-
Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine neue, physiologisch
aktive Substanz, Sulphostin, sowie auf ein Verfahren für deren
Herstellung und auf deren Verwendung. Die Verbindung gemäß der Erfindung
hemmt die Aktivität
der Dipeptidylpeptidase IV. Die Peptidylpeptidase IV, welche an
der Oberfläche
von T-Zellen auftritt, nimmt an der Aktivierung von T-Zellen teil
(Immunol. Today, 15, 180–184
(1994)) und spielt eine wichtige Rolle in dem Immunsystem. Dipeptidylpeptidase
IV ist auch mit dem Abbau eines Freisetzungshormons für ein Wachstumshormon
im Serum verbunden (J. Clin. Invest., 83, 1533–1540 (1989)). Von der Verbindung
gemäß der Erfindung
wird somit erwartet, dass sie als eine physiologisch aktive Substanz
für verschiedene
medizinische und pharmazeutische Zubereitungen verwendet werden
kann, wie Immunregulatoren, Hormonregulatoren, Anti-HIV-Arzneimittel,
antiallergischen Arzneimittel, Anti-Phlogistika, Anti-Rheumatika, etc.
-
Patent
Abstracts of Japan, Band 1996, Nr. 11, 29. November 1996 und
JP 08 176 157 offenbaren
Epostatin (C
23H
33N
3O
5), welches die
Dipeptidylpeptidase II wirksam hemmen kann und das bei der Kultur
eines spezifischen mikrobiellen Stammes (FERM P-14068), der zu der
Gattung Streptomyces gehört,
beobachtet wird.
-
Von
einigen Verbindungen, wie Diprotin A und B (J. of Antibiotics, 37,
422–425
(1984)), ist bekannt, dass sie physiologisch aktive Substanzen mit
einer die Dipeptidylpeptidase IV hemmenden Aktivität darstellen.
-
Diese
Verbindungen sind jedoch in ihrer hemmenden Aktivität gegen
das obige Enzym schwach und für
die Verwendung als eine physiologisch aktive Substanz in den obigen
medizinischen und pharmazeutischen Zubereitungen nicht ausreichend.
Somit wurde eine neue Verbindung, welche für die obigen Anwendungen geeignet
sind, erwartet.
-
Angesichts
der obigen Situation haben die Erfinder intensive Forschungen mit
mikrobiellen Metaboliten durchgeführt und im Ergebnis gefunden,
dass ein Stamm, der zu den Actinomyceten gehört, in der Lage ist, eine physiologisch
aktive Substanz, das Sulphostin, mit einer ausgezeichneten hemmenden
Aktivität
gegenüber
der Dipeptidylpeptidase IV zu produzieren. Die vorliegende Erfindung
wurde auf Basis dieses Ergebnisses gemacht.
-
Die
physiologisch aktive Substanz, das Sulphostin, gemäß der vorliegenden
Erfindung kann erzielt werden, indem ein Sulphostin produzierender
Mikroorganismus, der zu dem Stamm Streptomyces gehört, kultiviert
wird, dem Mikroorganismus erlaubt wird, die physiologisch aktive
Substanz herzustellen und im Kulturmedium anzureichern, und die
Substanz aus dem Kulturmedium geerntet wird.
-
1 zeigt
ein Infrarot-Absorptionsspektrum von Sulphostin, gemessen mit einer
Kaliumbromid-Tablette.
-
2 zeigt
ein Protonen-NMR-Spektrum von Sulphostin, gemessen in schwerem Wasser.
-
3 zeigt
ein Kohlenstoff-NMR-Spektrum von Sulphostin, gemessen in schwerem
Wasser.
-
4 zeigt
ein Phosphor-NMR-Spektrum von Sulphostin, gemessen in schwerem Wasser.
-
Ein
typisches Beispiel für
einen Mikroorganismus, der Sulphostin produziert, ist der Stamm
Streptomyces sp. MK251-43F3, der isoliert wurde aus der Erde bei
Hamo-machi, Sado-gun, Niigata-ken durch das Microbial Chemical Research
Institute im September 1994 (Dieser Stamm wurde hinterlegt bei und
akzeptiert von dem National Institute of Bioscience and Human-Technology
of the Agency of Industrial Science and Technology, 1–3, Higashi-1-chome,
Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305–8566,
Japan, am 6. Februar 1997 unter FERM BP-6571). Dieser Stamm ist
ein Beispiel für
solche Stämme,
die äußerst wirksam
gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet werden können.
Die mikrobiologischen und physiologischen Eigenschaften dieses Stammes
werden im Folgenden beschrieben.
-
1. Morphologische Eigenschaften
-
Der
MK251-43F3 Stamm verlängert
die Helix-bildenden Lufthyphen von den verzweigten Substrathyphen.
Ein reifes Sporenelement hat 10 bis 50 oder mehr ovale Sporen und
die Größe von einer
Spore beträgt etwa
0,6–0,8 μm × etwa 0,8–0,9 μm. Die Sporenoberfläche ist
stachelig oder kapillar. Es gibt keine quirlständige Hyphen und Rhizomorphe
in dem Mycel. Es gibt auch keine Sporangien oder bewegliche Sporen.
-
2. Wachstum in verschiedenen
Medientypen
-
Hinsichtlich
der Farbe der Kolonien auf dem Medium wird die Farbexpression gemäß „Color
Harmony Manual of Container Corporation of America" in Klammern als
Standardfarbe nach dem allgemeinen Farbnamen angegeben.
-
(1) Saccharose-Nitrat-Agarmedium (kultiviert
bei 27°C)
-
Weiße bis bräunlich-weiße (3ba,
Perlmutt) Lufthyphen haften dünn
an farblosen gewachsenen Kolonien. Kein lösliches Pigment wird gefunden.
-
(2) Glycerin-Asparagin-Agarmedium (ISP-Medium
5, kultiviert bei 27°C)
-
Das
Wachstum ist hellgelb (2cd, Elfenbeinfarbton). Eine Anhaftung der
Lufthyphen findet nicht statt. Kein lösliches Pigment wird zugelassen.
-
(3) Stärke-anorganisches
Salz-Agarmedium (ISP-Medium 4, kultiviert bei 27°C)
-
Weiße bis bräunlich-weiße Lufthyphen
haften leicht an einem farblosen bis hellgelblich-braunen (2gc, Bambus)
Wachstum. Kein lösliches
Pigment wird zugelassen.
-
(4) Tyrosin-Agarmedium (ISP-Medium 7,
kultiviert bei 27°C)
-
Das
Wachstum ist farblos bis hellgelb (2cb, Elfenbeinfarbton). Die Anhaftung
der Lufthyphen ist schlecht. Nach einer 3-wöchigen Kultur haften spärliche weiße Lufthyphen
nur partiell. Kein lösliches
Pigment wird zugelassen.
-
(5) Hefe-Malz-Luftmedium (ISP-Medium 2,
kultiviert bei 27°C)
-
Weiße Lufthyphen
haften leicht an dem farblosen bis hellgelben (2gc, Bambus) Wachstum.
Kein lösliches
Pigment wird zugelassen.
-
(6) Hafermehl-Agarmedium (ISP-Medium 3,
kultiviert bei 27°C)
-
Lufthyphen
in hellrosa (5ec, staubiger Pfirsich) haften an dem farblosen bis
hellgelben (2ca, Lt Elfenbein) Wachstum. Kein lösliches Pigment wird zugelassen.
-
3. Physiologische Eigenschaften
-
(1) Geeigneter Temperaturbereich für das Wachstum
-
Als
Ergebnis der Tests, die bei 10°C,
20°C, 24°C, 27°C, 30°C, 37°C und 50°C unter Verwendung
eines Hefe-Stärke-Agarmediums
(1% lösliche
Stärke;
0,2% Hefeextrakt und 2,4% Faseragar; pH 7,0) durchgeführt wurden,
wurde gefunden, dass die Kulturen bei allen getesteten Temperaturen
mit Ausnahme von 10°C
und 50°C
wuchsen. Die optimale Temperatur für das Wachstum scheint bei
etwa 30°C
zu liegen.
-
(2) Hydrolyse der Stärke (Stärke-anorganisches Salz-Agarmedium,
ISP Medium 4, kultiviert bei 27°C)
-
Die
Hydrolyse der Stärke
wurde etwa am fünften
Tag nach Kulturstart erkennbar. Die hydrolytische Wirkung war mittelstark.
-
(3) Wachstum eines Melanin-ähnlichen
Pigmentes (Trypton-Hefe-Nährlösung (ISP-Medium
1), Pepton-Hefe-Eisen-Agarmedium (ISP-Medium 6) und Tyrosin-Agarmedium
(ISP-Medium 7), jeweils bei 27°C
kultiviert)
-
- Negativ für
jedes Medium.
-
(4) Verwertung der Kohlenstoffquelle des
Pridham-Gottlieb-Agarmediums (ISP-Medium 9, kultiviert bei 27°C)
-
D-Glucose,
L-Arabinose, D-Yxlose, Rhamnose und Raffinose wurden für das Wachstum
verwendet. Inosit wird wahrscheinlich benutzt. D-Fructose, Saccharose
und D-Mannit werden nicht verwendet.
-
(5) Nitratreduktion (Peptonlösung, die
0,1% Kaliumnitrat enthält
(ISP-Medium 8),
kultiviert bei 27°C
-
Diese
Reduktionsreaktion ist negativ.
-
(6) Verflüssigung von Gelatine (15% einfaches
Gelatinemedium, kultiviert bei 20°C;
Glucose-Pepton-Gelatinemedium, kultiviert bei 27°C)
-
Im
Falle des einfachen 15% Gelatinemediums war das Wachstum bei 20°C schlecht
und es gab keine Notwendigkeit für
eine Wiederholung, da eine Verflüssigung
von Gelatine nicht beobachtet wurde. Im Falle des Glucose-Pepton-Gelatinemediums
begann die Verflüssigung
der Gelatine etwa am achtzehnten Tag nach Kulturstart, wobei aber
die Wirkung sehr schwach war. In diesem Fall jedoch besteht die
Notwendigkeit für
eine Wiederholungsprüfung.
-
(7) Koagulation und Peptonisierung von
Magermilch (Magermilchpulver, kultiviert bei 37°C)
-
Die
Peptonisierung beginnt ohne Koagulation etwa am zehnten Tag nach
Kulturstart. Die Wirkung ist schwach bis mittelstark.
-
Um
die obige Beschreibung der Eigenschaften zusammenzufassen sei erwähnt, dass
der MK251-43F3 Stamm die Helix-bildenden Lufthyphen aus den verzweigten
Substrathyphen verlängert
und jedes der reifen Sporenelemente 10 bis 50 ovalförmige Sporen
aufweist. Die Oberflächenkonfiguration
ist stachelig oder kapillar. Das Wachstum ist farblos oder hellgelb
in verschiedenen Medien.
-
Obgleich
die Lufthyphen in einigen Fällen
nicht haften, zeigte sich das Wachstum weiß bis bräunlich-weiß bis hellrosa in einigen Medien.
Es wurde kein lösliches
Pigment produziert. Die optimale Temperatur für das Wachstum lag bei etwa
30°C. Die
Bildung eines Melanin-ähnlichen
Pigmentes war negativ und die Hydrolysierbarkeit der Stärke war
mittelstark. Die proteolytische Fähigkeit war gering bis mittel,
obwohl hier die Notwendigkeit für
eine Überprüfung besteht.
Die 2,6-Diaminopimelinsäure,
die in der Zellwand enthalten war, besaß den LL-Typ. Die Mycelkomponente
Menachinon enthält
primär
MK-9 (H6) und enthält
auch MK-9 (H8).
-
Angesichts
dieser Eigenschaften wird von dem MK251-43F4 Stamm angenommen, dass
er zu der Gattung Streptomyces gehört. Die analogen Stämme, die
bereits isoliert wurden, umfassen Streptomyces flaveolus (Literatur:
International Journal of Systematic Bacteriology, Bd. 18, Seite
112 (1968) und Streptomyces fasiculatus (Literatur: International
Journal of Systematic Bacteriology, Bd. 18, Seite 108 (1968)). Die
zwei oben erwähnten,
konservierten Stämme
und der MK251-43F3 Stamm befinden sich nun unter einer Vergleichsstudie,
wobei aber zum jetzigen Zeitpunkt der MK251-43F3 Stamm Streptomyces
sp. MK251-43F3 genannt wird.
-
Der
MK251-43F3 Stamm wurde hinterlegt bei dem National Institute of
Bioscience and Human-Technology of the Agency of Industrial Science
and Technology, 1–3,
Higashi-1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, akzeptiert als FERM P-16065
am 6. Februar 1997 und zu der internationalen Hinterlegungsstelle
als FERM BP-6571 transferiert gemäß dem Budapester Vertrag über die
internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen
für die
Zwecke von Patentverfahren am 11. November 1998.
-
Der
gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendete Stamm, der zu der Gattung Streptomyces gehört, unterliegt
in seinen Eigenschaften Veränderungen,
wie dies auch bei anderen Streptomyces-Stämmen vorkommt. Der Stamm kann
zum Beispiel leicht durch artifizielle mutagene Mittel, wie die
Exposition von UV-Strahlen oder von Röntgenstrahlen oder durch die
Anwendung einer chemischen Substanz, mutagenisiert werden, wobei
jedoch alle Mutanten gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet werden können,
soweit sie die Fähigkeit
zur Produktion der physiologisch aktiven Substanz Sulphostin gemäß der vorliegenden
Erfindung besitzen.
-
Für die Produktion
von Sulphostin wird der Stamm zunächst in einem Medium aerob
kultiviert, welches die Nährstoffe
enthält,
die für
das Wachstum von Actinomyceten geeignet sind. Als Nährstoffe
können
diejenigen verwendet werden, die im Allgemeinen für die Kultur
von Actinomyceten benutzt werden. Als Kohlenstoffquelle können z.
B. Glucose, Fructose, Glycerin, Saccharose, Dextrin, Galactose,
organische Säuren,
etc. einzeln oder in Mischungen verwendet werden.
-
Als
anorganische und organische Stickstoffquellen können Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Harnstoff,
Ammoniumnitrat, Natriumnitrat, Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt,
Trockenhefe, Maisquellwasser, Sojamehl, Ölkuchen von Baumwollsamen,
Caseinhydrolysat, Bactosoyton, lösliche
pflanzliche Proteine, Hafermehl und ähnliches einzeln oder in Mischungen
verwendet werden.
-
Falls
notwendig, können
organische Salze dem Medium hinzugesetzt werden, wie Natriumchlorid, Calciumcarbonat,
Magnesiumsulfat, Kupfersulfat, Eisensulfat, Zinksulfat, Manganchlorid,
Phosphate, etc. Es ist auch möglich
organische Substanzen dem Medium in geeigneter Weise hinzuzufügen, wie
Aminosäuren, Vitamine,
Nukleinsäuren,
etc. und/oder anorganische Substanzen.
-
Für die Kultivierung
ist die Flüssigkultur,
insbesondere die „Deep
Spinner Culture",
am Besten nach der Erfindung geeignet. Es ist bevorzugt, die Kultur
bei einem leicht sauren bis leicht alkalischen pH und bei 20 bis
45°C durchzuführen.
-
Im
Falle einer Flüssigkultur
wird Sulphostin produziert und akkumuliert in dem Medium nach etwa
drei bis acht Kulturtagen. Wenn die Produktion von Sulphostin in
den Kulturen das Maximum erreicht hat, wird die Kultur gestoppt,
die Zellen und das Kulturmedium werden dann durch Filtration getrennt
und die Zielsubstanz wird aus den Zellen isoliert und gereinigt.
Für die
Isolierung und Reinigung der Zielsubstanz aus den Zellen können bekannte
Trenn- und Reinigungsverfahren verwendet werden, die allgemein für die Isolierung
von mikrobiellen Metaboliten aus Zellen in der Kultur benutzt werden.
-
Zum
Beispiel wird das verwendete Medium (15 Liter) in das Filtrat und
die Zellen durch ein gewöhnliches
Filtrationsverfahren aufgetrennt. Das erzielte Filtrat wird entlüftet und
für 2 Stunden
mit Aktivkohle gerührt,
welche mit Wasser ins Gleichgewicht gebracht wurde. Die Mischung
wird einem gewöhnlichen
Filtrationsverfahren unterworfen, um die nicht an die Aktivkohle
adsorbierte Fraktion zu gewinnen. Diese Fraktion wird unter reduziertem
Druck konzentriert, in zehn Äquivalenten
Ethanol suspendiert und filtriert, um eine Ethanol-unlösliche Fraktion
zu erzielen. Diese Ethanol-unlösliche Fraktion
wird weiter mit Methanol gewaschen und unter reduziertem Druck zur
Trockenheit verdampft, um eine Methanol-unlösliche Fraktion zu erzielen.
-
Die
Methanol-unlösliche
Fraktion wird einer mikrokristallinen Zellulose-Säulenchromatographie
(Funacel, hergestellt von Funakoshi Ltd.) mit einem Laufmittel von
n-Butanol, Essigsäure
und Wasser (2:1:1) unterworfen, um eine aktive Fraktion zu erzielen.
Diese aktive Fraktion wird bis zur Trockenheit unter reduziertem Druck
verdunstet, lyophilisiert und dann einer weiteren mikrokristallinen
Zellulose-Säulenchromatographie
mit einem Laufmittel von n-Butanol, Essigsäure und Wasser (3:1:1) unterworfen,
um eine aktive Fraktion zu erzielen. Diese aktive Fraktion wird
unter reduziertem Druck bis zur Trockenheit eingedampft und lyophilisiert,
um ein Rohmaterial zu erzielen. Dieses Rohmaterial wird in einer
0,2 N Ammoniumbicarbonat-Lösung gelöst und einer
DEAE Sephadex A-25 Säulenchromatographie
(Pharmacia) unterworfen, welche mit einer 0,2 N Ammoniumbicarbonat-Lösung entwickelt wird, um eine
aktive Fraktion zu erzielen. Diese aktive Fraktion wird bis zur Trockenheit
unter reduziertem Druck eingedampft, lyophilisiert, in einer 0,03
N Ammoniumbicarbonat-Lösung gelöst und einer
Hochdruckflüssigkeitschromatographie
(Pharmacia) unterworfen unter Verwendung von SHODEX IEC DEAE-825
Säulen,
welche mit einer 0,03 N Ammoniumbicarbonat-Lösung entwickelt werden, um
Sulphostin (0,5 mg) zu erzielen.
-
Die
physikochemischen Eigenschaften der so erzielten, physiologisch
aktiven Substanz, das Sulphostin, werden im Folgenden dargelegt.
- 1) Aussehen: weißes Pulver
- 2) Molekulargewicht: 272
- 3) Summenformel: C5H13N4O5SP
- 4) Löslichkeit:
Löslich
in Wasser und unlöslich
in niederem Alkohol, Aceton, Ethylacetat, Hexan und Petrolether.
- 5) Rf-Wert, gemessen durch Kieselgel-Dünnschichtchromatographie: 0,28
mit einem Entwicklungslösungsmittel
von n-Butanol, Essigsäure
und Wasser (2:1:1).
- 6) UV-Absorptionsspektrum: eine terminale Absorption wird gezeigt.
- 7) Infrarot-Absorptionsspektrum: gezeigt in der 1 (gemessen
in einer Kaliumbromidtablette). Die folgenden spezifischen Absorptionsbanden
(cm–1)
sind dargestellt: 3510, 3355, 3250, 1672, 1658, 1624, 1545, 1365,
1308, 1240, 1188, 1130, 1064 und 922.
- 8) Protonen-NMR-Spektrum: gezeigt in der 2 (gemessen
in schwerem Wasser). Die folgenden Signale δ (ppm) sind dargestellt: 4,18
(1H, dd, J = 6,8; 12,0 Hz), 3,82 (1H, tdd, J = 5,1; 7,3; 13,0 Hz),
3,70 (2H, tdd, J = 5,1; 6,7; 13,0 Hz), 2,39-2,44 (1H, m), 2,102,28
(1H, m) und 1,89-2,03 (2H, m).
- 9) Kohlenstoff-13-NMR-Spektrum: Gezeigt in der 3 (gemessen
in schwerem Wasser). Die folgenden Signale δ (ppm) sind dargestellt: 20,5;
24,2; 45,4; 51,3 und 172,4.
- 10) Phosphor-NMR-Spektrum: Gezeigt in der 4 (gemessen
in schwerem Wasser). Das folgende Signal δ (ppm) wird dargestellt: 6,01.
- 11) Spezifische Rotation: [α]D 28 –21,5° (c: 0,52;
H2O).
- 12) Schmelzpunkt: 203–208°C (Zersetzung).
- 13) Farbreaktion: Positiv auf Ninhydrin-Reaktion und Rydon-Smith-Reaktion.
-
Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Herstellung
von Sulphostin, welches das Kultivieren von MK251-43F3 (FERM-BP6571),
das Produzieren und Akkumulieren von Sulphostin in der Kultur und
das Ernten von Sulphostin aus der Kultur umfasst.
-
Ferner
umfasst die Erfindung einen Dipeptidylpeptidase IV Inhibitor, der
Sulphostin als einen Wirkstoff umfasst.
-
Eine
Arzneimittelzusammensetzung, die Sulphostin umfasst ist auch von
der Erfindung erfasst sowie der Stamm MK251-43F3 (FERM BP6571).
-
Bei
der Verwendung der vorliegenden Substanz für Arzneimittel und Pharmazeutika
können
konventionelle Verfahren für
die Herstellung und Verabreichung von solchen Arzneimitteln und
Pharmazeutika verwendet werden. Zum Beispiel können diese durch Injektion
oder durch orale oder rektale Applikation verabreicht werden. Die
Zubereitungsformen umfassen Injektionen, Pulver, Körner, Tabletten,
Zäpfchen,
etc.
-
Verschiedene
Arten von Hilfsmitteln, die bei Arzneimitteln und Pharmazeutika
verwendet werden, nämlich
Träger
und andere Zusatzmittel, wie Stabilisatoren, Antiseptika, schmerzlindernde
Mittel, Emulgatoren, etc., können
enthalten sein, soweit sie keinen nachteiligen Effekt auf das Sulphostin
in der Zubereitung der Arzneimittel und Pharmazeutika besitzen.
Der Sulphostingehalt der Zubereitungen kann über einen weiten Bereich in
Abhängigkeit
von der Zubereitungsform und von anderen Faktoren variieren, wobei
aber allgemein die Zubereitung 0,01 bis 100 Gewichtsprozent, vorzugsweise
1 bis 70 Gewichtsprozent, Sulphostin enthält und der restliche Anteil
Trägerstoffe
und andere Hilfsmittel umfasst, die im Allgemeinen für Arzneimittel
und Pharmazeutika verwendet werden.
-
Die
Dosierung von Sulphostin beträgt
etwa 0,01 bis 800 mg pro Tag für
eine erwachsene Person, obgleich dies in Abhängigkeit von dem Krankheitszustand
und anderen Faktoren variabel sein kann. Wo eine kontinuierliche
Verabreichung notwendig ist, ist eine tägliche Dosis wünschenswert.
-
Die
Dipeptidylpeptidase IV-Hemmwirkung von Sulphostin wird im Folgenden
unter Bezug auf die Testbeispiele beschrieben.
-
Testbeispiel 1: Messung der Dipeptidylpeptidase
IV-Aktivität
-
Die
Messung, wie unten beschrieben, wurde gemäß der Literatur durchgeführt (Biochem.
Biophys. Acta, 258, 591–599
(1972)). Die vorliegende Substanz wurde zu 0,025 ml von 3,2 mM Glycyl-propyl-β-naphthylamid
(Bachem, Schweiz) und 0,1 ml von 0,1 M Tris-Maleatpuffer (pH 7,2)
zugegeben und dann wurde Wasser zugesetzt, um ein Endvolumen von
0,2 ml zu erzielen, wodurch eine gemischte Lösung hergestellt wurde. Diese
gemischte Lösung
wurde für
10 Minuten auf 37°C
erwärmt.
0,025 ml einer Dipeptidylpeptidase IV Lösung, die partiell durch Ammoniumsulfat-Fraktionierung aus
einem Homogenat der Rattenniere gereinigt worden war, wurden der
obigen gemischten Lösung
zugesetzt und reagierte bei 37°C
für 1 Stunde.
Zu dieser Lösung wurden
0,1 ml eines 0,5 M Natriumcitratpuffers (pH 3,78), der 10% Polyoxyethylen-sorbitan-monolaurat
enthielt (Menge an zugesetztem Ethylenoxid: 20 Mol), und 0,2% eines
ersten Granat-GBC-Salzes
(Sigma Inc., USA) zugesetzt, um die Reaktion zu stoppen. Die Extinktion
(a) bei 525 nm wurde gemessen. Die Absorption (b) einer Kontrollprobe,
welche die vorliegende Substanz nicht enthielt, sondern nur den
obigen Puffer, wurde auch gemessen. Die Dipeptidylpeptidase IV-Hemmrate wurde berechnet
aus der Formel: [(b – a)/b] × 100. Die Werte
der hemmenden Wirkung der Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung
auf die Dipeptidylpeptidase IV wurde bei verschiedenen Konzentrationen
mit dem oben beschriebenen Verfahren bestimmt und sind in der Tabelle
1 gezeigt. Tabelle 1
| Konzentration
(μg/ml) | Hemmrate
% |
| 0,0025 | 23 |
| 0,005 | 42 |
| 0,01 | 54 |
| 0,02 | 67 |
| 0,05 | 82 |
-
Wie
oben gezeigt, zeigt Sulphostin eine starke Hemmwirkung gegen die
Peptidylpeptidase IV. Der IC50-Wert ist
0,0082 μg/ml.
-
Die
neue, physiologisch aktive Substanz, Sulphostin, gemäß der vorliegenden
Erfindung kann für
medizinische und pharmazeutische Zubereitungen verwendet werden,
wie Immunregulatoren, Hormonregulatoren, Anti-HIV-Arzneimittel,
Anti-Allergika, entzündungshemmende
Arzneimittel, Anti-Rheumatika, etc.