PT85349B - Processo para a preparacao de proteinas com actividade de factor viii por celulas microbianas hospedeiras, de vectores de expressao bem como de composicoes farmaceuticas contendo estas proteinas e de anticorpos uteis para a purificacao de factor viii e para diagnostico - Google Patents

Description

Memória descritiva referente à patente de invenção de GIST-BROCADES N. V., holandesa, industrial e comercial, com sede em l,Wateringseweg, 2611 XT Delft, Holanda, (inventores: Albert Johannes Joseph Van Coyon, Peter Michael Andreeli, Jan Aart Van Mourik e Hans Pannekoek, residentes na Holanda), para: PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE PROTENIAS COM ACTIVIDÃDE DE FACTOR VIII POR CÉLULAS MICROBIANAS HOSPEDEIRAS, DE VECTORES DE EXPRESSÃO BEM COMO DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS CONTENDO ESTAS PROTEÍNAS E DE ANTICORPOS ÚTEIS PARA A PURIFICAÇÃO DE FACTOR VIII E PARA DIAGNÓSTICO

Memória Descritiva

INTRODUÇÃO

Domínio técnico

A presente invenção refere-se a um processo para a preparação de proteínas com actividade de factor

- 1 VIII

Eatado da técnica factor VIII (também designado por factor VIIIc) é uma proteína de importância em medicina uma vez que é um componente essencial do mecanismo de coagulação do san· gue. Esta proteína ocorre no sangue de indivíduos saudáveis normais numa concentração de cerca de 100 ng/ml. A deficiência em factor VIII tem como resultado uma afecção da coagulação do sangue designada por hemofilia A, a qual ocorre principalmente em indivíduos do sexo masculino porque o gene do factor VIII está localizado no cromossoma X. E_sta doença constitui a principal afecção da coagulação do sangue hereditário, ocorrendo em cerca de 0,01 % da população masculina.

A hemofilia A pode ser tratada por administração de plasma sanguíneo de indivíduos saudáveis contendo factor VIII. E_ste tratamento, no entanto, apresenta várias desvantagens. Em primeiro lugar, a disponibilidade de factor VIII é limitada e o preço é muito elevado porque a concentração no sangue dos dadores e muito baixo. Sm segundo lugar, os rendimentos dos métodos habituais de fraccionamento de plasma são baixos. De facto verifica-se uma carência de factor VIII. Em terceiro lugar, cada hemofílico com hemofilia A recebe produto colhido de um grande número de dadores, o que conduz a um alto risco de adquirir doenças infecciosas, tais como as causadas pelo vírus de hepatite não-A, heptatite não-B. hepatite B ou de SIDA, os quais podem estar presentes no sangue de um dador. Outro problema consiste no desenvolvimento de anticorpos contra preparações de factor VIII em pacientes que designam por inibidores.

E_stes problemas provocaram um grande esforço de investigação para encontrar métodos alternativos para a produção de factor VIII, de modo a evitar a utilização de sangue de dadores, como seja por técnicas de ADN recombinante, e três grupos descreveram a clonagem molecular de cADN de factor VIII obtido a partir de mARN.

pedido de P_atente Internacional WO 85/01961 (Genetics Institue) descreve a preparação de cADN que codifica para o factor VIII humano ou para*9aounidades dotadas de actividade de factor VIII. O cADN é clonado, após o que se transforma uma linha de células de mamíferos COS-7 com um vector contendo o referido cADN.

pedido de P_atente Europeia EP-A-160457 (Genetech) descreve um método de transformação duma linha de células de mamífero (Rim de Hamster Jovem) com um vector contendo ADN que codifica para factor VIII funcional humano.

pedido de Patente Europeia EP-A-150735 (Chiron) descreve um método para a preparação da proteína do factor VIII e de fragmentos desta com actividade de factor VIII. 0 vector contendo o ADN que codifica para esta proteína expressa-se em linhas de células de mamífero, particularmente em células COS (Triett et al.. (1985)).

Embora as publicações antes mencionadas refiram que é possível usar micoorganismos como células hospedeiras num sistema de expressão, não são apresentados resultados experimentais que descrevem esta possibilidade, levando à conclusão inevitáveis de que a concretização deste procedimento encontrou dificuldades inesperadas a nível experimental.

A literatura citada mostra que é possivel preparar proteínas com actividade de factor VIII por técnicas de ADN recombinante, mas apenas em linhas de células de mamíferos. No entanto, a concentração de factor VIII produzido pelas linhas de células era muito reduzida; de facto demasiado reduzida para a produção comercial. Uma desvantagem adicional da utilização destas linhas de células consiste em que elas podem ser derivadas de material tumoral e pode, por consequência, conter substancias perigosas para a saúde.

É sabido, além disso# por exemplo dos pedidos de Patente Europeia EP-A-150735 (Chiron) e EP-A-123945 (Scripps) e de Brinkhons et al.# (1985). que a actividade do factor VIII deve ser atribuída não apenas à própria proteína factor VIII mas também a certos produtos de hidrólise proteolítica daquela proteína. A trombina é uma enzima proteolítica que, quando presente no sangue, digere parcialmente o factor VIII em subunidades polipeptídicas, duas das quais tem pesos moleculares de 92 kDa e de 80 kDa. Crê-se que quando está presente no sangue um complexo destas duas subunidades proteicas ou partes destas subunidades (Faye et al.,1986# Eaton et al.# 1986) a actividade do factor VIII resulta realçada.

DEFINIÇÕES

Factor VIII é a proteína que corrige a deficiência de coagulação conhecida como hemofilia A. 0 factor VIII circula no sangue combinado com uma proteína maior# o factor de von Willebrand (fvW), que se crê proteger o factor VIII# que é degradável precocemente.

factor VIII (humano) é caracterizado pela sequência de ácidos aminados apresentada no Quadro I. A numeração da sequência começa em Ala (1)# o primeiro ácido aminado depois da sequência de sinal de 19 ácidos aminados. 0 último ácido aminado é Tyr (2332), Esta numeração é usada em toda a especificação.

N_a literatura, o factor VIII é frequentemente referido como a combinação do factor VIIIc# que para os fins da presente invenção será referido como factor VIII, como o factor VlIIfvW, o factor de von Willebrand. Na presente invenção designar-se-á como factor VIII a combinação de uma subunidade de 80 kDa com uma subunidade de 92 kDa, combinação esta que deriva duma proteína percursora# a qual será referida como percursor do factor VIII. N_o percursor, a subunidade¹ de

kDa estão unidas por tuna ponte altamente glicosilada.

Os fragmeutos do factor VIII incluirão normalmente pelo menos uma porção duma das duas subunidades e podem conter, mas normalmente não contém, porções da proteína percursora fora das subunidades de 80 kDa e de 92 kDa.

No caso de referência a um peptídeo dotado de actividade biológica de factor VIII, será suficiente para satisfazer esta condição o facto de apresentar reactividade imunológica cruzadacom uma das subunidades proteicas.

Preparações farmacêuticas com actividade de factor VIII significa qualquer preparação com capacidade de correcção da deficiência de coagulação associada à carência de factor VIII. A correcção da deficiência de coagulação pode ser efectuada por acção directa da proteína preparada por técnicas recombinantes, pela administração de uma das subunidades de 80 kDa e 92 kDa ou de ambas ou dos respectivos análogos funcionalmente equivalentes, ou por neutralização dos anticorpos contra a proteína factor VIII presentes em pacientes inibidores, de modo que a proteína factor VIIL,um seu análogo ou os respectivos fragmentos funcionalmente equivalentes possam exercer integralmente a respectiva actividade.

A fim de simplificar, o termo proteína será usado tanto para proteínas como para polipeptídeos mais pequenos.

RESUMO DA INVENÇÁO

A presente invenção refere-se a um processo para a preparação de novos vectores para a preparação de proteínas dotadas de actividade biológica e fisiológica de factor VIII sob a forma isolável. 0 processo da presente invenção emprega hospedeiros microbianos, particularmente leveduras ou bactérias, transformados com um bloco integrado(cassette)

de expressão contendo uma região de transcrição e de início de tradução que funciona de modo eficiente no hospedeiro e um quadro de leitura livre que codifica para a proteína em questão. Os vectores preferidos codificam para um guia de sinal a secreção do produto codificado, bem como para uma proteína de fusão que inclui uma ponte entre as duas subunidades.

A expressão pode ser conseguida por meio da intervenção de elementos extracromossomais ou por integração do bloco integrado (cassette) de expressão no genoma do hospedeiro.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

FIGURA 1 í ANALISE DO COMPLEXO FACTOR VIII PURIFICADO - FACTOR DE VON WILLEBRAND (PAINEL A) E POLIPEPTIDEOS PURIFICADOS DO FACTOR VIII SEM FACTOR DE VON WILLEBRAND (PAINEL B) POR ANALISE IMUNOLÓGICA DE MANCHA.

Amostras contendo factor VIII foram submetidas a electroforese em gel de SDS-poliacrilamida. Após separação as proteínas foram transferidas para palículas de nitrocelulose e, após fases de lavagem adequadas, foram incubadas com anticorpos de polipeptideos de factor VIII.

A : faixa	1		anticorpo	policlonal	RH 63271
faixa	2		anticorpo	policlonal	RH 63272
faixa	3		anticorpo	policlonal	RH 63275
faixa	4		anticorpo	monoclonal	CLB-CAg 9
faixa	5	s	anticorpo	monoclonal	CLB-CAg 65
B : faixa	6		anticorpo	monoclonal	CLB-CAg 21
faixa	7		anticorpo	monoclonal	CLB-CAg 62

Os painéis A e B foram feitos correr durante períodos diferentes. A_s setas indicam as posiçdes das proteínas de 80 kDa e de 92 kDa.

FIGURA 2

ESTRATÉGIA PARA A SÍNTESE DUM CLONS DE CÃDN PARA O mARN DO FACTOR VIII.

Usaram-se iniciadores específicos, complementares das fracções indicadas de mARN do factor VIII para iniciadores da síntese de cADN. Usa-se para a detecção dos clones correctos de cADN um segundo oligonucleótido que também pode ser usado como iniciador para o fragmento de cADN seguinte. A_s sequências de nucleótidos dos iniciadores usados são as seguintes* * 3'GGAAGGTAGAGGGACTGGGGAAG 5’ * 3'GGACTCCTACCTCCAAGACCCG 5' í 3'CCTTTAGGGTTCTCTTCAGTGG 5' : 3'GGTAGTCTGTTAAACCGTGGTCC 5’ s 3‘GGTACTCCACCGTATGACCATG 5‘ * 3‘GCCACTCGACGGACACCTGCG 5'

Os fragmentos de cADN resultantes são subclonados com os sítios de enzimas de restrição indicados nos círculos* E* EcoRI; B* BamHI; P; PstI; Sa* Saci. Os números por baixo dos fragmentos referem-se à dimensão do fragmento correspondente em pares de bases. Os plasmídeos contendo os fragmentos A, B, C, D e E são denominados pCLB81, pCLB82, pCLB83, pCLB84 e pCLB85, respectivamente.

FIGURA 3 í MAPA DO PLASMÍDEO pOL5-21, APRESENTADO COMO EXEMPLO DUM PLASMÍDEO TIFO pOL5-n.

Os plasmídeos do tipo pOL5-n são constituidos por

s Sequências de ADN de B. licheniformis T5;

• Sequências que codificam para a quimosina;

s Promotor de alfa-amilase, sítio de ligação ribossomal, codão de início ATG e ADN que codifica 29 ácidos aminados das sequências de sinal da alfa-amilase;

ADN que codifica n ácidos aminados da proteína alfa-amilase madura (no caso de pOL5-21 são 21 ácidos aminados)?

Vector pUBllO com uma origem de replicação de Bacillus (Bac. ori) e o gene da resistência à neomicina (Nm)♦

m. c.s.

í sítios de clonagem múltipla.

FIGURA 4 8 CONSTRUÇÃO DOS PLASMÍDEOS pOL5-DELTA

No plasmídeo pOL5$21 delta as sequências de ADN de B. licheniformis a montante do gene da alfa-amilase foram suprimidas. Os simbolos são os mesmos da Figura 3.

FIGURA 5A e 5B 8 CONSTRUÇÃO DOS PLASMÍDEOS pOL92.

5A s Os plasmídeos pOL92-T-n são em parte derivados de pOL5-n (Figura 3) e o plasmídeo pGB842, djue é o fragmento SalI-EcoRV contendo a subunidade de ADN de 92 kDa dos plasmídeos pOL92-A-n, é em parte derivado de pOL5-n e o fragmento Sall-Apal# contendo a subunidade

de ADN de 92 kDa, de pGB842.

Os símbolos usados são:

-B.ori		Oriaem de reolicacão de Bacillus.
-E.ori		Oi-iaem de reolicacão de E. coli.
-Ap	s	Gene do plasmídeo pAT153 que codifica	para
		resistência à ampicilina.
-Nm	í	Gene do plasmídeo pUBUO que codifica	para resis-
		tência à neomicina.
-pA		Gene de expressão e sequências de sinal do gene
		de alfa-amilase de B. licheniformis.
-m. c.s.	• •	sítios de clonagem múltipla.

5B

FIGURA 5C

Sequência de ADN de B. licheniformis T5.

Inserção de cADN que codifica para 92 kDa do factor VIII.

Terminador de lactase de Kluyveromvces lactis (T).

ADN da quimosina.

Alternativamente os plasmídeos pOL92-A~n podem ser construídos a partir dos plasmídeos pOL92-T-n e de pOL-5-η, como represen· tado para o plasmídeo pOL92-A-21.

CONSTRUÇÃO DE PLASMcCDEOS pOL92-DELTA

No plasmídeo pOL92-T-21delta as sequências de ADN de B,licheniformis a montante do gene de alfa-amilase foram suprimidas.

Os símbolos são idênticos aos usados nas Figuras 5A e B,

FIGURA 6 ί

SDS-poliacrilamida a Coomassie.

ANALISE EM GEL DE LISADOS CELULARES B.SUBTILIS.

A_s amostras foram 6% e foram coradas

POLIACRILAMIDA DE DE TRANSFORMANTES DE analisadas num gel de com azul brilhante de

Faixa 1 í lisado celular de BaciUtis subtilis transformado com p0L92-T-21.

Faixa 2 : lisado celular de Bacillus substilis transformado com pOL-5-21.

Faixa 3 : marcador de peso molecular.

A flecha indica a banda proteica de kDa no plasmídeo pOL92-T-21.

FIGURA 7 · ESTRATÉGIA PARA A SUPRESSÃO DO GENE

ESTRUTURAL DE ALFA-AMILASE DE B.LICHENIFORMIS.

O plasmídeo pGB33 contém um fragmento de

EcoRI de 33 kb ancorado ao gene de alfa-amilase de B.licheniformis e sequências de ADN flanqueantes.

No plasmídeo pGB33 delta foi suprimido o gene de alfa-amilase completo.

Os símbolos usados sãos

sequências que codificam para a alfa-amilase.

s

Nmt

Nm^rí

4·

Amys

fenótipo resistente à neomicina. fenótipo proficiente em alfa-amilase.

Os restantes símbolos tem significados idênticos aos da Figura 3.

FIGURA 8 t ANALISE EM GEL DE POLIACRILAMIDA DE LISA·

DOS CELULARES DE TRANSFORMANTES DE B.LICHENIFORMIS.

As faixas 1 a 4 referem-se às proteínas extracelulares e as faixas 6 a 9 às proteínas intracelulares. A coloração foi feita com azul brilhante de Coomassie.

Faixa	1	• 9	Bacillus licheniformis T5-16 mados com pOL92-A-21	transfor-
Faixa	2		Estirpe T5-16, comparação
Faixa	3		Estirpe T5-16, comparação
Faixa	4	•	Estirpe T5-16 transformada com -T-2m	pOL92-
Faixa	5	• •	Marcadores de peso molecular
Faixa	6	9 9 mado	Bacillus licheniformis T5-16 com p0L92-A-21	transfor-
Faixa	7	$	Estirpe T5-16, comparação
Faixa	8	s	Estirpe T5-16, comparação
Faixa	9		Estirpe T5-16 transformada com pOL92- —T— 21

kDa

A flecha indica a subunidade proteica de

FIGURA 9

CONSTRUÇÃO DE PLASMÍDEOS pOL8O

O plasmídeo pOL8O-T-4Odelta foi construído a partir de pGB852, M13mpl8-80 kDa e p0L5-40delta de acordo com o esquema apresentado.

Os símbolos usados sãoí

-4-4-—^—# .....&

......a..........-*

í ADN que codifica para lactose s terminador de lactose : promotor de lactase : região 3* não codificante do cADN do factor VIII : fracção restante do domínio B do factor VIII í marcador de resistência G418 : ADN que codifica para a proteína de kDa

Os restantes símbolos tem significados Figura 3.

FIGURA 10

A.

sobrenadantes

Faixas 1 a 2

Figura 3

Faixas 4 e 5

Faixa 6

Faixa 7 subunidade de

B.

; DETECÇÃO DE POLIPEPTIDEOS DO FACTOR VIII

PRODUZIDOS POR ESTIRPES DE BACILLUS TRANSFORMADAS COM ANTICORPOS ESPECÍFICOS MONOCLONAIS E POLICLONAIS.

Detecção por a nálise imunológica de mancha da subunidade proteica de 92 kDa com o anticorpo monoclonal CLB-CArg9 e fosfatase alcalina de cabra anti-coelho.

As faixas 1 a 5 contém as proteínas dos das culturas.

í B.licheniformis T9 transformado com pOL92-T-2mdelta e pOL92-T2delta respectivamente.

: B.licheniformis estirpe T9, comparação í B.licheniformis T9 transformado com pOL5-21delta e pOL5-2delta respectivamente.

í padrão obtido com um crioprecipitado de factor VIII.

t marcador proteico de mancha de alto peso molecular de BRL (Bethesda).

A flecha à direita indica a posição da 92 kDa derivada de plasma (pd92 kDa).

D_etecção por análise imunológica de mancha da sununidade proteica de 80 kDa com o anticorpo polidonal RH63272 e fosfatase alcalina de cabra anti-coelho.

Faixa 1

Faixa 2

Faixa 3

Faixas 4 a 7

As faixas 3 a 7 contém as proteínas dos sobrenadantes das culturas.

marcador proteico de mancha de alto peso molecular de BRL (Bethesda).

padrão obtido com um cioprecipitado de factor VIII

B. liahenifortnis T9 transformado com o vector pOL5-4Pdelta.

B. licheniformis T9 transformado com pOL8O-T-4Odelta, pOL8O-T-21delta, p0L80-T-10delta e pOL8O-T-2delta respectivamente.

A flecha à esquerda indica a posição do doblete da subunidade de 80 kDa derivada de plasma (pd80 kDa). As flechas à direita indicam a posição da subunidade recombinante de 80 kDa (r80 kDa) e do produto de hidrólise de r80 kDa).

C, por análise imunológica

D_etecção da subunidade proteica de 80 kDa anticorpo policlonal RH 63272 tase alcalina de cabra anti-coell de manch com o

As faixas 2 a 7 contém as proteínas de lisados celulares.

Faixa 1 padrão obtido com um crioprecipitado de factor VIII.

Faixas 2, 4 e 6 j

B. subtilis 1A40 transformado com pOL80-T-40delta, pOL80-T-2delta e pOL8O-T-2delta, respectivamente.

Faixas 3, 5 e 7

B. subtilis 1A40 transformado com pOL5-4Odelta, pOL5-21delta e pOL-2delta_/ respectivamente.

A flecha à direita indica a posição do boblete da subunidade de 80 kDa derivada de plasma (pd80 kDa). A flecha a esquerda indica a posição da subunidade recombinante de 80 kDa (r80 kDa).

D.

Detecção por análise imunológica de mancha duma proteína de fusão 92 kDa/ /80 kDa com o anticorpo policional RH 63272 e fosfatase alcalina de cabra anti-coelho.

As faixas 1 a 8 contém as proteínas de lisados celulares.

Faixas 1 a 4

B.subtilis 1A40 de comparação transformado com o vector pPROM3-4.

Faixas 5-8 quatro colónias isoladas independentemente de B.subtilis transformadas com pPROM92/8OPB.

A flecha à direita indica a posição da proteína de fusão 92 kDa-80 kDa.

FIGURA 11

CONSTRUÇÃO DO PLASMÍDEO pPROM92/8OPB.

O plasmídeo pPROM92/8OPB foi con struido a partir de pGB861 e pPROM3-4 de acordo com o esquema apresentado.

Os símbolos usados sãos

sequência que cotificam para alfa-amina

ADN que codifica para as proteínas de kDa e 80 kDa fracçães restantes do domínio

VIII

B do factor sequências de ADN de B.licheniformis T5 promotor de B. licheniformis 3-4

Os restantes símbolos tem significados idênticos aos da Figura 9.

FIGURA 12 í ESTRUTURA DE ptBdLAC.

plasmídeo pGBdLAO contém um fragmento Xbal que funciona como ancoragem do gene de lactose e das sequências do promotor e do terminador de K.lactis. 0 fragmento do meio entre os dois sítios Glal foi suprimido do gene.

pUC19 promotor de lactose terminador de lactase gene de lactase

ESTRUTURA DE pGB850 plasmídeo pGB850 contém o ADN que codifica para a subunidade de 92 kDa sob regulação do promotor de lactase₀ Os símbolos usados são:

_____________ : pUG19

..a * * *..* < à— ί promotor de lactase

-* . . .« . « <- ’· terminador de lactase

ADN que codifica para a proteína de 92 kDa marcador de resistência G418

FIGURA : ESTRNTURA DE pGB851 plasmídeo pGB851 contém a maior parte do ADN da subunidade de 92 kDa com o gene de proquimosina bovina em fase do sítio BamHI.

ADN que codifica para a proquimosina

ADN que codifica para a lactase

Os restantes símbolos tem significados idênticos aos da Figura 13»

FIGURA : ESTRUTURA DE pGB852 plasmídeo pGB852 contém 0 ADN que codifica para a proteína de 80 kDa fundido ao gene da lactase.

ADN que codifica para a proteína de kDa · ADN que codifica para a lactase ^: fracção do ADN do factor VIII que precede o ADN que codifica para a proteína de 80 kDa.

^: região 3’ não codificante do ADN do factor VIII.

Os restantes símbolos tem significados idênticos aos da Figgra 13.

FIGURA 16 : ESTRUTURA DE pGB853 plasmídeo pGB853 contém o ADN que codifica para a proteína de 80 kDa sob regulação do promotor de lactose.

Os símbolos tem os significados idênticos aos da Figura 15.

FIGURA 17 ί ESTRUTURA DE pGB861 plasmídeo pGB861 contém cADN de factor VIII do qual parte do domínio B foi eliminada.

ADN que codifica para as proteínas de 92 kDa e 80 kDa parte restante do domínio B

Os restantes símbolos tem significados idênticos aos da Figura 15.

- 18 FIGURA 18

ANALISE DE ARN DE K. LACTIS TRANSFORMADO

COM pGB850 E COM pGB852

A : Faixa 1 : 2 : 3 :	K.lactis de comparação K.lactis transformado com pGB85O K.lactis independentemente transformado com pGB850
B : faixa	1 t	K.lactis de comparação
	2 :	K.lactis transformado com pGB852
	3 í	K.lactis independentemente transformado com pGB852
		As flechas indicam a posição das bandas de ARN ribossomal.

FIGURA 19

DETECÇÃO DE PROTEÍNAS CONTENDO AS SUB~ UNIDADES DE 92 kDa E DE 80 kDa PRODUZIDAS POR ESTIRPES DE K.LACEIS COM ANTICORPOS ESPECÍFICOS MONOCLONAIS E POLI.. CLONAIS

Dgtecção por análise imunológica de manch da proteína de fusão lactase-80 kDa com o anticorpo policlonal RH 63275 e peroxidase de burro anti-coelho.

Faixas 1 e 3 : extracto celular da estirpe progenitora de K.lactis feito na presença de 0,05% de Tween 80 ou de 2% de NP40, respectivamente.

Faixas 2 e 4 s extracto celular de K.lactis que expressa a proteína de fusão lactase-80 kDa, feito na presença de 0,05% de Tween 80 ou de 2% de NP40, respectivamente.

Faixa 5 : padrão obtido com uma preparação de factor VIII. A flecha indica a posição da proteína de fusão.

B. D_etecção por análise imunológica de mancha de proteína de fusão lactase-80 kDa com anticorpo policlonal RH 63272 e fosfatase alcalina de cabra anti-coelho.

Faixas 1 e 3 s extracto celular da estirpe progenitora de K.lactis feito na presença de 0,05% de Tween 80 ou de 2% NP40, respectivamente.

Faixas 2 e 4 í extracto celular de

K.lactis transformado com pGB852 e que expressa a proteína de fusão lactase-80 kDa. feito na presença de 0,05% de Tween 80 ou de 2% de NP40, respectivamente.

Faixa 5 t padrão obtido com uma preparação de factor VIII. A flecha indica a posição da proteína de fusão.

C. Detecção por aaálise imunológica de mancha da proteína de fusão lactase-80 dKa com o anticorpo monoclonal CLB-CAg e fosfatase alcalina de cabra anti-rato. T_odos os extractos celulares foram feitos na presença de 0,05% de Tween 80.

Faixas 1 a 3 t Três estirpes isoladas independentemente transformadas com o plasmídeo pGB85O contendo a sequencia que codifica para a subunidade de 92 kDa;

Faixa 4 : preparação de factor VIII;

Faixas 5 a 8 t estirpes isoladas independentemente transformadas com o plasmídeo pGB852 contendo a sequência que codifica para a proteína de fusão lactase-80 kDA;

Faixa 9 : estirpe de K.lactis progenitora. A flecha indica a posição da proteína de fusão.

Detecção por análise imunológica de mancha da proteína de fusão 92-kDa-proquimosina com um antissoro contra quimosina e peroxidase de burro anti-coelho.

Faixa 1 : estirpe progenitora de

K.lactis;

Faixas 2 a 4 : clones isolados independentemente transformados com o plasmídeo pGB851 contendo a sequência que codifica para 92 kDa-proquimosina;

Faixa 5 t levedura transformada com pGB85O contendo apenas a sequência que codifica para a proteína de 92 kDa;

Faixa 6 : levedura transformada com pGB852 contendo a sequência que codifica para a proteína de 80 kDa;

Faixa 7 s levedura transformada que produz proquimosina;

Faixa 8 ; padrão dupta preparação comercial de quimosina.

Os extractos celulares nas faixas 9 a foram incubados a pH 2 antes da preparação das amostras.

Faixa 9 s estirpe de levedura progenitora;

Faixas 10 e 12 s clones isolados independentemente transformados com a sequência que codifica para 92 kDa-proquimosina.

A flecha à esquerda indica a posição da proteína de fusão com proquimosina. As flechas à direita estão nas posições da proquimosina e da quimosina# respectivamente.

E. Detecção por analise imunológica de mancha da subunidade proteica de 80 kDa com o anticorpo policlonal RH 63 272.

Faixa 1 s K.lactis transformado com pGB852 (comparar com Fig. 19B).

Faixas 2 a 5 ; colónias de K,lactis independentes transformadas com pGB853.

Faixa 6 t estirpe de comparação.

F. Detecção por análise imunológica de mancha da subunidade proteica de 92 kDa com o anticorpo monoclonal CLB-CAg9.

Faixa 1 : K.lactis transformado com pGB85O. *

Faixa 2 s K.lactis de comparação.

G. Detecção por análise imunológioa de mancha das subunidades de 92 kDa e 80 kDa expressadas simultaneamente numa célula.

Faixas 1, 2 e 3 8 detecção da proteína de 80 kDa com o anticorpo policlonal RH 63272.

Faixa 1 : faixa de comparação, Fai®as 2 e 3 8 duas estirpes transformadas diferentes.

Faixas 4, 5 e 6 t detecção da proteína de 92 kDa com o anticorpo monoclonal CLB-CAg9.

Faixa 4 t faixa de comparação;

Faixas 5 e 6 xas 2 e 3.

mesmas estirpes das fai-

D_etecção por análise imunológioa de mancha da proteína de fusão 92 kDa-80 kDa com o anticorpo policlonal RH 63272.

Faixa 1 s K.lactis de comparação.

Faixas 2 a 4 s colónias de K.lactis independentes transformadas com pGB861.

D_etecção por análise imunológioa de mancha da proteína de fusão 92 kDa-80 kDa com o anticorpo policlonal RH 63272.

Faixa 1 t factor VIII de plasma.

I.

Faixas 2 e 3 í sobrenadantes celular e agregado sólido de K.lactis não transformado.

Faixas 4 e 5 s sobrenadante celular e agregado sólido de K.lactis transformado.

DESCRIÇÃO DOS MODOS ESPECÍFICOS DE CONCRETIZAÇÃO

De acordo com o objectivo da presente invenção, revela-se um processo para a preparação de novas construções de ADN que incluem blocos integrados (cassettes) de expressão tendo um quadro de leitura livre que codifica pelo menos uma porção de qualquer das duas subunidades de 80 kDa e 92 kDa do factor VIII ou de ambas. A_s construções serão usualmente preparadas em fases sucessivas empregando vectores apropriados, com clonagem em cada um dos estádios de preparação e análise do produto para assegurar que se obtiveram a organização e as sequências pretendidas. As construções resultantes podem então ser introduzidas em vectores apropriados, particularmente em vectores vai-vem ou lançadeiras, para transformação em hospedeiros adequados e expressão da proteína pretendida. A expressão do produto pode ter lugar no interior do citoplasma ou pode verificar-se a secreção no meio nutriente ou uma combinação dè ambos os mecanismos, podendo neste caso a proteína imatura, que retem o guia de sinal, ser processada em seguida por um tratamento enzimático apropriado. Verifica-se que os produtos resultantes possuem actividade biológica e em muitos casos fisiológica, na medida em que são dotados da capacidade de promover a actividade de coagulação, quer seja isoladamente, quer em combinação com factores endogénios no paciente. Em alternativa, os produtos resultantes podem ser usados para se ligarem às imunoglobulinas que se ligam âs proteínas do factor VIII no paciente, de modo a evitar que as imunoglobulinas reduzem a quantidade de factor VIII disponível no paciente.

Os hospedeiros que são utilizados são hospedeiros microbianos, quer procariontes quer eucariontes. São de particular interesse para fermentação comercial os hospedeiros procarióticos do género Baciluus, mais particularmente B» substilis ou B.licheniformis. Entre os eucariontes de particular interesse encontram-se as leveduras, partiularmente dos géneross Saccharomvces e Kluweromyces, mais particularmente Kluweromyces e de preferência K.lactis. Por conseguinte, de acordo com a presente invenção, as construções <ijue são preparadas e descritas serão exemplificadas para organismos microbianos mas serão dirigidas para os hospedeiros preferidos, Bacillus e Kluvveromvces.

É desejável que os hospedeiros particulares que são empregues sejam estirpes iitustriais que sejam estáveis e que tenham uma alta produção. Os hospedeiros podem ser modificados para melhorar os rendimentos. Por exemplo, com estirpes de Bacillus, os problemas com as exoproteases com a instabilidade dos plasmídeos podem ser rectifiçados. 0 problema das exoproteases pode ser corrigido utilizando mutantes deficientes e exoproteases (Kawamura e Doi, 1984). Enquanto que estes autores modificaram B,substilis, no desenvolvimento da presente invenção foi produzida uma estirpe melhorada de B. .licheniformis (ver Exemplo 4). Quando as pretende manutenção extracromossomal, é possível reduzir as oportunidades para recombinação homóloga por supressão cromossomnal da sequências homólogas de sequências presentes no plasmídeo. T mbám pode haver interesse em remover promotores ou outras sequências de regulação do cromossoma que sejam comuns ao plasmídeo.

Ag proteínas de interesse são as que auxiliam a correcção da deficiência de coagulação fornecendo uma função enexistente no paciente devido ao um defeito da quantidadede factor VIII endogénio ou devido a anticorpos endogénios que inactivam o factor VIII (humano), anteríormente definidas como a combinação das proteínas de 80 kDa e de 92 kDa. A subunidade de 80 kDa estende-se ate à extremidade

carboxi-terminal desde Glu-1649 através de Tyr-2332 e a subunidade de 92 kDa estende-se desde Ala-1 ate Arg-740, com uma ponte entre as duas sequências contendo sítios de hidrólise proteolítica.A ponte ou região central designada por domínio B do factor VIII situa-se entre Ser-741 ate Arfr-1648 (numeração de acordo com o Quadro 1).

Os peptídeos de interesse incluirão pelo menos 10 ácidos aminados e habitualmente pelo menos 12. Estes peptídeos podem incluir as sequências completas das subunidades de 80 kDa e de 92 kDa do factor VIII e podem conter fragmentos usados para ligarem de modo competitivo anticorpos ao factor VIII, os quais serão normalmente homólogos de uma sequência do factor VIII. De outro modo, usualmente menos de 10% da sequência de ácidos aminados e mais usualmente menos de 5% será modificada de sequência de ocorrência natural por meio de mutações# isto é, substituições conservativas e não-conser\ativas, supressões ou inserções. Quanto menor for o fragmentp, menor será o número de mutações permissíveis. Geralmente o número total de ácidos aminados envolvidos será menor do que 15, mais usualmente menor do que 10. É permissível um número superior de substituições nos casos em que as substituições são conservativas, tais como os ácidos aminados que são alifáticos e que podem ser derivados nas categorias de neutros, polares, acídicos ou básicos, e os ácidos aminados que são aromáticos.

A_s proteínas obtidas podem ser divididas nas seguintes categorias:

A primeira categoria consiste em fragmentos de cerca de 8 a 60 ácidos aminados, mais usualmente de cerca de 12 a 50, os quais tem a capacidade de competir com o factor VIII em relação a anticorpos, de modo que servem para remover do paciente anticorpos que possam ligar tanto ao factor VIII endógeno como ao factor VIII que á administrado. Estes fragmentos podem ser usados sob a forma de fragmentos ou podem ser modificados por junção destes a vários suportes, tais como

partículas, outras proteínas, liposomas ou semelhantes. 0 modo particular segundo o qual os fragmentos são modificados dependerá do modo de administração e do objectivo particular que se pretende atingir com a utilização dos fragmentos.

próximo grupo de proteínas será constituído pelas subunidades, as quais podem ser modificadas por truncagem ou por extensão, usualmente sem exceder 10% do número de ácidos aminados da proteína, sendo as proteínas activas num complexo de duas subunidades a fim de exercerem a respectiva actividade de coagulação. No caso das subunidades serem subunidades biológicas e poderem ser administradas individualmente, pressupõe-se que a subunidade forma um complexo com uma subunidade endógena para dar factor VIII activo. Err> alternativa, podem preparar-se proteínas de fusão, nas quais a totalidade ou uma fracção mioritária (> 90%) da subunidade pode ser fundida a outra proteína, usualmente pelo menos cerca de 5 ácidos aminados, particularmente quando a outra proteína pode fornecer uma sequência de sinal.

grupo seguinte de proteína será constituído por proteínas contendo sequências que são activas individualmente formando um complexo mas estão ligadas quer cabeça com cabeça quer cabeça com cauda, quer ainda cauda com cauda,, seja directamente ou por intermédio duma ponte de pelo menos de cerca de 900 ácidos aminados, usualmente menos de 500 ácidos aminados, mais usualmente menos de 60 ácidos aminados. A ponte pode ser uma ponte sintética, tendo-se removido uma porção da ponte natural, de modo a encurtar de modo substancial a distância entre as duas subunidades em comparação com o precursor natural. As subunidades também podem ser truncadas nas respectivas extremidades N-terminal e/ou C-terminal, usualmente em número de não mais do que cerca de 10%, mais usualmente em número de não mais do que cerca de 5%. É desejável que as duas subunidades estejam unidas entre si ou à ponte por sinais de processamento que permitem uma hidrólise enzimática, em particular uma hidrólise enzimática no

paciente de modo a permitir o aparecimento dos fragmentos individuais. Tanto os sinais de processamento naturais como um

processamento alternativo podem estar

do um grande número de sinais de protease reconhecidos por hospedeiros humanos, p.ex., K-R, R-R, etc..

As consequências de codificação podem ser obtidas de vários modos. A sequência para o precursor do factor VIII foi descrita na literatura (ver também Quadro I). De acordo com os procedimentos descritos na literatura, deve preparar-se ou uma sequência do genoma ou uma sequência de cADN de todas ou duma porção das subunidades de factor VIII. Deste modo é possível empregar para a região de codificação exões, fragmentos e o cADN completo para percursor do factor VIII, sequências sintéticas ou combinações destes elementos. As sequências podem ser modificadas por mutagénese in vitro, reparação por iniciadores, ressecção, restrição, formação de extremidades não salientes, seja por digestão seja por preenchimento, inserção de adaptadores, inserção em ligantes poliméricos, ligação com ligantes e técnicas semelhantes. Deste modo é possível empregar numerosas técnicas para modificar uma sequência de codificação, conseguir supressões, inserções e substituições, como sejam transições e transversões. A preparação da sequência de codificação pode ser feita independentemente da união a outros membros da “cassette de expressão ou pode ser conseguida com o mesmo processo. Podem empregar-se várias estratégias, dependendo das sequências e vectores disponíveis, da presença de sítios de restrição e de factores semelhantes, á conveniente preparar em primeiro lugar a sequência de cadificação, juntando em seguida os restantes membros da cassette de expressão.

Pocl®~se introduzir um guia de sinal na extremidade 5* da sequência de codificação. 0 guia de sinal servirá para provocar a secreção da proteína pretendida no meio nutriente. Normalmente o guia de sinal estará ligado á sequência de codificação por um sinal de processamento, usualmente envolvendo pelo menos 2 codões, o qual codifica para um wvmi sítio que é reconhecido por uma enzima que provocará hidrólise nesse sítio. Foi e studado um giaide número de guias de sinal numa variedade pes preferidas exoproteases e utilizados nas pes de Kluyveromyces, incluem o factor alfa, quer o factor alfa de Saccharomyces quer o de Kluyveromyces, e sequências guia sintéticas (ver exemplo 14).

de hospedeiros. Tem sido utilizados nas estirde Bacillus guias de sinal como alfa-amilase, levansucrases. Sequências de sinal que tem sido estirpes de levedura, particularmente nas estirA cassette de expressão conterá uma região de início de transcrição e de tradução ligada à extremidade 5* terminal da sequência de codificação, de modo a regular a transcrição e a tradução da sequência de codificação.

Ligada à extremidade 3¹ da sequência de codificação existirá um região de terminação de transcrição e de tradução, sendo as duas regiões de regulação funcionais no hospedeiro de expressão que se pretende utilizar.

São várias as regiões de início de transcrição e de tradução que podem ser utilizadas mas as regiões terão resultados variados no que se refere á respectiva eficiência quando usados em diferentes hospedeiros e no que se refere ao respectivo efeito nas características de crescimento dos diferentes hospedeiros. São de particular interesse como regiões de início de transcrição e de tradução para Bacillus as alfa-amilase, exoproteases e levansucrase. São de particular interesse como regiões de início de transcrição e de tradução para Kluyveromyces mactase, fosfoglicerato-quinase, enolase, etc.. Ag regiões de terminação não são tão críticas como as regiões de início, de modo que se pode utilizar qualqner região de terminação conveniente. D_este modo, a região de terminação pode ser originária do mesmo gene da região de início de transcrição e de tradução ou pode estar associada a um gene diferente, desde que esta região de terminação seja funcional no hospedeiro. Em muitos casos a região de terminação pode estar associada ao gene do qual foi obtido o guia de sinal ou

com um gene diferente

A cassette de expressão pode ser usada para transformar directamente o hospedeiro ou pode estar presente como parte dum vector. É preferível a utilização dum vector uma vez que este apresenta um certo número de outras vantagens. A maior parte dos vectores incluirão uma ou várias marcas que possibilitam a selecção do hospedeiro transformado. Deste modo, é possível seleccional os hospedeiros que contém a construção que leva à expressão em relação aos que não foram transformados. Na maior parte dos casos as marcas forne cem protecção perante biocidas, em particular perante antibiódicos, ou concedem propriedades prototróficas a um hospedeiro auxótrofico. A título ilustrativo podem mencionar-se marcas incluindo resistência à gentamicina (G418), canamicina.

tetraciclina. amplicilina, cloranfenicol, neomicina, etc.. Os genes de resistência devem conter as regiões de regulação de transcrição e de tradução apropriadas para funcionarem no hospedeiro da expressão.

O vector deve conter igualmente um sistema de replicação que seja funcional no hospedeiro, o qual pode ser do tipo de baixo número de cópias ou de alto número de cópias. Em dependência da natureza da construção, o vector

ser mantido

como um elemento extracromosso·

tornar-se parte integrante

hospedeiro» especialmente guando o vector possui regiões de homologia entre sequências de ADN do vector e sequências de

ADN do hospedeiro. Deste modo, a integração pode ser encorajada mediante a existência duma região de homologia entre o vector e o hospedeiro e especialmente quando e sistema de replicação escolhido é instável e pode ser mantido apenas sob pressão selectiva.

C_onsidera-se conveniente que o vector seja um vector vai-vem ou lançadeira, podendo ser neste caso o vector transferido para uw hospedeiro de clonagem, como seja E.coli, após cada manipulação. Deste modo, as construções

podem ser qrplificadas e analisadas de modo a assegurar que foram obtidos os resultados pretendidos.

Uma vez completado o vector de expressão, é possível usá-lo para transformação. Existem várias técnicas para transformação para as espécies pretendidas. Tanto Bacillus como Kluvveromvces podem ser transformados empregando protoplastos na presença de fusogénio, especialmente de polietileno-glicol. Em alternativa os plasraídeos podem ser linearizados e transformar com estes plasmídeos K,lactis num meio contendo um agente de transformação, p.ex. acetato de lítio, e um biocida, p.ex. G418. As células podem em seguiâa ser regeneradas e seleccionadas em relação à presença da cassette de expressão. Os transformantes podem então ser cultivados num meio de cultura apropriado para produção dos produtos pretendidos.

Os produtos pretendidos podem ser isolados de vários modos. Quando o produto fica retido no citoplasma, as células podem ser separadas, lisadas e a proteína pode ser extraída por extracção líquido-líquido, cromatografia, electroforese ou por outras técnicas convencionais. Quando o produto é segregado, o meio nutriente pode ser feito circular de forma contínua ou retirado parcialmente e o produto pretendido obtido do mesmo modo descrito para o lisado celular.

Uma vez obtido o produto no grau de pureza pretendido, este pode ser incorporado numa preparação farmacêutica adaptada ao objectivo em vista. Para uso em pacientes é possível combinar o produto com vários aditivos fisiologicamente aceitáveis, tais como água, solução salina, solução salina tamponizada por fosfato ou outros semelhantes, e á possível administrar a preparação obtida ao paciente, normalmente por via de injecção, especialmente intravascular. A quantidade a administrar variará amplamente conforme o objectivo visado, o estado do paciente, a proteína de que se trata e a respectiva actividade, bem como de outras considerações convencionais. Na maioria das situações, as subunida- 31 -

des fisiologicamente activas serão administradas de tal modo que se atinja um nível de cerca de 0,1 até cerca de 10 unidades por ml de sangue.

O_utro aspectQ da presente invenção consistem num processo para a preparação d e anticorpos que reconhecem as subunidades proteicas do factor VIII. E_stes anticorpos podem ser preparados de acordo com técnicas convencionais mediante a imunização de mamíferos com as proteínas obtidas de acordo com o processo da presente invenção. Obtem-se anticorpos específicos para as proteínas de 80 kDa e outros para as proteínas de 92 kDa. tina vez isolados a partir do sangue estes anticorpos podem ser usados para a produção de hibridomas a partir dos quais é possível produzir anticorpos monoclonais. Os anticorpos obtidos pelo processo da presente invenção podem ser usados para diagnóstico de anormalidades do factor VIII mediante o uso de qualquer uma das técnicas de análise convencionais directas ou competitivas em amostras de sangue, as quais incluem fazer contactar a amostra com o anticorpo produzido e verificar a presença ou ausência dum conjugado do anticorpo com o anticorpo do factor VIII, podendo ser assim determinado a quantidade da proteína factor VIII na amostra.

Os anticorpos podem também ser utilizados para a purificação das proteínas do factor VIII fazendo contactaruma fase líquida contendo a proteína do factor VIII fazendo contactar uma fase líquida contendo a proteína juntamente com um certo conteúdo de impurezas com uma fase sólida na qual está imofilizado o anticorpo produzido, separando a fase líquida da fase sólida e eluindo da fase sólida a proteína com um conteúdo de impurezas reduzido.

Os exemplos que se seguem são apresentados com o objectivo de ilustrar a presente invenção sem que de qualquer modo restrinjam o respectivo âmbito.

Métodos gerais

1. Técnicas de clonagem

No que diz respeito a métodos gerais de clonagem pode referir-se o manual de Maniatis et al., 1982.

As enzimas de restrição são usadas de acordo com as recomendações do fabricante e são obtidas de New England Biolabs (Biolabs), Bettresda Research Laboratories (BRL) ou Boehringer Mannheim (Boehringer). Em geral são necessárias 1 a 5 unidades de enzimas para cindir 1 micrograa ma de ADN.

Para ligação, fazem-se correr os fragmentos de ADN num gel de agarose, electroeluem-se, purificam-se numa coluna de NACS (BRL) de acordo com as recomendações do fabricante, precipitam-se com etanol e incubam-se num tampão contendp Tris-HCl 50 mM a pH 7,4? MgCl₂ 10 mM? ditiotreitol 10 mM? ATP 1 mM e ligase de ADN T4 (Biolabs).

Para marcação final, o ADN cortado com uma enzima de restrição é extraído com fenol e precipitado com etanol. 0 fosfato e removido da extremidade 5’ com fosfatase alcalina de intestino de vitela (Boehringer) em Tris-HC1 50 mM a pH 8.0 à temperatura de 37°C. Após inactivação da enzima a 65°C durante 1 h, seguida de extracção com fenol e pre· 32 cipitação com etanol, marcou-se o ADN usando grama- P-ATP (1 a 2 micromolar) num tampão contendo Tris-HCl 50 mM e a pH 7,6? MgCl₂ 10 mM e ditiotreitol 5 mM durante 30 minutos a 37°C. Os nucleótidos não incorporados são removidos por cromatografia em Sephadex G-50.

preenchimento dos sítios de restrição 5‘ salientes foi levado a efeito com o fragmento maior de ADN

polimerase I (Biolabs). A incubação foi efectuada durante 15 minutos a 30°C num tampão contendo Tris-HCl 10 mM a pH 7, 7; NaCl 50 mM; MgCl₂ 10 mM; ditiotreitol 1 mM e nucleótidos não marcados a 20 micromolar.

A transformação de E,coli foi levada a efeito pela técnica clássica de CaCl₂ (Maniatis et al., 1982) ou exactamente de acordo com a técnica descrita por Hanahn (1983). A transformação de Bacillus e de Kluyveromvces com ADN exterior foi levada a efeito como descrito no texto.

2. Análise de proteínas. Preparação das amostras e electroforese

Adicionaram-se 10 microlitros de tampão de diluição (Tris-HCl 0,313 M a pH 6,8, dodecilsulfato de sódio (DSS) a 10%, glicerol a 50%), 2,5 microlitros duma solução saturada de Azul de Bromofenol (ABF) em água e 2,5 microlitros de beta-mercaptoetanol a 40 microlitros dum extracto celular de Kluvveromyces. Fervem-se as amostras durante 2 minutos, centrifugaram-se numa centrífuga Eppendorf durante 2 minutos e subsequentemente depositaram-se em gel de poliacrilamida de acordo com a técnica de camadas de Laemli (1970) consistindo num gel de separação a 7, 5% e num gel de armazenagem a 5%. Fizeram-se correr os geis a 60 mA até a marca de ABF ter atingido o extre mo do gel.

Dissolveram-se as amostras de extractos celulares de Bacillus e as proteínas extracelulares em tampão de diluição (Tris-HCl 0,06 M e pH 6,8; DSS a 2% e glicerol a 1C%. Adicionaram-se ABF e beta-mercaptoetanol como acima. Ferveram-se as amostras 5 minutos, centrifugaram-se e subsequentemente depositaram-se num gel de poliacrilamida a 6% (gel de armazenagem a 5%) em camada e procedeu-se à separação como acima.

Todos os geis apresentados foram feitos correr de cima para baixo.

3. Ρχ-ο cedi mento de análise de proteínas por formação de manchas

As proteínas foram transferidas do gel para filtros de nitrocelulose (0,45 micrometros) para análise de mancha (técnica de mancha de Western) usando um aparelho Eiectroblot da companhia Biorad e um tampão contendo Tris 21 mH; glicina 160 mM e metanol a 20%, durante 16 h a 150 mA. A_s manchas foram tratadas durante 1 hora com solução de Albumina de S_oro de Bovino (ASB) (1% de ASB em Tris-HCl 50 mM e pH 7,5 e NaCl a 0.9%) e subsequentemente durante 2,5 horas com um antissoro em solução fresca de ASB. Depois de 3 lavagens com tampão de Tween 20 (Tris-HCl 50 mM e pH 7,5; NaCl a O,9% e Tween 20 a 0.05%) adicionou-se o segundo anticorpo em solução fresca de ASB e incubou-se durante 2 h, lavando novamente 3 vezes com tampão de Tween 20. A coloração das manchas foi efectuada conforme a enzima acoplada ao segundo anticorpo. No caso da peroxidase de rábano bastardo, a cloração foi efectuada durante 20 minutos com 0, 6 mg/ml de 4-cloro-naftol e 0.015% de H₂0₂ num tampão contendo Trio-HCL 50 mM a pH 7,5 e O,9% de NaCl seguido de lavagem com água destilada. Quando se usou fosfatase alcalina a mancha foi corada durante um período de incubação de 15 min com 0,033% de azul nitro de tetrazólio e 0,017% de fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo em Tris-HCl 100 mM a pH 9, 5; NaCl 100 mM e MgCl₂ 5 mM.

4. D_eterminação de quimosina

No caso do produto de fusão 92 kDa-proquimosina, parte das amostras foram tratadas a baixo pH a fim de activar a quimosina. A^icionou^se HC1 4 M a 500 microlitros de extracto celular a fim de baixar o pH até aproximadamente 2,0 e incubou-se a amostra à temperatura ambiente durante 2 h. Ajustou-se o pH a 6,4 com Tris 2,5 M. As amostras: foram usadas para análises em gel de poliacrilamida e para a determinação da actividade de quimosina de acordo com uma té cnica de análise normalizada por coagulação de leite (Foltman, 1970).

5. P_reparação e caracterização de anticorpos monoclonais e policlonais contra factor VIII

Imunizaram-se ratos Balb/c com complexo purificado factor VIII humano/factor de von Willebrand. Levou-se a efeito uma purificação por meio de filtração em gel de agarose dum crioprecipitado dum concentrado de factor VIII usado para fins terapêuticos (Laboratório Central do Serviço de Transfusão Sanguínea da Cruz Vermelha dos Paises-Baixos, Amesterdão, Países-Baixos)# como descrito por Van Mourik e Mochtar (1970). Realizou-se a hibridação de linfócitos como descrito por Galfró et al. (1977). A descrição das técnicas usadas para selecção de clones que produzem anticorpos monoclonais contra factor VIII foi apresentada noutra publicação (Stel et al., 1983).

Os anticorpos monoclonais contra factor VIII foram identificados de acordo com a respectiva reactividade com polipeptídeos de factor VIII usando um procedimento adaptado de Towbin et al. (1979). As amostras preparadas conforme descrito acima foram em primeiro lugar analisadas por electroforese de gel em DSS-poliacrilamida (Laemli, 1970). Em seguida, as proteínas separadas foram transferidas por electroforese (transferência de Western) do gel para uma película de nitrocelulose. As películas foram lavadas e incubadas durante 2 horas com os anticorpos monoclonais e lavados novamente. Em seguida, incubaram-se as películas com imunoglobulinas de cabra-anti-rato conjugadas com peroxidase, lavaram-se e incubaram-se com 4-cloro-l-naftol e Η₂Ο₂ para detectar peroxidase ligada a anticorpos (ver também acima) ·

Este procedimento demonstrou que se desenvolveram os seguintes anticorpos monoclonais distintos

(Figurs 1). 0 anticorpo designado por CLB-CAg9 reagiu com um polipeptídeo de 92 kDa e com polipeptídeos maiores. Um anticorpo, CLB-CAg 65, reagiu com o doblete de 79-80 kDa. Este último anticorpo não reage com o polipeptídeo de 92 kDa nem com polipeptídeos maiores. Este facto demonstra que o doblete de 79-80 kDa possui um epítopo que não existe no polipeptídeo de 92 kDa.

Além disso, os anticorpos monoclonais contra factor VIII foram identificados de acordo com a respectiva reactividade com os polipeptídeos do factor VIII e purificados por cromatografia de imunoafinidade como descrito anteriormente (Stel, 1984). A porção maior desta preparação, que não contém o factor de von Willebrand, consiste no doblete de 79-80 kDa. T_ambém estão presentes traços de polipeptídeos maiores. P_or análise desta preparação pela téenica imunológica de mancha demonstrou-se que, além do anticorpo monoclonal CLB-CAg 62 reagiam com o polipeptídeo de 92 kDa e com polipeptídeos maiores.

Afim de obter anticorpos policlonais contra polipeptídeos de factor VIII, imunizaram-se coelhos por métodos correntes com a preparação de factor VIII purificado por cromatografia como descrito acima. Os anticorpos deste modo obtidos foram identificados por análise imunológica de mancha como descrito acima usando o complexp purificado factor VlII/factor de von Willebrand ou polipeptídeos purificados de factor VIII, separados por electroforese em gel de DSS-poliacrilamida e subsequentemente transferidos para policuias de nitrocelulose para servirem de proteínas alvo. Esta análise demonstra que se tinham desenvolvido três antissoros policlonais distintos (RH 63271, RH 63272 e RH 63275). Estes antissoros reagiram com o doblete de 79-80 kDa , com o polipeptídeo de 92 kDa e com polipeptídeos maiores. Também demonstra que estes antissoros reagem com polipeptídeos menores.

Exemplo 1

SÍNTESE DUM CADN DO mARN DO FACTOR VIII

Isolamento de poliA+ ARN de fígado humano

Durante o trabalho com ARN houve o cuidado de trabalhar em meio isento de ribonuclease. Usaram-se utensílios de plástico estéreis e não reutilizáveis e todos os utensílios de vidro foram tornados isentos de nuclease por aquecimento durante a noite a 180°C. S_empre que possível, as soluções foram incubadas com pirocarbonato de dietilo a 0,1% durante 30 minutos e autoclavadas.

Preparou-se o ARN total de 60 g de tecido de fígado humano pelo método de t iocianato de guanidio como descrito por Chargwin et al. (1979). Levou-se a efeito uma homogeneização de tecido de fígado congelado e finamente moído em tiocianato de guanidio com um P_olytron durante 45 s. 0 rendimento de ARN total foi de aprpximadamente 133 mg. Efectuou-se o isolamento do poliA+ ARN pelo procedimento descrito por Aviv e Leder (1972) modificado. 0 ARN total foi ligado por uma técnica descontínua à quantidade apropriada de oligo(dT)-celulose (Collaborative Research, tipo T2) em Tris-HC1 50 mM (pH 7,5); EDTA 1 mM); DSS a 0, 2% e N_aCl 0,4 M. Preparou-se uma coluna para esta preparação e eluiu-se o poliA+ ARN com o mesmo tampão mas sem NaCl. Realizou-se um segundo ciclo de absorção de poliA+ ARN em oligo(dT)-celulose usando condições menos drásticas (tampão contendo NaCl 0,25 M), a fim de separar o poliA+ ARN do restante ARN ribossomol. 0 rendimento final de poliA+ ARN foi de cerca de 830 microgramas. A análise desta preparação por electroforese em gel de agarose mostrou que não continha ARN ribossomal.

Síntese de cAND dirigida por iniciador:

A síntese do cADN do factor VIII foi baseado no método de Gubler e Hoffman (1983) de acordo com a modificação introduzida por Toole et al. (1984). Sintetizaram-se iniciadores específicos para a síntese de cADN com um sintetizador de ADN da companhia Biosearch (Figura 2). Misturou-se proiA+ ARN de fígado humano (20 microgramas em água destilada) com um excesso molar de 10 vezes de inicia dor de cadeia simples em CHgHgOH 10 mM num volume total de 35 microlitoos e incubou-se durante 10 min à temperatura ambiente. Adicionou-se beta-mercaptoetanol até uma concentração final de 47 mM e em seguida RN^sina (P_romega-Blotec) até 100 U/ml (volume total de 47 microlitros). Em seguida adicionou-se 50 microlitros de tampão 2xRT (Tris-MCl 0,1 M a pH 8,3 (43°C); MgCl₂ 10 mM; KG1 150 mM; beta-mercaptoetanol 60 mM; dATP, dGTP e dTTP cada um 1 mM e dCTP 0,2 mM) e 0,4 microlitros de água. Após 2 min de incubação a 50°C seguidos de 2 min a 43°C, adicionaram-se 2,6 microlitros de super RT (Anglian Biotechnology, 17 U/microlitros). A síntese da primeira catenária foi realizada durante 45 min a 43°C. Provpcou-se a paragem da reacção em gelo e adicionaram-se 300 microlitros duma solução contendo Tris-HCl 40 mM (pH 7,5); MgCl mM; KC1 75 mM e 25 microgramas/ml de ASB (BRL, isenta de desoxiribonuclease e de ribonuclease). Para a marcação da se32 gunda catenária, adicionaram-se 2 mictolitros de alfa- P

-dCTP (3000 Ci/mmol; 10 mCi/ml), seguidos por 8 microlitros de ADN polimerase I (10 U/microlitro; Biolabs) e 4 microlitros de ARNase H (10 u/microlitro; Anglian)· Após 60 min a 11°C, adicionaram-se 4 microlitros de ATP 20 mM e 1 microlitro de

ADN ligase T4 (400 U/microlitro; Biolabs) e continuou-se a incubação durante 120 min a 18°C. Provocou-se a paragem da reacção por adição de 30 microlitros de EDTA 0,5 M e 4 microlitros de DSS a 10%. Extraíu-se a mistura com fenol e precipou-se o ADN com isopropanol. Removeram-se os nucleótidos não incorporados numa coluna de Saphadex G-50.

rendimento final foi de 400 ng de cADN de catenária dupla.

Ir r

Isolamento de clones de cADN parcial de factor VIIIt

Digeriu-se o cADN de catenária dupla com uma combinação de duas enzimas de restrição de acordo com o indicado na Figura 2. Após digestão, separaram-se os fragmentos do cADN de acordo com a respec tiva dimenção numa coluna de Sepharose CL-4B. Fizeram-se correr num gel de agarose amostras das fracções originárias da coluna e e stimou-se a respectiva dimensão por autorradiografia. Usou-se o material de dimensão superior a 600 pb para as experiências de clonagem subsequentes. Ligaram-se os fragmentos A e B no plasmídeo pAT153 (Twigg e Sherrat, 1980), os fragmentos C e D no plasmídeo pACYC177 (Chang e Cohen, 1978) e o fragmento E no plasmídeo pUC19 (Yanish-Perron et al., 1985). A_ntes da ligarão a fragmentos de cADN, digeriram-se todos os plasmídeos com as duas enzimas de restrição correspondentes e isolou-se o fragmento vector por electroforese em gel de agarose, seguida de electroeluição e de cromatografia em DEAE-Sephacel.

Após ligação, transformou-se E,coli

DH1 exactamente do modo descrito por Hanahn (1983). Obtiveram-se cerca de 100 colónias com plasmídeos contendo uma inserção por nanograma de cADN. Transferiram-se as colónias para filtros de nitrocelulose (Grunstein e Hogess, 1975), lisaram-se e hibridaram-se com sondas marcadas por isótopos radioacti·· vos (Figura 2). Os clones que tinham s ido derivados da síntese de cADN com o fragmento 1 como iniciador foram analisados com o fragmento 2. Os clones sintetizados com o fragmento 2 foram analisados com o fragmento 3, etc,. Procedeu-se à marcação dos fragmentos com gama- P-ATP e polinucleótido quinase (Maniatis et.al., 1982). A pre-hibridação dos filtros foi efectuada a 20°C numa solução de 6 x SSC, 5 x solução de Denhardt (Ficol a 0,1%; polivinil-pirrolidona a 0,1% e ABS a 0,1%) e 100 microgramas de ADN de Ξ.coli por ml. A hibridação foi levada a efeito na mesma solução contendo 10 ng de fragmento marcado por ml durante a noite a 20°C. Lavaram-se os filtros em 6 x SSC a 37°C e submeteram-se a autorradiografia.

Cerca de 1 em 1000 colónias era positiva e os clones correctos foram isolados de todos os subfragmentos de cADN. Os clones dos fragmentos A# B, C e D e E (Figura 2) foram designados por pCLB81, pCLB82, pCIiB83, pCLB84 e pCLB85, respectivamente.

Construção dum cADN do factor VIII de comprimento integral;

No clòne pCLB85 está ausente um pequeno fragmento de ADN da sequência que codifica para o factor VIII desde o codão de início ATG até ao sítio Saci na posição 16 (Quadro I). Os nucleótidos em falta foram conseguidos por síntese química dum fragmento de ADN, criando deste modo um sítio Sall a montante do codão ATC de tal modo que a sequência final resulta;

¹GTCGACATGCAAATAGAGCCTC3.

Para este fim, segmentou-se o plasmídeo pBR322 com Aval e preencheu-se o sítio Aval com o fragmento maior de ADN polimerase I. Após uma segunda segmentação com PvuII, o fragmento restante do plasmídeo pBR322 foi circularizado, obtendo-se o plasmídeo PI. 0 fragmento BamHI-SacI do plasmídeo pCIB85 de 1, 9 kb específico para o cADN do factor VIII foi ligado com PI segmento com BamHI e BanII. Após a ligação, adicionou-se um fragmento de ADN sintetizado quimicamente.

(CGGTCGACATGCAAATAGAGCT) e incubou-se a mistura com o fragmento maior de ADN polimerase I e com os quatro desoxirribonucleótidos. Após extracção com fenol, seguida de digestão com Sall e de outra extracção com fenol, ligou-se o fragmento. 0 plasmídeo resultante, pCLB86, ficou contendo, deste modo, um sítio Sall em frente do codão ATG de início do factor VIII_o

Os plasmídeos pCLB81, 82, 83, 84 e 86 são em seguida reunidos em 3 fases para dar um clone de factor

VIII de comprimento integral. Em primeiro lugar, combinou-se as inserções de pCLB84 e 86 no plasmídeo pUC19 cortado com Sall e PstI (pCLB87). Em seguida cortam-se os plasmídeos pCLB81 e 82 com EcoRI juntamente com Hpal e com BamHI juntamente com EcoRI, respectivamente, e ligam-se ao plasmídeo pEP121 (E_nger-Valk, 1984), obtendo-se o plasmídeo pCLB88. Então, combinam-se as inserções de pCLB83, 87 e 88 num clone de cADN contendo a fracção completa do gene dof factor VIII que codifica para a proteína sob a forma dum fragmento Sall-Hpal em pEP121 (pCLB89).

A inserção do cADN do factor VIII no plasmídeo pCLB89 foi submetida a sequenciação de acordo com os métodos de Sanger et. al. (1977) e Maxam e Gilbert (1980). A sequência é apresentada no Quadro I.

EXEMPLO 2

CONSTRUÇÃO DUM VECTOR DE SECREÇÃO DE BACILLUS COM A CASSETTE DE EXPRESSÃO DO GENE DE ALFA-AMILASE DE BACILLUS LICHENIFORMIS

P_or clonagem do gene de alfa-amilase de B. 1 i ch en i for mi s estirpe T5 no vector pUBUO (Matsumura et al., 1984) obtiveram-se os plasmídeos recombinantes pGB33 e pGB34 de acordo com o método descrito no pedido de P_atente E_uropeia EP-A-0134048.

Os fragmentos de restrição de B.lichenifo mis provenientes do plasmídeo pGB33 inseridos a ser sequencia rdos de M13mp8 e M13mp9 (Messing e Vieira, 1982) e determinaram-se as sequências de nucleótidos pelo método de terminação de cadeia di-deoxi de Sanger et al. (1977).

promotor, séquência de Shine-Dalgarno e a sequência de sinal do gene de alfa-amilase clonado são descritos no pedido de P_atente Europeia EP-A-O224294.

A fim de colocar um gene de quimosina bovina atrás destas sequências de regulação do início da transcrição e da dratução, digerimos pGB34 e pUR1523, um plasmídeo de E.coli que contém o gene da quimosina de bovino (ver pedido de Patente Europeia EP-A-OO771O9)_t com PstI. Após ligação e transformação de células de B.subtilis 1A-40 (BGSC, Ohio, EUA) competentes, isoleu-se o ADN plasmídeo a partir de transformantes seleccionados. Depois de efectuadas análises de restrição por endonuclease, obteve-se o plasmídeo recombinante correcto que se denomina pLC28. Por corte do plasmídeo pLC28 com a endonuclease de restrição Ciai seguido de ressetcção com a exonuclease Bal-31, ligação e transformação, obteve-se o plasmídeo pLC83 (ver pedido de P_atente Europeia EP-A-0134048).

É sabito da literatura recente (Ulmanen et al. (1985), Shiroza et al, (1985)), que o nível de secreção baseado na alfa-amilase depende igualmente da posição do codão da alfa-amilase madura ao qual o gene heteróçlíégo está ligado. Por conseguinte, incubámos um clone contendo alfa-amilase M13mp8 (designado por pPB4) com SstII, efectuando seguidamente ressacção com a exonuclease Bal-31, corte com Smal, ligação e transformaçãode células de E.coli JM101 competentes (Yanish-Perron et al., 1985). E_ste procedimento deu origem ao que se designou por banco de guias. Esta expressão significa um conjunto de clones derivados de M13mp8 nos quais o número de ácidos aminados (designados por ) antes do sítio de maturação da proteína alfa-amilase varia.

Os clones guia M13mp8 com o quadro de leitura correcto foram usados para colocar o gene da (pro) quimosina em fase por trás das sequências de regulação de transcrição, de tradução e de secreção da alfa-amilase. Estes plasmídeos de fusão foram desiginados por pLCn ou por pLPn conforme as referiam à qmimosina ou à proquimosina respectivamente, sendo η o núrnero de ácidos aminados da alfa-amilase por trás do sítio da maturação.

As construções pLCn e pLCn foram modificadas de modo a remover o sítio EcoRI, originário do plasmídeo pGB33, por acção da exonuclease Bal-31 após corte com EcoRI. Além disso, as construções pLC foram modificadas de modo a conterem sítios de restrição por endonuclease singulares atrás das sequências guia e um sítio de reconheeimento para sinal-peptidas directamente por trás das sequências guia.

A fim de corresponder a estas resquisitos sintetizaram-se por via química quatro oligodeoxirribucleótideos, I a IVs

I	5 '	-AATTCGCGGCCGCC-3 '	(no.
II :	5 '	-CGGGTCGACTCAAGCTTA-3 '	(no.
III :	3'	-GCGCCGGCGGGCCCAGCT-5'	(no.
IV :	3 '	-GAGTTCGAATTTAA-5	(no.
EcoRI	XmalII Xmal/Smal	Sall

5’ AA TTC GCG GCC GCC CGG GTC GAC TCA AGC TTA 3

227 7

A)

5)

2)

T.I

3' G CGC CGG CGG GCC CAG CTG AGT

III

TCG AAT TTA

IV glu phe ala ala ala arg vai asp ser ser leu asn se Estes fragmeiitos constituem o sítio de multiclonagem e estão ligados a construções pLC dando origem a vectores de secreção do tipo pOL5-n (Figura 3). E_ste plasmídeo serve de veículo para introduçãò subsequente (ver Exemplo 3) de genes que se podem expressar e que codificam para proteínas com actividade de factor VIII, sendo o plasmídeo adequado para a transformação de BaccilLus. Na designação do plasmídeo, n refere-se ao número de ácidcs aminados da alfa-amilase madura presentes atrás da sequência de sinal. A Figura 3 ilustra um plasmídeo que produzirá 21 ácidos aminados nesta secção. 0 número de ácidos aminados nesta secção não afecta a capacidade do plasmídeo, quando contém um gene que

codifica para uma proteína factor VIII, de expressar a proteína factor VIII num transformante Bacillus.

Transformou-se Bacillus subtilis com pOL5-21 e depositou-se o transformante em 14 de Julho de 1986 no C_entraal Bureavoor Schimmelcultures (CBS), em Oosterstraat 1, 3742 SK BAARN, PAÍSES BAIXOS, onde lhe foi dado o número de depósito CBS-304.86.

Mediante a utilização do vector de expressão pOL5-n contendo sequências homológicas com o cromossoma hospedeiro da estirpe B.licheniformis T5 observámos instabilidade dos plasmídeos tanto sob o aspecto estrutural como de secreção.

Para evitar a recombinação homóloga entre as sequências de alfa-amilase no cromêssoma da célula hospedeira de B.licheniformis por um lado e as mesmas sequências no vector de expressão por outro, decidimos anular estas sequências.

Em primeiro lugar, construímos uma estirpe hospedeira de Bacillus licheniformis a que faltava o promotor de alfa-amilase e o gene cromossomal completo de alfa-amilase (ver Exemplo 4).

Em segundo lugar removemos do vector de expressão as restantes sequências homólogas a montante do promotor de alfa-amilase. Em seguida os vectores pOL5-n foram digeridos com EcoRST e Bgll, ligados e transformados em protoplastos de Bacillus substilia 1A40 (BGSC, Ohio, E.U.A). Isolou· -se o ADN plasmídeo a partir dos transformantes resistentes à neomicina. Depois de realizadas análises de restrição por endonuclease obtiveram-se os plasmídeos recombinantes correctos que se disignaram por pOL5-delta (ver Figura 4).

A partir de protoplastos da estirpe Bacillus licheniformis (ver Exemplo 4) tnansformada com estes vectores pOL5-delta foram obtidos transformantes resistentes à neomicina. Estes transformantes T9 foram submetidos a um ensaio de estabilidade dos plasmídeos de acordo com o método descrito por Andreoli, 1985.

A população de ADN dos plasmídeos foi analisada mais em pormenor por mapeação com enzimas de restrição. Após cerca de 5o gerações menos de 5% dos vectores pOL5-delta tinham sido eliminados em contraste com as células T9 contendo plasmídeos pOL5 nas quais até 90% dos plasmídeos tinham sido eliminados.

Estes resultados indicam que os vectores de expressão pOL5-delta são estáveis no ambiente genético do hospedeiro Bacillus licheniformis T9.

Exemplo 3

INTRODUÇÃO DE CADN DE FACTOR VIII HUMANO NUM VECTOR DE BACILLUS E ANALISE DA EXPRESSÃO DA SUBUNIDADE DE 92 kDa DO FACTOR VIII EM FACILLUS SUBTILIS.

gene da subunidade de 92 kDa é inserido no plasmídeo pOL5-21 dando origem ao plasmídeo pOL92 (ver Figuras 5A e B). Após a transformação de protoplastos de Bacillus substilis (Chang e Cohen, 1979) seguida de análise por hibridação de colónias (Grunstein e Hogness, 1975) e mapeamento dos plasmídeos por enzimas de restrição, obtivemos as construções pOL92-T-21 e enzimas de restrição, as construções pOL92-21 e pO192-A-21, respectivamente.

A fim de examinar a expressão de polipeptídeos do factor VIII, fizeram-se crescer transformantes num meio apropriado, p.ex. caldo de soja Trypton a uma temperatura de 37 a 40°C com arejamento na presença de neomicina

(10 mícroâjramas/ml). Centrifugaram-se amostras da cultura e lisaram-se de modo seguinte: Após centrifugação de uma amostra de 2 ml da cultura ressuspenderam-se as células em 0,1 ml dum tampão contendo Tris-HCl 50 mM a pH 7,5 e EDTA 50 mM.

Aâicionou~se 1 microlitro de PMSF 100 mM e lisozima de clara de ovo até uma concentração final de 2 mg/ml. Após 5 minutos a 37°C adicionou-se outro mililitro de PMSF 100 mM e continuou-se a incubação durante 5 minutos a 37°C. Terminou-se a reacção por adição de tampão de iluição de amostras.

Na Figura 6 apresenta-se a análise em gel de DSS-poliacrilamida destas amostras. 0 lisado celular de pOL92-T-21 apresenta, por análise em gel de DSS-poliacrilamida, bandas de pesos moleculares de 46 kDa, 58 kDa e 88 kDa, respectivamente, sendo estas bandas muito mais intensas do que as da amostra de comparação. 0 peso molecular da maior protenina codificada por pOL92-T-21 é de 88 kDa. Com base na composição de ácidos aminados concluiu-se que o polipeptídeo correspondente à subunidade maior tem um peso molecular de 85 kDa (Vebar et al., 1985), enquanto que para o produto de frgammentação de origem humana se mediu um peso molecular de 92 kDa. As diferenças de peso molecular podem ser atribuidas em parte aos erros experimentais, a diferença nas reac^Ses de modificação das proteínas como a glicosilação, e/ou a diferenças no processamento dos produtos proteicos traduzidos. Deste modo, este resultado demonstra que produzimos proteína da subunidade maior do factor VIII em Bacillus.

Bacillus subtilis transformado com pOL92-T-2m foi dé?.positaao no CBS em 14 de J_ulho de 1986 tendo-Ihe sido atribuido o número de depósito CBS-303.86.

Exemplo 4

CONSTRUÇÃO DUM HOSPEDEIRO BACILLUS LICHENIFORMIS DEFICIENTE

EM EXOPROTEASE E DEFICIENTE EM ALFA AMILASE

Bacillus licheniformis produz pelo menos duas proteases extracelulares importantes, uma protease alcalina (ou subitilisina) e uma outra protease neutra. A estirpe T5 (pedido de Patente Eurppeia EP-A-O134O48) foi submetida a mutagénese por meio de dois ciclos subsequentes com radiação ultravioleta de acordo com o método de M^ller (1972) e cultivada em placas de meio mínimo de celulose de Spizizen suplementado com caseína a 0,4%. S_ete das 12 000 colónias produziram um halo menor no fim do primeiro ciclo. Este sete mutantes foram submetidos ao segundo c iclo de mutagénese por UV. Duas colónias de entre as 10 000 examinadas não apresentaram qualquer halo ou actividade de protease extracelular nas placas de caseína a 0,4%. E_stes mutantes duplos foram caracterizados tanto pela produção total de exoprotease em culturas líquidas como descrito por Kawamura e Doi (1984) como pela produção de alfa-amilase mediante a determinação da produção de açúcares redutores a partir de amido (Chandi e Kjaergaard, 1975) para excluir o isolamento de mutantes dificientes na secreção. Designou-se o isolado assim obtido, proficiente em alfa-amilase e cuja actividade de exoprotaease era inferior ao limitar de detecção, por estirpe T6.

passo seguinte consiste em construir um derivado de Bacillus licheniformis T6 ao qual falta o promotor de alfa-amilase e o gene estrutural completo de alfa-amilase. A fim de criar esta mutação de supressão (a que se chamou delta Amy) digeriu-se o plasmídeo recombinante pGB33, como descrito no pedido de Patente E_uropeia ΞΡ-Α-Ο134Ο48, com Hjnd III e Bgll, ligou-se e transformou-se em células competentes de Bacilfous. substilis estirpe 1A40 (DGSC, Ohio, E.U.A.). Isolou-se o ADN do plasmídeo a partir dos transformantes negativos em relação à alfa-amilase e resistentes à neomicina. Após análise por restrição com endanucleases obteve-se o plasmídeo recombinante delta Amy correcto, designado por pGB33delta. Este plasmídeo contém porçães das sequências laterais 5’ e 3‘ do gene da alfa-amilase da Bacillus licheniformis. A fim de substituir o gene da alfa-amilase do

— tipo selvagem pela mutação que consiste na supressão delta Amy, transformou-se o plasmídeo pGB33delta em protoplastos de Bacillus licheniformis T6 como descrito no Exemplo 5. Dois transformantes resistentes à neomicinade entre 20 000 não mostravam actividade de alfa-amilase éxtracelular e conservam o plasmídeo pGB33delta, indicando que a frequência do gene era muito bai.a. Os dois transformantes deficientes Nm^R foram expurgados do plasmídeo por cultura durante 20 gerações em meio mínimo, como descrito por Meyer e Fiechter (1985) na ausência de selecção por meio de antibiótico.

As células sensíveis à neomicina nas quais o plasmídeo tinha sido expurgado apareceram com uma frequência de cerca de 2%. Uma destas colónias foi denominada por estirpe T9. Usámos as técnicas de mancha de Soutnern e de hibridação (Maniatis et al. 1982) para confirmar que a estirpe T9 continha a supressão de 1,9 kb do gene da alfa-amilase. Na Figura 7 apresenta-se a construção do hospedeiro Bacillus licheniformis T9 deficiente em relação a alfa-amilase.

Uma vantagem adicional desta estirpe T9 consiste em gue, quando este hospedeiro contém um vector de secreção de alfa-amilase de Bacillus licheniformis, p.ex. pOL5 (ver Exemplo 2). já não existe competição para a ligação às moléculas de ARN-polimerase entre o promotor de alfa-amilase cromosomal e o promotor de alfa-amilase localizado no ADN do plasmídeo.

Exemplo 5

TRANSFORMAÇÃO DE PROTOPLASTOS E REGENERAÇÃO DE ESTIRPES DE BACILLUS LICHENIFORMIS

A estirpe Bacillus licheniformis T5 é uma estirpe industrial usada para a produção de enzimas extracelulares e encontra-se descrita no pedido de Patente , Europeia EP-A-0134048.

C_ultivou--se Bacillus licheniformis T5 durante a noite em 50 ml de meio NBSG-X (Thorne e Stull, 1966) a 37°C. Diluiu-se a cultura líl com meio NBSG-X fresco e cultivou-se mais 1 a 1,5 h. Após centrifugação durante 10 minutos a 5000 rpm num rotor Sorvall tipo GSA e ressuspensão em 10 ml de tampão SMM contendo sucrose 1,5 M; MgCl₂ 0,06 M e maleato 0,06 M, reduziram-se as células a protoplastos por incubação durante 2 h a 37°C na presença de 2 mg/ml de lieozima C_entrifugaram-se os protoplastos (10 min a 5000 rpm), ressuspenderam^se em 5 ml de tampão SMML (caldo L no qual se dissolveram sucrose 1,5 M; MgGl₂ 0,06 M e maleato 0,06 M), misturaram-se e centrifugaram-se de novo. Após ressuspensão, incubaram-se os protoplastos durante 2 min em polietileno-glicol 6000 a 30% com 1 .micrograma do plasmídeo pGB33 (ver Exemplo 2).

Depois desta incubação levou-se a efeito uma diluição de 1í3 com meio SMML e, após centrifugação, ressuspendeu-se o sólido em 1 ml de meio SMML. Em seguida cultivaram-se alíquotas de 0,1 ml em placas de agar de regeneí ração contdndo 0,7% (p/v) de K₂HPO₄; 0,3% (p/v) de KH₂P0₄? 0,125% (p/v) de (NH₄)₂SO₄; 0.035% (p/v) de MgSO₄.7H₂O; 1,5% (p/v) de agar; 3,7% (p/v) de KC1; 0,1% (p/v) de glucose, 0,01% (p/v) de agar; 3.7% (p/v) de KC1; 0,1% (p/v) de glucose, 0,01% (p/v) de ASB suplementado com 0,1% (p/v) de solução de esporulação contendo 0,2% (p/v) de MnS0₄; 0.2% (p/v) de ZnSO₄; 0,2% (p/v) de CoCl₂; 0,5% (p/v) de FeSO₄; 6% (p/v) de NaCl e 0,5% (p/v) de CaCl₂· As placas continham adicionalmente 10 microgramas/ml de neomicina.

Depois de incubar a 37°C durante pelo menos 72 horas, prepararam-se placas de réplica das placas originais em meio de agar de infusão de coração contendo 10 microgramas/ml de neomicina. Os transformantes foram analisados no que respeita ao respectivo conteúdo em ADN por isolamento do ADN como descrito por Holmes e Guigley (1981) seguido de caracterização em geis de agarose. Verificou-se que de

entre os transformantes 5% não continha qualquer ADN plasmídico mas continha o ADN completo do plasmídeo pGB33 como parte integral do respectivo genoma. C_onstatou-se que o plasmídeo pGB33 tinha sido integrado no cromossoma por meio de recombinação homologa entre as sequências da alfa-amilase no cromossoma do B.licheniformis T5 por um lado e as mesmas sequências do plasmídeo pGB33 por outro lado.

Exemplo 6

CONSTRUÇÃO DUMA ESTIRPE INDUSTRIAL EE BACILLUS ADEQUADA PARA INTEGRAÇÃO EFICIENTE DE GENES HETERÓLOGOS EM CROMOSSOMAS.

plasmídeo pBClô é derivado de Bacillus cereus e e homólogo em alto grau em relação ao plasmídeo pUBUO conforme descrito por Polak e Novick (1982). A diferença principal entre pBC16 e pUBUO resisde no facto do plasmídeo pBC16 conter um gene de resistência â tetraciclina enquanto que pUBUO contém um gene de resistência à neomicina.

Os transformantes de B.licheniformis T5, conforme descrito no Exemplo 5, que contém no respectivo cromossoma dois genes de amilase e uma cópia de pUBUO, foram transformados usando pBC16 linearizado com Xbal, de acordo com o protocolo de transformação de protoplastos conforme descrito no Exemplo 5. Nas placas de regeneração foram incluídos 10 microgramas/ml de tetraciclina. A selecção de colónias resistentes â tetraciclina teve como resultado uma estirpe na qual o gene de neomicina localizado no cromossoma derivado do plasmídeo pUBUO tinha sido substituido pelo gene da tetraciclina do plasmídeo pBC16 por recombinação dupla recíproca,

A estirpe resultante T5-16 pode ser usada para inserção eficiente em cromossomas de construção plasmídicas derivadas de pUBUO, sendo uma estirpe apropriada para esta finalidade. A estirpe T5-16 é resistente à tetraciclina e sensível a neomicina, possuindo aproximadamente 3 kb

de sequências de ADN homólogas a pUBllO no respectivo genoma.

A fim de obter uma estirpe de B.licheniformis deficiente em exoprotease apropriada para a integração de genes heterólogos em cromossomas, transformaram-se as estirpes T5-16 e T6 (ver Exemplo 4) em protoplastos e fundiram-se conforme descrito no pedido de P_atente E_uropeia EP-A-O134O48.

De entre os produtos da fusão resistentes à tetraciclina, seleccionaram-se os que não apresentavam actividade de exoprotease e caracterizaram-se por análise genó· mica usando uma sonda de ADN que codificava para alfa-amilase marcada com P. Um produto da fusão resistente à tetraciclina, negativa em relação à exoprotease e que possui no gene aproximadamente 3 kb de sequências de ADNhomólogas ao plasmídeo pUBllO é designado por estirpe T6-16.

Exemplo 7

INTEGRAÇÃO DO GENE DO FACTOR VIII HtJMANO NO CROMOSSOMA DE FACILLUS LICHENIFORMIS; EXPRESSÃO Ξ SECREÇÃO DA SUBUNIDADE DE 92 kDa DO FACTOR VIII.

Transformou-se a estirpe Bacillus licheniformis T5-16 com os phasmídeos pOL92-T-21 e pOL92-A-21 de acordo com o protocolo descrito no Exemplo5. S_eleccionaram-se os transformantes em placas de regeneração contendo 5 microgramas/ml de neomicina. Constatou-se que nenhum dos transformantes continha ADN plasmídico e que em todos os casos tinha ocorrido integração do ADN plasmídeo no genoma da estirpe T5-16 por recombinação homóloga.

A fim de examinar a expressão de polipeptídeos de factor VIII, cultivaram-se estes transformantes T5-16 em meio de infusão de coração suplementado com 0,5% de amido. Após 3 dias de incubação a 40°C prepararam-se para análise em geis de proteína de acordo com a técnica seguinte:

centrifugaram-se 3 ml de caldo da fermentação e precipitou-se a proteína da fracçção sobrenadante por adição de ácido tricloroacético (ATCA) a 5%; suspendeu-se o material precipitado em ATCA a 1% e separou-se novamente por centrifugação. Dissolveu-se em seguida a proteína de 25 ml do sobrenadante em 0,5 ml de tampão de diluição. Dissolveu-se em 0,7 ml do mesmo tampão a fracção sólida obtida a partir de 6 ml de caldo de cultura. Estudou-se a composição tanto do sobrenadante como da fracção celular por análise de 60 e de 50 microlitros, respectivamente, em gel de poliacrilamida DSS a 6%, como se apresenta na Figura 8.

A partir do resultado é possível concluir- se que o Bacillus licheniformis pode sintetizar e segregar proteínas de 92 kDa do factor VIII sob a forma de produtos intactos, uma vez que é claramente visível uma banda proteica nas fracções de proteínas do agregado celular e do sobrenaciante de células de B.licheniformis T5-16 transformadas com pOL92-A-21 e com pOL92-T-21, enquanto que no testemunho de comparação (estirpe T5-16) não se observam estas bandas.

Exemplo 8

SÍNTESE E SECREÇÃO DAS SUBUNIDADES PROTEICAS DE 80 kDa E DE 92 kDa USANDO 0 VECTOR DE SECREÇÃO DE ALFA-AMILASE DE BACILLUS LICHENIFORMIS pOL5-DELTA.

A fim.de criar um plasmídeo de expressão Bacillus contendo a subunidade proteica de 80 kDa, combinaram-se os seguintes três fragmentos de ADNs (i) o fragmento Sall-B_all de 4,6 kb proveniente de pOL5-4O desta contendo o promotor, o guia e o terminador de alfa-amilase, o gene de resistência à neomicina e uma origem de replicação de Bacillus.

(ii) um fragmento SalI-HincII de 0,6 kb proveniente dum clone M13mpl8 de 80 kDa contendo a fracção - 53 -

N terminal da subunidade de 80 kDa precedida por um codão ATG e por um sítio de restrição Sall, conforme descrito no Exemplo 13.

(iii) um fragmento HincII-EcoRV de 2,3 kb proveniente de pGB852 contendo a maior parte da sequência de codificação de 8P kDa e o terminador de lactase.

Após ligação destes três fragmentos, as moléculas de ADN recombinado são introduzidas e Bacillus por meio de transformação de protoplastos.

Isolou-se ADN plasmídico a partir dos transformantes resistentes à neomicina, conforme descrito por A_ndreoli (1985), efectuando em seguida um mapeamento de restrição por endonucleases. 0 plasmídeo seleccionado foi designado por pOL8O-T-4Odelta e a respectiva estrutura é apresentada na Figura 9.

A fim de examinar a expressão da proteína de 80 kDa do factor VIII, cultivaram-se os transformantes de Bacillus subtilis 1A40 obtidos em meio de caldo de triptona e soja com arejamento e na presença de neomicina (10 microgramas/ml).

Manteve-se a cultura durante a noite a 37°C e em seguida prepararam-se e analisaram-se amostras de proteínas como descrito na secção de Métodos Gerais. A Figura 10c apresenta a detecção da proteína de 80 kDa em lisados celulares de transformantes de B.subtilis obtidos com p0L80 delta em contraste com as estirpes te.temunho de pOLdelta. Este resultado demonstra que se produziu a proteína de 80 kDa do factor VIII em Bacillus subtilis.

A A fim de eliminar as sequências de ADN homólogo entre o cromossoma de Bacillus lidheniformis da estirpe T9 e o plasmídeo pOL92-T-21 seguimos a mesma técnicc.

descrita no Exemplo 2 para a construção do vector de expressão pOL5 delta. 0 plasmídeo obtido deste modo, pOL92-T-21 delta, possui a estrutura que se apresenta na Figura 5c.

Do mesmo modo introduziu-se de modo análogo ao descrito no Exemplo 3, no vector pOL5 delta de secreção de alfa-amilase o fragmento 5_alI-HpaI de 7,4 kb proveniente do plasmídeo pCLB89 contendo o cADN integral do factor VIII e o fragmento SalI-EcoRV de 5,8 kb do plasmídeo pGB861 contendo uma fusão entre as proteínas de 92 kDa e 80 kDa (ver Exemplo 14). Os plasmídeos obtidos deste modo foram designados, respectivamente, por pOLF8-2delta e pOL92/ /8O-21delta.

A fim de examinar a expressão de polipeptídeos de factor VIII, cultivaram-se os transíormantes de Baoillus T9 que contem os plasmídeos pOL5-21delta, pOL8O-T-40delta e pOL92-T-21delta em meio mínimo de concentração dupla (Anagnostopoulos e Spizizen, 1961) suplementado com 0,5% de extracto de levedura. Após dois dias de cultura a 40°C, prepararam-se amostras de proteína para análise em gel de DSS-poliacrilamida, depositaram-se num filtro de nitrocelulose e incubaram-se com anticorpos apropriados como descrito na reacção de Métodos Gerais. A partir dos resultados apresentados nas Figuras 10A e 10B é possível concluir que o Bacillus 1icheniformis T9 transformado pode sintetizar e segregar os polipeptídeos de 92 kDa e 80 kDa específicos de factor VIII.

Exemplo 9

EXPRESSÃO DUMA PROTEÍNA DE FUSÃO ENTRE AS SUBUNIDADES DE 92 kDa E 80 kDa DO FACTOR VIII USANDO UM PLASMÍDEO DE BACILLUS

D_epois da fermentação dos transformantes de Bacillus contendo as plasmídeos pOLF8-2delta e pOL92/8O-21 delta (ver Exemplo 8) apenas foi possível detectar traços dos polipeptideos específicos de factor VIII.

- 55 &

ADN do factor VIII que codifica para uma proteína de fusão 92/80 kDa foi inserida atrás do potente promotor de Bacillus licheniformis 3-4 (ver EP-A-O224294) do modo seguinte:

fragmento Sall-Nsil de 5,6 kb que codifica para a proteína de fusão 92/80 kDa de pGB861, o fragmento Xbal-XmalII de 3, 9 kb que codifica para o promotor 3-4, o gene de resiàtência à neomicina e um oligonucleótido com a sequência 5’dGGCCTGCA foram ligados e utilizados para a transformação de protoplastos de Bacillus. E_sta transformação deu origem ao plasmídeo pPROM92/8OPB (ver Figura 11).

Cultivaram-se estirpes de Bacillus contendo o plasmídeo pPROM92/8OPB durante pelo menos 2 dias a 4o°C, como descrito no Exemplo 8 e prepararam-se amostras de proteínas que foram analisadas para a expressão de polipeptideos de factor VIII como descrito na secção de Métodos Gerais.

A Figura 10D mostra a detecção da proteína de fusão 92/80 kDa no lisado celular de transformantes de Bacillus com pPROM92/8OPB em comparação com estirpes de Bacillus testemunhos.

Exemplo 10

CONSTRUÇÃO DO PLASMÍDEO pGBdLAC CONTENDO AS SEQUÊNCIAS DO PROMOTOR E DO TERMINADOR DE LACTASE.

Isolou-se ADN cromossomal da estirpe Kluyveromvces lactis CBS 2360 (Das e Hollenberg, 1982), cindiu-se com Xhol e separaram-se os fragmentos de acordo com a dimensão em gradiente de sucrose. D_etectaram-se as fracções contendo o gene de lactase com uma sonda LAC4 (Breunig et al., 1984) depois de se ter depositado o ADN num filtro de nitrocelulose. Cionou-se o ADN contendo o gene de lactase no sítio Xhol do plasmídeo pPA153-215 (Andreoli, 1985), dando origem ao plasmídeo pPA31. Subclonou-se um fragmento do plasmídeo

pPA31 obtido por tratamento com Xbal e contendo o gene de lactase no sítio Xbal do plasmídeo pUC19 (Yaniscb-Perron et al., 1985), obtendo-se deste modo o plasmídeo pUCla56. 0 fragmento EcoRI-Xbal contendo a extremidade 3’ do gene de lactase (Breunig et al., 1984) foi clonado separadamente em pUC19. No fragmento EcoRI-Xbal esta presente um sítio Ciai que é normalmente metilado numa estirpe dam(+) e que está situado cerca de 100 nucleótidos a jusante do sítio EcoRI. A fim de tornar possível o corte neste sítio Ciai transfectou-se o plasmídeo para uma estirpe de Ξ.coli dam(-), p.ex. a estirpe GM113 (Arraj e Marinus, 1983; Marinus e Morris, 1973). Separou-se o ADN plasmídeo e isolou-se o fragmento Clal-Xbal contendo a extremidade 3' do gene. Alem disso, isolou-se o fragmento Xbail-Cial contendo a extremidade 5f do gene de lactase a partir do plasmídeo pUCla56. Ligaram-se simultaneamente os dois fragmentos no sítio Xbal do plasmídeo pUC19, dando origem ao plasmídeo pGBdLAC (Figura 12).

Exemplo 11

CONSTRUÇÃO DUM VECTOR DE EXPRESSÃO DE K.LACTIS CONTENDO A SUBUNIDADE DE 92 kDa DO FACTOR VIII.

Numa primeira fase da síntese dum plasmídeo de expressão da subunidade de 92 kDa, ligou-se o fragmento HindIII-PstI de 1,4 kb, contendo a extremidade 3', do gene de lactase (Breunig et al., 1984) no fragmento BamHI-HindlII de 0,4 kb (nutleótidos 1875 a 2283 de acordo com o Quadro I) do cADN de factor VIII e ligou-se no plasmídeo pSP65 (Meit on et al., 1984) cortado com BamHI e PstI, dando origem ao plasmídeo pGB840. Em seguida introduziu-se no sítio HindIII um codão de paragem em fase com o quadro de leitura do factor VTII. Para este fim, sintetizou-se um oligonucleótido com a sequência 5¹ AGCTGAGGGCCCTC, o qual contém, além do codão de paragem TGA, um sítio de reconhecimento de Apal (GGGCCC). Ligou-se este oligonucleótido no sítio HindIII do plasmídeo pGB840, obtendo-se o plasmídeo pGB841. A partir deste último plasmídeo isolou-se o fragmento BamHI-HGRV de 1,2 kb e

ligou-se no fragmento BamHI-EcoRV de 1,2 kb do plasmídeo pCLB86. Deste modo foi obtido o plasmídeo pGB842 contendo o ADN que acÉLifica para a subunidade de 92 kDa completa e ; conten.'o um codão de paragem no sítio HindIII em pAT153. A fim de criar um plasmídeo de expressão para K.lactis contendo a subunidade proteica de 92 kDa combinaram-se os seguintes 3 fragmentos:

(i) o fragmento SalI-EcoRV de 3 kb do plasmídeo pGB842 contendo o ADN da subunidade de 92 kDa e o terminador de lactase, (ii) um fragmento SnaBl-S_alI de 0,25 kb contendo a fracção do promotor de lactase desde a posição - 282 (Breunig et al., 1984) atê à posição - 26 na qual foi introduzido um ligante Sall pelo método descrito anteriormente (EP-A-0096430) (iii) um fragmento SnaBI-EcoRV de 8,3 kb dum derivado do plasmídeo pGBdLAC contendo um gene de resistência a G418 (ver EP-A-0096430). 0 plasmídeo resultante foi designado pGB85O (Figura 13).

E.coli transformado com pGB850 foi depositado no CBS em 14 de J_ulho de 1986, tendo-lhe sido atribuido o número de depósito CBS-305.86.

EXEMPLO 12

CONSTRUÇÃO DUM VECTOR DE EXPRESSÃO PARA K.LACTIS CONTENDO UMA fusão entre a subunidade de 92 kDa E A PROQUIMOSINA.

cADN da proquimosina foi inserido no mesmo quadro de leitura atrás do sífiio BamHI na posição 1875 do cADN do factor VIII (Quadro I) do modo seguinte: Isolou-se o fragmento EcoRV-BamHI de 11,0 kb do plasmídeo pGB85O e preencheu-se o sítio BaníHI usando ADN-polimerasel de Klênow e os

trifosfatos dos quatro deoxinucleótidos. Em seguida isolou-se o fragmento SalI-HindIII de 2,3 kb contendo o gene da proquimosina do plasmídeo pGB131 (EP-A-OO9643O) e preencheram-se os sítios Sall e ΗχηάΙΙΙ do mesmo modo como descrito acima. Ligaram-se os dois fragmentos, obtendo-se o plasmídeo pGB851 que contém o ADN de codificação da proquimosina a jusante do ADN que codifica para a subunidade de 92 kDa (Figura 14).

Exemplo 13

CONSTRUÇÃO DE VECTORES DE EXPRESSÃO PARA K.LACTIS PARA A SUBUNIDADE PROTEICA DE 80 kDa.

C_onstruiu-se um vector para a expressão duma proteína de fusão lactase-80 kDa, Usaram-se dois fragmentos para o plasmídeo de expressão da subunidade de 80 kDa.

(i) Um derivado do plasmídeo pGBdLAC contendo o gene de resistência a G418 (acima) foi linearizado com Ciai.

(ii) 0 plasmídeo pCLB88 de factor VIII foi cortado com BamHI e Hpal e o fragmento desde a posição 4749 até à posição 7439 na sequência do cADN de factor VIII (Quadro I) foi isolado.

Ajustaram-se as extremidades de ambos os fragmentos usando ADN-polimerasel de Klenow e os quatro deoxiribonucleófâidos, ligou-se e transformou-se E.coli HB1C1. Identificaram-se por digestão com enzimas de restrição e por análise da sequência de ADN de acordo com Maxam e Gilber; (1980) os plasmídeos contendo a fracção correcta e de acordo com o quadro atrás das sequências de codificação da lactase. 0 plasmídeo resultante, pGB852, é apresentado na Figura 15.

E,coli transformado com pGB852 foi depositado no CBS em 14 de J_ulho de 1986, tendo-lhe sido atribuido

- 59 o numero de depósito CBS-306.86

Noutro vector de expressão um codão ATG precedido por um sítio de restrição S_all foi introduzido em frente do sítio de corte da protease na subunidade proteica de 80 kDaí introduziu-se um fragmento BamHI-HjndlI desde a posição 4749 até â posição 5584 da sequência do cADN do factor VIII em M13mpl8 (Messing e Vieira, 1982) cortado com BamHI e Hindll. Isolou-se ADN fágico de cadeia simples e hibridou-se com um nucleótido preparado por síntese química com a sequência 3', TTTGCGGTAGTTGCCAGCTGTACCTTTATTGAGCATGA 5*. Converteu-se o ADN fágico parcialmente em ADN de cadeia dupla por hibridação simultânea eom o ADN do plasmídeo M13mpl8 cortado com BamHI e Hindll.

Após hibridação preencheram-se os intervalos por incubação com ADN-polimerasel de Klenow (Boehringer) num tampão contendo os quatro deoxiribunocleótidos. Transformou-se E.coli JM101 com o ADN do plasmídeo resultante e separaram-se as colónias correctas por hibridação com o oligonucle ótido que tinha sido marcado na extremidade com gama-(32)P-ATP e polinucleótido-quimase T4. Isolou-se o ADN plasmídeo e isolou-se o fragmento resultante de mutagénese S_alI-HindII de 0, 6 kb. Ligou-se este fragmento com o fragmento HindiI-EqoRV de 2,3 kb contendo a maior parte da sequência de codificação da subunidade de 80 kDa do plasmídeo pGB852 e o fragmento SalI-EcoRV de 9, 2 kb contendo a sequência pUC do plasmídeo pGB85O. Isolou-se o plasmídeo resultante pGB853 de expressão da subunidade de 80 kDa (Figura 16).

Exemplo 14

CONSTRUÇÃO DE VECTORES PARA K. LACTIS DE EXPRESSÃO DUMA FUSÃO ENTRE AS PROTEÍNAS DE 92 kDa E 80 kDa.

Ligou-se o sítio PstI na posição 2660 da sequência do factor VIII no vector de fusão com o sítio BamHI na posição 4749 do modo seguinte:

Ligarm-se entre si o fragmento S_all-Pstl de 2,6 kb que codifica para a proteína de 92 kDa proveniente do plasmídeo pCLB88_z o fragmento BamHI-Hindll de

3,6 kb do plasmídio pGB852, o plasmídeo pUC19 digerido com Sall e HindiII e um oligonucleótido com a sequência AGGTCTAG, obtendo-se deste modo o plasmídeo pGB860. Preparou-se um derivado do plasmídeo pGB850 no qual o sítio Sall no ligante polimérico foi removido por digestão parcial com Sall seguida de incubação durante 1 minuto com Bal31 de acordo com a recomendação do fabricante (brl), obtendo-se o plasmídeo pGB85O dHSX. Em seguida introduziu-se o ADN do factor VIII que codifica para a proteína de fusão atrás do promotor de lactamas por meio de ligação do fragmento SalI-EcoRV de 5,8 kb do plasmídeo pGB86O ao fragmento SalI-EcoRV de 92 kb do plasmídeo pGB85O dHSX, resultante deste modo o vector de expressão pGB861 (Figura 17).

Obteve-se um vector para a secreção das subunidades do factor VIII por substituição do guia da secreção do factor VIII no plasmídeo pGB861 por uma sequência guia sintética do modo seguinte: reclonou-se em pTZ18R (Uhited States Biochemical Corporation) o fragmento SalI-BamHI de 1,9 kb que codifica para parte de proteína de 92 kDa originário do plasmídeo pGB861. Introduziu-se um sítio Mlul no ADN nas posições 2 e 3 da sequência proteica do factor VIII por meio da utilização dum oligonucleótido da sequência 5‘ AGCCAGGTAGTATCTacgcgtGGCACTAAAGCAGAA 3'.

Hibridou-se o oligonucleótido com o ADN fágico de cadeia simples do plasmídeo contendo o fragmento SalI-BamHI em pTZ18R. Depois da hibridação, preencheram-se os espaços vazios e isolaram-se os plasmídeos contendo o oligonucleótido conforme descrito no Exemplo 10. Usou-se o fragmento S_alI-BglII resultante de mutagénese de um dos plas- 61 -

— mídeos correctos para substituir o fragmento correspondente do plasmídeo pGB861, obtendo-se deste modo o plasmídeo pGB862. Cortou-se o plasmídeo pGB863 com Sall e Mlul. Preparou-se um fragmento de ADN que codifica para a sequência guia sintética:

!5»TCGACATGGCTTTCAGATCCTTGTTGGCTTTGTCCGGTTT...

3’ GTACCGAAAGTCTAGGAACAACCGAAACAGGCCAAA...

...GTCCTGTGGTGCTTTGGCTGCTA3‘

... CAGGACACCACGAAACCGACGATCGCG5’

Ligou-se este fragmento no plasmídeo pGB863 cortado com Sall e BamHI, obtendo-se deste modo o plasmídeo pGB864.

Exemplo 15

TRANSFORMAÇÃO DE KLUYVEROMYCES LACTIS E ANÁLISE DO ARN E DAS PROTEÍNAS PRODUZIDAS NOS TRANSFORMANTES.

Linearizaram-se todos os plasmídeos de expressão no sítio de restrição singular SacII e transformou-se ^K*lactis de acordo com o método de Ito et al. (1984) usando acetato de lítio O,2 M e 25 microgramas/ml de G418. Analizaram-se os transformantes por isolamento do ADN cromossomal seguido de digestão com várias enzimas de restrição. Cultivaram-se linhas de células contendo cópias intactas do ADN plasmídeo integrado no cromossoma durante 3 dias em meio YEPD a 3O°C para análise de ARN e das proteínas.

Para análise de ARN recolheram-se as células por centrifugação durante 10 minutos a 5000 rpm. S_uspendeu-se o sólido até uma ϋΟ^θ _nmde 300 mun tampão contendo Tris-HCl 1000 mM a pH 7,5; LiCl 100 mM; EDTA mM e 0,5 mg/ml de heparina. Aflicionaram-se 2 gramas de esferas de vidro (diâmetro 0,25-0,30 mm) e agitou-se a suspensão num vortex 5 vezes durante 30 segundos cada. Removeram-se as esferas de vidro e os • resíduos celulares por centrifugação a 10 000 rpm durante 5

- min. 0 sólido foi re-extraído com 0,5 ml do tampão acima definido e centrifugado. Recolheu-se o sobrenadante, extraíu-se com fenol e precipitou-se com etanol. Incubou-se o ARN com glioxal, (McMaster e Carmichal, 1977), fez-se correr em gel de agarose e depositou-se em Gene Screen Plus (NEN Research Products) como descrito por NEN. Apresenta-se o resultado na Figura 16. Verifica-se que se obteve ARN da dimensão esperada tanto em K.lactis transformado com pGB850 como por pGB852.

Para a análise de proteínas, recolheram-se as células por meio duma centrifugação a baixa velocidade e suspenderam-se em NaCl a O,97ó? fluoreto de fenilmetilsulfonilo (FFMS) 1 mM (e Tween 80 a 0,05 % ou Nonidet P40 a 2 % quando indicado) até uma densidade óptica final de 500 a 610 nm, Num tubo de ensaio de 10 ml de fundo cónico adicionaram-se 1, 2 g de esferas de vidro (diâmetro 0,25 a 0,30 mm) a 0,6 ml da suspensão das células da levedura e agitou-se a suspensão num vortex durante 1 minuto. Removeram-se os resíduos celulares e as esferas de vidro por centrifugação a baixa velocidade. Ppepararam-se amostras e fizeram-se correr num gel de DSS-poliacrilamida, depositaram-se sobre um filtro de nitro-celulose e incubaram-se com anticorpos, como descrito na secção Métodos Gerais.

Na Figura 19A apresenta-se a detecção da proteína de fusão lactase-80 kDa produzida por células de K. lactis transformadas com pGB852, conforme se verifica por meio do antissoro policlonal RH 63275 e de peroxidase de burro anti-coelho (Promega Biotec). Na pista 2 pode ver-se uma banda correspondente a um produto proteico da dimensão esperada (cerca de 100 kDa) e, embora muito mais fracamente, também na pista 4. Na estirpe de K.lactis progenitora (pistas 1 e 3) esta banda não pode ser detectada,

Obtiveram-se os mesmos resultados numa . experiência paralela na qual se mesmas amostras foram depositadas e incubadas com o antissoro policlonal RH 63272 e fosfa- 63 -

tase alcalina de cabra anti-coelho da firma Promega Biotec (Figura 19B).

N_uma terceira experiência foi possível verificar a presença do produto de fusão usando o antissoro monoclonal CLB-CAg 65 e fosfatase alcalina de cabra anti-rato (Figura 19C). Nas pistas 6 a 9 analisaram-se quatro clones de K_»lactis independentes transformados com o plasmídeo pGB852, produzindo todos os produtos de fusão âe lactase-80 kDa. Estes clones possuem de modo evidente um produto proteico da dimensão esperada (aproximadamente 100 kDa) que não se detecta na estirpe de levedura progenitora (pista 9) nem em K.lactis transformado com o plasmídeo pGB850 que contém a sequência de ADN que codifica para a subunidade de 92 kDa do factor VIII (faixas 1 a 4).

Para a detecção do produto de fusão 92 kDa-proquimosina usaram-se anticorpos policlonais contra quimosina comerciais (Laboratório Chr. Hansen) (Figura 19D). As pistas 2 a 4 mostram o padrão de três transformantes de K.lactis com pGB851 obtidos independentemente. P_oâe ver-se um produto proteico aproximadamente da dimensão esperada (110 kDa). Após tratamento dos extractos celulares a pH 2 (Métodos Gerais, 4) ainda a maior parte do material capaz de reacção imune esta localizada na mesma posição (faixas 10 a 12) mas também se visualizam duas bandas mais pequenas na posição aproximada da quimosina. Deste modo, o produto de fusão só está parcialmente processado pelo tratamento a pH 2. Na análise de coagulação do leite detectou-se actividade de quimosina (0,1 mg/1) ao contrário do que se verificou com a estirpe de levedura progenitora e com as outras amostras de comparação, demonstrando-se a presença de quimosina activa,

Níima outra série de experiências verificou-se que K.lactis também expressa as subunidades proteicas de 80 kDa e 92 kDa separadamente. N_a Figura 19E apresenta-se um lisado celular de K.lactis transformado com pGB853, feito correr em gel de DSS-policrilamida e depositado sobre um filtro - 64 -

de nttrocelulose. 0 produto depositado foi incubado com RH 63272 e fosfatase alcalina de cabra anti-coelho. Na figura 19F apresenta-se uma experiência semelhante na qual se transformou K.lactis com pGB85O e CLB-CAg 9 monoclonal e se usou depois de depositado. Além disso as duas subunidades proteicas podem ser expressas simultaneamente numa célula (Figura 19G). Para esta experiência, cortaram-se pGB85O e pGB853 com SacII e, após fenolização, misturaram-se em proporções equimolares e ligaram-se. Transformou-se K.lactis com uma mistura na qual mais de 50% do ADN se encontrava em dímeros. Depois de cultivar, lisaram-se as células e seleccionaram-se as estirpes ç[ue expressavam as duas subunidades simultaneamente por técnica de mancha imunológica e incubação com RH 63272 e CLB-CAg-9.

Na Figura 19H mostra-se que K.lactis tem também capacidade de expressar produtos de fusão da proteína de 92 kDa com a de 80 kDa. Transformaram-se células com pGB861, lisaram-se, fizeram-se correr as proteínas num gel de DSS-poliacrilamida e analisaram-se com RH 63272. Na maior parte dos transformantes detectou-se uma proteína de fusão da dimensão esperada.

Na Figura 191 demonstra-se uma proteína de fusão da proteína de 92 kDa com a de 80 kDa. Transformou-se K,lactis com pGB864 e determinou-se separadamente as proteínas intracelulares.

á possível concluir que K.lactis pode sintetizar ambas as proteínas, a de 80 kDa e a de 92 kDa, separadamente bem como fundidas entre si sob a forma de produtos intactos tanto intracelular como extracelularmente.

De acordo com o objecto da presente invenção é possível preparar várias proteínas relacionadas com o factor VIII por meio de microorganismos transformados, incluindo as subunidades proteicas de 80 kDa e de 92 kDa, uma proteína de fusão das subunidades proteicas de 80 kDa e de

kDa unidas entre si por uma ponte truncada e proteínas de fusão da subunidade com uma proteína endógena, constituida a proteína endógena a extremidade N-terminal. Os produtos referidos acima podem ser citoplasmáticos ou segregados para o meio. É possível produzir produtos individuais na mesma célula ou em diferentes células e no mesmo hospedeiro celular ou em hospedeiros diferentes.

É evidente, a partir dos resultados apresentados anteriormente, que o processo da presente invenção permite proteínas activas tanto biologicamente como fisiologicamente dotadas de actividade de factor VIII e capazes de competir com o factor VIII em relação a anticorpos que inibem aquela actividade. Deste modo é possível dispor de processos que utilizam hospedeiros microbianos com as suas economias e eficiências inerfentes para a produção duma proteína complexa, de modo a obter produtos que podem ser usados em vez do produto natural de modo a permitir um fornecimento estável, uniforme e seguro de produtos relacionados com o factor VIII.

Todas as publicações e pedidos de patente mencionados nesta memória descritiva permitem identificar o nível de conhecimentos dos especialistas da matéria a que a presente invenção diz respeito. Todas as publicações e pedidos de patente são aqui mencionados por referência tal como se cada publicação ou pedido de patente fosse especificamente e individualmente indicado ser mencionado por referência.

£_mbora a presente invenção tenha sido descrita com um certo grau de pormenorização por meio de modos de concretização e de exemplos para fins de clareza e de compreensão, é óbvio que é possível praticar certas mudanças e modificações dentro do âmbito das reivindicações.

Quadro I

Inserção de cADN do faotor VIII do plasmídeo pCLB89.

A sequência de ácidos aminados de Ala-1 até Tyr-2332 do faotor VIII e a respeotiva sequência de sinal de Met(-19) até Ser(-l) com a correspondente sequência de nucleótidos. 0 ácido aminado Phe-975 é codificado pelo codão TTC.

)

20 30 40 50

GTCGACATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGCCTTTTGCGATTC^GÚtTT ELSTCFFLCLLR C F

-19 Μ Q 'Ί — C.

Θ0

100

130 140 150 160 170180

GATCTCGGTGAGCTGCCTGTGGACGCAAGATTTCCTCCTAGAGTGCCAAAATCTTTTCCA D L G E L P V D A R F P P R V P KS F P

190 200 210 220 230240

TTCAACACCTCAGTCGTGTACAAAAAGACTCTGTTTGTABAATTCÁCGGATCACCTTTTC

F NTSVVYKKTLFVEFTDH I... F

250 260 270 280 290 ·300

AACATCGCTAAGCCAAGGCCACCCTGGATGGGTCTGCTAGGTCCTACCATCCAGGCTGAG

N I A K P R P P W M G L L. G P Τ I 0 A E αα

370 380 390 400 410420

GCTGTTGGTGTATCCTACTGGAAAGCTTCTGAGGGAGCTGAATATGATGATCAGACCAGT AVGVSYWKASEGAEYDDQTS

430 440 450 460 470480

CAAAGGGAGAAAGAAGATGATAAAGTCTTCCCTGGTGGAAGCCATACATATGTCTGGC.AG QREKEDDKVFPGGSHTYVWG!

.ί

490 500 510 520 530540 gtcctgaaagagaatggtccaatggcctctgacccactgtgccttacctactcatatctt VLKENGPMASDPLCL.

550

560

570

5Θ0

590

610

620

630

640

650

660

AGAGAAGGGAGTCTGGCCAAGGAAAAGACACAGACCTTGCACAAATTTATACTACTTTTT REG8LAKEKTGTLHKF I

710

700

720

GCTGTATTTGATGAAGGGAAAAGTTGGCACTCAGAAACAAAGAACTCCTTGATGCAGGAT AVFDEGKSWHSETKNSLM

670

680

690

C1

780

AGGGATGCTGCATCTGCTCGGGCCTGGCCTAAAATGCACACAGTCAATGGTTATGTAAAC R D. A A S A R A W P K Μ Η Τ V . N G Υ V N

730

740

750

760

770

790 800 810 820 830 840

AGGTCTCTGCCAGGTCTGATTGGATGCCACAGGAAATCAGTCTATTGGCATGTGATTGGA RS LPGUIGCHR K S V Y W Η V

850

860

870

880

890

900

ATGGGCACCACTCCTGAAGTGCACTCAATATTCCTCGAAGGTCACACATTTCTTGTGAGG MGTTPEVH S I F L E G Η T F L V R

299

1020

910 920 930 940 950 lACCATCGCCAGGCBTCCTTBBAAATCTCBCCAATAACTTTCCTTACTBCTCAA NHRQASLE I SP I T F L - T A _T

970 980 990 1000 1010

TGATGGACCTTGGACAGTTTCTACTGTTTTGTCATATCTCTTCCCACCAACATGATGGC

LMDLGQFL. LFCHISSHG1H

1080 |TGGAAGCTTATGTCAAAGTAGACAGCTGTCCAGAGGAACCCCAACTACGAATGAAAAAT MEAYVKVDSCPEEPGiLRMKN

1030

1040

1050

1060

1070

339

1130

1090 1100 1110 1120 1130 1140

YTGAAGAAGCGGAAGACTATGATGATGATCTTACTGATTCTGAAATGGATGTGGTCAGG Sl E E A E D Y D D D L. T D S E M D V V R

1200

1150 1160 1170 1180 1190 rTGATGATGACAACTCTCCTTCCTTTATCCAAATTCGCTCAGTTGCCAAGAAGCATCC^T ίDDDNSPSFI

I R S V A K F·· H

37?

1210

1240

1250

1260

1230 iIAaacttgggtacattacattgctgctgaagaggagbactgggactatgctcccttagtc K T W V H Y I A a e e e: d w d y a p l. V

1280 1290 1300 1310 1320 tCGCCCCCBATBACABAABTTATAAAABTCAATATTTBAACAATGGCCCTCABCGGATT .. A P D D R S Y

1270

1300

1310 ο Y L N N G P

13.30

1340

1350

1360

1370

1380

JTAGGAAGTACAAAAAAGTCCGATTTATGGCATACACAGATGAAACCTTTAAGACTCGT 3 R K Y K KVRFMAYTDETF K T

1400 1410 1420 1430 1440 fcAGCTATTCAGCATGAATCAGGAATCTTGGGACCTTTACTTTATGGGGAAGTTGGAGAC

G

1390

1430

A I G! Η E S

459

1450

1460

1470

1480

1490

1500

F K N G! A pACTGTTBATTATATTTAAGAATCAAGCAABCAGACCATATAACATCTACCCTCACGGA

I

1510

1520

1530

1540

1550

1560 'CACTGATGTCCGTCCTTTGTATTCAAGGAGATTACCAAAAGGTGTAAAACATTTGAAG

T-DVRPLYSR R L P K G V K H L K

1590

1570 1580 1590 1600 1610 1620 !)TTTTCCAATTCTGCCAGGAGAAATATTCAAATATAAATGGACAGTGACTGTAGAAGAT :> f p i

I F K Y K W T V T

1630

1640

1650

1660

1670

1680

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P T K S D

P R C L T R Y Y S S F V

539

1690

1700

1710

1720

1730

1740

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R D L A S G L.

F^:' L L I

1750

1760

1770

1780

1790

1800

G^TCAAAGAGGAAACCAGATAATGTCAGACAABAGGAATGTCATCCTGTTTTCTGTATTT :)QRGNG!IMSDKRNVILFSVF

- 69 1810 1820 1830 1840 1850

GATGAGAACCGAAGCTGGTACCTCACAGAGAATATACAACGCTTTCTCCCi DENRSWYLTENIORFLP

1870 1880 1890 1900 1910 / 1860

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GGAGTGCAGCTTGAGGATCCAGAGTTCCAAGCCTCCAACATCATGCACAGCATCAATGGC

1920

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1930	1940	1950	1960	1970	1980

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Y	V	F D	S	L β	L	S V c	L H	E V	A Y	W	Y I
		1990		2000		2010	' 2020		2030		2040
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L	S	I 8	A	β T	D	F L S	V F	- s	G Y	T	F K
		2050		2060		2070	2080		2090		2100

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H	K Μ V	Y	E D T	L T L	F P F	S	G E	T	V F
	2110		2120	21,30	2140		2150		2160
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M	S Μ E	N	P G L	W I L	G C H	N	S D	F	R N
	2170		2180	2190	2200		2210		2220
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R	GMT	A	L L K	V S S	C D K 12	N	T G	D	Y Y
	2230		2240	2250	2260		2270		2280
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E	D S Y	E	D I S	A Y L	L S K	N	N A	I	E P	739
	2290		2300	2310	2320		2330		2340
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R	S F S	β	M S R	Η P S	T R 0	K	0 F	N	A T
	2350		2360	2370	2380		2390		2400
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T	I P E	N	D I E	K T D	P W F	A	H R	T	P M.	77 y
	2410		2420	2430	2440		2450		2460
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P	K I 0	N	V S S	3 D L	L M L	L	R 0	S	P T
	2470		2480	2490	2500		2510		2520
CCACATGGGCTATCCTTATCTGATCTCCAAGAAGCCAAATATGAGACTTTTTCTGATGAT
P	H G L	S	L S D	L 0 E	A K Y	E	T F	s	D D	81 J
	2530		2540	2550	2560		2570		2580
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P	S P G	A	I D S	N N S	L. S E	M	T H	F	R P
	2590		2600	2610	2620		2630		2640
CAGCTCCATCACABT6GGGACATBGTATTTACCCCTGABTCA6BCCTCCAATTAABATTA
β	L Η H	S	G D M	V F T	P E S	G	L 0	L	R L	859
	2650		2660	2670	2680		2690		2700
AATGAGAAACTGGGGACAACTGCAGCAACAGAGTTGAAGAAACTTGATTTCAAAGTTTCT
N	E K L	G	T T A	ATE	L K K	L	D F	K	V S

2770 2780 2790 2Θ00 28102S20

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N T S S L, G P P S Μ P V Η Y D S Q L D T

2830 '2840 2850 2860 28702880

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2890 2900 2910 2920 29302940

GAAGAAAATAATGATTCAAAGTTGTTAGAATCAGGTTTAATGAATAGCCAAGAAAGTTCA EENNDSKLLESGLMNSQES S

2950 2960 2970 2980 29903000

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3070 30Θ0 3090 3100 31103120

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3130 3140 3150 3160 31703180

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3190

3220

AAAAAAGTGACACCTTTGATTCATGACAGAATGCTTATGGACAAAAAT6CTACAGCTTTG KKVTPLIHDRMLMDK NATAL

3250 3260 3270 3280 32903300

AGGCTAAATCATATGTCAAATAAAACTACTTCATCAAAAAACATGGAAATGGTCCAACAG RLNHMSNKTTSSKNMEMVGIG!

3310 3320 3330 3340 33503360

AAAAAA6AGGGCCCCATTCCACCAGATGCACAAAATCCAGATATGTCGTTCTTTAAGATG K K E G P I PPDAQMPDMSFFKM

1099

3370 3380 3390 3400 34103420

CTATTCTTGCCAGAATCAGCAAGGTGGATACAAAGGACTCATGGAAAGAACTCTCTGAAC LFLPE SARWIQRTHG K N S L N

3430 3440 3450 3460 34703480

TCTGGGCAAGGCCCCAGTCCAAAGCAATTAGTATCCTTAGGACCAGAAAAATCTGTGGAA

SBQGP SPKQLVSLGPEKSVE

3490 3500 3510 3520 35303540

GGTCAGAATTTCTTGTCTGAGAAAAACAAAGTGGTAGTAGGAAAGGGTGAATTTACAAAG GQNFLSEKNKVVVBKGEFT K

3550 3560 3570 3580 35903600

GACGTAGGACTCAAAGAGATGGTTTTTCCAAGCAGCAGAAACCTATTTCTTACTAACTTG DVGLKEMVFPSSRNLFLTNL

1129

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3670 3680 3690 3700 3710 3720 ^AGAAGGAAACATTAATCCAAGAGAATGTAGTTTTGCCTCAGATACATACAGTGACTGGC

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3730 3740 3750 3760 3770 3780 · ACTAAGAATTTCATGAAGAACCTTTTCTTACTGAGCACTAGGCAAAATGTAGAAGGTTCA TKNFMKNLFLLSTRGNVEGS

3790 3B00 3Θ10 3820 38303840

TATGACGGGGCATATGCTCCAGTACTTCAAGATTTTAGGTCATTAAATGATTCAACAAAT

YDGAYAPVL D. DFRSLNDSTN 125í

3850 3Θ60 3870 3880 38903900

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R T K K Η T A H F S K K GEEENLEG

3910 3920 3930 3940 39503960 rTGGGAAATCAAACCAAGCAAATTGTAGAGAAATATGCATGCACCACAAGBATATCTCCT

L G N Q T K 0 I VEKYACTTR I SP 1293

3970 39Θ0 3990 4000 40104020

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4030 4040 4050 4060 40704080

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4090 4100 4110 4120 41304140

GGTCCAAAAACATGAAACATTTGACCCCGAGCACCCTCACACAGATAGACTACAATGAG WSKNMKHLTPSTLTQ I D Y N E

4150 4160 4170 4180 41904200

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K E K G A I T G! S P L S D C L T R S H S 137°

4210 4220 4230 4240 .42504260

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4270 4280 4290 4300 43104320

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4330 4340 4350 4360 43704380 •CTTATAGAAAGAAAGATTCTGGGGTCCAAGAAAGCAGTCATTTCTTACAAGGAGCCAAA SYRKKDSGVGESSHFLGGAK

4390 4400 4410 4420 44304440 íAAAATAACCTTTCTTTAGCCATTCTAACCTTGGAGATGACTGGTGATCAAAGAGAGGTT

KNNLSLAILTLEMTGDQRE V 1459

4450 4460 4470 4480 44904500

5GCTCCCTGGGGACAAGTGCCACAAATTCAGTCACATACAAGAAAGTTGAGAACACTGTT •GSLGTSATNSVTYKKVENTV

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L P K P D L P K T S G K V E L L P K V H ₁₄ç₉

4570 4580 4590 4600 46104620

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4630 4640 4650 4660 46704690'

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4690 4700 4710 4720 47304740

AGACCTGGAAAAGTTCCCTTTCTGAGAGTAGCAACAGAAAGCTCTGCAAAGACTCCCTCC RPGKVPFLRVATESSA K T P S

4750 4760 4770 4790 47904900

AAGCTATTGBATCCTCTTGCTTGGGATAACCACTATGGTACTCAGATACCAAAAGAAGAG

KLLDPLAWDNHYGTGIPKEE ⁱ⁵'^G

4810 4820 4830 4840 48504860

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W K SOE K S P E K T A F K K K D T I I4870 4880 4890 4900 49104920

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S L N A C E S N Η A I A A I N E G Q N K

4930 4940 4950 4960 49704990

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3738

4990 5000 5010 5020 50305040

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5050 5060 5070 5090 50905100

GAGGAAATTGACTATGATGATACCATATCAGTTGAAATGAAGAAGGAAGATTTTGACATT EEIDYDDTISVEMK K E D F D -I.

5110 5120 5130 5140 51505160

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Y D E D E N G! S P θξ F Q K K T R Η Y F 169?

5170 5180 5190 5200 52105220

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I AAVERLWDYGMSSS PHVLR

5230 5240 5250 5260 52705280

AACAGGGCTCAGAGT6GCAGTGTCCCTCAGTTCAAGAAAGTTGTTTTCCAGGAATTTACT NRAQSGSVPQFKKVVFQEFT 173 3

5290 5300 5310 5320 53305340

GATGGCTCCTTTACTCABCCCTTATACCGTGGAGAACTAAATGAACATTTGGGACTCCTG DGSFTQPL.YRGELNEHLGLL

5350 5360 5370 5380 53905400

GGGCCATATATAAGAGCAGAAGTTGAAGÁTAATATCATGGTAACTTTCAGAAATCAGGCC

GPYIRAEVEDNIMVTFRNQA 177-.

^X^5460 ggcaagga

R 0 G

5520

5410 5420 5430 54405450 rCTCGTCCCTATTCCTTCTATTCTAGCCTTATTTCTTATGAGGAAGATCAI SRPYSFYSSLIS YEEDQ

5470 5480 5490 55005510

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A E P R K NFVKPNETKTYFW Κ V ¹⁸¹ *

5530 5540 5550 5560 5570 5580'

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DHHMAPTKDEFDCKAWA YFS

5590 5600 5610 5620 56305640

GATGTTGACCTGGAAAAAGATGTGCACTCAGGCCTGATTGGACCCCTTCTGGTCTGCCAC

D V D L E K D V H S G L I G P L L V C H ^185:1

5650 5660 5670 5680 56905700

ACTAACACACTGAACCCTGCTCATGGGAGACAAGTGACAGTACAGGAATTTGCTCTGΓΤΤ TNTLNPAHGRQVTVQEFALF • 5710 5720 5730 5740 57505760

TTCACCATCTTTGATGAGACCAAAAGCTGGTACTTCACTGAAAATATGGAAAGAAACTGC

FT IFDETKSWYFTENMER N C ¹⁸⁵?

5770 5780 5790 5800 58105820

AGGGCTCCCTGCAATATCCAGATGGAAGATCCCACTTTTAAAGAGAATTATCGCTTCCAT

R A P C N I β Μ E D P T F K E N Y R F H

5830 5840 5850 5860 58705880

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5890 5900 5910 5920 59305940 ^TTCGATGGTATCTGCTCAGCATGGGCAGCAATGAAAACATCCATTCTATTCATTTCAGT

IRWYLLSMGSNENIHS IHFS

5950 5960 5970 5980 59906000

3GACATGTGTTCACTGTACGAAAAAAAGAGGAGTATAAAATGGCACTGTACAATCTCTAT

GHVFTVRKKEEY K Μ A L Y N L Y W'¹

6010 6020 6030 6040 60506060

3CAGGTGTTTTTGAGACAGTGGAAATGTTACCATCCAAAGCTGGAATTTGGCGGGTGGAA PGVFETVEMLPSKAGIWRVE

6070 6080 6090 6100 61106120 rGCCTTATTGGCGAGCATCTACATGCTGGGATGAGCACACTTTTTCTGGTGTACAGCAAT CLIGEHLHAGMSTLFLVYSN 201?

r

6130 6140 6150 6160 6170 6180

WGTGTCAGACTCCCCTGGBAATGGCTTCTGGACACATTAGAGATTTTCAGATTACAGCT

0 T P L G M	A S G	Η I R D F Q J	[ T A
6190 6200	6210	6220 6230	6240

rCAGGACAATATGGACAGTGGGCCCCAAAGCTGGCCAGACTTCATTATTCCGGATCAATC

S G G! Y G Q W A P K LARL.HYSGSI 205°

6250 6260 6270 6200 62906300 ^ATGCCTGGAGCACCAAGGAGCCCTTTTCTTGGATCAAGGTGGATCTGTTGGCACCAATG NAWSTKEPFSWI K V D L. L A P M

6310 6320 6330 6340 6350^^6360

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I I H G I K T β G A R Q K. F 8 S L Y I S

6370 6380 6390 6400 64106420

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G! F I I Μ Y S L. D G K K W β T Y R G N S

6430 6440 6450 6460 64706480

ACTGGAACCTTAATGGTCTTCTTTGGCAATGTGGATTCATCTGGGATAAAACACAATATT T ,G T l, Μ V F F G N V D S S G I- K Η N I 213 6490 6500 6510 6520 65306540

TTTAACCCTCCAATTATTGCTCGATACATCCGTTTGCACCCAACTCATTATAGCATTCGC

F N P P I I A R Y I R L Η P T Η Y S I. R

6550 6560 6570 6580 65906600

AGCACTCTTCGCATGGAGTGGATGGGCTGTGATTTAAATAGTTGCAGCATGCCATTGGGA STLRMEWMGCDLNSC S MPLG 21’9

6610 6620 6630 6640 66506660

ATGGAGAGTAAAGCAATATCAGATGCACAGATTACTGCTTCATCCTACTTTACCAATATG

ME SKAISDAQI TASSYFTMM

6670 6680 6690 6700 67106720

TTTGCCACCTGGTCTCCTTCAAAAGCTCGACTTCACCTCCAAGGGAGGAGTAATGCCTGG

F A T W S P S K A R L Η I... β G R S N A W -X: 9

6730 6740 6750 6760 67706780

AGACCTCAGGTGAATAATCCAAAAGAGTGGCTGCAAGTGGACTTCCAGAAGACAATGAAA

R P Q V N IM P K E W L 0 V D F Q K T Μ H

6790 6800 6810 6820 68306840

GTCACAGGAGTAACTACTCAGGGAGTAAAATCTCTGCTTACCAGCATGTATGTGAAGGAG VTGVTT0GV K SLLTGMYV K. E 22^6850 6860 6Θ70 6880 68906900 ttcctcatctccagcagtcaagatgbccatcagtggactctcttttttcagaatsgcaaa FLISSS0DGH0WTL. FFQNG K

6910 6920 6930 6940 69506960 gtaaaggtttttcagggaaatcaagactccttcacacctgtggtgaactctctagaccca VKVFQGNGDSFTPVVNSLDP 2299

6970 6980 6990 7000 7010 7020

CCGTTACTGACTCGCTACCTTCGAATTCACCCCCAGAGTTGGGTGCACCAGATTGCCCTG

L T R	Y L R	I Η P	β S W	V Η β j	[ A L
7030	7040	7050	7060	7070	7080

AGGATGGAGGTTCTGGGCTGCGAGGCACAGGACCTCTACTGAGGGTGGCCACTGCAGCAC RMEVL GCEABDLY

2332 stop

7090 7100 7110 7120 7130 7140

CTGCCACTGCCGTCACCTCTCCCTCCTCAGCTCCAGGGCAGTGTCCCTCCCTGGCTTGCC

7150 7160 7170 7180 7190 7200

TTCTACCTTTGTGCTAAATCCTAGCAGACACTGCCTTGAAGCCTCCTGAATTAACTATCA

7210 7220 7230 7240 7250ζ*^7260

TCAGTCCTGCATTTCTTTGGTGGGGGGCCAGGAGGGTGCATCCAATTTAACTTAACTCTT

7270 7280 7290 7300 7310

ACCTATTTTCTGCAGCTGCTCCCAGATTACTCCTTCCTTCCAATATAACTAGGCAAAAAG

7330 7340 7350 7360 73707380

AAGTGAGGAGAAACCTGCATGAAAGCATTCTTCCCTGAAAAGTTAGGCCTCTCAGAGTCA

7390 7400 7410 7420 74307440

CCACTTCCTCTGTTGTAGAAAAACTATGTGATGAAACTTTGAAAAAGATATTTATGATGT

7450 7460 7470 7480 74907500

TAACATTTCAGGTTAAGCCTCATACGTTTAAAATAAAACTCTCAGTTGTTTATTATCCTG ,7510 7520 7530 7540 75507560

ATCAAGCATGGAACAAAGCATGTTTCAGGATCAGATCAATACAATCTTGGAGTCAAAAGG

7570 7580 7590 7600 76107620

CAAATCATTTGGACAATCTGCAAAATGGAGAGAATACAATAACTACTACAGTAAAGTCTG

7630 7640 7650 7660 76707680

TTTCTGCTTCCTTACACATAGATATAATTATGTTATTTAGTCATTATGAGGGGCACATTC

7690 7700 7710 7720 77307740

TTATCTCCAAAACTAGCATTCTTAAACTGAGAATTATAGATGGGGTTCAAGAATCCCTAA

7750 7760 7770 7780 77907800

GTCCCCTGAAATTATATAAGGCATTCTGTATAAATGCAAATGTGCATTTTTCTGACGAGT

7810 7820 7830 7840 78507860

GTCCATAGATAAAAAGCCATTTGGTCTTAATTCTGACCAATAAAAAAATAAGTCAGGAGG

7870 7880 7890 7900 79107920 atqcaattgttgaaagctttgaaataaaataacaatgtcttcTtbaaatttgtgatggcc

7930 7940 7950 7960 79707980

AAGAAAGAAAATGATGATGACATTAGGCTTCTAAAGGACATACATTTAATATTTCTGTGG

7990 8000 8010 8020 80308040

AAATATGAGGAAAATCCATGGTTATCTGAGATAGGAGATACAAACTTTGTAATTCTAATA

8050 8060 8070 8080 80908100

ATGCACTCAGTTTACTCTCTCCCTCTACTAATTTCCTGCTGAAAATAACACAACAAAAAT

8110 8120 8130 8140 81508162

GTAACAGGGGAAATTATATACCGTGACTGAAAACTAGAGTCCTACTTACATAGTTGAAAI

8170 8180 8190 8200 82108222

ATCAAGGAGGTCAGAAGAAAATTGGACTGGTGAAAACAGAAAAAACACTCCAGTCT8CCA

82308240

TATCACCACACAATAGGATCC

Claims (3)

1. REIVINDICAÇÕES

   - is Processo para a preparação de um bloco integrado (“cassette”) de expressão caracterizado por se incorporar, na direcção da transcripção, uma região de regulação do início de transcripção e de tradução, opcionalmente uma sequência de sinal de secreção, um quadro de leitura livre que codifica para uma sequência de ácidos aminados capaz de reacção imunológica cruzada com o factor VIII e uma região de regulação da terminação de tradução e de transcripção de modo que as regiões mencionadas sejam funcionais num hospedeiro microbiano.

   - 2a Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o quadro de leitura livre mencionado codificar de modo substancial para pelo menos uma das proteínas de 80 kDa ou de 92 kDa do factor VIII.

   - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o quadro de leitura livre mencionado codificar para as proteínas de 80 kDa e de 92 kDa ligadas de modo diferente da ponte polipeptídica natural do factor VIII.

   - 4ê Processo para a preparação de um vector caracterizado por se incorporar um sistema de replicação funcional num hospedeiro microbiano e um bloco integrado (cassette) de expressão contendo, na direcção da transcrição, uma região de regulação do início de transcrição e de tradução, opcionalmente uma sequência de sinal de seereção, um quadro de leitura livre que codifica para uma sequência de ácidos aminados capaz de reacção imunológica cruzada com o factor VIII e uma região de regulação da terminação de tradução e de transcripção de modo que as regiães mencionadas sejam funcionais num hospedeiro microbiano.

   _ ₅â Processo de acordo com a reivindicação
2. 4 caracterizado por se incorporar adicionalmente no vector uma marca para selecção num hospedeiro microbiano.

   - 6â -

   Processo de acordo com a reivindicação

   4 caracterizado por o quadro de leitura livre mencionado codificar de modo substancial para pelo menos uma das proteí nas de 80 kDa ou de 92 kDa do factor VIII.

   - 7â Processo de acordo com a reivindicação

   4- caracterizado por o quadro de leitura livre mencionado oo- dificar de modo substancial para a proteína de 80 kDa.

   - 8§ Processo de acordo com a reivindicação

   4 caracterizado por o quadro de leitura livre mencionado codificar de modo substancial para a proteína de 92 kDa.

   - gs Processo de acordo com a reivindicação

   4 caracterizado por o quadro de leitura livre mencionado codificar para as proteínas de 80 kDa e de 92 kDa ligadas de modo diferente da pente polipeptídica natural do factor VIII.

   - 10 S -

   Processo de acordo com a reivindicação 9 caracterizado por as proteínas de 80 kDa ede 92 kDa mencionadas estarem na ordem natural de factor VIII.

   - llâ -

   Processo para a preparação de um polipeptídeo sob forma isolável capaz de reacção cruzada com o factor VIII earacterizado pors cultivar-se um hospedeiro microbiano, transformado com um vector obtido de acordo com qualquer das reivindicações 4 a 10 ou contendo um bloco integrado de expressão obtido de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, num meio nutriente a fim de produzir o polipeptídeo mencionado; e isolar-se o polipeptídeo mencionado.

   - 12â Processo de acordo cota a reivindicação 11 caracterizado por o hpspedeiro microbiano ser uma estirpe de Bacillus subtilis ou de Bacillus licheniformis deficiente em relação a alfa-amilase e/ou deficiente em relação a exoprotease.

   Processo de aeordo com a reivindicação

   11 caracterizado por o hospedeiro microbiano ser uma bactéria ou um fungo.

   - 14 & Processo de aeordo com a reivindicação

   13 earacterizado por o hospedeiro miorobiano ser uma bactéria do género Bacillus ou um fungo do género Kluyveromyces.

   - 15^a Processo de acordo com a reivindicação

   14 caracterizado por o hospedeiro baoteriano ser Bacillus subtilis ou Bacillus licheniformis.

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações 14 ou 15 caracterizado por o bloco integrado de expressão estar presentes no plasmídeo pOL92, pOLSO ou

   - 16& - 80 - pPR0M92/80PB, utilizado para transformação dum hospedeiro do género Bacillus.

   - 17& -

   14 caracterizado por lactis.

   Processo de acordo com a reivindicação o fungo Kluyveromyces serKluyverotnyces

   - 18§ Processo de acordo com qualquer das reivindicações 14 ou 17 caracterizado por o bloco integrado de expressão estar presente no plasmídeo pGB850, pGB852, pGB853. pGB861 ou pGB864, utilizado para transformação dum hospedeiro do género Kluyveromyces.

   - 19^a Processo de acordo com a reivindicação 11 caracterizado por o quadro de leitura livre estar ligado pela sua extremidade 5* a uma sequência de ADN que codifica para uma sequência de sinal funcional no hospedeiro microbiano mencionado para a secreção do polipeptídeo mencionado e no qual a sequência de aBinal mencionado é processada.

   - 208 Processo de acordo com a reivindicação

   19 caracterizado por o hpspedeiro microbiano ser um fubgo do género Kluyveromyces.

   21ê

   Processo de acordo com a reivindicação 19 caracterizado por o hospedeiro microbiano ser uma bactéria do género Bacillus.

   „ 22- Processo para a preparação de uma composição farmacêutica contendo um polipeptídeo preparado pelo processo que consiste em:

   cultivar-se um hospedeiro microbiano, transformado com um vector obtido de acordo com qualguer das reivindicações 4 a 10 ou contendo um bloco integrado de expressão obtido de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, num meio nutriente a fim de produzir o polipeptídeo mencionado: e isolar-se o polipeptídeo mencionado, e uma substância veicular ou um diluente farmaceuticamente aceitável e opcionalmente um adjuvante.

   - 23ã -

   Processo para a preparação de um anticorpo para uma proteína obtida por um processo de acordo com qualquer das reivindicações 11 a 21 caracterizado por se imunizarem mamíferos com a proteína mencionada e se isolar o anticorpo a partir de sangue dos referidos mamíferos.

   - 24 â -

   Processo para a preparação de um anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 23 caracterizado por adicionalmente se produzir um hibridoma a partir do anticorpo obtido e se isolar o anticorpo monoclonal a partir do referido hibridoma.

   — 82

   - 25& Processo para a purificação duma proteína dotada de actividade de factor VIII caracterizado por se fazer contactar uma fase líquida contendo a proteína e impurezas com uma fase sólida contendo um anticorpo preparado de acordo com qualquer das reivindicações 23 ou 24, separar-se a fase líquida da fase sólida e eluir a partir da fase sólida a proteína com um conteúdo de impurezas reduzido.

   - 26s Processo para o diagnóstico de anormalidades do factor VIII em amostras de sangue caracterizado po:? se fazer contactar a amostra com um anticorpo preparado de acordo com qualquer das reivindicações 23 ou 24 e se determinar a presença ou a ausência dum conjugado do anticorpo com o antigene do factor VIII medindo deste modo a proteína de factor VIII na amostra.

   A requerente declara que os primeiros pedidos desta patente foram apresentados no Reino Unido em 18 de Julho de 1986 e em 23 de Dezembro de 1986, sob os N2s₀ 8617594 e 8630699, respeotivamente.

   Lisboa, 17 de Julho de 1987

   RESUMO

   PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE PROTEÍNAS COM ACTIVIDADE DE FACTOR VIII POR CÉLULAS MICROBIANAS HOSPEDEIRAS, DE VECTORES DE EXPRESSÃO BEM COMO BE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS CONTENDO ESTAS PROTEÍNAS E DE ANTICORPOS ÚTEIS PARA A PURIFICAÇÃO DE FACTOR VIII E PARA DIAGNOSTICO

   A invenção refere-se a um processo para a preparação de um bloco integrado (cassette) de expressão que compreende incorporar-se, na direcção da transcrição, uma região de regulação do início de transcrição e de tradução, opcionalmente uma sequência de sinal de secreção, um quadro de leitura livre que codifica para uma sequência de ácidos aminados capaz de reacção imunológica cruzada com u factor VIII e uma região de regulação da terminação de tradução e de transcrição de modo que as regiões mencionadas sejam funcionais num hospedeiro microbiano.

   Figura 2

   FIG- J

   1 2 3 4 5

   6 7

   I

   A

   B

   FIG. 2

   1kb ----------------1

   Fragmentos

   1 859

   2089

   12 5 3

   785

   2234 ^m'^c-^s-<EcoRI .XmaUI .Xmal jSall HindlII _5'pGAA TTC GCG GCC GCC CGG GTC GAC TCA AGC TTA AAT \ \ TCG CGG CCG CCC GGG TCG ACT CAA GCT TAA ATT \ CGC GGC CGC CCG GGT CGA CTC AAG CTT AAA₃-

   Klg. 4

   PvuH

   BglH hgaçao

   BglD í í

   Ncol

   I

   Fig. 5A

   E c o RIX m ams m aIS a ll Eco RIX m aULS m alS all

   Fig. 5B

   BglII

   PvulI

   PstI

   EcoRl

   EcoRl

   BglIL

   EcoRTXmainSmal|SalJ

   ÍOfeSalI Bali (BamHI) com

   Sal pOL92-T-21

   XmaUT

   Bãí®

   Bali pOLõ-21

   BglU hgaçáo ’ Xmalll

   EcoRlXmáíllSmalSalI ligaçao

   Fig. 6

   1 2 3 «— 9 4 kd *«-4 3 kd

   Γ xg. ι

   BamHI

   BamHl

   XmalII

   EcoRI

   PstI

   Bgll

   EcoR7

   Bgll corte comBglI e

   7.8Kb

   EcoRI PstI HindW pGB33

   Sall

   EcoRI EcoRI

   EcoRV

   Transformacáb de

   B. licheniformis

   T6 prohop/asfos pA i EcoRI

   EcoRI

   PstI

   ---hyacao HindU (HindUT/Bg©

   EcoRI

   BglH pGB33A
3. 5.9Kb Nm

   EcoRI ι zzt

   Campbellinteyracao Npo 'K o RI xsssd--- cromossoma de

   --- rece pcao (Amy⁺NmS) (Amy+Nm^R) cromo ssona recombina do

   EcoRI.

   EcoRI PjA._____________ recombinacao e / Fecho de plàsmidio EcoFU EcoRI / cromossona /'ecombinado (Amy+ Nm^R

   Nm

   EcoRI EcoRI —

   (âAmy Nm*)

   1234 56789