 1983) anvendte glyceraldehyd-3-phosphat- dehydrogenase-genpromotoren (GAP491-genpromotoren, også kendt som GPD) til at udtrykke a-interferon i vektorer hidrørende fra 30 gær-2-micronplasmidet. Disse konstruktioner gav α-interferon i et niveau på ca. 1% af totalt celleprotein. Kramer et al. (Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 81:367-370, 1984) anvendte den i gær repressive sure phosphatase-genpromotor (PH05) til at udtrykke α-interferon på en vektor hidrørende fra gær-2-micronplasmidet. Ved induktion gav denne 35 konstruktion α-interferon i et niveau på 0,2% af totalt celleprotein.

Andre proteiner, som er blevet udtrykt i gær i sammenlignelige niveauer i forhold til α-interferon er hepatitis B-overfladeantigen

I DK 175243 B1 I

i 4 I

I (HBS) samt human α-1-antitrypsin (AAT). Bitter og Egan (se ovenfor) I

I har anvendt GAP491-promotoren til at udtrykke HBS i niveauer på op I

I til 4% af totalt celleprotein. Ved at anvende PH05-promotoren blev I

I så meget som 3,4 μg HBS pr. ml gærkultur i mid-log fase (1,5 x 10^ I

I 5 celler/ml) opnået (Miyanohara et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA I

I 80:1-5, 1983). Under antagelse af, at 1010 celler indeholder ca. 120 I

I mg totalt protein (Robert A. Smith, personlig meddelelse), kan der I

I beregnes et udbytte på ca. 2% HBS. Valenzuela et al. (Nature I

I 298:347-350, 1982) anførte, at HBS-ekspression under anvendelse af I

I 10 ADH1-promotoren resulterede i ekspressionsniveauer, som ca. var to I

I størrelsesordener lavere end dem, der er rapporteret af Miyanohara I

I et al. (se ovenfor). I

I Ekspressionen af AAT har tilvejebragt lignende lave ekspressions- | I

15 niveauer. TPIl-promotoren blev anvendt til at frembringe AAT- I

I niveauer på ca. 0,9% af totalt celleprotein (Kawasaki, U.S. patent I

I nr. 4.599.311, 1986). Et plasmid med et højt kopiantal er blevet I

I anvendt til opnåelse af AAT-niveauer på fra 4% til 6% af totalt I

I celleprotein (Kawasaki og Bell, EP 171.142, publiceret 1986). Andre I

20 forskere har opnået AAT-ekspressionsniveauer på 1,2% (Cabezon, EP I

I 151.102, 1985) samt 1% (Rosenberg et al., Nature 312:77-80, 1984). I

Der er visse undtagelser fra disse eksempler med hensyn til lav he- terolog proteinekspression i gær. Disse omfatter superoxiddismutase I 25 (SOD) samt hepatitis B-kerneantigen (HBcAg). Hallewell og Mullenback I (W085/01503, 1985) har omtalt anvendelsen af GAP491-promotoren til at frembringe SOD ved et angivet niveau på 14,8% af totalt celle- protein. Kniskern et al. (Gene 46:135-141, 1986) har også anvendt GAP491-promotoren til frembringelse af hepatitis B-kerneantigen ved I 30 40% af totalt celleprotein. Kniskern et al. (se ovenfor) noterede, | at det høje nivieau af HBcAg kan relateres til den usædvanlige sta- , bilitet af det heterologe protein, som danner aggregater inden i I cellen, og kunne beskytte proteinet mod endoproteolytisk angreb.

I Cousens et al. (EP 196.056) omtaler en fremgangsmåde til forøgelse 35 af ekspressionsniveauer af heterologe proteiner ved at frembringe fusionsproteiner, som derefter kan spaltes in vitro.

I Kort fortalt produceres heterologe proteiner almindeligvis i lave I niveauer (mindre end ca. 5% af totalt celleprotein) i gær. Skønt 5 DK 175243 B1 grundene til dette fænomen ikke er forstået særlig godt, er det blevet postuleret, at naturen af de fremmede proteiner i sig selv og/eller lave niveauer af frenmede mRNA'er begrænser ekspressionsniveauet. HBcAg, en bemærkelsesværdig undtagelse, synes at være et 5 usædvanligt protein, hvis struktur forøger dets produktionsniveau.

Oenne undtagelse giver yderligere støtte til den hypotese, at ekspressionsniveauer kan være proteinafhængige.

Følgelig er der et behov inden for området for at frembringe en 10 fremgangsmåde til at forøge produktionen af heterologe proteiner, j såsom a-1-antitrypsin, i gærværtsceller. Den foreliggende opfindelse ! opfylder dette behov og tilvejebringer yderligere andre beslægtede j fordele. ;

15 Kort fortalt angår den foreliggende opfindelse en ekspressions- J

vektor, som er i stand til at styre ekspressionen af heterologe ge- j ner eller cDNA i gær, hvilken ekspressionsvektor indeholder en \ ADH2-promotor, et heterologt gen eller cDNA og en defekt, selekterbar markør. I en foretrukken udførelsesform koder det hete- j 20 rologe gen eller cDNA for a-1-antitrypsin.

Et anden aspekt ved den foreliggende opfindelse angår en gærværts-celle med en genetisk defekt, i hvilken celle der er blevet indført en ekspressionsvektor, som er i stand til at styre ekspressionen af 25 heterologe gener eller cDNA'er i gær, hvilken ekspressionsvektor indeholder en ADH2-promotor, et heterologt gen eller cDNA samt en defekt, selekterbar markør, hvilken markør kompletterer den genetiske defekt i gærværtscellen. 1 2 3 4 5 6

Med den foreliggende opfindelse tilvejebringes endvidere en frem- 2 v gangsmåde til at forøge produktionen af proteiner i gærværtsceller.

3

Metoden inkluderer, (a) at der i en gærværtscelle, som har en gene 4 tisk defekt, indføres en ekspressionsvektor, som er i stand til at 5 styre ekspressionen af heterologe gener eller cDNA i gær, hvilken 6 ekspressionsvektor indeholder en ADH2-promotor, et heterologt gen eller cDNA samt en defekt, selekterbar markør, hvilken defekt, selekterbar markør kompletterer den genetiske defekt i gærværtscellen, (b) at gærværtscellen dyrkes i et egnet medium, og (c) at det protein, som produceres af gærværtscellen, isoleres.

I DK 175243 B1 I

I 6 I

I I en foretrukket udførelsesform for opfindelsen er gærværtscellen en I

I (cir°)-stamme af S. cerevisiae, der er auxotrof for vækst pi leucin, I

I og som bærer en pep4-mutation, hvilket resulterer i nedsat aktivitet I

I af adskillige vacuoleproteaser; det heterologe gen koder for I

I 5 α-1-antitrypsin, og ekspressionsvektoren inkluderer et replikations- I

I startsted, REP1-, REP2- og REP3-gener hidrørende fra en I

I gær-2-microncirkel, en ADH2-4f-promotor og en defekt, selekterbar ί I

I markør, som består af leu2-d-genet. I en bestemt udførelsesform ! I

I tilbageholdes α-1-antitrypsinet i det væsentlige i cytoplasmaet i I

I 10 værtscellen, og gærværtscellen sprænges, før det a-l-antitrypsin, I

I som er produceret af gærværtscellerne, isoleres. I

I Andre aspekter af opfindelsen vil fremgå under henvisning til den I

I efterfølgende detaljerede beskrivelse samt de tilhørende tegninger. I

I 15 I

I Figur 1 illustrerer subkloning af en cDNA-sekvens, som koder for I

I I

I α-1-antitrypsin. j I

I Figur 2 illustrerer konstruktionen af plasmidet pAT-1. J I

I I

I 20 I

Figur 3 illustrerer konstruktionen af et plasmid, som omfatter I

I c I

ADH2-4_-promotoren fusioneret til den første aminosyrecodon af den I

I modne cr-l-antitrypsin-cDNA-sekvens. I

Η I

I 25 Figur 4 illustrerer konstruktionen af plasmider, som omfatter ; I

I ADH2-promotorsekvenser. | I

Figur 5 illustrerer konstruktionen af α-1-antitrypsinekspressions- j I

I vektoren pAT-3. I

I 30 1 I

I Figur 6 illustrerer konstruktionen af ekspressionsvektorerne pAT-4 I

I og pAT-6. I

I Defekt selekterbar markør: Et gen eller cDNA, som udtrykkes ved en I

I lav specifik aktivitet og anvendes på et plasmid for at tillade I

I selektion af celler, som er transformeret med plasmidet. Et sådant I

Før opfindelsen fremføres, kan det være nyttigt at forstå de an- I

I 35 vendte definitioner af bestemte udtryk, som anvendes herefter. I

DK 175243 B1

7 I

i gen kan udtrykkes ved en lav hastighed på grund af del etioner, mu- i tationer eller ændringer af et promotorområde. Et eksempel på et j sådant gen er leu2-d-genet, som er isoleret af Beggs (Nature j 275:104-108, 1978). Den lave ekspressionshastighed kan også skyldes 5 anvendelsen af en heterolog promotor til at drive ekspressionen af den selekterbare markør. Et eksempel af denne type på en selekterbar markør er E. coli lacZ-promotoren, som anvendes til at udtrykke . Aspergillus nidulans tpiA cDNA i gæren S. cerevisiae (beskrives herefter). Alternativt kan der anvendes et heterologt gen, i hvilket 10 ekspressionshastigheden er lav på grund af ændrede transkriptions-steder, hvilket er tilfældet med Schizosaccharomyces pombe POTl-genet (P.R. Russell, Gene 40:125-130, 1985). Den defekte, selekterbare markør kan også kode for et protein med en lav specifik aktivitet. Dette gen kan være et ændret homologt gen, som koder for 15 et protein med en nedsat specific aktivitet. Alternativt kan der anvendes et heterologt gen, som kun svagt kompletterer en defekt i værten.

Genetisk defekt: En læsion i et specifikt gen i en værtscelle, 20 hvilken læsion hidrører fra en punktmutation, deletion eller af brydelse og som resulterer i Mendel iansk segregering af defekten hos afkommet af en krydsning. En sådan defekt kan f.eks. føre til en auxotrof tilstand med hensyn til specifikke næringsstoffer. Et eksempel på denne type læsion er leu2-3,112-mutationen i S. cere-25 visiae, som fører til et krav for leucin i vækstmediet hos disse mutanter. Alternativt kan læsionen føre til en manglende evne hos en organisme, som indeholder læsionen, til at udnytte en specifik carbonkilde. Et sådant eksempel er tpil-mutationen i S. cerevisiae, som forhindrer mutanter i at gro på et medium, der indeholder j 30 glucose som den eneste carbonkilde. Genetiske defekter kan alminde- j ligvis kompletteres ved hjælp af plasmidbårne selekterbare markører. ’ 2-microncirkel: En naturligt forekommende gærpi asmidcirkel, som er i stand til at overvinde cellecyklusstyring af repli kationen til- op- ! 35 nåelse og opretholdelse af fra 60 til 100 kopier pr. haploid genom. j

2-micronplasmidcirklen kan omdannes mellem to forskellige former ved I

autokatalytisk, intermolekylær rekombination. Plasmidet indeholder dets eget replikationsstartsted og gener, som er betegnet REP1, REP2 og REP3, som er involveret i opretholdelsen og replikationen af i i

I DK 175243 B1 I

I 8 I

I pi asmidet. Replikationen og rekombinationen af 2-microncirklen dis- I

I kuteres af Broach og Hicks (Cell 21:501-508, 1980). I

I (cir°)-stammer: Gærstammer, som ikke indeholder 2-micronplasmidet. I

I 5 I

Mutantisolat: En DNA-sekvens, som adskiller sig fra vildtype alle- I

I let. En sådan forskel kan resultere i en ændret phenotype i en cel- I

I le, som bærer mutantsekvensen. F.eks. er vildtype ADH2-promotoren af I

I S. cerevisiae stærkt undertrykt i celler, som dyrkes på glucose som I

I 10 carbonkilden, og derepresseres i celler, som dyrkes på ethanol. Der I

I er blevet beskrevet adskillige mutanti sol ater, betegnet ADH2^ eller I

I ADHR3£, som udviser ændret aktivitet under derepressionsbetingelser. I

Som anvendt her, betyder udtrykket "mutantisolat af ADH2-promotor- I en", at udtrykket inkluderer men ikke er begrænset til disse spe- I 15 cielle isolater. Udtrykket "ADH2-promotor" inkluderer både vildty- pepromotoren og mutantisol aterne heraf. Disse promotorer vil omfatte mindst den regulerende RNA-polymerasebinding og transkriptionsinitieringsfunktioner af vildtypepromotoren.

20 Som ovenfor anført, har en række forskere opnået lavt ekspressions- niveau af en række heterologe proteiner i gær. Et sådant protein, a-1-antitrypsin (AAT), er derfor kun blevet udtrykt på niveauer på I fra ca. 1% til 6¾. Den foreliggende opfindelse er baseret på opfin- dernes opdagelse af, at en gær-ADH2-promotor, når den anvendes sam- 25 men med en defekt, selekterbar markør, er i stand til at styre høje niveauer af ekspression af heterologe gener eller cDNA i gærværts- celler. De ekspressionsvektorer, som omtales i den foreliggende op- findelse, er stabile og er i stand til autonom replikation til et højt kopiantal i gærværtsceller. Inklusionen af en reguleret I 30 ADH2-promotor gør det muligt, at gærværtscellerne dyrkes til en høj densitet under betingelser, som represserer transkriptionen af he- I terolog mRNA. Når en forudbestemt celledensitet er blevet opnået, I kan ekspressionen af det fremmede gen eller cDNA derefter I derepresseres eller "tændes". I en foretrukket udførel sesform-pro- I 35 ducerer det her omtalte gærekspressionssystem niveauer af AAT- I ekspression, som er konstitutive op til 30% eller højere af totalt I celleprotein.

På baggrund af at få heterologe proteiner er blevet udtrykt i gær i 9 DK 175243 B1 niveauer, som er større end ca. 5% af totalt protein, og at ekspressionsniveauer kan begrænses af naturen af det heterologe protein eller mRNA, ville det ikke være at forvente, at anvendelsen af ADH2-promotoren sammen med en defekt, selekterbar markør ville 5 forøge ekspressionsniveauerne med mindst 5 til 6 gange.

Som ovenfor anført, angår den foreliggende opfindelse en ekspressionsvektor, som indeholder en ADH2-promotor, et heterologt gen eller cDNA samt en defekt, selekterbar markør. I en foretrukket udfø-10 relsesform inkluderer ekspressionsvektoren DNA-sekvenser af det en dogene gær-2-micronplasmid. En specielt foretrukket ekspressionsvektor inkluderer 2-microncirkelplasmidreplikationsstartstedet og 2-micron-REPl-, -REP2- og -REP3-gener. I en anden foretrukket udførelsesform indeholder en ekspressionsvektor ifølge den foreliggende 15 opfindelse en transkriptionsterminator. En specielt foretrukket transkriptionsterminator hidrører fra TPIl-genet.

Foretrukne ADH2-promotorer inkluderer ADH2f-promotorer (Ciriacy,

Mutat. Res. 29:315-326, 1975; Ciriacy, Molec. Gen. Genet.

20 145:327-333, 1976; Ciriacy, Molec. Gen. Genet. 176:427-431m 1979;

Williamson og Young, Cell 23:605-614, 1981). En specielt foretrukket ADH2f-promotor er ADH2-4£-promotoren. Som tidligere anført, indeholder ADH2-promotoren sekvenser, som er ansvarlige for regulering af transkription, RNA-polymerasebinding og initiering af 25 transkription. I vildddtype ADH2-promotoren er den regulator!ske funktion knyttet til området med dyadesymmetri, som strækker sig fra ca. nucleotid -292 til ca. nucleotid -271; RNA-polymerasebinding er forbundet med TATA-boxen ved omkring nucleotid -160, og transkrip-tionsinitiering sker i området fra ca. -60 til -50.

30

En defekt, selekterbar markør, som anvendt her, tillader kun lavt niveau af komplettering for en genetisk defekt hos en gærværtsstam-me. Det lave kompletteringsniveau giver igen en kompenserende forøgelse af kopiantallet af ekspressionsvektoren, hvilket er nødven-35 digt for vækst af værtscellen under selektive betingelser (Erhart og Hollenberg, J. Bacteriol. 156:625, 1983). I en foretrukket udførelsesform ifølge den foreliggende opfindelse omfatter den defekte, selekterbare markør et gen eller cDNA, som koder for et protein, der udtrykkes ved et lavt niveau på grund af anvendelsen af en heterolog

I DK 175243 B1 I

I 10 I

I promotor eller på grund af ændrede transkriptionsstartsteder. I

I Aspergillus nidulans tpiA-cDNA henholdsvis Schizosaccharomyces pombe I

I POTl-genet er specielt foretrukne i denne henseende. I en alternativ I

I udførelsesforni omfatter den defekte, selekterbare markør en deletion I

I 5 eller en ændring i en promotor, som funktionsdygtigt er koblet til I

I markøren. En specielt foretrukket defekt, selekterbar markør i denne I

I henseende er leu2-d-genet. I

I Det vil være klart for en fagmand, at udover et heterologt gen eller I

I 10 cDNA, som koder for α-1-antitrypsin, kan der anvendes en række andre I

I heterologe gener eller cDNA'er ifølge den foreliggende opfindelse. I

I I

I I

I Et eksempel på et protein, som kan udtrykkes i høje niveauer i gær, ; I

I er koaguleringsfaktoren, Factor XIII. Factor XIII er en komponent i : I

I 15 blodkoaguleringssystemet, som, når den bliver aktiveret af thrombin, 1 I

I virker ind på slutstadierne af blodkoaguleringen til tværbinding af I

I fibrinpolymerer til stabilisering og forstærkning af fibrinklumpen. I

I Factor XIII, som består af en tetramer af to a-underenheder og to I

I b-underenheder, er blevet klonet som to cDNA'er, hvoraf én koder for I

I 20 a-underenheden og den anden koder for b-underenheden (Ichinose et I

I al., Biochem. J. 25:6900-6906, 1986, henholdsvis Ichinose et al., I

I Biochem J. 25:4633-4638, 1986). cDNA'et for a-underenheden er ble- I

I vet udtrykt i gær (hvilket er beskrevet i en verserende, til of- I

I fentiigheden overdraget U.S. patentansøgning serie nr. 909.512, som I

I 25 medtages her i sin helhed ved denne henvisning), under anvendelse af I

I en ekspressionsenhed, som er drevet af en ADH2-promotor og indsat i I

de her omtalte ekspressi onsvektorer. Transformation af ekspressions- I

I vektorerne, ind i den passende gærstamme har vist, at ekspressions- I

I vektorerne ifølge den foreliggende opfindelse giver op til 25 gange I

I 30 mere Factor XIII-aktivitet end en ekspressionsvektor, som udnytter I

I den traditionelle, selekterbare URA3-markør. I

I Et andet eksempel på et protein, som kan udtrykkes i gær, er anti- I

I koaguleringsfaktoren PAP-I (Funakoshi et al., Biochem.- J. I

I 35 26:5572-5578, 1987). PAP-I er et protein, som forsøgsvis er blevet I

I grupperet sammen med familien af lipocortiner og udviser evnen til I

at bindes til phospholipid. Der er blevet klonet et cDNA, som koder I

I for PAP-I-proteinet (beskrevet i en verserende U.S. patentansøgning I

I serie nr. 011.782 og nr. 059.355, som er medtaget her i deres helhed I

I i I

I

11 DK 175243 B1 ved denne henvisning). Dette cDNA er blevet anvendt i en ekspressionsvektor, som er beskrevet herefter, og er blevet transformeret ind i en hensigtsmæssig gærstamme til frembringelse af PAP-I. I en foretrukket udførelsesform frembragte det her omtalte 5 gærekspressionssystem niveauer af PAP-1-ekspression som var 10 gange højere end det niveau, der blev fundet under anvendelse af en ekspressionsvektor, der anvendte den traditionelle, selekterbare LEU2-markør.

10 Ekspressionsvektorerne ifølge den foreliggende opfindelse kan indføres i en gærværtscelle, som har en eller flere genetiske defekter, idet den defekte, selekterbare markør (de defekte, selekterbare markører) i ekspressionsvektoren kompletterer den (de) genetiske defekt(er) i gærværtscellen. Egnede værtsstammer kan opnås fra de-15 poneringer hos American Type Culture Collection, Rockville, Maryland og Yeast Genetic Stock Center, Berkeley, Californien eller kan fremstilles under anvendelse af standard mutageniseringsmetoder. Fremgangsmåder til indføring af en ekspressionsvektor i en gær-værtscelle er velkendte fra litteraturen (f.eks. Beggs, se ovenfor, 20 1978, og Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929-1933, 1978). Egnede værtsceller i denne henseende inkluderer stammer af Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces douglasii og Saccharomyces carlsbergensis, idet (cir°)-stammer navnlig foretrækkes. Andre arter af gær, som vides at bære endogent 2-micronplasmid kan kureres til 25 en (cir°)-tilstand (f.eks. ved metoden ifølge Dobson et al., Curr.

Genet. 2:210-215, 1980). Saccharomyces douglasii er en heterotallisk gær, som i starten blev isoleret af Donald C. Hawthorne. S. j douglasii-stamme 4770-1A er med held blevet transformeret med vektoren YEpl3, hvilket indicerer, at stammen indeholder endogent 2-30 mi cronpl asmid, som er i stand til at komplettere de ! repli kationsfunktioner, som mangler fra YEpl3-vektoren. Saccharomyces carlsbergensis er en anden stamme, der vides at bære

• I

endogent 2-micronplasmid. Stammer af S. carlsbergensis er blevet isoleret og undersøgt af Guerineu et al. (Biochem. Biophys.- Res.

35 Commun. 61:462, 1974) samt af Livingston (Genetics 86:73, 1977). I i en foretrukket udførelsesform bærer gærværtsstammen en i pep4-mutation, som resulterer i reduceret aktivitet af adskillige j vacuoleproteaser, som ellers ville nedbryde et heterologt protein, j som bliver frembragt i værtsstammen.

I DK 175243 B1 I

I 12 I

I Transformerede gaerværtsceller opnås ved at selektere for komplette- I

I ring af den genetiske defekt ved hjælp af den selekterbare markør, I

I som er til stede på pi asmidet. De udvalgte gaerværtsceller dyrkes på I

I et passende medium. Almindeligvis dyrkes cellerne natten over i et I

I 5 selektivt medium, som indeholder glucose, og skiftes derefter over I

I til et ethanol-holdigt medium for at derepressere det fremmede gen I

I eller cDNA-ekspression. Alternativt dyrkes cellerne i et selektivt I

I medium, som indeholder glucose, og cellerne får lov til at udtømme I

I glucosen, hvilket bevirker derepression af det fremmede gen eller I

I 10 cDNA-ekspression. Det udtrykte heterologe protein, som produceres af I

I de transformerede værtsceller, isoleres derefter ifølge traditio- I

I nel le procedurer. I

I Metoder til oprensning af heterologe proteiner, frembragt i trans- I

I 15 formerede gærceller, er velkendte inden for fagområdet. Hvor prote- I

iner tilbageholdes i værtscellen, er det nødvendigt først at åbne I

I cellen og fjerne cellerester, fortrinsvis ved centrifugering, til I

I frembringelse af et klaret lysat. I tilfældet med et secerneret I

I protein oprenses proteinet direkte fra dyrkningsmediet. Det klarede I

I 20 lysat eller medium fraktioneres derefter ved hjælp af traditionelle ι I

I proteinoprensningsmetoder. Der vil almindeligvis blive anvendt en I

I flertrinsproces. Typiske procedurer i denne henseende omfatter I

I præcipitering (f.eks. med polyethylenglycol eller ammoniumsulfat), I

I ionbytningskromatografi, affinitetskromatografi, præparativ I

I 25 gelelektroforese, højeffektiv væskekromatografi og hurtigtryks- 1 I

I væskekromatografi. I mange tilfælde foretrækkes det at koncentrere I

I de fraktioner, som har interesse mellem trinene, såsom ved I

I ammoniumsulfatpræcipitering efterfulgt af dialyse til fjernelse af I

I overskud af salt. Udvælgelsen og rækkefølgen af de forskellige trin 1 I

I 30 vil afhænge af egenskaberne af det bestemte protein, som har inte- I

resse, og det ligger inden for en fagmands kompetence. I

Ved en typisk præparation bliver gærværtsceller, som frembringer et I

I heterologt protein, såsom AAT, høstet ved centrifugering og I

I 35 resuspenderet i en egnet puffer, såsom phosphatpufferet sal in (PBS). I

Cellerne bliver åbnet, fortrinsvis ved vortexbehandling med glas- I kugler. Det foretrækkes også at fjerne uønskede proteiner fra op- I slæmningen af åbnede celler og glaskugler, såsom ved præcipitering I med 15% polyethylenglycol, molekylevægt 1000 (PEG-1000). Blandingen 13 DK 175243 B1 centrifugeres derefter for at fjerne glaskugler og ikke-opløsel ig-gjort cellemateriale. For at følge oprensningen bliver supernatanten undersøgt for proteinindhold under anvendelse af standard procedurer, såsom metoden ifølge Lowry et al. (J. Biol. Chem. 193:265-275, 5 1951) og for proteinet af interesse, såsom ved gelelektroforese el ler aktivitetsanalyse. Supernatanten påsættes derefter en ionbytningssøjle, såsom DEAE-Sephacel Fast Flow (Pharmacia, ækvilibreret med 50 mM Tris, pH 6,5). Proteinet elueres ved trinvis påsætning af puffer, som indeholder forskellige koncentrationer af NaCl. AAT 10 eluerer typisk ved 0,2 M NaCl. Fraktioner, som indeholder AAT, bliver dialyseret (f.eks. i 50 mM Tris, pH 8). Det dialyserede materiale påsættes derefter en ionbytningssøjle, fortrinsvis Pharmacia j

Mono-Q, en "Fast Pressure Liquid Chromatograph" (FPLC, Pharmacia,

Piscataway, N.J.). Der opsamles fraktioner, og de kan visualiseres 15 ved polyacrylamidgel elektroforese.

Proteinet kan yderligere oprenses ved at sammenhælde topfraktionerne fra FPLC og udfælde proteinet med 70% ammoniumsulfat. Præcipitatet bliver høstet ved centrifugering og resuspenderet, fortrinsvis i 0,2 20 M natriumphosphatpuffer, pH 7,2. Det genopløste præcipitat adskilles derefter efter størrelse under anvendelse af væskekromatografi. Op-samlede fraktioner kan visualiseres ved polyacrylamidgel elektroforese. Topfraktioner sammenhældes og fryses ved -80°C. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Udbytter af AAT kan analyseres ved at anvende en enzymkoblet 2 immunosorbentanalyse af "sandwich-typen" (ELISA) under anvendelse af 3 monoklonalt antistof mod AAT og et kaninantiserum frembragt mod hu 4 man AAT, som er blevet affinitetsoprenset og koblet til biotin. Det 5 monoklonale antistof mod AAT udplades typisk i standard microtiter- 6 plader med 96 brønde. Efter adsorption af antistoffet mod AAT, blo 7 keres pladerne med puffer, som indeholder bovin serumalbumin. Efter 8 blokeringen fjernes pufferen, ATT-prøver tilsættes til pladerne i 9 tre eksemplarer. En serie af oprenset AAT-standarder (>95% renhed, 10 bestemt ved elektroforese) inkluderes også på hver plade med 96 11 brønde. Efter inkubering og vask tilsættes det påvisende antistofbiotinkonjugat til pladen og efter endnu en inkubering og vask tilsættes avidin-alkalisk phosphatasekonjugat. Pladerne inkuberes derefter, vaskes, og der tilsættes alkalisk phosphatasesubstrat. Farveudvikl ingen måles ved 405 nm, f.eks. på en

I DK 175243 B1 I

H

I 14 ! I

I Titertek 310 C ELISA pladelæser. I

I Den biologiske aktivitet af AAT kan bestemmes ved at udnytte det I

I native AAT's evne til at binde til elastase. I en foretrukket ana- I

I 5 lyse blandes prøver, som indeholder AAT, med elastase i et forhold I

I på 1 /tg elastase til 4 øg AAT. Disse blandinger inkuberes på is, før I

I de høstes i et vandbad med kogende vand. Prøverne analyseres på en I

10% acrylamidgel og overføres til nitrocellulose under anvendelse af I

Western blotteknik (Towbin et al., Proc. Natl., Acad. Sci. USA I

I 10 76:4350, 1979). Oprenset kaninanti-AAT, gedeantikanin konjugeret med I

I peberrodperoxidase og BioRad-HRP- farveudviklingsreagens anvendes I

til at visualisere AAT-prøverne. Prøver, som indeholder aktiv AAT, I

I vil danne et kompleks med elastase og vandre langsommere gennem I

I acrylamidgelen. I

I 15 I

I Sekvensanalyse af den N-terminale ende af det rekombinerede protein, I

I som er frembragt af de transformerede gærceller, kan anvendes til I

I yderligere at karakterisere proteinet. Sekventering af den terminale I

I aminosyre kan udføres under anvendelse af metoden, beskrevet af I

I 20 Edman (Acta. Chem. Scand. 4:283-293, 1950). Forud for sekventering ι I

I dialyseres proteinet mod ammoniumbicarbonat, og det frysetørres for j I

I at fjerne salte. I I

I Som det vil være indlysende for en fagmand kan andre proteiner op- I

I 25 renses på lignende måder under anvendelse af antistoffer, analyser I

og fraktioneringsbetingelser, som er hensigtsmæssige for det be- I

I stemte protein, der har interesse. I

1 I

I Til opsummering af de eksempler, som følger herefter, beskriver ek- I

I 30 sempel 1 kloning af en cDNA-sekvens, som koder for human I

I α-1-antitrypsin. Eksempel 2 beskriver subkloning og modifikation af I

I ADH2-promotorsekvenser. Eksempel 3 beskriver konstruktionen af vek- I

torerne pAT-2, pAT-3, pAT-4 og pAT-6, som styrer ekspressionen af I

I a-1-antitrypsin i transformerede gærceller. Eksempel 4 beskriver I

I 35 transformationen af gærceller med plasmider, der er beskrevet i ek- I

H sempel 3. De transformerede celler dyrkes i hensigtsmæssige medier I

og frembringer høje niveauer af o:-1-antitrypsin. Eksempel 5 beskri- I

I ver fremgangsmåder til analyse af produktionen af a-1-antitrypsin af I

I de transformerede gærceller. Eksempel 6 beskriver kloningen af et 15 DK 175243 B1 cDNA, som koder for a-underenheden af human Factor XIII. Eksempel 7 beskriver konstruktionen af Factor XIII-a-underenhedens ekspressionsenheder. Eksempel 8 beskriver konstruktionen af ekspressionsvektorer under anvendelse af ekspressionsenheder, som er beskrevet i 5 eksempel 7 og ekspressionen af Factor XHI-a's underenhed i gær.

Eksempel 9 beskriver en fremgangsmåde til at analysere Factor XIII-aktivitet. Eksempel 10 beskriver kloningen af det cDNA, som koder for PAP-I. Eksempel 11 beskriver ekspressionen af PAP-I i gær.

10 De efterfølgende eksempler angives alene til illustration og ikke på nogen måde som en begrænsning.

EKSEMPLER

15 Enzymer, herunder restriktionsenzymer, DNA-polymerase I (Klenow-

fragment), BAL-31, T^-DNA-1igase, T4-polynucleotidkinase, bakteriel alkalisk phosphatase samt alkalisk kalvephosphatase blev opnået fra New England Biolabs (Beverly, Mass.), Bethesda Research Laboratories (Gaithesburg, Md.) og Boehringer-Mannheim Biochemical s (Indiana-20 polis, Ind.) og blev anvendt, som angivet af producenten og som be- I

skrevet i Mani atis et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual,

Cold Spring Harbor, N.Y., 1982). 01igonucleotider blev syntetiseret på et "Applied Biosystems" (Foster City, Calif.) Model 380-A-DNA-syntetiseringsapparat og blev oprenset ved polyacrylamid-25 gelelektroforese. Et humant placenta cDNA-bibliotek blev opnået fra Clontech Lab., Inc. (Palo Alto, Calif.).

Eksempel 1 30 AAT-subklonino

Der blev isoleret et cDNA, som koder for den fremherskende form af human α-1-antitrypsin (AAT), fra et humant lever-cDNA-bibliotek ved hjælp af traditionelle procedurer under anvendelse af bavian-se-35 kvensen som en DNA-hybridiseringsprobe (Kurachi et al., Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 78:6826-6830, 1980; og Chandra et al., Biochem.

Biophys. Res. Comm. 103:751-758, 1981). Biblioteket blev konstrueret ved at indsætte humant lever-cDNA i Pst I-stedet i plasmidet pBR322 (Bolivar et al., Gene 2:95-113, 1977). AAT-cDNA'et blev isoleret fra

I DK 175243 61 I

I I

I biblioteket som et 1500 basepar (bp) langt Pst I-fragment. Dette I

I fragment blev indsat i Pst I-stedet i pUC13 til frembringelse af I

I plasmidet pUCal. I pUCal er AAT-sekvensen flankeret ved 3'-enden af I

I Xba I og Eco Ri-stedet i polylinkeren. Denne cDNA-sekvens blev an- I

I 5 vendt til at konstruere plasmidet pFATPOT, som er illustreret i fi- I

I gur 1. Plasmidet pFATPOT er blevet deponeret hos ATCC som en I

I Saccharomyces cerevisiae-stamme-E18-transformant, deponering nr. I

I 20699. . I

I 10 AAT-cDNA'et blev derefter koblet til TPIl-terminatoren i plasmidet I

I pMVRl. Dette plasmid omfatter endvidere TPI1-promotoren og blev I

I samlet på følgende måde. Plasmid pIC7 (Marsh et al., Gene I

I 32:481-486, 1984) blev fordøjet med Eco RI, fragmentenderne blev I

I gjort stumpe med DNA polymerase I (Klenow-fragment) og det lineære I

I 15 DNA blev omformet til en cirkel under anvendelse af T^-DNA-1igase. I

I Det fremkomne plasmid blev anvendt til at transformere E. coli I

I stamme RR1. Plasmid-DNA blev fremstillet ud fra transformanterne og I

I blev screenet for tab af Eco Rl-stedet. Et plasmid med et korrekt I

I restriktionsmønster blev betegnet pIC7RI*. TPI1-promotorfragmentet I

I 20 blev opnået fra plasmidet pTPICIO (Alber og Kawasaki, se ovenfor), I

I hvilket er illustreret i figur 1. Dette plasmid blev skåret i det I

I unikke Kpn I-sted inden i TPIl-genet, det TPIl-kodende område blev I

fjernet med Bal31 exonuclease, og en kinasebehandlet Eco RI-1inker I

I (sekvens: GGAATTCC) blev tilføjet til 3'-enden af promotoren. For- I

25 døjel se med Bgl II og Eco RI gav et TPI1-promotorfragment med Bgl II I

I og Eco RI klæbrige ender. Dette fragment blev derefter koblet til I

I plasmid YRp7' (Stinchcomb et al., Nature 282:39-43, 1979), som var I

I blevet skåret med Bgl II og Eco RI. Det fremkomne plasmid TE32 blev I

I spaltet med Eco RI og Barn HI til fjernelse af en del af det I

I 30 tetracyclinresistente gen. Det 1 ineariserede plasmid blev derefter I

I omformet til en cirkel ved tilføjelse af en kinasebehandlet, I

I annelleret ("anneal") Eco RI-Bam HI-adaptor (5' AAT TCA TGG AG 3' og I

I 5' GAT CCT CCA TG 3') til frembringelse af plasmidet TEA32. Plasmid I

I TEA32 blev fordøjet med Bgl II og Eco RI, og det ca. 900 bp -lange I

I 35 TPI1-promotorfragment blev geloprenset. Plasmid pIC19H blev skåret I

I med Bgl II og Eco RI, og vektorfragmentet blev geloprenset. I

I TPI1-promotorfragmentet blev derefter ligeret til det lineariserede I

I pIC19H, og blandingen blev anvendt til at transformere E. coli I

I stamme RR1. Plasmid DNA blev fremstillet og screenet for I

17 DK 175243 B1 tilstedeværelsen af et ca. 900 bp langt Bgl II - Eco Ri-fragment. Et korrekt plasmid blev udvalgt og betegnet pICTPIP. Plasmidet pIC7RI* blev fordøjet med Hind III og Nar I, og det 2500 pb store fragment blev geloprenset. Et omtrentligt 900 bp langt fragment, som 5 omfattede en delvis TPIl-promotor og pICI9H-vektorsekvenser, blev fjernet fra pICTPIP under anvendelse af Nar I og Sph I og blev gel oprenset. Plasmidet pFATPOT blev fordøjet med Sph I og Hind III, og det 1750 bp lange fragment, som omfattede en del af TPI1-promotoren, et AAT-cDNA og TPIl-terminatoren, blev geloprenset.

10 pIC7RI*-fragmentet, TPIl-promotorfragmentet og TPIl-promotor-AAT-TPIl-terroinatorfragmentet fra pFATPOT blev derefter kombineret ved en trevejsligering til frembringelse af pMVRl (figur 1).

15 Eksempel 2 /

Subklonino og modifikation af ADH2-promotorer

Der blev konstrueret en ADH2-4£-promotor ved at tilføje et Eco RI-20 sted til 3'-enden af vildtype ADH2-promotoren og kombinere 3'-enden af denne modificerede promotor med 5'-delen af ADH2-4£-promotoren.

Det 2,2 kb lange Barn Hi-fragment, som indeholder vildtype ADH2-strukturgenet og 5'-flankerende sekvenser fra pBR322-ADR2-BSa (Williamson et al., se ovenfor) blev ligeret med M13mpl9, som var 25 blevet lineariseret med Barn HI. Orienteringen af indføjelsen blev bestemt ved restriktionsanalyse. Der blev udført stedspecifik in vitro mutageni sering (Zoller et al., DNA 3:479-488, 1984) på ADH2-indføjelsen i M13mpl9 under anvendelse af ZC237 (tabel 1) som den mutagene primer og ZC87 (tabel 1) som den anden primer. I posi-30 tive kloner udsløjfede oligonucleotid ZC237 strukturdelen af ADH2-genet, fusionerede 5'-flankerende sekvenser, herunder translationsstartsignalet, med Eco Ri-stedet i M13mpl9-polylinkeren. Den replikative form af DNA af den mutagen i serede fag blev fremstillet og blev skåret med Barn Hl og Eco RI til isolering af det lr2 kb 35 store promotorfragment. Dette fragment blev ligeret ind i pUC13, som var blevet lineariseret med Bam HI og Eco RI til frembringelse af plasmidet p237-Wt. For at ændre p237-Wt-promotoren til "promotor op" mutant ADH2-4f-promotor blev et 1,1 kb stort Bam HI-Sph I-fragment fra YRp7-ADR3-4c (Russel et al., Nature 304:652-654, 1983), soro

I I

I DK175243 B1 j I

I 18 I

I indeholder de ændringer, der fandtes at influere på promotorfunktio- I

I nen, subklonet i vektorfragmentet p237-Wt, som var blevet skåret med I

I Bam HI og Sph I. Det fremkomne plasmid blev betegnet p237-4c (figur I

I 2). I

I 5 I

I Tabel 1 I

I ZC87 5'tCC CAG TCA CGA CGT3' . I

I 10 ZC237 5'gCC AGT GAA TTC CAT TGT GTA TTA3' I

I ZC4I0 5'cGT AAT ACA GAA TTC CCG GG3' I

I ZC411 5'tAA TAC ACA ATG GAG GAT CCC3' I

H 1 s I

I ZC862 5'cGA ATC TTT TGA GCT CAG AAA CAC C3' I

I ZC1056 5'aAT TAG ATC TGC A3' I

I 20 ZC1057 5'gAT CT3' I

I ZC1113 5'cGA CCT TCC ATG TGA TAA CTC GAG AAG CTG AGA TGA AC3' I

I ZC1551 5'gAT CCC CGG GGA GCT CCT CGA GGC ATG3' I

I 25 I

I ZC1552 5'cCT CGA GGA GCT CCC CGG G3' I

ADH2-promotoren blev derefter fusioneret til codonen for den første I

I aminosyre i den modne form af AAT i plasmidet pAT-1 (figur 2). I

I 30 Plasmid pAT-1 omfatter ekspressionsenheden af ADH2-promotoren fra I

I p237-Wt koblet til α-1-antitrypsin-cDNA-TPIl-terminatorsekvensen fra I

I plasmid pMVRl. Disse sekvenser blev indføjet i en del af vektoren I

I pCPOT. (Plasmid pCPOT er blevet deponeret hos ATCC som en E. coli I

I stamme HB101-transformant og har fået deponering nr. 39685. Den om- I

I 35 fatter hele 2-micronplasmid DNA, leu2-d-genet, p8R322-sekvenser og I

I Schizosaccharomyces pombe POTl-genet). Plasmid pCPOT blev skåret med I

I Bam HI og Sal I til isolering af det ca. 10 kb lange, lineære vek- I

torfragment. pNVRl (eksempel 1) blev skåret méd Eco RI og Xho I til I

I isolering af det 1,5 kb lange I

19 DK 175243 B1 α-1-antitrypsin-cDNA-TPIl-terminatorfragment. Det 1,2 kb lange ADH2-promotorfragment blev isoleret fra p237-Wt som et Barn HI-Eco RI-fragment og blev koblet med det 1,5 kb lange α-1-antitrypsin-cDNA-TPIl-terminatorfragment og det lineariserede 5 pCPOT i en trevejsligering til frembringelse af et plasmid betegnet pAT-1.

PI asmidet pAT-1 indeholdt tre ekstra aminosyrecodoner mellem ! ADH2-translationsstartcodonen og den første aminosyrecodon for den i 10 modne form af AAT. Disse tre codoner blev fjernet ved stedstyret in vitro mutagenisering (Zoller et al., se ovenfor). Plasmidet pAT-1 blev skåret med Sph I og Bam HI til isolering af det 190 bp lange ADH2-promotorfragment. Dette fragment blev ligeret ind i M13mpl8, som var blevet li neari seret med Bam HI og Sph I. Den fremkomne kon-15 struktion var blevet underkastet in vitro mutageni sering under anvendelse af ZC411 (tabel 1) som den mutagene primer og ZC87 som den anden primer til fusionering af ADH2-translationsstartsignalet til den første codon af det modne α-1-antitrypsin. Positive kloner blev bekræftet ved dideoxysekventering fra -170 bp fra ATG gennem fu-20 si onspunktet. For at lette manipuleringen blev det 175 bp lange mutageniserede Sph Ι-Eco RI-promotorfragment ligeret ind i pUC19, som var blevet lineariseret med Sph I og Eco RI. Det fremkomne plasmid, som omfattede de 170 bp nærmest 3'-enden af ADH2-promotoren og ADH2-transi ationsstartstedet fusioneret til den første aminosyre 25 af den modne form af ATT i vektoren pUC19, blev betegnet p411 (figur 3).

For at tilvejebringe den fulde ADH2-4£-promotor fusioneret til den første aminosyre af det modne AAT, blev sekvensen længst mod 5'-en-30 den af ADH2-4£-promotoren, som indeholdt ændringerne, fundet af

Russell et al. (se ovenfor), til influering af promotorfunktionen, tilføjet til promotorfragmentet, som var til stede i plasmidet p411 (figur 3). Plasmidet p411 blev fordøjet med Sph I og Eco RI til isolering af det 175 bp lange promotorfragment. Plasmidet p237-4c 35 blev skåret med Eco RI og Sph I til isolering af det 3,71 kb lange fragment, som omfattede vektorsekvenserne og promotorsekvensen længst mod 5'-enden, hvilket giver "promotor-op"-fænotypen. Det 175 bp lange promotorfragment fra p411 blev ligeret ind i p237-4c-vek-torfragmentet. Det fremkomne plasmid, som indeholdt den fulde

I DK 175243 B1 I I

I 20 I

ADH2-4f-promotor fusioneret til den første aminosyrecodon af den I

I modne AAT-sekvens, blev betegnet p237-4cM. I

I ADH2-promotoren fra plasmidet pAT-1 blev modificeret til frembrin- I

I 5 gel se af en "universel" promotor ved at fjerne ADH2-translations- I

I startstedet og pUC18-polylinkersekvenserne, som fandtes i pAT-1 I

I (figur 4). Plasmid pAT-1 blev skåret med Sph 1 og Bam HI til i sole- I

I ring af det 190 bp lange partielle ADH2-promotorfragment. Dette j I

I fragment blev ligeret ind i M13mpl8 lineariseret med Barn HI og Sph I

I 10 I. Den fremkomne konstruktion blev underkastet in vitro mutageni- I

I sering (Zoller et al., se ovenfor) under anvendelse af ZC410 (tabel I

I 1) som den mutagene primer og ZC87 som den anden primer. Mutageni- I

I sering under anvendelse af ZC410 erstatter ADH2-translationsstart- I

I stedet og pUCI8-polylinkersekvenserne med et enkelt Eco Rl-sted fu- I

I 15 sioneret til M13mpl8-polylinker ved Sma I-stedet. Positive kloner I

I blev bekræftet ved dideoxysekventering gennem fusionspunktet. For at I

I lette håndteringen blev det mutageni serede delvise ADH2-promotor- I

I fragment subklonet som et 175 bp langt Sph Ι-Eco Rl-fragment i I

I pUC19, som var blevet lineariseret med Sph I og Eco RI. Det frem- I

I 20 komne plasmid, betegnet p410ES, indeholdt de 175 bp længst mod 3'- I

I enden af ADH2-promotoren. Vildtype ADH2-promotoren blev regenereret I

I ved at anvende det delvise ADH2-promotorfragment fra p410ES. Plasmid I

I p410ES blev fordøjet med Sph I og Eco RI til isolering af det 175 bp I

I lange delvise A0H2-promotorfragment. Dette fragment blev koblet med I

I 25 et 1 kb langt Bam HI-Sph I-fragment hidrørende fra pBR322-ADR2-BSa i I

I en trevejsligering ind i pUC13, som var blevet lineariseret ved I

I fordøjelse med Bam HI og Eco RI. Det 1 kb lange fragment hidrørende I

I fra pBR322-ADR2-BSa indeholdt sekvenser, som er homologe med vild- I

I type ADH2-promotorsekvensen. Det plasmid, som fremkom ved I

I 30 trevejsligeringen, blev bekræftet ved restriktionsanalyse og blev I

I betegnet p410-Wt. I

I Der blev frembragt en universel ADH2-4^-promotor ved at anvende det I

I mutageni serede promotorfragment fra plasmidet p410ES (figur 4).~ Det I

I 35 1,1 kb lange fragment, som indeholdt sekvenser, der vides at bidrage I

I med ADH2£-promotorfænotypen, blev taget fra plasmidet p237-4c. I

I Plasmidet p237-4c blev skåret med Bam HI og Sph I til isolering af I

det 1,1 kb lange ADH2-4f-promotorfragment. ADH2-4£-promotoren blev I

I rekonstrueret i en trevejsligering, som sammenføjede Bam HI-Sph I- I

21 DK 175243 B1

promotorfragmentet fra pZ37-4c, det mutageniserede Sph Ι-Eco RI-promotorfragment fra p410ES og pUC13, som var blevet lineariseret med Barn HI og Eco RI. Det fremkomne plasmid, der blev bekræftet ved I

restriktionsanalyse, indeholdt den komplette ADH2-4f-promotor ! 5 mutageniseret ved 3'-enden for at anbringe et Eco Ri-sted i stedet j for transiationsstartcodonen. Plasmidet blev betegnet p410-4 . j i

Den "universelle" promotor fra plasmid p410-4c blev anvendt til at erstatte TPI1-promotoren, som var til stede i plasmid pMVRl (eksem-10 pel 1). Plasmid p410-4c blev skåret med Barn Hl og Eco RI til isolering af det 1,2 kb store ADH2-4^.-promo to rf ragment. Plasmidet pMVRl blev fordøjet fuldstændigt med Eco RI og delvist med Bgl II til isolering af det 4,2 kb store AAT-TPIl-terminatorvektorfragment.

Disse to fragmenter blev ligeret til dannelse af plasmidet betegnet 15 pTRK4c.

Eksempel 3

Konstruksion af ekspressionsvektorerne dAT-2. dAT-3. pAT-4 oq pAT-6 20 Α. Konstruktion af pAT-2: j

Ekspressionsvektoren pAT-2, som omfatter ADH2-4£-promotoren, et !

AAT-cDNA og TPIl-terminatoren, blev samlet på følgende måde {figur 25 5). Plasmidet pCPOT blev fordøjet fuldstændigt med Barn HI og Sal I

til fjernelse af P0T1-genet. Det 10 kb lange, lineære vektorfragment blev isoleret. ADH2-4£-promotorfragmentet blev taget fra plasmid p237-4c. Plasmidet p237-4c blev skåret med Baro HI og Eco RI til isolering af det 1,2 kb store ADH2-4f-promotor fragment, som inde-30 holdt den fuldstændige promotor med et Eco Rl-sted 3' i forhold til transiationsstartcodonen. AAT-cDNA-TPIl-terminatorfragmentet blev isoleret som et 1,5 kb langt Eco RI-Xho I-fragment fra plasmid pHVRl. Disse tre fragmenter blev sammenføjet i en trevejsi igering og transformeret ind i E. coli stamme RR1. De fremkomne pi asmi der-blev 35 analyseret ved restriktionsanalyse. Det korrekte plasmid, betegnet pAT-2, omfatter ADH2-4£-promotoren, AAT-cDNA'et og TPIl-terminatoren i vektoren pCPOT.

B. Konstruktion af pAT-3:

I DK 175243 B1 I

I 22 I

I Ekspressionsenheden i plasmid pAT-2 koder for tre ekstra aminosyrer I

I mellem ADH2-translationsstartstedet og den første aminosyre af den I

I modne form af AAT. Disse tre aminosyrer blev fjernet ved at erstatte : I

I ADH2-4^-promotoren, som var til stede i plasmid pAT-2 med i I

I 5 ADH2-4f-promotoren fra plasmidet p237-4cM (figur 5). Plasmidet pAT-2 I

I blev skåret med Barn HI til isolering af det 12,4 kb lange vektor- I

I fragment, som omfattede α-1-antitrypsin-cDNA'et, TPIl-terminatoren I

I og vektoren pCPOT. Dette fragment blev behandlet med alkalisk I

I kalvephosphatase for at forhindre gendannelse af en cirkel ved li- I

I 10 gering. Plasmidet p237-4cM blev fordøjet med Barn HI til isolering af I

I det 1,2 kb lange fragment, som omfattede ADH2-4^-promotoren fusio- I

I neret til ATG og den første codon af AAT-cDNA'et. Dette fragment I

I blev ligeret ind i det 1ineariserede fragment fra pAT-2. Oriente- I

I ringen af ADH2-4f-promotoren blev bestemt ved restriktionsanalyse, I

I 15 og plasmidet med promotoren i den korrekte orientering blev betegnet I

I pAT-3. Plasmidet pAT-3, som omfattede ADH2-4£-promotoren fusioneret I

I direkte til AAT-cDNA'et, TPIl-terminatoren og vektoren pCPOT, an- I

I vendte leu2-d-selektionssystemet til opnåelse af et højt I

I plasmidkopiantal, når den blev transformeret i hensigtsmæssige I

I 20 stammer af S. cerevisiae. S. cerevisiae stamme ZH103 transformeret I

I med pAT-3 (transformanten betegnet ZM110) blev deponeret hos I

I American Type Culture Collection. I

I C. Konstruktion af plasmid pAT-4: I

I 25 i

I ADH2-4f-promotor-AAT-cDNA-ekspressionsenheden blev anbragt i vekto- I

I ren pTIP til frembringelse af plasmidet pAT-4 (figur 6). Vektoren, I

I pTIP, omfatter A. nidulans tpiA-cDNA (McKnight et al., Cell I

I 46:143-147, 1986) koblet til E. coli lacZ-promotoren, som kan kom- I

I 30 plettere TPI1-mutationen i S. cerevisiae. Den indeholder også den I

I selekterbare leu2-d-markør. A. nidulans tpiA-cDNA blev subklonet i I

I pUC19 (McKnight et al., se ovenfor) og blev genisoleret som et 1,2 I

I kb langt Barn ΗΙ-delvis Sst I-fragment. Dette fragment blev ligeret I

I ind i pIC19R, som var blevet lineariseret ved fordøjelse med Sst I I

I 35 og Bgl II. Det fremkomne plasmid pM144 blev lineariseret med Eco RV I

I og ligeret til kinasebehandlede Barn HI-linkere. Det lineære fragment I

I blev derefter skåret med Sal I og Barn HI til fjernelse af oversky- I

I dende linkere og til at isolere det 1,2 kb store tpiA-cDNA. Dette I

I fragment blev ligeret med pIC19R, som var blevet lineariseret ved I

23 DK 175243 B1 fordøjelse med Sal I og Bam HI. Det fremkomne plasmid pM147 blev kilden til tpiA-cDNA anvendt i pTIP. Plasmidet pM147 blev skåret med

Sal I og Bam HI til isolering af det 1,2 kb store tpiA-cDNA.

Plasmidet pCPOT blev ændret ved at erstatte det 750 bp lange Sph 5 Ι-Bam Hi-fragment, som indeholder 2-micron- og pBR322-sekvenser, med et 186 bp langt Sph Ι-Bam Hi-fragment hidrørende fra pBR322-tetra- cyclinresi stensgenet. Det fremkomne plasmid, betegnet pDPOT, blev spaltet med Bam HI og Sal I til fjernelse af S. pombe P0T1-genet og til isolering af det 10,2 kb lange vektorfragment. Disse to frag- 10 menter blev ligeret sammen, hvilket resulterede i plasmidet pTIP.

Plasmidet pTIP omfatter replikationsstartstedet, REP1, REP2 og REP3

af 2-micronplasmidet, pBR322-sekvenser, som koder for E. coli R

Amp -genet, Col El replikationsstartstedet og de defekte, selekter-bare markører leu2-d og tpiA, hvilket tillader selektion for 15 plasmidet med et højt kopiantal under anvendelse af leu2-d-selektionssystemet eller tpiA-selektionssystemet eller begge systemer.

Plasmid pAT-4 blev derefter samlet på følgende måde (figur 6).

20 Plasmidet pTIP blev lineariseret ved fordøjelse med Bam HI og be- I

handlet med bakteriel alkalisk phosphatase for at forhindre ! gencirkulering. Plasmidet pMVRl blev fordøjet med Eco RI og Bgl II til isolering det 1,5 kb lange α-1-antitrypsin-cDNA-TPIl-terminator-fragment. Den universelle ADH2-4f-promotor fra plasmidet p410-4c 25 blev isoleret som et 1,2 kb langt Bam HI-Eco Ri-fragment. Dette fragment blev koblet sammen med det 1,5 kb lange α-1-antitrypsin-cDNA-TPIl-terminatorfragment ind i den 1ineariserede pTIP-vektor i en trevejsligering. Ligeringsblandingen blev transformeret ind i E. coli stamme RR1. Plasmid DNA fremstillet ud 30 fra transformanter blev analyseret ved restriktionsanalyse for at identificere en positiv klon. Denne klon blev betegnet pAT-4. j t i i 1 i I Η

I DK 175243 B1 I I

i 24 I

I D. Konstruktion af plasmid pAT-6: I

I Vildtype ADH2-promotoren blev fusioneret til α-1-antitrypsin-cDNA'et I

I og anbragt i vektoren pTIP til opnåelse af plasmidet pAT-6. Pias- I

I 5 midet pTIP blev lineariseret med Barn HI og behandlet med bakteriel I

I alkalisk phosphatase til at forhindre gencirkulering. Plasmidet I

I pMVRl blev fordøjet med Bgl II og Eco RI til isolering åf det 1,5 kb I

I lange α-1-antitrypsin-cDNA-TPIl-terminatorfragment. Den universelle I

I ADH2-promotor blev isoleret fra plasmidet p410-Vlt som et 1,2 kb I

I 10 langt Bam HI-Eco RI-fragment. Dette fragment blev koblet med det 1,5 I

I kb lange α-1-antitrypsin-cDNA-TPIl-terminatorfragment i den linear- I

I iserede pTIP-vektor ved en trevejsligering. Ligeringsblandingen blev I

I transformeret ind i E. coli stamme RR1. Plasmid DNA, fremstillet fra I

I transformanterne, blev analyseret ved restriktionsanalyse til iden- I

I 15 tificering af en positivt klon. Klonen blev betegnet pAT-6. I

I Som følge af den anvendte kloningstrategi afviger promotorsekven- I

serne, som er til stede i både pAT-4 og pAT-6, fra vildtypesekvensen I

I umiddelbart 5' i forhold til ATG. Disse sekvensændringer resulterer I

I 20 i sekvenser omkring initieringscodonen, som kan føre til nedsatte I

I ekspressionsniveauer. For at maksimere ekspressionsniveauerne blev I

I disse plasmider fordøjet med Bam HI til fjernelse af promotoren, ATG I

I og den første codon af det modne AAT. Et promotorfragment, som om- I

I fatter en præcis ADH2-ATT-fusion blev derefter indsat. I tilfældet I

I 25 med pAT-4 blev plasmidet p237-4cM fordøjet med Bam HI, og ADH2-4f- I

promotorfragmentet blev isoleret. Promotoren blev derefter koblet I

med det med Bam HI skårne pAT-4 og et plasmid med den korrekte pro- I

motororientering blev udvalgt. I

I 30 Eksempel 4 I

I Transformation af værtsceller oo ekspression af ct-l-antitrvDsin I

PI asmiderne pAT-3 og pAT-4 blev transformeret ind i egnede gærværter I

I 35 under anvendelse af velkendte metoder inden for området (Beggs, I

I J.D., se ovenfor, 1978; Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA I

75:1929-1933, 1978). De anvendte S. cerevisiae stammer var I

I genotypisk pep4 og var blevet kureret med endogent 2-micronplasmid, I

I hvilket gør dem (cir°). Endvidere indeholdt stammerne mutationer, I

25 DK 175243 B1 som kompletterede den defekte, selekterbare markør, som var til stede på pi asmiderne.

Plasmidet pAT-3, som omfattede ADH2-4f-promotoren fusioneret til 5 AAT-cDNA'et i vektoren pCPOT, blev transformeret ind i S. cerevisiae stamme ZM103 (MATa leu2-3,112 ura3 pep5:URA3 barl gal 2 (c i r°)). Transformanterne blev udvalgt for deres evne til at vokse på -LEUDS (tabel 2).

10 Tabel 2 -LEUDS-plader 20 g glucose 15 6,7 g gærnitrogenbase uden aminosyrer (DIFCO Laboratories) 40 mg adenin 30 mg L-arginin-HCl 50 mg L-asparginsyre 20 mg L-histidin fri base 20 60 mg L-isoleucin 40 mg L-lysin-monohydrochlorid ! 20 mg L-methionin 60 mg L-phenylalanin 50 mg L-serin 25 50 mg L-tyrosin 40 mg uracil 60 mg L-valin 182 g sorbitol 18 g agar (DIFCO Laboratories) 30

Alle bestanddelene blev blandet i destilleret vand. Der blev tilsat destilleret vand til et slutvolumen på 1 liter. Der blev auto-claveret i 15 minutter. Efter autoclavering tilsattes 150 mg l-threonin og 40 mg L-tryptophan. Pladerne blev hældt op og frk lov 35 til at størkne.

I DK 175243 B1 I

I 25 I

I -LEUD I

I Anvend opskriften for -LEUDS-pladerne med udeladelse af sorbitol og I

I agar. Autoclaver i 15 minutter og tilsæt L-threonin og L-tryptophan I

I 5 efter fjernelse af mediet fra autoel aven. I

I HED A I

I 20 g gærekstrakt (DIFCO Laboratories) I

I 10 5 g ammoniumsulfat (Sigma, St. Louis, Mo.) I

I 10 ml 100% ethanol. I

Gærekstrakt og ammoniumsulfat blandes i destilleret vand. Der til- I

I sættes destilleret vand til et slutvolumen på 1 liter. Der auto- I

I 15 claveres i 25 minutter. Efter autoclavering afkøles mediet og der I

I tilsættes 10 ml 100% EtOH. I

I -LEU 1% EtOH I

20 Anvend opskriften for -LEUD med udeladelse af glucose. Alle be- I

I standdelene blandes i destilleret vand. Der tilsættes destilleret I

I vand til et slutvolumen på 1 liter. Der autoclaveres i 15 minutter. I

Efter autoclavering tilsættes 150 mg L-threonin og 40 mg L- I

I tryptophan. Mediet afkøles og der tilsættes 10 ml 100% ethanol. I

I 25 I

I -URADS-plader I 1

20 g glucose I

I 6,7 g gærnitrogenbase uden aminosyrer (DIFCO Laboratories, Detroit, I

I 30 Mich.) I

I 40 mg adenin I

I 30 mg L-arginin-HCl I

50 mg L-asparginsyre I

I 20 mg L-histidin fri base - I

35 60 mg L-isoleucin I

I 80 mg L-leucin I

I 40 mg L-lysin-monohydrochlorid I

I 20 mg L-methionin I

60 mg L-phenylalanin I

27 DK 175243 B1 50 mg L-serin 50 mg L-tyrosin 60 mg L-valin 182,2 g sorbitol 5 18 g agar (DIFCO Laboratories)

Alle bestanddelene blandes i destilleret vand. Der tilsættes destilleret vand til et siutvolurnen på 1 liter. Der autoelaveres i 15 minutter. Efter autoclavering tilsættes 150 mg L-threonin og 40 mg 10 L-tryptophan. Pladerne ophældes og får lov til at størkne.

-URAD

Der anvendes opskriften for -URADS-plader med udeladelse af sorbitol 15 og agar. Autoclavering i 15 minutter og tilsætning af L-threonin og L-tryptophan efter at mediet er fjernet fra autoel aven. .

-TRPDS

- 20 20 g glucose 6,7 g gærnitrogenbase uden aminosyrer (DIFCO) 40 mg adenin 30 mg L-arginin 50 mg L-asparginsyre 25 20 mg L-histidin fri base 60 mg L-isoleucin 80 mg L-leucin 40 mg L-lysin-monohydrochlorid 20 mg L-methionin 30 60 mg L-phenylalanin 50 mg L-serin 50 mg L-tyrosin 40 mg uracil 60 mg L-valin 35 182,2 g sorbitol 18 g agar (DIFCO) j

Alle bestanddelene blandes i destilleret vand. Der tilsættes destilleret vand til et si utvol urnen på 1 liter. Der autoel averes i 15 1

I DK 175243 B1 I

I 28 I

I minutter. Efter autoklavering tilsættes 150 mg L-threonin. Pladerne I

I hældes op og får lov til at størkne. I

I YEPD I

I 5 I

I 20 g glucose I

I 10 g gærekstrakt (DIFCO) I

20 g peptone (DIFCO) I

I 10 Alle bestanddelene blandes i destilleret vand. Der tilsættes de- I

I stilleret vand til et slutvolumen på 1 liter. Der autoclaveres i 25 I

I minutter. I

I Ekspression af AAT fra pAT-3-plasmidet i stammen ZM103 blev opnået ! I

B 15 ved først at dyrke transformanterne natten over ved 30°C i 10 ml - I

I LEUD (tabel 2). Dette gør det muligt for plasmidet at opnå og bevare I

B et højt kopiantal ved selektion for en svag komplettering af I

B leu2-d-genet anbragt på pAT-3. Cellerne blev pel 1 etteret, og det I

B brugte medium blev bortkastet. AAT-ekspression blev induceret ved at I

B 20 resuspendere cellerne i MED A (tabel 2) og dyrke cellerne ved 30°C i I

48 timer. Ethanol en, som er til stede i MED A som den eneste I

I carbonkilde, derepresserer ADH2-4f-promotoren, hvilket gør det mu- | I

B ligt at få en forøget ekspression af AAT. Under anvendelse af denne I

B metode blev AAT påvist ved 30% af totalt celleprotein. : I

I 25

B Plasmidet pAT-4, som omfatter ADH2-4^-promotoren fusioneret til j I

B AAT-cDNA'et i vektoren pTIP, blev transformeret ind i S. cerevisiae I

I stamme ZM115 (MATa ade2-101 leu2-3,112 ura3 gal2 Apep4::TPI1-CAT | I

B tpi 1::URA3 (cir°)). Transformanterne blev selekteret for deres evne J I

B 30 til at vokse på -LEUDS. |

^B

B Ekspression af AAT fra pAT-4-plasmidet i stammen ZM115 blev opnået B ved først at dyrke transformanterne natten over ved 30°C i 25 ml - B LEUD. Dette tillader plasmidet at opnå og opretholde et højt kopi - B 35 antal ved at anvende dobbeltselektion for svag komplettering af B leu2-d-genet og lacZ-TPIA-ekspressionsenheden anbragt på pAT-4.

B AAT-ekspression blev induceret ved at fortynde kulturen 1:50 i 25 ml I -LEU 1% EtOH (tabel 2) ved 30°C i 40 timer. Den ethanol, som er til B stede i mediet som den eneste carbonkilde, derepresserer 29 DK 175243 B1 ADH2-4£-promotoren, hvilket tillader forøget ekspression af AAT.

Eksempel 5 5 Beskrivelse af AAT-analvser A. Enzymkoblet immunosorbent analyse (ELISA):

Hensigtsmæssigt dyrkede celler, hvilket er beskrevet i det tidligere 10 afsnit, blev centrifugeret for at pellettere cellerne, og det brugte medium blev bortkastet. Cellerne blev pelletteret og vasket med destilleret vand. De vaskede pelleter blev frosset ved -80°C før de blev analyseret.

15 Rålysater blev fremstillet med glaskugler ud fra de frosne j cellepelletter. De vaskede cellepelletter blev tøet på is og for- tyndet i et ligeså stort volumen phosphatpufferet salin (PBS, Sigma,

St. Louis, Mo.). Glaskugler (450-500 μπι) blev tilsat til halvdelen af det totale volumen. Denne blanding blev vortexbehandlet ved fuld 20 hastighed i et minut, tre gange, hvor prøverne blev afkølet på is mellem vortexbehandlingerne. Større prøver på 50 ml eller mere blev behandlet på samme måde og blev lyseret i en "Bead Beater" (Biospec Products, Bartlesville, Okla.). De større voluminer blev afkølet i et ethanol isbad mellem vortexbehandli ngerne. Væsken blev fjernet fra 25 reagensglassene med en pasteurpipette og blev overført til et microcentrifugeringsrør. Glaskuglerne blev vasket en gang i det oprindelige volumen af PBS. Kuglerne blev vortexbehandlet i et minut, og væsken blev fjernet med en pasteurpipette og blev samlet med det oprindelige lysat. Lysaterne blev derefter centrifugeret i en 30 Eppendorf-microcentrifuge (Brinkmann, Westbury, N.Y.) med topha stighed i fem minutter. Supernatanten blev omhyggeligt fjernet til analyse.

EL ISA-analysen med dobbelt antistof blev påbegyndt ved først at 35 klæbe antistof til brøndene i en microtiterplade. Kaninan-ti-a-l-antitrypsin (Calbiochem), som var blevet affinitetsrenset over en human α-1-antitrypsinsøjle, blev fortyndet i 0,1 M ^COj, pH 9,7, til en koncentration på 5 /ig/ml. Der blev tilsat 500 ng antistof til hver brønd, og blandingerne blev inkuberet natten over

I DK 175243 B1 I

I 30 I

I ved 4°C, Overskydende antistof blev fjernet ved to vask med puffer C I

I (PBS + 0,5% Tween 20 + 0,05% NaN3 + 1% bovin serumalbumin). Over- I

I skydende bovinserumalbumin (BSA) blev fjernet ved to vask med puffer I

I C. Standarder og prøver blev fortyndet i puffer B i duplikat. 100 μ1 I

I 5 af hver prøve blev tilsat til brøndene og inkuberet ved 37°C i en I

I time. Ikke-bundet materiale blev fjernet ved tre vask med puffer C. I

I Biotinkonjugeret monoklonalt museanti-a-l-antitrypsin Fab blev I

I fortyndet til 1 /jg/ml i puffer B. 100 /ti af det biotinkonjugerede I

I museanti-a-l-antitrypsin Fab blev tilsat til hver brønd, og der blev I

I 10 inkuberet ved 37°C i en time. Overskydende Fab blev fjernet ved tre I

I vask med puffer C. Avidin-alkalisk phosphatase (Boehringer Mannheim, I

I Indianapolis, Indiana) blev fortyndet 1:2500 i puffer B, og 100 /il I

I blev tilsat til hver brønd. Blandingerne blev inkuberet ved 37°C i I

I en time, idet overskud af avidin-alkalisk phosphatase blev I

I 15 bortvasket med tre vask med puffer C i slutningen af timen. I

I Sigmaphosphatasesubstrat blev fortyndet til 0,6 mg/ml i puffer D (1 I

I liter destilleret vand, som indeholdt 96 ml diethanolamin + 56 mg I

I MgCl^, og hvor pH var indstillet til 9,8). 100 /zl substrat blev I

tilsat til hver brønd, og der blev inkuberet ved stuetemperatur i I

I 20 fra 15 til 30 minutter eller indtil der var sket en passende farve- I

I dannelse. Supernatantens absorbans ved 405 nm blev målt, og koncen- I

I trationen blev bestemt i forhold til en standardkurve. Den totale I

I koncentration af opløseligt protein af gærlysaterne blev bestemt ved ! I

I proceduren ifølge Lowry et al. (se ovenfor). Mængden af I

I 25 α-1-antitrypsin blev udtrykt som en procentdel af totalt opløseligt j I

H

I protein. I I

I B. Analyse for biologisk aktivitet: I

I 30 Elastasebindingsanalyser blev udført på prøverne til kvalitativ på- I

I visning af α-1-antitrypsinaktivitet. Prøver, som ifølge ELISA inde- I

I holdt a-1-antitrypsin, blev blandet med el astase i et forhold på 1 I

I elastase:4 μg o-1-antitrypsin (som bestemt ved ELISA) i ialt 50 I

I μΐ TNE (0,02 M Tris pH 8, 0,05 M NaCl, 1 mM EDTA). Disse blandinger j I

I 35 blev inkuberet i 45 minutter”på is, blev derefter opvarmet i et ko- I

I gende vandbad i 3 minutter. Prøverne blev analyseret på en 10% j I

I I

I acrylamidgel og overført til nitrocellulose ved metoden ifølge ! I

I Towbin (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350, 1979). Oprenset kanin- j I

I anti-a-1-antitrypsin, gedeantistof mod kanin konjugeret med I

31 DK 175243 B1 peberrodperoxidase og BioRad HRP farveudviklingsreagens blev anvendt til at visualisere a-1-antitrypsinprøverne. Prøver, soro indeholder aktivt a-1-antitrypsin, vil danne et kompleks roed elastase og vandre langsommere gennem den 10% polyacrylamidgel.

5

Eksempel 6

Kloning af et cONA. som koder for a-underenheden af human faktor XIII

10 A. Screening for cDNA, som koder for a-underenheden af human faktor XIII:

Et Agtll-ekspressionsbibliotek, som indeholdt cDNA'er fremstillet ud I

15 fra human placenta mRNA, blev undersøgt for a-underenheden af human 125 faktor XIII. Et I-mærket, affinitetsoprenset kaninantistof (specifik aktivitet = 6 x 10^ cpm/pg) blev anvendt til at undersøge 5 filtre, som indeholdt fager udpladede med en tæthed på 1,5 x 10 plaques pr. 150 mm plade. Der blev isoleret seks positive kloner ved 20 at undersøge ca. 3 x 10^ fager, og hver positiv fag blev plaque-oprenset.

32 PIaqueoprensede kloner blev derefter undersøgt med følgende p-mærket oligonucleotidprobe: * CTC CAC GGT GGG CAG GTC GTC CTC G3 .

25 Denne probe koder for aminosyresekvensen Ala-Glu-Asp-Asp-Leu-Pro-Thr-Val-Glu, som er til stede i aktiveringspeptidet i a-underenheden (Takagi og Doolittle, Biochem. J. 13:750-756, 1974). Nucleotid-sekvensen for proben blev udvalgt ved at anvende den mest hyppige codonanvendelse for aminosyrer for en række forskellige humane pro-30 teiner (Chen og Barker, Trends in Genetics 1:221-223, 1985).

Oligonucleotidet blev mærket med p til en specifik aktivitet på

O

1,1 x 10 cpm/pg.

B. DNA-sekventering af cDNA-indføjelser: 35

Der blev fremstillet fag-DNA ud fra positive kloner ved lysering i flydende kultur (T.J. Silhavy et al., Experiments with Gene Fusions, CSH Laboratory, N.Y., s. 140-141, 1984) efterfulgt af centrifugering og bånddannelse i en cæsiumchloridtringradient. cDNA-indføjelser

I DK 175243 B1 I

I 32 I

I blev isoleret ved fordøjelse af fag-ONA'et med Eco RI-endonuclease I

I og 5'- og 3'-enderne af hver indføjelse blev sekventeret. En af I

I klonerne med en stor cDNA-indføjelse (XHFXIIIa3.77, ATCC nr. 40261) I

I blev udvalgt til yderligere sekvensanalyse. Denne indføjelse inde- I

I 5 holdt tre interne Eco RI-steder, hvorved der fremkom fire cDNA- I

I fragmenter ved fordøjelse af fag-DNA'et med Eco RI. Disse fragmenter I

I og adskillige yderligere restriktionsfragmenter blev subklonet i I

I plasmid pUC9 eller pUC19. Yderligere restriktionsfragmenter fra an- I

I dre cDNA-indføjelser blev subklonet i M13mpl0, M13mpll, M13mpl8 el- I

I 10 ler M13mpl9 for at opnå overlappende sekvenser. cDNA-indføjelserne I

I blev derefter sekventeret ved dideoxymetoden (Sanger et al., Proc. I

I Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467, 1977) under anvendelse af i I

35 I

(a S)dATP og puffergradientgeler (Biggin et al., Proc. Natl. Acad.

I Sci. USA 80:3963-3965, 1983). Fordøjelser med nuclease BAL-31 blev I

I 15 udført for at frembringe fem yderligere fragmenter, som tilveje- I

I bragte overlappende sekvenser med Eco RI-restriktionsfragmenterne. I

I Sekvensen på 3831 basepar fra disse overlappende kloner koder for I

I hele aminosyresekvensen af den modne a-underenhed af human faktor I

I 20 XIII, som cirkulerer i blodet. A-underenheden er sammensat af 731 I

I aminosyrer begyndende med en aminoterminal sekvens på Ser-Glu-Thr- I

I Ser. Den aminoterminale sekvens er tidligere angivet af Takagi og I

I

Doolittle (se ovenfor). Den carboxyl terminale Met (nucleotiderne

I 2281-2283) er efterfulgt af en stopcodon (TGA), 1535 basepar ikke- I

I 25 kodende sekvens og et potentielt polyadenyleringssignal eller ! I

I I

processeringssignal på AATAAA. Polyadenyleringssekvensen var loka- | I

I liseret 14 nucleotider opstrøms poly(A)-halen på 10 nucleotider. , I

I Poly(A)-halen var kun til stede i en anden c-DNA-klon, betegnet I

I AHFXIIIa3.82. I

I 30 I

I cDNA-indføjelsen i XHFXIIIa3.77 koder også for 30 aminosyrerester, I

I som tilsyneladende koder for en sekvens i læseramme. Spaltning af I

I bindingen mellem Met og Ser til frembringelse af det modne faktor ; I

I XIII ville kræve en yderligere processeringsprotease (yderligere I

I

35 processen'ngsproteaser) til frembringelse af det modne protein med i I

I 1 I

aminoterminal Ser. Dette ville blive efterfulgt af en acetylerings- I

I I

I reaktion, hvilket fører til dannelsen af en acetyl serin ved den I

I aminoterminåle ende af det modne protein (Takagi og Doolittle, se I

I ovenfor; Nakamura et al., J. Biochem. 78:1247-1266, 1975). I

33 DK 175243 B1

Der blev fundet forskelle i nucleotidsekvensen for a-underenheden af faktor XIII ved tre positioner, når der blev foretaget en sammenligning med cDNA-indføjelserne i områder, hvor overlappende sekvenser var opnået. Nucleotiderne 2038, 2041 og 2727 indeholdt A, C 5 henholdsvis T i XHFXIIIa3.77, medens XHFXIIIa3.82 indeholdt G, G og A i samme positioner. Disse forskelle resulterede i en ændring af to aminosyrer (Ile 650 og Gin 651 til Val og Glu) og kunne repræsentere en polymorfisme som bidrager til mi kroheterogeni teten i a-underenheden af faktor XIII (Board og Coggan, Hum. Genet.

10 59:135-136, 1981).

Eksempel 7

Konstruktion af ekspressionsenheder for faktor XIII a-underenheden 15 A. Konstruktion af pRS202: cDNA'et for faktor XIII a-underenheden (asFXIII) blev modificeret ved in vitro mutagenisering for at erstatte det ikke-kodende 3'-om-20 råde med et Xho I-sted. For at lette håndteringen blev den 3,8 kb lange asFXIII-cDNA-indføjelse indeholdt i fagklon XHFXIIIa3.82 sub-klonet i pUC18. Fagklonen AHFXIIIa3.82 blev fordøjet fuldstændigt med Pst I til isolering af det 2,3 kb lange fragment omfattende asFXIII-cDNA'et. Dette fragment blev ligeret med pUC18, som var 25 blevet lineari seret ved fordøjelse med Pst I. Det fremkomne plasmid pUC18 #9 viste sig at have den 2,3 kb lange indføjelse i den ikke-kodende orientering. asFXIII-cDNA-indføjelsen, som var til stede i pUC18 #9, omfattede 19 bp 5' for translationsstart, det asFXIII-kodende område og 120 bp 3' for translationsstopstedet.

30 asFXIII-cDNA-indføjelsen blev derefter isoleret og subklonet i vektoren pUCl18 (opnået fra J. Vieira og J. Messing, Waksman Institute of Microbiology, Rutgers, Piscataway, N.J.) Den 2,3 kb lange asFXIII-indføjelse blev isoleret fra pUC18 #9 ved fordøjelsen af Pst 35 I, blev subklonet i pUC118 Pst I-stedet og blev transformeret i E. coli stamme JM109. En positiv klon, som indeholdt den 2,3 kb lange asFXIII-indføjelse i den ikke-kodende orientering, blev betegnet PRS201.

I DK 175243 B1 I

I I

I Det 120 bp lange ikke-translaterede 3'-område af asFXIII-cDNA'et I

I blev fjernet, og der blev indført et Xho I-sted 3' for translations- I

I stopcodonen ved stedstyret mutageni sering. Plasmid pRS201 blev I

I transformeret i E. coli stamme MV1193, og der blev isoleret I

I 5 enkeltstrenget template-DNA. Oligonucleotid ZC1113 (tabel 1) blev I

I udformet til fjernelse af det ikke-translaterede 3'-område efter den I

I asFXIII-kodende sekvens og til indføring af et Xho I-sted 3' for I

I translationsstopstedet. Den enkeltstrengede template af pRS201 blev I

I underkastet in vitro mutageni sering ved metoden ifølge Zoller et al. I

I 10 (se ovenfor, 1984), under anvendelse af det mutagene oligonucleotid I

I ZC1113. En positiv klon, som blev bekræftet ved restriktionsanalyse, I

I blev betegnet pRS202. I

I B. Konstruktion af plasmid pRS215: I

I 15 I

I Det 2,2 kb lange asFXIII-cDNA-fragment fra plasmid pRS202 blev an- I

I bragt bag ADH2-4f-promotoren og blev anbragt i pi asmidet pIC7RI*. I

I Plasmidet pTRK4c (eksempel 2) blev fordøjet fuldstændigt med Eco RI I

I og Sal I til isolering af det 4 kb lange fragment, som omfattede I

I 20 ADH2-4f-promotoren og TPIl-terminatoren samt pIC7RI*-vektor- I

I sekvenserne. 01igonucleotiderne ZC1056 og ZC1057 (tabel 1) blev ud- I

I formet til frembringelse af en adaptor med en Eco Ri-klæbrig ende, I

I et Bgl Il-sted og en Pst I-klæbrig ende. Den Eco Ri-klæbrige ende af I

I adaptoren ødelægger ved ligering til en anden Eco Ri-klæbrig ende I

I 25 Eco Ri-stedet. 01igonucleotiderne ZC1056 og ZC1057 blev kinase- I

I behandlet og annelleret til dannelse af Eco Rl-adaptoren. Det 2,2 kb I

I lange Pst Ι-Xho 1-asFXIII-fragment, som var isoleret fra plasmid I

I pRS202, blev sammenføjet med ZC1056/ZC1057-adaptoren og det 4 kb I

I store pTRK4c-fragment i en trevejsi igering. Det fremkomne plasmid I

I 30 blev betegnet pRS215. I

I Eksempel 8 I

I Ekspression af faktor XIII a-underenhed i gær - I

I 35 I

I A. Konstruktion af vektoren pEAS102: I

I Plasmid pEASI02, som omfatter dele af vektorerne YIp5 og pJDB207, I

I blev konstrueret på følgende måde. Plasmidet pJDB207 (Beggs, I

DK 175243 B1 35

Proceedings of Alfred Benzon Symposium 16:383-389, "Molecular Genetics in Yeast", Copenhagen, Denmark, 1981), som er et derivat af pJDB219 (O.D. Beggs, Nature 275:104-108, 1978) blev fordøjet med Bam HI og Pst I til isolering af det 4,4 kb lange fragment, der omfatter 5 leu2-d-genet, 2 micron DNA og pBR322-sekvenser. Plasmid YIp5 (Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:1035-1039, 1979) blev underkastet delvis fordøjelse med Pst I og fuldstændig fordøjelse med Barn HI til isolering af det 4,3 kb lange fragment, som omfattede URA3-genet og pBR322-sekvenser. Disse to fragmenter blev ligeret og 10 det fremkomne plasmid blev betegnet pEAS102.

B. Konstruktion af plasmid pRS217:

Der blev konstrueret en gærekspressionsvektor, som omfattede 15 ADH2-4f-promotoren, et asFXIII-cDNA, TPIl-terminatoren og pEAS102-vektorsekvenser. Plasmidet pRS217 blev konstrueret på følgende måde. Den ekspressionsenhed, som er til stede i pRS215 (eksempel 7) blev anbragt i gærvektoren pEAS102. Plasmidet pEAS102 blev fordøjet fuldstændigt med Hind III efterfulgt af behandling med 20 bakteriel alkalisk phosphatase for at forhindre gendannelse af cirkler. Plasmid pRS215 blev fordøjet med Hind III til isolering af den 3,5 kb lange ekspressionsenhed, som omfattede ADH2-4f-promo-toren, et asFXIII-cDNA og TPIl-terminatoren. Disse to fragmenter blev ligeret til frembringelse af plasmid pRS217.

25 C. Konstruktion af vektoren pRPOT:

Plasmidet pDPOT (eksempel 3) blev modificeret ved indføjelse af en polylinker. Plasmidet pDPOT blev fordøjet med Sph I og Barn HI til 30 isolering af det 10,8 kb lange fragment. Oligonucleotiderne ZC1551 og ZC1552 (tabel 1) blev udformet til frembringelse af en adaptor med en Barn Hi-klæbrig ende og en Sph I-klæbrig ende, som flankerede Sma I-, Sst I- og Xho I-restriktionsstederne. Oligonucleotiderne ZC1551 og ZC1552 blev kinasebehandlet og annelleret til frembrin-35 gelse af Barn HI-Sph I-adaptoren. Det 10,8 kb lange pDPOT-fragment blev cirkel formet ved ligering med ZC1551/ZC1552-adaptoren. Det fremkomne plasmid blev betegnet pRPOT.

I DK 175243 B1 I

I 36 I

I D. Konstruktion af plasmid pJRXIII: I

I I

I Ekspressionsenheden fra plasmidet pRS215, som indeholdt TPIl-pro- I

I motoren, et asFXIII-cDNA og TPIl-terminatoren, blev anbragt | I

I 5 i gær/E. coli-færgevektoren pRPOT. Plasmid pJRXIII, som omfattede I

I ekspressionsenheden fra pRS215 og pRPOT-vektorsekvenser, blev kon- ! I

I strueret på følgende måde. Plasmidet pRS215 blev fordøjet med Xho I I

I til isolering af den 3,5 kb lange ekspressionsenhed. pRS215-eks- I

I pressionsenheden blev ved ligering sammenføjet med pRPOT, som var I

I 10 blevet lineariseret ved fordøjelse med Xho I og efterfølgende be- I

handling med alkalisk kalvephosphatase til forhindring af genlige· I

I ring. Ligeringsblandingen blev transformeret ind i E. coli stamme I

I MC1061 (Dagert og Ehrlich, Gene 6:23-28, 1979). Plasmid DNA, som var I

I isoleret fra transformanterne, blev analyseret ved restriktionsana- I

I 15 lyse. Der blev identificeret en positiv klon, som indeholdt , I

I ekspressionsenheden i samme orientering som POTl-genet, og den blev I

I betegnet pJRXIII. I

E. Konstruktion af pi asmiderne pD15 og pD16: I

I 20 ; I

I Ekspressionsenheden i plasmidet pRS215 blev også indføjet i gær/E. ! I

I coli-færgevektoren pDPOT. Plasmidet pDPOT blev lineariseret ved I

I fordøjelse med Barn HI efterfulgt af behandling med alkalisk kalve- I

I phosphatase til forhindring af gendannelse af cirkler. Plasmidet I

I 25 pRS215 blev fordøjet med Sst I og Pst I til isolering af det 0,65 kb I

I lange fragment, som omfattede en del af ADH2-4£-promotoren og I

I ZC1056/ZC1057-adaptoren. Plasmidet pRS215 blev også fordøjet med Pst I

I I og Bgl II til isolering af det 2,3 kb lange fragment, som omfat- I

I tede asFXIII-cDNA'et og TPIl-terminatoren. Plasmidet p410-4c {ek- I

I 30 sempel 2) blev fordøjet med Barn HI og Sst I til isolering af det I

I 0,55 kb lange fragment, som omfattede en 5'-del af ADH2-4f-pro- I

I motoren. Det 0,55 kb lange Bam HI-Sst I-fragment hidrørende fra I

I p410-4c, det 0,65 kb lange Sst I-Pst I-fragment og det 3,1 kb lange I

I Pst I-Bgl Il-fragment fra pRS215 blev sammenføjet med Bara" HI- I

I 35 lineariseret pDPOT ved en ligering med fire dele. Der blev identi- I

I ficeret to pi asmider, som havde den korrekte indføjelse i modsatte I

I orienteringer. Plasmidet pD15 indeholdt ekspressionsenheden med I

I ADH2-4f-promotoren distal POTl-genet i vektoren. Plasmidet pD16 in- I

I deholdt ekspressionsenheden med ADH2-4f-promotoren proximal I

5 37 DK 175243 B1 P0T1-genet i vektoren.

10 15 20 25 30 35

I DK 175243 B1 I

I 38 I

I F. Transformation af pRS217, pJRXlll 09 pD16 samt ekspression af I

I aktiv faktor XIII i gær: I

I Plasmid pRS217 blev transformeret i Saccharomyces cerevisiae stamme I

I 5 XV794-7-1C (Mata ade2-l leu2-3 leu2-113 ura3 Apep4::TPI1-CAT (cir+) I

I under anvendelse af i alt væsentligt den metode, som er beskrevet af I

I Beggs (Nature 274:104-108, 1978). Transformanter blev udvalgt ved I

I evnen til at vokse på -URADS-piader (tabel 2). I

I 10 Ekspression af faktor XIII a-underenhed fra plasmidet pRS217, som I

I var transformeret ind i stamme XV794-7-1C, blev opnået ved først at I

I dyrke transformanterne natten over i 5 ml -URAD (tabel 2). Natkul- I

I turerne blev inokuleret i 1 liter -URAD og blev dyrket i 48 timer I

I ved 30°C. Kulturerne blev centrifugeret til indhøstning af celle- I

I 15 pel letter, som blev vasket en gang med destilleret vand og opbevaret I

I ved -80°C. I

I PI asmiderne pJRXIII og pD16 blev transformeret i gærværtstammen I

I ZM118 (MATa/MATa (cir°) der er homozygot for Atpil::URA3, I

I 20 pep4::URA3, leu2-3,112, ura3 og barl) og blev udvalgt på syntetisk I

I medium, som manglede tryptophan og som var suppleret med 1 M sor- I

I bitol (-TRPDS-plader, tabel 2). I

I Ekspression af aktiv faktor XIII fra pJRXIII og pD16 transformeret i , I

I 25 stamme ZM118 blev opnået ved først at dyrke transformanterne natten I

I over i 5 ml YEPD (tabel 2). To ml af natkul turen blev inokuleret i ; I

I 200 ml YEPD og blev dyrket ved 30°C med rystning. Kulturerne blev I

I centrifugeret for at høste cellepelletterne, som blev vasket en gang I

I med destilleret vand og opbevaret ved -80°C. I

I 30 I

I Cellepelletterne blev analyseret som beskrevet i eksempel 9. Alle I

I transformanterne viste sig at producere aktiv faktor XIII. En sam- I

I menligning af transformanterne viste imidlertid, at pJRXIII- I

I transformanterne producerede seks gange så meget aktiv faktor-XIII ' I

I 35 som pRS217-transformanterne producerede og pD16-transformanterne > I

I producerede 25 gange mere aktiv faktor XIII end pRS217-transfor- I

I manterne producerede. j I

39 DK 175243 B1

Eksempel 9

Beskrivelse af faktor XIII-analvser 5 A: Fremstilling af cellepelletter: Rålysater blev fremstillet med glaskugler ud fra frosne celle-pelletter. De vaskede cellepelletter blev optøet på is og fortyndet med et ligeså stort volumen phosphatpufferet sal in (PBS; Sigma, St.

10 Louis. Mo.), 1 mM Ø-mercaptoethanol (Sigma). Glaskugler (450-500 μπι) blev tilsat til halvdelen af det totale volumen. Denne blanding blev vortexbehandlet med fuld hastighed i et minut, 3 gange, idet prøverne blev afkølet på is mellem vortexbehandlingerne. Væsken blev fjernet fra reagensglassene med en pasteurpipette og overført til 15 mi crocentrifugeringsrør. Glaskuglerne blev vasket en gang i det oprindelige volumen PBS indeholdende 1 mM /l-mercaptoethanol (BME).

Kuglerne blev vortexbehandlet i et minut, og væsken blev fjernet med en pasteurpipette og blev forenet med det oprindelige lysat.

Lysaterne blev centrifugeret i en Eppendorf-microcentrifuge 20 (Brinkmann, Westbury, N.Y) ved tophastighed i fem minutter.

Supernatanten blev omhyggeligt fjernet til analyse.

B. Analyse af faktor XIII-aktivitet: 25 Faktor XIII-aktivitet blev målt under anvendelse af i alt væsentligt den metode, som er beskrevet af Curtis og Lorand (Methods Enzymol.

45:177-191, 1976). Lysaterne blev analyseret for totalt gærprotein ved metoden beskrevet af Lowry et al. (J. Biol Chem. 193:265-275, 1951). Prøver blev fortyndet til 10 μg/μ^ totalt gærprotein PBS + 1 30 mM BME. Standarder, hvortil der anvendtes kommercielt opnåeligt faktor XIII (tabel 3), blev fortyndet ved trinvis fortynding i 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM dithiothreitol. Fem μΐ prøve eller standard blev tilsat til 35 μΐ 50 mM Tris-HCl pH 7,6 og 1 /il thrombin (tabel 3). Blandingerne fik lov til at inkubere ved 37°C i 30 minutter.

35 Reaktionerne blev undertrykt ved tilsætning af to U Hirudin (Sigma).

Der blev tilsat 60 /il reaktionsblanding (tabel 3) ved 37°C, og ! blandingen blev inkuberet i 30 minutter. Reaktionerne blev standset ved tilsætning af 1 ml 7,5% trichloreddikesyre (TCA). Prøverne blev centrifugeret i en microcentrifuge ved tophastighed i 5 minutter, og

I DK 175243 B1 I

I 40 I

I supernatanterne blev bortkastet. Pelletterne blev vasket to gange I

I med 7,5% TCA. Pelletterne blev derefter opløst i 100 /il iseddikesy- I

I re. Der blev tilsat 5 ml scintillationsblanding (Optifluor, Packard I

I Instruments Co., Downers Grove, 111.), og prøverne blev talt på I

I 5 scinti 1lationstælleren (Beckman, Palo Alto, Calif.). I

I TABEL 3 I

I Thrombin: Frysetørret thrombin (Sigma, St. Louis, Mo.) I

I 10 blev opløst i 50% glycerol, 0,25 M Tris-HCl, pH I

I 7,5 til 1000 U/ml. Denne opløsning opbevares ved I

I -20°C. I

I Kommerciel Faktor XIII (Green Cross, Osaka, Japan) opløst i I

I 15 faktor XIII: 1 ml 50% glycerol, 50 mM Tris-HCl. pH 7,5, 10 mM I

I dithiothreitol (DTT; Sigma, St. Louis, Mo.). I

I Denne opløsning blev opbevaret ved -20°C. I

I Ν,Ν-dimethyl- Ν,Ν-dimethylcasein (Sigma, St. Louis, Ho.) er I

I 20 casein: opløst til 10 mg/ml i 0,5 M Tris-HCl pH 7,5. I

I 3 3 I

H-histamin- 1 mCi H-histamindihydrochlorid (New England I

I dihydrochlorid: Nuclear, Boston Mass.) blev opløst i 4 ml 10 mM I

I ikke-mærket histamindihydrochlorid. Denne opløs- I

I 25 ning blev opbevaret ved -20°C. I

I Reaktionspuffer: 1,4 M NaCl I

I 1,0 M Tris-base I

I 0,1 M CaCl2 I

I 30 0,2 M DTT I

I pH indstillet til 7,5 I

I 3 I

Reaktionsblanding: 2,0 ml H-histamindihydrochlorid I

I 8,0 ml Ν,Ν-dimethylcasein I

I 35 1,8 ml reaktionspuffer I

I Eksempel 10 I

I Kloning af cDNA. som koder for PAP-I I

41 DK 175243 B1

Isolering og karakterisering af det antikoagulerende protein er omtalt af Funakoshi et ål. (Biochem. J. 26:5572-5578, 1987). Et humant placenta cDNA-bibliotek (Clontech) blev undersøgt under anvendelse af affinitetsoprenset antistof mod PAP-I ifølge metoderne beskrevet 5 af Young og Davis (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1194-1198, 1983) samt Foster og Davie (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:4766-4770, c 1984). Der blev opnået 12 positive kloner ud fra 5 x 10 rekom-binanter, og de blev plaqueoprenset. Sekvensanalyse af den største klon (1,5 kb indføjelse) viste, at denne klon indeholdt en sekvens, 10 som koder for PAP-1 i åben læseramme begyndende med rest 38 og strækkende sig ind i det ikke-kodende 3'-område, som indeholder poly(A)-halen. Det oprindelige bibliotek blev derefter genundersøgt under anvendelse af denne klon som en hybridiseringsprobe. Proben blev mærket ved metoden ifølge Maniati s et al. (Proc. Natl. Acad.

15 Sci. USA 72:1184-1188, 1975). Filtrene blev vasket med 2 x SSC- puffer (8,2 g Na-citrat pH 7,0 og 17,5 g NaCl/liter), som indeholdt 0,5% SDS ved 60°C i en time. Der blev derefter opnået 24 kloner, og de blev plaqueoprenset. Positive kloner blev subklonet i M13mpl8 eller M13mpl9 til sekvensanalyse ved dideoxy- S-metoden ifølge 20 Sanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467, 1977). Den største klon (1,7 kb indføjelse) fandtes at kode for et cDNA i næsten fuld længde og inkluderede en initierings-Met-rest ved 5'-enden efterfulgt af hele det modne protein, en stopcodon og et poly-adenyleringssignal. cDNA-sekvensen for PAP-I indeholder ikke en le-25 derpeptidsekvens, hvilket indicerer, at PAP-I sandsynligvis ikke secerneres konstitutivt. Tilstedeværelsen. af Met ved 5'-enden med cDNA-sekvensanalysen og fraværet af dette Met ved proteinsekvens-analysen viste, at Met-resten fjernes ved en post-translationel begivenhed og den nyligt dannede NH2-terminale Ala-rest blokeres ved 30 acetylering.

Eksempel 11

Ekspression af PAP-I i Qær 35

Til ekspression i gær blev PAP-I-cDNA koblet til ADH2-4f-promotoren og TPIl-terminatoren. Denne ekspressionsenhed blev indsat i adskillige gærekspressionsvektorer, og vektorerne blev anvendt til at transformere udvalgte gærstammer.

I DK 175243 B1 I

I 42 I

I PAP-I-cDNA'et blev knyttet til ADH2-4f-promotoren på følgende måde. I

I Plasmid pAPl,7, som indeholder det 1,7 kb lange cDNA i pUC18, blev I

I skåret med Nco I og Barn HI, og det 1 i neari serede plasmid blev i so- I

I leret ved to omgange gel rensning. ADH2-4£-promotoren blev funkti o- I

I 5 nelt koblet til 5'-enden af PAP-I-cDNA'et ved hjælp af en adaptor I

I med følgende struktur: I

I AATTCTACAC I

I GATGTGGTAC I

I 10 I

I Dette blev opnået ved en ligering med tre dele under anvendelse af I

I Nco I-, Barn Hi-skåret vektor, det 1,2 kb lange Barn HI-Eco RI- I

I promotorfragment fra p410-4c (eksempel 2) og adaptoren. Det frem- I

I komne plasmid blev betegnet pPRl. Tilstedeværelsen af den korrekte I

I 15 promotorfusion blev bekræftet ved DNA-sekventering. I

I Der blev konstrueret ekspressionsvektorer. Plasmid pZUC13 (pZUC13 I

I omfatter det kromosomale LEU2-gen fra S. cerevisiae og replikations- I

I startstedet fra S. cerevisiae 2 micron plasmid indsat i pUC13. Det I

I 20 blev konstrueret på lignende måde som pZUC12, der er beskrevet i I

I publiceret europæisk patentansøgning nr. 195.691, under anvendelse I

I af plasmidet pMT212, der er beskrevet i publiceret europæisk I

I patentansøgning nr. 163.529), blev skåret med Sal I og behandlet med I

I kalvetarmphosphatase til forhindring af genligering. Plasmid pPRl I

I 25 blev fordøjet fuldstændigt med Sal I og Bgl II, og den ca. 2,4 kb I

I lange promotor + PAP-I-fragmentet blev udvundet. Gær-TPIl-termina- | I

I torfragmentet blev opnået fra plasmid pFGl (Alber og Kawasaki, J. I

I Mol. Appl. Genet. 1:419-434, 1982). Den omfatter området fra den I

I næstsidste aminosyrecodon i TPIl-genet til Eco Rl-stedet ca. 700 I

I 30 basepar nedstrøms. Der blev indsat et Barn HI-sted i stedet for dette I

I unikke Eco Ri-sted i pFGI ved først at skære plasmidet med Eco RI, I

I derefter gøre enderne stumpe med DNA-polymerase I (Klenow fragment), I

I tilføje syntetiske Bam HI-linkere (CGGATCCA) og genligere til I

I frembringelse af plasmid pl36. TPIl-terminatoren blev derefter I

I 35 udskåret fra pl36 som et Xba Ι-Bam Hi-fragment. Dette fragment blev I

I ligeret i YEpl3 (Broach et al., Gene 8:121, 1979), som var blevet I

I lineariseret med Xba I og Barn Hl. Det fremkomne plasmid er kendt som j I

I p213. Hind Hi-stedet blev derefter fjernet fra TPIl-terminator- I

I området i p213 ved at fordøje plasmidet med Hind III, gøre de \ I

43 DK 175243 B1 fremkomne ender stumpe med DNA-polymerase I (Klenow fragment) og gendanne en cirkel af det lineære molekyle under anvendelse af DNA-ligase. Det fremkomne plasmid blev betegnet p270.

5 Alternativt kan p270 konstrueres ved at fordeje plasmid pM220 (deponeret hos American Type Culture Collection som en E. coli RR1-transformant, deponering nr. 39853) med Xba I og Barn HI, oprense TPIl-terminatorfragmentet (ca. 700 bp) og indføje dette fragment i YEpl3 fordøjet med Xba I og Barn HI.

10 TPIl-terminatoren blev fjernet fra plasmidet p270 som et Xba I-Bam HI-fragment. Dette fragment blev klonet i pUC19 sammen med et andet fragment, som indeholdt TPI 1-promotoren fusioneret til CAT-genet (chloramphenicolacetyltransferasegenet) til opnåelse af et J5 TPI1-terminatorfragment med en Eco RV-ende. Det fremkomne plasmid blev betegnet pCAT (figur 11). TPIl-terminatoren blev derefter skåret fra pCAT som et Eco RV-Bam Hi-fragment og blev klonet i pIC19H (Marsh et al., se ovenfor) som var blevet skåret med de samme enzymer til opnåelse af pTTl. Plasmidet pTTl blev fordøjet med Sal I og 20 Bgl II, og det ca. 800 bp lange TPIl-terminatorfragment blev udvun det. De tre fragmenter (Sal I-skåret pZUC13, Sal I-Bgl II-promotor + PAP-1 og Bgl 11-Sal I-terminator) blev derefter føjet sammen. Der blev opnået to forskellige ekspressionsvektorer med modsatte orienteringer af ekspressionsenheden. Disse vektorer blev betegnet pZl og 25 PZ2.

Ekspressionsenheden fra pZ2 blev indføjet i gær/E. coli-færgevek-toren pDPOT. Plasmid pZ2 blev skåret med Barn HI til isolering af den 3,2 kb lange ekspressionsenhed. Plasmid pDPOT blev lineariseret ved 30 fordøjelse og blev derefter behandlet med alkalisk kalvephosphatase til forhindring af gendannelse af cirkler. Den 3,2 kb lange ekspressionsenhed blev føjet sammen med det 1ineariserede pDPOT-fragment ved ligering. Der blev isoleret to forskellige ekspressionsvektorer med modsatte orienteringer. Disse vektorer blev betegnet pDl og-pD2.

35 Plasmid pD2 indeholdt ekspressionsenheden med transkriptionsretningen væk fra P0T1-genet.

Plasmid pZ2 blev transformeret ind i S. cerevisiae stamme ZA521 (MATa 1eu2-3,112 ura3 pep4::URA3 barl gal2 (c i r°)). Transformanterne

I DK 175243 B1 I

I I

I blev dyrket i 10 ml -LEUD (tabel 1) natten over ved 30°C, og den op- I

I tiske tæthed af kulturerne blev målt ved 600 nm. Cellepelletterne I

I blev resuspenderet i MED A til en optisk tæthed svarende til 8 ved I

I 600 nm. Kulturerne blev inkuberet med omrystning i 28 timer. Plasmid I

I 5 pD2 blev transformeret i S. cerevisiae stamme ZM118. Transforman- I

I terne blev dyrket i YEPD (tabel 2) i 96 timer ved 30°C. I

I Kulturerne blev centrifugeret til pellettering af cellerne, og det I

I brugte medium blev bortkastet. Cellerne blev pelletteret og blev I

I 10 vasket med destilleret vand. De vaskede pel letter blev nedfrosset I

I ved -80°C, før de blev analyseret. I

I Rålysater blev fremstillet med glaskugler ud fra frosne cellepel- I

I leter. De vaskede cel lepel leter blev tøet på is og fortyndet i et I

I 15 ligeså stort volumen phosphatpufferet sal in (PBS). Glaskugler I

I (450-500 μπι) blev tilsat til det halve total volumen. Cellerne blev I

I lyseret ved vortexbehandling af blandingen ved fuld hastighed i et I

I minut, tre gange, idet prøverne blev afkølet på is mellem vortex- I

I behandlingerne. Væsken blev fjernet fra reagensglassene med en I

I 20 pasteurpitette og overført til et microcentrifugeringsrør. Glaskug- I

I lerne blev vasket en gang i det oprindelige volumen PBS. Kuglerne I

I blev vortexbehandl et i et minut, og væsken blev fjernet med en I

I pasteurpipette og føjet sammen med det oprindelige lysat. Lysaterne I

I blev derefter centrifugeret i en Eppendorf microcentrifuge (Brink- I

I 1 I

25 mann, Westbury, N.Y.) ved tophastighed i 5 minutter. Supernatanterne | I

I blev forsigtigt fjernet og analyseret for totalt opløseligt protein I I

I ved metoden beskrevet af Lowry et al. (J. Biol. Chem. 193:265-275, I

I 1951). I

I 30 Lysaterne blev derefter elektroforesebehandlet på polyacrylamid- j I

I geler. Ca. 50 puj totalt opløseligt protein som analyseret ved Lowry- [ I

I metoden (Lowry et al., se ovenfor) blev sat på en 12% polyacrylamid- I

I fl

gel sammen med PAP-1-standarder på 1, 2 eller 5 μ$ oprenset PAP-I. ! I

I Prøven blev underkastet elektroforese og visualiseret ved farvning j I

I 35 med coomasie blå. Ved sammenligning af det gærfrembragte PAP-I og j I

I den rensede PAP-1-standard blev det fundet, at det PAP-1, som j I

I frembringes af pZ2-transformanterne udgjorde ca. 2% af det totale j I

I opløselige protein til sammenligning med pD2-transformanter, som I

I producerede PAP-I ved ca. 20% af det totale opløselige protein. I

DK 175243 B1 45

Oet skal forstås, at skønt der her er beskrevet specifikke udførelsesformer for opfindelsen med det formål at illustrere opfindelsen, kan der foretages forskellige modifikationer uden at afvige fra opfindelsens ånd og rækkevidde. Opfindelsen er følgelig kun begrænset 5 af de tilhørende krav.

i 10 15 20 25 30 35

Claims (14)

1. Ekspressionsvektor, som er i stand til at styre ekspressionen af I I heterologe gener eller cDNA i gær, kendetegnet ved, at I I 5 ekspressionsvektoren indeholder en ADH2-promotor, et heterologt gen I I eller cDNA samt en defekt, selekterbar markør. I I I

2. Ekspressionsvektor ifølge krav 1, kendetegnet ved, at I I ADH2-promotoren er et muteret i sol at af ADH2-promotoren. I I 10 I

3. Ekspressionsvektor ifølge krav 1, kendetegnet ved, at I I ADK2-promotoren er ADH2-4^-promotoren. I

4. Ekspressionsvektor ifølge krav 1, kendetegnet ved, at I I 15 vektoren yderligere omfatter funktionelle, genetiske elementer hid- I I rørende fra en 2 microncirkel fra gær. I I i I I

5. Ekspressionsvektor ifølge krav 4, kendetegnet ved, at j I I elementerne inkluderer et replikationsstartsted samt REP1-, REP2- og j I I 20 REP3-gener. I

6. Ekspressionsvektor ifølge krav 1, kendetegnet ved, at I I vektoren inkluderer hele 2 microncirklen fra gær. I I 25

7. Ekspressionsvektor ifølge krav 1, kendetegnet ved, at I I den defekte, selekterbare markør omfatter Schizosaccharomyces pombe I I POTl-genet, Aspergillus nidulans tpiA-cDNA på funktionsdygtig måde I I koblet til E. coli lacZ-promotoren eller leu2-d-genet. I I 30

8. Ekspressionsvektor ifølge krav 1, kendetegnet ved, at I I den defekte, selekterbare markør omfatter et muteret strukturgen. I

9. Ekspressi onsvektor ifølge krav 1, kendetegnet ved, at I I den defekte, selekterbare markør inkluderer en deletion eller en I I 35 ændring i en promotor, som på funktionsdygtig måde er koblet til I I markøren. I

10. Ekspressionsvektor ifølge krav 1, kendetegnet ved, at I I det heterologe gen eller cDNA koder for α-1-antitrypsin, faktor XIII j I H 47 DK 175243 B1 eller PAP-I.

11. Gærværtscelle med en genetisk defekt, kendetegnet ved, at der i gærværtscellen er blevet indført en ekspressionsvektor 5 ifølge et hvilket som helst af kravene 1-10.

12. Gærværtscelle ifølge krav 11, kendetegnet ved, at ! gærcellen er en stamme af S. cerevisiae.

13. Fremgangsmåde til forøget frembringelse af proteiner i gærværtsceller, kendetegnet ved, | at der i en gærværtscelle, som har en genetisk defekt, indføres en ekspressionsvektor ifølge et hvilket som helst af kravene 1-10, 15 at gærværtscellen dyrkes i et hensigtsmæssigt medium og at det af værtscellen frembragte protein isoleres.

14. Fremgangsmåde til forøget produktion af α-1-antitrypsin i gær værtsceller, kendetegnet ved, at der i en (cir°)-stamme af S. cerevisiae, som er auxotrof for vækst på leucin og som bærer en pep4-mutation indføres en ekspres-25 sionsvektor, som er i stand til at styre ekspressionen af heterologe gener eller cDNA i gær, hvilken ekspressionsvektor inkluderer et replikationsstartsted og REP1-, REP2- og REP3-gener hidrørende fra en 2 microncirkel fra gær, hvilken ekspressionsvektor indeholder en ADH2-4f-promotor, et gen eller cDNA, som koder for a-1-antitrypsin 30 samt en defekt, selekterbar markør bestående af et leu2-d-gen, at gærværtscellerne dyrkes i et hensigtsmæssigt medium, at gærværtscellerne sprænges og 35 at det af gærværtscellerne frembragte a-1-antitrypsin isoleres.