DE69333747T2

DE69333747T2 - Rekombinante zelle, dna-konstruktionen, vektoren und methoden zur expression von phytatabbauenden enzymen in gewünschten verhältnissen

Info

Publication number: DE69333747T2
Application number: DE69333747T
Authority: DE
Inventors: Marja T. Paloheimo; Richard B. FAGERSTRÖM; Arja S.K. Miettinen-Oinonen; Marja K. Turunen; John A. Rambosek; Christopher S. Piddington; Christine S. Houston; Michael A. Cantrell; K.M. Helena Malton Road North Epping NEVALAINEN
Original assignee: AB Enzymes GmbH
Current assignee: AB Enzymes GmbH
Priority date: 1992-07-31
Filing date: 1993-07-27
Publication date: 2005-12-29
Anticipated expiration: 2013-07-28
Also published as: DE69333747D1; FI117202B; CA2141431A1; FI950409A0; ES2235157T3; PT655890E; FI950409A; AU4787993A; EP0655890A1; ATE287962T1; EP0655890B1; JPH09505201A; US5834286A; DK0655890T3; EP0655890A4; WO1994003072A1

Description

Die vorliegende Erfindung ist eine Teilfortführungsanmeldung der US-Anmeldung, Eingangs-Nr. 07/925 401, eingereicht am 31. Juli 1992.
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Stämme von Fadenpilzen, die fähig sind, wenigstens zwei Phytat-abbauende Enzyme in gewünschten Verhältnissen überzuexprimieren. Offenbart werden auch DNA-Sequenzen, Promotoren, DNA-Konstrukte und Vektoren, die zur Herstellung solcher Stämme verwendbar sind.
Hintergrund der Erfindung
Mineralstoffe sind für das Wachstum aller Organismen essentielle Elemente. Zur Viehbestandsproduktion bei monogastrischen Tieren (z. B. Schweine, Geflügel) und Fisch wird Futter normalerweise mit Mineralstoffen supplementiert. Pflanzensamen sind eine reichhaltige Quelle für Mineralstoffe, da sie Ionen enthalten, die mit den Phosphatgruppen von Phytinsäure komplexiert sind. Wiederkäuer benötigen kein anorganisches Phosphat und keine Mineralstoffe, da Mikroorganismen im Pansen Enzyme produzieren, die eine Umwandlung von Phytat (Myoinositol-Hexaphosphat) in Inositol und anorganisches Phosphat katalysieren. Bei diesem Prozess werden Mineralstoffe, die mit Phytat komplexiert waren, freigesetzt.
Phytat kommt als Quelle für gespeicherten Phosphor in praktisch allen Pflanzenfuttermitteln vor (für eine Übersicht siehe: Phytic Acid, Chemistry and Applications, E. Graf (Herausg.), Pilatus Press: Minneapolis, MN, U.S.A., 1986). Phytinsäure bildet einen normalen Bestandteil der Samen von Getreiden und Legumen. Sie fungiert zur Bindung von Futtermineralstoffen, die für die neue Pflanze essentiell sind, wenn sie aus dem Samen herauskommt. Wenn die Phosphatgruppen von Phytinsäure durch das Samenenzym Phytase entfernt werden, geht die Fähigkeit, Metallionen zu binden, verloren, und die Mineralstoffe werden für die Pflanze verfügbar. In Körnerfuttermitteln für Vieh sind die durch Phytinsäure gebundenen Spurenmineralien für eine Absorption durch monogastrische Tiere, denen Phytaseaktivität fehlt, nur teilweise verfügbar. Obgleich eine gewisse Hydrolyse im Colon erfolgt, geht der größte Teil der Phytase durch den Gastrointestinaltrakt von monogastrischen Tieren hindurch und wird im Dung ausgeschieden, was zu fäkalen Phosphatverschmutzungsproblemen in Gebieten mit intensiver Viehproduktion beiträgt. Anorganischer Phosphor, der im Colon freigesetzt wird, hat keinen Nährwert für das Vieh, da anorganischer Phosphor nur im Dünndarm absorbiert wird. Somit ist eine signifikante Menge der für die Ernährung wichtigen Nahrungsmineralstoffe monogastrischen Tieren möglicherweise nicht verfügbar.
Eine Umwandlung von Phytat in Inositol und anorganischen Phosphor kann durch mikrobielle Enzyme, die in einem breiten Rahmen als Phytase bezeichnet werden, katalysiert werden. Phytasen, wie z. B. Phytase #EC 3.1.3.8, sind fähig, eine Hydrolyse von Myoinositol-Hexaphosphat in D-Myoinositol-1,2,4,5,6-pentaphosphat und -orthophosphat zu katalysieren. Von bestimmten fungalen Phytasen wurde berichtet, dass sie Inositolpentaphosphat in Tetra-, Tri- und niedere Phosphate hydrolysieren; z. B. wird berichtet, dass A. ficuum-Phytasen Gemische aus Myoinositol-di- und monophosphat produzieren (Ullah, 1988). Phytaseproduzierende Mikroorganismen umfassen Bakterien, wie z. B. Bacillus subtilis (V. K. Powar und V. J. Jagannathan, J. Bacteriol. 151: 1102–1108, 1982) und Pseudomonas (D. J. Cosgrove, Austral. J. Biol. Sci. 23: 1207–1220, 1970); Hefen, wie Saccharomyces cerevisiae (N. R. Nayini und P. Markakis, Lebensmittel Wissenschaft und Technologie, 17: 24–26, 1984); und Pilze, wie z. B. Aspergillus terreus (K. Yamada, Y. Minoda und S. Yamamoto, Agric. Biol. Chem. 32: 1275–1282, 1968). Die mögliche Verwendung von Mikroben, die zur Produktion von Phytase fähig sind, als Futteradditiv für monogastrische Tiere, wurde bereits früher beschrieben (Shieh und Ware, US-Patent Nr. 3 297 548; Nelson, T. S. et al., J. Nutrition 101: 1289–1294, 1971). Bis jetzt hat sich allerdings die wirtschaftliche Anwendung dieses Konzepts als nicht-verwirklichbar erwiesen, und zwar wegen der hohen Kosten der Herstellung mikrobieller Phytasen.
Es wurde auch beschrieben, dass mikrobielle Phytasen zur Herstellung von Tierfutter aus bestimmten industriellen Verfahren, z. B. Weizen- und Mais-Abfallprodukte, einsetzbar sind. Das Nassmahlverfahren für Mais produziert Glutene, die als Tierfutter verkauft werden. Es wurde beschrieben, dass ein Phytasezusatz den Nährwert des Futterproduktes verbessert. Pilz-Phytaseenzyme und Verfahrensbedingungen (T ~ 50°C und pH ~ 5,5) wurden bereits in der europäischen Patentanmeldung 0 321 004 beschrieben. Beschrieben wurde auch, dass das Vorliegen von Phytat bei der Verarbeitung von Sojabohnenmehl das Mehl und Abfälle für Futtermittel, die bei der Aufzucht von Fisch, Geflügel und anderen Nicht-Wiederkäuern sowie von Kälbern, die mit Milch gefüttert werden, eingesetzt werden, ungeeignet macht. Es wird berichtet, dass Phytase zur Verbesserung des Nährwerts und des wirtschaftlichen Wertes dieses Sojamaterials mit hohem Proteingehalt einsetzbar ist (siehe Finase Enzymes By Alko, eine Produktinformationsbroschüre, veröffentlicht von Alko Ltd., Rajamaki, Finnland). Eine Kombination aus Phytase und einer sauren Phosphatase mit einem pH-Optimum von 2,5 aus A. niger wurde von Alko, Ltd., als Tierfutterergänzung in ihrem Phytinsäure-Abbauprodukt Finase F und Finase S eingesetzt. Eine kostengünstige Quelle für Phytase würde den Wert von Sojabohnenmehl als Tierfutter stark erhöhen (Shieh et al., 1969).
Phytase und weniger spezifische saure Phosphatasen werden durch den Pilz Aspergillus ficuum als extrazelluläre Enzyme produziert (Shieh et al., 1969). Wie verlautet, reinigte Ullah eine Phytase aus Wildtyp-A. ficuum, die ein scheinbares Molekulargewicht von 61,7 kDa (mit SDS-PAGE; bezüglich Glykosylierung korrigiert); einen optimalen pH bei pH 2,5 und pH 5,5; eine KM von etwa 40 μM und eine spezifische Aktivität von etwa 50 E/mg hatte (Ullah, A., Preparative Biochem. 18: 443–458, 1988); PCT-Patentanmeldung WO 91/05053 offenbart die Isolierung und die molekulare Klonierung einer Phytase aus Aspergillus ficuum mit pH-Optima bei pH 2,5 und pH 5,5, einer KM von etwa 250 μM und einer spezifischen Aktivität von etwa 100 E/mg Protein.
Saure Phosphatasen sind Enzyme, die eine weite Vielzahl von Phosphatestern katalytisch hydrolysieren und üblicherweise pH-Optima unter 6,0 aufweisen (Hollander, 1971); #EC 3.1.3.2 katalysiert z. B. die Hydrolyse von Orthophosporsäuremonoestern in Orthophosphatprodukte. Es wurde berichtet, dass eine saure Phosphatase aus A. ficuum gereinigt worden war. Die deglykosylierte Form der sauren Phosphatase hat ein scheinbares Molekulargewicht von 32,6 kDa (Ullah et al., 1987).
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, rekombinante Phosphatasen bereitzustellen, die aus Fadenpilzen isoliert wurden, die die Wirksamkeit der Freisetzung von Phosphor aus Phytat und den Salzen von Phytinsäure verbessern. Weitere Aufgaben der Erfindung liegen in der Bereitstellung effizienter und kostengünstiger Quellen für zwei oder mehr rekombinante Enzyme, die für eine kommerzielle Verwendung in Futtermitteln und industriellen Verfahren bei minimaler Verarbeitung einsetzbar sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Im Wesentlichen wurden zwei Enzyme aus Aspergillus niger var. awamori-Stamm AL-KO243, gereinigt: nämlich eine Phytase und eine pH 2,5-saure Phosphatase. Die Aminosäuresequenz für die isolierten inneren Peptide wurde für jedes Enzym bestimmt, und die abgeleiteten Nucleotidsequenzen wurden verwendet, um Sonden zu konstruieren, die für ein molekulares Klonen der zwei Gene eingesetzt wurden. Für jedes Gen wurde die genomische Nucleotidsequenz bestimmt, und außerdem wurde die codierende Region auch durch Klonieren der cDNA (wenn notwendig) bestimmt. Ein Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen der Phytase und der pH 2,5-sauren Phosphatase mit anderen bekannten Phosphatasen identifizierte eine potentielle Sequenz einer aktiven Enzymstelle. Transformationsvektoren wurden unter Verwendung von Promotoren, die für Fadenpilze nativ sind, konstruiert, und es wurden verschiedene unterschiedliche heterologe Promotorsequenzen bezüglich ihrer Fähigkeit, eine Expression der entsprechenden Gene zu steuern, verglichen. Es wurden rekombinante Wirtszellen selektiert, die Phytase und pH 2,5-saure Phosphatase in Leveln überproduzierten, die etwa 2 Mal bis etwa 4000 Mal höher bzw. 10 Mal bis 126 Mal höher waren als die Level dieser Enzyme, die durch den Aspergillus-Stamm ALKO243 (ATCC #38854) sezerniert werden. Es wurden auch mit zwei Genen transformierte Wirtszellen selektiert, die erhöhte Level der zwei rekombinanten Enzyme, d. h. Phytase und pH 2,5-saure Phosphatase, exprimierten. Es wurden selektierte Stämme von mit zwei Genen transformierten Zellen identifiziert, die Phytase zusammen mit pH 2,5-saurer Phosphatase innerhalb der gewünschten zugeschnittenen Bereiche der jeweiligen Enzymaktivitäten synthetisierten und sezernierten, z. B. innerhalb eines Bereichs von 3 : 1 bis 16 : 1 pH 2,5-saure Phosphataseaktivität zu Phytaseaktivität. Die hierin offenbarten transformierten, rekombinanten Wirtszellen lösen die Probleme des Standes der Technik und liefern kosteneffektive Quellen für kommerzielle Phosphataseenzyme, die zur Verwendung in kommerziellen Prozessen geeignet sind, die Mineralstoffe aus Phytaten in Pflanzenmaterialien entweder in vitro, d. h. in Futterbehandlungsprozessen, oder in vivo, d. h., durch Verabreichung eines Enzyms oder mehrerer Enzyme an die Tiere, freisetzen.
Die Phytase, die aus A. niger var. awamori-Stamm ALKO243 (ATCC #38854; auch bekannt als IFO4033), gereinigt worden war, wies ein scheinbares Molekulargewicht von 80-86.000 Dalton (SDS-PAGE) und 45.000–48.000 Dalton (SDS-PAGE) nach Behandlung mit Endoglycosidase F/N-Glycosidase F auf. Die gereinigte Phytase scheint unter nichtdenaturierenden Bedingungen monomer zu sein und einen isoelektrischen Punkt von etwa 5,3 zu haben. Dieses Phytaseenzym weist in Abwesenheit von Metallionen Aktivität auf, d. h., es ist Metallionen-unabhängig; das Enzym hat ein pH-Optimum von etwa 5,0 und ein Temperaturoptimum im Bereich von 55–60°C.
Die gereinigte pH 2,5-saure Phosphatase aus A. niger var. awamori-Stamm ALKO243, hatte ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 66.000 Dalton (SDS-PAGE) und 46.000-49.000 Dalton (SDS-PAGE) nach Entfernung von Kohlenhydraten mit Endoglycosidase F/N-Glycosidase F. Diese gereinigte pH 2,5-saure Phosphatase scheint unter nicht-denaturierenden Bedingungen tetramer mit einem isoelektrischen Punkt von etwa 4 bis 4,25 zu sein; sie hat eine scheinbare KM von 0,7 mM für Natriumphytat bei pH 2,5 und 4 mM für Paranitrophenylphosphat; ein pH-Optimum von etwa pH 2,5 und ein Temperaturoptimum von etwa 55°C.
Translatierte Nucleotidsequenzen für Phytase und pH 2,5-saure Phosphatase lieferten Polypeptide mit 470 Aminosäuren bzw. 479 Aminosäuren. Die errechneten Molekulargewichte für die vorausgesagten Phytase- und pH 2,5-saure Phosphatase-Polypeptide waren etwa 51.400 Dalton bzw. etwa 52.700 Dalton.
Das gewünschte Verhältnis an rekombinanter pH 2,5-saurer Phosphatase-Phytase und Phytase, die durch mit zwei Genen transformierten, rekombinanten Wirtszellen produziert werden, liefert ein ausgeglichenes Enzymgemisch, in dem eine kooperative Enzymaktivität schnell und wirksam die nahezu vollständige Hydrolyse von Phytat zu Inositol und freiem Phosphat unter Freisetzung von Mineralstoffen aus dem Phytinsäure-Komplex katalysiert.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich daher auf eine rekombinante transformierte Wirtszelle, die dadurch charakterisiert ist, dass sie durch eine erste Nucleinsäure, die fähig ist, unter stringenten Bedingungen mit der Nucleotidsequenz SEQ ID NO. 18 zu hybridisieren, und eine zweite Nucleinsäure, die fähig ist, unter stringenten Bedingungen mit der Nucleotidsequenz SEQ ID NO. 20 zu hybridisieren, transformiert worden ist, und dass sie fähig ist, die pH 2,5-saure Phosphatase-Enzymaktivität und die Phytase-Enzymaktivität in einem Verhältnis von 3 : 1 bis 16 : 1 zu sezernieren.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die voranstehenden Aspekte und viele der erwarteten Vorzüge der vorliegenden Erfindung werden besser verständlich, wenn dieselbe anhand der folgenden detaillierten Beschrei bung, wenn diese in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen genommen wird, verstanden wird.
1 zeigt das pH-Optimum eines von Metallionen unabhängigen Phytaseenzyms, das aus Aspergillus niger var. awamori-Stamm ALKO243 (ATCC #38854), gereinigt wurde. Das pH-Optimum liegt bei etwa pH 5, und im Bereich von pH 2 bis pH 7 gibt es >20% der maximalen Enzymaktivität (wie es in Beispiel 1 unten beschrieben wird);
2 zeigt das Temperaturoptimum bei 55–60°C mit >20% der maximalen Enzymaktivität im Bereich von 25°C bis 65°C für das gereinigte Phytaseenzym von 1 oben;
3 zeigt das pH-Optimum bei 37°C von pH 2,5-saurer Phosphatase, die aus Aspergillus niger var. awamori-Stamm ALKO243, gereinigt worden war, und eine scheinbare KM von 0,7 mM für Natriumphytat bei pH 2,5, ein pH-Optimum von pH 2,0–2,5 und eine Aktivität von >20% im Bereich von pH 1,5 bis pH 3,5 hat (wie unten in Beispiel 1 beschrieben);
4 zeigt das Temperaturoptimum bei etwa 55°C und im Bereich von 25°C bis 60°C eine Aktivität von >20% der maximalen Enzymaktivität für die pH 2,5-saure Phosphatase von 3 oben;
5 zeigt die relative Phytaseaktivität (d. h. Freisetzung von Phosphat aus Natriumphytat) von Finase, ein handelsübliches Präparat, das Phytase und Phosphatasen enthält, als Funktion des pHs bei 37°C (Quadrate) und 55°C (+);
6 zeigt die relative Phytaseaktivität (d. h. Phosphat-freisetzende Aktivität) von Finase (5) als Funktion der Temperatur, d. h. zwischen 10°C und 70°C, bei pH 5;
7 zeigt ein Autoradiogramm der radioaktiv markierten, degenerierten Oligonucleotid-Phytasesonde PHY-1, die unter stringenten Bedingungen mit Endonucleasefragmenten von genomischer DNA, erzeugt mit BamHI, EcoRI, XbaI; BamHI + EcoRI; BamHI + XbaI; und EcoRI + XbaI (wie in Beispiel 2 unten beschrieben), hybridisiert;
8 zeigt ein Autoradiogramm der radioaktiv markierten, spezifischen Oligonucleotid-pH 2,5-sauren Phosphatase-Sonde PHY-31, die unter stringenten Bedingungen mit Endonucleasefragmenten von genomischer DNA, erzeugt mit BamHI, HindIII, KpnI, PstI, SalI, SphI oder SstI (wie in Beispiel 2 unten beschrieben), hybridisiert;
9A und 9B (SEQ ID NO. 18) zeigen die genomische Nucleotidsequenz für das Phytasegen in Aspergillus niger var. awamori-Stamm ALKO243 (ATCC #38854); die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO. 19) für das Phytase-Polypeptid, wie es in Beispiel 2 unten beschrieben wird, und die 5'-Regulationspromotorregion des Gens;
10A, 10B, 10C und 10D zeigen die Organisation der Phytase-Expressionsvektor-Konstrukte pFF1, pFF2, pFF3 und pFF4 (wie in Beispiel 2 unten beschrieben);
11A und 11B (SEQ ID NO. 20) zeigen die Nucleotidsequenz für das pH 2,5-saure Phosphatase-Gen und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO. 21) des Enzyms;
12A, 12B, 12C und 12D zeigen die Organisation von Phytase-Expressionsvektor-Konstrukten pFF-6A, pFF8, pFF9 und pFF11, die entwickelt wurden, um E. coli-Nucleotidsequenzen zu entfernen (wie in Beispiel 4 unten beschrieben);
13A, 13B, 13C und 13D zeigen die Organisation der pH 2,5-sauren Phosphatase-Vektorkonstrukte pPHO-1-4A, aus denen lineare Fragmente isoliert werden können, wie es in Beispiel 4 unten beschrieben ist;
14A und 14B zeigen die Organisation von zwei Transformationsvektoren, die sowohl das pH 2,5-saure Phosphatase-Gen und das Phytase-Gen haben, nämlich pFIN-1A und pFIN-1B (wie in Beispiel 4 unten beschrieben);
15 zeigt die Phytaseaktivität in einem Plattenassay mit transformierten A. niger var. awamori-Subklonen, die Phytase bis zum 1260fachen über den Konzentrationen exprimieren, welche durch den ALKO243-Elternstamm produziert werden (die Größe der Kreise, die durch den Molybdat-Indikator-Komplex um Klone gebildet werden, ist proportional zur Enzymaktivität, wie es in Beispiel 4 unten beschrieben ist);
16 zeigt die chromosomale Phytase-Gen-Kopienzahl und mRNA-Level in Phytase-Gen-transformiertem A. niger var. awamori-Stamm ALKO2268, bestimmt durch Southern-Blot-Analyse bzw. Northern-Analyse (wie in Beispiel 4 unten beschrieben). Die in 15 zu erkennende signifikante Erhöhung bei der Phytaseaktivität in transformierten Zellen ist einem Einbau von einer Kopie oder von mehreren Kopien des klonierten rekombinanten Phytase-Gen-Konstrukts in chromosomale DNA zuzuordnen (siehe Beispiel 4 unten);
16A zeigt eine Southern-Blot-Analyse der nicht-transformierten ALKO2268-Kontrolle (Bahnen 1, 4 und 7) und überproduzierenden Phytasetransformanten (Bahnen 2, 5, 8, 9 und 10);
16B zeigt eine Northern-Blot-Analyse von mRNA-Leveln in der nicht-transformierten Kontrolle ALKO2268 (Bahn 1) und in transformierten Stämmen (Bahnen 2–6);
17 und 18 zeigen chromosomale Phytase- und pH 2,5-saure Phosphatase-Gen-Kopienzahlen und mRNA-Level in durch zwei Genen transformiertem A. niger var. awamori-Stamm ALKO243, bestimmt durch Southern-Blot-Analyse bzw. Northern-Analyse (wie in Beispiel 5 beschrieben);
17A zeigt die Southern-Blot-Analyse des nicht-transformierten Kontroll-ALKO243-Stamms (Bahn 2) und der zweifach transformierten Stämme (Bahnen 3, 4 und 5), sondiert auf Phytase-Gene;
17B zeigt eine Nortlhern-Blot-Analyse der nicht-transformierten Kontrolle und der zweifach transformierten Stämme (Bahnen 2, 3 und 4), sondiert auf Phytase-mRNA;
18A zeigt eine Southern-Blot-Analyse der nicht-transformierten Kontrolle ALKO243 (Bahn 3) und zweifach transformierter Stämme (Bahnen 4, 5 und 6), sondiert auf pH 2,5-saure Phosphatase-Gene;
18B zeigt eine Northern-Blot-Analyse der nicht-transformierten Kontrolle ALKO243 (Bahn 1) und zweifach transformierter Stämme (Bahnen 2, 3 und 4), sondiert auf pH 2,5-saure Phosphatase-mRNA;
19 stellt die Level der Phytaseaktivität in vierundzwanzig verschiedenen Transformanten unter Verwendung kreisförmiger oder linearer Plasmid-Vektorkonstrukte (wie in Beispiel 6 unten beschrieben) dar; und
20 zeigt die Wirkungen verschiedener Promotoren auf die Level der rekombinanten Phytaseaktivität und der pH 2,5-sauren Phosphataseaktivität in den durch zwei Gene transformierten A. niger var. awamori-Stämmen ALKO243 und ALKO2268, wie es in Beispiel 6 unten beschrieben wird.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die hierin verwendeten folgenden Ausdrücke sollen folgendes bedeuten:
Der Ausdruck "Phosphatase" soll ein Enzym bezeichnen, das fähig ist, Phosphat aus einem Phosphat-enthaltenden Substrat, z. B. Phytat, freizusetzen. Typische Beispiele für Phosphatasen umfassen fungale Phosphatasen und saure und neutrale Phosphatasen, z. B. pH 2,5-saure Phosphatase und pH 6-neutrale Phosphatase.
Der hierin verwendete Ausdruck "Nucleinsäure" bezieht sich auf natürliche oder synthetische DNA und RNA, Polynucleotide (d. h. größer als drei Nucleotide) und Oligonucleotide (d. h. größer als neun Nucleotide).
Der Ausdruck "fähig, unter stringenten Bedingungen zu hybridisieren" wird hierin verwendet, um ein Anlagern an eine Subjekt-Nucleotidsequenz oder ihren komplementären Strang unter Standardbedingungen, z. B. hohe Temperatur und/oder niedriger Salzgehalt, was ein Anlagern nicht-verwandter Sequenzen unmöglich machen kann, zu bezeichnen. Ein geeignetes Protokoll (involvierend 0,1 × SSC und Anlagern (Doppelstrangbildung) bei 68°C für 2 Stunden) ist in Maniatis, T. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, Cold Springs Harbor, N.Y., S. 387–389, 1982, beschrieben.
Der Ausdruck "Nucleotidsequenz" wird hierin verwendet, um eine Sequenz von Nucleotiden oder Nucleosiden zu bezeichnen und kann nicht-benachbarte Sequenzen umfassen; beispielsweise können in genomischen Sequenzen Sequenzen, die für eine Exonregion codieren, durch Intronsequenzen und dergleichen unterbrochen sein.
Der Ausdruck "benachbarte Nucleotidsequenz" wird hier verwendet, um eine Sequenz von Nucleotiden zu bezeichnen, die aufeinanderfolgend in Serie verknüpft sind.
Der Ausdruck "codierende Region" bezieht sich auf die Nucleotidsequenz innerhalb einer Nucleinsäure, die, wenn sie transkribiert und translatiert wird, zu einer Subjekt-Aminosäuresequenz wird, z. B. werden Exonregionen in genomische DNA, wenn sie in mRNA transkribiert werden, eine Translation der Subjekt-Aminosäuresequenz steuern. Der Ausdruck "codiert" wird verwendet, um eine Aminosäuresequenz zu bezeichnen, die im Tripletcode der Nucleotide durch die Nucleotidsequenz der codierenden Region codiert wird.
Der Ausdruck "Transformationsvektor" wird hier austauschbar mit "Vektorkonstrukt" verwendet, um ein rekombinantes Konstrukt (z. B. eine Plasmid-DNA) zu bezeichnen, das eine Subjekt-Phytase- und/oder pH 2,5-saure Phosphatase-Nucleotidsequenz darin eingearbeitet enthält, und umfasst eine Unterklasse "Expressionsvektoren". Repräsentative Beispiele für Transformationsvektoren umfassen Plasmidvektoren von E. coli (z. B. pBR322, pUC18, pUC19 und dergleichen, wie auch Vektoren, die zum Transformieren von Fadenpilzstämmen (z. B. pLO-3, pFF-6, pPHO-1 und dergleichen) einsetzbar sind). Die betreffende Phytase- oder pH 2,5-saure Phosphatase-Nucleotidsequenz kann die regulatorischen Sequenzelemente aus der 5'-Region des entsprechenden Gens (d. h., hierin "native regulatorische Elemente" genannt) enthalten; oder es kann ein heterologer Promotor (d. h., aus einem anderen Stamm, einer anderen Varietät, einer anderen Spezies oder einer anderen Gattung als A. niger var. awamori-Stamm ALKO243 oder aus einem anderen Gen, z. B. GA- oder GAPDH-Promotor-Nucleotidsequenzen) angefügt werden, um die Expression der Nucleotidsequenz zu steuern. Der betreffende Transformationsvektor kann auch geeignete Restriktionsstellen zur Aufnahme zusätzlicher Nucleotidsequenzen beinhalten, die zur Begünstigung der chromosomalen Integration der Vektor-DNA nützlich sind. Die betreffenden Transformationsvektoren sind fähig, Phosphatase-Nucleotidsequenzen in eine Wirtszelle einzuführen, so dass sie wirksam in die Wirtszellen-DNA integriert werden können und dass das Produkt der codierenden Region der Nucleotidsequenz durch die transformierte Wirtszelle exprimiert wird.
"Promotor" wird verwendet, um eine Nucleotidsequenz zu bezeichnen, die fähig ist, eine Expression einer stromabwärts gelegenen Nucleotidsequenz, wie z. B. regulatorische Signalsequenzen für die Transkription und Translation und dergleichen, zu bezeichnen. Repräsentative Beispiele für Promotoren werden unten in den Beispielen 3–5 angeführt, z. B. GA-, GAPHD- und native Phytase- oder pH 2,5-saure Phosphatase-Promotor.
"Selektierbarer Marker" wird verwendet, um eine Nucleotidsequenz zu bezeichnen, die fähig ist, ein Polypeptid zu codieren, das, wenn es durch eine transformierte Zelle exprimiert wird, der Zelle die Fähigkeit verleiht, identifiziert oder von anderen Zellen in einer Zellpopulation selektiert zu werden: Erläuternde Beispiele umfassen antigene Marker, Phenotyp-Marker (z. B. Zellgröße, Form, Sprossenmuster und dergleichen) und Arzneimittelresistenz-Marker, wie z. B. Phleomycinresistenz.
Der hierin verwendete Ausdruck "transformierte rekombinante Wirtszelle" bezieht sich auf eine Zelle, die chromosomale DNA mit einer integrierten Transformationsvektor-Nucleotidsequenz darin hat. Repräsentative Beispiele für transformierte rekombinante Wirtszellen der Erfindung umfassen bakterielle und fungale Zellen, die fähig sind, eine rekombinante Phytase und/oder eine oder mehrere rekombinante Phosphatasen zu synthetisieren und/oder zu sezernieren, d. h., eine Phytase, die durch eine Nucleotidsequenz codiert wird, die fähig ist, unter stringenten Bedingungen mit SEQ. ID. NO. 18 zu hybridisieren, und die rekombinante pH 2,5-saure Phosphatase, d. h. eine Phosphatase, die durch eine Nucleotidsequenz codiert wird, die fähig ist, mit SEQ. ID. NO. 20 zu hybridisieren.
Der hierin verwendete Ausdruck "Phytase-Nucleotidsequenz" bezieht sich auf die Nucleotidsequenz, die innerhalb SEQ. ID. NO. 18 lokalisiert ist.
Der Ausdruck "pH 2,5-saure Phosphatase-Nucleotidsequenz", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Nucleotidsequenz, die fähig ist, unter stringenten Bedingungen mit einer Nucleotidsequenz in SEQ. ID. NO. 20 zu hybridisieren.
Der Ausdruck "Phosphatase", wie er hier verwendet wird, umfasst alle Enzyme, die fähig sind, eine Phosphatesterbindung in einem Substrat zu spalten, und beinhaltet Phytasen und saure und neutrale Phosphatasen.
Der Ausdruck "Phytase" soll ein Enzym bezeichnen, das fähig ist, eine Phosphatesterbindung in einem Phytatsubstrat, z. B. Inositolhexaphosphat, Inositolpentaphosphat, Inositoltetraphosphat und Inositoltriphosphat und Salze davon, zu bezeichnen.
Der Ausdruck "gereinigte Phytase" soll ein gereinigtes Enzym der Erfindung bezeichnen, das aus A. niger var. awamori-Stamm ALKO243 isoliert und im Wesentlichen gereinigt wurde. Die betreffenden Enzyme sind unter nicht-denaturierenden Bedingungen monomer, haben einen isoelektrischen Punkt von etwa 5,3; scheinbare Molekulargewichte nach SDS-PAGE von etwa 80.000 Dalton bis 86.000 Dalton; scheinbare Molekulargewichte nach Kohlenhydratentfernung (z. B. mit Endoglycosidase F/N-Glycosidase F) von etwa 45.000 bis 48.000 Dalton (SDS-PAGE). Die betreffenden gereinigten Phytaseenzyme haben die folgenden katalytischen Eigenschaften: die Enzyme sind nämlich Metallionen-unabhängige Enzyme, die fähig sind, eine Phosphatesterbindung in einem Natriumphytatsubstrat zu hydrolysieren. Die betreffenden Enzyme haben bei 37°C ein pH-Optimum von etwa pH 5; weisen im Bereich von pH 2 bis pH 7 eine Aktivität von mehr als 20% der maximalen Enzymaktivität auf und haben ein Temperaturoptimum bei 55°C bis 60°C, wobei die Aktivität im Bereich von 25°C bis 65°C >20% der maximalen Enzymaktivität ist. Eine Einheit Phytaseaktivität (PU) ist die Menge an Enzymprotein, die erforderlich ist, um 1 nmol anorganisches Phosphat in einer Minute bei 37°C unter den in Beispiel 1 unten beschriebenen Assaybedingungen aus Natriumphytat freizusetzen.
Der Ausdruck "rekombinante Phytase" soll ein Phytaseenzym bezeichnen, das durch die codierende Nucleotidsequenz der 9A und 9B; SEQ. ID. NO. 18, codiert wird und durch eine rekombinante Wirtszelle, die mit dem betreffenden Transformationsvektor, welcher die betreffende Phytase-Nucleotidsequenz enthält, transformiert wurde, produziert wird. Das aus der Transkription der codierenden Region der betreffenden Phytase-Nucleotidsequenz vorausgesagte Molekulargewicht ist ein Polypeptid-Translationsprodukt (d. h. vor Glycosylierung) von etwa 51.000 Dalton bis etwa 52.000 Dalton.
Der Ausdruck "Metallionen-unabhängig" soll bedeuten, dass die Aktivität des Enzyms in Abwesenheit von Mn²⁺, Mg²⁺ und Ca²⁺ gemessen werden kann. Allerdings soll der Ausdruck nicht bedeuten, dass die Aktivität des Enzyms nicht in Gegenwart von Mn²⁺, Mg²⁺ oder Ca²⁺ verstärkt werden kann.
Der hierin verwendete Ausdruck "saure Phosphatase" soll ein Enzym bezeichnen, das ein pH-Optimum zur Vermittlung der Hydrolyse einer Phosphatesterbindung in einem Substrat bei einem pH-Wert von kleiner als 5,0, vorzugsweise kleiner als pH 3,0, hat.
Der Ausdruck "pH 2,5-saure Phosphatase" wird verwendet, um eine Phosphatase zu bezeichnen, die ein pH-Optimum zur Vermittlung der Hydrolyse eines Phosphatesters in einem Substrat bei pH 2,0–2,5 hat, z. B. in einem Natriumphytatsubstrat.
Der Ausdruck "gereinigte pH 2,5-saure Phosphatase" soll ein gereinigtes Enzym der Erfindung bezeichnen, das aus A. niger var. awamori-Stamm ALKO243 isoliert und im Wesentlichen gereinigt wurde. Wenn das Enzym aus dem betreffenden Fadenpilzstamm gereinigt wurde, hat es die folgenden Eigenschaften: das unter nicht-denaturierenden Bedingungen isolierte Enzym ist ein tetramerer Glykoprotein-Komplex aus vier identischen Monomeren mit einem scheinbaren isoelektrischen Punkt von etwa 4,0 bis etwa 4,25. Jedes der Monomeren hat unter denaturierenden Bedingungen in SDS-PAGE ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 66.000 Dalton, und die Monomere haben nach wesentlicher Entfernung des Kohlenhydrats ein scheinbares Molekulargewicht von 46.000–49.000 Dalton (SDS-PAGE). Die betreffenden gereinigten pH 2,5-saure Phosphataseenzyme haben die folgenden katalytischen Eigenschaften. Die Enzyme können nämlich eine Hydrolyse einer Phosphatesterbindung in einem Natriumphytatsubstrat mit einer scheinbaren KM von etwa 0,7 mM (d. h., bei 37°C und pH 2,5, wie in Beispiel 1 unten beschrieben) katalysieren. Die betreffenden Enzyme haben ein pH-Optimum von etwa pH 2 bis etwa pH 2,5 (d. h. bei 37°C); im Bereich von pH 1,5 bis pH 3,5 haben sie eine Aktivität von über 20% der maximalen Enzymaktivität, und sie haben bei 55°C ein Temperaturoptimum und im Bereich von 25°C bis 60°C eine Aktivität >20% der maximalen Enzymaktivität. Eine Einheit pH 2,5-saure Phosphataseaktivität (HFU) ist die Menge an Enzymprotein, die erforderlich ist, um 1 nmol anorganisches Phosphat aus p-Nitrophenylphosphat bei 37°C in einer Minute unter den in Beispiel 1 unten beschriebenen Bedingungen freizusetzen.
Der Ausdruck "rekombinante pH 2,5-saure Phosphatase" soll ein pH 2,5-saure Phosphataseenzym bezeichnen, das durch die codierende Region einer Nucleotidsequenz codiert wird, die fähig ist, unter stringenten Bedingungen mit einer Nucleotidsequenz der 11A und 11B, SEQ. ID. NO. 20, zu hybridisieren und die durch eine rekombinante Wirtszelle produziert wird, welche mit dem betreffenden Transformationsvektor, der die pH 2,5-saure Phosphatase-Nucleotidsequenz enthält, transformiert ist. In einem repräsentativen Beispiel ist die betreffende pH 2,5-saure Phosphatase-Nucleotidsequenz die codierende Region von SEQ. ID. NO. 20, die für ein Polypeptid mit einem scheinbaren Molekulargewicht (d. h. vor Glykosylierung) von etwa 52.000 Dalton bis etwa 53.000 Dalton codiert.
Der hierin verwendete Ausdruck "sezerniert" bezieht sich auf die extrazelluläre Form eines Proteins, z. B. auf ein "sezerniertes" Protein, das in einer Zelle synthetisiert wird und in das extrazelluläre Kulturmedium transportiert wird, wo sein Vorliegen oder seine Enzymaktivität analysiert werden kann.
Der Ausdruck "Phytase-Enzymaktivität" wird hierin verwendet, um die katalytische Aktivität einer Phytase, z. B. bei der Vermittlung einer Hydrolyse eines Natriumphytatsubstrats unter Phosphatfreisetzung, zu bezeichnen, wie sie zweckdienlicherweise in einem Assay auf Phosphat, z. B. der in den unten stehenden Beispielen beschriebene, gemessen werden kann.
Der Ausdruck "pH 2,5-saure Phosphatase-Enzymaktivität" wird hier verwendet, um die Phosphataseaktivität einer pH 2,5-sauren Phosphatase, beispielsweise bei der Vermittlung der Hydrolyse einer Phosphatesterbindung in einem para-Nitrophenylphosphatsubstrat (in einem Assay, wie z. B. der in den Beispielen unten beschriebene), zu bezeichnen.
Der Ausdruck "überproduzierend" wird austauschbar mit dem Ausdruck "überexprimierend" verwendet, um anzugeben, dass die transformierte, rekombinante Wirtszelle fähig ist, Level des betreffenden Enzyms zu synthetisieren und zu sezernieren, die wenigstens etwa 2 Mal höher sind als die Menge an Enzym, die unter identischen Bedingungen durch Zellen von A. niger var. awamori-Stamm ALKO243 (ATCC #38854) synthetisiert werden. Wie in Beispiel 4 dargestellt ist, (Tabellen 8 und 9 unten), resultiert eine Überproduktion im Stamm AL-KO2268 bei Schüttelflaschenkulturen, die nach Beispiel 1 durchgeführt wurde, zur Sekretion von etwa 45 Mal mehr Phytase-Enzymaktivität pro ml Kulturmedium als die, die unter äquivalenten Bedingungen durch ALKO243 sezerniert wird. Erläuternde Transformanten mit den betreffenden Nucleinsäuren der Erfindung (d. h., auch in Beispiel 3 gezeigt) produzieren eine etwa 6 Mal größere Aktivität als ALKO2268 (d. h., siehe Tabelle 7; eine bis zu etwa 300 Mal größere Aktivität als ALKO243). Andere Transformanten in Beispiel 4 (d. h. Tabellen 8 und 9) produzierten Phytaseaktivitäten pro ml, die bis zu etwa 2100 Mal größer waren als die von ALKO243. Eine Überproduktion bezüglich pH 2,5-saurer Phosphatase wird in entsprechender Weise durch Transformanten in Beispiel 4 unten veranschaulicht, die eine bis zu etwa 130fach (d. h. Tabelle 11) höhere Aktivität pro ml als ALKO243 produzierten. Zum Vergleich, der Stamm ALKO2268 produziert etwa 41–46% der pH 2,5-saure Phosphatase-Enzymaktivität, die durch ALKO243 produziert wird.
Der Ausdruck "Verhältnis von pH 2,5-saurer Phosphatase zu Phytase" bezieht sich auf das Verhältnis der Aktivität von pH 2,5-saurem Phosphataseenzym zu einer Phytaseaktivität, wobei in diesem Fall das Verhältnis errechnet werden kann, indem die Enzymaktivität von pH 2,5-saurer Phosphatase pro ml Probe (z. B. die Anzahl an HFU/ml) durch die Phytase-Enzymaktivität pro ml Probe (z. B. die Zahl der PU/ml) dividiert wird. Repräsentative Assays zur Bestimmung der Phytase- und pH 2,5-sauren Phosphataseaktivität sind in den Beispielen angegeben. Zu Vergleichszwecken, die in den Beispielen unten angegebenen Resultate zeigen die Menge an Phytase- und pH 2,5-saurer Phosphataseaktivität, produziert und sezerniert in der Kulturbrühe durch A. niger var. awamori-Stamm ALKO243 (ATCC #38854) über 5 Tage Fermentationskultur unter den in den Tabellen 7 und 8 beschriebenen Bedingungen (Beispiel 3). ALKO243-Zellen, die unter diesen Bedingungen kultiviert werden, produzieren etwa 80–450 PU Phytase und etwa 5.000–6.000 HFU pH 2,5-saure Phosphatase; zum Vergleich, der überproduzierende Phytasestamm A. niger var. awamori-Stamm ALKO2268 produziert etwa 3.000–9.000 PU und 2.000–3.000 HFU. Bei diesen beispielhaften Stämmen ist das Verhältnis von pH 2,5-saurer Phosphatase zu Phytase (d. h. HFU/PU) etwa 0,6, und zwar in Schüttelflaschen-Fermentationskulturmedien mit ALKO2268 nach 5 Tagen, und ist 64,7 mit ALKO243 (siehe z. B. Tabellen 11 und 14–16 unten). Wie in Beispiel 5 unten veranschaulicht wird, lagen Verhältnisse der pH 2,5-saure Phosphataseaktivität (HFU) zu Phytaseaktivität (PU) im Bereich von etwa 4 bis etwa 16 mit in Tabelle 14 angegebenen Transformanten und von etwa 3 bis 6 mit den Transformanten, deren Enzymaktivitäten in Tabelle 15 (PU) und Tabelle 16 (HFU) gezeigt sind. Das betreffende "Verhältnis von pH 2,5-saurer Phosphatase zu Phytase" erreicht ein ausgewogenes Enzymgemisch, in dem die kooperative Enzymaktivität die nahezu vollständige Hydrolyse von Phytat zu Inositol und freiem Phosphat unter Freisetzung von Mineralstoffen aus dem Phytinsäure-Komplex bei einem pH (beispielsweise dem im Magen eines monogastrischen Tiers) und einer Temperatur, die bei einem Handelsprodukt erwünscht sind, schnell und wirksam katalysiert. Der Ausdruck "kooperative Enzymaktivität" wird verwendet, um anzugeben, dass die betreffenden Verhältnisse bei der Enzymmischung die folgenden Eigenschaften verleihen: a) schnellere Katalyse von Phytat in Inositol und freies Phosphat; b) effizientere Umwandlung von Phytat in Inositol und freies Phosphat; und c) eine vollständigere Umwandlung von Phytat (d. h. IP6, siehe die folgenden Beispiele) in Inositol und Phosphat (d. h., eine höhere als 80%ige Umwandlung, wie in Beispiel 1, Tabelle 1 unten, dargestellt).
Eine "normalisierte Phytase-Einheit" oder "PNU" ist als die Menge an Phytaseaktivität definiert, die durch A. niger-ALKO243 produziert ist, die in diesem Fall 85 PU/ml entspricht. Eine "normalisierte saure Phosphatase-Einheit" oder "APNU" ist als die Menge an saurer Phosphataseaktivität definiert, die durch A. niger-ALKO243-Stamm produziert wird, die in diesem Fall 5.500 HFU/ml entspricht.
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung liefern Phytase-Nucleotidsequenzen und auch pH 2,5-saure Phosphatase-Nucleotidsequenzen, die fähig sind, unter stringenten Bedingungen mit einer Nucleotidsequenz SEQ. ID. NO. 18 bzw. SEQ. ID. NO. 20 zu hybridisieren. Die betreffenden Nucleotidsequenzen sind zum Aufbau von Nucleotidsonden, Transformationsvektoren, transformierten rekombinanten Wirtszellen geeignet, codieren für rekombinante Phytase und pH 2,5-saure Phosphatase-Proteine und dergleichen, wie es unten beschrieben wird.
In anderen Ausführungsformen stellt die Erfindung transformierte rekombinante Wirtszellen, z. B. E. coli, Bacillus, Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Cephalosporium, Rhizopus und dergleichen, bereit, die Kopien der betreffenden Phytase- und/oder pH 2,5-saure Phosphatase-Nucleotidsequenzen der Erfindung haben. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die transformierten rekombinanten Wirtszellen aus Spezies von Fadenpilzen, wie z. B. Aspergillus, Trichoderma und Rhizopus, ausgewählt, und in einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind die betreffenden Wirtszellen aus Varietäten und Stämmen von Aspergillus niger ausgewählt. In einer äußerst bevorzugten Ausführungsform sind die betreffenden Wirtszellen aus rekombinanten Wirtszellen ausgewählt, die Phytase-Nucleotidsequenzen enthalten, z. B. transformierte Zellen der Phytase-überexprimierenden Stämme GAI-6, GAL-142, GAN-1, GAG-12, GAO-248, GAI-12, GAK4-46, GAI-2, GAK4-52, GAM-111, GAK4-47, GAM-225, GAD-103, GAD-23, GAD-103, GAD-23, GAD-130, GAM-199, GAE-3, GAE-32, GAM-111 und GAL-65 (wie in Beispiel 4 unten beschrieben). In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden die betreffenden Wirtszellen unter rekombinanten Wirtszellen ausgewählt, die mit Vektoren transformiert sind, welche pH 2,5-saure Phosphatase-Nucleotidsequenzen haben, z. B. transformierte Zellen der Stämme GAO-69, GAW-131, GBL-128, GBL-97, GAO-61, GAW-89, GAW-130, GAW-121, GBL-87, GBL-119, GAO-84, GAW-54, GBL-129, GAW-141, GBL-103, GAW-112, GBL-92, GAW-114 und GAT-143 (wie in Beispiel 2, 4, 5 oder 6 unten beschrieben). Andere bevorzugte Wirtszellen umfassen Zellen, die aus den transformierten Stämmen GAX-11, GAX-12, GBE-14, GBH-134, GBH-15, GBJ-9, GBJ-10, GBJ-13, GBJ-16, GBJ-26, GBJ-27, GBJ-28, GBJ-31, GBJ-35, GBJ-38, GBJ-40, GBJ-76 und GBJ-82 ausgewählt sind (wie sie unten in Beispiel 2, 4, 5 oder 6 beschrieben sind). Der Fachmann wird erkennen, dass die hierin bereitgestellten Nucleotidsequenzen, Transformationsvektoren und transformierten rekombinanten Wirtszellen zur Identifizierung weiterer Stämme, die im Wesentlichen dieselben Eigenschaften wie die vorstehend identifizierten Stämme haben, verwendbar sind.
Fachleute werden erkennen, dass die Nucleotidsequenzen und die abgeleiteten Aminosäuresequenzen der Erfindung beim Aufbau von Nucleotid- und Antikörpersonden zur Identifizierung und Isolierung natürlicher Varianten und Mutanten von Transformanten, beispielsweise Mutanten, die aus der Behandlung mit Chemikalien, UV, gamma-Strahlung und dergleichen, resultieren, nützlich sein können. Mutanten können eine verstärkte Expression der betreffenden Phytase, pH 2,5-sauren Phosphatase oder sowohl einer Phosphatase als auch einer pH 2,5-sauren Phosphatase haben. Ein typischer Durchmusterungsassay zum Identifizieren der letztgenannten Mutanten umfassen Northern- und Southern-Blotting und Western-Blotting mit Antikörpern, die gegen Peptide (natürliche und synthetische) innerhalb der abgeleiteten Aminosäuresequenzen der betreffenden Phytasen und pH 2,5-sauren Phosphatasen gerichtet sind.
Der Fachmann auf diesem Gebiet wird natürlich erkennen, dass Gemische transformierter rekombinanter Wirtszellen verwendet werden können, um eine Produktion einer Phytase und einer oder mehrerer Phosphatasen zu erreichen; beispielsweise können transformierte rekombinante Wirtszellen aus einem Stamm, der Phytase produziert, mit transformierten rekombinanten Wirtszellen aus einem Stamm, der pH 2,5-saure Phosphatase produziert, vermischt werden. Auf diese Weise können die gemischten Zellkulturen so konstruiert werden, dass die Zellen ein gewünschtes Verhältnis von Phytase-Enzymaktivität zu pH 2,5-saurer Phosphatase-Enzymaktivität freisetzen.
Die transformierten rekombinanten Wirtszellen der Erfindung können auch zur Herstellung von im Wesentlichen reinen rekombinanten Phytasepräparaten eingesetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform codieren Phytase-Nucleotidsequenzen in der transformierten rekombinanten Wirtszelle für ein Polypeptid, das eine Phytase-Aminosäuresequenz RHGXRXP hat, worin R Arginin ist, H Histidin ist, G Glycin ist, X eine beliebige Aminosäure ist und P Prolin ist.
Ausführungsformen der Erfindung stellen auch "Gemische" aus rekombinanter Phytase und pH 2,5-saurer Phosphatase in verschiedenen Reinheitsgraden und in einem gewünschten Verhältnis im Wesentlichen reiner pH 2,5-saurer Phosphatase-zu-Phytase-Enzymaktivität bereit. Die Formulierung eines derart ausgewogenen Gemisches aus Enzymen in den gewünschten Verhältnissen verleiht dem Gemisch die Eigenschaften einer kooperativen Enzymaktivität (oben beschrieben), die auf Maß geschnitten sein kann, um so den Bereich gewünschter Eigenschaften bei einer ausgewählten industriellen Anwendung abzudecken (z. B. Verwendungen, wie die unten beschriebenen). Ausgangsmaterialien für die rekombinante Phytase und die rekombinante pH 2,5-saure Phosphatase umfassen Fermentationsbrühen, Produktionskulturmedien und dergleichen von transformierten rekombinanten Wirtszellen oder von ausgewählten Stämmen, die die betreffende Phytase und/oder pH 2,5-saure Phosphatase überproduzieren. Eine Folgeverarbeitung der betreffenden Enzyme zu einem Produkt kann eine Entfernung von Zellen und zellulärem Debris (z. B. durch Zentrifugation, Filtration und dergleichen), gefolgt von einer Konzentrierung (z. B. durch Ultrafiltration, Ionenaustausch oder Affinitätschromatographie und dergleichen) involvieren, oder das Ausgangsmaterial kann nach einer einfachen Reinigung (z. B. Lyophilisierung) zur Verwendung in technischen Prozessen geeignet sein. Die entsprechenden Gemische können durch Kombinieren gleicher (oder unterschiedlicher) Mengen der betreffenden Enzympräparate (z. B. aus verschiedenen Zellkulturen) hergestellt werden, um so das gewünschte Verhältnis der entsprechenden Enzymaktivitäten zu erreichen, oder die betreffenden Gemische können in derselben Kultur vorliegen (z. B. das Produkt einer durch zwei Gene transformierten rekombinanten Wirtszelle, wie es unten beschrieben wird).
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das betreffende Gemisch ein Verhältnis der Phosphatase-Enzymaktivität (z. B. pH 2,5-saure Phosphatase) zu einer Phytase-Enzymaktivität von etwa 3 : 1 bis etwa 16 : 1.
Ausführungsformen der Erfindung liefern transformierte rekombinante Wirtszellen, die mit einem oder mit mehreren Transformationsvektoren, die eine Phytase-Nucleotidsequenz und eine oder mehrere Phosphatasen, d. h. eine pH 2,5-saure Phosphatase-Nucleotidsequenz, haben, konstruiert sind, wobei die Expression jedes Enzyms unter der Kontrolle einer unabhängigen Promotorsequenz steht. Die betreffenden transformierten Wirtszellen werden zur Expression der zwei (oder mehr) Proteinprodukte innerhalb eines gewünschten Bereichs der Enzymaktivitäten ausgewählt.
Die Phosphatasen, die durch die transformierten rekombinanten Wirtszellen und Verfahren produziert werden, die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind, liefern gegenüber anderen Enzympräparaten, die vorher auf dem Fachgebiet verwendet wurden, die folgenden Vorteile: die betreffenden Phosphatasen der Erfindung haben eine höhere Enzymaktivität pro Volumeneinheit Probe, eine höhere Ausbeute an Enzymprotein pro Volumeneinheit Probe, eine größere Kosteneffizienz, zur Verwendung in einem technischen Produkt oder Verfahren ist eine geringere Konzentrierung und/oder Reinigung erforderlich, höhere Wirksamkeit bei der Umwandlung von Phytat in freies Inositol und anorganisches Phosphat und bei Verwendung in Tierfutter geringere Verdauungsnebenwirkungen.
Die Phosphatasen, die durch die transformierten rekombinanten Wirtszellen der Erfindung produziert werden, sind in kommerziellen Prozessen zur Freisetzung von Mineralstoffen aus Komplexen mit Phytat in Pflanzenmaterialien, wie z. B. Samen, und Vermahlungsabfallmaterial, wie z. B. Sojabohnenmehl, einsetzbar, so dass Materialien mit geringem Wert effizient und effektiv in hochqualitatives Futter für nicht-wiederkäuende Tiere umgewandelt werden. Beispiele für technische Prozesse, in denen die betreffenden Enzyme nützlich sind, umfassen Maisnassvermahlen, Pflanzenproteinisolierung (spezielle Sojaproteinisolierung), Getreidebehandlung zur Verwendung beim Backen und dergleichen.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Phosphatasen der Erfindung Tierfutter direkt zugesetzt, so dass Phosphatasen vom Tier aufgenommen werden und in vivo im Verdauungstrakt, z. B. eines nicht-wiederkäuenden Tiers, freigesetzt werden. In diesem Fall werden die entsprechenden Phosphatasen so gewählt, dass sie pH-Optima für die jeweiligen Enzymaktivitäten haben, die mit dem digestiven pH, welcher bei einem nicht-wiederkäuenden Tier auftritt, zusammenfallen (d. h., der Bereich von pH 1 bis pH 6).
Geeignete Verfahren zur Herstellung der betreffenden Enzyme zur Verwendung in Produkten umfassen Sprühtrocknung, Stabilisierung in flüssigen Formulierungen, Granulierung und Einkapselung, wobei diese dem Fachmann bekannt sind.
Die Phosphataseenzyme der Erfindung und die betreffenden Enzymgemische sind fähig, Phytat effizienter und schneller zu freiem Phosphat abzubauen als eines der Bestandteilsenzyme allein. Ausführungsformen der Erfindung liefern ein Gemisch aus einer Phytase und einer pH 2,5-sauren Phosphatase, das geeignet ist, Inositolphosphate von Phytaten und Phytinsäuren, Inositolhexaphosphat, IP-6; Inositolpentaphosphat, IP-5; Inositoltetraphosphat, IP-4; Inositoltriphosphat, IP-3; Inositoldiphosphat, IP-2; Inositolmonophosphat, IP-1; in freies Inositol und anorganisches Phosphat abzubauen. Das betreffende Gemisch liefert kooperative Enzymaktivitäten, indem es eine enzymatische Kaskade für eine schnelle, vollständige und effiziente Umwandlung eines Phytatsubstrats in anorganisches Phosphat und Inositol konstruiert. Z. B. kann eine Phytase mit Phytat (IP-6) als bevorzugtes Substrat eine effiziente Hydrolyse von IP-6 in IP-5, IP-4, IP-3 und IP-2, nicht aber in freies Inositol und anorganisches Phosphat katalysieren.
Umgekehrt kann eine pH 2,5-saure Phosphatase einfache Phosphatsubstrate (z. B. IP-5, IP-4, IP-3, IP-2 und IP-2) bevorzugen und eine effiziente Hydrolyse dieser Substrate in freies Inositol und anorganische Phosphate katalysieren. Es wird angenommen, dass durch Formulierung der betreffenden Phosphatase der Erfindung innerhalb gewünschter optimaler Bereiche der Phosphatase-zu pH 2,5-saurer Phosphataseaktivität die Gemische der Erfindung ausgewogene Enzymgemische mit kooperativer Enzymaktivität liefern. Die betreffenden Gemische der Erfindung, die auf diese Weise formuliert wurden, können eine schnellere, effizientere und voll-ständige Freisetzung größerer Mengen an freiem Inositol und anorganischem Phosphat aus Phytat und Phytinsäure bereitstellen als sie in derselben Zeit (und unter denselben pH- und Temperaturbedingungen) durch jedes der Bestandteilsphosphataseenzyme produziert werden.
Beispiel 1
Reinigung und Aminosäure-Sequenzierung von Phosphatasen
Phytase- und saure Phosphatase-Peptide
[Allgemeine Materialien und Verfahren werden in dem Abschnitt mit dem Titel "Materialien und Verfahren", der am Ende dieses und jedes nachfolgenden Beispiels folgt, beschrieben].
Reinigung von Phytase und pH 2,5-saurer Phosphatase
Die Enzyme Phytase und pH 2,5-saure Phosphatase wurden aus dem zellfreien Kulturmediumfiltrat/Konzentrat von A. niger var. awamori-Stamm ALKO243 (ATCC #38854) bei 4°C bis 8°C (wenn nichts anderes angegeben ist) gereinigt. Das Kulturfiltrat/Konzentrat (990 ml) wurde (auf Eis) auf eine 70%ige Sättigung in Ammoniumsulfat eingestellt, und das Präzipitat wurde durch Zentrifugation mit 10.000 × g für 15 Minuten entfernt. Der Überstand (1070 ml) wurde dann durch hydrophobe Chromatographie an Octyl-Sepharose CL-4B (Pharmacia) getrennt. Die Säule (5 cm × 17 cm) wurde in 20 mM Bis-Tris-HCl-Puffer pH 6,2, der 0,436 g (NH₄)₂SO₄/ml enthielt, äquilibriert. Der Überstand wurde aufgetragen, und nicht adsorbierte Proteine wurden durch Waschen mit 500 ml der Äquilibrierungspufferlösung entfernt. Adsorbierte Proteine wurden unter Verwendung von 500 ml linearen Gradienten mit 70% bis 0,0% Ammoniumsulfat in 20 mM Bis-Tris/HCl-Puffer, pH 6,2, eluiert. 10 ml-Fraktionen wurden gesammelt und auf Phytase- und pH 2,5-saure Phosphatase-Enzymaktivität analysiert. Die meiste Phytaseaktivität eluierte früh im Gradienten. Fraktionen, die die entsprechenden verschiedenen Enzymaktivitäten enthielten, wurden getrennt gesammelt, durch Ultrafiltration an Amecom PM10-Membranfiltern konzentriert. Phytase-enthaltende Fraktionen wurden durch Leiten über PD10(Pharmacia)-Gelfiltrationssäulen, die in 50 mM Bis-Tris/HCl-Puffer, pH 6,2, äquilibriert worden waren, entsalzt. Zuerst wird die Phytasereinigung beschrieben, danach die saure Phosphatase-Reinigung.
Phytase wurde zuerst durch Anionenaustauschchromatographie an DEAE-Sepharose (Pharmacia) gereinigt. Kurz ausgedrückt, ein 24,5 ml-Aliquot wurde auf eine 5 cm × 7 cm-Säule, die in 50 mM Bis-Tris/HCl, pH 6,2, äquilibriert worden war, aufgebracht. Nicht adsor bierte Proteine wurden durch Waschen mit dem Äquilibrierungspuffer (100 ml) entfernt, und adsorbierte Proteine wurden unter Verwendung von 200 ml eines linearen Gradienten von 0,0 M bis 0,5 M NaCl in Äquilibrierungspuffer eluiert. Die Fraktionen wurden auf Phytaseaktivität untersucht, und Fraktionen mit Aktivität wurden gesammelt und unter Verwendung eines Centricon 30-Minikonzentrators auf 600 μl konzentriert. Portionen von 100 μl wurden bei etwa 23°C auf eine Superose 12 HR 10/30-HPLC-Säule (Pharmacia) aufgetragen, und Proteine wurden mit 50 mM Bis-Tris/HCl, pH 6,2, bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 0,3 ml/min eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden identifiziert, gesammelt und konzentriert und in 50 mM Natriumformiatpuffer, pH 3,8, überführt, wobei ein Centricon 30-Mikrokonzentrator verwendet wurde. Die Enzymlösung in Formiatpuffer wurde unter Verwendung von Kationenaustauschchromatographie weiter gereinigt. Enzymproben wurden in 2 ml-Aliquots auf eine Mono S HR 5/5 FPLC-Säule (Pharmacia), die in 50 mM Natriumformiat (pH 3,8) bei etwa 23°C equilibriert worden war, aufgetragen. Die Säule wurde mit dem Äquilibrierungspuffer (10 ml) gewaschen, und gebundenes Protein wurde mit 60 ml/h eluiert, wobei ein linearer Gradient (20 ml) von 0 mM bis 430 mM NaCl im Formiat-Äquilibrierungspuffer verwendet wurde. Phytase wurde nach diesem Verfahren mit einer Ausbeute von 18,4% gereinigt, und sie hatte eine spezifische Aktivität von etwa 275.900 (PU/mg) bei einer errechneten 130fachen Reinigung (Tabelle A).
TABELLE A Zusammenfassung der Phytasereinigung
Saure Phosphatase-enthaltende Fraktionen aus der gesammelten Octyl-Sepharose-Fraktion, oben, wurden zunächst durch Ultrafiltration an Amicon PM10-Filter konzentriert und dann einer Molekularsiebchromatographie an einer 2,6 cm × 94 cm-Sephacryl S-200 (Pharmacia)-Säule, die in 50 mM Bis-Tris/HCl (pH 6,2) äquilibriert worden war, unterworfen. Proteine wurden mit 20 ml/h eluiert, und Fraktionen mit Aktivität wurden gesammelt und durch Anionenaustauschchromatographie an einer 5 cm × 7 cm DEAE-Sepharose (Pharmacia)-Säule, die in 50 mM Bis-Tris/HCl, pH 6,2, äquilibriert worden war, weiter gereinigt. Die Säule wurde mit 100 ml Äquilibrierungspuffer gewaschen, und adsorbierte Proteine wurden unter Verwendung von 200 ml eines linearen Gradienten von 0,0 M bis 0,5 M NaCl in Äquilibrierungspuffer eluiert. Gesammelte aktive Fraktionen wurden dann konzentriert, durch Ultrafiltration an einer Amicon PM10-Membran in 20 mM Bis-Tris/HCl, pH 6,0, transferiert und einem zweiten Anionenaustauschchromatogaphieschritt unterzogen, diesmal unter Verwendung einer Mono Q HR 5/5 HPLC-Säule (Pharmacia), die bei 23°C in 20 mM Bis-Tris/HCl, pH 6,0, äquilibriert worden war. Die Probe wurde in Aliquots mit 3,5 ml aufgebracht; die Säule wurde mit 10 ml des Äquilibrierungspuffers gewaschen, und die Proteine wurden mit 60 ml/h unter Verwendung von 20 ml eines linearen Gradienten von 0,0 mM bis 350 mM NaCl im Äquilibrierungspuffer eluiert. Fraktionen, die Enzymaktivität enthielten, wurden gesammelt, zu einem Gesamtvolumen von 400 μl konzentriert und unter Verwendung eines Centricon 30-Mikrokonzentrators in 20 mM Bis-Tris/HCl, pH 6,2, enthaltend 150 mM NaCl, transferiert. Eine weitere Reinigung wurde zunächst durch Molekularsiebchromatogaphie an einer Superose 12 HR 10/30 HPLC-Säule (Pharmacia), die im Bis-Tris/HCl-Probenpuffer äquilibriert worden war, durchgeführt. Aliquots von 100 μl wurden auf diese Säule aufgebracht, und Proteine wurden mit einer Rate von 18 ml/h bei 23°C eluiert. Fraktionen, die Enzymaktivität enthielten, wurden gesammelt, in 20 mM Histidin/HCl-Puffer, pH 5,8, transferiert, wobei eine PD10-Gelfiltrationssäule verwendet wurde; dann wurden sie einem zweiten Reinigungsschritt durch Anionenaustauschchromatographie an einer Mono Q HR 5/5-HPLC-Säule unterzogen. Aliquots mit 1 ml wurden auf die Säule aufgetragen, und die Säule wurde mit 5 ml des Histidin/HCl-Probenpuffers mit etwa 23°C gewaschen. Proteine wurden mit einer Geschwindigkeit von 60 ml/h unter Verwendung von 20 ml eines linearen Gradienten aus 0 mM bis 350 mM NaCl in Äquilibrierungspuffer eluiert. Die pH 2,5-saure Phosphatase wurde nach diesem Verfahren mit 13% Ausbeute bei 126facher Reinigung gereinigt, Tabelle B. TABELLE B Zusammenfassung der Reinigung der pH 2,5-Phosphatase

nb: nicht bestimmt

Phytase: Phytase, wie sie durch die (oben) angegebenen Verfahren gereinigt wurde, wies ein scheinbares Molekulargewicht nach SDS-PAGE von etwa 80.000–86.000 Dalton auf. Das Protein, wie es im Wesentlichen gereinigt war (d. h. an SDS-PAGE), gab bei Schiff-Färbung mit Periodsäure auf Kohlenhydraten eine positive Reaktion (d. h., das gereinigte Phyta seenzym ist ein Glycoprotein). Nach Behandlung der gereinigten Phytase mit einem Gemisch aus Endoglycosidase F/N-Glycosidase F wurde das scheinbare Molekulargewicht des Enzyms (an SDS-PAGE) zu etwa 45.000–48.000 Dalton verschoben, was nahe legt, dass etwa 44% der Molekülmasse dem Kohlenhydrat zuzuschreiben sind. (Der Typ der Kohlenhydratbindung und die Natur der Gruppierung wurden nicht bestimmt). Das Molekulargewicht des nicht-denaturierten, gereinigten Phytaseenzyrns wurde durch Molekularsieb-Gelfiltration (d. h., auf der Basis seines Stokes-Radius) mit etwa 90.000 Dalton nachgewiesen; ein scheinbares Molekulargewicht von 100.000 Dalton wurde durch native Gradienten-Gel-PAA-Elektrophorese beobachtet. Die zuletzt genannten Resultate legen nahe, dass das nicht-denaturierte, gereinigte Phytaseenzym als Monomer vorliegt. Der isoelektrische Punkt der betreffenden Phytase ist gemäß isoelektrischer Fokussierung 5,3.
pH 2,5-saure Phosphatase: pH 2,5-saure Phosphatase, die durch die oben angegebenen Verfahren gereinigt worden war, wies ein scheinbares Untereinheits-Molekulargewicht an SDS-PAGE von 66.000 Dalton auf. Das im Wesentlichen gereinigte Enzym (d. h. an SDS-PAGE) lieferte bei Schiff-Färbung mit Periodsäure eine positive Reaktion, was anzeigt, dass auch pH 2,5-saure Phosphatase ein Glycoprotein ist. Nach Entfernung von Kohlenhydrat mit Endoglycosidase F/N-Glycosidase F wies das Protein durch SDS-PAGE ein scheinbares Molekulargewicht von 46.000–49.000 Dalton auf (die glycosidische Verknüpfung und die Natur der Kohlenhydratgruppierung waren nicht charakterisiert). pH 2,5-saure Phosphatase weist gemäß nativer Gradienten-PAA-Gelelektrophorese ein scheinbares Molekulargewicht von 280.000 Dalton auf, was nahe legt, dass das gereinigte, nicht-denaturierte Enzym als Tetramer aus vier 66.000 Dalton-Untereinheiten vorliegt. Nach isoelektrischer Fokussierung ist der isoelektrische Punkt der sauren Phosphatase etwa 4 bis 4,25.
Katalytische Eigenschaften der gereinigten Enzyme Phytase und pH 2,5-saure Phosphatase
Phytase: Die gereinigte Phytase wies optimale Enzymaktivität auf (wie sie bei 37°C unter Bedingungen eines Substratüberschusses gemessen wurde), und zwar bei einem pH von etwa pH 5,0 mit einer Schulter bei pH 2,5 und bei einer Aktivität von >20% der maximalen Enzymaktivität im Bereich von pH 2 bis pH 7 (1). Das Temperaturoptimum für das gereinigte Phytaseenzym (bei optimalem Na-Phytatsubstrat und pH 5,0) wurde im Bereich von 55–60°C bei einer Aktivität von >20% der maximalen Aktivität im Bereich von 25°C bis 65°C festgestellt (2). Das gereinigte Phytaseenzym katalysierte die Hydrolyse von Natriumphytat in Abwesenheit von zugesetztem Metallion (d. h., das Enzym zeigte keine absolute Notwendigkeit für Metallionen und war somit "Metallionen-unabhängig"). Allerdings war die Aktivität des gereinigten Phytaseenzyms in Gegenwart von Mn²⁺, Mg²⁺ und Ca²⁺ erhöht.
pH 2,5-saure Phosphatase: Die scheinbare KM der pH 2,5-sauren Phosphatase für das Na-Phytatsubstrat bei 37°C und pH 2,5 wurde mit etwa 0,7 mM bestimmt, und für para-Nitrophenylphosphat (PNP) war die scheinbare KM bei 37°C und pH 2,5 4 mM. Das gereinigte Enzym pH 2,5-saure Phosphatase wies ein pH-Optimum im Bereich von pH 2,0 bis 2,5 auf (d. h., bei 37°C in Gegenwart optimaler Konzentrationen an Na-Phytatsubstrat), wobei die Aktivität im Bereich von pH 1,5 bis pH 3,5 >20% der maximalen Aktivität war (3). Das Temperaturoptimum für die durch pH 2,5 saure-Phosphatase vermittelte Hydrolyse von Na-Phytat wurde bei etwa 55°C bestimmt, wobei die Aktivität im Bereich von 25°C bis 60°C >20% der maximalen Enzymaktivität war (4). Zum Vergleich ist das pH/Aktivitätsprofil einer handelsüblichen, nicht-gereinigten Finase-Präparation in 5 gezeigt, und das Temperatur/Aktivitäts-Profil ist in 6 gezeigt.
Abbau von Phytat durch Phytase und pH 2,5-saure Phosphatase und Gemische davon
Finase ist eine kommerzielle Präparation von Enzymen aus Aspergillus, die ein Gemisch aus Phytase und Phosphatase umfasst. Das Verhältnis von pH 2,5-saurer Phosphatase (HFU)-Aktivität zu Phytaseaktivität (PU) wurde für Phytase mit etwa 7 : 1 bestimmt. Es wurde ein Vergleich für die Phytat-Abbaurate durch eine handelsübliche Finase-Enzympräparation mit der Abbaurate durch Präparationen von gereinigter Phytase, gereinigter pH 2,5-saurer Phosphatase und Gemischen davon, die unterschiedliche Säurephosphatase-zu-Phytase-Verhältnisse enthalten, durchgeführt. Das Verhältnis von saurer Phosphataseaktivität (HFU) zu Phytaseaktivität (PU) der gereinigten Phytase ist etwa 0,4 : 1, während die saure Phosphatase bei pH 5,0 keine Phytaseaktivität aufweist. Die Verhältnisse der Enzymgemische sind in den Tabellen 1.a und 1.b angegeben. Unter Verwendung von 10 mM Natrium-Phytat als Substrat wurde ein Vergleich bei pH 2,5, 37°C und bei pH 5,0, 37°C, durchgeführt. Die Enzymaktivitäten aller verschiedenen Präparationen, die in den Experimenten bei pH 2,5 verwendet wurden, waren 10.000 HPU pro mmol Na-Phytatsubstrat (HPU ist die Einheit der Phytaseaktivität, gemessen bei pH 2,5 unter Verwendung von 0,2 M Glycin (HCl)-Puffer, pH 2,5, anstelle von Natriumcitratpuffer, siehe Materialien und Verfahren am Ende von Beispiel 1). In den bei pH 5,0 durchgeführten Experimenten war die Enzymdosierung pro mmol Na-Phytatsubstrat 10.000 PU, mit Ausnahme des Experiments, das nur unter Verwendung von gereinigter saurer Phosphatase durchgeführt wurde. Aus dem Reaktionsgemisch wurden nach den angegebenen Zeiten (Stunden, h: 0, 1, 2, 8, 24 und 48 h) entnommen; die Proben wurden gefriergetrocknet und später auf Inositolhexa-, -penta-, -tetra- und -triphosphat (d. h. IP6, IP5, IP4 bzw. IP3), wie auch auf freies Inositol (Ins) und anorganischen Phosphor (Pi) analysiert. Inositolhexa-, -penta-, tetra- und – triphosphate wurden durch das Verfahren von Sandberg et al. (1987) analysiert. Inositol wurde durch HPLC unter Verwendung einer Sugar Pak 1-Säule (300 mm × 6,5 mm, Waters), 0,1 mM Ca-EDTA als Elutionsmittel (Calcium-Titriplex Merck 8439), Durchflussgeschwindigkeit 0,6 ml/min bei 90°C, analysiert. Die Detektion erfolgte durch RI (Waters) unter Verwendung von 0,1–0,5 mg/ml Myoinositol (Fluka) als Standard. Anorganischer Phosphor wurde so analysiert, wie es in Materialien und Verfahren am Ende von Beispiel 1 beschrieben ist. Die Resultate dieser Experimente sind nachfolgend in Tabelle 1a und Tabelle 1b angegeben.
TABELLE 1a
TABELLE 1b
Die in den Tabellen 1a und 1b angegebenen Resultate zeigen, dass die gereinigten Enzyme Phytase und pH 2,5-saure Phosphatase und das handelsübliche Finase-Enzymgemisch die Hydrolyse von Na-Phytat in Inositol und anorganisches Phosphat katalysierten, allerdings mit unterschiedlichen Raten bzw. Geschwindigkeiten und bei unterschiedlichen pH-Optima. Unter optimalen pH-Bedingungen für jedes der gereinigten Enzyme (d. h., pH 5,0 für gereinigte Phytase und pH 2,5 für die gereinigte pH 2,5-saure Phosphatase) wurden annähernd äquivalente Mengen an anorganischem Phosphat in 48 Stunden durch alle drei Enzympräparationen freigesetzt (d. h., 90% Pi für Phytase; 88% Pi für saure Phosphatase und 88% oder 103% für das Finasegemisch). Allerdings zeigen die Resultate auch, dass die Inositolproduktion (Ins, Tabellen 1a und 1b) bei pH 5,0 deutlich langsamer ist als bei pH 2,5. Inositol konnte als Endprodukt der Na-Phytat-Hydrolyse weder bei pH 2,5 noch bei pH 5,0 detektiert werden, wenn das gereinigte Phytaseenzym allein verwendet wurde, obgleich IP6, IP5, IP4 und IP3 während der Hydrolysezeit vollständig entfernt wurden. Daraus kann geschlossen werden, dass die wahrscheinlichen hydrolytischen Endprodukte der gereinigten Phytaseenzyme Inositol-di- und/oder -monophosphat sind. Dagegen katalysierte gereinigte saure Phosphatase den Phytatabbau (d. h., von IP6 = Inositolhexaphosphate) bei pH 2,5, wobei Inositol als Endprodukt produziert wurde. Diese kombinierten Resultate legen nahe, dass in einem kommerziellen Gemisch aus Phosphatasen, z. B. Finase, Phytase allein nicht ausreicht, um eine vollständige Umwandlung von Phytat in Inositol und anorganisches Phosphat zu ermöglichen. Die Resultate legten eher nahe, dass Inositol-Endprodukte aus der Wirkung von Enzymen mit Substratspezifität ähnlich der von gereinigter pH 2,5-saurer Phosphatase stammen können. Es wurde daher die Möglichkeit in Betracht gezogen, dass die Produkte der Phytat-Hydrolyse durch Phytase (d. h., IP5, IP4, IP3, IP2, IP1) als nützliche Substrate für saure Phosphatase dienen könnten, welche die Inositolphosphate in freies Inositol und anorganisches Phosphat umwandeln würde. Die Resultate legten somit eine vorher unerwartete kooperative Enzymaktivität für den Phytatabbau zwischen Phytase und pH 2,5-saurer Phosphatase nahe. Um diese Möglichkeit weiter zu klären, wurden die Substratspezifitäten der gereinigten Phytase und der pH 2,5-sauren Phosphatase beurteilt.
Die Substratspezifitäten von gereinigter Phytase und pH 2,5-saurer Phosphatase wurden bei 37°C unter Verwendung äquivalenter Konzentrationen an Phytatsubstrat (d. h., 20 mM) und bei gleicher Temperatur (d. h., 37°C) verglichen. Die Phytaseaktivität wurde bei pH 5,0 gemessen, und die saure Phosphataseaktivität wurde bei pH 2,5 gemessen, wobei das im Abschnitt Materialien und Verfahren, der am Ende von BEISPIEL 1 angeführt ist, Molybdatphosphat-Detektionssystem verwendet wurde. Ein Vergleich der relativen Aktivität der zwei unterschiedlichen Enzyme bei verschiedenen Substraten ist in der folgenden Tabelle 2 angegeben.
TABELLE 2 Substratspezifität von im Wesentlichen gereinigter Phytase und pH 2,5-saurer Phosphatase
Die in Tabelle 1a, Tabelle 1b und Tabelle 2 präsentierten Resultate zeigen, dass gereinigte Phytase beim Katalysieren einer Hydrolyse von anderen, einfacheren Phosphatenthaltenden Substraten weniger wirksam war, während sie bei der Vermittlung der Hydrolyse von Phytinsäure wirksam war. Dagegen war gereinigte pH 2,5-saure Phosphatase beim Katalysieren einer Hydrolyse von Phytinsäure relativ unwirksam, obgleich sie bei der Hydrolyse einfacherer Phosphate relativ wirksam war. Die Resultate stützen die Vorstellung eines kooperativen enzymatischen Gemisches, in dem die Produkte einer gereinigten Phytase (z. B. Inositol-di- und -monophosphat) als Substrate für eine gereinigte pH 2,5-saure Phosphatase dienen könnten, so dass freies Inositol und anorganisches Phosphat die letztendlichen Produkte der Reaktion sind.
"Ausgewogene" Enzymgemische
Als Nächstes wurde die Möglichkeit in Betracht gezogen, dass ein effektives kooperatives enzymatisches Gemisch konstruiert werden könnte, in dem die Mengen an gereinigter Phytase und gereinigter pH 2,5-saurer Phosphatase, die in einer Präparation miteinander vermischt wurden, optimiert sind, so dass die Aktivität der zwei verschiedenen Enzyme "ausgewogen" ist, d. h., um eine kooperative Enzymaktivität bei einem besonderen pH und einer besonderen Temperatur zu erreichen, so dass die optimale Rate, Effizienz und Vollständigkeit eines Phytatabbaus zu freiem Inositol und anorganischem Phosphat erhalten werden. Es wurden Untersu chungen durchgeführt, bei denen Gemische aus gereinigter Phytase und pH 2,5-saurer Phosphatase in definierten Verhältnissen der zwei Enzymaktivitäten formuliert wurden; während solche "ausgewogenen" Gemische aus gereinigter Phytase und pH 2,5-saurer Phosphatase Vorteile an erhöhter Phytase-Hydrolysegeschwindigkeit und einer vollständigeren Umwandlung in freies Inositol und anorganisches Phosphat gegenüber handelsüblichen Präparationen aufwiesen, wurde es für die Verwendung in den meisten industriellen Verfahren (z. B. Tierfutter) innerhalb gewünschter Bereiche der Verhältnisse der Enzymaktivitäten, z. B. pH 2,5-saure Phosphatase als nicht-kosteneffektiv angesehen, ein derartiges "ausgewogenes" Gemisch aus Enzymen zu reinigen, zu standardisieren, eine Qualitätskontrolle (QC) und eine Qualitätssicherung (QA) durchzuführen.
Um diese Probleme zu lösen, wurde zunächst die Möglichkeit in Betracht gezogen, dass Molekulartechniken eingesetzt werden könnten, um rekombinante Enzyme zu produzieren, die von ausreichend hoher Qualität sind, um einheitliche standardisierte Präparationen bereitzustellen und die die notwendige Kosteneffizienz und QC/QA-Eigenschaften, welche für kommerzielle Produkte "ausgewogener" Gemische erforderlich sind, aufweisen.
Aminosäuresequenzierung von Phytase und pH 2,5-saurer Phosphatase
Um innere Aminosäuresequenzen der gereinigten Proteine zu erhalten, wurden Peptidfragmente unter Verwendung von TPCK-Trypsin hergestellt (wie in Materialien und Verfahren, unten, beschrieben) hergestellt. Außerdem wurde pH 2,5-saure Phosphatase alkyliert (d. h., unter Verwendung von 4-Vinylpyridin) und danach mit Lysylendopeptidase C verdaut, wie es in Materialien und Verfahren beschrieben ist. Die resultierenden Peptide wurden durch Reverse-Phase-Hochdruckflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) an einer C18 RP-Säule gereinigt (wie es im Abschnitt Materialien und Verfahren, unten, beschrieben ist). Ein Amino-terminales Sequenzieren der gereinigten Peptide wurde unter Verwendung eines Gas-gepulsten Flüssigphasensequenzers durchgeführt, und die freigesetzten PTH-Aminosäuren wurden durch RP-HPLC analysiert (wie es in Materialien und Verfahren beschrieben ist). Eine Carboxyterminale Sequenzierung wurde unter Verwendung eines kinetischen Carboxypeptidase Y-Verdaus, einer PITC-Derivatisierung und einer RP-HPLC-Analyse der PITC-Aminosäuren durchgeführt.
Die Aminosäuresequenzen der tryptischen Peptide von Phytase und pH 2,5-Phosphatase, wie auch der Lysylendopeptidasepeptide von pH 2,5-Phosphatase sind in den folgenden Tabellen 3 und 4 dargestellt. Wie die in Tabelle 3 und 4 angegebenen Resultate zeigen, waren einige Peptidpräparate nicht rein. Die Tabellen 3 und 4 zeigen auch einen Vergleich der Peptid-Aminosäuresequenzen mit der Aminosäuresequenz, die aus der Nucleotidsequenzierung der Gene und der cDNA abgeleitet ist (Beispiel 2, unten), d. h., in Klammern [] in den Tabellen 3–4.
Die Amino-terminale Sequenz von gereinigter Aspergillus niger var. awamori-Stamm ALKO243-Phytase zeigte eine N-terminale Sequenz (d. h., Peptid #1081/N-phy Tabelle 3; LAVPAS(R)NQSTXDT), die ähnlich der für eine A. ficuum-Phytase beschriebenen Amino terminalen Sequenz (d. h., Ullah, 1988; LAVPASRNQSSGDT) ist. Ein Peptid (d. h., #420/10phy; LYVEMMQ(N)QA(E)Q(T)PLV) war ähnlich einem beschriebenen inneren Peptid einer A. ficuum-Phytase (d. h., Ullah, 1988, MMQCQAEQEPLVRVLVNDRX), aber nicht identisch mit dieser. Eine Carboxy-terminale Sequenzierung von Phytase lieferte die Sequenz XSA-OH. Ein Peptid (d. h., #675; Tabelle 3) enthielt eine KDPR-Sequenz, die mit der Sequenz, von der berichtet wurde, dass sie in anderen Phosphatasen vorliegt (nämlich KDPRA; Ullah, 1991), homolog ist.
TABELiLE 3 Aminosäureseguenzen von isolierten Phytase-Peptiden
TABELLE 3 (Fortsetzung)
Bei der Sequenzierung von pH 2,5-Phosphatase wurden aus der Amino-terminalen Sequenzierung von nativen oder alkylierten Proteinen, die aus Aspergillus niger var. awamori-Stamm ALKO243 gereinigt worden waren, keine Resultate erhalten. Ein Peptid (d. h., #1107T/7Lpho, Tabelle 4, unten) führte zu einer Sequenz, die zu einer Amino-terminalen Sequenz identisch war, die für eine Phosphatase beschrieben wurde, welche aus A. ficuum gereinigt worden war (d. h., Ullah & Cummins, 1987; FSYGAAIPQSTQEKQFSQEFRDG). Peptid #941C/10Lpho aus gereinigter pH 2,5-Phosphatase (ALKO243) kann eine Fortsetzung der #1107/7Lpho-Sequenz sein, da sie im A. ficuum-N-Terminus enthalten zu sein scheint. Das Peptid #1112T/3Tpho scheint eine Fortsetzung von Peptid #943C/IILpho zu sein, da es eine partiell überlappende Sequenz zu haben scheint (d. h., FSSG in #1112T/3Tpho). Das pH 2,5 Phosphatasepeptid #816C/1Lpho enthält eine mögliche Konsensussequenz als aktive Stelle (d. h., RHGXRXP).
TABELLE 4 Aminosäuresequenz von isolierten tryptischen (T) und Lysylendopeptidase C-Peptiden^a von pH 2,5-Phosphatase
Aus diesen Aminosäuresequenzen wurde eine Peptidsequenz aus Phytase (d. h., #420, Leu Tyr Val Glu Met Met Gln (Asn) Gln Ala (Glu) Gln (Thr) Pro Leu Val, worin das fragliche (Asn) in Cys korrigiert wurde; Ullah, 1988; Tabelle 3) und zwei aus pH 2,5-Phosphatase (d. h., #816C; Arg His Gly Glu Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Ala Gly Lys, und #1110T; Gln Leu Pro Gln Phe Lys, Tabelle 4) als für die Herstellung von degenerierten Oligonucleotidsonden zum molekularen Klonieren, wie es in Beispiel 2 unten beschrieben ist, als nützlich selektiert.
Materialien und Verfahren
Phytase- und pH 2,5-saure Phosphataseenzym-Assays: Molybdat-Detektionssystem
Beide Assays messen die Menge an anorganischem Phosphat, das durch Enzymwirkung freigesetzt wird, als kolorimetrische Quantifizierung unter Verwendung der Reduktion eines Phosphomolybdat-Komplexes. Eine Phytase-Einheit (PU) ist die Menge an Enzym, die unter den unten beschriebenen Bedingungen in einer Minute bei 37°C 1 nmol anorganisches Phosphat aus Na-Phytat freisetzt. Eine pH 2,5-saure Phosphatase-Einheit (HFU) ist die Enzymmenge, die unter den unten angegebenen Bedingungen in einer Minute 1 nmol anorganisches Phosphat aus p-Nitrophenylphosphat freisetzt.
Phytaseaktivität wurde bestimmt, indem 1 ml Substrat (1% Natriumphytat, täglich frisch hergestellt [Sigma #P3168] in 0,2 M Citratpuffer, pH 5,0) zu 1 ml verdünntem Enzymüberstand gegeben wurde, um die Orthophosphat-Hydrolyse zu initiieren. Nach genau 15 Minuten bei 37°C wurde die Hydrolysereaktion durch Zusatz von 2 ml 15% TCA (Trichloressigsäure, Merck #807) mit anschließendem Mischen, Abkühlen und Zentrifugation zur Entfernung von Präzipitat, das sich bildet, beendet. Freigesetztes Orthophosphat wurde durch Zusatz eines gleichen Volumens an frisch hergestelltem Reagens C (d. h., 3 Volumina 1 M Schwefelsäure, vermischt mit 1 Volumen 2,5% (Gew./Vol.) Ammoniummolybdat (Merck #1182) und 1 Volumen 10% (Gew./Vol.) Ascorbinsäure (Merck #127)) zu einer 1 : 10-Verdünnung des Hydrolysereaktionsgemisches (oben) gemessen. Das Reagens C-Gemisch wurde für 20 Minuten bei 50°C inkubiert. Die Extinktionen wurden bei 820 nm gegen eine Reagens-Blindprobe und bekannte Standards (Verdünnungen von 0,9 mM KH₂PO₄: Merck #4873 von 1 : 100–1 : 400) gemessen, um so eine Standardkurve zu erstellen. Die Menge an Phosphat, die durch Phytase freigesetzt worden war, wurde verwendet, um Phytase wie folgt zu berechnen: Der A_820nm-Wert für die Phytase wurde nämlich mit den A_820nm-Werten der Phosphat-Standardkurve verglichen, und nach Korrektur bezüglich der Verdünnungsfaktoren wurde die Phytaseaktivität erhalten, indem die Phosphorkonzentration (nmol/ml) durch die Hydrolysezeit (d. h., 15 min) dividiert wurde.
Die pH 2,5-saure Phosphataseaktivität wurde in ähnlicher Weise bestimmt: Es wurden nämlich 0,1 ml verdünntes Enzym (verdünnt in 0,2 M Glycin-HCl-Puffer, pH 2,5) zu 1,9 ml Substrat (30 mM p-Nitrophenylphosphat [Boehringer Mannheim], gelöst in 0,2 M Glycin-HCl-Puffer), pH 2,5, gegeben. Nach 15-minütiger Inkubation bei 37°C wurde die Reaktion durch Zusatz eines gleichen Volumens an 15% TCA (wie oben) beendet. Das freigesetzte Orthophosphat wurde unter Verwendung von Reagens C (wie oben beschrieben) gemessen, und die Aktivität wurde durch Vergleich mit bekannten verdünnten Phosphat-Standards (wie oben) und unter Verwendung der oben beschriebenen Berechnungen bestimmt.
Herstellung von tryptischen Peptidfragmenten zur Aminosäuresequenzierung
Gereinigte Phytase (70 μg) wurde in 50 mM Tris-HCl, pH 7,9, mit 2% (Gew./Gew.) Trypsin (TPCK-behandelt, Sigma) für 2 h bei 37°C verdaut und dann weiter mit 2% (Gew./Gew.) Trypsin für 21 h verdaut. Gereinigte pH 2,5-saure Phosphatase in 100 mM Tris-HCl, pH 8,0, wurde mit 2% (Gew./Gew.) Trypsin für 20 h bei 37°C behandelt und danach weiter mit 2% (Gew./Gew.) Trypsin für 6 h behandelt. Die Peptide wurden gereinigt, wie es unten beschrieben ist.
Herstellung von Lysylendopeptidase C-Peptidfragmenten zur Aminosäuresequenzierung
Gereinigte pH 2,5-saure Phosphatase wurde wie folgt unter Verwendung von 4-Vinylpyridin alkyliert: Zu lyophilisierter pH 2,5-saurer Phosphatase (75 μg) wurden 40 μl 0,5 M Tris-HCl, pH 7,5, der 6 M Guanidiniumhydrochlorid, 2 mM EDTA und 34 mM DTT enthielt, gegeben. Nach Zusatz von 1 μl 4-Vinylpyridin (Sigma) wurde das Reaktionsgemisch für 1 h bei Raumtemperatur (22°C) gehalten. Die Reaktion wurde durch Zusatz von 10 ml 1,4 M DTT gestoppt. Dann wurde alkylierte Phosphatase durch HPLC mit einer C-1-Reverse-Phase-Säule (TSK TMS 250; 0,46 × 4 cm) unter Verwendung eines Gradienten von 20% bis 70% ACN/0,06% TFA (80% bis 30% 0,1% TFA) in 30 min gereinigt. Die Fraktionen, die bei 218 nm adsorbierten, wurden gesammelt und in einer Speed-Vac-Vakuumzentrifuge eingeengt. Die getrocknete Probe wurde dann resuspendiert, indem 60 μl 70 mM Tris-HCl, pH 9,1, zugegeben wurden, und dann mit 2% (Gew./Gew.) Lysylendopeptidase C (Wako Chemicals) für 2 h bei 37°C verdaut. Nach Zugabe von weiteren 2% (Gew./Gew.) Lysylendopeptidase C wurde die Inkubation bei 37°C auf 26 h verlängert. Die Peptide wurden gereinigt, wie es unten beschrieben wird.
Peptidreinigung und Amino-terminale Sequenzierung
Die aus dem enzymatischen Verdau (oben) erhaltenen Peptide wurden durch HPLC an einer C 18-Reverse-Phase-Säule (Vydac 218 TP B5; 0,46 × 25 cm) mit einem 90 Minuten-Gradienten von 0 bis 60% ACN/0,06% TFA (100 bis 40% 0,1% TFA) getrennt. Die Extinktion bei 218 nm wurde zur Detektion von Peptiden verwendet. Eine Amino-terminale Sequenzierung der gereinigten Peptide wie auch der nativen Proteine erfolgte durch Abbau dieser in einem Gas-gepulsten Flüssigphasensequenzer (Kalkkinen & Tilgmann, 1988). Die freigesetzten PTH-Aminosäuren wurden on-line durch Verwendung einer Reverse-Phase-HPLC mit enger Bohrung analysiert.
Carboxy-terminale Sequenzierung von Phytase
Eine Charge gereinigter Phytase (53 μg) wurde mit Carboxypeptidase Y (Sigma, 0,6 U) in 50 mM Natriumacetat, pH 5,6, das 10% Harnstoff und 0,05% SDS enthielt, bei Raumtemperatur (22°C) verdaut. Zu verschiedenen Zeiten wurden Proben des Verdaus entnommen. Diese wurden in einer Speed-Vac-Vakuumzentrifuge getrocknet und mit Phenylisothiocyanat (PITC) entsprechend dem Aminosäure-Analysier-Kit Pico-Tag (Waters Association) derivatisiert. Eine Analyse der derivatisierten Aminosäuren wurde durch Reverse-Phase-HPLC mit der Pico-Tag-C-18-Säule durchgeführt und durch identisch derivatisierte Aminosäure-Standards quantifiziert.
BEISPIEL 2
Isolierung und Charakterisierung von Phosphatase-Genen
Phytase und pH 2,5-saure Phosphatase
[Allgemeine Materialien und Verfahren sind in dem Abschnitt mit dem Titel "Materialien und Verfahren", der auf die Beispiele folgt, beschrieben].
Für die molekulare Klonierung der Phytase- und der pH 2,5-sauren Phosphatase-Gene wurden innere Peptide aus den Enzymen (wie oben beschrieben) aus A. niger var. awamori-Stamm ALKO243 hergestellt. Die genomische DNA, die für Phytase und pH 2,5-saure Phosphatase codiert, wurde kloniert, und cDNA wurde ebenfalls kloniert, so dass die vollständige codierende Sequenz bestimmt werden konnte. Schließlich wurden Expressionsvektoren konstruiert (wie in Beispiel 3 unten beschrieben), welche jedes der Enzyme in funktioneller Form sezernierten, und es wurde ein mit zwei Genen transformierter Stamm selektiert, der das gewünschte kosteneffektive und "ausgewogene" Gemisch von Enzymen in einem Verhältnis von pH 2,5-saurer Phosphatase zu Phytase synthetisierte und sezernierte, das dem Gemisch die Eigenschaft kooperativer Enzymaktivität verleiht, was für eine besondere kommerzielle Verwendung, z. B. in Tierfutter, wünschenswert ist.
Entwicklung von Oligonucleotidsonden
Aus gereinigter Phytase und pH 2,5-saurer Phosphatase wurden einige innere Peptidfragmente sequenziert, Beispiel 1, oben. Ein degeneriertes Oligonucleotid, das zu allen acht möglichen Kodonkombinationen einer ausgewählten Region (Klammern, Tabelle 3) eines internen Phytase-Peptids komplementär war, wurde unter Verwendung des Pharmacia Gene Assembler Plus synthetisiert: nämlich das Peptid aus Phytase mit der Sequenz Leu Tyr Val Glu Met Met Gln Cys Gln Ala Glu Gln (d. h., Peptid #420, Tabelle 3, bei dem das fragliche (Asn) durch Cys korrigiert worden war; Ullah, 1988). PHY-1, das in Tabelle 5 gezeigt ist, ist ein 17 Basen-Oligonucleotid-Gemisch, das eine perfekte Übereinstimmung von acht Kombinationen enthält.
Ein degeneriertes 17mer-Oligoncleotid, PHY-31, wurde aus einem sauren Phosphatase-Peptid entwickelt : nämlich Peptid #816C aus pH 2,5 Phosphatase (d. h., Arg His Gly Glu Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Ala Gly Lys). Durch den Einbau eines neutralen Inosins existiert in PHY-31 eine perfekte Übereinstimmung von 64 möglichen Kombinationen. Die Nucleotidsequenz von Oligo-PHY-31 und die entsprechende Peptidsequenz sind in Tabelle 5 gezeigt. PHY-34 ist ein 17mer-Gemisch mit 128facher Degeneriertheit, konstruiert für die codierende Sequenz von Peptid #1110T von pH 2,5-saurer Phosphatase; PHY-35 ist ein 17mer-Gemisch mit 64facher Degeneriertheit, das ebenfalls für die codierende Sequenz für Peptid #1110T konstruiert wurde. Sowohl PHY-34 als auch PHY-35 sind für eine vollständige Darstellung von Peptid #1110T erforderlich. Peptid #1110T stammt aus einem Trypsin-Verdau von gereinigter, nativer pH 2,5-saurer Phosphatase (Tabelle 4, oben).
"Probing" genomischer ALKO243-DNA mit degenerierten Oligonucleotiden
Um die Spezifität der degenerierten Oligonucleotide zu beurteilen, wurde die gesamte genomische DNA aus ALKO243 mit PHY-1markiert, mit [γ-³²P]-ATP endmarkiert, zu einer hohen spezifischen Aktivität unter Verwendung von E. coli-Polynucleotid-T4-Kinase [BRL] sondiert. 7 zeigt, dass mit einem Waschen mit hoher Stringens eine einzige Bande an Phytase-Oligo-PHY-1 hybridisierte. Bei dieser Stringens wurde durch das degenerierte Oligo eine einzelne Bande erkannt, die es zu einem guten Kandidaten für ein Library-Screening machte.
7. A. niger var. awamori-Stamm ALKO243-genomische DNA, sondiert mit Phytase-Oligonucleotid PHY-1. Genomische DNA wurde durch ein neutrales Lyseverfahren isoliert. Kurz ausgedrückt, fein zermahlenes, gefriergetrocknetes Mycelium wurde mit 4% SDS-TE-Puffer lysiert. Zelldebris wurde entfernt, und Überstand wurde entfernt und zweimal mit einem gleiche Volumen an Tris-gesättigtem Phenol : Chloroform (1 : 1) extrahiert. Genomische DNA wurde mit NH₄OAC und EtOH präzipitiert. Pelletisierte DNA wurde durch Ultrazentrifugation durch CsCl, wie sie gewonnen worden war, gereinigt, wie es von Maniatis et al beschrieben wurde. Eine Hybridisierung an genomische DNA mit [γ-³²P]-ATP-markierten, degenerierten Oligos (Maniatis et al., 1982) erfolgte bei 42°C über Nacht an Filtern in Oligo-Hybridisierungslösung (6 × SSPE, 0,5% SDS, 3 × Denhardts, 100 μg/ml tRNA). Nicht-spezifische Bindung wurde durch zweimaliges Waschen der Filter für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 2 × SSC, 0,1% SDS, und einmaliges Waschen für 5 Minuten bei 42°C in frischer Lösung entfernt. Eine Belichtung über Nacht auf Kodak X-Omat AR-Film mit intensivierenden Filtern entwickelte positiv hybridisierende Banden.
In ähnlicher Weise wurde genomische DNA aus ALKO243 mit radioaktiv markierter, spezifischer pH 2,5-saurer Phosphatase-Oligo-PHY-31 (unter den in 7 oben beschriebenen Bedingungen) sondiert. Das Autoradiogramm ist in 8 gezeigt. Obgleich die Spezifität von PHY-31 nicht so hoch wie die von PHY-1 war, scheint es, dass durch diese Oligonucleotid-Sonde höchstens zwei Banden erkannt wurden.
Isolierung und Charakterisierung des Phytase-Gens
Genomische DNA wurde mit Sau3A partiell verdaut, um Fragmente mit einer Länge von 10–23 kb zu erzeugen. Verdaute DNA wurde an mit BamHI geschnittene, dephosphorylierte Lambda Dash II-Vektorarme [Stratagene] ligiert. Die Ligation wurde in vitro unter Verwendung von Stratagene-Gigapack Gold-Verpackungsextrakten verpackt. Ein verpackter Phage wurde verwendet, um E. coli-Stamm P2392 zu infizieren und Plaques zu erhalten. 5 × 10⁴ Plaque-bildende Einheiten wurden unter den folgenden Bedingungen mit Phytase-Oligo-PHY-1 durchgemustert: nämlich bei 42°C über Nacht an Filtern in Oligonucleotid-Hybridisierungslösung (6 × SSPE, 0,5% SDS, 3 × Denhardts, 100 μg/ml tRNA). Eine nicht-spezifische Bindung wurde durch zweimaliges Waschen der Filter für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 2 × SSC, 0,1% SDS und einmal für 5 Minuten bei 42°C in frischer Lösung entfernt. Eine Belichtung über Nacht auf Kodak X-Omat-AR-Film mit intensivierenden Filtern zeigte positiv hybridisierende Plaques. Zwölf stark hybridisierende Plaques wurden zur weiteren Charakterisierung herausgenommen. Lambda-Phage mit Inserts, die an die PHY-1-Sonden hybridisierten und bei 0,8% Agarosegel-Elektorphorese eine zu genomischen DNA-Fragmenten identische Größe hatten, wurden zur Subklonierung und eventuellen Nucleotidsequenzierung (wie unten in Materialien und Verfahren beschrieben) ausgewählt.
Subklonierung und Sequenzierung von genomischen Phytase-Klonen
Bakteriophagen-DNA, die im Wesentlichen durch das Verfahren von Yamamoto (1970) aus jedem der 12 Kandidaten isoliert worden war, wurde mit Restriktionsendonucleasen verdaut und mit dem PHY-1-Oligonucleotid sondiert. Ein 1,8 kb BamHI/Xbal hybridisierendes Fragment, das vorher in genomischen Southern identifiziert worden war, wurde aus dem Klon Nummer CH7 isoliert und in M13mp18 und M13mp19 [BRL] subkloniert. Subklon CH7, der mit Oligonucleotid-Sonden für Phytase (d. h., PHY-1) positiv reagiert hatte, wurde sequenziert.
Die Nucleotidsequenz dieses Subklons zeigte Regionen, die der beschriebenen Nucleotidsequenz von anderen bekannten Phytase-Peptidsequenzen entsprechen, wobei die wahrscheinliche Identität des Klons als eine genomische Phytase-DNA bestätigt wurde. Eine fortgesetzte Sequenzierung eines überlappenden 2,6 kb SphI-Fragments zeigte ein offenes Leseraster von 1409 bp, das 15 interne Peptidsequenzen und eine N-terminale Peptidsequenz umfasste. Die Analyse der stromaufwärts gelegenen Sequenz mit dem IntelliGenetics' PC/GENE-Programm "SIGNAL" (auf der Basis des Verfahrens von Standen, 1984) zeigte eine starke eukaryotische Kozak-Konsensussequenz, gefolgt von einem Methionin-Initiationskodon. Allerdings lag dieses ATG bezüglich dem Rest der Sequenz außerhalb des Rahmens. Ein potentielles 102 bp-Intron, das durch einen Konsensus-Pilzdonor, "Lasso"-geformte und Akzeptorsequenzen dargestellt wird (Rambosek und Leach, 1987), wurde zwischen dem potentiellen Initiationskodon und dem N-terminalen Peptid identifiziert. Ein Spleißen dieses vermeintlichen Introns stellte das Leseraster zwischen dem vorgeschlagenen ATG und der N-terminalen Peptid-Aminosäuresequenz wieder her. Durch Einbau dieses einzelnen vermeintlichen Introns in das 5'-Ende des Phytase-Gens wurde das gesamte Polypeptid durch 470 Aminosäuren codiert. Sequenz und Translation des Phytase-Gens ist in 9 dargestellt.
9. Nucleotidsequenz aus dem 2,6 kb SphI-Fragment, einschließlich des Phytase-Gens mit abgeleiteter Translation. Die vorgeschlagenen Intron-Donor (GTRNGT)-, "Lasso" (RCTRAC)- und Akzeptor (YAG)-Konsensussequenzen haben einen Strich darüber. Die Nucleotidsequenz, die dem Peptid #420 (Tabelle 3) entspricht, ist unterstrichen. Die Nucleotidsequenz wurde durch das M13-Didesoxyverfahren (Sanger et al., 1977) der überlappenden Subklone unter Verwendung des United States Biochemical Sequenase II-Kits bestimmt.
Die relative molekulare Masse des translatierten Phytase-Polypeptids wurde mit etwa 51.400 Dalton errechnet. Eine Kodon-Nutzungsanalyse für Phytase zeigte eine Frequenz von G + C in der stummen dritten Position des Sensekodons (d. h., ausschließlich der Trp- und Met-Kodons) von 68,3%. Das gesamte Struktur-Gen und die stromaufwärts gelegene Sequenz wurden als ein 2,6 kb SphI-Fragment in pUC-18 subkloniert und pFF-1 genannt (10).
10. Ringförmige Transformationsvektoren von Phytase. (A) pFF-1: ein 2,6 kb SphI-Fragment, das das Phytase-Gen und seinen nativen Promotor enthält, wurde aus einem positiven Lambda-Klon in pUC-18 subkloniert. In der -26-Position der für Phytase codierenden Region in pFF-1 wurde durch eine ortsspezifische Mutagenese eine XbaI-Stelle eingeführt, wodurch pSELFX erhalten wurde. (B) pFF-2: Phytase unter Kontrolle des A. niger-β-Tubulin-Promotors. Ein 2,0 kb XbaI-Fragment aus pSELFX wurde an eine einmal vorkommende XbaI-Stelle im fungalen Expressionsvektor pTL-113 ligiert, wodurch pFF-2 erhalten wurde. (C) pFF-3: Phytase unter Kontrolle des A. niger-GAPDH-Promotors. Das 2,0 kb Xbal-Fragment aus pSELFX wurde an die einmal vorkommende XbaI-Stelle in pPRE-81 ligiert, wodurch pFF-3 erhalten wurde. (D) pFF-4: Phytase unter Kontrolle des A. niger-GA-Promotors. Das 2,0 kb XbaI-Fragment aus pSELFX wurde an eine einmal vorkommende XbaI-Stelle in pGA ligiert, wodurch pFF-4 erhalten wurde.
Isolierung und Charakterisierung des Gens für pH 2,5-saure Phosphatase
Dieselbe Lambda-Bibliothek wurde replattiert und mit pH 2,5-saurer Phosphatase-Oligonucleotid PHY-31 unter Bedingungen, die mit genomischen Hybridisierungen oben entwickelt worden waren, durchgemustert. Zur weiteren Charakterisierung wurden zwölf hybridisierende Plaques herausgenommen. Bakteriophagen-DNA, die aus jedem der Kandidaten isoliert worden war, wurde mit Restriktionsendonucleasen verdaut und entweder mit PHY-31-Oligo oder einem zweiten Oligogemisch, PHY-34/35, das von einem unabhängigen pH 2,5-sauren Phosphatase-Peptid stammte, sondiert. Einer der Klone, AP99, enthielt ein 2,1 kb SphI-Fragment, das vorher bei der genomischen Southern-Analyse identifiziert worden war und das stark an beide Oligonucleotide hybridisierte. Eine starke Hybridisierung an zwei Oligonucleotide, die von einer unabhängigen Peptidsequenz stammen, legt sehr stark nahe, dass der Klon pH 2,5-saure Phosphatase-Sequenz enthielt. Dieses Fragment wurde zur Sequenzierung in M13mp18 und M13mp19 subkloniert. Die Nucleotidsequenz dieses Subklons zeigte ein ORF mit 785 bp mit einem potentiellen 5'-Initiations-ATG (Methionin) einer fungalen Signalsequenz und einer translatierten Sequenz, die mit dem N-terminalen Peptid und anderen internen Peptidsequenzen, die in Beispiel 1 oben bestimmt wurden, kompatibel ist (Tabelle 4). Stromabwärts zu dem ORF wurden Terminationskodons in allen drei Leserastern bis Nucleotid 1151 identifiziert, nachdem eine zusätzliche pH 2,5-saure Phosphatase-Peptidsequenz identifiziert wurde. Diese Resultate erforderten den Einschluss eines Introns (von Introns) in den 3'-Teil des Gens.
Identifizierung von cDNA-Klonen für pH 2,5-saure Phosphatase
PolyA-mRNA wurde gereinigt (wie unten beschrieben; Materialien und Verfahren) und für eine Polymerasekettenreaktions (PCR)-Klonierung eines Teils der pH 2,5-saure Phosphatase-cDNA verwendet. Kurz ausgedrückt, zuerst wurde eine Synthese des ersten Strangs mit dem Oligonucleotid-Primer AP273 durchgeführt, der an eine Subspecies-mRNA, die für pH 2,5-saure Phosphatase codierte, annealed: AP273 5-CTACCCCTCTGCATCTAG-3'. Oligonucleotid-PCR-Primer UPPHOS und DOWNPHOS wurden mit flankierenden EcoRI-Restriktionsstellen synthetisiert:
UPPHOS 5'-GAATTCCGAGTCCGAGGTCATGGGCGCG-3'; und
DOWNPHOS 5'-GAATTCCCGGGACCTACCCCTCTGCAT-3'.
UPPHOS und DOWNPHOS wurden in genomischen Klonen umgekehrt orientiert und durch 978 Basen getrennt. Eine PCR-Amplifikation des cDNA-mRNA-Komplexes mit den Oligonucleotid-Primern UPPHOS und DOWNPHOS lieferte ein spezifisches Produkt mit etwa 850 bp. Das amplifizierte Produkt wurde aus Agarosegelen isoliert und mit EcoRI verdaut. Zur Doppelstrangsequenzierung wurde dieses Fragment in pUC-18 subkloniert, mit EcoRI verdaut.
PCR-amplifizierte cDNA aus dem 3'-Teil des Gens wurde sequenziert und zeigte das Vorliegen von drei kurzen Introns, die jeweils fungale Donor-, "Lasso"- und Akzeptor-Konsensussequenzen aufwiesen. Die Exonsequenz wird durch Spleißen der Nucleotide 136-916, 971–1088, 1140–1245 und 1305–1740 abgeleitet (wie in 11 dargestellt ist). Die resultierende translatierte Sequenz codiert für ein Protein aus 479 aa. Die gesamte Sequenz mit Translation ist in 11 gezeigt.
Das abgeleitete pH 2,5-saure Phosphatase-Polypeptid hat ein errechnetes Molekulargewicht von etwa 52.700 Dalton. Eine Kodon-Verwendungsanalyse von pH 2,5-saurer Phosphatase zeigte eine sehr hohe Frequenz von G + C an der stummen dritten Position von Sense-Kodons mit 79,3%.
Das 2,1 kb SphI-Fragment enthielt nur 135 bp stromaufwärts liegende pH 2,5-saure Phosphatase-Sequenz. Da diese Länge an Promotorsequenz für eine effiziente Expression nicht ausreichend sein kann, wurde aus dem Lambda-Klon ein größeres Fragment subkloniert. pAP-3 enthält ein 5,1 kb SalI/PstI-Fragment aus Lambda-Klon AP99, und die Nucleotidsequenz ist in 11 gezeigt.
11. Nucleotidsequenz aus dem 2,1 kb SphI-Fragment, das das pH 2,5-saure Phosphatase-Gen enthält, mit abgeleiteter Aminosäuretranslation. Die Intron-Donor-, "Lasso"- und Akzeptorsequenzen, wie sie durch cDNA-Sequenzierung bestimmt wurden, sind mit einem Strich darüber gekennzeichnet. Die Nucleotidsequenz, die den Peptiden #816 und #1110 entspricht (Tabelle 4), ist unterstrichen. Die genomische Nucleotidsequenz wurde durch das M13-Didesoxyverfahren (Sanger et al., 1977) unter Verwendung des United States Biochemical Sequenase II-Kits bestimmt.
Materialien und Verfahren
Enzyme
Restriktionsenzyme wurden von Bethesda Research Laboratories und New England Biolabs (Beverly, A, USA) bezogen. T4-DNA-Ligase, T4-DNA-Polymerase, T4-Kinase und das Klenow-Fragment aus E. coli-DNA-Polymerase I wurden von BRL (Gaithersburg, MD, USA) bezogen. (Alkalische) Phosphatase aus Kälberdarm (CIP) wurde von Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN, USA) bezogen. Spheroplasting-Enzym, Novozym, wurde von Novo Biolabs (Bagsvaerd, Dänemark) gekauft. Alle Enzyme wurden nach den Empfehlungen des Herstellers eingesetzt. Die Enzym-Assay-Substrate Phytinsäure und para-Nitrophenylphosphat (PNPP) wurden von Sigma (St. Louis, MO, USA) bzw. BMB bezogen.
Bakterien- und Pilzstämme, Plasmide und Phage
A. niger var. awamori-Stamm ALKO243 (ATCC #38854) wurde für die Isolierung der Gene für Phytase und pH 2,5-saure Phosphatase verwendet.
Die E. coli-Stämme LE392 und P2392 und der Phage Lambda Dash II, der bei der Konstruktion der A. niger-Genbank eingesetzt wurde, wurden von Stratagene (La Jolla, CA, USA) erhalten. Der E. coli-Stamm JM109 wurde als Wirt bei Transformationen mit Konstruktionen, die von den Plasmiden pUC18 und pUC19 stammten, verwendet. Der Phage M13mp18 und M13mp19, die bei der Didesoxynucleotidsequenzierung eingesetzt wurden, wurden von Bethesda Research Laboratories (Gaithersburg, MD, USA) erhalten.
Der Phleomycin-resistente Vektor pLO-3, der das Phleomycin-Resistenz-Gen (ein Phleomycin-Bindungsprotein-Gen aus Streptoalloteichus hindustanus), gekoppelt an einen Hefecytochrom C1-Terminator, enthält, wurde von dem Plasmid pUT713 (CAYLA, Toulouse Cedex, Frankreich) abgeleitet. Es wird in Pilzen durch den β-Tubulin-Promotor von A. niger exprimiert.
Allgemeine Wachstumsmedien
E. coli JM109 wurde in L-Brühe wachsen gelassen. Transformanten wurden an L-Platten, ergänzt mit 1,5% Agar und enthaltend 125 μg/ml Ampicillin, selektiert. Vollständiges Medium (CM) für das Funguswaschstum in Flüssigkeit besteht aus: 50 ml 20 × Clutterbuck's Salze (120 g NaNO₃, 10,4 g KCl, 10,4 g MgSO₄ 7H₂O, 30,4 KH₂PO₄), 2,0 ml Vogel's Spurenelemente (0,3 M Zitronensäure, 0,2 M ZnSO₄, 25 mM Fe(NH₄)₂(SO₄)₂·6H₂O, 10 mM CuSO₄, 3 mM MnSO₄·H₂O, 8 mM Borsäure, 2 mM Na₂MoO₄·2H₂O), 5,0 g Trypton, 5,0 g Hefeextrakt, 10 g Glucose in einem Liter destilliertem Wasser. Die A. niger-Stämme ALKO243 und ALKO2268 wurden auf PD-Agar-Schrägflächen (2,4% Kartoffel-Dextrose-Brühe [Difco #0549]; 1,5% Agar [Difco #0140]) für sieben bis zwölf Tage bei 28°C wachsen gelassen.
Isolierung von genomischer DNA aus A. niger var. awamori-Stamm ALKO 243
Eine Schräge von ALKO243, gewachsen auf PDA für 5 Tage bei 35°C, wurde in 5 ml NP-40-H₂O (0,005% Vol./Vol.) Nonidet P40-Detergens) eingeweicht. Von den Schrägen wurden Sporen abgekratzt und in Glasröhrchen mit 3 mm-Glasperlen eingeweicht. 1 × 10⁸ Sporen wurden verwendet, um 500 ml CM in einem 2-Liter-Kolben zu beimpfen. Kulturen wurden bei 35°C unter Schütteln bei 200 UpM für 48 Stunden wachsen gelassen. Mycelia wurden an Mira-Stoff gesammelt, in flüssigem Stickstoff gefroren und über Nacht lyophilisiert. Die gesamten gefriergetrockneten Mycelia (etwa 2,0 g) wurden mit Meeressand in einem Mörser, der mit flüssigem Stickstoff gekühlt wurde, vermahlen. Vermahlene Mycelia wurden in eine 250 ml-Zentrifugenflasche überführt und in 30 ml 4% SDS-TE-Puffer (10 mM Tris-Base, 1 mM EDTA, 4% SDS) resuspendiert und bei Raumtemperatur für 1 Stunde lysieren gelassen. Zelldebris wurde durch Zentrifugation mit 4000 × g für 5 Minuten entfernt, und der Überstand wurde in ein 30 ml-Zentrifugenröhrchen entfernt. Die Proben wurden zweimal mit einem gleichen Volumen an Tris-gesättigtem Phenol : Chloroform (1 : 1) extrahiert, wobei die wässrige Phase jedes Mal in ein sauberes Röhrchen entfernt wurde. DNA wurde durch Zusatz von 10% (Vol./Vol.) 5 M NH₄OAc 2,5 Volumina EtOH präzipitiert und über Nacht bei –80°C inkubiert. Die Präparation wurde bis zum "Sirup-artigen Zustand" aufgetaut und für 30 Minuten bei 4°C und 12000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und das Pellet in 19 ml TE (10 mM Tris-Base, 1 mM EDTA) unter leichtem Pipettieren aufgelöst, dann wurden 19,0 g CsCl zugesetzt. Zwei 11,5 ml-Ultrazentrifugenröhrchen wurden mit DNA in TE + CsCl gelöst, 0,9 ml 10 mg/ml Ethidiumbromid wurden zugesetzt, und das Gemisch wurde mit 45.000 UpM (20°C) für 22 Stunden in einem Sorvall T865.1-Rotor zentrifugiert. Banden genomischer DNA wurden unter dem UV-Licht sichtbar, und durch eine subkutane Nadel, Nr. 18 m, gesammelt. Ethidium wurde durch Extraktion mit NaCl-gesättigtem Isopropanol entfernt. CsCl wurde durch Dialyse gegen TE entfernt. DNA wurde mit Ethanol in 0,3 M NaOAc präzipitiert.
Herstellung einer genomischen Genbank
Genomische DNA aus A. niger var. awamori-Stamm ALKO243 wurde mit Sau3A geschnitten, um Fragmente mit einer Länge von 10–23 kb herzustellen. Geschnittene DNA wurde an gekaufte, BamHI-geschnittene, dephosphorylierte Lambda-Dash II-Vektorarme ligiert. Die Ligation wurde unter Verwendung von Stratagene Gigapack Gold-Verpackungsextrakten in vitro verpackt. Verpackter Phage wurde verwendet, um E. coli-Stamm P2392 zu infizieren, um Plaques zu erhalten.
Screening der Datenbank mit Oligonucleotiden
Plaques wurden auf Schleicher & Schuell NC (BA85)-Nitrocellulosemembranen gehoben, wie es vom Hersteller empfohlen wird. Unter Verwendung der Aminosäuresequenzen aus Phytase und pH 2,5-saver Phosphatase (Beispiel 1, oben) wurden degenerierte Oligonucleotide für jedes Protein hergestellt. Das Oligonucleotid-Gemisch für jedes Protein war zu allen möglichen Codonkombinationen der ausgewählten Region des Peptids komplementär. Oligonucleotide wurden unter Verwendung des Pharmacia Gene Assembler Plus synthetisiert, und die Sequenzen sind in Tabelle 5 oben gezeigt.
Isolierung von Lambda-DNA
Einzelne isolierte hybridisierende Plaques wurden in 500 ml SM (pro Liter: 5,8 g NaCl, 2,0 g MgSO₄, 50 ml 1 M Tris-HCl, pH 7,5; 5 ml 2% (Gew./Vol.) Gelatinelösung) aufgenommen. 20 ml Chloroform wurden zugesetzt, und Phagenpartikel wurden über Nacht bei 4°C eluiert. 220 ml Zelllysat wurden mit 200 ml LE392-Zellen, die in Gegenwart von Mg und Maltose gewachsen waren, vermischt; es wurden 8 ml NZCYM-Medium (10,0 g NZ-Amin, 5,0 g NaCl, 5,0 g Hefeextrakt, 2,0 g MgSO₄·7H₂O und 1,0 g Casaminosäuren pro Liter; pH eingestellt auf pH 7,5) zugegeben, und die Kultur wurde unter Schütteln bei 37°C wachsen gelassen, bis die Zellen lysiert waren (etwa 6 Stunden). Dann wurden 100 ml Chloroform zugesetzt, und eine Inkubation wurde für 15 Minuten fortgesetzt, um eine vollständige Lyse sicherzustellen. Die Probe wurde dann 5 Minuten mit 8000 g zentrifugiert, und der Überstand wurde in ein frisches Röhrchen entfernt. RNAse A und DNAse I wurden zu je 1 mg/ml zugesetzt; die Proben wurden für 30 Minuten bei 37°C inkubiert, und ein gleiches Volumen an 20% (Gew./Vol.) PEG 8000, 2 M NaCl in SM wurden zugesetzt, um den Phagen zu präzipitieren. Proben wurden für wenigstens 1 Stunde auf Eis inkubiert. Der resultierende Phage wurde durch Zentrifugieren bei 10.000 × g für 20 Minuten bei 4°C pelletisiert; der Überstand wurde dekantiert, und das Phagenpellet wurde in 0,5 ml SM resuspendiert. DNA wurde durch Zusatz von SDS, EDTA und Proteinase K, gefolgt von einer Extraktion mit Phenol : Chloroform und einer Isopropanol-Präzipitation, weiter gereinigt. Die Größen der Lambda-DNA-Inserts wurden dann an 0,8% Agarosegelen untersucht, die DNA wurde an Nitrocellulose geblottet und mit den radioaktiv markierten Oligonucleotid-PHY-1- oder -PHY-31-Sonden hybridisiert. DNA-Fragmente, die an die Sonden hybridisieren und die mit den genomischen DNA-Fragmenten eine identische Größe hatten, wurden zur Subklonierung ausgewählt.
Isolierung von Gesamt-RNA aus A. niger
Drei 200 ml-Kulturen von A. niger var. awamori-ALKO243 wurden in RNA-Brühe als Medium (2% Maisstärke [Sigma], 1% Proteasepepton [Difco], 30 g/l Glucose, 5 g/l NH₄NO₃, 0,5 g/l MgSO₄·7H₂O, 0,5 g/l KCl, 0,183 g/l FeSO₄·7H₂O) für 48 Stunden bei 30°C, 220 UpM, wachsen gelassen. Die Mycelia wurden durch Whatman-Filterpapier #1 filtriert und mit 10 ml DEPC-behandeltem Wasser (0,1% Diethylpyrocarbonat in sterilem destilliertem Wasser) gespült, dann über Nacht bei –80°C lyophilisiert. 1,5 Gramm (insgesamt 3 g) getrockneter Mycelia wurden unter flüssigem Stickstoff zu feinem Pulver zerkleinert, dann in ein Zentrifugenröhrchen, das 10 ml "Breaking Buffer" (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA pH 8,5% SDS) und 10 ml Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (P/CIA: 50 : 48 : 2) enthielt, transferiert. Das Gemisch wurde für 30 Minuten bei Raumtemperatur auftauen gelassen und dann für 10 Minuten bei 10.000 UpM und 4°C zentrifugiert. Die wässrige Schicht wurde unter Verwendung einer Pipette mit weiter Bohrung in ein sauberes Zentrifugenröhrchen überführt und mit P/CIA reextrahiert, bis die Grenzfläche klar war. Es wurde ein gleiches Volumen an 6 M LiCl zu der letzten wässrigen Schicht gegeben, um die RNA zu präzipitieren; dann wurde über Nacht bei –80°C gekühlt. Das Gemisch wurde dann für 20 Minuten bei 10.000 × g und 4°C zentrifugiert, und das Pellet wurde in 2,4 ml GTC-Lösung (4 M Guanidinthiocyanat, 25 mM Natriumcitrat pH 7,5% N-Laurylsarcosin, 100 mM b-Mercaptoethanol) resuspendiert. Es wurde ein gleiches Volumen Isopropanol zugegeben, das Präzipitat wurde für 40 Minuten auf Trockeneis gekühlt und dann bei 4°C für 30 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde in 80% EtOH gespült, erneut zentrifugiert, im Vakuum getrocknet und schließlich in 1 ml DEPC-H₂O resuspendiert. Die Konzentration an RNA wurde spektralphotometrisch bei 260 nm bestimmt.
Isolierung von mRNA
Polyadenylierte Messenger-RNA (polyA-mRNA) wurde aus Gesamt-RNA affinitätsgereinigt, wobei Oligo(dT)-Cellulose-Säulen nach den Anweisungen der Hersteller (Pharmacia Fine Chemicals, Piscatawy, N.J.) verwendet wurden. Kurz ausgedrückt, 1,25 mg Gesamt-RNA wurden auf zwei getrennte Säulen, die vorher einer Zentrifugation und Äquilibrierung in Highsalt-Puffer (Pharmacia) unterworfen worden waren, aufgetragen. Nach drei Waschgängen in Low-salt-Puffer (Pharmacia) wurde die mRNA aus der Säule bei 65°C in vorerwärmtem Elutionspuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, enthaltend 1 mM EDTA) eluiert und durch Zusatz von 0,1 Volumen 10 mg/ml Glykogen und 2,5 Volumina Ethanol präzipitiert. Das Gemisch wurde für 2 Stunden bei –80°C gekühlt, dann für 30 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Die gewonnene mRNA wurde zu einer Endkonzentration von 1,3 mg/l in Elutionspuffer verdünnt.
PCR-Isolierung von pH 2,5-saurer Phosphatase-cDNA
Zuerst wurde eine Synthese eines ersten Strangs mit dem BMB-cDNA-Kit nach den Empfehlungen des Herstellers mit 1,0 mg mRNA und mit Oligonucleotid-Primer AP273, der komplementär zu der 3'-pH 2,5-Phosphatase-Nucleotidsequenz synthetisiert worden war: nämlich AP273 5'-CTACCCCTCTGCATCTAG-3'. Es wurden die Oligonucleotid-PCR-Primer UPPHOS und DOWNPHOS mit flankierenden EcoRI-Restriktionsstellen synthetisiert: nämlich
UPPHOS 5'-GAATTCCGAGTCCGAGGTCATGGGCGCG-3'; und
DOWNPHOS 5'-GAATTCCCGGGACCTACCCCTCTGCAT-3',
wie es oben beschrieben ist.
Subklonierung und Sequenzierung von Phytase- und pH 2,5-saure Phosphatase-Klonen
Hybridisierende Restriktionsfragmente von genomischen Lambda-Klonen wurden unter Verwendung des "Glassmilk Purification Kit", im Handel erhältlich von GeneClean (Bio 101, La Jolla, CA) gelgereinigt. Die Restriktionsfragmente wurden in M13mp-18 und M13mp-19 subkloniert, mit den geeigneten Enzymen geschnitten. Die Nucleotidsequenz von Klonen, die mit Oligonucleotidsonden für Phytase und pH 2,5-saurer Phosphatase positiv reagierten, wurde durch das M13-Didesoxynucleotid-Sequenzierungsverfahren (Sanger et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74: 5463–5467, 1977) bestimmt, wobei der United States Biochemical Sequenase II-Kit verwendet wurde. cDNA wurde in Regionen vermuteter Introns durch alkalische Denaturierung-Doppelstrangsequenzierung sequenziert. Das Phytase-Gen war vollständig in einem 2,6 kb SphI-Fragment enthalten, das in pUC-18 subkloniert wurde, wodurch pFF-1 erhalten wurde. Das vollständige pH 2,5-saure Phosphatase-Gen wurde als 2,1 bp SphI-Fragment isoliert, das in pUC-18 subkloniert wurde, wodurch pAP-1 erhalten wurde.
pSELFX ist ein Plasmid, das eine Phytase-Nucleotidsequenz enthält, in der eine XbaI-Stelle in die Gensequenz eingeführt wurde, indem die Nucleotide in Position -26 und -24 relativ zum ATG-Startkodon modifiziert wurden. Die Nucleotidänderungen wurden durch ortsspezifische Mutagenese des 2,6 kb SphI-Fragments, das das Phytase-Gen enthält, unter Verwendung des Promega Altered Sites Mutagenesis-Kit eingeführt. Das für die gerichtete Mutagenese verwendete Oligonucleotid ist unten dargestellt: nämlich
Oligo PHY-40: 5'-AGAAGAAATTTCTAGAACAGCAGCGATTGG-3'
(XbaI)
pAP-1Xba ist ein Plasmid, das eine pH 2,5-saure Phosphatase-Nucleotidsequenz enthält, in die eine XbaI-Stelle in die Gensequenz eingeführt worden war, indem die Nucleotide an den Positionen -24 und -27 relativ zum ATG-Startkodon modifiziert wurden. Die Nucleotidänderungen wurden durch PCR-Mutagenese eingeführt. Die Primer zur PCR-Mutagenese sind unten angegeben: nämlich,
Oligo #271 5'-CGAGAGCACCTTCTCTAGATTTTGTCAAATGTACC-3'
(XbaI)
und
Oligo #272 5'-ACCCTCACCGAACTTGCGGGCCG-3'.
pAP-1-DNA wurde als Matrize zur PCR-Amplifikation eingesetzt. Das resultierende amplifizierte Fragment wurde mit XbaI und NruI gespalten, und das Fragment wurde dann an XbaI/NruI-geschnittenes pAP-1 ligiert, wodurch Plasmid pAP-1Xba erhalten wurde. Das Plasmid wurde sequenziert, um sicherzustellen, dass keine Mutationen in die Region eingeführt wurden, welche durch PCR amplifiziert worden war. pAP-2 wurde durch Ligieren des Bam-HI/HindIII-Fragments, das mit Klenow-Reagens behandelt worden war, aus pAP-1XBA in SmaI-geschnittenes pUC-18 erzeugt. Transformanten, die korrekt orientiertes pAP-2 enthielten, wurden durch Analyse der Größe der Restriktionsendonuclease-Fragmente identifiziert.
Das gesamte Struktur-Gen für pH 2,5-saure Phosphatase wurde als 2,0 kb XbaI-Fragment aus pAP-2 zur Konstruktion von pH 2,5-saure Phosphatase-Transformationsvektoren, die das betreffende Enzym überexprimieren (Beispiel 4, unten), entfernt. Das vollständige pH 2,5-saure Phosphatase-Gen wurde auch als 5,0 kb PstI/SalI-Fragment isoliert, das in pUC-18 subkloniert wurde, wodurch pAP-3 erhalten wurde. pAP-3 wurde bei der Konstruktion von pH 2,5-saurer Phosphatase-Transformationsvektoren zum Überexprimieren des entsprechenden Enzyms (Beispiel 4, unten) verwendet.
Northern-Blotting-Verfahren
Zehn und zwanzig mg-Mengen an Gesamt-RNA (wie oben isoliert) wurden auf Vertiefungen eines 1,5% Agarose-Formaldehyd-Gels aufgetragen und durch Elektrophorese getrennt. RNA-Molekulargewichtsmarker (0,24 kb-9,5 kb "RNA Ladder", Bethesda Research Labs) wurden zum Größenvergleich auf das Gel aufgebracht. Das Gel wurde auf Nitrocellulose (Schleicher und Schuell; Keene, NH) geblottet, für eine Stunde bei 80°C in einem Vakuumofen getrocknet, in 50% Formamid, 5 × SSC, 0,1% SDS, 5 × Denhardt's und 100 mg/ml Kälberthymus-DNA bei 37°C für 24 Stunden vorhybridisiert, dann in derselben Lösung mit radioaktiv markierter Sonde bei 42°C für 24 Stunden hybridisiert. Der Filter wurde zweimal in 2 × SSC/0,1% SDS bei Raumtemperatur über fünfzehn Minuten gewaschen, dann einmal in 0,1 × SSC/0,1% SDS gewaschen und unter Verwendung eines Kodak S-Omat AR-Films mit intensivierenden Filtern autoradiographiert.
BEISPIEL 3
Homologie mit anderen Phosphatasen
Es wurde ein Vergleich zwischen der Aminosäuresequenz der pH 2,5-sauren Phosphatase und Phytase und anderen veröffentlichten saure Phosphatase-Sequenzen angestellt. Unter Verwendung des PC/GENE-Matrixprogramms PCOMPARE (auf der Basis des Verfahrens von Neddleman und Wunsch, 1970) wurde die Homologie (Anordnungspunktzahl von 17.705) bestimmt. Es wurde eine beachtliche Homologie zwischen der pH 2,5-sauren Phosphatase und anderen sauren Phosphatase-Enzymen "PHO-3" (Bajwa et al., 1984) und "PHO-5" (Arima et al., 1983), beide früher von anderen aus Saccharomyces cerevisiae isoliert, gefunden. Der Bereich der höchsten Homologie, RHGXRXP (aa-Positionen 81–87), wurde verwendet, um die EMBL CDPROT17-Protein-Datenbank-Release 1991 durchzusuchen. Die RHGXRXP-Sequenz wurde in mehreren anderen sauren Phosphatasen gefunden (wie in Tabelle 6 unten gezeigt ist).
TABELLE 6 Homologie von Phytase und pH 2,5-saurer Phosphatase mit anderen sauren Phosphatasen^a
Die Region RHGXRXP wird zwischen so unterschiedlichen Organismen, wie E. coli und Menschen konserviert. Diese Konservierung legt eine funktionelle Signifikanz nahe und kann somit eine aktive Stellenregion dieser Phosphatasen widerspiegeln.
BEISPIEL 4
Überexpression von rekombinanter Phytase und pH 2 5-saurer Phosphatase in Aspergillus niger
[Allgemeine Materialien und Verfahren werden in dem Abschnitt mit dem Titel "Materialien und Verfahren", der diesem Beispiel folgt, beschrieben].
Konstruktion von Expressionsvektoren für Phytase
Eine Reihe von Vektoren wurde zur Wiedereinführung von Phytase und pH 2,5-saurer Phosphatase sowohl unter Verwendung nativer als auch alternativer fungaler Promotoren entwickelt. Ein Satz Vektoren, der das Phytase-Gen trägt, pFF1–pFF4 (10, oben) enthielt keinen selektierbaren fungalen Marker; sie wurden durch Co-Transformation mit dem Plasmid pL03 eingeführt (siehe Materialien und Verfahren, unten).
Rekombinante Stämme, die aus den Vektoren pFF1-2 resultierten, enthielten fremde DNA-Sequenzen, die aus dem selektierbaren E. coli-Marker stammten. Daher wurde ein zweiter Satz an Vektoren, pFF6-pFF11 genannt, zur Entfernung dieser Sequenzen entwickelt. Die zuletzt genannten Vektoren enthielten einen selektierbaren Pilzmarker und Restriktionsstellen, die es ermöglichten, dass lineare Fragmente isoliert wurden, die frei von E. coli-Sequenzen waren (12).
12. Lineare Transformationsvektoren von Phytase. (A) pFF-6A: Phytase unter der Kontrolle ihres nativen Promotors. Das 2,6 kb SphI-Fragment aus pFF-1 wurde in die SphI-Stelle von pL03 kloniert, wodurch pFF-6 erhalten wurde, das als lineares 4,9 kb HindIII-Fragment isoliert wurde. (B) pFF-8: Phytase unter der Kontrolle des GAPDH-Promotors. Die Phleomycin-Resistenzkassette aus pL03 wurde als HindIII (gefülltes)/PstI-Fragment isoliert und in BglII (gefüllt)/Pst-geschnittenes pPRE-81 subkloniert, wodurch pPRE-82 erhalten wurde. Das pSELFX Xbal-Fragment, das Phyta se enthielt, wurde zu pPRE-82, partiell geschnitten mit XbaI, angefügt, wodurch pFF-8 erhalten wurde, das als 6,7 kb PstI-Fragment isoliert wurde. (C) pFF-9: Phytase unter Kontrolle des GA-Promotors. Die Phleomycin-Resistenzkassette aus pL03 wurde als KpnI (gefüllt)/HindIII-Fragment isoliert und an pFF-4 ligiert, partiell geschnitten mit KpnI, geglättet, dann mit HindIII geschnitten. pFF-9 wurde als ein 7,3 HindIII/KpnIlineares Fragment isoliert. (D)pFF-11: Phytase unter Kontrolle des GA-Promotors und Signalsequenz. Oligo #260 und #261 (siehe Materialien und Verfahren, unten) wurden an XbaI/XhoI-verdautes pFF-1 annealed und ligiert, der GA-Promotor wurde als KpnI/XbaI-Fragment angefügt, und die Phleomycin-Resistenzmarker (Phleo^r)-Kassette wurde als HindIII-Fragment angefügt, wobei pFF-11 erhalten wurde. Lineare DNA wurde als ein 7,35 KpnI-Fragment isoliert.
Konstruktion von Expressionsvektoren: pH 2,5-saure Phosphatase mit und ohne Phytase
Transformationsvektoren für pH 2,5-saure Phosphatase bestanden aus linearen Vektoren, pPH01–pPH04A genannt, die zur Einführung des pH 2,5-sauren Phosphatase-Gens konstruiert wurden (13). Es wurden auch zwei Vektoren, pFIN-1A und pFIN-1B, die die beiden Phytase- und pH 2,5-saure Phosphatase-Gene, exprimiert aus dem Glucoamylase-Promotor in einem einzelnen Plasmid, enthielten (14).
13. Vektoren, aus denen lineare Fragmente für die Wiedereinführung von pH 2,5-saurer Phosphatase isoliert werden können. (A) pPHO-1: pH 2,5-saure Phosphatase unter Kontrolle ihres nativen Promotors. Die phleo^r-Kassette wurde als HindIII-Fragment isoliert, an den Enden geglättet und an pAP-3 (das pH 2,5-saure Phosphatase-Gen in einem 5,0 kb PstI/SalI-Fragment in pUC-18 (5)) ligiert, mit EcoRI geschnitten und auch an den Enden geglättet. Lineare DNA wurde als 6,3 kb PstI-Fragment isoliert. (B) pPHO-2: pH 2,5-saure Phosphatase unter Kontrolle des b-Tubulin-Promotors. Das pH 2,5-saure Phosphatase-Gen, das in einem 2,0 kb XbaI-Fragment aus pAP-1Xba enthalten war (Materialien und Verfahren, unten), wurde in pTL-113 subkloniert, das dann mit SphI partiell geschnitten wurde, aufgefüllt wurde und dann an ein Fragment ligiert wurde, das die Phleomycin-Resistenzmarkerkassette enthielt, wodurch pPHO-2 erhalten wurde. (C) pPHO-3: pH 2,5-saure Phosphatase unter Kontrolle des GAPDH-Promotors. pPHO-2 wurde partiell mit XbaI verdaut, wodurch ein 4,3 kb XbaI-Fragment erhalten wurde, das pH 2,5-saure Phosphatase und die phleo^r-Kassette enthielt, das dann in die XbaI-Stelle von pPRE-81 ligiert wurde. (D) pPHO-4A: pH 2,5-saure Phosphatase unter Kontrolle des GA-Promotors. Das 2,0 kb Xba-Fragment aus pAP-1Xba wurde in pGA subkloniert, und ein 5,5 kb KpnI-Fragment, das den GA-Promotor und pH 2,5-saure Phosphatase enthielt, wurde isoliert und aufgefüllt und dann in pL03 ligiert.
14. Ein Dual-Enzym-Transformationsvektor wurde zum Überexprimieren von sowohl Phytase als auch pH 2,5-saurer Phosphatase durch ein einziges Plasmid konstruiert. (A) pFIN-1A und (B) pFIN-1B: Kombinationsplasmide mit Phytase und pH 2,5-saurer Phosphatase unter Kontrolle getrennter Kopien des GA-Promotors. Ein 8,1 kb HindIII-Fragment wurde aus pPHO-4A isoliert und in mit HindIII verdautes pFF-4 ligiert.
Transformationsvektorkonstrukte: Allgemeine Betrachtungen
Wie aus den in der obigen Diskussion der 12–15 gemachten Informationen hervorgeht, wurden mehrere unterschiedliche fungale Promotor-Konstruktionen beurteilt: nämlich der β-Tubulin-Promotor, der Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase-Promotor (GAPDH) und der Glucoamylase-Promotor (GA). Die zwei zuletzt genannten Pilz-Promotoren wurden aus A. niger ATCC1015 (Tailor, P. et al., 1990) isoliert. Diese entsprechenden Promotoren wurden untersucht, um ihre Fähigkeit zu bestimmen, die Expression von Phytase und pH 2,5-saurer Phosphatase zu steuern.
Um eine Fusion von alternativen Promotoren in die Konstrukte zu erleichtern, wurde eine XbaI-Restriktionsstelle durch ortsspezifische Mutagenese an der -26-Position des Phytase-Gens eingeführt. In ähnlicher Weise wurde eine XbaI-Stelle an Position -28 des pH 2,5-saurer Phosphatase-Gens durch PCR-Mutagenese (siehe Materialien und Verfahren, unten) entwickelt. Die angelegten XbaI-Stellen wurden anschließend für Fusionen mit alternativen fungalen Promotoren, die vorher so konstruiert worden waren, dass sie solche XbaI-Stellen in den 5'-Regulationsregionen des Gens enthielten, verwendet.
Die Resultate, die in Zellen erhalten wurden, welche mit Phytase-Vektorkonstrukten transformiert waren, sind unten als Erste aufgeführt, gefolgt von den Resultaten, die mit pH 2,5-saurer Phosphatase erhalten wurden.
Transformation der A. niger-Stämme ALKO243 und ALKO2268
A. niger var. awamori-Stamm ALKO243 und A. niger-Stamm ALKO2268, ein Mutantenstamm, der eine höhere Phytaseproduktion aufweist und durch UV-Mutagenese von ALKO243 abgeleitet ist, wurden als Wirte für gentechnische Phytase und pH 2,5-saure Phosphatase verwendet. Die A. niger-Stämme ALKO243 und ALKO2268 wurden durch eine Modifikation des Verfahrens von Tilburn et al. (1983) unter Verwendung von Phleomycin-Resistenz als Arzneimittel selektierbarer genetischer Marker transformiert. Da die klonierten Phytase- und pH 2,5-sauren Phosphatase-Gene auf Plasmiden ohne selektierbaren Marker gehalten wurden, wurden Spheroplasten mit einem Phleomycin-resistenten Vektor pLO-3 cotransformiert, welcher das Phleomycin-bindende Protein-Gen aus Streptoalloteichus hindustanus, gekoppelt an einen Hefe-Cytochrom C1-Terminator, enthält. pLO-3 wurde von dem Plasmid pUT713 [CAYLA, Toulouse Cedex, Frankreich] abgeleitet und wird in Fungus durch den β-Tubulin-Promotor von A. niger exprimiert. Transformante wurden mit einer Deckschicht im gleichen Volumen, die 50 μg/ml Phleomycin für den Stamm ALKO243 und 195–200 μg/ml für den Stamm ALKO2268 enthielt, selektiert (die Stämme ALKO243 und ALKO2268 waren beide für eine Spheroplasten-Lyse empfindlich und erforderten unterschiedliche osmotische Pufferbedingungen; siehe Materialien und Verfahren, unten). Auf Selektionsplatten wurden pro μg DNA dreißig bis fünfundvierzig Sporen-bildende Kolonien erhalten. Alle Phleomycinresistenten Kolonien hatten den Phleomycin-Resistenzmarker integriert (Southern-Analyse, Daten nicht gezeigt).
Screening nach Transformanten für eine Überexpression von Phytase
Transformante, die höhere Phytaseaktivität als der Elternstamm A. niger-Stamm ALKO243 produzieren, wurden in einem Phytase-Plattenscreening-Assay identifiziert, der die Akkumulation von anorganischem Phosphat durch die Reduktion eines Phosphomolybdat-Komplexes kolorimetrisch misst (Materialien und Verfahren, unten). Transformanten mit hoher Aktivität im Platten-Assay wurden anschließend auf Phytaseproduktion getestet, indem die Enzymaktivität analysiert wurde, welche in die Brühe einer Fermentationskultur freigesetzt wurde (wie unten beschrieben).
15 zeigt einen Platten-Assay zur Detektion erhöhter Phytaseaktivität. Conidien von A. niger-Phytase-Transformanten GAD-10 bis GAD-120 wurden auf Platten-Assaymedien getüpfelt, für zwei Tage bei 30°C inkubiert und mit Reagens C zur Farbdetektion überlagert (Materialien und Verfahren, unten). Positive GAD 130 (a4), GAD 112 (e3) und GAD 118, wenn diese in Schüttelflaschenkulturen gewachsen waren, zeigten Titer von 108.000 PU/ml, 35.600 PU/ml und 36.700 PU/ml (d. h., Zunahmen von bis zu etwa 1260fach höher als ALKO243). Die Phytaseaktivität für nicht-transformierten ALKO2268 (b5) war 4.000 PU/ml.
Analyse von Phytase-überpoduzierenden Transformanten
Die Menge an Phytase, die durch Transformanten produziert wurde, wurde analysiert, indem die Zellen in Schüttelflaschenkulturen wachsen gelassen wurden und die Menge an Enzym in der Brühe titriert wurde. Das Ganze wurde wie folgt durchgeführt: Kurz ausgedrückt, Kulturen wurden in Schüttelflaschen unter optimalen Bedingungen (Materialien und Verfahren, unten) entwickelt und für 5 Tage inkubiert; zu diesem Zeitpunkt wurden die Zellen durch Zentrifugation entfernt, und die überstehende Brühe aus der Kultur wurde titriert, um die Menge an Phytaseaktivität zu bestimmen. (Sowohl der Platten-Assay (oben) als auch der Brühetiter-Assay maßen die Menge an anorganischem Phosphat, das durch enzymatische Hydrolyse von Natriumphytatsubstrat freigesetzt wurde, durch kolorimetrische Quantifizierung der Reduktion eines Phosphomolybdat-Komplexes).
Unter Verwendung des nativen Phytase-Promotors (aus Plasmid pFF-1, siehe Beispiel 2, Materialien und Verfahren, oben) zeigten von den 58 erzeugten Transformanten vier eine erhöhte Phytaseproduktion, die 6,5–7,0-mal höher war als die, die von dem nichttransformierten, überproduzierenden Stamm ALKO2268 ("nicht-transformiert", Tabelle 7, unten) oder von den ALKO2268-Kontrollzellen, die mit einem Kontroll-Plasmid pLO-3, das keine Phytasesequenzen enthielt, transformiert worden waren, produziert wurde.
TABELLE 7 Überexpression von Phytase in Transformanten des Produktionsstamms ALKO2268^a
Weitere Studien involvierten eine Verwendung von heterologen Promotoren, die die Phytaseexpression steuern. 1467 Phytase-Transformanten wurden unter Verwendung des Platten-Assays untersucht (157 waren vom Stamm ALKO243 abgeleitet, und 1310 vom Stamm ALKO2268). Von diesen wurden 302 im Platten-Assay als potentielle Überproduzenten von Phytase identifiziert. Von diesen Phytase-überproduzierenden Transformanten hatten 25 (d. h., 1,7% der 1467 Beurteilten) eine Enzymaktivität, die über 700 mal größer war als die durch ALKO243 produzierte, ausgedrückt als PU/ml. (Die Resultate, die mit 18 der 25 Transformanten erhalten worden waren, sind in Tabelle 8 angegeben). Die Transformante, die die höchste Phytaseproduktion zeigte (d. h., GAI-6; 181.000 PU; etwa 2100-fach mehr PU/ml als ALKO243), war das Resultat einer Transformation mit dem pFF-9-Konstrukt, das einen Glucoamylase(GA)-Pilz-Promotor enthält. Die zuletzt genannte Transformante zeigte im Vergleich zu ALKO2268 (ein Überproduzent) oder ALKO243 (ein Wild-Typ-Stamm) signifikant erhöhte Level der Phytaseproduktion (siehe Tabelle 8, unten).
TABELLE 8 A. niger-Phytase-Transformanten, die das Phytaseenzym über 700 mal stärker als ALKO243 in Schüttelflaschenkulturen* produzierten
Molekulare Charakterisierung: Phytase-Transformanten
Southern- und Northern-Analysen wurden mit DNA und mRNA (bzw. mRNA), die aus den Phytase-Transformanten GAE 32, GAK 4-47, GAL 65, GAM 225 und GAO 248 (Tabelle 8), welche Phytase in Schüttelflaschen-Fermentationskulturen überproduzierten, isoliert worden waren, durchgeführt. Genomische DNA wurde aus den jeweiligen Transformantenstämmen isoliert, mit Restriktionsenzymen verdaut und mit einem radioaktiv markierten, klonierten Phytase-DNA-Restriktionsfragment sondiert (d. h., aus pFF1, oben, isoliert), um die Genkopienzahl und das Integrationsverfahren in die Transformanten zu bestimmen. Eine Erhöhung bei der Genkopienzahl wurde bestimmt, indem die Dichte des Blots bei 1,3 kb (d. h., die Transformationsvektorkonstrukt-DNA) mit der Dichte der endogenen chromosomalen Kopie des Phytase-Gens (d. h., bei 2,4 kb) und mit der Kontrolle genomischer ALKO2268-DNA verglichen wurde. Eine Quantifizierung wurde durch Scanning-Densitometrie erreicht ( 16A). Es wurden drei bis fünf zusätzliche Phytase-Vektor-Genkopien, die in mehreren unterschiedlichen Integrationsmustern (Daten nicht gezeigt) angeordnet waren, bei den Transformanten GAE 32, GAK 4-47, GAL-65, GAM-225 und GAO-248 detektiert.
Die Expressionslevel für Phytase-mRNA durch Northern-Blotting zeigten, dass Messagelevel an Transformanten gegenüber nicht-transformierten Kontrollen konsistent sieben- bis dreizehnfach erhöht waren (16B). Allerdings können tatsächliche Level höher sein, da es sich als schwierig erwies, mRNA aus Zellen zu isolieren, die in Produktionsmedium gewachsen waren, und es war daher notwendig, diese Vergleiche unter suboptimalen Bedingungen für Zellwachstum und Phytaseexpression durchzuführen.
16A. Southern-Blot-Analyse der genomischen Phytase-Kopienzahl bei überproduzierenden Phytase-Transformanten: genomische DNA wurde mit BamHI verdaut, geblottet, einer Elektrophorese unterworfen, und der Filter wurde mit BamHI-Fragmenten der 5'-Region von pFF-1 sondiert. Die Genkopienzahl wurde bestimmt, indem die Blotdichte der Genkopien (mit 1,3 kb) in Transformanten mit der Blotdichte des endogenen Phytase-Gens (mit 2,4 kb) durch Scanning-Densitrometrie verglichen wurde. Bahnen 1, 4, 7: Nicht-transformierte Kontrolle ALKO2268. Bahnen 2, 5, 8, 9, 10: Überproduzierende Phytase-Transformanten GAE-32, GAK-47, GAL-65, GAM-225 bzw. GAO-248.
16B. Northern-Blot-Analyse der Messenger-RNA-Level in Phytase-überproduzierenden Transformanten: 20 μg jeder Gesamt-RNA-Probe wurden in einem Formaldehyd-Gel einer Elektrophorese unterzogen und auf Nitrocellulose transferiert. Jede Transformante wurde mit den Restriktionsfragmenten des Phytase-Gens (d. h., BamHI-Fragmenten aus pFF-1) sondiert. Erhöhte Phytase-Message-Level wurden durch Scanning-Densitometrie der mRNA gemessen. RNA aus ALKO2268 (Bahn 1) wurde als Grundlinienkontrolle verwendet. Bahnen 2–6: GAE-32, GAK-47, GAL-65, GAM-225 bzw. GAO-248.
Die in Tabelle 9 unten angegebenen Resultate fassen die quantitativen Resultate zusammen, die durch Scanning der Dichte der Southern- und Northern-Blots in 16A und 16B erhalten wurden.
TABELLE 9 Vergleich der Phytase-Genkopienzahl, mRNA-Level und der Enzymproduktion durch Phytase-Überproduzenten
Analyse von überproduzierenden pH 2,5-saure Phosphatase-Transformanten
Es war nicht möglich, einen für pH 2,5-saure-Phosphatase spezifischen Platten-Screening-Assay zu entwickeln; daher wurden Transformanten analysiert, indem die Enzymproduktion in Kulturbrühe nach 5 Tagen Fermentation in Schüttelflaschen beurteilt wurde (wie beschrieben in Tabelle 7, oben, und in Materialien und Verfahren, unten). Die Bedingungen zur Messung der Produktion von pH 2,5-saurer Phosphatase im Fermentations-Schüttelflaschen-Assay sind unten beschrieben (Tabelle 10), wobei para-Nitrophenylphosphat als Substrat (auch unten beschrieben in Materialien und Verfahren), verwendet wurde. Wie in Tabelle 7, oben, wurden die Enzymlevel im Kulturbrüheüberstand titriert, und die Enzymlevel wurden mit den Level verglichen, die über denselben 5-tägigen Inkubationszeitraum durch eine Kontrollkultur des ALKO243-Stamms von A. niger produziert wurden.
Von den 55 Transformanten mit dem Plasmid pAP-3, das den nativen Promotor enthielt, welcher eine Expression von pH 2,5-saurer Phosphatase steuert (Beispiel 2, Materialien und Verfahren, oben) zeigten vier Transformanten Anstiege bei der Produktion von pH 2,5-saver Phosphatase, die 25- bis 57-fach höher waren (Tabelle 10) als die Level, die durch den Elternstamm ALKO243 produziert wurden. Die am stärksten produzierende Transformante (GAQ56) zeigte einen nahezu 58-fachen Anstieg gegenüber nicht-transformiertem ALKO2268 (Tabelle 10) und einen bis zu 126-fachen Anstieg, was in Tabelle 11 unten gezeigt ist.
TABELLE 10 Überexpression von pH 2,5-saurer Phosphatase in Transformanten des Produktionsstamms ALKO 2268^a
Weitere Studien beurteilten heterologe Promotoren, die eine pH 2,5-saure Phosphatase-Expression steuern. 1181 Transformanten waren Überproduzenten für pH 2,5-saure Phosphatase (410 resultierten aus Stamm ALKO243 und 771 gehörten zum Stamm ALKO2268). 32 Transformanten (2,7%) wurden als solche identifiziert, die pH 2,5-saure Phosphatase mit über 30 HFU/ml produzierten. Die am stärksten produzierende Transformante (d. h., GAO-69) wies einen Mittelwert von 126 HFU/ml auf. Diese Expression resultierte aus einer Transformation mit einem Plasmidkonstrukt, das einen fungalen Glucoamylase (GA)-Promotor hatte (Tabelle 11).
TABELLE 11 A. niger-pH 2,5-saure Phosphatase-Transformanten, die Enzym bei Leveln, die über 40 mal höher waren als die von ALKO243, in Schüttelflaschen-Fermentationskulturen überproduzierten^a
Molekulare Charakterisierung von pH 2,5-saure Phosphatase-Transformanten
Kopienzahl und Message-Level wurden unter Verwendung von Southern- und Northern-Blot-Analyse und Scanning-Densitometrie (wie oben beschrieben) für fünf der stärksten pH 2,5-sauren Phosphatase-Überproduzenten, die in Schüttelflaschen-Fermentationskulturen identifiziert worden waren (Tabelle 11, oben), bestimmt. DNA aus den pH 2,5-saure Phosphatase-Transformanten GAT-143, GAW-54, GAW-89, GAW-121 und GAW-130 wurden mit Restriktionsenzymen verdaut und an eine radioaktiv markierte pH 2,5-saure Phosphatasespezifische Sonde hybridisiert. Insgesamt hatten die pH 2,5-sauren Phosphatase-Transformanten höhere Genkopienzahlen (Tabelle 12, unten) als sie oben bei den Phytase-Transformanten (Tabelle 9, oben) beobachtet wurden. Dagegen waren die Message-Level für pH 2,5-saure Phosphatase-Transformanten (Tabelle 12) nicht so hoch, wie sie bei Phytase-Transformanten beobachtet wurden (Tabelle 9). Wie bei Phytase-Transformanten, oben, wurden allerdings die pH 2,5-sauren Phosphatase-Message-Level nicht unter optimalen Fermentationsbedingungen gemessen, und zwar wegen der Schwierigkeit, die bei der Isolierung von RNA aus Zellen unter Produktionskulturbedingungen auftreten. Daher kann die Expression unter Produktionsbedingungen höher sein als die hier gemessene.
TABELLE 12 Vergleich der pH 2,5-sauren Phosphatase-Genkopienzahl mit mRNA-Level und Enzymproduktion durch rekombinante transformierte Stämme^a
Materialien und Verfahren
Plasmidkonstruktionen wurden so entwickelt, dass die Vektorgerüstsequenzen leicht vor Transformation der entsprechenden Gene in Fungi entfernt werden konnten. Lineare DNA wurde aus Agarose isoliert und durch GeneClean gereinigt, um mögliche kontaminierende Spezifitäten zu entfernen. Die Konstrukte A-D und Konstrukte E-H, die die Phytase- bzw. pH 2,5- Phosphatase-Gene unter unterschiedlicher regulatorischer Kontrolle exprimieren, wurden wie unten beschrieben hergestellt.
Phytase- und pH 2,5-saure Phosphatase-Expressionsplasmide
Konstrukt A: pFF-6-Phytase unter Kontrolle ihres nativen Promotors
Das 2,6 kb SphI-Fragment, das das Phytase-Gen enthielt, wurde in die SphI-Stelle von pLO-3 kloniert. Es wurden zwei Orientierungen erzeugt, als pFF-6A und pFF-6B bezeichnet. Lineare DNA wurde aus jedem Vektor als ein 4,9 kb HindIII-Fragment isoliert.
Konstrukt B: pFF-8-Phytase unter Kontrolle des A. niger-GAPDH-Promotors
Der fungale Expressionsvektor pPRE8-1 wurde mit BglII geschnitten und mit DNA-Polymerase I-Klenow-Fragment geglättet; das Plasmid wurde dann zur Vervollständigung mit PstI geschnitten. Die Phleomycin-Resistenz (Phleo^r)-Marker-Expressionskassette wurde aus pLO-3 (als HindIII (gefüllt)/PstI-Fragment) entfernt und an das geschnittene pPRE8-1 ligiert, um pPRE8-2 zu erhalten. Transformanten wurden durch Restriktionsanalyse identifiziert. Das 2,0 kb XbaI-Fragment, das das Phytase-Gen enthielt (Beispiel 2, Materialien und Verfahren), wurde in die einmal vorkommende XbaI-Stelle stromabwärts von GAPDH-Promotor in Plasmid pPRE8-2 ligiert. Korrekt orientierte Transformanten, die pFF-8 enthalten, wurden durch Restriktionsanalyse identifiziert. Lineare DNA wurde aus pFF-8 als ein 6,7 kb PstI-Fragment isoliert.
Konstrukt C: pFF-9-Phytase unter Kontrolle des A. niger-GA-Promotors
Das 2,0 kb XbaI-Fragment, das das Phytase-Gen enthält (Beispiel 2, Materialien und Verfahren, oben), wurde an die einmal vorkommende XbaI-Stelle des fungalen Expressionsvektors pGA ligiert, wodurch pFF-4 erhalten wurde. Transformanten, die das korrekt orientierte Plasmid enthielten, wurden durch Restriktionsanalyse identifiziert. pFF-4 wurde partiell mit KpnI geschnitten, um einzeln geschnittenes lineares Plasmid zu produzieren. Die Enden wurde mit T4-DNA-Polymerase geglättet. Das Plasmid wurde dann zur Vervollständigung mit HindIII geschnitten. pLO-3 wurde zuerst mit KpnI geschnitten und mit T4-DNA-Polymerase geglättet und dann mit HindIII geschnitten. Das 2,1 kb-Fragment, das die phleo^r-Expressionskassette enthielt, wurde mit GeneClean von Agarose gereinigt und an geschnittenes pFF-4 ligiert. Transformanten, die pFF-9 enthielten, wurden durch Restriktionsanalyse identifiziert. Lineare DNA wurde als ein 7,3 kb HindIII/KpnI-Fragment aus pFF-9 isoliert.
Konstrukt D: pFF-11-Phytase unter Kontrolle des A. niger-GA-Promotors mit Sekretion über die GA-Signalsequenz
Oligonucleotide 260 und 261 wurden synthetisiert; sie codierten für eine XbaI-Stelle stromaufwärts von der Translations-Initiationsregion und der Signalsequenz für Glucoamylase, welche wiederum stromaufwärts von der Nucleotidsequenz lag, welche für den N-Terminus von Phytase codiert (SEQ. ID. NO. 1). (Das Konstrukt enthielt auch unmittelbar stromabwärts von dieser Region eine native XhoI-Stelle). Die zwei synthetischen Oligonucleotide, die in diesem Konstrukt verwendet wurden, hatten die folgende Nucleotidsequenz: nämlich
Oligo260: 5'-CTAGACACCTCAGCAATGTCGTTCCGATCTCTACTCGCCCTGA GCGGCCTCGTCTGCACAGGGTTGGCACTGGCAGTCCCCGCC-3' (84-mer); und
Oligo261: 5'-TCGAGGCGGGGACTGCCAGTGCCAACCCTGTGCAGACGAGGC CGCTCAGGGCGAGTAGAGATCGGAACGACATTGCTGAGGTGT-3' (84-mer).
Oliconucleotide 260 und 261 wurden angelagert und dann an XbaI/XhoI-geschnittenes pFF-1 angelagert, wodurch pFF-1 GA erhalten wurde. Der Glucoamylase-Promotor aus pGA wurde in pFF-1 GA (als KpnI/XbaI-Fragment) ligiert, wodurch pPREFF-11 erhalten wurde. Schließlich wurde eine phleo^r-Kassette als HindIII-Fragment in die einzige HindIII-Stelle der Konstruktion addiert. Transformanten, die korrekt orientiertes Plasmid enthielten, wurden durch Restriktionsanalyse identifiziert. Lineare DNA wurde als ein 7,35 KpnI-Fragment aus pFF-11 isoliert.
Konstrukt E: pPHO-1-pH 2,5-saure Phosphatase (AP) unter Kontrolle ihres nativen Promotors
pAP-3 wurde mit EcoRI geschnitten und mit Klenow an den Enden geglättet. Die phleo^r-Kassette wurde als HindIII-Fragment aus pLO-3 entfernt, mit Klenow an den Enden geglättet und in das geschnittene pAP-3-Plasmid ligiert. Transformanten, die korrekt orientiertes pPHO-1 enthielten, wurden durch Restriktionsanalyse identifiziert. Lineare DNA wurde aus pPHO-1 als ein 6,3 kb PstI-Fragment isoliert.
Konstrukt F: pPHO-2, pH 2,5-saures Phosphatase-Gen unter Kontrolle des A. niger-b-Tubulin-Promotors
Der fungale Expressionsvektor pTL113 wurde mit XbaI geschnitten und mit Kälberdarmphosphatase dephosphoryliert. Ein 2,0 kb XbaI-Fragment, das das pH 2,5-Phosphatase-Gen enthielt (Beispiel 2, Materialien und Verfahren, oben), wurde in geschnittenes pTl113 ligiert, wodurch pPREPHO-2 erhalten wurden. Transformanten, die korrekt orientierte Plasmide enthielten, wurden durch Restriktionsanalyse identifiziert. pPrepho-2 wurde partiell mit SphI geschnitten, wodurch ein einzeln geschnittenes, lineares Plasmid erhalten wurde. Die Enden von geschnittenem pPREPHO-2 wurden mit T4-DNA-Polymerase geglättet. Ein 2,7 kb HindI-II-Fragment mit glatten Enden, das die phleo^r-Expressionskassette aus pLO-3 enthielt, wurde in den geschnittenen pPREPHO-2-Vektor ligiert. Transformanten, die korrekt orientiertes pPHO-2-Plasmid enthielten, wurden durch Restriktionsanalyse identifiziert. Lineare DNA wurde als ein 6,0 kb PstI-Fragment isoliert.
Konstrukt G: pPHO-3 pH 2,5-saures Phosphatase-Gen unter Kontrolle des A. niger-GAPDH-Promotors
Ein 4,3 kb XbaI-Fragment, das das pH 2,5-Phosphatase-Gen (Beispiel 2, oben) und die phleo^r-Expressionskassette enthielt, wurde durch partielle Verdauung aus pPHO-2 entfernt. Das Fragment wurde mit GeneClean aus Agarose gereinigt und in eine einmal vorkommende XbaI-Stelle im fungalen Expressionsvektor pPRE8-1 ligiert. Transformanten, die korrekt orientiertes pPHO-3-Plasmid enthielten, wurden durch Restriktionsanalyse identifiziert. Lineare DNA wurde als ein 7,0 kb PstI-Fragment isoliert.
Konstrukt H: pPHO-4, pH 2,5-saures Phosphatase-Gen unter Kontrolle des A. niger-GA-Promotors
Das 2,0 kb XbaI-Fragment, das das pH 2,5-saure Phosphatase-Gen enthielt (Beispiel 2, oben), wurde in XbaI-geschnittenen fungalen Expressionsvektor pGA ligiert, wodurch pPREPHO-4 erhalten wurde. Transformanten, die korrekt orientiertes Plasmid enthielten, wurden durch Restriktionsanalyse identifiziert. Ein 5,5 kb KpnI-Fragment, das den GA-Promotor und das pH 2,5-saure Phosphatase-Gen enthielt, wurde durch partiellen Verdau aus pPREPHO-4 entfernt. Das resultierende Fragment wurde mit GeneClean aus Agarose gereinigt und mit T4-DNA-Polymerase an den Enden geglättet. Das Fragment mit geglätteten Enden wurde in pLO-3, das mit PstI geschnitten war, ligiert, und dann wurde die DNA an den Enden geglättet, um Plasmide in zwei unterschiedlichen Orientierungen zu ergeben, die pPHO-4A und pPHO-4B genannt wurden. Transformanten, die jede Orientierung enthielten, wurden durch Restriktionsanalyse identifiziert. Lineare DNA wurde als ein 8,1 kb HindIII-Fragment isoliert.
DNA-Transformation der A. niger-Stämme ALKO243 und ALKO2268
Sphäroblasten wurden erhalten, indem zuerst 0,5 ml bis 1 ml einer Pilzsporensuspension aus conidierenden Kulturen, die auf PD-Schrägen gewachsen waren, zu 50 ml CM-Medium in 250 ml-Kolben gegeben wurde. Für ALKO243 wurden Kulturen über Nacht bei 35°C, 200 UpM, vor Filtration wachsen gelassen. ALKO2268-Kulturen wurden 48 Stunden bei 30°C, 200 UpM, wachsen gelassen. Die resultierenden Mycelia wurden auf einer Doppelschicht Käseleinen gesammelt, zu 50 ml KCM-Puffer (0,7 M KCl, 10 mM MOPS, pH 5,8) mit 5 mg/ml Novozym 234 (Novo BioLabs) gegeben und bei 30°C, 85 UpM, über Nacht zur Sphäroblastenbildung inkubiert.
Die Sphäroblasten wurden durch Filtration durch einen Trichter, der mit Mirastoff gepackt und mit Käseleinen bedeckt war, in vier konische 15 ml-Zentrifugenröhrchen geerntet, dann für zehn Minuten, 1500 UpM, in einer Tischzentrifuge zentrifugiert. Die Pellets wurden vorsichtig in insgesamt 15 ml Sorbitpuffer (1 M Sorbit, 50 mM CaCl₂) resuspendiert und rezentrifugiert. Das Pellet wurde erneut in Sorbitpuffer (SB) gewaschen, dann in SB zu einer Dichte von 5 × 10⁷/ml resuspendiert.
5 μg lineare oder Plamid-DNA in 20 μl TE wurden zu 200 μl Sphäroblasten gegeben. Für Co-Transformationen wurde auch 1 μg selektierbarer Phleomycin-Resistenzmarker-Gen-DNA, pLO3, zugegeben. 500 μl PCM (40% PUG 8000, 10 mM MOPS, pH 5,8, 50 mM CaCl₂ [CaCl₂ unmittelbar vor Verwendung zugesetzt]) wurden vorsichtig in das DNA-Sphäroblasten-Gemisch pipettiert und für 30 Minuten auf Eis inkubiert.
1 ml PCM wurde zu der Transformationsmischung gegeben, die Mischung wurde in 50 ml Regenerationsagar (MA: CM plus 1,3 M Mannit, 3% Agar) pipettiert und in fünf Petrischalen verteilt. Sphäroblasten wurden sich für 3 bis 5 Stunden bei 35°C regenerieren gelassen, be vor sie mit einer gleichen Menge an OL + Phleomycin bedeckt wurden (OL: 1% Pepton, 1% Agar; Phleomycin [CAYLA]: 50 μg/ml für ALKO243, 195 μg/ml für ALKO2268). Vermeintliche Transformanten wurden auf PD + Phleomycin-Schrägen transferiert und bei 28°C wachsen gelassen.
Phytase-Platten-Assay
Transformanten, die höhere Phytaseausbeuten produzieren, wurden durch einen Platten-Assay identifiziert, der die Akkumulation von anorganischem Phosphat durch die Reduktion eines Phosphomolybdat-Komplexes misst. Conidien aus vermeintlichen Transformanten wurden auf Assayplatten aufgetüpfelt und zwei Tage bei 30°C inkubiert. 20 ml Reagens C (Verhältnis von 1 M Schwefelsäure [Mallinckrodt], 2,5% Ammoniummolybdat [Sigma], 10% Ascorbinsäure [Sigma] 3 : 1 : 1) wurden oben auf das Medium aufgetragen, und die Platten wurden für fünfzehn Minuten bei 50°C inkubiert, bevor eine Punktbewertung für die Farbintensität erfolgte. (Platten-Assay-Agar: 2% Maisstärke [Sigma #S-4126], 1% Proteasepepton [Difco #0122-1], 30 g Glucose/l, 5 g NH₄NO₃/l, 0,5 g MgSO₄·7H₂O/l, 0,5 g KCl, 0,183 g FeSO₄·7H₂O/l, 3% Agar, 3% Natriumphytat [Sigma #P-3168]).
Phytase- und pH 2,5-saure Phosphatase-Enzym-Assays
Die Enzym-Assays wurden wie in Beispiel 1, oben, durchgeführt.
Herstellung von Phytase und pH 2,5-saurer Phosphatase durch transformierte rekombinante Zellen
Transformierte, rekombinante Fadenpilze, die Phytase und pH 2,5-saure Phosphatase exprimieren, wurden unter identischen Bedingungen in einem Produktionsmedium auf Soja-Basis [(50 g/l Sojamehl, 30 g/l Glucose, 5 g/l NH₄NO₃, 0,5 g/l MgSO₄·7H₂O, 0,5 g/l KCl, 0,183 g/l FeSO₄·7H₂O, pH 5,0)] für fünf Tage an einem Rotationsschüttler mit 200 UpM und bei 28°C kultiviert. Transformanten, die den Glucoamylase-Promotor verwenden, wurden zusätzlich in Soja-Glucoamylase-Medium (Soja-Medium plus 4% Maisstärke und 6% Glucose) wachsen gelassen. Enzymproben wurden durch Zentrifugieren eines Aliquots der Fermentationskultur mit 13.000 UpM in einer Mikrozentrifuge für zehn Minuten, danach Übertragen des Enzym-enthaltenden Überstands in ein frisches Röhrchen für den Enzym-Assay (unten) gesammelt.
BEISPIEL 5
Ausgewogene Überexpression sowohl des Phytase-Gens als auch des pH 2,5-sauren Phosphatase-Gens
Analyse von Dual-Enzym-Transformanten mit Phytase- und pH 2,5-AP-Genen
Da sowohl pH 2,5-saure Phosphatase als auch Phytase für einen optimalen Abbau von Phytinsäure erforderlich sind, wurde es als vorteilhaft angesehen, Stämme zu konstruieren, die beide Enzyme überproduzieren könnten. Da Phytinsäure am wirksamsten dephosphoryliert wurde, wenn die Verhältnisse an Phytase-Einheiten zu saurer Phosphatase-Einheiten für die spezifische Verwendung maßgeschneidert sind (Beispiel 1, oben), wurde es als noch wün schenswerter angesehen, wenn Tranformantenstämme so gewählt werden können, dass sie beide Enzyme in diesem gewünschten Verhältnisbereich überproduzieren könnten.
A. niger-ALKO243-Transformanten wurden unter Verwendung der in Tabelle 13 angegebenen Kombinationen von Transformations-Vektorplasmiden und einer Co-Transfektion mit Phleomycin-selektierbarem Marker (wie oben beschrieben, Beispiel 4, Materialien und Verfahren) selektiert. Nach Co-Transformation mit den angegebenen Kombinationen aus Phytase- und pH 2,5-saurer Phosphatase-enthaltenden Plasmiden (Tabelle 13) wurden die Transformanten in Schüttelflaschenkulturen (wie in Tabelle 7 und Tabelle 10, Beispiel 4, oben, beschrieben) wachsen gelassen, um die Enzymproduktion zu beurteilen.

Alle Dual-Enzym-Transformanten wurden zunächst analysiert, um die Menge an pH 2,5-saurer Phosphatase zu bestimmen; wenn die Level deutlich erhöht waren, dann wurde die Phytaseaktivität analysiert (da Phytase zwei pH-Optima bei pH 2,5 und pH 5,0 hat [oben, Beispiel 1], kann ihre Aktivität unter pH 2,5-saurer Phosphatase-Parametern detektiert werden). (Die sauren Phosphatase-Werte wurden so eingestellt, dass sie für die Prozent Phytaseaktivität, die im pH 2,5-sauren Phosphatase-Assay auftreten, verantwortlich sind). Es wurde festgestellt, dass neun von 425 Transformanten sowohl Phytase als auch pH 2,5-saure Phosphatase überproduzieren und dass bei mehr als 4 : 1 HFU/PU (d. h., pH 2,5-saure Phosphatase-HFU dividiert durch Phytase-PU). TABELLE 13 DNA-Konstrukte, die zur Konstruktion von Dual-Enzym-Transformanten von ALKO243 mit erhöhten Leveln sowohl an pH 2,5-saurer Phosphatase als auch Phytase verwendet wurden

Plasmid-DNA-Kombination	Analysierte Zahl
pPHO1/pFF4	3
pPHO3/pFF1	108
pPHO3/pFF2	50
pPHO3/pFF4	11
pPHO3(lin)/pFF6(lin)	74
pPHO3(lin)/pFF8(lin)	7
pPHO4A/pFF1	21
pPHO4A/pFF2	22
pPHO4A/pFF3	25
pPHO4A/pFF4	22
pFF6/prepho2	2
pFIN-1A	84
pFIN-1B	46
Insgesamt	475

Achtzehn der 475 Kombinationstransformanten (Tabelle 13) zeigte Aktivitäten über dem 20fachen HFU/ml-Wert für ALKO243 für pH 2,5-saure Phosphatase und einen 250fach höheren PU/ml-Wert als ALKO243 für Phytaseaktivität (Tabelle 14).
TABELLE 14 A. niger-ALKO243-Dual-Enzym-Transformanten, die Phytase und pH 2,5-saure Phosphatase (pH 2,5-AP) bei Leveln der Enzymaktivität exprimieren, welche um das 20fache höher sind als bei der ALKO243-Elternzelle für pH 2,5-saure Phosphatase (A. P.) und für Phytase (Phy.) 250fach höher sind^a
Molekulare Charakterisierung
Die Stämme GAX-7, GAX-11 und GAX-12 wurden charakterisiert, um ihre relativen Mengen an Gendosierung, Message-Level und Enzymproduktion zu bestimmen. Die drei Transformanten zeigen alle eine Tandem-Integration, die aus der Einführung des Phytase-Transformationsvektors pFF4 herrührt. Zwei der Stämme, GAX-7 und GAX-11, zeigen auch mehrere Integrationsereignisse (17A). Der Anstieg beim Phytase-Message-Level gegenüber den ALKO243-mRNA-Leveln variierte von einem 17,5fachen Anstieg (für GAX-11) bis zu einem 34,4fachen Anstieg (für GAX-12) (17B; Tabelle 15).
17A zeigt eine Southern-Analyse der DNA-Kopienzahlen von Phytase-Genen in den Dual-Gen-transformierten GAX-Stämmen. DNA aus Dual-Enzym-Transformanten GAX-7, -11 und -12 wurde mit BamHI und XbaI verdaut, einer Elektrophorese unterworfen, geblottet, und der Filter wurde mit einem BamHI/XbaI-Fragment aus pFF-4 sondiert. Bahn 1. pFF-4-Plasmid-Kontroll-DNA, verdaut mit BamHI/XbaI. Bahn 2. Nicht-transformierte ALKO243-Kontroll-DNA. Bahn 3. Transformanten-GAX-7-DNA. Bahn 4. Transformanten-GAX-11-DNA. Bahn 5. Transformanten-GAX-12-DNA. p = Transformationsvektor-Plasmidkopienzahl; c = chromosomale Genkopienzahl.
17B zeigt die Northern-Analyse von Phytase-mRNA-Transkript-Leveln in den GAX-Stämmen von 17A: 20 mg Gesamt-RNA, gespickt mit 10 ng mp18-RF-DNA (mp), wurden einer Elektrophorese unterzogen, auf Nitrocellulose geblottet und mit pFF-1 sondiert. Das Phytasetranskript wird bei 1,4 kb markiert. Bahn 1. Kontroll-RNA von nicht-transformiertem ALKO243. Bahn 2. GAX-7-RNA. Bahn 3. GAX-11-RNA. Bahn 4. GAX-12-RNA.
TABELLE 15 Vergleich der Phytase-Kopienzahl, mRNA-Level und Enzymaktivität für Dual-Enzym-Transformanten^a
Daten aus einer ähnlichen Analyse durch Southern- und Northern-Blotting der drei Stämme sind in Tabelle 16, unten, für pH 2,5-saure Phosphatase-Transformationsvektor-Gensequenzen angegeben. Die Resultate zeigen, dass GAX-7, eine pPHO-3-Integrante, eine zusätzliche Kopie an pH 2,5-saver Phosphatase enthielt (als ein einzelnes Integrationsereignis), wohingegen GAX-11 und -12, pPHO-4A-Integranten, zusätzliche Kopien enthielten (erworben durch Tandemintegration; 18A). Message-Level für pH 2,5-saure Phosphatase waren in GAX-7 2,7fach erhöht (d. h., gegenüber Leveln bei ALKO243) und bei GAX-11 bzw. GAX-12 10fach bzw. 15fach (18B; Tabelle 16). Wie für die Einzel-pH 2,5-saure Phosphatase-Gentransformanten beobachtet wurde (d. h., Beispiel 4, oben), wurden höhere Kopienzahlen für eine Integration von Transformationsvektor-Plasmiden als bei den Phytase-Vektoren erhalten, allerdings waren die Message-Level für pH 2,5-saure Phosphatase nicht entsprechend so hoch wie die Level, die mit den Phytase-Vektoren beobachtet wurden (Tabelle 16, unten).
18A zeigt eine Southern-Analyse der DNA-Kopienzahl von pH 2,5-sauren Phosphatase-Sequenzen in Dual-Gen-transformierten GAX-Stämmen. Alle Proben wurden mit SalI verdaut, einer Elektrophorese unterzogen, auf Nitrocellulose geblottet und mit dem pH 2,5-sauren Phosphatase-Gen sondiert, wie es in Fragmenten aus pAP-3 isoliert worden war (Beispiel 3, oben). Bahn 1. pPHO-3-Plasmid-DNA-Kontrolle, mit SalI verdaut. Bahn 2. pPHO-4A-Plasmid-DNA-Kontrolle, mit SalI verdaut. Bahn 3. DNA-Kontrolle von nicht-transformiertem ALKO243. Bahn 4. GAX-7-DNA. Bahn 5. GAX-11-DNA. Bahn 6. GAX-12-DNA.
18B zeigt die Northern-Analyse von mRNA-Level der pH 2,5-sauren Phosphatase-Message-Expression in Dual-Enzym-transformierten Stämmen. Das pH 2,5-saure Phosphatase-RNA-Transkript ist mit Pfeil versehen. Bahn 1. Kontroll-RNA aus nichttransformiertem ALKO243. Bahn 2. GAX-7-RNA. Bahn 3. RNA. GAX-11-RNA. Bahn 4. GAX-12-RNA.
TABELLE 16 Vergleich der pH 2,5-saure Phosphatase-Kopienzahl, mRNA-Level und Enzymaktivität in Dual-Enzym-Transformanten^a
Materialien und Verfahren
Die hierin verwendeten Materialien und Verfahren waren dieselben wie die, die oben verwendet wurden (siehe Beispiel 4).
BEISPIEL 6
Kontrolle der Überexpressionslevel von Phytase und pH 2 5-saurer Phosphatase in Dual-Tranformanten
Wie oben in den Beispielen 2–5 beschrieben, wurden industriell signifikante Anstiege bei den Ausbeuten an Phytase und pH 2,5-saurer Phosphatase erreicht, indem ein Stamm von Aspergillus niger (d. h., ALKO2268) mit Transformationsvektorkonstrukten transformiert wurde und Transformanten, die das gewünschte enzymatisch aktive Protein überexprimierten, selektiert wurden. In Schüttelflaschenfermentationen wurden Phytaseausbeuten 2000fach gegenüber den Enzymproduktionsleveln erhöht, welche mit ALKO243 erreicht wurden (Beispiel 4; Tabelle 8, oben), und pH 2,5-saure Phosphatase-Ausbeuten wurden um mehr als das 100fache erhöht (Beispiel 3; Tabelle 11, oben). Diese Ausbeuteanstiege wurden als Resultat verschiedener Faktoren angesehen: Am wichtigsten eine verstärkte Gen-Dosierung und die Verwendung wirksamer alternativer Promotoren (d. h., heterologer Promotoren GA, GAP, GAPDH und der β-Tubulin-Promotor; siehe Beispiele 4 und 5, oben). Faktoren, die die Expressionslevel kontrollieren, wurden weiter beurteilt.
Der Effekt der Gendosierung auf Fermentationslevel von Phytase und saurer Phosphata se
Die in den Beispielen 4 und 5 oben präsentierten Daten legen nahe, dass relativ große Zunahmen beim Phytase-Protein aus relativ moderaten Zunahmen bei der Genkopienzahl und den mRNA-Transkriptleveln resultierten. Die beobachtete Genkopienzahl steigt im Bereich von 3–5 zusätzlichen Kopien bei den Phytase-überproduzierenden Stämmen. Diese Stämme, nämlich GAE-32, GAK-47, GAL-65, GAM-225 und GAO-248, erwarben die zusätzlichen Genkopien offensichtlich durch mehrfache Integrationsereignisse der rekombinanten Transformationsvektor-Plasmid-DNA, d. h., eher als durch Tandemintegration. Drei der fünf Stämme, GAL-65, GAM-225 und GAO-268, wurden mit linearen DNA-Fragmenten transformiert, bei denen Tandemanordnungen weniger wahrscheinlich auftreten. GAL-32 und GAK-47 wurden allerdings mit ringförmigen Vektorkonstruktionen transformiert, welche oft zu tandemartig ange ordneten Genkopien führen. Da die Transformanten auf der Basis der Phytaseaktivität im Enzym-Platten-Assay (anstatt durch Southern-Blot-Analyse, wie es üblicherweise der Fall ist) selektiert wurden, war die relative Häufigkeit von Transformanten, die Phytase-DNA-Sequenzen in optimalen Stellen integriert hatten, wahrscheinlich erhöht. Eine chromosomale Integrationsstelle (chromosomale Integrationsstellen) spielen offensichtlich eine wichtige Rolle bei der Phytase-Genexpression, und dieses Screeningverfahren selektierte optimierte Transformanten.
Bei stark produzierenden Phytase-Transformanten wurden die Messenger-RNA-Level sieben- bis dreizehnfach über denen von ALKO2268 festgestellt, während Fermentationslevel, die durch die Zellen produziert wurden, fünfzigfach anstiegen.
Die bei pH 2,5-sauren Phosphatase-Transformanten beobachtete Kopienzahl (Tabelle 12, Beispiel 4; Tabelle 16, Beispiel 5, oben) war bei Phytase-Transformanten höher (Tabelle 9, Beispiel 4; Tabelle 15, Beispiel 5, oben), allerdings waren die Menge an pH 2,5-saure Phosphatase-Message deutlich niedriger als bei Phytase-Transformanten. Stark pH 2,5-saure Phosphatase-überproduzierende Stämme GAT-143, GAW-54, GAW-89, GAW-121 und GAW-130 wurden mit Vektoren, die lineare DNA entweder aus pPHO-3 oder pPHO-4A haben, transformiert. In diesen Transformanten wurden sieben bis zwölf zusätzliche Genkopien (d. h., Vektor-Genkopien) erkannt, allerdings waren die Messagelevel nur etwa drei- bis etwa siebenfach erhöht.
Effekte von linearer und kreisförmiger DNA auf Transformantentiter
Die Effekte von linearen DNA-Transformationsvektorkonstrukten und rinförmigen Vek torkonstrukten auf die Phytase-Enzymproduktion wurde beurteilt. Insgesamt ergaben ringförmige Konstruktionen eine höhere Transformantenfrequenz mit verstärkter Phytase-Enzymproduktion (19), allerdings waren die maximalen Enzymlevel, die durch die Transformanten produziert wurden, bei linearen und ringförmigen Konstrukten vergleichbar. Beispielsweise ergab der ringförmige Vektor pFF3 8/24 (33%) Phytase-Transformanten mit Enzymproduktionsleveln, die über 750 PU lagen. Das lineare Gegenstück von pFF3, d. h., pFF8, hatte zweimal weniger Transformanten (d. h., die denselben Schwellenlevel der Phytaseproduktion erreichten), allerdings hatten die Transformanten, die selektiert wurden, maximale Produktionslevel, die mit denen von pFF8-Transformanten vergleichbar waren. Wenn lineare Fragmente gereinigt und religiert wurden, erhöhte sich die Frequenz stärkerer Produzenten nicht.
19. Vergleich der Effekte von linearer und ringförmiger DNA auf die Titer von vierundzwanzig ausgewählten Phytase-Transformanten. Mit dem ringförmigen Vektor pFF3 hatten 33% der Phytase-Transformanten Level der Enzymproduktion von über 750 PNU. Sein lineares Gegenstück, pFF8, hatte zweimal weniger Transformanten, die denselben Schwellenwert der Enzymproduktion erreichten. PNU = Phytasenormalisierte Einheiten.
Wirkungen von fungalen Promotoren auf Produkttiter
Der Expressionslevel von Genen in Aspergillus kann von der besonderen Wahl des A. niger-Fadenpilz-Promotors abhängen. Die in den Beispielen 4 und 5 oben präsentierten Resultate stützen die Feststellung, dass Phytase und pH 2,5-saure Phosphatase aus einer Varietät von A. niger-Promotoren (einschließlich des GA-, GAPDH- und β-Tubulin-Promotors), wie auch den nativen Promotorelementen in den 5'-regulatorischen Regionen des Phytase- und pH 2,5-sauren Phosphatase-Gens exprimiert werden können. Allerdings zeigen die Resultate auch, dass die maximalen Level an Enzym, die in Transformanten, aus einer Expression, die von unterschiedlichen Promotoren gesteuert wird, unterschiedlich sind; d. h., die Promotorwahl bestimmte den Expressionslevel. Während die nativen Phytase- und pH 2,5-sauren Phosphatase-Promotoren wirksam waren, waren doch die Glykoamylase (GA)- und GAPDH-Promotoren deutlich besser. Die Produktionslevel von Phytase und pH 2,5-saurer Phosphatase in Fermentationskultur unter der Kontrolle der GA- und GAPDH-Promotoren sind in 20 gezeigt.
20. Verschiedene Pilz-Promotoren, die bei der Transformation von Plasmiden verwendet wurden, beeinflussten den Level an Phytase und pH 2,5-saurer Phosphatase, die durch A. niger-Transformanten produziert wurden. Die Enzymlevel, die durch 10 Transformanten produziert wurden (d. h., mit den höchsten Leveln für den gegebenen Promotor), wurden gemittelt. (Daten aus Dual-Enzym-Transformanten wurden bei diesen Berechnungen nicht verwendet).
GAPDH = Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase. GA = Glucoamylase.
Es wurde beschrieben, dass der Glucoamylase-Promotor aus Aspergillus-Species verwendet wird, um die Expression von mehreren Proteinen zu erhöhen (Ullah et al., 1987). Zusätzlich zum GA-Promotor enthält die GA-Sequenz ein Glucoamylase-Signalpeptid und -Propeptid, von dem beschrieben wird, dass es bei Anstrengungen zur Verstärkung der Expression eingesetzt wurde (Yamamoto et al., 1970).
Um die Effekte der Phytase-Signalsequenz auf die produzierten Phytaselevel zu untersuchen, wurde die Signalsequenz im Phytase-Gen (in Konstrukt pFF-11) durch ein synthetisches Oligonucleotid ersetzt, das die vermeintliche Pilzglucoamylase-Signalsequenz enthält. Anstatt die produzierten Enzymlevel zu erhöhen, verringerte überraschenderweise die Insertion der GA-Signalsequenz tatsächlich die Level an produzierter Phytase im Vergleich zu den Produktionsleveln, die mit Transformanten erreicht wurden, die die native Phytase-Signalsequenz haben (d. h., in der nativen Phytase-Gensequenz). Diese Resultate zeigen die mögliche Bedeutung der Phytase-Signalsequenz bei der Maximierung der Level zur Produktion von Phytase.
Gene unter der Kontrolle eines Glucoamylase-Promotors können in Gegenwart von Stärke nach oben reguliert (induziert) werden. Um die Effekte einer solchen Hochregulierung bei den Leveln der Phytaseproduktion zu beurteilen, wurden einige pFF-4- und pFF-9-Glucoamylase-Promotor-Phytase-Transformanten in Medium kultiviert, das mit 4% Maisstärke supplementiert worden war. Die Level der Enzymproduktion wurden im Durchschnitt in den letztgenannten Kulturen 1,4-fach verstärkt, obgleich diese Produktionslevel nicht konsistent beobachtet wurden. Die höchsten Phytaseausbeuten, die unter induzierenden Bedingungen beobachtet wurden, waren 3240–3770 PNU. Die Resultate zeigen, dass eine Optimierung der Medien, die bei der Phytaseproduktion-Fermentationsbrühe eingesetzt wurden, zu signifikant höheren Enzymausbeuten führen könnten.
Der Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenase (GAPDH)-Promotor ist erwiesenermaßen ein konstitutiver Promotor, der eine Expression eines heterologen Genprodukts auf hohem Level steuern kann. Die Erfinder klonierten unabhängig das Glyceraldehydphosphat-Dehydrogenase-A-Gen (gpdA) aus A. niger-ATCC1015, um seine Wirkung auf die Phytase- und pH 2,5-saure Phosphatase-Genexpression in einem Transformationsvektorkonstrukt, welche in A. niger-Stamm ALKO243 oder -ALKO2268 eingeführt worden war, zu beurteilen. Die Level der Enzymproduktion in Tranformanten, die den GAPDH-Promotor haben, welcher die Expression von Phytase und pH 2,5-saurer Phosphatase steuert, waren nahezu identisch mit den Leveln, die oben unter Verwendung des Glucoamylase-Promotors erreicht wurden (20). Somit scheint der GAPDH-Promotor keine einzige Möglichkeit für eine erhöhte Enzymproduktion zu bieten. Die Gründe für dieses besondere Verhalten sind derzeit unklar; allerdings kann eine solche Variabilität bei der Expression zwischen ALKO243 und ALKO2268 mit der Ableitung von ALKO2268 als Mutante von ALKO243 in Verbindung stehen, und ALKO2268 produziert nur etwa die Hälfte der Menge an pH 2,5-saurer Phosphatase, die durch den Elternstamm ALKO243 produziert wird. Somit ist es möglich, dass ALKO2268 bezüglich einiger limitierender Faktoren, die mit der Expression von pH 2,5-saurer Phosphatase in Verbindung stehen, defizient ist. (Solche Stamm-abhängigen Differenzen bei der Promotor-gesteuerten Expression wurden mit keinen anderen Promotoren beobachtet).
Vom β-Tubulin-Promotor wird auch berichtet, dass er ein Promotor ist, der zur Steuerung der konstitutiven Expression von Genen fähig ist. Um seine möglichen Wirkungen auf die Phytase- und pH 2,5-saure Phosphatase-Genexpression zu untersuchen, wurde der β-Tubulin-Promotor aus A. niger-Stamm 1015 isoliert. Der Promotor wurde in Transformationsvektoren eingeführt, um seine Wirkungen auf die Level der Phytase- und pH 2,5-saure Phosphatase-Produktion zu beurteilen. Frühere Studien der Erfinder legten nahe, dass eine Expression von homologen Pilz-Genen verstärkt werden könnte, wenn eine Steuerung durch den β-Tubulin-Promotor erfolgte, und dass diese Erhöhung wesentlich größer war als die, die durch die Verwendung eines GAPDH- oder GA-Promotors erreicht werden konnte (Panlabs, nichtveröffentlicht). Unglücklicherweise senkte ein Einschluss eines β-Tubulin-Promotors in das Phytase-Transformationsvektorkonstrukt tatsächlich die produzierten Enzymlevel, und bei pH 2,5-saurer Phosphatase wurde nur ein moderater Anstieg bei den Produktionsleveln gegenüber den durch den nativen Promotor vermittelten Produktionsleveln festgestellt (20).
Es wurde auch als möglich erachtet, dass eine Produktion von rekombinanter Phytase und pH 2,5-saurer Phosphatase gegenüber einer Phosphat-vermittelten Transkriptionsrepression empfindlich sein könnte. In diesem Fall könnten die produzierten Enzymlevel erhöht werden, indem solche Bedingungen in der Fermentationskultur eliminiert werden. Zur Stützung der Vorstellung einer Phosphat-vermittelten Repression produzierten Zellen der beiden Stämme ALKO243 und ALKO2268 keine detektierbare Phytase, wenn überschüssiges Phosphat zu der Fermentationskulturbrühe gegeben wurde. Um diese Möglichkeit weiter zu untersuchen, wurden die Enzymlevel, die durch Phytase-Transformanten mit alternativen Promotoren (d. h., GA, GAPDH oder β-Tubulin) produziert wurden, mit den Leveln verglichen, die mit den nativen Phytase- und pH 2,5-sauren Phosphatase-Promotoren in den Tranformationsvektorkonstrukten erreicht wurden, um zu sehen, ob die Verwendung eines solchen alternativen Promotors die vermeintliche Phosphat-vermittelte Repression eliminieren würde. Interessanterweise wurde mit dem Phytase- oder pH 2,5-sauren Phosphatase-Promotor keine Phytaseproduktion detektiert, wenn die Transformanten in Gegenwart von Phosphat gewachsen waren, was die Vorstellung einer Phosphat-vermittelten Repression stützt, die durch die Verwendung des nativen Promotors, der in eine andere chromosomale Stelle integriert ist, überwunden werden kann. Bei der Beurteilung der alternativen Promotoren war eine Transformante mit einem β-Tubulin-Promotor fähig, Phytase in Gegenwart von Phosphat zu produzieren, sie zeigte aber eine Verringerung der Phytaseproduktion um etwa die Hälfte. Im Gegensatz dazu waren GAPDH-Promotor- und GA-Promotor-Transformanten zu einem gewissen Grad gegenüber einer Phosphat-vermittelten Inhibierung unempfindlich und zeigten ähnliche Level der Phytaseproduktion in Gegenwart oder Abwesenheit von zusätzlichem Phosphat. Somit legen die Resultate nahe, dass regulatorische Elemente in der 5'-regulatorischen Region der Phytase- und pH 2,5-saure Phosphatase-Gene zur Steuerung einer Phosphat-vermittelten Repression der Genexpression nützlich sein können und dass eine Insertion von alternativen Promotoren in die 5'-Region dieser Gene diese nativen regulatorischen Beschränkungen überwinden kann und die Produktionsausbeuten erhöhen kann.
Die Identifizierung der die Rate limitierenden Faktoren, ob sie mit Energie oder Sekretion in Verbindung stehen, kann die Ausbeuten an Phytase und pH 2,5-saurer Phosphatase weiter erhöhen. Andere Faktoren, wie z. B. Mediumoptimierung, erhöhte oder stabilisierte Gentranskriptionslevel von pH 2,5-saurer Phosphatase oder ein klassisches Mutagenese-Screening von starken Produzenten, könnten zusätzliche Einflüsse auf die Produktausbeute haben. Eine erhöhte Gendosierung und die Verwendung von alternativen Promotoren haben die Produktionsausbeuten gegenüber nativen Promotoren dramatisch erhöht und negative regulatorische Grenzen beseitigt. Die Klonierung und Wiedereinführung der Gene für Phytase und pH 2,5-saure Phosphatase hat zu kommerziell signifikanten Leveln dieser Enzyme zur Verwendung als Tierfutterergänzungen geführt. Eine rationale Entwicklung einer homologen Genüberexpression kann angewendet werden, um die Ausbeuten an anderen industriellen Pilzprodukten zu erhöhen, und kann möglicherweise ein besseres Verständnis der Mechanismen, die für eine heterologe Expression erforderlich sind, liefern.
Materialien und Verfahren
Die Materialien und Verfahren, die in diesem Beispiel eingesetzt wurden, sind dieselben wie die, die in Beispiel 4, oben, verwendet wurden.
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Rekombinante transformierte Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, dass sie durch eine erste Nucleinsäure, die fähig ist, unter stringenten Bedingungen mit der Nucleotidsequenz SEQ ID NO. 18 zu hybridisieren, und eine zweite Nucleinsäure, die fähig ist, unter stringenten Bedingungen mit der Nucleotidsequenz SEQ ID NO. 20 zu hybridisieren, transformiert worden ist, und dass sie fähig ist, die pH 2,5-saure Phosphatase-Enzymaktivität und die Phytase-Enzymaktivität in einem Verhältnis von 3 : 1 bis 16 : 1 zu sezernieren.
Wirtszelle nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie fähig ist, eine rekombinante Phytase und eine oder mehrere rekombinante Phosphatase(n) zu synthetisieren und zu sezernieren.
Wirtszelle nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die sezernierte, überexprimierte Phytase eine Enzymaktivität pro ml hat, die zweimal höher ist als eine Phytase-Enzymaktivität, die durch ALKO243 (ATCC#38854) sezerniert wird, oder die sezernierte überexprimierte Phosphatase eine Enzymaktivität hat, die mindestens etwa 10 mal höher ist als eine Phosphatase-Enzymaktivität, die durch ALKO243 (ATCC#38854) sezerniert wird.
Wirtszelle nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Zelle eines Fadenpilzes ist.
Wirtszelle nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Zelle von Aspergillus ist.
Wirtszelle nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Nucleotidsequenz für ein konserviertes Polypeptid codiert, das eine Aminosäuresequenz RHGXRXP hat, worin R Arginin ist, H Histidin ist, G Glycin ist, X eine beliebige Aminosäure ist und P Prolin ist.
Wirtszelle nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein pH 2,5-saure Phosphatase-Polypeptid mit einem Molekulargewicht von etwa 52.000 Dalton bis etwa 53.000 Dalton, wie es aus der vorhergesagten Aminosequenz errechnet wird, sezerniert.
Wirtszelle nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die pH 2,5-saure Phosphatase ein tetrameres Enzym unter nicht denaturierenden Bedingungen mit einem isoelektrischen Punkt von etwa 4,0 bis etwa 4,25 ist und ein Monomeren-Molekulargewicht unter denaturierenden Bedingungen von etwa 66.000 Dalton, bestimmt durch SDS-page und etwa 46.000 Dalton bis etwa 49.000 Dalton nach substantieller Kohlenhydratentfernung hat.
Wirtszelle nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die pH 2,5-saure Phosphatase einen scheinbaren Km-Wert von etwa 0,7 mM für Na-Phytat und 4 mM für Paranitrophenylphosphat und ein pH-Optimum von etwa pH 2,0 bis etwa pH 2,5 bei 37°C hat.
Wirtszelle nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie durch ein Vektorkonstrukt zum Exprimieren einer Phytasenucleinsäure in einer Zelle transformiert worden ist, umfassend einen Promotor, die Nucleinsäure, die fähig ist, unter stringenten Bedingungen mit der Nucleotidsequenz SEQ ID NO. 18 zu hybridisieren, und gegebenenfalls einen selektierbaren Marker.
Wirtszelle nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit einem Vektorkonstrukt zum Exprimieren von pH 2,5- saure Phosphatase-Nucleinsäure transformiert worden ist, umfassend einen Promotor, die Nucleinsäure, die fähig ist, unter stringenten Bedingungen mit der Nucleotidsequenz SEQ ID NO. 20 zu hybridisieren, und gegebenenfalls einen selektierbaren Marker.
Wirtszelle nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Vektorkonstrukte einen Promotor haben, der aus einem β-Tubulin-, GA-, GAPHD-, nativen Phytase- und nativen pH 2,5-saure Phosphatase-Promotor ausgewählt ist.
Wirtszelle nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit einem Vektorkonstrukt zum Exprimieren von Phytase- und Phosphatase-Nucieinsäuren in einer Zelle transformiert worden ist, umfassend mindestens einen Promotor, die Nucleotidsequenzen SEQ ID NO. 18 und SEQ ID NO. 20 und gegebenenfalls einen selektierbaren Marker oder mehrere selektierbare Marker.
Wirtszelle nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Vektorkonstrukt aus der Gruppe, bestehend aus Vektoren wie sie in 10A, 10B, 10C, 10D, 12A, 12B, 12C und 12D dargestellt sind, ausgewählt ist.
Wirtszelle nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Vektorkonstrukt aus der Gruppe von Vektoren, wie sie in 13A, 13B, 13C bzw. 13D dargestellt sind, ausgewählt ist.
Wirtszelle nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Vektorkonstrukt aus einer Gruppe von Vektoren, wie sie in 14A bzw. 14B dargestellt sind, ausgewählt ist.
Verwendung der Wirtszelle nach einem der Ansprüche 1 bis 16 zur Herstellung eines enzymatisch aktiven Gemisches, das ein überexprimiertes Phytat abbauendes Enzym oder mehrere überexprimierte Phytat abbauende Enzyme in einem Verhältnis von pH 2,5-saure Phosphatase- zu Phytase-Enzymaktivität von 3 : 1 bis 16 : 1 umfasst.