JP2916228B2 - 遺伝子操作した組み換えアプロチニン変異型、均質に処理されたアプロチニン変異型の微生物調製の方法およびその治療学的使用 - Google Patents
遺伝子操作した組み換えアプロチニン変異型、均質に処理されたアプロチニン変異型の微生物調製の方法およびその治療学的使用Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、組み換えアプロチニン変異型、形質転換し
た酵母菌で均質に処理した分泌産生物硫酸アンモニウム
前記アプロチニン変異型を調製する方法、および組み換
えアプロチニン変異型を含有する薬物に関する。
た酵母菌で均質に処理した分泌産生物硫酸アンモニウム
前記アプロチニン変異型を調製する方法、および組み換
えアプロチニン変異型を含有する薬物に関する。
アプロチニンは、58アミノ酸を含有し、そしてトリプ
シン、キモトリプシンおよび血漿カリクレインを阻害す
ることが知られている、よく研究されているタンパク質
である[H.FritzおよびG.Wunderer、Drug.Res.33、479-
494、1983;W.Gebhard、H.TschescheおよびH.Fritz、プ
ロテイナーゼ阻害因子(Proteinase Inhibitors)、Bar
rettおよびSalvesen(編)、Elsevier Science Publ.BV
375-387、1986)。
シン、キモトリプシンおよび血漿カリクレインを阻害す
ることが知られている、よく研究されているタンパク質
である[H.FritzおよびG.Wunderer、Drug.Res.33、479-
494、1983;W.Gebhard、H.TschescheおよびH.Fritz、プ
ロテイナーゼ阻害因子(Proteinase Inhibitors)、Bar
rettおよびSalvesen(編)、Elsevier Science Publ.BV
375-387、1986)。
ウシの器官から得られるアプロチニンは薬物Trasylol
中の活性物質であり、この薬物は種々の疾患、例え
ば、線溶亢進性出血および外傷出血ショックの処置のた
めに使用される。
中の活性物質であり、この薬物は種々の疾患、例え
ば、線溶亢進性出血および外傷出血ショックの処置のた
めに使用される。
さらに、新しい臨床的発見が存在し、この発見は開心
術における線維素溶解および凝固により引き起こされる
血液の損失はTrasylol の使用によりかなり減少するこ
とができることを示す(W.van Oeveren et al.、Ann.Th
orac.Surg.44、640-645、1987;D.Royston et al.、Lanc
et II、1289-1291、1987;B.P.Bistrup et al.、Lancet
I、366-367、1988)。
術における線維素溶解および凝固により引き起こされる
血液の損失はTrasylol の使用によりかなり減少するこ
とができることを示す(W.van Oeveren et al.、Ann.Th
orac.Surg.44、640-645、1987;D.Royston et al.、Lanc
et II、1289-1291、1987;B.P.Bistrup et al.、Lancet
I、366-367、1988)。
そのアミン酸配列の位置15にリジンの代わりに他のア
ミノ酸を含有するアプロチニンの半合成的に発生した相
同体は、アプロチニンのそれらと明確に異なる作用のプ
ロフィルおよび作用の特異性を有することを示すことが
できた[Tsche sche et al.、米国特許第4,595,674号;
H.R.Wenzel et al.、ペプチドおよびタンパク質の化学
(Chemistry of Peptides and Proteins)、Vol.3、198
5]。
ミノ酸を含有するアプロチニンの半合成的に発生した相
同体は、アプロチニンのそれらと明確に異なる作用のプ
ロフィルおよび作用の特異性を有することを示すことが
できた[Tsche sche et al.、米国特許第4,595,674号;
H.R.Wenzel et al.、ペプチドおよびタンパク質の化学
(Chemistry of Peptides and Proteins)、Vol.3、198
5]。
これらの半合成アプロチニン相同体のあるもは、例え
ば、膵臓および白血球からのエラスターゼへ強い阻害作
用を有する。この作用の新規な特異性のために、これら
のアプロチニン相同体はエラスターゼの開放の増加によ
り引き起こされる疾患、例えば、気腫の発生、ARDS(大
人の呼吸窮迫症候群)および慢性間接リウマチのために
治療学的に使用することができる。
ば、膵臓および白血球からのエラスターゼへ強い阻害作
用を有する。この作用の新規な特異性のために、これら
のアプロチニン相同体はエラスターゼの開放の増加によ
り引き起こされる疾患、例えば、気腫の発生、ARDS(大
人の呼吸窮迫症候群)および慢性間接リウマチのために
治療学的に使用することができる。
位置15にアルギニンを有する他のアプロチニン相同体
は、血液凝固のカスケードの中央に含まれる血漿カリク
レインヘのアプロチニンの阻害作用より明確により大き
い阻害作用により特性決定される。
は、血液凝固のカスケードの中央に含まれる血漿カリク
レインヘのアプロチニンの阻害作用より明確により大き
い阻害作用により特性決定される。
ウシのアプロチニンの半合成的修飾により達成可能な
収率は小さいことが、経験により示された。したがっ
て、有利には合成的に調製した遺伝子を使用して大量の
アプロチニン相同体調製するために、組み換え遺伝子産
生物を発酵により調製した[Auerswald et al.、欧州特
許(EP)01238993A2号;B.V.Wilcken-Bergman et al.、E
MBO J.、5、3219-3225、1986]。
収率は小さいことが、経験により示された。したがっ
て、有利には合成的に調製した遺伝子を使用して大量の
アプロチニン相同体調製するために、組み換え遺伝子産
生物を発酵により調製した[Auerswald et al.、欧州特
許(EP)01238993A2号;B.V.Wilcken-Bergman et al.、E
MBO J.、5、3219-3225、1986]。
例えば、E.coli K12菌株中の組み換えアプロチニン変
異型の調製に使用する発現系は、細胞内封入体の形態
で、アプロチニンの突然異変タンパク質を融合タンパク
質として蓄積するものであり、アプロチニン突然異変タ
ンパク質は、細胞内で、適当な融合相手、例えば、MS2
レプリカーゼのN末端ペプチド部分と形成する(E.A.Au
erswald et al.、Biol.Chem.Hoppe Seyler 369、27-3
5、1988)。
異型の調製に使用する発現系は、細胞内封入体の形態
で、アプロチニンの突然異変タンパク質を融合タンパク
質として蓄積するものであり、アプロチニン突然異変タ
ンパク質は、細胞内で、適当な融合相手、例えば、MS2
レプリカーゼのN末端ペプチド部分と形成する(E.A.Au
erswald et al.、Biol.Chem.Hoppe Seyler 369、27-3
5、1988)。
これらを別として、また、E.coli発現系/分泌系を使
用することは可能であり、これらの系は、アプロチニン
突然変異タンパク質と分泌シグナルペプチドのための適
当な遺伝子配列、例えば、OmpA配列またはphoAシグナル
配列との融合により、阻害アプロチニン変異型をバクテ
リア細胞のペリプラズム中に分泌することができるよう
にする[個人的情報、W.バーンズ博士−バイエル社;C.
B.Marks et al.、J.Biol.Chem.261、7115-7118、198
6]。
用することは可能であり、これらの系は、アプロチニン
突然変異タンパク質と分泌シグナルペプチドのための適
当な遺伝子配列、例えば、OmpA配列またはphoAシグナル
配列との融合により、阻害アプロチニン変異型をバクテ
リア細胞のペリプラズム中に分泌することができるよう
にする[個人的情報、W.バーンズ博士−バイエル社;C.
B.Marks et al.、J.Biol.Chem.261、7115-7118、198
6]。
真核生物系のうちで、酵母菌発現系は組み換えアプロ
チニン変異型の遺伝子操作の調製にとくに適当であり、
ここで遺伝子酸生物は細胞内に蓄積されるか、あるいは
酵母菌からの適当な分泌シグナル配列との融合として、
分泌通路を通過しそして、膜プロテアーゼにより切断
後、阻害物質として培地中に輸送される。分泌のために
使用することができる適当なシグナル配列の例は、アル
ファ−交換因子、アルファ−アミラーゼ、グルコアミラ
ーゼまたはインベルターゼのシグナル配列である。
チニン変異型の遺伝子操作の調製にとくに適当であり、
ここで遺伝子酸生物は細胞内に蓄積されるか、あるいは
酵母菌からの適当な分泌シグナル配列との融合として、
分泌通路を通過しそして、膜プロテアーゼにより切断
後、阻害物質として培地中に輸送される。分泌のために
使用することができる適当なシグナル配列の例は、アル
ファ−交換因子、アルファ−アミラーゼ、グルコアミラ
ーゼまたはインベルターゼのシグナル配列である。
しかしながら、E.coliおよび酵母菌の外に、また、ト
ランスアクチベーターの調製のために多数の他の原核生
物および真核生物発現系/分泌系、例えば、バチルス属
(Bacillus)、ブドウ球菌属(Staphylococcus)または
アスペルギルス属(Aspergillus)を使用することがで
きる。
ランスアクチベーターの調製のために多数の他の原核生
物および真核生物発現系/分泌系、例えば、バチルス属
(Bacillus)、ブドウ球菌属(Staphylococcus)または
アスペルギルス属(Aspergillus)を使用することがで
きる。
前述の例が示すように、種々の原核生物および真核生
物の系におけるアプロチニン突然変異タンパク質の発現
はこの技術水準である。
物の系におけるアプロチニン突然変異タンパク質の発現
はこの技術水準である。
これに関して、工業的規模の調製にかんがみて、細胞
内に蓄積された形態でなく、この系に固有の分泌機構を
利用することによって、アプロチニン変異型を発酵媒質
中に輸送された活性物質として得ることは有利である。
内に蓄積された形態でなく、この系に固有の分泌機構を
利用することによって、アプロチニン変異型を発酵媒質
中に輸送された活性物質として得ることは有利である。
この目的に、酵母菌系を使用するとき、分泌酵母菌タ
ンパク質のシグナル配列、例えば、アルファ−アミラー
ゼ、グルコアミラーゼ、インベルターゼまたはアルファ
−交配因子のシグナル配列を遺伝子操作によりアプロチ
ニン変異型のN末端に融合する。
ンパク質のシグナル配列、例えば、アルファ−アミラー
ゼ、グルコアミラーゼ、インベルターゼまたはアルファ
−交配因子のシグナル配列を遺伝子操作によりアプロチ
ニン変異型のN末端に融合する。
アプロチニン変異型のN末端のシグナルペプチドの酵
素による切断は、酵母菌に対して固有でありかつ特異的
切断配列(シグナルペプチドのC末端における)を認識
する酵素により、膜輸送により起こる(参照、Review A
rticle R.C.DasおよびJ.L.Schultz、Biotec.Progress
3、43-48、1987)。
素による切断は、酵母菌に対して固有でありかつ特異的
切断配列(シグナルペプチドのC末端における)を認識
する酵素により、膜輸送により起こる(参照、Review A
rticle R.C.DasおよびJ.L.Schultz、Biotec.Progress
3、43-48、1987)。
しかしながら、酵母菌において発現される自然N末端
配列「Arg-Pro-Asp」をもつ組み換えアプロチニン変異
型の場合において、分泌された物質は種々の融合したシ
グナルペプチドのアミノ酸の変動するN末端付加を有す
ることが明らかにされた。精製に適当な均一にかつ正し
くプロセシングされた分泌産生物は発見されていない。
配列「Arg-Pro-Asp」をもつ組み換えアプロチニン変異
型の場合において、分泌された物質は種々の融合したシ
グナルペプチドのアミノ酸の変動するN末端付加を有す
ることが明らかにされた。精製に適当な均一にかつ正し
くプロセシングされた分泌産生物は発見されていない。
分泌産生物の部分的または完全な誤ったプロセシング
は、また、酵母菌に対して固有の分泌シグナル配列との
融合産物として発現された他の異種タンパク質について
文献に記載されている(R.C.DasおよびJ.L.Schultz、Bi
otec.Progress 3、43-48、1987;P.J.et al.、J.Biol.Ch
em.263、16471-16478、1988)。
は、また、酵母菌に対して固有の分泌シグナル配列との
融合産物として発現された他の異種タンパク質について
文献に記載されている(R.C.DasおよびJ.L.Schultz、Bi
otec.Progress 3、43-48、1987;P.J.et al.、J.Biol.Ch
em.263、16471-16478、1988)。
驚くべきことには、今回、遺伝子操作により修飾され
そして、例えば、位置2にアミド酸プロリンの欠失を有
するか、あるいはAla-(−2)‐Gln-(−1)(また
は、アラニル−グルタミニル−残基)のN末端付加を有
するアプロチニン変異型が、高い百分率で、酵母菌中で
正しく発現されることが発見された。
そして、例えば、位置2にアミド酸プロリンの欠失を有
するか、あるいはAla-(−2)‐Gln-(−1)(また
は、アラニル−グルタミニル−残基)のN末端付加を有
するアプロチニン変異型が、高い百分率で、酵母菌中で
正しく発現されることが発見された。
こうして、本発明は、位置2にアミノ酸プロリンの欠
失を有するか、あるいはアラニン−(−2)−グルタミ
ン−(−1)の付加を有する組み換えアプロチニンまた
はアプロチニン変異型に関する。アプロチニンはヒトま
たは動物の由来であることができる。
失を有するか、あるいはアラニン−(−2)−グルタミ
ン−(−1)の付加を有する組み換えアプロチニンまた
はアプロチニン変異型に関する。アプロチニンはヒトま
たは動物の由来であることができる。
非常にとくに好ましいアプロチニン変異型は、 からなる群からのものである。
本発明は、また、前述のアプロチニンの1種または2
種以上を含有する薬物に関する。
種以上を含有する薬物に関する。
好ましいアプロチニンは、前述の交換に加えて、位置
12、13、14、15、16、17、18、19、34、36、37、38、3
9、41、42および52の1または2以上の他の交換を有す
る。各位置に存在することができる交換およびアミノ酸
についてのそれ以上の詳細は、欧州特許(EP)238,993
号、297,362号および307,592号に記載されている。
12、13、14、15、16、17、18、19、34、36、37、38、3
9、41、42および52の1または2以上の他の交換を有す
る。各位置に存在することができる交換およびアミノ酸
についてのそれ以上の詳細は、欧州特許(EP)238,993
号、297,362号および307,592号に記載されている。
以下の実施例は、自然アプロチニンと比較して修飾さ
れたN末端アミノ酸配列を有する、組み換えアプロチニ
ン突然変異タンパク質(mutein)の遺伝子操作した構成
を記載する。さらに、酵母菌中のアルファ−交配因子pr
e-pro配列をもつ融合産生物としてのこれらのアプロチ
ニン突然変異タンパク質の発現、およびプロセシングさ
れた分泌産生物の精製を例示する。単離されたアプロチ
ニン変異型の主として均一なN末端のプロセシングおよ
びその阻害性質を、同様に示す。
れたN末端アミノ酸配列を有する、組み換えアプロチニ
ン突然変異タンパク質(mutein)の遺伝子操作した構成
を記載する。さらに、酵母菌中のアルファ−交配因子pr
e-pro配列をもつ融合産生物としてのこれらのアプロチ
ニン突然変異タンパク質の発現、およびプロセシングさ
れた分泌産生物の精製を例示する。単離されたアプロチ
ニン変異型の主として均一なN末端のプロセシングおよ
びその阻害性質を、同様に示す。
方法: 酵素および標準の技術 分子の遺伝子実験のための酵素は、ベーリンガー・マ
ンヘイム(Boehringer Mannheim)(FRG)、ギブコ(Gi
bco)−BRL(米国)およびファーマシア(スウェーデ
ン)から入手した。
ンヘイム(Boehringer Mannheim)(FRG)、ギブコ(Gi
bco)−BRL(米国)およびファーマシア(スウェーデ
ン)から入手した。
分子遺伝子実験のための標準の技術、例えば、E.coli
からのプラスミドDNAの単離、種々の酵素を使用するク
ローニング実験のためのDNA断片の単離および結合は、
次の文献に記載されている:マニアチス(Maniatis)
ら、モレキュラー・クローニング(Molecular Clonin
g)、コールド・スプリング・ハーバー(Cold Spring H
arbor)(1982)。
からのプラスミドDNAの単離、種々の酵素を使用するク
ローニング実験のためのDNA断片の単離および結合は、
次の文献に記載されている:マニアチス(Maniatis)
ら、モレキュラー・クローニング(Molecular Clonin
g)、コールド・スプリング・ハーバー(Cold Spring H
arbor)(1982)。
DNAの合成 アプロチニン変異型およびDNAプライマーの調製に要
求されるDNAブロック[特異的突然変異誘発(directed
mutagenesis)]を、アプライド・バイオシステムス(A
pplied Biosystems)380A DNA合成装置を使用して調製
した。脱保護されたDNAオリゴヌクレオチドは、変性ポ
リアクリルアミドゲルの電気泳動によるか、あるいは高
圧液体クロマトグラフィー(HPLC)によるトリチル誘導
体として、日常的に精製した。
求されるDNAブロック[特異的突然変異誘発(directed
mutagenesis)]を、アプライド・バイオシステムス(A
pplied Biosystems)380A DNA合成装置を使用して調製
した。脱保護されたDNAオリゴヌクレオチドは、変性ポ
リアクリルアミドゲルの電気泳動によるか、あるいは高
圧液体クロマトグラフィー(HPLC)によるトリチル誘導
体として、日常的に精製した。
特異的突然変異誘発 特定のアミノ酸コドンまたは遺伝子区画の特異的突然
変異誘発は、エクステイン(Eckstein)の方法(J.W.Ta
ylor、J.OttおよびF.Eckstein、Nucl.Acids Res.13、87
64-8785)により、アマーシャム‐ブヒラー(Amersham-
Buchler)(注文No.RPN.2322)を使用して実施する。
変異誘発は、エクステイン(Eckstein)の方法(J.W.Ta
ylor、J.OttおよびF.Eckstein、Nucl.Acids Res.13、87
64-8785)により、アマーシャム‐ブヒラー(Amersham-
Buchler)(注文No.RPN.2322)を使用して実施する。
DNAの配列決定 遺伝子およびベクターの構成体のDNA配列を検査する
ために、M13ベクター中のサブクローニングした一本鎖D
NAをサンガー(Sanger)の方法(F.Sanger et al.、PNA
S 74、5463-5467、1977)配列決定した。二本鎖DNAは、
M.ハットリおよびY.サカイの方法(Anal.Biochem.152、
232-238、1986)により配列決定した。
ために、M13ベクター中のサブクローニングした一本鎖D
NAをサンガー(Sanger)の方法(F.Sanger et al.、PNA
S 74、5463-5467、1977)配列決定した。二本鎖DNAは、
M.ハットリおよびY.サカイの方法(Anal.Biochem.152、
232-238、1986)により配列決定した。
サッカロミセス・セレビシアエ(S.cerevisiae)の形質
転換 100mlの菌株SC106(MAT−アルファ、hom3、ga12、his
6、ura3;菌株S2207A、Yeast Genetic Stock Cente、カ
リフォルニア・バーケレイ大学、米国カリフォルニア州
94720)の酵母菌の2×107/mlの細胞濃度を有する懸濁
液を遠心した;細胞の沈降を5mlのTE緩衝液(10ミリモ
ルのトリス×HC1、pH7.5、1ミリモルのEDTA)で1回、
次いで5mlのLiA緩衝液(TE緩衝中の0.1モルの酢酸リチ
ウム)で洗浄した。次いで、細胞を1mlのLiA緩衝液中に
懸濁し、そして30℃において1時間インキュベーション
した。
転換 100mlの菌株SC106(MAT−アルファ、hom3、ga12、his
6、ura3;菌株S2207A、Yeast Genetic Stock Cente、カ
リフォルニア・バーケレイ大学、米国カリフォルニア州
94720)の酵母菌の2×107/mlの細胞濃度を有する懸濁
液を遠心した;細胞の沈降を5mlのTE緩衝液(10ミリモ
ルのトリス×HC1、pH7.5、1ミリモルのEDTA)で1回、
次いで5mlのLiA緩衝液(TE緩衝中の0.1モルの酢酸リチ
ウム)で洗浄した。次いで、細胞を1mlのLiA緩衝液中に
懸濁し、そして30℃において1時間インキュベーション
した。
10μlのプラスミド溶液溶液(1〜5μgのDNA)お
よび15μlの担体DNA(ニシン***、3mg/mlからの変性D
NA)を、0.1mlの細胞懸濁液に添加した。30℃において3
0分間インキュベーションし、そして0.7mlのポリプロピ
レングリコール(LiA緩衝液中の40%のポリプロピレン
グリコール3350)に添加し、そして30℃においてさらに
60分間インキュベーションした。次いで、細胞を熱衝撃
し(42℃、5分)次いでエッペンドルフのマイクロフー
グで4秒間遠心した。細胞の沈澱を0.5mlのTE緩衝液で
2回洗浄した;次いで、細胞を0.1mlのTE緩衝液中に懸
濁させ、そして選択栄養培地で平板培養した。30℃にお
いて3日後、形質転換体が得られた。
よび15μlの担体DNA(ニシン***、3mg/mlからの変性D
NA)を、0.1mlの細胞懸濁液に添加した。30℃において3
0分間インキュベーションし、そして0.7mlのポリプロピ
レングリコール(LiA緩衝液中の40%のポリプロピレン
グリコール3350)に添加し、そして30℃においてさらに
60分間インキュベーションした。次いで、細胞を熱衝撃
し(42℃、5分)次いでエッペンドルフのマイクロフー
グで4秒間遠心した。細胞の沈澱を0.5mlのTE緩衝液で
2回洗浄した;次いで、細胞を0.1mlのTE緩衝液中に懸
濁させ、そして選択栄養培地で平板培養した。30℃にお
いて3日後、形質転換体が得られた。
形質転換体の増殖および分泌産生物の分析 形質転換体を、スレオニン、メチオニンおよびヒスチ
ジン(各場合において20mg/l)を補充したSD培地(0.67
%の酵母菌窒素塩基、アミノ酸を含まない、2%のD−
グルコース)中で30℃において培養した。十分な細胞密
度(通常5×109細胞/ml)に到達した後、細胞を遠心
し、そして培養上澄み液中のトリプシンまたはエラスタ
ーゼ阻害活性を測定した。
ジン(各場合において20mg/l)を補充したSD培地(0.67
%の酵母菌窒素塩基、アミノ酸を含まない、2%のD−
グルコース)中で30℃において培養した。十分な細胞密
度(通常5×109細胞/ml)に到達した後、細胞を遠心
し、そして培養上澄み液中のトリプシンまたはエラスタ
ーゼ阻害活性を測定した。
10l規模の組み換えアプロチニン変異型の発現のための
酵母菌形質転換体の発酵 次の培地を使用した: SD バクト酵母菌窒素塩基 グルコース 6.7g/l グルコース 20.0g/l SD2 バクト酵母菌窒素塩基 グルコース 6.7g/l グルコース 20.0g/l KH2PO4 6.7g/l SC6 ディフコ酵母 エキス 20.0g/l KH2PO4 1.4g/l (NH4)2SO4 1.4g/l MgSO4×7H2O 0.25g/l 泡消剤SAG471 (ユニオン・カーバイド) 0.1ml/l 成分を脱イオン水中に溶解し、そしてpHを5.5に調節
する。栄養溶液を121℃において20分間滅菌する。グル
コースを必要な体積の1/5の脱イオン水中に溶解しそし
て、冷却後、栄養溶液と一緒にする。
酵母菌形質転換体の発酵 次の培地を使用した: SD バクト酵母菌窒素塩基 グルコース 6.7g/l グルコース 20.0g/l SD2 バクト酵母菌窒素塩基 グルコース 6.7g/l グルコース 20.0g/l KH2PO4 6.7g/l SC6 ディフコ酵母 エキス 20.0g/l KH2PO4 1.4g/l (NH4)2SO4 1.4g/l MgSO4×7H2O 0.25g/l 泡消剤SAG471 (ユニオン・カーバイド) 0.1ml/l 成分を脱イオン水中に溶解し、そしてpHを5.5に調節
する。栄養溶液を121℃において20分間滅菌する。グル
コースを必要な体積の1/5の脱イオン水中に溶解しそし
て、冷却後、栄養溶液と一緒にする。
保存培養: 酵母菌形質転換体を、冷蔵庫内でSD平板(SD+2%の
寒天)上で4週まで維持した。長期間の貯蔵は液体窒素
中である。
寒天)上で4週まで維持した。長期間の貯蔵は液体窒素
中である。
前培養: 1の震盪フラスコないでSD2栄養溶液中で前培養物
を調製した(内容物の体積:100ml)。フラスコをSD源平
板からの単一のコロニーで接種し、そして震盪器内で28
℃および280rpmで2〜3日間インキュベーションした。
(震盪器の軌道の直径:2.5または5.0cm)。
を調製した(内容物の体積:100ml)。フラスコをSD源平
板からの単一のコロニーで接種し、そして震盪器内で28
℃および280rpmで2〜3日間インキュベーションした。
(震盪器の軌道の直径:2.5または5.0cm)。
10lの発酵: 10lの発酵槽を約200mlの前培養物培地中に懸濁した1.
0lの前培養物からの細胞沈澱で接種した。発酵条件は、
次の通りであった:SC6の溶液、28℃、撹拌機の速度600r
pm、通気速度0.5vvm、2.5nのNaOHおよび2.5NのH2SO4に
よるpHの制御。
0lの前培養物からの細胞沈澱で接種した。発酵条件は、
次の通りであった:SC6の溶液、28℃、撹拌機の速度600r
pm、通気速度0.5vvm、2.5nのNaOHおよび2.5NのH2SO4に
よるpHの制御。
供給: 培養物にグルコースを連続的に供給し、そして1日1
回ディフコ酵母エキスを供給した。
回ディフコ酵母エキスを供給した。
グルコース溶液: 合計体積1000mlの500gのグルコース;供給を接種後4
時間に0.02ml×l×分の速度で開始し、10〜20時間後に
0.1ml/l×分に増加した。呼吸商が1より非常に上昇し
ないように、グルコースの導入を選択した。
時間に0.02ml×l×分の速度で開始し、10〜20時間後に
0.1ml/l×分に増加した。呼吸商が1より非常に上昇し
ないように、グルコースの導入を選択した。
ディフコ酵母エキス:酵母エキスは5g/lの量で1日1
回添加した。酵母エキスは脱イオン水中の懸濁液として
調製した。
回添加した。酵母エキスは脱イオン水中の懸濁液として
調製した。
グルコースおよび酵母エキス溶液を121℃において20
分間インキュベーションした。
分間インキュベーションした。
述べた条件下に96時間発酵した後、約30g/lの細胞乾
燥重量に到達した。達成された産生物の収量は6g/lであ
った。
燥重量に到達した。達成された産生物の収量は6g/lであ
った。
ポリアクリルアミドゲルの電気泳動 タンパク質は通常SDSポリアクリルアミドゲルの電気
泳動(Laemmli、Nature227、680、1970)により検出
し、そしてクーマッシー・ブリリアント・ブルーで染色
した。
泳動(Laemmli、Nature227、680、1970)により検出
し、そしてクーマッシー・ブリリアント・ブルーで染色
した。
アミノ酸分析 約1ナノモルのタンパク質を200μlの6MのHC1、0.05
%のβ−メルカプトエタノールの存在下に110℃におい
て真空下に22時間インキュベーションした。加水分解物
を乾燥し、150μlのクエン酸ナトリウム緩衝液pH2.2中
に溶解し、そして濾過した。アミノ酸分析は、蛍光灯検
出器およびシマズC-R2AX積分器を有するバイオトロニッ
クLC5000アミノ酸分析器で実施した。アミノ酸を、文献
に記載されているようにしてフタルアルデヒドとの反応
後、定量した(Benson & Hare、Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA、72、619、1975)。
%のβ−メルカプトエタノールの存在下に110℃におい
て真空下に22時間インキュベーションした。加水分解物
を乾燥し、150μlのクエン酸ナトリウム緩衝液pH2.2中
に溶解し、そして濾過した。アミノ酸分析は、蛍光灯検
出器およびシマズC-R2AX積分器を有するバイオトロニッ
クLC5000アミノ酸分析器で実施した。アミノ酸を、文献
に記載されているようにしてフタルアルデヒドとの反応
後、定量した(Benson & Hare、Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA、72、619、1975)。
アミノ酸の配列決定 1〜2ナノモルのタンパク質を30μlのトリフルオロ
酢酸中に溶解し、次いでポリブレン処理したガラス線維
のフィルターに適用し、そして気相配列決定装置(アプ
ライド・バイオシステムス)でヘウィック(Hewick)ら
no方法(J.Biol.Chem.256、7990、1981)により配列決
定した。フェニルチオヒダントイン誘導体を分離し、そ
してベウレウザー(Beyreuther)et al.、タンパク質化
学における現代の方法(Mdern Methods in Protein Che
mistry)、303-325、Walter de Gruyter、ベルリン(19
83)に記載されているシアノHPLCカラム(デュポン)お
よびウォーターズHPLC系を使用して分析した。
酢酸中に溶解し、次いでポリブレン処理したガラス線維
のフィルターに適用し、そして気相配列決定装置(アプ
ライド・バイオシステムス)でヘウィック(Hewick)ら
no方法(J.Biol.Chem.256、7990、1981)により配列決
定した。フェニルチオヒダントイン誘導体を分離し、そ
してベウレウザー(Beyreuther)et al.、タンパク質化
学における現代の方法(Mdern Methods in Protein Che
mistry)、303-325、Walter de Gruyter、ベルリン(19
83)に記載されているシアノHPLCカラム(デュポン)お
よびウォーターズHPLC系を使用して分析した。
トリプシン阻害アッセイ トリプシン活性は、ゲイガー(Geiger)およびフリッ
ツ(Fritz)、酵素分析の化学(Methods of Enzymatic
Analysis)、Vol.第3版、Bergmeyer(編)、Verlag Ch
emie、ワインハイム(1984)、p.121の方法により、ベ
ンゾイル−L−アルギニンp−ニトロアニリドを基質と
して使用して決定した。遊離したp−ニトロアニリンを
分光光度計で405nmにおいて測定した。酵素および阻害
因子は、基質の添加前に、15分間予備インキュベーショ
ンした。
ツ(Fritz)、酵素分析の化学(Methods of Enzymatic
Analysis)、Vol.第3版、Bergmeyer(編)、Verlag Ch
emie、ワインハイム(1984)、p.121の方法により、ベ
ンゾイル−L−アルギニンp−ニトロアニリドを基質と
して使用して決定した。遊離したp−ニトロアニリンを
分光光度計で405nmにおいて測定した。酵素および阻害
因子は、基質の添加前に、15分間予備インキュベーショ
ンした。
エラスターゼ阻害アッセイ ヒト白血球エラスターゼは、エラスチン・プロダクツ
・カンパニー・インコーポレーテッド(Elastin Produc
ts Company,Inc.、米国ミシシッピイ州63069パシフィッ
クP.O.Box147)から入手した。使用した基質は、MeOSuc
-Ala-Ala-Pro-Val-pNA[ベイケム(Bachem)、スイス国
ブベンドルフ]であった。アッセイの条件は表3に示
す。一般に、アッセイ緩衝液で希釈しそして気質(DMSO
中に0.1モルの濃度で溶解し、そして緩衝液で原溶液の
濃度に調節した)後、阻害因子の試料を開始し、そして
基質からのp−ニトロアニリンの遊離を405nmにおいて
連続的に追跡した。100%の値を阻害因子なしの対応す
るアッセイにおいて決定した。阻害(%)を次の式から
計算した: 阻害%=100×[1−(阻害因子の存在下の光学密度
/阻害因子の不存在下の光学密度)]緩衝液:0.2モルの
トリス/HC1、pH8.0+0.1%のツイーン80 基質の添加後の合計の体積:0.65ml 酵素の量/アッセイ:50ng 室温における予備インキュベーション時間:30分 基質:MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA 原溶液:0.065モル 量/アッセイ:0.1ml アッセイ温度:30℃ 表:エラスターゼ阻害アッセイの条件(ナカジマら、J.
Biol.Chem.254、4027、1979)。
・カンパニー・インコーポレーテッド(Elastin Produc
ts Company,Inc.、米国ミシシッピイ州63069パシフィッ
クP.O.Box147)から入手した。使用した基質は、MeOSuc
-Ala-Ala-Pro-Val-pNA[ベイケム(Bachem)、スイス国
ブベンドルフ]であった。アッセイの条件は表3に示
す。一般に、アッセイ緩衝液で希釈しそして気質(DMSO
中に0.1モルの濃度で溶解し、そして緩衝液で原溶液の
濃度に調節した)後、阻害因子の試料を開始し、そして
基質からのp−ニトロアニリンの遊離を405nmにおいて
連続的に追跡した。100%の値を阻害因子なしの対応す
るアッセイにおいて決定した。阻害(%)を次の式から
計算した: 阻害%=100×[1−(阻害因子の存在下の光学密度
/阻害因子の不存在下の光学密度)]緩衝液:0.2モルの
トリス/HC1、pH8.0+0.1%のツイーン80 基質の添加後の合計の体積:0.65ml 酵素の量/アッセイ:50ng 室温における予備インキュベーション時間:30分 基質:MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA 原溶液:0.065モル 量/アッセイ:0.1ml アッセイ温度:30℃ 表:エラスターゼ阻害アッセイの条件(ナカジマら、J.
Biol.Chem.254、4027、1979)。
実施例1 Val-15-Leu-17-、DePro2-Val-15-Leu-17-、DePro2-15
-、Depro2-Val-15-Leu-17-Arg-19−およびDePro2-Arg-1
5-Ala-17−アプロチニンのための遺伝子の構成およびク
ローニング E.coli−酵母菌シャトルベクターpMT15の誘導体(第
1図)を、酵母菌中アプロチニン突然異変タンパク質の
クローニングのために使用した。
-、Depro2-Val-15-Leu-17-Arg-19−およびDePro2-Arg-1
5-Ala-17−アプロチニンのための遺伝子の構成およびク
ローニング E.coli−酵母菌シャトルベクターpMT15の誘導体(第
1図)を、酵母菌中アプロチニン突然異変タンパク質の
クローニングのために使用した。
ベクターpMT15は、E.coliのための選択的マーカーと
してアンピシリン抵抗性遺伝子および酵母菌のためにUR
A3遺伝子断片を含有する。E.coliおよび酵母菌中の複製
のために、pBR322から由来したCol E1および酵母菌から
のB形態の2μプラスミドのDNAセグメント使用した。
異種の遺伝子の発現のために、MAT 1−アルファ−プロ
モーターおよびアルファ−因子の前駆体タンパク質のN
末端pre-pro配列のための解読領域を、プラスミドpCY17
(KarjanおよびHerskowitz、Cell 30、933、1982)から
のEcoRI-HindIII断片の形態で組み込んだ。
してアンピシリン抵抗性遺伝子および酵母菌のためにUR
A3遺伝子断片を含有する。E.coliおよび酵母菌中の複製
のために、pBR322から由来したCol E1および酵母菌から
のB形態の2μプラスミドのDNAセグメント使用した。
異種の遺伝子の発現のために、MAT 1−アルファ−プロ
モーターおよびアルファ−因子の前駆体タンパク質のN
末端pre-pro配列のための解読領域を、プラスミドpCY17
(KarjanおよびHerskowitz、Cell 30、933、1982)から
のEcoRI-HindIII断片の形態で組み込んだ。
アルファ−因子のpre-pro配列から下流において、ベ
クターpMT15は転写ターミネーター機能をもつ酵母菌か
らのURA3遺伝子のBam HI-SalI断片を含有する(Yarger
et al.、Mol.Cell.Biol.8、1095、1986)。
クターpMT15は転写ターミネーター機能をもつ酵母菌か
らのURA3遺伝子のBam HI-SalI断片を含有する(Yarger
et al.、Mol.Cell.Biol.8、1095、1986)。
アルファ−因子のpre-pro配列の解読領域を有する235
bpのpMT15のPstI-HindIII断片を、ベクターM13mp18中に
クローニングし、そしてオリゴヌクレオチドプライマー
5′‐GAA-GAA GGG GTA TTG GAT AAA AGA-3′を使用し
て特異的突然変異誘発させた。突然変異誘発の結果は、
アルファ‐因子のpre-pro配列の位置18においてTCTから
AGCのセリンコドンの変更であり、これは新しいHindIII
制限切断部位を発生した(第2図)。切頭213bpのPstI-
HindIII断片を使用して、pMT15中の235bpのPstI-HindII
I断片を置換した。このようにして修飾されたプラスミ
ドをpS580と呼んだ;それはKEX2プロセシング部位とし
てLys-Arg-Glu-Ala-Glu-Alaの代わりにLys-Argのための
解読配列を含有する(第3図)。
bpのpMT15のPstI-HindIII断片を、ベクターM13mp18中に
クローニングし、そしてオリゴヌクレオチドプライマー
5′‐GAA-GAA GGG GTA TTG GAT AAA AGA-3′を使用し
て特異的突然変異誘発させた。突然変異誘発の結果は、
アルファ‐因子のpre-pro配列の位置18においてTCTから
AGCのセリンコドンの変更であり、これは新しいHindIII
制限切断部位を発生した(第2図)。切頭213bpのPstI-
HindIII断片を使用して、pMT15中の235bpのPstI-HindII
I断片を置換した。このようにして修飾されたプラスミ
ドをpS580と呼んだ;それはKEX2プロセシング部位とし
てLys-Arg-Glu-Ala-Glu-Alaの代わりにLys-Argのための
解読配列を含有する(第3図)。
pS580中のアルファ−因子のpre-pro配列との融合のた
めに、合成Val-15-Leu-17−アプロチニン遺伝子を使用
し、これは5′末端においてアルファ−因子のpre−pro
配列の少なくとも5つのコドンによりpS580中のHindIII
切断部位まで伸長された(第4図)。
めに、合成Val-15-Leu-17−アプロチニン遺伝子を使用
し、これは5′末端においてアルファ−因子のpre−pro
配列の少なくとも5つのコドンによりpS580中のHindIII
切断部位まで伸長された(第4図)。
修飾されたVal-15-Leu-17−アプロチニン遺伝子をpS5
80の開いたHindIII-BamHI切断部位中に組み込んだ。こ
のようにして、アルファ−因子のpre−pro配列の3′末
端をLys-Arg−プロセシング部位で再構成し、そしてVal
-15-Leu-17−アプロチニン遺伝子とのリーディングフレ
ームの融合を発生させた(第5図)。
80の開いたHindIII-BamHI切断部位中に組み込んだ。こ
のようにして、アルファ−因子のpre−pro配列の3′末
端をLys-Arg−プロセシング部位で再構成し、そしてVal
-15-Leu-17−アプロチニン遺伝子とのリーディングフレ
ームの融合を発生させた(第5図)。
pS580誘導体をpS604と呼んだ。
VaL-15-Leu-17−アプロチニンの位置2におけるアミ
ノ酸プロリンを排除するために、アルファ−因子のpre-
pro配列に対して5′末端において融合したアプロチニ
ン突然変異タンパク質を、pS604からHindIII-BamHIカセ
ットとして単離し、そして突然変異誘発ベクターM13-mp
18中でクローニングした。
ノ酸プロリンを排除するために、アルファ−因子のpre-
pro配列に対して5′末端において融合したアプロチニ
ン突然変異タンパク質を、pS604からHindIII-BamHIカセ
ットとして単離し、そして突然変異誘発ベクターM13-mp
18中でクローニングした。
位置2におけるプロリンコドンを欠失するために、次
の合成突然変異誘発プライマーを第1突然変異誘発サイ
クルにおいて使用した: Val-15-Leu-17−アプロチニン遺伝子の位置2におけ
るプロリンコドンの欠失は、DNA配列決定により評価し
た。
の合成突然変異誘発プライマーを第1突然変異誘発サイ
クルにおいて使用した: Val-15-Leu-17−アプロチニン遺伝子の位置2におけ
るプロリンコドンの欠失は、DNA配列決定により評価し
た。
DePro2-Arg-15−アプロチニン遺伝子を構成するため
に、M13-mp18突然変異誘発ベクター中でクローニングし
たDePro2-Val-15-Leu-17−アプロチニン遺伝子を第2突
然変異誘発サイクルにかけた。
に、M13-mp18突然変異誘発ベクター中でクローニングし
たDePro2-Val-15-Leu-17−アプロチニン遺伝子を第2突
然変異誘発サイクルにかけた。
次の突然変異誘発プライマーを、位置15および位置17
のためのコドンの分子遺伝子交換のために使用した: Arg-15によるVal-15の置換およびArg-17によるLeu-17
の置換を、DNA配列決定により確証した。
のためのコドンの分子遺伝子交換のために使用した: Arg-15によるVal-15の置換およびArg-17によるLeu-17
の置換を、DNA配列決定により確証した。
引き続いて、両者の組み換えアプロチニン突然変異タ
ンパク質を、シャトルベクターpS580のHindIII-BamHI切
断部位中への組み込みにより、アルアァ−因子のpre-pr
o配列に融合した。pS580誘導体をpS707(DePro2-Val-15
-Leu-17−アプロチニンを含有する)およびpA202(DePr
o2-Arg-15−アプロチニンを含有する)と呼んだ。
ンパク質を、シャトルベクターpS580のHindIII-BamHI切
断部位中への組み込みにより、アルアァ−因子のpre-pr
o配列に融合した。pS580誘導体をpS707(DePro2-Val-15
-Leu-17−アプロチニンを含有する)およびpA202(DePr
o2-Arg-15−アプロチニンを含有する)と呼んだ。
突然変異体DePro2-Val-15-Leu-17-Arg-19−アプロチ
ニン(ベクターpS773)およびDePro2-Arg-15-Ala-17−
アプロチニン(ベクターpA202)を、前述の方法で構成
し、そしてクローニングした。
ニン(ベクターpS773)およびDePro2-Arg-15-Ala-17−
アプロチニン(ベクターpA202)を、前述の方法で構成
し、そしてクローニングした。
実施例2 ALA(‐2)‐Gln(‐1)‐Val-15-Leu-17-、Ala(‐
2)‐Gln(‐1)‐Arg-15、Ala(‐2)‐Gln(‐
1)‐Val-15-Leu-17-Arg−およびAla(‐2-)‐Gln
(‐1)‐Arg-Ala-17−アプロチニンのための遺伝子の
構成 前述のアプロチニン突然変異タンパク質のN末端上へ
のジペプチドAla-Glnの遺伝子操作した付加のために、M
13突然変異誘発ベクター中でクローニングしたDePro2-V
al-15-Leu−アプロチニンおよびDePro2-Arg-15−アプロ
チニンを、次のDNAプライマーを使用して他の突然変異
誘発サイクルにかけた: 5′末端において修飾された2つのアプロチニン突然変
異タンパク質のDNA配列を、DNA配列決定により確証し
た。
2)‐Gln(‐1)‐Arg-15、Ala(‐2)‐Gln(‐
1)‐Val-15-Leu-17-Arg−およびAla(‐2-)‐Gln
(‐1)‐Arg-Ala-17−アプロチニンのための遺伝子の
構成 前述のアプロチニン突然変異タンパク質のN末端上へ
のジペプチドAla-Glnの遺伝子操作した付加のために、M
13突然変異誘発ベクター中でクローニングしたDePro2-V
al-15-Leu−アプロチニンおよびDePro2-Arg-15−アプロ
チニンを、次のDNAプライマーを使用して他の突然変異
誘発サイクルにかけた: 5′末端において修飾された2つのアプロチニン突然変
異タンパク質のDNA配列を、DNA配列決定により確証し
た。
Ala(‐2)‐Gln(‐1)‐Val-15-Leu-17−アプロ
チニン遺伝子およびAla(‐2)‐Gln(‐1)‐Arg-15
−アプロチニン遺伝子を、実施例1に記載した方法に類
似する方法で酵母菌シャトルベクター中にクローニング
した。
チニン遺伝子およびAla(‐2)‐Gln(‐1)‐Arg-15
−アプロチニン遺伝子を、実施例1に記載した方法に類
似する方法で酵母菌シャトルベクター中にクローニング
した。
クローニングしたアプロチニン突然変異タンパク質を
もつAla(‐2)‐Gln(‐1)‐Val-15-Leu-17−アプ
ロチニンおよびAla(‐2)‐Gln(‐1)‐Arg-15−ア
プロチニンを、pS744およびpA202と呼んだ。
もつAla(‐2)‐Gln(‐1)‐Val-15-Leu-17−アプ
ロチニンおよびAla(‐2)‐Gln(‐1)‐Arg-15−ア
プロチニンを、pS744およびpA202と呼んだ。
Ala(‐2)‐Gln(‐1)‐Val-15-Leu-17-Arg−ア
プロチニン(ベクターpS774)およびAla(‐2-)‐Gln
(‐1)‐Arg-Ala-17−アプロチニン(ベクターpA20
7)を、前述の方法で構成し、そしてクローニングし
た。
プロチニン(ベクターpS774)およびAla(‐2-)‐Gln
(‐1)‐Arg-Ala-17−アプロチニン(ベクターpA20
7)を、前述の方法で構成し、そしてクローニングし
た。
実施例3 酵母菌中の組み換えアプロチニン変異型の発現 酵母菌菌株SC106を、ブラスミドベクターpS604、pS70
7、pS744、pS773、pS774、pA202、pA204およびpA207で
前述のように形質転換した。
7、pS744、pS773、pS774、pA202、pA204およびpA207で
前述のように形質転換した。
URA+酵母菌形質転換体を単離し、そして誘発条件下に
培養した(参照、方法の節)。収率を測定するために、
発現すべきアプロチニン突然変異タンパク質が位置15に
バリンおよび位置17にロイシンを有する場合、培養上澄
み液をエラスターゼ阻害活性について試験した。発現す
べきアプロチニン突然変異タンパク質が位置15にアルギ
ニンを有する場合、前述のトリプシン阻害アッセイを実
施した。引き続いて、10lの発酵槽中で分泌されたアプ
ロチニン突然変異タンパク質の発現産生物を精製し、そ
して特性決定した。
培養した(参照、方法の節)。収率を測定するために、
発現すべきアプロチニン突然変異タンパク質が位置15に
バリンおよび位置17にロイシンを有する場合、培養上澄
み液をエラスターゼ阻害活性について試験した。発現す
べきアプロチニン突然変異タンパク質が位置15にアルギ
ニンを有する場合、前述のトリプシン阻害アッセイを実
施した。引き続いて、10lの発酵槽中で分泌されたアプ
ロチニン突然変異タンパク質の発現産生物を精製し、そ
して特性決定した。
実施例4 組み換えアプロチニン変異型の精製 10lのバッチからの発酵ブロスを9000rpm(15〜30分
間)において遠心した。上澄み液を種々フィルター(8
〜0.2μm)で濾過し、水で7.5mSの伝導度に希釈し、そ
してクエン酸でpH3に調節した。このようにして予備処
理した試料を50ミリモルのクエン酸ナトリウムpH3中の1
00〜200ml S−セファローズ(Sepharose)ファスト・フ
ロー(ファーマシア)と混合し、そして30〜60分間撹拌
した。引き続いて、ゲルを1〜5lの50ミリモルのクエン
酸ナトリウムpH3、10ミリモルのトリスHC1、pH9で洗浄
し、そして最後に20ミリモルのHEPES、pH6で洗浄した。
洗浄したゲルを適当なカラムに移し、溶離し、そしてBI
O-PILOT系(ファーマシア)中で分画し、ここで20ミリ
モルのHEPES中の0〜1モルの塩化ナトリウムの勾配使
用した。ヒト白血球エラスターゼまたはウシトリプシン
を使用する阻害アッセイにおいて阻害活性の決定後、適
当な分画を集め、そして回転蒸発器で濃縮した。
間)において遠心した。上澄み液を種々フィルター(8
〜0.2μm)で濾過し、水で7.5mSの伝導度に希釈し、そ
してクエン酸でpH3に調節した。このようにして予備処
理した試料を50ミリモルのクエン酸ナトリウムpH3中の1
00〜200ml S−セファローズ(Sepharose)ファスト・フ
ロー(ファーマシア)と混合し、そして30〜60分間撹拌
した。引き続いて、ゲルを1〜5lの50ミリモルのクエン
酸ナトリウムpH3、10ミリモルのトリスHC1、pH9で洗浄
し、そして最後に20ミリモルのHEPES、pH6で洗浄した。
洗浄したゲルを適当なカラムに移し、溶離し、そしてBI
O-PILOT系(ファーマシア)中で分画し、ここで20ミリ
モルのHEPES中の0〜1モルの塩化ナトリウムの勾配使
用した。ヒト白血球エラスターゼまたはウシトリプシン
を使用する阻害アッセイにおいて阻害活性の決定後、適
当な分画を集め、そして回転蒸発器で濃縮した。
この材料をさらにセファデックス(Sephadex)G-50ス
ーパーファイン(ファーマシア)のゲル濾過および20ミ
リモルのHEPES、pH6中のS−セファローズファスト・フ
ローまたはS−セファローズHPまたはモノS(ファーマ
シア)のクロマトグラフィーによりさらに精製した。0
〜1モルのNaClの勾配をS−セファローズからの溶離に
使用した。分画をゲル電気泳動および適当な阻害アッセ
イにより検査した。阻害活性をもつ集め、0.1モルのNH4
HCO3に対して透析し、そして凍結乾燥した。
ーパーファイン(ファーマシア)のゲル濾過および20ミ
リモルのHEPES、pH6中のS−セファローズファスト・フ
ローまたはS−セファローズHPまたはモノS(ファーマ
シア)のクロマトグラフィーによりさらに精製した。0
〜1モルのNaClの勾配をS−セファローズからの溶離に
使用した。分画をゲル電気泳動および適当な阻害アッセ
イにより検査した。阻害活性をもつ集め、0.1モルのNH4
HCO3に対して透析し、そして凍結乾燥した。
前記の工程図を下記に示す。
典型的には、発酵バッチ中に存在する阻害因子の量に
基づいて20〜40%の収率が得られた。
基づいて20〜40%の収率が得られた。
実施例5 実施例4におけるように得られた阻害因子の特性決定 凍結乾燥物を最初にアミノ酸分析(第1表)およびN
末端配列決定(アプライド・バイオシステムスの配列決
定装置)(第2表)により特性決定した。その結果を下
記第1表および第2表に示す。
末端配列決定(アプライド・バイオシステムスの配列決
定装置)(第2表)により特性決定した。その結果を下
記第1表および第2表に示す。
Val-15-Leu-17−アプロチニンの場合において、この
アプロチニン変異型のN末端において正しく切断された
分泌された物質(正しいプロセシング)は発見されなか
った。対照的に、位置2における欠失またはN末端の伸
長Ala(‐2)‐Gln(‐1)を有するアプロチニン変異
型は、70〜80%の正しいN末端のプロセシングで発見さ
れた。
アプロチニン変異型のN末端において正しく切断された
分泌された物質(正しいプロセシング)は発見されなか
った。対照的に、位置2における欠失またはN末端の伸
長Ala(‐2)‐Gln(‐1)を有するアプロチニン変異
型は、70〜80%の正しいN末端のプロセシングで発見さ
れた。
この結果を第3表に示す。
さらに、阻害の反応速度論をヒト白血球エラスターゼ
またはウシ膵臓カリクレインで決定した。
またはウシ膵臓カリクレインで決定した。
この結果を第4表に示す。
これから、N末端における変化は阻害性質に影響を与
えないことが見いだされた。
えないことが見いだされた。
本発明の主な特徴および態様は、次の通りである。
1、位置2にアミノ酸プロリンの欠失を有するか、ある
いはアラニン−(−2)−グルタミン−(−1)の付加
を有するアプロチニン。
いはアラニン−(−2)−グルタミン−(−1)の付加
を有するアプロチニン。
2、ヒトまたは動物由来の上記第1項記載のアプロチニ
ン。
ン。
3、位置12、13、14、15、16、17、18、19、34、36、3
7、38、39、41、42および52の1または2以上の追加の
変動を有する上記第1または2項目記載のアプロチニ
ン。
7、38、39、41、42および52の1または2以上の追加の
変動を有する上記第1または2項目記載のアプロチニ
ン。
からのアプロチニン変異型。
5、上記第1〜4項のいずれかに記載のアプロチニンを
含有する薬物。
含有する薬物。
6、適当なベクターを使用して酵母菌または他の下等の
真核生物を形質転換し、この形質転換体を培養し、そし
てアプロチニン変異型を培養ブロスから精製することを
特徴とする、上記第1〜4項のいずれかに記載のアプロ
チニン変異型を調製する方法。
真核生物を形質転換し、この形質転換体を培養し、そし
てアプロチニン変異型を培養ブロスから精製することを
特徴とする、上記第1〜4項のいずれかに記載のアプロ
チニン変異型を調製する方法。
7、形質転換しそして培養する下等の真核生物はサッカ
ロミセス・セレビシアエ(S.cerevisiae)である、上記
第6項記載の方法。
ロミセス・セレビシアエ(S.cerevisiae)である、上記
第6項記載の方法。
第1図は、E.coli−酵母菌シャトルベクターpMT15の制
限地図である。酵母菌中の遺伝子の発現のために必須な
DNAシグナル配列は箱で囲まれている。 第2図は、pre-pro−アルファ−因子の配列中の新規なH
indIII切断部位の遺伝子操作した導入を示す。HindIII
の認識はセリンコドンの交換(TCT-AGC)により発生し
た。 第3図は、E.coli−酵母菌シャトルベクターpS580の構
成の線図である。 第4図は、5′末端においてHindIII切断部位まで伸長
しアルファ−因子のリーダーのDNA配列をもつ、合成Val
-15-Leu-17−アプロチニン遺伝子のDNA配列を示す。ア
ミノ酸配列中のKEX2酵母菌酵素の切断部位にしるしが付
されている。 第5図は、E.coli酵母菌−シャトルベクターpS604の構
成の線図である。
限地図である。酵母菌中の遺伝子の発現のために必須な
DNAシグナル配列は箱で囲まれている。 第2図は、pre-pro−アルファ−因子の配列中の新規なH
indIII切断部位の遺伝子操作した導入を示す。HindIII
の認識はセリンコドンの交換(TCT-AGC)により発生し
た。 第3図は、E.coli−酵母菌シャトルベクターpS580の構
成の線図である。 第4図は、5′末端においてHindIII切断部位まで伸長
しアルファ−因子のリーダーのDNA配列をもつ、合成Val
-15-Leu-17−アプロチニン遺伝子のDNA配列を示す。ア
ミノ酸配列中のKEX2酵母菌酵素の切断部位にしるしが付
されている。 第5図は、E.coli酵母菌−シャトルベクターpS604の構
成の線図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 FI A61K 38/55 C12P 21/02 C C12N 15/09 ZNA C12N 15/00 ZNAA C12P 21/02 A61K 37/64 (72)発明者 ミヒヤエル・シエデル ドイツ連邦共和国デー5600ブツペルター ル1・ゲレルトベーク 37 (72)発明者 ラテインドラ・ダス ドイツ連邦共和国デー5600ブツペルター ル1・パールケシユトラーセ 15 (56)参考文献 特開 平2−480(JP,A) 特表 平3−502519(JP,A) (58)調査した分野(Int.Cl.6,DB名) C12P 21/02 C12N 15/00 - 15/90 C12N 9/99 A61K 37/64 BIOSIS(DIALOG) WPI(DIALOG) WPAT(QUESTEL)
Claims (1)
- 【請求項1】位置2にアミノ酸プロリン残基の欠失を有
するか、あるいはN-末端にアラニル−グルタミニル−残
基が付加したアプロチニン。
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DE3930522.8 | 1989-09-13 |
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Publication Number | Publication Date |
---|---|
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ID=6389306
Family Applications (1)
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AU (1) | AU632361B2 (ja) |
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DD (1) | DD299311A5 (ja) |
DE (2) | DE3930522A1 (ja) |
DK (1) | DK0419878T3 (ja) |
ES (1) | ES2062235T3 (ja) |
FI (1) | FI104724B (ja) |
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US5591603A (en) * | 1987-08-28 | 1997-01-07 | Novo Nordisk A/S | Process for preparing aprotinin and aprotinin analogs in yeast cells |
DK450187D0 (da) * | 1987-08-28 | 1987-08-28 | Novo Industri As | Fremgangsmaade til fremstilling af proteiner |
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US5231010A (en) * | 1989-09-13 | 1993-07-27 | Bayer Aktiengesellschaft | Recombinant aprotinin variants genetically engineered process for the microbial preparation of homogeneously processed aprotinin variants and the therapeutic use thereof |
IL99585A0 (en) * | 1990-10-01 | 1992-08-18 | Novo Nordisk As | Aprotinin analogues,their production and pharmaceutical compositions containing them |
DE4417353A1 (de) * | 1994-05-18 | 1996-01-25 | Bayer Ag | Verfahren zur Herstellung von rekombinantem Aprotinin und rekombinanten Aprotinin Varianten mit der natürlichen N-terminlaen Sequenz |
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US5786328A (en) * | 1995-06-05 | 1998-07-28 | Genentech, Inc. | Use of kunitz type plasma kallikrein inhibitors |
DE19629982A1 (de) * | 1996-07-25 | 1998-01-29 | Bayer Ag | Aprotinin-Varianten mit verbesserten Eigenschaften |
DE19725014A1 (de) * | 1997-06-13 | 1998-12-17 | Bayer Ag | Aprotininvarianten mit verbesserten Eigenschaften und Bikunine von Aprotininvarianten |
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US20060218667A1 (en) * | 2004-10-12 | 2006-09-28 | Vojdani Fakhrieh S | Plant-produced recombinant aprotinin and aprotinin variants |
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GB2188322A (en) * | 1986-03-26 | 1987-09-30 | Bayer Ag | Aprotinin and analogues thereof produced by a recombinant host |
GB2208511A (en) * | 1987-08-07 | 1989-04-05 | Bayer Ag | Variants of bovine pancreatic trypsin inhibitor produced by recombinant dna technology |
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-
1990
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- 1990-09-12 AU AU62453/90A patent/AU632361B2/en not_active Ceased
- 1990-09-13 KR KR1019900014459A patent/KR0169976B1/ko not_active IP Right Cessation
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