DE3785658T2 - Methoden und zusammensetzungen fuer tests mit nukleinsaeuresonden. - Google Patents
Methoden und zusammensetzungen fuer tests mit nukleinsaeuresonden.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren für Tests mit Nukleinsäuresonden und Zusammensetzungen für eine Anwendung dabei.
- Insbesondere betrifft die Erfindung solche Verfahren, worin ein Nukleinsäure-Zielanalyt in einer getesteten Probe durch Hybridisierung mit einer ersten Sonde, die an einen festen Träger gebunden ist, aus der Lösung eingefangen wird. Unter diesen Verfahren sind Sandwichtestverfahren, worin die Zielsubstanz mittels einer zweiten Sonde nachgewiesen wird, die zum Nachweis markiert ist und die mit einem Segment des Zielanalyten hybridisiert, das von dem mit der ersten Sonde hybridisierenden Segment verschieden ist.
- Bei den die vorliegende Erfindung betreffenden Testverfahren sind die an den festen Träger gebundenen Sonden Oligonukleotide mit zwischen etwa 15 und etwa 100 Basen.
- Nukleinsäuresondentests zur Untersuchung einer Probe auf die Anwesenheit eines bestimmten Nukleinsäure-Analyten und die Anwendung solcher Tests für die Diagnose von Krankheiten von Tieren und Pflanzen, für die Untersuchung von Blut, Nahrungsmitteln und anderen Produkten auf virale oder mikrobielle Kontaminierung, für die Isolierung, Charakterisierung und Manipulation von Genen und Mikroorganismen und für andere Zwecke sind wohlbekannt. Siehe z.B. Meinkoth und Wahl, Anal. Biochem. 138, 267-284 (1984), Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1982), Owens und Diener, U.S.-Patent Nr. 4,480,040 und Falkow und Moseley, U.S.-Patent Nr. 4,358,535.
- Unter den Nukleinsäuresondentests sind oben beschriebene "Sandwichtests". Es wurde festgestellt, daß der Einfangschritt in einem Sandwichtest vor dem Markierungsschritt durchgeführt werden kann oder daß der Einfang und die Markierung gleichzeitig durchgeführt werden können. Siehe z.B. Langdale und Malcolm, Gene 36, 201-210 (1985), Ranki et al., Gene 21, 77-85 (1983), Dunn und Hassell, Cell 12, 23-36 (1977), Ranki und Soderlund, U.S.-Patente Nr. 4,486,539 und 4,563,419.
- Sanwichassaymethoden haben den Vorteil, daß die Nukleinsäure einer untersuchten Probe nicht direkt an einen festen Träger immobilisiert werden muß. Stattdessen wird eine Fängersonde, wie etwa in US-A-4486539 beschrieben, an den festen Träger immobilisiert, und dies kann durch einen Lieferanten anstelle der tatsächlich den Test durchführenden Person erfolgen. Sandwichtests bieten auch, weil sie zwei Hybridisierungen mit dem Analyten beinhalten, die Aussicht auf eine höhere Spezifität als Nicht-Sandwichtests, welche eine Hybridisierung einer einzigen markierten Sonde mit dem Analyten umfassen.
- Die Verwendung kurzer Oligonukleotide mit weniger als etwa 100 Nukleotiden als Sonden in Nukleinsäuresondentests bringt ebenfalls bestimmte Vorteile. Die zur Hybridisierung zwischen Sonde und Analyt erforderliche Zeit ist bei kurzen Sonden geringer. Mit der gegenwärtigen Technologie für eine chemische Synthese und Reinigung können einzelsträngige Oligonukleotide von bis zu etwa 100 Nukleotiden in einer definierten Sequenz in hochreiner Form in ausreichender Menge und mit ausreichender Geschwindigkeit für eine Routineanwendung in Tests hergestellt werden. Solche Präparationen sind einfacher, ergeben eine Sonde von höherer Qualität für Sensitivitäts- und Spezifitätszwecke in Nukleinsäuresondentests und sind meist kostengünstiger als Präparationen von längeren Sonden, bei denen man, um kostengünstig zu sein, biologische Verfahren verwenden muß (z.B. Klonierung).
- Eine Sandwichtestmethode, in der die an die feste Phase gebundene "Fängersonde" weniger als etwa 200 Basen aufweist, ist in EP-A-0070687 beschrieben.
- Es sind verschiedene Methoden zum Fixieren einzelsträngiger Nukleinsäuren an feste Träger beschrieben worden, für die Affinitätschromatographie, worin eine Hybridisierung zwischen Nukleinsäuren mit komplementären Sequenzen eine Trennung bewirkt, und für Nukleinsäuresondentests, einschließlich Sandwichtests. Siehe z.B. Langdale und Malcolm, supra, Brunemann und Westhoff, Meth. Enzym. 100, 400-407 (1983), Brunemann, Nucl. Acids Res. 10, 7181-7196 (1982), Brunemann et al., Nucl. Acids Res. 10, 7163-7180 (1982), Clerici et al., Nucl. Acids Res. 6, 247-258 (1979). In US-A-4419444 wird allgemein die Anlagerung organischer Verbindungen an feste Träger über den Hydroxylsauerstoff einer Kohlehydratgruppierung beschrieben. Die Anlagerung von Nukleinsäuren an Aminoderivatisierte und Carboxyl-derivatisierte feste Träger, insbesondere eine solche Anlagerung, worin mindestens etwa 30 % der Nukleinsäuresondenpräparation kovalent nur durch einen Hydroxylsauerstoff einer terminalen Deoxyribose- oder Ribosegruppierung gebunden werden, ist jedoch nicht beschrieben.
- Die vorliegende Erfindung betrifft die Nutzung der Vorteile von sowohl Sandwichtests als auch der Verwendung kurzer Oligonukleotide mit weniger als etwa 100 Basen als Sonden in den Tests.
- Es wurden feste Träger entdeckt, die besonders gut zur Verwendung in Nukleinsäuresonden-Sandwichtests geeignet sind, wobei man ein Oligonukleotid mit 15 bis 100 Basen verwendet, um einen Nukleinsäureanalyten aus einer Hybridisierungslösung einzufangen. Die erfindungsgemäßen festen Träger sind durch einen hohen Anteil (typischerweise mindestens etwa 30 %) von gebundener Oligonukleotid-"Fängersonde" gekennzeichnet, die an den Träger kovalent nur durch einen Linker gebunden ist, der kovalent mit dem Träger und dem 5'-Sauerstoff des 5'- terminalen Nukleosids oder dem 3'-Sauerstoff des 3'-terminalen Nukleosids des Oligonukleosids des Oligonukleotids verknüpft ist und dadurch vollständig zum Einfangen eines Analyten verfügbar ist, anstelle mit dem Träger auf eine Weise assoziiert zu sein, wodurch eine Verfügbarkeit zum Einfangen eines Analyten erheblich verringert oder sogar beseitigt würde, wie etwa durch nicht-kovalente Assoziierung oder kovalente Bindung über eine reaktive Basengruppierung.
- Die erfindungsgemäßen festen Träger sind (1) makroporiges quervernetztes Dextran, poröses Silikatglas, Polystyrol oder Latex, derivatisiert mit einem aminoterminierten Linker, wobei terminale Aminogruppen von Linkergruppierungen kovalent über eine Phosphoramidatgruppe mit dem terminalen Nukleosid der Oligonukleotid-Fängersonde verknüpft sind und wobei im wesentlichen alle Aminogruppen, die nicht über eine Phosphoramidatgruppe mit dem terminalen Nukleosid der Oligonukleotid-Fängersonde verknüpft sind, durch eine Acylgruppe von einer unspezifischen Wechselwirkung mit dem Oligonukleotid blockiert sind, (2) makroporiges quervernetztes Dextran, das nach Bromcyan-Aktivierung mit der Aminogruppe der Aminoalkylphosphoramidatgruppe umgesetzt wird, die an ein terminales Nukleosid einer Oligonukleotid-Fängersonde derivatisiert wurde, um das quervernetzte Dextran mit der Sonde kovalent zu derivatisieren, (3) makroporiges quervernetztes Dextran, poröses Silikatglas, Polystyrol oder Latex, derivatisiert mit einem Carboxyl-terminierten oder Aktivester-terminierten Linker, wobei ein Anteil der Carboxylgruppen in einer Amidbindung mit einer Aininogruppe einer Diaminoalkyl- oder Diaminoalkyldisulfid-(wie etwa Cystaminyl)-Linkergruppierung verknüpft ist, deren andere Aminogruppe ein Teil eines Phosphoramidats ist, das wiederum direkt mit dem terminalen Nukleosid der Oligonukleotid-Fängersonde verknüpft ist und (4) quervernetztes Dextran, poröses Silikatglas, Latex oder Polystyrol, derivatisiert mit einem Sulfhydryl-terminierten Linker, wobei ein Anteil der Sulfhydrylgruppen in einer Disulfidbindung mit einem Schwefel eines Linkers verknüpft sind, der ein aktiviertes Disulfid (aktiviert z.B. mit 2- Pyridyl oder 4-Pyridyl) an einem Ende und eine Aminogruppe am anderen aufweist, wobei die Aminogruppe einen Teil eines Phosphoramidats bildet, das direkt mit einem terminalen Nukleosid der Sonde verknüpft ist, wobei die Disulfidbindung von einem Disulfidaustausch zwischen der Sulfhydrylgruppe, die an das Dextran, das Silikat, den Latex oder das Polystyrol derivatisiert ist, und dem aktivierten Disulfid des mit der Sonde verknüpften Linkers stammt.
- Die bevorzugten Trägermaterialien, mit denen die erfindungsgemäßen festen Träger hergestellt werden, sind mit langkettigem Alkylamin derivatisiertes und Carboxyl-derivatisiertes Glas mit kontrollierten Poren, wie es von Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA unter den Produktnummern 24875 bzw. 23735 in Form von Körnern mit einem nominellen Porendurchmesser von 0,05 um (500 Angström) und Teilchendurchmessern zwischen etwa 125 und 177 um (Micron) vertrieben wird, und das makroporige quervernetzte Dextranmaterial Sephacryl S-500, das von Pharmacia Inc., Piscataway, New Jersey, USA unter Code Nr. 17-0475-01 in Form von Körnern mit einem Naßdurchmesser von etwa 40 bis etwa 105 um (Micron) und einem Ausschlußvolumen für Dextrane eines Molekulargewichts über etwa 2 x 10&sup7; Dalton vertrieben wird, wobei das wie im folgenden beschrieben modifizierte Sephacryl mit Bromcyan oder mit einem Amino-terminierten, Carboxyl-terminierten oder Aktivester-terminierten Linker derivatisiert wird.
- Reaktionen der bevorzugten Trägermaterialien mit den bevorzugten Fängersonden, bei denen es sich um modifizierte Sonden handelt, an deren 5'-Enden eine geeignete Linkergruppierung gebunden ist, sind im folgenden beschrieben.
- Neue und vorteilhafte erfindungsgemäße Sandwichtestmethoden beruhen auf der Entdeckung verschiedener überraschender Eigenschaften von erfindungsgemäßen festen Trägern, die mit der Performance der Träger in auf verschiedene Arten durchgeführten Sandwichtests in Beziehung stehen.
- Aus dem Stand der Technik ist bekannt, daß Vorhybridisierung eines festen Trägers (z.B. eines Nitrocellulosefilters), an den ein Nukleinsäure-Zielanalyt gebunden worden ist, mit einer nicht-homologen (manchmal hier als "inert bezeichneten) Nukleinsäure (wie etwa gescherte Lachssperma- oder Heringssperma-DNA oder gekochte tRNA, die nicht zum Nachweis markiert ist und die eine geringe Sequenzhomologie zum Nukleinsäure-Zielanalyten besitzt), die sich in einer Lösung befindet, die mit dem festen Träger unter Hybridisierungsbedingungen zum Zwecke einer Hybridisierung der Ziel-Nukleinsäure auf dem Träger mit einer Nukleinsäuresonde in der Lösung inkubiert wird, unspezifische Sondenbindung reduziert und daher das Hintergrundsignal verringert. Siehe z.B. Maniatis et al., supra und US-A-4302204. Im Stand der Technik wird nicht vorgeschlagen, daß Vorhybridisierung eines mit einem Oligonukleotid derivatisierten festen Trägers mit einer nicht-homologen Nukleinsäure die Wirksamkeit des Einfangs einer Nukleinsäure mit komplementärer Sequenz durch das Oligonukleotid während der Hybridisierung erhöht. Wir haben völlig überraschend festgestellt, daß Vorhybridisierung eines erfindungsgemäßen festen Trägers mit einer nicht-homologen Nukleinsäure die Wirksamkeit des Einfangs eines Zielanalyten während der Hybridisierung mit einer die Zielsubstanz enthaltenden Lösung nahezu verdoppelt.
- Weiterhin ist aus dem Stand der Technik bekannt, daß der Zusatz von Dextransulfat in Hybridisierungslösungen, in denen ein kurzes (weniger als 100 Nukleotide langes) Oligonukleotid vorhanden ist, keinen Einfluß auf die Wirksamkeit besitzt, mit der Hybridisierung zwischen dem Oligonukleotid und einer Nukleinsäure mit einer zu der des Oligonukleotids komplementären Sequenz auftritt. Im Gegensatz dazu haben wir überraschend festgestellt, daß die Einfangwirksamkeit von an erfindungsgemäße feste Träger gebundenen Oligonukleotiden mit zwischen etwa 5 % (Gew./Vol.) und 20 % (Gew./Vol.), vorzugsweise etwa 9 % (Gew./Vol.) bis etwa 11 % (Gew./Vol.) Dextransulfat in der Hybridisierungslösung merkbar erhöht wird, wenn der Analyt lang, d.h. mehr als etwa 500 Basen ist. Wir haben ebenfalls festgestellt, daß Dextransulfat in diesem Konzentrationsbereich in einer Vorhybridisierungslösung sogar unter Ausschluß nicht-homologer DNA die Einfangwirksamkeit erhöht.
- Wir haben jedoch festgestellt, daß bei einem erheblich kürzeren Analyten (etwa 30 Basen) Dextransulfat keinen Einfluß auf die Einfangwirksamkeit besitzt. Weiterhin haben wir festgestellt, daß der Einfluß, den Dextransulfat auf die Einfangwirksamkeit bei einem langen Analyten besitzt, nicht wie der Stand der Technik vermuten lassen würde, ein Volumen-Ausschlußeffekt ist, da Polyethylenglykol einen sehr geringeren Einfluß auf die Einfangwirksamkeit besitzt. Die Basis des vorteilhaften Einflusses, den wir für Dextransulfat auf die Einfangwirksamkeit durch erfindungsgemäße feste Träger gefunden haben, bleibt unklar, obwohl er mit der Ladung in Beziehung stehen kann.
- Wir haben auch überraschenderweise entdeckt, daß Ergebnisse (d.h. die bezüglich des Hintergrunds korrigierte Signalintensität einer markierten, mit dem Analyten hybridisierten Sonde, die über eine Fängersonde an Körner gebunden ist), die mit einem Sandwichassay erhalten werden, worin Einfang des Analyten und Hybridisierung der markierten Sonde mit dem Analyten gleichzeitig erfolgen, im wesentlichen gleich wie bei einem Sandwichtest sind, worin der Analyt zuerst in einem nennenswerten Ausmaß mit markierter Sonde in Lösung hybridisiert wird und wo dann ein Einfang des Analyten, der vollständig oder teilweise mit markierter Sonde komplexiert ist, erfolgt. Die Ergebnisse, die erhalten werden, wenn der Einfangsschritt vor dem Hybridisierungsschritt mit markierter Sonde durchgeführt wird, sind erheblich schlechter als bei den anderen beiden Prozeduren, vermutlich weil der an Körner gebundene Analyt weniger leicht für eine Bindung durch eine markierte Sonde in Lösung zugänglich ist.
- Schließlich wurde eine Anzahl von Oligonukleotiden, die in der folgenden Tabelle I aufgelistet sind, aus der von Ratner et al., Nature 313, 277-284 (1985) zur Verfügung gestellten Sequenz als geeignet zur Anwendung als Sonden in Nukleinsäuresonden-Hybridisierungstests identifiziert, einschließlich erfindungsgemäßen Tests auf HIV-1, dem Erreger von AIDS. Insbesondere wurde festgestellt, daß die Oligonukleotide unter Stringenzbedingungen, die denjenigen in Tests gemäß vorliegender Erfindung verwendeten vergleichbar sind, an das HIV-1-Genom (eine RNA, die als provirale DNA in das Genom infizierter Zellen integriert) oder an ein Fragment davon, aber nicht an menschliche, E.coli oder pBR322-DNA in Southern-Hybridisierungen hybridisiert. Tabelle I Oligo
- Jedes der Oligonukleotide kann eine DNA oder eine RNA sein, obwohl DNAs bei den Tests verwendet wurden. Natürlich bedeuten die T's in den oben spezifizierten Sequenzen für die Oligonukleotide, die RNAs sind, Uridin-Reste.
- In Fällen, wenn der nachzuweisende Analyt provirale HIV-1-DNA aus infizierten Lymphozyten oder von HIV-1-RNA revers transkribierte DNA ist, eignen sich auch Oligos mit Sequenzen, die zu denen der in Tabelle I aufgelisteten Oligos komplementär sind, ebenfalls für Sonden.
- In einem ihrer Gesichtspunkte ist die vorliegende Erfindung ein fester Träger mit einer daran gebundenen einzelsträngigen Oligonukleotidsonde von 15 bis 100 Basen, die ausgewählt ist aus
- (A) porösem Silikatglas, das an Siliciumatomen derivatisiert ist mit
- (1) Gruppen der Formel
- -(CH&sub2;)n(NH)(CO)(CH&sub2;)cR&sub1; und
- -(CH&sub2;)n(NH)(PO&sub2;)O-(Oligo),
- wobei im wesentlichen kein Silicium mit einer Gruppe derivatisiert ist, die mit einer Aminogruppe endet, worin c 0 bis 5 ist, n 2 bis 8 ist, R&sub1; Methyl oder Benzyl ist, -O-(Oligo) die Oligonukleotidsonde ist und das mit (Oligo) verknüpfte Sauerstoffatom der 5'-Sauerstoff des 5'-Nukleosids oder der 3'- Sauerstoff des 3'-Nukleosids der Sonde ist, oder
- (2) Gruppen der Formel
- -L&sub1;-CO&sub2;H und
- (i) -L&sub1;-(CO)(NH)(CH&sub2;)pNH(PO&sub2;)O-(Oligo) oder
- (ii) -L&sub1;-(CO)(NH)(CH&sub2;)pSS(CH&sub2;)rNH(PO&sub2;)O-(Oligo),
- worin -L&sub1; -(CH&sub2;)n(NH)(CC)(CH&sub2;)m- ist, worin die Gruppe -(CH&sub2;)n mit einem Siliciumatom verknüpft ist und worin m, n, p und r gleich oder verschieden und jeweils 2 bis 8 sind, oder
- (3) Gruppen der Formel
- und
- (B) einem quervernetzten, makroporigen Dextranmaterial, das an Hydroxyl-Sauerstoffatomen, die sich an Kohlenstoffatomen der Zuckergruppierungen befinden, die mindestens ein benachbartes Kohlenstoffatom mit einem nicht-derivatisierten Hydroxyl aufweisen, derivatisiert ist mit
- (1) Gruppen der Formel
- -C(=NH)NH(CH&sub2;)q(NH)(CO)(CH&sub2;)cR&sub1; und
- -C(=NH)NH(CH&sub2;)q(NH)(CO)(CH&sub2;)pNH(PO&sub2;)O-(Oligo),
- wobei im wesentlichen kein Hydroxyl-Sauerstoffatom mit einer Gruppe derivatisiert ist, die mit einer Aminogruppe endet, oder
- (2) einer Gruppe der Formel
- -C(=NH)NH(CH&sub2;)p(NH)(PO&sub2;)O-(Oligo) oder
- (3) Gruppen der Formel
- -C(=NH)NH(CH&sub2;)qCO&sub2;H und
- (i) L&sub2;-NH(PO&sub2;)O-(Oligo), oder
- (ii) L&sub2;-SS(CH&sub2;)rNH(PO&sub2;)O-(Oligo),
- worin c, q, p und r gleich oder verschieden sind und q 2 bis 10 ist und worin L&sub2;
- -C(=NH)NH(CH&sub2;)q(CO)(NH)(CH&sub2;)p-
- ist, worin die -C(=NH)-Gruppe mit einem Hydroxyl-Sauerstoff des Dextrans verknüpft ist oder
- (4) Gruppen der Formel
- -C(=NH)NH(CH&sub2;)nSH und
- -C(=NH)NH(CH&sub2;)nSS(CH&sub2;)pNH(PO&sub2;)O-(Oligo)
- und
- (C) Polystyrol, welches gegebenenfalls mit einem Quervernetzungsmittel wie etwa Divinylbenzol quervernetzt sein kann, und das an Phenylgruppen derivatisiert ist mit
- (1) Gruppen der Formel
- -(CH&sub2;)sCO&sub2;H und
- (i) L&sub3;-NH(PO&sub2;)O-(Oligo) oder
- (ii) L&sub3;-SS(CH&sub2;)nNH(PO&sub2;)O-(Oligo),
- worin L&sub3; -(CH&sub2;)s(CO)(NH)(CH&sub2;)p- ist, worin die (CH&sub2;)s-Gruppe mit einer Phenylgruppe des Polystyrols verknüpft ist und worin s, p und n gleich oder verschieden sind und s 2 bis 10 ist, oder
- (2) Gruppen der Formel
- -(CH&sub2;)s(CO)(NH)(CH&sub2;)p(NH)(CO)(CH&sub2;)cR&sub1; und
- -(CH&sub2;)s(CO)(NH)(CH&sub2;)p(NH)(PO&sub2;)O-(Oligo),
- wobei im wesentlichen keine Phenylgruppe mit einer Gruppe derivatisiert ist, die mit einer Aminogruppe endet, oder
- (3) Gruppen der Formel
- -(CH&sub2;)s(CO)(NH)(CH&sub2;)pSH und
- -(CH&sub2;)s(CO)(NH)(CH&sub2;)pSS(CH&sub2;)nNH(PO&sub2;)O-(Oligo).
- In einem anderen ihrer Gesichtspunkte ist die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis eines einzelsträngigen Nukleinsäureanalyten in einer Probe unter Verwendung:
- (a) eines festen Trägers, der eine erste Sonde ("Fängersonde") enthält, die ein einzelsträngiges Oligonukleotid zwischen 15 und 100 Basen in einer Sequenz ist, die komplementär zur Sequenz eines ersten Segments des Analyten ist, wobei ein erheblicher Anteil der ersten Sonde, die ein Teil des festen Trägers ist, mit dem Träger nur endverknüpft (d.h. kovalent und nur durch einen Linker, der entweder mit dem 5'-Sauerstoff des 5'-terminalen Nukleosids oder dem 3'- Sauerstoff des 3'-terminalen Nukleosids verknüpft ist, an den Träger gebunden) ist und
- (b) einer zweiten Sonde, die ein einzelsträngiges Oligonukleotid mit einer Sequenz ist, die komplementär zur Sequenz eines zweiten Segments des Analyten ist und zum Nachweis markiert ist, unter der Voraussetzung, daß die Sequenz der zweiten Sonde nicht zu der der ersten Sonde komplementär ist und das zweite Segment nicht mit dem ersten Segment überlappt, wobei das Verfahren umfaßt:
- (1) Inkubieren des festen Trägers unter Vorhybridisierungsbedingungen mit einer Vorhybridisierungslösung, die (i) eine nicht-homologe Nukleinsäure oder (ii) Dextransulfat mit einer Konzentration zwischen etwa 5 % (Gew./Vol.) und 20 % (Gew./Vol.) oder sowohl (i) als auch (ii) umfaßt,
- (2) Inkubieren des gemäß Schritt (1) vorhybridisierten festen Trägers unter Hybridisierungsbedingungen mit einer Hybridisierungslösung, die zwischen etwa 5 % (Gew./Vol.) und 20 % (Gew./Vol.) Dextransulfat, Nukleinsäure aus der zu testenden Probe einschließlich des Analyten, sofern er in der Probe vorhanden ist, und die zweite Sonde in molarem Überschuß bezüglich der Menge des Analyten in der Hybridisierungslösung enthält,
- (3) Waschen des festen Trägers nach Schritt (2), um eine zweite Sonde davon zu entfernen, die nicht stabil mit dem Analyten hybridisiert hat und
- (4) Bestimmen nach Schritt (3), ob das auf der nachweisbaren Markierung auf der zweiten Sonde, die mit dem Analyten hybridisiert hat, beruhende Signal mit dem festen Träger assoziiert ist.
- Es ist ersichtlich, daß bei dem im vorstehenden Absatz beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren eine zweite Sonde vor Schritt (2) gegebenenfalls in einer Lösung unter Hybridisierungsbedingungen mit Nukleinsäure aus der zu testenden Probe inkubiert werden kann, wodurch bei Anwesenheit von Zielanalyt in der Probe mindestens ein Teil des Zielanalyten zum Zeitpunkt, wenn man mit Schritt (2) beginnt, bereits mit der zweiten Sonde in der Hybridisierungslösung hybridisiert sein wird, mit der der feste Träger gemäß Schritt (2) vereinigt wird. Dies bedeutet, daß eine Hybridisierung von markierter zweiter Sonde mit dem Analyten in Lösung vor dem Einfang der Zielsubstanz mit einer Fängersonde des festen Trägers durchgeführt werden kann.
- Bei einem anderen erfindungsgemäßen Verfahren zum Nachweis eines einzelsträngigen Nukleinsäureanalyten in einer Probe verwendet man:
- (a) einen festen Träger, der eine erste Sonde ("Fängersonde") enthält, die ein einzelsträngiges Oligonukleotid mit zwischen 15 und 100 Basen in einer Sequenz ist, die komplementär zur der Sequenz eines ersten Segments des Analyten ist, wobei ein erheblicher Anteil der ersten Sonde, die ein Teil des festen Trägers ist, mit dem Träger nur endverknüpft (d.h. kovalent und nur durch einen Linker, der entweder mit dem 5'-Sauerstoff des 5'-terminalen Nukleosids oder dem 3'-Sauerstoff des 3'-terminalen Nukleosids verknüpft ist, an den Träger gebunden) ist und
- (b) einer zweiten Sonde, die ein einzelsträngiges Oligonukleotid mit einer Sequenz ist, die komplementär zu der Sequenz eines zweiten Segments des Analyten und zum Nachweis markiert ist, unter der Voraussetzung, daß die Sequenz der zweiten Sonde nicht zu der der ersten Sonde komplementär ist und das zweite Segment nicht mit dem ersten Segment überlappt,
- umfassend:
- (1) Inkubieren des festen Trägers unter Vorhybridisierungsbedingungen mit einer Vorhybridisierungslösung, die (i) eine nicht-homologe Nukleinsäure oder (ii) Dextransulfat in einer Konzentration zwischen etwa 5 % (Gew./Vol.) und 20 % (Gew./Vol.) oder sowohl (i) als auch (ii) enthält,
- (2) Inkubieren des festen Trägers, der gemäß Schritt (1) vorhybridisiert wurde, unter Hybridisierungsbedingungen mit einer ersten Hybridisierungslösung, die zwischen etwa 5 % (Gew./Vol.) und 20 % (Gew./Vol.) Dextransulfat, Nukleinsäure aus der zu testenden Probe einschließlich des Analyten, sofern er in der Probe vorhanden ist, enthält, wobei die erste Hybridisierungslösung im wesentlichen von der zweiten Sonde frei ist,
- (3) Inkubieren des festen Trägers nach Schritt (2) unter Hybridisierungsbedingungen mit einer zweiten Hybridisierungslösung, die eine zweite Sonde in molarem Überschuß bezüglich der Menge des Analyten in der zweiten Lösung enthält, einschließlich des durch Hybridisierung mit der ersten Sonde an den festen Träger gebundenen Analyten,
- (4) Waschen des festen Trägers nach Schritt (3), um eine zweite Sonde davon zu entfernen, die nicht stabil mit dem Analyten hybridisiert hat und
- (5) Bestimmen nach Schritt (4), ob ein Signal aufgrund der nachweisbaren Markierung an der mit dem Analyten hybridisierten zweiten Sonde mit dem festen Träger assoziiert ist.
- Die Erfindung umfaßt weiterhin Testkits zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren zum Nachweis eines einzelsträngigen Nukleinsäureanalyten in einer Probe. Diese Kits umfassen einen erfindungsgemäßen festen Träger, eine markierte Sonde zum Einfangen des Analyten auf dem festen Träger und die (sofern überhaupt) erforderlichen Reagenzien zur Erzeugung eines Signals von der markierten Sonde (z.B. Enzym-gekoppeltes Avidin, wenn die Markierung Biotin ist, Fluoreszenz-verstärkende Lösung, wenn die Markierung ein chelatiertes Europiumion ist (siehe Musso et al., PCT Internationale Veröffentlichung Nr. W087/02708)).
- In noch einem weiteren Gesichtspunkt betrifft die Erfindung eine DNA oder RNA mit der Sequenz eines in der obigen Tabelle I aufgelisteten Oligonukleotids oder eines Komplements davon (d.h. ein Oligonukleotid mit einer Sequenz, die komplementär zu der eines solchen Oligonukleotids ist), wobei die DNA oder RNA gegebenenfalls zum Nachweis markiert ist. Jede der zahlreichen auf dem Fachgebiet bekannten Methoden zur Markierung eines Oligonukleotids, um es nachweisbar zu machen, kann bei den erfindungsgemäßen DNAs und RNAs verwendet werden. Eine DNA oder RNA kann beispielsweise mit ³²P in der Phosphatgruppe am 5'-Kohlenstoff des 5'-Nukleosids unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase, mit Biotin, das über eine Diaminoalkyllinkergruppierung mit einer Phosphoramidatgruppe am 5'- Terminus der DNA oder RNA (wie von Chu und Orgel, DNA 4, 327- 331 (1985) beschrieben) verknüpft ist oder über einen Linker mit einer modifizierten Nukleosidbase (wie beispielsweise von Dreyer und Dervan, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82, 968-972 (1985) beschrieben) oder mit einem chelatierten Europiumion markiert sein (wie von Musso et al., PCT Internationale Veröffentlichung Nr. WO87/02708).
- Ein Oligonukleotid, das als Fängersonde verwendet werden soll, kann an das feste Trägermaterial befestigt werden durch (1) unterschiedliche nicht-kovalente Wechselwirkungen (wie etwa diejenigen, wodurch Nukleinsäuren an Materialien, wie etwa Nitrocellulose- oder Nylenfilter binden), (2) kovalente Bindungen zwischen reaktiven Gruppen auf dem Material oder auf Gruppen, mit denen das Material kovalent derivatisiert ist, und reaktiven Gruppen auf den Pyrimidin- oder Purinbasengruppierungen des Oligonukleotids und (3) kovalente Bindungen zwischen reaktiven Gruppen auf dem Material oder auf Gruppen, mit denen das Material kovalent derivatisiert ist, und einer reaktiven Gruppe auf einer Gruppe, mit der das eine oder andere terminale Nukleosid des Oligonukleotids derivatisiert ist (z.B. über den 5'-Sauerstoff des 5'-terminalen Nukleosids oder den 3'-Sauerstoff des 3'-terminalen Nukleosids) . Man sagt, daß eine Fängersonde in einem festen Träger "endverknüpft" ist, wenn das einzige Mittel der kovalenten Bindung an den Träger das des gerade beschriebenen Typs (3) ist. Es ist günstig, insbesondere zur Verwendung von festen Trägern mit einer Fängersonde in Nukleinsäuresondentests, einen hohen endverknüpften Anteil der Fängersonde zu haben und die nicht-kovalenten Wechselwirkungen zwischen der endverknüpften Sonde und dem Trägermaterial minimal zu machen, da eine solche endverknüpfte Fängersonde zum Einfangen der Zielsubstanz maximal verfügbar ist. Ein "erheblicher Anteil" an Fängersonde in einem festen Träger ist endverknüpft, wenn mehr als etwa 10 % der Fängersonde im Träger endverknüpft sind. Vorzugsweise sind mindestens etwa 30 % endverknüpft.
- Eine Messung des Ausmaßes der Endverknüpfung für feste Träger, in denen eine Fängersonde an bei der vorliegenden Erfindung verwendete feste Trägermaterialien (z.B. Silikatglaskörner, quervernetztes Dextran, Polystyrol) durch einen Linker gebunden ist, der zu einer Disulfidbindung oder einer Phosphoramidatgruppe am Terminus der Nukleinsäure führt, ist möglich, da die Disulfidbindung leicht reduziert wird, wobei unter milden Bedingungen eine endverknüpfte Sonde, aber keine kovalent über eine oder mehrere Basen gebundene Sonde freigesetzt wird, und weil die Phosphoramidatbindung säurelabil ist, wobei ebenfalls unter geeigneten sauren Bedingungen eine endverknüpfte Sonde, aber keine kovalent über eine oder mehrere Basen gebundene Sonde freigesetzt wird. Eine nicht-kovalente Bindung kann abgeschätzt werden, indem eine Fängersonde einfach mit Trägermaterial unter Bedingungen inkubiert wird, die nicht zu eine kovalenten Bindung über den Linker oder auf andere Weise führen, und dann die von dem Material absorbierte Sondenmenge gemessen wird. Bei diesen Messungen von kovalenter und nicht-kovalenter Bindung verwendet man günstigerweise eine ³²P-markierte Fängersonde, da die Sondenmenge, die mit dem Träger assoziiert ist und von ihm entfernt wird, dann einfach gemessen werden kann.
- Insbesondere aus Messungen, wie oben beschrieben, zur Art der Bindung von Fängersonden an verschiedene Materialien mit verschiedenen Linkergruppierungen wurden die hervorragenden Eigenschaften von erfindungsgemäßen festen Trägern, die zur oben beschriebenen Gruppe (B) (3) zählen (quervernetztes, makroporiges Dextranmaterial, das an bestimmten Hydroxyl- Sauerstoffatomen mit Gruppen der Formel
- -C(=NH)NH(CH&sub2;)qCO&sub2;H und
- (i) L&sub2;-NH(PO&sub2;)O-(Oligo) oder
- (ii) L&sub2;-SS(CH&sub2;)rNH(PO&sub2;)O-(Oligo)
- derivatisiert wurden) entdeckt. Am meisten bevorzugt von den Dextranmaterialien unter diesen Trägern ist Sephacryl S-500. Die Linker ohne das Disulfid sind mehr bevorzugt.
- Es ist selbstverständlich, daß andere makroporige, quervernetzte Dextranmaterialien als das bevorzugte Sephacryl S-500 bei den erfindungsgemäßen festen Trägern verwendet werden können. Man kann beispielsweise Sephacryl S-200 und Sephacryl S-1000, die von Pharmacia Inc. vertrieben werden, sowie andere makroporige, quervernetzte Dextranmaterialien verwenden, insbesondere solche Materialien, die wie Sephacryl durch Quervernetzung von Allyldextran mit N,N'- Methylenbisacrylamid hergestellt und von Pharmacia sowie von anderen Firmen vertrieben werden.
- Obwohl die vorliegende Erfindung hier mit einem Nachweis von HIV-1 veranschaulicht wird, kann der Fachmann erkennen, daß die Erfindung auf den Nachweis eines beliebigen Nukleinsäureanalyten anwendbar ist, insbesondere auf einen, der in einzelsträngiger Form in einer zu testenden Probe auftritt (d.h. mit einem großen Überschuß eines Stranges gegenüber dem Strang an komplementärer Sequenz) und nicht auf HIV-1 beschränkt ist.
- Weiterhin können die erfindungsgemäßen festen Träger, obwohl sie hier in erster Linie bezüglich ihrer Nützlichkeit in Nukleinsäuresondentests beschrieben sind, auch in der Affinitätschromatographie verwendet werden, da "Oligo-dT-Säulen" seit langem zur Isolierung von Nukleinsäuren von Interesse verwendet worden sind. Während Oligo-dT-Säulen auf die Isolierung von mit einem Poly-A-Schwanz versehenen RNAs beschränkt sind, können die Träger gemäß vorliegender Erfindung zur Isolierung einer spezifischen Nukleinsäure von Interesse verwendet werden, ob es sich um DNA oder RNA handelt und ob sie polyadenyliert ist oder nicht. Die erfindungsgemäßen Träger, bei denen eine Fängersonde durch einen Linker, der eine Disulfidbindung besitzt, mit dem Trägermaterial verknüpft sind, werden in manchen Fällen günstigerweise zur Isolierung einer Nukleinsäure von Interesse durch Affinitätschromatographie verwendet, da die zur Abtrennung der (an die Nukleinsäure von Interesse gebundenen) Fängersonde vom festen Träger erforderlichen Bedingungen bei diesen Trägern mit Disulfidlinkern mild und leicht durchführbar sind.
- Die hier verwendete Bezeichnung "Aktivester" betrifft, wie im Fachgebiet bekannt, Ester, die durch Verbindungen wie etwa N- Hydroxysuccinimid, S-2-Pyridin und dgl. mit Carboxylatgruppen gebildet werden.
- Eine Probe, an der die erfindungsgemäßen Testverfahren angewendet werden, erhält man üblicherweise durch Behandlung einer ungereinigten Probe, wie etwa Blut oder einer anderen Körperflüssigkeit, einer Gewebeprobe aus einer Pflanze oder einem Tier, einer Nahrungsmittelprobe, einer Mikroorganismenkultur und dgl. durch in der Technik bekannte Methoden, um Nukleinsäure oder mindestens die Fraktion von Nukleinsäure isoliert, von der man annimmt, daß sie den Nukleinsäureanalyten (d.h. die "Zielsubstanz") enthält. Beim Isolierungsverfahren trennt man Nukleinsäure von anderen Substanzen wie etwa Proteinen ab, die den Test stören könnten und im Falle bestimmter Enzyme den Nukleinsäureanalyten und Oligonukleotidsonden abbauen.
- In bestimmten Fällen, wo der Analyt, sofern er überhaupt vorhanden ist, wahrscheinlich in Konzentrationen unterhalb der Nachweisgrenze des Tests ist, kann es notwendig sein, die Analytenmenge zu amplifizieren, wobei man beispielsweise von Saiki et al., Science 231, 1434-1436 (1985) entwickelten Prozeduren folgt.
- Vorhybridisierungs- und Hybridisierungsbedingungen und Waschmethoden zur Entfernung instabil hybridisierter oder nichthybridiserter Sonde sind dem Fachmann auf dem Gebiet des Nukleinsäuresondentests wohlbekannt.
- In der überwiegenden Zahl von Fällen kann die zweite Sonde leicht in molarem Überschuß gegenüber der Menge eines Analyten in einer Hybridisierungslösung bereitgestellt werden, in der aus Erfahrung die Maximalmenge an Analyten bekannt ist, die vorhanden sein kann. In einem Fall, wo dieses Maximum zufällig nicht bekannt ist, können verschiedene Tests, in denen die Konzentration der zweiten Sonde über einen weiten Bereich variiert, mit unterschiedlichen Portionen einer Probe durchgeführt werden, um sicherzustellen, daß ein Test mit einem molaren Überschuß an zweiter Sonde ausgeführt wird.
- Die Bestimmung, ob ein Signal von der Markierung auf der mit dem Analyten hybridisierten zweiten Sonde mit dem festen Träger assoziiert ist, ermöglicht die Durchführung von für die Markierung geeigneten Messungen am Träger, um jedes derartige Signal vom Träger nachzuweisen. Vorzugsweise vergleicht man das Signal von einem Träger, an dem Analyt aus einer Testprobe gebunden sein kann, mit einem Signal von einem Kontrollträger, bei dem es sich um einen auf im wesentlichen die gleiche Weise wie bei der Testprobe behandelten Träger handelt, von dem aber bekannt ist, daß kein Analyt daran gebunden ist. Ein Signal vom Träger der Testprobe mit größerer Stärke als das vom Kontrollträger bestätigt, daß das Signal vom Testprobenträger auf einen Analyten in der Testprobe zurückzuführen ist, sofern man weiß, daß der Test bei beiden Trägern funktioniert hat. Natürlich kann auch, wie es in der Technik selbstverständlich ist, eine positive Kontrollprobe, von der bekannt ist, daß sie die untersuchte Nukleinsäure enthält, parallel mit der Testprobe und der negativen Kontrollprobe verwendet werden, um sicherzustellen, daß das Testsystem funktioniert.
- Die Erfindung wird jetzt ausführlicher in den folgenden Beispielen veranschaulicht.
- In Sandwichtests, bei denen man kurze Oligonukleotide einschließlich deren Komponente, die mit dem Einfangen eines Analyten aus der Lösung assoziiert ist, verwendet, ist es für die Sensitivität und Spezifität und daher für die Zuverlässigkeit wichtig, daß die Sonden hochgereinigt und von gleicher Sequenz sind. Während zahlreiche Synthese- und Reinigungsmethoden für den Fachmann verfügbar sind, um Oligonukleotide mit ausreichender Qualität zu erhalten, haben wir festgestellt, daß die folgende akzeptabel ist: Oligonukleotide werden unter Verwendung eines automatischen Applied Biosystem 380A Synthesegeräts unter Verwendung der Cyanoethylphosphoramiditchemie synthetisiert. Die Synthesen werden in einem 1 umol Maßstab unter Verwendung eines kurzen Kopplungszyklus von 9 Minuten durchgeführt. Charakteristische Ausbeuten für jede Kopplung sind 98 %, wie durch Tritylnachweis unter Verwendung eines colorimetrischen Tests gemessen wurde. Bei einer solchen Prozedur wird eine DNA-Sonde mit 30 Nukleotiden in drei Stunden synthetisiert, gefolgt von weiteren 18 Stunden zur Entfernung der Basenschutzgruppen und zur Reinigung des tritylierten Oligonukleotids. Die am Ende des Reinigungsprotokolls erhaltenen Mengen an Oligonukleotid reichen zwischen 400 und 600 ug Oligonukleotid pro Synthese.
- Da eine reine Sonde mit voller Länge eine kritische Erfordernis für den eindeutigen Nachweis eines spezifischen Nukleinsäure-Zielanalyten ist, haben wir der Entwicklung eines Protokolls der Oligonukleotidreinigung besondere Aufmerksamkeit geschenkt. Die Reinigung tritylierter Oligonukleotide wird unter Verwendung einer semipräparativen C-18 Reverse- Phase-Chromatographie (10 x 250 mm Säule) durchgeführt. Versuche zur Isolierung von Oligonukleotiden, die vor der C-18- Chromatographie detrityliert wurden, haben sich als weniger wirksames Mittel der Reinigung aufgrund der weniger hydrophoben Natur der Oligonukleotide erwiesen. Zur Eluierung des tritylierten Oligonukleotids von vollständiger Länge wird ein Gradient von 15 bis 35 % Acetonitril in 0,1 M Triethylammoniumacetat, pH 6,6 über eine Dauer von 40 Minuten verwendet. Dieses Oligonukleotid wird anschließend unter Verwendung von 80 % Essigsäure in Wasser für 1 Stunde detrityliert. Der Detritylierung folgt eine G-50-Sephadex -Chromatographie. Das isolierte Oligonukleotid wird weiter durch HPLC auf einer RPC-5-Säule (4,6 x 250 mm Säule, Lösungsmittel A, 2 mM Tris, pH 12, Lösungsmittel B, 2 mM Tris, 200 mM Perchlorat, pH 12, Gradient 10 % B bis 50 % B über 40 Minuten) charakterisiert. Dieser letzte Schritt kann auch für einen zusätzlichen Schritt der Reinigung für geringe Mengen an Oligonukleotiden sorgen.
- Für Oligonkleotidsonden mit einer größeren Länge (> 50 Nukleotide) erfolgt die Isolierung von Oligonukleotiden vollständiger Länge durch präparative Polyacrylamid- Gelelektrophorese unter Verwendung eines 12 bis 20 %igen Gels nach bei Maniatis et al., supra beschriebenen Protokollen.
- Die vorstehenden Prozeduren (für Oligonukleotide, die kürzer als 50 Nukleotide sind) wurden zur Herstellung der in Tabelle I als DNAs aufgelisteten Oligonukleotide verwendet.
- Oligonukleotidsonden werden am 3'-Kohlenstoff des 3'-Nukleosids ("3'-Terminus") oder am 5'-Kohlenstoff des 5'-Nukleosids ("5'-Terminus") unter Verwendung einer beliebigen Standardtechnik phosphoryliert.
- Zur Phosphorylierung am 3'-Terminus, siehe Panet und Khorana, J. Biol. Chem. 249, 5213-5221.
- Oligonukleotide werden routinemäßig an ihren 5'-Terminiunter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase gemäß einem Standardprotokoll (siehe Maniatis et al., supra) phosphoryliert.
- Zur Herstellung einer ³²P-markierten Sonde verwendet man Substrate, die an geeigneten Positionen ein ³²P-haltiges Phosphat aufweisen, bei der Phosphorylierung.
- Die Markierung einer Sonde für Nachweiszwecke kann radioaktiv oder nicht-radioaktiv erfolgen.
- Bei Verwendung einer radioaktiven Markierung ist eine ³²P- Markierung wie in Beispiel II beschrieben bevorzugt, obwohl man auch eine Markierung mit anderen Isotopen, z.B. ¹²&sup5;I oder ¹&sup4;C gemäß in der Technik bekannten Methoden verwenden kann.
- Zum Nachweis einer radioaktiv markierten Sonde, die mit einem Analyten komplexiert ist, der wiederum mit an den festen Träger gebundener Fängersonde komplexiert ist, verwendet man Szintillationszählung.
- Es sind zahlreiche nicht-radioaktive Markierungs- und zugehörige Nachweisprotokolle bekannt. Jede diese Markierungstechniken, die minimale Beeinflussung der Basenpaarung zwischen der markierten Oligonukleotidsonde und dem Segment des Analyten, der eine Sequenz besitzt, die komplementär zu der der Sonde ist, kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Man kann beispielsweise eine Markierung mit Biotin über einen Diaminlinker, der mit Biotin und über eine Phosphoramidatbindung mit einem Phosphat am 5'-Terminus des Oligonukleotids gemäß Chu und Orgel, DNA, Vo. 4, 327-331 (1985) verknüpft ist, verwenden, ebenso wie eine entsprechende Markierung mit EDTA-chelatiertem fluoreszierendem Eu&spplus;³ anstelle von Biotin, wie bei Musso et al., PCT Internationale Veröffentlichung Nr. WO87/02708 beschrieben. Auch eine Markierung mit einem an eine Nukleosidbase gekoppelten Biotin, wie von Dreyer und Dervan, supra, beschrieben, kann verwendet werden.
- (A) Glas mit kontrollierten Poren, das mit einem "langkettigen Alkylamin" derivatisiert war, wurde von Pierce Chemical Col., Rockford, Illinois, USA, Product Nr. 24875 bezogen. Dieses poröse Silikatglas hat Siliciumatome, die mit einer Gruppe der Formel -(CH&sub2;)&sub6;NH&sub2; derivatisiert sind.
- (B) Carboxyl-derivatisiertes Glas mit kontrollierten Poren wurde von Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA, Produkt Nr. 23735, bezogen. Dieses poröse Silikatglas hat Siliciumatome, die mit einer Gruppe der Formel -(CH&sub2;)&sub3;NH(CO)(CH&sub2;)&sub2;CO&sub2;H derivatisiert sind.
- (C) Thiol-derivatisiertes Glas mit kontrollierten Poren wurde ebenfalls von Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA, Produkt Nr. 23748 bezogen. Dieses poröse Silikatglas hat Siliciumatome, die mit einer Gruppe der Formel
- derivatisiert sind.
- (D) Succinimidester-derivatisiertes poröses Silikatglas wird mit dem oben beschriebenen Carboxyl-derivatisierten Glas hergestellt. Das Carboxyl-derivatisierte Glas wird getrocknet, indem es dreimal mit Aceton und anschließend dreimal mit trocknem Aceton (getrocknet durch Aufbewahren über Molekularsieben mit 4 Angström) gewaschen wird. Die Körner werden anschließend unter Verwendung einer Glasfritte filtriert und im Vakuum für 10 Stunden getrocknet. Zu 500 mg trockenen Körnern in 15 ml trockenem N,N-Dimethylformamid ("DMF") werden 500 mg Dicyclohexylcarbodiimid und 300 mg N-Hydroxysuccinimid gegeben. Das Gemisch wird 16 Stunden lang gerührt und mit trockenem DMF (3 x, jeweils 20 ml) und Methylenchlorid (2 x, jeweils 20 ml) gewaschen, um überschüssigen Reaktanden und Dicyclohexylharnstoff zu entfernen. Der resultierende Träger wird anschließend 3 Stunden lang im Vakuum getrocknet.
- (A) Sephacryl S-500 wurde von Pharmacia Inc., Piscataway, New Jersey, USA unter der Code Nr. 17-0475-01 bezogen.
- (B) Das Sephacryl S-500 wurde nach Bunemann et al., supra, Bromcyan-aktiviert. 100 g nasses Material, wie vom Hersteller geliefert, wurden unter Verwendung eines großen Überschusses an destilliertem Wasser und einer Glasfritte gewaschen. Der Naßkuchen wurde in einen 1000 ml-Becher überführt, der mit einem Überkopf-Paddelrührer und einer pH-Elektrode ausgestattet war. 500 ml eiskaltes Wasser wurden zugegeben und die Suspension wurde heftig gerührt, während sie durch gelegentliche Zugabe von Eisstücken auf unter 10ºC gehalten wurde. 40 g festes Bromcyan wurden zugegeben und der pH wurde wiederholt kontrolliert und zwischen 10,5 und 11,5 durch Zugabe von 5 M NaOH für etwa 20 Minuten gehalten. Dann wurde das Kornmaterial schnell mit 5 Volumina eiskaltem Wasser und anschließend 1 Volumen eiskaltem 10 mM Kaliumphosphat, pH 8,0, gewaschen.
- Wie für den Fachmann klar ist, erfordert CNBr-Aktivierung Hydroxylgruppen an benachbarten Kohlenstoffatomen.
- (C) Carboxyl-derivatisiertes Material wurde wie folgt hergestellt: Zu einer Suspension von 20 g frisch hergestelltem CNBr-aktiviertem Sephacryl S-500 in 20 ml 10 mM Kaliumphosphat, pH 8,0 wurden 16 g 6-Aminocapronsäure in vier Portionen bei Intervallen von 30 Minuten zugegeben, und das resultierende Gemisch wurde mit einem Paddelrührer für 20 Stunden gerührt. (Alternativ kann Hexylendiamin anstelle von 6-Aminocapronsäure verwendet werden, um den entsprechenden Amin-derivatisierten Träger zu ergeben).
- Das resultierende derivatisierte Sephacryl wurde eine Glasfritte filtriert und gründlich mit 10 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 8,0, 1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 8,0, 1 M KCl, 0,1 M NaOH und schließlich Wasser gewaschen. Der Naßkuchen wurde dann in 1,0 M MES, pH 6,0 suspendiert und bei 4ºC aufbewahrt.
- (D) Succinimid-derivatisiertes makroporiges, quervernetztes Dextranmaterial wurde aus dem Carboxyl-derivatisierten Material wie folgt hergestellt: In 0,1 M MES-Puffer, pH 6 suspendiertes, Carboxyl-derivatisiertes Sephacryl S-500 wurde in eine Glasfritte überführt und aufeinanderfolgend mit Wasser, 70:30, 50:50 und dann 30:70 H&sub2;O/Aceton gewaschen, gefolgt von dreimaligem Waschen mit Aceton, wiederum gefolgt von dreimaligem Waschen mit Aceton, das über Molekularsieben mit 0,4 nm (4 Angström) getrocknet worden war. Nach Filtration wurde das Sephacryl für 10 Stunden unter Hochvakuum (0,01 Torr) getrocknet. Dann wurden 500 mg des getrockneten, Carboxyl-derivatisierten Materials, wie in Beispiel IV (D) für Carboxyl-derivatisiertes poröses Glas beschrieben, behandelt, um das Succinimidester-derivatisierte Sephacryl zu ergeben.
- (E) Thiol-derivatisiertes Sephacryl S-500 wird wie folgt hergestellt: Zu einer Suspension von 15 g frisch hergestelltem, CNBr-aktiviertem Sephacryl S-500 in 10 mM Kaliumphosphat, pH 8,0, werden 5 g Cystamin-Dihydrochlorid gegeben und das Gemisch wird mit einem Paddelrührer für 20 Stunden gerührt. Das resultierende derivatisierte Sephacryl wird filtriert und wie in V (C) gewaschen. Vor der Verwendung wird die Disulfidbindung des Cystaminlinkers des derivatisierten Materials durch Suspendieren des Materials in 100 mM Dithiothreitol (DTT), 50 mM HEPES, pH 7,7 für 1 Stunde bei 25ºC gespalten, wonach ein gründliches Waschen des Materials mit entgastem 0,2 M HEPES, pH 7,7, 0,1 M KCl und schließlich wieder mit 0,2 M HEPES, pH 7,7 erfolgt.
- (A) Ein mit 1 % Divinylbenzol quervernetztes Polystyrolchlormethylharz (1,1 mM Cl/g, 200 - 400 mesh) wurde von U.S. Biochemical Corp. (Cleveland, Ohio, USA) bezogen. Mit 12 % Divinylbenzol quervernetzte Polystyrolkörner, Meshgröße 200 bis 400, wurden von Polysciences, Warrington, Pennsylvania bezogen.
- (B) Die mit 12 % Divinylbenzol quervernetzten Polystyrolkörner wurden wie folgt Carboxyl-derivatisiert:
- 10 g der Körner wurden zu 150 ml 1,2-Dichlorethan gegeben, und das Gemisch wurde auf Rückfluß gebracht. Ein filtriertes Gemisch von 20 mmol Aluminiumchlorid und 10 mmol Glutarsäuremonomethylesterchlorid in 10 ml Nitrobenzol wurde über eine Dauer von 5 Minuten zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde für weitere 4 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Das Harz wurde durch eine Glasfritte filtriert, mit Dioxan:4 M HCl (3:1), Dioxan:Wasser (3:1), Dioxan, Ethanol, Aceton und schließlich Methanol gewaschen und anschließend in einem Exsikkator unter Vakuum getrocknet. Zu 2 g KOH in einem Dreihalskolben wurden 100 ml Ethylenglykol gegeben, und das Gemisch wurde auf 100ºC erhitzt. Nach vollständigem Lösen des KOH wurden 5 g des getrockneten, derivatisierten Harzes zusammen mit 3 ml Hydrazinhydrat zugegeben. Das Gemisch wurde auf Rückfluß gebracht und 3 Stunden lang unter Rückfluß erhitzt, wonach eine Portion der Flüssigkeit abdestilliert wurde, bis die Rückflußtemperatur 198ºC erreichte. Der Kolben wurde dann verstöpselt und für 12 weitere Stunden unter Rückfluß erhitzt. Dann wurde das Harz, wie oben (nach der Derivatisierung mit Glutarsäuremonomethylesterchlorid) beschrieben, gewaschen.
- (C) Die mit 12 % Divinylbenzol quervernetzten Polystyrolkörner wurden Amino-derivatisiert wie folgt: Zu 5 g Carboxyl-derivatisierten Körnern wurden 1 g Dicyclohexyl-carbodiimid und 1,25 g N-Hydroxysuccinimid in 50 ml Dimethylformamid (DMF) gegeben. Nach 30-minütigem Rühren wurden 7 g 1,8-Diaminooctan zugegeben und das Gemisch wurde für 3 weitere Stunden gerührt. Das Harz wurde anschließend abfiltriert und dann aufeinanderfolgend mit Methanol, Wasser, Methanol, CH&sub2;Cl&sub2; und schließlich Aceton gewaschen.
- (D) Das mit 1 % Divinylbenzol quervernetzte, Chlormethyl-derivatisierte Polystyrolharz wurde wie folgt Aminoderivatisiert: Zu 10 g des 1 % quervernetzten, Chlormethylderivatisierten Harzes (wie von U.S. Biochemicals, Inc. geliefert) in 80 ml DMF wurden 2,6 g N-t-Butyloxycarbonyl-6- aminocapronsäure und 1,28 g Kaliumfluorid gegeben, und das Gemisch wurde bei 80ºC für 16 Stunden gerührt. Das Harz wurde dann abfiltriert, aufeinanderfolgend mit CH&sub2;Cl&sub2;, Methanol und Aceton gewaschen und dann 3 Stunden lang unter Hochvakuum (0,001 Torr) behandelt. Die Schutzgruppenentfernung der Aminogruppe wurde mit 30 %iger Trifluoressigsäure in CH&sub2;Cl&sub2; durchgeführt, um den Amino-derivatisierten Träger zu ergeben. Eine Picrinsäuretitration der Aininogruppen ergab einen Substitutionsgrad von 0,17 mmol/g Harz.
- Die Aminoalkylderivate wurden typischerweise im 1 bis 10 nmol-Maßstab bei Konzentrationen von 1 bis 20 umol/l hergestellt. Es wurde nach dem Protokoll von Chu et al., Nucl. Acids Res. 11, 6513-6529 (1983) gearbeitet und das modifizierte Oligonukleotid wurde nach Chollet und Kawashima, Nucl. Acids Res. 13, 1529-1541 (1985) durch Ethanolfällung isoliert.
- Somit wurden zur Herstellung des Aminohexyladdukts eines Oligonukleotids 4 nmol des (am 5'-Terminus phosphorylierten) Oligonukleotids in einem silikonisierten Eppendorf-Gefäß in 0,3 ml 0,25 M 1,6-Diaminohexan, 0,1 M N-Methylimidazol und 0,1 M 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid ("CDI"), pH 6,0 aufgenommen und für 20 Stunden reagieren gelassen. Die resultierende DNA wurde dreimal mit Ethanol gefällt, um überschüssiges Diamin zu entfernen und wurde dann in 0,1 M MOPS, pH 7,5 aufgenommen. Die Vorbehandlung von Reaktionsgefäßen mit einer Silanisierungslösung erwies sich jedesmal als notwendig, wenn ein Oligonukleotid an einer Reaktion beteiligt ist, um eine unspezifische Bindung des Oligonukleotids an die Wände des Gefäßes während der Reaktion zu verhindern.
- Gemäß der gleichen Prozedur, aber mit 1,2-Diaminoethan oder 1,8-Diaminooctan anstelle von 1,6-Diaminohexan wurde das 2- Aminoethyl- bzw. 8-Aminooctyl- anstelle des 6-Aminohexyl- Addukts erhalten.
- Zur Herstellung dieser Derivate mit Glycin oder Aminocapronsäure wurde die folgende Prozedur verwendet: Das 5'-phosphorylierte Oligonukleotid (4 nmol) in einem silanisierten Eppendorf-Gefäß wurde in 0,3 ml 0,1 M Imidazol, 0,1 M CDI, pH 6,0 bei 25ºC aufgenommen, und die Bildung des Phosphorimidazolids über eine Dauer von 90 Minuten ermöglicht. Dann wurde das Oligonukleotid mit Ethanol gefällt und anschließend in 0,3 ml einer Lösung von 0,1 M Glycin oder 0,1 M Aminocapronsäure, pH 8 aufgenommen und für 3 Stunden bei 50ºC erhitzt. Das resultierende Addukt wurde dann durch Ethanolfällung isoliert und schließlich in 0,05 M MOPS, pH 7,5 aufgenommen.
- Zu 1 nmol eines 5'-phosphorylierten Oligonukleotids in einem silanisierten Eppendorf-Gefäß wurden 0,3 ml 0,1 M Imidazol und 0,15 M CDI, pH 6,00 gegeben und die resultierende Lösung wurde für 1,5 Stunden bei 23ºC inkubiert. Das 5'-Imidazolidderivat wurde durch Ethanolfällung isoliert und dann in 0,3 ml 0,25 M Cystamin, pH 7,7 aufgenommen, wonach die Reaktion für 3 Stunden bei 50ºC fortschreiten gelassen wurde. Das Cystaminylphosphoramidatderivat wurde anschließend dreimal mit Ethanol gefällt, um überschüssiges Cystamin zu entfernen. Das DNA-Pellet wurde anschließend in 0,05 M MOPS, pH 7,5 aufgenommen.
- Folgt man den gleichen Prozeduren wie in den Beispielen VII (A), (B) und (C) mit Oligonukleotiden, die am 3'-Terminus phosphoryliert sind, anstelle derjenigen, die am 5'-Terminus phosphoryliert sind, erhält man 3'-derivatisierte Phosphoramidataddukte anstelle der 5'-derivatisierten.
- Die für die obige Derivatisierung verwendete Standardreaktion ist wie folgt:
- 10 mg eines Glases mit kontrollierten Poren, das mit einem langkettigen Alkylamin derivatisiert war (Pierce Chemical Co., Produkt Nr. 24875), mit 20 bis 30 umol Aminogruppen pro Gramm Glas werden in einem silanisierten Eppendorf-Gefäß mit 0,11 ml 0,1 M N-Methylimidazol, 0,1 M CDI und von 5 x 10&supmin;&sup7; bis 20 x 10&supmin;&sup7; M eines 5'-phosphorylierten Oligonukleotids vereinigt. Die Reaktion wird für 24 Stunden unter Rühren fortgesetzt, und dann erhalten die Körner 1-minütige Waschungen mit NaOH, pH 12, um unspezifisch gebundene DNA zu entfernen. Schließlich werden die derivatisierten Körner in TE- Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) aufbewahrt.
- Vor der Verwendung werden die nicht umgesetzten Aminogruppen der Körner blockiert, indem 10 g Körner mit 100 ul 50 mM N- Hydroxysuccinimidester von Essig- oder Propionsäure, 0,2 M HEPES, pH 7,7 vermischt und für 15 Minuten umgesetzt werden, wonach drei Waschgänge mit 0,2 M HEPES, pH 7,7 und schließlich Aufbewahrung in TE-Puffer folgen. Diese Behandlung reicht aus, um im wesentlichen alle freien Aminogruppen in den Körnern zu blockieren.
- Die Kopplungsausbeuten von Oligonukleotiden an die Amin-derivatisierten, porösen Silikatglaskörner wurden bestimmt, indem 25 pmol von ³²P-markiertem, 5'-phosphoryliertem Oligonukleotid mit 50 mg der Körner in 0,55 ml 0,1 M Methylimidazol, 0,1 M CDI, pH 6,00 für 24 Stunden unter Rühren umgesetzt wurden, gefolgt von 1-minütigen Waschgängen mit NaOH, pH 12, um nicht gebundenes Oligonukleotid zu entfernen. Die unspezifische (d.h. nicht-kovalente) Bindung wurde durch Durchführung der Reaktion in Abwesenheit von CDI bestimmt. Anschließend wurden die Cerenkov-Impulse von den Körnern in einem Beckman LS 7800 Flüssigszintillationssytem (Beckman Instruments, Inc.) bestimmt. Die "Bindungsausbeute" ist der an die Körner gebundene Anteil der 25 pmol. Die Bindungsausbeuten erwiesen sich als eine Funktion der Länge des Oligonukleotids. Typischerweise wurden Ausbeuten von 75 bis 80 % für ein 17-mer für die Amin-derivatisierten porösen Glaskörner erhalten, Ausbeuten von 40 bis 45 % wurden für ein 25-mer beobachtet. Das Ausmaß der unspezifischen Bindung variierte zwischen 4 bis 6 %. Eine im wesentlichen vollständige Abspaltung des Oligonukleotids vom Träger erfolgte nach Säurehydrolyse der Phosphoramidatbindung, was darauf hinweist, daß das gesamte Oligonukleotid, das durch die in diesem Absatz beschriebene Prozedur nicht unspezifisch gebunden ist, endverknüpft ist.
- 50 mg nasse, frisch hergestellte CNBr-aktivierte Sephacryl S-500 Körner werden mit 0,5 ml 0,1 M NaHCO&sub3;, 0,5 M NaCl, pH 8,3 und 0,025 ml 5'-6-Aminohexylphosphoramidat-derivatisiertem Oligonukleotid (etwa 5 x 10&supmin;&sup6; M) in 0,05 M MOPS, pH 7,5 vereinigt. Die Reaktion wird für 20 Stunden fortschreiten gelassen. Das Gefäß wird anschließend zentrifugiert und der Überstand entfernt und die Körner werden dann mit 0,1 M Tris, pH 8,00 für 1 Stunde vereinigt, um nicht-reagierte, von der Bromcyan-Derivatisierung zurückbleibende Stellen zu inaktivieren. Anschließend werden die Körner viermal mit NaOH, pH 12 gewaschen und schließlich in TE-Puffer aufbewahrt. Der Linker, der das Sephacryl -Hydroxyl-Sauerstoffatom und den 5'-Sauerstoff des 5'-Nukleosids des Oligonukleotids verknüpft, besitzt dann die Formel
- -C(=NH)NH(CH&sub2;)&sub6;NH(PO&sub2;)-.
- Die gleiche Prozedur unter Verwendung von 2 Aminoethylphosphoramidat-derivatisiertem anstelle von 6-Aminohexylphosphoramidat-derivatisiertem Oligonukleotid ergibt einen festen Träger, worin der Linker zwischen dem Dextran-Sauerstoff und dem 5'-Sauerstoff des 5'-Nukleosids des Oligonukleotids die Formel hat:
- -C(=NH)NH(CH&sub2;)&sub2;NH(PO&sub2;)-.
- Bei den oben beschriebenen Carboxyl-derivatisierten porösen Silikatglas-, mit Divinylbenzol quervernetzten Polystyrolund makroporigen quervernetzten Dextranträgern wurde das folgende Protokoll verwendet:
- Zu 50 bis 75 mg Carboxyl-derivatisiertem Träger (Naßgewicht im Falle von Sephacryl ) werden 25 bis 30 pmol des 5'-Aminoalkylphosphoramidat- oder 5'-Cystaminylphosphoramidat-derivatisierten Oligonukleotids in 0,75 ml 0,15 M CDI, 0,1 M MES, pH 6 gegeben, und das Gemisch wird für 1 Stunde (im Falle von Sephacryl ) oder 16 Stunden (im Falle von Glas und Polystyrol) in einem Rotationsmischer langsam gerührt. (Die größere Reaktionsgeschwindigkeit beim Sephacryl ist ein bemerkenswerter Vorteil dieses Materials). Nach der Reaktion wird der Träger viermal mit NaOH, pH 12 gewaschen, und schließlich wird das Oligonukleotid-derivatisierte Material in TE-Puffer aufbewahrt.
- Für diese Carboxy-derivatisierten Träger wurden unter Verwendung von ³²P-markiertem Oligonukleotid und Messung von Cerenkov-Impulsen Kopplungsausbeuten der Körner wie in dem vorstehenden Beispiel angegeben erhalten. Die unspezifische Bindung wurde durch Messung der Radioaktivität im Trägermaterial nach Durchführung der Kopplungsreaktion in Abwesenheit von CDI festgestellt. Eine Bindung über Aminoreste von Basen anstelle über die terminale Aminogruppe des mit dem Oligonukleotid verbundenen Linkers wurde durch Reaktion von phosphoryliertem, aber ansonsten nicht-derivatisiertem Oligonukleotid mit dem Trägermaterial festgestellt. Der Grad der Endverknüpfung wurde aus der Säurehydrolyse der Phosphoramidatbindung in HCl, pH 2 bei 37ºC für 4 Stunden, gefolgt von Waschungen des Trägers mit NaOH, pH 12 erhalten, wobei die auf dem Träger zurückbleibende Radioaktivität eine Schätzung der Endverknüpfung ergab. Für Träger mit dem 5'-Cystaminylphosphoramidat-derivatisierten Oligonukleotid wurde der Grad der Endverknüpfung durch Spaltung der Disulfidbindung mit DTT bestimmt. So wurden 50 mg Oligonukleotid-derivatisierter Träger für 1 Stunde bei 23ºC mit 0,2 ml 0,1 M DTT, 0,1 M HEPES und 1 mM EDTA, pH 7,7 inkubiert. Anschließend wurde der Träger mit NaOH, pH 12 gewaschen, um dissoziiertes Oliogonukleotid zu entfernen. Im allgemeinen standen die Ergebnisse für die Endverknüpfung mit den Cystaminyl-derivatisierten Oligonukleotiden im Einklang mit denen der Aminoalkyl-derivatisierten Oligonukleotide.
- Die zur Abspaltung der Cystaminyl-derivatisierten Oligonukleotide verwendeten milden Bedingungen sind für eine Anwendung der erfindungsgemäßen festen Träger für die Isolierung von Nukleinsäuren bemerkenswert.
- Der am meisten bevorzugte erfindungsgemäße feste Träger ist Carboxyl-derivatisiertes Sephacryl S-500, das mit 5'-(6- Aminohexylphosphoramidat)-derivatisiertem Oligonukleotid derivatisiert ist.
- Bei der Prozedur dieses Beispiels werden etwa 1,2 pmol Oligonukleotid pro Milligramm (Naßgewicht) von Carboxyl-derivatisiertem Sephacryl S-500 derivatisiert. Etwa die Hälfte des Oligonukleotids ist nur endverknüpft (kovalent nur durch Bildung einer Amidbindung zwischen dem 6-Amin des mit dem Oligonukleotid verknüpften 6-Aminohexylphosphoramidats und dem mit dem Sephacryl verknüpften Carboxyl), nur etwa 0,5 % sind nicht-kovalent an den Träger gebunden und etwa von der Hälfte nimmt man an, daß sie kovalent über Aminogruppen von Basen im Oligonukleotid (z.B. Cytosine) gebunden ist (möglicherweise zusammen mit einer Amidbildung zwischen dem Carboxylrest des Trägers und dem Aminrest des 6-Aminohexyl-phosphoramidats).
- Höhere Grade an Endverknüpfung und eine verringerte Bindung über die Nukleosidbasen erhält man, wenn Carbonylbasen des Trägermaterials als ihre N-Hydroxysuccinimidester aktiviert werden. Bei einer typischen Immobilisierungsprozedur werden 10 mg trockener, N-Hydroxysuccinimid-aktivierter Sephacryl - Träger in 0,7 ml 0,2 M HEPES, pH 7,7, das 20 bis 25 pmol eines 5'-Aminoalkylphosphoramidat- oder 5'-Cystaminylphosphoramidat-derivatisierten Oligonukleotids enthält, suspendiert, und das Gemisch wird 1 Stunde lang auf einem Rotationsmischer gerührt. Der Träger wird dann viermal mit NaOH, pH 12,0 gewaschen und dann in TE aufbewahrt. (Nach Hydratisierung erhält man 50 mg nassen Träger aus 10 mg trockenem Material). Eine Immobilisierung unter diesen Bedingungen ergibt eine 50 bis 55 %ige Bindungseffizienz und mehr als 80 % Endverknüpfung des Oligonukleotids. Bei den N-Hydroxysuccinimid-aktivierten Trägermaterialien neigen die Ergebnisse jedoch dazu, variabel zu sein. Dies scheint auf die Empfindlichkeit der Succinimidestergruppierung gegenüber einer Hydrolyse zurückzuführen zu sein. Daher sind ein strenger Ausschluß von Feuchtigkeit während der Herstellung der Succinimidester-aktivierten Träger und eine Lagerung der vakuumgetrockneten Form unter N&sub2; bei 4ºC hilfreich, um gute Ergebnisse mit den Trägern sicherzustellen.
- Dieses Beispiel veranschaulicht ein Verfahren zur Verwendung der erfindungsgemäßen Oligonukleotid-derivatisierten festen Träger zum Nachweis eines Nukleinsäureanalyten, insbesondere des Genoms des HIV-1 Virus, dem Erreger des Acquired Immune Deficiency Syndrome beim Menschen.
- Ein erfindungsgemäßer fester Träger ("Körner") wurde mit Carboxyl-derivatisiertem Sephacryl S-500 und 5'-(6-Aminohexyl)-phosphoramidat-derivatisiertem Oligonukleotid 85-241 (Fängersonde) hergestellt. Der Linker zwischen dem Dextran-Sauerstoff und dem 5'-Sauerstoff des 5'-Thymidins des Oligonukleotids hat die Formel
- -C(=NH)NH(CH&sub2;)&sub5;(CO)(NH)(CH&sub2;)&sub6;NH(PO&sub2;)-.
- Das Oligonukleotid 85-233 wurde unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinase mit einem ³²P-haltigen Phosphat phosphoryliert, um als zweite markierte Sonde eingesetzt zu werden.
- Es sollte angemerkt werden, daß die folgende Prozedur ebenso mit von 85-241 und 85-233 verschiedenen Oligonukleotidpaaren durchgeführt werden könnte, die Sequenzen besitzen, die komplementär zu denen von nicht-überlappenden Segmenten des HIV- 1 Genoms sind. Beispielsweise könnte jedes Paar von in Tabelle I aufgelisteten Oligonukleotiden verwendet werden. Weiterhin könnte sie mit anderen, zur Herstellung der Körner verwendeten festen Trägermaterialien und mit einer nichtradioaktiven Markierung zum Nachweis auf der zweiten Sonde durchgeführt werden.
- Es wird die gesamte Nukleinsäure aus der Lymphozytenfraktion von 10 ml Blut einer auf HIV-1 Infektion getesteten Person unter Verwendung einer beliebigen Standardprozedur isoliert. Eine Probe von 10 ug humaner DNA (etwa 108 Genomäquivalente) wird parallel als negative Kontrolle mit der auf das HIV-1 Genom getesteten Nukleinsäureprobe untersucht. Dann folgt man mit der Probe und der Kontrolle dem folgenden Protokoll:
- Die Hybridisierungslösung (HS; 5x SSPE, 0,75 M NaCl, 50 mM NaH&sub2;PO&sub4;, pH 7,4, 5 mM EDTA), 10 % Dextransulfat und 0,1 % Natriumdodecylsulfat (SDS) werden zum Aufwärmen vor der Anwendung auf 37ºC gestellt.
- 20x SSC wird auf 2x SSC (0,3 M NaCl, 30 mM Natriumcitrat, pH 7,0) verdünnt und zur späteren Verwendung auf 37ºC gestellt.
- Eine Stammlösung von Körnern wird in TE-Puffer resuspendiert, und 250 ul dieser Suspension werden entnommen, um 50 mg (Naßgewicht) Körner zu erhalten. Diese 250 ul werden dann in ein Eppendorf-Gefäß gegeben, und die Körner werden zentrifugiert (5 Sekunden), um die 50 mg Körner zu pelletieren. Jeder Test sollte mit 50 mg Körnern durchgeführt werden.
- Anschließend wird die Vorhybridisierung wie folgt durchgeführt: Entfernen des TE-Puffers, in dem die Körner gelagert werden, nach einer Zentrifugation für 5 bis 10 Sekunden. Zugabe von 250 ul vorgewärmter HS (bei 37ºC) zu den Körnern und Resuspendieren der Körner. Stellen dieses Vorhybridisierungsgemisches auf 37ºC für 15 bis 60 Minuten.
- Dann wird die Sandwichhybridisierung durchgeführt:
- Hybridisierungsschritt in der Lösung:
- Während der Vorhybridisierung der Körner wird markiertes Oligonukleotid (zweite Sonde) zu einem Aliquot von Proben- (oder Kontroll-) Nukleinsäure gegeben. Das Volumen dieser Hybridisierungslösung sollte nicht 50 ul übersteigen, und kann in TE-Puffer erfolgen. Das Verhältnis von Sondenmenge zu Menge an Zielsubstanz sollte etwa 5:1 (mol:mol) sein.
- Überführen der Markierungssonde-Zielsubstanz-Hybridisierungslösung (50 ul) auf 65ºC für 5 Minuten.
- Bringen der Markierungssonde-Zielsubstanz-Lösung auf 42ºC. Anschließende Zugabe von HS, um eine endgültige Hybridisierungslösung von 250 ul zu ergeben und Fortsetzen der Hybridisierung für 30 bis 60 Minuten bei 42ºC.
- Entfernen der Körner von der Vorhybridisierungstemperatur, Zentrifugieren der Körner auf dem Boden des Gefäßes und Entfernen der Vorhybridisierungslösung, kurz bevor die Körner zum Einfang verwendet werden. Anschließendes Stellen der Körner auf 37ºC und Überführen der 250 ul Hybridisierungslösung (Zielsubstanz und markierte Sonde) zu den Körnern. Resuspendieren der Körner in der Hybridisierungslösung und Schütteln alle 5 Minuten. Halten für 60 Minuten bei 37ºC.
- Vorbereitung von Szintillationsgefäßen und Pipetten während die Körner den Hybridisierungskomplex einfangen.
- Zentrifugieren der Körner (5 bis 10 Sekunden) und Entfernen der Hybridisierungslösung nach 60 Minuten für den Einfang.
- Zugabe von 1 ml vorgewärmtem (37ºC) 2x SSC zu den Körnern, Schütteln des Gefäßes und Zentrifugieren für 5 bis 10 Sekunden. Entfernen der Waschlösung und noch zweimaliges Wiederholen des Waschgangs.
- Zählen der Körner für jede Probe unter Verwendung des Szintillationszählers (z.B. ein Beckman LS7800) nach Entfernung der letzten Waschlösung.
- Eluierung der markierten Sonde von den Körnern:
- Zur Rückgewinnung der Isotopen-markierten Sonde von den Körnern werden die Körner in 100 bis 1000 ul Wasser resuspendiert und für 5 Minuten auf 100ºC erhitzt.
- Die Suspension wird in Disposäulen (Quik-Sep) überführt und zum Sammeln der Eluierungslösung geschleudert.
- Diese Lösung sollte 80 % der mit den Körnern assoziierten Markierung enthalten. Die Markierung kann durch Lyophilisierung konzentriert werden.
- Durch Subtraktion der Hintergrundimpulse, die von dem mit humaner negativer Kontroll-DNA verwendeten festen Träger erhalten wurden, von den Impulsen, die von dem festen Träger mit der Probenukleinsäure stammen, von der man annimmt, daß sie Analyten enthält, wird das Signal vom festen Träger mit Probennukleinsäure aufgrund der Markierung auf dem mit Analyten hybridisierten Oliognukleotid bestimmt.
- Wie oben erwähnt, wurde festgestellt, daß die Verwendung von Dextransulfat (bei einer Konzentration von 5 % bis 20 %, vorzugsweise etwa 10 %) mindestens bei der Einfanghybridisierung das Verhältnis von Signal zu Rauschen bei der Verwendung fester Träger gemäß vorliegender Erfindung zum Nachweis von Nukleinsäureanalyten merkbar verbessert. Dies ist bei den im vorliegenden Beispiel verwendeten Körnern zum Nachweis des HIV-1 Genoms als Analyt der Fall.
- Wie im vorliegenden Beispiel weiter erwähnt, wurde festgestellt, daß die Verwendung von Dextransulfat (in einer Konzentration von 5 % bis 20 %, vorzugsweise etwa 10 %) auch in der Vorhybridisierungslösung günstig ist, um das Verhältnis von Signal zu Rauschen bei der Verwendung erfindungsgemäßer fester Träger zum Nachweis eines Nukleinsäureanalyten zu erhöhen.
- In einer weniger bevorzugten Modifizierung der vorstehenden Prozedur dieses Beispiels kann eine nicht-homologe (in der vorliegenden Beschreibung auch als "inert" bezeichnete) Nukleinsäure, wie etwa sonifizierte Lachssperma-DNA der Vorhybridisierungslösung in einer Konzentration von etwa 1 mg/ml zugesetzt werden.
Claims (16)
1. Verfahren zum Nachweis eines einzelsträngigen
Nukleinsäureanalyten in einer Probe unter Verwendung:
(a) eines festen Trägers, der eine erste Sonde enthält,
die ein einzelsträngiges Oligonukleotid zwischen 15 und
100 Basen in einer Sequenz ist, die komplementär zu der
Sequenz eines ersten Segments des Analyten ist, wobei
ein erheblicher Anteil der ersten Sonde, die Teil des
festen Trägers ist, kovalent und nur durch einen Linker,
der entweder mit dem 5'-Sauerstoff des 5'-terminalen
Nukleosids oder dem 3'-Sauerstoff des 3'-terminalen
Nukleosids verknüpft ist, an den Träger gebunden ist
und
(b) einer zweiten Sonde, die ein einzelsträngiges
Oligonukleotid mit einer Sequenz ist, die komplementär zu
der Sequenz eines zweiten Segments des Analyten ist und
zum Nachweis markiert ist, vorausgesetzt, daß die
Sequenz der zweiten Sonde nicht komplementär zu der der
ersten Sonde ist und das zweite Segment nicht mit dem
ersten Segment überlappt, wobei das Verfahren umfaßt:
(1) Inkubieren des festen Trägers unter
Vorhybridisierungsbedingungen mit einer
Vorhybridisierungslösung, die (i) eine nicht-homologe Nukleinsäure oder (ii)
Dextransulfat in einer Konzentration zwischen etwa 5 %
(Gew./Vol.) und 20 % (Gew./Vol.) oder sowohl (i) als
auch (ii) umfaßt,
(2) Inkubieren des gemäß Schritt (1)
vorhybridisierten festen Trägers unter Hybridisierungsbedingungen
mit einer Hybridisierungslösung, die zwischen etwa 5 %
(Gew./Vol.) und 20 % (Gew./Vol.) Dextransulfat,
Nukleinsäure aus der zu testenden Probe einschließlich des
Analyten, sofern er in der Probe vorhanden ist, und die
zweite Sonde in molarem Überschuß relativ zur Menge des
Analyten in der Hybridisierungslösung enthält,
(3) Waschen des festen Trägers nach Schritt (2),
um eine zweite Sonde davon zu entfernen, die nicht
stabil mit dem Analyten hybridisiert hat und
(4) Bestimmen nach Schritt (3), ob ein Signal
aufgrund der nachweisbaren Markierung an der mit dem
Analyten hybridisierten zweiten Sonde mit dem festen
Träger assoziiert ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der feste Träger, an
den die erste Sonde gebunden ist, ausgewählt ist aus:
(A) porösem Silikatglas, das an Siliciumatomen
derivatisiert ist mit
(1) Gruppen der Formel
-(CH&sub2;)n(NH)(CO)(CH&sub2;)cR&sub1; und
-(CH&sub2;)n(NH)(PO&sub2;)O-(Oligo),
wobei im wesentlichen kein Silicium mit einer Gruppe
derivatisiert ist, die mit einer Aminogruppe endet,
worin c 0 bis 5 ist, n 2 bis 8 ist, R&sub1; Methyl oder
Benzyl ist, -O-(Oligo) die Oligonukleotidsonde ist und das
mit (Oligo) verknüpfte Sauerstoffatom der 5'-Sauerstoff
des 5'-Nukleosids oder der 3'-Sauerstoff des
3'-Nukleosids der Sonde ist, oder
(2) Gruppen der Formel
-L&sub1;-CO&sub2;H und
(i) -L&sub1;-(CO)(NH)(CH&sub2;)pNH(PO&sub2;)O-(Oligo) oder
(ii) -L&sub1;-(CO)(NH)(CH&sub2;)pSS(CH&sub2;)rNH(PO&sub2;)O-(Oligo),
worin -L&sub1; -(CH&sub2;)n(NH)(CO)(CH&sub2;)m- ist, worin die Gruppe
-(CH&sub2;)n mit einemSiliciumatom verknüpft ist und worin
m, n, p und r gleich oder verschieden und jeweils 2 bis
8 sind, oder
(3) Gruppen der Formel
und
(B) einem quervernetzten, makroporigen Dextranmaterial,
das an Hydroxyl-Sauerstoffatomen, die sich an
Kohlenstoffatomen der Zuckergruppierungen befinden, die
mindestens ein benachbartes Kohlenstoffatom mit einem
nichtderivatisierten Hydroxyl aufweisen, derivatisiert ist
mit
(1) Gruppen der Formel
-C(=NH)NH(CH&sub2;)q(NH)(CO)(CH&sub2;)cR&sub1; und
-C(=NH)NH(CH&sub2;)q(NH)(CO)(CH&sub2;)pNH(PO&sub2;)O-(Oligo),
wobei im wesentlichen kein Hydroxyl-Sauerstoffatom mit
einer Gruppe derivatisiert ist, die mit einer
Aminogruppe endet, oder
(2) einer Gruppe der Formel
-C(=NH)NH(CH&sub2;)p(NH)(PO&sub2;)O-(Oligo) oder
(3) Gruppen der Formel
-C(=NH)NH(CH&sub2;)gCO&sub2;H und
(i) L&sub2;-NH(PO&sub2;)O-(Oligo), oder
(ii) L&sub2;-SS(CH&sub2;)rNH(PO&sub2;)O-(Oligo),
worin c, q, p und r gleich oder verschieden sind und q 2
bis 10 ist und worin L&sub2;
-C(=NH)NH(CH&sub2;)q(CO)(NH)(CH&sub2;)p-
ist, worin die -C(=NH)-Gruppe mit einem
Hydroxyl-Sauerstoff des Dextrans verknüpft ist oder
(4) Gruppen der Formel
-C(=NH)NH(CH&sub2;)nSH und
-C(=NH)NH(CH&sub2;)nSS(CH&sub2;)pNH(PO&sub2;)O-(Oligo)
und
(C) Polystyrol, welches gegebenenfalls mit einem
Quervernetzungsmittel wie etwa Divinylbenzol quervernetzt
sein kann, und das an Phenylgruppen derivatisiert ist
mit
(1) Gruppen der Formel
-(CH&sub2;)sCO&sub2;H und
(i) L&sub3;-NH(PO&sub2;)O-(Oligo) oder
(ii) L&sub2;-SS(CH&sub2;)nNH(PO&sub2;)O-(Oligo),
worin L&sub3; -(CH&sub2;)s(CO)(NH)(CH&sub2;)p- ist, worin die (CH&sub2;)s-
Gruppe mit einer Phenylgruppe des Polystyrols verknüpft
ist und worin s, p und n gleich oder verschieden sind
und s 2 bis 10 ist, oder
(2) Gruppen der Formel
-(CH&sub2;)s(CO)(NH)(CH&sub2;)p(NH)(CO)(CH&sub2;)cR&sub1; und
-(CH&sub2;)s(CO)(NH)(CH&sub2;)p(NH)(PO&sub2;)O-(Oligo),
wobei im wesentlichen keine Phenylgruppe mit einer
Gruppe derivatisiert ist, die mit einer Aminogruppe endet,
oder
(3) Gruppen der Formel
-(CH&sub2;)s(CO)(NH)(CH&sub2;)pSH und
-(CH&sub2;)s(CO)(NH)(CH&sub2;)pSS(CH&sub2;)nNH(PO&sub2;)-(Oligo).
3. Verfahren nach Anspruch 2, worin die erste Sonde durch
den 5'-Sauerstoff des 5'-Nukleosids an den festen Träger
gebunden ist und worin der feste Träger mit der daran
gebundenen ersten Sonde ausgewählt ist aus:
(A) einem Glas mit kontrollierten Poren in Form von
Körnern eines Durchmessers zwischen etwa 100 und etwa
200 um (Micron) und einem Porendurchmesser zwischen etwa
0,04 um und 0,06 um (400 bis 600 Angström) und das an
Siliciumatomen derivatisiert ist mit Gruppen der Formel
-(CH&sub2;)a(NH)(CO)(CH&sub2;)bCH&sub3; und
-(CH&sub2;)a(NH)(PO&sub2;)O-(Oligo)
wobei im wesentlichen kein Siliciumatom mit einer Gruppe
derivatisiert ist, die mit einer Aminogruppe endet,
worin a 3 oder 6 ist und b 0, 1 oder 2 ist und
(B) einem makroporigen Material, das durch
Quervernetzung von Allyldextran mit N,N'-Methylenbisacrylamid
hergestellt wurde, in Form von Körnern mit einem
Naßdurchmesser zwischen etwa 30 und etwa 120 um (Micron)
und einem Ausschlußvolumen für Dextrane zwischen etwa
10&sup6; Dalton und etwa 10&sup8; Dalton und das an Hydroxyl-
Sauerstoffatomen, die sich an Kohlenstoffatomen der
Zuckergruppierungen befinden, die mindestens ein
benachbartes Kohlenstoffatom mit einem nicht-derivatisierten
Hydroxyl enthalten, derivatisiert ist mit Gruppen der
Formel
-C(=NH)NH(CH&sub2;)&sub6;NH(CO)(CH&sub2;)bCH&sub3; und
-C(=NH)NH(CH&sub2;)&sub6;NH(CO)(CH&sub2;)pNH(PO&sub2;)O-(Oligo)
oder
-C(=NH)NH(CH&sub2;)&sub6;NH(PO&sub2;)O-(Oligo),
wobei im wesentlichen kein Hydroxyl-Sauerstoffatom mit
einer Gruppe derivatisiert ist, die mit einer
Aminogruppe endet.
4. Verfahren nach Anspruch 2, worin die erste Sonde durch
den 5'-Sauerstoff des 5'-Nukleosids an den festen Träger
gebunden ist und worin der feste Träger mit der daran
gebundenen ersten Sonde ausgewählt ist aus:
(A) einem Glas mit kontrollierten Poren in Form von
Körnern eines Durchmessers zwischen etwa 100 und etwa
200 um (Micron) und einem Porendurchmesser zwischen etwa
0,04 um und 0,06 um (400 bis 600 Angström) und das an
Siliciumatomen derivatisiert ist mit Gruppen der Formel
-(CH&sub2;)&sub3;NH(CO)(CH&sub2;)&sub2;CO&sub2;H und
-(CH&sub2;)&sub3;NH(CO)(CH&sub2;)&sub2;(CO)(NH)(CH&sub2;)&sub6;NH(PO&sub2;)O-(Oligo)
und
(B) einem makroporigen Material, das durch
Quervernetzung von Allyldextran mit N,N'-Methylenbisacrylamid
hergestellt wurde, in Form von Körnern mit einem
Naßdurchmesser zwischen etwa 30 und etwa 120 um (Micron)
und einem Ausschlußvolumen für Dextrane zwischen etwa
10&sup6; Dalton und etwa 10&sup8; Dalton und das an Hydroxyl-
Sauerstoffatomen, die sich an Kohlenstoffatomen der
Zuckergruppierungen befinden, die mindestens ein
benachbartes Kohlenstoffatom mit einem nicht-derivatisierten
Hydroxyl enthalten, derivatisiert ist mit Gruppen der
Formel
-C(=NH)NH(CH&sub2;)&sub5;CO&sub2;H und
-C(=NH)NH(CH&sub2;)&sub5;(CO)(NH)(CH&sub2;)&sub6;NH(PO&sub2;)O-(Oligo).
und
(C) mit 0 % bis etwa 16 % Divinylbenzol quervernetzten
Polystyrolkörnern von einer Größe zwischen etwa 60 und
500 mesh, die an den Polystyrol-Phenylgruppen
derivatisiert sind mit Gruppen der Formel
-(CH&sub2;)&sub4;CO&sub2;H und
-(CH&sub2;)&sub4;(CO)(NH)(CH&sub2;)&sub6;(NH)(PO&sub2;)O-(Oligo)
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, worin sowohl die erste
Sonde als auch die zweite Sonde 25 bis 50 Basen
aufweisen und die zweite Sonde radioaktiv markiert ist.
6. Verfahren nach Anspruch 5, worin die radioaktive
Markierung auf der zweiten Sonde ein ³²P einer an den
5'-Kohlenstoff des 5'-Nukleosids gebundenen Phosphatgruppe
ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, worin sowohl die
Vorhybridisierungslösung als auch die Hybridisierungslösung
zwischen etwa 8 % (Gew./Vol.) und etwa 12 % (Gew./Vol.)
Dextransulfat umfassen.
8. Verfahren nach Anspruch 7, worin vor Schritt (2) gemäß
Anspruch 1 Nukleinsäure aus der zu testenden Probe unter
Hybridisierungsbedingungen in einer ersten
Hybridisierungslösung
inkubiert wird, die einen molaren Überschuß
an zweiter Sonde bezüglich der Konzentration des
Analyten in der Hybridisierungslösung aufweist, bis ein
nennenswerter Anteil eines vorhandenen Analyten mit der
zweiten Sonde hybridisiert hat, und dann Schritt (2)
gemäß Anspruch 1 durch Vereinigung des gemäß Schritt (1)
von Anspruch 1 vorhybridisierten festen Trägers mit der
ersten Hybridisierungslösung und Eintauchen in eine
zweite Hybridisierungslösung gestartet wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, worin der
Analyt das Genom eines HIV-1-Virus oder ein Fragment
davon ist, das Segmente mit Sequenzen umfaßt, die
komplementär zur ersten Sonde und zur zweiten Sonde sind.
10. Fester Träger zur Anwendung bei dem Verfahren nach einem
der Ansprüche 1 bis 9 mit einer daran gebundenen
einzelsträngigen Oligonukleotidsonde von 15 bis 100 Basen und
ausgewählt aus
(A) porösem Silikatglas, das an Siliciumatomen
derivatisiert ist mit
(1) Gruppen der Formel
-(CH&sub2;)n(NH)(CO)(CH&sub2;)cR&sub1; und
-(CH&sub2;)n(NH)(PO&sub2;)O-(Oligo),
wobei im wesentlichen kein Silicium mit einer Gruppe
derivatisiert ist, die mit einer Aminogruppe endet,
worin c 0 bis 5 ist, n 2 bis 8 ist, R&sub1; Methyl oder
Benzyl ist, -O-(Oligo) die Oligonukleotidsonde ist und das
mit (Oligo) verknüpfte Sauerstoffatom der 5'-Sauerstoff
des 5'-Nukleosids oder der 3'-Sauerstoff des
3'-Nukleosids der Sonde ist, oder
(2) Gruppen der Formel
-L&sub1;-CO&sub2;H und
(i) -L&sub1;-(CO)(NH)(CH2)pNH(PO&sub2;)O-(Oligo) oder
(ii) -L&sub1;-(CO)(NH)(CH&sub2;)pSS(CH&sub2;)rNH(PO&sub2;)O-(Oligo),
worin -L&sub1;-(CH&sub2;)n(NH)(CO)(CH&sub2;)m- ist, worin die Gruppe
-(CH&sub2;)n mit einem Siliciumatom verknüpft ist und worin
m, n, p und r gleich oder verschieden und jeweils 2 bis
8 sind, oder
(3) Gruppen der Formel
und
(B) einem quervernetzten, makroporigen Dextranmaterial,
das an Hydroxyl-Sauerstoffatomen, die sich an
Kohlenstoffatomen der Zuckergruppierungen befinden, die
mindestens ein benachbartes Kohlenstoffatom mit einem
nichtderivatisierten Hydroxyl aufweisen, derivatisiert ist
mit
(1) Gruppen der Formel
-C(=NH)NH(CH&sub2;)q(NH)(CO)(CH&sub2;)cR&sub1; und
-C(=NH)NH(CH&sub2;)q(NH)(CO)(CH&sub2;)pNH(PO&sub2;)O-(Oligo),
wobei im wesentlichen kein Hydroxyl-Sauerstoffatom mit
einer Gruppe derivatisiert ist, die mit einer
Aminogruppe endet, oder
(2) einer Gruppe der Formel
C(=NH)NH(CH&sub2;)p(NH)(PO&sub2;)O-(Oligo) oder
(3) Gruppen der Formel
-C(=NH)NH(CH&sub2;)qCO&sub2;H und
(i) L&sub2;-NH(PO&sub2;)O-(Oligo), oder
(ii) L&sub2;-SS(CH&sub2;)rNH(PO&sub2;)O-(Oligo),
worin c, q, p und r gleich oder verschieden sind und q 2
bis 10 ist und worin L&sub2;
-C(=NH)NH(CH&sub2;)q(CO)(NH)(CH&sub2;)p-
ist, worin die -C(=NH)-Gruppe mit einem
Hydroxyl-Sauerstoff des Dextrans verknüpft ist oder
(4) Gruppen der Formel
-C(=NH)NH(CH&sub2;)nSH und
-C(=NH)NH(CH&sub2;)nSS(CH&sub2;)pNH(PO&sub2;)O-(Oligo)
und
(C) Polystyrol, welches gegebenenfalls mit einem
Quervernetzungsmittel wie etwa Divinylbenzol quervernetzt
sein kann, und das an Phenylgruppen derivatisiert ist
mit
(1) Gruppen der Formel
-(CH&sub2;)sCO&sub2;H und
(i) L&sub3;-NH(PO&sub2;)O-(Oligo) oder
(ii) L&sub3;-SS(CH&sub2;)nNH(PO&sub2;)O-(Oligo),
worin L&sub3; -(CH&sub2;)s(CO)(NH)(CH&sub2;)p- ist, worin die (CH&sub2;)s-
Gruppe mit einer Phenylgruppe des Polystyrols verknüpft
ist und worin s, p und n gleich oder verschieden sind
und s 2 bis 10 ist, oder
(2) Gruppen der Formel
-(CH&sub2;)s(CO)(NH)(CH&sub2;)p(NH)(CO)(CH&sub2;)cR&sub1; und
-(CH&sub2;)s(CO)(NH)(CH&sub2;)p(NH)(PO&sub2;)O-(Oligo),
wobei im wesentlichen keine Phenylgruppe mit einer
Gruppe derivatisiert ist, die mit einer Aminogruppe endet,
oder
(3) Gruppen der Formel
-(CH&sub2;)s(CO)(NH)(CH&sub2;)pSH und
-(CH&sub2;)s(CO)(NH)(CH&sub2;)pSS(CH&sub2;)nNH(PO&sub2;)O-(Oligo).
11. Fester Träger nach Anspruch 10, worin das Oligonukleotid
durch den 5'-Sauerstoff des 5'-Nukleosids gebunden ist
und worin der Träger ausgewählt ist aus:
(A) einem Glas mit kontrollierten Poren in Form von
Körnern eines Durchmessers zwischen etwa 100 und 200 um
(Micron) und einem Porendurchmesser zwischen etwa 0,04
und 0,06 um (400 bis 600 Angström) und an Siliciumatomen
derivatisiert ist mit Gruppen der Formel
-(CH&sub2;)a(NH)(CO)(CH&sub2;)bCH&sub3; und
-(CH&sub2;)a(NH)(PO&sub2;)O-(Oligo)
wobei im wesentlichen kein Siliciumatom mit einer Gruppe
derivatisiert ist, die mit einer Aminogruppe endet,
worin a 3 oder 6 ist und b 0, 1 oder 2 ist und
(B) einem makroporigen Material, das durch
Quervernetzung von Allyldextran mit N,N'-Methylenbisacrylamid
hergestellt wurde, in Form von Körnern mit einem
Naßdurchmesser zwischen etwa 30 und etwa 120 um (Micron)
und einem Ausschlußvolumen für Dextrane zwischen etwa
10&sup6; Dalton und etwa 10&sup8; Dalton und das an Hydroxyl-
Sauerstoffatomen, die sich an Kohlenstoffatomen der
Zuckergruppen befinden, die mindestens ein
benachbartes Kohlenstoffatom mit einem nicht-derivatisierten
Hydroxyl enthalten, derivatisiert ist mit Gruppen der
Formel
-C(=NH)NH(CH&sub2;)&sub6;NH(CO)(CH&sub2;)bCH&sub3; und
-C(=NH)NH(CH&sub2;)&sub6;NH(CO)(CH&sub2;)&sub6;NH(PO&sub2;)O-(Oligo),
wobei im wesentlichen kein Hydroxyl-Sauerstoffatom mit
einer Gruppe derivatisiert ist, die mit einer
Aminogruppe endet, oder mit einer Gruppe der Formel
-C(=NH)NH(CH&sub2;)&sub6;NH(PO&sub2;)O-(Oligo).
12. Fester Träger nach Anspruch 10, worin das Oligonukleotid
durch den 5'-Sauerstoff des 5'-Nukleosids an den festen
Träger gebunden ist und worin der feste Träger
ausgewählt ist aus:
(A) einem Glas mit kontrollierten Poren in Form von
Körnern eines Durchmessers zwischen etwa 100 und etwa
200 um (Micron) und einem Porendurchmesser zwischen etwa
0,04 und 0,06 um (400 bis 600 Angström) und an
Siliciumatomen derivatisiert ist mit Gruppen der Formel
-(CH&sub2;)&sub3;NH(CO)(CH&sub2;)&sub2;CO&sub2;H und
-(CH&sub2;)&sub3;NH(CO)(CH&sub2;)&sub2;(CO)(NH)(CH&sub2;)&sub6;NH(PO&sub2;)O-(Oligo)
und
(B) einem makroporigen Material, das durch
Quervernetzung von Allyldextran mit N,N'-Methylenbisacrylamid
hergestellt wurde, in Form von Körnern mit einem
Naßdurchmesser zwischen etwa 30 und etwa 120 um (Micron)
und einem Ausschlußvolumen für Dextrane zwischen etwa
10&sup6; Dalton und etwa 10&sup8; Dalton und das an Hydroxyl-
Sauerstoffatomen, die sich an Kohlenstoffatomen der
Zuckergruppen befinden, die mindestens ein
benachbartes Kohlenstoffatom mit einem nicht-derivatisierten
Hydroxyl enthalten, derivatisiert ist mit Gruppen der
Formel
-C(=NH)NH(CH&sub2;)&sub5;CO&sub2;H und
-C(=NH)NH(CH&sub2;)&sub5;(CO)(NH)(CH&sub2;)&sub6;NH(PO&sub2;)O-(Oligo)
und
(C) mit 0 % bis etwa 16 % Divinylbenzol quervernetzten
Polystyrolkörnern von einer Größe zwischen etwa 60 und
500 mesh, die an den Polystyrol-Phenylgruppen
derivatisiert sind mit Gruppen der Formel
-(CH&sub2;)&sub4;CO&sub2;H und
-(CH&sub2;)&sub4;(CO)(NH)(CH&sub2;)&sub2;(NH)(PO&sub2;)O-(Oligo).
13. Fester Träger nach Anspruch 11 oder 12, worin das
Oligonukleotid 25 bis 50 Basen besitzt.
14. Fester Träger nach Anspruch 13, worin das Oligonukleotid
eine DNA oder RNA ist, die eine Sequenz aufweist, die
komplementär zur Sequenz eines Segments des Genoms von
HIV-1 ist.
15. Testkit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der
Ansprüche 1 bis 9 zum Nachweis eines einzelsträngigen
Nukleinsäureanalyten in einem
Nukleinsäuresonden-Sandwichassay, wobei der Kit umfaßt (A) einen festen Träger
nach einem der Ansprüche 12 bis 16, worin (Oligo) eine
Sequenz besitzt, die komplementär zur Sequenz eines
ersten Segements des Analyten ist und (B) eine zweite
Sonde, die ein einzelsträngiges Oligonukleotid mit einer
Sequenz ist, die komplementär zur Sequenz eines zweiten
Segments des Analyten ist und zum Nachweis markiert ist,
vorausgesetzt, daß die Sequenz der ersten Sonde nicht
komplementär zu der der zweiten Sonde ist und daß das
zweite Segment nicht mit dem ersten Segment überlappt.
16. RNA oder DNA zur Anwendung im Verfahren nach einem der
Ansprüche 1 bis 9 mit einer Sequenz, die aus der Gruppe
ausgewählt ist, bestehend aus:
und jeder Sequenz, die komplementär zu einer der oben
spezifizierten ist,
unter der Voraussetzung, daß in einer RNA ein T in den
oben spezifizierten Sequenzen ein Uridin bedeutet.
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