DE1642637A1

DE1642637A1 - Milchgerinnungsenzym und Verfahren zu seiner Erzeugung

Info

Publication number: DE1642637A1
Application number: DE1968K0064985
Authority: DE
Inventors: Masanobu Kawai; Noboru Mukai
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1967-03-14
Filing date: 1968-03-11
Publication date: 1972-02-17
Also published as: CH501729A; NL6803435A; DK115102B; FR1568170A; NO134260C; IT1021505B; NO134260B; FI44364B; US3607655A; GB1177054A

Description

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Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Tokyo, Japan

Milohgerlnnungsenzym und Verfahren zu seiner Erzeugung

Zusammenfassung:

Das Verfahren zur Erzeugung des Mi lchgerinnungs enzyrns «furch Fermentation besteht darin, dass ein Mikroorganismus der zu der Gattung Irpex, Fomitopsis, Coriolus oder Lenzites gehört, in einem Nährmedium unter aeroben Bedingungen gezüchtet wird. Das Enzym reichert sich in der Nährflüssigkeit an und kann daraus gewonnen und so behandelt werden, dass ein festes Enzymprodukt erhalten wird, das zum Beispiel bei der Käseherstellung benutzt werden kann.

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OHtGlNAL

Die Erfindung bezieht sich auf ein Milcngerl/Uiungsenzym. liu spezielleren bezieht sie sich auf ein Milchgerlnnungsenzym und auf ein Verfahren zu seiner Erzeugung durch Fermentation. Im noch spezielleren bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Erzeugung eines MiIchgerinnu.igsenzyms durch Fermentation mit Basidiomyoetes.

Aus der Literatur ist es bekannt, dass Labferrnent, das aus dein Labmagen des Kalbes gewonnen worden ist, sin gut bekanntem, bei der Käseherstellung unentbehrliches MSchgerinriungsenzym ist. Einige wenige MiIchgorinnungsenzyme, die durch Züchten von Mikroorganismen erhalten werden, kommen als Ersatzenzyme für das Labferment in Betracht. Ein Beispiel dafür ist das Verfahren zur Erzeugung eines Milchg^rinnungsenzyms durch Schimmelpilz, das in der japanischen Patentveröffentlichung 18 8j5O/65 beschrieuen wird. Es sind jedoch sehr wenige Verfahren, wenn überhaupt, zur Erzeugung von MiIchgerinnungsenzymen entwickelt worden, die für eine industrielle Produktion geeignet sind.

Als Ergebnis von Studien über hydro lysierentie Enzyme, die beim Züchten von Basidiomycett-S erzeugt weraen, haben die Erfinder vorliegender Erfindung ein Enzym gefunden, das eine verhältnismassig schwache proteolytische Wirkung und ein starkes Milchgerinnungsvermögen hat, nämlich ein bei der Herstellung von Käse äusserst urauchbares Milchgerinnungsenzym, das in einem industrieilen Maßstao mit geringen Kosten erzeugt werden kann.

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üemjemäss ist eines der Ziele der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes Verfahren für axe Erzeugung von brauchbarem Milch-Cerinnungsenzym zu schaffen, das die Nachteile und Unzulänglichkeiten der früher bekannten Methoden nicht besitzt.

Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Erzeugung eines Milchgerinnungsenzyms durch Fermentation zu schaffen, das in wirksamer und einfacher l.^:eise aus-geführt werden kann.

Ein weitere Ziel cer Erfindung besteht in der Schaffung eines Verfahrens zur Erzeugung eines MiIchgerinnungsenzyms durch Fermentation, das in vorteilhafter¹ Weise in industriellem Maßstab mit geringen Kosten mit einer hohen Produktionsausbeite ausgeführt werden kann.

Noch ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Schaffung eines Milchgerinnungsenzyms.

Diese unJ andere Ziele und Vorteile der vorliegenden Erfindung worden für den Fachmann aus der nachfolgenden Beschreibung und den Ansprüchen ersichtlich sein.

Nach der vorliegenden Erfindung ist gefunden worden, dass ein Hilchgerinnungsenzym, das zum Beispiel bei der Herstellung von Käse ^rauchbai· ist, beim Züchten von Basidiomycetes, die au den Gatturfen Irpox, Fomitopsis, Coriolus und Lenzites gehören, er-

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zeugt wird. Als Nährmedium kann ein festes Medium zum Züchten dieser Mikroorganismen verwendet werden. Im allgemeinen ist es bei industrieller Erzeugung vorteilhafter, ein flüssiges Medium zu benutzen. Es gibt viele Fälle, in denen besonders ausgezeichnete Ergebnisse erhalten werden, wenn das Züchten unter Belüftung und Bewegung vorgenommen wird.

Es ist sowohl ein synthetisches Züchtungsmedium als auch ein natürliches Nährsubstrat bei vorliegender Erfindung geeignet, vorausgesetzt, dass es die notwendigen Nährstoffe für das Wachstum des verwendeten Stammes enthält. Zu solchen Nährstoffen gehören in angemessenen Mengen Substanzen, wie ein Kohlenstofflieferant, * ein Stickstofflieferant, anorganische Verbindungen und dergl., die durch die angewendeten Mikroorganismen verbraucht werden könne». So können als Kohlenstofflieferant zum Beispiel Kohlehydrate, wie Stärke, Dextrin, Rohrzucker, Milchzucker, Maltoae, Glukose, schwarz-ölige Melasse, Stx\|jkehydrolysate usw., oder andere geeignete Kohlenstofflieferanten, wie Holzhydrolysat usw., erwähnt werden. Diese Substanzen können für sich oder in Mischung von zwei oder mehreren benutzt werden. Als Stickstofflieferant können zahlreiche anorganische oder organische Salze oder Verbindungen, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat, Ammondmmphosphat usw., oder natürliche stickstoffhaltige Substanzen, wie flüssiger Maisauszug ( cornsteep liquor ), Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Bouillon, Kaseinhydrolysat, Sojabohnenmehl, Weizenkleie, Hefe, Fischauszüge, Extrakt von Reiskleie usw., verwendet werden. Diese Substanzen können

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wiederum entweder für sich oder in Kombination von zwei oder mehreren verwendet werden. Zu anorganischen Verbindungen, die zu dem ' Züchtungsmedium hinzugefügt werden können, gehören Salze, wie Phosphate, Magnesiumsalze, Zinksalze, Kupfersalze, Eisensalze usw., zum Beispiel Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Eisensulfat, Manganchlorid, Calciumchlorid, Natriumchlorid und dergl. Ferner können dem Me- ■ dium in geeigneter Je nach Wunsch Nährstoffe, wie Vitamine, wachstumsfördernde Substanzen, zum Beispiel Biotin, oder Aminosäuren, wie Glutaminsäure oder Asparaginsäure, und dergl. zugesetzt werden.

Eine charakteristische bevorzugte Zusammensetzung des Züchtungsmediums bei einer Belüftungs-Bewegungs-Züchtung besteht zum Beispiel in der Kombination von Ammoniumchlorid, Stärke und anorganischen Salzen. Andere charakteristische Nährzusammensetzungen werden in den späteren Beispielen angegeben. ;

Das Züchten wird unter aeroben Bedingungen bei einer Züchtungstemperatur von vorzugsweise etwa 25° bis 35° C ausgeführt. Das pH des Mediums während des Züchtens sollte in dem Bereich von 2 bis 7 gehalten werden. Im allgemeinen wird das Züchten 2-10 TageÄng vorgenommen.

Ein MiIchgerinnungsenzym wird durch Züchten, wie es eben beschrieben wurde, erzeugt. Sobald das Enzym von der Kulturflüssigkeit abgetrennt worden -ist, kann das KulturfiItrat, das durch Abfil-

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trieren der Zellen der Mikroorganismen erhalten worden ist, nach üblichen Methoden, wie einer Enzymreinigungsmethode und dergl., zum Beispiel durch Ausfällen mit einem organischen Lösungsmittel, Aussalzen, Konzentrieren unter vermindertem Druck, Absorption und Desorption und dergl., konzentriert oder verfestigt werden. Verfahren, bei denen anorganische Salze, wie Ammoniumsulfat, Natriumchlorid usw., oder organische Lösungsmittel, wie Methanol, Aceton, Isopropy!alkohol usw., zu der Enzymlösung hinzugegeben werden, sind am einfachsten anwendbar. Die Anteile der zuzugebenden anorganischen Salze oder organischen Lösungsmittel wechseln mit dem benutzten speziellen Mittel. Zum Beispiel wird das Milchgerinnungsenzym durch Zugabe von Ammoniumsulfat in einer Sättigungsmenge von 60 - 70 Gew.-$ oder durch Zugabe der meisten Arten von wasserlöslichen Lösungsmitteln in einem Anteil von 100 - 250 Vol.~?ä/Vol. ausgefällt. Mit diesen Konzentrationen können die in jeder Lösung lösbaren Verunreinigungen niedergeschlagen werden.

Wie oben festgestellt worden ist, wird die vorliegende Erfindung durch Züchten von Mikroorganismen, die zu den Gattungen Irpex, Fomitopsis, Coriolus, oder Lenzites gehören, in einem wässrigen Nährmedium ausgeführt. Diese Mikroorganismen werden in "Genshoku Nippon Kinrui Zukan" ( Farbige Encyclopädie von japanischen Mikroorganismen ), Vol. 1, 1957 und Vol. 2, I965, veröffentlicht von Hoiku-sha, und in "Genera10f FolypJaceae of Nippon" ( Bulletin ,. des Tokyo Kagaku Museums ) Nr. 6, 1-111 (19²O) beschrieben. Qie Verwendung dieser Mikroorganismen zur Erzeugung eines Milchgerin?· nungsenzyms ist bisher noch nicht bekannt gewesen, und diese$

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stellt eine der neuen Erkenntnisse der vorliegenden Erfindung dar.

Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der vorliegenden Erfindung und sollen nicht als Begrenzung aufgefasst werden. Wenn es nicht anders angegeben wird, beziehen sich die Prozente in den Beispielen und in dem gesamten vorliegenden Text auf das Gewicht.

Beispiel 1 "

Es werden 20 1 eines Nährmediums, das 5 # Stärke, 0,3 % Ammoniumchlorid, 0,3 ',o Hefeextrakt und anorganische Salze enthält, hergestellt und sterilisiert. Das Nährmedium hat ein pH von 5*5· Anschliessend werden Hyphen von einem Stamm, der zu der Gattung Irpex lacteus Fr. IFO5367 ( IFO: Institute for Fermentation, Osaka, Japan ) gehört, in das Medium eingeimpft. Das Züchten wird dann bei 30° C und 400 Umdrehungen je Minute mit Belüftung mit einer Geschwindigkeit von 15 l/Minute 90 Stunden lang vorgenommen.

Nach Beendigung des Züchtens beträgt die Milchgerinnungsstärke des Kult:Py,filtrats, das durch Abfiltrieren der Zellen des-Mikroorganismus erhalten wurde, 600 Einheiten/ml. Eine Einheit für die Milchgerinnungsstarke entspricht der Enzymmenge, die erforderlich ist, die Koagulation von 3|ml handelsüblicher Milch mit 0,002 Mol * Calciumchloridgehalt bei Einstellung des pH auf 5,8 bei 35° C in 40 Minuten in Gang zu bringen. Ansehllessend wird Ammoniumsulfat zu dem Kulturfiltrat in einer Sättigungsmenge von 70 Gew.-^ hinzugefügt. Der ausgefällte Niederschlag wird mittels Zentrifugen-

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abscheidung gesammelt, in einer geringen Menge destilliertem Wasser gelöst und über Nacht bei fliessendem Wasser dialysiert. Die Innenlösung der Dialyse wird gefriergetrocknet. Das erhaltene Enzym-Standardprodukt besitzt eine Milchgerinnungsstärke von Einheiten/mg.

Beispiel 2

40 ml Nährmedium, das 5 % Glukose, 0,3 % Ammoniumchlorid, 0,5 % Hefeextrakt und anorganische Salze enthält, werden in einen kgelförmigen 250 ml-Kolben gefüllt und sterilisiert. Das Nährmedium hat ein Anfangs-pH von 4,5· Hyphen des gleichen Stammes, der in Beispiel 1 benutzt worden ist, werden in das Nährmedium eingeimpft. Das Züchten wird dann unter aerobem Schütteln der Kultur bei 30° C 144· ftunden lang vorgenommen.

Eine Enzymlösung wird durch Abfiltrieren der Zellen des Mikroorganismus erhalten. Die Stärke des erhaltenen Filtrats beträgt 450 Einheiten/ml. Anschliessend wird ein Enzym-Standardprodukt mit einer Stärke von 65Ό Einheiten/mg durch Zugabe einer doppelten Menge ( Vol./Vol. ) Aceton zu dem Filtrat zum Ausfällen des aktiven Teils daraus erhalten.

Beispiel 3

20 1 eines Nährmediums, das 5 % Rohrzucker, 2 % flüssigen Maisauszug, 3 '}'-> Hefeextrakt und anorganische Salze enthält, werden auf ein pH von 5,0 eingestellt und sterilisiert. Hyphen eines zu der Gattung Fomitopsis Finicola ATCC 20036 gehörenden Stammes

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werden in das Nährmedium eingeimpft. Das Züchten wird dann bei 30° C 96 Stunden lang bei 400 Umdrehungen je Minute mit Belüftung ' mit einer Geschwindigkeit von 15 1 je Minute vorgenommen.

Nach Beendigung des Züchtens beträgt die Milchgerinnungsstärke der entstandenen Kulturflüssigkeit, die nach dem Abfiltrieren der Zellen des Mikroorganismus erhalten worden ist, 500 Einheiten/rnl.

Von dem Kulturfiltrat wird das Enzym-Standardprodukt auf die gleiche Jeise, wie sie in Beispiel 1 beschrieben wird, isoliert. Die Stärke des entstandenen Produktes beträgt 700 Einheiten/mg.

Beispiel 4

40 ml eines Kulturmediums, das 5 ιό Glukose, 2,5 ti flüssigen Maisauszug, 0,5 ^c/o Hefeextrakt und anorganische Salze enthält, werden in einen kegelförmigen 250 ml-Kolben gebracht, und das gleiche Sterilisierungs- und Beimpfungsverfahren, das in Beispiel 2 beschrieben wird, wird aisgeführt. Das Anfangs-pH des Kulturmediums beträgt 4,5? Der verwendete Mikroorganismus ist der gleiche, der in Beispiel J5 beschrieben wird. Das Züchten'wird unter aerobem Schütteln der Kultur bei 30° C 144 Stunden lang vorgenommen.

Eine Enzymlösung wird durch Abfiltrieren der Zellen des Mikroorganismus erhalten. Die Stärke des Filtrats beträgt 400 Einheiten/ml. Anschliessend wird eine doppelte Menge ( Vol./Vol. ) Aceton zu dem Filtrat hinzugefügt, um die aktiven Anteile daraus

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auszufällen. Als Ergebnis wird ein Enzym-Standardprodukt mit einer MiIchgerinnungsstärke von 600 Einheiten/ml erhalten.

Beispiel 5

Das Züchten wird unter den gleichen Bedingungen und in der gleichen Weise, wie in Beispiel 1, mit der Ausnahme jedoch ausgeführt, dass Lenzites saepiaria Pr. IF06267 ( IPO: Institute for Fermentation, Osaka, Japan ) als Mikroorganismus angewendet und das Züchten 120 Stunden lang vorgenommen wird. Die MiIchgerinnungsstärke des Kulturfiltrats, das nach Beendigung des Züchtens erhalten worden ist, beträgt 530 Einheiten/ml.

Beispiel 6

20 1 eines Kulturmediums, das 5 /j Rohrzucker, 2 >j flüssigen Maisauszug, 0,3 fo Hefeextrakt und anorganische Salze enthält, werden auf ein pH von 5,0 eingestellt und sterilisiert. Anschliessend wird das Kulturmedium mit einem zu Coriolus consorus ATCC 1157^· gehörenden Stamm ueimpft. Das Züchten wird bei 28° C und ²K)O Umdrehungen Je Minute mit Belüftung mit einer Geschwindigkeit von 15 1 je Minute in 90 Stunden vorgenommen.

Nach Beendigung des Züchtens beträgt die Milchgerinnungsstärke des Kulturfiltrats, dasdurch Abfiltrieren der Zellen des Mikroorganismus erhalten worden Ist, 800 EInheiten/rnl.

Anschliessend wird Ammoniumsulfat zu dem Kulturfiltrat In einer Jäfctlgungsmenge von 80 Gew.- > lilnzugei'ügt. Der entstandene Nieder-

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schlag wird durch Zentrifugalabscheidung gesammelt, in einer geringen Menge destilliertem Wasser gelöst und über Nacht" bei fliessendem V/asser dialysiert. Die Innenlösung der Dialyse wird gefriergetrocknet. Die Milchgerinnungsstärke des so erhaltenen Enzym-Standardproduktes beträgt 900 Einheiten/mg.

Beispiel 7

40 ml eines Kulturmediums, das 5 % Glukose, 1 % flüssigen Maisaus zug, 0,2 % Ammoniumchlorid, 0,2 % Hefeextrakt und anorganische \ Salze enthält, werden in einen kegelförmigen 250 ml-Kolben gebracht. Das gleiche Sterilisierungs- und Beimpfungsverfahren, wie es in Beispiel 2 beschrieben wird, wird ausgeführt. Das AnfangspH des Kulturmediums beträgt 4,5· Der verwendete Mikroorganismus ist der gleiche, der in Beispiel 6 beschrieben wird,, Das Züchten wird dann unter aerobem Schütteln der Kultur bei 50° C in 150 Stunden vorgenommen·

Eine Enzymlösung wird durch Abfiltrieren der Zellen des Mikroorganismus erhalten. Die Milchgerinnungsstärke des entstandenen Piltrats beträgt 350 Einheiten/ml. Anschliessend wird die doppelte Menge ( Vol./VoI,) von Aceton zu dem Filtrat hinzugefügt, um den aktiven Teil daraus niederzuschlagen. Der Niederschlag wird im Vakuum getrocknet. Als Ergebnis wird ein Standard-Enzymprodukt , · mit einer Stärke von 500 Einheiten/mg erhalten.

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Beispiel 8

Das Züchten wird in der gleichen Weise, wie es in Beispiel 1 beschrieben wird, 90 Stunden lang mit Coriolus hirsutus ATCC 2O2J5J als Mikroorganismus vorgenommen. Die Milchgerinnungsstärke des Kulturfiltrats, die nach Beendigung des Züchtens erhalten wird, beträgt 620 Einheiten/ml.

Es ist offensichtlich, dass die so beschriebene Erfindung in mannigfaltiger Weise variiert werden kann. Solche Variationen sind nicht so zu verstehen, dass sie ausserhalb des Gegenstandes und des Umfangs der Erfindung liegen, und alle solche Abwandlungen fallen unter die folgenden Ansprüche.

- Patentansprüche -

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Claims

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Patentansprüche :

1. Verfahren aur Erzeugung eines MiIchgerinnungsenzyms durch Fermentation, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Mikroorganismus, der zu einer aus der aus Irpex, Fomitopsis, Coriolus ^unc* kenzites bestehenden Gruppe ausgewählten Gattung gehört, in einem Nährmedium unter aeroben Bedingungen züchtet, das Milchgerinnungsenzym in dem entstandenen Kulturmedium anreichert und das genannte Enzym daraus gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte Nährmedium ein wässriges flüssiges Medium ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Züchten bei einer Temperatur von etwa 25 bis 35 C und be einem pH von .;twa 2 bis 7 vorgenommen wir: ,

4. Verfahren nach Anspruch 1, daüur-cn gekennzeichnet; dasa der goruiruite wikrcOiganismus Irpa:: laoteus Fx-, IF0536? ist»

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3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der genannte Mikroorganismus Fomitopsis Pinicola ATCC 200Jo ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der genannte Mikroorganismus Lenzites saepiaria Fr. IFO6267 ist.

7· Verfahren nach'Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der genannte Mikroorganismus Coriolus consorus ATCC 11574 ist.

o. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der genannte Mikroorganismus Coriolus hirsutus ATCC 202^3 ist.

9· Verfahren zur Erzeugung eines Milchgerinnungsenzyme, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Mikroorganismus, der zu einer aus der der aus Irpe::, ffornltopsls, Coriolus und Lenzites bestehenden Gruppe ausgewählten Gattung gehört, in einem Nährmedium tffcer aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von etwa 25° bis j55° C und einem pH von etwa 2 bis 7 züchtet, das Milchgerinnungsenzym in dem entstandenen Kulturmedium anreichert, das Enzjm aus dem genannten Kulturmedium gewinnt und dann das genannte Enzym zu einem fssten Enzymprodukt gefriertrocknen

10* Verfahren nach Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet, dass :.:lr. Nahi-medium ein wUasri^s flüssiges Medium verwendet wird.

11_; ϊΤαοh dem Verfahren dos Anspruchs 1 ^raeugfcea Milchgerinnungs*· ©:'i;J/i.'jt

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