DE2717333A1

DE2717333A1 - Hitze- und saeurebestaendiges alpha- amylaseenzym, verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung

Info

Publication number: DE2717333A1
Application number: DE19772717333
Authority: DE
Inventors: Yoshiko Ishii; Mutsuo Kanno; Masaki Tamura
Original assignee: Unilever Bestfoods North America
Current assignee: Unilever Bestfoods North America
Priority date: 1976-04-19
Filing date: 1977-04-19
Publication date: 1977-11-10
Also published as: CA1081633A; FI771240A; YU40476B; ES457925A1; DK169877A; NL7704280A; DE2717333C2; FI58157B; NZ183818A; DK149157C; AU513863B2; BR7702475A; IT1080353B; FR2348930B1; FI58157C; JPS52151790A; AR218023A1; YU99877A; MY8000095A; AU2422677A

Description

MÜLLER-BORE · DEUFEL · SCHÖN · UERTEL PATE NTAN WALTE

DR. WOLFGANG MÜLLER-BORE (PATENTANWALTVON IM7-I97S) DR. PAUL DEUFEL. DIPL.-CH EM. DR. ALFRED SCHÖN. DIPL.-CHEM. WERNER HERTEL. DIPL.-ΡΗΥβ.

C 2999

CPC INTERNATIONAL INC.

International Plaza, Englewood Cliffs, New Jersey O7632, USA

Hitze- und säurebeständiges Oi--Amylaseenzym, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung

7 09845/0838

β MÜirCHSir ββ · SIXBXRTSTH. 4 · ΡΟβΤϊΑΟΒ ββΟΠΟ · KABEL: MUXBOPAT · TXL. (Μ·) 47«000 · TSLXX S-MSM

Die Erfindung betrifft ein hitze— und säurebeständiges «<—Amylaseenzym, ein Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung bei Verfahren zum Hydrolysieren, Verflüssigen und/oder Umwandeln von Stärke enthaltenden Materialien in Stärkehydrolysate.

0(.-Amylaseenzympräparate wurden seit geraumer Zeit zum Hydrolysieren, Verflüssigen und/oder Umwandeln stärkehaltiger Materialien in Stärkehydrolysate, sowie in Detergentien- bzw. Waschmittelgemischen verwendet. Wenn man oC—Amylaseenzyme zur Behandlung von Stärkematerialien verwendet, so werden sie dabei in der ersten Stufe von Verfahren zur Herstellung einer Reihe synthetischer Stärkehydrolysatmaterialien, wie Maltodextrine, Maissirup, Dextrose, Levulose, Maltose und dergleichen eingesetzt. <X-Amylaseenzyme hydrolysieren Stärkemoleküle, die dabei in eine Vielzahl verschiedener Bruchstücke mit mittlerem Molekulargewicht gespalten werden, die als Maltodextrine bekannt sind. Die Maltodextrine werden nachfolgend mit einem oder mehreren weiteren Enzympräparaten, u.a. Glucamylase, ß-Amyläse und Glucoseisomerase behandelt, um die gewünschten Endprodukte herzustellen. Wahlweise können mehrere dieser Enzympräparate gleichzeitig einer Aufschlämmung des Stärkematerials einverleibt werden, um auf diese Weise direkt das als Endprodukt erwünschte Stärkehydrolysat herzustellen.

o(—Amyläseenzyme können aus einer großen Vielzahl verschiedener Quellen gewonnen werden. Die meisten <X-Amylaseenzyme werden von bzw. aus bakteriellen Quellen, wie Bacillus subtiIi3. Bacillus lichenifortnis, Bacillus stearothermophilus und anderen Mikroorganismenstämmen erzeugt, die in einem geeigneten Nährmedium kultiviert werden, worauf man die dabei erzeugten Zellen zerstört und das Enzympräparat hierauf aus der Kulturbrühe abtrennt und reinigt.

Viele der derzeit im Handel erhältlichen <X-Amylaseenzyme werden aus Bacillus subtilis-Mikroorganismen hergestellt. Bei der Verwendung dieser Enzyme zur Umwandlung von Stärke in

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Stärkehydrolysate weisen sie in der Regel eine optimale Temperatur im Bereich von etwa 80 bis 85 C und einen optimalen pH-Wert von etwa 6,0 auf. Diese Temperatur- und pH-Bedingungen, die für eine effiziente Nutzung des Enzyms erforderlich sind, haben zwei Nachteile. Erstens wird ein Teil der reduzierenden Endgruppen der Stärke isomerisiert, wenn die Stärke mit dem Enzym bei einem pH von etwa 6 und einer Temperatur von etwa 80 bis 85 C konvertiert wird, wobei dann im Verlauf des nachfolgenden Umwandlungsverfahrens Maltolose erzeugt wird, wodurch sich die Ausbeute an dem gewünschten Endprodukt, z.B. Dextrose, Levulose oder Maltose, verringert. Zweitens liegt das pH-Optimum von Glucamylase, die beim Konversions— und Verzuckerungsverfahren eingesetzt wird, in der Regel bei etwa k_t5 bei aus Aspergillus niger gewonnenen Enzymen und bei etwa 5,0 im Fall von aus Rhizopus Mikroorganismen gewonnenen Enzymen. Deshalb muß nach Vollendung der unter Verwendung von o(—Amylase— enzym durchgeführten Verflüssigungsstufe der pH-Wert von etwa 6 auf etwa k,5 oder 5»0 gesenkt werden. Durch diese pH-Einstellung wird die Ionenkonzentration erhöht, wodurch die Belastung der bei der Reinigung des Endprodukts verwendeten Ionenaustauscherharze und folglich auch die Raffinations— kosten steigen.

In den letzten Jahren wurden verschiedene hitzestabile d-Amy-1 aseenzyme entwickelt. Beispiele derartiger oC—Amylaseenzyme sind u.a. die aus Mikroorganismen der Spezies Bacillus stearothermophilus hergestellten Enzympräparate (vgl. Ogasawara und Mitarbeiter, J^ Biol. Chem.. 67» 65» 77 und 83 (197O); G.B. Manning und L. L. Campbell, J^ Biol. Chem., 236, 2952, 2958 und 2962 (1961); S. L. Pfueller und W. H. Elliot, J. Biol. Chem.. 2kk , k8 (1969)). Seit noch kürzerer Zeit sind cX-Amylaseenzyme mit guter Hitzestabilität in neutralen oder schwach-alkalischen Lösungen erhältlich. Diese hitze- und alkalibeständigen Ot-Atay— laseenzyme werden unter dem Markennamen "Thermamyl" vertreten. Sie werden durch Kultivieren von Mikroorganismen der Spezies Bacillus licheniformis erzeugt (vgl. GB-PS 1 296 839, Madaen und Mitarbeiter, Die Stärke, 2£, 304, 305 und 308 (1973) und Narimasa Saito, ABB, J_5J>, 290 (1973)) S Aus Bacillus licheni-

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form!3 erzeugte Ot-Amylaseenzyme besitzen zwar eine gute Hitzestabilität in neutralen und schwach—alkalischen Lösungen, sind jedoch unter sauren Bedingungen nicht stabil genug, um wirtschaftlich eingesetzt werden zu können.

Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, °(-Ainylaseenzyme zu schaffen bzw. zur Verfügung zu stellen, die sowohl eine gute Hitzebeständigkeit als auch eine gute Stabilität unter sauren Bedingungen, und insbesondere bei pH-Werten besitzen, die es ermöglichen, sie unter Bedingungen einzusetzen, die für andere Amylasen, wie Glucamylase, verträglich sind.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein hitze- und säurebeständiges o(-Amylaseenzym gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es in der Lage ist,

1. mindestens etwa 70 °/o seiner anfänglichen Λ-Amylaseaktivität zu behalten, wenn man es in Abwesenheit zugesetzter Calciumionen 10 Minuten bei 90 C und einem pH von 6,0 hält,

2. mindestens etwa 50 % seiner anfänglichen &-Amylaseaktivität zu behalten, wenn man es in Abwesenheit zugesetzter Calciumionen 60 Minuten bei 90 C und einem pH von 6,0 hält,

3. mindestens etwa 50 # seiner anfänglichen Ot-Amylaseaktivität zu behalten, wenn man es in Gegenwart von 5 mMol Calcium— ionen 10 Minuten bei 80°C und einem pH von k,55 hält.

Bevorzugte erfindungsgemäße Enzyme sind außerdem dazu befähigt, mindestens etwa 50 ?6 ihrer anfänglichen Aktivität bei einer Temperatur von 85 C und einem pH von 4,55 in Gegenwart von 5 mMol Calciumionen und 22,5 Gewichtsprozent Stärke, Trockensubstanz, zu behalten. Bevorzugte erfindungsgemäße Enzyme sind weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß sie befähigt sind, mindestens etwa 95 % ihrer anfänglichen oi-Amylaseaktivitat bei einer Temperatur von 80⁰C und einem pH-Wert im Bereich von etwa k bis 6,0 zu behalten. Diese Enzyme stammen vorzugsweise von einem Mikroorganismus der Gattung Bacillus und ins-

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besondere von einem Mikroorganismus der Spezies Bacillus stearothermophilus.

Bevorzugte erfindungsgemäße Ci-Amylaseenzyme besitzen ein durch SDS-Scheibenelektrophorese bestimmtes Molekulargewicht von mindestens etwa 90 000 und sind dadurch gekennzeichnet, daß sie im wesentlichen frei von Proteaseaktivität sind. Sie weisen beispielsweise in der Regel ein Protease/ct-Amylase-Verhältnis von weniger als 3 und insbesondere weniger als 1 auf.

Die neuen oi-Amylaseenzyme der Erfindung werden vorzugsweise hergestellt, indem man einen Mikroorganismus der Spezies Bacillus stearothermophilus und insbesondere einen Mikroorganismenstamm aus der Gruppe Bacillus stearothermophilus ATCC Nr. 31 195, 31 196, 31 197, 31 198 und 31 199, einschließlich der Varianten, Mutanten und Submutanten der genannten Stämme kultiviert und dann das dabei erzeugte oC-Amylase enzym gewinnt.

In der Zeichnung zeigt:

Figur 1 ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der Restaktivität und dem pH-Wert für zwei erfindungsgeroäße Enzyme und, zum Vergleich,bei Thermamyl-öf-Amylase erläutert;

Figur 2 ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der relativen Aktivität und der Temperatur bei zwei erfindungsge— mäßen Enzymen sowie, zum Vergleich, bei Thermamyl-Ot-Amylase erläutert;

Figur 3 ein Diagramm, das die Thermostabilität anhand der Beziehung zwischen der Restaktivität und der Inkubationszeit bei 8O⁰C und einem pH von 4,55 in Gegenwart von 5 mMol Calciumionen für die beiden erfindungsgemäßen Enzyme sowie, zum Vergleich, Thermamyl-(A-Amylaee erläutert;

Figur 4 ein Diagramm, das die Thermostabilität bei 90⁰C und

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einem pH von 6,0 anhand der Beziehung zwischen der Restaktivität und der Inkubationszeit für zwei erfindungsgemäße Enzyme sowie, zum Vergleich, bei Thermamy 1-<X-Amy läse erläutert;

Figur 5 ein Diagramm, in dem die Hitzebeständigkeit von zwei erfindungsgemäßen Enzymen und, zum Vergleich, von Thermamyl-oC- Amy läse, jeweils bei 90⁰C, einem pH von 6,0 und in Gegenwart von 1 mMol Calciumionen dargestellt ist;

Figur 6 ein Diagramm, das die Hitzebeständigkeit von zwei erfindungsgemäßen Enzymen sowie, zum Vergleich, von Thermamyl, jeweils bei 85°C und einem pH von ^,55 in Gegenwart von 1 mMol Calcium!onen und 22,5 "h Stärke, Trockensubstanz, erläutert;

Figur 7 ©in Diagramm, das die Hitzebeständigkeit zweier erfindungsgemäßer Enzyme sowie,zum Vergleich, von Thermamyl-od-Amylase, jeweils bei 85 C, einem pH von 4,55 sowie in Gegenwart von 22,5 # Stärke und 5 mMol Calciumionen erläutert;

Figur 8 ein Diagramm, in dem die Bestimmung des Molekulargewichts zweier erfindungsgemäßer Enzyme durch SDS-Scheibenelektrophorese graphisch dargestellt und erläutert ist;

Figur 9 ein Diagramm, das die Beziehung zwischen dem pH-Wert und der Enzymaktivität bei einem erfindungsgemäßen Enzym sowie, zum Vergleich, bei bekannten, von Mikroorganismen der Spezies Bacillus stearothermophilus stammenden <X-Amylasen erläutert;

Figur 10 ein Diagramm, das die Beziehung zwischen der Temperatur und der Aktivität für ein erfindungsgemäßes Enzym

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und, zum Vergleich.einer bekannten, von Bacillus stearothermophilus stammenden σί-Amy läse erläutert}

Figur 11 ein Diagramm, das die Desaktivierungskurven eines erfindungsgemäßen Enzyms sowie, zum Vergleich, zweier bekannter, von Bacillus subtilis bzw. Bacillus licheniformis stammender o(-Amylasen, jeweils bei 80 C und pH 4,5 in Gegenwart von 5 mMol Calciumionen darstellt;

Figur 12 ein Diagramm, in dem die Desaktivierungskurven eines erfindungsgemäßen Enzyms sowie, zum Vergleich, zweier bekannter, von Bacillus licheniformis bzw. Bacillus stearothermophilus stammender cfcrAmylasen, jeweils bei 90°C und einem pH von 6,0 ohne Calciumionen, darstellt»

Verschiedene Arten von Mikroorganismen wurden unter verschiedenen Bedingungen, wie Wachstums- bzw. Kultivierungstemperatur (37°C, 45°C, 55°C und 70°C), pH-Wert (5,0 und.7,0) und Kulturmedien, bezüglich der Erzeugung von Λ-Amylase und der thermischen Stabilität des gebildeten Enzyms gesichtet. Dabei wurde gefunden, daß thermophile, bei 55°C isolierte Strahlenpilze (ray fungi) und thermophile Fungi bei 45°C OC-Amy läse in hohen Ausbeuten erzeugen, die jedoch nicht hitzebeständig ist, während thermophile Bakterien bei 70°C hitzebeständige oL-Amyl&ae_f jedoch nur in niedrigen Ausbeuten erzeugen. Von diesen Voruntersuchungen ausgehend wurde die weitere Sichtung von Mikroorganismen bezüglich ihrer Fähigkeit säure- und hitzebeständige oC-Amylase zu erzeugen, durch Kultivierung bei 55 und 70°C durchgeführt. Insgesamt wurden 550 Proben Mikroorganismenquellen, unter anderem Bodenproben, Wasser aus heißen Quellen, Kompostproben usw. von verschiedenen Stellen gesammelt·

Die Säure- und Hitzebeständigkeit wurde jeweils bestimmt, indem jeweils die öG-Amylaseaktivität vor und nach einer 10-minütigen Hitzebehandlung der KuIturfilträte bei 8O⁰C und pH 5»0 in Gegenwart von 10 mMol Calciumionen bestimmt wurde.

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-Vb-

Die oC-Amylaseaktivität wurde wie folgt bestimmt:

Eine 0,2#ige Lösung löslicher Stärke wurde wöchentlich wie folgt hergestellt: 200 mg lösliche Stärke wurden in etwa 50 ml 0,2molarer Acetatpufferlösung (pH ^,5), die 0,013 Mol CaCl₂ ^#2H₂0 enthielt, in siedendem Wasser auf 100°C erhitzt, worauf die dabei erhaltene Lösung mit der gleichen Pufferlösung auf 100 ml ergänzt wurde. Das 0,1 ml Enzymlösung und 0,3 ml 0,2#ige Stärkelösung enthaltende Proberohr wurde jeweils 5 Minuten bei . 60 C inkubiert. Dann wurde die Reaktion durch Zugabe von 1,0 ml 0,5normaler Essigsäure abgestoppt· Hierauf wurden 3»0 ml 0,015$iger Jodlösung zugesetzt und eingerührt, worauf die . optische Dichte bei 700 mu gegen H-O als Standard gemessen wurde. Das Rohr ohne Enzym diente als Blindprobe. Seine optische Dichte bei 700 mu wurde als OD, bezeichnet. Eine Enzym— ( aktivitäts)einheit wurde als die Enzymmenge definiert, die unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen zu einer Abnahme des Blauwertes um 10 Ji pro Minute führt.

NML-Einheiten = (0D, - OD) χ 100

0D_b χ 5 x 10

Soweit nichts Gegenteiliges ausdrücklich angegeben ist, wurden die nachfolgend angegebenen ct-Amylaseaktivitäten jeweils in der vorstehend beschriebenen Weise bestimmt (NML-Einheiten). Wo die Ot-Amylaseaktivität in CPC-Ä-Amylaseeinheiten angegeben ist, ist zu beachten, daß die CPC-Einheiten etwa i/i*K> der NML-Einheiten sind.

Die CPC-o(-Amylaseaktivitätseinheiten wurden nach folgender Methode bestimmt:

Ein ml einer entsprechend verdünnten Enzymlösung wird 10 ml einer 1,0% lösliche Stärke enthaltenden, 0,3molaren Essigsäurepuff er lösung (pH 6,0)zugesetzt, worauf man das Gemisch 10 Minuten bei 6o°C reagieren läßt. Dann wird 1 ml der Reak-

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tionslösung in einen 100 ml Meßkolben gegeben, in dem 50 ml 0,02normaler Salzsäure vorgelegt sind, worauf man 3 ml 0,05#ige Jodlösung zugibt und den Kolbeninhalt dann mit Wasser auf 100 ml ergänzt. Die sich entwickelnde Blaufärbung wird durch Messen der Absorption bei 620 mu bestimmt. Eine CPC-Einheit ist als die Menge Enzym definiert, die erforderlich ist, um unter den angegebenen Bedingungen in einer Minute 10 mg Stärke abzubauen.

1 CPC-Einheit = D_q - D_g χ 50 χ (Verdünnungsfaktor) ;

D 10 χ 10 ο

D = Absorption der Vergleichslösung (statt der Enzymlösung wird Wasser zugesetzt) ;

D = Absorption der Reaktionslösung

Die bei den "screening"— bzw. Sdc htungsversuchen angewandten Kulturbedingungen und -medien sind in der nachfolgenden Tabelle X zusammengefaßt.

Die Ergebnisse der ersten und der zweiten Sichtungsversuchsreihen (1. bzw. 2. Sichtung) sind in der nachfolgenden Tabelle II wiedergegeben.

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Kulturbedingungen und -medien

Bedingungen

Platten-Kultur*¹' Schräg-Agar-Kultur'²' Kolben-Kultur*³'

a) 55°C /pH 5 55°C /pH 5 50°C /pH 6

b) 55°C /pH 7 55°C /pH 7 50⁰C /pH 7

c) 70⁰C /pH 5 70°C /pH 5 60°C /pH 6

d) 70⁰C /pH 7 70⁰C /pH 7 60⁰C /pH 7

(1) Medium für die Plattenkultur

Cb^bJ

Amylopectin 0,02 96 (NH^)₂HPO 0,025

Hefeextrakt 0,025 Na-Ci trat 0,01 96 MgSO. ·7HO 0,05 96

KCl 0,15 96

CaCl₂*2H₂O 0,05 96 Agar - 2,0 96

(2) Medium für die (3) Medium für die Schräg-Agar - Kultur (B-D) Kolben-Kultur (B-M)

Lösliche Stärke 1,096 3,0 96

Bacto-trypton (Difco) 0,5 # °»5 #

Hefeextrakt 0,5 # ¹»° #

CaCl₂»2H₂0 0,05 96 °tO5 %

• 4H 0 0,05

•7H₂0 - °t°5 96

_k 0,1 96 0.1 #

Agar 2,0

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Tabelle II

1 . Sichtung

Isolierungs- Isolierte bedingungen. Stämme

Sichtungsergebnis (Screening) 2. Sichtung

Verteilung von OC-Amylaseerzeugern

100-200 ~500 ~1000 -2000 ~2500 E/ml E/ml E/ml E/ml E/ml

55°C/pH	5,0	Strahlenpilze (Ray fungi) 503 Stämme	+	16 O	O	46 O	34 O	1 O
		Bacterien 292 Stämme	+	9 O	k 1	2 2	O O	O O
55°C/pH	7,0	Strahlenpilze (Ray fungi) 629 Stämme	+	16 O	50 O	34 O	27 O	5 O
		Bacterien 769 Stämme	+	5 k	3 3	2 O	O O	O O
70°C/pH	5,0	Bacterien 841 Stämme	+	O 7	1 1	O 1	O 3	O O
70°C/pH	7,0	Bacterien 1326 Stämme	+	O 15	O 2	O O	O O	O O

RA: Verbleibende Aktivität bzw. Restaktivität nach 10-minütiger Wärmebehandlung bei 8O⁰C und pH 5,0. Alle RA-positiven Stämme wiesen etwa 100 # Restaktivität auf·

Etwa 25 96 der bei 55 C isolierten thermophilen Strahlenpilze erzeugten 100 bis 2500 Einheiten Λ-Amylase pro ml Kulturbrühe, jedoch war nach der Wärmebehandlung (1O Minuten bei 80°C und pH 5»0) keine Restaktivität mehr vorhanden.

Von insgesamt IO61 bei 55 C isolierten thermophilen Bakterienstaminen erzeugten insgesamt 35 Stämme oi-Amylase in einer zwischen 100 und 1000 Einheiten pro ml Kulturbrühe liegenden Menge, wobei 10 dieser Stämme eine hitzebeständige oC-Amylase erzeugten. Fast alle von bei 70°C isolierten thermophilen Bakterien erzeugten oc-Amylasen waren säure- und hitzebeständig. Dabei wurden die größten (X-Amylasemengen von Bakterienstänunen erzeugt, die bei pH 5*0 isoliert worden waren.

Bei den letztgenannten 219 Stämmen, die bei 70⁰C und pH 5,0 isoliert worden waren, wurde die Beziehung zwischen der Aktivität und der Klarzonengröße untersucht. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in Tabelle IXX wiedergegeben, aus der zu ersehen ist, daß 90 $ dieser Stämme Klarzonen mit einem Durchmesser von weniger als 3 cm ergaben und 0 bis 200 Einheiten d—Amy läse erzeugten. Die höchste Ot-Amylaseproduktion wurde bei den Stämmen erreicht, die eine Klarzone mit einem Durchmesser von mehr als 3 cm ergaben, jedoch waren dies nur 10 # der geprüften Stämme.

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Tabelle III

Beziehung zv/ischen Aktivität und Klarzonengröße des isolierten Stamms

Aktivität KlarzonengröOe auf der Isolierunga-

ira platte

Kolben (Durchmesser in cm)

(E/ml)	<2	-3	15	0	Gesamt
0-100	153	ko	1	0	208
- 200	3	2	2	0	6
- 500	0	0	1	0	2
- 1000	0	0	1	1	1
- 1500	0	0		2

Gesamt 156 k2 20 1 219

Aufgrund der vorstehenden Versuche wurde gefunden, daß die Isolierung von Bakterienkolonien mit einer Klarzone mit einem Durchmesser von mehr als 3 cm auf dem bei diesen Versuchen verwendeten Plattenmedium bei 70°C und einem pH von 5,0 eine
ausgezeichnete Methode zur Sichtung von. bzw. Suche nach Mikroorganismen darstellt, die befähigt sind, säure- und thermostabile ei—Amylaseenzyme in hohen Ausbeuten zu erzeugen.

Als Ergebnis dieser Sichtung wurden 5 Stämme als beste bzw. leistungsfähigste Erzeuger säure- und hitzebeständiger Ct-Amylaae· enzyme ausgewählt.

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-Vt-

Jeder dieser fünf Stämme wurde in wie nachstehend beschrieben gereinigter Form in der dauernden Sammlung der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, hinterlegt. Die ATCC bewahrt und erhält diese Stämme aufgrund einer vertraglichen Vereinbarung mit der CPC International Inc..

Der Vertrag zwischen der ATCC und der CPC International Inc. sieht vor, daß die Kulturen oder Subkulturen der Allgemeinheit nach

1) Erteilung eines US-Patents, das die fraglichen Hinterlegungen beschreibt und identifiziert und die ihnen zugeteilten ATCC-Nr. offenbart

oder

2) Bekanntmachung oder Offenlegung einer US- oder ausländischen Patentanmeldung, die die fraglichen Hinterlegungen beschreibt und identifiziert und die ihnen zugeteilten ATCC-Nr. offenbart, ·«

ständig zur Verfügung stehen. Die CPC International Inc. hat sich für den Fall, daß irgendeine dieser hinterlegten Kulturen während der Laufzeit des Patents absterben oder zerstört werden sollte, verpflichtet, diese durch eine lebende Kultur des gleichen Organismus zu ersetzen. Außerdem hat die CPC International Inc. die ATCC authorisiert, dem United States Patent and Trademark Office und dem Patentamt der Bundesrepublik Deutschland durch einen authorisierten Angehörigen der genannten Behörden die Kulturen oder Subkulturen auf Anfrage jederzeit zugänglich zu machen.

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Hinterlegte Organismen NML-Starom Nr. ATCC Nr.

Bacillus stearothermophilus B-501 31 195

Bacillus stearothermophilus B-63k 31 196

Bacillus stearothermophilus B-781 31 197

Bacillus stearothermophilus B-905 31 198

Bacillus stearothermophilus B-968 31 199

Außerdem wurden die NML-Stämme B-501 und B-781 beim Fermen tation Research Institute, Industrial Technology Agency, MITI, unter den FRI-Nummern 3389 und 3390 hinterlegt.

Die fünf (5) bei der ATCC hinterlegten, ausgewählten Stämme weisen folgende bakteriologische. Merkmale auf:

(1) Morphologische Merkmale;

A. Form und Größe der Zellen: 0,6 χ 2 - 3 p» einzelne

Stäbchen, selten in Ketten (alle Stämme)

B. Pleomorphie: Negativ (alle Stämme)

C. Beweglichkeit: Beweglich und begeißelt (alle Stämme)

D. Sporen: 0,6 χ 1,0 - 1,5 ρ» eiförmig; keulenförmiges

Sporengehäuse (alle Stämme)

E. Gram -Flecken: Positiv (alle Stämme)

F. Säurefestigkeit: Negativ (alle Stämme)

(2) Wachstum auf verschiedenen Medien

A. Nähr- Agar-Platte: Sich aktiv ausbreitende Kolonien

mit körniger Oberfläche und rauhen Kanten (alle Stämme)

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B. Nähr-Schräg-Agar-Platte: Gutes Wachstum, weiß-opak»

aktive Ausbreitung, wabenartige Auswüchse (alle Stämme)

C. Nährbouillon-Flüssigkultur: Transparent braun, weißer

Oberflächenrasen (alle Stämme)

D. Nährgelatine-Stich-Kulturt Verflüssigung (alle Stämme) (Nutrient gelatin stab culture)

E. Nährgelatine-Ag ar-Platte: Breite Klarzone (alle

Stämme)

F. Salz-Nährbouillon-Flüssigkultur: Wachstumsinhibierung

in 2 % Salz (alle Stämme)

G. Milch-Agar-Platte: Klarzonenbildung durch Hydrolyse

von Casein (alle Stämme)

H. Glucose-Schräg-Agar-Platte: Gutes Wachstum, ähnliche

Kolonien wie auf Nähragar (alle Stämme)

I, Proteosepepton -Schräg-Agar-Platte: Kein Wachstum

(alle Stamine)

(3) Physiologische Merkmale:

A. Nitratreduktion: Positiv (alle Stämme)

B. Katalasetest: Positiv (alle Stämme)

C. Vogues-Proskauer-Reaktion: Positiv (alle Stämme)

D. Verwertung von Citronensäure: Positiv (alle Stämme)

E. Schwefelwasserstoffbildung: Positiv (alle Stämme)

F. Schwefelwasserstoffbildung: Positiv (alle Stämme)

G. Stärkehydrolyse: Starke Hydrolyse (alle Stämme)

H. Bildung von Säure und Gas: Positiv bzgl. Säure, jedoch

keine Gasbildung aus

709845/0838 ^Glucose> Xylose, Arabinose

und Mannit (alle Stämme)

*0

I, Temperatur- und pH-Bedingungen!

37°C

50 - 70 C

pH-Bereich für Wachstum

optimaler pH

ATCC Nr. 31 195 (B-501)

ATCC Nr. 31 197 (B-781)

kein Wachstum schwaches Wachstum schwaches Wachstum mäßiges Wachstum gutes Wachstum gutes Wachstum

5-8
6-7

5-8 6-7

Die vorstehenden Tests wurden entsprechend "Laboratory Methods in Microbiology¹¹ von W. F. Harrigan und Mitarb, und den von der American Bacteriological Association herausgegebenen "Manual of Microbiological Methods" durchgeführt.

Anhand der vorstehenden Charakter!stika wurden die fünf ausgewählten Stämme in Übereinstimmung mit Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Ausgabe, als Bacillus stearo— thermophilus identifiziert.

Diese fünf Stämme wurden nach der Plattenstreifmethode weiter gereinigt. Die Ergebnisse der Isolierung, Kultivierung und Reinigungsbedingungen bezüglich der fünf ausgewählten Stämme sind in der nachfolgenden Tabelle IV zusammengefaßt. Wie aus Tabelle IV zu ersehen ist, war der gereinigte Stamm ATCC Nr. 31 199 (B-968), der Öf-Amylase in einer einer Aktivität von 2111 NML-Einheiten/ml Kulturbrühe entsprechenden Menge (etwa 15 CPC-Einheiten) erzeugte, der beste der fünf ausgewählten Stämme.

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Tabelle IV

Übersicht über die ausgewählten Stämme

	ATCC Nr.	195	1.	Sichtung	5,0	2.	Sichtung	1 152	89	Kultur bedingun gen	Reinigung	72	Kultur bedingun gen
		196	Isolierungs bedingungen Temp. pH	5,0	Herkunft Aktivität Kultur bzw· (E/ml) zeit Quelle (h)	700	112		Aktivität Kultur- (B/ml) zeit	65
O	31	197	( ^c)	5,0		591	kz			26
CO	31	198		5,0		1 217		60°C/pH 6		65	60°C/pH 6
cn	31	199	70	5,0	Ackerboden	1 098		50°C/pH 6	1 372		50°C/pH 6
/0831	31		55		Boden aus Stärkeabsetz becken			60°C/pH 6	687		60°C/pH 6
	31		70		Boden aus heißer Quelle			60°C/pH 6	1 002		60°C/pH 6
		70	Fermentierter Hafer in Silo			60°C/pH 6	859		55°C/pH 6
		70	Kompost			2 111	IS5
						fl7333 I I I I I

Bei der Herstellung der erfindungsgemäßen <X—Amyläseenzyme wird ein zur Erzeugung eines säure- und hitzebeständigen d-Amylaseenzyms befähigter Mikroorganismenstamm, z.B. ein Stamm, der den in Tabelle III angegebenen Testanforderungen genügt, beispielsweise Bacillus stearothermophilus Stamm ATCC Nr. 31 195t 31 196, 31 197, 31 198 oder 31 199 in einem zum Kultivieren thermophiler Bakterien bekannten Nährmedium kultiviert. Diese Kulturmedien sollten eine assimilierbare Kohlenstoff— und Stickstoffquelle sowie andere wesentliche Nährstoffe enthalten.

Geeignete assimilierbare Kohlenstoffquellen sind u.a. Kohlenhydrate, wie Stärken, hydrolysierte Stärken, Maismehl, Weizenmehl usw.. Die Kohlenhydratkonzentration im verwendeten Nähr— medium kann innerhalb weiter Grenzen schwanken und beispielsweise zwischen etwa 1 und 25 und vorzugsweise im Bereich von etwa 10 bis 20 ?£ (Gewicht/Volumen), berechnet als Dextrose, liegen. Bevorzugte assimilierbare Kohlenhydrate sind Stärke oder partiell hydrolysierte Stärke, die, wenn sie auf Gewichts— basis verwendet werden, in Mengen in einem Bereich von 1 bis 5 Gewichtsprozent vorhanden sein sollen.

Die Stickstoffquelle im Nährmedium kann anorganisch und/oder organisch sein. Geeignete anorganische Stickstoffquellen sind u.a. Ammoniumsalze und anorganische Nitrate usw.. Geeignete organische Stickstoffquellen sind u.a. Pepton, Fleischextrakt, Enzymextrakt, Casein, Maisquellwasser, Malzextrakt, Sojabohnen— mehl, Magermilch usw..

Außerdem sollte das Nährmedium die üblichen Spurenstoffe, z.B. anorganische Salze, die u.a. Calciumchlorid, Magnesiumsulfat, Phosphate, Natriumchlorid, Kaliumchlorid usw. umfassen, enthalten. Die vorstehenden Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und anorganischen Salze können einzeln oder in geeigneten Kombinationen verwendet werden. Außerdem können kleine Mengen von Metallsalzen, Vitaminen, Aminosäuren usw. verwendet werden, um das Wachstum und die Produktivität der Bakterien zu fördern.

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Bei der Herstellung der erfindungsgemäßen CV-Amyläseenzyme wird bei den gleichen Kultivierungsbedingungen gearbeitet, die normalerweise bei der Kultivierung thermophiler Bakterien angewandt werden. Vorzugsweise wird der Stamm in einem tiefen flüssigen Kulturmedium unter Rühren und Belüftung zwei bis fünf Tage bei 50 bis 70°C und einem pH-Wert von 5 bis 9 kultiviert. Das Enzym sammelt sich in dem kultivierten Medium an.

Nach der Erzeugung bzw. Bildung des erfindungsgemäßen O^-Amylaseenzyms werden die Mikrobenzellen in herkömmlicher Weise, z.B. durch Zentrifugieren, abgetrennt. Das Filtrat wird dann vorzugsweise durch Zugabe anorganischer Salze, wie Ammoniumsulfat, Natriumsulfat oder Magnesiumsulfat, ausgesalzen und/ oder durch Zusatz wassermischbarer organischer Lösungsmittel, wie Aceton, Äthanol, Propan-2-ol usw., versetzt, um das Enzym auszufällen, so daß dieses konzentriert werden kann. Man kann die ft-Amylase auch dadurch gewinnen, daß man dem Filtrat Stärke zusetzt, so daß die OC-Amylase an die Stärke adsorbiert wird.

Eine bevorzugte Methode zur Reinigung und Abtrennung des Enzyms aus dem Filtrat besteht darin, daß man das Filtrat mit dem doppelten Volumen kaltem Aceton versetzt, um das Enzym auszufällen. Das ausgefällte Enzym wird dann in 0,05molarer Tris-Salzsäurepufferlösung (pH 8,5) gelöst und dann durch eine DEAE-Zellulosesäule, die mit der gleichen Pufferlösung ins Gleichgewicht gebradi t ist, beschickt. Bei einem pH-Wert von 8,5 werden die Nicht-öG-Amylaseproteine, Pigmente usw. an der DEAE-Zellulose adsorbiert, während der größte Teil der OC-Amy läse in Lösung bleibt. Das das it—Amy läse enzym enthaltende Filtrat wird nachfolgend als "partiell raffiniertes Enzym¹¹ bezeichnet. Das partiell raffinierte Enzym kann weiter gereinigt werden, indem man es gegen eine 0,01m Tris-Salzsäurepufferlösung (pH 7»0) dialysiert und dann durch eine Hydroxylapatitsäule schickt, die mit der gleichen Pufferlösung ins Gleichgewicht gebracht ist. Dabei wird das Enzym an die Säule adsorbiert.

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Das adsorbierte Enzym wird eluiert, indem man die Ammoniumsulfatkonzentration stetig von 0 auf 0,05molax* steigert.

Das so erhaltene partiell raffinierte Enzym wird,nachdem man es konzentriert hat, durch eine Ionenaustauscherharzsäule (Sephadex G-150) geschickt, wobei das Enzym schwach an das Ionenaustauscherharz adsorbiert wird. Das Enzym wird in der Fraktion mit einem Molekulargewicht unter 10 000 eluiert. Die Aktivität des auf diese Weise erhaltenen raffinierten Enzyms ist zwar 100 mal höher als im ursprünglichen Filtrat, jedoch sind bei der Scheibenelektrophorese außer dem des QC-Amylaseenzyms auch Streifen einiger weniger anderer Proteine zu beobachten, und außerdem ist das Enzym noch nicht kristallisiert. Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung und sind in keiner Weise als Beschränkung zu verstehen. Angaben bezüglich der Anteile oder Mengenverhältnisse beziehen sich, soweit nicht ausdrücklich etwas anderes angegeben ist, stets auf das Gewicht.

Beispiel 1

Ein 3,0 Gew.-# lösliche Stärke, 0,5 Gew.~# Bactotrypton, 1,0 Gew.-96 Enzymextrakt, 0,05 Gew.-# Calciumchlorid, 0,05 Gew.-# Magnesiumsulfat und 0,1 Gew.-# Kaliumdihydrogenphosphat enthaltendes Kulturmedium wurde auf pH 7 eingestellt. 50 ml dieses Mediums wurden in einen 500 ml fassenden konischen Kolben gegossen und Minuten bei 121 C sterilisiert. Das sterilisierte Medium wurde mit Bacillus stearothermophilus Stamm ATCC Nr. 31 195 (B-501) beimpft und dann h Tage bei 60 C unter Rühren bebrütet. Nach dem Kultivieren wurden die Mikrobenzellen abzentrifugiert· Die enzymatische Aktivität des Filtrats betrug 10 CPC-o<--Amylaseeinheiten/ml (bestimmt nach der vorstehend beschriebenen CPC-Methode). Dieses Filtrat wurde mit dem zweifachen Volumen Aceton versetzt, um das Enzym auszufällen, das dann in einer 0,05mola— ren Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,5) gelöst wurde. Diese Lösung wurde dann durch eine DEAE-Zellulosesäule geschickt, die mit

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der gleichen Pufferlösung ins Gleichgewicht gebracht worden war. Das ji-Amylaseenzym wurde nicht an die DEAE-Zellulose adsorbiert, während die meisten anderen Proteine, Pigmente usw. adsorbiert und somit abgetrennt wurden. Das so erhaltene partiell raffinierte Enzym wurde dann zuerst konzentriert und hierauf durch eine Sephadex~G-150-Säule geschickt. Dabei wurde das Enzym schwach an das Ionenaustauscherharz adsorbiert und in der Fraktion mit einem Molekulargewicht von weniger als 10 000 eluiert. Das so erhaltene gereinigte Enzym wurde dann durch Gefriertrocknen zu einem raffinierten Enzympulverpräparat aufgearbeitet, dessen relative Aktivität etwa. 200 CPC-Einheiten/mg Protein betrug.

Beispiel 2

Ein Kulturmedium, das 3 % Maisstärke, 0,5 % Pepton, 1 # Maisquellwasser, 0,05 °fa Calciumchlorid, 0,05 % Manganchlorid, 0,05 # Magnesiumchlorid und 0,05 # Kaliumchlorid enthielt, wurde auf pH 7»5 eingestellt. 50 ml dieses Kulturmediums wurden in einen 500 ml fassenden konischen Kolben gefüllt und 15 Minuten bei 121°C sterilisiert. Das sterilisierte Medium wurde mit Bacillus stearothermophilus Stamm ATCC Nr. 31 196 (B-781) beimpft und k Tage bei 55°C gerührt. Nach dem Kultivieren wurden die Mikrobenzellen durch Zentrifugieren abgetrennt. Die °i-Amylaseaktivität im Filtrat betrug 1^ CPC-Einheiten/ml. Die oC-Amylase wurde durch Zusatz von Propan-2-ol in einer dem doppelten Filtratvolumen entsprechenden Menge ausgefällt. Die Fällung wurde durch Gefriertrocknen zu einem trockenen Pulver aufgearbeitet. Die Aktivität des rohen Enzympulvers betrug 3 CPC-Einheiten/mg. Aus diesem rohen Enzympulver wurde durch Reinigung analog Beispiel 1 ein raffiniertes Enzympulver mit einer Aktivität von 230 Einheiten/mg erhalten.

Die fünf isolierten und ausgewählten Stämme, also ATCC Nr.

31 195, 31 196, 31 197, 31 198 und 31 199, wurden bezüglich des

Einflusses der Temperatur und des pH-Werts auf die Bildung von

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θί-Amylase geprüft. Die <X-Amylaseaktivität wurde bei diesen Versuchen durch den Mittelwert des jeweiligen Aktivitäts— maximums in bzw. bei drei Kolben bzw. Parallelversuchen ausgedrückt. Die Zusammensetzung des Kulturmediums für sowohl die Vorkultur als auch die Hauptkultur wies die in der Tabelle I angegebene Zusammensetzung (B-M-Medium) auf. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in der nachfolgenden Tabelle V zusammengefaßt .

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	ATCC Nr.	Einfluß	von Temperatur und	055	pH	Tabelle	pH 6	V	1	(Kulturzeit)	7,0	1	PH	7,5	pH 8	,0	IS?
	31 195			355	auf die			1	pH	(90)				100	(90)
				942	Aktivität				514	(90)				120	(90)
		50	pH 5,5 pH 6,0	0					334	(90)	1			1 040	(90)	co CO
		55	1	418	(90)				490	(90)	1			30	(90)
	31 196	60	1	477	(90)				100	(89)	1
O		65		608	(48)		«X-Amylaseproduktion		368	(41)
co co		45		932	(90)		E/ml		681	(41)
I _ ,η.		50		403	(89)		,5		916	(68)		168	(43)	1 051	(43)
! £		55		24	(65)				975	(20)	262	(20)	191	(68)
		60		751	(41)			1	356	(20)	155	(20)	59	(43)
	31 197	65		057	(68)	720		1	224	(44)	001	(44)
		70		085	(43)	1 155			679	(44)	330	(27)
		50		687	(43)	1 166			012	(27)	139	(27)
		55			(44)	615		084	(27)	848	(27)
		60	1		(44)			815
		65	1	(44)
		1	(44)

		(44)
	(27)
(27)
(27)

Temp.

Fortsetzung von Tabelle V

Aktivität E/ml (Kulturzeit)

ATCC Nr. ( C) pH 5,5 pH 6,0 pH 6,5 pH 7,0 pH 7,5 pH 8,0

31 198 50 184 (68) 272 (68) 480 (68) 352 (68) 152 (68)

55 768 (44) 752 (68) 832 (44) 880 (44) 955 (44)

60 621 (44) 675 (44) 739 (44) 1 104 (44) 1 123 (44)

65 1 340 (68) 782 (44) 776 (44) 698 (44) 661 (44)

Os 31 199 45 143 (139) 133 (139) 113 (139) 115 (139) 86 (139)

£ 50 686 (139) 663 (139) 543 (139) 493 (139) 491 (139)

Q 55 1 608 (43) 1 365 (43) 1 267 (43) 1 025 (43) 946

⁰⁰ 60 1 485 (43) 1 457 (43) 1 295 (43) 1 154 (43) 1 117

ο» 65 0 (65) 0 (65) 0 (65) 0 (65) 0 (65)

Aus der Tabelle V ist zu ersehen, daß die optimalen Bedingungen für die Stämme ATCC Nr. 31 195 und 31 196 60°C und pH 7,0 bzw. 7,5 betragen. Die Stämme ATCC Nr. 31 197 und 31 198 erzeugten beträchtliche Mengen .X-Amylase, wenn sie bei 65 C kultiviert wurden, jedoch war die Kultivierung bei dieser hohen Temperatur bei den anderen Stämmen nicht für die Erzeugung guter Λ-Amylaseaktivität geeignet. Bei einer Kultivierungstemperatur von 55 bis 60°C betrug der für die öt-Amylaseerzeugung optimale pH-Wert des Kulturmediums 8,0 beim Stamm ATCC Nr. 31 198 und 5,5 beim Stamm ATCC Nr. 31 199.

Die nachfolgende Tabelle VI gibt zusammengefaßt die Ergebnisse bzgl. der <X-Amylaseerzeugung der fünf isolierten Stämme unter Verwendung wiederholt übertragener Schräg-Agar—Kulturen (jeder Stamm wurde mehrmals (9-11 mal) auf zwei verschiedenen Arten von Schräg-Agar-Kulturmedien übertragen bzw. überimpft und dann in einem flüssigen Nährmedium kultiviert, um ein geeignetes Schräg-Agar-Medium zu finden, das eine - stabile OC-Amylase— produktion aufrechterhalten kann) wieder, während die nachfolgende Tabelle VII die wesentlichsten Daten der Versuche wiedergibt, die zur Bestimmung des Einflusses des Mediumvolumens auf die Λ-Amylaseproduktion (das Mediumvolumen in 500 ml Kolben wurde variiert, um den Einfluß des Belüftungseffekts auf die Qi-Amylaseerzeugung durch den jeweils untersuchten Stamm zu ermitteln) durchgeführt wurden.

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lo

	Kulturen	, 1	Stärke	Kolbenkultur	Bedingungen Temp. pH ( ^c)	zur Sichtung (screening)	,0	70	0,5 ic	7,0
	ATCC Medium und	10		Aktivität, E/ral (Kulturzeit /~"h__7)	60	1 ,0 ?έ Agar	,0	0,05 %	η
Tabelle VI	Nr. Zahl der Plattenwech sel	, 10	856 (90)	Il	Bacto-Trypton (Difco) 0,5 # pH		0,05 #	η
	31 195 BD*¹	2	910 (43)	Il	Hefeextrakt	0,1 #	7,5
	BD,	10	i4o (72)	60	CaCl₂'2H₂	9845/0838	η
ίΧ,-Amylaseproduktion unter Verwendung wiederholt überimpfter	NA*²,	10	976 (26)	η	MnCl₂'4H₂		η
Schräg-Agar -	31 196 BD,	1	1 503 (26)	It	KH₂PO₄		7,5
BD,	10	1 550 (26)	' 55			η
NA,	10	1 330 (27)	Il		η
31 197 BD,	4	1 127 (26)	Il		8,0
BD,	11	1 420 (26)	60		η
NA,	11	736 (44)	η		Il
31 198 BD,	2	712 (44)	Il	5,5
BD,	9	1 117 (44)	55	M
NA,	9.	1 163 (44)	η	η
31 199 BD,	1 Schräg-Agar - Medium	1 013 (68)	η
BD,	Lösliche	775 (68)	2,0 j,
NA,		5,0

1«

*2 Nähr-Schräg-Agar -Medium

Bacto-Pepton (Difco) 0,5 Bacto-Rindfleischextr.

(Difco) 0,3

Agar 2,0

PH 7,2

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Tabelle VII Einfluß des Medxumvolumens auf* die Amylaseproduktion

: Kolbenkultur

Zahl der

ATCC Nr. Plattenwechsel

Bed ingungen

Temp.

(°C) H Mediumvolumen Aktivität E/ml ml/500 ml Kulturzeit £λ/ Kolben

31 195

BD-11

60

7,0

50
60
70

150 127

1 192

790

(65) (65)

(41) (65)

31 196

BD-2

60

7,5 30
40
50
60
70

954 966. 976 1 236 651

(26) (26) (26) (26)

31 197

BD-3

55

7,5 30
40
50
60
70

1 435

1 590

1 510

1 380

840

(41) (41)

31 198

BD-4

60

8,0 30
40
50
60
70

689

651 736 939 777

(44

(44)

31 199 BD-2 55 5,5

709845/0838 30 4o 50 60 70

1 131

1 240

1 163

1 054

1 224

(44) (44) (44) (68) (68)

Es wurden zwei Stämme der Erfindung (ATCC Nr. 31 195 und 31 199) gereinigt und die Eigenschaften der von ihnen erzeugten OC-Amylase nach der nachfolgend beschriebenen Arbeitsweise mit denjenigen eines handelsüblichen Enzyms (Thermamyl Liquid 6O, Batch AN IOO5) verglichen.

OC-Amylaseenzym wurde aus den Kulturfiltraten der Stämme ATCC Nr. 31 195 und 31 199 oder aus dem Thermamyl-Ä-Amylase-Präparat (zweifach verdünnt) durch Versetzen mit 2 Volumina kalten Acetons ausgefällt. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren gewonnen und in O,025molarer Calciumacetatlösung gelöst. Dann wurde der so erhaltenen Lösung so viel lösliche Stärke zugesetzt, daß eine 20^ige Stärkesuspension erhalten wurde. Diese Suspension wurde 30 Minuten auf 85 C erhitzt, worauf der Niederschlag abzentrifugiert wurde. Dann wurde die Lösung gegen 0,05molare Tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,5)» die 1OmMoI Clciumionen enthielt, dialysiert, wobei die Pufferlösung zweimal erneuert wurde. Das Dialysat wurde einer DEAE-Zellulosesäule zugeführt, die mit der Dialysepufferlösung ins Gleichgewicht gebracht worden war. Die ok-Amyläse wurde in der Säule nicht adsorbiert und mit der gleichen Pufferlösung eluiert. Die Ci-Amylaseaktivität aufweisenden Fraktionen wurden gesammelt, worauf das θί-Amylaseenzym durch Ausfällen mit Aceton konzentriert wurde. Die Λ-Amylaseaktivität wurde nach der vorstehend beschriebenen CPC-Methode bestimmt. Die wesentlichen Daten des Reinigungsverfahrens bzw. der danach durchgeführten Versuche sind in der nachfolgenden Tabelle VIII zusammengefaßt.

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Tabelle VIII *"

o<	.-Amylasereiniffung	Aceton- fällung	Hitze- behand— lung	DEAE- Zellulose
Reirigungs- , . - Verfahren c\ —Amylase	Kulturbrühe od. rohes Enzympräparat
ATCC Nr. 31 195		8 640 2 016	8 420 1 450	2 400 15,7
Gesamtaktivität (CPC-Einheiten) Gesamtprotein (mg)	9 870 7 990	^,3	5,8	152,9
Spezifische Aktivi tät (Einheit./mg)	1,2	87,5	85,3	24,3
Ausbeute (#)	100
ATCC Nr. 31 199		8 210	Z 214	2 310
Gesarataktivität (CPC-Einheiten)	9 910	1 969	1 206	33
Gesamtprotein (mg)	4 914	*.2	6,0	70
Spezifische Aktivi tät (Einheiten/mg)	2,0	82,8	72,8	23,3
AiB beute (#)	100
Thermamyl		9 400	9 540	2 410
Gesamtaktivität (CPC-Einheiten)	12 100	286	183	24
Gesamtprotein (mg)	684	32,9	52,1	100,4
Spezifische Aktivi tät (Einheiten/mg)	17,7	77,7	78,8	19,9
Ausbeute ($)	100

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Die Säure- und Hitzebeständigkeit der partiell gereinigten tf-Amylasepräparate von den Stämmen ATCC Nr. 31 195 und 31 199t sowie der Thermamyl-O-Amylase mit einer Aktivität von 7 Einh./ml wurde durch 1-stündiges Inkubieren unter folgenden Bedingungen bestimmt:

(a) 90°C, pH 6,0, Ca⁺⁺ 0 oder 1 mMol;

(b) 80°C, pH 4,55, Ca⁺⁺ 5 mMol;

(c) 85°C, pH 4,55, Ca⁺* 1 mMol oder 5 mMol, 22,5 # lösliche Stärke.

5 ml des rt-AmylasePräparats wurden in einem Visking-8/32-Zelluloserohr 3 Stunden bei 4°C gegen 0,05molare Calciumacetatpufferlösung (pH 4,5 bis 6,0) dialysiert, die 0 bis 5 mMol Calciumacetat enthielt, wobei die Pufferlösung zweimal gewechselt wurde. Dann wurden h ml des Dialysats in kleine Proberöhrchen gegeben und bei der angegebenen Temperatur im -Wasserbad inkubiert. Die Proberöhrchen wurden hierauf rasch in einem Eiswasserbad abgekühlt, worauf die verbliebene (X-Amylaseaktivität (Restaktivität) bestimmt wurde.

** 0,3 ml einer dialysierten <X-Amylaseenzymlösung, 0,5 ml einer 1-molaren Calciumacetatpufferlösung, 0,2 ml einer 0,5mo— laren Calciumchloridlösung und 3,0 ml einer 3Obigen Aufschlämmung löslicher Stärke wurden in ein Proberohr pipettiert. Das Gemisch wurde dann unter ständigem Rühren 30 Minuten bei 85 C inkubiert. Dann wurden die Proberöhrchen in einem Eiswasserbad rasch abgekühlt und hierauf die Restaktivität bestimmt.

Die Ä-Amylase-Restaktivitäten wurden jeweils nach Inkubationszeiten von 5» 10, 20, 30 und 60 Minuten bestimmt.

Der optimale pH-Wert und die optimale Temperatur wurden für die oC-Amylasen aus den Stämmen ATCC Nr. 31 195 und 31 199, sowie die Thermamyl-OC-Amylase nach den vorstehend beschriebenen

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CPC-Versuchsbedingungen bestimmt, wobei Jedoch natürlich entweder der pH-Wert oder die Temperatur variiert wurde. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in den Figuren 1 und 2 graphisch dargestellt. Das pH-Optimum lag bei den beiden (X-Amylasen aus den Stämmen ATCC 31 195 und 31 199 bei 4,0 bis 5,2 und bei der handelsüblichen ^(-Amylase (Thermamyl) bei 4,5. Es wurde festgestellt, daß die handelsübliche C(-Amy läse auch in einem neutralen und alkalischen pH-Bereich eine hohe enzymatische Aktivität behält.

Die optimale Temperatur lag bei der Ot-Amy läse aus dem Stamm ATCC Nr. 31 199 bei 75°C, bei der aus dem Stamm ATCC Nr. 31 bei 80⁰C und bei der handelsüblichen öt-Amylase (Thermamyl) bei 85 C. Die Beziehung zwischen der enzymatischen Aktivität und der Reaktionstemperatur war bei den o(-Amylasen aus den Stämmen ATCC 31 195 und ATCC 31 199 sehr ähnlich, während der Verlauf bei der handelsüblichen rt-Amylase (Thermamyl) davon beträchtlich abwich. Es wurde gefunden, daß die Ot-Amylaseaktivität bei der handelsüblichen Oi-Amylase (Thermamyl) um 20 bis 30 i» gesteigert wurde, wenn das Enzym bei 85 C und pH 6,0 in Gegenwart von Stärke und Calciumionen inkubiert wurde. Diese Tatsache kann den Unterschied zwischen den erfindungsgemäßen Λ-Amylaseenzymen aus den Stämmen ATCC 31 195 und ATCC 31 199 einerseits und der handelsüblichen Λ-Amyläse (Thermamyl) andererseits bezüglich des Verlaufs der enzymatischen Aktivität in Abhängigkeit von der Reaktionstemperatur erklären.

Figur 3 gibt die Inaktivierungskurven für die erfindungsgemäßen Öt-Amylasen aus den Stämmen ATCC 31 195 und 31 199 sowie für die handelsübliche <X-Amylase (Thermamyl) beim Inkubieren bei 80°C und pH 4,55 in Gegenwart von 5 mMol Calciumchlorid wieder. Die Cf-Amylase aus dem Stamm ATCC 31 199 wies die höchste Thermostabilität auf, gefolgt von der tt-Amyläse aus dem Stamm ATCC 31 195· Die handelsübliche Ä-Amylase (Thermamyl) war den beiden erfindungsgemäßen A-Amylaseenzymen aus den Stämmen ATCC 31 195 und ATCC 31 199 bezüglich der Hitzebeständigkeit unter den genannten Bedingungen beträchtlich unterlegen·

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Figur k git)* die Inaktivierungskurven für die erfindungagemäßencX-Amylaseenzyme aus den Stämmen ATCC 31 195 und 31 199, sowie für eine handelsübliche Ä-Amylase (Thermamyl) und eine weitere bekannte cC-Amylase, nämlich die von Ogasawara und Mitarbeitern in J_z. Biochem.. 67, 65, 77, 83 (197O) beschriebene Öi-Amylase aus Bacillus stearothermophilus beim Inkubieren bei 90 C und pH 6,0 in Abwesenheit von Calcium!onen wieder (die Inkubationsbedingungen entsprechen den von Ogasawara und Mitarb, hierfür angegebenen Bedingungen).

Wie aus Figur h zu ersehen ist, wiesen die Ot-Amylaseenzyme der Erfindung eine wesentlich höhere Hitzebeständig^ it auf als sowohl die handelsübliche ÖL-Amylase (Thermamyl) als auch die von Ogasawara und Mitarb, beschriebene, bekannte <?l-Amy läse, was deswegen als besonders überraschend anzusehen ist, weil die erfindungsgemäßen OC-Amylasen ebenso wie das letztgenannte bekannte Enzym von Bacillus stearothermophilus stammen.

Figur 5 gibt die Inaktivierungskurven der erfindungsgemäßen (X-Amylaseenzyme aus den Stämmen ATCC 31 195 und ATCC 31 199, sowie, zum Vergleich, der handelsüblichen Λ-Amylase (Thermamyl) unter den vorstehend für Figur k angegebenen Bedingungen (z.B. 90⁰C und pH 6,0) wieder, wobei jedoch abweichend davon das Medium 1 mMol Calciumionen enthielt. Dabei wiesen die erfindungsgemäOen A-Amylasen immer noch eine höhere Hitzebeständigkeit als Thermamyl-ft-Amylase auf, jedoch war der Unterschied nicht so groß wie ohne zugesetzte Calciumionen. Dieser Sachverhalt läßt darauf schließen, daß die erfindungsgemäßen Ct-Amylasen aus den Stämmen ATCC 31 195 und 31 199 Calciumionen fester als die handelsübliche flt-Amy läse (Thermamyl) binden, so daß ihr Bedarf an Calciumionen zum Stabilisieren des Proteinmoleküls geringer ist als der von Thermarayl-ÖL-Amylase.

Die Figuren 6 und 7 geben die Inaktivierungskurven der erfindungsgemäßen Cf-Amylaseenzyme aus den Stämmen ATCC 31 195 und 31 199» sowie, zum Vergleich der handelsüblichen Oi-Amy läse

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it

(Thermamyl) beim Inkubieren bei 85 C und einem pH von 4,55 in Gegenwart von löslicher Stärke (22,5 %t T.S.) und Calciumionen wieder, und zwar Figur 6 bei einer Calciumionenkonzentratlon von 1 mMol und Figur 7 bei einer Calciumionenkonzentratxon von 5 mMol. Die erfindungsgemäßen Ot-Amy lasen aus den Stämmen ATCC 31 195 und 31 199 wiesen sowohl unter den Bedingungen von Figur 6 als auch unter denen von Figur 7 eine höhere Hitzebeständigkeit auf als die handelsübliche ΰί-Amylase (Thermamyl). Die Bedingungen bei den vorstehenden Versuchen, deren Ergebnisse in den Figuren 6 und 7 graphisch dargestellt sind, gleichen den bei vielen großtechnischen Verflüssigungsverfahren angewandten Arbeitsbedingungen, so daß zu erwarten ist, daß die erfindungsgemäßen Ci-Amylaseenzyme bei der industriellen Verflüssigung und Konversion von Stärke bei sauren pH—Werten eine höhere Hitzebeständigkeit als bislang bekannte Enzyme aufweisen werden.

Das Molekulargewicht der erfindungsgemäßen df-Amylaseenzyme aus den Stämmen ATCC 31 195 und 31 199 wurde durch SDS-Scheibenelektrophorese nach der von Weber und Osborn (J^ Biöl. Chem., 244« 14O6 (1969)) beschriebenen Methode jeweils mit 96 000 bestimmt. Als Markierungsproteine wurden Albumin (Molekulargewicht 67 OOO), Ovalbumin (Molekulargewicht 45 OOO), Chymotrypsin (Molekulargewicht 25 OOO) und Cytochrom C (Molekulargewicht 12 5OO) verwendet. Die Lage der erfindungsgemäßen Λ-Amylasen auf dem Polyacrylamidgel wurde bestimmt, indem das Gel auf eine Amylose-Azuragarplatte gebracht und bei 37°C bebrütet wurde. Die Ergebnisse dieses Tests sind in der Figur graphisch dargestellt.

Das so ermittelte Molekulargewicht der erfindungsgemäßen cC- Amylasen ist mit 96 000 viel höher als das von Ogasawara und Mitarb, (j. Biochem.. 67, 65, 77, 83 (197O)) bzw. Manning und Mitarb. (J. Biol. Chem.. 236. 2952, 2958, 2962 (1961)) für von Bacillus stearothermophilus stammende C(-Amy las en angegebene Molekulargewicht von 48 000 bzw. 15 6OO.

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Die fünf isolierten Stämme bzw. die daraus gewonnenen Ä-Al sen wurden auf das Vorhandensein von Proteaseaktivität geprüft, da die Anwesenheit von Protease oder proteolytischem Enzym in «χ—Amylaseenzymen dazu führt, daß die Enzyme dazu neigen, mit verschiedenen Proteinmaterialien, die in vielen Stärkematerialien vorhanden sind, unter Bildung wasserlöslicher Proteinhydrolysate» z.B. Aminosäuren, zu reagieren. Aue diesem Grund ist die Anwesenheit von Proteaseenzym als Verunreinigung in «X-Amylaseenzymen im Hinblick auf die wirtschaftliche und effiziente Hydrolyse von Stärkematerialien nachteilig. Die Proteaseaktivitäten der erfindungsgemäßen, aus den fünf isolierten Stämmen gewonnenen OC-Amylaseenzyme wurden nach einer modifizierten Anson-Hagiwara-Methode an Präparaten bestimmt, die durch Ausfällen mit Aceton aus nitraten von Kulturen im Stadium der maximalen oC-Amylaseproduktion gewonnen worden waren.

Die bei diesen Versuchen erhaltenen Ergebnisse wurden mit denen von Enzympräparaten aus handelsüblicher #-Amyläse (Thermamyl) und einer bakteriellen Ot-Amylase der CPC verglichen. Wie nachfolgend gezeigt, enthielten Thermamyl und die Kulturfiltrate von isolierten thermophilen Strahlenpilzen (ray fungi) große Mengen Protease, wogegen die hitzebeständige 01-Amy läse erzeugenden Stämme der Erfindung keine nennenswerten Proteasemengen erzeugten.

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Mo

Proteaseaktivität

von c(. -Amy läse

Enzym

Protease^C-Amylase— Verhältnis

ATCC Nr. 31 195

ATCC Nr. 31 196

ATCC Nr. 31 197

ATCC Nr. 31 198

ATCC Nr. 31 199 CPC-BLA Thermamyl 60

0,06 0,17

2,35 0,08 0,06 6,2

36,5 109,0

1)

Thermophile Strahlenpilze (ray fungi), isoliert bei 55°C und pH 7,0.

Wie aus den vorstehenden Versuchsergebnissen zu ersehen ist, enthalten die tf-Amylaseenzyme der Erfindung keine signifikante Proteaseaktivität, d.h., daß sie ein Protease/it-Amylaee-Verhältnis von weniger als 3 und in der Regel sogar weniger ale 1 aufweisen. Dies ist ein bedeutender Vorteil, wenn man das Enzym zum Hydrolysieren von Stärkematerialien verwendet.

Beispiel 3

Das nachfolgende Beispiel erläutert die Verwendung der erfindungsgemäOen flf-Amylaseenzyme zum Verflüssigen von Stärke bei der Herstellung von Stärkehydrolysaten mit hohen OE-Werten.

von Starkehydrol

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«Μ

In 70 ml Wasser wurden 30 g Kartoffelstärke suspensiert, worauf 75 mg Calciumchloriddihydrat zugegeben wurden und der pH auf k,5 eingestellt wurde. Diese Aufschlämmung wurde mit dem raffinierten, pulverigen, nach Beispiel 2 erhaltenen Enzym in einer 50 CPC-Einheiten entsprechenden Menge versetzt, worauf man das Gemisch zur Verflüssigung der Stärke 30 Minuten bei 85⁰C reagieren ließ. Der DE-Wert der verflüssigten Lösung, die einen pH-Wert von 4,3 aufwies, betrug etwa 21. Nachdem die Temperatur des Reaktionsgemisches auf etwa 60 C abgesunken war, wurde ein von Aspergillus niger stammendes Glucamylaseenzym zugesetzt und die Lösung 48 Stunden bei 6O⁰C verzuckert und konvertiert. Der DE-Wert der verzuckerten und konvertierten Lösung betrug 97t5 und ihr Dextrosegehalt 96,0 $.

Das vorstehende Beispiel 3 zeigt, daß die erfindungsgemäßen Of-Amylaseenzyme Stärke hydrolysieren und verflüssigen. Sie können dazu verwendet werden, lösliche Stärke, Amylose, Amylopectin, Glycogen usw. zu konvertieren, um die Viskosität dieser Substrate abrupt zu verringern. Wenn man die Enzyme der Erfindung bei pH 4,5 und 6O⁰C mit löslicher Stärke reagieren läßt, so verschwindet die Stärke-Jodid-Reaktion bei einem Hydrolyse— grad (DE) von etwa 15, wonach die Hydrolyse jedoch bis zu einem höchsten Hydrolysegrad bzw. DE-Wert von 32 bis 36 weitergeht... Die in dem hydrolysierten Produkt enthaltenen Zucker wurden analytisch als Maltose, Maltotriose, Maltotetraose und andere Maltooligosaocharide im Gemisch mit einer kleinen Menge Glucose identifiziert. Die Mutarotation des reduzierenden Zuckerprodukts ist, wie festgestellt wurde, negativ. Demzufolge sind die Enzyme der Erfindung äf-Amylaseenzyme des verflüssigenden Typs, die die öt-1,4-Bindungen in Stärke glatt hydrolysieren.

Die Beziehung zwischen der Verflüssigung und der Verwendung eines erfindungsgemäßen Enzyms (relativer Wert) und dem Arbeits-pH-Wert ist in Figur 9 graphisch dargestellt, wobei zum Vergleich die mit den bekannten, von Bacillus stearothermophilus stammenden Ä-Amylaseenzymen erzielten Ergebnisse wiedergegeben sind. Wie aus Figur 9 ersichtlich ist, liegt der opti-

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male pH-Wert für die Enzyme der Erfindung in einem Bereich von 4,2 bis 5,2. Die bevorzugten erfindungsgemäßen Enzyme verlieren ihre Aktivität selbst dann nicht, wenn man sie bei Raumtemperatur Zh Stunden bei pH-Werten im Bereich von 3 bis stehen läßt.

Die Beziehung zwischen der Verflüssigung durch die erfindungsgemäßen Enzyme (relativer Wert) und der Arbeitstemperatur ist in Figur 10 graphisch dargestellt, wobei zum Vergleich die entsprechende Kurve für die von Ogasawara und Mitarb, beschriebene iC-Amylase aus Bacillus stearothermophilus wiedergegeben ist· Wie aus Figur 10 zu ersehen ist, beträgt die bevorzugte Arbeitstemperatur für die erfindungsgemäßen Enzyme etwa 80⁰C.

Aus dem vorstehenden ist zu ersehen, daß die erfindungsgemäßen Oi-Amylaseenzyme zur Verflüssigung und Konversion von Stärke in der Stärkeverzuckerungsindustrie, beim Entschlichtungsverfahren in der Textilindustrie und als Zusätze in Wasohmittelgemischen, bzw. auf den üblichen Anwendungsgebieten bakterieller OC-Amylaseenzyme eingesetzt werden können.

Die erfindungsgemäßen ö(-Amyl as e enzyme eignen sich besonders zur Verflüssigung und Konversion von Stärke bei der Herstellung von Mal todextrinen, insbesondere mit nachfolgender Erzeugung von Dextrose unter Verwendung von Glucamylase, da die Isomerisierung der Endgruppen des Moleküls vermieden werden kann, weil/das Enzym effizient in einem sauren pH-Bereich, d.h. bei einem pH von 4,5 his 5|0, einsetzen läßt, wodurch die Dextroseausbeute erhöht wird. Die Verwendung dieser neuen Enzyme verringert außerdem die Ionenaustauscherbelastung beim Raffinat ions verfahren, weil vor der Verzuckerung und Konversion mit Glucamylase keine Einstellung des pH-Wert erforderlich ist.

Eine bevorzugte Einsatzmöglichkeit für die erfindungsgenäßen oC-Amylaseenzyme ist deren Verwendung bei Verfahren zum Kon—

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- ι* -Vi

vertieren von Stärke, bei denen die restliche, nicht-konver— tierte Stärke in körniger Form erhalten bleibt. Derartige Verfahren sind in den US-Patentschriften 3 922 196, 3 922 197, 3 922 198, 3 922 199.3 922 200 und 3 922 201 beschrieben und beansprucht, auf die hier ergänzend Bezug genommen wird.Bei diesen Verfahren zum Konvertieren von Stärke, bei denen die nicht umgewandelte Stärke in körniger Form zurückbleibt, wird die Solubilisierung des Stärkematerials zumindest in der Anfangsphase bei verhältnismäßig niederen Temperaturen, d.h. unter der Temperatur, bei der die Stärke zu verkleistern beginnt, bis hinauf zu der tatsächlichen Anfangsgelatinisierungstemperatur der Stärke, durchgeführt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieser Verfahren wird gleichzeitig mit der ck-Amylase in der anfänglichen Solubilisierungsstuf e Glucamylaseenzym verwendet. Die erfindungsgemäßen Enzyme eignen sich besonders für dieses Verfahren, da ihr optimaler pH—Bereich mit Glucamylase verträglich ist.

Eine ajidere bevorzugte Einsatzmöglichkeit für die erfindungs— gemäßen 0^-Amylaseenzyme ist deren Verwendung bei Verfahren der aus den US-Patentschriften 3 853 706 und 3 8^9 19²* bekannten Art, auf die hiermit ergänzend Bezug genommen wird.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung lassen sich die erfindungsgemäßen tf-Amylaseenzyme bei einem Verfahren der aus der US-PS 3 912 590 bekannten Art verwenden, auf die hier ebenfalls ergänzend Bezug genommen wird. Bei der Verwendung der erfindungsgemäßen <X—Amylaseenzyme nach diesem bekannten Verfahren wird eine Aufschlämmung von Stärke, z,B. Maisstärke, die mindestens 25 Gew.-# Stärkematerial enthält, mit dem Ct-Amyläseenzym bei einer Temperatur von etwa 100 bis 115 und vorzugsweise etwa 105 bis 110 C etwa 1 bis 60 und vorzugsweise 5 bis 10 Minuten lang behandelt, um die Stärke zu verflüssigen, worauf die Temperatur auf 80 bis 100 und vorzugsweise 90 bis 100°C herabgesetzt wird, wenn die Viskosität der verdünnten Lösung bei 95°C gemessen weniger als 300 beträgt. Der besondere Vorteil, den man dadurch erreicht, daß

jre Vorteil, den

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man bei einem Verfahren, bei dem nach dem vorstehend genannten Temperaturprofil gearbeitet wird, die erfindungsgemäßen ct-Amylaseenzyme verwendet, ist darin zu sehen, daß ein niedrigerer pH-Wert angewandt werden kann, so daß bei einem nachfolgenden Verzuckerungsverfahren mit Glucamylase keine oder allenfalls eine geringe Nachstellung des pH-Werts erforderlich ist.

Ganz besonders vorteilhaft und daher bevorzugt ist die Verwendung der erfindungsgemäßen PC-Amylaseenzyme bei einem Verfahren zum Konvertieren von Stärke, bei dem eine Stärkeauf— schlämmung der Einwirkung des Enzyms bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 3,5 bis 6,5 und vorzugsweise etwa h bis 5» einer Temperatur im Bereich von etwa 50 bis 100 und vorzugsweise etwa 60 bis 95 C ausgesetzt wird, um die Stärke zu verflüssigen. Im Falle der vorstehend beschriebenen Verfahren zur Hydrolyse körniger Stärke wird die Temperatur in dem Bereich zwischen der normalen Gelatinisierungsbeginntemperatur bis zur tatsächlichen Gelatinisierungstemperatur der Stärke, also etwa 60 C bei Maisstärke, liegen. Im Falle des Verfahrens zur direkten Verflüssigung wird die das Enzym enthaltende Stärkeaufschlämmung, z.B. mittels eines Düsenerhitzers, vorzugsweise auf eine Temperatur im Bereich von etwa 85 bis 95 und insbesondere etwa 90 bis 92 C erhitzt, um die Stärke zu verflüssigen. Nach der anfänglichen Solubilisierung, wie bei der Hydrolyse körniger Stärke, oder Verflüssigung wird die Aufschlämmung vorzugsweise einer "Hitzeschockbehandlung" bei einer Temperatur über 100 und vorzugsweise bei einer Temperatur im Bereich von etwa 110 bis 150 C unterworfen, um sämtliche noch gegebenenfalls vorhandenen Stärkekörner zu verflüssigen. Darauf wird die verflüssigte Stärkeaufschlämmung abgekühlt und vorzugsweise mit weiterer rf-Amylase allein oder in Kombination mit anderen Enzymen, wie Glucamylase, ß-Amylase, Pullulanase, Glucoseisomerase, nacheinander oder in Kombination behandelt. Wenn Of-Amyläse allein verwendet wird, wird die Temperatur in der zweiten Enzymbehandlungsstufe vorzugsweise

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in einem Bereich von etwa 80 bis 90 und insbesondere bei etwa 85 C, der optimalen Temperatur für die erfindungsgemäOen Enzyme, gehalten. Wenn noch andere Enzyme, wie Glucamylase und/oder Glucoseisomerase anwesend sind, wird die Temperatur etwas niedriger liegen, d.h. bei etwa 55 bis 75 und insbesondere etwa 60 C.

Die erfindungsgemäßen Oi-Amylaseenzyme lassen sich von den aus Tieren, Pflanzen, Hefen, Fungi imperfecti und Schimmelpilzen (molds) gewonnenen -~X-Amylasen nach dem Stand der Technik insofern klar unterscheiden, als diese bekannten Enzyme eine so geringe Hitzebeständigkeit aufweisen, daß sie ihre Aktivität bei einer 5-minütigen Behandlung bei 70 C und pH 6 vollständig verlieren. Vergleicht man die Hitzebeständigkeit der erfL ndungsgemäßen ot-Amylasen, die in Figur 12 dargestellt ist (die Arbeitsbedingungen bei den Versuchen, deren Ergebnisse in Figur 12 wiedergegeben sind, stimmen im wesentlichen mit den Durchführungsbedingungen der Versuche überein, deren Ergebnisse in Figur 6 graphisch dargestellt sind), so ist klar zu erkennen, daß die erfindungsgemäßen Ot-Amylaseen«yme bezüglich der Säure- und Hitzebeständigkeit den damit verglichenen <X-Amylaseenzymen nach dem Stand der Technik eindeutig überlegen sind. Aus Figur 12 ist außerdem klar ersichtlich, daß die erfindungs gemäßen <X-Amyl as e enzyme sich dadurch auszeichnen, daß sie in der Lage sind, mindestens etwa 70 und vorzugsweise mindestens etwa 90 $ ihrer Anfangs— aktivität beizubehalten, wenn sie in Abwesenheit zugesetzter Calciumionen 10 Minuten lang bei 90 C und einem pH-Wert von 6,0 gehalten werden, sowie mindestens etwa 50 $> ihrer anfänglichen Λ—Amyläseaktivität zubehalten, wenn man sie 60 Minuten bei 90°C und einem pH von 6,0 hält. Wie aus Figur 11 zu ersehen ist, zeichnen sich die erfindungsgemäßen <*-Amylaseenzyme weiterhin dadurch aus, daß sie befähigt sind, mindestens etwa 50 io ihrer anfänglichen Ot-Amylaseaktivität zu behalten, wenn man sie in Gegenwart von 5 mMol Calciumionen 10 Minuten bei einer Temperatur von 8O⁰C und einem pH von 4,55 hält.

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-H-

Tabelle IX gibt eine vergleichende Übersicht über die wesentlichen anwendungstechnischen Kenndaten der erfindungsgemäßen 4-Amylaseenzyme sowie der derzeit großtechnisch verwendeten a-Amylaseenzyme von Bacillus subtilis und Bacillus 1i c heni formi s einerseits sowie der in der Literatur beschriebenen, von Bacillus stearothermophilus stammenden iX-Amylaseenzyme andererseits wieder. Insbesondere werden in der Tabelle IX die genannten Enzyme bezüglich der für sie jeweils optimalen Arbeitsbedingungen hinsichtlich pH-Wert und Temperatur sowie hinsichtlich ihres jeweiligen Molekulargewichts verglichen. Die Figuren 11 und.12 zeigen eine vergleichende Gegenüberstellung der Eigenschaften dieser Enzyme bezüglich der Hitze- und Säurebeständigkeit in graphischer Darstellung.

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Geprüfte Enzyme

Tabelle IX

Optimaler Arbeits-pH

Geeignete Molekülar-Arbeitstemp. gewicht

C\-Ainylaseenzyme der
Erfindung

01—Amylaso von
B. subtilis¹'

Ot-Amylase von
B.licheniforrais

2)

h_% O - 5,2

^,5 - 6,5 5,0 - 9,0

«X-Araylase von
B. stearothermophilus

a) Ogasawara und Mit. '5,0 - 6,0

b) Campbell und Mit.

3)

4,8

80⁰C

- 60°C

76 - 78°C

65 - 70°C
55 - 70°C

96 000 hs ooo

22 500

k8 000 15 600

Ogasavara und Mit., J^ Biochem., 67> 65 (197O).

²'Shigemasa Saito, ABB, 155, 290 (i973).

^'Campbell und Mit., J^ Biol. Chem. , 236, 2958 (1961). ^Campbell und Mit., J^ Biol·. Chem. _t 236. 2958 (1961).

'In der britischen Patentschrift wird das Molekulargewicht der <X-Amylase von B^ licheniformis mit 18 000 - 20 000 und das der CK. -Amylase von B^ subtilia mit 96 000 angegeben.

Vergleicht man die erfindungsgemäßen OC-Amylaseenzyme mit den bekannten ct-Amylaseenzymen aus Bacillus subtilis. so fällt auf, daß diese sich, wie aus den Figuren 9 und 11 zu ersehen ist, bezüglich ihres optimalen Betriebs—pH—Werts, der geeigneten Betriebstemperatur, des Molekulargewichts und ihrer Hitze— und Säurebeständigkeit beträchtlich unterscheiden. Dies zeigt, daß die Enzyme der Erfindung von der bekannten C(-Amylase aus Bacillus subtilis grundlegend verschieden sind.

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- 4f -

Vergleicht man die oC-Amylaseenzyme der Erfindung mit den o(-Ainyl as e enzymen aus Bacillus licheniformis, so ist auch hier festzustellen, daß sich die Enzyme hinsichtlich ihres optimalen Arbeits-pH-Werts, ihres Molekulargewichts und ihrer Hitze- und Säurebeständigkeit erheblich unterscheiden, wie aus Tabelle IX und den Figuren 11 und 12 zu ersehen ist.

Es versteht sich für den Fachmann von selbst, daß die zur Erzeugung der neuen (K-Arnylaseenzyme der Erfindung verwendeten Stämme nach bekannten Methoden der Einwirkung bekannter rautagener Mittel, wie UV-Licht, einer chemischen Behandlung und dergleichen, unterworfen werden können. Demgemäß umfaßt die Erfindung aus den Stämmen ATCC Nr. 31 195, 31 196, 31 197t 31 19^{8 und} 31 199t sowie deren Varianten und Mutanten und/oder aus Submutanten der genannten Varianten und Mutanten gewonnene bzw. von den fraglichen Mikroorganismen erzeugte '3-Amylaseenzyme.

Wie auch einige der bekannten Ö(-Amylaseenzyme, werden die Enzyme der Erfindung durch Quecksilber und Äthylendiamintetra— essigsäure inhibiert, durch Calcium dagegen stabilisiert.

Es versteht sich für den Fachmann von selbst, daß die von den vorstehenden Beispielen erläuterte Erfindung im Rahmen des Erfindungsgedankens in verschiedener Weise abgewandelt werden kann. Zahlreiche Variationen und Modifikationen der Erfindung ergeben sich für den Fachmann ohne weiteres und können von ihm ausgeführt bzw. angewandt werden, ohne von dem vorstehend beschriebenen und offenbarten Erfindungsgedanken abzuweichen.

Wie bereits erwähnt, lassen sich die neuen CC—Amyläseenzyme der Erfindung in vorteilhafter Weise bei der Hydrolysierung und/oder Verflüssigung von Stärke einsetzen und können aufgrund ihrer Stabilität bei niederen pH-Werten in Kombination mit anderen säurebeständigen Amylasen, wie Glucamylase, verwendet werden, und zwar sowohl in löslicher als auch in immobilisierter Form. 709845/0838

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Claims

Patentansprüche _,„«««

Hitze- und säurebeständiges Ot-Amyl as e enzym, dadurch gekennzeichnet, daß es in der Lage ist,

1. mindestens etwa 70 % seiner anfänglichen °t-Amylaseaktivität zu behalten, wenn man es in Abwesenheit zugesetzter Calciumionen 10 Minuten bei 90 C und einem pH von 6,0 hält,

2. mindestens etwa 50 # seiner anfänglichen oC-Amylaseaktivität zu behalten, wenn man es in Abwesenheit zugesetzter Calciumionen 60 Minuten bei 90 C und einem pH von 6,0 hält,

3. mindestens etwa 50 $ seiner anfänglichen Λ—Amylaseaktivität zu behalten, wenn man es in Gegenwart von 5 mMol Calciumionen 10 Minuten bei 80 C und einem pH von ^,55 hält.

2. ot-Amylaseenzym nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es ein durch SDS-Scheibenelektrophorese bestimmtes Molekulargewicht von mindestens etwa 90 000 besitzt.

3· Λ-Amylaseenzym nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es von einem Mikroorganismus der Gattung Bacillus stammt.

k. Λ-Amylaseenzym nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß es von einem Mikroorganismus der Spezies Bacillus stearothermophilus stammt.

5. Λ-Amylaseenzym insbesondere nach Anspruch k_f dadurch gekennzeichnet, daß es von einem Mikroorganismus der Spezies Bacillus stearothermophilus Stamm ATCC Nr. 31 195» 31 196, 31 197, 31 198 und/oder 31 199 einschließlich der Varianten,

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ORIGINAL INSPECTED

NACHQEREICHT

Mutanten und Submutanten dieser Stämme stammt.

6. «cC-Amylaseenzym nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es von Bacillus stearothermophilus Stamm ATCC Nr. 31 oder einer Mutante dieses Stammes stammt.

7. <&>—Amylaseenzym nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß es in der Lage ist, mindestens etwa 50 % seiner anfänglichen Aktivität bei einer Temperatur von 85 C und einem pH von 4,55 in Gegenwart von 5 mMol Calciumionen und 22,5 Gewichtsprozent Stärke, Trockensubstanz, während einer Zeitspanne von 30 Minuten zu behalten.

8. Verfahren zur Herstellung eines hitze- und säurebeständigen o£- -Amylaseenzyms, insbesondere gemäß einem der Ansprüche bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus der Spezies Bacillus stearothermophilus Stamm ATCC Nr. 31 195, 31 196, 31 197, 31 198 und/oder 31 199, einschließlich der Varianten, Mutanten und Submutanten dieser Stämme in einem Nährmedium kultiviert und das dabei erzeugte Enzym gewinnt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Nährmedium verwendet, das eine assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquelle enthält.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus 1 bis 5 Tag(e) bei einem pH im Bereich von 5 bis 9 und bei einer Temperatur von etwa 50 bis 70°C kultiviert.

11. Verwendung eines oC -Amylaseenzyms gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 und insbesondere eines nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 bis 10 hergestellten oC-Amylaseenzyms zur Umwandlung von Stärke in ein Stärkehydrolysat durch

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a) Behandeln einer wäßrigen Stärkeaufschlämraung mit dem C(-Amylaseenzym bei einem pH von 3»5 bis 6,5 und vorzugsweise bei einer Temperatur von etwa 50 bis 1OO°C und einem pH von etwa h bis 5» zur Verflüssigung und Umwandlung der Stärke

b) Gewinnen eines Stärkehydrolysate aus der Umwandlungsstufe

wobei bzw. wonach das Stärkehydrolysat vorzugsweise mit einem Glueamylaseenzym behandelt,

auf über 100°C erhitzt und hierauf abgekühlt und mit zusätzlicher ct-Amylase behandelt
und/oder
mit einem Glucoseisoraeraseenzym behandelt wird.

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