BR112019016139A2 - polipeptídio de relaxina modificada compreendendo um melhorador farmacocinético e usos do mesmo - Google Patents

Abstract

a presente invenção refere-se de modo geral a polipeptídios de relaxina modificados, tais como os polipeptídios de relaxina 2 humana modificada, compreendendo um aminoácido codificado artificialmente que é ligado a um melhorador farmacocinético, e usos terapêuticos de tais polipeptídios, tal como para o tratamento de condições cardiovasculares (tal como insuficiência cardíaca) e/ou condições relacionadas à fibrose.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para POLIPEPTÍDIO DE RELAXINA MODIFICADA COMPREENDENDO UM MELHORADOR FARMACOCINÉTICO E USOS DO MESMO. Descrição de Pedidos Relacionados [001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório US 62/627,411, depositado em 7 de 2018 e do Pedido Provisório US N° 62/456,161, depositado em 8 de fevereiro de 2017, a íntegra de todos os documentos listados acima encontrando-se aqui incorporada a título de referência.

Descrição de Sequências [002] Este pedido inclui, como parte de sua descrição, uma listagem de sequências biológicas, contidas em um arquivo denominado 46561o2413.txt que tem um tamanho de 150.746 bytes, que foi criado em 8 de fevereiro de 2018, 8, cuja íntegra encontra-se aqui incorporada a título de referência.

Antecedentes da Invenção [003] A presente invenção refere-se em geral a polipeptídios de relaxina modificada, tais como polipeptídios de relaxina 2 humana modificada, compreendendo um melhorador farmacocinético, e aos usos terapêuticos de tais polipeptídios, tal como para o tratamento de condições cardiovasculares (tal como insuficiência cardíaca) e/ou condições relacionadas à fibrose. Em modalidades exemplificativas, o melhorador farmacocinético é ligado a um aminoácido codificado artificialmente,que pode ser ribossomalente incorporadono polipeptídio de relaxina.

[004] Insuficiência cardíaca (HF) representa uma carga enorme no sistema de saúde atual com uma prevalência estimada nos Estados Unidos de 5,8 milhões e mais de 23 milhões ao redor do mundo (Roger et al., 2012. Circulation, 125(1): e2-e220). Os sintomas de HF são resultado de débito cardíaco inadequado e podem ser debilitantes

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2/197 dependendo do estágio avançado da doença. Os principais sintomas e sinais de HF incluem: 1) dispnéia (dificuldade de respirar) resultante de edema pulmonar devido ao fluxo direto ineficaz a partir do ventrículo esquerdo e à pressão aumentada no leito capilar pulmonar; 2) ocorre edema nas extremidades inferiores quando o ventrículo direito é incapaz de acomodar o retorno venoso sistêmico; e 3) fadiga devido à incapacidade do coração debilitado de sustentar débito cardíaco suficiente para satisfazer as necessidades metabólicas do corpo (Kemp & Conte, 2012. Cardiovascular Pathology, 21:365-371).

[005] Muitas doenças contributivas, fatores de risco, e alterações patológicas podem basicamente levar à insuficiência cardíaca (Jessup & Brozena, 2003. N Engl J Med, 348(20): 2007-2018). Eventos prejudiciais que se acreditava estarem envolvidos na patofisiologia de HF variam desde uma lesão muito aguda tal como infarto do miocárdio até uma lesão mais crônica tal como hipertensão por toda a vida. O índice de mortalidade permance alto com -50% das pessoas com HF morrendo dentro de 5 anos a partir do diagnóstico (Roger et al., 2012. Circulation, 125(1): e2-e220; Roger et al., 2004. Jama, 292(3): 344-50). A insuficiência cardíaca representa nitidamente uma necessidade médica significativa ainda não atendida.

[006] O hormônio relaxina 2 humana (também chamado de relaxina H2) é um peptídio de 6 kDa composto de 53 aminoácidos que é conhecido como sendo responsável pela remodelagem do trato reprodutivo antes da parte, facilitando assim o processo do nascimento. Embora predominantemente um hormônio de gravidez, a relaxina também foi detectada em mulheres não grávidas bem como nos homens. Relaxina humana é um membro da família de peptídios insulínicos que inclui insulina, inúmeros peptídios semelhantes à insulina (INSL3-6), e os fatores de crescimento semelhantes à insulina (IGFI e IGFII) (Van Der Westhuizen et al., 2007. Curr Drug Targets,

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8(1): 91-104). Todos esses peptídios heterodiméricos são estruturalmente relacionados entre sistema imunológico e são compreendidos de duas cadeias peptídicas (A & B) que são conectadas por duas ligações dissulfeto, e com a cadeia A contendo uma única ligação dissulfeto intramolecular. O receptor para relaxina 2 (H2), denominado Receptor 1 de Peptídios da Família da Relaxina (RXFP1), é conservado entre camundongos e seres humanos com 85% de identidade de aminoácidos é essencialmente ubiquamento expresso em seres humanos e em outras espécies (Halls et al., 2007. Br J Pharmacol, 150(6): 677-91).

[007] Durante a gestação humana, com o propósito de atender às demandas nutricionais impostas pelo feto, o corpo da mulher sofre uma redução significativa de -30% na resistência vascular sistêmica (SVR) e um aumento concomitante de -50% no débito cardíaco (Jeyabalan, 2010: Renal e Electrolyte Disorders. Lippincott Williams & Wilkins. 462518; Clapp e Capeless, 1997. Am J Cardiol, 80(11): 1469-73). Adaptações vasculares adicionais incluem um aumento de -30% na complacência arterial global que é importante para manutenção do acoplamento ventricular-arterial eficiente, assim como um aumento de -50% tanto no fluxo sanguíneo renal (RBF) quanto na taxa de filtração glomerular (GFR), importantes para eliminação dos resíduos metabólicos (Jeyabalan, 2010: Renal e Electrolyte Disorders. Lippincott Williams & Wilkins. 462-518; Poppas et al., 1997. Circulation, 95(10): p. 2407-15). Tanto estudos pré-clínicos em roedores quanto estudos clínicos realizados em uma diversidade de cenários de pacientes oferecem evidências de que a relaxina está envolvida, pelo menos até certo ponto, na mediação dessas alterações fisiológicas adaptativas (Conrad, 2011. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 301 (2), R267275; Teichman et al., 2009. Heart Fail Rev, 14(4), 321-329.). Muitas dessas respostas adaptativas provavelmente beneficiariam pacientes

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4/197 com HF já que fibrose em excessivo, complacência arterial pobre, e função renal pobre são todas características comuns em pacientes com insuficiência cardíaca (Mohammed et al., 2015. Circulation, 131(6), 550559), (Wohlfahrt et al., 2015. Eur J Heart Faila, 17(1), 27-34; Dammon et al., 2011. Prog Cardiovasc Dis, 54(2), 144-153). Como aproximadamente 30% dos pacientes com HF sofrem de enfraquecimento renal moderado a severo (Triposkiadis and Skoularigis, 2012. Curr Heart Fail Rep, (4):354-62), um agente tal como relaxina melhorando tanto o fluxo vascular quanto a manipulação de eletrólitos, pode ser de particular benefício para pacientes com HF.

[008] O peptídio relaxina tem uma meia-vida farmacocinética curta: Serelaxina, um peptídio relaxina humana recombinante, que foi desenvolvido para o tratamento de HF, tem uma meia-vida farmacocinética curta de 5-15 minutos na primeira fase, e precisa de 48 horas de infusão intravenosa contínua para ter utilidade terapêutica (REASANZ (serelaxin) Briefing Document Prepared by Novartis for FDA Cardiovascular and Renal Drugs Advisory Committee Meeting. February 26, 2014). Para doenças crônicas como insuficiência cardíaca, uma molécula de relaxina com um perfil farmacocinético melhorado oferece a oportunidade de vias alternativas para administração da droga, além da infusão intravenosa contínua, eyond continuous intravenous infusion, suscetível de ser mais favorável como um terápico para pacientes que sofrem de doenças crônicas.

Sumário da Invenção [009] São apresentados neste pedido polipeptídios de relaxina modificados compreendendo um aminoácido codificado artificialmente, onde (a) o polipeptídio de relaxina compreende a cadeia A do polipeptídio de relaxina de SEQ ID NO: 4 e a cadeia B do polipeptídio de relaxina de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6, substituídos com um aminoácido codificado artificialmente em uma posição selecionada do

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5/197 grupo que consiste em: resíduo 1 da cadeia A, resíduo 2 da cadeia A, resíduo 5 da cadeia A, resíduo 13 da cadeia A, resíduo 18 da cadeia A, resíduo 5 da cadeia B, resíduo 7 da cadeia B, e resíduo 25 da cadeia B, e tendo opcionalmente até duas substituições, inserções e/ou deleções aminoacíficas adicionais na referida cadeia A da relaxina e/ou na referida cadeia B da relaxina; (b) o referido aminoácido codificado artificial mente tem a estrutura:

onde o grupo R é qualquer substituinte diferente da cadeia lateral encontrada em alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteina, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina ou valina; e (c) o referido aminoácido codificado artificialmente é ligado a um melhorador farmacocinético compreendendo um componente peptídico entre 2 e 30 aminoácidos e uma porção prolongadora da meiavida.

[0010] Também é apresentado neste pedido um polipeptídio de relaxina modificada compreendendo AQ1-GGGGS-Glu^Y (SEQ ID NO: 139)-C14-COOH que tem a estrutura:

o

AQI-Reíasana: \ h _H O , ο «

í. :! „ S i ü « A A N — Λκ Λ -----. ----. ,ΟΗ éH, á ^H ô ^M ò ^H «V o (Fórmula HI), onde a referida AQ1 -Relaxina compreende um polipeptídio da cadeia A da relaxina tendo pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 35 e um polipeptídio da cadeia B da relaxina tendo pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 5 ou com a SEQ ID NO: 6, onde a paraacetil-fenilalanina modificada representada na fórmula III fica localizada no terminal N da referida cadeia A do polipeptídio de relaxina.

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6/197 [0011] Também é apresentado neste pedido um polipeptídio de relaxina modificada compreendendo AQ1-Relaxina-GGGGS-Glu^Y (SEQ ID NO: 139)-C14-COOH, que tem a estrutura de fórmula III descrita neste pedido, onde a AQ1-Relaxina compreende um polipeptídio da cadeia A da relaxina de SEQ ID NO: 35 e um polipeptídio da cadeia B da relaxina de SEQ ID NO: 6, onde a para-acetil-fenilalanina modificada representada na fórmula III fica localizada no terminal N da referida cadeia A do polipeptídio de relaxina.

[0012] Também é apresentado neste pedido um polipeptídio de relaxina modificada compreendendo a estrutura shown in FIG. 8.

[0013] Também é apresentado neste pedido um polipeptídio de relaxina modificada compreendendo a estrutura mostrada na FIG. 9.

[0014] Em um outro aspecto, é apresentada neste pedido uma composição farmacêutica compreendendo um polipeptídio de relaxina modificada descrito neste relatório e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0015] Em um outro aspecto, é apresentada neste pedido uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de de um polipeptídio de relaxina modificada descrito neste pedido para o tratamento de um distúrbio associado à relaxina e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0016] Em um outro aspecto, é apresentado neste pedido um método para tratar uma doença associada à relaxina compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um polipeptídio de relaxina modificada ou de uma composição compreendendo um polipeptídio de relaxina modificada descrito neste pedido.

[0017] Em um outro aspecto, é apresentado neste pedido um método para tratar uma doença cardiovascular compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um polipeptídio de relaxina modificada ou de uma composição compreendendo um polipeptídio de

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7/197 relaxina modificada descrito neste pedido a um paciente com necessidade do mesmo.

[0018] Em um outro aspecto, é apresentado neste pedido um método para tratar ou aliviar um sintoma de insuficiência cardíaca compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um polipeptídio de relaxina modificada ou de uma composição compreendendo um polipeptídio de relaxina modificada descrito neste pedido a um paciente com necessidade do mesmo.

[0019] Em um outro aspecto, é apresentado neste pedido um método para tratar uma doença associada à fibrose, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídio de relaxina modificada ou de uma composição compreendendo um polipeptídio de relaxina modificada descrito neste pedido a um paciente com necessidade do mesmo.

[0020] Em um outro aspecto, é apresentado neste pedido um método para tratar ou prevenir insuficiência renal, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídio de relaxina modificada ou de uma composição compreendendo um polipeptídio de relaxina modificada descrito neste pedido a um paciente com necessidade do mesmo.

[0021] Em um outro aspecto, é apresentado neste pedido um método para melhorar, estabilizar ou restaurar a função renal em um paciente com necessidade do mesmo, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídio de relaxina modificada ou de uma composição compreendendo um polipeptídio de relaxina modificada descrito neste pedido ao paciente.

[0022] Em um outro aspecto, é apresentado neste pedido um método para produzir um polipeptídio de relaxina modificada descrito neste pedido, compreendendo: (a) apresentar um polipeptídio compreendendo a referida cadeia A da relaxina e a referida cadeia B da

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8/197 relaxina, onde o referido polipeptídio compreende o referido aminoácido codificado artificialmente; e (b) ligar o referido aminoácido codificado artificialmente ao referido melhorador farmacocinético.

Breve Descrição das Várias Vistas dos Desenhos [0023] FIG. 1. Sequência de um polipeptídio de relaxina 2 humana sem um aminoácido codificado artificialmente. Os polipeptídios de cadeia A (SEQ ID NO: 4) e de cadeia B (SEQ ID NO: 6) são ligados por ligações dissulfeto representadas na FIG. 5. A posição 1 na cadeia B é modificada em relação à cadeia B do polipeptídio de relaxina 2 (SEQ ID NO: 5) (posição sublinhada, ácido aspártico substituído com alanina como mostrado), que se verificou melhorar a produção sem afetar adversamente a potência de forma significativa. Nos exemplos funcionais deste pedido esse polipeptídio é chamado de tipo selvagem ou WT-RLX.

[0024] FIG. 2. Sequência de RLX-AQ1 (AQ1), um polipeptídio de relaxina 2 humana com um aminoácido codificado artificialmente, paraacetil-fenilalanina (pAcF, sublinhada) substituindo a posição 1 da cadeia A. A cadeia A (SEQ ID NO: 35) e a cadeia B (SEQ ID NO: 6) são ligadas por ligações dissulfeto nas posições representadas na FIG. 5.

[0025] FIG. 3. Sequência de RLX-BM25/AN1 (BM25/AN1), um polipeptídio de relaxina humana com um aminoácido codificado artificialmente, para-acetil-fenilalanina (pAcF, sublinhada) substituindo a posição 25 da cadeia B, e ainda a posição 1 da cadeia A contém a substituição de asparagina por glutamina (sublinhada). A cadeia A (SEQ ID NO: 36) e a cadeia B (SEQ ID NO: 37) são ligadas por ligações dissulfeto nas posições representadas na FIG. 5.

[0026] FIG. 4. Representação esquemática de um polipeptídio prepro-relaxina para expressão de RLX-AQ1. Um polipeptídio preprorelaxina (SEQ ID NO: 38) é expresso em E. coliou em outro sistema de expressão. Um aminoácido codificado artificialmente tal como pAcF

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9/197 pode ser incorporado de forma ribossômica na sequência de polipeptídios prepro-relaxina, facilitando a subsequente ligação a um melhorador farmacocinético (extensor farmacocinético). A sequência líder específica para expressão em E. coli está indicada por círculos cinza. O peptídio C (peptídio conector), derivado de pro-insulina com sítios de divagem de peptídio adicionados e uma substituição de Lys por Gly, está indicada por círculos pretos. A sequência líder o peptídio C são removidos por divagem enzimática (sítios de divagem indicados por setas não marcadas). A substituição de alanina no resíduo 1 da cadeia B (B1) (presente na SEQ ID NO: 6) ajuda a remover a sequência líder. O resíduo pAcF para ligação do melhorador farmacocinético específico para o sítio está indicado. As cadeias A e B alinham-se com o HUGO denominado RLN2 e são derivadas do cDNA da variante 1 do transcrito relaxina2 (refseq NM_134441).

[0027] FIG. 5. Representação estrutural de RLX-AQ1 madura compreendendo uma cadeia A (SEQ ID NO: 36) e uma cadeia B (SEQ ID NO: 6), que é ligada através de um aminoácido codificado artificialmente na posição 1 da cadeia A a um melhorador farmacocinético (PK extender).

[0028] FIGURAS 6A-6B. Efeitos de WT-RLX (FIG. 6A) e AQ1GGGGS-Glu^Y (SEQ ID NO: 139)-C14-COOH (FIG. 6B) nas alterações na expressão gênica de alfa-actina do músculo liso em fibroblastos cardíacos humanos tratados com TGF-beta usando qRT-PCR para medir as concentrações de mRNA. Os números acima das barras indicam a redução percentual vs. TGF-beta apenas com veículo fixado como linha basal. Média ± SEM; *P < 0,05. Veh = veículo. nM = nanomolar.

[0029] FIGURAS 7A-7D. Vacuolização epitelial no túbulo cortical renal relacionada com PEG em ratos Sprague Dawley fêmeas. Rim de ratos tratados por via subcutânea (SQ) uma vez ao dia com veículo ou

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10/197 análogos de relaxina. Análogos de relaxina contendo PEG (FIGS. 7B e 7C) apresentam acentuada vacuolização tubular cortical caracterizada pela presença de vacúolos coalescentes grandes. Não são observados vacúolos em veículo (FIG. 7A) ou em animais tratados com relaxina não peguilada (FIG. 7D). FIG. 7A: Veículo (150 mM Arg in 10 mM citrate buffer pH 5,5) SQ por 10 dias. FIG. 7B: AQ1-PEG36-Glu-C13-COOH (1,5 kD PEG) SQ a 40 mg/kg/dia por 7 dias. FIG. 7C: AQ1 -20-kDa-PEG (20 kD PEG) SQ a 15 mg/kg/dia por 10 dias. FIG. 7D: AQ1-GGGGSGlu^Y (SEQ ID NO: 139)-C14-COOH SQ a 40 mg/kg por 7 dias. Amplificação 40χ, H&E.

[0030] FIG. 8. Estrutura de AQ1-GGGGS-Glu^Y (SEQ ID NO: 139)C14-COOH representada na fórmula III.

[0031] FIG. 9. Estrutura de AQ1-GGGGS-Glu^Y (SEQ ID NO: 139)C14-COOH representada na fórmula III.

Descrição Detalhada

Definições [0032] Conforme usado neste relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas no singular um, uma, e o/a incluem a referência no plural a menos que nitidamente indicado em contrário pelo contexto. Assim sendo, por exemplo, uma referência a uma relaxina, polipeptídio de relaxina, ou polipeptídio de relaxina modificada representa uma referência a uma ou mais dessas proteínas e inclui seus equivalentes conhecidos pelos especialistas na técnica, e assim por diante.

[0033] A menos que definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos usads neste relatório descritivo têm o mesmo significado que aquele comumente conhecido pelo especialista na técnica à qual esta invenção pertence.

[0034] Os termos extensor farmacocinético, melhorador farmacocinético, extensor PK, e melhorador PK são usasdos

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11/197 intercambiavelmente e cada um deles indica uma porção farmaceuticamente aceitável, um domínio, ou uma molécula covalentemente ligada (conjugada ou fundida) ao polipeptídio de relaxina modificada descrito neste pedido, opcionalmente por meio de um aminoácido codificado artificialmente, que previne, retarda ou mitiga a degradação proteolítica in vivo ou outra modificação química do polipeptídio de relaxina modificada que diminui sua atividade, aumenta a meia-vida (a meia-vida sérica e/ou a meia-vida terapêutica), e/ou melhora ou altera outras propriedades farmacocinéticas ou biofísicas incluindo, porém sem limitação, aumento da taxa de absorção, redução da toxicidade, melhora da solubilidade, redução da agregação, aumento da atividade biológica e/ou da seletividade alvo do polipeptídio de relaxina modificada, e/ou redução da imunogenicidade do polipeptídio de relaxina modificada, em comparação com uma referência tal como uma forma não conjugada do polipeptídio de relaxina modificada do polipeptídio relaxina do tipo selvagem. O melhorador farmacocinético descrito neste pedido pode compreender um componente peptídico, compreendendo um ou mais aminoácidos, e uma porção prolongadora da meia-vida.

[0035] O termo porção extensora da meia-vida refere-se a uma porção, domínio, ou molécula farmaceuticamente aceitável covalentemente ligada (conjugada ou fundida) ao polipeptídio de relaxina modificada descrito neste pedido, por exemplo, como um componente de um extensor PK, opcionalmente por meio de um aminoácido codificado artificialmente, diretamente ou via um ligante (por exemplo, um componente peptídico ou PEG), que aumenta a meia-vida (a meia-vida sérica e/ou a meia-vida terapêutica), e/ou que melhora ou altera outras propriedades farmacocinéticas ou biofísicas incluindo, porém sem limitação, aumento da taxa de absorção, redução da toxicidade, melhora da solubilidade, redução de agregação, aumento da

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12/197 atividade biológica e/ou seletividade alvo do polipeptídio relaxina modificada, aumento da manufaturabilidade, e/ou redução da imunogencidade do polipeptídio de relaxina modificada, em comparação com um comparativo tal como uma forma não conjugada do polipeptídio de relaxina modificada ou do polipeptídio de relaxina do tipo selvagem. O termo porção extensora da meia-vida inclui, porém sem limitação, porções extensoras da meia-vida não proteináceas, tais como um ácido graxo ou um derivado do mesmo, um polímero solúvel em água tal como polietileno glicol (PEG) ou PEG discreto, amido hidroxietílico (HES), um lipídio, um grupo acil ramificado ou não ramificado, um grupo C8-C30 acil ramificado ou não ramificado, um grupo alquil ramificado ou não ramificado, e um grupo C8-C30 alquil ramificado ou não ramificado; e porções extensoras da meia-vida proteináceas, tais como albumina sérica, transferrina, adnectina (por exemplo, adnectina de ligação à albumina ou adnectina extensora da farmacocinética (PKE)), domínio Fc, e polipeptídio não estruturado, tal como os polipeptídios XTEN e PAS (por exemplo, sequências de polipeptídios desordenados conformacionalmente compostas dos aminoácidos Pro, Ala, and/or Ser), e uma fragmento de qualquer um dos anteriores. O termo ligante ou espaçador pode ser qualquer componente que liga uma porção prolongadora da meia-vida ao polipeptídio relaxina modificada. Ligantes exemplificativos incluem, porém sem limitação, compostos orgânicos pequenos, polímeros solúveis em água de diversos comprimentos tais como poli(etileno glicol) ou polidextrana, e peptídios ou polipeptídios, por exemplo, de até 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10 ou até 6 aminoácidos de comprimento.

[0036] O termo componente peptídico refere-se a um componente um extensor PK e compreende a peptide de até 50 aminoácidos de comprimento. Componentes peptídicos exemplificativos incluem, porém sem limitação, peptídios de até 40, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3,

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2, ou 1 aminoácidos de comprimento. Tal componente peptídico pode ligar covalentemente uma porção prolongadora da meia-vida ao polipeptídio de relaxina modificada descrito neste pedido. Em algumas modalidades, o componente peptídico pode compreender 2-50 aminoácidos. Em algumas modalidades, o componente peptídico pode compreender 2-30 aminoácidos. Em algumas modalidades, o componente peptídico pode compreender 3-20 aminoácidos. Em algumas modalidades, o componente peptídico pode compreender 5-10 aminoácidos.

[0037] O termo estabilidade ou estabilidade térmica refere-se à capacidade de um polipeptídio de resistir ao desenovelamento quando aquecido. Geralmente, quanto mais alta a estabilidade térmica de uma molécula, mais a temperatura que é necessária para que o polipeptídio seja desenovelado. Métodos exemplificativos para determinação da estabilidade térmica de um polipeptídio são os métodos de calorimetria diferencial de varredura (DSC) e de fluorescência por varredura térmica. A estabilidade térmica pode ser determinada em relação a um composto comparativo, por exemplo, para identificar um polipeptídio com estabilidade térmica aumentada.

[0038] O termo agregação refere-se à tendência de um polipeptídio de formar complexos ligados de forma não covalente com outras moléculas (tais como outras moléculas do mesmo polipeptídio), formando assim complexos de alto peso molecular. Métodos exemplificativos para medir a formação de agregados incluem cromatografia de exclusão por tamanho. As quantidades relativas de agregação podem ser determinadas em relação a um composto comparativo, por exemplo, para identificar um polipeptídio com agregação reduzida.

[0039] O termo desamidação refere-se à tendência dos resíduos aminoacídicos em um polipeptídio de sofrer uma reação de

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14/197 desamidação, alterando assim a estrutura química do aminoácido, e afetando potencialmente a função do polipeptídio. Métodos exemplificativos para medir a desamidação incluem focalização isoelétrica capilar por imagem (iclEF). A quantidade relativa de desamidação pode ser determinada em relação a um composto comparativo, por exemplo, para identificar um polipeptídio com desamidação reduzida.

[0040] O termo proteólise in vivo refere-se à divagem de um polipeptídio quando introduzido em sistema vivo (por exemplo, qunado injetado em um organismo) que pode resultar de proteases que ocorrem no referido organismo. A proteólise pode afetar potencialmente a atividade biológica ou a meia-vida de um polipeptídio. Por exemplo, relaxina do tipo selvagem pode sofrer divagem, resultando em um polipeptídio truncado inativo. Um método exemplificativo para medir a proteólise in vivo da relaxina é o imunoensaio imunoabsorvente eletroquimioluminescente baseado na Meso Scale Discovery (MSD) (ECLIA). A quantidade relativa de proteólise in vivo pode ser determinada em relação a um composto comparativo, por exemplo, para identificar um polipeptídio com proteólise in vivo reduzida.

[0041] O termo solubilidade refere-se à quantidade de uma substância que pode dissolver em outra substância, por exemplo, a quantidade de um polipeptídio de relaxina não modificada ou modificada que pode dissolver em uma solução aquosa. Um método exemplificativo para medir a solubilidade de um polipeptídio de relaxina não modificada ou modificada é o teste de solubilidade em fluxo de tampão. A solubilidade relativa pode ser determinada em relação a um composto comparativo, por exemplo, para identificar um polipeptídio com solubilidade aumentada.

[0042] O termo atividade biológica ou bioatividade refere-se à capacidade de uma molécula de afetar quaisquer propriedades físicas

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15/197 ou bioquímicas de um sistema, via, molécula ou interação biológica relacionada com um organismo, incluindo, porém sem limitação, vírus, bactérias, bacteriofago, transposon, prion, insetos, fungos, plantas, animais, e seres humanos. Por exemplo, no contexto de uma relaxina não modificada ou modificada, atividade biológica inclui qualquer uma das funções realizadas pela relaxina. Por exemplo, um polipeptídio de relaxina modificada biologicamente ativo pode ter uma ou mais das atividades biológicas da relaxina do tipo selvagem, incluindo, porém sem limitação: ativação de um receptor RXFP1 de relaxina 2 incluindo ortólogos de RXFP1 humanos e não humanos, ativação de outro receptor de relaxina tal como RXFP2 incluindo ortólogos humanos e não humanos, atividade antifibrótica in vitro ou in vivo, eficácia no tratamento de insuficiência cardíaca ou de uma doença fibrótica seja em um humano, em um animal não humano, e/ou em um sistema modelo, e outras atividades biológicas descritas neste pedido, por exemplo, diminuição da resistência vascular sistêmica (SVR), aumento do débito cardíaco, aumento da complacência arterial global, aumento do fluxo sanguíneo renal (RBF) e/ou da taxa de filtração glomerular (GFR). Métodos exemplificativos para determinar se uma molécula possui pelo menos uma atividade biológica de relaxina do tipo selvagem (tal como o polipeptídio de relaxina do tipo selvagem de SEQ ID NO: 4 e de SEQ ID NO: 5) ensaios de atividade in vitro ou ensaio de ligação de receptor, por exemplo, o ensaio de acúmulo de cAMP intracelular. O nível relativo de atividade biológica pode ser determinado em relação a um composto comparativo, por exemplo, para identificar um polipeptídio tendo atividade biológica ou tendo atividade biológica suficientemente alta para o uso terapêutico pretendido, por exemplo, tendo uma EC50 menos de 5 vezes, 10 vezes, menos de 20 vezes, menos de 50 vezes, ou menos de 100 vezes mais alta que a EC50 de um composto comparativo, em um ensaio de atividade in vitro ou in vivo.

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16/197 [0043] O composto comparativo descrito neste pedido pode ser uma outra sequência sem uma modificação, tal como uma modificação descrita neste pedido. Por exemplo, o composto comparativo pode ser a mesma sequência de polipeptídios de relaxina modificada sem ligação a um extensor PK. Compostos comparativos exemplificativos incluem, sem limitação, o polipeptídio de relaxina do tipo selvagem de SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5, um polipeptídio de relaxina modificada de SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 6, um polipeptídio de relaxina modificada de SEQ ID NO: 36 e SEQ ID NO: 6, um polipeptídio de relaxina modificada de SEQ ID NO: 35 e SEQ ID NO: 6, ou outro composto comparativo. Em algumas modalidades, o composto comparativo pode conter pelo menos um aminoácido codificado artificialmente, que pode ser ligado a um ligante, polímero, molécula biologicamente ativa, peptídio, polipeptídio, ou porção extensora da meia-vida descrita neste pedido (por exemplo, PEG, ou ácido graxo). Em algumas modalidades, um composto comparativo pode conter pelo menos um aminoácido não codificado artificialmente, que pode ser ou não ligado a um ligante, polímero, molécula biologicamente ativa, peptídio, polipeptídio, ou porção extensora da meia-vida descrita neste pedido. Em algumas modalidades, um composto comparativo pode conter substituições, deleções e/ou deleções de aminoácidos adicionais. Em algumas modalidades, a comparação pode ser feita com uma forma acilada ou não acilada do polipeptídio; no primeiro caso, a comparação pode ser feita com um polipeptídio compreendendo ou não compreendendo um aminoácido codificado artificialmente.

[0044] O termo correspondente refere-se a uma posição (posição correspondente) ou a uma região (região correspondente) em una sequência de polipeptídios ou de polinucleotídeos que é identificada por comparação com uma sequência de referência. A sequência de referência pode ser uma sequência do tipo selvagem ou não modificada,

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17/197 tal como o polipeptídio de relaxina do tipo selvagem de SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5. Uma posição ou região correspondente pode ser identificada por alinhamento da sequência com uma sequência de referência. Por exemplo, a posição correspondente ao aminoácido 1 na cadeia A da relaxina refere-se à posição na sequência que se encontra na mesma coluna de alinhamento que o aminoácido 1 na SEQ ID NO: 4 quando aquela sequência está alinhada com a SEQ ID NO: 4. No alinhamento, o aminoácido ou nucleotídeo pode coincidir ou não com o aminoácido ou nucleotídeo na posição correspondente na sequência de referência.

[0045] O alinhamento usado para identificar uma posição correspondente ou uma região correspondente pode ser obtido por meio de um algoritmento de alinhamento convencional tal como Blast (Altschul et al., J Mol Biol. 1990 Oct 5;215(3):403-10), Smith-Waterman (Smith and Waterman, J Mol Biol. 1981 Mar 25;147(1 ):195-7), ou Needleman-Wunsch (Needleman and Wunsch, J Mol Biol. 1970 Mar;48(3):443-53). O algoritmo de Needleman-Wunsch pode ser usado para obter o alinhamento global de escore máximo (i.e., um alinhamento contendo cada resíduo em ambas as sequências, embora um alinhamento possa começar e/ou terminar em lacunas). Usando-se Blast, Smith-Waterman, ou Needleman-Wunsch, o alinhamento de escore máximo pode ser identificado usando parâmetros default, tal como o uso da matriz de pontuação BLOSUM62, uma penalidade de lacunas de abertura de 11, e uma penalidade de lacunas de extensão de 1, e (quando se usa o Blast para alinhamento pareado) um tamanho de palavra de 3.

[0046] O termo doença associada à fibrose inclui doenças, distúrbios, e condições nas quais fora observada a ocorrência de fibrose ou às quais fibrose está sabidamente ou cogitadamente associada ou que contribui para a etiologia, evolução, ou sintomas das mesmas, ou

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18/197 quais sabidamente ou cogitadamente ocorre fibrose como evolução das doenças. A fibrose pode afetar um órgão ou tecido tal como o pâncreas, o pulmão, o coração, o rim, o fígado, os Ihos, o sistema nervoso, a medula óssea, os linfonodos, o endomiocárdio, ou o retroperitôneo. Doenças exemplificativas associadas à fibrose incluem, porém sem limitação, esteato-hepatite não alcoólica, (NASH), fibrose do fígado, précirrose, cirrose, doença pulmonar parenquimatosa difusa, fibrose cística, fibrose do pulmão ou pulmonar, fibrose maciça progressiva, fibrose pulmonar idiopática, fibrose após injeção, fibrose de rim ou renal, doença renal crônica, doença renal diabética, glomerulosclerose segmentar focal, nefropatia membranosa, nefropatia por IgA, mielofibrose, insuficiência cardíaca, insuficiência cardíaca metabólica, fibrose cardíaca, fibrose capsular, catarata, cicatrização ocular, fibrose pancreática, fibrose cutânea, fibrose intestinal, estenose intestinal, fibrose endomiocardíaca, fibrose atrial, fibrose mediastinal, doença de Crohn, fibrose retroperitoneal, queloide, fibrose sistêmica nefrogênica, esclerodermia, esclerose sistêmica, artrofibrose, sindrome de Peyronie, contratura de Dupuytren, nefropatia diabética, capsulite adesiva, doença hepática alcoólica, hepatoesteatose, hepatite viral, doença biliar, hemocromatose primária, cirrose medicamentosa, cirrose criptogênica, doença de Wilson, deficiência de alfa 1-antitripsina, doença pulmonar intersticial (ILD), doença pulmonar fibrótica humana, degeneração macular, retinopatia retiniana, retinopatia vítrea, fibrose miocardíaca, oftalmopatia de Grave, ergotismo induzido por drogas, doença cardiovascular, aterosclerose/restenose, cicatrizes hipertróficas, mielofibrose primária ou idiopática, e doença do intestino inflamado (incluindo, porém sem limitação, colite colagenosa. Em algumas modalidades, a doença associada à fibrose pode incluir fibrose do fígado, fibrose de rim ou renal, fibrose do pulmão ou pulmonar, fibrose do coração ou cardíaca. Em algumas modalidades, a doença

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19/197 associada à fibrose podeser fibrose do fígado. Em algumas modalidades, a doença associada à fibrose pode ser NASH.

[0047] O termo substancialmente purificado refere-se a um polipeptídio de relaxina não modificada ou modificada que pode ser substancialmente ou essencialmente livre de componentes que normalmente acompanham ou interagem com a proteína como encontrada em seu ambiente de ocorrência natural, i.e., uma célula nativa, ou célula hospedeira no caso de polipeptídios de relaxina não modificada ou modificada produzidas de forma recombinante. O polipeptídio de relaxina não modificada ou modificada que pode ser substancialmente livre de material celular inclui preparações de proteína tendo menos de cerca de 30%, menos de cerca de 25%, menos de cerca de 20%, menos de cerca de 15%, menos de cerca de 10%, menos de cerca de 5%, menos de cerca de 4%, menos de cerca de 3%, menos de cerca de 2%, ou menos de cerca de 1 % (em peso seco ou molhado) de proteína contaminante. Assim sendo, o polipeptídio de relaxina não modificada ou modificada substancialmente purificado produzido pelos métodos da presente invenção pode ter um nível de pureza de pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, especificamente, um nível de pureza de pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, e mais especificamente, um nível de pureza de pelo menos cerca de 90%, um nível de pureza de pelo menos cerca de 95%, um nível de pureza de pelo menos cerca de 99% ou mais segundo determinado por métodos apropriados tais como análise por SDS/PAGE, RP-HPLC, SEC, e eletroforese capilar.

[0048] Uma célula hospedeira recombinante ou célula hospedeira refere-se a uma célula que inclui um polinucleotídeo exógeno, independente do método usado para inserção, por exemplo,

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20/197 absorção direta, transdução, cruzamento f (f-mating), ou outros métodos conhecidos na arte de criar células hospedeiras recombinantes. O polinucleotídeo exógeno pode ser mantido como um vetor não integrado, por exemplo, um plasmídio, ou alternativamente, pode ser integrado no genoma hospedeiro.

[0049] Conforme usado neste relatório descritivo, o termo eucariota refere-se a organismos pertencentes ao domínio filogenético Eucarya tais como animais (incluindo, porém sem limitação, mamíferos, insetos, répteis, aves, etc.), ciliados, plantas (incluindo, porém sem limitação, monocotiledôneas, dicotiledôneas, algas, etc.), fungos, leveduras, flagelados, microsporidia, protistas, etc.

[0050] Conforme usado neste relatório descritivo, o termo não eucariota refere-se a organismos não eucarióticos ou a organismos procarióticos. Por exemplo, um organismo não eucariótico pode pertencer ao domínio filogenético Eubacteria (incluindo, porém sem limitação, Escherichia coli, Thermus thermophilus, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, etc.), ou ao domínio filogenético Archaea (incluindo, porém sem limitação, Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium such as Haloferax volcanii e Halobacterium species NRC-1, Archaeoglobus fulgidus, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus horikoshii, Aeuropyrum pernix, etc.).

[0051 ] Conforme usado neste relatório descritivo, o termo mediom ou meios inclui qualquer meio de cultura, solução, suporte sólido, semissólido ou rígido que possa suportar ou conter qualquer célula hospedeira, incluindo células hospedeiras bacterianas, células hospedeiras de leveduras, células hospedeiras de insetos, células hospedeiras vegetais, células hospedeiras eucarióticas, células hospedeiras de mamíferos, células CHO, células hospedeiras

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21/197 procarióticas, células hospedeiras de E. coli, ou células hospedeiras, e conteúdos celulares. Assim sendo, o termo pode abranger um meio no qual a célula hospedeira fora cultivada, por exemplo, um meio no qual o polipeptídio de relaxina não modificada ou modificada fora secretado, inclusive o meio seja antes ou depois da etapa de proliferação. O termo também pode abranger tampões ou reagentes que contêm lisados de células hospedeiras, tal como no caso em que o polipeptídio polipeptídio de relaxina não modificada ou modificada é produzido intracelularlmente e as células hospedeiras são lisadas ou rompidas para liberar o polipeptídio de relaxina não modificada ou modificada.

[0052] O termo relaxina, conforme usado neste relatório descritivo, refere-se à relaxina humana, especificamente relaxina 2 humana (também conhecida como relaxina H2 ou RLN2) a menos que o contexto indique em contrário, cuja sequência de aminoácidos e estrutura espacial são bastante conhecidas. A relaxina humana é composta por uma cadeia A de vinte e quatro aminoácidos e uma cadeia B de vinte e nove aminoácidos que são interligadas por ligações dissulfeto (vide FIG. 5). Uma relaxina do tipo selvagem apropriadamente interligada contém três pontes dissulfeto: uma entre a posição 11 da cadeia A e a posição 11 da cadeia B, uma segunda entre a posição 24 da cadeia A e a posição 23 da cadeia B, e uma terceira entre as posições 10 e 15 da cadeia A.

[0053] Conforme usado neste relatório descritivo, polipeptídio de relaxina modificada ou relaxina modificada são usados intercambiavelmente e devem incluir os polipeptídios e proteínas que diferem da relaxina do tipo selvagem (por exemplo, relaxina humana do tipo selvagem de SEQ ID NO:4 e SEQ ID NO:5) e tipicamente apresentam pelo menos uma atividade biológica da relaxina 2, assim como análogos de relaxina, isoformas de relaxina, miméticos de relaxina, polimorfismos (por exemplo, variantes da sequência da

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22/197 relaxina de ocorrência natural), fragmentos de relaxina, proteínas híbridas de relaxina, proteínas de fusão, oligômeros e multimeros, homólogos, variantes de parceiros de glicosilação, variantes, variantes de emenda, e muteínas, dos mesmos. O termo polipeptídio de relaxina modificada e relaxina modificada abrange polipeptídios de relaxina compreendendo uma ou mais substituições, adições ou deleções de aminoácidos.

[0054] As substituições em uma ampla variedade de posições aminoacídicas na relaxina de ocorrência natural podem ser incorporadas em um polipeptídio de relaxina modificada. As substituições incluindo, porém sem limitação, aquelas que modulam a solubilidade ou a estabilidade, aumentam a atividade agonista, aumentam a meia-vida in vivo ou in vitro, aumentam a resistência à protease, reduzem a imunogenicidade ou a toxicidade, facilitam a purificação ou a manufaturabilidade etc. e estão abrangidas pelo termo polipeptídio de relaxina modificada ou relaxina modificada. Em algumas modalidades, as substituições por aminoácidos codificados artificialmente descritos neste pedido podem ser combinadas com outras adições, substituições ou deleções no polipeptídio de relaxina modificada para afetar traços biológicos do polipeptídio de relaxina modificada em relação a outro polipeptídio de relaxina (por exemplo, o polipeptídio de relaxina do tipo selvagem de SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5, ou outro polipeptídio de relaxina tal como o mesmo polipeptídio de relaxina sem a referida adição, substituição, ou deleção, ou outro polipeptídio não modificado ou modificado de relaxina não modificada ou modificada). Em algumas modalidades, as outras adições, substituições ou deleções podem aumentar a estabilidade (incluindo, porém sem limitação, a resitência à degradação proteolítica) do polipeptídio de relaxina modificada ou aumentar a afinidade do polipeptídio de relaxina modificada para seu receptor. Em alguns casos,

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23/197 as outras adições, substituições ou deleções podem aumentar a estabilidade farmacêutica de um polipeptídio de relaxina modificada. Em algumas modalidades as outras adições, substituições ou deleções podem aumentar a solubilidade (incluindo, porém sem limitação, quando expresso em E. coliou outras células hospedeiras), aumentar a manufaturabilidade, ou diminuir a agregação do polipeptídio de relaxina modificada. Em algumas modalidades, as adições, substituições ou deleções podem aumentar a solubilidade do polipeptídio subsequente à expressão em E. coliou em outras células hospedeiras recombinantes. Em algumas modalidades, é possível selecionar sítios para substituição por um aminoácido codificado naturalmente ou artificialmente além de outro sítio para incorporação de um aminoácido artificial que resulta no aumento da solubilidade de um polipeptídio subsequente à expressão em E. coliou em outras células hospedeiras recombinantes.

[0055] Em algumas modalidades, os polipeptídios de relaxina modificada further comprise an additional insertion, substitution ou deletion that modulates biological activity of a relaxina modificada polypeptide. Por exemplo, the additions, substitutions ou deletions may modulate one ou more properties ou activities of relaxina modificada. Por exemplo, as adições, substituições ou deleções podem modular a afinidade para o receptor do polipeptídio de relaxina, proteínas de ligação, ou ligando associado, modular a transdução de sinais depois da ligação ao receptor de relaxina, modular a meia-vida in vivo ou circulante, modular a meia-vida terapêutica, modular a estabilidade do polipeptídio, modular a divagem pelas proteases, modular a dose, modular a liberação ou a biodisponibilidade, facilitar a purificação, diminuir a desamidação, diminuir a agregação, aumentar a vida útila ou a meia-vida in vitro, ou melhorar ou alterar uma via de administração particular. De maneira similar, os polipeptídios de relaxina modificada podem compreender sequências de divagem de proteases, grupos

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24/197 reativos, domínios de ligação de anticorpo (incluindo, porém sem limitação, FLAG ou poli-His) ou outras sequências baseadas na afinidade (incluindo, porém sem limitação, FLAG, poli-His, GST, etc.) ou moléculas ligadas (incluindo, porém sem limitação, biotina) que melhoram a detecção (incluindo, porém sem limitação, GFP), a purificação ou outros traços do polipeptídio.

[0056] O termo polipeptídio de relaxina modificada também inclui fragmentos biologicamente ativos, variantes e estereoisômeros biologicamente ativos da relaxina de ocorrência natural assim como variantes agonistas, miméticas e antagonistas da relaxina de ocorrência natural e fusões polipeptídicas dos mesmos. Fusões compreendendo aminoácidos adicionais no terminal amino, no terminal carboxila, ou em ambos, estão abrangidas pelo termo polipeptídio de relaxina modificada. Fusões exemplificativas incluem, porém sem limitação, por exemplo, metionil relaxina na qual uma metionina é ligada ao terminal N da cadeia A e/ou da cadeia B de uma relaxina resultante da expressão recombinante da forma madura da relaxina sem o peptídio líder ou sinal ou porção do mesmo (por exemplo, uma metionina é ligada ao terminal N da cadeia A e/ou da cadeia B de uma relaxina resultante da expressão recombinante, por exemplo, em E. coli), fusões com o propósito de purificação (incluindo, porém sem limitação, poli-histidina ou epítopos de afinidade), fusões com peptídios de ligação de albumina sérica tal como PKE adnectina e fusões com proteínas séricas tal como albumina sérica, e proteínas de fusão compreendendo relaxina e uma ou mais outras moléculas (parceiro de fusão), incluindo, porém sem limitação, albumina sérica, domínio Fc, região constante da imunoglobulina, polipeptídio não estruturado, e adnectina, e um fragmento dos mesmos. Qualquer um desses fragmentos pode ser preparado a partir das proteínas por métodos bioquímicos tradicionais, ou por expressão de um polinucleotídeo codificando o fragmento.

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25/197 [0057] Exceto onde indicado em contrário, em geral os termos polipeptídio de relaxina e relaxina, conforme usados neste relatório descritivo, abrangem tanto polipeptídios de relaxina não modificada (i.e., do tipo selvagem) quanto polipeptídios de relaxina modificada.

[0058] O termo polipeptídio de relaxina modificada inclui polipeptídios conjugados a um polímero tal como PEG ou um extensor PK e pode compreender opcionalmente uma ou mais derivatizações de cisteína, lisina, ou outros resíduos. Em algumas modalidades, o polipeptídio de relaxina modificada pode compreender um ligante, um polímero, ou um extensor PK, onde o aminoácido ao qual o ligante, o polímero ou o extensor PK é conjugado pode ser um aminoácido artificial de acordo com a presente invenção, ou um aminoácido codificado naturalmente (por exemplo, lisina ou cisteína) utilizando técnicas conhecidas na literatura tal como acoplamento à lisina ou cisteína.

[0059] O termo polipeptídio de relaxina modificada também inclui polipeptídios conjugados de relaxina ou ligados ao extensor PK descrito aqui via um aminoácido codificado naturalmente, por exemplo, cisteína ou lisina, no polipeptídio de relaxina. Em algumas modalidades, o aminoácido codificado naturalmente pode ser uma substituição ou inserção no polipeptídio de relaxina.

[0060] O termo polipeptídio de relaxina modificada também inclui relaxina modificada glicosilada, tal como, porém sem limitação, polipeptídios glicosilados em qualquer posição aminoacídica, formas glicosiladas N-ligadas ou O-ligadas do polipeptídio. Além disso, variantes de emenda também estão incluídas.

[0061] Todas as referências a posições aminoacídicas na relaxina não modificada ou modificada descrita neste pedido baseiam-se na posição correspondente na cadeia A de SEQ ID NO: 4 ou na cadeia B de SEQ ID NO:5, a menos que especificado em contrário. Os

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26/197 especialistas na técnica vão perceber que as posições aminoacídicas correspondentes à posição na SEQ ID NO: 4 ou 5 ou em outra sequência de relaxina podem ser facilmente identificadas em qualquer outra molécula de relaxina tal como fusões, variantes, fragmentos de relaxina, etc. Por exemplo, programas de alinhamento de sequências tal como BLAST podem ser usados para alinhar e identificar uma posição particular em uma proteína que corresponde a uma posição na SEQ ID NO: 4 ou 5 ou em outra sequência de relaxina. As substituições, deleções ou adições de aminoácidos aqui descritas em referência à SEQ ID NO: 4 ou 5, ou outra sequência de relaxina, destinam-se a referir-se também a substituições, deleções ou adições em posições correspondentes em fusões de relaxina, vari-formigas, fragmentos, etc., aqui descritos ou conhecidos na técnica e estão expressamente abrangidos pela presente descrição..

[0062] O termo polipeptídio de relaxina modificada também abrange homodímeros, heterodímeros, homomultímeros, e heteromultímeros que são formados via parceiros de fusão, tais como domínios Fc, ou que são ligados, incluindo, porém sem limitação aqueles ligados diretamente via cadeias laterais de aminoácidos codificados artificialmente, às mesmas cadeias laterais de aminoácidos codificados artificialmente ou a cadeias laterais de aminoácidos codificados artificialmente diferentes, a cadeias laterais de aminoácidos codficados naturalmente, ou indiretamente via um ligante. Ligantes exemplificativos incluem, porém sem limitação, compostos orgânicos pequenos, polímeros solúveis em água de diversos comprimentos tais como poli(etileno glicol) ou polidextrana, ou peptídios ou polipeptídios, por exemplo, de até 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ou até 1 aminoácido de comprimento.

[0063] O termo modificado, conforme usado neste relatório descritivo, refere-se a quaisquer alterações feitas em um dado

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27/197 polipeptídio, tais como alterações no comprimento do polipeptídio, na sequência de aminoácidos, na estrutura química, modificação cotranslacional, ou modificação pós-translacional de um polipeptídio. O termo modificado pós-translacionalmente refere-se a qualquer modificação de um aminoácido natural ou artificial que ocorre em um aminoácido depois de ele ser incorporado em uma cadeia polipeptídica. O termo abrange, apenas a título de exemplo, modificações in vivo cotranslacionais, modificações in vitro co-translacionais (tal como em um sistema de translação livre de células), modificações in vivo póstranslacionais, e modificações in vitro pós-translacionais.

[0064] Um aminoácido codificado artificialmente refere-se a um aminoácido que não é um dos 20 aminoácidos comuns ou pirrolisina ou selenocisteína. Outros termos que podem ser usados como sinônimos do termo aminoácido codificado artificialmente são aminoácido artificial, aminoácido não natural, aminoácido de ocorrência não natural, e várias versões hifenizadas e não hifenizadas dos mesmos. O termo aminoácido codificado artificialmente também inclui, porém sem limitação, aminoácidos que ocorrem por modificação (por exemplo, modificações pós-translacionais) de um aminoácido codificado naturalmente (incluindo, porém sem limitação, os 20 aminoácidos comuns ou pirrolisina e selenocisteína), mas que eles próprios não são naturalmente incorporados em uma cadeia polipeptídica em crescimento pelo complexo de translação. Exemplos de tais aminoácidos codificados artificialmente incluem, porém sem limitação, A/-acetilglucosaminil-L-serina, A/-acetilglucosaminil-L-treonina, e Ofosfotirosina.

[0065] No contexto de um polipeptídio de relaxina modificada, conforme usado neste relatório descritivo, os termos para-acetilfenilalanina e para-acetil-L-fenilalanina (incluindo as abreviações pAcF e pAF) também abrangem os produtos de reações químicas nas

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28/197 quais o grupo acetil na posição para está ausente e uma ligação a uma outra molécula está presente no lugar do mesmo. Assim sendo, por exemplo, em um polipeptídio de relaxina modificada that compreende uma para-acetil-fenilalanina (tal como para-acetil-L-fenilalanina), a paraacetil-fenilalanina pode compreender uma ligação oxima, triazol, amida, ou outra ligação na posição para, por exemplo, tendo uma ligação oxima que resulta da reação do grupo carbonila da para-acetil-L-fenilalanina com um grupo amino-óxi, e falta um carbono de carbonila, na posição para. Tal para-acetil-fenilalanina pode ser chamada de para-acetilfenilalanina modificada, por exemplo, para-acetil-L-fenilalanina modificada.

[0066] Um aminoácido codificado artificialmente exemplificative é a para-acetil fenilalanina (pACF). Ele pode ser sintetizado pelo procedimento anteriormente descrito em Zhang, Z., Smith, B. A. C., Wang, L., Brock, A., Cho, C. & Schultz, P. G., Biochemistry, (2003) 42, 6735-6746, cuja íntegra está aqui incorporada a título de referência.

[0067] Um grupo modificador do terminal amino refere-se a qualquer molécula que possa ser presa ao terminal amino de um polipeptídio. De maneira similar, grupo modificador terminal carbóxi refere-se a qualquer molécula que possa ser presa ao terminal carbóxi de um polipeptídio. Grupos modificadores de terminal incluem, porém sem limitação, various polímeros solúveis em água, metionina, peptídios, ou proteínas tal como albumina sérica, domínio Fc, região constante da imunoglobulina, polipeptídio não estruturado, adnectina, ou um fragmento da mesma, ácidos graxos ou derivados dos mesmos, ou outras porções que aumenta a meia-vida sérica (//? vivo) dos polipeptídios.

[0068] Os termos grupo funcional, porção ativa, grupo ativador, grupo deslocável, sítio reativo, grupo quimicamente reativo e porção quimicamente reativa são usados na técnica e neste pedido

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29/197 refere-se a porções ou unidades definíveis distintas de uma molécula. Os termos são um tanto sinônimos no campo da química e são usados neste pedido para indicar as porções de moléculas que desempenham alguma função ou atividade e são reativas com outras moléculas. [0069] O termo ligação é usado neste pedido para indicar grupos ou ligações que normalmente são formadas como resultado de uma reação química e são tipicamente ligações covalentes. Ligações hidroliticamente estáveis significam que as ligações são substancialmente estáveis em água e não reagem com água em valores de pH úteis, incluindo, porém sem limitação, em condições fisiológicas por um período de tempo prolongado, talvez até mesmo por tempo indefinido. Ligações hidroliticamene instáveis ou degradáveis significam que as ligações são degradáveis em água ou em soluções aquosas, incluindo, por exemplo, sangue. Ligações enzimaticamente instáveis ou degradáveis significam que a ligação pode ser degradada por uma ou mais enzimas. Como se sabe na técnica, PEG, ácidos graxos, e outros polímeros podem incluir ligações degradáveis no esqueleto do polímero ou no grupo ligante entre o esqueleto do polímero e um ou mais dos grupos funcionais terminaia da molécula de polímero. Por exemplo, as ligações éster que podem ser formadas pela reação de ácidos carboxílicos ou ácidos carboxílicos ativados com grupos álcool em um agente biologicamente ativo gealmente hidrolisam em condições fisiológicas para liberar o agente. Outras ligações hidroliticamente degradáveis incluem, porém sem limitação, ligações carbonato; ligações imina que podem resultar da reação de uma amina e um aldeído; ligações fosfato éster que podem ser formadas por reação de um álcool com um grupo fosfato; ligações hidrazona que podem ser o produto reacional de uma hidrazida e um aldeído; ligações acetal que podem ser o produto reacional de um aldeído e um álcool, ligações ortoéster que podem ser o produto reacional de um formiato e um álcool;

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30/197 ligações peptídio que podem ser formadas por um grupo amina, incluindo, porém sem limitação, em uma extremidade de um polímero, e um grupo carboxila de um peptídio; ligações oxima ou semicarbazona que podem ser o produto reacional de uma funcionalidade carbonila e um reagente contendo hidroxilamina ou semicarbazida; ligações oligonucleotídeo que podem ser formadas por um grupo fosforamiditp, incluindo, porém sem limitação, na extremidade de um polímero, e um grupo 5' hidroxila de um oligonucleotídeo.

[0070] Onde os grupos substituintes estão especificados por suas fórmulas químicas convencionais, escritas da esquerda para a direita, eles também abrangem os substituintes quimicamente idênticos que resultariam da estrutura escrita da direita para a esquerda, por exemplo, a estrutura CH2O é equivalente à estrutura -OCH2. As composições apresentadas neste pedido podem incluir compostos marcados isotopicamente com um ou mais átomos substituídos por um átomo com uma massa atômica ou número de massa diferente da massa atômica ou número de massa normalmente encontrado na natureza. As composições apresentadas neste pedido podem incluir isômeros, incluindo, porém sem limitação diastereômeros, enantiômeros, e misturas dos mesmos, por exemplo, L-aminoácidos e/ou D-aminoácidos (tais como para-acetil-D-fenilalanina e/ou para-acetil-L-fenilalanina).

[0071] O termo substituintes inclui, porém sem limitação, substituintes não interferentes. Substituintes não interferentes são aqueles grupos que produziem compostos estáveis. Substituintes não ou radicais interferentes incluem, porém sem limitação, halo, C1-C10 alquila, C2-C10 alquenila, C2-C10 alquinila, C1-C10 alcóxi, C1-C12 aralquila, C1-C12 alcarila, C3-C12 cicloalquila, C3-C12 cicloalquenila, fenila, fenila substituída, toluoila, xilenila, bifenila, C2-C12 alcoxialquila, C2-C12 alcoxiarila, C7-C12 ariloxialquila, C7-C12 oxiarila, C1-C6 alquilsulfinila, C1-C10 alquilsulfonila, -(CH2)m -0-(01-010 alquila)

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31/197 onde m varia de 1 a 8, arila, arila substituída, alcóxi substituído, fluoroalquila, radical heterocílico, radical heterocíclico substituído, nitroalquila, -NO2, -CN, -NRC(O)-(C1-C10 alquila), -C(O)-(C1-C10 alquila), C2-C10 alquil tioalquila, -C(O)O-( C1-C10 alquila), -OH, SO2, =S, -COOH, -NR2, carbonila, -C(O)-(C1-C10 alquil)-CF3, C(O)—CF3, -C(O)NR2, -(C1-C10 aril)-S-(C6-C10 arila), -C(O)-(C1C10 arila), -(CH2)m -0-(-(CH2)m-0-(C1-C10 alquila) onde cada m varia de 1 a 8, -C(O)NR2, -C(S)NR2, - SO2NR2, -NRC(O) NR2, NRC(S) NR2, sais dos mesmos, entre outros. Cada R, conforme usado neste relatório descritivo, é H, alquila ou alquila substituída, arila ou arila substituída, aralquila, ou alcarila.

[0072] O termo halogênio inclui flúor, cloro, iodo, e bromo.

[0073] O termo alquila, isoladamente ou como parte de outro substituinte, significa, a menos que indicado em contrário, um radical hidrocarboneto de cadeia reta ou ramificada, ou cíclico, ou uma combinação dos mesmos, que pode ser completamente saturada, mono- ou poli-insaturada e pode incluir radicais di- e multivalentes, tendo o número de átomos de carbono designado (i.e., C1 -C10 significa um a dez carbonos). Exemplos de radicais hidrocarboneto saturado incluem, porém sem limitação, grupos tais como metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, t-butila, isobutila, sec-butila, ciclo-hexila, (ciclohexil)metila, ciclopropilmetila, homólogos e isômeros de, por exemplo, n-pentila, n-hexila, n-heptila, n-octila, entre outros. Um grupo alquila insaturado é um grupo tendo uma ou mais ligações duplas ou ligações tiplas. Exemplos de grupos alquil insaturado incluem, porém sem limitação, vinila, 2-propenila, crotila, 2-isopentenila, 2-(butadienila), 2,4pentadienila, 3-(1,4-pentadienila), ethinila, 1- e 3-propinila, 3-butinila, e seus homólogos e isômeros superiores. O termo alquila, a menos que indicado em contrário, também inclui aqueles derivados de alquila definidos mais detalhadamente abaixo, tais como heteroalquila.

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Grupos alquila que se limitam a grupos hirogênio são chamados homoalquila.

[0074] O termo alquileno isoladamente ou como parte de outro substituinte significa um radical divalente derivado de um alcano, como exemplificado, porém sem limitação, pelas estruturas -CH2CH2- e CH2CH2CH2CH2-, e incluía inda aqueles grupos descritos abaixo como heteroalquileno. Tipicamente, um grupo alquila (ou alquileno) ‘terá de 1 a 24 átomos de carbono, com os grupos tendo 10 ou menos átomos de carbono sendo uma modalidade particular dos métodos e composições descritos neste pedido. Um alquila inferior ou alquileno inferior é um grupo alquila ou alquileno de cadeia mais curta, geralmente com oito ou menos átomos de carbono.

[0075] Os termos alcóxi, alquilamino e alquiltio (ou tioalcóxi) são usados em seu sentido convencional, e referem-se aos grupos alquil presos ao resto da molécula por um átomo de oxigênio, um grupo amino, ou um átomo de enxofre, respectivamente.

[0076] O termo heteroalquila, isoladamente ou em combinação com outro termo, significa, a menos que indicado em contrário, um radical hidrocarboneto de cadeia reta ou ramificada, ou cíclico, ou combinações dos mesmos, consistindo no número indicado de átomos de carbono e pelo menos um heteroátomo selecionado do grupo que consiste em O, N, Si e S, e onde os átomos de nitrogênio e enxofre podem ser opcionalmente oxidados e o heteroátomo de nitrogênio pode ser opcionalmente quaternizado. Os heteroátomos O, N e S e Si podem ser colocados em qualquer posição interna do grupo heteroalquila ou na posição em que o grupo alquil é preso ao resto da molécula. Exemplos incluem, porém sem limitação, -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2,-S(O)-CH3, CH2-CH2-S(O)2-CH3, -CH=CH-O-CH3, -Si(CH3)3, -CH2-CH=NOCH3, e -CH=CH-N(CH3)-CH3. Até dois heteroátomos podem ser

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33/197 consecutivos, tais como, por exemplo, -CH2-NH-OCH3 e -CH2-OSi(CH3)3. De maneira similar, o termo heteroalquileno, isoladamente ou como parte de outro substituinte, significa um radical divalente derivado de heteroalquila, como exemplificado, porém sem limitação, por -CH2-CH2-S-CH2 CH2- e -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-. Para grupos heteroalquileno, os mesmos heteroátomos ou heteroátomos diferentes também podem ocupar um dos terminais ou ambos os terminais da cadeia (incluindo, porém sem limitação, alquileno-óxi, alquilenodióxi, alquilenoamino, alquilenodiamino, amino-óxialquileno, entre outros). Além disso, para os grupos de ligação alquileno e heteroalquileno, a orientação dos grupos de ligação não está implícita pela direção na qual está escrita a fórmula do grupo de ligação. Por exemplo, a fórmula-C(O)2R’ representa tanto -C(O)2R’ quanto R’C(O)2.

[0077] Os termos cicloalquila e heterocicloalquila, isoladamente ou em combinação com outros termos, representam, a menos que indicado em contrário, versões cíclicas de alquila e heteroalquila, respectivamente. Assim sendo, um cicloalquila ou heterocicloalquila incluem ligações de anel saturado, paricalmente insaturado e completamente insaturado. Adicionalmente, para heterocicloalquila, um heteroátomo pode ocupar a posição na qual o heterociclo é preso ao resto da molécula. Exemplos de cicloalquila incluem, porém sem limitação, ciclopentila, ciclo-hexila, 1-ciclo-hexenila, 3-ciclo-hexenila, ciclo-heptila, entre outros. Exemplos de heterocicloalquila incluem, porém sem limitação, 1-(1,2,5,6-tetra-hidropiridila), 1-piperidinila, 2piperidinila, 3-piperidinila, 4-morpholinila, 3-morpholinila, tetrahidrofuran-2-ila, tetra-hidrofuran-3-ila, tetra-hidrotien-2-ila, tetrahidrotien-3-ila, 1 —piperazinila, 2-piperazinila, entre outros. Adicionalmente, o termo abrange estruturas anelares bicíclicas e tricíclicas. De maneira similar, o termo heterocicloalquileno

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34/197 isoladamente ou como parte de outro substituinte significa um radical divalente derivado de heterocicloalquila, e o termo cicloalquileno isoladamente ou como parte de outro substituinte significa um radical divalente derivado de cicloalquila.

[0078] O termo arila significa, a menos que indicado em contrário, um substituinte hidrogênio aromático poli-insaturado que pode ser um único anel ou múltiplos anéis (incluindo, porém sem limitação, de 1 a 3 anéis) que são fundidos um ao outro ou ligados de forma covalente. O termo heteroarila refere-se a grupos (ou anéis) arila que contêm de um 1 a quatro heteroátomos selecionados dentre N, O, e S, onde os átomos nitrogênio e enxofre são opcionalmente oxidados, e os átomos de nitrogênio são opcionalmente quaternizados. Um grupo heteroarila pode ser preso ao resto da molécula através de um heteroátomo. Exemplos não limitativos de grupos arila e heteroarila incluem fenila, 1 -naftila, 2naftila, 4-bifenila, 1-pirrolila, 2-pirrolila, 3-pirrolila, 3-pirazolila, 2imidazolila, 4-imidazolila, pirazinila, 2-oxazolila, 4-oxazolila, 2-fenil-4oxazolila, 5-oxazolila, 3-isoxazolila, 4-isoxazolila, 5-isoxazolila, 2thiazolila, 4-tiazolila, 5-thiazolila, 2-furila, 3-furila, 2-tienila, 3-tienila, 2piridila, 3-piridila, 4-piridila, 2-pirimidila, 4-pirimidila, 5-benzothiazolila, purinila, 2-benzimidazolila, 5-indolila, 1-isoquinolila, 5-isoquinolila, 2quinoxalinila, 5-quinoxalinila, 3-quinolila, e 6-quinolila. Substituintes para cada um dos sistemas anelares arila e heteroarila mencionados acima são selecionados do grupo de substituintes aceitáveis descritos abaixo.

[0079] Resumidamente, o termo arila quando usado em combinação com outros termos (incluindo, porém sem limitação, arilóxi, ariltióxi, arilalquila) inclui tanto os anéis arila quanto os anéis heteroarila definidos acima. Assim sendo, o termo arilalquila destina-se a incluir os radicais nos quais um grupo arila é preso a um grupo alquila (incluindo, porém sem limitação, benzila, fenetila, piridilmetila entre

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35/197 outros) incluindo os grupos alquila nos quais um átomo de carbono (incluindo, porém sem limitação, um grupo metileno) fora substituído, por exemplo, por um átomo oxigênio (incluindo, porém sem limitação, fenoximetila, 2-piridiloximetila, 3-(1-naftilóxi)propila, entre outros).

[0080] Cada um dos termos acima (incluindo, porém sem limitação, alquila, heteroalquila, arila e heteroarila) destina-se incluir tanto as formas substituídas como as não substituídas do radical indicado. Substituintes exemplificativos para cada tipo de radical estão apresentados abaixo.

[0081] Substituintes para os radicais alquil e heteroalquil (incluindo os grupos normalmente denominados alquileno, alquenila, heteroalquileno, heteroalquenila, alquinila, cicloalquila, heterocicloalquila, cicloalquenila, e heterocicloalquenila) podem ser um ou mais de uma variedade de grupos selecionados dentre, porém sem limitação: -OR’, =0, =NR’, =N-OR’, -NR’R, -SR’, -halogênio, -SiR’RR’, OC(O)R’, -C(O)R’, -CO2R’, -CONR’R, -OC(O)NR’R, -NRC(O)R’, NR’ C(O)NRR’, -NRC(O)2R’, -NR-C(NR’RR’)=NR, NR

C(NR’R)=NR’, -S(O)R’, -S(O)2R’, -S(O)2NR’R, NRSO2R’, -CN e NO2 em um número variando de zero a (2m’+1), onde m’ é o número total de átomos de carbono em tal radical. R’, R, R’ e R referem-se, cada um independentemente, a hidrogênio, heteroalquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, incluindo, porém sem limitação, arila substituída com 1-3 halogênios, grupos alquila, alcóxi ou tioalcóxi substituído ou não substituído, ou grupos arilalquila. Quando um composto da invenção inclui mais de um grupo R, por exemplo, cada um dos grupos R é independentemente selecionado da mesma forma que o são cada um dos grupos R’, R, R’ e R quando mais de um desses grupos está presente. Quando R’ e R são presos ao mesmo átomo de nitrogênio, eles podem ser combinados com o átomo de nitrogênio para formar um anel de 5, 6, ou 7 membros. Por

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36/197 exemplo, -NR’R inclui, porém sem limitação, 1 -pirrolidinila e 4morfolinila. Da discussão acima sobre substituintes, o especialista na técnica vai entender que o termo alquil inclui grupos que incluem átomos de carbono ligados a grupos diferentes de grupos hidrogênio, tais como haloalquila (incluindo, porém sem limitação, -CF3 e CH2CF3) e acila (incluindo, porém sem limitação, -C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3, entre outros).

[0082] De maneira similar aos substituintes descritos para o radical alquila, os substituintes para os grupos arila e heteroarila variam e são selecionados dentre, porém sem limitação: halogênio, OR’, =0, =NR’, =N-OR’, -NR’R, -SR’, -halogênio, -SiR’RR’, OC(O)R’, -C(O)R’, CO2R’, -CONR’R, -OC(O)NR’R, -NRC(O)R’, NR’ C(O)NRR’, NRC(O)2R’, NR-C(NR’RR’)=NR, NR C(NR’R)=NR’, -S(O)R’, S(O)2R’, -S(O)2NR’R, NRSO2R’, -ON e -NO2, -R’, -N3, -CH(Ph)2, fluoro(C1 -C4)alcóxi, e fluoro(C1 -C4)alquiIa, em um número que varia de zero ao número total de valências abertas no sistema anel aromático; e onde R’, R, R’ e R são independentemente selecionados dentre hidrogênio, alquila, heteroalquila, arila e heteroarila. Quando um composto da invenção inclui mais de um grupo R, por exemplo, cada um dos grupos R é independentemente selecionado da maneira como o são cada um dos grupos R’, R, R’ e R quando mais de um desses grupos está presente.

[0083] O termo ácido graxo refere-se a uma cadeia arila saturada ou não insaturada com 6 a 20 átomos de carbono ou um derivado da mesma. Em algumas modalidades, o ácido graxo pode ser ligado a um componente peptidico do melhorador farmacocinético descrito neste pedido e terminar em um ácido carboxílico ou em um grupo metila. Em algumas modalidades, o ácido graxo ligado ao componente peptidico do melhorador farmacocinético pode terminar em um ácido carboxílico. Em algumas modalidades, o ácido graxo pode ser ligado ao

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37/197 componente peptídico através de uma ligação amida. Em algumas modalidades, o ácido graxo pod ter entre 10 e 18 átomos de carbono. Em algumas modalidades, o ácido graxo pode ter entre 12 e 17 átomos de carbono. Em algumas modalidades, o ácido graxo pode ter 14, 15, ou 16 átomos de carbono. Em algumas modalidades, o ácido graxo pod ter 15 átomos de carbono.

[0084] Conforme usado neste relatório descritivo, o termo polímero solúvel em água refere-se a qualquer polímero que seja solúvel em solventes aquosos. A ligação de polímeros solúveis em água a polipeptídios de relaxina modificada pode resultar em alterações que incluem, porém sem limitação, meia-vida sérica (//? vivo) aumentada ou modulada, meia-vida terapêutica aumentada ou modulada em relação à forma não modificada, imunogenicidade ou toxicidade reduzida ou modulada, características de associação física moduladas tais como agregação e formação de multímeros reduzidas, ligação alterada ao receptor, ligação alterada a um ou mais parceiros de ligação, e dimerização ou multimerização do receptor alterada. O polímero solúvel em água pode ter ou não sua própria atividade biológica, e pode ser utilizado como um ligante para prender a relaxina modificada a outras substâncias, incluindo, porém sem limitação um ou mais polipeptídios de relaxina modificada ou não modificada, ou uma ou mais moléculas biologicamente ativas. Polímeros adequados incluem, porém sem limitação, polietileno glicol, polietileno glicol propionaldeído, derivados do tipo mono C1 -C10 alcóxi ou arilóxi dos mesmos (descritos na Patente US N° 5,252,714 que está aqui incorporado a título de referência), monometóxi-polietileno glicol, PEG discreto, polivinil pirrolidona, álcool polivinílico, poliaminoácidos, anidro maleico de éter divinílico, Λ/-(2Hidroxipropil)-metacrilamida, dextrana, derivados de dextrana incluindo sulfato de dextrana, polipropileno glicol, copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, poliol polioxietilado, heparina, fragmentos

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38/197 de heparina, polissacarídeos, oligossacarídeos, glicanas, celulose e derivados de celulose, incluindo, porém sem limitação metilcelulose e carboximetil celulose, amido e derivados de amido, polipeptídios de dois ou mais aminoácidos, polialquileno glicol e derivados do mesmo, copolímeros de polialquileno glicóis e derivados dos mesmos, éteres polivinil etílicos, e alfa-beta-poli(2-hidroxietil)-DL-aspartamida, entre outros, ou misturas dos mesmos. Exemplos de tais polímeros solúveis em; agua incluem, porém sem limitação, polietileno glicol e albumina sérica.

[0085] Conforme usado neste relatório descritivo, o termo polialquileno glicol (PEG) ou poli(alqueno glicol) refere-se a polietileno glicol (poli(etileno glicol)), polipropileno glicol, polibutileno glicol, e derivados dos mesmos. O termo polialquileno glicol abrange polímeros tanto lineares quanto ramificados e pesos moleculares entre 0,1 kDa e 100 kDa. Outras modalidades exemplificativas estão listadas, por exemplo, em catálogos de fornecedorea comerciais, tal como o catálogo da Shearwater Corporation Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications (2001).

[0086] Conforme usado neste relatório descritivo, os termos meiavida sérica modulada ou meia-vida in vivo modulada e termos similares referem-se à alteração positiva ou negativa na meia-vida circulante de uma relaxina modificada em relação a uma referência tal como sua forma não modificada ou a relaxina do tipo selvagem. A meiavida sérica pode ser medida coletando-se amostras de sangue em vários instantes após a administração da relaxina modificada, e determinando-se a concentração daquela molécula em cada amostra. A correlação da concentração sérica com o tempo permite calcular a meiavida sérica. A meia-vida sérica (in vivo) aumentada pode ser desejável mente de pelo menos cerca de duas vezes, mas um aumento menor pode ser útil, por exemplo, onde isto possibilita um regime de

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39/197 dosagem satisfatório ou evita um efeito tóxico. Em algumas modalidades, o aumento pode ser de pelo menos cerca de três vezes, pelo menos cerca de cinco vezes, pelo menos cerca de dez vezes, pelo menos cerca de vinte vezes, ou pelo menos cerca de cinquenta vezes. [0087] O termo meia-vida terapêutica modulada, conforme usado neste relatório descritivo, significa a alteração positiva ou negativa na meia-vida sérica ou in vivo da quantidade terapeuticamente eficaz do polipeptídio de relaxina modificada descrito neste pedido, em relação a uma referência tal como sua forma não modificada ou a relaxina do tipo selvagem. A meia-vida terapêutica é medida medindo-se as propriedades farmacocinéticas e/ou farmacodinâmicas da molécula em vários instantes após a administração. A meia-vida terapêutica aumentada possibilita desejável mente um regime de dosagem benéfico particular, uma dose total benéfica particular, ou evita um efeito indesejado. Em algumas modalidades, a meia-vida terapêutica aumentada resulta de potência aumentada, ligação aumentada ou reduzida da molécula modificada ao seu alvo, quebra aumentada ou reduzida da molécula por enzimas tal como proteases, ou um aumento ou redução em outro parâmetro ou mecanismo de ação da molécula não modificada ou um aumento ou redução na depuração mediada por receptor da molécula. Em algumas modalidades, o aumento na meiavida terapêutica pode ser de pelo menos cerca de duas vezes, pelo menos cerca de três vezes, pelo menos cerca de cinco vezes, pelo menos cerca de dez vezes, pelo menos cerca de vinte vezes, ou pelo menos cerca de cinquenta vezes.

[0088] O termo isolado, quando aplicado a um ácido nucleico ou a uma proteína, denota que o ácido nucleico ou a proteína está livre de pelo menos alguns dos componentes celulares aos quais ela está associada no estado natural, ou que o ácido nucleico ou a proteína fora concentrada até um nível maior que a concentração de sua produção in

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40/197 vivo ou in vitro. Ele pode estar em um estado homogêneo. As substâncias isoladas podem estar em um estado seco ou semi-seco, ou em solução, incluindo, porém sem limitação, uma solução aquosa. Ela pode ser um componente de uma composição farmacêutica que compreende veículos e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis adicionais. A pureza e a homogeneidade são tipicamente determinadas por meio de técnicas de química analítica tais como eletroforese em gel de poliacrilamida ou cromatografia líquida de alta eficiência. Uma proteína que seja a espécie predominante presente em uma preparação é substancialmente purificada. Em particular, um gene isolado é separado das fases de leitura aberta que flanqueiam o gene e codificam uma proteína diferente do gene de interesse. O termo purificado denota um ácido nucleico ou proteína que dá origem a substancialmente uma banda em um gel eletroforético. Particularmente, ele pode significar que o ácido nucleico ou proteína é pelo menos 85% puro, pelo menos 90% puro, pelo menos 95% puro, pelo menos 99% ou ainda mais puro. [0089] O termo ácido nucleico refere-se a desoxirribonucleotídeos, desoxirribonucleosídeos, ribonucleosídeos, ou ribonucleotídeos e polímeros dos mesmos seja na forma de fita simples ou de fita dupla. A menos que especificamente limitado, o termo abrange ácidos nucleicos contendo análogos conhecidos de nucleotídeos naturais que possuem propriedade de ligação similares ao ácido nucleico de referência e são metabolisados de maneira similar aos nucleotídeos de ocorrência natural. A menos que especificamente indicado em contrário, o termo também se refere a análogos de oligonucleotídeos que incluem PNA (ácido peptidonucleico), análogos de DNA usado na tecnologia antisense (fosforotioatoes, fosforoamidatoes, entre outros). A menos que indicado em contrário, uma sequência de ácidos nucleicos particular também abrange implicitamente variantes conservativamente modificadas dos mesmos

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41/197 (incluindo, porém sem limitação, substituições de códon degeneradas) e sequências complementares assim como as sequências explicitamente indicadas.

[0090] Os termos polipeptídio, peptídio e proteína são usados intercambiavelmente neste pedido para indicar um polímero de resíduos aminoacídicos. Isto é, uma descrição voltada para um polipeptídio aplica-se igualmente a uma descrição de um peptídio e a uma descrição de uma proteína, e vice-versa. Os termos aplicam-se a polímeros de aminoácidos de ocorrência natural assim como a polímeros de aminoácidos nos quais um ou mais resíduos aminoacíficos é um aminoácido codificado artificialmente. Conforme usado neste relatório descritivo, os termos abrangem cadeias de aminoácidos de qualquer comprimento, incluindo proteínas de comprimento integral, onde os resíduos aminoacídicos são ligados por ligações peptídicas covalentes. [0091] Variantes conservativamente modificadas refere-se a sequências de aminoácidos contendo substituições conservativas. Variantes conservativamente modificadas exemplificativas incluem substituições, deleções ou inserções em uma sequência de ácidos nucleicos, peptídios, polipeptídios, ou proteínas que altera, acrescenta ou deleta um único aminoácido ou uma pequena percentagem de aminoácidos na sequência de polipeptídios ou na sequência de polipeptídios codificada, por exemplo, até 1,2, 3, 4, ou 5 aminoácidos, ou até 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, ou 3,5% dos aminoácidos na sequência de polipeptídios ou na sequência de polipeptídios codificada, que opcionalmente pode ser ou pode incluir uma substituição de aminoácidos por aminoácidos quimicamente similares. Tabelas de substituições conservativas apresentando aminoácidos funcionalmente similares são conhecidas pelos especialistas na técnica. Tais variantes conservativamente modificadas são adicionais a e não excluem variantes polimórficos, homólogos interespécies, e alelos dos

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42/197 polipeptídios de relaxina modificada divuglados.

[0092] Tabelas de substituições conservatives apresentando aminoácidos funcionalmente similares são conhecidas pelos especialistas na técnica. Cada um dos oito grupos a seguinte contém aminoácidos que são substituições conservatives uns dos outros:

1) Alanina (A ou Ala), Glicina (G ou Gly);

2) Ácido aspártico (D ou Asp), Ácido glutâmico (E ou Glu);

3) Asparagina (N ou Asn), Glutamina (Q ou Gin);

4) Arginina (R ou Arg), Lisina (K ou Lys), Histidina (H ou His);

5) Isoleucina (I ou lie), Leucina (L ou Leu), Metionina (M ou Met), Valina (V ou Vai);

6) Fenilalanina (F ou Phe), Tirosina (Y ou Tyr), Triptofano (W ou Trp);

7) Serina (S ou Ser), Treonina (T ou Thr); e

8) Cisteína (C ou Cys), Metionina (M ou Met) (vide, por exemplo, Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2nd edition (December 1993).

[0093] Os termos idêntico ou percentagem de identidade, no contexto de dois ou mais ácidos nucleicos ou sequências de polipeptídios, referem-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são as mesmas. Sequências são substancialmente idênticas se tiverem uma percentagem de resíduos aminoacíficos ou de nucleotídeos que são os mesmos (/.e., cerca de 60% de identidade, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, de identidade ao longo de uma região especificada), quando comparadas e alinhadas para correspondência

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43/197 máxima em uma janela de comparação, ou uma região designada segundo medida usando dos seguintes algoritmos de comparação de sequências (ou outros algoritmos disponíveis para o especialista na técnica) ou por alinhamento manual e inspeção visual. A identidade pode exisitr ao longo de uma região ou janela de comparação que tenha pelo menos cerca de 20 aminoácidos ou nucleotides de comprimento, ou ao longo de uma região que tenha pelo menos cerca de 25 aminoácidos ou nucleotides de comprimento, ou, onde não especificado, através da sequência inteira de um polinucleotídeo ou polipeptídio. Uma janela de comparação, conforme usado neste relatório descritivo, inclui referência a qualquer segmento de posições contíguas, por exemplo, pelo menos ou cerca de 10, 15, 20, 25, ou 30 aminoácidos, em que uma sequência pode ser comparada a uma sequência de referência com o mesmo número de posições contíguas depois de as duas sequências serem alinhadas de forma ideal. Exemplos de algoritmos que podem ser adequados para determinar a percentagem de identidade de sequência e similaridade de sequências são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que estão descritos em Altschul et al. (1997) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, e Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, respectivamente, assim como os algoritmos de Smith-Waterman (Smith e Waterman, J Mol Biol. 1981 Mar 25;147(1 ):195-7), ou Needleman-Wunsch (Needleman and Wunsch, J Mol Biol. 1970 Mar;48(3):443-53), que podem operados com parâmetros pardão, por exemplo, da maneira descrita nas respectivas publicações.

[0094] O termo indivíduo, conforme usado neste relatório descritivo, refere-se a um animal, em algumas modalidades a um mamífero, e em outras modalidades a um ser humano, que é o objeto de tratamento, observação ou experimento. Um animal pode ser um animal de stimação (por exemplo, cães, gatos, entre outros), um animal

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44/197 de fazenda (por exemplo, vacas, carneiros, porcos, cavalos, entre outros) ou um animal de laboratório (por exemplo, ratos, camundongos, porquinhos-da-índia, entre outros).

[0095] O termo quantidade eficaz conforme usado neste relatório descritivo refere-se àquela quantidade do composto (por exemplo, um polipeptídio de relaxina modificada descrito neste pedido) que está sendo administrado que pode prevenir, curar, atenuar, aliviar, retardar a manifestação, reduzir a severidade, ou reduzir até certo ponto um ou mais dos sintomas da doença, condição ou distúrbio sendo tratado. As composições contendo o polipeptídio de relaxina modificada descritas neste pedido podem ser administradas para tratamentos profiláticos, melhoradores, e/ou terapêuticos.

[0096] Os termos melhorar ou melhorador significam aumentar ou prolongar, seja em termos da potência ou da duração, um efeito desejado. Assim sendo, em relação a melhorar o efeito de agentes terapêuticos, o termo melhorador refere-se à capacidade de aumentar ou prolongar, seja em termos da potência ou da duração, o efeito de outros agentes terapêuticos em um sistema.

[0097] Nas aplicações profiláticas, as composições contendo o polipeptídio de relaxina modificada são administradas a um paciente suscetível ou com risco de ter uma doença, distúrbio ou condição particular. Tal quantidade é definida como quantidade profilatiamente eficaz.

[0098] Nas aplicações terapêuticas, as composições compreendendo o polipeptídio de aminoácido artificial modificado são administradas a um paciente que já sofre de uma doença, condição ou distúrbios, em uma quantidade suficiente para curar ou pelo menos em parte interromper ou aliviar os sintomas da doença, distúrbio ou condição. Tal quantidade é definida como quantidade terapeuticamente eficaz, e pode depender da severidade e do curso da doença, distúrbio

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45/197 ou condição, de terapias anteriores, do estado geral de saúde do paciente e da resposta às drogas, e do critério do médico assistente. Considera-se que a determinação de tais quantidades terapeuticamente eficazes por experimentação de rotina (por exemplo, um ensaio clínico de escalonamento de dose) é de conhecimento do especialista na técnica.

[0099] O termo tratar é usado para indicar tratamentos profiláticos e/ou terapêuticos.

[00100] Agente redutor, conforme usado neste relatório descritivo em relação ao renovelamento de proteínas, é definido como qualquer composto ou material que mantenha os grupos sulfidrila no estado reduzido e que reduz as ligações dissulfeto intra- ou intermoleculares. Agentes redutores adequados incluem, porém sem limitação, ditiotreitol (DTT), 2-mercaptoetanol, cisteína, cisteamina (2-aminoethanethiol), e glutationa reduzida. É facilmente evidente para os especialistas na técnica que uma ampla variedade de agentes redutores é adequada para uso nos métodos e nas composições da presente invenção.

[00101] Agente oxidante, conforme usado neste relatório descritivo em relação ao renovelamento de proteínas, é definido como qualquer composto ou material que seja capaz de remover um elétron de um composto que está sendo oxidado. Agentes oxidantes adequados incluem, porém sem limitação, glutationa oxidada, cistina, cistamina, ditiotreitol oxidado, eritreitol oxidado, e oxigênio. É facilmente evidente para os especialistas na técnica que uma ampla variedade de agentes oxidantes é adequada para uso nos métodos e nas composições da presente invenção.

[00102] Agente desnaturante ou desnaturante, conforme usado neste relatório descritivo, é definido como qualquer composto ou material que cause um desenovelamento reverssível de uma proteína. A potência de um agente desnaturante ou desnaturante será

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46/197 determinada tanto pelas propriedades como pela concentração do agente desnatura ou desnaturante particular. Agentes desnaturantes ou desnaturantes adequados podem ser caótropos, detergentes, solventes orgânicos, solventes miscíveis em água, fosfolipídios, ou uma combinação de dois ou mais desses agentes. Caótropos adequados incluem, porém sem limitação, ureia, guanidina, e tiocianato de sódio. Detergentes úteis podem incluir, porém sem limitação, detergentes fortes, tais como dodecil sulfato de sódio, ou ésteres de polioxietileno (por exemplo, detergentes como Tween ou Triton), Sarkosyl, detergentes não iônicos leves (por exemplo, digitonina), detergentes catiônicos leves tal como N->2,3-(Dioleioóxi)-propil-N,N,Ntrimetilamônio, detergentes iônicos leves (por exemplo, colato de sódio ou desoxicolato de sódio) ou detergentes zwiteriônicos incluindo, porém sem limitação, sulfobetaínas (Zwittergent), 3-(3clolamidopropil)dimetilammonio-1-propano sulfato (CHAPS), e 3-(3clolamidopropil)dimetilamônio-2-hidróxi-1 -propano sulfonato (CHAPSO). Solventes orgânicos miscíveis em água tais como acetonitrila, alcanóis inferiores (especialmente C2 - C4 alcanóis tais como etanol ou isopropanol), ou alcanodióis inferiores (especialmente C2 - C4 alcanodióis tal como etileno-glicol) podem ser usados como desnaturantes. Fosfolipídios úteis na presente invenção podem ser fosfolipídios de ocorrência natural tais como fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, e fosfatidilinositol ou derivados ou variantes sintéticos de fosfolipídios tais como di-hexanoilfosfatidilcolina ou di-heptanoilfosfatidilcolina.

[00103] Renovelamento, conforme usado neste relatório descritivo, descreve qualquer processo, reação ou método que transforme polipeptídios contendo ligações dissulfeto de um estado inadequadamente enovelado ou não enovelado em uma conformação nativa ou apropriada enovelamento em relação às ligações dissulfeto.

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47/197 [00104] Coenovelamento, conforme usado neste relatório descritivo, refere-se especificamente a processos, reações, ou métodos de renovelamento que empregam pelo menos dois polipeptídios que interagem entre sistema imunológico e resultam na transformação de polipeptídios não enovelados ou inadequadamente enovelados em polipeptídios nativos adequadamente enovelados.

[00105] O termo protegido refere-se à presença de um grupo protetor ou porção que impede a reação do grupo funcional quimicamente reativo em certas condições reacionais. O grupo protetor vai variar dependendo do tipo de grupo quimicamente reativo sendo protegido. Por exemplo, o grupo quimicamente reativo for uma amina ou uma hidrazida, o grupo protetor pode ser selecionado do grupo de terc-butiloxicarbonil (t-Boc) e 9-fluorenilmetoxicarbonil (Fmoc). Se o grupo quimicamente reativo for um tiol, o grupo protetor pode ser ortopiridil dissulfeto. Se o grupo quimicamente reativo for um ácido carboxílico, tal como ácido butanoico ou propionico, ou um grupo hidroxila, o grupo protetor pode ser benzila ou um grupo alquil tal como metila, etila, ou terc-butila. Outros grupos protetores conhecidos na literatura também podem ser usados nos ou com os métodos e composições descritos neste pedido, incluindo grupos fotoláveis tais como e MeNvoc. Outros grupos protetores conhecidos na literatura também podem ser usados nos ou com os métodos e composições descritos neste pedido.

[00106] A título de exemplo apenas, grupos bloqueadores/protetores podem ser selecionados dentre:

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Cbz a! toe Me h₃c

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H_SC_{X z}CH_:i (H₃ChC'³''-_Et t^butiia T8DMS

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Fmoc [00107] Outros grupos protetores estão descritos em Greene and

Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Ed., John Wiley &

Sons, New York, NY, 1999, cuja íntegra está aqui incorporada a título de referência.

[00108] Os termos distúrbios do sistema cardiovascular ou distúrbios cardiovasculares incluem, por exemplo, os seguintes distúrbios: hipertensão (pressão sanguínea alta), distúrbios vasculares periféricos e cardíacos, doença coronariana, angina do peito estável e instável, ataque cardíaco, insuficiência miocardíaca, ritmos cardíacos anormais (or arritmias), disfunção isquêmica (miocárdio hibernante), disfunção pós-isquêmica termporária (miocárdio atordoado), insuficiência cardíaca, distúrbios do fluxo sanguíneo periférico, síndrome coronariana aguda, insuficiência cardíaca, doença do músculo cardíaco (cardiomiopatia), infarto do miocárdio e doença vascular (doença dos vasos sanguíneos).

[00109] O termo insuficiência cardíaca inclui manifestações tanto agudas quanto crônicas de insuficiência cardíaca, assim como tipos mais específicos ou relacionados de doenças, tais como insuficiência cardíaca avançada, insuficiência cardíaca aguda no pós-operatório, síndrome cardio-renal, insuficiência cardíaca com função renal

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49/197 enfraquecida, insuficiência cardíaca crônica, insuficiência cardíaca crônica com fração de ejeção intermediária (HFmEF), insuficiência cardíaca compensada, insuficiência cardíaca descompensada, insuficiência cardíaca direita, insuficiência cardíaca esquerda, global failure, cardiomiopatia isquêmica, cardiomiopatia dilatada, insuficiência cardíaca associada a defeitos cardíacos congênitos, defeitos da vávula do coração, insuficiência cardíaca associada a defeitos da válvula cardíaca, estenose mitral, insuficiência mitral, estenose aórtica, insuficiência aórtica, estenose tricúspide, insuficiência tricúspide, estenose pulmonar, insuficiência da válvula pulmonar, insuficiência cardíaca associada a defeitos combinados da válvula cardíaca, inflamação do miocárdio (miocardite), miocardite crônica, miocardite aguda, miocardite viral, insuficiência cardíaca diabética, cardiomiopatia alcoólica, insuficiência cardíaca associada a distúrbios cardíacos de armazenamento, insuficiência cardíaca diastólica, insuficiência cardíaca sistólica, fases agudas de agravamento da insuficiência cardíaca, insuficiência cardíaca com fração de ejeção preservada (HFpEF), insuficiência cardíaca com fração de ejeção reduzida (HFrEF), insuficiência cardíaca crônica com fração de ejeção reduzida (HFrEF), insuficiência cardíaca crônica com fração de ejeção preservada (HFpEF), pós-remodelagem miocardíaca, angina, hipertensão, hipertensão pulmonar e hipertensão arterial pulmonar.

[00110] O termo distúrbios fibróticos abrange doenças e distúrbios caracterizados por fibrose, incluindo, entre outros, as seguintes doenças e distúribos: fiborse do fígado ou hepática, cirrose do fígado, NASH, fibrose pulmonar ou fibrose do pulmão, fibrose cardíaca, fibrose endomiocardíaca, nefropatia, glomerulonefrite, fibrose renal intersticial, lesão fibrótica resultante de diabetes, fibrose da medula óssea e distúrbios fibróticos sismilares, esclerodermia, morféia, queloides, cicatrização hipertrófica (também subsequente a procedimentos

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50/197 cirúrgicos), nevos, retinopatia diabética, vitreoretinopatia proliferativa e distúrbios do tecido conjuntivo (por exemplo, sarcoidose.

[00111] Os termos distúrbio associado à relaxina e doença associada à relaxina abrangem doenças e distúrbios que podem ser prevenidos, tratados, aliviados ou de alguma forma afetados pela modulação no nível de relaxina no corpo tal como aumento do nível sérico da proteína relaxina. Distúrbios associados à relaxina incluem, porém sem limitação, distúrbios do sistema cardiovascular e os distúrbios fibróticos descritos neste relatório descritivo.

[00112] Os polipeptídios compreendendo os aminoácidos codificados artificialmente apresentados neste pedido podem incluir compostos marcados isotopicamente com um ou mais átomos substituídos por um átomo tendo uma massa atômica ou número atônico diferente da massa atômica ou número atômico normalmente encontrado na natureza. Exemplos de isótopos que podem ser incorporados nos presentes compostos incluem isótopos de hidrogênio, carbono, nitrogênio, oxigênio, flúor e cloro, tais como 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 180, 170, 35S, 18F, 36CI, respectivamente. Certos compostos marcados isotopicamente descritos neste pedido, por exemplo, aqueles nos isótopos radioativos tais como 3H e 14C são incorporados podem ser úteis em ensaios de distribuição tecidual de drogas e/ou substratos. Além disso, a substituição por isótopos tal como deutério, i.e., 2H, pode apresentar certas vantagens terapêuticas resultantes de maior estabilidade metabólica, por exemplo, meia-vida in vivo aumentada ou necessidade de dosagens reduzidas.

I. Generalidades [00113] São apresentadas neste pedido moléculas de relaxina modificada ligadas a um melhorador farmacocinético. Modalidades exemplificativas demonstraram apresentar pelo menos uma propriedade vantajosa selecionada dentre meia-vida in vivo aumentada,

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51/197 formação reduzida de vacúolos renais, fluxo sanguíneo renal aumentado, maior solubilidade, agregação reduzida, viscosidade mais baixa, manufaturabilidade aumentada, em comparação com outros polipeptídios de relaxina modificada ou do tipo selvagem.

[00114] Em um aspecto, a presente invenção apresenta um polipeptídio de relaxina modificada compreendendo um aminoácido codificado artificialmente, onde:

(a) o polipeptídio de relaxina modificada compreende a cadeia A do polipeptídio de relaxina de SEQ ID NO: 4 e a cadeia B do polipeptídio de relaxina de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6, substituídos com um aminoácido codificado artificialmente em uma posição selecionada do grupo que consiste em: resíduo 1 da cadeia A, resíduo 2 da cadeia A, resíduo 5 da cadeia A, resíduo 13 da cadeia A, resíduo 18 da cadeia A, resíduo 5 da cadeia B, resíduo 7 da cadeia B, e resíduo 25 da cadeia B, e tendo opcionalmente até duas substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos adicionais na referida cadeia da relaxina e/ou na referida cadeia B da relaxina;

(b) o referido aminoácido codificado artificialmente tem a estrutura:

R onde o grupo R é qualquer substituinte diferente da cadeia lateral encontrada em alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina ou valina;

(c) o referido aminoácido codificado artificialmente é ligado a um melhorador farmacocinético compreendendo um componente peptidico

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52/197 of entre 2 e 30 aminoácidos e uma porção prolongadora da meia-vida. [00115] Em algumas modalidades, a referida cadeia A do polipeptídio de relaxina pode compreender a SEQ ID NO: 4 substituída com o referido aminoácido codificado artificialmente no resíduo 1 e e tendo opcionalmente até duas substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos adicionais. A referida cadeia A do polipeptídio de relaxina pode compreender a SEQ ID NO: 4 substituída com o referido aminoácido codificado artificialmente no resíduo 1 e tendo opcionalmente uma substituição, inserção e/ou deleção de aminoácidos adicional. A referida cadeia B do polipeptídio de relaxina pode compreender a SEQ ID NO: 5 ou a SEQ ID NO: 6 tendo opcionalmente até duas substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos adicionais. A referida cadeia B do polipeptídio de relaxina pode compreender a SEQ ID NO: 5 ou a SEQ ID NO: 6 tendo opcionalmente uma substituição, inserção e/ou deleção de aminoácidos adicional. A referida cadeia A do polipeptídio de relaxina pode compreender a SEQ ID NO: 4 substituída com o referido aminoácido codificado artificialmente no resíduo 1 e a referida cadeia B do polipeptídio de relaxina pode compreender a SEQ ID NO: 5 ou a SEQ ID NO: 6.

[00116] Em algumas modalidades, o referido pelo menos um aminoácido codificado artificialmente pode compreender um grupo carbonila, um grupo amino-óxi, um grupo hidrazida, um grupo hidrazina, um grupo semicarbazida, um grupo azida, ou um grupo alquino. O referido aminoácido codificado artificialmente pode compreender um derivado de fenilalanina. O referido aminoácido codificado artificialmente pode ser selecionado dentre uma fenilalanina parasubstituída, ortossubstituída, ou metassubstituída. O referido aminoácido codificado artificialmente pode ser selecionado dentre a fenilalanina para-substituída, orto-substituída, ou meta-substituída compreendendo um grupo carbonila, um grupo amino-óxi, um grupo

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53/197 hidrazida, um grupo hidrazina, um grupo semicarbazida, um grupo azida, ou um grupo alquino. O referido aminoácido codificado artificialmente pode compreender para-acetil-L-fenilalanina. O referido aminoácido codificado artificialmente pode ser ligado ao referido melhorador farmacocinético. Por exemplo, o referido aminoácido codificado artificialmente pode ser ligado ao referido melhorador farmacocinético através de uma ligação oxima ou de uma ligação triazol, por exemplo, uma ligação oxima [00117] Em algumas modalidades, a referida cadeia A do polipeptídio de relaxina pode compreender a SEQ ID NO: 35, e a referida cadeia B do polipeptídio de relaxina pode compreender a SEQ ID NO: 5 ou a SEQ ID NO: 6, e onde a referida cadeia A ou cadeia B da relaxina pode opcionalmente ter até duas substituições, inserções ou deleções de aminoácidos adicionais. O referido polipeptídio de relaxina modificada pode compreender um polipeptídio da cadeia A da relaxina tendo pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 35 e um polipeptídio da cadeia B da relaxina tendo pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6. A referida cadeia A do polipeptídio de relaxina pode ter pelo menos 95% de identidade de sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 35. A referida cadeia B do polipeptídio de relaxina pode ter pelo menos 95% de identidade de sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6. A referida cadeia A do polipeptídio de relaxina pode compreender a SEQ ID NO: 35 e a cadeia B do polipeptídio de relaxina pode compreender a SEQ ID NO: 5 ou a SEQ ID NO: 6. Em algumas modalidades, a referida cadeia A do polipeptídio de relaxina pode compreender a SEQ ID NO: 35 e a cadeia B do polipeptídio de relaxina pode compreender a SEQ ID NO: 6.

[00118] Em algumas modalidades, o referido componente peptídico pode compreender entre 1 e 25 aminoácidos, por exemplo, entre 2 e 20

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54/197 aminoácidos, entre 3 e 10 aminoácidos, ou entre 4 e 8 aminoácidos. O referido componente peptídico pode compreender GIu, Glu^Y, GGGGS-GIuy (SEQ ID NO: 139), DRDDRD (SEQ ID NO: 102), KKKKKK-GIuy (SEQ ID NO: 103), RGGEEKKKEKEK-Glu^Y (SEQ ID NO: 104), GGGEEE-Glu^Y (SEQ ID NO: 105), EEEGGG-Glu^Y (SEQ ID NO: 106), KKKGGG-Glu^Y (SEQ ID NO: 107), GETGSSGEGT-Glu^Y (SEQ ID NO: 108), GGGKKK-Glu^Y (SEQ ID NO: 109), GSHHHHHGS-Glu^Y (SEQ ID NO: 110), Sar-Sar-Sar-Sar-Ser-Sar-Sar-Sar-Sar-Glu^Y (SEQ ID NO: 111), Sar-Sar-Sar-Sar-Ser-Glu^Y (SEQ ID NO: 112), Sar-Sar-Sar-GluGlu-Glu^Y (SEQ ID NO: 113), KKKSGGSGG-Glu^Y (SEQ ID NO: 118), KKSGGSGG-Glu^Y (SEQ ID NO: 114), KKSGGSGG-Glu“ (SEQ ID NO: 115), KKSAGSAG-Glu^Y (SEQ ID NO: 116), KSGGSGG-Glu^Y (SEQ ID NO: 117), KKSGGSGGEE-Glu^Y (SEQ ID NO: 119), dKdKdKdKdKdKGlu^Y (SEQ ID NO: 120), EESGGSGG-Glu^Y (SEQ ID NO: 121), GSGSGSGS-Glu^Y (SEQ ID NO: 123), EEEGGG-dGlu^Y (SEQ ID NO: 128), EGGGGSK-Glu^Y (SEQ ID NO: 130), EEEEEE-Glu^Y (SEQ ID NO: 131), EEEEPEEEEPEEEEPEEEE-Glu^Y (SEQ ID NO: 133), EEEEPEEEEPEEEEPEEGGG (SEQ ID NO: 135),

EEEEGEEEEGEEEEGEEEE-Glu^Y (SEQ ID NO: 136), KGGEEKKKEKEKEPKGGEEKKKEKEK-Glu^Y (SEQ ID NO: 137), EAQKAQAEAQKAQAEAQKAQA-Glu^Y (SEQ ID NO: 138), KK-Glu^Y (SEQ ID NO: 140), Glu^Y, KGPKGP-Glu^Y (SEQ ID NO: 146), SGGGSGlu^Y (SEQ ID NO: 147), KGGGS-Glu^Y (SEQ ID NO: 148), KGGGSE-Glu^Y (SEQ ID NO: 149), GSPGSP-Glu^Y (SEQ ID NO: 150), GGGGP-Glu^Y (SEQ ID NO: 151), EGGS-Glu^Y (SEQ ID NO: 152), EGGGP-Glu^Y (SEQ ID NO: 153), KGPGSE-Glu^Y (SEQ ID NO: 154), Espermina-Glu^Y, ou KKGGS-Glu^Y (SEQ ID NO: 156).

[00119] O referido componente peptídico pode compreender GGGGS-Glu^Y (SEQ ID NO: 139), DRDDRD (SEQ ID NO: 102), KKKKKK-Glu^Y (SEQ ID NO: 103), RGGEEKKKEKEK-Glu^Y (SEQ ID NO:

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104), GGGEEE-Glu^Y (SEQ ID NO: 105), EEEGGG-Glu^Y (SEQ ID NO: 106), KKKGGG-GIuy (SEQ ID NO: 107), GGGKKK-Glu^Y (SEQ ID NO: 109), GSHHHHHGS-GIuy (SEQ ID NO: 110), Sar-Sar-Sar-Sar-Ser-Glu^Y (SEQ ID NO: 112), Sar-Sar-Sar-Glu-Glu-Glu^Y (SEQ ID NO: 113), ou KSGGSGG-GIuy (SEQ ID NO: 117).

[00120] O referido componente peptídico pode compreender Glu^Y. Por exemplo, o referido componente peptídico pode compreender GGGGS-GIuy (SEQ ID NO: 139).

[00121] Em modalidades exemplificativas, o referido polipeptídio de relaxina modificada pode compreender a cadeia A do polipeptídio de relaxina de SEQ ID NO: 4 e a cadeia B do polipeptídio de relaxina de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6, substituído com um aminoácido codificado artificialmente no resíduo 1 da cadeia A, onde o referido aminoácido codificado artificialmente é ligado ao referido melhorador farmacocinético e o referido melhorador farmacocinético compreende o componente peptídico GGGGS-Glu^Y (SEQ ID NO: 139). Em algumas modalidades, o componente peptídico pode ser covalentemente ligado ao referido aminoácido codificado artificialmente, por exemplo, via uma ligação oxima.

[00122] Em modalidades exemplificativas, a referida porção prolongadora da meia-vida pode compreender um ácido graxo ou um derivado do mesmo, onde o ácido graxo ou o derivado do mesmo pode ser covalentemente ligado ao componente peptídico. A referida porção prolongadora da meia-vida pode compreender um ácido graxo saturado ou um derivado do mesmo. A referida porção prolongadora da meiavida pode compreender um ácido graxo terminado com um ácido carboxílico. A referida porção prolongadora da meia-vida pode compreender um ácido graxo de fórmula I: -Cn-COOH (Fórmula I), onde n pode variar entre 10 e 18, tal como entre 12 e 17, ou 13, 14, 15, ou 16. Em algumas modalidades, -Cn- de fórmula I pode compreender um

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56/197 primeiro carbono de carbonila e -(CH2)_n-i-. Por exemplo, -C13- pode ser -(C=O)-(CH2)i2-; -C14- pode ser -(C=O)-(CH2)i3-; -C15- pode ser (C=O)-(CH₂)i4-. Em algumas modalidades, o primeiro carbono de carbonila do ácido graxo pode ser ligado a resíduo (gama) Glu, opcionalmente via uma ligação amida. Em algumas modalidades, o primeiro carbono de carbonila do ácido graxo pode ser ligado a resíduo gama Glu via uma ligação amida.

[00123] Em outras modalidades exemplificativas, a referida porção prolongadora da meia-vida pode compreender -C14-COOH.

[00124] Em outras modalidades exemplificativas, o referido melhorador farmacocinético pode compreender a estrutura:

GGGGS-GkWCU-COOH (Fórmula II) onde o grupo amino-óxi de fórmula II é ligado ao aminoácido artificial no referido polipeptídio de relaxina modificada, por exemplo, via uma ligação oxima.

[00125] Em outras modalidades exemplificativas, a referida porção prolongadora da meia-vida pode ser conjugada ao referido componente peptídico através de uma ligação amida.

[00126] Em outras modalidades exemplificativas, o referido polipeptídio de relaxina pode compreender a cadeia A do polipeptídio de relaxina de SEQ ID NO: 4 e a cadeia B do polipeptídio de relaxina de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6, substituído com um aminoácido codificado artificialmente no resíduo 1 da cadeia A; onde o referido aminoácido codificado artificialmente compreende para-acetil-Lfenilalanina; onde o referido aminoácido codificado artificialmente é ligado ao referido melhorador farmacocinético que compreende um componente peptídico compreendendo GGGGS-Glu^Y (SEQ ID NO:

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139); e uma porção prolongadora da meia-vida compreendendo -C14COOH, tal como-(C=O)-(CH₂)i₃-COOH.

[00127] Em uma outra modalidade, a invenção apresenta um polipeptídio de relaxina modificada compreendendo a estrutura:

AQ1-Relaxina tf

CHj O

Η H H A H i. □ ° ° ΗΟ'^'Ο ° (Fórmula IH) onde a referida AQ1-Relaxina compreende um polipeptídio da cadeia A da relaxina tendo pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 35 e um polipeptídio da cadeia B da relaxina tendo pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6, onde a para-acetilL-fenilalanina representada na fórmula III fica localizada no terminal N do referido polipeptídio da cadeia A da relaxina. A referida cadeia A do polipeptídio de relaxina pode ter pelo menos 95% de identidade de sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 35. A referida cadeia B do polipeptídio de relaxina pode ter pelo menos 95% de identidade de sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6. A referida AQ1-Relaxina pode compreender um polipeptídio da cadeia A da relaxina de SEQ ID NO: 35 e um polipeptídio da cadeia B da relaxina de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6.

[00128] Em uma outra modalidade, a invenção apresenta um polipeptídio de relaxina modificada compreendendo o conjugado de relaxina AQ1-GGGGS-Glu^Y(SEQ ID NO: 139) -C14-COOH que compreende um polipeptídio da cadeia A da relaxina de SEQ ID NO: 35 e um polipeptídio da cadeia B da relaxina de SEQ ID NO: 6, onde a paraacetil-L-fenilalanina localizada no terminal N da referida cadeia A do polipeptídio de relaxina pode ser ligado ao melhorador farmacocinético GGGGS-Glu^Y (SEQ ID NO: 139)-014-COOH, como representado na

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58/197 fórmula III:

ό

AQI-RelaxmayS·*^ ^•^Λγ- '0' - γ μ ~ ητ ν Υ Ν ' f ΐί γ

CK» Ü ΰ Ο ^Κ Η0·%^Ο ° (Formula III) [00129] Em uma outra modalidade, o polipeptídio de relaxina modificada compreende a estrutura mostrada na FIG. 8.

[00130] Em uma outra modalidade, o polipeptídio de relaxina modificada compreende a estrutura mostrada na FIG. 9.

[00131] Em modalidades exemplificai ivas, o referido polipeptídio de relaxina modificada pode ser biologicamente ativo. O referido polipeptídio de relaxina modificada pode ser terapeuticamente eficaz para o tratamento de uma ou mais doenças ou condições associadas à relaxina. O referido polipeptídio de relaxina modificada pode apresentar formação reduzidas de vacúolos renais, em comparação com um composto comparativo, tal como AQ1-20 kDa PEG (AQ1 relaxina conjugada a PEG com um peso molecular médio de 20 kDa). O referido polipeptídio de relaxina modificada pode apresentar nenhum enfraquecimento da função renal ou enfraquecimento reduzido da função renal, em comparação com um composto comparativo, tal como AQ1-20 kDa PEG. A referida função renal pode ser medida determinando-se um ou mais dentre taxa de filtração glomerular estimada, depuração de creatina, taxa de filtração de glomerular insulina, ou taxa de filtração de glomerular isotópica.

[00132] Em modalidades exemplificativas, o referido polipeptídio de relaxina modificada não apresenta fluxo sanguíneo renal reduzido, e/ou pode ser capaz de aumentar o fluxo sanguíneo renal, depois da administração. O fluxo sanguíneo renal pode ser medido determinandose a depuração de para-amino-hipurato.

[00133] O referido polipeptídio de relaxina modificada pode

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59/197 apresenta uma meia-vida in vivo aumentada, por exemplo, aumentada em pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes, ou pelo menos 50 vezes, em comparação com um composto comparativo, tal como relaxina do tipo selvagem.

[00134] Em um outro aspecto, a invenção apresenta uma composição farmacêutica compreendendo um polipeptídio de relaxina modificada descrito neste pedido e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[00135] Em um outro aspecto, a invenção apresenta uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de um polipeptídio de relaxina modificada descrito neste pedido para o tratamento ou a prevenção de um distúrbio associado à relaxina e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[00136] Em um outro aspecto, a invenção apresenta um método para tratar ou prevenir uma doença associada à relaxina compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um polipeptídio de relaxina modificada ou de uma composição compreendendo um polipeptídio de relaxina modificada descrito neste pedido a um paciente com necessidade do mesmo.

[00137] Em um outro aspecto, a invenção apresenta um método para tratar ou prevenir uma doença cardiovascular compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um polipeptídio de relaxina modificada ou de uma composição compreendendo um polipeptídio de relaxina modificada descrito neste pedido a um paciente com necessidade do mesmo. A referida cardiodoença vascular pode ser selecionada dentre doença coronariana, ataque cardíaco, arritmia, insuficiência cardíaca, cardiomiopatia, e doença vascular.

[00138] Em um outro aspecto, a invenção apresenta um método para tratar, prevenir ou aliviar um sintoma de insuficiência cardíaca compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um polipeptídio

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60/197 de relaxina modificada ou de uma composição compreendendo um polipeptídio de relaxina modificada descrito neste pedido a um paciente com necessidade do mesmo. A referida insuficiência cardíaca pode ser selecionada dentre insuficiência cardíaca avançada, síndrome cardiorenal, insuficiência cardíaca com função renal enfraquecida, insuficiência cardíaca crônica, insuficiência cardíaca crônica com fração de ejeção intermediária (HFmEF), insuficiência cardíaca aguda, insuficiência cardíaca aguda no pós-operatório, insuficiência cardíaca compensada, insuficiência cardíaca descompensada, insuficiência cardíaca direita, insuficiência cardíaca esquerda, insuficiência cardíaca global, cardiomiopatia isquêmica, cardiomiopatia dilatada, insuficiência cardíaca associada a defeitos cardíacos congênitos, insuficiência cardíaca associada a defeitos da válvula cardíaca, insuficiência cardíaca associada a defeitos combinados da válvula cardíaca, insuficiência cardíaca diabética, cardiomiopatia alcoólica, insuficiência cardíaca associada a distúrbios cardíacos de armazenamento, insuficiência cardíaca diastólica, insuficiência cardíaca sistólica, pósremodelagem miocardíaca, insuficiência cardíaca com fração de ejeção preservada (HFpEF), insuficiência cardíaca com fração de ejeção reduzida (HFrEF), angina, hipertensão, hipertensão pulmonar, e hipertensão arterial pulmonar.

[00139] Em algumas modalidades, a referida insuficiência cardíaca pode ser selecionada dentre insuficiência cardíaca crônica, insuficiência cardíaca aguda, insuficiência cardíaca aguda no pós-operatório, insuficiência cardíaca crônica com fração de ejeção reduzida (HFrEF), insuficiência cardíaca crônica com fração de ejeção preservada (HFpEF), insuficiência cardíaca crônica com fração de ejeção intermediária (HFmEF), insuficiência cardíaca diastólica, insuficiência cardíaca sistólica, pós-remodelagem miocardíaca, angina, hipertensão, hipertensão pulmonar e hipertensão arterial pulmonar.

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61/197 [00140] Em algumas modalidades, a referida insuficiência cardíaca pode ser selecionada dentre insuficiência cardíaca aguda no pósoperatório, insuficiência cardíaca avançada, síndrome cardio-renal, e insuficiência cardíaca com função renal enfraquecida.

[00141] Os referidos métodos de tratamento podem compreender ainda administrar, em combinação, concomitantemente e sequencialmente, com o referido polipeptídio de relaxina modificado, pelo menos um agente terapêutico adicional selecionado dentre inibidores de ACE, β-bloqueadores, diuréticos, antagonistas do receptor de mineralocorticoides, moduladores do receptor de rianodina, ativadores de SERCA2a, inibidores de renina, bloqueadores do canal de cálcio, agonistas do receptor de adenosina A1, receptor parcial de adenosina A1, inibidores da dopamina β-hidroxilase, antagonistas do receptor de angiotensina II, antagonistas do receptor de angiotensina II com agonismo tendencioso para vias de sinalização celular selecionadas, combinações de antagonistas do receptor de angiotensina II e inibidores da enzima neprilisina, inibidores da enzima neprilisina, ativadores da guanilato ciclase solúvel, ativadores de miosina ATPase, inibidores da quinase rho 1, inibidores da quinase rho 2, agonistas do receptor de apelina, compostos doadores de nitroxila, inibidores da quinase II dependente de cálcio, agentes antifibróticos, inibidores da galectina-3, antagonistas do receptor de vasopressina, moduladores do receptor de FPR2, agonistas do receptor de peptídio natriurético, bloqueadores do canal de vaniloide-4 receptor de potencial transitório, agentes antiarrítmicos, bloqueadores do canal de corrente esquisita If, nitratos, compostos de digitalis, agentes inotrópicos e agonistas do receptor β, agentes de resselagem de membrana celular, por exemplo, Poloxâmero 188, agentes anti-hiperlipidêmicos, agentes aumentadores de HDL plasmático, agentes anti-hipercolesterolêmicos, inibidores da biossíntese de colesterol (tais como inibidores da HMG

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CoA), agonista de LXR, agonista de FXR, probucol, raloxifene, ácido nicotínico, niacinamida, inibidores da absorção de colesterol, sequestrantes de ácidos biliares, resinas trocadoras de ânions, aminas quaternárias, colestiramina, colestipol, indutores do receptor de lipoproteínas de baixa densidade, clofibrato, fenofibrato, bezafibrato, ciprofibrato, gemfibrizol, vitamina B6, vitamina B12, vitaminas antioxidantes, agentes antidiabéticos, inibidores da agregação plaquetária, antagonistas do receptor de fibrinogênio, derivados de aspirina e de ácido fíbrico, inibidores de PCSK9, aspirina, e inibidores de P2Y12 tal como Clopidogrel.

[00142] Em um outro aspecto, a invenção apresenta um método para tratar, prevenir ou aliviar um sintoma de uma doença associada à fibrose, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídio de relaxina modificada ou de uma composição compreendendo o polipeptídio de relaxina modificada descrito neste pedido a um paciente com necessidade do mesmo. A referida doença associada à fibrose pode compreender fibrose do coração, do pulmão, do rim, da medula óssea, ou do fígado, fibrose dermatológica, ou um distúrbio fibrótico do olho. A referida doença associada à fibrose pode ser selecionada dentre fibrose do fígado, esteato-hepatite não alcoólica, (NASH), cirrose, pré-cirrose, doença pulmonar parenquimatosa difusa, fibrose cística, fibrose pulmonar, fibrose maciça progressiva, fibrose pulmonar idiopática, fibrose após injeção, fibrose renal, doença renal crônica, doença renal diabética, glomerulosclerose segmentar focal, nefropatia membranosa, nefropatia por IgA, mielofibrose, insuficiência cardíaca, insuficiência cardíaca metabólica, fibrose cardíaca, fibrose capsular, catarata, cicatrização ocular, fibrose pancreática, fibrose cutânea, fibrose intestinal, estenose intestinal, fibrose endomiocardíaca, fibrose atrial, fibrose mediastinal, doença de Crohn, fibrose retroperitoneal, queloide, fibrose sistêmica nefrogênica, esclerodermia,

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63/197 esclerose sistêmica, artrofibrose, sindrome de Peyronie, contratura de Dupuytren, nefropatia diabética, capsulite adesiva, doença hepática alcoólica, hepatoesteatose, hepatite viral, doença biliar, hemocromatose primária, cirrose medicamentosa, cirrose criptogênica, doença de Wilson, deficiência de alfa 1 -antitripsina, doença pulmonar intersticial (ILD), doença pulmonar fibrótica humana, degeneração macular, retinopatia retiniana, retinopatia vítrea, fibrose miocardíaca, oftalmopatia de Grave, ergotismo induzido por drogas, doença cardiovascular, aterosclerose/restenose, cicatrizes hipertróficas, mielofibrose primária ou idiopática, doença do intestino inflamado, e colite colagenosa.

[00143] O referido método para tratar uma doença associada à fibrose pode compreender ainda administrar, em combinação, concomitantemente ou sequencialmente, com o referido polipeptídio de relaxina modificado, pelo menos um agente antifibrótico ao referido paciente. O referido agente antifibrótico pode ser selecionado dentre nintedanib, Pirfenidona, antagonistas de LPA1, antagonistas do receptor de LPA1, análogos de GLP1, tralokinumab (IL-13, AstraZeneca), vismodegib (antagonista de hedgehog, Roche), PRM151 (pentraxina-2, TGF beta-1, Promedior), SAR-156597 (Mab IL-4&IL13 biespecífico, Sanofi), simtuzumab ((anticorpo anti-lisil oxidase-like 2 (anti-LOXL2), Gilead), CKD-942, PTL-202 (PDE inh./pentoxifylline/NAC liberação controlada oral, Pacific Ther.), omipalisib (inibidor oral de PI3K/mTOR, GSK), IW-001 (solução oral de colágeno bovino tipo V modificado, ImmuneWorks), STX-100 (integrina alfa V/ beta-6 ant, Stromedix/ Biogen), Actimmune (IFN gama), PC-SOD (midismase; inalado, LTT Bio-Pharma / CKD Pharm), lebrikizumab (mAb humanizado anti-IL-13 SC, Roche), AQX-1125 (ativador de SHIP1, Aquinox), CC-539 (inibidor de JNK, Celgene), FG-3019 (FibroGen), SAR-100842 (Sanofi), e ácido obeticólico (OCA ou INT-747, Intercept).

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64/197 [00144] Em um outro aspecto, a invenção apresenta um método para tratar ou prevenir insuficiência renal, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídio de relaxina modificada ou de uma composição compreendendo um polipeptídio de relaxina modificada descrito neste pedido a um paciente com necessidade do mesmo.

[00145] Em um outro aspecto, a invenção apresenta um método para melhorar, estabilizar ou restaurar a função renal em um paciente como necessidade do mesmo, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídio de relaxina modificada ou de uma composição compreendendo um polipeptídio de relaxina modificada descrito neste pedido ao referido paciente.

[00146] Em um outro aspecto, a invenção apresenta um método para a produção de um polipeptídio de relaxina modificada descrito neste pedido, compreendendo: (a) apresentar um polipeptídio compreendendo uma cadeia A da relaxina e uma cadeia B da relaxina, onde o referido polipeptídio compreende um aminoácido codificado artificialmente; e (b) ligar o referido aminoácido codificado artificialmente ao referido melhorador farmacocinético. O referido aminoácido codificado artificialmente pode ser ligado ao referido melhorador farmacocinético por uma ligação oxima, por exemplo, que liga o referido aminoácido codificado artificialmente a um componente peptídico do melhorador farmacocinético. A referida ligação oxima pode ser formada pela reação de um grupo carbonila e um grupo amino-óxi. O referido grupo carbonila pode ser um substituinte do referido aminoácido codificado artificialmente, e o referido grupo amino-óxi pode ser um constituinte do referido melhorador farmacocinético. O referido grupo amino-óxi pode ser um constituinte do referido aminoácido codificado artificialmente, e o referido grupo carbonila pode ser um constituinte do referido melhorador farmacocinético, por exemplo, um constituinte de

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65/197 um componente peptídico do referido melhorador farmacocinético. O referido aminoácido codificado artificialmente pode ser ribossomicamente incorporado no referido polipeptídio.

II. Ácidos nucleicos recombinantes gerais e métodos para uso com os polipeptídios de relaxina modificada divulgados [00147] Nas modalidades da presente invenção, ácidos nucleicos codificando um polipeptídio de relaxina modificada de interesse podem ser isolados, clonados e muitas vezes alterados com a ajuda de métodos recombinantes. Tais modalidades podem ser usadas, incluindo, porém sem limitação, para expressão de proteínas ou durante a criação de variantes, derivados, ou outras sequências derivadas de um polipeptídio de relaxina modificada. Em algumas modalidades, as sequências codificando os polipeptídios de relaxina modificada da invenção são operacionalmente ligadas a um promotor heterólogo. Em algumas modalidades o uso de códon de DNA nas sequências polipeptídica codificando o polipeptídio de relaxina modificada pode ser otimizado para expressão em E. coli ou em uma célula de mamífero (por exemplo, CHO) usando-se técnicas bastante conhecidas nas literaturas. [00148] Polinucleotídeos exemplificativos codificando uma cadeia A da relaxina (SEQ ID NO: 10), uma cadeia B da relaxina (SEQ ID NO: 11), as cadeias A e B da relaxina (SEQ ID NO: 12), e sequências líderes (SEQ ID NO: 13-14) são apresentados neste pedido.

[00149] Uma sequência de nucleotídeos codificando um polipeptídio de relaxina modificada descrita neste pedido pode ser sintetizada com base na sequência de aminoácidos do polipeptídio parental, incluindo, porém sem limitação, tendo a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 4, 5, 6, 35, 36, ou 37 e então alterando a sequência de nucleotídeos de forma a efetuar a intrdoução (i.e., incorporação ou substituição) ou remoção (i.e., deleção ou substituição) dos resíduos aminoacídicos relevantes. A sequência de nucleotídeos pode ser

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66/197 convenientemente modificada por mutagênese sítio-dirigida de acordo com métodos convencionais. Alternativamente, a sequência de nucleotídeos pode ser preparada por síntese química, incluindo, porém sem limitação, uso de um sintetizador de oligonucleotídeos, onde os oligonucleotídeos são desenhados com base na sequência de aminoácidos do polipeptídio desejado, e preferivelmente seleção dos códons que são favorecidos na célula hospedeira na qual o polipeptídio recombinante será produzido.

[00150] Adicionalmente, um códon seletor codificando um aminoácido codificado artificialmente pode ser incorporado nas sequências de polinucleotídeos, como ainda descrito neste pedido.

[00151] A invenção também se refere a células hospedeiras eucarióticas, células hospedeiras não eucarióticas, e organismosa para a incorporação in vivo de um aminoácido artificial via pares de tRNA/RS ortogonais. As células hospedeiras são geneticamente modificadas (incluindo, porém sem limitação, transformadas, transduzidas ou transfectadas) com os polinucleotídeos da invenção ou construtos que incluem um polinucleotídeo da invenção, incluindo, porém sem limitação, um vetor da invenção, que pode ser, por exemplo, um vetor de clonagem ou um vetor de. Por exemplo, as regiões codificadoras do tRNA ortogonal, da tRNA sintetase ortogonal, e da proteína a ser derivatizada são operacionalmente ligados a elementos de controle de expressão gênica que são funcionais na célula hospedeira desejada. O vetor pode estar, por exemplo, na forma de um plasmídio, um cosmídio, um fago, uma bactéria, um vírus, um polinucleotídeo nu, ou um polinucleotídeo conjugado. Os vetores podem ser introduzidos nas células e/ou micro-organismos por métodos tradicionais.

III. Códons seletores [00152] Os códons seletores da invenção expandem o esqueleto de códons genéticos do maquinário de biossíntese de proteínas. Por

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67/197 exemplo, um códon seleteor inclui, porém sem limitação, um códon de três bases único, um códon nonsense, tal como um códon de término, incluindo, porém sem limitação, um códon âmbar (UAG), um códon ocre, ou um códon opala (UGA), um códon artificial, um códon de quatro ou mais bases, um códon raro, ou similares. É bastante óbvio para os especialistas na técnica que existe um grande número de códons seletores que podem ser introduzidos em um gene ou polinucleotídeo desejado, incluindo, porém sem limitação, um ou mais, dois ou mais, três ou mais, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais em um único polinucleotídeo codificando pelo menos uma porção do polipeptídio relaxina modificada. [00153] Em uma modalidade, os métodos envolvem o uso de um códon seletor que é um códon de término para a incorporação de um ou mais aminoácidos artificiais (i.e., codificados artificialmente) in vivo. Por exemplo, é produzido um O-tRNA que reconhece o códon de término, incluindo, porém sem limitação, UAG, e é aminoacilado por uma O-RS com um aminoácido artificial desejado. Esse O-tRNA não é reconhecido pelas aminoacil-tRNA sintetases de ocorrência natural do hospedeiro. Mutagênese sítio-dirigida convencional pode ser usada para introduzir o códon de término, incluindo, porém sem limitação, TAG, no sítio de interesse em um polipeptídio de interesse. Vide, por exemplo, Sayers, J.R., et al. (1988), Nucleic Acids Res, 16:791-802. Quando a O-RS, ο O-tRNA e o ácido nucleico que codifica o polipeptídio de interesse são combinados in vivo, o aminoácido artificial é incorporado em resposta ao códon UAG para dar um polipeptídio contendo o aminoácido artificial na posição especificada.

[00154] A incorporação de aminoácidos artificiais in vivo pode ser feita sem perturbação significativa da célula hospedeira eucariótica. Por exemplo, como a eficiência da supressão para o códon UAG depende da competição entre o O-tRNA, incluindo, porém sem limitação, o tRNA supressor de âmbar, e um fator de liberação eucariótico (incluindo,

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68/197 porém sem limitação, eRF) (que se liga a um códon de término e inicia a liberação do peeptídio em desenvolvimento a partir do ribossoma), a eficiência de supressão pode ser modulada por, incluindo, porém sem limitação, aumento do nível de expressão de O-tRNA, e/ou do tRNA supressor.

[00155] Aminoácidos artificiais também podem ser codificados com códons raros. Por exemplo, quando a concentração de arginina em uma reação de síntese de proteína in vitro é reduzida, o códon rato arginina, AGG, mostrou-se eficiente para inserção de Ala por um tRNA sintético acilado com alanina. Vide, por exemplo, Ma et al., Biochemistry, 32:7939 (1993). Neste caso, o tRNA sintético compete com o tRNAArg de ocorrência natural, que existe como uma espécie secundária em Escherichia coli.

[00156] Códons seletores também compreendem códons estendidos, incluindo, porém sem limitação, códons de quatro ou mais bases, tais como códons de quatro, cinco, seis ou mais bases. Exemplos de códons de quatro bases incluem, porém sem limitação, AGGA, CUAG, UAGA, CCCU entre outros. Exemplos de códons de cinco bases incluem, porém sem limitação, AGGAC, CCCCU, CCCUC, CUAGA, CUACU, UAGGC entre outros.

[00157] Em uma modalidade, podem ser usados na presente invenção códons extendidos à base de códons raros ou de códons nonsense, que podem reduzir a transcrição missense e a supressão de deslocamento em outros sítios indesejados.

[00158] Para um dado sistema, um códon seletor também pode incluir um dos códons naturais de três bases, onde o sistema endógeno não usa (ou raramente usa) o códon base natural. Por exemplo, este inclui um sistema que não possui um tRNA que reconheça o códon natural de três bases, e/ou um sistema no qual o códon de três bases é um códon raro.

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69/197 [00159] Genes codificando para proteínas ou polipeptídios de interesse tal como um polipeptídio de relaxina modificada podem ser mutagenizados por métodos conhecidos pelo especialista na técnica e descritos neste pedido para incluir, por exemplo, um ou mais códons seletores para a incorporação de um aminoácido artificial. Por exemplo, um ácido nucleico para uma proteína de interesse é mutagenizada para incluir um ou mais códons seletores, proporcionando a incorporação de um ou mais aminoácidos artificiais. A invenção inclui qualquer uma dessas variantes, incluindo, porém sem limitação, versões mutantes de qualquer proteína, por exemplo, incluindo pelo menos um aminoácido aritificial.

[00160] Moléculas de ácido nucleico codificando uma proteína de interesse tal como um polipeptídio de relaxina modificada podem ser facilmente mutadas para introduzir uma cisteína em qualquer posição desejado do polipeptídio. A cisteína é amplamente usada para introduzir moléculas reativas, polímeros solúveis em água, proteínas, ou uma ampla variedade de outras moléculas, em uma proteína de interesse.

IV. Aminoácidos codificados artificialmente [00161] Uma variedade muito ampla de aminoácidos codificados artificialmente é adequada para uso na presente invenção. Qualquer número de aminoácidos codificados artificialmente pode ser introduzido em um polipeptídio de relaxina modificada. Em geral, os aminoácidos codificados artificialmente introduzidos são substancialmente quimicamente inertes para os 20 aminoácidos geneticamente codificados comuns (i.e., alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina, e valina). Em algumas modalidades, os aminoácidos codificados artificialmente incluem grupos funcionais de cadeia lateral que reagem de forma eficiente e seletiva com grupos funcionais não

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70/197 encontrados nos 20 aminoácidos comuns (incluindo, porém sem limitação, grupos azido, cetona, aldeído e amino-óxi) para formar conjugados estáveis. Por exemplo, um polipeptídio de relaxina modificada que inclui um aminoácido codificado artificialmente contendo um grupo funcional azido pode ser reagido com um polímero ou extensor farmacocinético, ou, alternativamente, um segundo polipeptídio contendo uma porção alquino para formar um conjugado estável resultante para a reação seletiva dos grupos funcionais azida e alquino para formar um produto de cicloadição [3+2] de Huisgen.

A estrutura genética de um alfa-aminoácido está ilustrada a seguir (fórmula IV):

IV

[00162] Um aminoácido codificado artificialmente é tipicamente qualquer estrutura tendo a fórmula mostrada acima onde o grupo R é qualquer substituinte diferente do substituinte usado nos vinte aminoácidos naturais, e pode ser adequado para uso nos polipeptídios de relaxina modificada da presente invenção. Como os aminoácidos codificados artificialmente da invenção diferem tipicamente dos aminoácidos naturais apenas na estrutura da cadeia lateral, os aminoácidos codificados artificialmente formam ligações amida com outros aminoácidos, incluindo, porém sem limitação, codificados naturalmente ou artificialmente, da mesma maneira como são formados em polipeptídios de ocorrência natural. No entanto, os aminoácidos codificados artificialmente possuem grupos de cadeia lateral que os diferenciam dos aminoácidos naturais. Por exemplo, R compreende opcionalmente um grupo alquila, arila, acila, ceto, azido, hidroxila,

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71/197 hidrazina, ciano, halo, hidrazida, alquenila, alquinila, éter, tiol, seleno, sulfonila, borato, boronato, fosfo, fosfono, fosfina, heterociclico, enona, imina, aldeído, éster, tioácido, hidroxilamina, amino, ou similar ou qualquer combinação dos mesmos.

[00163] Aminoácidos codificados artificialmente exemplificativos que podem ser adequados para uso na presente invenção e que são úteis para reações com extensores farmacocinéticos e polímeros incluem, porém sem limitação, aqueles com grupos reativos carbonila, amino-óxi, hidrazina, hidrazida, semicarbazida, azida e alquino. Em algumas modalidades, os aminoácidos codificados artificialmente compreendem uma porção sacarídeo. Exemplos de tais aminoácidos incluem AZ-acetiIL-glucosaminil-L-serina, A/-acetil-L-galactosaminil-L-serina, A/-acetil-Lglucosaminil-L-treonina, A/-acetil-L-glucosaminil-L-asparagina e Omanosaminil-L-serina.

[00164] Muitos dos aminoácidos codificados artificialmente apresentados neste pedido encontram-se comercialmente disponíveis, por exemplo, na Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA), Novabiochem (uma divisão da EMD Biosciences, Darmstadt, Alemanha), ou Peptech (Burlington, MA, USA). Aqueles que não estão comercialmente disponíveis são opcionalmente sintetizados da maneira descrita neste pedido ou por meio de métodos tradicionais conhecidos pelo especialista na técnica. Para técnicas de síntese orgânica, vide, por exemplo, Organic Chemistry by Fessendon and Fessendon, (1982, Second Edition, Willard Grant Press, Boston Mass.); Advanced Organic Chemistry by March (Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York); e Advanced Organic Chemistry by Carey and Sundberg (Third Edition, Parts A e B, 1990, Plenum Press, New York). Vide, também, Patente US N^os 7,045,337 e 7,083,970, que estão aqui incorporadas a título de referência. Além dos aminoácidos artificiais que contêm cadeias laterais novas, aminoácidos artificiais que podem ser adequados para uso na

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72/197 presente invenção também compreendem opcionalmente estruturas de esqueleto modificado, incluindo, porém sem limitação, aqueles ilustrados pelas estruturas de fórmula V e VI:

V

R

X

onde Z compreende tipicamente OH, NH2, SH, NH-R', ou S-R'; X e Y, que podem ser iguais ou diferentes, compreendem tipicamente S ou O, e R e R’, que são opcionalmente iguais ou diferentes, são tipicamente selecionados da mesma lista de constituintes para 0 grupo R descrito acima para os aminoácidos artificiais de fórmula I assim como hidrogênio. Por exemplo, os aminoácidos artificiais da invenção opcionalmente compreendem substituições no grupo amino ou carboxila como ilustrado pelas fórmulas V e VI. Aminoácidos artificiais deste tipo incluem, porém sem limitação, α-hidróxi ácidos, a-tioácidos, a-aminotiocarboxilatos, incluindo, porém sem limitação, com cadeias laterais correspondendo aos vinte aminoácidos naturais comuns ou cadeias laterais artificiais. Além disso, as substituições no carbono α opcionalmente incluem, porém sem limitação, aminoácidos L, D, ou aa-dissubstituídos tais como D-glutamato, D-alanina, D-metil-O-tirosina, ácido aminobutírico, entre outros. Outras alternativas estruturais

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73/197 incluem aminoácidos cíclicos, tais como análogos de prolina assim como análogos de prolina de 3, 4, 6, 7, 8, e 9 membros no anel, β e γ aminoácidos tais como β-alanina e ácido γ-amino butírico substituídos. [00165] Muitos aminoácidos artificiais baseiam-se em aminoácidos naturais, tais como tirosina, glutamina, fenilalanina, entre outros, e são adequados para uso na presente invenção. Análogos de tirosina incluem, porém sem limitação, tirosinas para-substituídas, tirosinas ortosubstituídas, e tirosinas meta-substituídas, onde a tirosina substituída compreende, incluindo, porém sem limitação, um grupo ceto (incluindo, porém sem limitação, um grupo acetila), um grupo benzoila, um grupo amino, uma hidrazina, uma hidroxiamina, um grupo tiol, um grupo carbóxi, um grupo isopropila, um grupo metila, um hidrocarboneto Ce C20 de cadeia reta ou ramificada, um hidrocarboneto saturado ou insaturado, um grupo O-metila, um grupo poliéter, um grupo nitro, um grupo alquinila ou similar. Além disso, anéis arila com múltiplas substituições também são contemplados. Análogos de glutamina que podem ser adequados para uso na presente invenção incluem, porém sem limitação, derivados do tipo α-hidróxi, derivados γ-substituídos, derivados cíclicos, e derivados de glutamina substituída com amida. Exemplos de análogos de fenilalanina que podem ser adequados para uso na presente invenção incluem, porém sem limitação, fenilalaninas para-substituídas, fenilalaninas ortossubstituídas, e fenilalaninas metassubstituídas, onde 0 substituinte compreende, incluindo, porém sem limitação, um grupo hidróxi, um grupo metóxi, um grupo metila, um grupo alila, um aldeído, um azido, um iodo, um bromo, um grupo ceto (incluindo, porém sem limitação, um grupo acetila), um grupo benzoila, um grupo alquinila, ou similar, exemplos específicos de aminoácidos artificiais que podem ser adequados para uso na presente invenção incluem, porém sem limitação, uma p-acetil-L-fenilalanina, uma O-metilL-tirosina, uma L-3-(2-naftil)alanina, uma 3-metil-fenilalanina, uma 0-4

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74/197 alil-L-tirosina, uma 4-propil-L-tirosina, uma tri-O-acetil-GIcNAcp-serina, uma L-Dopa, uma fenilalanina fluorada, uma isopropil-L-fenilalanina, uma p-azido-L-fenilalanina, uma p-acil-L-fenilalanina, uma p-benzoil-Lfenilalanina, uma L-fosfosserina, uma fosfonoserina, uma fosfonotirosina, uma p-iodo-fenilalanina, uma p-bromofenilalanina, uma p-amino-L-fenilalanina, uma isopropil-L-fenilalanina, e uma ppropargilóxi-fenilalanina, entre outras.

[00166] Em uma modalidade, são apresentadas composições de um polipeptídio de relaxina modificada compreendendo um aminoácido artificial (tal como p-acetil-L-fenilalanina). Também são apresentadas várias composições compreendendo p-acetil-L- fenilalanina e, incluindo, porém sem limitação, proteínas e/ou células. Em um aspecto, uma composição que incluem o aminoácido artificial p-acetil-L- fenilalanina inclui ainda um tRNA ortogonal. O aminoácido artificial pde ser ligado (incluindo, porém sem limitação, covalentemente) ao tRNA ortogonal, incluindo, porém sem limitação, covalentemente ligado ao tRNA ortogonal através de uma ligação amino-acia, covalentemente ligado a um 3ΌΗ ou a um 2ΌΗ de um açúcar ribose terminal do tRNA ortogonal, etc.

[00167] O polipeptídio de relaxina modificada descrito neste pedido pode compreender um aminoácido codificado artificialmente descrito na Patente US N° 8,735,539, intitulada Relaxin polypeptides comprising non-naturally encoded amino acids, cuja íntegra está aqui incorporada a título de referência.

V. Estrutura e Síntese de Aminoácidos Artificiais [00168] Em algumas modalidades a presente invenção apresenta um polipeptídio de relaxina modificada ligada a um extensor farmacocinético, por exemplo, compreendendo u ácido graxo, por uma ligação oxima. Muitos tipos de aminoácidos codificados artificialmente são adequados para formação de ligações oxima. Estes incluem, porém

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75/197 sem limitação, aminoácidos codificados artificialmente contendo um grupo carbonila, dicarbonila, semelhante à carbonila, carbonila disfarçada, carbonila protegida, ou hidroxilamina. Tais aminoácidos, sua estrutura e sua síntese estão descritas nas Patentes US N^os 8,012,931 e 8,735,539, cuja íntegra está aqui incorporada a título de referência. [00169] Estruturas e métodos de síntese exemplificativos de aminoácidos codificados artificialmente, incluindo aminoácidos contendo hidroxilamina, são conhecidos na literatura, por exemplo, aqueles divulgados na Patente US N° 7,332,571, nas Publicações de Patente US N^os 2006/0194256, 2006/0217532, e 2006/0217289 e no documento WO 2006/069246, a íntegra de cada um deles estando aqui incorporada a título de referência.

SÍNTESE QUÍMICA DE AMINOÁCIDOS CODIFICADOS ARTIFICIALMENTE [00170] Muitos dos aminoácidos artificiais adequados para uso na presente invenção encontram-se comercialmente disponíveis, por exemplo, na Sigma (USA) ou Aldrich (Milwaukee, Wl, USA). Aqueles que não se encontram comercialmente disponíveis são opcionalmente sintetizados da maneira apresentada neste pedido ou da maneira apresentada em várias publicações ou por meio de métodos tradicionais conhecidos pelos especialistas na técnica.

A. Grupos reativos carbonila [00171] Aminoácidos com um grupo reativos carbonila possibilitam uma variedade de reações para ligar moléculas (incluindo, porém sem limitação, PEG ou outras moléculas solúveis em água tais como componentes peptídicos) via adição nucleofílica ou reações de condensação com aldol, entre outras.

[00172] A síntese de p-acetil-(+/-)-fenilalanina e m-acetil-(+/-)fenilalanina está descrita em Zhang, Z., et al., Biochemistry 42: 67356746 (2003), que está aqui incorporado a título de referência. Outros

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76/197 aminoácidos contendo carbonila podem ser preparados de maneira similar por um especialista na técnica.

[00173] Em algumas modalidades, um polipeptídio de relaxina modificada compreendendo um aminoácido codificado artificialmente pode ser quimicamente modificado para gerar um grupo funcional carbonila reativo. Por exemplo, uma funcionalidade aldeído útil para reações de conjugações pode ser gerada a partir de uma funcionalidade tendo grupos amino e hidroxila adjacentes.

[00174] Na presente invenção, um aminoácido codificado artificialmente contendo hidroxila e amino adjacentes pode ser incorporado no polipeptídio como uma funcionalidade aldeído disfarçada. Por exemplo, 5-hidroxilisina contém um grupo hidroxila adjacente à amina epsilon. As condições reacionais para gerar o aldeído envolvem tipicamente a adição de excesso molar excess de metaperiodato de sódios em condições leves para evitar a oxidação em outros sítios no polipeptídio. O pH da reação de oxidação é tipicamente cerca de 7,0. Uma reação típica envolve a adição de um excesso de cerca de 1,5 molar de metaperiodato de sódio a uma solução tamponada do polipeptídio, seguida por incubação por cerca de 10 minutos no escuro. Vide, por exemplo, a Patente US N° 6,423,685, que está aqui incorporada a título de referência.

[00175] A funcionalidade carbonila pode ser seletivamente reagido com um reagente contendo hidrazina, hidrazida, hidroxilamina, ou semicarbazida condições em leves em solução aquosa para formar as ligações hidrazona, oxima, ou semicarbazona correspondentes, respectivamente, que são estáveis em condições fisiológicas. Vide, por exemplo, Jencks, W. P., J. Am. Chem. Soc. 81,475-481 (1959); Shao, J. e Tam, J. P., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995). Além disso, a reatividade única do grupo carbonila possibilita a modificação seletiva na presença de outras cadeias laterais de aminoácidos. Vide, por

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77/197 exemplo, Cornish, V. W., et al., J. Am. Chem. Soc. 118:8150-8151 (1996); Geoghegan, K. F. & Stroh, J. G., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992); Mahal, L. K., et al., Science 276:1125-1128 (1997).

B. Grupos reativos hidrazina, hidrazida ou semicarbazida [00176] Aminoácidos codificados artificialmente contendo um grupo nucleofílico, tal como uma hidrazina, hidrazida ou semicarbazida, possibilitam a reação com uma variedade de grupos eletrofílicos para formar conjugados.

[00177] Aminoácidos contendo hidrazida, hidrazina, e semicarbazida encontram-se disponíveis em fontes comerciais. Por exemplo, Lglutamato-y-hidrazida encontra-se disponível na Sigma Chemical (St. Louis, MO). Outos aminoácidos não disponíveis comercialmente podem ser preparados por um especialista na técnica. Vide, por exemplo, Patente US N° 6,281,211, que está aqui incorporada a título de referência.

[00178] Polipeptídios de relaxina modificada contendo aminoácidos codificados artificialmente que contêm funcionalidades hidrazida, hidrazina ou semicarbazida podem ser reagidos de forma eficiente e seletiva com uma varidade de moléculas que contêm aldeídos ou outros grupos funcionais com reatividade química similar. Vide, por exemplo, Shao, J. e Tam, J., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995). A reatividade única dos grupos funcionais hidrazida, hidrazina e semicarbazida deixa-os significativamente mais reativos para aldeídos, cetonas e outros grupos eletrofílicos em comparação com os grupos nucleofílicos presentes nos 20 aminoácidos comuns (incluindo, porém sem limitação, o grupo hidroxila da serina ou treonina ou os grupos amino da lisina e o terminal N).

C. Aminoácidos contendo amino-óxi [00179] Aminoácidos codificados artificialmente contendo um grupo amino-óxi (também chamado hidroxilamina) possibilitam a reação com

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78/197 uma variedade de grupos eletrofílicos para formar conjugados (incluindo, porém sem limitação, com PEG ou componentes peptídicos). Como as hidrazinas, hidrazidas e semicarbazidas, a nucleoficilidade melhorada do grupo amino-óxi permite que ele reaja de forma eficiente e seletiva com uma variedade de moléculas que contêm aldeídos outros grupos funcionais com reatividade química similar. Vide, por exemplo, Shao, J. and Tam, J., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995); H. Hang and C. Bertozzi, Acc. Chem. Fies. 34: 727-736 (2001). Considerando que o resultado da reação com um grupo hidrazina é a hidrazona correspondente, entretanto, uma oxima geralmente resulta da reação de um grupo amino-óxi com um grupo contendo carbonila tal como uma cetona.

[00180] Aminoácidos contendo amino-óxi podem ser preparados a partir de precursores de aminoácidos facilmente disponíveis (homosserina, serina e treonina). Vide, por exemplo, M. Carrasco and R. Brown, J. Org. Chem. 68: 8853-8858 (2003). Certos aminoácidos contendo amino-óxi, tal como ácido L-2-amino-4-(amino-óxi)butírico, já foram isolados de fontes naturais (Rosenthal, G., Life Sei. 60:1635-1641 (1997). Outros aminoácidos contendo amino-óxi podem ser preparados pelo especialista na técnica.

D. Grupos reativos azida e alquino [00181] A reatividade única de grupos funcionais azida e alquino deixa-os úteis para a modificação seletiva de polipeptídios e outras moléculas biológicas. As azidas orgânicas, particularmente azidas alifáticas, e os alquinos geralmente são estáveis em condições químicas reativas comuns. Em particular, ambos os grupos funcionais azida e alquino são inertes em relação às cadeias laterais (i.e., grupos R) dos 20 aminoácidos comuns encontrados em polipeptídios de ocorrência natural. Quando colocados bem próximos, no entanto, a natureza spring-loaded dos grupos azida e alquino é revelada e eles reagem

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79/197 seletiva e eficientemente via a reação de cicloadição [3+2] de Huisgen para gerar o triazol correspondente. Vide, por exemplo, Chin J., et al., Science 301:964-7 (2003); Wang, Q., et al., J. Am. Chem. Soc. 125, 3192-3193 (2003); Chin, J. W., et a!., J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002).

[00182] Como a reação de cicloadição de Huisgen envolve uma reação de cicloadição seletiva (vide, por exemplo, Padwa, A., in Comprehensive Organic Synthesis, Vol. 4, (ed. Trost, B. M., 1991), pp. 1069-1109; Huisgen, R. in 1,3-Dipolar Cicloaddition Chemistry, (ed. Padwa, A., 1984), pp. 1-176) e não uma substituição nucleofílica, a incorporação de aminoácidos codificados artificialmente portadores de cadeias laterais contendo azida e alquino permite que os polipeptídios resultantes sejam modificados de forma seletiva em qualquer posição do aminoácido codificado artificialmente. Uma reação de cicloadição envolvendo um polipeptídio de relaxina modificada contendo azida ou alquino pode ser realizada à temperatura ambiente em condições aquosas pela adição de Cu(ll) (incluindo, porém sem limitação, na forma de uma quantidade catalítica de CuSO4) na presença de um agente redutor para reduzir Cu(ll) para Cu(l), in situ, em quantidade catalítica. Vide, por exemplo, Wang, Q., etal., J. Am. Chem. Soc. 125, 3192-3193 (2003); Tornoe, C. W„ et al., J. Org. Chem. 67:3057-3064 (2002); Rostovtsev, et al., Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599 (2002). Agentes redutores exemplificativos incluem, incluindo, porém sem limitação, ascorbato, cobre metálico, quinina, hidroquinona, vitamina K, glutationa, cisteína, Fe²⁺, Co²⁺, e um potencial elétrico aplicado.

[00183] Em alguns casos, onde se deseja uma reação de cicloadição [3+2] de Huisgen entre uma azida e um alquino, 0 polipeptídio de relaxina modificada pode compreender um aminoácido codificado artificialmente compreendendo uma porção alquino e 0 melhorador farmacocinético a ser preso ao aminoácido pode compreender uma

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80/197 porção azida. Alternativamente, a reação inversa (i.e., com uma porção azida no aminoácido e a porção alquino presente no polímero solúvel em água) também pode ser realizada.

[00184] O grupo funcional azida também pode ser reagido seletivamente com um polímero solúvel em água contendo um grupo éster arílico e apropriadamente funcionalizado com uma porção aril fosfina para gerar uma ligação amida. O grupo aril fosfina reduz a azida in situe a amina resultante então reage eficientemente com uma ligação éster para gerar a amida correspondente. Vide, por exemplo, E. Saxon and C. Bertozzi, Science 287, 2007-2010 (2000). O aminoácido contendo azida pode ser uma azida alquílica (incluindo, porém sem limitação, ácido 2-amino-6-azido-1-hexanoico) ou uma azida arílica (pazido-fenilalanina).

[00185] O grupo funcional azida também pode ser reagido seletivamente com um polímero solúvel em água contendo um tioéster e apropriadamente funcionalizado com uma porção aril fosfina para gerar uma ligação amida. O grupo aril fosfina reduz a azida in situ e a amina resultante então reage eficientemente com a ligação tioéster para gerar a amida correspondente.

[00186] Aminoácidos contendo alquino encontram-se comercialmente disponíveis. Alternativamente, aminoácidos contendo alquino podem ser preparados de acordo com métodos tradicionais. Por exemplo, p-propargiloxifenilalanina pode ser sintetizada, por exemplo, da maneira descrita em Deiters, A., et al., J. Am. Chem. Soc. 125: 11782-11783 (2003), e 4-alquinil-L-fenilalanina pode ser sintetizada da maneira descrita em Kayser, B., et al., Tetrahedron 53(7): 2475-2484 (1997). Outros aminoácidos contendo alquino podem ser preparados pelo especialista na técnica.

[00187] Aminoácidos contendo azida encontram disponíveis em fontes comerciais. Para aqueles aminoácidos contendo azida que não

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81/197 se encontram comercialmente disponíveis, o grupo azida pode ser preparado de forma relativamente fácil por métodos tradicionais conhecidos pelo especialista na técnica, incluindo, porém sem limitação, via deslocamento de um grupo deslocável adequado (incluindo, porém sem limitação, halogênioeto, mesilato, tosilato) ou via abertura de uma lactona adequadamente protegida. Vide, por exemplo, Advanced Organic Chemistry by March (Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York).

[00188] Uma molécula que pode ser adicionada a uma proteína da invenção através de uma cicloadição [3+2] inclui virtualmente qualquer molécula com um derivado azídico ou alquínico. As moléculas incluem, porém sem limitação, corantes, fluoróforos, agentes de reticulação, derivados de sacarideo, polímeros (incluindo, porém sem limitação, polímeros compreendendo polietileno glicol), fotorreticuladores, compostos citotóxicos, marcadores de afinidade, derivados de biotina, resinas, contas, um peptídio, uma segunda proteína ou polipeptídio (ou mais), polinucleotídeos (incluindo, porém sem limitação, DNA, RNA, etc.), quelantes metálicos, cofatores, ácidos graxos, carboidratos, entre outros. Essas moléculas podem ser adicionadas a um aminoácido artificial com um grupo alquinila, incluindo, porém sem limitação, ppropargiloxifenilalanina, ou um grupo azido, incluindo, porém sem limitação, p-azido-fenilalanina, respectivamente.

E. Grupos reativos aminotiol [00189] A reatividade única de grupos funcionais aminotiol betasubstituído deixa-os úteis para a modificação seletiva de polipeptídios e outras moléculas biológicas que contêm grupos aldeído via formação da tiazolidina. Vide, por exemplo, J. Shao and J. Tam, J. Am. Chem. Soc. 1995,117(14) 3893-3899. Em algumas modalidades, aminoácidos com aminotiol betassubstituído podem ser incorporados em polipeptídios de relaxina modificada e então reagidos com um melhorador

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82/197 farmacocinético compreendendo uma funcionalidade aldeído. Em algumas modalidades, um melhorador farmacocinético, um conjugado medicamentoso ou outra carga útil podem ser acoplados a um polipeptídio de relaxina modificada compreendendo um aminoácido com via formação da tiazolidina.

F. Grupos reativos adicionais [00190] Grupos reativos adicionais e aminoácidos codificados artificialmente que podem ser incorporados em polipeptídios de relaxina modificada da invenção estão descritos nos seguintes pedidos de patente que estão todos aqui incorporados em sua íntegra a título de: Publicação de Patente US N° 2006/0194256, Publicação de Patente US N° 2006/0217532, Publicação de Patente US N° 2006/0217289, e Publicação de Pedido de Patente Internacional N° WO/2007/070659.

VI. Geração In vivo de polipeptídios de relaxina modificada compreendendo aminoácidos codificados artificialmente [00191] Os polipeptídios de relaxina modificada da invenção podem ser gerados in vivo usando tRNA e tRNA sintetases para adicionar ou substituir aminoácidos que não são codificados em sistemas de ocorrência natural. Tais métodos estão descritos na Patente US N° 8,735,539, cuja íntegra está aqui incorporada a título de referência.

[00192] Métodos para gerar tRNAs e tRNA sintetases que usam aminoácidos que não são codificados em sistemas de ocorrência natural estão descritos, por exemplo, nas Patentes US N^os 7,045,337 e 7,083,970 que estão aqui incorporadas a título de referência. Esses métodos envolvem gerar um maquinário translacional que funcione de forma independente das sintetases e tRNAs endógenos ao sistema translacional (e, por conseguinte, às vezes são chamados de ortogonais). Tipicamente, o sistema de translação compreende an tRNA ortogonal (Ο-tRNA) e uma aminoacil tRNA sintetase ortogonal (ORS). Tipicamente, a O-RS preferivelmente aminoacila o Ο-tRNA com

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83/197 pelo menos um aminoácido artificial no sistema de translação e o OtRNA reconhece pelo menos um códon seletor que não é reconhecido pelos outros tRNAs no sistema. O sistema de translação insere assim um aminoácido codificado artificialmente em uma proteína produzida no sistema, em resposta a um códon seletor codificado, dessa forma substituindo um aminoácido em uma posição no polipeptídio codificado.

[00193] O uso de O-tRNA/aminoacil-tRNA sintetases envolve a seleção de um códon específico que codifica o aminoácido codificado artificialmente. Embora qualquer códon possa ser usado, geralmente é desejável selecionar um códon que seja raramente ou nunca usado na célula a O-tRNA/aminoacil-tRNA sintetase é expressa. Por exemplo, códons exemplificativos incluem códon nonsense tal como códons de término (âmbar, ocre, e opala), códons de quatro ou mais bases e outros códons de três bases naturais que são raramente usados ou não são usados.

[00194] Códons seletores específicos podem ser introduzidos em posições apropriadas na sequência codificadora do polinucleotídeo da relaxina usando métodos de mutagênese conhecidos na literatura (incluindo, porém sem limitação, mutagênese sítio-dirigida, mutagênese por inserção de cassetes, mutagênese por seleção de sítios de restrição, etc.).

VII. Expressão em não eucariotas e em eucariotas

Sistemas de Expressão, Cultura, e Isolamento [00195] Polipeptídios de relaxina modificada ou não modificada podem ser expressos em qualquer número de sistemas de expressão adequados incluindo, por exemplo, leveduras, células de insetos (por exemplo, células de insetos infectadas com Baculovírus), células de mamíferos, e bactérias. Uma descrição de sistemas de expressão exemplificativos é apresentada a seguir.

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84/197 [00196] Levedura: Conforme usado neste relatório descritivo, o termo levedura inclui qualquer uma das várias leveduras capazes de expressar um gene codificando um polipeptídio de relaxina modificada, incluindo, porém sem limitação, P. pastoris, P. guillerimondii, S. cerevisiae, S. carlsbergensis, S. diastaticus, S. douglasii, S. kluyveri, S. norbensis, S. oviformis, K. lactis, K. fragilis, C. albicans, C. maltosa, e H. polymorpha. O documento WO 2005/091944, que está aqui incorporado a título de referência, descreve a expressão de relaxina em leveduras. Espécies de E. Coli, Pseudomonas, e outros procariotas:

[00197] O termo hospedeiro bacteriano ou célula hospedeira bacteriana refere-se a uma célula bacteriana que pode ser, ou fora, usada como receptor para vetores recombinantes ou outro DNA de transferência. O termo inclui a progênie da célula hospedeira bacteriana original que fora transfectada. Fica entendido que a progênie de uma célula parental pode não ser necessariamente completamente idêntica em termos de morfologia ou de complemento de DNA genômico ou total à matriz original, devido à mutação acidental ou deliberada. Progênies da célula parental que são suficientemente similares à matriz a ser caracterizada pela propriedade relevante, tal como a presença de uma sequência de nucleotídeos codificando um polipeptídio relaxina não modificada ou modificada, estão incluídas na progênie visada por esta definição.

[00198] Ao selecionar hospedeiros bacterianos para expressão, hospedeiros adequados podem incluir aqueles que apresentam, inter alia, capacidade satisfatória de formação de corpos de inclusão, baixa atividade proteolítica, e robustez geral. A fermentação industrial/farmacêutica geralmente utiliza bactérias derivadas de cepas K (por exemplo, W3110) ou de bactérias derivadas de cepas B (por exemplo, BL21). Outros exemplos de hospedeiros E. coli adequados incluem, porém sem limitação, cepas de BL21, DH10B, ou derivados

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85/197 das mesmas. Em uma outra modalidade dos métodos da presente invenção, o hospedeiro E. coli é uma cepa protease menos incluindo, porém sem limitação, OMP- e LON-. A cepa da célula hospedeira pode ser uma espécie de Pseudomonas, incluindo, porém sem limitação, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, e Pseudomonas putida. Sabe-se que a Pseudomonas fluorescens biovar 1, designada cepa MB101, é útil para produção recombinante e está disponível para processos de produção de proteínas terapêuticas.

[00199] Depois que uma cepa de célula hospedeira recombinante é estabelecida (i.e., o construto de expressão é introduzido na célula hospedeira e células hospedeiras com o construto de expressão adequado são isoladas), a cepa da célula hospedeira recombinante é cultivada em condições apropriadas para a produção de polipeptídios de relaxina modificada.

[00200] Células hospedeiras recombinantes podem ser cultivadas em formatos intermitentes ou contínuos, seja com coleta das células (no caso em que o polipeptídio de relaxina modificada acumula-se intracelularmente) ou coleta do sobrenadante da cultura em formatos intermitentes ou contínuos.

[00201] Os polipeptídios de relaxina modificada produzidos em células hospedeiras bacterianas podem ser pobremente solúveis ou insolúveis (na forma de corpos de inclusão). Em uma modalidade da presente invenção, substituições de aminoácidos podem ser feitas com facilidade no polipeptídio de relaxina modificada, as quais são selecionadas com a finalidade de aumentar a solubilidade da proteína produzida de forma recombinante. O polipeptídio de relaxina modificada pode ser solubilizado, por exemplo, com ureia ou cloridrato de guanidina.

[00202] No caso da proteína de relaxina modificada solúvel, a relaxina pode ser secretada no espaço periplasmático ou no meio de

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86/197 cultura. Por exemplo, a relaxina modificada é secretada no espaço periplasmático de células W3110-B2 usando plasmídios codificando construtos incluindo oito sequências líderes diferentes, incluindo aquelas listadas nas SEQ ID NOs: 39-44, e transformando as mesmas em células W3110-B2, as células foram então cultivadas a 37°C até a OD atingir cerca de 0,8, quando então a expressão induzida com 0,01 % de arabinose. Cinco horas depois da liberação periplástica, amostras podem ser preparadas a partir das culturas. Ademais, relaxina modificada solúvel pode estar presente no citoplasma das células hospedeiras. Pode-se desejar concentrar a relaxina modificada solúvel antes de realizar a etapa de purificação.

[00203] Quando o polipeptídio de relaxina modificada é produzido como uma proteína de fusão, a sequência de fusão pode ser removida. A remoção de uma sequência de fusão pode ser efetuada por divagem enzimática ou química. A remoção enzimática das sequências de fusão pode ser efetuada por meio de métodos conhecidos pelo especialista na técnica. A escolha da enzima para remoção da sequência de fusão pode ser determinada pela identidade da fusão, as condições reacionais podem ser especificadas pela escolha da enzima como ficará evidente para um especialista na técnica. A divagem química pode ser efetuada usando reagentes conhecidos pelos especialistas na técnica, incluindo, porém sem limitação, brometo de cianogênio, protease TEV, e outros reagentes. O polipeptídio de relaxina modificada clivado pode ser purificado a partir da sequência de fusão clivada por métodos conhecidos pelos especialistas na técnica.

[00204] Em geral, é ocasionalmente desejável desnaturar e reduzir o polipeptídio expresso e então fazer com que os polipeptídios renovelem na conformação preferida. Por exemplo, guanidina, ureia, DTT, DTE, e/ou uma chaperonina podem ser adicionados a um produto de translação de interesse. As proteínas podem ser renoveladas em um

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87/197 tampão de redox contendo, incluindo, porém sem limitação, glutationa e L-arginina oxidadas. Reagentes de renovelamento podem ser escoados ou de outra forma colocados em contato com um ou mais polipeptídios ou outros produtos de expressão, ou vice-versa.

[00205] No caso de produção procariótica de polipeptídio de relaxina modificada, o polipeptídio de relaxina modificada dessa maneira pode ser mal enovelado e assim não ter atividade biológica ou ter atividade biológica reduzida. A bioatividade da proteína pode ser restaurada por renovelamento. Em geral, o polipeptídio relaxina não modificada ou modificada mal enovelado é renovelado por solubilização (onde o polipeptídio relaxina modificada também é insolúvel), desenovelamento e redução da cadeia polipeptídica usando, por exemplo, um ou mais agentes caotrópicos (por exemplo, ureia e/ou guanidina) e um agente redutor capaz de reduzir ligações dissulfeto (por exemplo, ditiotreitol, DTT ou 2-mercaptoetanol, 2-ME). A uma concentração moderada de caótropo, adiciona-se então um agente oxidante (por exemplo, oxigênio, cistina ou cistamina), que permite a reformação de ligações dissulfeto. O polipeptídio relaxina modificada pode ser renovelado por meio de métodos tradicionais conhecidos na literatura, tais como aqueles descritos nas Patentes US N^os 4,511,502, 4,511,503, e 4,512,922, que estão aqui incorporadas a título de referência. O polipeptídio de relaxina modificada também pode ser coenovelado com outras proteínas para formar heterodímeros ou heteromultímeros.

[00206] Depois do renovelamento, a relaxina modificada pode ser ainda purificada. A purificação da relaxina modificada pode ser efetuada por meio de várias técnicas conhecidos pelos especialistas na técnica, incluindo cromatografia por interação hidrófoba, cromatografia de exclusão por tamanho, cromatografia de troca iônica, cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa, cromatografia de afinidade, entre outras, ou qualquer combinação das mesmas. Purificação

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88/197 adicional também pode incluir uma etapa de secagem ou precipitação da proteína purificada.

[00207] Depois da purificação, a relaxina modificada pode ser transferida para diferentes tampões e/ou concentrada por qualquer um de uma variedade de métodos conhecidos na literatura, incluindo, pesl, diafiltração e diálise. A relaxina modificada que é apresentada como uma única proteína purificada pode ser submetida à agregação e precipitação.

[00208] A relaxina modificada purificada pode ser pelo menos 90% pura (segundo medido por cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa, RP-HPLC, ou eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida, SDS-PAGE) ou pelo menos 95% pura, ou pelo menos 98% pura, ou pelo menos 99% pura ou mais. Independente do valor numérico exato da pureza da relaxina modificada, a relaxina modificada é suficientemente pura para uso como um produto farmacêutico ou para processamento posterior, tal como conjugação com um melhorador farmacocinético.

[00209] Certas moléculas de relaxina modificada podem ser usadas como agentes terapêuticos na ausência de outros princípios ativos ou proteínas (que não excipientes, veículos, e estabilizantes, albumina sérica, entre outros), ou elas podem ser complexadas com uma outra proteína ou com um polímero.

[00210] Em algumas modalidades da presente invenção, o redimento de relaxina modificada depois de cada etapa de purificação pode ser de pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91 %, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca

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89/197 de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, pelo menos cerca de 99,9%, ou pelo menos cerca de 99,99%, da relaxina não modificada ou modificada no material de partida para cada etapa de purificação.

VIII. Expressão em sistemas alternativos [00211] Os polipeptídios de relaxina modificada da presente invenção podem ser expressos usando um sistema de translação (por exemplo, in vitro) livre de células. Os sistemas de translação podem ser celulares ou livres de células, e podem ser procarióticos ou eucarióticos. Sistemas de translação celulares incluem, porém sem limitação, preparações de células inteiras tais como células permeabilizadas ou culturas de células nas quais um ácido nucleico desejado pode ser transcrito para mRNA e o mRNA, transladado. Sistemas de translação livres de células encontram-se comercialmente disponíveis e muitos tipos e sistemas diferentes são bastante conhecidos. Exemplos de sistemas livres de células incluem, porém sem limitação, lisados procarióticos tais como lisados de Escherichia coli, e lisados eucarióticos tais como extratos de gérmen de trigo, lisados de células de inseto, lisados de reticulócitos de coelho, lisados de oócitos de coelho e lisados de células humanas. Também se encontram disponíveis extratos membranosos, tais como extratos de pâncreas canino contendo membranas microssômicas, que são úteis para a translação de proteínas secretoras.

IX. Proteínas de fusão contendo polipeptídios de relaxina modificada [00212] A invenção também apresenta polipeptídios de relaxina modificada, ou fragmentos da mesma, compreendendo a sequência do polipeptídio de relaxina modificada e um parceiro de fusão. O parceiro de fusão pode conferir uma propriedade funcional, incluindo, porém sem

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90/197 limitação, extensão da meia-vida, facilitação da purificação e/ou produção da proteína, propriedades biofísicas melhoradas tais como maior solubilidade ou estabilidade, e imunogenicidade ou toxicidade reduzidas, ou qualquer outro parâmetro. Por exemplo, a proteína de fusão pode apresenta meia-vida in vivo estendida, dessa forma facilitando uma dosagem menos frequente (tal como dosagem duas vezes por semana, uma vez por semana, ou uma vez a cada duas semanas, etc.) em um regime terapêutico. Proteínas de fusão exemplificativas compreendem uma relaxina modificada fundida a um parceiro de fusão tal como uma albumina (por exemplo, albumina sérica humana), adnectina extensora de PK (PKE), XTEN, domínio Fc, região constante da imunoglobulina, ou um fragmento de qualquer um dos acima, ou uma combinação de qualquer um dos acima. Uma proteína de fusão pode ser produzida por expressão de um ácido nucleico que codifica a sequência do polipeptídio de relaxina modificada e uma sequência do parceiro de fusão na mesma fase de leitura, opcionalmente separadas por uma sequência codificando um peptídio de conexão. A proteína de fusão pode compreender o polipeptídio de relaxina modificada e o parceiro de fusão em qualquer ordem, por exemplo, um ou mais parceiros de fusão ligados ao terminal N e/ou ao terminal C da sequência do polipeptídio de relaxina modificada, ou um ou mais parceiros de fusão ligados tanto ao terminal N quanto ao terminal C.

X. Glicosilação de polipeptídios de relaxina modificada e não modificada [00213] A presente invenção inclui polipeptídios de relaxina modificada compreendendo um ou mais aminoácidos codificados artificialmente contendo resíduos sacarídeo. Os resíduos sacarídeo podem ser naturais (incluindo, porém sem limitação, Nacetilglucosamina) ou não naturais (incluindo, porém sem limitação, 3

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91/197 fluorogalactose). Os sacarídeos podem ser ligados aos aminoácidos codificados artificialmente seja por uma ligação glicosídica N- ou Oligada (incluindo, porém sem limitação, N-acetilgalactose-L-serina) ou por uma ligação não natural (incluindo, porém sem limitação, uma oxima ou o glicosídeo C- ou S-ligado correspondente).

[00214] As porções de sacarídeo (incluindo, porém sem limitação, glicosil) podem ser adicionadas aos polipeptídios de relaxina modificada seja in vivo ou in vitro. Em algumas modalidades da presente invenção, um polipeptídio de relaxina modificada compreendendo um aminoácido codificado artificialmente contendo carbonila pode ser modificado com um sacarídeo derivatizado com um grupo amino-óxi para gerar o polipeptídio glicosilado correspondente ligado via uma ligação oxima. Depois de preso ao aminoácido codificado artificialmente, o sacarídeo pode ser ainda elaborado por tratamento com glicosiltransferases e outras enzimas para gerar um oligossacarídeo ligado ao polipeptídio de relaxina modificada. Vide, por exemplo, H. Liu, et al. J. Am. Chem. Soc. 125: 1702-1703 (2003).

XI. Administração e composições farmacêuticas [00215] Também são apresentadas neste pedido composições farmacêuticas compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do polipeptídio relaxina modificada, descrito neste relatório, e um veículo farmaceuticamente aceitável ou excipiente. Tal veículo ou excipiente inclui, porém sem limitação, solução salina, solução tamponada, dextrose, sacarose, histidina, água, glicerol, PS80 (Polissorbato 80), etanol, e/ou combinações dos mesmos. A formulação é feita de forma a se adequar ao modo de administração.

[00216] Por exemplo, um polipeptídio de relaxina modificada descrito neste pedido pode ser administrado a um paciente em uma concentração entre cerca de 0,1 e 100 mg/kg de peso corporal do paciente receptor. Em uma modalidade, um polipeptídio de relaxina

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92/197 modificada descrito neste pedido pode ser administrado a um paciente em uma concentração de cerca de 0,5-5 mg/kg de peso corporal do paciente receptor. Em uma outra modalidade, um polipeptídio de relaxina modificada descrito neste pedido pode ser administrado a um paciente em uma concentração com uma frequência entre uma vez ao dia e uma vez a cada duas semanas, três semanas, ou quatro semanas, tal como cerca de uma vez por semana, duas vezes por semana, uma vez a cada dois dias, uma vez a cada três dias, uma vez a cada quatro dias, uma vez a cada cinco dias, ou uma vez a cada seis dias. Em uma outra modalidade, um polipeptídio de relaxina modificada descrito neste pedido pode ser administrado a um paciente uma vez por semana.

[00217] Deve ficar entendido que a concentração do polipeptídio de relaxina modificada administrada a um dado paciente pode ser maior ou menos que as concentrações de administração exemplificativas apresentadas acima.

[00218] Com base nas informações fornecidas na presente invenção descrição, um especialista na técnica seria capaz de determinar uma dosagem eficaz e a frequência de administração por meio de experimentação de rotina, por exemplo, orientado pela descrição fornecida neste relatório e pelos ensinamentos contidos em Goodman et al., (2006). Goodman & Gilman's the pharmacological basis of therapeutics. New York: McGraw-Hill; ou Howland et al., (2006). Pharmacology. Lippincott's illustrated reviews. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins.

[00219] As quantidades médias da relaxina modificada podem variar e em particular devem basear-se nas recomendações e na prescrição de um médico qualificado. A quantidade exata de relaxina modificada é uma questão de preferência sujeita a fatores tais como o tipo exato da condição sendo tratada, a condição do paciente sendo tratado, assim como outros ingredientes na composição. A presente invenção também

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93/197 apresenta a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um outro agente ativo. A quantidade a ser dada pode ser facilmente determinada por um especialista na técnica.

[00220] Uma composição farmacêutica refere-se a uma composição química ou biológica adequada para administração a um mamífero. Tais composições podem ser especificamente formuladas para administração por uma ou mais de inúmeras vias, incluindo, porém sem limitação bucal, epicutânea, epidural, inalação, intra-arterial, intracardíaca, intracerebroventricular, intradérmica, intramuscular, intranasal, intraocular, intraperitoneal, intraespinhal, intratecal, intravenosa, oral, parenteral, retal via um enema ou supositório, subcutânea, subdérmica, sublingual, transdérmica, e transmucosa. Além disso, a administração pode ocorrer por meio de injeção, pó, líquido, gel, gotas, ou outros meios de administração.

[00221] Conforme usado neste relatório descritivo veículo farmaceuticamente aceitável ou excipiente inclui todo e qualquer solvente, meio de dispersão, revestimento, agente antibacteriano e antifúngico, agente isotônico e retardador da absorção que sejam fisiologicamente compatíveis. Em uma modalidade, o veículo é adequado para administração parenteral. Em uma outra modalidade, o veículo é adequado para administração subcutânea. Alternativamente, o veículo pode ser adequado para administração intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, ou sublingual. Veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis.

[00222] Em algumas modalidades, temperatura ambiente compf pode estar presente na forma liofilizada. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, lipossoma, ou outra estrutura ordenada para alta concentração da droga. O veículo pode ser

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94/197 um solvente ou um meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, e polietileno glicol líquido), e misturas adequadas dos mesmos. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende um estabilizante. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos.

[00223] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende um agente isotônico, por exemplo, açúcares tal como sacarose, poliálcoois tais como manitol, sorbitol, ou cloreto de sódio na composição. Com a inclusão de um agente tal como sais de monoestearato e gelatina, a absorção das composições injetáveis pode ser prolongada. Além disso, o polipeptídio pode ser formulado em uma formulação de liberação prolongada, por exemplo, em uma composição que inclui um polímero de liberação lenta. Os compostos ativos podem ser preparados com veículos que possam proteger o composto contra liberação rápida, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes e sistemas de distribuição microencapsulados. Polímeros biocompatíveis biodegradáveis podem ser usados, tais como etileno vinil acetato, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, ácido poliláctico ie copolímeros polilácticos, poliglicólidos (PLG).

[00224] Os polipeptídios de relaxina modificada e as composições da presente invenção podem ser administrados por qualquer via convencional para proteínas ou peptídios, incluindo, porém sem limitação, a via parenteral, por exemplo, injeções incluindo, porém sem limitação, a via subcutâne ou intravenosa ou qualquer outra forma de injeções ou infusões. As composições de polipeptídios podem ser administradas por inúmeras vias que incluem, porém sem limitação, a via oral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, transdérmica,

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95/197 subcutânea, topical, sublingual, ou retal. Composições compreendendo relaxina modificada também podem ser administradas via lipossomas. O polipeptídio de relaxina modificada pode ser usado isoladamente ou em combinação com outros componentes adequados tal como um veículo farmacêutico. O polipeptídio de relaxina modificada pode ser usado em combinação com outos agentes descritos neste pedido. [00225] Formulações adequadas para administração parenteral, tal como, por exemplo, por via intra-articular (nas articulações), intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, e subcutânea, incluem soluções injetáveis aquosas e não aquosas isotônicas e estéreis, que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostatos, e solutos que deixam a formulação isotônica com o sangue do receptor visado, e suspensões aquosas e não aquosas estéreis que podem incluir agentes de suspensão, solubilizantes, agentes espessantes, estabilizantes, e conservantes. As formulações de relaxina modificada podem apresentadas em recipientes vedadas com uma única dose ou com múltiplas doses, tais como ampolas e frascos.

[00226] A dose administrada a um paciente, no contexto da presente invenção, é suficiente para ter uma resposta terapêutica benéfica no paciente ao longo do tempo, ou outra atividade apropriada, dependendo da aplicação. A dose é determinada pela eficácia da formulação, e pela atividade, estabilidade ou meia-vida sérica do polipeptídio de relaxina modificada empregado e pela condição do paciente, assim pelo peso corporal ou a área superficial do paciente a ser tratado.

[00227] A dose administrada, por exemplo, a um paiente pesando 70 quilos, está tipicamente na faixa equivalente a dosagens das proteínas terapêuticas atualmente usadas, ajustadas para a atividade alterada ou meia-vida sérica da composição relevante.

[00228] Para administração, as formulações da presente invenção são administradas a uma taxa determinada pela LD-50 ou ED-50 da

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96/197 formulação relevante, e/ou pela observação de quaisquer efeitos colaterais dos polipeptídios de relaxina modificada em várias concentrações, incluindo, porém sem limitação, como se aplica à massa e ao estado geral de saúde do paciente. A administração pode ser feita em dose única ou em doses fracionadas.

[00229] Os polipeptídios de relaxina modificada da presente invenção podem ser administrados diretamente a um indivíduo mamífero. Os polipeptídios de relaxina modificada da presente invenção podem ser preparados em uma mistura em uma forma de dosagem unitária injetável (incluindo, porém sem limitação, solução, suspensão, ou emulsão) com um veículo farmaceuticamente aceitável. Os polipeptídios de relaxina modificada da presente invenção também podem sser administrados por infusão contínua (usando, incluindo, porém sem limitação, minibombas tais como bombas osmóticas), bolo único, ou formulações de depósito de liberação lenta.

[00230] Formulações adequadas para administração incluem soluções aquosas e não aquosas, soluções isotônicas estéreis, que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostatos, e solutos que deixam a formulação isotônica, e suspensões aquosas e não aquosas estéreis que podem incluir agentes de suspensão, solubilizantes, agentes espessantes, estabilizantes, e conservantes. As soluções e suspensões podem ser preparadas a partir de pós estéreis, grânulos, e comprimidos do tipo descrito anteriormente.

[00231] Veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem, porém sem limitação, tampões contendo succinato, fosfato, borato, HEPES, citrato, histidina, imidazol, acetato, bicarbonate, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo, porém sem limitação, ácido ascórbico; polipeptídios de baixo peso molecular incluindo, porém sem limitação, aqueles com menos de cerca de 10 resíduos; proteínas, incluindo, porém sem limitação, albumina sérica, gelatina, ou imunoglobulinas;

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97/197 polímeros hidrofílicos incluindo, porém sem limitação, polivinilpirrolidona; aminoácidos incluindo, porém sem limitação, glicina, glutamina, asparagina, arginina, histidina ou derivados de histidina, metionina, glutamato, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos, incluindo, porém sem limitação, trealose, sucrose, glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes incluindo, porém sem limitação, EDTA e edentato dissódico; íons metálicos divalentes incluindo, porém sem limitação, zinco, cobalto, ou cobre; álcoois de açúcares incluindo, porém sem limitação, manitol ou sorbitol; contraíons formadores de sal incluindo, porém sem limitação, sódio e cloreto de sódio; e/ou tensoativos não iônicos incluindo, porém sem limitação Tween™ (incluindo, porém sem limitação, Tween 80 (polissorbato 80 ou PS80) e Tween 20 (polissorbato 20), Pluronics™ e outros ácidos plurônicos, incluindo, porém sem limitação, e outros ácidos plurônicos, incluindo, porém sem limitação, ácido plurônico F68 (poloxâmero 188), ou PEG. Tensoativos adequados incluem, por exemplo, porém sem limitação, poliéteres à base de poli(óxido de etileno)-poli(óxido de propileno)-poli(óxido de etileno), i.e., (PEO-PPO-PEO), ou poli(óxido de propileno)-poli(óxido de etileno)-poli(óxido de propileno), i.e., (PPOPEO-PPO), ou uma combinação dos mesmos. PEO-PPO-PEO e PPOPEO-PPO encontram-se comercialmente disponíveis sob os nomes comerciais Pluronics™, R-Pluronics™, Tetronics™ e R-Tetronics™ (BASF Wyandotte Corp., Wyandotte, Mich.) e estão ainda descritos na Patente US N° 4,820,352 aqui incorporada em sua íntegra a título de referência. Outros polímeros em blocos de etileno/polipropileno pode ser tensoativos adequados. Pode-se usar um tensoativo ou uma combinação de tensoativos para estabilizar a relaxina modificada contra um ou mais estresses incluindo, porém sem limitação estresse que resulta da aditação. Alguns dos agentes acima podem ser chamados de agentes de volume. Alguns também podem ser chamados de

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98/197 modificadores da tonicidade. Conservantes antimicrobianos também podem ser aplicados para estabilidade do produto e eficácia antimicrobiana; conservantes adequados incluem, porém sem limitação, álcool benzílico, cloreto de benzalcônio, metacresol, metil/propil parabeno, cresol, e fenol, ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica pode compreender um tampão contendo succinato, fosfato, borato, HEPES, citrato, histidina, imidazol, acetato, bicarbonate, e/ou outros ácidos orgânicos; um carboidrato (por exemplo, monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos), tais como trealose, sacarose, glicose, manose, ou dextrina; e um tensoativo tal como Tween™ 80 (polissorbato 80 ou PS80) ou Tween 20 (polissorbato 20). Em algumas modalidades, a composição farmacêutica pode compreender um tampão contendo histidina, um carbodidrato tal como sacarose; e um tensoativo tal como PS80.

[00232] Os polipeptídios de relaxina modificada da presente invenção, inclusive aqueles ligados a um melhorador farmacocinético também podem ser administrados por sistemas de liberação sistemática ou como parte dos mesmos. Composições de liberação sistemática incluem, inclusive, porém sem limitação, matrizes poliméricas semipermeáveis na forma de artigos moldados, incluindo, porém sem limitação, filmes, ou microcáspsulas. Matrizes de liberação sistemática incluem desde materiais biocompatíveis tal como poli(2-hidroxietil metacrilato), etileno vinil acetato (ou ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico, polilactídeos (ácido poliláctico), poliglicolídeo (polímero de ácido glicólico), polianidridos de polilactídeo co-glicolídeo (copolímeros de ácido láctico e ácido glicólico), copolímeros de L-ácido glutâmico e gama-etil-L-glutamato, poli(orto)ésteres, polipeptídios, ácido hialurônico, colágeno, sulfato de condroitina, ácidos carboxílicos, ácidos graxos, fosfolipídios, polissacarídeos, ácidos nucleicos,

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99/197 poliaminoácidos, aminoácidos tais como fenilalanina, tirosina, isoleucina, polinucleotídeos, polivinil propilenila, polivinilpirrolidona e silicone. Composições de liberação sistemática também incluem composto aprisionado lipossomicamente.

[00233] A dose administrada a um paciente no contexto da presente invenção deve ser suficiente para provocar uma resposta benéfica no indivíduo ao longo do tempo. Geralmente, a quantidade farmaceuticamente eficaz total do polipeptídio de relaxina modificada da presente invenção administrada por via parenteral (por exemplo, por via intravenosa ou subcutânea) por dose pode variar na faixa de cerca de 0,01 pg/kg a cerca de 500 mg/kg, cerca de 0,01 pg/kg a cerca de 100 mg/kg, cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 50 mg/kg, cerca de 100 pg/kg a cerca de 40 mg/kg, cerca de 0,2 mg/kg a cerca de 20 mg/kg, ou cerca de 0,5 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, ou is cerca de 0,5 mg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 2 mg/kg, cerca de 3 mg/kg, cerca de 4 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 6 mg/kg, cerca de 7 mg/kg, cerca de 8 mg/kg, cerca de 9 mg/kg, cerca de 10 mg/kg, cerca de 12 mg/kg, cerca de 15 mg/kg, cerca de 20 mg/kg, cerca de 30 mg/kg, cerca de 40 mg/kg, cerca de 50 mg/kg, ou cerca de 100 mg/kg, de peso corporal do paciente, embora esta esteja sujeita a critério terapêutico. Em algumas modalidades, o polipeptídio de relaxina modificada da presente invenção administrado por via parenteral (por exemplo, por via intravenosa ou subcutânea) por dose pode variar na faixa de cerca de 0,2 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, 0,5 mg/kg a cerca de 3 mg/kg, ou 1 mg/kg a cerca de 3 mg/kg, ou is cerca de 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 30 mg/kg, 50 mg/kg, ou 80 mg/kg. Em algumas modalidades, o polipeptídio de relaxina modificada da presente invenção administrado por via parenteral (por exemplo, por via intravenosa ou subcutânea) por dose pode ser de cerca de 1 mg/kg. Em algumas modalidades, o polipeptídio de relaxina modificada da

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100/197 presente invenção administrado por via parenteral (por exemplo, por via intravenosa ou subcutânea) peo dose pode ser uma dose fixa na faixa de cerca de 0,1 mg a cerca de 10.000 mg, de cerca de 1 mg a cerca de 5.000 mg, de cerca de 10 mg a cerca de 2,500 mg, de cerca de 100 mg a cerca de 1.000 mg, de cerca de 200 mg a cerca de 800 mg, de cerca de 400 mg a cerca de 600 mg, de cerca de 1 mg a cerca de 10 mg, de cerca de 10 mg a cerca de 50 mg, de cerca de 50 mg a cerca de 100 mg, de cerca de 100 mg a cerca de 300 mg, de cerca de 300 mg a cerca de 500 mg, de cerca de 500 mg a cerca de 700 mg, de cerca de 700 mg a cerca de 900 mg, de cerca de 900 mg a cerca de 1.200 mg, de cerca de 1.000 mg a cerca de 2.000 mg, de cerca de 2.000 mg a cerca de 3.000 mg, de cerca de 3.000 mg a cerca de 4.000 mg, de cerca de 4.000 mg a cerca de 5.000 mg, de cerca de 5.000 mg a cerca de 6.000 mg, de cerca de 6.000 mg a cerca de 7.000 mg, de cerca de 7.000 mg a cerca de 8.000 mg, de cerca de 8.000 mg a cerca de 9.000 mg, ou de cerca de 9.000 mg a cerca de 10.000 mg.

XII. Usos terapêuticos dos polipeptídios de relaxina modificada [00234] A presente invenção apresenta o uso de polipeptídios de relaxina modificada no tratamento de doenças que incluem cardiodoença vascular ou doença fibrótica, tal como insuficiência cardíaca, pancreatite, inflamação, câncer, esclerodermia, fibrose pulmonar, fibrose renal, fibrose hepática, ou fibrose cardíaca.

[00235] A referida cardiodoença vascular pode incluir, porém sem limitação, doença da artéria coronariana, ataque cardíaco, arritmia ou ritmos cardíacos anormais, insuficiência cardíaca, doença da válcula cardíaca, doença cardíaca congênita, cardiomiopatia (doença do músculo cardíaco), doença pericardíaca, doença aórtica, síndrome de Marfan, ou doença vascular (doença dos vasos sanguíneos).

[00236] Em algumas modalidades, a referida insuficiência cardíaca pode compreender uma ou mais de insuficiência cardíaca avançada,

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101/197 síndrome cardio-renal, insuficiência cardíaca com função renal enfraquecida, insuficiência cardíaca crônica, insuficiência cardíaca crônica com fração de ejeção intermediária (HFmEF), insuficiência cardíaca aguda, insuficiência cardíaca aguda no pós-operatório tal como pós-insuficiência cardíaca descompensada aguda, insuficiência cardíaca compensada, insuficiência cardíaca descompensada, insuficiência cardíaca direita, insuficiência cardíaca esquerda, insuficiência cardíaca global, cardiomiopatia isquêmica, cardiomiopatia dilatada, insuficiência cardíaca associada a defeitos cardíacos congênitos, insuficiência cardíaca associada a defeitos da válvula cardíaca, estenose mitral, insuficiência mitral, estenose aórtica, insuficiência aórtica, estenose tricúspide, insuficiência tricúspide, estenose pulmonar, insuficiência da válcula pulmonar, angina, hipertensão, hipertensão pulmonar ou hipertensão arterial pulmonar, insuficiência cardíaca associada a defeitos combinados da válvula cardíaca, inflamação do miocárdio (miocardite), miocardite crônica, miocardite aguda, miocardite viral, insuficiência cardíaca diabética, cardiomiopatia alcoólica, insuficiência cardíaca associada a distúrbios cardíacos de armazenamento, insuficiência cardíaca diastólica, insuficiência cardíaca sistólica, disfunção diastólica, pós-remodelagem miocardíaca, insuficiência cardíaca crônica com fração de ejeção preservada (HFpEF), ou insuficiência cardíaca crônica com fração de ejeção reduzida (HFrEF).

[00237] Em algumas modalidades, a referida insuficiência cardíaca é selecionada dentre insuficiência cardíaca crônica, insuficiência cardíaca aguda, insuficiência cardíaca aguda no pós-operatório, insuficiência cardíaca crônica com fração de ejeção reduzida (HFrEF), insuficiência cardíaca crônica com fração de ejeção preservada (HFpEF), insuficiência cardíaca crônica com fração de ejeção intermediária (HFmEF), insuficiência cardíaca diastólica, insuficiência cardíaca

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102/197 sistólica, pós-remodelagem miocardíaca, angina, hipertensão, hipertensão pulmonar e hipertensão arterial pulmonar. Em algumas modalidades, a referida insuficiência cardíaca é selecionada dentre insuficiência cardíaca aguda no pós-operatório, insuficiência cardíaca avançada, síndrome cardio-renal, e insuficiência cardíaca com função renal enfraquecida.

[00238] Fibrose é a formação de tecido conjuntivo fibroso em excesso em um órgão ou tecido. A deposição excessiva de tecido fibroso está associada a condições patológicas que podem levar ao enfraquecimento da função do órgão ou do tecido. Órgãos afetados podem incluir os pulmões (fibrose do pulmão ou pulmonar), o fígado (fibrose do fígado ou hepática), os rins (fibrose de rim ou renal), e o coração (fibrose cardíaca). A fibrose também pode afetar outros tecidos e órgãos incluindo as articulações, a pele, o intestino, a medula óssea, e outros. Condições ou doenças fibróticas exemplificativas incluem, porém sem limitação, esteato-hepatite não alcoólica (NASH), que afetam o fígado); doença renal diabética e nefropatia diabética, que afetam os rins; e insuficiência cardíaca metabólica, que afeta o coração. Por exemplo, NASH caracteriza-se por gordura, inflamação e lesão no fígado em pessoas que consomem pouco álcool ou que não consomem álcool e pode levar à cirrose hepática. A NASH tende a ser diagnosticada em pessoas de meia idade com sobrepeso ou obesas que frequentemente apresentam os níveis de lipídios no sangue elevados e diabetes ou pré-diabetes.

[00239] A atividade biológica dos polipeptídios de relaxina modificada para potencial uso terapêutico pode ser determinada por meios de ensaios in vitro ou in vivo padrão ou conhecidos. Os polipeptídios de relaxina podem ser analisados quanto à atividade biológica por métodos adequados conhecidos na literatura. Tais ensaios incluem, porém sem limitação, ensaios de ligação ao receptor.

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103/197 [00240] Em relação a doenças tais como insuficiência cardíaca e doença fibrótica, a atividade de uma relaxina modificada pode ser determinada por meio de um ou mais ensaios in vivo. Os referidos ensaios envolvem tipicamente a administração de uma relaxina em um modelo animal da referida doença e a determinação do efeito na evolução da doença, na severidade, ou outros indícios de tratamento eficaz. Tais ensaios podem ser usados para determinar as dosagens eficazes e os regimes de tratamento no sistema do modelo, e com base nestes prever um regime de dosagem para uso clínico, por exemplo, para pacientes humanos. Ensaios de HF exemplificativos que podem ser utilizados incluem: 1) o modelo de ligação da coronária descendente anterior esquerda (LAD) de camundongo que mimetiza as alterações cardíacas de pacientes que sofrem um infarto do miocárdio e evoluem para HF (Samuel et al., Lab. Investigation 91:675-690, 2011); 2) modelo de infusão limitada de Angll no qual concentrações míminas de Angll são utilizadas para induzir fibrose cardíaca (Xu et al., J. Cardiovasc. Pharmacol. 51:62-70, 2008); 3) modelo de rato sensível a Dahl-Salt que se caracteriza por hipertensão, enfraquecimento renal, e sobrecarga do volume sanguíneo (Sakata et al., Circulation 109:2143-2149, 2004); 4) modelo de rato hipertenso com envelhecimento espontâneo (SHR) de fibrose cardíaca e renal que foi anteriormente utilizado para demonstrar a eficácia da WT-RLX (Lekgabe et al., Hypertension 46:412-418, 2005); e 5) modelo de sobrecarga de pressão em constricção aórtica torácica de rato (Kuster et al., Circulation 111:420-427, 2005). Além desses modelos, a atividade da relaxina modificada também pode ser determinada em um modelo de cachorro, tal como em cachorros normais e com HF induzida por marcapasso eletrônico. Adicionalmente, esses ensaios podem ser realizados para determinar se uma relaxina modificada é eficaz quando dada não só no modo preventivo, mas também no modo terapêutico. Além disso, as relaxinas modificadas

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104/197 podem ser testadas em modelos de fibrose que incluem fibrose renal (Yoshida et al., Nephrol. Dialysis Transplant 27: 2190-2197, 2012), pulmonar (Huang et al., Am. J. Pathol. 179:2751-2765, 2011), e hepática (Williams et al., Gut 49:577-583, 2001). Por exemplo, a eficácia de uma relaxina modificada pode ser comparada com a eficácia da relaxina do tipo selvagem (por exemplo, relaxina humana do tipo selvagem).

[00241] As quantidades administradas da relaxina, dos polipeptídios de relaxina, e/ou dos análogos de relaxina da presente invenção podem variar e em particular devem basear-se nas recomendações e na prescrição de um método qualificado. A quantidade exata de relaxina, polipeptídios de relaxina, e/ou análogos de relaxina da presente invenção é uma questão de preferência sujeita a fatores tais como o tipo exato e/ou a severidade da condição sendo tratada. A condição do paciente sendo tratado, assim como os outros ingredientes na composição. A invenção também pode compreender ainda a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um outro agente ativo. A quantidade a ser dada pode ser facilmente determinada pelo especialista na técnica com base na terapia com relaxina, terapias disponíveis com relaxina, e/ou outros análogos de relaxina.

[00242] Os compostos da presente invenção podem ser usados para reduzir a área do miocárdio afetada por um infarto, e para a profilaxia de infartos secundários. É apresentado ainda o uso dos compostos da presente invenção para a profilaxia e/ou o tratamento de distúrbios tromboembólicos, lesão por reperfusão subsequente à isquemia, lesões micro- e macrovasculares (vasculite), tromboses arterial e venosa, edemas, isquemias tais como infarto do miocárdio, derrame, e crises isquêmicas transitórias, para cardioproteção relacionada com operações de desvio da artéria coronária (enxerto de bypass da artéria coronária, CABG), angioplastias transluminais coronárias percutâneas

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105/197 primárias (PTCAs), PTCAs após trombose, PTCA de resgate, transplantes do coração e cirurgias de coração aberto, e para proteção de órgãos relacionada com transplantes, cirurgias de desvio, exames com cateter e outros procedimentos cirúrgicos. É ainda apresentado o uso dos compostos da presente invenção para a profilaxia e/ou o tratamento de distúrbios respiratórios, tais como, por exemplo, doença pulmonar obstrutiva crônica (bronquite crônica, COPD), asma, enfisema pulmonar, bronquiectasia, fibrose cística (mucoviscidose) e hipertensão pulmonar, em particular hipertensão arterial pulmonar.

[00243] Modalidades exemplificativas da presente invenção apresentam o uso de uma relaxina modificada da invenção como um medicamento para a profilaxia e/ou o tratamento de doenças renais, incluindo, porém sem limitação, doenças renais agudas e crônicas e insuficiências renais agudas e crônicas, assim como insuficiência renal aguda e crônica, incluindo estágios agudos e crônicos da insuficiência renal com e sem a necessidade de diálise, assim como as doenças renais subjacentes ou relacionadas tais como hipoperfusão renal, hipotensão induzida por diálise, glomerulopatias, proteinúia glomerular e tubular, edema renal, hematúria, glomerulonefrite primária, secundária, bem como aguda e crônica, glomerulonefrite membranosa e membranoproliferativa, síndrome de Alport, glomerulosclerose, doenças tubulares interstisciais, doenças nefropáticas, tais como doenças renais primárias e hereditárias, inflamação renal, doenças renais imunes como rejeição a transplante renal, doenças renais induzidas pelo complexo imune, assim como doenças nefropáticas induzidas por intoxicação, doenças renais diabéticas e não diabéticas, pielonefrite, rins císticos, nefrosclorese, nefrosclerose hipertensiva, síndrome nefrótica, que são caracterizadas e associadas por diagnóstico a uma redução anormal na depuração de creatinina e/ou na excreção de água, concentrações sanguíneas aumentadas anormais de

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106/197 ureia, nitrogênio, potássio e/ou creatinina, alteração na atividade de enzimas renais, tal como glutamilsintetase, osmolaridade da urina e volume de urina, microalbuminúria aumentada, macroalbuminúria, lesões glomerulares e arteriolares, dilatação tubular, hiperfosfatemia e/ou a necessidade de diálise.

[00244] Além disso, uma relaxina modificada da invenção pode ser usada como um medicamento para a profilaxia e/ou o tratamento de carcinomas renais, após ressecção incompleta do rim, desidratação subsequente ao uso excessivo de diuréticos, aumento descontrolado da pressão sanguínea com hipertensão maligna, obstrução e infecção do trato urinário, amiloidose, assim como doenças sistêmicas associadas à lesão glomerular, tal como lúpus eritematoso, e doenças sistêmicas reumáticas imunes, tais como estenose da artéria renal, trombose da artéria renal, trombose da veia renal, nefropatia induzida por analgésicos e acidose tubular renal.

[00245] Além disso, a presente invenção apresenta o uso de uma relaxina modificada da invenção como um medicamento para a profilaxia e/ou o tratamento de doenças renais intersticiais agudas e crônicas induzidas por meios de contraste e drogas, síndrome metabólica e dislipemia.

[00246] Além disso, a presente invenção apresenta o uso de uma relaxina modificada da invenção como um medicamento para a profilaxia, o alívio, e/ou o tratamento de efeitos posteriores ou sintomas associados a doenças renais agudas e/ou crônicas, tais como edema pulmonar, insuficiência cardíaca, uremia, anemia, distúrbios eletrolíticos (por exemplo, hipercalemia, hiponatremia), assim como metabolismo ósseo e de carboidratos.

[00247] Além disso, a presente invenção apresenta o uso de uma relaxina modificada da invenção como um medicamento para melhorar, estabilizar ou restaurar a função renal em um paciente como

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107/197 necessidade do mesmo, por exemplo, um paciente com uma doença renal descrita acima.

[00248] Outras modalidades exemplificativas apresentam o uso de uma relaxina modificada para o tratamento e/ou a profilaxia de doenças pulmonares, especialmente de distúrbios asmáticos, hipertensão arterial pulmonar (PAH) e outras formas de hipertensão pulmonar (PH) incluindo doença cardíaca esquerda, HIV, anemia de células falciformes, tromboembolismos (CTEPH), sarcoidose, COPD ou hipertensão pulmonar associada à fibrose pulmonar, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), síndrome da angústia respiratória aguda (ARDS), lesão pulmonar aguda (ALI), deficiência de alfa-1-antitripsina (AATD), fibrose pulmonar, enfisema pulmonar (por exemplo, enfisema pulmonar induzida pela fumaça de cigarro) e fibrose cística (CF).

[00249] Outras modalidades exemplificativas apresentam o uso da relaxina modificada para o tratamento e/ou a profilaxia de distúrbios fibróticos, incluindodistúrbios fibróticos dos órgãos internos, tais como, por exemplo, o pulmão, o coração, o rim, a medula óssea, e em particular o fígado, e também fibrose dermatológica e distúrbios fibróticos do olho.

[00250] A presente invenção apresenta ainda o uso da relaxina modificada para preparar um medicamento para o tratamento e/ou a prevenção de distúrbios, em particular dos distúrbios mencionados acima.

[00251] A presente invenção apresenta ainda um método para o tratamento e/ou a prevenção de distúrbios, em particular dos distúrbios mencionados acima, usando uma quantidade eficaz de pelo menos uma relaxina modificada da invenção.

[00252] A presente invenção apresenta ainda uma relaxina modificada para uso em um método para o tratamento e/ou a profilaxia de doença coronariana, síndrome coronariana aguda, insuficiência

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108/197 cardíaca (por exemplo, insuficiência cardíaca aguda, insuficiência cardíaca crônica, ou insuficiência cardíaca avançada), e infarto do miocárdio.

[00253] As composições farmacêuticas adequadas para uso nos métodos e as composições da presente invenção incluem composições nas quais os princípios ativos estão contidos em uma quantidade eficaz para alcançar a propósito visadso, por exemplo, tratamento de insuficiência cardíaca. A determinação de uma dose eficaz está dentro das aptidões dos especialistas na técnica tendo em vista a presente invenção.

[00254] Para qualquer composto, a dose terapeuticamente eficaz pode ser inicialmente estimada em ensaios in vitro, por exemplo, ativação do receptor de RXFP1, ex vivo em corações de ratos perfundidos isolados, ou em modelos animais, usualmente camundongos, ratoss, coelhos, cachorros, ou porcos. O modelo animal também é usado para obter a faixa de concentração a via de administração desejáveis. Tais informações podem ser então usadas para determinar as doses e vias úteis para administração a seres humanos.

[00255] Uma dose terapeuticamente eficaz refere-se àquela quantidade de uma relaxina modificada que melhora os sintomas ou a condição. A eficácia terapêutica e a toxicidade de tais compostos podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos tradicionais in vitro ou em animais experimentais, por exemplo, ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população) e LD50 (a dose letal para 50% da população. A relação da dose entre efeitos terapêuticos e efeitos tóxicos é o índice terapêutico, e pode ser expressa como a relação ED50/LD50. Composições farmacêuticas exemplificativos apresentam índices terapêuticos elevados. Os dados obtidos a partir dos ensaios in vitro e estudos em animais são usados na formulação de

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109/197 uma faixa de dosagem para uso humano. A dosagem de tais compostos reside, por exemplo, dentro de uma faixa de concentrações circulantes que incluem a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem varia nesta faixa dependendo da forma de dosagem empregada, da sensibilidade do paciente, e da via de administração.

[00256] As quantidades normais de dosagem podem variar de uma dose total de 0,1 a 100.000 miligramas, dependendo da via de administração. Orientações sobre dosagens particulares e métodos de distribuição estão apresentados na literatura. Vide Patente US N° 4,657,760; 5,206,344; ou 5,225,212.

XIII. Combinações [00257] Uma relaxina modificada da invenção pode ser administrada isoladamente ou em combinação com outros compostos ativos. Neste contexto, o termo combinação abrange qualquer meio de administração concomitante ou sequencial, independente de a relaxina modificada e o outro agente estarem contidos na mesma composição ou serem administrados separadamente, a administração podendo ser através dos mesmos modos de administração ou de modos de administração diferentes. A presente invenção apresenta medicamentos compreendendo pelo menos uma relaxina modificada e um ou mais outros ingredientes ativos, em composições farmacêuticas nas quais ela está mistura com excipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis, para o tratamento e/ou a prevenção dos distúrbios mencionados acima. [00258] Princípios ativos adequados para combinação podem incluir, a título de exemplo: princípios ativos que modulam o metabolismo de lipídios, antidiabéticos, agentes hipotensivos, agentes melhoradores da perfusão e/ou antitrombóticos, antioxidantes, antagonistas do receptor de quimiocina, inibidores da quinase p38, agonistas de NPY, agonistas de orexina, anorécticos, inibidores de PAF-AH, inibidores de antiflogísticos (inibidores de COX, antagonistas do receptor de LTB4),

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110/197 analgésicos, por exemplo, aspirina, inibidores de P2Y12 tal como Clopidogrel, inibidores de PCSK9 tal como evolocumab (REPATHA) ou alirocumab (PRALUENT), antidepressivos e outros psicofármacos.

[00259] A presente invenção apresenta ainda combinações de pelo menos uma relaxina modificada com princípio ativo um princípio ativo modificador do metabolismo de lipídios, um antidiabético, um princípio ativo baixador da pressão sanguínea e/ou um agente com efeitos antitrombóticos.

[00260] A relaxina modificada pode ser combinada com um ou mais princípios ativos moduladores do metabolismo de lipídios, por exemplo, inibidores da HMG-CoA redutase, inibidores da expressão da HMG-CoA redutase, inibidores da síntese do esqualeno, inibidores de ACAT, indutores do receptor de LDL, inibidores da absorção de colesterol, adsorventes de ácidos biliares poliméricos, inibidores da reabsorção de ácidos biliares, inibidores de MTP, inibidores da lipase, ativadores de LpL, fibratos, niacina, agonistas do receptor de niacina, inibidores de CETP, agonistas de PPAR-a, PPAR-γ e/ou PPAR-δ, moduladores de RXR, moduladores de FXR, moduladores de LXR, hormônios da tireoide e/ou miméticos tireoidianos, inibidores da ATP citrato lipase, antagonistas de Lp(a), antagonistas do receptor 1de canabinoides, agonistas do receptor de leptina, agonistas do receptor de bombesina, inibidores de PCSK9, agonistas do receptor de histamina e os antioxidantes/sequestrantes de radicais.

[00261] Em algumas modalidades, uma relaxina modificada é administrada em combinação com um inibidor da HMG-CoA redutase da classe das estatinas, por exemplo, lovastatina, sinvastatina, pravastatina, fluvastatina, atorvastatina, rosuvastatina ou pitavastatina. Em uma outra modalidade, a relaxina modificada é administrada em combinação com um inibidor da síntese de esqualeno, por exemplo, BMS-188494 ou TAK-475. Em uma outra modalidade, a relaxina

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111/197 modificada é administrada em combinação com um inibidor de ACAT, por exemplo, avasimibe, melinamida, pactimibe, eflucimibe ou SMP797. Em uma outra modalidade, a outra relaxina modificada é administrada em combinação com um inibidor da absorção de colesterol, por exemplo, ezetimibe, tiqueside ou pamaqueside. Em uma outra modalidade, a relaxina modificada é administrada em combinação com um inibidor de MTP, por exemplo, implitapide, BMS-201038, R103757 ou JTT-130. Em uma outra modalidade, a relaxina modificada é administrada em combinação com um inibidor da lipase, por exemplo, orlistat. Em uma outra modalidade, a relaxina modificada é administrada em combinação com um hormônio da tireoide e/ou um mimético tireoidiano, por exemplo, D-tiroxina ou 3,5,3'-triiodotironina (T3). Em uma outra modalidade, a relaxina modificada é administrada em combinação com um agonista do receptor de niacina, por exemplo, niacina, acipimox, acifran ou radecol. Em uma outra modalidade, a relaxina modificada é administrada em combinação com um inibidor de CETP, por exemplo, dalcetrapib, BAY 60-5521, anacetrapib ou CETP vaccine (CETi-1). Em uma outra modalidade, a relaxina modificada é administrada em combinação com um agonista de PPAR-γ, por exemplo, da classe das tiazolidinadionas, por exemplo, pioglitazona ou rosiglitazona. Em uma outra modalidade, a relaxina modificada é administrada em combinação com um agonista de PPAR-δ, por exemplo, GW-501516 ou BAY 68-5042. Em uma outra modalidade, a relaxina modificada é administrada em combinação com um adsorvente de ácidos biliares poliméricos, por exemplo, colestiramina, colestipol, colesolvam, CholestaGel ou colestimida. Em uma outra modalidade, a relaxina modificada é administrada em combinação com um inibidor da reabsorção de ácidos biliares, por exemplo, inibidores de ASBT (= IBAT), tal como, por exemplo, AZD-7806, S-8921, AK-105, BARI-1741, SC-435 ou SC-635. Em uma outra modalidade, a relaxina modificada é

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112/197 administrada em combinação com um antioxidante/sequestrante de radicais, por exemplo, probucol, AGI-1067, BO-653 ou AEOL-10150. Em uma outra modalidade, a relaxina modificada é administrada em combinação com um antagonista do receptor 1 de canabinoides, por exemplo, rimonabant ou SR-147778.

[00262] A relaxina modificada pode ser combinada com um ou mais antidiabéticos, por exemplo, insulina e derivados de insulina, sulfonilureias, biguanidas, derivados de meglitinida, inibidores de glucosidase, agonistas da PPAR-gama, inibidores da dipeptidilpeptidase IV (inibidores de DPP-IV), oxadiazolidinonas, tiazolidinadionas, agonistas do receptor de GLP 1, antagonistas de glucagon, sensibilizadores de insulina, agonistas do receptor de CCK 1, agonistas do receptor de leptina, inibidores das enzimas hepáticas envolvidas na estimulação da gluconeogênese e/ou da glicogenólise, moduladores da absroção de glicose e também abridores do canal de potássio.

[00263] Em algumas modalidades, a relaxina modificada é administrada em combinação com insulina ou um derivado de insulina. Em uma outra modalidade, a relaxina modificada é administrada em combinação com a sulfonilureia, por exemplo, tolbutamida, glibenclamida, glimepiride, glipizide ou gliclazide. Em uma outra modalidade, a relaxina modificada é administrada em combinação com uma biguanida, por exemplo, metformina. Em uma outra modalidade, a relaxina modificada é administrada em combinação com um derivado de meglitinide, por exemplo, repaglinide ou nateglinide. Em uma outra modalidade, a relaxina modificada é administrada em combinação com um inibidor da glucosidase, por exemplo, miglitol ou acarbose. Em uma outra modalidade, a relaxina modificada é administrada em combinação com um inibidor de DPP-IV, por exemplo, sitagliptina e vildagliptina. Em uma outra modalidade, a relaxina modificada é administrada em

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113/197 combinação com um agonista de PPAR-gama, por exemplo, da classe das tiazolinadionas, por exemplo, pioglitazona ou rosiglitazona.

[00264] A relaxina modificada pode ser combinada com um ou mais princípios ativos hipotensivos, por exemplo, antagonistas de cálcio, antagonistas de angiotensina II, inibidores de ACE, inibidores de renina, bloqueadores de beta-receptores, bloqueadores de alfa-receptores, diuréticos, antagonistas de aldosterona, antagonistas do receptor de mineralocorticoides, inibidores de ECE, inibidores de ACE/NEP e os inibidores de vasopeptidase.

[00265] Em algumas modalidades, a relaxina modificada é administrada em combinação com um antagonista de cáclio, por exemplo, nifedipine, amlodipine, verapamila ou diltiazem. Em uma outra modalidade, a relaxina modificada é administrada em combinação com um antagonista de angiotensina II, por exemplo, losartan, valsartan, candesartan, embusartan, olmesartan ou telmisartan. Em uma outra modalidade, a relaxina modificada é administrada em combinação com um inibidor de ACE, por exemplo, enalapril, captopril, lisinopril, ramipril, delapril, fosinopril, quinopril, perindopril ou trandopril. Em uma outra modalidade, a relaxina modificada é administrada em combinação com um bloqueador de beta-receptores, por exemplo, propranolol, atenolol, timolol, pindolol, alprenolol, oxprenolol, penbutolol, bupranolol, metipranolol, nadolol, mepindolol, carazalol, sotalol, metoprolol, betaxolol, celiprolol, bisoprolol, carteolol, esmolol, labetalol, carvedilol, adaprolol, landiolol, nebivolol, epanolol ou bucindolol. Em uma outra modalidade, a relaxina modificada é administrada em combinação com um bloqueador de alfa-receptores, por exemplo, prazosin. Em uma outra modalidade, a relaxina modificada é administrada em combinação com um diurético, por exemplo, furosemide, bumetanide, torsemide, bendroflumetiazida, clorotiazida, hidroclorotiazida, hidroflumetiazida, meticlotiazida, politiazida, triclorometiazida, clorotalidona, indapamida,

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114/197 metolazona, quinetazona, acetazolamida, diclorofenamida, metazolamida, glicerol, isosorbida, mannitol, amilorida ou triamteren. Em uma outra modalidade, a relaxina modificada é administrada em combinação com um antagonista de aldosterona ou do receptor mineralocorticoides, por exemplo, espironolactona ou eplerenona. Em uma outra modalidade, a relaxina modificada é administrada em combinação com um antagonista do receptor de vasopressina, por exemplo, conivaptan, tolvaptan, lixivaptan ou SR-121463.

[00266] A relaxina modificada pode ser combinada com um ou mais dos seguintes agentes: agentes antitrombóticos, por exemplo, inibidores da agregação plaquetária ou os anticoagulantes; diuréticos; antagonistas do receptor de vasopressina; nitratos orgânicos e doadores de NO; compostos com atividade inotrópica positiva; compostos que inibem a degradação do guanosina monofosfato cíclico (cGMP) e/ou do adenosina monofosfato cíclico (cAMP), tal como, por exemplo, inibidores de fosfodiesterases (PDE) 1, 2, 3, 4 e/ou 5, em particular inibidores de PDE 5, tal como sildenafil, vardenafil e tadalafil, e também inibidores de PDE 3, tal como milrinona; peptídios natriuréticos, por exemplo, peptídio natriurético atrial (ANP, anaritide), peptídio natriurético tipo B ou peptídio natriurético cerebral (BNP, nesiritide), peptídio natriurético tipo C (CNP) e também urodilatin; agonistas do receptor de prostaciclina (receptor IP), por exemplo, iloprost, beraprost, cicaprost; inibidores do canal If (canal de corrente esquisita), por exemplo, ivabradine; sensibilizadores de cálcio, tal como, a título de exemplo, levosimendan; suplementos de potássio; estimulantes NO-independentes, porém heme-dependentes de guanilato ciclase, por exemplo, os compostos descritos nos documentos WO 00/06568, WO 00/06569, WO 02/42301 e WO 03/095451; ativadores NO- e heme-independentes de guanilato ciclase, por exemplo, os compostos descritos nos documentos WO 01/19355, WO

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01/19776, WO 01/19778, WO 01/19780, WO 02/070462 e WO 02/070510; inibidores da elastase neutrofílica humana (HNE), por exemplo, sivelestat e DX-890 (Reltran); compostos que inibem a cascata de transdução de sinais, por exemplo, inibidores de tirosinaquinases, por exemplo, sorafenib, imatinib, gefitinib e erlotinib; e/ou compostos que modulam o metabolismo energético do coração, por exemplo, etomoxir, dicloroacetato, ranolazina e trimetazidina.

[00267] Em algumas modalidades, a relaxina modificada é administrada em combinação com um nitrato orgânico ou doador de NO, por exemplo, nitroprussida sódica, nitroglicerol, mononitrato de isosorbida, dinitrato de isosorbida, molsidomin ou SIN-1, ou em combinação com NO inalante. Em uma outra modalidade, a relaxina modificada é administrada em combinação com um composto ionotrópico positivo, por exemplo, glicosídeos cardíacos (digoxina), agonistas beta-adrenérgicos e dopaminérgicos, tal como isoproterenol, adrenalina, noradrenalina, dopamina ou dobutamina. Em uma outra modalidade, a relaxina modificada é administrada em combinação com antissimpatotônicos, tal como reserpina, clonidina ou alfa-metildopa, ou em combinação com agonistas do canal de potássio, tal como minoxidila, diazóxido, di-hidralazina ou hidralazina, ou com substâncias que liberam óxido de nitrogênio, tal como nitrato de glicerol nitroprussida sódica. Em uma outra modalidade, a relaxina modificada é administrada em combinação com um inibidor da agregação plaquetária, por exemplo, aspirina, clopidogrel, ticlopidina ou dipiridamol. Em uma outra modalidade, a relaxina modificada é administrada em combinação com um inibidor de trombina, por exemplo, ximelagatran, melagatran, dabigatran, bivalirudin ou clexane. Em uma outra modalidade, a relaxina modificada é administrada em combinação com um antagonista de GPIIb/llla, por exemplo, tirofiban ou abciximab. Em uma outra modalidade, a relaxina modificada é administrada em combinação com

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116/197 um inibidor do fator Xa, por exemplo, rivaroxaban (BAY 59-7939), DU176b, apixaban, otamixaban, fidexaban, razaxaban, fondaparinux, idraparinux, PMD-3112, YM-150, KFA-1982, EMD-503982, MCM-17, MLN-1021, DX 9065a, DPC 906, JTV 803, SSR-126512 ou SSR128428. Em uma outra modalidade, a relaxina modificada é administrada em combinação com heparina ou um derivado de heparina de baixo peso molecular (LMW). Em uma outra modalidade, a relaxina modificada é administrada em combinação com um antagonista de vitamina K, tal como, a título de exemplo, Coumadin (warfarina).

[00268] A presente invenção apresenta ainda medicamentos compreendendo pelo menos uma relaxina modificada, usualmente junto com um ou mais auxiliares farmaceuticamente adequados atóxicos e inertes, e também o uso dos mesmos para as finalidades mencionadas acima. Opcionalmente o referido medicamento pode compreender a referida relaxina modificada e um outro princípio ativo, tal como aqueles identificados acima. Por exemplo, o referido medicamento pode a referida relaxina modificada e um outro princípio ativo em uma quantidade eficaz para o tratamento ou a prevenção de insuficiência cardíaca e/ou uma doença associada à fibrose.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Incorporação ribossômica de um aminoácido codificado artificialmente em PreproRelaxina [00269] Este exemplo exemplifica a clonagem e a expressão de um polipeptídio de relaxina incluindo um aminoácido codificado artificialmente em E. coli.

[00270] Métodos para clonagem de relaxina são conhecidos pelos especialistas na técnica. Sequências de polipeptídios e polinucleotídeos para relaxina e clonagem da relaxina em células hospedeiras estão detalhadas na Patente US N° 4,758,516; Patente US N° 5,166,191; Patente US N° 5,179,195, 5,945,402; e 5,759,807; todas estas patentes

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117/197 estão aqui incorporadas a título de referência.

[00271] O cDNA codificando relaxina está mostrado como SEQ ID NO: 12 e a sequência de aminoácidos do polipeptídio maduro está mostrada como SEQ ID NO: 1. Sequências exemplificativas da relaxina estão apresentadas na Tabela 1.

Tabela 1: Sequências da Relaxina

SEQ ID NO:	Nome da sequência	Sequência
1	Sequência de aminoácidos da relaxina (cadeias A e B)	QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTW S
2	Sequência de aminoácidos da relaxina B1 Ala (cadeias Ae B)	QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC ASWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTW S
3	Sequência de aminoácidos da pro-relaxina, exemplificativa	DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTW SRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPL ALEGSLQKRQLYSALANKCCHVGCTKR SLARFC
4	Sequência de aminoácidos da cadeia A da relaxina	QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC
5	Sequência de aminoácidos da cadeia B da relaxina	DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTW S
6	Sequência de aminoácidos da cadeia B da relaxina com B1 Ala	ASWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTW S
7	Sequência de aminoácidos do peptídio C (peptídio de conexão), exemplificativa	RREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLA LEGSLQKR
8	Sequência de aminoácidos líder da relaxina, exemplificativa	MKKNIAFLLKR
9	Sequência de aminoácidos líder da insulina, exemplificativa	MIEGGR

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10	Sequência de ácidos nucleicos da cadeia A da relaxina, exemplificativa	caactctacagtgcattggctaataaatgttgccatgttgg ttg taccaaaag atctcttg ctag attttg c
11	Sequência de ácidos nucleicos da cadeia B da relaxina B, exemplificativa	g actcatg g atg g ag g aag ttattaaattatg cg g ccg c g aattag ttcg cg cgcag attg ccatttg cg g catg ag ca cctggagc
12	Sequência de ácidos nucleicos das cadeias A e B da relaxina, exemplificativa	caactctacagtgcattggctaataaatgttgccatgttgg ttg taccaaaag atctcttg ctag attttg c g actcatg g atg g ag g aag ttattaaattatg cg g ccg c g aattag ttcg cg cgcag attg ccatttg cg g catg ag ca cctggagc
13	Sequência de ácidos nucleicos líder da relaxina, exemplificativa	atg aaaaag aatatcg catttcttcttaaacg g
14	Sequência de ácidos nucleicos líder da insulina, exemplificativa	atgattgaaggtggtcgt
15	Exemplo de uma sequência de aminoácidos de um construto de expressão de relaxina	MIEGGRDSWMEEVIKLCGRELVRAQIAIC GMSTWSRREAEDLQVGQVELGGGPGA GSLQPLALEGSLQKRQLYSALANKCCHV GCTKRSLARFC
35	Cadeia A da relaxina substituída com paraacetil-L-fenilalanina na posição 1	(pAcF)LYSALANKCCHVGCTKRSLARFC
36	Cadeia A da relaxina substituída com asparagina na posição 1	NLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC
37	Cadeia B da relaxina substituída com para-acetil fenilalanina na posição 25	ASWMEEVIKLCGRELVRAQIAICG(pAcF) STWS
38	Sequência de expressão de prepro-Relaxina, exemplificativa (X pode ser, por exemplo, pAcF)	MIEEGR ASWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTW S RREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLA

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		LEGSLQGR XLYSALANKCCHVGCTKRSLARFC
39	Sequência de aminoácidos líder da insulina, exemplificativa	MIEEGR

[00272] Um sistema de translação introduzido que compreende um tRNA ortogonal (O-tRNA) e uma aminoacil tRNA sintetase ortogonal (ORS) é usado para expressar relaxina ou análogos de relaxina contendo um aminoácido codificado artificialmente. A O-RS preferivelmente aminoacila o Ο-tRNA com um aminoácido codificado artificialmente. Por sua vez, o sistema de tradução insere o aminoácido codificado artificialmente na relaxina ou no análogo de relaxina, em resposta a um códon seletor codificado. Sequências de O-RS e Ο-tRNA adequadas estão descritas no documento WO 2006/068802 intitulado Compositions of Aminoacyl-tRNA Sintetase and Uses Thereof (E9; SEQ ID NO: 16) e no documento WO 2007/021297 intitulado Compositions of tRNA and Uses Thereof (F13; SEQ ID NO: 17), que estão aqui incorporados em sua íntegra a título de referência. Sequências exemplificativas que podem ser utilizadas estão ilustradas na Tabela 2.

Tabela 2: Sequências Utilizadas em Sistemas de Expressão

SEQ ID NO:18	M. jannaschii mtRNAcuA	tRNA
SEQ ID NO:19	HLAD03; um tRNA supressor de âmbar otimizado	tRNA
SEQ ID NQ:20	HL325A; um tRNA supressor de deslocamento de AGGA otimizado	tRNA
SEQ ID NO:21	Aminoacil tRNA sintetase para a incorporação de p-azido-Lfenilalanina p-Az-PheRS(6)	RS
SEQ ID NO:22	Aminoacil tRNA sintetase para a incorporação de p-benzoil-Lfenilalanina p-BpaRS(1)	RS

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SEQ ID NO:23	Aminoacil tRNA sintetase para a incorporação de propargilfenilalanina Propargil-PheRS	RS
SEQ ID NO:24	Aminoacil tRNA sintetase para a incorporação de propargilfenilalanina Propargil-PheRS	RS
SEQ ID NO:25	Aminoacil tRNA sintetase para a incorporação de propargilfenilalanina Propargil-PheRS	RS
SEQ ID NO:26	Aminoacil tRNA sintetase para a incorporação de p-azidofenilalanina p-Az-PheRSfl)	RS
SEQ ID NO:27	Aminoacil tRNA sintetase para a incorporação de p-azidofenilalanina p-Az-PheRS(3)	RS
SEQ ID NO:28	Aminoacil tRNA sintetase para a incorporação de p-azidofenilalanina p-Az-PheRS(4)	RS
SEQ ID NO:29	Aminoacil tRNA sintetase para a incorporação de p-azidofenilalanina p-Az-PheRS(2)	RS
SEQ ID NO:30	Aminoacil tRNA sintetase para a incorporação de p-acetilfenilalanina (LW1)	RS
SEQ ID NO:31	Aminoacil tRNA sintetase para a incorporação de p-acetil fenilalanina (LW5)	RS
SEQ ID NO:32	Aminoacil tRNA sintetase para a incorporação de p-acetilfenilalanina (LW6)	RS
SEQ ID NO:33	Aminoacil tRNA sintetase para a incorporação de p-azidofenilalanina (AzPheRS-5)	RS
SEQ ID NO:34	Aminoacil tRNA sintetase para a incorporação de p-azidofenilalanina (AzPheRS-6)	RS

[00273] A transformação de E. coli com plasmídios contendo o gene de relaxina modificada ou de análogo de relaxina e o par de aminoacil tRNA sintetase ortogonal/tRNA (específico para o aminoácido codificado artificialmente desejado) possibilita a incorporação sítioPetição 870190074948, de 05/08/2019, pág. 140/421

121/197 específica do aminoácido codificado artificialmente no polipeptídio de relaxina, como descrito na Patente US N° 8,735,539, cuja íntegra está aqui incorporada a título de referência.

[00274] Relaxina madura do tipo selvagem é amplificada por PCR a partir de uma reação de síntese de cDNA usando protocolos padrão e é clonada em um vetor plasmídico, tal como pET30 (Ncol-BamHI). A sequência da relaxina é subclonada em um vetor de supressão contendo um supressor de âmbar tirosil tRNATyr/CUA oriundo de Methanococcus jannaschii (Mj tRNATyr/CUA) sob o controle constitutivo de um promotor sintético derivado da sequência promotora de lipoproteínas de E. coli (Miller, J.H., Gene, 1986), assim como a tirosil tRNA-sintetase ortogonal (MjTyrRS) (por exemplo, E9) sob o controle do promotor GlnRS de E. coli. A expressão da relaxina está sob o controle do promotor T7, que é indiretamente induzido pela L-arabinose. Mutações âmbar são introduzidas usando-se protocolos de mutação de mudança rápida padrão (Stratagene; La Jolla, Califórnia). Os construtos são verificados quanto à sequência.

Supressão com para-acetil-fenilalanina (pAcF) [00275] Plasmídios contendo o gene de relaxina modificada compreendendo uma mutação âmbar (codificando a SEQ ID NO: 38 with pAcF no resíduo 1 da cadeia A, vide FIG. 4) e o par aminoacil tRNA sintetase ortogonal/tRNA descrito acima foram usados para transformação em Escherichia coli cepa W3110B55 [F- IN (rrnD-rmE) lambdaaraB::g1 te/A fhuk::dhfr proS W375R::caf| para produzir cepas de E. coli nas quais a expressão da polimerase T7 ficasse sob o controle de um promotor induzível por arabinose. Culturas bacterianas de uma noite são diluídas 1:100 em balões de agitação contendo 2X de meio de cultura YT e cultivadas a 37°C até atingir uma ODeoo de ~ 0,8. A expressão de proteína é induzida pela adição de arabinose (0,2% final), e para-acetil-fenilalanina (pAcF) até uma concentração final de 4 mM.

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As culturas são incubadas a 37°C por 5 horas. As células são pelotizadas e ressuspendidas no tampão de lise B-PER (Pierce) 100ul/OD/ml + 10ug/ml DNase e incubadas a 37°C por 30 min. O material celular é removido por centrifugação e o sobrenadante é removido. A pelota é ressuspendida em igual quantidade de tampão de SDS-PAGE de carga de proteína. Todas as amostras são carregadas em um gel de PAGE a 4-12% com MES e DTT. A expressão de relaxina é confirmada por SDS-PAGE, análise da mancha ocidental, ou espectrometria de massas com armadilha de íons combinada com ionização por eletroaspersão, entre outros.

[00276] A sequência gênica da relaxina pode incluir uma His-tag Nterminal, por exemplo, HHHHHHSGG (SEQ ID NO: 55). Proteínas relaxina mutantes contendo His-tag podem ser purificadas por métodos conhecidos pelos especialistas na técnica. A resina quelante de níquel ProBond (Invitrogen, Carlsbad, CA) pode ser usada via os procedimentos tradicionais de purificação de proteínas contendo His-tag fornecidos pelo fabricante. Medições funcionais das proteínas podem ser feitas por meio de métodos conhecidos na técnica, métodos apresentados neste pedido e nas referências incorporadas, e alternativamente é possível desenvolver um ELISA em células vivas para avaliar os polipeptídios de relaxina da invenção.

Exemplo 2: Produção e purificação de relaxina madura contendo um aminoácido codificado artificialmente [00277] PreproRelaxina (SEQ ID NO: 38 com pAcF no resíduo 1 da cadeia A, vide FIG. 4) foi produzida por fermentação em células de E. coli como corpos de inclusão. O aminoácido codificado artificialmente para-acetil-fenilalanina foi incorporado de forma ribossômica usando os métodos gerais apresentados no Exemplo 1.

[00278] Células de E. coli contendo o plasmídio expressando polipeptídio de relaxina modificada foram cultivadas em um fermentador

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123/197 contendo meio de fermentação. Canamicina foi adicionada ao fermentador para promover a estabilidade do plasmídio. Cloridrato de Lalanina-L-para-acetilfenilalanina fermentador para fermentor acetilfenilalanina (pAcF) na (L-Ala-pAcF) foi adicionado ao permitir a incorporação de psequência de aminoácidos da

PreproRelaxina. Por fim, L-arabinose foi adicionada para induzir a expressão de PreproRelaxina. A PreproRelaxina produzida no interior das células resultou na formação de corpos de inclusão (IBs) insolúveis. O caldo de fermentação foi recolhido depois de um período pós-indução. O título da fermentação foi de aproximadamente 4,5 g de PreproRelaxina por L de fermentação.

[00279] Os corpos de inclusão (IBs) foram separados das células intactas por lise das células sob alto cisalhamento. Os IBs intactos foram recuperados por centrifugação. Depois da recuperação, as pelotas de IB foram ressuspendidas em água e novamente centrifugadas para remover as impurezas. Os IBs lavados foram solubilizados a um pH 8,5 em tampão 5M de guanidina/Tris contendo 5 mM de ditiotreitol (DTT). O renovelamento da PreproRelaxina foi obtido através da lenta diluição da solução de IBs solubilizados aproximadamente 1 para 4,5 em tampão Tris pH 8,5 arrefecido contendo 5 mM de DTT e 8,5 mM de cistamina. A solução de renovelamento foi incubada por um mínimo de 12 horas antes de se continuar com o processamento. Depois de terminado o período de incubação o pH caiu para 3,5-4,0 por adição de ácido acético e ácido clorídrico, para promover a precipitação das impurezas. O material precipitado foi removido por centrifugação seguida por filtração profunda.

[00280] A solução de renovelamento resultante da filtração profunda foi diluída aproximadamente 1 para 6,5 com tampão acetato pH 4 para reduzir a condutividade na preparação a ser carregada em uma coluna de troca catiônica Tosoh Bioscience SP550C. Depois de carregada, a

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124/197 coluna SP550C foi lavada e em seguida a PreproRelaxina foi eluída usando um de gradiente 10% - 90% tampão acetato de 50 mM pH 5,5 contendo 1 M de NaCI. O eluato de SP550C foi diluído com água purificada até que a concentração de PreproRelaxina fosse igual a 1,5 mg/mL. O pH foi ajustado em 8,0 pela adição de 2 M de Tris, pH 8,0 seguida pela adição de 2 mM de CaCI2 na preparação para conversão enzimática.

[00281] Tripsina do tipo selvagem foi modificada com anidrido succínico (i.e., succinilação) para facilitar sua remoção da mistura reacional PreproRelaxina/tripsina ao fim da etapa de tratamento com tripsina. Tripsina do tipo selvagem concentrada em 10 mM de HCI, 20 mM de CaCI2 foi diluída até atingir 5 mg/mL com água pusrificada e em seguida 1 M de tampão borato pH 7,6 foi adicionado até uma concentração final de 0,2 M. Anidrido succínico sólido foi adicionado à solução de tripsina diluída de pH ajustado em um excesso de 100 molar em relação à tripsina em três adições equimolares (3 x adições de um excesso de 33,3 molar) com misturação por 10 minutos entre cada adição.

[00282] Tripsina succinilada foi adicionada à solução de PreproRelaxina incubada a 22°C por 4 horas para garantir a remoção enzimática completa do peptídio de conexão e da sequência líder da molécula de PreproRelaxina. A molécula de Relaxina-R resultante contém uma arginina C-terminal na cadeia B. O material tratado com tripsina foi em seguida processado através de um filtro trocador de ânions Sartobind STIC® PA que liga a tripsina succinilada enquanto que a Relaxina-R foi coletado no escoamento. Carboxipeptidase-B (CPB) foi adicionada ao filtrado do STIC® PA e incubada com agitação por 2 horas para garantir a remoção enzimática completa do resíduo arginina C-terminal da cadeia B. A reação de CPB foi resfriada bruscamente reduzindo-se o pH da mistura reacional para 2,8 - 3,2.

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125/197 [00283] A Relaxina madura foi purificada usando a resina trocadora de cátions Tosoh Bioscience SP-5PW. A Relaxina foi carregada na coluna e então seguida por três lavagens da coluna; 1) 50 mM de acetato pH 5,5, 2) 50 mM de acetato pH 5,5, 0,1 M NaCI and, 3) 50 mM de acetato pH 4,0. A relaxina ligada foi eluída em pH 4 usando um gradiente linear de 0% a 100% de KCI 2 M em 20 volumes de coluna. A solução de Relaxina eluída teve o pH ajustado em 3,0 usando HCI 1 M antes de novo processamento. Alternativamente, a tripsina foi removida da mistura reacional por precipitação. A relaxina precipita depois do aumento do pH da mistura reacional para 8,0 por 1 hora à temperatura ambiente. A relaxina precipitada foi então recuperada por centrifugação. A pelota foi lavada 3 vezes por ressuspensão da pelota em tampão Tris pH 8 seguida por centrifugação. Depois da lavagem final, a pelota foi novamente solubilizada em ácido acético 20 mM. A relaxina purificada não apresentou atividade tríptica. O produto final foi relaxina madura.

[00284] Essencialmente o mesmo método de síntese foi usado para produzir RLX-AQ1 (AQ1) (FIG. 2) e RLX-BM25/AN1 (BM25/AN1) (FIG. 3), com a modificação apropriada da sequência da PreproRelaxina.

Exemplo 3: Conjugação da relaxina ao melhorador farmacocinético compreendendo um peptídio ligado a um ácido graxo [00285] A Relaxina purificada foi concentrada por ultrafiltração até aproximadamente 10 mg/mL. Um melhorador farmacocinético ativado com amino-óxi compreendendo um peptídio e um C15 ácido graxo (por exemplo, GGGGS-Glu^Y (SEQ ID NO: 139)-C14-COOH) foi adicionado à mistura reacional em um excesso de 1,5 molar em relação à relaxina. Um aditivo do tipo hidrazida (i.e., hidrazida 4 amino-benzoica) foi então adicionado em um excesso de 45 molar em relação à relaxina. A solução era ajustada conforme necessário com HC11 M para manter um pH entre 3,5 e 4,0 e a temperatura foi controlada a 30 °C. A reação de

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conjugação formou uma ligação oxima estável entre o ligante peptidico ligado a um ácido graxo C15 (por exemplo, GGGGS-Glu^Y (SEQ ID NO: 139)-C14-COOH), preparado obedecendo ao procedimento descrito no Exemplo 4, e o resíduo para-acetil-fenilalanina na relaxina. A reação terminou em 16 horas.

[00286] A mistura da reação de conjugação foi diluída até atingir < 4 mS/cm com tampão acetato 10 mM pH 4,0 e então carregada na coluna trocadora de cátions GE Healthcare SP HP. Depois de terminado o carregamento, a coluna foi lavada com histidina 20 mM pH 6,0 para remover as impurezas. O conjugado Relaxina-C15 (compreendendo, por exemplo, AQ1-Relaxina-GGGGS-Glu^Y (SEQ ID NO: 139)-014COOH) foi então eluído com bicarbonate de amônioõO mM, pH 8,5. A estrutura da relaxina madura está ilustrada esquematicamente na FIG. 5 e na fórmula III:

AQ1 -Relaxina tv, (Fórmula HI) [00287] O conjugado Relaxina-015 purificado foi concentrado e em seguida diafiltrado em um tampão de formulação final apropriado. Uma composição exemplificativa do conjugado é Relaxina-015 8 mg/mL em histidina 20 mM, sacarose 0,25 M, polissorbato-800,05% (p/v), pH 5,5. A composição é armazenada congelada a < -60^QC.

[00288] Outros conjugados Relaxina-ácido graxo podem ser preparados usando-se processos similares.

Exemplo 4: Síntese de melhoradores farmacocinéticos em fase sólida [00289] Os melhoradores farmacocinéticos apresentados neste pedido podem ser preparados pelos procedimentos exemplificados abaixo.

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127/197 [00290] As abreviações usadas no presente pedido, inclusive particularmente nos esquemas e exemplos ilustrativos que se seguem, são conhecidas pelos epts. Algumas das abreviações usadas são as seguintes: min para minutos; h para horas; rt para temperatura ambiente; sat. para saturada; TFA para ácido trifluoroacético; DMF para Ν,Ν-dimetilformamida; DCM para diclorometano; Fmoc para 9fluorenilmetiloxicarbonil; HATU = hexafluorofosfato de 3-óxido 1[Bis(dimetilamino)metileno]-1 H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridínio; DIEA ou DIPEA para diisopropiletilamina; NMP para N-metilpirrolidona; EDC para I -etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida; DMSO para dimetilsulfóxido; MeOH para metanol; EtOAc para etil acetato; EtaN para trietilamina; MeCN ou ACN para acetonitrila.

[00291] Dados Analíticos: Espectrometria de massas: ESI-MS(+) significa espectrometria de massas com ionização por eletroaspersão realizada em modo de íons positivos; ESI-MS(-) significa espectrometria de massas com ionização por eletroaspersão realizada em modo de íons negativos; ESI-HRMS(+) significa espectrometria de massas com ionização por eletroaspersão de alta resolução realizada em modo de íons positivos; ESI-HRMS(-) significa espectrometria de massas com ionização por eletroaspersão de alta resolução realizada em modo de íons negativos. As massas detectadas estão apresentadas depois da designação da unidade m/z. Os compostos com massas exatas superiores a 1000 foram em geral detectados como íons com carga dupla, íons com carga tripla, e/ou íons com carga quádrupla. CAD: Detector aerossol carregado. ELSD: Detector por espalhamento de luz evaporativo.

[00292] Análise LCMS Condição A: Coluna: Waters Acuity UHPLC BEH C18, 2,1 x 50 mm, partículas de 1,7 pm; Fase móvel A: 5:95 acetonitrila:água com 0,05% de TFA; Fase móvel B: 95:5 acetonitrila:água com 0,05% de TFA; Temperatura: 50 °C; Gradiente: 0

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100% de B durante 3 min, e então retenção por 1,0 min a 100% de B; Fluxo: 1 mL/min; Detecção: massa.

[00293] Análise LCMS Condição B: Coluna: Waters Acuity UHPLC BEH C18, 2,1 x 50 mm, partículas de 1,7 pm; Fase móvel A: 5:95 acetonitrila:água com 10 mM de acetato de amônio; Fase móvel B: 95:5 acetonitrila:água com 10 mM de acetato de amônio; Temperatura: 50°C; Gradiente: 0-100% de B durante 3 min, e então retenção por 1,0 min a 100% de B; Fluxo: 1,0 mL/min; Detecção: massa.

[00294] Análise UHPLC-CAD Condição A: Coluna: Waters BEH Fenila, 150 x 2,1 mm, partículas de 1,7 pm; Fase móvel A: água com 0,05% de TFA, Fase móvel B: acetonitrila com 0,05% de TFA; Temperatura: 35°C; Perfil do gradiente: 10% de B a 35% de B de 0 min a 15 min, 35% de B a 95% de B de 16 min a 25 min, e então retenção por 1,0 min a 95% de B; Tempo após a operação: 4 min (nas condições da fase móvel inicial); Fluxo taxa: 0,35 mL/min; Volume de injeção: 3 pL de amostra 2 mg/mL em DMSO; Detecção: CAD na faixa de 100 PA e gás a 2,41 bar (35 psi).

[00295] Análise UHPLC-CAD Condição B: Coluna: Waters BEH Fenila, 150 x 2,1 mm, partículas de 1,7 pm; Fase móvel A: água com 0,05% de TFA, Fase móvel B: acetonitrila com 0,05% de TFA; Temperatura: 35°C; Perfil do gradiente: 10% de B a 95% de B de 0 min a 25 min, e então retenção por 1,0 min a 95% de B; Tempo após a operação: 4 min (nas condições da fase móvel inicial); Fluxo taxa: 0,35 mL/min; Volume de injeção: 3 pL de amostra 2 mg/mL em DMSO; Detecção: CAD na faixa de 100 PA e gás a 2,34 bar (34 psi).

Procedimentos gerais:

[00296] Todas as manipulações foram feitas sob automação em um sintetizador de peptídios Prelude (Protein Technologies). Todos os procedimentos, a menos que observado, foram realizsados em um vaso de reação de polipropileno de 40 mL equipado com uma frita inferior. O

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129/197 vaso foi conectado ao sintetizador de peptídios Prelude tanto por sua parte inferior como por sua parte superior. DMF pode ser adicionada pelo topo e pelo fundo do vaso, que lava igualmente de cima a baixo as laterais do vaso. Os reagentes foram adicionados somente pela parte inferior do vaso e passam para cima através da frita para contatar a resina. Todas as soluções foram removidas pela parte inferior do vaso. Agitação periódica descreve um rápido pulso de gás N2 através da frita inferior; 0 pulso durava aproximadamente 5 segundos e ocorria a cada 30 segundos. As soluções de aminoácidos geralmente não eram usadas além de duas semanas após sua preparação. As soluções de HATU foram usdadas dentro de duas semanas após sua preparação. DMF = dimetilformamida; HATU = hexafluorofosfato de 3-óxido de 1[Bis(dimetilamino)metileno]-1 H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridínio; DIPEA = diisopropiletilamina; resina de cloreto de 2-clorotritila = resina de cloreto de 2-clorotrifenilmetial (Chem-lmprex, malha 100 - 200, contas amarelas, 1,1 meg/g). Os aminoácidos comuns usasdos estão listados abaixo com os grupos protetores da cadeia lateral indicados entre parênteses. Fmoc-Ala-OH; Fmoc-Arg(Pbf)-OH; Fmoc-Asn(Trt)-OH; Fmoc-AspíOBuj-OH; Fmoc-Bzt-OH; Fmoc-Cys(Trt)-OH; FmocDab(Boc)-OH; Fmoc-Dap(Boc)-OH; Fmoc-Gln(Trt)-OH; Fmoc-Gly-OH; Fmoc-His(Trt)-OH; Fmoc-Hyp(^íBu)-OH; Fmoc-lle-OH; Fmoc-Leu-OH; Fmoc-Lys(Boc)-OH; Fmoc-Nle-OH; Fmoc-Met-OH; Fmoc-[N-Me]AlaOH; Fmoc-[N-Me]Nle-OH; Fmoc-Phe-OH; Fmoc-Pro-OH; Fmoc-SarOH; Fmoc-Ser(^íBu)-OH; Fmoc-Thr(^íBu)-OH; Fmoc-Trp(Boc)-OH; FmocTyr(^fBu)-OH; Fmoc-Val-OH. Os seguintes derivados de ácidos graxos foram usados para a derradeira etapa de acoplamento, HO₂C(CH2)nCH₃, n = 10 - 18, e ΗΟ₂0(0Η₂)η(0θ2^ίΒυ), n = 10 - 18.

[00297] O procedimento geral descreve um experimento realizado em uma escala de 0,4 mmol, onde a escala foi determinada pela quantidade de (9H-fluoren-9-il)metil (2-(amino-óxi)etil)carbamato ligado

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130/197 à resina. Esta escala corresponde a aproximadamente 364 mg da resina descrita acima. No entanto, foram usados 800 mg da resina com base na suposição de 46% de eficiência de carga. O excesso de cloreto de 2-clorotrifenilmetila foi resfriado bruscamente com metanol ao final da reação de carga. Todos os procedimentos podem ter a escala de 0,400 mmol reduzida por ajuste dos volumes descritos pelo múltiplo da escala. Antes do acoplamento de aminoácidos, todas as sequências de síntese de peptídios começaram com um procedimento de carga de ligante e um procedimento de intumescimento da resina, descritos abaixo como Procedimento de Carga de Ligante, e Procedimento de Intumescimento da Resina. Em seguida, o acoplamento de aminoácidos ao terminal N de uma amina primária usou o Procedimento de Acoplamento de Aminas Primárias descrito abaixo. O acoplamento de aminoácidos ao terminal N de uma amina secundária usou o Procedimento de Acoplamento de Aminas Secundárias descrito abaixo. A desproteção global e a divagem a partir das resinas usaram o Procedimento Global de Desproteção descrito abaixo. Por fim, a preparação de uma solução límpida contendo os produtos brutos para purificação por LC-MS usou o Procedimento de Preparação de Amostras descrito abaixo.

[00298] Procedimento de Carga de Ligante: A escala 0,4 mmol foi usada para preparar seis vasos de reação (RVs) com uma carga de 0,4 mmol de (9H-fluoren-9-il)metil (2-(amino-óxi)etil)carbamato para as resinas em cada RV. DIEA (2,95 mL, 16,9 mmol) foi adicionada a uma mistura de cloridrato de (9H-fluoren-9-il)metil (2-(aminoóxi)etil)carbamato (composto 4, 0,803 g, 2,4 mmol) em CH2CI2 (72 mL) a 0°C. Imediamente depois ela ficou homogênea, e 12 mL desta solução límpida foram adicionados a um frasco de 30 mL contendo 800 mg de resina cloreto de 2-clorotritila. Todos os 6 frascos foram colocados em um agitador por 75 min a 750 rpm. Em seguida, 0,2 mL de MeOH foi

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131/197 adicionado a um frasco de cada vez, cada um deles sendo agitado por 2 min a 750 rpm. As resinas foram transferidas para um RV de 40 mL, lavadas com CH2CI2 (8 mL x 3), DMF (8 mL x 3), CH2CI2 (10 mL x 3). Este processo (resfriamento brusco com MeOH e lavagens com CH2CI2/DMF/CH2CI2) foi aplicado aos outros 5 frascos para dar 0 composto ligante ligado à resina 5 em seis RVs.

[00299] Procedimento de Intumescimento da Resina: Os RVs contendo as resinas da etapa anterior foram conectados ao Sintetizador de Peptídios Prelude, e lavados (intumescidos) três vezes da seguinte maneira: DMF (10 mL) foi adicionada ao RV, e depois disso a mistura foi periodicamente agitada por 10 min antes de 0 solvente ser drenado através da frita.

Procedimento de Acoplamento de Aminas Primárias:

[00300] Piperidina:DMF (20:80 v/v, 10,0 mL) foi adicionada ao RV contendo a resina da etapa anterior. A mistura foi periodicamente agitada por 5 min e depois disso a solução foi drenada através da frita. Piperidina:DMF (20:80 v/v, 10,0 mL) foi novamente adicionada ao RV. A mistura foi periodicamente agitada por 5 min e depois disso a solução foi drenada através da frita. A resina foi lavada no fundo uma vez da seguinte maneira: DMF (10,0 mL) foi adicionada pelo fundo do vaso e a mistura resultante foi periodicamente agitada por 2 min antes de a solução ser drenada através da frita. A resina foi lavada por cima sucessivamente quatro vezes da seguinte maneira: para cada lavagem, DMF (10,0 mL) foi adicionada pelo topo do vaso e a mistura resultante foi periodicamente agitada por 2 min antes de a solução ser drenada através da frita. Foram adicionados ao RV um aminoácido ou um ácido graxo (0,2 M em DMF, 4,0 mL, 2 eq), HATU (0,2 M em DMF, 4,0 mL, 2 eq), e DIPEA (0,8 M em DMF, 2,0 mL, 4 eq) nessa ordem. A mistura foi periodicamente agitada por 15 min ou 30 min, e então a solução da mistura reacional foi drenada através da frita (0 tempo de reação de 15

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132/197 minutos foi usado somente para a primeira reação de acoplamento para formar a primeira ligação amida no sintetizador Prelude; para todas as outras sequências, foi aplicado o tempo de reação de 30 minutos). A resina foi lavada sucessivamente três vezes da seguinte maneira: para cada lavagem, DMF (8,0 ml_) foi adicionada pelo topo do vaso e a mistura resultante foi periodicamente agitada por 2 min antes de a solução ser drenada através da frita. Foram adicionados ao RV DMF (3,3 ml_), DIPEA (0,8 M em DMF, 1,5 ml_, 3 eq). Depois de a mistura ser agitada por 30 segundos, foi adicionado anidrido acético (1,0 M em DMF, 5,0 ml_, 12,5 eq). A mistura foi periodicamente agitada por 10 min, depois disso a solução foi drenada através da frita. A resina foi lavada por baixo uma vez da seguinte maneira: DMF (10,0 ml_) foi adicionada pelo fundo do vaso e a mistura resultante foi periodicamente agitada por 2 min antes de a solução ser drenada através da frita. A resina foi lavada por cima sucessivamente quatro vezes da seguinte maneira: para cada lavagem, DMF (10,0 ml_) foi adicionada pelo topo do vaso e a mistura resultante foi periodicamente agitada por 2 min antes de a solução ser drenada através da frita. A resina resultante foi usada diretamente na etapa seguinte.

Procedimento de Acoplamento de Aminas Secundárias:

[00301] Piperidina:DMF (20:80 v/v, 10,0 ml_) foi adicionada ao RV contendo as resinas da etapa anterior. A mistura foi periodicamente agitada por 5 min e depois disso a solução foi drenada através da frita. Piperidina:DMF (20:80 v/v, 10,0 ml_) foi novamente adicionada ao RV. A mistura foi periodicamente agitada por 5 min e depois disso a solução foi drenada através da frita. A resina foi lavada por baixo uma vez da seguinte maneira: DMF (10,0 ml_) foi adicionada pelo fundo do vaso e a mistura resultante foi periodicamente agitada por 2 min antes de a solução ser drenada através da frita. A resina foi lavada por cima sucessivamente quatro vezes da seguinte maneira: para cada lavagem,

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DMF (10,0 ml_) foi adicionada pelo topo do vaso e a mistura resultante foi periodicamente agitada por 2 min antes de a solução ser drenada através da frita. Foram adicionados ao vaso reacional um aminoácido ou um ácido graxo (0,2 M em DMF, 4,0 ml_, 2 eq), HATU (0,2 M em DMF, 4,0 ml_, 2 eq), e DIPEA (0,8 M em DMF, 2,0 ml_, 4 eq) nessa ordem. A mistura foi periodicamente agitada por 30 min, e então a solução reacional foi drenada através da frita. A resina foi lavada por cima sucessivamente três vezes da seguinte maneira: para cada lavagem, DMF (8,0 ml_) foi adicionada pelo topo do vaso e a mistura resultante foi periodicamente agitada por 2 min antes de a solução ser drenada através da frita. Foram novamente adicionados ao vaso reacional um aminoácido ou um ácido graxo (0,2 M em DMF, 4,0 ml_, 2 eq), HATU (0,2 M em DMF, 4,0 ml_, 2 eq), e DIPEA (0,8 M em DMF, 2,0 ml_, 4 eq) nessa ordem. A mistura foi periodicamente agitada por 30 min, e então a solução reacional foi drenada através da frita. A resina foi lavada por cima sucessivamente três vezes da seguinte maneira: para cada lavagem, DMF (8,0 ml_) foi adicionada pelo topo do vaso e a mistura resultante foi periodicamente agitada por 2 min antes de a solução ser drenada através da frita. Foram adicionados ao RV DMF (3,3 ml_), DIPEA (0,8 M em DMF, 1,5 ml_, 3 eq). Depois de a mistura ser agitada por 30 segundos, foi adicionado anidrido acético (1,0 M em DMF, 5,0 ml_, 12,5 eq). A mistura foi periodicamente agitada por 10 min, depois disso a solução foi drenada através da frita. A resina foi lavada por baixo uma vez da seguinte maneira: DMF (10,0 ml_) foi adicionada pelo fundo do vaso e a mistura resultante foi periodicamente agitada por 2 min antes de a solução ser drenada através da frita. A resina foi lavada por cima sucessivamente quatro vezes da seguinte maneira: para cada lavagem, DMF (10,0 ml_) foi adicionada pelo topo do vaso e a mistura resultante foi periodicamente agitada por 2 min antes de a solução ser drenada através da frita. A resina resultante foi usada

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134/197 diretamente na etapa seguinte.

Procedimento Global de Desproteção:

[00302] Depois de terminado o procedimento no Prelude, cada RV foi lavado com CH2CI2 (8 ml_ χ 6), e deixado secar ao ar. Quando a resina estava escoando livremente, ela foi transferida para um frasco de 30 ml_, e 8 ml_ da solução de divagem (vide abaixo) foram adicionados. Depois que 0 frasco foi agitado em um agitador por 75 min a 750 rpm, a mistura reacional foi filtrada. A solução parda límpida resultante foi dividida em quatro tubos de ensaio de 25 ml_, cada um deles contendo 16 ml_ de éter dietílico, resultando na formação de suspensões brancas. Cada uma delas foi centrifugada, lavada duas vezes com éter dietílico para formar sólidos brancos em cada um dos tubos de ensaio. A solução de divagem (50 ml_) foi preparada da seguinte maneira: a um balão de Erlenmeyer de 250 ml foram adicionados 500 mg de ditiotreitol, 46 ml_ TFA, 2,5 ml_ de água, e 1,0 ml_ de triisopropilsilano, com agitação para formar uma solução límpida.

Procedimento de Preparação de Amostras:

[00303] A cada tubo de ensaio contendo 0 produto bruto obtido na etapa anterior foram adicionados, em ordem, 0,4 ml_ de DMSO e 0,4 ml_ de MeOH. Depois de agitar por 1 min, em muitos casos formou-se uma límpida. No entanto, se ainda houvesse sólidos presentes no tubo de ensaio, mais DMSO (0,2 ml_) era adicionado, e a mistura era agitada por 2 min. Neste ponto, se houvesse sólidos remanescentes, a solução límpida era removida e mais DMSO (até 1,0 ml_) era adicionado. A solução límpida resultante foi submetida à LC-MS preparatória a 2,0 ml_ por injeção.

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Síntese do composto A

HO' □Η ίΈιιΟΗ, (BocJjO

A DMAP, THF. 60 C ^HCYΟ...........:------Π

27% rendí Tsento q .0

Η 'Suík ,hL

V ^0Η δ

Η

1. KOH. EtOH <ΒΐιΟ_χ ,. Ν.

---------_σ

THF/HsO (3/1)

RT, 16 h

HBr + Sr-W^NHj. _λ

2. 3 NHCi in CPME 19% rendimento ,ΝΗί

HCI

Õ

O

Fmec^ (X Ji,

N — if Ο*0ίΐ Η H

OMe

76% rendimento

3N HC1/CPME Fmoc, -, 0 et₂O, R.T, 18 h N 'NHj ______ , H ™ _HC(

83% rendimento 4

DIEA, OH,Cl;

agitador per 7 5 mi n e então resfriamento bruscamente com MeOH 2 min ,

CX -OH

TFA, Et_aSiH 9 H 9 H ⁰ h | o 9

DiT.HiO 0 ..-- A ÃA A N. - A A/\A RT5 min Η X^v~ >Γ N Y N T Y - N H OH

H₂N _h η _H δ ^H J 0 ^H composto A GGGGS-Glu^Y-C14-COOH [00304] DMAP (2,80 g, 23,0 mmol) foi adicionado a uma mistura de ácido pentadecanodioico (25,0 g, 92,0 mmol) em 2-Me-THF (250 ml_). Depois de agitar à temperatura ambiente por 10 min, ter-butanol (13,2 ml_, 138 mmol) foi adicionado e a agitação continuou à temperatura ambiente por 10 min. Depois que a suspensão resultante foi aquecida a 60°C por 10 min, ela transformou-se em uma solução incolor límpida. Uma solução de BOC-anidrido (26,0 g, 119 mmol) em THF (100 mL) foi acrescentada, durante 2 horas, à mistura reacional acima a 60°C em um funil de adição de pressão equalizada. Próximo ao fim da adição, a mistura reacional transformou-se em uma solução rosa-claro límpida. A agitação continou a 60°C por 18 h. Depois de esfriar para 0°C, 100 mL

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136/197 de HCI 1,5 N foram adicionados durante 5 min. Em seguida, a mistura foi aquecida até a temperatura e agitada por 15 min. Depois da separação, a camada orgânica foi lavada com salmoura (250 ml_ x 2), secada sobre Na₂SC>4, filtrada, e concentrada. O material resultante foi suspendido em acetonitrila (250 ml_), agitado à temperatura ambiente por 1 h, e filtrado para remover o material de partir diácido não reagido. Em seguida, o filtrado foi concentrado até aproximadamente 125 mL. A suspensão resultante foi agitada a 0°C oor 2 h, ficando mais nebulosa com o tempo. O sólido resultante foi filtrado, lavado com acetonitrila fria (0°C) (2 x 15 mL), e secado, dando ácido 15-(terc-butóxi)-15oxopentadecanoico (composto 1, 8,20 g, 25,0 mmol, 27,2 % de rendimento) como um sólido esbranquiçado. ¹H RMN (400 MHz, CDCI3, ppm) δ 2,35 (t, J = 7,58 Hz, 2H), 2,20 (t, J = 7,46 Hz, 2H), 1,68 - 1,54 (m,4H), 1,45 (s,9H), 1,34- 1,24 (m, 18H). ¹³C RMN (125 MHz, CDCI3, ppm) δ 179,91, 173,44, 79,93, 35,64, 34,08, 29,57, 29,48, 29,46, 29,41, 29,39, 29,29, 29,23, 29,09, 29,06, 28,12, 25,12, 24,70.

[00305] Os seguintes compostos foram preparados de acordo com 0 procedimento acima, HO₂C(CH₂)_nCO₂ ^fBu, n = 10 -18. A separação do produto desejado - mono éster HO2C(CH2)nCO2^fBu do diácido HO2C(CH₂)_nCO₂H não reagido do diéster BuO^CH^nCO/Bu reagido demais foi obtida em cada caso utilizando-se suas diferentes solubilidades em acetonitrila.

h

CL

OH + Br õ

HBr .nh₂

1. KOH, EtOH

2. 3NHC!ínCPME

1S% renáH-nento

[00306] Hidróxido de potássio (74,1 g, 1122 mmol) foi adicionado aos poucos durante 10 minutos a uma solução límpida de terc-butil Nhidroxicarbamato (50,0 g, 376 mmol) em etanol anidro (500 mL) a 0°C, usando um agitador mecânico. Depois de agitar a 0°C por 10 min, e em seguida à temperatura ambiente por 20 min, a mistura reacional foi

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137/197 resfriada para 0°C, e bromidrato de 2-bromoetilamina (100 g, 488 mmol) foi adicionado aos poucos durante 15 min. Depois de agitar a 0°C por 30 min, e em seguida à temperatura ambiente por 5 h, as suspensões brancas resultantes foram filtradas e a torta de filtrado foi lavada com EtOH (40 ml_ x 2). Os filtrados combinados foram concentrados até um volume de 100 ml_, extraídos com f-BuOMe (500 ml_) e Η₂Ο (250 ml_). Depois da separação, a camada aquosa foi extraída com FBuOMe (200 ml_). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (2 x 200 mL), secadas sobre Na2SO4, filtradas, concentradas e secadas em alto vácuo para dar um líquido muito viscoso (20,0 g). O líquido resultante foi dissolvido em FBuOMe (300 mL). HCI (3 M em éter ciclopentilmeílico) (40 mL, 120 mmol) foi adicionado em gotas à solução límpida acima à temperatura ambiente. Formou-se uma suspensão branca. Depois de agitar à temperatura ambiente por 4 h, os sólidos sbrancos resultantes foram filtrados, lavados com FBuOMe, e secados a vácuo por 45 min para dar cloridrato de terc-butil 2aminoetoxicarbamato (composto 2, 15,5 g, 72,9 mmol, 19,4% de rendimento) como um sólido branco. ¹H RMN (400 MHz, DMSO-de, ppm) δ 10,21 (br s, 1H), 8,27 (br s, 2,6H), 3,92 (t, J = 5,26 Hz, 2H), 2,98 (t, J=5,26 Hz, 2H), 1,41 (s, 9H). ¹³C RMN (125 MHz, DMSO-d₆, ppm) δ 157,10, 80,79, 72,00, 37,46, 28,46.

_o THF/H2O (3/1) íí RT. 16 h

Ο ΜΗ

7S% rendimento [00307] Bicarbonate de sódio (8,00 g, 95 mmol) foi adicionado a uma mistura agitada de cloridrato de terc-butil 2-aminoetoxicarbamato (composto 2, 13,5 g, 63,5 mmol), Fmoc-OSu (25,7 g, 76,0 mmol) em THF (450 mL) e água (150 mL). Depois de agitar à temperatura ambiente por uma noite, todos os componentes voláteis foram removidos a vácuo. O resíduo foi extraído com EtOAc (400 mL, 200 mL)

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138/197 depois que a camada aquosa fora saturada com NaCI sólido. As camadas orgânicas combinadas foram secadas sobre NazSCU, filtradas, concentradas. O resíduo foi submetido à cromatografia rápida sobre sílica-gel, eluindo com EtOAc/hexanos. As frações mais puras foram combinadas, concentradas, e o resíduo foi novamente purificado usando as condições acima. Mais uma vez, as frações mais puras foram combinadas e concentradas. O resíduo foi purificado uma terceira vez usando condições idênticas. As frações puras foram combinadas, concentradas, e secadas em alto vácuo para dar (composto 3,19,2 g, 48,2 mmol, 76 % de rendimento). ¹H RMN (400 MHz, CDCI3, ppm) δ 7,78 (d, J= 7,32 Hz, 2H), 7,65 (d, J= 7,32 Hz, 2H), 7,63, (s, 1H), 7,42 (t, J= 7,32 Hz, 2H), 7,33 (t, J= 7,232 Hz, 2H), 6,00 (br s, 1H), 4,40 (d, 2H), 4,26 (t, J= 7,10 Hz, 1H), 3,91 (t, J= 4,20 Hz, 2H), 3,49-3,46 (m, 2H), 1,52 (s, 9H). ¹³C RMN (125 MHz, CDCI3, ppm) δ 157,54, 156,90, 144,06, 141,32, 127,68, 127,08, 125,23, 119,96, 82,11, 75,66, 66,91, 47,30, 39,23, 28,24.

O O i I 4N ri^L'dioxano / \ ei ⁺ O MY*· n^

Η ^3% rendtmenio

3 ⁴ [00308] HCI (100 mL, 400 mmol, 4 M em dioxano) foi adicionado à temperatura ambiente a uma solução agitada de composto 3 (8,6 g, 21,6 mmol), 1,4-dimetoxibenzeno (7,46 g, 54,0 mmol) em éter dietílico (100 mL). Depois de agitar à temperatura ambiente por uma noite, a mistura transformou-se em uma suspensão grossa que mal pôde ser agitada. Mais éter (400 mL) foi adicionado e a suspensão resultante foi agitada à temperatura ambiente por 30 min. Ela foi então filtrada em uma atmosfera de nitrogênio e os sólidos foram lavados com éter (3 χ 100 mL) para dar 0 composto 4 (6,36 g, 19,0 mmol, 87 % de rendimento) como um sólido branco. ¹H RMN (400 MHz, DMSO-de, ppm) δ 11,10 (br, s, 2,60 H), 7,89 (d, J= 7,58 Hz, 2H), 7,70 (d, J= 7,34 Hz, 2H), 7,54 (br

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139/197 t, J = 5,5 Hz, 1H), 7,42 (t, J = 7,32 Hz, 2H), 7,34 (t, J = 7,32 Hz, 2H), 4,31 (d, J = 6,6 Hz, 2H), 4,23 (t, J = 6,6 Hz, 1H), 4,06 (t, J = 5,38 Hz, 2H), 3,28 (q, J = 5,22 Hz). ¹³C RMN (125 MHz, DMSO-d₆, ppm) δ 156,74, 144,32, 141,22, 128,11, 127,57, 125,64, 120,60, 73,50, 66,08, 47,17, 38,91.

H £

N „ z, A

Y h .

° HO->O° ,OH

GGGGS-Glu^Y-C14-COOH

Composto A [00309] O material bruto foi purificado por LC/MS preparatória usando as seguintes condições: Coluna: XBridge CSH C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; Fase móvel A: 5:95 acetonitrila: água com 0,1% de ácido triflouroacetico; Fase móvel B: 95:5 acetonitrila: água com 01.% de ácido triflouroacetico; Gradiente: 0-34,9% de B durante 23 min, e em seguida uma retenção de 2 min a 100% de B; Fluxo: 20 mL/min. As frações contendo o produto desejado foram combinadas e os orgânicos voláteis foram removidos usando uma corrente de nitrogênio. A fração aquosa resultante contendo o produto desejado foi resfriada para -78°C em uma corrente de nitrogênio e liofilizada para dar o composto do título A como um sólido branco (88 mg, 25,9% de rendimento, LC-CAD purity 98,6%).

Condição de análise A: Tempo de retenção = 1,24 min; ESI-MS (M+H)⁺ = 775,30.

Condição de análise B: Tempo de retenção = 1,05 min; ESI-MS (M+H)⁺ = 775,25.

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140/197

NH, NH, NH, NH,

KGGEEKKKEKEKEPKGGEEKKKEKEK-Glu^Y-C15-COOH

Massa exata: 3496,97 [00310] O material bruto resultante foi purificado por LC/MS preparatória usando as seguintes condições: Coluna: XBridge C18, 19 x 200 mm, partículas de 5 pm; Fase móvel A: 5:95 acetonitrila: água com 0,1% de ácido trifluoroacético; Fase móvel B: 95:5 acetonitrila: água com 0,1% de ácido trifluoroacético; Gradiente: 20-70% de B durante 20 min, e em seguida uma retenção de 5 min a 100% de B; Fluxo: 20 mL/min. As frações contendo o produto desejado foram combinadas e os orgânicos voláteis foram removidos usando uma corrente de nitrogênio. A fração aquosa contendo o produto desejado foi resfriada para -78°C em uma corrente de nitrogênio e liofilizada para dar o composto do título como um sólido branco (47 mg, 3,4% de rendimento, pureza por LC-CAD 72%).

Condição de análise A: Tempo de retenção = 1,14 min; ESI-MS (M+3H)⁺³ = 1166,90, (M+3H)⁺⁴ = 875,45.

Condição de análise B: Tempo de retenção = 0,991 min; ESI-MS (M+3H)⁺³ = 1166,90, (M+3H)⁺⁴ = 875,50.

Exemplo 5: Síntese em fase sólida de melhoradores farmacocinéticos [00311] Os melhoradores farmacocinéticos apresentados neste pedido podem ser preparados pelos procedimentos exemplificados abaixo.

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141/197

CbzHN”

Br ₊ .NHBõC HQ

DBU, THF

Pd/C

84%

CbzHN'^^°'NHBoc ----------------------Et₅SHCHCf₃ KteOH 83%

Ü u ~^AA

NHCbz ,0Ο M

JL .,-N

NHCbz

Pd/C

RATU, NMM, DMF.

955$

CHClj MeOH

95%

X _zo. N H [00312] Benzil (2-(((tercbutóxicarbonil)amino)óxi)etil)carbamato, 3. DBU (26,3 ml, 174 mmol) foi adicionado aos poucos a uma mistura em agitação de benzil (2-bromoetil)carbamato (30 g, 116 mmol) e terc-butil hidroxicarbamato (24,76 g, 186 mmol) em THF (75ml). A mistura reacional foi agitada por uma noite à temperatura ambiente (precipitados foram observados). LCMS mostra apenas a quantidade mínima de material de partida restante. A mistura reacional foi concentrada, resfriada bruscamente com água, e extraída com etil acetato. As fases etil acetato foram combinadas, lavadas com água, e salmoura, e em seguida secadas com Na2SO4. Depois da concentração, foram obtidos 45 g de produto bruto que foram submetidos à separação por cromatografia (0-20% de acetona em hexano). Depois da separação, benzil (2-(((tercbutoxicarbonil)amino)óxi)etil)carbamato (32,9 g, 106 mmol, 91% de rendimento) foi obtido como um sólido amarelo claro muito viscoso. ¹H RMN (400MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ (7,43 - 7,30 (m, 5H), 5,75 (br. s., 1H), 5,32 (s, 1H), 5,14 (s, 2H), 3,94 - 3,85 (m, 2H), 3,54 - 3,42 (m, 2H), 1,50 (s, 9H).

[00313] Cloridrato de terc-butil (2-aminoetóxi)carbamato, 4. Benzil (2(((terc-butoxicarbonil)amino)óxi)etil)carbamato (16,4g, 52,8 mmol) foi dissolvido em MeOH (161 ml) e clorofórmio (5,33 ml, 66,1 mmol) foi adicionado. A solução foi purgada com nitrogênio antes da adição cautelosa de Pd/C (2,81 g, 2,64 mmol). A solução foi então resfriada para 0°C e trietilsilano (76 ml, 476 mmol) foi adicionado lentamente. Desprendimento de H2 foi observado durante a adição e foi exotérmico.

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142/197

Depois da adição, a reação foi então deixada esquentar gradualmente até a temperatura ambiente por uma noite. A mistura reacional foi filtrada através de um chumaço de celite e lavada com mais metanol antes de ser evaporada a vácuo. O resíduo foi então triturado com hexano e o sólido resultante foi filtrado, lavado com mais hexano e deixado secar sob sucção para dar cloridrato de terc-butil 2aminoetoxicarbamato (10,2 g, 48,0 mmol, 91 % de rendimento) como um sólido rosado. 1H RMN (400MHz, CLOROFÓRMIO-d) (8,78 (br. s., 1H), 8,31 (br. s., 2H), 4,24 (s., 2H), 3,39 (s., 2H), 1,48 (s, 9H).

[00314] terc-butil ((3,6,9-trioxo-1 -fenil-2-oxa-4,7,10-triazadodecano12-il)óxi)carbamato, 5. N-Metilmorfolina (5,17 ml, 47,0 mmol) foi adicionada em gotas a uma solução de cloridrato de terc-butil 2aminoetoxicarbamato (4 g, 18,81 mmol), ácido 2-(2(((benzilóxi)carbonil)amino)acetamido)acético (5,01 g, 18,81 mmol) e HATU (7,87 g, 20,69 mmol) em DMF anidra (75 ml). A mistura foi deixada agitar à temperatura ambiente por uma noite. A reação foi diluída com etil acetato e lavada com HCI 1 N. A fase aquosa separada foi então extraída com uma porção adicional de etil acetato e os orgânicos combinados foram então lavados com HCI 1 N, salmoura, solução saturada de bicarbonate de sódio seguida por mais uma lavagem com salmoura. A camada orgânica foi então secada (Na2SO4) e evaporada a vácuo. O produto bruto foi então purificado por cromatografia em coluna usando etil acetato-hexano como eluente para dar 6,25g (78%) do composto do título. ¹H RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-d) δ 7,69 (s, 1H), 7,41 - 7,28 (m, 6H), 7,00 - 6,87 (m, 1H), 5,81 (brs, 1H), 5,14 (s, 2H), 3,98 (dd, J=16,7, 5,7 Hz, 4H), 3,86 (t, J=4,8 Hz, 2H), 3,55 - 3,46 (m, 2H), 1,46 (s, 9H). MS m/e 447,0 (M+Na⁺).

[00315] Cloridrato de terc-butil (2-(2-(2aminoacetamido)acetamido)etóxi)carbamato, 6. 5 (6,25 g, 14,72 mmol) foi dissolvido em metanol anidro (58,9 ml) e clorofórmio (1,782

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143/197 ml, 22,09 mmol) foi adicionado seguido por Pd-C (1,567 g, 1,472 mmol). O balão de reação foi então purgado com hidrogênio (balão) e deixado agitar por 6 horas antes de ser filtrado através de celite e evaporado para dar cloridrato de terc-butil 2-(2-(2aminoacetamido)acetamido)etoxicarbamato (4,87 g, 14,90 mmol, 101 % de rendimento). ¹H RMN (400 MHz, DMSO-d₆) δ 10,00 (br s, 1H), 8,71 (brt, J=5,7 Hz, 1H), 8,18 - 7,99 (m, 4H), 3,77 (d, J=5,7 Hz, 2H), 3,69 (t, J=5,9 Hz, 2H), 3,59 (s, 2H), 3,36 - 3,23 (m, 3H), 1,41 (s, 9H).

95%

H éster snstilicD ííe L-sehna t

HATU, KMM, t)MF ” Y V 'ΝΗβΜ HATU.NMM.

O 7S% HO _T LiOH, 3:1 THRágua í—8 R*Me r - _H [00316] (S)-terc-butil 2-(((benzilóxi)carbonil)amino)-5-(((S)-3hidróxi-1 -metóxi-1 -oxopropan-2-il)amino)-5-oxopentanoato, 8. Ácido (S)-4-(((benzilóxi)carbonil)amino)-5-(terc-butóxi)-5oxopentanoico (7., adquirido na Chemlmpex) (15g, 44,5 mmol) e cloridrato de (S)-metil 2-amino-3-hidroxipropanoato (6,92 g, 44,5 mmol) foram dissolvidos em DMF (148 ml) e a solução foi resfriada para 0°C. HATU (18,60 g, 48,9 mmol) foi adicionado seguido por N-metilmorfolina (12,22 ml, 111 mmol). A mistura reacional foi deixada agitar a 0°C em uma atmosfera de N2 por 12 horas. A mistura reacional foi diluída com EtOAc, resfriada bruscamente com HCI 1 N, e em seguida lavada com NaHCOs saturado, e salmoura. A fase orgânica foi secada sobre Na2SÜ4 anidro e concentrada a vácuo. O produto bruto foi purificado por purificação cromatográfica (0-40% de acetona/Hexano) para dar (S)terc-butil 2-(((benzilóxi)carbonil)amino)-5-(((S)-3-hidróxi-1 -metóxi-1 oxopropan-2-il)amino)-5-oxopentanoato (16,31 g, 36,5 mmol, 82 % de rendimento) como um sólido esbranquiçado. ¹H-RMN (CDCI3, 400 MHz) δ 7,37 (m, 5H), 6,5 (bs, 1H), 5,53 (m, 1H); 5,1 (s, 2H), 4,7(m, 1 H), 4,28(m, 1H), 4,1 (bs, 1H), 3,95(m, 1H), 3,8(s, 3H), 2,4(m, 2H), 2,3(M,1H), 1,7(m, 1H), 1,5(s, 9H); MS m/e 439,2 (M+H⁺).

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144/197 [00317] Ácido (S)-2-((S)-4-(((benzilóxi)carbonil)amino)-5-(tercbutóxi)-5-oxopentanamido)-3-hidroxipropanoico, 9. (S)-terc-butil 2(((benzilóxi)carbonil)amino)-5-(((S)-3-hidróxi-1-metóxi-1-oxopropan-2il)amino)-5-oxopentanoato (14 g, 31,9 mmol) foi dissolvido em THF (106 ml) e água (53,2 ml) e foi resfriado para 0°C Depois de agitar por 30 minutos, LiOH (0,688 g, 28,7 mmol) foi adicionado. A mistura reacional foi agitada a esta temperatura em uma atmosfera de N2. Depois de terminada a reação, 0 pH da mistura reacional foi ajustado em ~4 a 0 °C. A mistura reacional foi extraída com EtOAc (3x150ml). A fase orgânica combinada foi secada sobre Na2SÜ4 anidro e foi concentrada sob rotovaporização para dar ácido (S)-2-((S)-4(((benzilóxi)carbonil)amino)-5-(terc-butóxi)-5-oxopentanamido)-3hidroxipropanoico (13,01 g, 30,7 mmol, 96 % de rendimento) como um sólido esbranquiçado. MS m/e 425,0 (M+H⁺).

[00318] (5S, 10S)-metil 5-(terc-butoxicarbonil)-10-(hidroximetil)3,8,11,14-tetraoxo-1 -fenil-2-oxa-4,9,12,15-tetra-aza-heptadecan-17oato, 10. Cloridrato de metil 2-(2-aminoacetamido)acetato (5 g, 27,4 mmol) foi dissolvido em DMF (116 ml) e ácido (S)-2-((S)-4(((benzilóxi)carbonil)amino)-5-(terc-butóxi)-5-oxopentanamido)-3hidroxipropanoico foi carregado (11,62 g, 27,4 mmol). A esta mistura reacional foram adicionados HATU (11,45 g, 30,1 mmol) e Nmetilmorfolina (7,53 ml, 68,5 mmol). A mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente em uma atmosfera de N2 por 12 horas. LC/MS e HPLC indicaram 0 término da reação. A mistura reacional foi diluída com EtOAc (150ml_) e foi resfriada bruscamente com HCI 1 N. A camada orgânica foi separada e foi lavada com salmoura (50ml_), NaHCOs aquoso (50ml_) e por fim salmoura (3x50ml_). A camada orgânica foi secada sobre Na2SÜ4 anidro e evaporada a vácuo para dar 0 produto desejado como um óleo grosso, que foi purificado por purificação cromatográfica (0-10% de MeOH/DCM) para dar 0 produto desejado

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145/197 (5S, 10S)-metil 5-(terc-butóxicarbonil)-10-(hidroximetil)-3,8,11,14tetraoxo-1 -fenil-2-oxa-4,9,12,15-tetra-aza-heptadecan-17-oato (14g, 25,3 mmol, 93 % de rendimento) como um óleo grosso. ¹H-RMN (CDCI₃, 400 MHz) δ 7,38 (m, 5H), 5,1 (m, 2H), 4,0 (m, 6H), 3,7(s, 3H), 2,4(m, 2H), 2,2(M,1 H), 1,9(m, 1H), 1,45(s, 9H); MS m/e 553,2 (M+H⁺). [00319] Ácido (5S,10S)-5-(terc-butóxicarbonil)-10-(hidroximetil)3,8,11,14-tetraoxo-1 -fenil-2-oxa-4,9,12,15-tetra-aza-heptadecan-17oico, 11. (5S,10S)-metil (5S,10S)-metil 5-(terc-butóxicarbonil)-10(h id roxi meti I )-3,8,11,14-tetraoxo-1-fenil-2-oxa-4,9,12,15-tetra-azaheptadecan-17-oato (20 g, 36,2 mmol) foi dissolvido em THF (193 ml) e água (97 ml) e foi resfriado para 0°C. Depois de agitar por 30 minutos, LiOH (0,780 g, 32,6 mmol) foi adicionado. A mistura reacional foi agitada a 0c em uma atmosfera de N2 por 5 horas. O progresso da reação foi monitorado por LC/MS e HPLC. Depois de terminada a reação, ela foi diluída com EtOAC (150ml_) e foi neutralizada com HCI 1 N. A fase orgânica foi separada, e a fase aquosa foi extraída com EtOAc (3x50ml_), secada sobre NazSCXi anidro, concentrada a vácuo e secada em alto vávuo por 12 horas para dar 0 produto desejado como um sólido esbranquiçado (18g, 96% de rendimento). MS m/e 539,1 (M+H⁺).

13 [00320] Ácido 15-(terc-butóxi)-15-oxopentadecanoico, 13. Uma suspensão de ácido pentadecanodioico (20,2 g, 70,5 mmol) em anidrido acético (70 ml) foi aquecida até 128°C em uma atmosfera de Ar. A solução resultante foi agitada a esta temperatura por 6,0 h e então resfriada para a temperatura ambiente. A solução foi diluída com tolueno (100 ml_) e evaporada. O resíduo foi extraído com tolueno (4x80 ml_) e secado a vácuo por 6,5 h para dar 27,53 g de um sólido esbranquiçado.

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A uma mistura do sólido acima (27,53 g) e Fbutanol (235 ml), à temperatura ambiente e em uma atmosfera de Ar, 4dimetilaminopiridina (34,8 g, 282 mmol) foi adicionada em três porções durante um período de 15 min. A mistura foi aquecida até 50°C e a solução resultante foi agitada a esta temperatura por 34,0 h. Depois de esfriar pata a temperatura ambiente, a mistura foi diluída com tolueno (50 mL) e evaporada. O resíduo foi extraído com tolueno (2x100 mL) e então recuperado em 9/1 éter/CHkCh (600 mL). A solução foi lavada com HCI 1 M (400 mL), HCI 0,5 M (400 mL), água (300 mL) e salmoura (300 mL). A fase orgânica foi secada (NazSCXi) e evaporada. O produto bruto foi recuperado em CH2CI2 (50 mL) e sonicado. A suspensão resultante foi filtrada através de um funil médio fritado e 0 sólido no funil foi enxaguado com duas porções pequenas de CH2CI2. O filtrado e os enxagues foram combinados e evaporados. O concentrado foi cromatografado (cartucho de 120 g para coluna de cromatografia rápida, CH2CI2 a 9/1 ChhCh/i-PrOH) dando, em ordem de eluição:

- uma mistura ~5/1 (7,19 g, óleo incolor) de d\-terc-butil pentadecanodioato e ácido 15-(terc-bt/tóx/)-15-oxopentadecanoico.

- ácido 15-(terc-butóxi)-15-oxopentadecanoico (4,38 g, 19 % de rendimento) como um sólido branco: LC/MS [M-H]’¹ = 327; ¹H RMN (400 MHz, CDCh) δ 2,37 (t, J= 7,4 Hz, 2H), 2,22 (t, J= 7,5 Hz, 2H), 1,63 (m, 4H), 1,47 (s, 9H), 1,28 (m, 18H).

- uma mistura ~4/1 (4,42 g, sólido esbranquiçado) de ácido 15-(tercbutóxi)-15-oxopentadecanoico e ácido pentadecanodioico.

[00321] A mistura de di- e monoésteres terc-butílicos (7,19 g) foi separada por cromatografia (cartucho de 120 g para coluna de cromatografia rápida, CH2CI2 a 9/1 CH2Cl2/i-PrOH) para dar uma quantidade adicional de ácido 15-(terc-butóxi)-15-oxopentadecanoico (0,8 g, 4% de rendimento) como um sólido branco.

[00322] A mistura de monoéster terc-butílico e diácido (4,42 g) foi

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147/197 separada por cromatografia (cartucho de 330 g para coluna de cromatografia rápida, Hex a 4/1 Hex/acetona) para dar uma quantidade adicional de ácido 15-(terc-butóxi)-15-oxopentadecanoico (2,92 g, 13 % de rendimento) como um sólido branco.

[00323] A quantidade isolada total de ácido 15-(terc-butóxi)-15oxopentadecanoico foi de 8,1 g (36% de rendimento).

Ο.;, ,Ο'Βυ

'NHCte

HO' UÍjOR

Rs'Bii

HATU, NMM, DMF

1S [00324] terc-butil N2-((benzilóxi)carbonil)-N5-((S)-1 -((2-((2-((2((2,2-dimetil-4,10-dioxo-3,6-dioxa-5,9-diazaundecan-11 -il)amino)-2oxoetil)amino)-2-oxoetil)amino)-2-oxoetil)amino)-3-hidróxi-1oxopropan-2-il)-L-glutaminato, 14. Cloridrato de terc-butil 2-(2-(2aminoacetamido)acetamido)etoxicarbamato (3,73 g, 11,41 mmol) e ácido (5S,10S)-5-(terc-butóxicarbonil)-10-(hidroximetil)-3,8,11,14tetraoxo-1-fenil-2-oxa-4,9,12,15-tetra-aza-heptadecan-17-oico (5,85 g, 10,87 mmol) foram dissolvidos em DMF (36,2 ml) à temperatura ambiente em uma atmosfera de nitrogênio. A solução foi resfriada para 0°C antes da adição de HATU (4,55 g, 11,96 mmol) seguida pela adição em gotas de N-metil morfolina (2,99 ml, 27,2 mmol). A reação foi deixada esquentar até a temperatura ambiente por uma noite. A reação deixada esfriar para 0°C antes de resfriamento brusco com água gelada e agitação vigorosa enquanto o gelo derretia. Quando todo o gelo havia derretido em volta do balão, formou-se um precipitado que foi então

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148/197 filtrado com sucção por uma noite (lenta). O sólido ceroso resultante foi dissolvido em metanol (200ml_) antes da evaporação. Tratamento com metanol (cerca de 20ml_) seguido pela adição de éter dietílico precipitou o produto que foi recolhido por sucção para dar (23S,28S)-terc-butil 28(((benzilóxi)carbonil)amino)-23-(hidroximetil)-2,2-dimetil4,10,13,16,19,22,25-heptaoxo-3,6-dioxa-5,9,12,15,18,21,24heptaazanonacosan-29-oato 6,4 g (73% de rendimento). ¹H RMN (400 MHz, DMSO-d₆) δ 9,96 (br s, 1H), 8,24 - 8,01 (m, 5H), 7,87 (br t, J=5,6 Hz, 1H), 7,62 (br d, J=7,8 Hz, 1H), 7,40 - 7,30 (m, 5H), 5,10 - 4,96 (m, 3H), 4,30 - 4,24 (m, 1H), 4,10 (q, J=5,3 Hz, 3H), 3,93 - 3,84 (m, 1H), 3,80 - 3,53 (m, 13H), 3,31 - 3,23 (m, 2H), 3,17 (d, J=5,3 Hz, 7H), 2,90 (s, 1H), 2,75 - 2,67 (m, 1H), 2,35 - 2,20 (m, 2H), 1,98- 1,86 (m, 1H), 1,82 - 1,71 (m, 1H), 1,42 - 1,24 (m, 20H). MS m/e 811,4 (M+H⁺).

[00325] terc-butil N5-((S)-1 -((2-((2-((2-((2,2-dimetil-4,10-dioxo-3,6dioxa-5,9-diazaundecan-11 -il)amino)-2-oxoetil)amino)-2oxoetil)amino)-2-oxoetil)amino)-3-hidróxi-1-oxopropan-2-il)-Lglutaminato, 15. Metanol (158 ml) foi adicionado de uma só vez a (23S,28S)-terc-butil 28-(((benzilóxi)carbonil)amino)-23-(hidroximetil)2,2-d i meti I-4,10,13,16,19,22,25-heptaoxo-3,6-dioxa-

5,9,12,15,18,21,24-heptaazanonacosan-29-oato (6,4 g, 7,89 mmol) e o sólido foi deixado agitar em uma atmosfera de nitrogênio até que a amina tivesse dissolvido (cerca de de 3 horas). Pd/C (0,840 g, 0,789 mmol) foi então adicionado e uma atmosfera de hidrogênio foi então introduzida por meio um balão. A reação foi deixada agitar à temperatura ambiente antes de filtração através de um papel-filtro de vidro e evaporação do filtrado para dar (23S,28S)-terc-butil 28-amino23-(hidroximetil)-2,2-dimetil-4,10,13,16,19,22,25-heptaoxo-3,6-dioxa-

5,9,12,15,18,21,24-heptaazanonacosan-29-oato 4,8 g (90% de rendimento) como um sólido esbranquiçado quebradiço.

¹H RMN (400 MHz, DMSO-d₆) δ 9,96 (br s, 1H), 8,29 - 8,19 (m, 1H), 8,17

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- 7,96 (m, 3H), 7,87 (br t, J=5,7 Hz, 1H), 5,00 (br s, 1H), 4,28 - 4,08 (m, 1H), 3,78 - 3,56 (m, 10H), 3,30 - 3,14 (m, 3H), 2,90 (s, 1H), 2,75 - 2,67 (m, 1H), 2,34 - 2,06 (m, 3H), 1,87 - 1,74 (m, 1H), 1,68 - 1,50 (m, 1H), 1,41 (d, J=4,3 Hz, 15H), 1,10 (s, 1H).

terc-butil (23S,28S)-28-(terc-butoxicarbonil)-23-(hidroximetil)-2,2dimeti 1-4,10,13,16,19,22,25,30-octaoxo-3,6-dioxa 5,9,12,15,18,21,24,29-octa-azatetratetracontan-44-oato, 16.

[00326] N-Metil morfolina (1,950 ml, 17,73 mmol) foi adicionada em gotas a uma solução parcial de (23S,28S)-terc-butil 28-amino-23(hidroximetil)-2,2-dimetil-4,10,13,16,19,22,25-heptaoxo-3,6-dioxa-

5,9,12,15,18,21,24-heptaazanonacosan-29-oato (4,8 g, 7,09 mmol), ácido 15-(ter-butóxi)-15-oxopentadecanoico (2,446 g, 7,45 mmol) e HATU (2,97 g, 7,80 mmol) a 0°C em uma atmosfera de nitrogênio. Mais 20 ml_ de DMF foram adicionados para solubilizar a mistura reacional que foi então deixada esquentar lentamente até a temperatura ambiente por uma noite. A reação foi então resfriada em um banho de gelo antes de ser resfriada bruscamente com gelo e deixada derreter enquanto a mistura era agitada vigorosamente. O sólido foi então filtrado para um sólido semelhante à goma (6,1 g) que foi transferido para SFC para purificação. Purificação por SFC deu (23S,28S)-terc-butil 28-(tercbutoxicarbonil)-23-(hidroximetil)-2,2-dimetil-4,10,13,16,19,22,25,30octaoxo-3,6-dioxa-5,9,12,15,18,21,24,29-octa-azatetratetracontan-44oato (2,5 g, 2,53 mmol, 35,7% de rendimento) como um sólido branco que foi usado na etapa seguinte. ¹H RMN (400 MHz, DMSO-de) δ 9,96 (br s, 1H), 8,23 - 8,02 (m, 1H), 7,97 (br d, J=7,5 Hz, 1 H), 7,84 (t, J=5,8 Hz, 1H), 4,96 (t, J=5,6 Hz, 1H), 4,32 - 4,21 (m, 1H), 4,17 - 4,03 (m, 1H), 3,85 (d, J=6,0 Hz, 1H), 3,76 (br d, J=5,1 Hz, 1H), 3,72 - 3,55 (m, 1H), 3,30 - 3,24 (m, 1H), 2,27 - 2,07 (m, 1H), 2,01 - 1,86 (m, 1H), 1,80 - 1,65 (m, 1H), 1,49 - 1,38 (m, 5H), 1,35 (br s, 1H), 1,29 - 1,16 (m, 4H). MS m/e 987,7 (M+H⁺).

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150/197 [00327] Ácido (17S,22S)-1-(amino-óxi)-22-carbóxi-17(hidroximetil)-4,7,10,13,16,19,24-heptaoxo-3,6,9,12,15,18,23heptaazaoctatriacontan-38-oico, composto A. (23S,28S)-terc-butil 28-(terc-butoxicarbonil)-23-(hidroximetil)-2,2-dimetil4,10,13,16,19,22,25,30-octaoxo-3,6-dioxa-5,9,12,15,18,21,24,29-octaazatetratetracontan-44-oato (2,5 g, 2,53 mmol) foi dissolvido em 25ml_ + 10ml_ de uma mistura de lavagem fria de 92:8 TFA:TIPS. A solução foi adicionada diretamente ao sólido branco e deixada agitar à temperatura ambiente por 3 horas. A solução foi resfriada para 0 °C e 320 ml_ de heptano: 40 ml_ de MTBE foram adicionados por uma noite antes de a solução ser transferida para a geladeira. Um óleo límpido havia se separado e ficou visível no fundo do balão. O sobrenadante foi removido e éter dietílico frio (1 L) foi adicionado. O sólido branco resultante foi agitado por 2 horas antes de ser rapidamente filtrado e secado em funil buchner para dar o ácido (17S,22S)-1-(amino-óxi)-22carbóxi-17-(h id roxi meti I )-4,7,10,13,16,19,24-heptaoxo3,6,9,12,15,18,23-hepta-azaoctatriacontan-38-oico 2,1 g (95 % de rendimento),1H RMN (400 MHz, DMSO-d₆) δ 8,42 - 8,34 (m, 1H), 8,20 7,95 (m, 3H), 4,81 - 4,74 (m, 1H), 4,61 (dd, J=10,9, 4,6 Hz, 1H), 4,48 (dd, J=10,8, 7,5 Hz, 1H), 4,30 - 4,03 (m, 1 H), 3,93 - 3,30 (m, 10H), 2,47 - 2,39 (m, 1H), 2,33 (dt, J=3,7, 1,9 Hz, 1H), 2,27 - 2,08 (m, 3H), 2,05 1,91 (m, 1H), 1,82 - 1,69 (m, 1 H), 1,52 - 1,43 (m, 2H), 1,24 (s, 9H), 1,21 -1,00 (m, 1H). Análise por HPLC com detecção por CAD indicaram 81 % de pureza, Agilent 1100 LC/UV/CAD, ACE C18-300 300 X 4,6 mm ID, 5μΐτι, A: Água 0,05% de TFA; B: ACN 0,05% de TFA.

Exemplo 6: Síntese em fase sólida de melhoradores farmacocinéticos adicionais [00328] Análise LCMS Condição A: Coluna: Waters Acuity UHPLC BEH C18, 2,1 x 50 mm, partículas de 1,7 pm; Fase móvel A: 5:95 acetonitrila:água com 0,05% de TFA; Fase móvel B: 95:5

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151/197 acetonitrila:água com 0,05% de TFA; Temperatura: 50°C; Gradiente: ΟΙ 00% de B durante 3 min, e então uma retenção de 1,0 min a 100% de B; Fluxo: 1 mL/min; Detecção: massa.

[00329] Análise LCMS Condição B: Coluna: Waters Acuity UHPLC BEH C18, 2,1 x 50 mm, partículas de 1,7 pm; Fase móvel A: 5:95 acetonitrila:água com 10 mM de acetato de amônio; Fase móvel B: 95:5 acetonitrila:água com 10 mM de acetato de amônio; Temperatura: 50°C; Gradiente: 0-100% de B durante 3 min, e então uma retenção de 1,0 min a 100% de B; Fluxo: 1,0 mL/min; Detecção: massa.

[00330] Análise UHPLC-ELSD Condição A: HPLC Condições: Coluna: Waters BEH C18, 150 x 2,1 mm, partículas de 1,7 pm; Fase móvel A: água com 0,05% de TFA, Fase móvel B: acetonitrila com 0,05% de TFA; Temperatura: 35°C; Perfil do gradiente: 10% de B a 50% de B de 0 min a 15 min, 50% de B a 60% de B de 16 min a 20 min, 60% de B a 95% de B de 21 min a 26 min e então uma retenção de 4,0 min a 95% de B; Tempo após a operação: 4 min (nas condições da fase móvel inicial); Fluxo taxa: 0,35 mL/min; Volume de injeção: 5 pL de amostra a 1 mg/mL em 50/50 MeCN/água; Condições de MS: Faixa da massa m/z 120 - 2000. lonização e modo: lonização por eletroaspersão, modo de ions positivos. Condições de ELSD: Ganho: 20. Temperatura do tubo de desvio: 60°C. Taxa de fluxo do gás: 40 psi.

[00331] Análise UHPLC-ELSD Condição B: HPLC Condições: Coluna: Waters BEH CSH C18, 150 x 2,1 mm, partículas de 1,7 pm; Fase móvel A: água com 0,05% de TFA, Fase móvel B: acetonitrila com 0,05% de TFA; Temperatura: 35°C; Perfil do gradiente: 10% de B a 95% de B de 0 min a 24 min, e então uma retenção de 3,0 min a 95% de B; Tempo após a operação: 4 min (nas condições da fase móvel inicial); Fluxo taxa: 0,35 mL/min; Volume de injeção: 2 pL de amostra a 1 mg/mL em 50/50 MeCN/água; Condições de MS: Faixa da massa m/z 120 2000. lonização e modo: lonização por eletroaspersão, modo de íons

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152/197 positivos. Condições de ELSD: Ganho: 50. Temperatura do tubo de desvio: 60°C. Taxa de fluxo do gás: 40 psi [00332] Análise UHPLC-CAD Condição C: Condições de HPLC: Coluna: Waters BEH Fenila, 150 x 2,1 mm, partículas de 1,7 pm; Fase móvel A: água com 0,05% de TFA, Fase móvel B: acetonitrila com 0,05% de TFA; Temperatura: 35°C; Perfil do gradiente: 10% de B a 95% de B de 0 min a 25 min, e então uma retenção de 2,0 min a 95% de B; Tempo após a operação: 4 min (nas condições da fase móvel inicial); Fluxo taxa: 0,35 mL/min; Volume de injeção: 5 μΙ_ de amostra a 1 mg/mL em MeOH; Condições de MS: Faixa da massa m/z 120 - 2000. lonização e modo: lonização por eletroaspersão, modo de íons positivos. Condições de CAD: Faixa: 100PA. Taxa de fluxo do gás: 35 psi.

[00333] Análise UHPLC-CAD Condição D: Condições de HPLC: Coluna: Waters BEH Fenila, 150 x 2,1 mm, partículas de 1,7 pm; Fase móvel A: água com 0,05% de TFA, Fase móvel B: acetonitrila com 0,05% de TFA; Temperatura: 35°C; Perfil do gradiente: 10% de B a 35% de B de 0 min a 15 min, 35% de B a 95% de B de 16 min a 25 min, e então uma retenção de 2,0 min a 95% de B; Tempo após a operação: 3 min (nas condições da fase móvel inicial); Fluxo taxa: 0,35 mL/min; Volume de injeção: 2 pL de amostra a 1 mg/mL em 50/50 MeOH/água; Condições de MS: Faixa da massa m/z 120 - 2000. lonização e modo: lonização por eletroaspersão, modo de íons positivos. Condições de CAD: Faixa: 100PA. Taxa de fluxo do gás: 35 psi

Síntese de PEG36-Glu^Y-Ci3-CH3(8).

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153/197

Ο

·' I

[00334] 2,5-Dioxopirrolidin-1 -il tetradecanoato (1). DCC em CH2CI2 (1 M, 99 mL, 99 mmol) foi adicionado a uma solução agitada de ácido tetradecanoico (20,55 g, 90 mmol) em DMF (100 mL). A mistura foi agitada à temperatura ambiente por uma noite, filtrada, concentrada e secada em alto vácuo. Os sólidos resultantes foram suspendidos em éter/hexanos (1:3, 80 mL) por 45 min, recolhidos por filtração e secados para dar 2,5-dioxopirrolidin-1 -il tetradecanoato (1) (16,96 g, 52,1 mmol, 58% de rendimento) como um sólido branco, que foi usado diretamente

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154/197 na etapa seguinte sem purificação posterior.

[00335] ácido (S)-5-(terc-Butóxi)-5-oxo-4tetradecanamidopentanoico (2). Água (150 ml) foi adicionada a uma mistura agitada de ácido (S)-4-amino-5-(terc-butóxi)-5-oxopentanoico (10,5 g, 51,7 mmol), 2,5-dioxopirrolidin-1-il tetradecanoato (1) (16,81 g, 51,7 mmol), e NaHCOs (5,21 g, 62,0 mmol) em DME (450 ml_). A solução límpida resultante foi agitada à temperatura ambiente por 4 h. O DME foi removido a vácuo, e então HCI aquoso (1 M, 67,2 ml, 67,2 mmol) foi adicionado para ajustar o pH em 2-3. A suspensão resultante foi agitada a 0°C por 30 min, e então filtrada. O sólido branco resultante foi secado azeotropicamente com DME (2x), e em seguida suspendido em éter/hexanos 1:3 (160 ml_) à temperatura ambiente por 1 h. O sólido branco resultante foi recolhido por filtração e secado em alto vácuo para dar o ácido (S)-5-(terc-butóxi)-5-oxo-4-tetradecanamidopentanoico (2) (8,5 g, 21 mmol, 40 % de rendimento), que foi usado diretamente na etapa seguinte sem purificação posterior.

[00336] (S)-l-terc-Butil 5-(2,5-dioxopirrolidin-1-il) 2tetradecanamidopentanodioato (3). DCC em CH2CI2 (1M, 26,6 ml_, 26,6 mmol) foi adicionado a uma mistura agitada de ácido (S)-5-(tercbutóxi)-5-oxo-4-tetradecanamidopentanoico (2) (10,0 g, 24,2 mmol), e 1 -hidroxipirrolidina-2,5-diona (3,06 g, 26,6 mmol) em DMF (30 mL) à temperatura ambiente. A mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente por uma noite, filtrada, e concentrada. O resíduo foi dissolvido em CH2CI2 e purificado por cromatografia rápida sobre sílica-gel, eluindo com EtOAc/hexanos (1:2) para dar 0 (S)-1-terc-butil 5-(2,5dioxopirrolidin-1-il) 2-tetradecanamidopentanodioato (3) (8,95 g, 17,5 mmol, 73% de rendimento) como um sólido branco. ¹H-RMN (CDCI3, 400 MHz) δ 6,29 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 4,58 (m, 1H), 2,82 (s, 4H), 2,70 (m, 1H), 2,63 (m, 1H), 2,29 (m, 1H), 2,20 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 2,06 (m, 1H), 1,60 (m, 2H), 1,46 (s, 9H), 1,25 (m, 20H), 0,86 (t, J = 6,3 Hz, 3H). ¹³C

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RMN (CDCh, 100 MHz) δ ppm 173,0, 170,3, 168,7, 167,6, 82,4, 51,2, 36,0, 31,5, 29,29. 29,27, 29,25, 29,11,28,97, 28,92, 27,6, 27,15, 27,10, 25,21,25,11,22,3, 13,7.

[00337] Composto 5. Água (4,5 mL) foi adicionada à temperatura ambiente a uma mistura agitada de composto 4 (750 mg, 0,448 mmol), (S)-1-terc-butil 5-(2,5-dioxopirrolidin-1-il) 2tetradecanamidopentanodioato 3 (297 mg, 0,582 mmol), e NaHCOs (75 mg, 0,90 mmol) em DME (13,5 mL). Depois que a solução límpida resultante foi agitada à temperatura ambiente por uma noite, HCI aquoso (1M, 0,896 mL, 0,896 mmol) foi adicionado, e a mistura foi concentrada a vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de fase reversa de pressão média em uma coluna C-18, eluindo com MeCN/NH4OAc aq. (monitorada por ELSD-MS). As frações contendo 0 produto desejado foram combinadas e os orgânicos voláteis foram removidos usando uma corrente de nitrogênio. A solução aquosa resultante contendo 0 produto desejado foi liofilizada para dar 0 composto do título 5 (610 mg, 66% de rendimento) como um sólido branco. (M+2H)²⁺ 1036, (M+3H)³⁺691.

[00338] Composto 6. DCC em CH2CI2 (1 M, 0,32 mL, 0,32 mmol) foi adicionado a uma mistura agitada de composto 5 (550 mg, 0,266 mmol), e 1 -hidroxipirrolidina-2,5-diona (36,7 mg, 0,319 mmol) em CH2CI2 (12 mL). A mistura foi agitada à temperatura ambiente por uma noite, filtrada, e concentrada a vácuo para dar 0 composto 6 como um sólido branco, que foi usado diretamente na etapa seguinte sem purificação posterior.

[00339] Composto 7. Água (2,5 mL) foi adicionada a uma mistura agitada de composto 6 (577 mg, 0,266 mmol), terc-butil 2aminoetoxicarbamato (Miao, Z.; Liu, J.; Norman, T.; Driver, R. WO 2006/069246) (70,3 mg, 0,399 mmol), e NaHCO3(33,5 mg, 0,40 mmol) em DME (7,5 mL) à temperatura ambiente. A mistura foi agitada à

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156/197 temperatura ambiente por uma noite e concentrada. O resíduo foi purificado por cromatografia de fase reversa de pressão média em uma coluna C-18, eluindo com MeCN/aq.NHhCI (monitorada por ELSD-MS). As frações contendo o produto desejado foram combinadas e os orgânicos voláteis foram removidos usando uma corrente de nitrogênio. A solução aquosa resultante contendo o produto desejado foi liofilizada para dar o composto do título 7 (360 mg, 61% de rendimento) como um sólido branco. (M+2H)²⁺ 1115, (M+3H)³⁺ 743.

[00340] Composto 8. TFA (2 mL) foi adicionado a uma mistura agitada de composto 7 (274 mg, 0,123 mmol), 1,4-dimetoxibenzeno (155 mg, 1,12 mmol) em CH2CI2 (2 mL) à temperatura ambiente. A mistura foi agitada à temperatura ambiente por 4 h, e em seguida concentrada. O resíduo foi purificado por cromatografia de fase reversa de pressão média em uma coluna C-18, eluindo com MeCN/aq.NFUCI (monitorada por ELSD-MS). As frações contendo 0 produto desejado foram combinadas e os orgânicos voláteis foram removidos usando uma corrente de nitrogênio. A solução aquosa resultante contendo 0 produto desejado foi liofilizada para dar 0 composto do título 8 (228 mg, 84% de rendimento) como um sólido branco. Sua pureza por UHPLC-ELSD foi determinada como sendo igual a 93,3% usando a Análise UHPLC-ELSD

Condição A. (M+2H)²⁺ 1037, (M+3H)³⁺ 691.

Síntese de PEG36-Glu^Y-Ci3-CO2H (16).

1,í «q. NsHCQx

ÍJM&HsO

RT, -SE h

100% í&jch, t-SuOH

SMAP, PhMe

35%

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157/197

NKS, DCC

CHjGlj

RT.'ieh '03% «ΓΧίί^ΕΓΚ.

T dmbh₂o [ <’ <^{J v} 90¾ ^cio^nto ^₀^x^C<^x₀^x_Xk..,_..----v₀.,--.^,Gnh₃

[00341] Ácido 14-(terc-Butóxi)-14-oxotetradecanoico (9). Um balão de fundo redondo de 1 L, secado com chama, foi carregado com ácido tetradecanodioico (21 g, 81 mmol), DMAP (9,93 g, 81 mmol) e tolueno (300 mL). Depois que a mistura foi agitada à temperatura ambiente por 15 min, 2-metilpropan-2-ol (11,7 mL, 122 mmol) e di-tercbutil dicarbonato (26,6 g, 122 mmol) foram adicionados. A mistura

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158/197 resultante foi agitada à temperatura ambiente por 30 min, e em seguida aquecida a 116°C por 15 h. A mistura foi concentrada, e o resíduo foi submetido à cromatografia rápida sobre sílica-gel, eluindo com EtOAc/hexanos (1:2) contendo 1% de HOAc, para dar o ácido 14-(tercbutóxi)-14-oxotetradecanoico (9) (9,0 g, 29 mmol, 35 % de rendimento). O material foi aproximadamente 80% puro por ¹H-RMN (a principal impureza sendo o éster di-terc-butílico), e foi usado diretamente na etapa seguinte sem purificado posterior.

[00342] terc-Butil 14-(2,5-dioxopirrolidin-1-il) tetradecanodioato (10). DCC em CH2CI2 (1M, 59,6 mL, 59,6 mmol) foi adicionado a uma solução agitada de ácido 14-(terc-butóxi)-14-oxotetradecanoico (9) (12,5 g, 39,8 mmol), e 1 -hidroxipirrolidina-2,5-diona (6,86 g, 59,6 mmol) em CH2CI2 (200 mL). A mistura foi agitada à temperatura ambiente por uma noite, filtrada, e concentrada. O resíduo foi purificado por cromatografia rápida sobre sílica-gel, eluindo com CH2CI2 para dar 0 1terc-butil 14-(2,5-dioxopirrolidin-1 -il) tetradecanodioato (10) (6,2 g, 15 mmol, 38 % de rendimento) como um sólido branco. ¹H-RMN (CDCI3, 400 MHz) δ 2,84 (br s, 4H), 2,60 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 2,20 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 1,74 (m, 2H), 1,57 (m, 2H), 1,44 (s, 9H), 1,40 (m, 2H), 1,26 (m, 14H). ¹³C-RMN (CDCI3, 100 MHz) d 173,4, 169,2, 168,7, 79,9, 35,6, 31,0, 29,54, 29,51,29,47, 29,34, 29,31,29,09, 28,8, 28,1,25,6, 25,1.

[00343] ácido (S)-5-(terc-Butóxi)-4-(14-(terc-butóxi)-14oxotetradecanamido)-5-oxopentanoico (11). Água (40 ml) foi adicionada a uma mistura agitada de ácido (S)-4-amino-5-(terc-butóxi)5-oxopentanoico (1,600 g, 7,87 mmol), 1-terc-butil 14-(2,5dioxopirrolidin-1 -il) tetradecanodioato (10) (3,6 g, 7,87 mmol), e NaHCOs (0,794 g, 9,45 mmol) em DME (120 mL). A solução límpida resultante foi agitada à temperatura ambiente por uma noite. O DME foi removido a vácuo, e HCI aquoso (1 M, 9,45 ml, 9,45 mmol) foi adicionado para ajustar 0 pH em 2-3. A mistura foi extraída com CH2CI2 (1 χ 250 mL, 2

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159/197 χ 50 ml_) ao passo que a camada aquosa foi saturada com NaCI sólido. As camadas orgânicas combinadas foram secadas sobre NazSCU, filtradas, concentradas e secadas em alto vácuo para dar o ácido (S)-5(terc-butóxi)-4-(14-(terc-butóxi)-14-oxotetradecanamido)-5oxopentanoico (11) (5,14 g, 10,3 mmol) como um sólido branco que foi usado diretamente na etapa seguinte sem purificação posterior.

[00344] (S)-l-terc-Butil 5-(2,5-dioxopiirolidin-1-il) 2-(14-(tercbutóxi)-14-oxotetradecanamido)pentanodioato (12). DCC em CH2CI2 (1 M, 11,8 ml_, 11,8 mmol) foi adicionado a uma solução agitada de ácido (S)-5-(terc-butóxi)-4-(14-(terc-butóxi)-14oxotetradecanamido)-5-oxopentanoico (11) (3,93 g, 7,87 mmol), e 1hidroxipirrolidina-2,5-diona (1,359 g, 11,81 mmol) em CH2CI2 (100 ml_). A mistura foi agitada à temperatura ambiente por 20 h, e em seguida filtrada. O filtrado foi concentrado a vácuo, e 0 resíduo foi purificado por cromatografia rápida sobre sílica-gel, eluindo com EtOAc/CHkCh (1:19) para dar 0 (S)-1 -terc-butil 5-(2,5-dioxopirrolidin-1-il) 2-(14-(terc-butóxi)14-oxotetradecanamido)pentanodioato (12) (3,2 g, 68% de rendimento). ¹H-RMN (CDCI3, 400 MHz) δ 6,27 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 4,59 (m, 1H), 2,84 (s, 4H), 2,71 (m, 1H), 2,63 (m, 1H), 2,31 (m, 1H), 2,22 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 2,18 (d, J = 7,8 Hz, 2H), 2,08 (m, 1H), 1,58 (m 4H), 1,47 (s, 9H), 1,43 (s, 9H), 1,25 (m, 16H). ¹³C-RMN (CDCI3, 100 MHz) d 173,41, 173,37, 170,7, 169,1, 168,0, 82,8, 79,9, 51,6, 36,4, 35,6, 29,58, 29,47, 29,35, 29,30, 29,10, 28,12, 27,99, 27,55, 27,50, 25,59, 25,48, 25,13.

[00345] Composto 13. Água (4 ml_) foi adicionada a uma mistura agitada de composto 4 (750 mg, 0,448 mmol) (adquirido na Quanta BioDesign, Powell, Ohio), (S)-1-terc-butil 5-(2,5-dioxopirrolidin-1-il) 2(14-(terc-butóxi)-14-oxotetradecanamido)pentanodioato (12) (401 mg, 0,672 mmol), e NaHCOs (45,1 mg, 0,537 mmol) em DME (12 ml_). Depois que a mistura foi agitada à temperatura ambiente por uma noite, HCI aquoso (1M, 0,537 ml_, 0,537 mmol) foi adicionado. A mistura foi

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160/197 concentrada a vácuo, e o resíduo foi purificado por cromatografia de fase reversa de pressão média em uma coluna C-18, eluindo com MeCN/aq.NHhCI (monitorada por ELSD-MS). As frações contendo o produto desejado foram combinadas e os orgânicos voláteis foram removidos usando uma corrente de nitrogênio. A solução aquosa resultante contendo o produto desejado foi liofilizada para dar o composto do título 13 (870 mg, 90% de rendimento) como um sólido branco. (M+2H)²⁺ 1079, (M+3H)³⁺ 719.

[00346] Composto 14. DCC em CH2CI2 (1 M, 0,605 ml_, 0,605 mmol) foi adie ionado a uma mistura agitada de composto 13 (870 mg, 0,403 mmol), e 1 -hidroxipirrolidina-2,5-diona (69,6 mg, 0,605 mmol) em CH2CI2 (10 ml_) à temperatura ambiente. A mistura foi agitada à temperatura ambiente por uma noite, filtrada, concentrada e secada em alto vácuo para dar 0 composto 14 como um sólido branco que foi usado diretamente na etapa seguinte sem purificação posterior.

[00347] Composto 15. Água (4 ml_) foi adicionada a uma mistura agitada de composto 14 (908 mg, 0,403 mmol), e terc-butil 2aminoetoxicarbamato (2) (142 mg, 0,806 mmol) em DME (12 mL) à temperatura ambiente. A mistura foi agitada à temperatura ambiente por uma noite, concentrada, e 0 resíduo foi purificado por cromatografia de fase reversa de pressão média em uma coluna C-18, eluindo com MeCN/aq.NHhCI (Coluna: Teledyne Isco C18 Redi SepRf High performance Gold; Detector: ELSD; Taxa: 60 mL/min; Solvente A: 95% de H2O, 5% de MeCN 10 mM de NH4OAC; Solvente B: 5% de H2O, 95% de MeCN, 10 mM de NH4OAC). As frações contendo 0 produto desejado foram combinadas e os orgânicos voláteis foram removidos usando uma corrente de nitrogênio. A solução aquosa resultante contendo 0 produto desejado foi liofilizada para dar 0 composto do título 15 (730 mg, 78% de rendimento) como um sólido branco. (M+2H)²⁺1158, (M+3H)³⁺ 772. [00348] Composto 16. TFA (8 mL, 104 mmol) foi adicionado a uma

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161/197 mistura agitada de composto 15 (420 mg, 0,181 mmol), e 1,4dimetoxibenzeno (201 mg, 1,451 mmol) em CH2CI2 (8 mL) à temperatura ambiente. A mistura foi agitada à temperatura ambiente por 3 h, concentrada, e 0 resíduo foi purificado por cromatografia de fase reversa de pressão média em uma coluna C-18, eluindo com MeCN/aq.NHhCI (monitorada por ELSD-MS). As frações contendo 0 produto desejado foram combinadas e os orgânicos voláteis foram removidos usando uma corrente de nitrogênio. A solução aquosa resultante contendo 0 produto desejado foi liofilizada para dar 0 composto do título 16 (240 mg, 63% de rendimento) como um sólido branco. Sua pureza por UHPLC-ELSD foi determinada como sendo igual a 75,2% usando a Análise UHPLC-ELSD Condição B. (M+2H)²⁺ 1052, (M+3H)³⁺ 701.

Síntese de Espermina-Glu^Y-Ci4-CO2H (27)

NaHCO-,

R.T, 16h

100% rtndffltnto

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162/197

TFA, δΤΤ, Et_aSiH

RT.

2t%

[00349] terc-butil (4-((3-aminopropil)(tercbutóxicarbonil)amino)butil)(3(((benziloxi)carbonil)amino)propil)carbamato (18). Água (100 mL) foi adicionada a uma mistura de N-(benziloxicarboniloxi)succinimida (16,6 g, 66,4 mmol), di-terc-butil butano-1,4-diilbis((3-aminopropil)carbamato) (17) (Stromgaard, K; Bjornsdottir, I; eersen, K; Brierley, M. J.; Rizoli, S.; Eldursi, N; Mellor, I,. R.; 4 Peter N.R. Usherwood, P. N. R.; Hansen, S.

H.; Krogsgaard-Larsen, P.; Jaroszewski, J. W. Chirality, 2000, 12, 93)

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163/197 (19,1 g, 47,4 mmol) em THF (300 ml_). Depois de a mistura ser agitada à temperatura ambiente por uma noite, todo o THF foi removido a vácuo e a mistura foi extraída com CH2CI2 (350 ml, 100 ml x 2) ao passo que a camada aquosa foi saturada com NaCI sólido. As camadas orgânicas combinadas foram secadas sobre NazSCU, filtrada, concentrada a vácuo, e purificadas por cromatografia rápida eluindo com 2M de NH3MeOH/CH2Cl2 (de 1:19 a 1:9) para dar 0 terc-butil (4-((3aminopropil)(terc-butoxicarbonil)amino)butil)(3(((benzilóxi)carbonil)amino)propil)carbamato (18) (5,19 g, 9,67 mmol, 20,4% de rendimento). ¹H-RMN (400 MHz, CDCI3) δ ppm 7,22 - 7,40 (m, 5 H), 5,01 - 5,12 (m, 2 H), 3,34 - 3,48 (m, 4 H), 3,01 - 3,31 (m, 5 H), 2,65 (br t, J=6,60 Hz, 2 H), 1,86 - 2,19 (m, 4 H), 1,55 - 1,75 (m, 4 H), 1,43 - 1,50 (m, 4 H), 1,43 (s, 9 H), 1,42 (s, 9 Η). O espetro de ¹³C-RMN foi muito complexo devido à presença de rotâmeros.

[00350] 1-(terc-butil) 15-(2,5-dioxopirrolidin-1-il) pentadecanodioato (19). Uma mistura de ácido 15-(terc-butóxi)-15oxopentadecanoico (Composto 1 in Exemplo 4) (3,28 g, 10,0 mmol), 1hidroxipirrolidina-2,5-diona (1,73 g, 15,0 mmol), e EDC (2,88 g, 15,0 mmol) em CH2CI2 (100 ml_) foi agitada à temperatura ambiente por 16 h. Ela foi então diluída com CH2CI2 (200 ml_), e lavada com salmoura/água (1:1) duas vezes, secada sobre Na2SO4, filtrada, concentrada, e secada em alto vácuo para dar 0 1-terc-butil 15-(2,5dioxopirrolidin-1 -il) pentadecanodioato (19) (4,26 g, 10,0 mmol, 100 % de rendimento), que foi usado diretamente na etapa seguinte.

[00351 ] (S)-5-(terc-butóxi)-4-(15-(terc-butóxi)-15oxopentadecanamido)-5-oxopentanoico acid (20). Uma solução de NaHCOs (1,01 g, 12,0 mmol) em água (30 ml_) foi adicionada a uma mistura de ácido (S)-4-amino-5-(terc-butóxi)-5-oxopentanoico (2,44 g, 12,0 mmol), e 1-terc-butil 15-(2,5-dioxopirrolidin-1 -il) pentadecanodioato (19) (4,26 g, 10,0 mmol) em DME (90 ml_). Depois que a mistura foi

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164/197 agitada à temperatura ambiente por 16 h, todo o DME foi removido a vácuo, o pH foi ajustado em 2-3, e a mistura foi extraída com CH2CI2 (350 ml_, 150 ml_). As camadas orgânicas combinadas foram secadas sobre Na₂SO4, filtradas, concentradas e secadas em alto vácuo para dar 0 ácido (S)-5-(terc-butóxi)-4-(15-(terc-butóxi)-15-oxopentadecanamido)5-oxopentanoico (20) (5,14 g, 10,0 mmol, 100% de rendimento), que foi usado diretamente na etapa seguinte.

[00352] l-(terc-butil) 5-(2,5-dioxopirrolidin-1-il) (15-(terc-butóxi)15-oxopentadecanoil)-L-glutamato (21). Uma mistura de ácido (S)-5(terc-butóxi)-4-(15-(terc-butóxi)-15-oxopentadecanamido)-5oxopentanoico (20) (5,14 g, 10,0 mmol), 1 -hidroxipirrolidina-2,5-diona (1,73 g, 15,0 mmol), EDC (2,88 g, 15,0 mmol) em CH2CI2 (100 mL) foi agitada à temperatura ambiente por 16 h. Ela foi então diluída com CH2CI2 (200 mL), e lavada com salmoura/água (1:1) duas vezes. A camada orgânica foi secada sobre Na₂SO4, filtrada, concentrada a vácuo, e 0 resíduo foi submetido à cromatografia rápida eluindo com EtOAc/CH₂CI₂ para dar (S)-1 -terc-butil 5-(2,5-dioxopirrolidin-1-il) 2-(15(terc-butóxi)-15-oxopentadecanamido)pentanodioato (21) (3,41 g, 5,58 mmol, 55,8% de rendimento) (55,8% de rendimento em 3 etapas) como um sólido branco. ¹H-RMN (400 MHz, CDCI3) δ ppm 6,20 (br d, J=7,82 Hz, 1 H), 4,62 (td, J=7,95, 4,89 Hz, 1 H), 2,80 - 2,91 (m, 4 H), 2,56 - 2,79 (m, 2 H), 2,29 - 2,42 (m, 1 H), 2,17 - 2,28 (m, 4 H), 2,02 - 2,16 (m, 1 H), 1,54 - 1,69 (m, 4 H), 1,48 - 1,53 (m, 9 H), 1,44 - 1,48 (m, 9 H), 1,21 1,39 (m, 18 H). ¹³C-RMN (101 MHz, CDCI3) δ ppm 173,35, 173,33, 170,66, 168,95, 168,01,82,82, 79,85, 51,66, 36,46, 35,66, 29,61,29,49, 29,35, 29,31,29,12, 28,15, 28,00, 27,62, 27,54, 25,60, 25,48, 25,15.

[00353] terc-butil (S)-8,13,21 -tris(terc-butóxicarbonjl)-3,18,23trioxo-1 -fenil-2-oxa-4,8,13,17,22-penta-aza-heptatriacontan-37-oato (22). Água (20 mL) foi adicionada a uma mistura de terc-butil (4-((3aminopropil)(terc-butóxicarbonil)amino)butil)(3Petição 870190074948, de 05/08/2019, pág. 184/421

165/197 (((benzilóxi)carbonil)amino)propil)carbamato (18) (1,42 g, 2,65 mmol), (S)-1 -terc-buti I 5-(2,5-dioxopi rrol idi n-1 -il) 2-(15-(terc-butóxi)-15oxopentadecanamido)pentanodioato (21) (1,62 g, 2,65 mmol) em DME (60 ml_). Depois que a mistura foi agitada à temperatura ambiente por uma noite, todos os componentes voláteis (inclusive a água) foram removidos em alto vácuo, e o resíduo foi secado azeotropicamente com MeOH (2 x). O resíduo foi dissolvido em MeOH/CHECh (1:9, <10 ml_) e submetido à cromatografia rápida, eluindo com MeOH/CHkCh para dar o (S)-terc-butiI 8,13,21 -tris(terc-butóxicarbonil)-3,18,23-trioxo-1 -fenil-2oxa-4,8,13,17,22-penta-aza-heptatriacontan-37-oato (22) (2,74 g, 2,65 mmol, 100% de rendimento) como um líquido viscoso. ¹H-RMN (400 MHz, CDCI₃) δ ppm 7,29 - 7,39 (m, 5 H), 7,12 - 7,25 (m, 1 H), 6,69 - 6,89 (m, 1 H), 5,67 - 5,95 (m, 1 H), 5,03 - 5,15 (m, 2 H), 4,30 - 4,47 (m, 1 H), 3,38 - 3,54 (m, 8 H), 3,05 - 3,32 (m, 8 H), 2,12 - 2,35 (m, 6 H), 1,86 2,05 (m, 1 H), 1,51-1,76 (m, 7 H), 1,45 (s, 9 H), 1,44 (s, 27 H), 1,171,33 (m, 20 Η). O espectro de ¹³C-RMN foi muito complexo devido à presença de rotâmeros.

[00354] terc-butil (S)-5-(3-aminopropil)-10,18-bis(tercbutóxicarbonil)-2,2-dimetil-4,15,20-trioxo-3-oxa-5,10,14,19-tetraazatetratriacontan-34-oato (23). Uma mistura de (S)-terc-butil 8,13,21 -tris(terc-butóxicarboni I )-3,18,23-trioxo-1 -fenil-2-oxa4,8,13,17,22-penta-aza-heptatriacontan-37-oato (22) (1,36 g, 1,32 mmol), e Pd-C (0,140 g, 10% em peso) em etanol (100 ml_) foi hidrogenada em um agitador Parr (H2, 2,07 bar (30 psi)) por 18 h à temperatura ambiente. A mistura foi filtrada, lavada com EtOH, concentrada e secada em alto vácuo para dar 0 (S)-terc-butil 5-(3aminopropil)-10,18-bis(terc-butóxicarbonil)-2,2-dimetil-4,15,20-trioxo-3oxa-5,10,14,19-tetra-azatetratriacontan-34-oato (23) (1,19 g, 1,32 mmol, 100 % de rendimento), que foi usado diretamente na etapa seguinte. ¹H-RMN (400 MHz, CDCI3) δ ppm 6,91 - 7,09 (m, 1 H), 6,46

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6,73 (m, 1 Η), 4,34 - 4,54 (m, 1 Η), 3,66 - 3,81 (m, 1 Η), 3,10 - 3,36 (m, 10 Η), 2,82 - 2,93 (m, 2 Η), 2,58 - 2,67 (m, 3 Η), 2,13 - 2,36 (m, 6 Η), 1,55 - 1,72 (m, 6 Η), 1,49 - 1,53 (m, 4 Η), 1,48 (s, 9 Η), 1,47 (d, J=3,18 Hz, 27 H), 1,22 - 1,37 (m, 20 Η). O ¹³C-RMN spectra foi muito complexo devido à presença de rotâmeros.

[00355] Ácido (S)-20,28,33-tris(terc-butóxicarbonjl)-2,2-dimetil· 4,18,23,38-tetraoxo-3-oxa-19,24,28,33,37-penta-azahentetracontan-41-oico (24). Piridina (13 mL) foi adicionada a uma mistura de (S)-terc-butil 5-(3-aminopropil)-10,18-bis(tercbutóxicarbonil)-2,2-dimetil-4,15,20-trioxo-3-oxa-5,10,14,19-tetraazatetratriacontan-34-oato (23) (1,19 g, 1,32 mmol), e dihidrofuran-2,5diona (0,66 g, 6,6 mmol). Depois que a mistura foi agitada à temperatura ambiente por 16 h, todos os componentes voláteis foram removidos a vácuo, e o resíduo foi submetido à cromatografia rápida eluindo com MeOH/CH2Cl2 contendo 0,5% de AcOH para dar o ácido (S)-20,28,33tris(terc-butóxicarbonil)-2,2-dimetil-4,18,23,38-tetraoxo-3-oxa19,24,28,33,37-penta-aza-hentetracontan-41-oico (24) (1,32 g, 1,32 mmol, 100% de rendimento) como um líquido viscoso. ¹H-RMN (400 MHz, CLOROFÓRMIO-cZ) δ ppm 4,38 - 4,50 (m, 1 H), 3,47 - 3,58 (m, 1 H), 3,09 - 3,32 (m, 9 H), 2,75 (s, 4 H), 2,64 - 2,73 (m, 2 H), 2,46 - 2,59 (m, 2 H), 2,27 - 2,35 (m, 2 H), 2,17 - 2,27 (m, 4 H), 2,07 - 2,14 (m, 4 H), 1,83 - 2,04 (m, 1 H), 1,67 - 1,80 (m, 3 H), 1,55 - 1,66 (m, 4 H), 1,41 1,54 (m, 38 H), 1,19- 1,37 (m, 20 H).

[00356] 21,36-di-terc-butil 1-(2,5-dioxopiirolidin-1-il) (S)-8,13bis(terc-butóxicarbonil)-3,18,23-trioxo-4,8,13,17,22-penta-azahexatriacontano-1,21,36-tricarboxilato (25). DCC em CH2CI2 (1,0 M, 2,0 mL, 2,0 mmol) foi adicionado a uma mistura de ácido (S)-20,28,33tris(terc-butóxicarbonil)-2,2-dimetil-4,18,23,38-tetraoxo-3-oxa19,24,28,33,37-penta-aza-hentetracontan-41-oico (24) (1,32 g, 1,32 mmol), 1 -hidroxipirrolidina-2,5-diona (0,23 g, 2,0 mmol) em CH2CI2 (20

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167/197 mL). Depois que a mistura foi agitada à temperatura ambiente por 16 h, ela foi filtrada, concentrada, e secada em alto vácuo para dar o 21,36di-terc-butil 1-(2,5-dioxopirrolidin-1-il) (S)-8,13-bis(terc-butóxicarbonil)3,18,23-trioxo-4,8,13,17,22-penta-aza-hexatriacontane-1,21,36tricarboxilato (25) (1,45 g, 1,32 mmol, 100% de rendimento), que foi usado diretamente na etapa seguinte.

[00357] terc-butil (S)-18,23,31-tris(terc-butóxicarbonil)-2,2dimetil-4,10,13,28,33-pentaoxo-3,6-dioxa-5,9,14,18,23,27,32-heptaaza-heptatetracontan-47-oato (26). Uma solução de NaHCOs (0,233 g, 2,77 mmol) em água (4 mL) foi adicionada a uma mistura de (S)-

21.36- di-terc-butil 1-(2,5-dioxopirrolidin-1-il) 8,13-bis(tercbutóxicarbonil)-3,18,23-trioxo-4,8,13,17,22-penta-aza-hexatriacontano-

1.21.36- tricarboxilato (25) (1,45 g, 1,32 mmol), e cloridrato de terc-butil 2-aminoetoxicarbamato (0,561 g, 2,64 mmol) em DME (12 mL) à temperatura ambiente. Depois que a mistura foi agitada à temperatura ambiente por 6 h, todos os componentes voláteis, inclusive a água, foram removidos a vácuo, e o resíduo foi secado azeotropicamente com THF. O resíduo foi submetido à cromatografia rápida eluindo com MeOH/CHECh para dar o terc-butil (S)-18,23,31-tris(terc-butóxicarbonil)2,2-dimetil-4,10,13,28,33-pentaoxo-3,6-dioxa-5,9,14,18,23,27,32hepta-aza-heptatetracontan-47-oato (26) (0,87 g, 0,75 mmol, 57% de rendimento) como um líquido viscoso. ¹H-RMN (400 MHz, CDCh) δ ppm 4,33 - 4,48 (m, 1 H), 3,80 - 3,94 (m, 4 H), 3,42 - 3,55 (m, 14 H), 3,08 - 3,32 (m, 7 H), 2,68 - 2,77 (m, 4 H), 2,50 - 2,63 (m, 4 H), 2,13 2,34 (m, 4 H), 1,54 - 1,74 (m, 6 H), 1,43 - 1,53 (m, 45 H), 1,22 - 1,35 (m, 20 Η). O espectro de ¹³C-RMN foi muito complexo devido à presença de rotâmeros.

[00358] Ácido (S)-1-(amino-óxi)-25-carbóxi-4,7,22,27-tetraoxo3,8,12,17,21,26-hexa-aza-hentetracontan-41-oico (27). A uma mistura de (S)-terc-butil 18,23,31-tris(terc-butóxicarbonil)-2,2-dimetil

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4,10,13,28,33-pentaoxo-3,6-dioxa-5,9,14,18,23,27,32-hepta-azaheptatetracontan-47-oato (26) (0,50 g, 0,43 mmol), e DTT (0,067 g, 0,43 mmol) em TFA (1,5 ml), foram adicionados trietilsilano (0,10 ml, 0,63 mmol) e água (0,10 mL, 5,6 mmol). A mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente por 2 h, e em seguida todos os componentes voláteis foram removidos usando uma corrente de N2 por uma noite. O resíduo foi submetido à purificação por LC/MS preparatória usando as seguintes condições: Coluna: Waters CSH C18,19x200 mm, partículas de 5 pm; Fase móvel A: 5:95 acetonitrila: água com 0,1% de ácido trifluoroacético; Fase móvel B: 95:5 acetonitrila: água com 0,1% de ácido trifluoroacético; Gradiente: 0-35% de B durante 25 minutos, e então uma retenção de 5 minutos a 100% de B; Fluxo: 20 mL/min. As frações contendo 0 produto desejado foram combinadas e os componentes orgânicos voláteis foram removidos usando uma corrente de nitrogênio. A solução aquosa resultante contendo 0 produto desejado foi resfriado para -78°C em uma corrente de nitrogênio e liofilizado para dar 0 composto do título (27) como um sólido branco (72 mg, 21% de rendimento). Sua pureza por LC-CAD foi determinada como sendo igual a 94,9% usando a Análise UHPLC-CAD Condição C. [MH]⁺ 745,09.

Condição de análise A: Tempo de retenção = 1,27 min; ESI-MS (MH)⁺ = 744,55.

Condição de análise B: Tempo de retenção = 1,20 min; ESI-MS (MH)⁺ = 744,40.

Síntese do Composto 39:

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MeO-·:/ 'ΐ-ΩΜβ

TFA/CK₂CI₂ (1:1)

RT. _ ¢1% rend:mints

[00359] l-(terc-butil)

18-(2,5-dioxopirrolidin-1 -il) octadecanodioato (29). EDC (1,406 g, 7,33 mmol) foi adicionado a uma

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170/197 mistura de ácido 18-(terc-butóxi)-18-oxo-octadecanoico (28) (preparado por método similar àquele usado para preparar o Composto 1 no Exemplo 4) (2,09 g, 5,64 mmol), e 1 -hidroxipirrolidina-2,5-diona (0,844 g, 7,33 mmol) em CH2CI2 (40 ml_). A mistura foi agitada à temperatura ambiente por uma noite, diluída com CH2CI2 (100 ml_) e lavada com NaHCOs. Depois da separação, a camada aquosa foi extraída com CH2CI2 (80 ml_ x 2). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura, secadas sobre Na2SO4, filtradas, e concentradas a vácuo. O resíduo foi submetido à cromatografia rápida eluindo com CH2CI2 para dar 0 1-terc-butil 18-(2,5-dioxopirrolidin-1 -il) octadecanodioato (29) (2,13 g, 4,55 mmol, 81 % de rendimento) como um sólido branco. ¹H-RMN (400 MHz, CDCI3) δ 2,85 (br s, 4H), 2,62 (t, J=7,5 Hz, 2H), 2,22 (t, J=7,6 Hz, 2H), 1,77 (quin, J=7,5 Hz, 2H), 1,67 1,54 (m, 3H), 1,50 - 1,37 (m, 10H), 1,37 - 1,21 (m, 22H). ¹³C-RMN (101 MHz, CDCI3) δ ppm 173,33, 169,12,168,67, 79,85, 35,67, 30,98, 29,65 (br s), 29,62 (br s), 25,61, 29,55, 29,50, 29,36, 29,31, 29,12, 29,09, 28,81,28,15, 25,15, 24,60.

[00360] terc-butil (S)-18-((6-(((benzilóxi)carbonil)amino)-1 -(tercbutóxi)-1 -oxo-hexan-2-il)amino)-18-oxo-octadecanoato (30). NaHCOs (0,41 g, 4,83 mmol) foi adicionado a uma mistura de 1-tercbutil 18-(2,5-dioxopirrolidin-1 -il) octadecanodioato (29) (1,13 g, 2,416 mmol), e cloridrato de Lys(N^£-CBZ)-O^fBu (1,17 g, 3,14 mmol) em DME (60 ml_) e água (20 ml_). A suspensão clara resultante foi agitada à temperatura ambiente por uma noite. O DME foi removido a vácuo, e em seguida HCI aquoso (1 M, 4,83 ml_, 4,83 mmol) foi adicionado para ajustar 0 pH em 2-3. A mistura foi extraída com EtOAc (200 ml_, 100 ml_ x 2). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura, secadas sobre NazSCU, filtradas, concentradas a vácuo e submetidas à cromatografia rápida eluindo com EtOAc/CHzCh para dar 0 (S)-terc-butiI 18-((6-(((benzilóxi)carbonil)amino)-1 -(terc-butóxi)-l-oxo

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171/197 hexan-2-il)amino)-18-oxo-octadecanoato (30) (1,66 g, 2,42 mmol, 100% de rendimento) como um líquido viscoso incolor. ¹H-RMN (400 MHz, CDCI₃) δ ppm 7,29 - 7,38 (m, 5 H), 6,08 (br d, J=7,34 Hz, 1 H), 5,06 5,19 (m, 2 H), 4,84 - 5,02 (m, 1 H), 4,48 (td, J=7,70, 5,14 Hz, 1 H), 3,07 -3,27 (m, 2 H), 2,15-2,24 (m, 4 H), 1,75- 1,88 (m, 1H), 1,49- 1,70 (m, 7 H), 1,46 (s, 9 H), 1,44 (s, 9 H), 1,20 - 1,34 (m, 26 H). ¹³C-RMN (101 MHz, CDCI3) δ ppm 173,30, 172,87, 171,81, 171,05, 156,49, 136,67,

128.47, 128,03, 82,03, 79,82, 66,55, 60,35, 52,24, 40,66, 36,65, 35,64, 32,35, 29,67, 29,64, 29,61, 29,50, 29,48, 29,44, 29,33, 29,29, 29,10, 28,13, 28,00, 25,63, 25,13, 22,25, 21,00, 14,19. [MH]⁺689,62.

[00361 ] terc-butil (S)-18-((6-amino-1 -(terc-butóxi)-l-oxo-hexan-2il)amino)-18-oxo-octadecanoato (31). Uma mistura de (S)-terc-butil 18-((6-(((benzilóxi)carbonil)amino)-1 -(terc-butóxi)-l -oxo-hexan-2il)amino)-18-oxo-octadecanoato (30) (1,060 g, 1,2 mmol), e Pd-C (0,128 g, 1,200 mmol) em EtOH (50 ml_) foi hidrogenada (balão) por uma noite à temperatura ambiente. Depois de vários ciclos de purga a vácuo com nitrogênio, a mistura reacional foi filtrada com cautela, e lavada com EtOH. O filtrado foi concentrado e secado em alto vácuo para dar (31) (S)-terc-buti I 18-((6-amino-1 -(terc-butóxi)-l -oxo-hexan-2-il)amino)-18oxo-octadecanoato (0,67 g, 1,2 mmol, 100 % de rendimento) como um líquido incolor, que foi usado diretamente na etapa seguinte. ¹H-RMN (400 MHz, CDCI3) δ ppm 6,40 - 6,59 (m, 1 H), 4,30 - 4,50 (m, 1 H), 3,16 - 3,37 (m, 2 H), 2,65 - 2,81 (m, 2 H), 2,10 - 2,25 (m, 4 H), 1,72 - 1,84 (m, 1 H), 1,47 - 1,67 (m, 7 H), 1,43 (s, 9 H), 1,41 (s, 9 H), 1,22 - 1,36 (m, 26 H). ¹³C-RMN (CDCI3) δ ppm 173,53, 173,48, 171,90, 82,10, 79,95,

52.47, 50,19, 40,80, 36,50, 35,62, 32,11, 30,66, 29,63, 29,60, 29,56,

29.48, 29,44, 29,33, 29,25, 29,05, 28,07, 27,94, 25,66, 25,09, 22,41. [MH]⁺ 555,63.

[00362] terc-butil (S)-19-(terc-butóxicarbonil)-1 -(9H-fluoren-9-il)3,13,21 -trioxo-2,7,10-trioxa-4,14,20-triazaoctatriacontan-38-oato

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172/197 (32). NaHCO₃ (0,202 g, 2,40 mmol) foi adicionado a uma mistura de 2,5-d ioxopi rrol idi n-1 -il 1 -(9H-fluoren-9-il)-3-oxo-2,7,10-trioxa-4azatridecan-13-oato (0,715 g, 1,44 mmol), (S)-terc-butil 18-((6-amino-1(terc-butóxi)-l-oxo-hexan-2-il)amino)-18-oxo-octadecanoato (31) (0,67 g, 1,2 mmol) em DME (15 ml_) e água (5). Depois de agitar à temperatura ambiente por uma noite, todos os componentes voláteis foram removidos a vácuo, e o resíduo foi submetido à cromatografia rápida, eluindo com EtOAc/CHkCh para dar o (S)-terc-butil 19-(tercbutóxicarbonil)-1 -(9H-f I uoren-9-i I )-3,13,21 -trioxo-2,7,10-trioxa-4,14,20triazaoctatriacontan-38-oato (32) (1,12 g, 1,20 mmol, 100 % de rendimento) como um líquido viscoso incolor. ¹H-RMN (400 MHz, CDCI₃) δ ppm 7,78 (d, J=7,58 Hz, 2 H), 7,63 (d, J=7,34 Hz, 2 H), 7,37 7,47 (m, 2 H), 7,30 - 7,36 (m, 2 H), 6,21 - 6,37 (m, 1 H), 6,00 - 6,17 (m, 1 H), 5,43 - 5,63 (m, 1 H), 4,40 - 4,54 (m, 3 H), 4,19 - 4,33 (m, 1 H), 3,75 (t, J=5,87 Hz, 2 H), 3,53 - 3,68 (m, 6 H), 3,42 (br d, J=4,89 Hz, 2 H), 3,22 (q, J=6,28 Hz, 2 H), 2,44 (br t, J=5,38 Hz, 2 H), 2,22 (t, J=7,58 Hz, 4 H), 1,75 - 1,89 (m, 1 H), 1,55 - 1,69 (m, 7 H), 1,47 (s, 9 H), 1,46 (s, 9 H), 1,20 - 1,35 (m, 26 H). ¹³C-RMN (101 MHz, CDCI3) δ ppm 173,34, 173,01, 171,82, 171,38, 156,56, 143,99, 141,34, 127,70, 127,05, 125,06, 119,98, 82,07, 79,87, 70,25, 70,12, 70,05, 67,29, 66,63, 52,27, 47,33, 40,86, 38,99, 37,03, 36,67, 35,67, 32,45, 29,70, 29,67, 29,64, 29,63, 29,53, 29,51, 29,38, 29,33, 29,13, 29,03, 28,15, 28,04, 25,68, 25,16, 22,47. [MH]⁺ 936,80.

[00363] terc-butil (S)-1-amino-15-(terc-butóxicarbonil)-9,17dioxo-3,6-dioxa-10,16-diazatetratriacontan-34-oato (33). Et₃N (2,5 ml_, 18 mmol) foi adicionado a uma mistura de (S)-terc-butil 19-(tercbutóxicarbonil)-1 -(9H-f I uoren-9-i I )-3,13,21 -trioxo-2,7,10-trioxa-4,14,20triazaoctatriacontan-38-oato (32) (1,12 g, 1,20 mmol) em DMF (10 mL). Depois que a mistura foi agitada à temperatura ambiente por uma noite, mais Et₃N (1,0 mL, 7,2 mmol) foi adicionado. A mistura foi agitada à

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173/197 temperatura ambiente por mais 7 h. Todos os componentes voláteis foram removidos a vácuo, e o resíduo foi secadas em alto vácuo para dar (S)-terc-butiI 1 -amino-15-(terc-butóxicarbonil)-9,17-dioxo-3,6-dioxa-

10,16-diazatetratriacontan-34-oato (33) (0,857 g, 1,20 mmol, 100 % de rendimento) como um líquido incolor, que foi usado diretamente na etapa seguinte. [MH]⁺ 714,70.

[00364] terc-butil (S)-39-(terc-butóxicarbonil)-1 -(9H-fluoren-9-il)3,13,23,33,41 -pentaoxo-2,7,10,17,20,27,30-heptaoxa-4,14,24,34,40pentaazaoctapentacontan-58-oato (34). NaHCCh (0,20 g, 2,4 mmol) foi adicionado a uma mistura de 2,5-dioxopirrolidin-1-il 1-(9H-fluoren-9il)-3-oxo-2,7,10-trioxa-4-azatridecan-13-oato (0,715 g, 1,44 mmol), (S)terc-butil 1 -amino-15-(terc-butóxicarbonil)-9,17-dioxo-3,6-dioxa-10,16diazatetratriacontan-34-oato (33) (0,857 g, 1,20 mmol) em DME (15 mL) e água (5 mL). Depois que a mistura foi agitada à temperatura ambiente por uma noite, todos os componentes voláteis foram removidos a vácuo, e HCI aquoso (1 M, 2,4 mL, 2,4 mmol) foi adicionado para ajustar o pH em 2-3. A mistura resultante foi extraída com EtOAc (200 mL, 100 mL x 2). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura, secadas sobre NazSCU, filtradas, e concentradas a vácuo. O resíduo foi submetido à cromatografia rápida (sílica-gel) eluindo com MeOH/CHzCb para dar o (S)-terc-butil 29-(terc-butóxicarbonil)-1-(9H-fluoren-9-il)3,13,23,31 -tetraoxo-2,7,10,17,20-pentaoxa-4,14,24,30-tetraazaoctatetracontan-48-oato (34) (1,03 g, 0,940 mmol, 78% de rendimento) como um líquido viscoso incolor. ¹H-RMN (400 MHz, CDCI₃) δ ppm 7,78 (d, J=7,58 Hz, 2 H), 7,63 (br d, J=7,34 Hz, 2 H), 7,39

- 7,46 (m, 2 H), 7,30 - 7,36 (m, 2 H), 6,74 (br s, 1 H), 6,27 - 6,39 (m, 1 H), 6,05 - 6,24 (m, 1 H), 5,60 - 5,78 (m, 1 H), 5,19 - 5,40 (m, 3 H), 4,38

- 4,55 (m, 3 H), 4,17 - 4,32 (m, 1 H), 3,74 - 3,79 (m, 2 H), 3,72 (t, J=5,99 Hz, 2 H), 3,61 - 3,67 (m, 4 H), 3,54 - 3,61 (m, 8 H), 3,48 - 3,54 (m, 6 H), 3,37 - 3,47 (m, 4 H), 3,17 - 3,29 (m, 2 H), 2,49 (br t, J=5,87 Hz, 2 H),

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2,43 (t, J=5,87 Hz, 2 H), 2,18 - 2,26 (m, 4 H), 1,76 - 1,90 (m, 1 H), 1,51

- 1,73 (m, 7 H), 1,48 (s, 9 H), 1,46 (s, 9 H), 1,18 - 1,37 (m, 26 H). ¹³CRMN (101 MHz, CDCI₃) δ ppm 173,34, 173,04, 171,80, 171,43, 171,34, 156,62, 144,00, 141,35, 127,69, 127,05, 125,04, 119,97, 82,05, 79,87, 77,55, 70,22, 70,18, 70,16, 70,07, 69,92, 67,23, 66,51, 53,40, 52,29, 50,86, 47,34, 40,99, 39,18, 39,04, 37,04, 36,95, 36,67, 35,67, 32,42, 29,70 (br s), 29,68 (br s), 29,65 (br s), 29,63 (br s), 29,54, 29,51,29,38, 29,34, 29,32, 29,12, 29,01, 28,15, 28,0, 25,68, 25,16, 22,51. [MH]⁺ 1254,90.

[00365] terc-butil (S)-1 -amino-25-(terc-butóxicarbonil)-9,19,27trioxo-3,6,13,16-tetraoxa-10,20,26-triazatetratetracontan-44-oato (35). EtsN (1,2 mL, 8,61 mmol) foi adicionado a uma mistura de (S)-tercbutil 29-(terc-butóxicarbonil)-1 -(9 H-f I uoren-9-i I )-3,13,23,31 -tetraoxo2,7,10,17,20-pentaoxa-4,14,24,30-tetra-azaoctatetracontan-48-oato (34) (330 mg, 0,301 mmol) em DMF (3 mL). Depois que a mistura foi agitada à temperatura ambiente por 20 h, todos os componentes voláteis foram removidos em alto vácuo. O resíduo foi submetido à cromatografia rápida, eluindo com 2M de NHs-MeOH/CHzCh (1:9), para dar 0 (S)-terc-butil 1-amino-25-(terc-butóxicarbonil)-9,19,27-trioxo-

3,6,13,16-tetraoxa-10,20,26-triazatetratetracontan-44-oato (35) (164 mg, 0,188 mmol, 62,3 % de rendimento) como um líquido incolor. ¹HRMN (400 MHz, CDCI3) δ ppm 6,78 - 6,92 (m, 1 H), 6,48 - 6,62 (m, 1 H), 6,15 - 6,35 (m, 1 H), 4,35 - 4,53 (m, 1 H), 3,75 (q, J=6,11 Hz, 4 H), 3,59

- 3,68 (m, 8 H), 3,54 - 3,59 (m, 2 H), 3,49 - 3,54 (m, 2 H), 3,40 - 3,48 (m, 3 H), 3,16 - 3,29 (m, 2 H), 2,80 - 2,92 (m, 2 H), 2,38 - 2,57 (m, 4 H), 2,12

- 2,32 (m, 4 H), 1,75 - 1,87 (m, 1 H), 1,49 - 1,75 (m, 8 H), 1,47 (s, 9 H), 1,45 (s, 9 H), 1,20 - 1,38 (m, 26 H). ¹³C-RMN (101 MHz, CDCI3) δ ppm 173,32, 173,04, 171,80, 171,47, 171,37, 81,99, 79,85, 74,86, 73,34, 70,30, 70,23, 70,12, 70,08, 69,88, 67,30, 52,31, 50,60, 41,74, 39,18, 39,00, 37,05, 37,00, 36,64, 35,65, 32,35, 29,67, 29,66, 29,61, 29,52,

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175/197

29,48, 29,33, 29,31, 29,31, 29,11, 29,04, 28,13, 28,03, 25,68, 25,13, 22,51. [MH]⁺ 873,75.

[00366] Ácido (S)-23-(terc-butóxicarbonil)-2,2-dimetil4,21,29,39,49-pentaoxo-3,32,35,42,45-pentaoxa-22,28,38,48-tetraazadopentacontan-52-oico (36). Piridina (5,0 ml_) foi adicionada a uma mistura de (S)-terc-butil 1-amino-25-(terc-butóxicarbonil)-9,19,27-trioxo-

3,6,13,16-tetraoxa-10,20,26-triazatetratetracontan-44-oato (35) (164 mg, 0,188 mmol), e di-hidrofuran-2,5-diona (94 mg, 0,939 mmol) à temperatura ambiente. Depois que a mistura foi agitada à temperatura ambiente por uma noite, todos os componentes voláteis foram removidos em alto vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia de fase reversa de pressão média em uma coluna C-18, eluindo com MeCN/TFA aq. (monitorada por ELSD-MS). As frações contendo o produto desejado foram combinadas e os componentes orgânicos voláteis foram removidos usando uma corrente de nitrogênio. A solução aquosa resultante contendo o produto desejado foi liofilizada para dar o composto do título (S)-23-(terc-butóxicarbonil)-2,2-dimetil4,21,29,39,49-pentaoxo-3,32,35,42,45-pentaoxa-22,28,38,48-tetraazadopentacontan-52-oico acid (36) (123 mg, 0,126 mmol, 67,3 % de rendimento) como um líquido incolor. [MH]⁺ 973,81.

[00367] 29,47-di-terc-butil 1-(2,5-dioxopiirolidin-1-il) (S)3,13,23,31 -tetraoxo-7,10,17,20-tetraoxa-4,14,24,30-tetra-azaheptatetracontano-1,29,47-tricarboxilato (37). A uma mistura de ácido (S)-23-(terc-butóxicarbonil)-2,2-dimetil-4,21,29,39,49-pentaoxo3,32,35,42,45-pentaoxa-22,28,38,48-tetra-azadopentacontan-52-oico (36) (123 mg, 0,126 mmol), 1 -hidroxipirrolidina-2,5-diona (21,8 mg, 0,190 mmol), e EDC (31,5 mg, 0,164 mmol), foi adicionado CH2CI2 (5 ml_). After a solução límpida resultante foi agitada à temperatura ambiente por uma noite, LC/ELSD-MS mostrou aproximadamente 70% de conversão. Mais 1 -hidroxipirrolidina-2,5-diona (21,8 mg, 0,190

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176/197 mmol), e EDC (31,5 mg, 0,164 mmol) foram adicionados, e a mistura foi agitada à temperatura ambiente por 3,5 h. LC/ELSD-MS mostrou conversão completa. A mistura foi diluída com CH2CI2 (150 mL) e lavada com água/salmoura (2:1), secad sobre NazSCU, filtrada, concentrada em alto vácuo para dar 0 (S)-29,47-di-terc-butil 1-(2,5dioxopirrolidin-1 -il) 3,13,23,31 -tetraoxo-7,10,17,20-tetraoxa-4,14,24,30tetra-aza-heptatetracontano-1,29,47-tricarboxilato (37) (135 mg, 0,126 mmol, 100 % de rendimento) como um líquido incolor, que foi usado diretamente na etapa seguinte. [MH]⁺ 1070,93.

[00368] terc-butil (S)-39-(terc-butóxicarbonil)-2,2-dimetil4,10,13,23,33,41 -hexaoxo-3,6,17,20,27,30-hexaoxa-5,9,14,24,34,40hexaazaoctapentacontan-58-oato (38). NaHCOs (21,2 mg, 0,252 mmol) foi adicionado a uma mistura de (S)-29,47-di-terc-butil 1-(2,5dioxopirrolidin-1 -il) 3,13,23,31 -tetraoxo-7,10,17,20-tetraoxa-4,14,24,30tetra-aza-heptatetracontano-1,29,47-tricarboxilato (37) (135 mg, 0,126 mmol), e cloridrato de terc-butil 2-aminoetoxicarbamato (53,6 mg, 0,252 mmol) em DME (4,5 mL) e água (1,5 mL). A solução límpida resultante foi agitada à temperatura ambiente por uma noite. Todos os componentes voláteis foram removidos a vácuo, e 0 resíduo foi purificado por cromatografia de fase reversa de pressão média em uma coluna C-18, eluindo com MeCN/aq.TFA (monitorada por ELSD-MS). As frações contendo 0 produto desejado foram combinadas e os componentes orgânicos voláteis foram removidos usando uma corrente de nitrogênio. A solução aquosa resultante contendo 0 produto desejado foi liofilizada para dar 0 composto do título (S)-terc-butil 39-(tercbutóxicarbonil)-2,2-dimetil-4,10,13,23,33,41-hexaoxo-3,6,17,20,27,30hexaoxa-5,9,14,24,34,40-hexaazaoctapentacontan-58-oato (38) (118 mg, 0,104 mmol, 83,0 % de rendimento). [MH]⁺1131,99.

[00369] Ácido (S)-1-(amino-óxi)-33-carbóxi-4,7,17,27,35pentaoxo-11,14,21,24-tetraoxa-3,8,18,28,34Petição 870190074948, de 05/08/2019, pág. 196/421

177/197 pentaazadopentacontan-52-oico (39). TFA (2 mL) foi adicionado a 0°C a uma mistura de (S)-terc-butil 39-(terc-butóxicarbonil)-2,2-dimetil4,10,13,23,33,41-hexaoxo-3,6,17,20,27,30-hexaoxa-5,9,14,24,34,40hexaazaoctapentacontan-58-oato (38) (118 mg, 0,104 mmol), e 1,4dimetoxibenzeno (144 mg, 1,043 mmol) em CH2CI2 (2 mL). A mistura foi agitada a 0°C oor 5 min, e em seguida à temperatura ambiente por 2 h. A mistura foi concentrada, e então secada em alto vácuo por 30 min. O resíduo foi purificado por cromatografia de fase reversa de pressão média em uma coluna C-18, eluindo com MeCN/TFA aq. (monitorada por ELSD-MS). As frações contendo 0 produto desejado foram combinadas e os componentes orgânicos voláteis foram removidos usando uma corrente de nitrogênio. A solução aquosa resultante contendo 0 produto desejado foi resfriado para -78°C em uma corrente de nitrogênio e liofilizado para dar 0 ácido (S)-1-(amino-óxi)-33-carbóxi4,7,17,27,35-pentaoxo-11,14,21,24-tetraoxa-3,8,18,28,34-pentaazadopentacontan-52-oico (39) (60,0 mg, 0,064 mmol, 61,3% de rendimento) como um sólido branco. Sua pureza por LC-CAD foi determinada como sendo igual a 98,0% usando a Análise UHPLC-CAD Condição D. [MH]⁺ 919,88, [M+2H]⁺/2 460,69.

Exemplo 7: Ensaio de acúmulo de cAMP intracelular [00370] Os efeitos da relaxina H2 são mediados via seu receptor acoplado à proteína G cognata, Receptor de Peptídios da Família das Relaxinas (RXFP1), levando à estimulação de uma combinação de vias de sinalização celular que são dependentes do tipo de célula e podem incluir adenilato ciclase, proteína quinase A, proteína quinase C, fosfatidilinositol 3-quinase, e quinase regulada por sinalização extracelular (Erk1/2). Bathgate, et al., 2006. Pharmacol. Rev. 58, 7-31. O ensaio de acúmulo de cAMP intracelular descrito neste pedido foi usado para avaliar a bioatividade e a potência das relaxinas. Os compostos de teste eram à base de WT-RLX (FIG. 1), AQ1 (FIG. 2), e

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BM25/AN1 (FIG. 3). Os extensores farmacocinéticos mostrados foram conjugados à para-acetil-fenilalanina contida em AQ1 e BM25/AN1 via uma ligação oxima como descrito no Exemplo 3.

[00371] Células CHO-K1 (ATCC; Cat. # CRL-9618) expressando de forma estável o receptor de RXFP1 humano (locus número LOC59350) (10.000/well) foram plaqueadas em placas de 96 poços e cultivadas por uma noite a 37°C e 5% de CO2. No dia seguinte, 0 meio foi removido das células e as células foram estimuladas com a adição de um ligando (polipeptídio de relaxina) em 50 uL de tampão (1X de HBSS, 5 mM de HEPES (7,2), 0,5 mM de IBMX, 0,1% de BSA); a incubação levou 10 min a 37°C. Células não estimuladas foram usadas como controles de referência. As reações foram interrompidas e os níveis de cAMP celular foram medidos usando-se 0 kit Dynamic 2 cAMP de fluorescência homogênea resolvida no tempo (HTRF) (CisBio, #62AM4PEC) de acordo com 0 protocolo do fabricante. As placas foram analisadas com a ajuda de uma leitora EnVision 2104 Multilablel (PerkinElmer). O sinal foi expresso em função da relação intensidade de fluorescência a 665 nm/intensidade de fluorescência a 620nm x 10.000. A concentração de cAMP na amostra foi determinada por comparação com curvas padrão generadas a partir de concentrações conhecidas de cAMP. A potência de cada relaxina foi determinada com a ajuda de uma curva de concentração resposta de dez pontos que foi feita em duplicata. Os dados foram analisados usando 0 software Excel da Microsoft, Versão 2013 Xlfit. Os valores da concentração efetiva 50 (EC50), 0 ponto no qual a resposta foi semi-máxima, foram calculados com a ajuda de uma equação logística de quatro parâmetros que permitiu uma inclinação da variável (Tabela 3).

[00372] Tabela 3. Resultados do ensaio de acúmulo de cAMP intracelular. Abreviações usadas nesta tabela: dK: D-lisina; Sar: sarcosina (N-metilglicina); dGlu: D-ácido glutâmico; 20kDa PEG:

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179/197 poli(etileno glicol), peso molecular 20 kDa; PEGn (por exemplo, n é 2, 12, 24, ou 36): -(O-CH₂-CH₂)n-O-; -C13-: -(C=O)-(CH₂)i₂-; -C14-: (C=O)-(CH₂)i3-; -C15-: -(C=O)-(CH₂)i4- (estas abreviações são ilustrativas, mas não limitam, o -Cn- da fórmula I ou o uso desses termos fora desta tabela). Em Glu^Y-C13-, Glu^Y-C14-, Glu^Y-C15-, e Glu^Y-C17- na Tabela 3, o primeiro carbono da carbonila do ácido graxo está ligado ao resíduo (gama) Glu via uma ligação amida.

Nome do Conjugado de Relaxina	hRXFP1/CHO-K1 cAMP EC50 (nM, média)	SEQ ID NO: do componente peptídico
WT-RLX	0,12
BM25/AN1	0,09
BM25/AN1-C13-CH3	1,85
AQ1	0,11
AQ1-20kDa PEG	3,22
AQ1-GIU-C13-CH3	0,95
AQ1-Glu-C13-COOH	0,18
AQ1-PEG36-GIU-C13-CH3	0,15
AQ1-PEG36-GIU-C13-COOH	0,25
AQ1 -GGGGS-GluY-C13-COOH	0,14	101
AQ1-DRDDRD-C13-COOH	0,32	102
AQ1 -KKKKKK-GluY-C13-COOH	0,08	103
AQ1 -RGGEEKKKEKEK-GluY-C13-COOH	0,29	104
AQ1 -GGGEEE-GluY-C13-COOH	0,22	105
AQ1 -EEEGGG-GluY-C13-COOH	0,31	106
AQ1 -KKKGGG-GluY-C13-COOH	0,09	107
AQ1 -GETGSSGEGT-GluY-C13-COOH	0,65	108
AQ1 -GGGKKK-GluY-C13-COOH	0,19	109
AQ1 -GSHHHHHGS-GluY-C13-COOH	0,28	110

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180/197

AQ1-Sar-Sar-Sar-Sar-Ser-Sar-Sar-Sar- Sar-GluY-C13-COOH	0,39	111
AQ1 -Sar-Sar-Sar-Sar-Ser-GluY-C13- COOH	0,32	112
AQ1 -Sar-Sar-Sar-Glu-Glu-GluY-C13- COOH	0,59	113
AQ1 -KKSGGSGG-GluY-C13-COOH	0,34	114
AQ1 -KKSGGSGG-Glu“-C13-COOH	0,27	115
AQ1 -KKSAGSAG-GluY-C13-COOH	0,27	116
AQ1 -KSGGSGG-GluY-C13-COOH	0,24	117
AQ1 -KKKSGGSGG-GluY-C13-COOH	0,14	118
AQ1 -KKSGGSGGEE-GluY-C13-COOH	0,16	119
AQ1 -dKdKdKdKdKdK-GluY-C13-COOH	0,10	120
AQ1 -EESGGSGG-GluY-C13-COOH	0,83	121
AQ1 -GGGGS-GluY-C15-COOH	1,55	122
AQ1 -GSGSGSGS-GluY-C15-COOH	2,79	123
AQ1 -EEEGGG-GluY-C15-COOH	5,26	124
AQ1 -EEEGGG-GluY-C17-COOH	10,52	125
AQ1 -EEEGGG-GluY-C13-CH3	0,38	126
AQ1 -EEEGGG-GluY-C15-CH3	0,46	127
AQ1 -EEEGGG-dGluY-C13-COOH	1,91	128
AQ1 -EEEGGG-GluY-C14-COOH	1,88	129
AQ1 -EGGGGSK-GluY-C13-COOH	0,31	130
AQ1 -EEEEEE-GluY-C15-COOH	11,06	131
AQ1-Composto 39	2,23
AQ1-EEEEPEEEEPEEEEPEEEE-GluY- C14-CH3	0,33	133
AQ1-EEEEPEEEEPEEEEPEEEE-GluY- C15-CH3	0,34	134
AQ1-EEEEPEEEEPEEEEPEEGGG-C14- CH3	0,16	135

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181/197

AQ1 -EEEEGEEEEGEEEEGEEEE-Gluy- C14-CH3	0,67	136
AQ1- KGGEEKKKEKEKEPKGGEEKKKEKEK- GluY-C15-COOH	1,81	137
AQ1- EAQKAQAEAQKAQAEAQKAQA- GluY-C15-COOH	4,96	138
AQ1 -GGGGS-GluY-C14-COOHa	0,28	139
AQ1-KK-GluY-C13-COOH	0,10	140
AQ1-KK-GluY-C14-COOH	0,34	141
AQ1-KK-GluY-C15-COOH	0,40	142
AQ1 -EEEEEE-GluY-C14-CH3	0,38	143
AQ1-KK-GluY-C14-CH3	0,35	144
AQ1 -KGP-GluY-C14-COOH	0,27	145
AQ1-KGPKGP-GluY-C14-COOH	0,23	146
AQ1 -SGGGS-GluY-C14-COOH	0,32	147
AQ1 -KGGGS-GluY-C14-COOH	0,34	148
AQ1 -KGGGSE-GluY-C14-COOH	0,37	149
AQ1 -GSPGSP-GluY-C14-COOH	0,29	150
AQ1-GGGGP-GluY-C14-COOH	0,39	151
AQ1 -EGGS-GluY-C14-COOH	0,33	152
AQ1-EGGGP-GluY-C14-COOH	0,44	153
AQ1 -KGPGSE-GluY-C14-COOH	0,60	154
AQ1 -Espermina-GluY-C14-COOH	0,39
AQ1 -KKGGS-GluY-C15-COOH	1,36	156

^a O conjugado de relaxina AQ1-GGGGS-Glu^Y (SEQ ID NO: 139)-C14-COOH compreende um polipeptídio da cadeia A da relaxina de SEQ ID NO: 35 e um polipeptídio da cadeia B da relaxina de SEQ ID NO: 6, onde a para-acetil-Lfenilalanina modificada localizada no terminal N da referida cadeia A do polipeptídio de relaxina está ligada ao melhorador farmacocinético compreendendo GGGGS-Glu^Y (SEQ ID NO: 139)-C14-COOH, como representado na fórmula III

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Ο

AQ-i-Relaxina

CH_S

(Fórmula III)

Exemplo 8: Estudos farmacocinéticos (PK) In vivo [00372] Ratos Sprague-Dawley machos (n=3) receberam uma única dose intravenosa (IV) ou subcutânea (SC) (1 mg/kg) de construtos de relaxina (descritos no Exemplo 7, acima) formulada em um tampão adequado (por exemplo, Histidina 20 mM, NaCI 750 mM, pH 6,0). Amostras de sangue foram coletadas pela veia jugular em diferentes instantes durante 72 horas. Deixou-se que as amostras de sangue coagulassem à temperatura ambiente (30-60 min) e elas foram então centrifugadas (1500-2000) a 4°C para obter soro. Depois de centrifugação, as amostras de soro foram transferidas para placas de 96 poços e armazenadas a -80°C até a bioanálise. As concentrações de relaxina foram medidas a partir do soro por ELISA.

[00373] Os perfis de concentração-tempo da relaxina dos animais individuais foram usados para análise. Os parâmetros farmacocinéticos foram calculados por métodos não-compartimentais usando Phoenix WinNonlin (versão 6.4) ou Kinetica (versão 5). Os parâmetros farmacocinéticos médios Cmax, AUCint, C24 e a meia-vida foram apresentados (Tabela 4).

Tabela 4. Dados PK in vivo (abreviações como na Tabela 3).

Nome do Conjugado de Relaxina	Rat PK SC Dose (mg/kg)	RatPK AUC Total h*nmol/L	Rat PK C24 (nM)	SEQ ID NO: do componente peptídico
AQ1-20kDa PEG	1,0a	1475	39
AQ1-PEG36-GIU-C13-COOH	1,0	1003	9,7
AQ1-GGGGS-GluY-C13- COOH	0,8	1096	1,52	101

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AQ1-DRDDRD-C13-COOH	1,0	1008	0,38	102
AQ1-KKKKKK-GluY-C13- COOH	1,0	38	0,05	103
AQ1 -RGGEEKKKEKEK-GluY- C13-COOH	1,0	987	0,10	104
AQ1-GGGEEE-GluY-C13- COOH	1,0	866	0,18	105
AQ1-EEEGGG-GluY-C13- COOH	1,0	1381	0,29	106
AQ1-KKKGGG-GluY-C13- COOH	1,0	258	0,24	107
AQ1 -GETGSSGEGT-GluY- C13-COOH	1,0	1112	0,28	108
AQ1-GGGKKK-GluY-C13- COOH	1,0	231	0,10	109
AQ1-GSHHHHHGS-GluY- C13-COOH	1,0	582,0	0,46	110
AQ1 -KSGGSGG-GluY-C13- COOH	1,0	814	0,73	117
AQ1-KKKSGGSGG-GluY- C13-COOH	1,0	264	0,21	118
AQ1 -KKSGGSGGEE-GluY- C13-COOH	1,0	676	0,09	119
AQ1 -dKdKdKdKdKdK-GluY- C13-COOH	1,o	31,2	0,06	120
AQ1-GGGGS-GluY-C15- COOH	1,0b	5526	44	122
AQ1-EEEGGG-GluY-C15- COOH	1,0	3553	22	124
AQ1-EEEGGG-GluY-C13- CH3	1,0	274	0,4	126
AQ1-EEEGGG-GluY-C15- CH3	1,0	370	0,89	127
AQ1-EEEGGG-GluY-C14-	1,0c	2137	5,2	129

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COOH
AQ1-GGGGS-GluY-C14- COOH	1,0	2308	17	139
AQ1-KK-GluY-C14-COOH	1,0	451	1,5	141
AQ1-KK-GluY-C15-COOH	1,0	820	8,8	142
AQ1-GSPGSP-GluY-C14- COOH	1,0	1979	5	150
AQ1-GGGGP-GluY-C14- COOH	1,0	2179	3,9	151

^a Ajustado desde 0,2 mpk ^b Ajustado desde 0,3 mpk ^c Ajustado desde 0,5 mpk

Exemplo 9: Estudos do fluxo sanguíneo renal em ratos [00374] Ratos Sprague Dawley machos (~250-300g) foram anestesiados com pentobarbital sódico (50 mg/kg), a traqueia foi canulada com um tubo de PE-205 para manter a patência das vias aéreas, e a temperatura foi mantida a 37°C com uma chapa cirúrgica aquecida. Um cateter de pressão 1.4F (Millar Inc., Houston, TX) foi introduzido na artéria carótida direita para medir a pressão sanguínea aórtica. A veia jugular direita foi canulada com um tubo de PE-50 para administração dos artigos de teste. O rim esquerdo foi exposto por meio de uma incisão retroperitoneal, e uma sonda de fluxo Doppler (Modelo 0.5 VB, Transonic System Inc., Ithaca, NY) foi presa à artéria renal esquerda para monitoramento do fluxo sanguíneo. Pentobarbital sódico (15 mg/kg, intraperitoneal) foi suplementado após o término desses procedimentos cirúrgicos. Após um equilíbrio de 10-15 min, a relaxina foi administrada a 1 mg/kg por via intravenosa em um volume de dosagem de 0,15 a 1,82 mL/kg durante 30 segundos via uma bomba de infusão (Harvard Apparatus, Holliston, MA). A pressão sanguínea, a frequência cardíaca e o fluxo sanguíneo renal foram continuamente registrado por 45 min depois da administração de relaxina usando-se uma unidade de Condicionamento de Sinais Millar MPVS Ultra

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185/197 conectada a um computador desktop operando o software de aquisição de dados LabChart 7-Pro (ADInstruments, Dunedin, Nova Zealândia) (Tabela 5).

Tabela 5. Alterações no fluxo sanguíneo renal de ratos (abreviações como na Tabela 3).

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Conjugado de Relaxina	% de alteração do RBF em relação à linha basal	SEQ ID NO: DO COMPONENTE PEPTÍDICO
WT-RLX	+25
AQ1-20kDa PEG	+21
BM25/AN1	-20
BM25/AN1-C13-CH3	-100a
BM25/AN1- PEG36-C13-CH3	-90
BM25/AN1- PEG36-Glu-C13-CH3	-25
AQ1	-17
AQ1-GIU-C13-CH3	-27b
AQ1-Glu-C13-COOH	+14b
AQ1-PEG36-Glu-C13-CH3	+20b
AQ1-PEG36-C13-COOH	+22
AQ1-PEG36-Glu-C13-COOH	+24
AQ1-PEG36-Glu-C15-COOH	+30
AQ1-PEG24-Glu-C13-COOH	+15
AQ1-PEG12-Glu-CI 3-COOH	+5
AQ1 -GGGGS-GluY-C13-COOH	+2	101
AQ1-DRDDRD-C13-COOH	+11	102
AQ1 -KKKKKK-GluY-C13-COOH	+12	103
AQ1 -RGGEEKKKEKEK-GluY-C13-COOH	+19	104
AQ1 -GGGEEE-GluY-C13-COOH	+11	105
AQ1 -EEEGGG-GluY-C13-COOH	+7b	106
AQ1 -KKKGGG-GluY-C13-COOH	+10b	107
AQ1 -GGGKKK-GluY-C13-COOH	+9	109
AQ1 -GSHHHHHGS-GluY-C13-COOH	+16	110
AQ1 -Sar-Sar-Sar-Sar-Ser-GluY-C13-COOH	+6	157
AQ1 -Sar-Sar-Sar-Glu-Glu-GluY-C13-COOH	+5	158
AQ1 -KSGGSGG-GluY-C13-COOH	+17	117
AQ1 -EEEGGG-GluY-C13-CH3	+ 1	126
AQ1 -EEEGGG-GluY-C15-CH3	+18	127
AQ1 -GGGGS-GluY-C14-COOH	+10	139

^a Os animais morreram logo após a administração do composto. A necrópsia mostrou

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187/197 uma coloração pálida dos rins, indicando perda completa de fluxo sanguíneo.

^b Observou-se que o composto era pobrement solúvel.

[00375] Os resultados apresentados na tabela acima ilustram a complexa relação entre a estrutura e a posição dos conjugados e o fluxo sanguíneo renal resultante. WT-RLX sozinho provocou um aumento de aproximadamente 25% no fluxo sanguíneo renal em relação à linha basal, o que era esperado dada a atividade vascular conhecida da relaxina. Esperava-se que os vários compostos de teste, sendo agonistas de relaxina (vide Exemplo 7), provocassem igualmente um aumento no fluxo sanguíneo renal. Surpreendentemente, no etanto, observou-se que alguns dos compostos provocavam reduções no fluxo sanguíneo renal. Tal redução do fluxo sanguíneo renal podería ser uma contrai ndicação clinicamente significativa, especialmente em insuficiência cardíaca, onde com frequência se observa enfraqucimento renal. Os compostos BM25/AN1, BM25/AN1-C13-CH3, BM25/AN1PEG36-C13-CH3, BM25/AN1- PEG36-Glu-C13-CH3, AQ1, e AQ1-GluC13-CH3 resultaram todos em redução do fluxo sanguíneo renal (Tabela 5, acima).

[00376] Estes resultados eram inesperados e imprevisíveis. Compostos estruturalmente relacionados apresentam efeitos divergentes no fluxo sanguíneo renal LEVEMIR®, uma forma de insulina de ação prolongada aprovada pelo FDA e comercializada para o tratamento de diabetes, é um conjugado insulina-C13-CH3 que demonstrou segurança (NDA 21-878 da Novo Nordisk A/S, página 1). Ao contrário, a administração de BM25/AN1-C13-CH3, which que é estruturalmente similar ao LEVEMIR®, foi fatal nos ratos, e a necrópsia mostrou rins pálidos indicando que o fluxo sanguíneo renal foi bloqueado. Além disso, a relaxina AQ1, que contém uma única substituição de aminoácidos por para-acetil-fenilalanina na posição 1 da cadeia A, reduziu o fluxo sanguíneo renal, ao passo que o composto AQ1-PEG de20kDa, que contém a mesma substituição de aminoácidos

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188/197 artificial, mas é conjugado a urn PEG de 20kDa, aumentou o fluxo sanguíneo renal. Ademais, o BM25/AN1-PEG36-Glu-C13-CH3 reduziu o fluxo sanguíneo renal, mas o AQ1-PEG36-Glu-C13-CH3 aumentou o fluxo sanguíneo renal. Vários dos compostos mencionados acima que causaram redução do fluxo sanguíneo renal continham um melhorador farmacocinético terminando com um grupo metila, por exemplo, BM25/AN1-C13-CH3, BM25/AN1- PEG36-C13-CH3, e AQ1-Glu-C13CH3. No entanto, os animais tratados com AQ1-EEEGGG-Glu^Y-C15CH3 e AQ1-PEG36-GIU-C13-CH3 apresentaram fluxo sanguíneo renal satisfatório, indicando que o grupo metil não causou invariavelmente fluxo sanguíneo renal pobre. Ao contrário, o AQ1 -GGGGS-Glu^Y (SEQ ID NO: 139)-C14-COOH, e outras moléculas de relaxina AQ1 testadas conjugadas a um melhorador farmacocinético compreendendo um componente peptídico e um ácido graxo -C13-COOH, -C14-COOH ou C15-COOH, em geral apresentaram fluxo sanguíneo renal (Tabela 5, acima).

Exemplo 10: Estudos de toxicidade em ratos [00377] AQ1-20kDa-PEG foi dado a ratos por administração subcutânea em doses de 1,5, e 15 mg/kg/dia por 10 dias. Após a dose final os animais foram eutanasiados, dissecados, e uma histopatologia dos rins foi realizada. Vacúolos foram observados nas células epiteliais tubulares renais em todas as doses (FIG. 70). Ao contrário, vacúolos não foram observados nas células epiteliais tubulares renais dos ratos medicados com Veículo (150 mM de Arg em 10 mM de tampão citrato pH 5,5) por via subcutânea por 10 dias (FIG. 7A).

[00378] AQ1-PEG36-GIU-C13-COOH foi dado a ratos por administração subcutânea em doses de10 e 40 mg/kg/dia por 7 dias. Após a dose final os animais foram eutanasiados, dissecados, e uma histopatologia dos rins foi realizada. Vacúolos foram observados nas células epiteliais tubulares renais em todas as doses (FIG. 7B).

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189/197 [00379] AQ1 -GGGGS-GIuy (SEQ ID NO: 139)-014-COOH foi dado a ratos por administração subcutânea em doses de5, 20, e 40 mg/kg/dia por 7 dias. Após a dose final os animais foram eutanasiados, dissecados, e uma histopatologia dos rins foi realizada. Em todas as doses, as células epiteliais tubulares renais pareciam normais sem evidências de vacúolos relacionados com o artigo de teste (FIG. 7D).

[00380] O composto AQ1-GGGGS-Glu^Y (SEQ ID NO: 139)-C14COOH também apresentou bons resultados no fluxo sanguíneo renal (Exemplo 9), um perfil de solubilidade favorável (dados não mostrados), e viscosidade significativamente mais baixa que a do AQ1-PEG de 20kDa.

Exemplo 11: Efeito da relaxina em fibroblastos cardíacos humanos primários [00381] Fibroblastos cardíacos humanos primários (NHCF-V) foram adquiridos na Lonza, Fairlawn, NJ (Cat.#: CC-2904). Células NHCF-V foram isoladas do ventrículo de tecido cardíaco adulto normal. As células tingiram positivas para α-actina do músculo liso e expressaram > 90% de colágeno I e < 10% de fator VIII de Von Willibrand. As células nas passagens 3 a 6 foram usadas para estudos de transcrição reversa quantitativa em tempo real-reação em cadeia da polimerase (qRTPCR). As células foram cultivadas em FGM™-3 BulletKit™ (Cat. #: CC4526, Lonza) contendo meio completo a 10% de FBS. Na confluência, as células foram separadas e cultivadas em placas de 6 poços a uma densidade de 150.000 /poço por 24 horas em meio completo. As células foram transferidas para meio livre de soro (Cat. #: CC-3131, Fibroblast Basal Medium, Lonza) por 24 horas, e então tratadas com relaxina H2 humana (Cat. #: 3596-RN, R&D Systems) ou AQ1-GGGGS-Glu^Y (SEQ ID NO: 139)-C14-COOH na presença de 0,5 ng/mL de TGF-β (Cat. #: 240-B, R&D Systems) por mais 24 horas. A seleção da concentração de TGF-β para criação de perfil e a duração do tratamento foram baseadas

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190/197 em trabalhos anteriores. As células nas placas de 6 poços foram recolhidas para extração de RNA total e análise de qRT-PCR.

[00382] RNA total foi extraído usando-se o mini kit RNeasy (Cat. #: 74106, Qiagen) de acordo com os protocolocos do fabricante, incluindo a remoção de cDNA genômico na coluna. qRT-PCR em tempo real foi realizada em duas etapas: síntese de cDNA e detecção em tempo real foram realizados em um ciclizador térmico PTC-100 (MJ Research) e um Sistema de Detecção de Sequências ABI Prism 7700 (Applied Biosystems), respectivamente. TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) foi usada nas reações de PCR subsequentes de acordo com os protocolos do fabricante. Todas as reações de qRT-PCR foram realizadas em duplicata. Inicadores sequência-específicos para alfa-actina de músculo liso (Senso: 5’AAATACTCTGTCTGGATCGGTGGCTCC-3’ (SEQ ID NO:51); Antisense: 5’-CACATAGGTAACGAGTCAGAGCTTTGGCTA-3’ (SEQ ID NO:52)) e o gene zelador L30 (Senso: 5’GCTGGAGTCGATCAACTCTAGG-3' (SEQ ID NO:53); Antisense: 5’CCAATTTCGCTTTGCCTTGTC-3’ (SEQ ID NO:54)) foram criados com a ajuda do software Primer Express Versão 2 (Applied Biosystems) baseado em sequências publicadas (www.ncbi.nlm.nih.gov). Os níveis de expressão de alfa-actina de músculo liso foram normalizados para os níveis de expressão do gene zelador L30. Fibroblastos cardíacos humanos tratados com AQ1-GGGGS-Glu^Y (SEQ ID NO: 139)-C14COOH foram analisados quanto a diferenças na significância das células tratadas com veículo usando-se um teste t de Student (Microsoft Excel, Versão 2013) com um valor P de < 0,05 sendo considerado significativo.

[00383] Foi demonstrado que o AQ1-GGGGS-Glu^Y (SEQ ID NO: 139)-C14-COOH reduz a expressão de gene pro-fibrótico, alfa-actina de músculo liso, em fibroblastos cardíacos humanos primários tratados

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191/197 com TGF-beta (0,5 ng/mL; 24 hr). Como mostrado nas FIGS. 6A-6B, as reduções na expressão gênica foram dependentes da concentração e igualmente robustas para a relaxina H2 humana e para AQ1-GGGGSGlu^Y (SEQ ID NO: 139)-C14-COOH. AQ1-GGGGS-Glu^Y (SEQ ID NO: 139)-C14-COOH pode ser usado como um agente antifibrótico para tratar doenças fibróticas, por exemplo, fibrose cardíaca.

Exemplo 12: Exemplos adicionais de melhoradores farmacocinéticos [00384] Os melhoradores farmacocinéticos mostrados na Tabela 6 abaixo geralmente são produzidos de acordo com os métodos descritos nos Exemplos 4, 5, e 6, acima. Esses melhoradores farmacocinéticos são conjugados a polipeptídios de relaxina modificada compreendendo um aminoácido codificado artificialmente (por exemplo, na posição 1 da cadeia A, tal como em RLX-AQ1) usando os métodos descritos no Exemplo 3 e são caracterizados, incluindo testes de atividade biológica, propriedades farmacocinéticas, efeitos no fluxo sanguíneo renal, formação de vacúlos, e efeitos nos fibroblastos cardíacos como descrito nos Exemplos 7-11.

Tabela 6. Melhoradores farmacocinéticos exemplificativos (abreviações como na Tabela 3, e como indicado abaixo).

Estrutura do melhor ador farmacocinético	SEQ ID NO: do componente peptídico
AAAAAS-X-FA	159
AAAAS-X-FA	160
AAAS-X-FA	161
AASAASAASAA-X-FA	162
AASAASAAS-X-FA	163
AASAAS-X-FA	164
AASSA-X-FA	165
AAS-X-FA	166
AGAGS-X-FA	167

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192/197

AGAGS-X-FA	168
AGAS-X-FA	169
AGAS-X-FA	170
AGGAS-X-FA	171
AGGAS-X-FA	172
AGGGS-X-FA	173
AGGGS-X-FA	174
AS-X-FA	175
apapapaps-x-fa	176
APAPAPS-X-FA	177
APAPS-X-FA	178
APS-X-FA	179
EGGEGG-Z-FA	180
EGGEGP-Z-FA	181
EGPEGP-Z-FA	182
GGAAS-X-FA	183
GGAAS-X-FA	184
GGAS-X-FA	185
GGAS-X-FA	186
GGGAS-X-FA	187
GGGAS-X-FA	188
GGGGGGS-X-FA	189
GGGGGS-X-FA	190
GGGGS-FA	191
GGGGS-PEG2-PEG2-X-FA	192
GGGGS-X-C14-C00H	193
cauda de GGGGS-X-FA-ácido malônico	194
cauda de GGGGS-X-FA-ácido succínico	195
GGGGS-Z-FA	196
GGGGS-Z-FA	197
GGGGT-FA	198
GGGSG-X-FA	199

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193/197

GGGSSS-X-FA	200
GGGSS-X-FA	201
GGGSS-X-FA	202
GGGS-X-FA	203
GGGTTTT-X-FA	204
GGSGGGGG-X-FA	205
GGSGGSGGSGG-X-FA	206
GGSGGSGGS-X-FA	207
GGSGGS-X-FA	208
GGSGG-X-FA	209
GGSGS-X-FA	210
GGSSG-X-FA	211
GGSSSS-X-FA	212
GGSSS-X-FA	213
GGSS-X-FA	214
GGSS-X-FA	215
GGSS-X-FA	216
GGS-Z-FA	217
GGTTTT-X-FA	218
GGTTT-X-FA	219
GGTT-X-FA	220
GSGGG-X-FA	221
GSGGS-X-FA	222
GSGSGSGSGS-X-FA	223
GSGSGSGS-X-FA	224
GSGSGS-X-FA	225
GSGSG-X-FA	226
GSGS-X-FA	227
GSP-Z-FA	228
GSSSS-X-FA	229
GSSS-X-FA	230
GSS-X-FA	231

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194/197

GS-Z-FA	232
GTTT-X-FA	233
GTT-X-FA	234
KGGGS-Z-FA	235
KGGKGG-Z-FA	236
KK-PEG2-PEG2-X-FA	237
KKS-FA	238
KKS-Z-FA	239
KKT-FA	240
KKT-Z-FA	241
cauda de KK-X-ácido malônico	242
cauda de KK-X-ácido succínico	243
KK-Z-FA	244
KPKS-Z-FA	245
KSGGGSK-Z-FA	246
KSGKSG-Z-FA	247
SGGGGG-X-FA	248
SGGGG-X-FA	249
SGGGG-X-FA	250
SGGGS-X-FA	251
SGGG-X-FA	252
SGG-X-FA	253
SG-X-FA	254
X = GluY, (D)-GluY, Aspa, Aspp, (D)-Aspa, ou (	D)-Aspp

Z = (D)-Glu^Y, Asp^a, Asp^p, (D)-Asp^a, ou (D)-Asp^p

FA = ácido graxo = por exemplo, C13-COOH, C14-COOH, ou C15-COOH; a menos que indicado em contrário [00385] Os melhoradores farmacocinéticos mostrados na Tabela 7 abaixo geralmente são produzidos de acordo com os métodos descritos nos Exemplos 3-5 deste pedido. Esses melhoradores farmacocinéticos são conjugados a polipeptídios de relaxina modificada compreendendo um aminoácido codificado artificialmente (por exemplo, na posição 1 da

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195/197 cadeia A, tal como em RLX-AQ1) usando os métodos descritos no Exemplo 3 e são caracterizados, incluindo testes de atividade biológica, propriedades farmacocinéticas, efeitos no fluxo sanguíneo renal, formação de vacúlos, e efeitos nos fibroblastos cardíacos como descrito nos Exemplos 7-11.

Tabela 7. Melhoradores farmacocinéticos exemplificativos (abreviações: N-MeK: 6-N-metillisina; Dap: ácido 2,3-diaminopropiônico; o restante, como na Tabela 3).

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196/197

Estrutura do melhorador farmacocinético	SEQ ID NO: do componente peptídico
GS-GluY-C14-COOH	255
GGS-GluY-C14-COOH	256
GSP-GluY-C14-COOH	257
EGGEGG-GluY-C14-COOH	258
GluYGGGGS-GluY-C14-COOH	259
EGGEGP-GluY-C14-COOH	260
EGPEGP-GluY-C14-COOH	261
Espermina-GluY-C13-COOH
KGGGS-GluY-C15-COOH	262
KSGGGSK-GluY-C15-COOH	263
KSGKSG-GluY-C15-COOH	264
KGGKGG-GluY-C15-COOH	265
KPKS-Glif-CI 5-COOH	266
dKdKdKdKdKdK-GluY-C13-COOH	267
DapDapDapDapDapDap-GluY-C13-COOH	268
N-MeK-N-MeK-N-MeK-N-MeK-N-MeK-N-MeK- GluY-C13-COOH	269
dKdKdKGGG-GluY-C13-COOH	270
GGGEEE-GluY-C15-COOH	271
GGGEEE-GluY-C17-COOH	272
KKKKP-GluY-C13-COOH	273
KKKKKK-C13-COOH	274
KAQKAQA-GluY-C13-COOH	275
KKKKPKKKK-GluY-C13-COOH	276
KKKKKKGGG-GluY-C13-COOH	277
EEEGGG-dGluY-C13-CH3	278
GGGGS-GluY-C13-CH3	279

[00386] Fica entendido que os exemplos e as modalidades descritos neste pedido são apenas ilustrativos e que várias modificações ou alterações à luz dos mesmos serão sugeridas aos especialistas na técnica e devem ser incluídas no espírito e alcance deste pedido e no

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197/197 escopo das reivindicações anexas. Também deve ficar entendido que a terminologia usada neste relatório tem o propósito de descrever apenas modalidades exemplificativas, e não se destina a limitar o escopo da presente invenção, que é limitado apenas pelas reivindicações anexas. Todas as publicações, patentes, pedidos de patente, e/ou outros documentos citados neste pedido estão aqui incorporados em sua íntegra a título de referência para todos os fins como se estivesse indicado que cada publicação, patente, pedido de patente, e/ou outro documento individual fora individualmente incorporado em sua íntegra a título de referência para todos os fins.

Claims (75)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Polipeptídio de relaxina modificada compreendendo um aminoácido codificado artificialmente, caracterizado pelo fato de que:

   (a) o polipeptídio de relaxina modificada compreende a cadeia A do polipeptídio de relaxina de SEQ ID NO: 4 e a cadeia B do polipeptídio de relaxina de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6, substituídos com um aminoácido codificado artificialmente em uma posição selecionada do grupo que consiste em: resíduo 1 da cadeia A, resíduo 2 da cadeia A, resíduo 5 da cadeia A, resíduo 13 da cadeia A, resíduo 18 da cadeia A, resíduo 5 da cadeia B, resíduo 7 da cadeia B, e resíduo 25 da cadeia B, e tendo opcionalmente até duas substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos adicionais na referida cadeia A da relaxina e/ou na referida cadeia B da relaxina;

   (b) o referido aminoácido codificado artificialmente tem a estrutura:

   

   onde o grupo R é qualquer substituinte diferente da cadeia lateral encontrada em alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteina, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina ou valina; e (c) o referido aminoácido codificado artificialmente é ligado a um melhorador farmacocinético compreendendo um componente peptídico entre 2 e 30 aminoácidos e uma porção prolongadora da meiavida.

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2. 2/17

   2. Polipeptídio de relaxina modificada de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida cadeia A do polipeptídio de relaxina compreende a SEQ ID NO: 4 substituída com o referido aminoácido codificado artificialmente no resíduo 1 e tendo opcionalmente até duas substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos adicionais.
3. 3. Polipeptídio de relaxina modificada de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida cadeia A do polipeptídio de relaxina compreende a SEQ ID NO: 4 substituída com o referido aminoácido codificado artificialmente no resíduo 1 e tendo opcionalmente uma substituição, inserção e/ou deleção de aminoácidos adicional.
4. 4. Polipeptídio de relaxina modificada de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a referida cadeia B do polipeptídio de relaxina compreende a SEQ ID NO: 5 ou a SEQ ID NO: 6 tendo opcionalmente uma substituição, inserção e/ou deleção de aminoácidos adicional.
5. 5. Polipeptídio de relaxina modificada de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida cadeia A do polipeptídio de relaxina compreende a SEQ ID NO: 4 substituída com o referido aminoácido codificado artificialmente no resíduo 1 e a referida cadeia B do polipeptídio de relaxina compreende a SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6.
6. 6. Polipeptídio de relaxina modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, caracterizado pelo fato de que o referido aminoácido codificado artificialmente compreende um grupo carbonila, um grupo amino-óxi, um grupo hidrazida, um grupo hidrazina, um grupo semicarbazida, um grupo azida, ou um grupo alquino.
7. 7. Polipeptídio de relaxina modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, caracterizado pelo fato de que o

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   3/17 referido aminoácido codificado artificialmente compreende um derivado de fenilalanina.
8. 8. Polipeptídio de relaxina modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, caracterizado pelo fato de que o referido aminoácido codificado artificialmente é selecionado dentre uma fenilalanina para-substituída, ortossubstituída, ou metassubstituída.
9. 9. Polipeptídio de relaxina modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, caracterizado pelo fato de que o referido aminoácido codificado artificialmente é selecionado dentre uma fenilalanina para-substituída, ortossubstituída, ou metassubstituída compreendendo um grupo carbonila, um grupo amino-óxi, um grupo hidrazida, um grupo hidrazina, um grupo semicarbazida, um grupo azida, ou um grupo alquino.
10. 10. Polipeptídio de relaxina modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, caracterizado pelo fato de que o referido aminoácido codificado artificialmente compreende para-acetilL-fenilalanina.
11. 11. Polipeptídio de relaxina modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10, caracterizado pelo fato de que o referido aminoácido codificado artificialmente é ligado ao referido componente peptídico.
12. 12. Polipeptídio de relaxina modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-11, caracterizado pelo fato de que o referido aminoácido codificado artificialmente é ligado ao referido melhorador farmacocinético através de uma ligação oxima ou de uma ligação triazol.
13. 13. Polipeptídio de relaxina modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-11, caracterizado pelo fato de que o referido aminoácido codificado artificialmente é ligado ao referido melhorador farmacocinético através de uma ligação oxima.

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    4/17
14. 14. Polipeptídio de relaxina modificada de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida cadeia A do polipeptídio de relaxina compreende a SEQ ID NO: 35, e a referida cadeia B do polipeptídio de relaxina compreende a SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6, e onde a referida cadeia A ou cadeia B da relaxina tem opcionalmente até duas substituições, inserções ou deleções de aminoácidos adicionais.
15. 15. Polipeptídio de relaxina modificada de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que compreende um polipeptídio da cadeia A da relaxina tendo pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 35 e um polipeptídio da cadeia B da relaxina tendo pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 5 ou com a SEQ ID NO: 6.
16. 16. Polipeptídio de relaxina modificada de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a cadeia A do polipeptídio de relaxina tem pelo menos 95% de identidade de sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 35.
17. 17. Polipeptídio de relaxina modificada de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a cadeia B do polipeptídio de relaxina tem pelo menos 95% de identidade de sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 5 ou com a SEQ ID NO: 6.
18. 18. Polipeptídio de relaxina modificada de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a cadeia A do polipeptídio de relaxina compreende a SEQ ID NO: 35 e a cadeia B do polipeptídio de relaxina compreende a SEQ ID NO: 5 ou a SEQ ID NO: 6.
19. 19. Polipeptídio de relaxina modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-18, caracterizado pelo fato de que o

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    5/17 referido componente peptídico compreende entre 2 e 25 aminoácidos.
20. 20. Polipeptídio de relaxina modificada de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o referido componente peptídico compreende entre 2 e 20 aminoácidos.
21. 21. Polipeptídio de relaxina modificada de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o referido componente peptídico compreende entre 3 e 10 aminoácidos.
22. 22. Polipeptídio de relaxina modificada de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o referido componente peptídico compreende entre 4 e 8 aminoácidos.
23. 23. Polipeptídio de relaxina modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-18, caracterizado pelo fato de que o referido componente peptídico compreende Glu, Glu^Y, GGGGS-Glu^Y (SEQ ID NO: 139), DRDDRD (SEQ ID NO: 102), KKKKKK-Glu^Y (SEQ ID NO: 103), RGGEEKKKEKEK-Glu^Y (SEQ ID NO: 104), GGGEEE-Glu^Y (SEQ ID NO: 105), EEEGGG-Glu^Y (SEQ ID NO: 106), KKKGGG-Glu^Y (SEQ ID NO: 107), GETGSSGEGT-Glu^Y (SEQ ID NO: 108), GGGKKKGlu^Y (SEQ ID NO: 109), GSHHHHHGS-Glu^Y (SEQ ID NO: 110), Sar-SarSar-Sar-Ser-Sar-Sar-Sar-Sar-Glu^Y (SEQ ID NO: 111), Sar-Sar-Sar-SarSer-Glu^Y (SEQ ID NO: 112), Sar-Sar-Sar-Glu-Glu-Glu^Y (SEQ ID NO: 113), KKKSGGSGG-Glu^Y (SEQ ID NO: 118), KKSGGSGG-Glu^Y (SEQ

    ID NO: 114), KKSGGSGG-Glu“ (SEQ ID NO: 115), KKSAGSAG-Glu^Y (SEQ ID NO: 116), KSGGSGG-Glu^Y (SEQ ID NO: 117), KKSGGSGGEE-Glu^Y (SEQ ID NO: 119), dKdKdKdKdKdK-Glu^Y (SEQ ID NO: 120), EESGGSGG-Glu^Y (SEQ ID NO: 121), GSGSGSGS-Glu^Y (SEQ ID NO: 123), EEEGGG-dGlu^Y (SEQ ID NO: 128), EGGGGSK-Glu^Y (SEQ ID NO: 130), EEEEEE-Glu^Y (SEQ ID NO: 131),

    EEEEPEEEEPEEEEPEEEE-Glu^Y (SEQ ID NO:

    EEEEPEEEEPEEEEPEEGGG (SEQ ID NO:

    EEEEGEEEEGEEEEGEEEE-Glu^Y (SEQ ID

    133),

    135) ,

    136) ,

    NO:

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    6/17

    KGGEEKKKEKEKEPKGGEEKKKEKEK-Glu^Y (SEQ ID NO: 137), EAQKAQAEAQKAQAEAQKAQA-GIuy (SEQ ID NO: 138), KK-Glu^Y (SEQ ID NO: 140), Glu^Y, KGPKGP-Glu^Y (SEQ ID NO: 146), SGGGSGlu^Y (SEQ ID NO: 147), KGGGS-Glu^Y (SEQ ID NO: 148), KGGGSE-Glu^Y (SEQ ID NO: 149), GSPGSP-Glu^Y (SEQ ID NO: 150), GGGGP-Glu^Y (SEQ ID NO: 151), EGGS-Glu^Y (SEQ ID NO: 152), EGGGP-Glu^Y (SEQ ID NO: 153), KGPGSE-Glu^Y (SEQ ID NO: 154), Espermina-Glu^Y, ou KKGGS-Glu^Y (SEQ ID NO: 156).
24. 24. Polipeptídio de relaxina modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-18, caracterizado pelo fato de que o referido componente peptídico compreende GGGGS-Glu^Y (SEQ ID NO: 139), DRDDRD (SEQ ID NO: 102), KKKKKK-Glu^Y (SEQ ID NO: 103), RGGEEKKKEKEK-Glu^Y (SEQ ID NO: 104), GGGEEE-Glu^Y (SEQ ID NO: 105), EEEGGG-Glu^Y (SEQ ID NO: 106), KKKGGG-Glu^Y (SEQ ID NO: 107), GGGKKK-Glu^Y (SEQ ID NO: 109), GSHHHHHGS-Glu^Y (SEQ ID NO: 110), Sar-Sar-Sar-Sar-Ser-Glu^Y (SEQ ID NO: 112), Sar-Sar-SarGlu-Glu-Glu^Y (SEQ ID NO: 113), ou KSGGSGG-Glu^Y (SEQ ID NO: 117).
25. 25. Polipeptídio de relaxina modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-18, caracterizado pelo fato de que o referido componente peptídico compreende Glu^Y.
26. 26. Polipeptídio de relaxina modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-18, caracterizado pelo fato de que o referido componente peptídico compreende GGGGS-Glu^Y (SEQ ID NO: 139).
27. 27. Polipeptídio de relaxina modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-18, caracterizado pelo fato de que o polipeptídio de relaxina compreende a cadeia A do polipeptídio de relaxina de SEQ ID NO: 4 e a cadeia B do polipeptídio de relaxina de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6, substituídos com um aminoácido codificado artificialmente no resíduo 1 da cadeia A, onde o referido

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    7/17 aminoácido codificado artificialmente é ligado ao referido melhorador farmacocinético e o referido melhorador farmacocinético compreende o componente peptídico GGGGS-Glu^Y (SEQ ID NO: 139).
28. 28. Polipeptídio de relaxina modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-27, caracterizado pelo fato de que a referida porção prolongadora da meia-vida compreende um ácido graxo ou um derivado do mesmo, onde o ácido graxo ou o derivado do mesmo é covalentemente ligado ao componente peptídico.
29. 29. Polipeptídio de relaxina modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-27, caracterizado pelo fato de que a referida porção prolongadora da meia-vida compreende um ácido graxo saturado ou um derivado do mesmo.
30. 30. Polipeptídio de relaxina modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-29, caracterizado pelo fato de que a referida porção prolongadora da meia-vida compreende um ácido graxo terminado com um ácido carboxílico.
31. 31. Polipeptídio de relaxina modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-30, caracterizado pelo fato de que a referida porção prolongadora da meia-vida compreende um ácido graxo de fórmula I:

    -Cn-COOH (Fórmula I) onde n varia entre 10 e 18.
32. 32. Polipeptídio de relaxina modificada de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que n varia entre 12 e 17.
33. 33. Polipeptídio de relaxina modificada de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que n é 13, 14, ou 15.
34. 34. Polipeptídio de relaxina modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-33, caracterizado pelo fato de que a referida porção prolongadora da meia-vida compreende -C14-COOH.
35. 35. Polipeptídio de relaxina modificada de acordo com

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    8/17 qualquer uma das reivindicações 1-34, caracterizado pelo fato de que o referido melhorador farmacocinético compreende:

    HO.

    H H t ti â ^H O ^H Ô ? H

    A -'X N N '-' Y ^H Á O HO O

    GGGGS-Glu^Y-C14-C00H (Fórmula II) onde o grupo amino-óxi é ligado ao aminoácido artificial no referido polipeptídio de relaxina modificado.
36. 36. Polipeptídio de relaxina modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-35, caracterizado pelo fato de que a referida porção prolongadora da meia-vida é conjugada ao referido componente peptidico através de uma ligação amida.
37. 37. Polipeptídio de relaxina modificada de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídio de relaxina compreende a cadeia A do polipeptídio de relaxina de SEQ ID NO: 4 e a cadeia B do polipeptídio de relaxina de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6, substituídos com um aminoácido codificado artificialmente no resíduo 1 da cadeia A;

    onde o referido aminoácido codificado artificialmente compreende para-acetil-L-fenilalanina ligada ao referido melhorador farmacocinético que compreende um componente peptidico compreendendo GGGGS-Glu^Y (SEQ ID NO: 139); e uma porção prolongadora da meia-vida compreendendo C14-COOH.
38. 38. Polipeptídio de relaxina modificada compreendendo:

    o

    AQÍ-Relaxina γ\·™^!

    H s M

    Y* •o''*·'·' * Y~ Jj T

    CH, O Õ

    H

    -Vy -A O HO* -O (Fórmula III)

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    9/17 caracterizado pelo fato de que a referida AQ1-Relaxina compreende um polipeptídio da cadeia A da relaxina tendo pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 35 e um polipeptídio da cadeia B da relaxina tendo pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 5 ou com a SEQ ID NO: 6, onde a para-acetil-fenilalanina modificada representada na fórmula III fica localizada no terminal N do referido polipeptídio de cadeia A da relaxina.
39. 39. Polipeptídio de relaxina modificada de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que a cadeia A do polipeptídio de relaxina tem pelo menos 95% de identidade de sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 35.
40. 40. Polipeptídio de relaxina modificada de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que a cadeia B do polipeptídio de relaxina tem pelo menos 95% de identidade de sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 5 ou com a SEQ ID NO: 6.
41. 41. Polipeptídio de relaxina modificada de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que AQ1-Relaxina compreende um polipeptídio da cadeia A da relaxina de SEQ ID NO: 35 e um polipeptídio da cadeia B da relaxina de SEQ ID NO: 5 ou de SEQ ID NO: 6.
42. 42. Polipeptídio de relaxina modificada caracterizado pelo fato de que compreende AQ1-GGGGS-Glu^Y (SEQ ID NO: 139)C14-COOH que compreende a estrutura mostrada na FIG. 8, que compreende a estrutura mostrada na FIG. 9, ou que compreende um polipeptídio da cadeia A da relaxina de SEQ ID NO: 35 e um polipeptídio da cadeia B da relaxina de SEQ ID NO: 6, onde a para-acetil-fenilalanina modificada localizada no terminal N da referida cadeia A do polipeptídio de relaxina é ligada ao melhor farmacocinético GGGGS-Glu^Y (SEQ ID NO: 139)-014-COOH, representado na fórmula III:

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    10/17 o

    AQl-Relaxina y^J--..O’

    HO.

    O «

    Χλ o0

    J

    N '

    H

    A> ό

    HO 0 (Fórmula III)
43. 43. Polipeptidio de relaxina modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-42, caracterizado pelo fato de que é biologicamente ativo.
44. 44. Polipeptidio de relaxina modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-43, caracterizado pelo fato de que é terapeuticamente eficaz para o tratamento de uma ou mais doenças ou condições associadas à relaxina.
45. 45. Polipeptidio de relaxina modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-44, caracterizado pelo fato de que resulta em menos formação de vacúolos renais em comparação com AQ1-20kDa PEG.
46. 46. Polipeptidio de relaxina modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-45, caracterizado pelo fato de que resulta em nenhum enfraquecimento ou em enfraquimento reduzido da função renal em comparação com AQ1-20kDa PEG.
47. 47. Polipeptidio de relaxina modificada de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que a referida função renal é medida pela determinação de uma ou mais dentre taxa de filtração glomerular estimada, depuração de creatina, taxa de filtração glomerular de insulina, ou taxa de filtração glomerular isotópica.
48. 48. Polipeptidio de relaxina modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-47, caracterizado pelo fato de que não reduz o fluxo sanguíneo renal depois da administração.
49. 49. Polipeptidio de relaxina modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-48, caracterizado pelo fato de que é capaz de aumentar o fluxo sanguíneo renal depois da administração.

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50. 50. Método como definido na reivindicação 48 ou 49, caracterizado pelo fato de que o referido fluxo sanguíneo renal é medido pela determinação da depuração de para-amino-hipurato.
51. 51. Polipeptídio de relaxina modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-50, caracterizado pelo fato de que apresenta uma meia-vida in vivo aumentada.
52. 52. Polipeptídio de relaxina modificada de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que a referida meia-vida in vivo é aumentada em pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes, ou pelo menos 50 vezes.
53. 53. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídio de relaxina modificada como definido em qualquer uma das reivindicações 1-52 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
54. 54. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade eficaz de um polipeptídio de relaxina modificada como definido em qualquer uma das reivindicações 1-52, para o tratamento de um distúrbio associado à relaxina e um veículo farmaceuticamente aceitável.
55. 55. Método para tratar de uma doença associada à relaxina caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma quantidade eficaz de um polipeptídio de relaxina modificada como definido em qualquer uma das reivindicações 1-52 ou de uma composição como definida emde acordo com qualquer uma das reivindicações 53-54, a um paciente com necessidade do mesmo.
56. 56. Método para tratar de uma doençuma doença cardiovascular caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma quantidade eficaz de um polipeptídio de relaxina modificada como definido em qualquer uma das reivindicações 1-52 ou de uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 53-54,

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    12/17 a um paciente com necessidade do mesmo.
57. 57. Método de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que a referida doença cardiovascular é selecionada dentre doença arterial coronariana, ataque cardíaco, arritmia, insuficiência cardíaca, cardiomiopatia, e doença vascular.
58. 58. Método para tratar ou aliviar um sintoma de insuficiência cardíaca caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma quantidade eficaz de um polipeptídio de relaxina modificada como definido em qualquer uma das reivindicações 1-52 ou de uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 53-54, a um paciente com necessidade do mesmo.
59. 59. Método de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que a referida insuficiência cardíaca é selecionada dentre insuficiência cardíaca avançada, síndrome cardiorenal, insuficiência cardíaca com função renal enfraquecida, insuficiência cardíaca crônica, insuficiência cardíaca crônica com fração de ejeção intermediária (HFmEF), insuficiência cardíaca aguda, insuficiência cardíaca aguda no pós-operatório, insuficiência cardíaca compensada, insuficiência cardíaca descompensada, insuficiência cardíaca direita, insuficiência cardíaca esquerda, insuficiência cardíaca global, cardiomiopatia isquêmica, cardiomiopatia dilatada, insuficiência cardíaca associada a defeitos cardíacos congênitos, insuficiência cardíaca associada a defeitos da válvula cardíaca, insuficiência cardíaca associada a defeitos combinados da válvula cardíaca, diabetic insuficiência cardíaca, cardiomiopatia alcoólica, insuficiência cardíaca associada a distúrbios cardíacos de armazenamento, insuficiência cardíaca diastólica, insuficiência cardíaca sistólica, pós-remodelagem miocardíaca, insuficiência cardíaca com fração de ejeção preservada (HFpEF), insuficiência cardíaca com fração de ejeção reduzida (HFrEF), angina, hipertensão, hipertensão pulmonar, e hipertensão arterial

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    13/17 pulmonar.
60. 60. Método de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que a referida insuficiência cardíaca é selecionada dentre insuficiência cardíaca crônica, insuficiência cardíaca aguda, insuficiência cardíaca aguda no pós-operatório, insuficiência cardíaca crônica com fração de ejeção reduzida (HFrEF), insuficiência cardíaca crônica com fração de ejeção preservada (HFpEF), insuficiência cardíaca crônica com fração de ejeção intermediária (HFmEF), insuficiência cardíaca diastólica, insuficiência cardíaca sistólica, pós-remodelagem miocardíaca, angina, hipertensão, hipertensão pulmonar e hipertensão arterial pulmonar.
61. 61. Método de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que a referida insuficiência cardíaca é selecionada dentre insuficiência cardíaca aguda no pós-operatório, insuficiência cardíaca avançada, síndrome cardio-renal, e insuficiência cardíaca com função renal enfraquecida.
62. 62. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 55-61, caracterizado pelo fato de que compreende ainda administrar em combinação, concomitantemente ou sequencialmente, com o referido polipeptídio de relaxina modificado, pelo menos um agente terapêutico adicional selecionado dentre inibidores de ACE, βbloqueadores, diuréticos, antagonistas do receptor de mineralocorticoides, moduladores do receptor de rianodina, ativadores de SERCA2a, inibidores de renina, bloqueadores do canal de cálcio, agonistas do receptor de adenosina A1, receptor parcial de adenosina A1, inibidores de dopamina β-hidroxilase, antagonistas do receptor de angiotensina II, antagonistas do receptor de angiotensina II com agonismo tendencioso para vias de sinalização celular selecionadas, combinações de antagonistas do receptor de angiotensina II e inibidores da enzima neprilisina, inibidores da enzima neprilisina, ativadores da

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    14/17 guanilato ciclase solúvel, ativadores de miosina ATPase, inibidores da quinase rho 1, inibidores da quinase rho 2, agonistas do receptor de apelina, compostos doadores de nitroxila, inibidores da quinase II dependente de cálcio, agentes antifibróticos, inibidores da galectina-3, antagonistas do receptor de vasopressina, moduladores do receptor de FPR2, agonistas do receptor de peptídio natriurético, transient receptor potential vanilloid-4 channel bloqueadores, agentes antiarrítimicos, bloqueadores do canal de corrente esquisita If, nitratos, compostos à base de digitalis, agentes ionotrópicos, agonistas do receptor β, agentes de resselagem de membrana celular, por exemplo, Poloxâmero 188, agentes anti-hiperlipidêmicos, agentes aumentadores do HDL plasmático, agentes hipercolesterolâmicos, inibidores da biossíntese de colesterol (tal como inibodres de HMG CoA redutase), agonista de LXR, agonista de FXR, probucol, raloxifeno, ácido nicotínico, niacinaamida, inibidores da absorção de colesterol, sequestrantes de ácido biliar, resinas trocadoras de ânions, aminas quaternárias, colestiramina, colestipol, indutores do receptor de lipoproteínas de baixa densidade, clofibrato, fenofibrato, bezafibrato, ciprofibrato, gemfibrizol, vitamina B6, vitamina B12, vitaminas antioxidantes, agentes antidiabéticos, inibidores da agregação plaquetária, antagonistas do receptor de fibrinogênio, derivados de aspirina e ácido fíbrico, inibidores de PCSK9, aspirina, e inibidores de P2Y12 tal como Clopidogrel.
63. 63. Método para tratar uma doença associada à fibrose, caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídio de relaxina modificada como definido em qualquer uma das reivindicações 1-52 ou de uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 53-54, a um paciente com necessidade do mesmo.
64. 64. Método de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de que a referida doença associada à fibrose

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    15/17 compreende fibrose do coraçãoo, pulmão, rim, medula óssea, ou fígado, fibrose dermatológica, ou um distúrbio ocular fibrótico.
65. 65. Método de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que a referida doença associada à fibrose é selecionada dentre fibrose hepática, esteato-hepatite não alcoólica (NASH), cirrose, pré-cirrose, doença pulmonar parenquimatosa solução aquosafusa, fibrose cistíca, fibrose pulmonar, fibrose maciça progressiva, fibrose pulmonar idiopática, fibrose após injeção, fibrose renal, doença renal crônica, doença renal do diabetes, glomerulosclerose segmentai focal, nefropatia membranosa, nefropatia por IgA, mielofibrose, insuficiência cardíaca, insuficiência cardíaca metabólica, fibrose cardíaca, fibrose capsular, catarata, cicatrização ocular, fibrose pancreática, fibrose cutânea, fibrose intestinal, estenose intestinal, fibrose endomiocardíaca, fibrose atrial, fibrose mediastinal, doença de Crohn, fibrose retroperitoneal, queloide, fibrose sistêmica nefrogênica, esclerodermia, esclerose sistêmica, artrofibrose, sindrome de Peyronie, contratura de Dupuytren, nefropatia diabética, capsulite adesiva, doença hepática alcoólica, hepatoesteatose, hepatite viral, doença biliar, hemocromatose primária, cirrose medicamentosa, cirrose criptogênica, doença de Wilson, deficiência de alfa 1-antitripsina, doença pulmonar intersticial (ILD), doença pulmonar fibrótica humana, degeneração macular, retinopatia retiniana, retinopatia vítrea, fibrose miocardíaca, oftalmopatia de Grave, ergotismo induzido por drogas, doença cardiovascular, aterosclerose/restenose, cicatrizes hipertróficas, mielofibrose primária ou idiopática, doença do intestino inflamado, e colite colagenosa.
66. 66. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 63-65, caracterizado pelo fato de que compreende ainda administerrar em combinação, concomitantemente ou sequencilamente, com o referido polipeptídio de relaxina modificado, pelo menos um

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    16/17 agente contra fibrose ao referido paciente.
67. 67. Método de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de que pelo menos um agente contra fibrose é selecionado dentre nintedanib, Pirfenidona, antagonistas de LPA1, antagonistas do receptor de LPA1, análogos de GLP1, tralokinumab (IL13, AstraZeneca), vismodegib (antagonista de hedgehog, Roche), PRM151 (pentraxina-2, TGF beta-1, Promedior), SAR-156597 (Mab biespecifico IL-4&IL-13, Sanofi), simtuzumab ((anticorpo anti-lisil oxidase-like 2 (anti-LOXL2), Gilead), CKD-942, PTL-202 (PDE inalado/pentoxifilina/NAC liberação controlada oral, Pacific Ther.), omipalisib (inibidor oral de PI3K/mT0R, GSK), IW-001 (modulador de colágeno bovino tipo V solução oral, ImmuneWorks), STX-100 (integrina alfa V/ beta-6 ant, Stromedix/ Biogen), Actimmune (IFN gama), PC-SOD (midismase; inalado, LTT Bio-Pharma / CKD Pharm), lebrikizumab (mAb humanizado anti-IL-13 SC, Roche), AQX-1125 (ativador de SHIP1, Aquinox), CC-539 (inibidor de JNK, Celgene), FG-3019 (FibroGen), SAR-100842 (Sanofi), e ácido obeticólico (OCA ou INT-747, Intercept).
68. 68. Método para tratar ou prevenir insuficiência renal, caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídio de relaxina modificada como definido em qualquer uma das reivindicações 1-52 ou de uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 53-54, a um paciente com necessidade do mesmo.
69. 69. Método para melhorar, estabilizar ou restaurar a função renal em um paciente com necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídio de relaxina modificada como definido em qualquer uma das reivindicações 1-52 ou de uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 53-54 ao paciente.

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    17/17
70. 70. Método para produzir um polipeptídio de relaxina modificada como definido em qualquer uma das reivindicações 1-52, caracterizado pelo fato de que compreende:

    (a) apresentar um polipeptídio compreendendo a cadeia A da referida relaxina e a cadeia B da referida relaxina, onde o referido polipeptídio compreende o referido aminoácido codificado artificialmente; e (b) ligar o referido aminoácido codificado artificialmente ao referido melhorador farmacocinético.
71. 71. Método de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de que o referido aminoácido codificado artificialmente é ligado ao referido melhorador farmacocinético por uma ligação oxima.
72. 72. Método de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pelo fato de que a referida ligação oxima é formada pela reação de um grupo carbonila e um grupo amino-óxi.
73. 73. Método de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que o referido grupo carbonila é um substituinte do referido aminoácido codificado artificialmente, e o referido grupo amino-óxi é um constituinte do referido melhorador farmacocinético.
74. 74. Método de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que o referido grupo amino-óxi é um substituinte do referido aminoácido codificado artificialmente, e o referido grupo carbonila é um constituinte do referido melhorador farmacocinético.
75. 75. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 70-74, caracterizado pelo fato de que o referido aminoácido codificado artificialmente é incorporado de forma ribossômica no referido polipeptídio.