DK149157B - Fremgangsmaade til fremstilling af et varme- og syrestabilt alfa-amylaseenzym - Google Patents

Description

149157

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af et hidtil ukendt varme- og syrestabilt <*-amylaseenzym.

α-amylaseenzympræparater er blevet anvendt til at hydrolysere, smelte og/eller omdanne stivelsesholdige materialer til stivelseshydrolysat er. Endvidere har sådanne præparater været anvendt som bestanddele af vaskemidler. Når α-amylaseenzymer anvendes til behandling af stivelsesholdige materialer, benyttes de i et indledende trin til fremstilling af et antal syntetiske stivel-seshydrolysatmaterialer, såsom malto-dextriner, majssiruper, dextrose, lævulose, maltose og andre materialer, a-amylaseen-zymet hydrolyserer stivelsesmolekylerne, som derved nedbrydes 2 149157 til forskellige fragmenter med intermediær molekylvægt, kendt under navnet malto-dextriner. Malto-dextrinerae behandles derefter med et eller flere yderligere enzympræparater, såsom gluco-amylase, β-amylase og glucose-isomerase, for at producere det ønskede slutprodukt. I stedet kan flere af disse enzympræparater indføres i en opslæmning af stivelse samtidigt for direkte at producere det ønskede stivelseshydrolysat.

α-amylaseenzymer er tilgængelige fra vidt forskellige kilder.

De fleste α-amylaseenzymer produceres af "bakterier, såsom Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus og andre, som dyrkes i passende dyrkningsmedier, hvorefter de således dannede celler sønderdeles, og enzympræparatet skilles fra væsken og renses.

Mange af de kommercielt tilgængelige α-amylaseenzymer, som produceres for tiden, stammer fra Bacillus subtilis-mikroorganismer.

Når disse enzymer anvendes til omdannelse af stivelse til sti-velseshydrolysater, vil de sædvanligvis have en optimal temperatur mellem 80°0 og 85°0 og en optimal pH-værdi på 6,0. Betingelserne for temperatur og pH-værdi, som er nødvendige for effektiv anvendelse af enzymet, har to ulemper. Por det første, hvis stivelse omdannes med enzymet ved en pH-værdi på cirka 6 og en temperatur på ca. 80 - 85 °C, vil en del af de reducerende endegrupper i stivelsen blive isomeriseret, og ved en efterfølgende omdannelsesproces opstår maltulose, som reducerer udbyttet af det ønskede produkt, f. eks. dextrose, lævulose eller maltose. For det andet er den optimale ρϊΐ-værdi af glucoamylase, der anvendes til omdannelsen og saccharifikationsprocessen, sædvanligvis ca. 4,5, for så vidt angår enzymer fra organismer af arten Aspergillus niger, og ca. 5,0, for så vidt angår enzymer fra organismer af slægten Rhizopus. Ved afslutning af smeltningstrinnet ved hjælp af dv-amylaseenzymet har det derfor været nødvendigt at indstille pH-værdien fra ca. 6 til 4,5 eller 5,0. Denne indstilling af pH-værdien medfører en forøgelse af ionkoncentrationen, og som følge deraf forøges belastningen og omkostningerne ved raffineringen under anvendelse af ionbytterharpikser, når disse anvendes til rensning af slutproduktet.

3.

149157

Der er for nylig udviklet forskellige varmestabile a-amylase-enzymer. Eksempler på sådanne varmestabile a-amylaseenzymer er sådanne, som er produceret af mikroorganismer af arten Bacillus s t e ar o thermo phili s som beskrevet af Ogasawara et al., J. Biol.

Chem., 67, 65, 77 og 85 (1970); G.B. Manning og I.L. Campbell, J. Biol. Chem., 236, 2952, 2958 og 2962 (1961); S.L. Pfueller og W.H. Elliot, J. Biol. Chem., 244. 48 (1969). Senere er fremkommet α-amylaseenzymer med god varmestabilitet i neutrale eller svagt alkaliske opløsninger. Disse varme- og alkalistabile α-amylaseenzymer er markedsført under varemærket "Thermamyl".

De produceres ved dyrkning af mikroorganismer af arten Bacillus licheniformis som beskrevet i britisk patentskrift nr. 1.296.839, publiceret 22. november 1972, Madsen et al., Die Stårke, 25, 304, 305 og 308 (1973) og Narimasa Saito, ABB, 1^, 290 (1973).

Selv om α-amylaseenzymer, som produceres fra Bacillus licheni-formis har en forholdsvis god varmestabilitet i neutral og svagt alkalisk opløsning, har de ikke en så god stabilitet under sure betingelser, at de kan anvendes økonomisk i kommerciel målestok.

Den foreliggende opfindelse har således til formål at tilvejebringe α-amylaseenzymer, som har en god varmestabilitet samt en god stabilitet under sure betingelser, især ved sådanne pH-værdier, som gør dem egnede under betingelser, hvor der også kan anvendes andre amylaser, såsom glucoamylase.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del anførte.

De ved fremgangsmåden fremstillede varme- og syrestabile «ί-amy-laseenzymer har følgende egenskaber (1) de er i stand til at opretholde mindst ca. 70 pct. af deres oprindelige «*-amylaseaktivitet, når de holdes ved 90°C og en pH-værdi på 6,0 i 10 minutter uden tilsætning af calciumion, (2) de er i stand til at opretholde mindst ca. 50 pct. af deres oprindelige ac-amylaseaktivitet, når de holdes ved 90°C ved en pH-værdi på 6,0 i 60 minutter uden tilsætning af calciumion, og (3) de er i stand til at opretholde mindst ca. 50 pct. af deres oprindelige o(-amylaseaktivitet ved en temperatur på 80°C og en pH-værdi på 4,55 i nærværelse af 149157 4 5 mM calciumioner i 10 minutter. Enzymerne er også i stand til at tilbageholde mindst ca. 50 pct. af deres oprindelige aktivitet ved en temperatur på 85°C og ved en pH-værdi på 4,55 i nærværelse af 5 mM calciumion og 22,5 vægtprocent stivelse.

De omhandlede of-amylaseenzymer har en molekylvægt på mindst 90.000r bestemt ved SDS-pladeelektroforese, og de udmærker sig ved at være i det væsentlige fri for proteaseaktivitet, idet de nemlig har et protease/a-amylaseforhold på mindre end 3 og fortrinsvis mindre end 1.

Opfindelsen skal i det efterfølgende illustreres nærmere ved hjælp af tegningen, hvor fig. 1 illustrerer forholdet mellem optimal pH-værdi af de to enzymer opnået ifølge opfindelsen og Thermamyl-ofc-amylase, fig. 2 illustrerer forholdet mellem optimal temperatur for de to enzymer Opnået ifølge opfindelsen og Thermamy 1 -<<-amy 1 ase, fig. 3 illustrerer forholdet for termostabiliteten af de to enzymer opnået ifølge opfindelsen og Thermamy l-°<-amylase ved 80°C, pH = 4,55 I { med 5 mM Ca , fig. 4 illustrerer forholdet mellem termostabiliteten af de to enzymer opnået ifølge opfindelsen og Thermamy1-Of-amylase samt tf-amy-lase vundet fra Bacillus stearothermophilus, som beskrevet af Ogasawava et al. i ovennævnte litteratursted, ved 90°C og en pH-værdi på 6,0,

Fig. 5 sammenligner termostabiliteten af to enzymer opnået ifølge opfindelsen med Thermamyl-«t-amylase ved 90°C, en pH-værdi på 6,0 og et indhold af 1 mM Ca++, fig. 6 illustrerer forholdet mellem termostabiliteten af de to enzymer opnået ifølge opfindelsen og Thermamyl ved 85°C og en pH-værdi på 4,55 i nærværelse af 22,5 pct. stivelse, på tørstofbasis, 149157 5 fig. 7 illustrerer forholdet mellem termostabiliteten af de to enzymer opnået ifølge opfindelsen og Thermamyl-rf-amylase ved 85°C, pH = 4,55 i nærværelse af 22,5 pct. stivelse og 5 mM Ca , fig. 8 illustrerer grafisk bestemmelsen af molekylvægten af de to enzymer opnået ifølge opfindelsen ved SDS-pladeelektroforese, fig. 9 illustrerer forholdet mellem pH-værdien og enzymaktiviteten for et af enzymerne opnået ifølge opfindelsen og kendte Øt-amylaser, afledt af Bacillus stearothermophilus-mikroorganismer, fig. 10 illustrerer forholdet mellem temperaturen og enzymaktiviteten af et enzym opnået ifølge opfindelsen og en kendt "C-amylase afledt af Bacillus stearothermophilus, fig. 11 illustrerer deaktiveringskurver for et enzym opnået ifølge opfindelsen og kendte tX-amylaser, afledt af Bacillus subtilis og Bacillus licheniformis, idet der behandles ved 80°C og pH = 4,5 i nærværelse af 5 mM calciumion, og fig. 12 illustrerer deaktiveringskurverne for et enzym opnået ifølge opfindelsen og hidtil kendte oC-amylaser, afledt af Bacillus li-cheniformis og Bacillus stearothermophilus, idet der behandles ved 90°C og en pH-værdi på 6,0 uden calciumion.

De omhandlede hidtil ukendte mikroorganismer er blevet isoleret på følgende måde:

Produktionen og den termiske stabilitet af a-amylase fra forskellige mikroorganismer blev undersøgt under forskellige betingelser, såsom væksttemperatur (27°C, 45°C, 55°C og 70°C), pH-værdi (5,0 og 7,0) og media. Det viste sig, at termofile strålesvampe, isoleret ved 55°C, og termofile svampe ved 45°C producerer termolabil a-amylase i høje udbytter, medens termofile bakterier ved 70°C producerer termostabil a-amylase i lavt udbytte.

Baseret på disse indledende studier blev mikroorganismerne undersøgt og inddelt for syre- og termostabilitet af α-amylase, idet der dyrkedes ved 55°C og 70°C.

6 U9157 I alt 550 prøver af mikrobielle kilder, herunder jordprøver, vand fra varme kilder, kompost og lignende kilder, blev opsamlet fra forskellige lokaliteter.

Syre- og termostabiliteter blev bestemt ved prøvning af a-amy-laseaktivitet før og efter varmebehandling af den filtrerede dyrkningsvæske ved 80°0 og pH = 5,0 i 10 minutter i nærværelse af 10 mM calciumion.

α-amylaseaktiviteten blev bestemt på følgende måde:

0,2 pct. opløselig stivelsesopløsning blev fremstillet hver uge på følgende måde: 200 mg opløselig stivelse i cirka 50 ml 0,2 M

acetatpuffer ( pH = 4,5 ) indeholdende 0,013 M CaCl2.2H20 opvarmedes til 100°0 i kogende vand, og den dannede opløsning blev indstillet på 100 ml med samme puffer. Et reagensglas indeholdende 0,1 ml af enzymopløsningen og 0,3 ml 0,2 pct. opløselig stivelsesopløsning blev dyrket i 5 minutter ved 60 °C. Reaktionen blev stoppet ved tilsætning af 1,0 ml 0,5 N eddikesyre. Efter tilsætning af 3,0 ml 0,015 pct. iodopløsning og omrøring blev den optiske tæthed aflæst ved 700 my. over for H20. Et glas uden enzym tjente som kontrol, og den optiske tæthed ved 700 myi blev bestemt som OD^. En enhed af enzymet var den mængde, som katalyserer en 10 pct. formindskelse af blåfarven pr. minut under de ovenfor beskrevne betingelser.

(OD. - OD) x 100 MM, enheder = 0¾ x 5 i~i&—

Med mindre det modsatte er angivet, blev <*-amylaseaktiviteten bestemt ved ovennævnte procedure (NMI-enheder). Hvis a-amylase-aktiviteten er angivet i CPC-oc-amy lase-enheder, er CPC-enhedeme cirka 1/140 af NML-enhedeme.

CPC-a-amylase-enhedeme for aktiviteten bestemmes ved følgende procedure:

1 ml af en passende fortyndet enzymopløsning sættes til 10 ml af en 1 pct. opløselig stivelsesbpløsning - 0,03 M

7 149157 eddikesyrepufferopløsning (pH = 6,0), og reaktionen udføres i 10 minutter ved 60°C. 1 ml af reaktionsopløsningen indføres i en 100 ml inddelt kolbe indeholdende 50 ml Ο,ΟΖ N saltsyre, og efter tilsætning af 3 ml 0,5 pct. iodopløsning indstilles det totale rumfang på 100 ml ved tilsætning af vand.

Den dannede blå farve måles for absorbans ved 620 πηι. Mængden af enzym, som kræves til at dekomponere 10 mg stivelse i løbet af 1 minut, er defineret som 1 CPC-enhed.

1 CPC-enhed = 0 ^—- x -tø x (fortyndingsfaktor) ‘‘o hvor

Dq = absorbans for kontrolopløsning (vand tilsættes i stedet for enzymopløsningen)

Ds = absorbans af reaktionsopløsningen.

Dyrkningsbetingelserne og de anvendte medier til disse studier fremgår af tabel 1.

Resultaterne af første og anden screening er rapporteret i tabel 2.

8 149157 TABEL 1

Dyrkningsbetingelser og medier

Betingelser

Bladekultur^ ^ ^ Skråkultur Eolbekultur^ (a) 55°C, pH 5 55°C, pH 5 50°C, pH 6 (b) 55°C, pH 7 55°0, pH 7 50°C, pH 7 (c) 70°C, pH 5 70°C, pH 5 60°C, pH 6 (d) 70°C, pH 7 70°C, pH 7 60°C, pH 7 ^ ^Medium for pladekultur (B-B)

Amylopectin 0,02 $ (NH4)2HB04 0,025$ Gærekstrakt 0,025$

Na-citrat 0,01 $

MgS04*7H20 0,05 $ ECl 0,15 $ 0aCl2-2H20 0,05 $

Agar 2,0 $ ^Medium for ^Medium for

Skråkultur Kolbekultur (B=D) (B=M)

Opløselig stivelse 1,0 $ 3,0 $

Ba(MftoFt0n °.5 i 0,5 * Gærekstrakt 0,5 $ 1,0 $

CaCl2*2H20 0,05$ 0,05$

MnCl2-4H20 0,05$

MgS04*7H20 - 0,05$ kh2bo4 0,1 $ 0,1 $

Agar 2,0 $ 9 149157 0 in'ii t-o OO mo OO OO oo

ni D

1 fc ©

P

H "g

<D O C

43 OH ø c o a -a-o o o c-o o o o tn o o -h ω ·\ tn cm a O CN1JD „

© l O

Ό

O

Ml Μ *H ·

Cl ft •HI I O O ©

Cl © OH -+3 CD I tQ o a vo O CM CM -+0 CM O O i~ OO ΙΑ ·Η ©i >> ·\ *+ tn f>

Ml H rr [3 D H

Ol © t . ftP

j cqi a ..¾ I © Mø!

q <HI I OP

q ©i a © q I OH O ©

jj Ml <n o a tn o H-t- o o tn tn t- τ- o cm o M

η ©I © uvv. H- in O

PI f iD 00-g.

©I W) .o -PI C *© o

Hl -H ©«-

Cl H r* ral © o ,ώ ©I W H OH ¢0¾

pejl β M cm a vo ο σ»θ vo O ιη«+ o IH O in C M

•Η O l N τ- t— τ* *H *H

C ft OD H O

ø O ti 0 τ- β 0 o Λ ©

ΓΛ © H

* Pl> . «aj © CM fd I + I + 1+1+ 1+1+ Sfj M © M © g

© © M © > S

ft Μ M ftH Μ © I „ © a©© a©© i a μ p © © g M i ©g Mg m§ m© © © hm t>a©a i> a © a ©© ©p -p ©ω m©H© ιη©·Η© ·η -ρ ·η m «η©

Mg ©+> ΜΡ © Ρ Μ -Ρ Μ © U © !> ©a η ra © ra Hra©m ω ©νο ·η Η © «© -Ρ ο© -Ρ -ΡΗ -Ρ CM -Ρ -Ρ ο -ρ μ tn cm μ er» ,¾ σ> τ- tn ω ·η m ra -Ρ ο ©σν ρ cm ©νο ©«+ © · ρ © Η winpqcM co νο pq c— fq 00 pq i- ·Η o

i> ft •H

M O O O O Spe! β I M ·> ·> ·* © •h ra © in o in c— p©

C C ra © H

© oh w Μ ω ω ©η © Η © ft ft ft ft Ph oj

M PM

O © β ·> ·> ^ ·.

CQHHO O OO

OP O O O O

• ra © in in OO re i- HP in in c- t- * 10 149157

Ca 25 pet. af de termofile strålesvampe isoleret ved 55°C udviste 100 - 2500 enheder eO-amylase-produktion pr. ml kultur- væske, men ingen aktivitet forblev efter varmebehandling (80°C, 10 minutter, pH = 5,0).

I alt .35 stammer af 1061 termofile bakteriestammer, isoleret ved 55°C, udviste 100 - 1000 enheder oC-amylase-produktion, og 10 af disse stammer producerede en termostabil α-amylase. Næsten alle α-amylaser fra termofile bakterier, isoleret ved 70°C, udviste syre— og termostabilitet, og de største udbytter blev opnået fra isolater ved pH = 5,0.

Sammenhængen mellem aktiviteten og størrelsen af den klare zone for de sidste 219 stammer, isoleret ved 70°C og en pH-værdi på 5,0, blev undersøgt. Resultaterne af disse studier er vist i tabel 3, hvoraf det kan ses, at 90 pct. af stammerne gav en klar zone på mindre end 3 cm i diameter og producerede 0 - 200 enheder α-amylase. Hen største produktion blev opnået med stammer, som gav en klar zone på mere end 3 cm i diameter, men disse repræsenterede kun 10 pct. af de afprøvede stammer.

JABEL· 3

Forhold mellem aktivitet og klar zone-størrelse af isoleret stamme

Klar zone-størrelse på isolationsplade Aktivitet i kolbe (cm i diameter) (U/ml) -Ί “ ~ Total 0 - 100 153 40 15 0 208 - 200 3 2 1 0 6 - 500 0 0 2 0 2 - 1.000 0 0 1 0 1 - 1.500 00 1 12

Total 156 42 20 1 219 11 149157

Baseret på ovennævnte prøver har det vist sig, at isolationen af bakteriekolonier med en klar zone på mere end 3 cm i diameter på det anvendte plademedium ved prøverne ved 70°C og en pH-værdi på 5,0 er en udmærket metode for screening af mikroorganismer, der er i stand til at give høje udbytter af syre- og termostabile Ct-amylaseenzymer,

Som resultat af denne screening blev to stammer udvalgt som største producenter af syre- og termos tabile oc-amylaseenzymer.

Hver af de to stammer i renset form som beskrevet i det efterfølgende er deponeret i den permanente samling American Type Gulture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852. ATCC opbevarer disse stammer i henhold til en kontrakt med ejeren af det foreliggende patent.

I henhold til denne kontrakt er de omhandlede kulturer eller underkulturer permanent tilgængelige for offentligheden uden begrænsninger, ud over de rettigheder, som er en følge af udstedte patenter. Efter aftalen er patenthaveren indforstået med at erstatte eventuelt ødelagte kulturer i den deponerede samling, så længe patenterne er i kraft, med levende kulturer af samme organisme.

Deponerede_organigmgr NML stamme nr. A!P0C nr.

Bacillus stearothermophilus B-501 31.195

Bacillus stearothermophilus B-968 31.198

Desuden er NML-stamme B-501 deponeret i Fermentation Research Institute, Industrial Technology Agency, MITI, som FRI nr. 3389.

De bakteriologiske egenskaber for de to udvalgte stammer, som er deponeret i ATCC-samlingen, er følgende: 12 149157 (1) Morohologiske egenskaber A. I'orm_og_størrelse_af_celler 0,6 x 2 - 3^u; enkelte stave, sjældent i kæder (begge stammer) B. £ΐ225ί2ΕΕϊΐΐ£ΐίΕ£

Negativ (begge stammer) C. Bevægelighed

Bevægelige og har flagella (begge stammer) D. Scorer 0,6 x 1,0 - 1,5 μ, ægformet, ketsjerformet sporehus (begge stammer) E. Gram-stammer

Positive (begge stammer) E. Syrefast

Negativ (begge stammer) (2) Vækst på forskellige medier 4-·

Aktive spredte kolonier med grov overflade og ru kant (begge stammer) B. Næringsagar-skråkultur

God vækst, hvid opaque, aktivt spredt, kamformede udvækster (begge stammer) 13 149157 C. Næringsvæske ^fIffdgnde ^kultur Transparent brun, hvid overflade (begge stammer) D. Næringsgelatine_stavkultur Smeltning (begge stammer) E. Næringsgelatineagar-plade Stor klar zone (begge stammer) E. Salt-næring_flydende_kultur Vækstinhibering i 2% salt (begge stammer) G. Mælkeagar-plade

Celle-zone-dannelse ved hydrolyse af casein (begge stammer)

God vækst, kolonier svarende til de på næringsagar opnåede (begge stammer) I. Proteose-pepton-agar-skråkultur

Ingen vækst (begge stammer) (3) Physiologiske egenskaber A. Nitrat-reduktion

Positiv (begge stammer) 14 149157 B. Catalase-jorøye Positiv (begge stammer) C. Vogugs-Proskauer-reaktion

Positiv (begge stammer) D. Udn2ttelse_af_citrons2re

Positiv (begge stammer) E. Pannelseaf Hydrogensulfid

Positiv (begge stammer)

Positiv (begge stammer) G. 52drol£se_af_stivelse Kraftig Hydrolyse (begge stammer) H. Dannelse af_gyge_og>gag

Positiv for syre, men ingen gasdannelse fra glucose, xylose, arabinose og mannitol (begge stammer) I. Temperatur_og_2H_for_vækst ATCG nr. 31.195 (B-501) 37°C Ingen vækst 42°C Svag vækst 50 - 70°C God vækst pH-område for vækst 5-8

Optimalt pH 6-7 15 149157

Ovennævnte prøver blev udført i overensstemmelse med "Laboratory Methods in Microbiology" af W.3?. Harrigan et al., og "Manual of Microbiological Methods", publiceret af American Bacteriological Association.

Af de ovenfor beskrevne egenskaber fremgår det, at de to udvalgte stammer er identificeret som tilhørende arten Bacillus stearother-mophilus i overensstemmelse med Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. udgave.

De nævnte to stammer blev yderligere renset ved plade-udstryg-ningsmetoden. Resultaterne af isolationen, dyrkning og rensningsbetingelserne for de to udvalgte stammer er opstillet i efterfølgende tabel 4. Af denne tabel ses, at den rensede stamme af ATCC nr. 31.199 (B-968) var den bedste af de to udvalgte stammer, idet den producerede 2111 NML-enheder o^-amylase pr. ml dyrkningsvæske (ca. 15 CPC-enheder).

φ md ^ 16 149157

Η MW

I Φ ft ft P W) 3 0 » »

-P -Η Ο O

H +5 Ο O

3 Φ o in M P vo in P ' ,

33 M CM CM

P-ri 2 -Φ H-P S 3 -H W ^

-P

(D/^v PH CM r- •H a E" ·>- !>\ tn T- H M · ·

Pw 1- CM

P

Φ VO VO

m

Η Μ M

I Φ ft ft ρ ω 3 0 -

-Ρ -Η Ο O

ΦΙ H-P O O

§1 3 Φ Ο O

Bl M.Q vo VO

¢61

PI

Ί V

to! -p ^ Φ cn o HI Η Ό g CO Η- srt 01 3 -Η ·Η f>l M +j +> Η Ml m 3i m i •a} MhI -p EH 01 ©^

I -PH CM CO

ai h a in on

31 T- O

HI -Η M · * PI -P'— T-

01 X

11 ^

Wl w P . o •Γ3 ra ¢50 3 +» P ta φ ρ o Μ W ft H 0 a

•H 0 O

Μ Η M

IP O O

ra φ M - * 0 ra ft in in Ο H •Η Φ -P w _ 0 0· H -H ft

o -p a O O O

ra © φο c- c-

H P|EH

P

0 in σ\ cn σν o f f o EH T- t- <a{ tn tn 17 149157

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen dyrkes mikroorganismen i et næringsmedium, som er egnet for dyrkning af termophile "bakterier. Sådanne dyrkningsmedier "bør indeholde en assimilerhar kilde for carbon og nitrogen sammen med andre væsentlige nærings« midler.

Egnede assimilerbare kilder for carbon er carbonhydrat, såsom stivelse, hydrolyseret stivelse, majsmel og hvedemel. Koncentrationen af carbonhydrat i mediet kan variere stærkt. Således kan den variere mellem 1 og 25% vægt/vol., men det foretrukne område ligger mellem 10$ og 20% vægt/vol., idet procentmængderne er beregnet som dextrose. Det foretrukne assimilerbare carbonhydrat er stivelse eller delvis hydrolyseret stivelse, som anvendes i mængder fra 1 til 5 pot. efter vægt.

Nitrogenkilden i næringsmediet kan være af uorganisk og/eller organisk natur. Egnede uorganiske nitrogenkilder er ammoniumsalte og nitrater. Egnede organiske nitrogenkilder er pepton, kødekstrakt, enzymekstrakt, casein, majsstøbevæske, maltekstrakt, sojabønnemel og skummetmælk.

Desuden skal næringsmediet indeholde de sædvanlige sporstoffer, såsom uorganiske salte, og eksempler herpå er calciumchlorid, magnesiumsulfat, phosphater, natriumchlorid og kaliumchlorid.

De nævnte kilder for carbon, nitrogen og uorganiske salte kan findes enkeltvis eller i passende kombinationer. Desuden kan tilsættes små mængder metalsalte, vitaminer og aminosyrer, som fremmer væksten og produktiviteten af bakterierne.

Dyrkningsbetingelserne, der anvendes til at producere a-amylar-seenzymer, er de samme, som normalt anvendes ved dyrkning af thermophile bakterier. Fortrinsvis dyrkes en stamme i et flydende dyrkningsmedium under omrøring og luftning i 2 til 5 dage ved en temperatur mellem 50 og 70°C ved en pH-værdi på 18 149157 5-9. Enzymer ophobes i dyrkningsmediet.

Efter dannelsen af άτ-amylaseenzymet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fjernes de mikrobielle celler på sædvanlig måde, såsom ved centrifugering. Filtratet underkastes derefter en udsaltning ved tilsætning af organiske salte, såsom ammoniumsulfat, natriumsulfat eller magnesiumsulfat, og/eller ved anvendelse af med vand blandbare organiske opløsningsmidler, såsom acetone, ethanol eller 2-propanol, til udfældning af enzymet, således at det kan koncentreres. Det er også muligt at udvinde amylase ved tilsætning af stivelse til filtratet, således at OC-amylasen adsorberes til stivelsen.

En foretrukken metode til rensning af det i filtratet indeholdte enzym omfatter en behandling af filtratet med kold acetone i det dobbelte rumfang af filtratet til udfældning af enzymet. Det udfældede enzym opløses derefter i en 0,05 M tris-saltsyrepuffer-opløsning (pH = 8,5)» og det føres derefter gennem en kolonne af DEAE-cellulose, som indstilles på ligevægt med samme pufferopløsning. Ved en pH-værdi på 8,5 bliver ikke-oc-amylaseproteiner, pigmenter etc. adsorberet til DEAE-cellulosen, mens hovedparten af a-amylase forbliver i opløsning. Eiltratet indeholdende a-amylaseenzymet omtales i det efterfølgende som "partielt raffineret enzym". Det partielt raffinerede enzym kan renses yderligere ved dialyse over for en 0,01 tris-saltsyre-pufferopløsning (pH = 7,0) og føres derefter gennem en kolonne af hydroxylapatit, som indstilles på ligevægt med den samme pufferopløsning. Enzymet adsorberes til kolonnen i dette trin. Det adsorberede enzym elueres ved lineært at forøge ammoniumsulfatkoncentrationen fra 0 til 0,5 molær.

Det således opnåede partielt raffinerede enzym bliver efter koncentrering ført gennem en kolonne af Sephadex G-150. Enzymet bliver svagt adsorberet til Sephadex, og det elueres i en fraktion under en molekylvægt på 10.000. Aktiviteten af det således rensede enzym er forøget med 100 gange i forhold til det oprindelige filtrat, men ved pladeelektroforese iagttages også bånd af nogle få andre proteiner foruden af ct-amylaseenzymet - og en krystallisation af enzymet er endnu ikke opnået.

19 149157

Opfindelsen er illustreret nærmere i efterfølgende eksempler, hvori alle mængdeforhold er angivet efter vægt, med mindre andet er anført.

EKSEMPEL I

Et dyrkningsmedium indeholdende 3,0$ (efter vægt) opløselig stivelse, 0,5 hactotrypton, 1,0$ enzymekstrakt, 0,05$ calciumchlo-rid, 0,05$ magnesiumsulfat og 0,1$ kaliumdihydrogenphosphat indstilles på en pH-værdi på 7,0. En 50 ml portion af dette medium hlev hældt i en 500 ml konisk kolbe, som hlev steriliseret i 15 minutter ved 121°C. Let steriliserede medium blev podet med en stamme af Bacillus stearothermophilus ATCC nr. 31.195 (B-501) og dyrket under omrystning i 4 dage ved 60°0. Efter dyrkning blev de mikrobielle celler fracentrifugeret. Len enzymatiske aktivitet af filtratet pr. ml var 10 CPO a-amylase-enheder (bestemt ved.ovennævnte CPC-metode). Til dette filtrat sattes 2 rumfang acetone til udfældning af enzymet, som derefter opløstes i 0,5 molær tris-HCl-puffer (pH = 8,5). Lerefter førtes opløsningen gennem en kolonne med LEAE-cellulose, som var indstillet på ligevægt med samme puf fer opløsning. oC-amylaseenzymet blev ikke adsorberet på LEAE-cellulosen, medens de fleste andre proteiner og pigmenter blev adsorberet til LEAE-cellulosen og derved fjernet. Let således opnåede delvis raffinerede enzym blev først koncentreret og derefter ført gennem en kolonne af Sephadex 0-150. Enzymet var svagt adsorberet til Sephadex, og det blev elueret i en fraktion med molekylvægt under 10.000. Let således raffinerede enzym blev udvundet som et pulveriseret raffineret enzym ved frysetørring, og dets relative aktivitet var 200 OPC-enheder/ mg protein.

EKSEMPEL II

De to stammer (dvs. ATCC nr. 31.195 og 31.199) blev prøvet for bestemmelse af effekten af temperaturen og pH-værdien på <*-amyla-se-produktion. «tf-amylase-aktiviteten ved forsøget blev udtrykt som 149157 20 middelværdi af maksimal aktivitet af 3 kolber. Mediumsammensætningen for både forkulturen og hovedkulturen er den samme som vist i tabel 1 (et B-M-medium). Resultaterne af disse forsøg fremgår af tabel 5.

21 149157 o o o o o in » σ\ σι σι σι ιο Οι ο ο ο ο ο Ο CN -4· σι 1—I γΡ Ο γΗ -—* Λ ---- ^ Λ σι σι σι σ> m ιη η η <ί ^ u » ι—1 ιΡ *-ρ ‘— — Γ' — 33 ιο ιρ ιο η· ο Ο, οο » Η <f οι Η ι—i

Cl

Hl ο ο ο ο ο σ σ σι σι ιη -PI - οι οι οι οι σι η Η· Ή" ιο Μ Γ-* wwww rHrHwww 31 —- — ΌΙ Β3 01 a τρ ττ ο ο ιη ro ιη Tf ο HI ι—ι σι σ ο ιΡ σι οι ιη

a m η « η ρ τ* ο pH

II ι—I ι—i γΗ r—I

(Dl

(Dl -T

31 Ό pH I Ή

tH 4-1 -T — -T

gi H in σι σ σι σι m 31 3 - m m Tp tp io I I -P lO i—I i—I — — — tf I rP ^ w I C 33 °3i ,¾ a ro σι r~ m o PJ pH Tf ιο σι -ι ι h m ni m

p_*i 031 *H i—I rP

< W D

^ 01

Hl (D o o o oo o σ σ ro ro m 31 -P - σ σ Tf σ η η ># ί in -PI ·Η ΙΟ Η Η τ ^ - 31 > — — ΜΙ ·Η 33 0)1 -Ρ a in in η ο ro σι in (-^ ο a Μ ιη ιη τ' σι ιο ιο ιη gi < ο m οι ,—ι ιο σι τρ

(Dl Η Η γΗ ι—I

ΡΙ (ΡΙ 31 •Pi m οι οι η η 341 - σι σι τρ τρ (Dl in pH pH —' 4-il _ ^ 1| 11 jjj

Wl a ro ίο oo in

Tf oo o oo i—I ΙΟ lO Tf

lp »P

a —- gu o m o in in o in o in φο in m ιο e Tfininioio

Er ~ #

H

a tn σι en σι

U >P iP

U

ÉT rH rP

< σι σι ί 149157 22

Det fremgår af tabel 5, at optimale betingelser for ATCC nr. 31.195 var 60°C, pH = 7,0. Dyrkning ved 65°C var ikke hensigtsmæssig for fremstilling af en god efc-amylase-aktivitet. Ved 55°C til 60°C var den optimale pH-værdi 5,5 for ot-amylase-produktion for stammen ATCC nr. 31.199.

I tabellerne 6 og 7 er der henholdsvis (1) angivet ot-amylase-produktion for de to isolerede stammer under anvendelse af gentagne overførte skråkulturer (hver stamme yar overført 9-11 gange på 2 slags skråkulturmaterialer og derefter dyrket i flydende medium for at finde et egnet skråkulturmedium, som var i stand til at opretholde stabil produktion af a-amylase) og (2) bestemt effekten af mediets rumfang på α-amylase-produktionen (mediets rumfang i 500 ml kolber blev ændret for at undersøge virkningen af luftningen på produktionen af α-amylase for hver stamme).

23 149157 MEL· 6 _Kolbekultur ATCC Medier og antal Aktivitet, U/ml Betingelser

nr. overføringer (kulturtid, tiner) Temp., pH

_ °G_ 31.195 BD 1, 1 856 (90) 60 7,0

Bl),' 10 910 (43) » " NA*2, 10 140 (72) " " 31.199 BD, 2 iiS3 (44) 55 5,5 BD, 9 1013 (68) ” " NA, 9 775 (68) " *1 Skråkultur_mediim_for_screening *2 Næringsagar-skråkultur

Opløselig stivelse 1,0 # Bacto-pepton (Difco) 0,5#

Bacto-trypton (Difco) 0,5 # Bacto-kødekstrakt 0,3# Gærekstrakt 0,5 # (Difco)

Ca012*2H20 0,05# Agar 2»°^

MnCl2.4H20 .0,05# pH 7,2 kh2po4 0,1 #

Agar 2,0 # pH 5,0 24 149157 TABEL 7

Effekt_af_mediets_Toljmen<<>2§_g22lase-groduktior[ _Kolbekultur AICC Antal kultur- Betingelser Med.volumen Aktivitet, U/rnl nr. overføringer Temp. pH ml/500 ml (dyrkningstid,timer) _(°G) kolbe 30 150 (65) 40 127 (65) 31.195 BD-11 60 7,0 50 1.192 (41) 60 790 (41) 70 146 (65) 30 1.131 (44) 40 1.240 (44) 31.199 BD-2 55 5,5 50 1.163 (44) 60 1.054 (68) 70 1.224 (68)

Amylasen fra de omhandlede stammer (ATCC nr. 31.195 og 31.199) blev renset, og den herfra fremstillede «X-amylase blev sammenlignet med renset Thermamyl væske 60, fraktion AN 1005 ved den efterfølgende procedure.

cC^amylaseenzym.blev udfældet fra filtratet af dyrkningsvæsken fra AT0C nr. 31.195 og 31.199 eller fra Thermamyl a-amylase (to gange fortyndet) ved tilsætning af 2 rumfang kold acetone. Bundfaldet blev opsamlet ved centrifugering og opløst i 0,025 m calciumacetat opløsning. Opløselig stivelse blev sat til opløsningen for at opnå 20# stivelses-suspension. Denne suspension blev opvarmet til 85°C i 30 minutter, og bundfaldet blev fjernet ved centrifugering. Derpå blev opløsningen dialyseret over for 0,05 m tris-HCl-puffer (pH = 8,5) indeholdende 10 mM Ca++, idet pufferen blev udskiftet to gange. Dialysatet blev påført en kolonne med bære-cellulose, som var blevet indstillet 25 149157 på ligevagt med dialyse-pufferen. Q(-amylasen var ikke adsorberet af kolonnen og elueret med samme puffer, iraktionerne med a-amylase-aktivitet blev opsamlet, og «(-amylaseenzymet blev koncentreret ved fældning med acetone. cC-amylase-aktiviteten blev bestemt ved den ovenfor beskrevne CPC-metode. Rensningsprocessen fremgår af tabel 8.

26 149157 TABEL 8

Dyrkningsvæske

Rensnings- for rå enzym- Acetone- Varmebe- DEAE-a-amylase proces præparation udfældning handling cellulose ATCC nr. 31.195 Total aktivitet (CPC-enheder) 9.870 8.640 8.420 2,400

Total protein (mg) 7.990 2.016 1.450 15,7

Specifik aktivitet (Enh./mg) 1,2 4,3 5,8 152,9

Udbytte (f) 100 87,5 85,3 24,3 ATCO nr. 31.199 Total aktivitet (CPC-enheder) 9.910 8.210 7.214 2.310

Total protein (mg) 4.915 1.969 1.206 33

Specifik aktivitet (Enh./mg) 2,0 4,2 6,0 70

Udbytte (%) 100 82,8 72.8 23,3

Thermamyl

Total aktivitet (CPC-enheder) 12.100 9.400 9.540 2.410

Total protein (mg) 684 286 183 24

Specifik aktivitet (Enh./mg) 17,7 32,9 52,1 100,4

Udbytte (f>) 100 77,7 78,8 19,9 27 149157

Syre- og termostabiliteten af de delvist rensede cC-amylase-præparater fra ATCC nr. 31.195 og 31.199 og Thermamyl-a-amylase (indeholdende 7 enheder/ml) blev bestemt ved dyrkning i 60 minutter under følgende betingelser:

(a) * 90°C, pH = 6,0, Ca++ 0 eller 1 mM

(b) * 80°C, pH = 4,55, Ca++ 5 mM og (c) **85°C, pH = 4,55, Ca++ 1 mM eller 5 mM, 22,59^ opløselig stivelse.

*5 ml af α-amylase-præparatet blev dialyseret i et Visking 8/32 celluloserør over for 0,05 M calciumacetat-puffer (pH = 4,6- 6,0) indeholdende 0 - 5 mM calciumacetat i 3 timer ved 4°C, idet pufferen blev udskiftet to gange. Derpå blev 4 ml af dialysaterne indført i små prøverør eller reagensglas og dyrket ved den angivne temperatur på vandbad. Rørene blev hur.tigt afkølet på et isbad, og den resterende a-amylase-aktivitet blev bestemt.

**0,3 ml af en dialyseret enzymopløsning af a-amylase, 0,5 ml 1M caleiumacetatpuffer, 0,2 ml 0,5 M calciumchlorid og 3,0 ml 30# opløselig stivelsesopslaemning blev pipetteret ind i reagensglasset. Blandingen blev derefter dyrket ved 85°0 i 30 minutter under kontinuerlig omrøring. Reagensglassene blev hurtigt afkølet på isvand, og den resterende α-amylase-aktivitet blev bestemt efter dyrkning i 5, 10, 20, 30 og 60 minutter.

Den optimale pH-værdi og temperatur af ATCC nr. 31.195 og ATCC nr. 31.199 a-amylase og Thermamyl-a-amylase blev bestemt med den ovenfor beskrevne CPC-prøvemetode, dog med en ændring af pH-værdien eller temperaturen. Resultaterne fremgår af efterfølgende fig. 1 og 2. Den optimale pH-værdi for både ATCC nr. 31.195 og ATCC nr. 31.199 a-amylaser var 4,0 - 5,2, og for Thermamyl-a-amylase var den 4,5. Thermamyl-a-amylasen viste sig at opretholde en høj enzymatisk aktivitet over for et pH-område fra neutral til alkalisk.

De optimale temperaturer var 75°C for ATCC nr. 31.199 a-amylase, 80°c for ATCC nr. 31.195 a-amylase og 85°C for Thermamyl-a-amylase .

28 149157 amylase. Forholdet mellem den enzymatiske aktivitet og reaktionstemperaturen var tilnærmelsesvis de samme for ATCC nr. 31.195 og ATCC nr. 31.199 α-amylaser, men var meget forskellig for Thermamyl-a-amylase . Det viste sig, at α-amylase-aktiviteten for Thermamyl-cc-amylase var forøget med 20 - 30 pot., når den dyrkedes ved 85°0 og en pH-værdi på 6,0 i nærværelse af stivelse og Ca**. Dette faktum kan forklare forskellen af det enzymatiske aktivitets-reaktionstemperatur-forhold mellem ATCC nr. 31.195 og ATCC nr. 31.199 α-amylaser og Thermamyl-a-amylase.

Pig, 3 illustrerer inaktiveringskurver for ATCC nr. 31.195 og ATCC nr. 31.199 a-amylase og Thermamyl-a-amylase, når de "blev dyrket ved 80°C og pH = 4,55 i nærværelse af en 5 mM CaClg. ATCC nr.

31.199 α-amylase viste den højeste thermostabilitet efterfulgt af ATCC nr. 31.195 α-amylase. Thermamyl-a-amylase var betydelig dårligere end ATCC nr. 31.195 og ATCC nr. 31.199 α-amylaser i henseende til thermostabilitet under disse betingelser.

Pig. 4 illustrerer inaktiveringskurveme for ATCC nr. 31.195 og ATCC nr. 31.199 α-amylaser, Thermamyl-a-amylase og Bacillus stearothermophilus α-amylase beskrevet af Ogasawara et al. (J· Biochem., 67, 65, 77, 83 (1970)), når de blev dyrket ved 90°C og pH =6,0 i fraværelse af Ca4^ (dyrkningsbetingelserne beskrevet af Ogasawara et al. var de samme som anvendt ved denne test).

Som det fremgår af fig. 4, udviser oi«-amylaser fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse meget højere thermostabilitet end både Thermamyl-°C-amylase og °t-amylase ifølge Ogasawara et al.

(selv om ^-amylaserne også ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstilles med organismer tilhørende arten Bacillus stearothermophilus ).

Pig. 5 illustrerer inaktiveringskurver for ATCC nr. 31.195 og ATCC nr. 31.199 a-amylaser og Thermamyl-a-amylase under de samme betingelser som beskrevet for fig. 4 (dvs. 90°C og pH = 6,0), idet dog mediet indeholdt 1 mM Ca++. «C-amylaserne fremstillet ifølge opfindelsen udviste stadig højere thermostabilitet end Thermamy1-ot-amy1ase, men forskellen var ikke så stor som ved til- 29 149157 sætning af Ca++. Heraf synes det at fremgå, at ATCC nr. 31.195 og ATCC nr. 31.199 Or-amylase binder Ca++ mere fast end Thermamyl-<X.-amylase, hvorfor deres behov for Ca++ til stabilisering af proteinmolekylet er mindre end for Thermamyl-cC-amylase.

Figurerne 6 og 7 illustrerer inaktiveringskurver for ATCC nr.

31.195 og ATCC nr. 31.199 α-amylaser og Thermamyl-a-amylase, dyrket ved 85°C og en pH-værdi på 4»55 i nærværelse af opløselig stivelse (22,5$, d.s.) og Ca++ (1 mM Ca++ som illustreret i fig.

6 og 5 mM ATCC Ca++ som illustreret i fig. 7). ATCC nr. 31.195 og nr. 31.199 o(-amylaser udviste højere termostabilitet end Therma-myl-<x-amylase under betingelserne for både fig. 6 og 7). Da betingelserne ifølge ovennævnte prøver, illustreret i fig. 6 og 7, svarer til manqe i praksis anvendte betingelser, vil det kunne ventes, at ot-amylaserne fremstillet ifølge opfindelsen udviser højere termostabilitet ved sure pH-værdier ved den industrielle anvendelse og omdannelse af stivelse.

Molekylvægtene for både ATCC nr. 31.195 og ATCC nr. 31.199 a-amylaser blev bestemt til 96.000, målt ved en metode af Weber og Osbom, <T. Biol. Chem., 244, 1406 (1969) ved hjælp af SDS-plade-elektrophorese. Mærkeproteinerne var albumin (MV 67.000), ovalbumin (MV 45.000), chymotrypsin (MV 25.000) og cytochrome C (MV 12.500). Positionen af e(.-amylaser fremstillet ifølge opfindelsen på polyacrylamidgelen blev bestemt ved anbringelse af gelen på en amylose-Azure-agarplade og dyrkning ved 37 °C. Resultaterne af denne prøve fremgår af fig. 8.

Værdien på 96.000 for molekylvægten af ot-amylaser fremstillet i-følge opfindelsen er meget større end for Bacillus stearothermo-philus «C-amylaser rapporteret af Ogasawara et al., J. Biochem., 67, 65, 77, 83 (1970.) (molvægt angivet til 48.000) og af Manning et al., J. Biol. Chem., 236 , 2952, 2958, 2962 (1961) (molvægt angivet til 15.600).

149157 30

De to isolerede stammer blev prøvet for proteaseaktivitet, idet tilstedeværelsen af protease eller proteolytisk enzym i α-amylase enzymerne har tilbøjelighed til at reagere med forskellige proteinstoffer i mange stivelsesholdige materialer til produktion af vandopløselige proteinhydrolysater, såsom aminosyrer. Af denne grund er tilstedeværelsen af proteaseenzym-forureningen i <x- amylaseenzymerne skadelig for effektiv hydrolyse af stivelses-materialerne. Proteaseaktiviteterne i de α-amylaseenzymer, som er produceret ud fra de to isolerede stammer, blev bestemt fra acetone-bundfaldene af dyrkningsfiltrater under maksimal a-amy-laseproduktion véd en modificeret Anson-Hagiwara-metode.

De opnåede resultater blev sammenlignet med enzympræparater af Thermamyl-oc-amylase og en CPO-bakteriel a-amylase. Som vist i det efterfølgende indeholdt Thermamyl og dyrkningsfiltrater af isolerede thermophile strålesvampe store mængder protease. På den anden side producerede de termostabile a-amylase-producerende stammer ATCC nr. 31.195 og 31.199 ingen væsentlige mængder protease.

PROTEASE-AKTIVITET

A3?

d-AMYLASE

Enzym Protease/oc-amylase-forhold ATCC nr. 31.195 0,06 ATOC nr. 31.199 0,06 CPC-BM 6,2

Thermamyl 60 36,5 B-1721 109,0 ^Thermophil strålesvamp isoleret ved 55°C og pH = 7,0.

149157 31

Af de ovenfor anførte resultater fremgår det, at c(.-amylaserne fremstillet ifølge opfindelsen ikke indeholder væsentlige mængder proteaseaktivitet, dvs. at protease/oL-amylase-forholdet er mindre end 3 og sædvanligvis mindre end 1. Dette er en væsentlig fordel, når man anvender enzymet til hydrolyse af stivelsesmaterialer.

oC-amylaseenzymerne fremstillet ifølge opfiiidelsen anvendes til smeltning eller nedbrydning af stivelse ved fremstilling af sti-velseshydrolysater med højt D.E.

30 gram kartoffelstivelse blev suspenderet i 70 ml vand, 75 mg calciumchlorid-dihydrat blev tilsat, og pH-værdien blev indstillet på 4,5. Til denne opslæmning sattes 50 CPC-enheder af det raffinerede pulverformige enzym fra eksempel II til smeltning af stivelsen ved 85°0 i 30 minutter. D.E. af den flydende opløsning var ca. 21, og pH-værdien var ‘4,3. Efter at temperaturen var faldet til 60°C, tilsattes et gluco-amylase-enzym fra Aspergillus niger, og opløsningen blev forsukret og omdannet ved 60°C i 48 timer. D.E, af den forsukrede og omdannede opløsning var 97,5, og dextroseindholdet var 96,0 pct.

Som det fremgår af ovennævnte vil <<-amylaseenzymet fremstillet i-følge opfindelsen hydrolysere og smelte eller flydendegøre stivelsen. Enzymet kan anvendes til omdannelse af opløselig stivelse, a-mylose, amylopectin, glycogen og lignende produkter for kraftigt at reducere viskositeten af disse substrater. Når enzymerne fremstillet ifølge opfindelsen reagerer med opløselig stivelse ved pH = 4,5 og 60°C, forsvinder stivelses-iod-reaktionen ved en hydrolysegrad (D.E.) på ca. 15, og den endelige grad er et D.E. på 32 - 36. Sukkerstofferne i det hydrolyserede produkt blev analyseret som maltose, maltotriose, maltotetrose og andre maltooligosaccharider sammen med en lille mængde glucose. Mutarotationen af de reducerede sukkerprodukter har vist sig at være negativ. I overensstemmelse hermed er enzymerne fremstillet ifølge opfindelsen oC-amyla-seenzymer af den smeltende type, og de hydrolyserer frit ¢(,-1,4-bindingerne i stivelsen.

149157 32

Forholdet mellem smeltning under anvendelse af enzymet fremstillet ifølge opfindelsen (relativ værdi) og pH-værdien under driften er vist i fig. 9 og sat i forhold til de kendte «.^.-amylaseenzymer fra Bacillus stearothermophilus. Som vist i fig. 9 er den optimale pH-værdi for enzymerne fremstillet ifølge opfindelsen 4,2 - 5,2. Enzymerne fremstillet ifølge opfindelsen mister ikke deres aktivitet, selv om de henstilles i 24 timer ved stuetemperatur ved en pH-værdi på 3-11.

Forholdet mellem smeltning af enzymerne fremstillet ifølge opfindelsen (relativ værdi) og driftstemperaturen er vist i fig. 10 og sammenlignet med cC-amylase afledt af Bacillus stearothermophilus beskrevet af Ogasawara et al. Som vist i fig. 10 er den foretrukne temperatur ved anvendelsen af enzymet ca. 80°C.

Det fremgår af det ovenfor anførte, at de omhandlede <fc-amylase-enzymer kan anvendes til nedbrydning, smeltning eller omdannelse af stivelse i stivelsesnedbrydningsindustrien, til fjernel-af appretur i tekstilindustrien og som additiver i vaskemidler svarende til den konventionelle anvendelse af bakterielle oO-amy-laseenzymer.

De omhandlede oc-amylaseenzymer er særligt egeride til smeltning og omdannelse af stivelse ved fremstilling af malto-dextriner til efterfølgende produktion af dextrose med glucoamylase, fordi isomerisation af den endestillede gruppe i molekylerne kan undgås, fordi enzymet effektivt kan anvendes ved surt pH (dvs. ved en pH-værdi på 4,5 - 5,0), hvorved udbyttet af dextrose forøges. Anvendelsen af disse enzymer reducerer også ionbytterbe-lastningen ved raffineringen, fordi der ikke kræves nogen pH-indstilling forud for sukkerdannelsen og omdannelsen med gluco-amylaseenzym.

33 149157

De omhandlede et-arnylaseenzymer kan anvendes til omdannelse af stivelse til et stivelseshydrolysat, hvor den resterende ikke-omsatte stivelse forbliver i granulær form. Disse processer er beskrevet og beskyttet i USA-patenterne nr. 3.922.196, 3.922.197, 3.922.198, 3.922.199, 3,922.200 og 3.922.201, alle udstedt 25. november 1975. Ved disse processer omhandlende granular stivelse udføres i det mindste den indledende opløseliggørelse ved forholdsvis lave temperaturer, dvs. under den begyndende gelatineringstempe-ratur for stivelse op til den virkelige begyndende gelatineringstemperatur for stivelse. Ved foretrukne udførelsesformer for disse kendte processer anvendes glucoamylaseenzym sammen med <A-amyiaseenzym i det begyndende opløseliggørende trin. De omhandlede enzymer er særligt egnede for denne proces, fordi deres optimale pH-område er forligeligt med glucoamylase.

De omhandlede enzymer kan man'endvidere anvende i de processer, der er omtalt i beskrivelsen til USA-patenterne nr. 3.853.706 fra 10. december 1974 og 3 849 194 fra 19. november 1974.

Enzymerne kan desuden anvendes i den proces, der er beskrevet i USA-patent nr. 3.912.590 fra 14. oktober 1975. Anvendelsen af de omhandlede <£-amylaseenzymer i forbindelse med denne sidstnævnte proces udføres ved, at en opslæmning af stivelse, såsom majsstivelse, indeholdende mindst 25 vægtprocent stivelsesmateriale behandles med cfc-amylaseenzymet ved en temperatur på 100°C til 115°C, fortrinsvis fra 105°C til 110°C i 1 - 60 minutter og fortrinsvis 5-10 minutter til opløseliggørelse af stivelsen, hvorefter temperaturen nedsættes til 80 - 100°C, fortrinsvis til 90 - 100°C, når viskositeten af den fortyndede opløsning er mindre end 300 cP, målt ved 95°C. Den store fordel ved at gennemføre dette temperaturforløb med o(.-amylaseenzymerne fremstillet ifølge opfindelsen består deri, at en lavere pH-værdi kan anvendes, således at en ringe eller ingen pH-indstilling er nødvendig i en efterfølgende forsukringsprocedure med glucoamylase.

Den særlig foretrukne anvendelse af «Vamylaseenzymerne til omdannelse af stivelse består i at underkaste en stiveIsesopslæm- 149157 34 ning påvirkning af enzymet ved en pH-værdi fra 3,5 til 6,5, fortrinsvis fra 4 til 5, ved en temperatur mellem 50 og 100°C, fortrinsvis mellem 60 og 95°C, til opløseliggørelse af stivelsen.

For så vidt angår den ovenfor beskrevne proces med hydrolyse af granulaer stivelse benyttes temperaturer fra den normale begyndende gelatineringstemperatur til den virkelige begyndende gelatineringstemperatur for stivelse, dvs. cirka 60°C for majsstivelse. I tilfælde af en direkte opløseliggørelsesprocedure bliver en stivelsesopslæmning indeholdende enzymet fortrinsvis opvarmet (f.eks. ved hjælp af en jet-opvarmning) til en temperatur fra 85 til 95°C og derover, fortrinsvis fra 90 til 92°C, til opløseliggørelse af stivelsen. Efter den indledende opløseliggørelse (i henhold til hydrolysen af granulær stivelse) eller smeltning, underkastes opslæmningen fortrinsvis en "varm-chok"-behandling ved en temperatur over 100°C, fortrinsvis mellem 110 og 150°C, for at smelte ethvert resterende stivelsegranulat.

Derefter afkøles den smeltede eller flydendegjorte stivelse, og den behandles fortrinsvis med mere a-amylase, alene eller i kombination med andre enzymer, såsom glucoamylase, pullulanase, glu-coseisomerase, i rækkefølge eller i kombination. Hvis o\-amyla-se anvendes alene i andet enzymtrin, holdes temperaturen fortrinsvis mellem 80 og 90°C, især fortrinsvis cirka 85°C, der er den optimale temperatur for enzymerne fremstillet ifølge opfindelsen. Hvis andre enzymer findes, såsom glucoamylase og/eller glucoseisomera.se, skal temperaturen være noget lavere, nemlig 55-75°C, fortrinsvis ca. 60°C.

Som konklusion kan anføres, at (Λ-amylaseenzymerne fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen klart adskiller sig fra hidtil kendte <*-amylaser, som erdannet af dyr, planter, gær, imperfekte fungi og svampe, derved af disse kendte enzymer har en så lav varmestabilitet, at de helt mister deres aktivitet ved en behandling i 5 minutter ved 70°C og en pH-værdi på 6,0.

Ved sammenligning af varmestabiliteten af “C-amylaserne fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse som vist i fig. 12 (de data, som fig. 12 er baseret på, er i det væsentlige de samme som for fig. 6). er det klart, at øC-amylaseenzymerne fremstillet ifølge opfindelsen er langt bedre i henseende til syre- og varmestabilitet· end de kendte oC-amylaseenzymer. Det fremgår endvidere 35 149157 af fig. 12, at ot-amylaseenzymerne fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse er i stand til at opretholde mindst 70 pct. og fortrinsvis mindst 90 pct. af deres begyndelsesaktivitet, når de holdes ved 90°C og en pH-værdi på 6,0 i 10 minutter i fraværelse af tilsat calciumion samt er i stand til at opretholde mindst ca.

50 pct. af deres begyndelses o^-amylase-aktivitet, når de holdes ved 90°C og en pH-værdi på 6,0 i 60 minutter. Som det fremgår af fig. 11, er det klart, at <*.-amylaseenzymerne er karakteristiske ved, at de er i stand til at opretholde mindst ca. 50 pct. af deres oprindelige <£;amy læseaktivitet ved en temperatur på 80°C og en pH-værdi på 4,55 i nærværelse af 5 mM calciumion i 19 minutter. .

Tabel 9 viser forholdet mellem de omhandlede o^-amylaseenzymer og Λ-amylaseenzymerne Bacillus subtilis og Bacillus lichenifor-mis, der anvendes industrielt, og enzymerne fra Bacillus stea-rothermophilus, der er beskrevet i litteraturen. De er sammenlignet i henseende til deres optimale pH-værdi under drift, temperaturen og molekylvægten. Fig. 11 og 12 angiver deres egenskaber i henseende til varme- og syrestabilitet.

149157 36 TABEL 9

Optimal pH-værdi Passende drifts-Enzymer prøvet under drift temperatur Molekylvægt c£-amylaseenzymer fremstillet ifølge 0 opfindelsen 4,0 - 5,2 80 C 96.000 ot-amylase af o c B. subtilis1 4,5-6,5 45 - 60 C 49.0005 oC-amylase af ? 0 _ B. licheniformis^ 5,0 - 9,0 76 - 78 C 22.5005 oC-amylase af B. stearothermophilus λ (a) Ogawara et.al. 5,0 - 6,0 65 - 70°C 48.000 (b) Campbell et al.3 4,8 55 - 70°C 15,-6004 i

Ogasawara et.al., J. Biochem. 67, 65 (1970) ^Shigemasa Saito, ABB, 155. 290 (1973).

3Campbell et al., J. Biol. Chem., 256, 2958 (1961) 4Campbell et al., J. Biol. Chem., 526. 2958 (1961).

^Britisk patentskrift angiver molekylvægten af cCramylase fra B. licheniformis til at være 18.000 - 20.000 og B. s&btilis 96.000.

Når (Λ-amylaseenzymerne fremstillet ifølge opfindelsen sammenlignes med λ-amylaseenzymerne fra Bacillus subtilis, udviser disse en betydelig forskel, som det fremgår, af figurerne 9 og 11, for så vidt angår deres optimale pH-værdi, driftstemperatur, molekylvægten og varme- og syrestabiliteten. Dette angiver, at dette enzym er temmelig forskelligt fra <*-amylasen af Bacillus subtilis.

Når ø(-amylaseenzymerne fremstillet ifølge opfindelsen og ov-amyla-seenzymerne for Bacillus licheniformis sammenlignes, er de be-