DE4425058C2 - Verfahren zur Herstellung einer thermostabilen Glukoamylase - Google Patents
Verfahren zur Herstellung einer thermostabilen GlukoamylaseInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer
thermostabilen Glukoamylase mit Hilfe eines amylolytischen,
Stärke als Kohlenstoff-Quelle benutzenden Hefestammes der Art
Saccharomyces cerevisiae.
Seit langem besteht ein hohes Interesse an der Gewinnung von
stärkeabbauenden Enzymen für industrielle Zwecke bzw. an der
Konstruktion von Mikroorganismen, die solche Enzyme
extrazellulär abgeben, insbesondere Glukoamylase (1,4-α-D-Glucan
Glucanhydrolase, EC 3.2.1.3.), die als Endprodukt das
Monosaccharid Glukose bildet.
Eine Anzahl von Mikroorganismen, vor allem Pilze, sind zu einem
enzymbildenden Stärkeabbau befähigt. Aber auch die Verwendung
von Hefestämmen der Art Saccharomyces cerevisiae zur Herstellung
derartiger Enzympräparate - und beispielsweise auch von
Glukoamylase - ist seit langem bekannt (D Mot).
Dabei hat es sich gezeigt, daß nicht jedes dieser Produkte in
der für eine industrielle Ausnutzung erwünschten Art und Menge
erzeugt werden kann. Durch unterschiedliche Glykosilierung,
ungenaues Abspalten von Sekretions-Sequenzen oder fehlenden oder
eingeschränkten Transport des Produktes innerhalb einer
Hefezelle und aus einer Hefezelle heraus werden nämlich die
Eigenschaften des als Produkt vorgesehenen Proteins von dem
Wirtstamm selbst negativ beeinflußt.
Es sind deshalb außerhalb von Saccharomyces cerevisiae eine
ganze Reihe von (unterschiedlich gut funktionierenden) Wirts-
Vektor-Systemen entwickelt worden, die alle jeweils für ein
bestimmtes Genprodukt gut, für andere, heterologe Genprodukte
meist weniger geeignet sind.
In EP 0 260 404 A2 sowie Derwent Abstract 92-22 32 41/27 und
Derwent Abstract 87-17 36 94/25 ist beschrieben, Glukoamylase-
Gene aus anderen Donorstämmen in Saccharomyces cerevisiae (S.c.)
zu transformieren. Die erhaltenen Amylasen weisen jedoch nicht
die gewünschten Eigenschaften auf, was im wesentlichen auf
unterschiedliche Glykosilierung und ungenaues Abspalten von
Selektions-Sequenzen zurückzuführen ist.
Will man ein mit dem gewünschten (natürlichen) Protein möglichst
identisches Protein (gleiche primäre, sekundäre und tertiäre
Struktur, gleiche Eigenschaften) durch genetic engeneering in
einer Hefe herstellen, dann ist deshalb ein Test in jeweils ganz
unterschiedlichen Wirts-Vektor-Systemen erforderlich, da
beispielsweise der Grad und die Art der Glykosilierung oder die
Ausbildung entsprechender räumlicher Strukturen wirtsspezifisch
sind.
Aus diesem Grund ist deshalb auch die Art Arxula adeninivorans
näher untersucht worden; vor allem einige biochemische
Eigenschaften, wie beispielsweise die Isolierung, Reinigung und
Charakterisierung einer Glukoamylase, sind bereits beschrieben
worden, und molekularbiologisch konnte etwa die ungefähre Größe
des Genoms bestimmt werden (DD-Patentschriften 265 163 A1 und
268 254 A1).
In der DD-Patentschrift 265 163 A1 wird ein Verfahren für die
Gewinnung einer thermostabilen Glukoamylase aus der Hefe Arxula
adeninivorans beschrieben. Diese Glukoamylase ist dabei dadurch
gekennzeichnet, daß das Optimum ihres pH-Wertes zwischen 4,0 und
5,5 liegt, und in Gegenart des Substrates Stärke weist sie ein
Temperatur-Optimum von 70°C auf. Unter diesen Bedingungen
verfügt sie auch über eine hohe Thermostabilität; nach 15 Min
bei 70°C sind noch 80% der Ausgangsaktivität vorhanden. Höhere
pH-Werte verhindern eine Inaktivierung der Glukoamylase. Während
bei pH 4,5 in Gegenwart von 5% Stärke nach 15 Minuten bei 60°C
nur noch 50% der Aktivität vorhanden sind, findet bei pH 6,0
unter sonst gleichen Bedingungen keine Inaktivierung statt.
Der Nachteil dieses Verfahrens ist die erforderliche Isolation
des Enzympräparates aus der Hefe Arxula adeninivorans, welche
sich durch die - unvermeidliche - Bildung von Pseudomyzel
wesentlich schlechter als andere Hefen biotechnologisch
aufarbeiten läßt, zumal die Kenntnisse über Arxula adeninivorans
bei weitem geringer sind als über andere, seit langen Zeiten
bekannte, umfangreich angewendete und ausführlich untersuchte
Hefearten wie etwa Saccharomyces cerevisiae.
Die Erfindung hat sich deshalb die Aufgabe gestellt, eine
derartige, von der Hefeart Arxula adeninivorans synthetisierbare
Glukoamylase stattdessen in der biotechnologisch leicht
handhabbaren Hefe Saccharomyces cerevisiae zu synthetisieren,
die dabei so konstruiert werden soll, daß die auf diese Weise
erzeugten amylolytischen Hefestämme Stärke als Kohlenstoff-
Quelle benutzen.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß in diesem
Hefestamm ein aus einem Donorstamm der Art Arxula adeninivorans
isoliertes Glukoamylase-Gen transformiert wird, dessen
Aminosäure-Sequenz mit der die Sekretion bestimmenden
Teilsequenz der 16 (N-terminalen) Aminosäuren M-R-Q-F-L
-A-L-A-A-A-A-S-I-A-V-A beginnt, wobei das Glucoamylase-Gen mittels
eines Glucoamylase-Promotors expri
miert wird.
Durch die Expression des Glukoamylase-Gens in Saccharomyces
cerevisiae wird diese Hefe in die Lage versetzt, Stärke als
Kohlenstoffquelle zu verwenden. Unter Benutzung eines
hefeeigenen Glukoamylase-Promotors ist die in Saccharomyces
cerevisiae synthetisierte Glukoamylase sowohl hinsichtlich der
Menge als auch der biochemischen Eigenschaften mit derjenigen
aus Arxula adeninivorans durchaus vergleichbar. Ganz offenbar
ist die für die Sekretion des Enzympräparates verantwortliche
Signalsequenz auch in Saccharomyces cerevisiae wirksam.
In einer bevorzugten Ausführungsvariante kann die synthetisierte
Glukoamylase unter Verwendung der abzentrifugierten
Kulturflüssigkeit ungereinigt biochemisch charakterisiert
werden.
Anhand der Zeichnung wird die Erfindung an einem Ausfüh
rungsbeispiel näher erläutert. Es zeigen
Fig. 1 das Klonierungsschema des Glukoamylase-Gens von
Arxula adeninivorans,
Fig. 2 die gelelektrophoretische Analyse eines Plasmides
pGAA (Dazu wurde die DNS des Plasmides pGAA mit
den Restriktionsendonukleasen (1) EcoRI/ApaI, (2)
EcoRI/PstI und (3) ApaI/PstI gespalten und in
einem 0,8%igem Agarose-Gen aufgetrennt),
Fig. 3 die Restriktionskarte des Glukoamylase-Gens von
Arxula adeninivorans,
Fig. 4 die gelelektrophoretische Auftrennung der Chromo
somen von Arxula adeninivorans Ls3 (Donorstamm
aus der Stamm-Sammlung im Institut für Pflanzen
genetik und Kulturpflanzenforschung Gatersleben)
mit Hilfe der PFG und die Hybridisierung mit dem
enthaltenen DNS-Fragment,
Fig. 5 PFG (1-7) und DNS-Hybridisierung (8-14) der Chro
mosomen von Arxula adeninivorans-Stämmen (1, 8)
CSIR 1136, (2, 9) CSIR 1138, (3, 10) CSIR 1147,
(4, 11) CSIR 1148, (5, 12) CSIR 1149, (6, 13) CBS
8244T und (7, 14) Ls3 (für die Hybridisierung
wurde ein DNS-Fragment mit dem Glukoamylase-Gen
als radioaktiv markierte Sonde verwendet),
Fig. 6 eine Agarose-Gelelektrophorese (1-3) und eine
Northern Blot Analyse (4-6) der aus (1, 4) gesamt,
(2, 5) frei und (3, 6) ER-gebundenen Polysomen iso
lierten RNS von Arxula adeninivorans Ls3 (für die
Northern Analyse wurde ein DNS-Fragment mit dem
Glukoamylase-Gen als radioaktiv markierte Sonde
verwendet),
Fig. 7/1 bis
Fig. 7/2 die Nukleotidsequenz des Glukoamylase-Gens und
die zugehörige Aminosäure-Sequenz der Gluko
amylase von Arxula adeninivorans Ls3,
Fig. 8/1 und
Fig. 8/3 einen Vergleich der Aminosäure-Sequenz der Gluko
amylase von Arxula adeninivorans Ls3 mit den Glu
koamylasen von Rhizopus oryzae, Aspergillus ni
ger, Saccharomyces diastaticus und Saccharomycop
sis fibuligera,
Fig. 9 das Konstruktionsschema des Plasmides pET-GAA,
Fig. 10 die gelelektrophoretische Auftrennung (1-4) und
eine Western Blot Analyse (5-8) der intrazellulä
ren Proteine von (1, 3, 5, 7) Escherichia coli HMS
174 und (2, 4, 6, 8) Escherichia coli HMS 174/pET-
GAA (die gelelektrophoretische Auftrennung er
folgte an einem 10%igen Polyacrylamid-Gel, für
die Western Blot Analyse wurden Antikörper gegen
die Glukoamylase des Glukoamylase-Gens von Arxula
adeninivorans eingesetzt),
Fig. 11 das Konstruktionsschema eines Plasmides Ycp50-
GAA,
Fig. 12 das Konstruktionsschema eines Plasmides pYGAP-
GAA,
Fig. 13 Wachstum und Verlauf der sekretorischen Gluko
amylase-Aktivität (Teilfig. 13b) von Saccharomy
ces cerevisiae SEY 6210/pYGAP-GAA bei einer Kul
tivierung in einem Hefe-Minimalmedium (Tanaka)
mit Glukose, Maltose oder Stärke als Kohlenstoff-
Quelle (Endkonzentration 1%) und
Fig. 14 die pH-Wert-Abhängigkeit und Temperatur-Abhängig
keit der von Saccharomyces cerevisiae SEY
6210/pYGAP-GAA sekretierten Glukoamylase.
Um eine cDNS-Genbank von Arxula zu erhalten, wird zunächst
die Gesamt-RNS aus Zellen, die in einem Hefe-Minimalmedium
mit Maltose als Kohlenstoff-Quelle (Tanaka) kultiviert wor
den sind, in vorbekannter Weise (Elion) isoliert. An
schließend erfolgt eine mRNS-Reinigung und cDNS-Synthese
mittels eines handelsüblichen und einschlägigen Labor-Kits
(mRNA Purification Kit Produkt-Nr. 27-9258-O1 bzw. cDNA
Synthesis Kit Produkt-Nr. 27-9260-O1 der Fa. Pharmacia).
Dabei kann man cDNS-Fragmente bis zu einer Größe von 4,5
Kbp zu synthetisieren; sie werden für die Ligation in den
Phagenvektor Lambda gt11 (Fa. Pharmacia) eingesetzt.
Nach der Ligation und Verpackung der daraus gewonnenen DNS
mit einem handelsüblichen Labor-Kit (DNA Packaging Kit Pro
dukt-Nr. 733 792 Fa. Boehringer) können rekombinante Phagen
isoliert werden. Bei den im Laborversuch angeschlossenen
gelelektrophoretischen Analysen zeigte es sich, daß die 4 ×
105 rekombinanten Phagen cDNS-Fragmente bis zu einer Größe
von 2 Kbp eingebaut hatten.
Da bei der Expression des Glukoamylase-Gens von Arxula
adeninivorans in unterschiedlichen Wirtssystemen die Te
stung unterschiedlicher Transkriptions-Promotoren, so z. B.
auch die des glukoamylase-eigenen Promotors, angestrebt
wird, muß gleichzeitig eine Phagen-Genbank mit chomosomaler
DNS hergestellt werden.
Dazu wird die chromosomale DNS von Arxula adeninivorans
nach einer in der DD-Patentschrift 298 821 A5 beschriebenen
Methode isoliert und partiell mit der Restriktase EcoRI ge
spalten; dann werden 3-6 Kbp große restriktase-erzeugte
DNS-Fragmente isoliert. Die erhaltenen DNS-Fragmente wurden
anschließend (wie unter 1.2. beschrieben) in den Phagenvek
tor Lambda gt11 eingebaut. Im Laborversuch konnten nach Li
gation und Verpackung 5 × 105 rekombinante Phagen mit 3-6
Kbp großen DNS-Fragmenten der chromosomalen DNS von Arxula
adeninivorans isoliert werden.
Gleichzeitig wird auch die im DD-Patent 298 821 A5 be
schriebene Charon-4A-Phagengenbank mit 10-15 Kbp großen
Fragmenten der chromosomalen DNS von Arxula adeninivorans
verwendet.
Für die Immunisierung von Kaninchen werden sekretorische
Proteine eines Donorstammes Arxula adeninivorans Ls3 einge
setzt. Dieser Donorstamm wird 3 Tage lang in einer 1%igen
Maltose-Kultur kultiviert. Unter diesen Kultivierungsbedin
gungen wird die Glukoamylase des Donorstammes induziert und
ins Medium exportiert. Sie dominiert im Vergleich zu den
anderen sekretorischen Proteinen.
Das Kultivierungsmedium wird mittels Zentrifugation von den
Zellen getrennt und anschließend durch ein 0,22-µm-Milli
pore-Filter (Fa. Millipore) filtriert. Mit Hilfe der Affi
nitäts-Chromatographie unter Verwendung von Hydroxylapatit-
Säulen (equilibriert mit 10 mM Natriumphosphat-Puffer mit
einem pH-Wert von 6,8) erfolgt die Konzentrierung und Rei
nigung der sekretorischen Proteine. Die so an die Hydro
xylapatit-Säulen gebundenen Proteine des Kultivierungsmedi
ums werden mit 250 mM des gleichen Natriumphosphat-Puffers
von der Säule eluiert, gegen destilliertes Wasser unter
sterilen Bedingungen dialysiert und zur dreimaligen Immuni
sierung verwendet.
Das so gewonnene Antiserum wird zunächst durch Ammoniumsul
fat-Fällung und anschließende Dialyse gegen TBS (10 mM Tris
HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl) gereinigt und für "Western Blot"-
Experimente - siehe (b) - eingesetzt. Anschließend erfolgt
die Reinigung durch Immun-Adsorption, wodurch die Monospe
zifität des Immunserums erreicht wird - siehe (c) -.
Nach gel-elektrophoretischer Trennung der sekretorischen
Proteine in einem 7,5%igen Polyacrylamid-Gel unter nativen
Bedingungen (Ornstein, Davis) wird dieses Polyacrylamid-Gel
horizontal in ca. 8 mm dicke Streifen geschnitten, die zum
Zwecke der Proteinelution in 10 mM Natriumphosphat-Puffer
pH 7,0 bei 10°C für 15 Stunden inkubiert werden. Die aus
den einzelnen Fraktionen eluierten Proteine werden in be
kannter Weise (Büttner 1987) auf Glukoamylase-Aktivität ge
testet. Die entsprechenden positiven Fraktionen werden wei
ter gereinigt (dialysiert gegen destilliertes Wasser), kon
zentriert (Lyophilisation), in Laemmli-Puffer suspendiert
und in der SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese im Ver
gleich zu den sekretorischen Proteinen aufgetrennt. Dabei
konnte im Laborversuch ein ca. 90 kDa großes Polypeptid als
Glukoamylase-Bande identifiziert werden.
Die als Antigen zur Kaninchenimmunisierung eingesetzten
Proteine werden gelelektrophoretisch in einem präparativen
SDS-Polyacrylamyd-Gel aufgetrennt und durch Elektrotransfer
auf Nitrozellulose (Fa. Schleicher/Schüll) immobilisiert.
Von diesem Blot wird von beiden Seiten ca. 5 mm breite
Streifen abgeschnitten und nach 30 minütiger Blockierung in
0,5%iger Magermilch/TBS-T (TBS + 0,1% Tween 20) für 3 Stunden
in primärem, durch Ammoniumsulfatfällung gereinigtem Anti
serum inkubiert. Nach dreimaligem Waschen der Membranstrei
fen für je 10 Minuten in TBS-T erfolgt ihre Inkubation in
einem Anti-Kaninchen-IgG-alkalische Phosphatase-Konjugat
(Fa. Promega), das 1 : 7.500 in TBS-T verdünnt worden ist.
Nach wiederholten Wasch-Schritten, wie bereits beschrieben,
wird die alkalische Phosphatase mit Hilfe des Substratgemi
sches lokalisiert.
Die Glukoamylase-Polypeptidbande wird aus der unbehandelten
Nitrozelluosemembran herausgeschnitten und als Antigen für
eine Immunadsorption verwendet.
Der Nitrozellulose-Membranstreifen, auf dem sich das Gluko
amylase-Polypeptid immobilisiert befindet, wird 30 Minuten
in TBS-T bei Raumtemperatur unter Schütteln gewaschen und
danach für dieselbe Zeit in Blockierungslösung blockiert.
Durch die sich anschließende 60-minütige Inkubation des
Membranstreifens in 1 : 2 verdünntem, durch Ammoniumsulfat
präzipitation gereinigtem, polyspezifischem Antiserum bin
den die Glukoamylase-Antikörper. Nach insgesamt 5 Wasch
schritten für je 5 Minuten in TBS-T werden die Antikörper
unter kräftigem Schütteln des Nitrozellulose-Streifens in
Glyzinpuffer (0,1 M Glyzin, pH 2,5; 0,9% NaCl; 1% Rinderse
rumalbumin) abgelöst. Der Puffer wird sofort nach der Ablö
sung der Antikörper mit gesättigter Natriumphosphatlösung
neutralisiert. Dieses gereinigte monospezifische Antiserum
wird über Nacht bei 4°C gegen TBS dialysiert und in Aliquo
ten bei 20°C gelagert.
Potentielle rekombinante Phagen mit entsprechendem Gluko
amylase-Insert werden in einem Stamm Y 1090 von Escherichia
coli vermehrt; dieser wird so zur Lyse gebracht, daß auf
LB-Agar Platten ca. 5.000-10.000 Einzelplaques auftreten.
Die während des Vermehrungszyklus der Phagen gebildeten
Proteine werden durch einfachen Kontakt mit einer Nitrozel
lulose-Membran auf diese immobilisiert (Sambrook). Mit
Hilfe des monospezifischen Antiserums gegen Glukoamylase
werden glukoamylase-produzierende Phagen mittels eines so
genannten ECL-Detection Kits (Fa. Amersham) detektiert.
Das Screening erfolgt nach einer in der DD-Patentschrift
298 821 A5 beschriebenen Methode. Modifiziert wird ledig
lich die Hybridisierungs-Temperatur, die 65°C beträgt. Als
radioaktiv markierte DNS-Sonde dient die mittels immunolo
gischen Screenings isolierte cDNS, die einen Teil des Glu
koamylase-Gens von Arxula adeninivorans enthält.
Mit Hilfe der unter 1.6 und 1.7 beschriebenen Screenings
gelingt es ohne Schwierigkeit, das Glukoamylase-Gen aus Ar
xula adeninivorans zu isolieren und in ein Plasmid pBlue
script II KS(-) aus Escherichia coli (Fa. Stratagene) einzu
bauen (Fig. 1).
Das DNS-Fragment, bestehend aus zwei EcoRI-DNS-Fragmenten
mit einer Gesamtgröße von 21,3 Kbp (3,3 Kbp und 18 Kbp),
auf dem sich das Glukoamylase-Gen von Arxula adeninivorans
befindet, wird mittels Restriktionsspaltungen näher charak
terisiert, um eine Restriktionskarte des Glukoamylase-Gens
zu erstellen. Die Fig. 2 und 3 zeigen Restriktionsspaltun
gen und eine graphische Darstellung des 5 Kbp große Apal-
PstI-DNS-Fragmentes.
Mit Hilfe der sogenannten "Pulsed Field"-Gel-Elektrophorese
(PFG) ist es möglich, die vier Chromosomen von Arxula
adeninivorans gel-elektrophoretisch voneinander zu trennen
(Kunze 1994, Smith), deren DNS auf Nitrozellulose zu über
führen und gegen das radioaktiv markierte DNS-Fragment mit
dem Glukoamylase-Gen zu hybridisieren (Bignell). Als Hybri
disierungstemperatur wurden im Laborversuch 52°C gewählt.
Hierbei zeigte es sich, daß das Glukoamylase-DNS-Fragment
mit dem Chromosom 2 (Molekulargewicht ca. 3,0 Mbp) hybridi
siert, was mit den früher (Büttner 1990) ermittelten Ergeb
nissen, die durch genetische Methoden erreicht wurden,
übereinstimmt (Fig. 4).
Gleichzeitig wurden innerhalb dieser Untersuchungen neben
dem Donorstamm Ls3 auch gel-elektrophoretisch aufgetrennte
Chromosomen der Arxula adeninivorans-Wildstämme CSIR 1136,
CSIR 1138, CSIR 1147, CSIR 1148, CSIR 1149 und CBS 8244
(Van der Walt) mit einbezogen. Dabei konnte gezeigt werden,
daß das Glukoamylase-Gen sich bei allen untersuchten 7
Wildstämmen auf dem Chromosom 2 befindet (Fig. 5).
Die Größe des Transkriptes kann mittels "Northern"-Hybridi
sierung festgestellt werden. Dazu wird (Stoltenburg) die
Gesamt-RNS sowie die RNS von den freien und den vom endo
plasmatischen Retikulum (ER) gebundenen Polysomen isoliert
und gegen die radioaktiv markierte Glukoamylase-DNS-Sonde
hybridisiert. Bei der sich anschließenden Autoradiographie
können sowohl bei der Gesamt-RNS als auch bei der RNS der
ER-gebundenen Polysomen Hybridisierungssignale nachgewiesen
werden.
Mit Hilfe dieser Hybridisierungssignale konnte im Laborver
such gezeigt werden, daß das Glukoamylase-Gen eine 2 Kbp
große mRNS transkribiert (Fig. 6). Hybridisierungssignale
bei der von den freien Polysomen isolierten RNS ließen sich
nicht nachweisen. Da bekannt ist, daß die Glukoamylase ein
sekretorisches Enzym ist, welches über das endoplasmatische
Retikulum und den Golgi- Apparat transportiert wird, muß
es an ER-gebundenen Polysomen translatiert werden, was mit
tels der beschriebenen "Northern"-Hybridisierungen bestä
tigt worden ist.
Die DNS-Sequenzierung kann mit Hilfe eines A. L. F. DNA
Sequencer (Fa. Pharmacia) durchgeführt werden. Man findet
die DNS-Sequenz sowohl des Glukoamylase-Gens als auch des
dazugehörigen Transkriptions-Promotors (Fig. 7).
In dem Promotor lassen sich je eine "TATA"-Box (Pos.-47)
und "CAAT"-Box (Pos. -81) identifizieren. Das eigentliche
Gen umfaßt vom Translationsstart (ATG) bis einschließlich
Stop-Codon 1875 Bp. Der sich daran anschließende Terminator
zeigt Homologien zu Consensus Sequenzen, die bei
Saccharomyces cerevisiae festgestellt wurden (ATAATTATAT).
Anhand dieser Nukleinsäuresequenz läßt sich die Aminosäure-
Sequenz ermitteln (Fig. 8). Sie setzt sich aus 624 Amino
säuren zusammen. Beim Vergleich mit den Aminosäure-Sequen
zen anderer Glukoamylase konnte nachgewiesen werden, daß
die Homologie zur Glukoamylase von Rhizopus oryzae 32,6%,
zu Saccharomycopsis fibuligera 23,1%, zu Aspergillus niger
22,1% und zu Saccharomyces diastaticus 15,4% beträgt
(Ashikari, Itoh, Boel, Yamashita).
Berechnet man anhand des Computerprogramms "P Signal" (PC
Gene der Fa. IntelliGenetics, Inc.) die für die Sekretion
der Glukoamylase verantwortliche Aminosäure-Sequenz, so
zeigt sich, daß sie die ersten 16 N-terminalen Aminosäuren
umfaßt.
Durch den Einbau des Glukoamylase-Gens unmittelbar hinter
den T7-Transkriptions-Promotor des Plasmides pET-12 (Fa.
Novagen, Inc) und anschließende Transformation in
Escherichia coli kann das Glukoamylase-Gen zu Expression
gebracht werden. Dazu muß mittels Mutagenese über eine PCR-
Reaktion unmittelbar vor das Startcodon (ATG) ein EcoRV und
an das 3'-Ende des Gens ein BamHI-Restriktionsort syntheti
siert werden (Fig. 9). Das erhaltene Plasmid wird in den
Escherichia coli-Stamm HMS 174 (Fa. Novagen,Inc.) transfor
miert und die erhaltenen Transformanten werden charakteri
siert (Hanahan).
Der Nachweis der Glukoamylase-Aktivität erfolgt nach einer
bereits bekannten Methode (Büttner 1987). Im Laborversuch
wurde weder intra- noch extrazellulär eine Glukoamylase-Ak
tivität gemessen.
Mit Hilfe der Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese können die
intra-und extrazellulären Proteine gel-elektrophoretisch
getrennt und anschließend mittels "Western Blot" gegen An
tikörper der Glukoamylase hybridisiert werden (Towbin)
(Fig. 10). Dabei kann man nachweisen, daß die Escherichia
coli-Transformanten ein ca. 70 kDa großes Protein syntheti
sieren, das nach der "Western Blot"-Analyse als
Glukoamylase identifiziert werden kann. So kann das aus
Arxula adeninivorans stammende Glukoamylase-Gen in
Escherichia coli zwar exprimiert werden, jedoch ohne eine
Glukoamylase-Aktivität aufzuweisen.
Dieses Ergebnis kann durch den Einbau des Glukoamylase-Gens
in andere Plasmide und anschließende Transformation in
Escherichia coli bestätigt werden.
Bei dem Test der Expression des Glukoamylase-Gens mittels
glukoamylase-eigenen Transkriptions-Promotors im Wirtssy
stem von Saccharomyces cerevisiae wird das Glukoamylase-Gen
mit Promotor in das Escherichia coli-Saccharomyces
cerevisiae-Hybridplasmid Ycp50 eingebaut und dieses Plasmid
(Ycp50-GAA) nach einer vorbeschriebenen Methode (Ito,
Dohmen) in einen Saccharomyces cerevisiae-Stamm SEY 6210 (α
leu2-3 leu2-112 ura3-52 his3-Δ 200 trpl-Δ 901 lys2-801
suc2-Δ 9GAL - S. Emr/USA) transformiert (Fig. 11). Die da
bei erhaltenen Transformanten weisen weder intra- noch ex
trazellulär eine Glukoamylase-Aktivität auf.
Das Glukoamylase-Gen kann auch mittels GAP-Promotor (Fa.
Ciba Geigy) in Saccharomyces cerevisiae zur Expression ge
bracht werden. Hierzu wird das unter Punkt 3 beschriebene
EcoRV-BamHI-DNS-Fragment mit dem Glukoamylase-Gen unmittel
bar hinter dem GAP-Promotor und vor dem PHO5-Terminator von
Saccharomyces cerevisiae in das Plasmid pJDB2O7-GAP (Kunze
1991) eingebaut. Das erhaltene Plasmid pYGAP-GAA kann in
einen Saccharomyces cerevisiae-Stamm SEY 6210 transformiert
und die erhaltenen Transformanten charakterisiert werden
(Ito, Dohmen) (Fig. 12).
In der Saccharomyces cerevisiae-Transformante SEY
6210/pYGAP-GAA kann Glukoamylase-Aktivität intra- und ex
trazellulär nachgewiesen werden. Die maximalen Konzentra
tionen an extrazellulärer Glukoamylase bei Verwendung eines
Hefe-Minimalmediums mit Maltose als Kohlenstoff-Quelle
(Tanaka) konnten im Laborversuch am Ende der log-Phase (55
Stunden) mit 1558 pkat/ml gemessen werden (Fig. 13). Bei
Verwendung anderer Kohlenstoff-Quellen (Glukose, Stärke)
waren geringere Aktivitäten an sekretorischer Glukoamylase
nachweisbar (Glukose - 980 pkat/ml, Stärke - 510 pkat/ml).
Allerdings muß dabei berücksichtigt werden, daß z. B. die
Saccharomyces cerevisiae-Transformante auf Stärke als ein
ziger Kohlenstoff-Quelle wachsen kann, hier jedoch in der
stationären Wachstumsphase der niedrigste Zelltiter er
reicht wird (Fig. 13).
Vergleiche der intra- und extrazellulären Glukoamylase-Ak
tivitäten zeigen, daß in der Saccharomyces cerevisiae-
Transformante SEY 6210/pYGAP-GAA stets mehr als 97% der
Glukoamylase-Aktivitäten extrazellulär nachweisbar sind.
Diese Werte sind vergleichbar mit den bei Arxula
adeninivorans Ls3 ermittelten (Tab. 1).
Analog zur der in der DD-Patentschrift 265 163 A1 beschrie
benen Verfahrensweise kann die in der Saccharomyces
cervisiae- Transformante SEY 6210/pYGAP-GAA synthetisierte
Glukoamylase biochemisch charakterisiert werden (Fig. 14).
Hierbei wird jedoch nunmehr mit ungereinigten Enzympräpara
ten, d. h. mit der abzentrifugierten Kulturflüssigkeit, ge
arbeitet. So liegt das pH-Optimum bei 4,0. Bei Verwendung
von Stärke als Substrat (Endkonzentration 1,25%) liegt das
Temperaturoptimum bei 50°C. Unter diesen Bedingungen ver
fügt die Glukoamylase über eine hohe Thermostabilität; nach
15 Min bei 50°C sind noch 95% der Ausgangsaktivität vorhan
den. Diese Werte sind mit denen der ungereinigten Enzymprä
parate von Arxula adeninivorans Ls3 identisch (pH-Optimum
4,0; Temperaturoptimum 50°C).
Ashikari T, Nakamura N, Tanaka Y, Kiuchi N (1986),
Agric. Biol. Chem. 50: 957-964 (Ashikari)
Bignell E, Evans K (1990) A.v.Leeuwenhoek 58: 49-55
(Bignell)
Boel H, Hjort I, Svensson B, Noriss F, Noriss KE, Fiil NB
(1984) EMBO J.3: 1097-1102 (Boel)
Büttner R, Bode R, Birnbaum D (1987) J. Basic Microbiol. 27:
299-308 (Büttner 1987)
Büttner R, Bode R, Samsonova IA, Birnbaum D (1990) J. Basic
Microbiol. 30: 227-231 (Büttner 1990)
Davis BJ, (1964) Ann.NY Acad.Sci.121, 404-427 (Davis)
De Mot R, Andries K, Verachtert H (1984)
Syst. Appl. Microbiol. 5: 106-118 (De Mot)
Dohmen RJ, Strasser AM, Höner CB, Hollenberg CP (1991)
Yeast 7: 691-692 (Dohmen)
Elion EA, Warner JR (1984) Cell 39: 663 (Elion)
Hanahan D (1983) J. Mol. Biol. 166: 557-580 (Hanahan)
Ito U, Fukada Y, Murata K, Kimura A (1983) J. Bacteriol. 153:
163-168 (Ito)
Itoh T, Ohtsuki I, Yamashita I, Fukui S (1987)
J. Bacteriol. 169: 4171-4176 (Itoh)
Kunze G, Schulz R, Barner A (1991) Proc. EBC Congr. 1991,
321-328 (Kunze 1991)
Kunze G, Kunze I. (1994) A.v.Leeuwenhoek 65: 29-34 (Kunze
1994)
McCann AK, Barnett JA (1986) Yeast 2: 109-115 (McCann)
Ornstein L (1964) Ann. NY Acad. Sci. 121, 321-349 (Ornstein)
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989) Molecular
Cloning. A Laboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (Sambrook)
Smith CL, Klco S. Cantor CR (1988) Pulsed Field Gel
Electrophoresis and technology of large DNA molecules. In:
Genome Analysis, A practical approach. (eds) Davis K,
Oxford IRL Press, 41-72 (Smith)
Stoltenburg R, Wartmann T, Kunze I, Kunze G (1994)
Anal. Biochem. (in Vorbereitung) (Stoltenburg)
Tanaka A, Ohnishi N, Fukui S (1967) J. Ferment. Technol. 45:
617-623 (Tanaka)
Towbin H, Staehelin T, Gordon J (1979) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 76, 4350-4354 (Towbin)
Van der Walt JP, Smith MT, Yamada Y (1990) A.v.Leeuwenhoek
57: 59-61 (Van der Walt)
Vihinen M, Mäntsälä P (1989) Crit. Biochem. Mol. Biol. 24: 329-
418 (Vihinen)
Yamashita I, Suzuki K, Fukui S (1985) J. Bacteriol. 161: 567-
573 (Yamashita)
Claims (2)
1. Verfahren zur Herstellung einer thermostabilen Glukoamylase unter
Verwendung eines Hefestammes der Art Sacharomyces cerevisiae,
dadurch gekennzeichnet, daß
ein geeignetes Gen für diese Glukoamylase aus einem Donorstamm der Art
Arxula adeninivorans isoliert und
in Sacharomyces cerevisiae zur Expression gebracht wird, so daß die
Glukoamylase mit der die Sekretion bestimmenden Teilsequenz aus den 16 (N-
terminalen) Aminosäuren MRQFLALAAAASIAVA beginnt, wobei das
Glukoamylase-Gen mittels eines Glukoamylase-Promotors exprimiert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß
die synthetisierte Glukoamylase unter Verwendung der abzentrifugierten
Kulturflüssigekit ungereinigt biochemisch charakterisiert wird.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19944425058 DE4425058C2 (de) | 1994-07-15 | 1994-07-15 | Verfahren zur Herstellung einer thermostabilen Glukoamylase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19944425058 DE4425058C2 (de) | 1994-07-15 | 1994-07-15 | Verfahren zur Herstellung einer thermostabilen Glukoamylase |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE4425058A1 DE4425058A1 (de) | 1996-01-18 |
| DE4425058C2 true DE4425058C2 (de) | 1999-02-18 |
Family
ID=6523265
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE19944425058 Expired - Fee Related DE4425058C2 (de) | 1994-07-15 | 1994-07-15 | Verfahren zur Herstellung einer thermostabilen Glukoamylase |
Country Status (1)
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Families Citing this family (4)
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|---|---|---|---|---|
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-
1994
- 1994-07-15 DE DE19944425058 patent/DE4425058C2/de not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| EP0260404A2 (de) * | 1986-08-21 | 1988-03-23 | VAN DEN BERG, Robert | Durch rekombinante DNS-Technologie konstruierte amylolytische enzymproduzierende Mikroorganismen und ihre Verwendung in Gärungsverfahren |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Derw. Abstr. 87-173694/25 * |
| Derw. Abstr. 92-223241/27 * |
Also Published As
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| DE4425058A1 (de) | 1996-01-18 |
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