SI7710998A8 - Postopek za pripravo alfa-amilaznega encima, odpornega na toploto in kisline - Google Patents

Description

Oblast tehnike

Pronalazak pripada oblasti proizvodnje enzlma, posebno alfaamllaznog enzlma otpornog na toplotu I kiseline, koji se može koristiti za hldrolizu, sečnjavanje i/ili konverziju materijala koji sadrži škrob u hidrollzate škroba.

Prema medjunarodnoj klasifikaciji patenata, pronalazak je svrstan u C 07G 7/02; A 61K 37/48.

Tehnlčkl problem

Preparati alfa-amilaznih enzima koriste se za hldrolizu, stečnjavanje i/ili konverziju različitih materijala koji sadrže škrob u hidrollzate škroba a koriste se I u formulacijama deterdženata. Kada se alfa-amilazni enziml koriste za tretiranje materijala koji sadrže škrob, oni se koriste kao početna faza u proizvodnji večeg broja sintetičkih materijala na bazi hidrollzata škroba kao što su malto-dekstrlnl, kukuruzni sirupi, dekstroza, levuloza, maltoza Itd.

Alfa-amilazni enzim hidroiizuje škrobne molekule tako što Ih rasklda u različite fragmente Intermedijame molekulske težine poznate kao malto-dekstrini. Malto-dekstrini se kasnlje treti raju sa jednim iii više dopunskih enzimskih preparata uključujučl gluko-amilazu, beta-amilazu i izomerazu glukoze sa ciljem da se proizvede željen! finalni proizvod. Alternativno se može uvesti vedi broj ovih enzimskih preparata u suspenziju skrobnog materijala tako da se direktno proizvodi željeni hidrolizat škroba. Alfa-amilazni enzimi su pristupačni iz različitih izvora. Mnogi alfa-amilazni enzimi proizvode se iz bakterijskih izvora kao što su Caillus subtillis, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermpohilus i drugi koji se kultivišu u odgovarajučoj podloži za kulturu, pa se čelije koje se odatie proizvode potom razaraju i enzimski peparat se posle toga odvaja od čorbe i prečiščava se.

Mnogi komercijalno pristupačni alfa-amilazni enzimi koji se danas proizvode izvode se iz Bacillus subtillis mikroorganizama. Kada se ovi enzimi koriste za prevodjenje škroba u hidrollzate sklorba, oni če ugiavnom imati optimalni temperatrnl interval od oko 80°C do oko 85°C, i optimalen pH oko 6.0. Tempraturni uslovi ioptimalni pH interval za efikasno koriščenje inzima imaju dva nedostatka. Prvo, škrob se prevodi sa enzimom na pH oko 6 i na temperaturi od oko 80°C do oko 85°C, i u tim uslovima deo redukujučih krajnjih grupa škroba se izomerlzuje, pa se u kasnijem procesu konverzije proizvodi maltuloza koja smanjuje stepen izolovanja željenog proizvoda, na primer, dekstroze, levuloze iii maltoze. Drugo, optimalna pH vrednost glukoamllaze koja se koristi u konverziji u procesu saharifikacije je ugiavnom oko 4,5 u slučaju enzima Aspergillus nlger a pH vrednost je oko 5.0 u slučaju enzima tipa Rhizopus. Zbog toga je utvrdjeno, posle završavanja faze stečnjavanja korščenjem alfa-amilaznog enzima, da je neophodno da se pH vrednost podesi od oko 6 na 4,5 iii 5,0. Ovo podešavanje pH vrednosti povečava koncentraciju jona pa se zbog toga povečava opterečenje i kasnlji troškovi rafinisanja koriščenjem jonoizmenjivačkih smola koje se koriste u prečiščevanju finalnog proizvoda.

Imajuči u vidu gore navedene probleme, bilo je neophodno proizvesti alfa-amilazni enzim koji če biti otporan na toplotu i kiseline.

Pronalaskom se rešava problem proizvodnje alfa-amilaznog enzima otpornog na toplotu i kiseline, kultlvisanjem mikroorganizma soja odabranog u grupi koja se naročito sastoji od Bacillus stearothetmophilus ATCC brojevi: 31, 195, 31, 196, 31, 197, 31, 198 i 31, 199, kao i njihovih varijaclja, mutanata i pod-mutanata ovih mutanata kultlvisanjem u klutivacionoj sredini koja sadrži aslmilacione izvore ugljenika, i azota i koja uključuje kukuruzni škrob, kukurznu kvasinu, farmamediu, i neorganske soli kao što su kalcijum hlorid, magenzijum sulfat, mangan hlorid i natrijum hlorid, pri pH od 5 do 9 tokom perioda od jednog do pet dana.

Stanje tehnike

Poslednjih godina pronadjeni su mnogi različiti toplotno stabilni afla-amilazni enzimi. Primeri takvih toplotno stabilnih alfaamilaznih enzima uključuju one koji se proizvode iz Bacillus stearothermophilis kao što su opisali Ogasawara et al., J. Biol. Chem., 67, 65,77 i 83 (1970); G.B. Manning i L.L Campbell, J. Biol. Chem., 236, 2952, 2958 i 2962 (1961); S. L Pfueller and W.H. Elliot, J. Biol. Chem., 244, 48 (1969).

Još skorije, postali su pristupačni alfa-amilazni enzimi koji imaju dobru toplotnu stabilnost u neutralnim i slabo alkalnim rastvorima. Ovakvi alfa-amilazni enzimi koji su stabilni na toploti i prema alkalijama prodaju se na tržištu pod imenom Thermamyl”. Proizvode se kultivisanjem mikroorganizama vrste Bacillus licheniformis, kao što je opisano u Britanskoj patentnoj prijavi br. 1,296, 839, objavljenoj 22. novembra 1972., Madesen et al., Die Starke, 25, 304, 305 i 308 (1973) i Narimasa Saito, ABB, 155, 290 (1973).

Dok alfa-amilazni enzimi proizvedeni iz Bacillus licheniformis imaju relativno dobru otplotnu stabilnost u neutralnim i slabo alkalnim rastvorima, oni nemaju podesnu stabilnost pod kiseiim uslovima da bi njihovo koriščenje bilo ekonomično sa komercijalnog stanovišta.

Opis rešen|a tehničkog problema sa primerima Izvodjenja

Kao što je več pomenuto, pronalazak se odnosi na postupak za dobivanje alfa-amilaznog enzima otpornog na toplotu i kiseline, odnosno alfa-amilaznog enzima kod koga su eliminisani nedostaci do sada pristupačnih enzima.

Posebno, alfa-amilazni enzimi dobiveni postupkom prema ovom pronalasku se karakterišu time što su (1) sposobni da zadrže najmanje 70% od svoje početne alfa-amilazne aktivnosti kada se drže na 90°C i pri pH vrednosti od oko 10 minuta u odsustvu dodatog kalcijumovog jona; (2) sposobni su da zadrže najmanje oko 50% od njihove početne alfa-amilazne aktivnosti kada se drže na 90°C. na pH 6.0 u toku 60 minuta u odsustvu dodanog kalcijumovog jona i (3) sposobni su da zadrže najmanje oko 50% od njihove početne alfa-amilazne aktivnosti na temperaturi od 80°C i na pH 4.55 u prisustvu 5 mM kalcijumovog jona u toku 10 minuta. Enzimi prema pronalasku takodje su sposobni da zadrže najmanje oko 50% od njihove početne aktivnsti na temperaturi od 85°C i na pH 4.55 u prisustvu 5 mM kalcijumovog jona i 22.5 tež. procenta škroba, d.s. Enzimi prema pronalasku se dalje karakterišu time što su sposobni da zadrže najmanje oko 95% od njihove početne alfaamilazne aktivnosti na temperaturi od 80°C. i na pH u intervalu od oko 4 do oko 6.0. Ovi enzimi se poželjno izvode iz Baclllus mikroorganizma i još poželjnije iz Baclllus stearothermophilus mikroorganizma.

Alfa-amilazni enzimi prema pronalasku imaju molekulsku težlnu najmanje 90,000 kao što je odredjeno SDS disk elektroforezom i karakterišu se time što su praktično slobodni od proteazno aktivnosti, n.pr., oni uglavnom imaju proteaza/alfa-amilaznl odnos manj! od 3, i poželjno manjl od 1.

Novi alfa-amilazni enzimi prema pronalasku proizvode se kultivisanjem u podesnoj podloži mikroorganizma Bacillus stearothermophilus, poželjno kultivisanjem soja izabranog iz grupe koja sadrži Bicillus stearothermpohilus ATCC No. 31,195 31,196, 31,197, 31,198, 31,199, njihovih varianata, mutanata i sub-mutanata, i posle toga izolovanjem proizvedenog alfaamilaznog enzima.

Sl. 1 ilustruje odnos optimalnog pH dva enzima iz pronalaska sa Thermamyl alfa-amilazom.

Si. 2 ilustruje odnos optimalne temperature dva enzima iz pronalaska sa Thermamy1 alfa-amilazom.

Sl. 3 ilustruje odnos termostabilnosti dva enzima iz pronalaska sa Thermamyl alfa-amilazom na 80°C, pH 4.55 sa 5 mM Ca + +.

Sl. 4 ilustruje odnos termosabilnosti dva enzima iz pronalaska sa Thermymyl alfa-amilazom na 90°C i na pH 6.0.

Sl. 5 uporedjuje termostabilnost dva enzima iz pronalaska sa Thermamyl alfa-amilazom na 90°C, na pH 6.0 i u prisustvu 1mM Ca+ +.

Sl. 6 ilustruje odnos termostabilnosti dva enzima iz sadašnjeg pronalaska sa Thermamylom na 85°C i na pH 4.55 u prisustvu 22.5% škroba, d.s.

Sl. 7 ilustruje odnos termostabilnosti dva enzima iz sadašnjeg pronalaska sa Thermamy1 alfa-amilazom na 85°C., na pH 4.55 u prisustvu 22.5% škroba i 5 mM cA+ +.

Sl. 8 ilustruje grafički odredjivanje molekulske težine enzima iz pronalaska pomoču SDS disk eletroforeze.

Sl. 9. ilustruje odnos izmedju pH i enzimske aktivnosti jednog od enzima iz pronalaska sa predjašnjim alfa-amilazama izvedenim iz Bacillus stearothermophilus mikroorganizmima.

Sl. 10 ilustruje odnos izmedju temperature enzima iz sadašnjeg pronalaska sa alfa-amilazom iz prednjašnje nauke izvedenom Iz Bacillus stearothermophilus.

Sl. 11 ilustruje deaktivacione krive enzime iz sadašnjeg pronalaska sa alfa-amilazom Iz predjašnje nauke izvedenom Iz Bacillus subtilis I sa alfa-amilazom izvedenom iz Bacillus licheniformis kada su tretirane na 80°C i na pH 4.5 u prisustvu 5

MM kalcijumovog jona.

Sl. 12 ilustruje dekativvacione krive enzima iz sadašnjeg pronalaska sa alfa-amilazama iz predjašnje nauke izvedenim Iz Bacillus licheniformis i Bacillus stearothermophilus kada su tretirani na 90°C. i na pH 6.o bez kalcijumovog Jona.

Proizvodnja i termička stabilnost alfa-amilaze iz raznih vrsta mikroorganizama testirani su pod različitim uslovima kao što su temperatura rasta (37°C, 45°C, 55°C i 70°C), pH (5.0 i 7.0) I podloge. Nadjeno je da termofilne zrakaste gljivice Izolovane na 55°C i termofilne gljivice izolovane na 45°C proizvode termolabilnu alfa-amilazu u visokim prinosima, dok termofilne bakterije na 70°C proizvode termostabilnu alfa-amilazu u niškim prinosima. Na osnovu ovih početnih proučevanja, testiranje mikroorganizama za alfa-amilazu koja je termostabllna I otporna prema kiselinama vršeno je kultivisanjem na 55°C i 70°C. Sakupljeno je ukupno 550 uzoraka mikrobnih izvora sa različitih lokacija uključujuči zemljište, vodu iz toplih potoka, djubrlvo, itd. Termostabilnost i otpornost prema kiselinama odredjenl su testiranjem alfa-amilaze aktivnosti pre j posle toplotnog tretiranja filtrata kluture na 80°C i na pH 5.0 u toku 10 minuta u prisustvu 10 mM kalcijumovog jona.

Alfa-amilazna aktivnost odredjenaja na sledeči način:

Pravi se 0.2% rastvor rastvornog škroba jednom nedeljno na sledeči način: 200 mg rastvornog škroba u približno 50 ml. 0.2M acetatnog pufera (pH 4.5) koji sadrži 0.013M CaCl₂.2H₂O zagreva se na 100°C u ključaloj vodi i dobiveni rastvor se dopuni na 100 ml sa istim puferom. Epruveta koja sadrži 0.1 ml. enzlmskog rastvora i 0.3 ml 0.2% rastvora rastvornog škroba inkubira se 5 minuta na 60°C. Reakcija se zaustavi dodavanjem 1.0 ml. 0.5N sirčetne kiseline. Pošto se doda 3.0 ml. 0.015% rastvora joda pa se meša, očita se optička gustina na 700 mu naspram H₂O. Epruveta bez enzima služi kao kontrola i njena optička gustina na 700 mu označuje se kao OD^. Jedna jedinica enzima bila je ona količina koja katalizuje 10% smanjivanje prave vrednosti u minutu pod uslovima koji su opisani gore.

NMLjedinlce = (OD^- OD) x 100/ OD^ x 5x 10

Izuzev gde je rečeno suprotno, navedena alfa-amilazna aktivnost odredjena je gornjim postupkom (NMLjedinice). Kada je alfa-amilazna aktivnost označena u CPC alfa-amilaznim jedinicama, CPCjedinice su približno 1/140 deo NML jedinica. CPC alfa-amllazne jedlnice aktivnosti odredjene su sledečim postupkom:

Jedan miiilltar pravilno razblaženog enzimskog rastvora doda se na 10 miiilitara 1% rastvornog škroba - 0.03 M puferskog rastvora sirčetne kiseline (pH 6.0) i reakcija se vrši 10 minuta na 60°C. Jedan mililiter reakcionog rastvora stavi se u graduisani balon od 100 ml. koji sadrži 50 ml 0.02N hlorovodonične kiseline, i pošto se u ovo doda 3 mililitra 0.05% jodnog rastvora, ukupna zapremina se dopuni na 100 ml. dodavanjem vode. Plava boja koja se razvija meri se na apsorbanciju na 620 mu. Količina enzima koja je potrebna za raspadanje 10 mg. škroba u jednom minutu definiše se kao - CPC jedinica.

CPCJedlnlca = θ₀’Οθ/θ₀ x50/10x10x (faktor razblaienja) gde jo

D_q = apeorbancija kontrolnog rastvora (dodaje se voda umesto anzimskog rastvora)

Dg = apeorbancija reakcionog rastvora

Uslovl kuttivlsanja i podloge koje se koriste u proučevanju testiranja sumarizovani su u Tablici 1.

Rezultati prvog i drugog testiranja navedeni su u Tablici 2.

Tablloa 1

F

Ualovl kultlvlnanja 1 pofllorco

Unlovl	Kultura na koooj ploČiciA2'	Kultura	/a1) u balonu''
	Kultura	na pločici^1^
i?) *·-	55°O	pH 5	55°O, ρΠ 5	50°C,	pil 6
Λ)	55%	pH 7	55°C, pil ?	50°0,	pH 7
c)	70°C,	pH 5	70% pH 5	60°C,	pil 6
d)	7Q°q,	pH 7	70°G, pH 7	60°0,	pil 7

(2) Podloga ga (3) Pocllop;» zn (1) Podloga ga

(B-B)			<B-D)	(II-II)
Auiilopoktin	0.02%	Rastvorni okrob	1.0%	3.0%
(lIlk)2IlP04	0.025%	Bdkto-tripton	0.5%	0.5%
		(Difco)
Ekutrakt	0.025%
kvaoca		Ekstrakt kvouca	0.5%	1.0%
Ilo-cltrat	0.01%
		CaCl2’2U20	0.05%	0.05%
Η,-00„·?Η„0	0.05%
*r c.		KnOL/AHgO	0.05%	«e»
KOI	0.15%
		ME304*7U2 0	m	0.05%

ϋπ01^·2„ο0

0.05%

2.0tf ^MI2^F02|.

0.1%

0.1 J

Afjur

Argt

2.0% φ

Μ

U

Η •Η

R ci ο

.μ

CJ η

φ §

«d ο

h

Ρ (d •r.

•Η ϋ

&

S α

a

8θ

CU

I ο

Ο Η

Ο θ ηηο

I

Ο Η Ο Β Ο X *3

Η

I

Ο Η

Ο 0 1Λ\ I 3 (Mrl I 0 ο\ 03 γΗ *%

Μ £

ω

Si

Η β) Ο ττ t: ο

H «

I

Ο

Μ ^,Η d ial

Ο <3 Η ϊ> W Ο 3 Η γΙΟ ΟΟ

4-0 ΟΟ rc

Ο CJ C1

ICO <fr Η *ί* ωο σ»ο υ

i •Η •Π»

t) d ω ω •Ρ το ω ο (ό ω

Λ1

Ρ rc rtO N m ft

Ο ο

ιη ιτ\ mo Ο Ο

ΟΟ d-Ο Ο Ο rc ο ο rcrc m

VDO ΙΛ4· Η

ΟΟ ΟΟ o rc 00

OH Ο Ο

OC Ο ic

Ο •ο d Η το rt Ο ο α +5

Λ1 0J «3 6Λ ft CJ (U υ

i

Ή το

Η tod

I» « « .!’ το ω ο « w ’3 GA rtCI ν ω d ο > το ο •Η το rt ο ο « Ψ>

Λ4 σ\ W Ο ft t>

Φ το •Η το rt Ο Φ η <Ρ

Λ< Η d dw ω φ

I» ο

Φ το το Ο Η ω h _Λ ω νο p cj Λ) rc fu e ft pH

O I • Φ ic p ra ^Λ p,‘d / ^qb' •HO

H ro o O Λ4 O O CO d d u rt •H d H to « H N «j d rt •rt O P ft C rt ·Η -p l· o tO to o o rt ω p

O .rt 'n, g Si •rt β) U H O O Pi O >P

Si p (.0 •H ·

IH d o i' aktivnosti •p p φ U) r'- H o o d d P -P rt n Pr 3 O

Ο ο'ft ο

ο

IC

IC

H »r

IC

Μ ft ra ft

Ο ο

ο

-IS o

o o

(S

Oko 25% termofilnih zrakastih gljivica izolovanlh na 55°C pokazalo je 100-2,500 jedinica proizvodnje alfa-amllaze po mililitru čorbe kulture, ali nije zaostala aktivnost posle toplotnog tretiranja (80°C, 10 minuta, pH 5.0).

Ukupno 35 sojeva od 1,061 termofilnih bakterijskih sojeva izolovanlh na 55°C pokazalo je 100-1,000 jedinica prizvodnje alfa-amllaze, a 10 od tih sojeva proizvelo je termostabllnu alfa* amilazu. Gotovo sva alfa-amllaze Iz termofilnih bakterija Izolovanlh na 70°C pokazale su termostabllnost I stabilnost prema kiselinama; i najvišl producenti dobiveni su iz pH 5.0 izolata.

Ispitan je odnos izmedju aktivnosti I veličine bistre zone u najmanje 219 sojeva Izolovanlh na 70°C I na pH 5.0. Rezultati ovog proučevanja prikazani su u Tablici 3 odakle se može videti da je 90% ovih sojeva dalo bistru zonu prečnika manjeg od 3 cm i proizvelo je 0-200 jedinica alfa-amilaze. Najviša proizvodnja dobivena je iz sojeva koji su dali bistru zonu prečnika večeg od 3 cm, ali se je ovako ponašalo samo 10% od testiranih sojeva.

Tablica 3.

Odnos izmedju aktivnosti i veličine bistre zone Izolovanog soja

Veličina biotro eone na plooi aa iaolovanja (cm u piOČnik«)

-Γ2---ΠΓ

153 40 15

2 1

0 2

0 1

0 1

156 42 20

4< Ukupno

20Q

G

2

1

2

219

Na bazi gornjih testova nadjeno je da je izolovanje bakterijskih kolonija koje imaju bistru zonu veču od 3 cm u prečniku, na ploči aa podlogom koja se koristi u testovima, sjajan metod za testiranje mlkroorganizama koji su sposobni da proizvode visoke prinoee alfa-amilaznih enzima koji su otporni prema kiselinama i temperaturi.

Na osnovu ovog testiranja, izabrano je pet sojeva koji su najvišl producenti alfa-amilaznih enzima koji su termostabilni i otporni prema kiselinama.

Svaki od ovih pet sojeva u prečiščenom obliku, kao što je opisano niže, deponovan je u permanentno] kolekciji American Type Culture Collecetion (ATCC), 12301 Praklawn Drive, Rockville, Maryland 20852. ATCC održava ove sojeve prema kontraktu izmedju ATCC i CPC International Inc., vlasnika ove patentne prijave.

Ugovor izmedju ATCC i CPC International Inc., obezbedjuje permanentnu pristupačnost kultura lli subkultura svim korisnlcima bez ograničavanja posle (1) objavljivanja U.S. patenta koji opisuje i identifikuje predmetne depozite i opisuje ATCC brojeve koji su Im pripisani; ill (2) posle publikovanja lli izlaganja javnosti bilo koje U.S. ill Strane patentne prijave koja opisuje i identifikuje predmetne depozite i opisuje ATCC brojeme koji su Im pripisani. CPC International Inc., se je saglaslo da, ukoliko neka od ovih deponovanih kultura ugine ill bude unlštena, za vreme efikasnog važenja patenta, izvrši zamenu sa žlvom kulturam istog organizma. Dalje, CPC International Inc., je ovlastio ATCC da besplatno omogučl United States Patent and Trademark Office i West German Patent Office Slobodan prlstup kulturama iii sub-kulturama u bilo koje vreme na zahtev ovlaščenih lica tih kancelarija.

Deponovani organizmi

NML Soj No. ATCC No.

Bacillus stearothermophilus B-501 31,195

Bacillus stearothermophilus B-634 31,196

Bacillus stearothermophilus B-781 31,197

Bacillus stearothermophilus B-905 31,198

Bacillus stearothermophilus B-968 31,199

Dalje, NML sojevi B-501 i B-781 deponovani su kod Fermentation Research Institue, Industrial Technology Agency, MITI, kao FRI No. 3389 i 3390.

(1) Morfološke karakteristike:

A. Veličina i oblik čelija: 0.6 x 2 - 3u; pojedinačnl štaplčl retko u nizovima (svi sojevi)

B. Pleomorfizam: Negativan (svi sojevi)

C. Pokretljlvost: pokretljivi i imaju flagele (svi sojevi)

D. Spora; 0.6x1.0 - 1.5 u, ovalno oblikovana; kučište spore u obliku raketa (svi sojev!)

E Gram boja: Pozitivna (svi sojevl)

F. Trošenje kiseline: Negativno (svi sojev!) (2) Rast na razllčitim podlogama:

A Ploda sa hranljivim agarom: Aktivne kolonije koje se šire sa grubom površinom i grubom ivicom (svi sojevi)

B. Kosa pločia sa hranljivim agarom: Dobar rast, belo-opalan, aktivno širenje, spoljašnji rast u obliku češlja (svi sojevi)

C. Hranljiva tedna čorba za kulturu: Prozračno mrk, bela matlrana površina (evi sojevi)

D. Hranljiva želatinska čorba za kulturu: Ukvefakcija (svi sojevi)

E. Agarna ploča sa hranljivim želatinom: široka bistra zona (svi sojevi)

F. So-hranljlva tečnost za kulturu: Inhibiranje rasta u 2% soli (svi sojevi)

G Mlečna agarna ploča: Obrezovanje bistre zone hidrolizom kazeina (svi sojevi)

H. Glukozna agarna kosa pločica: Dobar rast, slične kolonije sa onima na hranljivom agara (svi sojevi)

I. Proteoza peptonska agarna kosa pločica: Nema rasta (svi sojevi) (3) Fizološke karakteristike:

A Nitratna redukcija: Pozitivna (svi sojevi)

B. Katalaza test: Pozitivan (svi sojevi)

C. Vogues-Proskauer reakcija: Pozitivna (svi sojevi)

D. tekoriščenje limunske kiseline: Pozitivno (svi sojevi)

E. Obrezovanje vodonik-sulfida: Pozitivno (svi sojevi)

F. Hidroliza škroba: Jaka hidroliza (svi sojevi)

G. Obrezovanje kiseline i gasa: Pozitivno za kisellnu ali se gas ne obrezuje Iz glukoze, ksiloze, arablnoze, manitola (svi sojevi)

H. Temperatura i pH za rast:

ATCC No. 51,195	ATCC No. 31,197
	(n-501)	Ο'/οι)
37?C	nema raata	neznatna rnct
42°C	noznatan raat	uinoron rnab
50 -70°C	dober rcat	dobui’ mrit
pil interval zn m s l;	5-0	- 0
OptlHolan pil	G - 7	G - 7

Gornji tastovi izvršeni su prema Labaratory Methods In Microbiology od W.F. Harrigan-a et al. i Manual of Microbiological Methods koje su publikovali American Bacteriological Assoclation.

Na osnovu prethodnlh karakteristika pet (5) izabranih sojeva identiflkovanl su kao Badllus stearothermophilus prema Bergeyevom Manual of Determinatlva Bacteriology, 8th Edition.

Ovih pet sojeva je dalje prečiščeno pomoču postupka mazanja na ploči. Rezultati izolovanja, kultivisanja i uslovi prečiščavanja u odnosu na pet izabranih sojeva sumarizovani su u Tablici 4. Kao što se može videti iz Tablice 4, prečiščeni soj ATCC No. 31,199 (B-968) bio je najbolj! od pet izabranih sojeva, I prolzvodlo je 2,111 NML jedinica alfa-amilazne aktivnosti na mililitar čorbe za kultura (oko 15 CPC jedinica).

Testiranje_Dru~o testiranje_Prečiščevanje

CO dr\ hSS t P •rl rt 45 O «1

«a o

4» rt

P o

>

N

H

I o

N '^H d £2 o rt rt > rt o ra rt • r>

0,0

f.B

4)\^

S4 <0

M ft *

«ί⁵

S

W

P, ra

p.

ra

Pt

O o

o

ΙΛ o° o

o

ΙΛ

ΙΛ

cm	ΙΛ	ω	ΙΛ	CM
č»	10	Pl	k0
ni	C<	Pl	σ>	rt rt
C'-	CO	0	ir»	rt
K\	kD	0	to
*		«t		Pl
rt		rt
k0	• kO	0	k0	kO
ra	ra	ra	ra
ra p,	Pi	Pi	Pl	Pl
»	•	*	•	»
P	0	0	0	0
3	0	0	0	0
O	0	0	0	0
to	m	ω	kD	kD

σ' OJ <M H o <0 rt 4* «i* «Γ rt

	0	rt	r«	co.
ΙΛ	0	σ>	rt	ov
H	O-	ir>	PJ	0
·»			*	·»
H			rt	rt

t	rt	d	3
Π	rt d d	rt P	w
0	•p) -P ,0	•rl O	P P
N	0		3 rt
O	d d p •p « 43	d rt •Prt	rt*$
>	»rt rt	»rt	P
•H ®	•rl d	•rl tO d S	d
'S +*	•odd	•Γ3 O	Φ	p
d »ra p.h		rt‘O 0 3	S M P d	•g
X» ·Γ3	odo	d P	d f>	•ra
O H	M & »rt	M	Pa 0	P
O	O	O	O	0
•	•	•	•	•
lA	lA	u\	U\	US

0	us	0	0	0
0·	m	r-	0-	Cs

US	kO	O.
OS	0>	σ\
H	rt	rt
*	«	r
H	rt	rt
K\	»P	Kk

H

K\ £

rt *

H

KS

U proizvodnji alfa-amilaznih enzima iz sadašnjeg pronalaska soj mikroorganizma koji može da proizvede alfa-amilazni enzlm koji je stabilan prema kiselinama i toploti kao što je onaj koji zadovoljava tastove u Tablici 3 (n.pr., Bacillus stearothermophilus sojevi ATCC No. 31,195, 31,196, 31,197, 31,198 iii 31,199) kultiviše se u hranljivoj podloži koja je poznata za kultivisanje termofilnih bakterija. Takve podloge za kulturu treba da sadrže izvor asimilirajučeg ugljenika i azota zajedno sa drugim esencijalnim hranljivim sastojcima.

Podesni izvori asimilirajučeg ugljenika uključuju ugljene hidrate kao što su skrobovi, hidrolizovani skrobovi, kukuruzni obrok, pšenično brašno, itd. Koncentracija ugljenih hidrata koja treba da se koristi u podloži može varirati u širokim granlcama, n.pr., može varirati od oko 1% w/v do oko 25% w/v, a najbolje varira od oko 10% w/v do oko 20% w/v, pri čemu se procenti izračunavaju kao dekstroza. Poželjni asimilirajuči ugljeni hidrat je škrob iii delimično hidrolizovan škrob (i kada se koriste na težinskoj osnovi prisutni su u količini koja varira od 1 do 5%, težlnskih).

Izvor azota u hranljivoj podloži može biti neorganske i/ili organske prirode. Podesni neorganski izvori azota uključuju amonijum soli i neorganske nitrate, itd. Podesni organski izvori azota uključuju pepton, mesni ekstrakt, enzimski ekstrakt, kazein, kukuruznu tečnost, ekstrakt slada, sojino brašno, odmaščeno mleko, itd.

Dalje, hranljiva podloga treba da sadrži uobičajene supstance u tragovima kao što su neorganske soli uključujuči kalcijumhlorid, magnezijum-sulfat, fosfate, natrijum-hlorid, kalijumhlorid, itd.

Ovi izvori ugljenika, azota i neorganske soli mogu se koristiti pojedinačno iii u odaovarajučim kombinacijama. Dalje, može se koristiti mala količina metalnih soli, vitamina, amino-klselina, itd. za promociju rasta i produktivnosti bakterija.

Uslovi kultivisanja koji se koriste za proizvodnju alfa-amilaznih enzima iz sadašnjeg pronalaska su isti kao što se normalno koriste za kultivisanje termofilnih bakterija. Najbolje se soj kultiviše uronjen u tečnu podlogu za kulturu pod mešanjem i aeracijom u toku 2 do 5 dana na 50°C do 70°C na pH 5 do 9. Enzim se akumulira u podloži za kulturu.

Posle proizvodnje alfa-amilaznog enzima Iz sadašnjeg pronalaska, mikrobne čelije se uklone konvencionalnim sredstvima kao što je centrifugiranje. Filtrat se tada poželjno podvrgne isoljavanju dodavanjem neorganskih soli kao što su amonljum-sulfat, natrijum-sulfat iii magnezijum-sulfat i/ili koriščenjem organskih rastvarača koji se mešaju sa vodom kao što su aceton, etanol, 2-propanol, itd. radi taloženja enzima tako da se može koncentrovati. Takodje je moguče da se alfaamilaza izoluje dodavanjem škroba u filtrat tako da če se alfaamilaza sorbovati na škrob.

Poželjno sredstvo za prečiščevanje enzima iz filtrata koji sadrži enzim uključuje faze tretiranja filtrata sa hladnim acetonom u dvostrukoj zapremini od filtrata radi taloženja enzima. Staloženl enzim se tada rastvori u 0.05 M tris-hlorovodonlčna kiselina puferskom rastvoru (pH 8.5) i tada se propusti kroz DEAEceluloznu kolonu koja se ekvilibriše sa istim puferskim rastvorom, Na pH 8.5 ne-alfa-amilazni enzlmi, proteini, pigmenti, Itd. se adsorbuju na DEAE-celulozi dok največi deo alfa-amilaze ostaje u rastvoru. Filtrat koji sadrži alfa-amilazni enzim zove se ovde 'delimično rafinisani enzim”. Delimično rafinisani enzim može se dalje prečistiti dijalizom naspram 0.01 tris-hlorovodonična kiselina puferskog rastvora (pH 7.0) pa se zatim propušta kroz hidroksiapatitnu kolonu koja se ekvilibriše sa istim puferskim rastvorom. U ovoj fazi enzim se sorbuje na kolonu. Sorbovani enzim se eluira linearnim povečevanjem koncentracije amonijum-sulfata od 0 do 0.5 molarnog.

Tako dobiveni delimično rafinisani enzim se, posle koncentrovanja, propušta kroz Sephadex G-150 kolonu. Enzim se slabo adsorbuje na Sephadex-u i eluira se u frakciji molekulske težine ispod 10,000. Aktivnost rafinlsanog enzima koji se dobiva na ovaj način povečana je za 100 puta od originalnog filtrata, ali se pri disk elektroforszi takodje zapažaju i trake drugih proteina osim za aifa-amilaznl enzim - a kristalizacija enzima još nije postignuta.

Sledeči primeri služe da potpunije opišu način pravljenja i koriščenja gore opisanog pronalaska, kao i da prikažu najbolje načine za sprovodjenje različitih aspekata pronalaska. Treba da je jasno da ovi primeri ne ograničavaju pravi obim pronalaska več su dati samo radi njegovog ilustrovanja. Svi odnosi su u težinskim delovima, ako nije drukčije naznačeno.

Primer 1

Podloga za kulturu koja sadrži 3.0% (tež.) rastvornog škroba, 0.5% baktotriptona, 1.0% enzimskog ekstrakta, 0.05% kalcijumhlorida, 0.05% magnezijum-sulfata i 0.1% kalijum-biofosfata podesi se na pH 7.0. Alikvot od 50 ml. ove podloge izlije se u konusni balon od 500 ml i sterilizuje se .15 minuta na 121°C. Sterilisana podloga inokulira se sa ATCC No. 31,195 (B-501) sojem Bacillus stearothermophilus i kuhtiviše se pod mešanjem u toku 4 dana na 60°C. Posle kultivisanja, mikrobne čelije se uklone centrifugiranjem. Enzimska aktivnost filtrata po Jednom mililitru bila je 10 CPC alfa-amilaznih Jedinica (odredjeno CPC postupkom koji je opisan gore). Ovome filtratu dodaju se dve zapremine acetona da se staioži enzim koji se kasnije rastvori u 0.05 molarnom Trls-HCi puferu (pK 8.5). Tada se rastvor propusti kroz DEAE-celuloznu kolonu koja se ekvilibriše sa istim puferskim rastvorom. Alfa-amilazni enzim se ne sorbuje na DEAE-celulozu dok se mnogi drugi proteini, pigmenti, itd., sorbuju na DEAE-celulozu pa se tako odvajaju. Tako dobiven delimično rafinisan enzim se prvo koncentruje i tada propusti kroz Sephadex G-150 kolonu. Enzim se slabo sorbuje na Sephadex-u i eluira se u frakcija molekulske težine ispod 10,000. Tako dobiveni rafinisani enzim prevede se u sprašenl, rafinisani enzim suvim zamrzavanjem i njegova relativna aktivnost bila je oko 200 CPC jedinioa/mg proteina.

Primer 2

Podloga za kulturu koja sadrži 3% kukuruznog škroba, 0.5% peptona, 1% kukuruzne tečnosti, 0.05% kalcijum-hlorida i 0.05% kalljum-hlorlda podesi M na pH 7.5. Allkvot od 50 ml. ove podloge za kulturo stavi se u konusnl balon od 500 ml i sterillzuje se 15 minuta na 121°C. Sterllizovana podloga Inokulira se sa ATCC No. 31,196 (B-781) sojem Badllus stearothermophilus i meša se 4 dana na 55°C. Posle kultivisanja, mikrobne čelije se uklone centrifulgranjem. Alfaamilazna aktivnost u filtratu bila je 14 CPC jedinica/ml. AKaamilaza je staloiena dodavanjem dvostruke zapremina od filtrata 2-propanola. Talog se obrezuje u suvi prah suvim zamrzavanjem. Aktivnost sirovog enzima u prahu bila je 3 CPC jedinice/mg. Raflnisani, sprašeni enzim koji ima aktivnost od

230 jedinica/mg dobiven je iz ovog sirovog enzima u prahu rafinisanjem po postupku iz Primera 1.

Pet izolovanih i izabranih sojeva (t.J., ATCC No., 31,195, 31,196 31,197, 31,198 i 31,199) testirani su da se odredi efekat temperature i pH na proizvodnju alfa-amilaze. Alfa-amilazna aktivnost u eksperimentima izražena je kao presečna vrednost največe aktivnosti triplikatnih balona. Sastav podloge koji se koristi I za pre-kulturu i za glavnu kulturo Je isti kao Što je prikazano u Tablid 1 (B-M podloga). Rezultati ovih ekeperimenata sumarizovani su u Tablid 5.

Efekat temperature i pH na proizvodnju a-amllaze

Aktivnost u U/ml (Vrege kultivisanja)

ATCC No.	CC)	pil	5.5	pil	6.0	PH	6.5	PH	7.0	pa	7.5	pil	8.0
31,195	50			1,055	(90)			514	(90)			100	(90)
	55			1,355	(90)			1,334	(90)			120	(90,
	60			942	(48)			1,490	(90)			1,040	(90)
	65			0	(90)			100	(90)			30	(90)
31,196	45			418	(89)			368	(89)
	50			477	(65)			681	(41)
	55			608	(41)			916	(41)
	60			932	(68)			975	(68)	1,168	(43)	1,051	(43)
	65			403	(43)			356	(20)	262	(20)	191	(68)
	70			24	(43)			224	(20)	155	(20)	59	(43)
V,197	50			751	(44)	720	(44)	679	(44)	1,001	(44)
	55			1,057	(44)	1,155	(27)	1,012	(44)	1,330	(27)'
	60			1,085	(44)	1,166	(27)	1,084	(27)	1,139	(27)
	65			1,687	(44)	615	(27)	815	(27)	848	(27)
31, 198	50			184	(68)	272	(68)	480	(68)	352	(68,	152	(68)
	55			768	(44)	752	(68)	832	(44)	880	(44)	955	(44) ’
	60			621	(44)	675	(44)	739	(44)	1,104	(44)	1,123	(44)
	65			1,340	(68)	782	(44)	776	(44)	698	(44,	661	(44,
31,199	45	143	1139)	133	(139)	113	(139)	115	(139)	86	(139)
	50	686	(139)	663	(139)	54 3	(139)	493	(139)	491	(139)
	55	1,608’	(43)	1,365	(43)	1,267	(43)	1,025	(43)	946	(43) '
	00	1,485	(43)	1,457	(43)	1,295	(43)	1,154	(43)	.1,117	(43)
	65			0	(65)	0	(65)	0	(65)	0	(65) '	0	(65)

Iz Tablice 5 može se videti da su optimalni uslovi za ATCC No.

31,195 i 31,196 bili 60°C, pH 7.0 i 60°C, odnosno pH 7.5. ATCC No. 31,197 i 31,198 proizveli su značajne količine alfa-amilaze kada se kultivišu na 65°C, ali ova visoka temperatura kultivisanja nije bila podesna za proizvodnju dobre alfaamilazne aktivnosti za druge izolovane sojeve. Na 55°C do 60°C, nadjeno je da Je optimalan pH 8.0 za proizvodnju alfaamllaze za soj ATCC No. 31,198, a optimalan pH podloge za soj ATCC No. 31,199 bio je 5.5.

TABLICA

Tablice 6, odnosno 7 (1) sumarizuju proizvodnju alfa-amilaze pet izabranih sojeva koriščenjem ponovljenih transfera na kosim pločicama (svaki soj je tretiran tako da je vršeno 9-11 transfera na dve vrste podloga za kose pločice, a onda je kultlvisan u tečnosti tako da se nadje podesna podloga za kosu pločicu koja održava stabilnu proizvodnju alfa-amilaze), i (2) odredjuju efekat zapremine podloge na proizvodnju alfa-amilaze (menja se zapremina podloge u balonima od 500 ml.) tako da se Ispita efekat aeradje na proizvodnju alfa-amilaze pomoču svakog soja.

Proizvodnja «-amllaze korišžonjom ponovljenih transfera na koaltif plocicsjia ¹¹

Kultura u balonu

iio. broj tr anafor a	Aktivnost, U/ml	Uslovi	pH
(Vreno kultivls	., ΙΠΙ)
91,195 BD*, 1	056 (90)		60	7.o
BD, 10	910 (4-3)		II	It
I1A' , 10	140 (72)		II	II
51, 1% BD, 2	976 (26)		60	7.5
BD, 10	1,503 (26)		It	II
HA, 10	1,550 (26)		11	n
51,19? BD, 1	1,330 (27)		55	7.5
BD, 10	1,127 (26)		II	It
11Λ, 10	1,420 (26)		n	11
>1,190 BD, · 4-	736 (44)	1	60	8.0
BD, 11	712 (44)		It	tl
HA, 11	1,117 (44)		It	11
31,199 BD, 2	1,163 (44)		55	5.5'
BD, 9	1,013 (60)		II .	II
HA, 9	775 (60)			II
Podloga za kosu ploSicu za x	Kosa plofiica sa branjljiviit
• to3tiranjo		agcrom	*
nestvora! škrob	1.09	Bakto-pspton (Difoo)	' 0.59
Bckto-tripton (Difco) 0.59	Ekstrakt	Bakto-i',0-
Ekotrakt kvesca	0.59	večino (Difco)	0.37-
CeCl,,.2Hn0	0.059	Agar		2.0,9
KnClg.fHIgO	0.059	pil		7.2
kii2po4	O.l9
Agor	2.0tf
pil	5.0

Tablica 7

Kfokat gapremlno podloge na proizvodnju amllase

Kultura u balonu

Broj tran- ATCC afera na ΤΐΌ. kosim ploč.	Uslovi	Zapr.podloge al/500 ul. balon	Aktivnost, U/ml (Vreme kulbiv., e.)
Temp« (°0)	pil
			30	150 (65)
			40	18? (G5)
31,195 BD-11	60	7.0	50	1,192 (41)
			60	790 (41)
•				146 (t.5)
			30	954 (26)
			40	966 (u,;)
31,196 BD-2	GO	7.5	50	976 (;\.)
			GO	1,236 (86)
			70	651 (4J)
			30	1,435 (41)
			40	1,590 (41)
31,197 BD-3	55	7.5	50	1,510 (41)
			60	1,300 (41)
			70	640 (41)
			30	' 600 (44)
	1		40	651 (44),
31,198 BD-4	60	8.0	50 .	736 (44)
			60	939 (44)
			7°	'777 (44)
			30. · ,	1,131 (44)
			40	1,240 (44)
31,199 BD-2	55	5.5	50	1,163 (44)
			60	1,054 (GO)
			70	1,224 (60)

Postupak prečis6 a* ni j; -»Anllasa vanja

ΛΤΟΟ I’o. 51,195

Ul.npna uktivnost (Cx'J jedlnloe)

Ukupan protein (n»_G)

Specifična aktivnost (jodinice/mg)

Princa (',!)

ATCC lio. 51 »199

Ukucna aktivnost (oi'C joflinico)

Ukupan protein (mg)

Specifična aktivnost ( jodinice/iag)

Prinos (‘O

Thnr.')wyl

Ul.unnn aktivnost (CPC jodinioe)

Ukupan protein (mg)

Specifična aktivnost (jodinioe/mg) lrinos (;«)

Tablica 8

PročlŽčnvan.le alfa-anllass

Čorba kulture iii sirovi onsinčki prop.	Taloženje aoetonom	Toplotno tretira- n.1e	DEAE- coluloza
9,870	8,640	8,420	2,400
7,990	2,016	1,450	15.7
1.2	4.5	5.8	152.9
100	87.5	85.3	24.3
9,910	.8,210	7,214	2,310
4914	1969	1206	33 ·
2.0	4.2	6.0	70
100	82.0	7.2.0	23.3
12,100	9,400	'\9,540'	'2,410 ;> ·
684	286 ·	183	24'..
17.7	32.9	52.1	100.4
loo	77.7	78.8	19.9

Dva soja iz sadašnjeg pronalaska (ATCC No. 31,195 i 31,199) su prečiščena I osobine alfa-amilaze koja je iz njih proizvedena uporedjene au sa Thermamyiom Uquid 60, Batch AN 1005 po postupku koji Je opisan niže.

AJfa-amllaznl enzim staložen je iz filtrata kulture ATCC No.

31,195 I 31,199 ill iz Thermamyi alfa-amilaze (dva puta razblažene) dodavanjem dve zapremine hladnog acetona. Talog je sakupljen centrifugiranjem i rastvoren je u 0.025 M rastvoru kalcijum-acetata. D rastvor se doda rastvomi skorb tako da se napravi 20% škrobna supsenzija. Ova supsenzija se zagreva na 85°C 30 minuta I talog se ukloni centrifugiranjem. Zatim se rastvor dlalizuje naspram 0.05 M Trls-HCI pufera (pH 8.5) koji sadrži 10 mM Ca+ + , i pufer se dva puta zameni. Diallzat se aplicira na DEAE-oiuloznu kolonu koja se ekvllibriše sa puferom za dlalizu. Alfa-amilaza se ne adsorbuje na koloni i eluira se sa Istim puferom. Frakcije koje imaju alfa-amilaznu aktivnost se sakupe i alfa-amilazni enzim se koncentruje taloženjem sa acetonom. Alfa-amilazna aktivnost se odredjuje CPC postupkom koji je opisan gore. Postupak prečiščevanja sumarizovan je u Tablici 8.

Stabilnost prema kiselinama i termostabilnost delimično prečiščenih alfa-amllaznlh preparata iz ATCC No. 31,195 i

31,199 I Thermamyl alfa-amilaze (koja ima 7 Jedinica/ml) odredjenl su inkublranjem u toku 60 minuta pod sledečim uslovima:

(a) 90°C, pH 6.0, Ca + + O iii 1 mM;

(b) 80°C, pH 4.55, Ca + + 5 mM, i (c) 85°C pH 4.55, Ca++ 1 mM iii 5 mM, 22.5% rastvornog škroba.

*5 ml. alfa-amilaznog preparata dializuje se u Visking 8/32 celuloznoj epruveti naspram 0.05 M kalcijum-acetatnog pufera (pH 4.5-6.0) koji sadrži 0-5 mM kalcijum-acetata u toku tri časa na 4°C, pri čemu se pufer dva puta menja. Zatim se 4 ml dializata stavi u male epruvete I inkubira na naznačenoj temperaturi na vodenom kupatilu. Epruvete se brzo ohlade na kupatilu sa ledanom vodom I odredi se zaostala alfa-amllazna aktivnost.

**0.3 ml. dializovanog enzlmskog rastvora alfa-milaze, 0.5 ml. 1 M kalcijum-acetatnog pufera, 0.2 ml 0.5 M CaCI^ i 0.3 ml. 30% supsenzije rastvornog skorba otplpetira se u epruvetu. Zatim se epruvete brco ohlade na kupatilu sa ledenom vodom i odredi se zaostala alfa-amilazna aktivnost.

Zaostale alfa-amllazne aktivnosti odredjene su posle 5, 10, 20, 30 i 60 minuta Inkubiranja.

Optimalna temperatura i pH ATCC No. 31,195 l ATCC No.

31,199 alfa-amilaza i Thermamyl aHa-amllaze odredjenl su pomoču CPC uslova za testiranje koji su opisani gore, izuzev što je menjana reakciona pH vrednost iii temperatura. Rezultati tastova prikazani su na Slikama 1 i 2. Optimalan pH za ATCC No. 31,195 i ATCC No. 31,199 alfa-amilaze bio je 4.0 - 5.2 a za Thermamyl alfa-amilazu 4.5. Nadjeno je da Thermamyl alfaamilaza zadržava visoku enzimsku aktivnost u neutralnom I alkalnom pH Intervalu.

Optimalne temperature bile su 75°C za ATCC No. 31,199 alfaamilazu, 80°C za ATCC No. 31,195 alfa-amilazu i 85°C za Thermamyl alfa-amilazu. Odnos izmedju enzimske aktivnosti i reakciona temperature bio je vrlo sličan za ATCC NO. 31,195 i ATCC No. 31,199 alfa-amilaze, ali je za Thermamyl alfa-amilazu bio vrlo raztičrt. Nadjeno je da se alfa-amilazna aktivnost Thermamyi alfa-amilaze povečava za 20-30% kada se ova inkubira na 85°C I na pH 6.0 u prisustvu škroba i Ca++. Ova činjenica može objasniti razliku u odnosu enzimska aktivnostreakdona temperatura izmedju ATCC No. 31,195 i ATCC No.

31,199 alfa-amilaza I Thermamyl alfa-amilaze.

Sl. 3 ilustruje krive Inaktiviranja ATCC No. 31,195 i ATCC No.

31,199 alfa-amilaza i Thermamyl alfa-amilaza kada se ove Inkubiraju na 80°C I na pH 4.55 u prisustvu 5 mM CaCIg· ATCC No. 31,199 alfa-amilaza pokazuje najvlšu termostabilnost posle ATCC No. 31,195 alfa-amilaze. Thermamyl alfa-amilaza je znatno elabija od ATCC No. 31,195 i ATCC No 31,199 alfaamilaza u pogledu termostabilnosti pod ovim uslovima.

Sl. 4 ilustruje krive inaktiviranja ATCC No., 31,195 I ATCC No.

31,199 alfa-amilaza, Thermamyl alfa-amilaze i Badllus starothermophllus alfa-amilaze koju su opisali Ogasawara et, al. (J. Biochem. 67, 65, 77, 83 (1970)) kada se ove inkubiraju na 90°C, i na pH 6.0 u odsustvu Ca+ + (uslove inkubiranja opisali su Ogasawara et. al. i bili su isti kao u ovom testu).

Kao što se može videti sa Sl. 4, alfa-amilaze iz sadašnjeg pronalaska pokazale su mnogo veču termostabilnost bilo od Thermamyl alfa-amilaze bilo od Ogasawara-ine et. al. alfaamilaze (iako alfa-amilaze koje su testirane u sadašnjem pronalasku takodje pripadaju soju Bacillus stearotehermophilus).

Sl. 5 ilustruje krive inaktiviranja ATCC No. 31,195 I ATCC no:

31,199 alfa-amilaza i Thermamyl alfa-1amllaze pod Istim uslovima kao što je opisano gore za Sl. 4 (n. pr., 90°C I p H 6.0) izuzev što je podloga sadržala 1 mM Ca + +. Alfa-amilaze iz sadašnjeg pronalaska su još uvek pokazlvale veču termostabilnost od Thermamyl alfa-amilaze, ali razlika nije bila tako velika kao u slučaju bez dodanog Ca+ + . Ove činjenice izgleda pokazuju da ATCC No. 31,195 i ATCC No. 31,199 alfaamilaza vezuju Ca+ + čvršče nego Thermamyl alfa-amilaza, pa su stoga njene potrebe za CA+ + radi stabilizacije proteinskog molekula manje od Thermamyl alfa-amilaze.

Slike 6 i 7 ilustruju krive inaktiviranja ATCC No. 31,195 i ATCC No. 31,199 alfa-amilaze i Thermamyl alfa-amilaze kada se ove inkubiraju na85°C i na pH 4.55 u prisustvu rastvornog škroba (22.5%, d.s.) iCa+ + (1 mMCa+ + kao što je ilustrovano na Sl. 6 i 5 mM Ca++ kao što je ilustrovano na Sl. 7). ATCC No.

31,195 i ATCC No. 31,199 alfa-amilaze pokazale su veču termostabilnost od Thermamyl alfa-amilaze pod uslovima sa Slika 6 I 7. Pošto su uslovi gornjih testova koji su ilustrovani na slikama 6 i 7 slični sa mnogim Industrijskim uslovima likvefakcije, očekuje se da če alfa-amilaze iz sadašnjeg pronalaska demonstrirati veču termostabilnost na kiselim pH vrednostima u industrijskoj likvefakciji ikonverclji škroba. Odredjeno je da su molekulske težine i ATCC No. 31,1951 ATCC No. 31,199 alfa-amilaza 96,00 po postupku Webera i Osboma, J. Biol. Chem., 244, 1406 (1969) koriščenjem SDS disk elektorforeze. Markirnl proteini bili su albumin (M. tež. 67,000), ovalbumin (M. tež. 45,000), himotripsln (M. tež. 25,000) i cltrohrom C (M. tež. 12,500). Položaj alfa-amllaza Iz sadašnjeg pronalaska na polikrllamldnom gelu odredjen je stavljenjem gela na amiloza-azurnu agarnu ploču i inkubiranjem na 37°C. Rezultati ovog testa ilustrovanl su na Sl. 8.

Vrednost od 96,000 za molekulsku težinu alfa-amilaza iz sadašnjeg pronalaska je mnogo veča od onih za Bacillus stearothermophilus alfa-amilaze koje su dali Ogasawara et al., J. Biochem., 67, 65, 77, 83 (1970) (M. Tež. data kao 48,000) i Manning et al. J. Biol. Chem., 236, 2952, 2958, 2962 (1961) (M. tež. navedena kao 15,600).

Pet izolovanih sojeva testirani su na proteaznu aktivnost pošto se prlsustvom proteaze iii proteolltičkog enzima u alfaamilaznlm enzimima javlja težnja za reakcijom sa razllčltim belančevlnastim materijalima koji su prisutnl u mnogim škrobnim materijalima tako da se proizvode proteinski hidrolizati kao što su amlno-kissline. Iz ovog razloga, prisustvo proteaznog enzmskog kontaminanta u alfa-amilaznim enzimima štetno je za efikasnu hidrolizu škrobnih materijala. Proteazne aktivnosti u alta-amilaznim enzimima proizvedenim iz pet Izolovanih sojeva odredjene su iz acetonskih taioga filtrata kulture u fazi maksimalne proizvodnje alfa-amilaze koriščenjem modifikovanog Anson-Hagiwara postupka.

Dobiveni rezultati uporedjeni su sa enzimskim preparatima Thermamyl alfa-amilaze i CPC bakterijske alfa-amilaze. Kao što je prikazano niže, Thermamyl i filtrati kulture izolovanih termofilnih zrakastih gljivica aadržali su velike količine proteaze. S druge strane, termostabilni alfa-amilazni proizvodni sojevi iz sadašnjeg pronalaska nisu proizveli značajnu količinu proteaze.

Proteazna aktivnost Alfa-amilaze

Enzim Odnos proteaza/alfa-amilaza
ATCC No. 31,195	0.06
ATCC No. 31,196	0.17
ATCC No. 31,197	2.35
ATCC No. 31,198	0.08
ATCC No. 31,199	0.06
CPC-BLA 6.2
Thermamyl 60	36.5

B-172 109.0

1/ Termofilna zrakasta gljivica izolovana na 55°C I na pH 7.0.

Kao što se može videti Iz gornjih rezultata alfa-amilaze iz sadašnjeg pronalaska ne sadrže bilo kakave značajne količine proteazne aktivnosti, tj., odnos proteza/amilaza je manjl od 3 i uglavnom manjl od 1. Ovo je značajna prednost kada se enzlm koristi za hidrolizu škrobnih materijala.

Primer 3

Sledeči primer ilustruje koriščenje alfa-amilaznih enzima iz sadašnjeg pronalaska i likvefakciji škroba u proizvodnji škrobnih hidrolizata sa visokim D.E.

Trideset grama škroba iz krompira suspenduje se u 70 ml. vode, doda se 75 mg kalcljum-hlorid dihidrata i pH se podesi na 4.5. Ovoj supsenziji se doda 50 CPC jedinica raflnisanog, sprašenog enzima dobivenog u Primeru 2 tako da se škrob tretira na 85°C 30 minuta. D.E. stečnjenog rastvora bio je oko 21 a pH je bio 4.3. Kada se temperatura smanji na 60°C doda se glukamllazni enzim izveden iz Aspergillus niger i rastvor se saharifikuje i prevodi na 60°C 48 časova. D.E. sahartfikovanog i konvertovanog rastvora bio je 97.5 a sadržaj dekstroze bio je 96.0%.

Kao što je prikazano u prethodnom primeru (Primer 3) alfaamilazni enzim iz sadašnjeg pronalaska hidrolizuje i stečnjava škrob. Mogu se koristiti za konvsrzlju rastvornog škroba, amilazs, amilopektina, glikogena, itd., da se nalog smanji viskozltet ovlh supstrata. Kada enzimi iz sadašnjeg pronalaska rsaguju sa rastvornim škrobom na pH 4.5 i na 60°C, skrobjodidna reakcija Iščezava pri brzini hidrolize (D.E.) oko 15 a obavezna brzina je D.E. 32 do 36. šečeri hidrolizovanog proizvoda analizirani su kao maltoza, maltotrioza, maltotetroza I drugi maltooligosaharidi zajedno sa matom kollčinom glukoze. Mutarotacija redukcionog šečernog proizvoda je negativna. Prema torne, enzimi iz ovog pronalaska su alfa-amilazni enzimi tipa za llkvefakciju i slobodno hidrolizuju alfa-1,4 veze škroba. Odnos izmedju likvefakcije koriščenjem enzima iz sadašnjeg pronalaska (relativna vrednost) i operativnog pH prikazan je na sl. 9 i njemu su suprotstavljeni poznati alfa-amilazni enzimi izvedeni iz Bacillus starothermophilus. Kao što je prikazano na Si. 9, optimalen pH za enzime iz sadašnjeg pronalaska je pH 4.2 do pH 5.2. Poželjni enzimi iz sadašnjeg pronalaska ne gube svoju aktivnost čak i ako se ostave 24 časa na sobnoj temperaturi na pH u intervalu od 3 do 11.

Odnos izmedju likvefakcije enzimima iz sadašnjeg pronalaska (relatvina vrednost) i operativne temperature prikazan je na Si. 10 i njemu je suprotstavljena alfa-ailaza izvedena iz Bacillus stearothermophilus koju su opisali Ogasawara st al. Kao što je prikazano na SL 10, poželjna operativna temperatura za enzime iz sadašnjeg pronalaska je oko 80°C.

Kao što se vidi Iz prethodnog, alfa-amilazni enzimi Iz sadašnjeg pronalaska mogu se koristiti u likvefakciji I konverziji škroba u industriji saharifikacijs škroba, zatim u tekstilno) Industriji i kao aditivi u formulacijama deterdjenata slično sa konvencionalnim primenama bakterijskih alfa-amilaznih enzima.

Alfa-amilazni enzimi Iz sadašnjeg pronalaska su naročito podesni za llkvefakciju i konverziju škroba u proizvodnji maltodekstrina, i kasnijoj proizvodnji dekstroze koriščenjem glukoamilaze pošto se izomerizacija kranje grupe molekula može izboči zato što se enzim može efikasno koristiti na kiselom pH (tj. pH 4.5-5.0), pa se tako povečava prinos dekstroze. Koriščenjem ovih novih enzima takodje se smanjuje opterečenje Jonske izmene u postupku rafinlsanja zato što nije potrebno pH podešavanje pre saharifikacije i konverzije sa glukoamilaznim enzimom.

U jednom poželjnom postupku koriščenja alfa-amilaznih enzima iz sadašnjeg pronalaska, enzim se koristi za konverziju škroba u škrobni hidrolizat gde zaostali nekonvertovani škrob ostaje u granularnom obliku. Ovi postupci su opisani i zaštičeni u U.S. Patentima No. 3,922,196; 3,922,197; 3,922,198; 3,922,199;

3,922,200 1 3,922,201 kojisu svi objavljeni 25. Novembra 1975, a ceo njihov sadržaj daje se ovde kao referenca. U ovim postupcima sa granularnim škrobom, vrši se barom početno rastvaranje škrobnih materijala na relativno niškim temperaturama, tj. Ispod početne temperature želatinlzacije škroba. U najpoželjnijem postupku za vršenje ovih postupaka, glukoamilazni enzim koristi se konkurentno sa alfa-amilaznlm enzlmom u početno) fazi rastvaranja. Enzimi iz sadašnjeg postupka su naročito podesni za ovaj postupak pošto je njihov pH interval koji je optimalan kompatibilan sa glukoamiiazom.

II drugom poželjnom postupku za koriščenje alfa-amllaznih enzima Iz sadašnjeg pronalaska mogu se koristiti postupci koji su opisani u U.S. Patentu No. 3,853,706, koji Je objavljen 10. Decembra, 1974. I U.S. Patentu No. 3,849, 194 koji je objavljen 19 Novembra 1974, a njihovi opisi navods se ovde kao referenca.

U još uvek poželjnom drugom načinu koriščenja alfa-amilaznlh enzima Iz sadašnjeg pronalaska može se koristiti postupak koji Je opisan u U.S. Patentu No. 3,192,590 koji je objavljen 14 Oktobra, 1975 od Slott-a et. al. a pripada Novo Industri A/S, pa je i ovaj opis ovde uključen kao referenca. Koriščenjem alfaamllaznih enzima iz sadašnjeg pronalaska sa postupkom Slott-a et. al., suspenzija škroba, kao što je kukruzni škrob, koja ima najmanje 25% tež. skrobnog materijala tretira se sa alfaamilaznim enzlmom na temperaturi u intervalu od oko 100°C do oko 115°C, najbolje od 105°C do oko 110°C u toku 1 do 60 minuta, i najbolje 5-10 minuta tako da se škrob likvrfikuje a posle toga temperatura se smanji na 80-100°C i poželjno na 90°C do 100°C, kada je viskozitet zgusnutog rastvora manji od 300 c.p.s. moreno na 95°C. Jedinstvena prednost primene postupka sa ovim temperaturnim profilom sa alfa-amllaznlm enzimima iz sadašnjeg pronalaska je da se može koristiti nižl pH tako da nema iii je potrebno samo malo pH podešavanja u kasnljem postupku saharifikacije sa glukoamiiazom.

Najpoželjnije koriščenje alfa-amilaznlh enzima iz sadašnjeg pronalaska za konverziju škroba uključuje podvrgavanje škrobne eupsenzije dejstva enzima na pH u intervalu od oko 3.5 do oko 6.5, najbolje od oko 4 do oko 5, na temperaturi koja varira od oko 50°C do oko 100°C, i poželjno od 60°C do Oko 95°C tako da se škrob llkvifikuje. U slučaju postupaka za hldrolizu granuiarnog škroba koji su opisani gore, temperatura če varirati od normalne početne temperature želatinlzacije pa do stvarne početne temperature želatinlzacije škroba, tj. od oko 60°C za kukuruzni škrob. U slučaju direktnog postupka likvefakdje, škrobna suspenzija koja sadrži enzim se poželjno zagreva (n.pr., sa mlaznlm grejačem) na temperaturu koja varira od oko 85°C do oko 95°C i još poželjnije od oko 90°C do oko 92°C tako da se škrob likfifikuje. Posle početnog rastvaranja (kao u hidrolizi granuiarnog škroba) iii likvefakdje, suspenzija se početno podvrgava tretiranju toplotnim šokom na temperaturi iznad 100°C, a poželjno ova varira od oko 11O°C do oko 15O°C tako da se llkvifikuje zaostali škrob u granulama. Posle toga, likvifikovana škrobna supsenzija se ohladi i poželjno se tretira sa još alfa-amilaze, iii same iii u kombinaciji sa drugim enzimima kao što su glukoamilaza, beta-amilaza, puluanaza, izomeraza glukoze, sekvencijalno iii u kombinaciji. Ako se alfa-amilaza koristi sama u drugoj enzimskoj fazi temperatura če poželjno varirati od oko 80°C do oko 90°C i najpožljenije od oko 85°C, što je optimalna temperatura za enzime iz sadašnjeg pronalaska. Ako su prisutni drugi enziml kao što je glukoamilaza i/ili izomeraza glukoze, temperatura če biti nešto niža, n.pr., 5575°C i poželjno oko 60°C.

Zaključak

Alfa-amilazni enzimi iz sadašnjeg pronalaska mogu se jasno razlikovati od alfa-amilaza iz predjašnje nauke dobivenih iz životinja, biljaka, kvasaca, nesavršenih gljivica, i algi, pošto ovi enziml iz predjašnje nauke Imaju tako nisku toplotnu stabilnost da potpuno gube svoju aktivnost posle 5-minutnog tretiranja na 70°C i na pH 6.0. Uporedjivanjem toplotne stabilnosti alfaamilaza Iz sadašnjeg pronalaska kao što Je prikazano na Sl. 12 (podaci za pravljenje sl. 12 su praktično isti kao što se koriste za el. 6) jasno je da su alfa-amilazni enzimi iz sadašnjeg pronalaska daleko bolji u pogledu stabilnosti prema kiselinama i toploti kada se uporede sa alfa-amilaznim enzimima iz predjašnje nauke. Takodje je sa Sl. 12 jasno da se alfa-amilazni enzimi iz sadašnjeg pornalaska karakterišu time što su sposobni da sadrže najmanje oko 70% i poželjno najmanje oko 90% od svoje početne aktivnosti kada se drže na 90°C i na PH 6.0 u toku 10 minuta u odsustvu dodanog kalcijumovog jona, a takodje su sposobni da zadrže najmanje oko 50% od svoje početne aktivnosti kada se drže na 90°C i na pH 6.0 u toku 60 minuta. Kao što se vidi sa Sl. 11 jasno je da se alfa-amilazni enziml Iz sadašnjeg pronalaska dalje karakterišu time što su sposobni da zadrže najmanje oko 50% od svoje početne aifa-amllazne aktivnosti na temperaturi od 80°C i na pH 4.55 u prisustvu 5 mM kalcijumovog jona u toku 10 minuta.

Tablica 9 prikazuje odnos izmedju alfa-amllaznih enzima Iz sadašnjeg pronalaska i alfa-amilaznih enzima Bacillus subtills i Bacillus llcheniformis koji se koriste industrijski, kao i onih Iz Bacillus stearothermophilus koji su opisani u literaturi. Uporedjenl su u pogledu optimalnog operativnog pH, pravilne operativne temperature i molekulske težlne. Slike 11 i 12 suprotstavljaju njihove osobine u pogledu stabilnosti prema kiselinama i toploti.

Tablica 9

Optimalen opeTeetiraniž aasim rativni nH Aifa-anffifaani cnžTmi/iaovog pronaiaska 4.0 - 5.2	Pravilna operativna tomperatura 80°0	Molekulska težina
96.000
Alfa-amilssa ·,
‘izŠ. subtilis·1, 4.5 - 6.5	45 - 60°0	49,0005
AlfR-nmi?aza iz ?
liTTCioheniformls* 5.0 - 9.0	76 - 78°0	22,5005
Alfa-emilaza iz
h. stearothermopbilus
a) Ogasavara et. al.1 5.0-6.0	65 - 70°0	48,000
b) Oampbell et. al. 5 4.8	55 - 70°0	15,(S004

^Ogaeauara et. al., J. Blosotiem,. 62, 65 (1970). ²3higeinasa Salto, ABB, 155. 290 (1973).

^Campbell et. al. J. Biol. Cbom.. 236. 2958 (I96I).

4„

Campbell et. al,, ibid., 236. 2958 (1961).

^Britanska Patentna Prijava navodi molekulaku težinu alfaamilaze iz B. licheniformis 18,000-20,000 a iz B. aubtilis 96,000. “ -Kada se alfa-amilazni enzimi Iz sadašnjeg pronaiaska uporede sa alfa-amilaznim enzimima iz Bacillus subtilis, vidi sa da su ove značajno različlte, kao što je jasno sa Slika 9 i 11, u pogledu njihove optimalne operativne pH vrednosti, pravilne operativne temperature, molekulske težine i stabilnosti prema kiselinama i toploti. Ovo pokazuje da je ovaj enzlm sasvim razllčit od alfaamllaze iz Badlus subtilis.

Kada se alfa-amilazni enzimi iz sadašnjeg pronaiaska I alfaamilazni enzimi iz Badlus licheniformis uporede, razlikuju se značajno po svojem optimalnom operativnom pH, po molekulskoj težini i po stabilnosti prema kiselinama i toploti kao što je prikazano u Tablid 9 i na Slikama 11 i 12.

Stručnjadma če biti jasno da se sojevi koji se koriste za proizvodnju alfa-amllaznih enzima iz sadašnjeg proalaska mogu podvrgnuti mutagenim sredstvlma koriščenjem poznatih tehnika, kao što su ultra-ljubičasta svetlost, hemijsko tretiranje I slično. Prema torne, sadašnji pronalazak obuhvata Ifa-amilazne enzima proizvedene iz sojeva ATCC No. 31,195, 31,196,31,197, 31,198, 31,199, I varijanta I mutanata ovih sojeva, kao I podmutanata pomenutih varljanata i mutanata.

Kao I neki drugi poznati alfa-amilazni enzimi, enzimi iz sadašnjeg pronaiaska Inhiblraju sa pomoču žive i EDTA dl se stabllizuju kaldjumom.

Stručnjadma če biti jasno da se mogu koristiti različlte modifikacije sadašnjeg pronaiaska, kao što je opisan u prethodnim primerima, bez otstupanja od oblma pronaiaska. Mnoge njegove varijadje i modifikadje biče jasne stručnjadma i mogu se Izvršiti bez odstopanja od duha I oblma pronaiaska koji je ovde opisan.

Soj koji odgovara ATCC No. 31,199 (8-968) je mutiran da bi se razvili sojevi sa višom alfa-amilaznom aktivnošču. Upotrebtjene kultivadone sredine su date niže u tablid.

kolonija B-968 je kultivisano na temperaturi od 55°C 16 h uz mučkanje od 130 rpm. Čelije su isprane i suependovane u sterilnoj vodi. Zatim je dodat etilenimln tako da je krajnja koncentradja bila 1 /Ul/1ml 47% kolonija je dalo 30-40 CPC alfaamllaznih jedinica na milllitar filtrata kultivadone sredine.

Jedan soj, identifikovan kao M-1041 je izolovan nakon gornje procedure i dalje se tretira. Kultivisanje u sredini za zasad na gornji način a potom je ispran i suspendovan u sterilnoj vodi. Zatim je tokom 20 sec tretiran sa UV-zradma uz mešanje na magnetnoj mešalid u petrijevoj šolji postavljeno] 28 cm ispod

UV-Jampe. 3% aakupljenlh kolonija je imalo aktivnost od 80 do 100 CPC-aHa-amllaznih Jedinlca na milllftar filtrata kultivadone sredine.

Sakupljen je soj Identifikovan kao M-1327 i kultivisan je 5h na

55°C u glavnoj sredini, čelije su isprane sa sterilnom vodom I suspendovane i mešane 30 min. u 5 ml fosfatnog pufera koji je sadržavao 100yug/ml N-metil-N’-nltro-N-nitrozo-gvanldlna na pH 6-0 i sobno] temperaturi. Mutantni soj Iz ove procedure je identifikovan kao M-1717.

' -TOBEICA.

Sastav sredine (% nas./zapr.)

Kosi agar Ravan Zasad Glavn

Rastvomi škrob Kukuruzni škrob	1.0	3.0		6.0
Ažurna amiloza	-	0.1	-	-
CSL*	-	-	-	1.0
Bacto-tripton	0.5	0.5	-	-
Ekstrakt kvasca	0.5	0.5	1.0	0.5
Farmamedia	-	-	-	4.0
CaCl_.2H.O	0.05	0.05	0.05	0.1
MgSO4.7H«O	-	0.05	0.05	0.05
MnCl2.4H2O	0.05	0.0001	0.0001	0.001
kh2po4	0.1	0.1	0.1	-
NaCI	-	—	—	0.005
Agar	2.0	2.0	-	-
pH	6.0	6.0	.6.0	6.25.

M-1717 je dalje deljen na tri tipa A, B i C. Tip B je pokazao najstabilnlju prolzvodnju enzima i najbolju aHa-amllaznu aktivnost. (190-280 CPC-aHa-amilaznlh jedlnlca na ml. kultivadonog filtrata). OVaj soj, M-1717 B, je kultivisan u glavnoj sredini u Istim ušlovima kao M-1327, a zatim Je Ispran i eupsendovan na Isti način. Mutantni soj, identifikovan kao N-21 je Imao aktivnost od 330 do 490 CPC-aHa-amilaznlh jedlnlca na ml. kultivadonog filtrata.

Za praktične evrhe, pozitivni mutanti su sakupljenl razblažlvanjem mutageno-tretiranih čelija, slpanjem razblaženlh čelija u ravnu sredinu I kultivisanjem preko noči na 70°C. Bistre zone oko kolonija su obrazovane hldrolizom amlloza-azura u ravno] sredini.

Kosi agari su napravljeni na kosoj sredini od kolonija koje su Imale najšire bistre zone i kultivisan! su preko noči na 70°C. Sojev! sa najvlšlm prlnosom su sakupljenl i prečiščeni.

Claims (2)

1. PATENTNI ZAHTEVI

   1. Postupak za dobivanje alfa-amilaznog enzima otpornog na toplotu i kiseline, naznačen time, što obuhvata kultivlsanje mikroorganizma soja odabranog u grupi koja se sastoji od Badllus stearothermophilus ATCC Nos. 31,195, 31,196, 31,197, 31,198 i 31,199 u kultivadonoj sredini koja sadrži asimiladone Izvore ugljenika i azota i koja uključuje 6% kukuruznog škroba, 1% tečnosti kukuruzne kvasine, 0,5% brašna pamukovog semana, 01,% CaCl^h^O, 0.05% Mg SO₄.7H₂O, 0.001% MnCIg^HgO i 0.05% NaCI, pri čemu su svi procenti mas./zapr., a kultivlsanje se vrši na pH od 5 do 9, poželjno oko 6.25-6.30, tokom perioda od jednog do pet dana, na temperaturi od oko 50-70°C, poželjno oko 55-60°C, i što se tako dobivenl alfaamilazn! enzim izoluje iz fermenadone sredine.
2. 2. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time, što fermentadona sredina još sadrži do 2%, 50%-rastvora kiselo hldrollzovanog sojlnog proteine koji sadrži 20% NaCI.