DE3888561T2 - Hohe Proteinsyntheserate in Hefe. - Google Patents
Hohe Proteinsyntheserate in Hefe.Info
- Publication number
- DE3888561T2 DE3888561T2 DE3888561T DE3888561T DE3888561T2 DE 3888561 T2 DE3888561 T2 DE 3888561T2 DE 3888561 T DE3888561 T DE 3888561T DE 3888561 T DE3888561 T DE 3888561T DE 3888561 T2 DE3888561 T2 DE 3888561T2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- yeast
- promoter
- plasmid
- expression vector
- cdna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims abstract description 112
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 title 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 title 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 149
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims abstract description 88
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 85
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 51
- 229940024142 alpha 1-antitrypsin Drugs 0.000 claims abstract description 48
- 102100034044 All-trans-retinol dehydrogenase [NAD(+)] ADH1B Human genes 0.000 claims abstract description 46
- 101710193111 All-trans-retinol dehydrogenase [NAD(+)] ADH4 Proteins 0.000 claims abstract description 46
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 claims abstract description 46
- 102000015395 alpha 1-Antitrypsin Human genes 0.000 claims abstract description 45
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 40
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 33
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 claims abstract description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 86
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 45
- 108010071289 Factor XIII Proteins 0.000 claims description 26
- 229940012444 factor xiii Drugs 0.000 claims description 26
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 claims description 24
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 16
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 13
- 101150014925 POT1 gene Proteins 0.000 claims description 10
- 101100280051 Brucella abortus biovar 1 (strain 9-941) eryH gene Proteins 0.000 claims description 9
- 101100235161 Mycolicibacterium smegmatis (strain ATCC 700084 / mc(2)155) lerI gene Proteins 0.000 claims description 9
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 9
- 101150080369 tpiA gene Proteins 0.000 claims description 9
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 8
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 101710084218 Master replication protein Proteins 0.000 claims description 6
- 101000708578 Milk vetch dwarf virus (isolate N) Para-Rep C3 Proteins 0.000 claims description 6
- 101710112083 Para-Rep C1 Proteins 0.000 claims description 6
- 101710112078 Para-Rep C2 Proteins 0.000 claims description 6
- 102100022881 Rab proteins geranylgeranyltransferase component A 1 Human genes 0.000 claims description 6
- 102100022880 Rab proteins geranylgeranyltransferase component A 2 Human genes 0.000 claims description 6
- 101710119887 Trans-acting factor B Proteins 0.000 claims description 6
- 101710119961 Trans-acting factor C Proteins 0.000 claims description 6
- 230000004075 alteration Effects 0.000 claims description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 5
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 claims description 4
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 claims description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 3
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 claims description 3
- 102100031108 Pyroglutamyl-peptidase 1 Human genes 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 abstract 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 182
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 119
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 89
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 81
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 45
- 101000801742 Homo sapiens Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 35
- 102100033598 Triosephosphate isomerase Human genes 0.000 description 35
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 102100034283 Annexin A5 Human genes 0.000 description 23
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 21
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 19
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 17
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 17
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 17
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 16
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 15
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 14
- 101100232929 Caenorhabditis elegans pat-4 gene Proteins 0.000 description 13
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 13
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 13
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 13
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 13
- 101150050575 URA3 gene Proteins 0.000 description 12
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 12
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 12
- 101100246753 Halobacterium salinarum (strain ATCC 700922 / JCM 11081 / NRC-1) pyrF gene Proteins 0.000 description 11
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 11
- 101100135676 Mus musculus Paxip1 gene Proteins 0.000 description 11
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 11
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 11
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 11
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 11
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 10
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 10
- 101100189378 Caenorhabditis elegans pat-3 gene Proteins 0.000 description 10
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 10
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 9
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 9
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 9
- 101001094044 Mus musculus Solute carrier family 26 member 6 Proteins 0.000 description 9
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 9
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 8
- 101150101567 pat-2 gene Proteins 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 7
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 7
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 7
- 239000002585 base Substances 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101100518972 Caenorhabditis elegans pat-6 gene Proteins 0.000 description 6
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101000823116 Homo sapiens Alpha-1-antitrypsin Proteins 0.000 description 6
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 6
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 6
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 6
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 6
- 101100494726 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) pep-4 gene Proteins 0.000 description 6
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 6
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 6
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 6
- 244000309466 calf Species 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 6
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 101150032817 TPI1 gene Proteins 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 229940005809 human factor xiii Drugs 0.000 description 5
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 108010058643 Fungal Proteins Proteins 0.000 description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 4
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 4
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 4
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 4
- PPZMYIBUHIPZOS-UHFFFAOYSA-N histamine dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.NCCC1=CN=CN1 PPZMYIBUHIPZOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000051631 human SERPINA1 Human genes 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 4
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 3
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150071434 BAR1 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Natural products OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 3
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 3
- 108010001496 Galectin 2 Proteins 0.000 description 3
- 102100021735 Galectin-2 Human genes 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N L-Aspartic acid Natural products OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 description 3
- BVHLGVCQOALMSV-JEDNCBNOSA-N L-lysine hydrochloride Chemical compound Cl.NCCCC[C@H](N)C(O)=O BVHLGVCQOALMSV-JEDNCBNOSA-N 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 3
- 108010049190 N,N-dimethylcasein Proteins 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 108091036407 Polyadenylation Proteins 0.000 description 3
- 241000204893 Saccharomyces douglasii Species 0.000 description 3
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 3
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 3
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 3
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 3
- 239000012458 free base Substances 0.000 description 3
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 3
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 3
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 229960001153 serine Drugs 0.000 description 3
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 description 3
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 3
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KWTQSFXGGICVPE-WCCKRBBISA-N Arginine hydrochloride Chemical compound Cl.OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N KWTQSFXGGICVPE-WCCKRBBISA-N 0.000 description 2
- 101100148606 Caenorhabditis elegans pst-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 2
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 2
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 2
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000019040 Nuclear Antigens Human genes 0.000 description 2
- 108010051791 Nuclear Antigens Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 102000011755 Phosphoglycerate Kinase Human genes 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- 101001099217 Thermotoga maritima (strain ATCC 43589 / DSM 3109 / JCM 10099 / NBRC 100826 / MSB8) Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 2
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 2
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L disodium;(4-nitrophenyl) phosphate;hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].[O-][N+](=O)C1=CC=C(OP([O-])([O-])=O)C=C1 KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000000779 smoke Substances 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N (4r,7s,10s,13s,16r)-16-acetamido-13-(1h-imidazol-5-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15-tetraoxo-7-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14-tetrazacycloheptadecane-4-carboxamide Chemical compound N1C(=O)[C@@H](NC(C)=O)CSSC[C@@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CC1=CN=CN1 FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N 0.000 description 1
- SNBCLPGEMZEWLU-QXFUBDJGSA-N 2-chloro-n-[[(2r,3s,5r)-3-hydroxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl]acetamide Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CNC(=O)CCl)[C@@H](O)C1 SNBCLPGEMZEWLU-QXFUBDJGSA-N 0.000 description 1
- KINMYBBFQRSVLL-UHFFFAOYSA-N 4-(4-phenoxybutoxy)furo[3,2-g]chromen-7-one Chemical compound C1=2C=COC=2C=C2OC(=O)C=CC2=C1OCCCCOC1=CC=CC=C1 KINMYBBFQRSVLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150078509 ADH2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101800001401 Activation peptide Proteins 0.000 description 1
- 102400000069 Activation peptide Human genes 0.000 description 1
- 102100034035 Alcohol dehydrogenase 1A Human genes 0.000 description 1
- 102100022712 Alpha-1-antitrypsin Human genes 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000000412 Annexin Human genes 0.000 description 1
- 108050008874 Annexin Proteins 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 108010076804 DNA Restriction Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010014561 Emphysema Diseases 0.000 description 1
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 101000892220 Geobacillus thermodenitrificans (strain NG80-2) Long-chain-alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 description 1
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000780443 Homo sapiens Alcohol dehydrogenase 1A Proteins 0.000 description 1
- 101001010513 Homo sapiens Leukocyte elastase inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 101000579123 Homo sapiens Phosphoglycerate kinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001104199 Homo sapiens Retinitis pigmentosa 9 protein Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 1
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 101001104198 Mus musculus Retinitis pigmentosa 9 protein homolog Proteins 0.000 description 1
- JJIHLJJYMXLCOY-BYPYZUCNSA-N N-acetyl-L-serine Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O JJIHLJJYMXLCOY-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- KJWZYMMLVHIVSU-IYCNHOCDSA-N PGK1 Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@@H]1[C@@H](CCCCCCC(O)=O)C(=O)CC1=O KJWZYMMLVHIVSU-IYCNHOCDSA-N 0.000 description 1
- 241001504519 Papio ursinus Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 102100028251 Phosphoglycerate kinase 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 101710167911 Repressible acid phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102100040073 Retinitis pigmentosa 9 protein Human genes 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 235000003534 Saccharomyces carlsbergensis Nutrition 0.000 description 1
- 241001123227 Saccharomyces pastorianus Species 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 108010016828 adenylyl sulfate-ammonia adenylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 208000006682 alpha 1-Antitrypsin Deficiency Diseases 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 239000002506 anticoagulant protein Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003241 endoproteolytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000317 environmental toxin Toxicity 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 description 1
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 description 1
- 229960000645 histamine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 230000014726 immortalization of host cell Effects 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 239000013618 particulate matter Substances 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 230000027086 plasmid maintenance Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000022983 regulation of cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000009711 regulatory function Effects 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 235000017550 sodium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/104—Aminoacyltransferases (2.3.2)
- C12N9/1044—Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase (2.3.2.13), i.e. transglutaminase or factor XIII
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4721—Lipocortins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- C07K14/8121—Serpins
- C07K14/8125—Alpha-1-antitrypsin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Mycology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, zur gesteigerten Produktion von Proteinen in Hefe-Wirtszellen im allgemeinen und insbesondere ein verbessertes Verfahren zur erhöhten Produktion von α-1-Antitrypsin und anderen Proteinen.
- Gegenwärtige Technologie auf dem Gebiet der Gentechnologie hat die Expression fremder Gene in Hefe erleichtert. Die Produktion von eukaryontischen (z. B. Säugetier-) Genprodukten in Hefe hat Vorteile gegenüber der Produktion unter Verwendung von Säugetier- oder Bakterien-Zellkultur. Einer der Hauptnachteile in der Verwendung von Bakterien als einem Wirt zur Produktion heterologer Proteine ist die Produktion von Endotoxinen, die vollständig entfernt werden müssen, bevor das Produkt als eine pharmazeutische Substanz verwendet werden kann. Es hat sich gezeigt, daß heterologe Proteine, die in Bakterien produziert werden, niedrige Löslichkeit besitzen, ein Problem, das, sofern es nicht überwunden wird, ihre Verwendung als Pharmazeutika stark einschränkt. Außerdem ist die Verwendung von Säugetierzellen zur Expression eines Proteinproduktes auf kommerziellen Niveaus sehr viel teurer. Im Gegensatz dazu ist die Fermentation von Hefe in kommerziellem Maßstab gut eingeführt, was die Produktion großer Mengen heterologer Proteinprodukte ermöglicht. Hefe ist ein eukaryontischer Organismus, der größere Ähnlichkeit mit Säugetierzellen teilt, als dies Bakterien tun.
- Kürzlich aufgetretene Bedenken wegen der Verwendung von aus menschlichen Körperflüssigkeiten gewonnenen Produkten und die Schwierigkeit und Kosten, die die Reinigung solcher Proteine mit sich bringt, haben für zu Interesse an der Produktion rekombinanter Proteine in Hefe geführt. Ein Beispiel eines Proteins, das in Hefe exprimiert worden ist, ist α-1- Antitrypsin (AAT) (Kawasaki, U.S.-Patent Nr. 4,599, 311 und Kawasaki et al., U.S.-Patent Nr. 4,711,848).
- Der Proteaseinhibitor AAT, auch bekannt als α-1- Proteaseinhibitor, ist ein Bestandteil von Säugetierblut, der als ein Inhibitor von proteolytischen Enzymen, wie etwa Serinproteasen, wirkt. In Säugetieren ist die hauptsächliche physiologische Funktion von α-1-Antitrypsin die Inhibition von Elastase, einer potenten Protease, die Strukturproteine hydrolysiert. Elastase wirkt so, daß sie den Abbau inhalierter teilchenförmiger Materie in den Lungen unterstützt. Es wird die Hypothese vertreten, daß die inhibitorische Aktivität, die von α-1-Antitrypsin gezeigt wird, ein defensiver, selbstregulierender Mechanismus ist, der die Körpergewebe vor Angriff durch Elastase und durch andere proteolytische Enzyme schützt, die während einer entzündlichen Reaktion freigesetzt werden.
- Genetische Mängel, die zu verringerten Gehalten an α-1- Antitrypsin führen, sind beim Menschen identifiziert worden. Genetische Varianten, bezeichnet als Z und S, sind mutante Allele, die verringerte Gehalte an α-1-Antitrypsin in einzelnen Menschen produzieren, die Kombinationen dieser Allele tragen (z. B. SS, SZ). Diese genetischen Mängel können begleitet sein von degenerativen Lungenerkrankungen und in einigen Fällen von Lebererkrankung. Die niedrigen Gehalte an α-1-Antitrypsin-Aktivität in Zusammenhang mit den mutanten Allelen können weiter verringert werden durch die inaktivierende Oxidation von α-1-Antitrypsin durch Umweltgifte, einschließlich Tabakrauch. Es ist auch postuliert worden, daß Emphyseme bei Rauchern, die homozygot für das normale Allel sind, das Ergebnis von durch Rauch induzierter Oxidation von normalem α-1-Antitrypsin ist.
- Substitutionstherapie ist erfolgreich eingesetzt worden, um Patienten mit α-1-Antitrypsin-Mangel zu behandeln (Gadek et al., J. Clin. Invest. 68 : 1158-1165, 1981). Das verabreichte α- 1-Antitrypsin, konzentriert aus gepooltem, menschlichen hepatitis-freien Donorplasma, baute Anti-Elastase-Aktivität in Alveolen-Strukturen auf und verursachte keine ungünstigen Nebenwirkungen.
- Die Expression von α-1-Antitrypsin und anderen heterologen Proteinen in Hefe hat im allgemeinen zu Expressionsniveaus im Bereich von etwa 1% bis 5% vom Gesamtprotein geführt. Im Gegensatz dazu können Hefeproteine, die von Genen kodiert werden, die auf Mehrfachkopien-Plasmiden vorliegen, in so hohen Gehalten wie 50% bis 80% vom exprimierten Gesamtprotein produziert werden (Mellor et al., Gene 33 : 215-226, 1985). Es sieht daher so aus, daß Expressionsniveaus von heterologen DNA-Sequenzen in Hefe zumindest teilweise durch die Natur der heterologen Sequenz selbst und durch die Turnover-Rate des kodierten Proteins reguliert werden können (Mellor et al., aaO). Mellor et al. haben vorgeschlagen, daß fremde Proteine in Hefe instabil sind und daß steady-state-Gehalte an heterologer mRNA relativ niedrig sind. Andererseits haben Kramer et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 : 367-370, 1984) und Kniskern et al. (Gene Gene 46 : 135-141, 1986) gezeigt, daß steady-state-Gehalte an heterologer mRNA relativ zur Menge an exprimiertem heterologen Protein relativ hoch sind und daß im Fall von Hepatitis-B-Kernantigen, das heterologe Protein stabiler ist als Hefeproteine.
- Andere Faktoren können ebenfalls die Hefe-Expressionsniveaus von heterologen Genen beeinflussen, aber die Manipulation dieser Faktoren hat die Expressionsniveaus heterologer Proteine allgemein nicht über etwa 5% Gesamtproteinexpression angehoben. Sogar wenn diese Faktoren optimiert werden, nähern sich die Expressionsniveaus von fremden Proteinen nicht den Niveaus, die mit klonierten Hefegenen erhalten werden.
- Mehrere Beispiele von Expression auf niedrigem Niveau von fremden Proteinen in Hefe sind in der Literatur aufgetaucht. Alpha-Interferon zum Beispiel ist von vielen Forschern unter Verwendung einer Vielzahl von Promotoren in Hefe exprimiert worden. Mellor et al. (aaO), Tuite et al. (EMBO J. 1 : 603-608, 1982) und Hitzeman et al. (Science 219 : 620-625, 1983) verwendeten den Promotor des Gens von Hefe-Phosphoglycerat- Kinase (PGKI), um Alpha-Interferon auf Niveaus zwischen 1% und 3% vom Gesamtzellprotein zu produzieren. In jedem Falle wurde die PGK1-Promoter-Alpha-Interferon-Expressionseinheit in Vektoren verwendet, die vom Hefe-2-Mikron-Plasmid abgeleitet waren. Der konstitutive Promotor aus dem Hefe-ADHI-Gen wurde von Hitzeman et al. verwendet (Nature A12 : 717-722, 1981) ,um Alpha-Interferon zu exprimieren, im Hefevektor YRp7. Diese Konstruktionen lieferten Alpha-Interferon bei 0,4% vom Gesamtzellprotein. Bitter und Egan (Gene 32 : 263-274, 1983) verwendeten den Promotor des Gens von Glyceraldehyd-3- phosphat-Dehydrogenase (GAP491, auch bekannt als GPD), um Alpha-Interferon zu exprimieren, in von Hefe-2-Mikron-Plasmid abgeleiteten Vektoren. Diese Konstrukte lieferten Alpha- Interferon bei ungefähr 1% Gesamtzellprotein. Kramer et al.
- (Proc. Natl. Acad. Scj. USA 81 : 367-370, 1984) verwendeten den Promotor des Gens der reprimierbaren sauren Phosphatase von Hefe (PHO5), um Alpha-Interferon zu exprimieren, auf einem vom Hefe-2-Mikron-Plasmid abgeleiteten Vektor. Bei Induktion lieferte diese Konstruktion Alpha-Interferon bei Niveaus von 0,2% vom Gesamtzellprotein.
- Andere Proteine, die in Hefe bei mit Alpha-Interferon vergleichbaren Niveaus exprimiert worden sind, sind Hepatitis- B-Oberflächenantigen (HBS) und menschliches α-1-Antitrypsin (AAT). Bitter und Egan (aaO) haben den GAP491-Promotor verwendet, um HBS bei Niveaus bis zu 4% vom Gesamtzellprotein zu exprimieren. Unter Verwendung des PHO5-Promotors wurden soviel wie 3,4 ug HBS pro ml Hefe-mid-log-Phasenkultur (1,5 · 10&sup7; Zellen/ml) erhalten (Niyanohara et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 : 1-5, 1983). Wenn man annimmt, daß 1010 Zellen etwa 120 mg Gesamtprotein enthalten (Robert A. Smith, persönliche Mitteilung), kann eine Ausbeute von etwa 2% HBS berechnet werden. Valenzuela et al. (Nature 298 : 347-350, 1982) berichteten, daß HBS-Expression unter Verwendung des ADH1- Promotors zu Expressionsniveaus führt, die ungefähr zwei Größenordnungen niedriger waren als diejenigen, die von Miyanohara et al. (aaO) berichtet worden waren.
- Die Expression von AAT hat ähnlich niedrige Expressionsniveaus ergeben. Der TPI1-Promotor wurde verwendet, um AAT-Niveaus von ungefähr 0,9% vom Gesamtzellprotein zu produzieren (Kawasaki, U.S.-Patent Nr. 4,599,311, 1986). Ein Plasmid mit hoher Kopienzahl ist verwendet worden um AAT-Niveaus von 4% bis 6% vom Gesamtzellprotein zu erhalten (Kawasaki und Bell, EP 171, 142, veröffentlicht 1986). Andere Forscher haben AAT- Expressionsniveaus von 1,2% (Cabezon, EP 151,102, 1985) und 1% Rosenberg et al., Nature 312 : 77-80, 1984) erzielt.
- Es gibt bestimmte Ausnahmen zu diesen Beispielen für niedrige Expression von heterologen Proteinen in Hefe. Diese schließen Superoxid-Dismutase (SOD) und Hepatitis-B-Kernantigen (HBcAg) ein. Hallowell und Mullenbach (WO85/01503, 1985) haben die Verwendung des GAP491-Promotors zur Produktion von SOD bei einem berichteten Niveau von 14,8% Gesamtzellprotein offenbart. Kniskern et al. (Gene 46 : 135-141, 1986) haben ebenfalls den GAP491-Promotor verwendet, um Hepatitis-B- Kernantigen bei 40% Gesamtzellprotein zu produzieren. Kniskern et al. (aaO) bemerken, daß das hohe Niveau von HBcAg zusammenhängen könnte mit der ungewöhnlichen Stabilität des heterologen Proteins, das Aggregate in der Zelle bildet und das Protein vor endoproteolytischem Angriff schützen könnte. Cousens et al. (EP 196,056) offenbaren ein Verfahren zur Erhöhung von Expressionsniveaus von heterologen Proteinen durch Herstellung von Fusionsproteinen, die anschließend invitro gespalten werden können.
- Zusammenfassend gesagt, werden heterologe Proteine im allgemeinen in Hefe auf niedrigen Niveaus produziert (weniger als 5% vom Gesamtzellprotein). Obgleich die Gründe für dieses Phänomen nicht gut verstanden sind, ist postuliert worden, daß die Natur der fremden Proteine selbst und/oder niedrige Gehalte an fremden mRNAs Expressionsniveaus begrenzen. HBcAg, eine bemerkenswerte Ausnahme, scheint ein ungewöhnliches Protein zu sein, dessen Struktur sein Produktionsniveau erhöht. Diese Ausnahme verleiht der Hypothese, daß Expressionsniveaus proteinabhängig sind, weitere Stütze.
- Folglich besteht in der Technik ein Bedürfnis nach einem Verfahren zur Steigerung der Produktion von heterologen Proteinen, wie etwa α-1-Antitrypsin, in Hefe-Wirtszellen. Die vorliegende Erfindung befriedigt dieses Bedürfnis und stellt außerdem andere verwandte Vorteile bereit.
- Kurz gesagt offenbart die vorliegende Erfindung einen Expressionsvektor, der in der Lage ist, die Expression von heterologen Genen oder heterologe cDNA in Hefe zu steuern, wobei der Expressionsvektor einen ADH2-Promotor, ein heterologes Gen oder eine heterologe cDNA und einen unvollkommenen selektionierbaren Marker enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform kodiert das heterologe Gen oder die heterologe cDNA α-1-Antitrypsin,
- Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung offenbart eine Hefe-Wirtszelle mit einem genetischen Defekt, in die ein Expressionsvektor eingeführt worden ist, der in der Lage ist, die Expression von heterologen Genen oder cDNAs in Hefe zu steuern, wobei der Expressionsvektor einen ADH2-Promotor, ein heterologes Gen oder eine heterologe cDNA und einen unvollkommenen selektionierbaren Marker enthält, wobei der Marker den genetischen Defekt in der Hefe-Wirtszelle komplementiert.
- Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur gesteigerten Produktion von Proteinen in Hefe-Wirtszellen zur Verfügung. Das Verfahren schließt ein (a) Einführen eines Expressionsvektors, der in der Lage ist, die Expression von heterologen Genen oder heterologe cDNA in Hefe zu steuern. In eine Hefe-Wirtszelle mit einem genetischen Defekt, wobei der Expressionsvektor einen ADH2-Promotor, ein heterologes Gen oder eine heterologe cDNA und einen unvollkommenen selektionierbaren Marker enthält, wobei der unvollkommene selektionierbare Marker den genetischen Defekt von der Hefe- Wirtszelle komplementiert; (b) Züchten der Hefe-Wirtszelle in einem geeigneten Medium; und (c) Isolieren des in der Wirtszelle produzierten Proteins.
- In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Hefe-Wirtszelle ein [cir&sup0;]-Stamm von S. cerevisiae, der für Wachstum auf Leucinauxotroph ist und eine pep4-Mutation trägt, die zu verringerter Aktivität von mehreren Vakuleren-Proteasen führt; kodiert das heterologe Gen α-1-Antitrypsin; und schließt der Expressionsvektor einen Replikationsursprung, REP1-, REP2- und REP3-Gene, abgeleitet von einem Hefe-2- Mikron-Kreis, einen ADH2-4-C-Promotor und einen unvollkommenen selektionierbaren Marker, dem aus dem leu2-d-Gen besteht, ein. In einer besonderen Ausführungsform wird das α-1-Antitrypsin im wesentlichen im Cytoplasma der Wirtszelle zurückgehalten und die Hefe-Wirtszelle wird vor dem Isolieren des von den Hefezellen produzierten α-1-Antitrypsins aufgebrochen.
- Andere Aspekte der Erfindung werden bei Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung und die beigefügten Zeichnungen deutlich werden.
- Fig. 1 veranschaulicht das Subklonieren einer cDNA-Sequenz, die α-1-Antitrypsin kodiert.
- Fig. 2 veranschaulicht die Konstruktion von Plasmid pAT-1.
- Fig. 3 veranschaulicht die Konstruktion eines Plasmids, das den ADH2-4C-Promotor umfaßt, verknüpft mit dem ersten Aminosäurecodon der cDNA-Sequenz von reifem α-1-Antitrypsin.
- Fig. 4 veranschaulicht die Konstruktion von Plasmiden, die ADH2-Promotor-Sequenzen umfassen.
- Fig. 5 veranschaulicht die Konstruktion des α-1-Antitrypsin- Expressionsvektors pAT-3.
- Fig. 6 veranschaulicht die Konstruktion der Expressionsvektoren pAT-4 und pAT-6.
- Bevor die Erfindung dargelegt wird, könnte es zu einem Verständnis derselben hilfreich sein, Definitionen bestimmter Ausdrücke, die im weiteren verwendet werden sollen, anzugeben.
- Ein Gen oder eine cDNA, das (die) bei einer niedrigen spezifischen Aktivität exprimiert wird und auf einem Plasmid verwendet wird, um Selektion von Zellen zu ermöglichen, die mit dem Plasmid transformiert sind. Solch ein Gen kann auf Grund von Deletionen, Mutationen und Alterationen einer Promotor-Region mit einer niedrigen Rate exprimiert werden. Ein Beispiel für solch ein Gen ist das leu2-d-Gen, das von Beggs isoliert worden ist (Nature 275 : 104-108, 1978). Die niedrige Expressionsrate kann auch bewirkt werden durch die Verwendung eines heterologen Promotors, um die Expression des selektionierbaren Markers anzutreiben. Ein Beispiel für diesen Typ von selektionierbarem Marker ist der E. coli-lacZ- Promotor, der verwendet wird, um die Aspergillus nidulanstpiA-cDNA in der Hefe S. cerevisiae zu exprimieren (hierin beschrieben). Alternativ kann ein heterologes Gen verwendet werden, in dem die Expressionsrate aufgrund geänderter Transkriptionsstellen niedrig ist, wie in dem Fall des Schizosaccharomyces pombe-POT1-Gens (P.R. Russell, Gene 40 : 125-130, 1985). Der unvollkommene selektionierbare Marker kann auch ein Protein mit einer niedrigen spezifischen Aktivität kodieren. Dieses Gen kann ein geändertes homologes Gen sein, das ein Protein mit einer verringerten spezifischen Aktivität kodiert. Alternativ kann ein heterologes Gen verwendet werden, das einen Defekt im Wirt nur schwach komplementiert.
- Eine Veränderung in einem spezifischen Gen in einer Wirtszelle, die von einer Punktmutation, Deletion oder Disruption herrührt und zur Mendelschen Spaltung des Defekts in der Nachkommenschaft einer Kreuzung führt. Solch ein Mangel kann z. B. zu einer auxotrophen Bedingung im Hinblick auf spezifische Nährstoffe führen. Ein Beispiel dieser Art von Veränderung ist leu2-3.112-Mutation in S. cerevisiae, die dazu führt, daß bei diesen Mutanten im Wachstumsmedium Leucin erforderlich ist. Alternativ kann die Veränderung zur Unfähigkeit eines Organismus, der die Veränderung enthält, führen, eine spezifische Kohlenstoffquelle zu verwerten. Solch ein Beispiel ist die tpi1-Mutation in S. cerevisiae, die verhindert, daß Mutanten auf Medien wachsen, die Glucose als die einzige Kohlenstoffquelle enthalten. Genetische Defekte können im allgemeinen durch plasmidgetragene selektionierbare Marker komplementiert werden.
- Ein natürlich auftretender Hefe-Plasmidkreis, der in der Lage ist, sich über die Zellzyklussteuerung der Replikation hinwegzusetzen, um bis zu 60-100 Kopien pro haploidem Genom zu erreichen und zu halten. Der 2-Mikron- Plasmidkreis kann sich durch autokatalysierte intramolekulare Rekombination zwischen zwei unterschiedlichen Formen ineinander umwandeln. Das Plasmid enthält seinen eigenen Replikationsursprung und mit REP1, REP2 und REP3 bezeichnete Gene, die bei der Erhaltung und Replikation des Plasmids beteiligt sind. Replikation und Rekombination des 2-Mikron- Kreises sind diskutiert bei Broach und Hicks (Cell 21 : 501-508, 1980).
- Hefestämme, die das 2-Mikron-Plasmid nicht enthalten.
- Eine DNA-Sequenz, die sich vom Wildtyp-Allel unterscheidet. Solch ein Unterschied kann zu einem veränderten Phänotyp einer Zelle, die die mutante Sequenz trägt, führen. Zum Beispiel wird der Wildtyp-ADH2-Promotor von S. cerevisiae in Zellen, die auf Glucose als der Kohlenstoffquelle wachsen, stark reprimiert und wird in Zellen, die auf Ethanol wachsen, dereprimiert. Mehrere mutante Isolate, bezeichnet als ADH2C oder ADR3C, sind beschrieben worden, die veränderte Aktivität unter Derepressionsbedingungen zeigen. Wie hierin verwendet schließt der Begriff "mutantes Isolat des ADH2-Promotors" diese besonderen Isolate ein, ist aber nicht hierauf beschränkt. Der Begriff "ADH2-Promotor" wird sowohl den Wildtyp-Promotor als auch mutante Isolate desselben einschließen. Diese Promotoren werden wenigstens die Regulator, RNA-Polymerase-Bindungs- und Transkriptionsinitiations-Funktionen des Wildtyp-Promotors umfassen.
- Wie oben angegeben, haben mehrere Forscher Expressionen auf niedrigem Niveau von einer Vielzahl von heterologen Proteinen in Hefe erreicht. Ein solches Protein, α-1-Antitrypsin (AAT), ist bisher nur bei Niveaus von etwa 1% bis 6% exprimiert worden. Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung der Erfinder, daß ein Hefe-ADH2-Promotor, wenn er zusammen mit einem unvollkommenen selektionierbaren Marker verwendet wird, in der Lage ist, hohe Expressionsniveaus von heterologen Genen oder heterologer cDNA in Hefe-Wirtszellen zu steuern. Die in der vorliegenden Erfindung offenbarten Expressionsvektoren sind stabil und sind in der Lage zu autonomer Replikation zu hoher Kopienzahl in Hefe-Wirtszellen. Der Einschluß eines regulierten ADH2-Promotors ermöglicht, daß die Hefe-Wirtszellen unter Bedingungen, die die Transkription der heterologen mRNA reprimieren, zu hoher Dichte wachsen. Wenn erst einmal eine vorbestimmte Zelldichte erreicht worden ist, kann die Expression des fremden Gens oder der fremden cDNA dann dereprimiert oder "ein" geschaltet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform liefert das hierin offenbarte Hefe-Expressionssystem AAT-Expressionsniveaus, die bis zu 30% oder mehr vom Gesamtzellprotein darstellen.
- In Anbetracht der Tatsache, daß wenige heterologe Proteine in Hefe bei größeren Niveaus als etwa 5% vom Gesamtprotein exprimiert worden sind und daß Expressionsniveaus durch die Natur des heterologen Proteins oder der heterologen mRNA begrenzt waren, wäre es nicht zu erwarten gewesen, daß die Verwendung eines ADH2-Promotors in Kombination mit einem unvollkommenen selektionierbaren Marker Expressionsniveaus um wenigstens das 5- bis 6-fache erhöhen wurde.
- Wie oben angegeben, offenbart die vorliegende Erfindung einen Expressionsvektor, der einen ADH2-Promotor, ein heterologes Gen oder eine heterologe cDNA und einen unvollkommenen selektionierbaren Marker enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform schließt der Expressionsvektor DNA-Sequenzen des endogenen Hefe-2-Mikron-Plasmids ein. Ein besonders bevorzugter Expressionsvektor schließt den Replikationsursprung des zirkulären 2-Mikron-Plasmids und die REP1-, REP2- und REP3-Gene von 2-Mikron ein. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform enthält der Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung einen Transkriptionsterminator. Ein besonders bevorzugter Transkriptionsterminator ist abgeleitet vom TPI1-Gen.
- Bevorzugte ADH2-Promotoren schließen die ADH2C-Promotoren ein (Ciriacy, Mutat. Res. 29 : 315-326, 1975; Ciriacy, Molec. Gen. Genet. 145 : 327-333, 1976; Ciriacy, Molec. Gen. Genet. 176 : 427- 431, 1979; Williamson und Young, Cell 23 : 605-614,1981). Ein besonders bevorzugter ADH2C-Promotor ist der ADH2-4C-Promotor. Wie zuvor angegeben, enthält der ADH2-Promotor Sequenzen, die für die Transkriptionsregulation, RNA-Polymerasebindung und Transkriptionsinitiation verantwortlich sind. Im Wildtyp-ADH2- Promotor hängt die Regulatorfunktion mit der Dyad-Symmetrieregion zusammen, die sich von etwa Nucleotid -292 bis etwa Nucleotid -271 erstreckt; die RNA-Polymerasebindung hängt zusammen mit der TATA-Box um Nucleotid -160; und die Transkriptionsinitation tritt in der Region von ungefähr -60 bis -50 auf.
- Ein unvollkommener selektionierbarer Marker, wie er hierin verwendet wird, ermöglicht nur Komplementation auf niedrigem Niveau für einen genetischen Defekt in einem Hefe-Wirtsstamm. Das niedrige Komplementationsniveau seinerseits liefert einen kompensierenden Anstieg in der Kopienzahl des Expressionsvektors, eine Voraussetzung für das Wachstum der Wirtszelle unter selektiven Bedingungen (Erhart und Hollenberg, J. Bacteriol. 156 : 625, 1983). In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt der unvollkommene selektionierbare Marker ein Gen oder eine cDNA, das (die) ein Protein kodiert, das aufgrund der Verwendung eines heterologen Promotors oder aufgrund geänderter Transkriptionsstartstellen bei einem niedrigen Niveau exprimiert wird. Die Aspergillus nidulans-tpiA-cDNA bzw. das Schizosaccharomyces pombe-POT1-Gen sind in dieser Hinsicht besonders bevorzugt. In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform schließt der unvollkommene selektionierbare Marker eine Deletion oder Alteration in einem mit dem Marker operativ verknüpften Promotor ein. Ein besonders bevorzugter unvollkommener selektionierbarer Marker in dieser Hinsicht ist das leu2-d-Gen.
- Es wird den Fachleuten auf diesem Gebiet klar sein, daß, zusätzlich zu einem heterologen Gen oder einer heterologen cDNA, das (die) α-1-Antitrypsin kodiert, eine Vielzahl anderer heterologer Gene oder cDNAs in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden kann.
- Ein Beispiel für ein Protein, das bei hohem Niveaus in Hefe exprimiert werden kann, ist der Gerinnungsfaktor, Faktor XIII. Faktor XIII ist ein Bestandteil des Blutgerinnungssystems, der, wenn er durch Thrombin aktiviert wird, in den letzten Stufen der Blutgerinnung wirkt, um Fibrinpolymere quer zu vernetzen, um das Fibringerinnsel zu stabilisieren und zu verstärken. Faktor XIII, der aus einem Tetramer aus zwei a- Untereinheiten und zwei b-Untereinheiten besteht, ist als zwei cDNAs kloniert worden, wobei eine die a-Untereinheit kodiert und die andere die b-Untereinheit kodiert (Ichinose et al., Biochem. J. 25 : 6900-6906, 1986 bzw. Ichinose et al., Biochem. J. 25 : 4633-4638, 1986). Die a-Untereinheit-cDNA ist in Hefe exprimiert worden (wie beschrieben in der ebenfalls anhängigen, gemeinsam übertragenen U.S.-Patentanmeldung Serial No. 909,512, die hierin durch Bezugnahme in ihrer Gänze miteinbezogen ist) unter Verwendung einer Expressionseinheit, angetrieben von einem ADH2-Promotor und inseriert in die hierin beschriebenen Expressionsvektoren. Transformation der Expressionsvektoren in den geeigneten Hefestamm hat belegt, daß die Expressionsvektoren der Erfindung bis zu 25mal mehr Faktor XIII-Aktivität liefern als ein Expressionsvektor, der den herkömmlichen selektionierbaren Marker URA3 verwendet.
- Ein anderes Beispiel für ein Protein, das in Hefe exprimiert werden kann, ist das gerinnungshemmende PAP-I (Funakoshi et al., Biochem. J. 26 : 5572-5578, 1987). PAP-I ist ein Protein, das vorläufig in die Familie der Lipocortine eingruppiert worden ist und die Fähigkeit zeigt, sich an Phospholipid zu binden. Eine cDNA ist kloniert worden, die das PAP-I-Protein kodiert (beschrieben in den ebenfalls anhängigen U.S.- Patentanmeldungen Serial Nos. 011, 782 und 059, 355, die hierin durch Bezugnahme in ihrer Gänze miteinbezogen sind). Diese cDNA ist in einem Expressionsvektor verwendet worden, der hierin beschrieben ist, und ist in einen geeigneten Hefestamm transformiert worden, um PAP-I zu produzieren. In einer bevorzugten Ausführungsform produziert das hierin offenbarte Hefe-Expressionssystem PAP-I-Expressionsniveaus, die 10mal höher sind als die Niveaus, die unter Verwendung eines Expressionsvektors gefunden werden, der den herkömmlichen selektionierbaren Marker LEU2 verwendet.
- Die Expressionsvektoren der vorliegenden Erfindung können in eine Hefe-Wirtszelle eingeführt werden, die einen oder mehrere genetische Defekte besitzt, wobei der (die) unvollkommene(n) selektionierbare(n) Marker des Expressionsvektors den (die) genetische(n) Defekt(e) in der Hefe-Wirtszelle komplementiert (komplementieren). Geeignete Wirtsstämme können von Hinterlegungsstellen, wie etwa der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, und dem Yeast Genetic Stock Center, Berkeley, Kalifornien, erhalten werden oder können unter Verwendung von Standard-Mutagenesetechniken hergestellt werden. Verfahren zur Einführung eines Expressionsvektors in eine Hefe-Wirtszelle sind in der Literatur gut bekannt (z. B. Beggs, aaO, 1978, und Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA A7 : 1929-1933, 1978). Geeignete Wirtszellen in dieser Hinsicht schließen Stämme von Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces douglasii und Saccharomyces carlsbergenis ein, wobei [cir&sup0;]-Stämme besonders bevorzugt sind. Andere Hefe- Spezies, von denen bekannt ist, daß sie endogenes 2-Mikron- Plasmid tragen, können in einen [cir&sup0;]-Zustand gebracht werden (z. B. durch das Verfahren von Dobson et al., Curr. Genet. 2 : 210-215, 1980). Saccharomyces douglasii ist eine heterothallische Hefe, die ursprünglich von Donald C. Hawthorne isoliert wurde. S. douglasii-Stamm 4770-1A ist erfolgreich mit dem Vektor YEp13 transformiert worden, was zeigt, daß der Stamm endogenes 2-Mikron-Plasmid enthält, das in der Lage ist, die Replikationsfunktionen, die dem YEp13- Vektor fehlen, zu komplementieren. Saccharomyces carlsbergensis ist eine andere Spezies, von der bekannt ist, daß sie endogenes 2-Mikron-Plasmid trägt. Stämme von S.
- carlsbergensis sind von Guerineu et al., (Biochem. Biophys. Res. Commun. 61 : 462, 1974) und Livingston (Genetics 86 : 73, 1977) isoliert und untersucht worden. In einer bevorzugten Ausführungsform trägt der Hefe-Wirtsstamm eine pep4-Mutation, die zu verringerter Aktivität mehrerer Vakuleren-Proteasen führt, die ansonsten ein im Wirtsstamm produziertes heterologes Protein abbauen könnten.
- Transformierte Hefe-Wirtszellen werden durch Selektionieren auf Komplementation des genetischen Defektes durch den auf dem Plasmid vorhandenen selektionierbaren Marker erhalten. Die selektionierten Hefe-Wirtszellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet. Im allgemeinen werden die Zellen über Nacht im selektivem Medium, daß Glucose enthält, gezüchtet, dann zu ethanolhaltigem Medium gewechselt, um die Fremdgen- oder -cDNA-Expression zu dereprimieren. Alternativ werden die Zellen in selektiven Medium, das Glucose enthält, gezüchtet, und man läßt die Zellen die Glucose aufbrauchen, was dann die Derepression der Fremdgen- oder -cDNA-Expression bewirken wird. Das exprimierte heterologe Protein, das von den transformierten Wirtszellen produziert wird, wird dann gemäß herkömmlichen Verfahren isoliert.
- Verfahren zur Reinigung von heterologen Proteinen, die in transformierten Hefezellen produziert werden, sind allgemein in der Technik bekannt. Wo das Protein in der Wirtszelle zurückgehalten wird, wird es notwendig sein, die Zelle zunächst aufzubrechen und Zelltrümmer zu entfernen, vorzugsweise durch Zentrifugation, um ein geklärtes Lysat herzustellen. Im Fall eines sekretierten Proteins wird das Protein direkt aus dem Kulturmedium gereinigt. Das geklärte Lysat oder Medium wird dann mit herkömmlichen Proteinreinigungsverfahren fraktioniert. Ein mehrstufiges Verfahren wird im allgemeinen verwendet werden. Typische Verfahren in dieser Hinsicht schließen Ausfällung (z. B. mit Polyethylenglykol oder Amoniumsulfat), Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie, präparative Gelelektrophorese, Hochleistungsflüssigkeitschromatographie und Schnelldruckflüssigkeitschromatographie ein. In vielen Fällen ist es vorzuziehen, die interessierenden Fraktionen zwischen den Schritten zu konzentrieren, wie etwa durch Ammoniumsulfatausfällung, gefolgt von Dialyse, um überschüssiges Salz zu entfernen. Die Auswahl und Ordnung der verschiedenen Schritte wird von den Charakteristika des bestimmten interessierenden Proteins abhängen und liegt innerhalb des Könnens des Durchschnittsfachmannes auf diesem Gebiet.
- In einer typischen Herstellung werden Hefe-Wirtszellen, die ein heterologes Protein, wie etwa AAT, produzieren, durch Zentrifugation geerntet und in einem geeigneten Puffer, wie etwa phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), erneut suspendiert. Die Zellen werden aufgebrochen, vorzugsweise durch Verwirbelung mit Glasperlen. Es ist auch vorzuziehen, unerwünschte Proteine aus der Aufschlämmung aus aufgebrochenen Zellen und Glasperlen zu entfernen, wie etwa durch Ausfällung mit 15% Polyethylenglykol MW1000 (PEG-1000). Die Mischung wird dann zentrifugiert, um Glasperlen und nicht-löslich gemachtes Zellmaterial zu entfernen. Um die Reinigung zu überwachen, kann der Überstand unter Verwendung von Standardverfahren, wie etwa dem Verfahren von Lowry et al. (J. Biol. Chem. 193 : 265- 275, 1951), auf Proteingehalt und durch beispielsweise Gelelektrophorese oder Aktivitätstest auf das interessierende Protein untersucht werden. Der Überstand wird dann auf eine Ionenaustauschsäule aufgebracht, wie etwa eine DEAE-Sephacel Fast Flow (Pharmacia, äquilibriert mit 50mM Tris, pH 6,5). Protein wird durch schrittweises Aufbringen von Puffer, der variierende Konzentrationen von NaCl enthält, eluiert. AAT eluiert typischerweise bei 0, 2 M NaCl. Fraktionen, die AAT enthalten, werden dialysiert (z. B. in 50 mM Tris pH 8). Das dialysierte Material wird dann auf eine Ionenaustauschsäule aufgebracht, vorzugsweise Pharmacia Mono-Q, auf einem Fast- Schnelldruckflüssigkeitschromatographiegerät (FPLC, Pharmacia, Piscataway, N.J.). Fraktionen werden gesammelt und können durch Polyacrylamidgelelektrophorese sichtbar gemacht werden.
- Das Protein kann weiter durch Poolen der Peak-Fraktionen aus FPLC und Ausfällen des Proteins mit 70% Ammoniumsulfat gereinigt werden. Der Niederschlag wird durch Zentrifugation geerntet und vorzugsweise in 0,2 M Natriumphosphat-Puffer, pH 7,2, erneut suspendiert. Der erneut aufgelöste Niederschlag wird dann unter Verwendung von Flüssigkeitschromatographie nach Größe getrennt. Gesammelte Fraktionen können durch Polyacrylamidgelelektrophorese sichtbar gemacht werden. Peak- Fraktionen werden gepoolt und bei -80ºC eingefroren.
- AAT-Ausbeuten können unter Verwendung eines enzymverknüpften Immunsorbenstests (ELISA) vom "Sandwich-Typ" unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers zu AAT und eines gegen menschliches AAT erzeugten Kaninchen-Antiserums, das affinitätsgereinigt und an Biotin gekoppelt worden ist, untersucht werden. Der monoklonale anti-AAT-Antikörper wird typischerweise aufgebracht auf Standard-Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen. Nach Absorption des anti-AAT-Antikörpers werden die Platten mit Puffer, der Rinderserumalbumin enthält, blockiert. Nachdem der Blockierungspuffer entfernt ist, werden AAT-Proben zu den Platten dreifach zugegeben. Eine Reihe gereinigter AAT-Standards (> 95% rein, bestimmt mit Elektrophorese) werden ebenfalls auf jeder Platte mit 96 Vertiefungen miteinbezogen. Nach Inkubation und Waschung wird das Nachweis-Antikörper-Biotin-Konjugat zur Platte zugegeben und nach einer weiteren Inkubation und Waschung wird Avidinalkalische Phosphatase-Konjugat zugegeben. Die Platten werden dann inkubiert, gewaschen und alkalisches Phosphatasesubstrat wird zugegeben. Farbentwicklung wird bei 405 nm zum Beispiel auf einem ELISA-Plattenablesegerät Titertek 310 C überwacht.
- Die biologische Aktivität des AATs kann unter Ausnutzung der Fähigkeit von nativem AAT, Elastase zu binden, bestimmt werden. In einem bevorzugten Test werden Proben, die AAT enthalten, mit Elastase in einem Verhältnis von 1 ug Elastase zu 4 ug AAT vermischt. Diese Mischungen werden auf Eis inkubiert, bevor sie in einem siedenden Wasserbad erhitzt werden. Die Proben läßt man auf einem 10% Acrylamidgel laufen und überführt sie auf Nitrocellulose unter Verwendung der Western-Transfertechnik (Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 : 4350, 1979). Gereinigtes Kaninchen-anti-AAT, Ziegenanti-Kaninchen, konjugiert an Meerrettich-Peroxidase, und Farbentwicklungsreagenz BioRad HRP werden verwendet, um die AAT-Proben sichtbar zu machen. Proben, die aktives AAT enthalten, werden einen Komplex mit Elastase bilden und langsamer durch das Acrylamidgel wandern.
- Sequenzanalyse des N-Terminus des von den transformierten Hefezellen produzierten rekombinanten Proteins kann verwendet werden, um das Protein weiter zu charakterisieren. Aminoterminale Sequenzierung kann unter Verwendung des Verfahrens durchgeführt werden, das von Edman (Acta. Chem. Scand. 4 : 283-293, 1950) beschrieben ist. Vor der Sequenzierung wird das Protein in Ammoniumbicarbonat dialysiert und lyophilisiert, um Salze zu entfernen.
- Wie den Fachleuten auf diesem Gebiet klar sein wird, können andere Proteine mit ähnlichen Verfahren gereinigt werden, unter Verwendung von Antikörpern, Tests- und Fraktionierungsbedingungen, die für das bestimmte interessierende Protein geeignet sind.
- Um die Beispiele, die folgen, zusammenzufassen, beschreibt Beispiel 1 das Klonieren einer cDNA-Sequenz, die menschliches α-1-Antitrypsin kodiert. Beispiel 2 beschreibt das Subklonieren und die Modifikation von ADH2-Promotorsequenzen. Beispiel 3 beschreibt die Konstruktion der Vektoren pAT-2, pAT-3, pAT-4 und pAT-6, die die Expression von α-1-Antitrypsin in transformierten Hefezellen steuern. Beispiel 4 beschreibt die Transformation von Hefezellen mit Plasmiden, die in Beispiel 3 beschrieben sind; Die Transformanten werden in geeigneten Medien kultiviert und produzieren hohe Gehalte an α-1-Antitrypsin. Beispiel 5 beschreibt Verfahren zur Untersuchung der Produktion von α-1-Antitrypsin durch transformierte Hefezellen. Beispiel 6 beschreibt das Klonieren einer cDNA, die die a-Untereinheit von menschlichem Faktor XIII kodiert. Beispiel 7 beschreibt die Konstruktion von Expressionseinheiten für die a-Untereinheit von Faktor XIII. Beispiel 8 beschreibt die Konstruktion von Expressionsvektoren, die die Expressionseinheiten verwenden, die in Beispiel 7 beschrieben sind, und die Expression von der a-Untereinheit von Faktor XIII in Hefe. Beispiel 9 beschreibt ein Verfahren zur Untersuchung von Faktor XIII-Aktivität. Beispiel 10 beschreibt das Klonieren der cDNA, die PAP-I kodiert. Beispiel 11 beschreibt die Expression von PAP-I in Hefe.
- Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung und nicht zur Beschränkung angeboten.
- Enzyme, einschließlich Restriktionsenzyme, DNA-Polymerase (Klenow-Fragment), BAL-31, T&sub4;-DNA-Ligase, T&sub4;-Polynucleotid- Kinase, bakterielle alkalische Phosphatase und alkalische Phosphatase vom Kalb wurden erhalten vom New-England Biolabs (Beverly, Mass.), Bethesda Research Laboratories (Gaithesburg, Md.) und Boerhinger-Mannheim Biochemicals (Indianapolis, Ind.) und wurden verwendet, wie vom Hersteller angegeben oder in Maniatis et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982) beschrieben. Oligonucleotide wurden auf einem DNA-Synthesizer Model 380-A von Applied Biosystems (Foster City, Kalif.) synthetisiert und mit Polyacrylamidgelelektrophorese gereinigt. Eine cDNA-Bibliothek aus menschlicher Plazenta wurde von Clontech Lab., Inc. (Palo Alto, Kalif.) erhalten.
- Eine cDNA, die für die vorherrschende Form von menschlichem α- 1-Antitrypsin (AAT) kodiert, wurde aus einer cDNA-Bibliothek einer menschlichen Leber mit herkömmlichen Verfahren unter Verwendung der Baboon-Sequenz (Kurachi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 : 6826-6830, 1980; und Chandra et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 103 : 751-758, 1981) als eine DNA- Hybridisierungssonde isoliert. Die Bibliothek wurde konstruiert, indem cDNA aus menschlicher Leber in die Pst I- Stelle des Plasmids pBR322 (Bolivar et al., Gene 2 : 95-113, 1977) inseriert wurde. Die AAT-cDNA wurde aus der Bibliothek als ein 1500 Basenpaare (bp) langes Pst 1-Fragment isoliert. Dieses Fragment wurde in die Pst 1-Stelle von pUc13 inseriert, um das Plasmid pUCa1 herzustellen. In pUCα1 wird die AAT- Sequenz auf dem 3'Ende von Xba I- und Eco RI-Stellen im Polylinker flankiert. Diese cDNA-Sequenz wurde verwendet, um das Plasmid pFATPOT zu konstruieren, dargestellt in Fig. 1. Plasmid pFATPOT ist bei der ATCC als ein Transformant des Saccharomyces cerevisiae-Stammes E18 hinterlegt worden, Zugangsnummer 20699.
- Die AAT-cDNA wurde dann mit dem TPI1-Terminator im Plasmid pMVR1 verknüpft. Dieses Plasmid umfaßt außerdem den TPI1- Promotor und wurde in der folgenden Art und Weise zusammengebaut. Plasmid pIC7 (Marsh et al., Gene 32 : 481-486, 1984) wurde mit Eco RI verdaut, die Fragmentenden wurden mit DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) stumpfendig gemacht und die lineare DNA wurde unter Verwendung von T&sub4;-DNA-Ligase rezirkularisiert. Das resultierende Plasmid wurde verwendet, um E coli-Stamm RR1 zu transformieren. Plasmid-DNA wurde aus den Transformanten hergestellt und wurde auf den Verlust der Eco RI-Stelle gescreent. Ein Plasmid mit dem richtigen Restriktionsmuster wurde mit pIC7RI* bezeichnet. Das TPI1- Promotorfragment wurde als Plasmid pTPIC10 (Alber and Kawasaki, aaO) erhalten, wie in Fig. 1 dargestellt. Dieses Plasmid wurde an der einzigen Kpn 1-Stelle im TPI1-Gen geschnitten, die TPI1-Kodierungsregion wurde mit BAl31- Exonuclease entfernt und ein kinasierter Eco RI-Linker (Sequenz: GGAATTCC) wurde zum 3'-Ende des Promotors hinzugefügt. Verdauung mit Bgl II und Eco RI lieferte ein TPI1-Promotorfragment mit kohäsiven Bgl II- und Eco RI-Enden. Dieses Fragment wurde dann an Plasmid YRp7' (Stinchcomb et al., Nature 282 : 39-43, 1979) gebunden, das mit Bgl II und Eco RI geschnitten worden war. Das resultierende Plasmid, TE32, wurde mit Eco RI und Bam HI geschnitten, um einen Teil des Tetracyclin-Resistenzgens zu entfernen. Das linearisierte Plasmid wurde dann durch die Zugabe eines kinasierten, anelierten Eco RI-Bam HI-Adaptors (5'' AAT TCA TGG AG 3' und 5' CAT CCT CCA TG 3') rezirkularisiert, um Plasmid TEA32 herzustellen. Plasmid TEA32 wurde mit Bgl II und Eco RI verdaut und das 900 bp lange TPI1-Promotorfragment wurde gelgereinigt. Plasmid pIC19H wurde mit Bgl II und Eco RI geschnitten und das Vektorfragment wurde gelgereinigt. Das TPI1-Promotorfragment wurde dann an den linearisierten pIC19H ligiert und die Mischung wurde verwendet, um E. coli-Stamm RR1 zu transformieren. Plasmid-DNA wurde hergestellt und auf das Vorhandensein eines 900 bp Bgl II-Eco RI-Fragmentes gescreent. Ein richtiges Plasmid wurde selektioniert und mit pICTPIP bezeichnet. Plasmid pIC7RI* wurde mit Hind III und Nar I verdaut und das 2500 bp lange Fragment wurde gelgereinigt. Ein ungefähr 900 bp langes Fragment, das einen partiellen TPI1-Promotor und pIC19H-Vektorsequenzen umfaßt, wurde unter Verwendung von Nar I und Sph I aus pICTPIP entfernt und wurde gelgereinigt. Plasmid pFATPOT wurde mit Sph I und Hind III verdaut und das 1750 bp lange Fragment, das einen Teil des TPI1-Promotors, eine AAT-cDNA und den TPI1-Terminator umfaßte, wurde gelgereinigt. Das pIC7RI*-Fragment, das TPI1- Promotorfragment und das TPI1-Promotor-AAT-TPI1-Terminator- Fragment aus pFATPOT wurden dann in einer Dreifach-Ligation kombiniert, um pMVR1 herzustellen (Fig. 1).
- Ein ADH2-4C-Promotor wurde durch Hinzufügen einer Eco RI-Stelle zum 3'Ende des Wildtyp-ADH2-Promotors und Kombinieren des 3'- Teiles dieses modifizierten Promotors mit dem 5'-Teil des ADH2-4C-Promotors aufgebaut. Das 2,2 kb lange Bam HI-Fragment, das das Wildtyp-ADH2-Strukturgen und 5'-flankierende Sequenzen aus pBR322-ADR2-RSa (Williamson et al., aaO) enthielt, wurde mit M13mp19 ligiert, der mit Bam HI linearisiert worden war. Die Orientierung des Inserts wurde durch Restriktionsanalyse bestimmt. Ortsspezifische in-vitro-Mutagenese (Zoller et al., DNA 3: 479-488, 1984) wurde auf dem ADH2-Insert in M13mp19 unter Verwendung von ZC237 (Tabelle 1) als dem Mutageneseprimer und ZC87 (Tabelle 1) als dem zweiten Primer durchgeführt. In positiven Klonen wurde der strukturelle Teil des ADH2-Gens von dem Oligonucleotid ZC237 ausgeloopt, wobei die 5'-flankierende Sequenz, einschließlich des Translationsstartsignals, mit der Eco RI-Stelle des M13mp19- Stelle-Polylinkers verknüpft wurde. Replikativform-DNA der mutagenisierten Phage wurde hergestellt und mit Bam HI und Eco RI geschnitten, um das 1,2 kb lange Promotorfragment zu isolieren. Dieses Fragment wurde in pUC13 ligiert, das mit Bam HI und Eco RI linearisiert worden war, um Plasmid p237-Wt zu erzeugen. Um den p237-Wt-Promotor zum mutanten "promotor-up"- ADH2-4C-Promotor zu verändern, wurde ein 1,1 kb langes Bam HI- Sph I-Fragment aus YRp7-ADR3-4C (Russell et al., Nature 304: 652-654, 1983), das die Alterationen enthielt, von denen herausgefunden worden war, daß sie die Promotorfunktion beinflussen, in das Vektorfragment von p237-Wt subkloniert, das mit Bam HI und Sph I geschnitten worden war. Das resultierende Plasmid wurde als p237-4C bezeichnet (Fig. 2). TABELLE 1
- Der ADH2-Promotor wurde dann mit dem Codon für die erste Aminosäure der reifen Form von AAT im Plasmid pAT-1 verknüpft (Fig. 2). Plasmid pAT-1 umfaßt die Expressionseinheit des ADH2-Promotors aus p237-Wt, verknüpft mit der α-1-AntitrypsincDNA-TPI1-Terminator-Sequenz aus dem Plasmid pMVR1. Diese Sequenzen wurden in einem Teil des Vektors pCPOT inseriert. (Plasmid pCPOT ist hinterlegt worden bei der ATCC als Transformant von E coli-Stamm HB101 und hat die Zugangsnummer 39685 erhalten. Es umfaßt die gesamte 2-Mikron-Plasmid-DNA, das leu2-d-Gen, pBR322-Sequenzen und das Schizosaccharomyces pombe-POT1-Gen). Plasmid pCPOT wurde mit Bam HI und Sal I geschnitten, um das ungefähr 10 kb lange lineare Vektorfragment zu isolieren. pMVR1 (Beispiel 1) wurde mit Eco RI und Xho I geschnitten, um das 1,5 kb lange α-1-AntitrypsincDNA-TPI1-Terminator-Fragment zu isolieren. Das 1,2 kb lange ADH2-Promotor-Fragment wurde aus p237-Wt als ein Bam HI-Eco RI-Fragment isoliert und wurde mit dem 1,5 kb langen α-1- Antitrypsin-cDNA-TPI1-Terminatorfragment und dem linearisierten pCPOT in einer dreiteiligen Ligation verknüpft, um ein mit pAT-1 bezeichnetes Plasmid zu liefern.
- Plasmid pAT-1 enthielt drei zusätzliche Aminosäurecodons zwischen dem ADH2-Translationsstartcodon und dem ersten Aminosäurecodon für die reife Form von AAT. Diese drei Codons wurden durch ortsgerichtete in-vitro-Mutagenese (Zoller et al., aaO) entfernt. Plasmid pAT-1 wurde mit Sph I und Bam HI geschnitten, um das 190 bp lange ADH2-Promotorfragment zu isolieren. Dieses Fragment wurde in M13mp18 ligiert, das mit Bam HI und Sph I linearisiert worden war. Die resultierende Konstruktion wurde in-vitro-Mutagenese unter Verwendung von ZC411 (Tabelle 1) als dem Mutageneseprimer und ZC87 als zweiten Primer unterworfen, um das ADH2- Translationsstartsignal an den ersten Codon von reifem α-1- Antitrypsin zu binden. Positive Klone wurden durch die Didesoxy-sequenzierung von -170 bp vom ATG bis zum Fusionspunkt bestätigt. Zur Erleichterung der Handhabung wurde das 175 bp lange mutagenisierte Sph I-Eco RI-Promotorfragment in mit Sph I und Eco RI linearisiertes pUC19 ligiert. Das resultierende Plasmid, das die am weitesten 3'-gelegenen 170 bp des ADH2-Promotors und den ADH2-Translationsstart gebunden an die erste Aminosäure der reifen Form von AAT in Vektor pUC 19 umfaßte, wurde mit p411 (Fig. 3) bezeichnet.
- Um den vollständigen ADH2-4C-Promotor, gebunden an die erste Aminosäure von reifem AAT, zu erzeugen, wurde die am weitesten 5'-gelegene Sequenz des ADH2-4C-Promotors, die die Alterationen enthält, von denen Russell et al. (aaO) herausgefunden hatten, daß sie die Promotorfunktion beeinflussen, zu dem in Plasmid p411 vorhandenen Promotorfragment hinzugefügt (Fig. 3). Plasmid p411 wurde mit Sph I und Eco RI verdaut, um das 175 bp lange Promotorfragment zu isolieren. Plasmid p237-4C wurde mit Eco RI und Sph I geschnitten, um das 3,71 kb lange Fragment zu isolieren, das die Vektorsequenzen und die am weitesten 5'- gelegene Promotorsequenz umfaßt, die den "Promotor-up"- Phänotyp verleiht. Das 175 bp lange Promotorfragment aus p411 wurde in das p237-4C-Vectorfragment ligiert. Das resultierende Plasmid, das den vollständigen ADH2-4C-Promotor, gebunden an den ersten Aminosäurecodon der reifen AAT-Sequenz, enthielt, wurde mit p237-4CM bezeichnet.
- Der ADH2-Promotor aus Plasmid pAT-1 wurde modifiziert, um einen "universellen" Promotor zu schaffen, indem die ADH2- Translationsstartstelle und die pUC18-Polylinkersequenzen, die in pAT-1 zu finden sind, entfernt werden (Fig. 4). Plasmid pAT-1 wurde mit Sph I und Bam HI geschnitten, um das 190 bp lange Teil-ADH2-Promotor-Fragment zu isolieren. Dieses Fragment wurde in M13mp18 ligiert, das mit Bam HI und Sph I linearisiert worden war. Die resultierende Konstruktion wurde einer in-vitro-Mutagenese (Zoller et al., aaO) unterzogen, unter Verwendung von ZC410 (Tabelle l) als dem Mutageneseprimer und ZC87 als dem zweiten Primer. Die Mutagenese unter Verwendung von ZC410 ersetzt das ADH2- Translationsstartsignal und die pUC18-Polylinkersequenzen durch eine einzelne Eco RI-Stelle, gebunden an den N13mp18- Polylinker an der Sma I-Stelle. Positive Klone wurden durch Didesoxy-Sequenzierung durch den Fusionspunkt bestätigt. Zur Erleichterung der Handhabung wurde das mutagenisierte Teil- ADH2-Promotorfragment als ein 175 bp langes Sph I-Eco RI- Fragment in pUC19 subkloniert, das mit Sph I und Eco I linearisiert worden war. Das resultierende Plasmid, bezeichnet mit p410ES, enthielt die am weitesten 3'-gelegenen 175 bp des ADH2-Promotors. Der Wildtyp-ADH2-Promotor wurde unter Verwendung des Teil-ADH2-Promotorfragment aus p410ES regeneriert. Plasmid p410ES wurde mit Sph I und Eco RI verdaut, um das 175 bp lange Teil-ADH2-Promotorfragments zu isolieren. Dieses Fragment wurde mit einem 1 kb langen Bam HI- Sph I-Fragment, abgeleitet aus pBR322-ADR2-BSa, in einer dreiteiligen Digation in pUC13 ligiert, das durch Verdauung mit Bam HI und Eco RI linearisiert worden war. Das 1 kb lange Fragment, abgeleitet aus pBR322-ADR2-BSa, enthielt Sequenzen, die homolog mit der Wildtyp-ADH2-Promotorsequenz sind. Das Plasmid, das aus der dreiteiligen Ligation resultierte, wurde durch Restriktionsanalyse bestätigt und mit p410-Wt bezeichnet.
- Ein universeller ADH2-4C-Promotor wurde unter Verwendung des mutagenisierten Promotorfragments aus Plasmid p410ES erzeugt (Fig. 4). Das 1,1 kb lange Fragment, das Sequenzen enthielt, von denen bekannt ist, daß sie den ADH2C-Promotor-Phänomen verleihen, wurde aus Plasmid p237-4 genommen. Plasmid p237-4C wurde mit Bam HI und Sph I geschnitten, um das 1,1 kb lange ADH2-4C-Promotorfragment zu isolieren. Der ADH2-4C-Promotor wurde in einer 3-Weg-Ligation rekonstruiert, die das Bam HI- Sph I-Promotorfragment aus p237-4C, das mutagenisierte Sph I- Eco RI-Promotorfragment aus p410ES und pUC13, das mit Bam HI und Eco RI linearisiert worden war, verknüpfte. Das resultierende Plasmid, das durch Restriktionsanalyse bestätigt wurde, enthielt den vollständigen ADH2-4C-Promotor, mutagenisiert am 3'-Ende, um eine Eco RI-Stelle an die Stelle des Translationsstartcodons zu setzen. Das Plasmid wurde mit p410-4C bezeichnet.
- Der "universelle" Promotor aus Plasmid p40-4C wurde verwendet, um den TPI1-Promotor, der in Plasmid pMVR1 (Beispiel 1) vorliegt, zu ersetzen. Plasmid p410-4C wurde mit Bam HI und Eco RI geschnitten, um das 1,2 kb lange ADH2-4C-Promotorfragment zu isolieren. Plasmid pMVR1 wurde vollständig mit Eco RI und teilweise mit Bgl II verdaut, um das 4,2 kb lange AAT-TPI1- Terminator-Vektorfragment zu isolieren. Diese zwei Fragmente wurden ligiert, um das mit pTRK4c bezeichnete Plasmid zu bilden.
- Der Expressionsvektor pAT-2, der den ADH2-4C-Promotor, eine AAT-cDNA und den TPI1-Terminator umfaßt, wurde wie folgt zusammengebaut (Fig. 5). Plasmid pCPOT wurde vollständig mit Bam HI und Sal I verdaut, um das POT1-Gen zu entfernen. Das 10 kb lange lineare Vektorfragment wurde isoliert. Das Promotorfragment wurde aus Plasmid p237-4C genommen. Plasmid p237-4C wurde mit Bam HI und Eco RI geschnitten, um das 1,2 kb lange ADH2-4C-Promotorfragment zu isolieren, das den vollständigen Promotor mit einer Eco RI-Stelle 3' zum Translationsstartcodon enthielt. Das AAT-cDNA-TPI1-Terminator- Fragment wurde als ein 1,5 kb langes Eco RI-Xho 1-Fragment aus Plasmid pMVR1 isoliert. Diese drei Fragmente wurden in einer dreiteiligen Ligation verknüpft und in E. coli-Stamm RR1 transformiert. Die resultierenden Plasmide wurden durch Restriktionsanalyse analysiert. Das richtige Plasmid, bezeichnet mit pAT-2, umfaßt den ADH2-4C-Promotor, die AAT-cDNA und den TPI1-Terminator im Vektor pCPOT.
- Die Expressionseinheit in Plasmid pAT-2 kodiert drei zusätzliche Aminosäuren zwischen dem ADH2-Translationsstart und der ersten Aminosäure der reifen Form von AAT. Diese drei Aminosäuren wurden entfernt, indem der ADH2-4C-CPromotor, der in Plasmid pAT-2 vorliegt, durch den ADH2-4C-Promotor aus Plasmid p237-4CM ersetzt wurde (Fig. 5). Plasmid pAT-2 wurde mit Bam HI geschnitten, um das 12,4 kb lange Vektorfragment zu isolieren, das die α-1-Antitrypsin-cDNA, den TPI1-Terminator und den Vektor pCPOT umfaßte. Dieses Fragment wurde mit alkalischer Phosphatase vom Kalb behandelt, um Rezirkularisierung bei Ligation zu verhindern. Plasmid p237-4CM wurde mit Bam HI verdaut, um das 1,2 kb lange Fragment zu isolieren, das den ADH2-4C-Promotor umfaßte, gebunden an das ATC und den ersten Codon der AAT-cDNA. Dieses Fragment wurde in das linearisierte Fragment aus pAT-2 ligiert. Die Orientierung des ADH2-4C-Promotors wurde durch Restriktionsanalyse bestimmt und das Plasmid mit dem Promotor in der richtigen Orientierung wurde mit pAT-3 bezeichnet. Plasmid pAT-3, umfassend den ADH2-4C-Promotor, direkt gebunden an die AAT-cDNA, den TPI1-Terminator und den Vektor pCPOT, nutzt das leu2-d-Selektionssystem, um eine hohe Plasmid- Kopienzahl zu erreichen, wenn es in geeignete Stämme von S. cerevisiae transformiert wird. S. cerevisiae-Stamm ZN103, der transformiert ist mit pAT-3, (Transformant bezeichnet mit ZM110) ist bei der American Type Culture Collection hinterlegt worden.
- Die ADH2-4C-Promotor-AAT-cDNA-Expressionseinheit wurde in den Vektor pTIP eingebracht, um Plasmid pAT-4 zu erzeugen (Fig. 6). Der Vektor pTIP umfaßt die A. nidulans-tpiA-cDNA (Mc Knight et al., Cell 46: 143-147, 1986), gebunden an den E. coli-lacZ-Promotor, der die tpi1-Mutation in S. cerevisiae komplementieren kann. Er enthält auch den selektionierbaren leu2-d-Marker. Die A. nidulans-tpiA-cDNA wurde in pUC19 subkloniert (McKnight et al., aaO) und wurde erneut isoliert als ein 1,2 kb langes Bam HI-Teil-Sst 1-Fragment. Dieses Fragment wurde in pIC19R ligiert, das durch Verdauung mit Sst I und Bgl II linearisiert worden ist. Das resultierende Plasmid, pM144, wurde mit Eco RV linearisiert und an kinasierte Bam HI-Linker ligiert. Das lineare Fragment wurde dann mit Sal I und Bam HI geschnitten, um überschüssige Linker zu entfernen und die 1,2 kb lange tpiA-cDNA zu isolieren. Dieses Fragment wurde mit pIC19R ligiert, das durch Verdauung mit Sal I und Bam HI linearisiert worden war. Das resultierende Plasmid, pM147, war die Quelle für die tpiA- cDNA, die in pTIP verwendet ist. Plasmid pM147 wurde mit Sal I und Bam HI geschnitten, um die 1,2 kb lange tpiA-cDNA zu isolieren. Plasmid pCPOT wurde verändert, indem das 750bp lange Sph I-Bam HI-Fragment, das 2-Mikron- und pBR322- Sequenzen enthielt, durch ein 186 bp langes Sph I-Bam HI- Fragment ersetzt wurde, das abgeleitet ist von dem pBR322- Tetracyclin-Restistenzgen. Das resultierende Plasmid, bezeichnet mit pDPOT, wurde mit Bam HI und Sal I geschnitten, um das S. pombe-POT1-Gen zu entfernen und das 10,2 kb lange Vektorfragment zu isolieren. Diese zwei Fragmente wurden miteinander ligiert, was zu dem mit pTIP bezeichneten Plasmid führte. Plasmid pTIP umfaßt den Replikationsursprung, REP1, REP2 und REP3 vom 2-Mikron-Plasmid, pBR322-Sequenzen, die das E. coli-AmpR-Gen kodieren, den Col E1-Replikationsursprung und die unvollkommenen selektionierbaren Marker leu2-d und tpiA, was Selektion auf hohe Plasmid-Kopienzahl unter Verwendung entweder des leu2-d-Selektionssystems oder des tpiA- Selektionssystems oder beider ermöglicht.
- Plasmid pAT-4 wurde dann wie folgt zusammengebaut (Fig. 6). Plasmid pTIP wurde durch Verdauung mit Bam HI linearisiert und mit bakterieller alkalischer Phosphatase behandelt, um Rezirkularisierung zu verhindern. Plasmid pMVR1 wurde mit Eco RI und Bgl II verdaut, um das 1,5 kb lange α-1-AntitrypsincDNA-TPI1-Terminator-Fragment zu isolieren. Der universelle ADH2-4C-Promotor aus Plasmid p410-4C wurde als ein 1,2 kb langes Bam HI-Eco RI-Fragment isoliert. Dieses Fragment wurde mit dem 1,5 kb langen α-1-Antitrypsin-cDNA-TPI1-Terminator- Fragment in den linearisierten pTIP-Vektor in einer dreiteiligen Ligation verknüpft. Die Ligationsmischung wurde in E. coli-Stamm RR1 transformiert. Aus den Transformanten hergestellte Plasmid-DNA wurde durch Restriktionsanalyse analysiert, um einen positiven Klon zu identifizieren. Dieser Klon wurde mit pAT-4 bezeichnet.
- Der Wildtyp-ADH2-Promotor wurde gebunden an die α-1- Antitrypsin-cDNA und in den Vektor pTIP eingebracht, um Plasmid pAT-6 zu erhalten. Plasmid pTIP wurde mit Bam HI linearisiert und mit bakterieller alkalischer Phosphatase behandelt, um Rezirkularisierung zu verhindern. Plasmid pMVR1 wurde mit Bgl II und Eco RI verdaut, um das 1,5 kb lange α-1- Antitrypsin-cDNA-TPI1-Terminator-Fragment zu isolieren. Der universelle ADH2-Promotor wurde aus Plasmid p410-Wt als ein 1,2 kb langes Bam HI- Eco RI-Fragment isoliert. Dieses Fragment wurde verknüpft mit dem 1,5 kb langen α-1- Antitrypsin-cDNA-TPI1-Terminator-Fragment in den linearisierten pTIP-Vektor in einer dreiteiligen Ligation. Die Ligationsmischung wurde in E. coli-Stamm RR1 transformiert. Aus den Transformanten hergestellte Plasmid-DNA wurde durch Restriktionsanalyse analysiert, um einen positiven Klon zu identifizieren. Der Klon wurde mit pAT-6 bezeichnet.
- Als ein Ergebnis der verwendeten Klonierungsstrategie wichen die sowohl in pAT-4 als auch in pAT-6 vorliegenden Promotorsequenzen von der Wildtypsequenz unmittelbar 5' zum ATG ab. Diese Sequenzalterationen führten zu Sequenzen um den Initiationscodon, die zu verringerten Expressionsniveaus führen könnten. Um die Expressionsniveaus zu maximieren, wurden diese Plasmide mit Bam HI verdaut, um den Promotor, ATG und das erste Codon von reifem AAT zu entfernen. Ein Promotorfragment, das eine genaue ADH2-AAT-Fusion umfaßt, wird dann substituiert. Im Fall von pAT-4 wird Plasmid p237-4CM mit Bam HI verdaut und das ADH2-4C-Promotorfragment wird isoliert. Der Promotor wird dann mit dem mit Bam HI geschnittenen pAT-4 verknüpft und ein Plasmid mit der richtigen Promotororientierung wird selektioniert.
- Die Plasmide pAT-3 und pAT-4 wurden in geeignete Hefewirte unter Verwendung von in der Technik gut bekannten Verfahren transformiert (Beggs, J.D., aaO, 1978; Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929-1933, 1978). Die verwendeten S. cerevisiae-Stämme waren genotypisch pep4 und waren geheilt von endogenen 2-Mikron-Plasmid, was sie [cir&sup0;) machte. Zusätzlich enthielten die Stämme Mutationen, die von den auf den Plasmiden vorliegenden unvollkommenen selektionierbaren Markern komplementiert wurden.
- Plasmid pAT-3, der den ADH2-4C-Promotor, gebunden an die AAT- cDNA in Vektor pCPOT, umfaßte, wurde in S. cerevisiae-Stamm ZM103 transformiert (Mata leu2-3.112 ura3 pep4::URA3 bar1 gal2 [cir&sup0;]. Transformanten wurden auf ihre Fähigkeit selektioniert, auf -LEUDS zu wachsen (Tabelle 2).
- 20 g Glucose
- 6,7 g Hefe-Stickstoffbasis ohne Aminosäuren (DIFCO Laboratories)
- 40 mg Adenin
- 30 mg L-Arginin-HCl
- 50 mg L-Asparaginsäüre
- 20 mg L-Histidin, freie Base
- 60 mg L-Isoleuzin
- 40 mg L-Lysin-Monohydrochlorid
- 20 mg L-Methionin
- 60 mg L-Phenylalanin
- 50 mg L-Serin
- 50 mg L-Tyrosin
- 40 mg Uracil
- 60 mg L-Valin
- 182 g Sorbit
- 18 g Agar (DIFCO Laboratories)
- Mische alle Bestandteile in destilliertem Wasser. Füge destilliertes Wasser bis zu einem Endvolumen von 1 Liter zu. Autoklaviere 15 Minuten. Füge nach dem Autoklavieren 150 mg L- Threonin und 40 mg L-Tryptophan zu. Gieße Platten und erlaube diesen, fest zu werden.
- Verwende das Rezept für -LEUDS-Platten, unter Weglassen von Sorbit und Agar. Autoklaviere für 15 Minuten und füge das L- Threonin und L-Tryptophan nach Entfernung der Medien aus dem Autoklaven zu.
- 20 g Hefeextrakt (DIFCO Laboratories)
- 5 g Ammoniumsulfat (Sigma, St. Louis, Mo.)
- 10 ml 100% Ethanol
- Mische Hefeextrakt und Ammoniumsulfat in destilliertem Wasser. Füge destilliertes Wasser bis zu einem Endvolumen von 1 Liter zu. Autoklaviere 25 Minuten. Kühle die Medien nach dem Autoklavieren und füge 10 ml 100% EtOH zu.
- Verwende das Rezept für -LEUD unter Weglassen der Glucose und mische alle Bestandteile in destilliertem Wasser. Füge destilliertes Wasser bis zu einem Endvolumen von 1 Liter zu. Autoklaviere 15 Minuten. Füge nach dem Autoklavieren 150 mg L- Threonin und 40 mg L-Tryptophan zu. Kühle die Medien und füge 10 ml 100% Ethanol zu.
- 20 g Glucose
- 6,7 g Hefe-Stickstoffbasis ohne Aminosäuren (DIFCO Laboratories, Detroit, Michigan)
- 40 mg Adenin
- 30 mg L-Arginin-HCl
- 50 mg L-Asparaginsäure
- 20 mg L-Histidin, freie Base
- 60 mg L-Isoleucin
- 80 mg L-Leucin
- 40 mg L-Lysin-Monohydrochlorid
- 20 mg L-Methionin
- 60 mg L-Phenylalanin
- 50 mg L-Serin
- 50 mg L-Tyrosin
- 60 mg L-Valin
- 182,2 g Sorbit
- 18 g Agar (DIFCO Laboratories)
- Mische alle Bestandteile in destilliertem Wasser. Füge destilliertes Wasser bis zu einem Endvolumen von 1 Liter zu. Autoklaviere 15 Minuten. Füge nach dem Autoklavieren 150 mg L- Threonin und 40 mg L-Tryptophan zu. Gieße Platten und erlaube diesen, fest zu werden.
- Verwende das Rezept für -URADS-Platten unter Weglassen des Sorbits und Agars. Autoklaviere für 15 Minuten und füge L- Threonin und L-Tryptophan nach Entfernung der Medien aus dem Autoklaven zu.
- 20 g Glucose
- 6,7 g Hefe-Stickstoffbasis ohne Aminosäuren (DIFCO)
- 40 mg Adenin
- 30 mg L-Arginin
- 50 mg L-Asparaginsäure
- 20 mg L-Histidin, freie Base
- 60 mg L-Isoleucin
- 80 mg L-Leuzin
- 40 mg L-Lysin-Monohydrochlorid
- 20 mg L-Methionin
- 60 mg L-Phenylalanin
- 50 mg L-Serin
- 50 mg L-Tyrosin
- 40 mg Uracil
- 60 mg L-Valin
- 182,2 g Sorbit
- 18 g Agar (DIFCO)
- Mische alle Bestandteile in destilliertem Wasser. Füge destilliertes Wasser bis zu einem Endvolumen von 1 Liter zu. Autoklaviere 15 Minuten. Füge nach dem Autoklavieren 150 mg L- Threonin zu. Gieße Platten und erlaube diesen, fest zu werden.
- 20 g Glucose
- 10 g Hefeextrakt (DIFCO)
- 20 g Pepton (DIFCO)
- Mische alle Bestandteile in destilliertem Wasser. Füge destilliertes Wasser bis zu einem Endvolumen bis zu 1 Liter zu. Autoklaviere 25 Minuten.
- Expression von AAT aus dem pAT-3-Plasmid im Stamm ZM103 wurde erreicht, indem zunächst Transformanten über Nacht bei 30ºC in 10ml-LEUD (Tabelle 2) gezüchtet wurden. Dies ermöglicht dem Plasmid, durch Selektion auf die schwache Komplementation des auf pAT-3 angeordneten leu2-d-Gens eine hohe Kopienzahl zu erreichen und zu halten. Die Zellen wurden pelletiert und das verbrauchte Medium wurde verworfen. AAT-Expression wurde durch erneutes Suspendieren der Zellen in MED A (Tabelle 2) und Züchten der Zellen bei 30ºC für 48 Stunden induziert. Das in MED A als die einzige Kohlenstoffquelle vorhandene Ethanol deprimiert den ADH2-4C-Promotor, was erhöhte Expression von AAT ermöglicht. Unter Verwendung dieses Verfahrens wurde AAT bei 30% vom Gesamtzellprotein nachgewiesen.
- Plasmid pAT-4, das den ADH2-4C-Promotor, gebunden an die AAT- cDNA im Vektor pTIP, umfaßte, wurde in S. cerevisiae-Stamm ZM115 transformiert (Mata ade2-101 leu2-3,112 ura3 gal2 Δpep4:TPI1-CAT tpil::URA3 [cir&sup0;]). Transformanten wurden auf ihre Fähigkeit selektioniert, auf -LEUDS zu wachsen.
- Expression von AAT aus dem pAT-4-Plasmid im Stamm ZM115 wurde erreicht, indem zunächst die Transformanten über Nacht bei 30ºC in 25 ml -LEUD gezüchtet wurden. Dies ermöglicht dem Plasmid, durch Verwendung der doppelten Selektion auf schwache Komplementation des leu2-d-Gens und der lacZ-tpiA- Expressionseinheit, angeordnet auf pAT-4, eine hohe Kopienzahl zu erreichen und zu halten. AAT-Expression wurde durch Verdünnen der Kultur 1 : 50 in 25 ml -LEU 1% EtOH (Tabelle 2) bei 30ºC für 40 Stunden induziert. Das in den Medien als die einzige Kohlenstoffquelle vorhandene Ethanol dereprimierte den ADH2-4C-Promotor, was erhöhte Expression von AAT ermöglichte.
- In geeigneter Weise gezüchtete Zellen, wie beschrieben im vorangehenden Abschnitt, wurden zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren, und die verbrauchten Medien wurden verworfen. Die Zellen wurden pelletiert und mit destilliertem Wasser gewaschen. Die gewaschenen Pellets wurden bei -80ºC eingefroren, bevor sie untersucht wurden.
- Rohe Glasperlen-Lysate wurden aus den gefrorenen Zellpellets hergestellt. Die gewaschenen Zellpellets wurden auf Eis aufgetaut und in einem gleichen Volumen phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, Sigma, St. Louis, Mo.) verdünnt. Glasperlen (450-500 um) wurden zu einer Hälfte des Gesamtvolumens zugegeben. Diese Mischung wurde bei voller Geschwindigkeit für 1 Minute dreimal verwirbelt, wobei die Proben zwischen den Verwirbelungen auf Eis gekühlt wurde. Größere Proben von 50 ml oder mehr wurden in derselben Art und Weise behandelt und in einem Bead Beater (Biospec Products, Bartlesville, Okla.) lysiert. Die großen Volumina wurden in einem Ethanol-Eisbad zwischen den Verwirbelungen abgekühlt. Die Flüssigkeit wurde aus den Röhrchen mit einer Pasteurpipette entfernt und in ein Mikrofugenröhrchen überführt. Die Glasperlen wurden einmal im ursprünglichen PBS- Volumen gewaschen. Die Perlen wurden 1 Minute verwirbelt und die Flüssigkeit wurde mit Pasteurpipette entfernt und mit dem ursprünglichen Lysat gepoolt. Die Lysate wurden dann in eine Eppendorf-Mikrofuge (Brinkmann, Westbury, N.Y.) bei Höchstgeschwindigkeit für fünf Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde sorgfältig für die Untersuchung entfernt.
- Der Doppel-Antikörper-ELISA wurde initiiert, indem zunächst Antikörper an die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte angehaftet wurden. Kaninchen-anti-α-1-Antitrypsin (Calbiochem), das über eine Human-α-1-Antitrypsin-Säule affinitätsgereinigt worden war, wurde in 0,1 M Na&sub2;CO&sub3;, pH 9,7 auf eine Konzentration von 5 ug/ml verdünnt. 500 ug Antikörper wurden zu jeder Vertiefung zugegeben und die Mischungen wurden über Nacht bei 4ºC inkubiert. Überschüssige Antikörper wurden durch zwei Waschungen mit Puffer C (PBS + 0,5% Tween 20 + 0,05% NaN&sub3; + 1% Rinderserumalbumin) entfernt. Oberschüssiges Rinderserumalbumin (BSA) wurde durch zwei Waschungen mit Puffer C entfernt. Standards und Proben wurden in Puffer B doppelt verdünnt. 100 l jeder Probe wurden zu den Vertiefungen zugegeben und bei 37ºC für eine Stunde inkubiert. Nichtgebundenes Material wurde durch drei Waschungen mit Puffer c entfernt. Biotin-konjugierter monoklonaler Mäuse-anti-α-1- Antitrypsin-Fab wurde auf 1 um/ml in Puffer B verdünnt. 100 ul des Biotin-konjugierten Mäuse-anti-α-1-Antitrypsin-Fab&sub5; wurden zu jeder Vertiefung zugegeben und bei 37ºC für eine Stunde inkubiert. Überschüssiger Fab wurde durch drei Waschungen mit Puffer c entfernt. Avidin-alkalische Phosphatase (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana) wurde 1 : 2500 in Puffer B verdünnt und 100 ul wurden zu jeder Vertiefung zugegeben. Die Mischungen wurden bei 37ºC für eine Stunde inkubiert, wobei das überschüssige Avidin-alkalische Phosphatase mit drei Waschungen mit Puffer C am Ende der Stunde weggewaschen wurde.
- Sigma Phosphatase Substrate wurde verdünnt auf 0,6 mg/ml Puffer D (1 Liter destilliertes Wasser, das 96 ml Diethanolamin + 56 mg MgCl&sub2; enthielt, und pH eingestellt auf pH 9,8). 100 ul Substrat wurden zu jeder Vertiefung zugegeben und bei Raumtemperatur für 15-30 Minuten oder bis zu genügender Farbentwicklung inkubiert. Die Extinktion bei 405 nm des Überstandes wurde gemessen und die Konzentration wurde relativ zu einer Standardkurve bestimmt. Die Gesamtkonzentration der Hefelysate am löslichen Protein wurde mit dem Verfahren von Lowry et al. (aaO) bestimmt. Die Menge an al-Antitrypsin wurde als prozentueller Anteil vom gesamten löslichen Protein ausgedrückt.
- Elastase-Bindungstests wurden auf den Proben durchgeführt, um α-1-Antitrypsin-Aktivität qualitativ nachzuweisen. Proben, die α-1-Antitrypsin, wie bestimmt mit ELISA, enthielten, wurden mit Elastase bei einem Verhältnis von 1 ug Elastase: 4 ug α-1- Antitrypsin (wie bestimmt mit ELISA) in insgesamt 50 ul TNE (0,02 M Tris pH 8, 0,05 M NaCl, 1 mM EDTA) vermischt. Diese Mischungen wurden für 45 min auf Eis inkubiert, dann in einem siedenden Wasserbad für 3 min erhitzt. Die Proben ließ man auf einem 10%igen Acrylamidgel laufen und überführte sie unter Verwendung des von Towbin (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350, 1979) beschriebenen Verfahren auf Nitrocellulose. Gereinigtes Kaninchen-anti-α-1-Antitrypsin, Ziegen-anti-Kaninchen, konjugiert an Meerrettich-Peroxidase, und Farbentwicklungsreagenz BioRad HRP wurden verwendet, um die α- 1-Antitrypsin-Proben sichtbar zu machen. Proben, die aktives α-1-Antitrypsin enthalten, werden einen Komplex mit Elastase bilden und langsamer über das 10%ige Polyacrylamidgel wandern.
- Eine λgt11-Expressionsbibliothek, die aus menschlicher Plazenta-mRNA hergestellte cDNA enthielt, wurde auf die a- Untereinheit von menschlichem Faktor XIII gescreent. Ein mit ¹²&sup5;I markierter affinitätsgereinigter Kaninchen-Antikörper (spezifische Aktivität = 6 · 10&sup6; cpm/ug wurde verwendet, um Filter zu screenen, die Phage enthielten, die mit einer Dichte von 1,5 · 10&sup5; Plaques pro 150 mm Platte aufplattiert waren.
- Sechs positive Klone wurden durch Screening von ungefähr 3 · 10&sup6; Phagen isoliert und jede positive Phage wurde plaquegereinigt.
- Plaquegereinigte Klone wurden dann gescreent mit der folgenden mit ³²P-markierten Oligonukleotidsonde: 5' CTC CAC GGT GGG CAG GTC GTC CTC G3'. Diese Sonde kodiert für die Aminosäuresequenz Ala-Glu-Asp-Asp-Leu-Pro-Thr-Val-Glu, die im Aktivierungspeptid der a-Untereinheit vorliegt (Takagi and Doolittle, Biochem. J. 13: 750-756, 1974). Die Nukleotidsequenz für die Sonde wurde ausgewählt, indem die häufigste Codonverwendung für Aminosäuren für eine Anzahl verschiedener menschlicher Proteine verwendet wurde (Chen und Barker, Trends in Genetics 1: 221-223, 1985). Das Oligonukleotid wurde mit ³²P auf eine spezifische Aktivität von 1,1 · 10&sup8; cpm/ug markiert.
- Phagen-DNA wurde aus positiven Klonen durch das Flüssigkultur- Lyseverfahren (T.J. Silhavy et al., in Experiments with Gene Fusions, CSH Laboratory, N.Y., S. 140-141, 1984), gefolgt von Zentrifugation und Banden auf einem Cäsiumchlorid- Stufengradienten hergestellt. cDNA-Inserts wurden durch Verdauung der Phagen-DNA mit Eco RI-Endonuclease isoliert und die 5'und 3'-Enden jedes Inserts wurden sequenziert. Einer der Klone mit einem großen cDNA-Insert (λHFXIIIa3.77, ATCC No. 40261) wurde für weitere Sequenzanalyse ausgewählt. Dieses Insert enthielt drei interne Eco RI-Stellen, was zu vier cDNA- Fragmenten bei Verdauung der Phagen-DNA mit Eco RI führte. Diese Fragmente und mehrere zusätzliche Restriktionsfragmente wurden in Plasmid pUC9 oder pUC19 subkloniert. Zusätzliche Restriktionsfragmente aus anderen cDNA-Inserts wurden in M13mp10, M13mp11, M13mp18 oder M13mp19 subkloniert, um überlappende Sequenzen zu erhalten. Die cDNA-Inserts wurden dann mit dem Didesoxy-Verfahren sequenziert (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 : 5463-5467, 1977), unter Verwendung von [α³&sup5;S]dATP und Puffergradienten-Gelen (Riggin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3963-3965, 1983). Verdauungen mit Nuclease BAL-31 wurden durchgeführt, um fünf zusätzliche Fragmente zu erzeugen, die überlappende Sequenzen mit den Eco RI-Restriktionsfragmenten lieferten.
- Die Sequenz von 3831 Basenpaaren aus diesen überlappenden Klonen kodiert für die gesamte Aminosäuresequenz der reifen a- Untereinheit von menschlichem Faktor XIII, der im Blut zirkuliert. Die a-Untereinheit besteht aus 731 Aminosäuren, beginnend mit einer aminoterminalen Sequenz aus Ser-Glu-Thr- Ser. Über diese aminoterminale Sequenz wurde bereits von Takagi und Doolittle (aaO) berichtet. Dem carboxylterminalen Met (Nucleotide 2281-2283) folgen ein Stopcodon (TGA), 1535 Basenpaare nicht-kodierende Sequenz und ein potentielles Polyadenylierungs- oder Verarbeitungssignal aus AATAAA. Die Polyadenylierungssequenz wurde 14 Nucleotide flußaufwärts vom Poly(A)-Schwanz aus 10 Nucleotiden lokalisiert. Der Poly(A)- Schwanz war nur in einem zweiten cDNA-Klon vorhanden, bezeichnet mit λHFXIIIa3.82.
- Das cDNA-Insert in λHFXIIIa3.77 kodiert auch für 30 Aminosäurereste, die eine in-frame-Sequenz zu kodieren scheinen. Spaltung der Bindung zwischen Met und Ser, um reifen Faktor XIII zu liefern, wurde eine zusätzliche Verarbeitungsprotease(n) erforderlich machen, um das reife Protein mit einem aminoterminalen Ser zu liefern. Dieser wurde eine Acetylierungsreaktion folgen, die zur Bildung von Acetyl- Serin am aminoterminalen ende des reifen Proteins führt (Takagi und Doolittle, aaO; Nakamura et al., J.Biochem. 78: 1247-1266, 1975).
- Unterschiede in der Nucleotidsequenz für die a-Untereinheit von Faktor XIII wurden an drei Positionen gefunden, als ein Vergleich der cDNA-Inserts in Regionen durchgeführt wurde, in denen überlappende Sequenzen erhalten wurden. Nukleotide 2038, 2041 und 2727 enthielten A, C bzw. T in λHFXIlla3.77, während λHFXIIIa3.82 G, C und A in denselben Positionen enthielt. Diese Unterschiede führen zu einer Veränderung in zwei Aminosäuren (Ile 650 und GIn 651 zu Val und Glu) und könnten einem Polymorphismus darstellen, der zur Mikroheterogenität in der a-Untereinheit von Faktor XIII beiträgt (Board und Coggan, Hum. Genet. 59: 135-136, 1981).
- Die cDNA der a-Untereinheit von Faktor XIII (asFXIII) wurde durch in-vitro-Mutagenese modifiziert, um die 3'-nichtkodierende Region durch eine Xho I-Stelle zu ersetzen. Zur Erleichterung der Handhabung wurde das 3,8 kb lange asFXIII- cDNA-Insert, das in Phagen-Klon λHFXIIIa3.82 enthalten war, in pUC18 subkloniert. Der Phagen-Klon λHFXIIIa3.82 wurde vollständig mit Pst I verdaut, um das 2,3 kb lange Fragment zu isolieren, das die asFXIII-cDNA umfaßte. Dieses Fragment wurde mit pUC18 ligiert, das durch Verdauung mit Pst I linearisiert worden war. Es wurde festgestellt, daß das resultierende Plasmid, pUC18 #9, das 2,3 kb lange Pst I-Insert in der Antisense-Orientierung aufwies. Das in pUC18 #9 vorhandene asFXIII-cDNA-Insert umfaßte 19 bp 5' zum Translationsstart, die asFXIII-Kodierungsregion und 120 bp 3' zum Translationsstop.
- Das asFXIII-cDNA-Insert wurde dann isoliert und in den Vektor pUC118 subkloniert ( erhalten von J. Vieira und J. Messing, Waksman Institute of Microbiology, Rutgers, Piscataway, N.J.). Das 2,3 kb lange asFXIII-Insert wurde aus pUC18 #9 durch Verdauung mit Pst I isoliert, in die pUC118-Pst I-Stelle subkloniert und in E. coli-Stamm JM109 transformiert. Ein positiver Klon, der das 2,3 kb lange asFXIII-Insert in der Antisense-Orientierung enthielt, wurde mit pRS201 bezeichnet.
- Die 120 bp lange 3'-nicht-translierte Region der asFXIII-cDNA wurde entfernt und eine Xho I-Stelle wurde 3' zum Translations-Stopcodon durch ortsgerichtete Mutagenese inseriert. Plasmid pRS201 wurde in E. coli-Stamm MV1193 transformiert und eine einzelsträngige Matrizen-DNA wurde isoliert. Oligonukleotid ZC1113 (Tabelle 1) wurde konstruiert, um die 3'-nicht-translierte Region im Anschluß an die asFXIII- Kodierungssequenz zu entfernen und eine Xho 1-Stelle 3' zum Translationsstop einzuführen. Die einzelsträngige Matrize von pRS201 wurde in-vitro-Mutagenese mit dem Verfahren von Zoller et al., (aaO, 1984) unter Verwendung des Mutagenese- Oligonukleotids ZC1113 unterworfen. Ein positiver Klon, bestätigt durch Restriktionsanalyse wurde, mit pRS202 bezeichnet.
- Das 2,2 kb lange asFXIII-cDNA-Fragment aus Plasmid pRS202 wurde hinter dem ADH2-4C-Promotor angeordnet und in Plasmid pIC7RI* untergebracht. Plasmid pTRK4c (Beispiel 2) wurde vollständig mit Eco RI und Sal I verdaut, um das 4 kb lange Fragment zu isolieren, das den ADH2-4C-Promotor, den TPI1- Terminator und die pIC7RI*-Vektorsequenzen umfaßte. Oligonucleotide ZC1C156 und ZC1057 (Tabelle 1) wurden konstruiert, um einen Adaptor mit einem kohäsiven Eco RI-Ende, einer Bgl. II-Stelle und einem kohäsiven Pst I-Ende zu bilden. Das kohäsive Eco RI-Ende des Adaptors zerstört, bei Ligation an ein anderes kohäsives Eco RI-Ende, die Eco RI-Stelle. Oligonucleotide ZC1056 und ZC1057 wurden kinasiert und aneliert, um den Eco RI-Adaptor zu bilden. Das 2,2 kb lange Pst I-Xho I-asFxIII-Fragment, isoliert aus Plasmid pRS202, wurde mit dem ZC1056/ZC1057-Adaptor und dem 4 kb langen pTRK4c-Fragment in einer dreiteiligen Ligation verknüpft. Das resultierende Plasmid wurde mit pRS215 bezeichnet.
- Plasmid pEAS102, das Teile der Vektoren YIp5 und pJDB207 umfaßt, wurde wie folgt konstruiert. Plasmid pJDB207 (Beggs, Proceedings of Alfred Benzon Symposium 16: 383-389, "Molecular Genetics in Yeast", Kopenhagen, Dänemark, 1981), ein Derivat von pJDB219 (J.D. Beggs, Nature 275: 104-108, 1978), wurde mit Bam HI und Pst I verdaut, um das 4,4 kb lange Fragment zu isolieren, das das leu2-d-Gen, 2-Mikron-DNA und pBR322- Sequenzen umfaßte. Plasmid YIp5 (Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1035-1039, 1979) wurde Teilverdauung mit Pst I und Vollverdauung mit Bam HI unterworfen, um das 4,3 kb lange Fragment zu isolieren, das das URA3-Gen und pBR322- Sequenzen umfaßte. Diese zwei Fragmente wurden ligiert und das resultierende Plasmid wurde mit pEAS102 bezeichnet.
- Ein Hefe-Expressionsvektor, der den ADH2-4C-Promotor, eine asFXIII-cDNA, den TPI1-Terminator und pEAS102-Vektorsequenzen umfaßte, wurde konstruiert. Plasmid pRS217 wurde wie folgt konstruiert. Die Expressionseinheit, die in pRS215 vorliegt (Beispiel 7), wurde in den Hefevektor pEAS102 eingebracht. Plasmid pEAS102 wurde vollständig mit Hind III verdaut, gefolgt von Behandlung mit bakterieller alkalischer Phosphatase, um Rezirkularisierung zu verhindern. Plasmid pRS215 wurde mit Hind III verdaut, um die 3,5 kb lange Expressionseinheit zu isolieren, die den ADH2-4C-Promotor, eine asFXIII-cDNA und den TPI1-Terminator umfaßte. Diese zwei Fragmente wurden miteinander ligiert, um Plasmid pRS217 zu schaffen.
- Plasmid pDPOT (Beispiel 3) wurde durch die Insertion eines Polylinkers modifiziert. Plasmid pDPOT wurde mit Sph I und Bam H I verdaut, um das 10,8 kb lange Fragment zu isolieren. Oligonucleotide ZC1551 und ZC1552 (Tabelle 1) wurden konstruiert, um einen Adaptor mit einem kohäsiven Bam HI-Ende und einem kohäsiven Sph I-Ende, die Sma I-, Sst I- und Xho I- Restriktionsstellen flankieren, zu bilden. Oligonucleotide ZC1551 und ZC1552 wurden kinasiert und aneliert, um den HI- Bam Sph I-Adaptor zu bilden. Das 10,8 kb lange pDPOT-Fragment wurde durch Ligation mit dem ZC1551/ZC1552-Adaptor zirkularisiert. Das resultierende Plasmid wurde pRPOT genannt.
- Die Expressionseinheit aus Plasmid pRS215, die den TPI1- Promotor, eine asFXIII-cDNA und den TPI1-Terminator umfaßte, wurde in den Hefe/ E. coli-Pendelvektor pRPOT eingebracht. Plasmid pJRXIII, das die Expressionseinheit aus pRS215 und pRPOT-Vektorsequenzen umfaßt, wurde wie folgt konstruiert. Plasmid pRS215 wurde mit Xho I verdaut, um die 3,5 kb lange Expressionseinheit zu isolieren. Die pRS215-Expressionseinheit wurde durch Ligation mit pRPOT verknüpft, das durch Verdauung mit Xho I linearisiert und anschließend mit alkalischer Phosphatase vom Kalb behandelt worden war, um Selbstligation zu verhindern. Die Ligation wurde in E. coli-Stamm MC1061 transformiert (Dagert und Ehrlich, Gene 6: 23-28, 1979). Plasmid-DNA, die aus den Transformanten isoliert wurde, wurde durch Restriktionsanalyse analysiert. Ein positiver Klon wurde identifiziert, der die Expressionseinheit in derselben Orientierung wie das POT1-Gen enthielt, und wurde mit pJRXIII bezeichnet.
- Die Expressionseinheit in Plasmid pRS215 wurde auch in den Hefe/E. coli-Pendelvektor pDPOT inseriert. Plasmid pDPOT wurde durch Verdauung mit Bam HI linearisiert, gefolgt von Behandlung mit alkalischer Phosphatase vom Kalb, um Rezirkularisierung zu verhindern. Plasmid pRS215 wurde mit Sst I und Pst I verdaut, um das 0,65 kb lange Fragment zu isolieren, das einen Teil des ADH2-4C-Promotors und den ZC1056/ZC1057-Adaptor umfaßte. Plasmid pRS215 wurde auch mit Pst I und Bgl II verdaut, um das 2,3 kb lange Fragment zu isolieren, das die asFXIII-cDNA und den TPI1-Terminator umfaßte. Plasmid p410-4C (Beispiel 2) wurde mit Bam HI und Sst I verdaut, um das 0,55 kb lange Fragment zu isolieren, das einen 5'-Teil des ADH2-4C-Promotors umfaßte. Das 0,55 kb lange Bam HI-Sst I-Fragment, abgeleitet von p410-4C, das 0,65 kb lange Sst I-Pst I-Fragment und 3,1 kb lange Pst I-Bgl II- Fragmente aus pRS215 wurden mit dem mit Bam HI linearisierten pDPOT in einer vierteiligen Ligation verknüpft. Zwei Plasmide wurden als das richtige Insert in entgegengesetzten Orientierungen aufweisend identifiziert. Plasmid pD15 enthielt die Expressionseinheit mit dem ADH2-4C-CPromotor diestal zum POT1-Gen im Vektor. Plasmid pDl6 enthielt die Expressionseinheit mit dem ADH2-4C-Promotor proximal zum POT1- Gen im Vektor.
- Plasmid pRS217 wurde in Saccharomyces cerevisiae-Stamm XV794- 71C (MATa ade2-1 leu 2-3 leu2-112 ura3 Δpep4::TPI1-CAT [cir&spplus;]) unter Verwendung des Verfahrens transformiert, das im wesentlichen von Beggs beschrieben ist (Nature 275: 104-108, 1978). Transformanten wurden auf die Fähigkeit selektioniert, auf -URADS-Platten (Tabelle 2) zu wachsen.
- Expression der Faktor XIII-a-Untereinheit aus dem pRS217- Plasmid, transformiert in den Stamm XV794-7-1C, wurde erreicht, indem zunächst die Transformanten über Nacht in 5 ml -URAD (Tabelle 2) gezüchtet wurden. Die Übernacht-Kulturen wurden in 1 Liter -URAD eingeimpft und für 48 Stunden bei 30ºC gezüchtet. Die Kulturen wurden zentrifugiert, um die Zellpellets zu ernten, die einmal mit destilliertem Wasser gewaschen und bei -80ºC aufbewahrt wurden.
- Plasmide pJRXIII und pD16 wurden in den Hefe-Wirtsstamm ZM118 (MATa/MATα [cir&sup0;] homozygot für Δtpil::URA3, pep4::URA3, leu2- 3, 112, ura3, und bar1) transformiert und auf synthetischem Medium selektioniert, dem Tryptophan fehlte und das mit 1 M Sorbit ergänzt war (-TRPDS-Platten, Tabelle 2).
- Expression von aktivem Faktor XIII aus pJRXIII und pD16, transformiert in Stamm ZM118, wurde erreicht, indem die Transformanten über Nacht in 5 ml YEPD (Tabelle 2) gezüchtet wurden. Zwei ml der Übernacht-Kultur wurden in 200 ml YEPD eingeimpft und bei 30ºC unter Rütteln gezüchtet. Die Kulturen wurden zentrifugiert, um die Zellpellets zu ernten, die einmal mit destilliertem Wasser gewaschen und bei -80ºC aufbewahrt wurden.
- Die Zellpellets wurden untersucht, wie in Beispiel 9 beschrieben. Es wurde festgestellt, das alle Transformanten aktiven Faktor XIII produzierten. Ein Vergleich der Transformanten zeigte jedoch, daß pJRXIII-Transformanten 6mal mehr aktiven Faktor XIII produzierten, als pRS217- Transformanten produzierten, und pD16-Transformanten 25mal mehr aktiven Faktor XIII produzierten, als pRS217- Transformanten produzierten.
- Rohe Glasperlenlysate wurden aus den gefrorenen Zellpellets hergestellt. Die gewaschenen Zellpellets wurden auf Eis aufgetaut und in einem gleichen Volumen phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; Sigma, St. Louis, Mo.), 1 mM β- Mercaptoethanol (Sigma) verdünnt. Glasperlen (450-500 um) wurden zu einer Hälfte des Gesamtvolumens zugegeben. Diese Mischung wurde bei voller Geschwindigkeit für eine Minute drei mal verwirbelt, wobei die Proben zwischen den Verwirbelungen auf Eis gekühlt wurden. Die Flüssigkeit wurde aus den Röhrchen mit einer Pasteurpipette entfernt und in ein Mikrofugenröhrchen überführt. Die Glasperlen wurden einmal im ursprünglichen PBS-Volumen, das 1 mM β-Mercaptoethanol (BME) enthielt, gewaschen. Die Perlen wurden eine Minute lang verwirbelt und die Flüssigkeit wurde mit Pasteurpipette entfernt und mit dem ursprünglichen Lysat gepoolt. Die Lysate wurden dann in einer Eppendorf-Mikrofuge (Brinkmann, Westbury, N.Y.) bei Höchstgeschwindigkeit für fünf Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde für die Untersuchung sorgfältig entfernt.
- Faktor XIII-Aktivität wurde unter Verwendung des Verfahrens gemessen, das im wesentlichen von Curtis und Lorand (Methods Enzymol. 45: 177-191, 1976) beschrieben ist. Die Lysate wurden auf Gesamthefeprotein mit dem Verfahren gemessen, das von Lowry et al. beschrieben ist (J. Biol. Chem. 193: 265-275, 1951). Proben wurden mit 10 ug/ul Gesamthefeprotein mit PBS +1 mM BME verdünnt. Standards unter Verwendung kommerziell erhältlichen Faktors XIII (Tabelle 3) wurden in schrittweiser Verdünnung in 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM Dithiothreit verdünnt. 5 ul Probe oder Standard wurden zu 35 ul 50 mM Tris- HCl pH 7,6 und 1 ul Thrombin (Tabelle 3) zugegeben. Die Mischungen ließ man bei 37ºC für 30 Minuten inkubieren. Die Reaktionen wurden durch die Zugabe von 2 U Hirudin (Sigma) gelöscht. Sechzig ul Reaktionsmischung (Tabelle 3) wurden bei 37ºC zugegeben und die Mischung wurde für 30 Minuten inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 1 ml 7,5%iger Trichloressigsäure (TCA) gestoppt. Die Proben wurden in der Mikrofuge bei Höchstgeschwindigkeit für 5 Minuten abgeschleudert und die Überstände wurden verworfen. Die Pellets wurden zweimal mit 7,5%iger TCA gewaschen. Die Pellets wurden dann in 100 ul Eisessig gelöst. Fünf ml Szintillationscocktail (Optifluor, Packard Instruments Co., Downers Grove, 111.) wurden zugegeben und die Proben wurden auf dem Szintillationszähler ausgezählt (Beckman, Palo Alto, Calif.).
- Thrombin: Lyophilisiertes Thrombin (Sigma, St. Louis, Mo.) wird in 50% Glyzerin, 0,25 M Tris-HCl pH 7,5 auf 1000 U/ml gelöst. Diese Lösung wird bei -20ºC gelagert.
- Kommerzieller Faktor XIII: Faktor XIII (Green Cross, Osaka, Japan), gelöst in 1 ml 50% Glyzerin, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM Dithiothreit (DTT; Sigma, St. Louis, Mo.). Diese Lösung wird bei -20ºC gelagert.
- N,N-Dimethylcasein: N,N-Dimethylcasein (Sigma, St. Louis, Mo.) wird auf 10 mg/ml in 0,5 M Tris- HCl pH 7,5 gelöst.
- ³H-Histamin Dihydrochlorid: 1 mCi ³H-Histamin-Dihydrochlorid (New England Nuclear, Boston, Mass.) wurde gelöst in 4 ml 10 mM nicht-markiertem Histamin-Hydrochlorid. Diese Lösung wird bei -20ºC gelagert.
- Reaktionspuffer: 1,4 M NaCl
- 1,0 M Tris-Base
- 0,1 M Cacl&sub2;
- 0,2 M DTT
- pH eingestellt auf 7,5
- Reaktionsmischung: 2,0 ml ³H-Histamin-Dihydrochlorid
- 8,0 ml N,N-Dimethylcasein
- 1,8 ml Reaktionspuffer
- Isolierung und Charakterisierung des gerinnungshemmenden Proteins ist offenbart von Funakoshi et al. (Biochem. J. 26: 5572-5578, 1987). Eine menschliche Plazenta-cDNA-Bibliothek (Clontech) wurde unter Verwendung von affinitätsgereinigtem Antikörper gegen PAP-I gemäß den Verfahren von Young und Davis (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 1194-1198, 1983) und Foster und Davie (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 4766-4770, 1984) gescreent. Zwölf positive Klone wurden aus 5 · 10&sup5; Rekombinanten erhalten und wurden dann plaquegereinigt. Sequenzanalyse des größten Klons (1,5 kb Insert) zeigte, daß dieser Klon eine offenen Leserahmensequenz enthielt, die für PAP-I kodiert, beginnend bei Rest 38 und sich entsprechend bis zur 3'-nicht-kodierenden Region, die den Poly(A)-Schwanz enthält. Die ursprüngliche Bibliothek wurde dann erneut unter Verwendung dieses Klons als einer Hybridisierungssonde gescreent. Die Sonde wurde mit dem Verfahren von Maniatis et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 : 1184-1188, 1975) markiert. Filter wurden mit 2 · SSC-Puffer (8,2 g Na-Zitrat pH 7,0 und 17,5 g NaCl/Liter), der 0,5% SDS enthielt, bei 60ºC für 1 Stunde gewaschen. 24 Klone wurden dann erhalten und plaquegereinigt. Positive Klone wurden für Sequenzanalyse unter Verwendung der Didesoxy-³&sup5;S-Methode von Sanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467, 1977) in M13mp18 oder M13mp19 kloniert. Es wurde festgestellt, daß der größte Klon (1,7 kb Insert) eine cDNA in nahezu vollständiger Länge kodiert und einen Initiations-Met-Rest am 5'-Ende einschloß, gefolgt vom gesamten reifen Protein, einem Stopcodon und einem Polyadenylierungssignal. Die cDNA-Sequenz von PAP-I enthielt keine Leader-Peptidsequenz, was zeigt, daß PAP-I vermutlich nicht konstitutiv sekretiert wird. Das Vorliegen von Met am 5'-Ende nach cDNA-Sequenzanalyse und das Fehlen dieses Met nach Proteinsequenzanalyse zeigte, daß der Met-Rest in einem post-translationalen Ereignis entfernt wird und der neugebildete NH&sub2;-terminale Ala-Rest durch Acetylierung blockiert ist.
- Für Expression in Hefe wurde die PAP-I-cDNA mit dem ADH2-4C- Promotor und dem TPI1-Terminator verknüpft. Diese Expressionseinheit wurde in mehrere Hefeexpressionsvektoren inseriert und die Vektoren wurden verwendet, um ausgewählte Hefestämme zu transformieren.
- Die PAP-I-cDNA wurde mit dem ADH2-4C-Promotor wie folgt verknüpft. Plasmid pAP1,7, das die 1,7 kb lange cDNA in pUC18 umfaßt, wurde mit Nco I und Bam HI geschnitten und das linearisierte Plasmid wurde durch zwei Runden Gelreinigung isoliert. Der ADH2-χ-Promotor wurde funktionell verknüpft mit dem 5'-Ende der PAP-I-cDNA durch einen Adaptor mit der folgenden Struktur:
- Dies wurde durch eine dreiteilige Ligation unter Verwendung des mit Nco I, Bam HI geschnittenen Vektors, des 1,2 kb langen Bam HI-Eco RI-Promotorfragmentes aus p410-4c (Beispiel 2) und des Adaptors erreicht. Das resultierende Plasmid wurde mit pPR1 bezeichnet. Das Vorliegen der richtigen Promotorfusion wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
- Expressionsvektoren wurden dann konstruiert. Plasmid pZUC13 (pZUC13 umfaßt das chromosomale leu2-Gen aus S. cerevisiae und den Replikationsursprung aus dem S. cerevisiae-2-Mikron- Plasmid, inseriert in pUC13. Es wurde in einer zu pZUC12 analogen Art und Weise konstruiert, die in der veröffentlichten europäischen Patentanmeldung 195, 691 beschrieben ist, unter Verwendung des Plasmids pMT212, das in der veröffentlichten europäischen Patentanmeldung 163, 529 beschrieben ist) wurde mit Sal I geschnitten und mit Kalbsintestinalphosphatase behandelt, um Selbstligation zu verhindern. Plasmid pPR1 wurde vollständig mit Sal I und Bgl II verdaut und das 2,4 kb lange Promotor + PAP-I-Fragment wurde gewonnen. Das Hefe-TPI1-Terminator-Fragment wurde aus Plasmid pFG1 erhalten (Alber und Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1: 419-434, 1982). Es umfaßt die Region vom vorletzten Aminosäurecodon des TPI1-Gens bis zur Eco RI-Stelle ungefähr 700 Basenpaare flußabwärts. Diese einzige Eco RI-Stelle von pFGI wurde durch eine Bam HI-Stelle ersetzt, indem das Plasmid zunächst mit Eco RI geschnitten, dann die Enden mit DNA- Polymerase I (Klenow-Fragment) stumpfendig gemacht, synthetische Bam HI-Linker (CGGATCCA) zugefügt und religiert wurde, um Plasmid p136 herzustellen. Der TPI1-Terminator wurde dann aus p136 als ein Xba I-Bam HI-Fragment herausgeschnitten. Dieses Fragment wurde in YEp13 (Broach et al., Gene 8: 121, 1979) ligiert, das mit Xba I und Bam HI linearisiert worden war. Das resultierende Plasmid ist als p213 bekannt. Die Hind III-Stelle wurde dann aus der TPI1-Terminatorregion von p213 entfernt, indem das Plasmid mit Hind III verdaut, die resultierenden Termini mit DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) stumpfendig gemacht und das lineare Molekül unter Verwendung von T&sub4;-DNA-Ligase rezirkularisiert wurde. Das resultierende Plasmid wurde mit p270 bezeichnet.
- Alternativ kann p270 konstruiert werden, indem Plasmid pM220 (hinterlegt bei der American Type Culture Collection als ein E. coli-RR1-Transformant, Zugangsnummer 39853) mit Xba I und Bam HI verdaut, das TPI1-Terminatorfragment ( 700 bp) gereinigt und dieses Fragment in mit Xba I, Bam H1 verdautes YEp13 inseriert wurde.
- Der TPI1-Terminator wurde aus Plasmid p270 als ein Xba I-Bam HI-Fragment entfernt. Dieses Fragment wurde zusammen mit einem anderen Fragment, das den TPI1-Promotor, gebunden an das CAT (Chloramphenicol-Acetyltransferase) -Gen enthielt, kloniert, um ein TPI1-Terminatorfragment mit einem Eco RV-Ende zu erhalten. Das resultierende Plasmid wurde mit pCAT bezeichnet (Fig. 11). Der TPI1-Terminator wurde dann aus pCAT als Eco RV-Bam HI-Fragment geschnitten und in pIC19H (Marsh et al., aaO) kloniert, das mit denselben Enzymen geschnitten worden war, um pTT1 zu erhalten. Plasmid pTT1 wurde mit Sal I und Bgl II verdaut und das 800 bp lange TPI1-Terminatorfragment wurde gewonnen. Die drei Fragmente (mit Sal I geschnittenes pZUC13, Sal I-Bgl II-Promotor + PAP-I und Bgl II-Sal I-Terminator) wurden dann verknüpft. Zwei unterschiedliche Expressionsvektoren mit entgegengesetzter Expressionseinheitsorientierung wurden erhalten. Diese Vektoren wurden mit pZ1 und pZ2 bezeichnet.
- Die Expressionseinheit aus pZ2 wurde in den Hefe/E. coli- Pendelvektor pDPOT inseriert. Plasmid pZ2 wurde mit Bam HI geschnitten, um die 3,2 kb lange Expressionseinheit zu isolieren. Plasmid pDPOT wurde durch Verdauung linearisiert und wurde anschließend mit alkalischer Phosphatase vom Kalb behandelt, um Rezirkularisierung zu verhindern. Die 3,2 kb lange Expressionseinheit wurde mit dem linarisierten pDPOT- Fragment durch Ligation verknüpft. Zwei unterschiedliche Expressionsvektoren wurden mit entgegengesetzten Orientierungen isoliert. Diese Vektoren wurden mit pD1 und pD2 bezeichnet. Plasmid pD2 enthielt die Expressionseinheit mit der Transkriptionsrichtung weg vom POT1-Gen.
- Plasmid pZ2 wurde in den S. cerevisiae-Stamm ZA521 (Mata leu2- 3, 112 ura3 pep4::URA3 bar1 gal2 [cir&sup0;]) transformiert. Die Transformanten wurden in 10 ml -LEUD (Tabelle 1) über Nacht bei 30ºC gezüchtet und die optischen Dichten der Kulturen wurden bei 600 nm bestimmt. Die Zellpellets wurden in MED A auf eine optische Dichte, die bei 600 nm 8 entspricht, erneut suspendiert. Die Kulturen wurden unter Rütteln für 28 Stunden inkubiert. Plasmid pD2 wurde in S. cerevisiae-Stamm ZM118 transformiert. Die Transformanten wurden in YEPD (Tabelle 2) für 96 Stunden bei 30ºC gezüchtet.
- Die Kulturen wurden zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren, und das verbrauchte Medium wurde verworfen. Die Zellen wurden pelletiert und mit destilliertem Wasser gewaschen. Die gewaschenen Pellets wurden bei -80ºC eingefroren, bevor sie untersucht wurden.
- Rohe Glasperlen-Lysate wurden aus den gefrorenen Zellpellets hergestellt. Die gewaschenen Zellpellets wurden auf Eis aufgetaut und in einem gleichen Volumen phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünnt. Glasperlen (450-500 um) wurden zu einer Hälfte des Gesamtvolumens zugegeben. Die Zellen wurden durch dreimalige Verwirbelung der Mischung bei voller Geschwindigkeit für eine Minute lysiert, wobei die Proben zwischen den Verwirbelungen auf Eis gekühlt wurden. Die Flüssigkeit wurde aus den Röhrchen mit einer Pasteurpipette entfernt und in ein Mikrofugenröhrchen überführt. Die Glasperlen wurden einmal im ursprünglichen PBS-Volumen gewaschen. Die Perlen wurden eine Minute verwirbelt und die Flüssigkeit wurde mit Pasteurpipette entfernt und mit dem ursprünglichen Lysat gepoolt. Die Lysate wurden dann in eine Eppendorf-Mikrofuge (Brinkmann, Westbury, N. Y.) bei Höchstgeschwindigkeit für fünf Minuten zentrifugiert. Die Überstände wurden sorgfältig entfernt und auf gesamtes lösliches Protein mit dem von Lowry et al. beschriebenen Verfahren (J. Biol. Chem. 193: 265-275, 1951) untersucht.
- Die Lysate wurden anschließend einer Elektrophorese auf Polyacrylamidgelen unterzogen. Ungefähr 50 ug gesamtes lösliches Protein, wie nachgewiesen mit dem Lowry-Verfahren (Lowry et al., aaO), wurden zusammen mit PAP-I-Standards mit 1, 2 oder 5 ug gereinigtem PAP-I auf ein 12% Polyacrylamidgel geladen. Die Probe wurde einer Elektrophorese unterzogen und durch Anfärbung mit Coomasie-Blau sichtbar gemacht. Durch Vergleich des von Hefe produzierten PAP-I mit dem gereinigten PAP-I-Standard wurde festgestellt, daß das PAP-I, das durch pZ2-Transformanten produziert wurde, ungefähr 2% des gesamtlöslichen Proteins darstellte, verglichen mit den pD2- Transformanten, die PAP-I bei ungefähr 20% vom gesamten löslichen Protein produzierten.
- Aus dem Vorstehenden wird man anerkennen, daß, obgleich spezifische Ausführungsformen der Erfindung zu Zwecken der Veranschaulichung hierin beschrieben worden sind, verschiedene Modifikationen durchgeführt werden können, ohne den Geist und den Schutzumfang der Erfindung zu umgehen. Demgemäß ist die Erfindung mit Ausnahme durch die beigefügten Ansprüche nicht beschränkt.
- Die in der vorstehenden Beschreibung, den Ansprüchen und/oder in den beigefügten Zeichnungen offenbarten Merkmale können, sowohl einzeln als auch in jeder Kombination derselben, Gegenstand für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Formen sein.
Claims (14)
1. Ein Expressionsvektor, der in der Lage ist, die Expression
von heterologen Genen oder heterologer cDNA in Hefe zu
steuern, wobei besagter Expressionsvektor einen ADH2-Promotor,
ein heterologes Gen oder eine heterologe cDNA und einen
unvollkommenen selektionierbaren Marker enthält.
2. Der Expressionsvektor nach Anspruch 1, wobei besagter ADH2-
Promotor ein mutantes Isolat des ADH2-Promotors ist.
3. Der Expressionsvektor nach Anspruch 1, wobei besagter ADH2-
Promotor der ADH2-4C-Promotor ist.
4. Der Expressionsvektor nach Anspruch 1, wobei besagter
Vektor außerdem funktionale genetische Elemente einschließt,
die abgeleitet sind von einem Hefe-2-Mikron-Kreis.
5. Der Expressionsvektor nach Anspruch 4, wobei besagte
Elemente einen Replikationsursprung und REP1-, REP2- und REP3-
Gene einschließen.
6. Der Expressionsvektor nach Anspruch 1, wobei besagter
Vektor den gesamten Hefe-2-Mikron-Kreis einschließt.
7. Der Expressionsvektor nach Anspruch 1, wobei besagter
unvollkommener selektiver Marker das Schizosaccharomyces
pombe-POT1-Gen, die Aspergillus nidulans tpiA-cDNA, operabel
verknüpft mit dem E. coli-lacZ-Promotor, oder das leu2-d-Gen
umfaßt.
8. Der Expressionsvektor nach Anspruch 1, wobei besagter
unvollkommener selektionierbarer Marker ein mutantes Struktur-
Gen umfaßt.
9. Der Expressionsvektor nach Anspruch 1, wobei besagter
unvollkommener selektionierbarer Marker eine Deletion oder
Alteration in einem mit besagtem Marker operabel verknüpften
Promotor einschließt.
10. Der Expressionsvektor nach Anspruch 1, wobei besagtes
heterologes Gen oder besagte heterologe cDNA α-1-Antitrypsin,
Faktor XIII oder PAP-I kodiert.
11. Eine Hefe-Wirtszelle mit einem genetischen Defekt, in die
ein Expressionvektor nach einem der Ansprüche 1-10 eingeführt
worden ist, wobei der unvollkommene selektionierbare Marker
des Expressionsvektors komplementär zum genetischen Defekt der
Hefe-Wirtszelle ist.
12. Die Hefe-Wirtszelle nach Anspruch 11, wobei besagte
Hefezelle ein Stamm von S. cerevisiae ist.
13. Ein Verfahren zur gesteigerten Produktion von Proteinen in
Hefe-Wirtszellen, welches umfaßt:
Einführen eines Expressionsvektors nach einem der Ansprüche 1-
10 in eine Hefe-Wirtszelle mit einem genetischen Defekt, wobei
der unvollkommene selektionierbare Marker des
Expressionsvektors komplementär zum genetischen Defekt der
Hefe-Wirtszelle ist;
Züchten besagter Hefe-Wirtszelle in einem geeigneten Medium;
und
Isolieren des von besagter Wirtszelle produzierten Proteins.
14. Ein Verfahren zur gesteigerten Produktion von α-1-
Antitrypsin in Hefe-Wirtszellen, welches umfaßt:
Einführen eines Expressionsvektors, der in der Lage ist, die
Expression von heterologen Genen oder heterologer cDNA in Hefe
zu steuern, einschließlich eines Replikationsursprungs und
REP1-, REP2- und REP3-Genen, abgeleitet von einem Hefe-2-
Mikron-Kreis, in einen [cir&sup0;]-Stamm von S. cerevisiae, der für
Wachstum auf Leucin auxotroph ist und eine u-Mutation
trägt, wobei besagter Expressionsvektor einen ADH2-4C-Promotor,
ein Gen oder eine cDNA, die α-1-Antitrypsin kodiert, und einen
unvollkommenen selektionierbaren Marker, der aus einem leu2-d-
Gen besteht, umfaßt;
Züchten besagter Hefe-Wirtszellen in einem geeigneten Medium;
Aufbrechen besagter Hefe-Wirtszellen; und
Isolieren des von besagten Hefe-Wirtszellen produzierten α-1-
Antitrypsins.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US2986787A | 1987-03-23 | 1987-03-23 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE3888561D1 DE3888561D1 (de) | 1994-04-28 |
DE3888561T2 true DE3888561T2 (de) | 1994-09-01 |
Family
ID=21851327
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE3888561T Expired - Lifetime DE3888561T2 (de) | 1987-03-23 | 1988-03-23 | Hohe Proteinsyntheserate in Hefe. |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0284044B1 (de) |
JP (1) | JP2795850B2 (de) |
AT (1) | ATE103333T1 (de) |
CA (1) | CA1304020C (de) |
DE (1) | DE3888561T2 (de) |
DK (1) | DK175243B1 (de) |
Families Citing this family (65)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3906540A1 (de) * | 1989-03-02 | 1990-09-13 | Behringwerke Ag | Expressionsvektoren zur synthese von proteinen in der spalthefe schizosaccharomyces pombe |
US5225537A (en) * | 1989-12-29 | 1993-07-06 | Zymogenetics, Inc. | Methods for producing hybrid phospholipid-binding proteins |
FR2656531B1 (fr) * | 1989-12-29 | 1992-04-24 | Sanofi Sa | Promoteur artificiel pour l'expression de proteines dans le levure. |
ES2109336T3 (es) | 1990-11-26 | 1998-01-16 | Genetics Inst | Expresion de pace en celulas huesped y metodos de utilizacion de la misma. |
US5407822A (en) * | 1991-10-02 | 1995-04-18 | Sanofi | Artificial promoter for the expression of proteins in yeast |
FI924494A0 (fi) * | 1992-10-06 | 1992-10-06 | Valtion Teknillinen | Oekad produktion av avsoendrarde proteiner i eukaryotiska rekombinantceller |
EP0672753B1 (de) * | 1993-10-05 | 2008-01-02 | Asahi Glass Company Ltd. | Vektor zur vielfachklonierung, expressionsvektor und herstellung von fremdprotein mit expressionsvektor |
US5629167A (en) * | 1994-04-19 | 1997-05-13 | Biocine S.P.A. | Detection of antibodies against Chlamydia trachomatis pgp3 antigen in patient sera by enzyme-linked immunosorbent assay |
EP0723883B1 (de) | 1995-01-27 | 2001-06-27 | The Yokohama Rubber Co., Ltd. | Luftreifen und Verfahren zur Herstellung |
GB2318732A (en) | 1996-11-01 | 1998-05-06 | Johnson & Johnson Medical | Wound healing compositions containing alpha-1-antitrypsin |
FI972909A0 (fi) | 1997-07-09 | 1997-07-09 | Valtion Teknillinen | Oekad produktion av avsoendrade proteiner genom rekombinatjaestceller |
DE19736343B4 (de) * | 1997-08-21 | 2006-02-09 | Forschungszentrum Jülich GmbH | Verfahren zur Erhöhung der Genexpression von Saccharose Synthase |
SK1662000A3 (en) | 1997-09-05 | 2000-08-14 | Pentapharm Ag | Expression vector for improved production of polypeptides in yeast |
FR2768743B1 (fr) * | 1997-09-23 | 2001-09-14 | Bio Merieux | Procede de lyse de micro-organisme |
DE69841807D1 (de) | 1997-11-06 | 2010-09-16 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Neisseriale antigene |
CA2317815A1 (en) | 1998-01-14 | 1999-07-22 | Chiron S.P.A. | Neisseria meningitidis antigens |
GB9808932D0 (en) | 1998-04-27 | 1998-06-24 | Chiron Spa | Polyepitope carrier protein |
CN1210305C (zh) | 1998-05-01 | 2005-07-13 | 希龙公司 | 脑膜炎奈瑟球菌抗原和组合物 |
US6358705B1 (en) | 1998-07-16 | 2002-03-19 | Novo Nordisk A/S | Method of making proteins in transformed yeast cells |
FR2781500B1 (fr) * | 1998-07-23 | 2000-09-08 | Bio Merieux | Dispositif perfectionne et procede de lyse de micro-organismes |
ES2477194T3 (es) | 1999-04-30 | 2014-07-16 | Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. | Ant�genos neisseriales conservados |
GB9911683D0 (en) | 1999-05-19 | 1999-07-21 | Chiron Spa | Antigenic peptides |
GB9916529D0 (en) | 1999-07-14 | 1999-09-15 | Chiron Spa | Antigenic peptides |
AU784203B2 (en) | 1999-10-29 | 2006-02-23 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Neisserial antigenic peptides |
US6709863B2 (en) | 1999-12-08 | 2004-03-23 | Iowa State University Research Foundation | Nucleic acid molecules encoding multiple start codons and histidine tags |
EP1897555B1 (de) | 2000-01-17 | 2014-07-16 | Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. | Ergänzter Außenmembranvesikel-Impfstoff gegen Meningokokken |
EP1671981A3 (de) | 2000-10-27 | 2006-07-05 | Chiron SRL. | Nukleinsäure und Proteine von Streptococcus Gruppe A |
GB0107658D0 (en) | 2001-03-27 | 2001-05-16 | Chiron Spa | Streptococcus pneumoniae |
GB0107661D0 (en) | 2001-03-27 | 2001-05-16 | Chiron Spa | Staphylococcus aureus |
AU2004236174B2 (en) | 2001-10-10 | 2011-06-02 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods |
NZ532027A (en) | 2001-10-10 | 2008-09-26 | Neose Technologies Inc | Remodeling and glycoconjugation of peptides |
EP2305313B1 (de) | 2001-10-10 | 2014-03-26 | ratiopharm GmbH | Neumodulierung und Glykokonjugation von Interferon alpha (IFNa) |
ES2386386T3 (es) | 2001-12-12 | 2012-08-20 | Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. | Inmunización contra Chlamydia trachomatis |
EP1572720A4 (de) | 2002-05-24 | 2008-12-24 | Nps Allelix Corp | Verfahren zur enzymatischen herstellung von glp-2-(1-33)- und glp-2-(1-34)-peptiden |
CA2506318C (en) | 2002-11-15 | 2011-07-12 | Chiron Srl | Unexpected surface proteins in neisseria meningitidis |
GB0308198D0 (en) | 2003-04-09 | 2003-05-14 | Chiron Srl | ADP-ribosylating bacterial toxin |
US7419801B2 (en) | 2003-08-08 | 2008-09-02 | Arriva Pharmaceuticals, Inc. | Methods of protein production in yeast |
US7829307B2 (en) | 2003-11-21 | 2010-11-09 | Nps Pharmaceuticals, Inc. | Production of glucagon-like peptide 2 |
CN103755800B (zh) | 2004-02-02 | 2016-02-24 | Ambrx公司 | 经修饰的人类生长激素多肽与其用途 |
EP1818405B1 (de) | 2004-04-09 | 2015-06-03 | Monsanto Technology, LLC | Zusammensetzungen und Verfahren zur Kontrolle von Insektenbefall bei Pflanzen |
BRPI0512235A (pt) | 2004-06-18 | 2008-02-19 | Ambrx Inc | polipeptìdeos ligadores de antìgenos e seus usos |
US7638491B2 (en) | 2004-12-22 | 2009-12-29 | Ambrx, Inc. | Therapies using non-natural amino acids and polypeptides |
CN102732588B (zh) | 2004-12-22 | 2015-01-07 | Ambrx公司 | 氨酰基-tRNA合成酶的组合物及其用途 |
CN103690936A (zh) | 2004-12-22 | 2014-04-02 | Ambrx公司 | 经修饰的人类生长激素 |
WO2007021297A1 (en) | 2005-08-18 | 2007-02-22 | Ambrx, Inc. | COMPOSITIONS OF tRNA AND USES THEREOF |
CA2812343C (en) | 2005-09-16 | 2017-12-12 | Monsanto Technology Llc | Methods for genetic control of insect infestations in plants and compositions thereof |
CN104357447A (zh) | 2005-09-16 | 2015-02-18 | 德福根有限公司 | 使用RNAi控制有害生物的方法 |
JP2009520949A (ja) | 2005-11-16 | 2009-05-28 | アンブルックス,インコーポレイテッド | 非天然アミノ酸を含んでいる組成物および方法 |
US20080317670A1 (en) | 2005-12-14 | 2008-12-25 | Ambrx, Inc. | Compositions Containing, Methods Involving, and Uses of Non-Natural Amino Acids and Polypeptides |
AU2007214547B2 (en) | 2006-02-13 | 2012-09-20 | Monsanto Technology Llc | Selecting and stabilizing dsRNA constructs |
DK2054431T3 (da) | 2006-06-09 | 2012-01-02 | Novartis Ag | Konformere af bakterielle adhæsiner |
CN106008699A (zh) | 2006-09-08 | 2016-10-12 | Ambrx公司 | 经修饰的人类血浆多肽或Fc骨架和其用途 |
CA2682147C (en) | 2007-03-30 | 2017-08-08 | Ambrx, Inc. | Modified fgf-21 polypeptides and their uses |
NZ603812A (en) | 2007-11-20 | 2014-06-27 | Ambrx Inc | Modified insulin polypeptides and their uses |
MX2010008632A (es) | 2008-02-08 | 2010-08-30 | Ambrx Inc | Leptina-polipeptidos modificados y sus usos. |
EP2318029B1 (de) | 2008-07-23 | 2017-11-01 | Ambrx, Inc. | Modifizierte bovine g-csf-polypeptide und ihre verwendung |
CA2738033C (en) | 2008-09-26 | 2019-11-26 | Ambrx, Inc. | Non-natural amino acid replication-dependent microorganisms and vaccines |
KR101647164B1 (ko) | 2008-09-26 | 2016-08-09 | 암브룩스, 인코포레이티드 | 변형된 동물 에리트로포이에틴 폴리펩티드 및 이의 용도 |
CN102666578A (zh) | 2009-12-21 | 2012-09-12 | Ambrx公司 | 经过修饰的猪促生长素多肽和其用途 |
PE20121707A1 (es) | 2009-12-21 | 2012-12-17 | Ambrx Inc | Polipeptidos de somatotropina bovina modificados y sus usos |
RS59193B1 (sr) | 2010-08-17 | 2019-10-31 | Ambrx Inc | Modifikovani polipeptidi relaksina i njihova primena |
US9567386B2 (en) | 2010-08-17 | 2017-02-14 | Ambrx, Inc. | Therapeutic uses of modified relaxin polypeptides |
TWI480288B (zh) | 2010-09-23 | 2015-04-11 | Lilly Co Eli | 牛顆粒細胞群落刺激因子及其變體之調配物 |
TW202124419A (zh) | 2014-10-24 | 2021-07-01 | 美商必治妥美雅史谷比公司 | 經修飾之fgf-21多肽及其用途 |
WO2018148419A1 (en) | 2017-02-08 | 2018-08-16 | Bristol-Myers Squibb Company | Modified relaxin polypeptides comprising a pharmacokinetic enhancer and uses thereof |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU600885B2 (en) * | 1984-05-25 | 1990-08-30 | Zymogenetics Inc. | Stable DNA constructs |
ATE85812T1 (de) * | 1985-11-13 | 1993-03-15 | Xoma Corp | Verkuerzter phosphoglycerat-kinase-promotor. |
-
1988
- 1988-03-23 EP EP88104649A patent/EP0284044B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-23 JP JP63069222A patent/JP2795850B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-23 DE DE3888561T patent/DE3888561T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-23 AT AT88104649T patent/ATE103333T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-03-23 CA CA000562260A patent/CA1304020C/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-23 DK DK198801591A patent/DK175243B1/da not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DK159188D0 (da) | 1988-03-23 |
DK159188A (da) | 1988-12-14 |
EP0284044B1 (de) | 1994-03-23 |
CA1304020C (en) | 1992-06-23 |
JPS6416587A (en) | 1989-01-20 |
DE3888561D1 (de) | 1994-04-28 |
JP2795850B2 (ja) | 1998-09-10 |
DK175243B1 (da) | 2004-07-19 |
EP0284044A1 (de) | 1988-09-28 |
ATE103333T1 (de) | 1994-04-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE3888561T2 (de) | Hohe Proteinsyntheserate in Hefe. | |
US5037743A (en) | BAR1 secretion signal | |
DE3885668T2 (de) | Kluyveromyces als Wirtsstamm. | |
DE3587759T2 (de) | Erhöhte Hefetranskription unter Verwendung einer Hybridkonstruktion der Promotorregion. | |
DE69332893T2 (de) | Methode zur erhöhung der produktion von rekombinanten disulfidverknüpften-proteinen in (saccharomyces cerevisiae) | |
DE3881776T2 (de) | DNS-Konstruktionen, enthaltend eine Kluyveromyces-alpha-Factor-Leadersequenz zur Leitung der Sekretion von heterologen Polypeptiden. | |
DE3308215C2 (de) | Expression, Processing und Sekretion von heterologem Protein durch Hefe | |
DE3382658T2 (de) | Glycolytische promotoren fuer regulierte proteinexpression: protease-inhibitor. | |
KR0181179B1 (ko) | 피치아 파스토리스 산성 인산효소 유전자의 디앤에이 단편 및 이를 사용하는 방법 | |
DE68928545T2 (de) | Herstellung von glukoseoxidase in rekombinanten systemen | |
DE68929115T2 (de) | Verfahren zur Herstellung von menschlichem Serumalbumin in Hefe | |
DE3884610T2 (de) | Durch sterole regulierbare promoterelemente. | |
DE3486206T2 (de) | Expressionssysteme für Hefe mit PyK-Promotoren enthaltenden Vektoren und Synthese von Fremdproteinen. | |
DE3486452T2 (de) | Superoxiddismutase und deren Expression in Mikroorganismen | |
EP0139383A1 (de) | Verfahren zur Expression fremder Gene in "Schizosaccharomyces pombe" und die Verwendung dieser Produkte in therapeutischen Zusammensetzungen sowie DNA-Konstruktionen und transformante Stämme von "Schizosaccharomyces pombe", die für ein solches Verfahren verwendet werden können und ihre Herstellung | |
DE3751269T2 (de) | Expression des biologisch aktiven Faktors XIII. | |
CZ284251B6 (cs) | Způsob výroby heterologního proteinu v transformované buňce | |
DE69025457T2 (de) | Mutantschimmelstammnachweis | |
DE69028884T2 (de) | Protein mit Urate-Oxidase-Aktivität, dafür kodierendes rekombinantes Gen, Expressionsvektor, Mikroorganismen und Transformanten | |
EP0324712B1 (de) | Hirudin-Derivat | |
DE3887082T2 (de) | Verfahren zur Regulierung der Proteinglycosylierung. | |
EP0494702A2 (de) | Gentechnische Herstellung von Faktor XIIIa | |
DE69226028T2 (de) | Mutanter AOX2 Promotor, Mikroorganismen es enthaltend, Verfahren zur Herstellung und Produktion von heterologem Protein, das solche Mikroorganismen benutz | |
DE3689918T2 (de) | Verfahren zur Verwendung von BAR1 für die Fremdproteinsekretion. | |
DE69331434T2 (de) | Mutanter AOX2 Promotor, diesen enthaltender Vektor, transformierte Zellen und Herstellung von heterologen Proteinen |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8364 | No opposition during term of opposition |