DE3687463T2

DE3687463T2 - Polypeptid-produkt.

Info

Publication number: DE3687463T2
Application number: DE8686300932T
Authority: DE
Inventors: Ruby Ione Nielsen; Martin Schuelein
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1985-02-12
Filing date: 1986-02-11
Publication date: 1993-04-29
Anticipated expiration: 2006-02-12
Also published as: DK62985A; DK62985D0; ATE84570T1; DK153568B; EP0192401A3; EP0192401A2; JPH0736752B2; DE3687463D1; EP0192401B1; DK153568C; JPS61187787A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige, mikrobiell gewonnene α-Galactosidase-Produkte. Das neuartige Enzym ist α- Galactomannangalactosidase genannt worden.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

D-Galacto-D-Mannane sind Speicherkohlehydrate, die man in den Endospermen einiger Hülsenfruchtsamen findet. Galactomannane bestehen aus einem β-D-(1-4)-Mannan-Polymerrückgrat, an das verschiedene Mengen einzelner (1-6)-α-D-Galactopyranosylgruppen angehängt sind.
Galactomannane werden als Bestandteile von Nahrungsmitteln und Tierfuttermitteln und für kosmetische, pharmazeutische und andere industrielle Anwendungszwecke verwendet. Typischerweise werden Galactomannane für die Herstellung interaktiver Gele durch Zugabe von Polymeren, wie etwa Xanthan, Carragenan, Agar und Agarose zum Galactomannan verwendet. Diese Wechselwirkung wird hier im folgenden als Gelierfähigkeit bezeichnet. Wenn das Verhältnis zwischen Galactose und Mannan in einem Galactomannan jedoch zu hoch ist, werden Gele schlecht oder gar nicht gebildet, was hier im folgenden als schlechte oder keine Gelierfähigkeit bezeichnet wird.
Das Problem schlechter oder keiner Gelierfähigkeit kann gelöst werden, indem einige der Galactopyranosylgruppen unter Verwendung von z. B. α-Galactosidasen, die aus Pflanzen gewonnen werden, wie etwa Luzernensamen-α-Galactosidase, siehe Carbohydr.Res. 71 (1979), 212, und 92 (1981), 269, aus den Galactomannanen entfernt werden. Auch andere aus Pflanzen gewonnene α-Galactosidasen haben vergleichbare Aktivität. Siehe z. B. US-Patent Nr. 4,332,894. Aus Pflanzen gewonnene α- Galactodidasen sind jedoch relativ teuer.
Um Galactomannane mit einem genügend niedrigen Gehalt an Galactopyranosylgruppen herzustellen, damit eine befriedigende Bildung von interaktiven Gelen ermöglicht wird, ist es notwendig, wenigstens etwa 10 Gew.-% des Galactosegehalts aus Galactomannanen, wie etwa Guar-Galactomannan, freizusetzen. Hier angegebene prozentuale Anteile von aus einem Galactomannan freigesetzter Galactose beziehen sich auf den Galactose-Gehalt im Galactomannan-Ausgangsmaterial, sofern nicht anders angegeben.
Um Galactomannane mit einem gewünschten niedrigen Verhältnis zwischen Galactose und Mannan herzustellen, kann die enzymatische Entfernung der Galactopyranosylgruppen in einem Reaktionsmedium mit einem hohen Gehalt an Galactomannan durchgeführt werden. Vorzugsweise liegt der Gehalt an Galactomannanen im Reaktionsmedium im Bereich von 2 bis 70 Gew.-%, vorzugsweise von 8 bis 50 Gew.-%, vgl. europäische Patentanmeldung Nr. 84200304.8. Die enzymatische Entfernung der Galactopyranosylgruppen kann jedoch auch in geeigneter Weise in einem Medium durchgeführt werden, das weniger als 2% Galactomannan enthält.
Es ist berichtet worden (s. J. Bacteriol. 129 (1977), 850 ff, und J.Biol.Chem. 224 (1969), 2975 ff), daß α-Galactosidase aus Aspergillus niger Guarmehl und Johannesbrotgummi hydrolysierte. Dieses Ergebnis könnte darauf beruhen, daß das verwendete Enzym aus Aspergillus niger mit einer beträchtlichen Menge an endo-β- Mannanase verunreinigt war, das zunächst das Mannan-Rückgrat des Galactomannans spaltet und dadurch den Angriff durch die α- Galactosidase ermöglicht. Galactomannane, die aus dem bekannten Enzym aus Aspergillus niger hergestellt werden, werden schlechte oder keine Gelierfähigkeit besitzen. Am Ende von Seite 7 in der europäischen Patentanmeldung Nr. 84 200 304.8 wird festgestellt, daß α-Galactosidase aus Aspergillus niger Guar-Galactomannan hydrolysierte, das mit β-Mannanase depolymerisiert worden war. β-Mannanase ist ein Enzym, das von den meisten Pilzen produziert wird. β-Mannanase baut β-D-(1-4)-Mannan-Verknüpfungen ab.
In J.Biol.Chem. 245 (1970), 786 wird festgestellt, daß α- Galactosidase aus Mortierella vinacea D-Galactose aus dem Galactomannan von Leguminosensamen nicht hydrolysiert. Auch waren α-Galactosidase I und α-Galactosidase II aus Bacteriodes ovatus nicht in der Lage, Galactosereste aus intaktem Guar-Gummi zu entfernen, s. J.Bacteriol. 161 (1985), 500.
Mehrere andere mikrobielle α-Galactosidasen sind in der Technik bekannt. Die Jetzigen Erfinder haben etwa 200 verschiedene Pilz- und Bakterienstämme, ausgewählt aus den meisten saprophytischen Arten, einschließlich denjenigen, die in Appl.Biochem.Micorbiol, 18 (1982), 1 ff, aufgelistet sind, auf α-Galactosidase-Produktion gescreent. Es wurde festgestellt, daß all diejenigen, die getestet worden waren, nicht in der Lage waren, D-Galactopyranosylgruppen aus Galactomannanen abzuspalten, wenn das Mannan-Rückgrat nicht abgebaut war.

ZIELE DER ERFINDUNG

Eine Aufgabe dieser Erfindung ist es, mikrobielle α-Galactosidasen zur Verfügung zu stellen, die in der Lage sind, eine signifikante Menge Galactose aus Galactomannanen abzuspalten, ohne das Mannan-Rückgrat wesentlich abzubauen. Die neuartigen α- Galactosidasen werden hier im weiteren als β-Galactomannangalactosidasen bezeichnet. Ihre Wirkung verbessert die Gelierfähigkeit von Galctomannanen.
Eine zweite Aufgabe dieser Erfindung ist es, α-Galactomannangalactosidase-Produkte zur Verfügung zu stellen, die wenig oder keine endo-β-Mannanase enthalten. Wesentlicher Abbau des Mannan- Rückgrats zerstört die Gelierfähigkeit.
Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist es, mikrobielle α- Galactomannangalactosidasen zur Verfügung zu stellen, die in einem Reaktionsmedium, das eine relativ hohe Konzentration der Galactomannane enthält, in der Lage sind, Galactomannane mit verbesserter Gelierfähigkeit zu bilden. Solche α-Galactomannangalactosidasen aus mikrobiellen Quellen sind aus mehreren Gründen erwünscht. Erstens sind sie nicht so teuer wie aus Pflanzen gewonnene α-Galactosidasen. Zweitens ist die Verwendung eines Reaktionsmediums, das einen relativ hohen Gehalt an Galactomannanen enthält, aufgrund wirtschaftlicher Überlegungen ebenfalls wichtig.

KURZE ANGABE DIESER ERFINDUNG

Es ist nunmehr überraschenderweise festgestellt worden, daß bestimmte Penicillium-Spezies α-Galactomannangalactosidase- Enzyme bilden. Die Erfindung betrifft dieses neuartige Enzym, das Verfahren zu seiner Herstellung und das Verfahren seiner Verwendung.

DETAILLIERTE DISKUSSION DIESER ERFINDUNG

Die α-Galactomannangalactosidase-Produkte dieser Erfindung sind nicht dieselben wie die bisher bekannten α-Galactosidasen. Der Unterschied zwischen den bekannten α-Galactosidasen und der α- Galactomannangalactosidase dieser Erfindung kann unter anderem durch immunchemische Tests und über Eigenschaftsunterschiede gezeigt werden.
Die α-Galactomannangalactosidase-Produkte dieser Erfindung sind in der Lage, 1,6-α-D-verknüpfte Galactopyranosylreste von Galactomannanen, wie etwa Guar-Gummi, in einem Reaktionsmedium mit einem relativ hohen Gehalt der Galactomannane abzuspalten, ohne daß Mannan-Rückgrat wesentlich abzubauen. Vorzugsweise sind die α-Galactomannangalactosidase-Produkte dieser Erfindung frei von endo-β-Mannanase-Aktivität, wobei diese weniger als 0,01 EMANU pro GALU, vorzugsweise weniger als 0,001 EMANU pro GALU mißt, gemäß den Aktivitätstests, die hier im weiteren beschrieben sind. Diese Grenzen sind empirisch, weil sie extensive Reinigungsprozesse umfassen, um endo-β-Mannanase aus dem gewünschten Produkt zu entfernen; die Grenzen repräsentieren den Grad zur Verringerung von endo-β-Mannanase-Gehalt, der erforderlich ist, um die Verwendung der α-Galactomannangalactosidase zur Herstellung von Galactomannanen mit den gewünschten Gelierfähigkeiten zu ermöglichen. Die α-Galactomannangalactosidase-Produkte, die wie in Beispiel 9 unten gereinigt wurden, waren für die Herstellung von Galactomannanen mit einer gewünschten Gelierfähigkeit geeignet.
Die Enzym-Eigenschaften sind wie folgt: Das Molekulargewicht liegt zwischen 55.000 und 67.000. Das pH-Optimum liegt im Bereich 4 bis 6. Der pI-Wert beträgt etwa 4,3. Das Temperaturoptimum beträgt 55ºC (Kurzzeit) und 50ºC (Langzeit), s. Beispiel 10 für weitere Details.
Bei Verwendung der α-Galactomannangalactosidase-Produkte dieser Erfindung werden durch geeignete Auswahl des Ausmaßes, zu dem die Galctopyranosylgruppen abgespalten werden, Galactomannane mit der Fähigkeit hergestellt, Gele unterschiedlicher Stärken zu bilden, die von sehr schwachen Gelen bis zu starken Gelen reichen. Das Ausmaß, zu dem Galactopyranosylgruppen abgespalten werden, kann durch Einstellen der Länge der Zeit kontrolliert werden, die die Galactomannane mit den α-Galactomannangalactosidase-Produkten dieser Erfindung behandelt werden, und durch geeignetes Auswählen der Konzentration der α-Galactomannangalactosidase-Produkte dieser Erfindung. Die α-Galactomannangalactosidase-Produkte dieser Erfindung sind in der Lage, wenigstens 10 Gew.-%, bezogen auf das Galactomannan, abzuspalten. Einige bevorzugte α-Galactomannangalactosidase-Produkte dieser Erfindung sind in der Lage, 20 Gew.-% und sogar 50 Gew.-% der Galactose vom Galctomannan abzuspalten, ohne das Mannan- Rückgrat wesentlich abzubauen.
So kann die Inkubation z. B. gestoppt werden, wenn der Galactose- Gehalt in den resultierenden Galactomannanen dem Bereich von 1 bis 50 Gew.-%, bevorzugt von 10 bis 25 Gew.-%, des ursprünglichen Galactose-Gehaltes erreicht. Weil die α-Galactomannangalactosidase-Produkte dieser Erfindung im wesentlichen frei von endo-β-Mannanase-Aktivität sind, ist es möglich, Galactopyranosylreste aus Galactomannanen abzuspalten, ohne das Mannan- Rückgrat wesentlich abzubauen, was bedeutet, daß es möglich ist, Galactomannane mit einerseits einem mittleren Molekulargewicht von wenigstens 50.000, vorzugsweise wenigstens 500.000, am bevorzugtesten wenigstens 1.000.000 und andererseits einer gewünschten Gelierfähigkeit herzustellen. Um dies zu wiederholen, zeigen Galactomannane mit niedrigem Molekulargewicht zeigen sehr niedrige oder keine Gelierfähigkeit.
Die Behandlung von Galactomannanen mit den α-Galactomannanengalactosidase-Produkten dieser Erfindung wird vorzugsweise in einem Reaktionsmedium durchgeführt, das wenigstens 1 Gew.-%, bevorzugt wenigstens 2 Gew.-%, am bevorzugtesten wenigstens 30 Gew.-%, der Galactomannane enthält. Die Verwendung eines Reaktionsmediums, das große Mengen an Galactomannanen enthält, ist aus wirtschaftlichen Überlegungen bevorzugt. Das Reaktionsmedium ist vorzugsweise wäßrig.
Beispiele der wichtigsten Galactomannane sind Guar-Galactomannan (erhältlich aus Cyanaposis tetragonolibus) und Johannesbrotgummi (erhältlich aus Ceratonia siliqua). Weitere Beispiele sind in Adv.Carbohydr.Chem.Biochem. 35 (1978), 341 ff angegeben. Übliche Galactomannane enthalten zwischen etwa 20 und 50 Gew.-% Galactose, oft zwischen etwa 35 und 45 Gew.-% Galactose. Guar- Galactomannan enthält etwa 35% Galactose und etwa 62% D- Mannose, und man nimmt an, daß es ein Molekulargewicht zwischen etwa 16·10&sup5; und 22·10&sup5; besitzt. Johannesbrotgummi enthält zwischen etwa 20 und 25 Gew.-% Galactose und zwischen etwa 75 und 80 Gew.-% Mannose, und man nimmt an, daß es ein Molekulargewicht zwischen etwa 11·10&sup5; und 16·10&sup5; besitzt.
Spezifische Beispiele von Produkten, die mit Galactomannanen geliert werden, sind Nahrungsmittel- und Futtermittelprodukte, zum Beispiel alkoholfreie Getränke, Backgelee und Instant- Schokoladenpudding, s. Food Technol. 27 (1973), 26 ff, und Heimtiernahrung.
Die α-Galactomannangalactosidase-Produkte dieser Erfindung können durch Oberflächenkultivierung oder durch Submers- Kultivierung eines Mikroorganismus, z. B. α-Galactomannangalactosidase produzierenden Pilzen oder Bakterien, vorzugsweise Pilzen, gefolgt durch Gewinnung des Enzyms durch herkömmliche Techniken, hergestellt werden.
Die zu verwendenden Mikroorganismen können von jedem Durchschnittsfachmann auf diesem Gebiet unter Anwendung der folgenden vier Kriterien für die Auswahl ausgewählt werden:
1) Das von dem Mikroorganismus hergestellte Enzym muß α- Galactosidase-Aktivität besitzen; s. den Aktivitätstest auf p- Nitrophenyl-α-D-galactopyranosid, unten;
2. Das von dem Mikroorganismus hergestellte Enzym sollte eine Initiierungsrate von wenigstens 0,3 g Galactose/(Liter·Stunde ·GALU) bei Verwendung der Screening-Methode mit Guar G, die in Beispiel 8 unten beschrieben ist, besitzen.
3) Das von dem Mikroorganismus hergestellte Enzym-Produkt muß eine endo-β-Mannanase-Aktivität unter 0,01 EMANU pro GALU besitzen, s. die Aktivitätstests unten.
4) Das von dem Mikroorganismus hergestellte Enzym muß in der Lage sein, die Gelierfähigkeit von Guar-Gummi so zu verbessern, daß bei Anwendung der Testmethode, die in Beispiel 10 unten beschrieben ist, ein Gel gebildet werden kann.
Oberflächen-Kultivierung wird auf einem halbfesten Medium durchgeführt, das eine Quelle für assimilierbaren Stickstoff und Kohlenstoff und essentielle Nährstoffe enthält.
Submers-Kultivierung wird unter aeroben Bedingungen in einem Fermentationsmedium durchgeführt, das eine Quelle für assimilierbaren Stickstoff und Kohlenstoff und essentielle Nährstoffe enthält. Weitere Details, wie etwa pH-wert, Temperatur, Belüftung und Bewegung, können ohne weiteres vom Durchschnittsfachmann auf diesem Gebiet ausgewählt werden. Die hierin beispielhaft belegte α-Galactomannangalactosidase ist ein extrazelluläres Enzym, gebildet von Stämmen gut bekannter Spezies, nämlich Penicillium chrysogenum, Penicillium islandicum und Penicillium notatum. Exemplarische Stämme sind DSM 3214, DSM 3215 bzw. DSM 3216.
Die gewonnene Galactomannangalactosidase kann als solche verwendet oder weiter gereinigt werden, z. B. durch Ionenaustauschchromatographie, fraktionierte Ausfällung oder Gelfiltration, um unter anderem endo-β-Mannanase zu entfernen. Vorzugsweise werden die α-Galactomannangalactosidase-Produkte dieser Erfindung etwa 250 GALU/ml in Aktivität von Enzym-Lösungen (wobei diese weit konzentrierter sind, als dies jemals in Kulturen festgestellt worden ist) oder 250 GALU/g, wenn sie in fester Form vorliegen.
Die α-Galactomannangalactosidase kann auch aus Stämmen, gehalten werden, die so mutiert worden sind, daß sie eine geringe Menge oder keine endo-β-Mannanase produzieren. Methoden zum Mutieren von Stämmen sind dem Durchschnittsfachmann auf diesem Gebiet bekannt, z. B. Ultraviolettbestrahlung und chemische Mutagene.
Diese Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht, die jedoch nicht als einschränkend aufgefaßt werden sollen. Die Beispiele veranschaulichen einige bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung. Der Buchstabe ® gibt an, daß dies ein Warenzeichen ist.
Um α-Galactomannangalactosidase-Produkte gemäß dieser Erfindung herzustellen, wurden die gemäß den Beispielen 1-6 unten erhaltenen Produkte weiter gereinigt, wie in Beispiel 9 beschrieben.
Die in den Beispielen 1-3 verwendeten Stämme wurden bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) im Januar 1985 hinterlegt.

Kultivierung von Stämmen

Die α-Galactomannangalactosidase produzierenden Stämme können auf Agar-Schrägplatten gezüchtet werden, die die folgenden Bestandteile pro Liter enthalten: 4,0 g Hefeextrakt, 1,0 g Kaliumdihydrogenphosphat, 0,1 g Magnesiumphosphat, Heptahydrat, 15 g Glucose und 20 g Bacto® (Difco Laboratories, Detroit, USA)-Agar. Dieses Substrat wird bei 121ºC für 20 oder 40 Minuten autoklaviert und wird im weiteren als YPG bezeichnet.

Aktivitätstests auf α-Galactosidase

Das Prinzip des Tests ist, daß α-Galactosidase das farblose p- Nitrophenyl-α-D-galactopyranosid (im weiteren als p-NPGal bezeichnet) hydrolysiert, wobei p-Nitrophenol gebildet wird, das im alkalischen gelb ist. Eine α-Galactosidase-Einheit (im weiteren als GALU bezeichnet) ist die Enzym-Menge, die 1 umol p- NPGal pro Minute unter den folgenden Standardbedingungen hydrolysiert: Substrat: 0,80 nM p-NPGal, pH: 5,5 (0,0333 M Acetatpuffer), Temperatur: 37ºC und Reaktionszeit: 15 Minuten. Die gebildete Farbe wird durch Spektrophotometrie bei der Wellenlänge 405 nm gemessen.
Weitere Details dieser Methode sind in der Broschüre AF 204/2 GB, datiert 29. November 1984, von Novo Industri A/S beschrieben.

Aktivitätstests auf endo-β-Mannanase

Die endo-β-Mannanase-Aktivität wurde durch die reduzierende Wirkung auf die Viskosität von Johannesbrotgummi bei Verwendung von Mannanase® 1.5 L (Novo Industri A/S) als Standard bestimmt. Die Methode ist in der Broschüre AF 156/1 GB, datiert 16. September 1975, von Novo Industri A/S beschrieben. Die Aktivitätseinheit, auf die in dieser Broschüre Bezug genommen wird, wird HCU genannt. Die Aktivität von Mannanase 1.5 L beträgt 1.500.000 HCU/g. Durch Testen der Menge an freigesetztem reduzierenden Zucker, unter Verwendung der Somogyis-Nelson-Methode (J.Biol.Chem. 153 (1944), 375) und unter Verwendung von Mannose als Standard, hat man festgestellt, daß 1 HCU 0,011 EMANU entspricht, wobei 1 EMANU definiert ist als die Menge endo-β- Mannanase, die 1 umol Mannose-Äquivalent aus Johannesbrotgummi pro Minute bei 50ºC und bei einem pH-Wert von 5,0 freisetzt.

Beispiel 1

a) Enzym-Produktion

Ein Substrat für Schüttelkolben wurde mit den folgenden Bestandteilen pro Liter hergestellt: 20 g Cornsteep-Flüssigkeit (Corn Products Corp.), 10 g Ammoniumnitrat, 10 g Kaliumdihydrogenphosphat, 1 g Magnesiumsulfat, Heptahydrat, 10 g Guar-Gummi extra LK (NDH Nordisk Droge Handels A/S, Dänemark), 0,1 g Pluronic® L61 (BASF, Bundesrepublik Deutschland), 5 g Calciumcarbonat und Leitungswasser. Der pH wurde auf 6,5 eingestellt und Sterilisierung fand bei 121ºC für 40 Minuten statt. Ein 500 ml- Erlenmeyerkolben mit 100 ml Substrat wurde mit etwa 10&sup7; Sporen von einer YPG-Agar-Schrägplatte die zuvor mit Penicillium chrysogenum DSM 3214 beimpft worden war, beimpft. Die Kolben wurden bei 230 UPM und bei 30ºC für 3 oder 4 Tage geschüttelt, woraufhin die Fermentationsbrühe zentrifugiert wurde. Der Überstand, der α-Galactomannangalactosidase enthielt, wurde vom Myzel abgetrennt. Das Myzel wurde verworfen und der Überstand wurde auf α-Galactosidase analysiert. Unter diesen Bedingungen produzierte der Stamm 10 GALU/ml.

b) Enzym-Reinigung

1 Liter Kulturbrühe wurde durch einen Glasfaser-Filter (Whatman® GF/D und GF/F) auf einem Büchnertrichter mit einem Durchmesser von 11 cm filtriert. Das Filtrat wurde durch Osmose mit einer Amicon®-Hohlfaserpatrone (H1P10) mit einem Schnitt bei einem Molekulargewicht von 10.000 konzentriert, woraufhin das Konzentrat mit entionisiertem Wasser ausgewaschen wurde, bis die Leitfähigkeit 3 mSi (milliSiemens) betrug. Danach wurde das Konzentrat unter Verwendung einer Amicon®-Zelle mit einer GR81PP- Membran (De Danske Sukkerfabrikker, Dänemark) und mit einem Schnitt bei einem Molekulargewicht von 6.000 konzentriert. Im erhaltenen Konzentrat wurde der pH auf 7,0 eingestellt.
Eine DEAE-Tris-Acryl-Ionenaustauschsäule wurde mit 50 mM Tris- Puffer (pH: 7,0) äquilibriert. (Tris ist Tris(hydroxymethyl)aminomethan.) 200 ml des Ionenaustauschers wurden in eine Säule mit einem Durchmesser von 5 cm gepackt, und die Säule wurde so gepackt, daß sie eine Durchflußrate von 320 ml pro Stunde besaß. Ionenaustausch wurde auf dem Filtrat vom Glasfilter durchgeführt, und Fraktionen wurden gesammelt. Die α-Galactomannangalactosidase bindet sich schwach an diesen Ionenaustauscher und wurde entweder nach Waschen mit Tris-Puffer oder mit einem Natriumchlorid-Gradienten eluiert.
Die Aktivität von α-Galactomannangalactosidase in den Fraktionen wurde gemessen, und die Fraktionen, die Protein mit dieser Aktivität enthielten, wurden gesammelt und konzentriert.
Die Proteine wurden konzentriert, und Komponenten mit niedrigem Molekulargewicht wurden auf einer Amicon®-Hohlfaserpatrone (H1P10) mit einem Schnitt bei einem Molekulargewicht 10.000 ausgewaschen.
Die resultierenden 10 ml Enzym-Lösung wurden durch Messen der Aktivität auf α-Galactomannangalactosidase und endo-β-Mannanase analysiert. Die gefundenen Aktivitäten betrugen 300 GALU/ml bzw. 23 EMANU/ml (2.100 HCU/ml).

Beispiel 2

Unter Verwendung desselben Verfahrens, wie in Beispiel 1a beschrieben, mit der Maßgabe, daß der verwendete Stamm Penicillium islandicum DSM 3215 war, betrug die Ausbeute 17 GALU/ml.
Durch Reinigen von 1,4 Litern Kulturbrühe unter Verwendung des in Beispiel 1b beschriebenen Verfahrens wurden 18 ml einer Lösung des teilweise gereinigten Enzyms mit der Aktivität 540 GALU/ml und 32 EMANU/ml (2.900 HCU/ml) erhalten.

Beispiel 3

Unter Verwendung desselben Verfahrens, wie in Beispiel 1a beschrieben, mit der Maßgabe, daß der verwendete Stamm Penicillium notatum DSM 3216 war, betrug die Ausbeute 4 GALU/ml.
Durch Reinigen von 1,1 Liter Kulturbrühe unter Verwendung des in Beispiel 1b beschriebenen Verfahrens wurden 18 ml einer Lösung des teilweise gereinigten Enzyms mit der Aktivität 300 GALU/ml und 8 EMANU/ml (700 HCU/ml) erhalten.

Beispiel 4

a) Enzym-Produktion

Dieses Beispiel veranschaulicht die Produktion von α-Galactomannangalactosidase durch Penicillium chrysogenum in einem Pilotanlagen-Fermenter. Die Impfkultur stammt aus 1 Liter des folgenden Mediums: 50 g Sojamelasse (Aarhus Oliefabrik, Dänemark), 20 g Ammoniumsulfat, 10 g Kaliumdihydrogenphosphat, 1 g Magnesiumsulfat, 5 g Calciumcarbonat und 0,5 g Pluronic. Der pH wurde auf 6,5 eingestellt, und das Medium wurde in 3 Liter- Erlenmeyerkolben bei 125ºC bei 45 Minuten sterilisiert. Nach Abkühlen auf 30ºC wurde das Medium mit Spuren von Penicillium chrysogenum von YPG-Agar-Schrägplatten beimpft, die bei 30ºC für 7 Tage beimpft worden waren. Die Kolben wurden bei 30ºC für 2 Tage geschüttelt. 800 ml dieser Impfkultur wurden in den Hauptfermenter überführt, der 400 g Sojamelasse, 160 g Ammoniumsulfat, 80 g Kaliumdihydrogenphosphat, 8 g Magnesiumsulfat, Heptahydrat, 40 g Calciumcarbonat, 3 g Pluronic und Wasser auf ein Volumen von 8 Litern enthielt. Der pH wurde auf 6,5 eingestellt, und das Medium wurde für 120 Minuten bei 125ºC sterilisiert. 100 ml 15%ige Phosphorsäure wurden separat bei 125ºC für 30 Minuten sterilisiert und verwendet, um den pH während der Fermentation zu regulieren. Im Anschluß an die Beimpfung wurde mit der Belüftung (8 Liter/Minute) begonnen. Rühren mit einer Geschwindigkeit von 520-830 UPM wurde ebenfalls begonnen. Die Temperatur wurde konstant bei 30ºC gehalten. Die Fermentation wurde für 65 Stunden gehalten, wobei während dieser Zeit der pH von 6,7-7,0 anstieg. Danach wurde der Tank abgekühlt, und das Myzel wurde durch Zentrifugation abgetrennt. Die überstehende Flüssigkeit wurde analysiert und die gefundene Aktivität betrug 3 GALU/ml.

b) Enzym-Reinigung

11 Liter Kulturbrühe wurden unter Verwendung von 140 g Kieselgur auf einem Filtertuch filtriert, und die Flüssigkeit wurde unter Verwendung eines Porzellantrichters mit einem Durchmesser von 40 cm durchgesaugt.
Konzentration durch Osmose wurde auf einer Millipor® Pelican Kassette mit einem Schnitt auf Molekulargewicht 10.000 durchgeführt. Der verwendete Filtertyp war Polysulfon mit dem Code PTGC 00005. Dadurch wurden 11 Liter auf 1 Liter konzentriert. Auswaschen wurde mit entionisiertem Wasser durchgeführt, bis die Leitfähigkeit unter 3 mSi lag.
Die durch Osmose konzentrierte Lösung wurde gefroren und aufgetaut, wonach der pH auf 7,0 eingestellt wurde. Die Lösung wurde auf einem Glasfilter (Whatman® GF/D) filtriert.
Danach wurde das Filtrat einer Ionenaustauschchromatographie auf einer DEAE-Tris-Acryl-Säule unterworfen, gefolgt von einer Konzentration unter Verwendung einer Amicon-Hohlfaserpatrone (PDP 10), analog, wie in Beispiel 1b beschrieben. Dadurch wurden 160 ml einer Lösung eines teilweise gereinigten Enzyms mit der Aktivität 20 GALU/ml und unter 3 EMANU/ml (unter 250 HCU/ml) erhalten.

Beispiel 5

Dieses Beispiel veranschaulicht die Produktion einer α-Galactomannangalactosidase durch Penicillium islandicum in einem Pilotanlagen-Fermenter.
Der Stamm wurde bei 30ºC für 1 Woche auf einer YPG-Agar-Schrägplatte kultiviert. Die Sporen von der Schrägplatte wurden verwendet, um den Impffermenter zu beimpfen, der aus 1 Liter Medium der folgenden Zusammensetzung bestand: 20 g Cornsteep-Flüssigkeit, 10 g Ammoniumnitrat, 10 g Kaliumdihydrogenphosphat, 5 g Calciumcarbonat, 20 g Raffinose, 1 g Magnesiumsulfat, Heptahydrat, 0,1 g Pluronic und Leitungswasser auf ein Volumen von 1 Liter. Der pH wurde auf 6,5 eingestellt. Das Medium wurde bei 125ºC für 60 Minuten sterilisiert. Die Impfkultur wurde bei 30ºC für 2 Tage bei 230 UPM geschüttelt. 800 ml dieser Impfkultur wurden verwendet, um den Hauptfermenter zu beimpfen, der aus 8 Litern des folgenden Substrats bestand: 160 g Cornsteep-Flüssigkeit, 80 g Ammoniumnitrat, 80 g Kaliumdihydrogenphosphat, 8 g Magnesiumsulfat, Heptahydrat, 160 g Raffinose, 40 g Calciumcarbonat, 1 g Pluronic und Leitungswasser auf ein Volumen von 8 Litern. Der pH wurde auf 6,5 eingestellt. Das Medium wurde bei 125ºC für 120 Minuten sterilisiert. Als die Temperatur auf 30ºC fiel, wurde es mit 800 ml Impfkultur beimpft. Die Temperatur wurde bei 30ºC gehalten, Bewegung bei 620 UPM, Druck bei 0,5 ato, Belüftung bei 8 Litern/Minute, und der pH fiel von 6,45 auf 5,9. Nach 90 Stunden wurde die Fermentation gestoppt, abgekühlt und zentrifugiert. Der Überstand enthielt 7 GALU/ml.
Durch Reinigen von 8 Litern Kulturbrühe unter Verwendung des in Beispiel 4b beschriebenen Verfahrens wurden 500 ml einer Lösung des teilweise gereinigten Enzyms mit der Aktivität 60 GALU/ml und 1,4 EMANU/ml (130 HCU/ml) erhalten.

Beispiel 6

In diesem Beispiel wurde die α-Galactomannangalactosidase durch Penicillium notatum produziert. Der Stamm wurde auf einer YPG- Agar-Schrägplatte bei 30ºC für 1 Woche gezüchtet. Die Sporen wurden verwendet, um 1 Liter Substrat der folgenden Zusammensetzung zu beimpfen: 20 g Cornsteep-Flüssigkeit, 10 g Ammoniumhydrat, 10 g Kaliumdihydrogenphosphat, 1 g Magnesiumsulfat, Heptahydrat, 5 g Guar-Gummi, 20 g Raffinose, 5 g Calciumcarbonat, 0,1 Pluronic und Leitungswasser auf ein Volumen von 1 Liter. Der pH wurde auf 6,5 eingestellt, und das Medium wurde bei 125ºC für 40 Minuten sterilisiert. Der Kolben wurde bei 230 UPM für 2 Tage bei 30ºC geschüttelt, wobei nach dieser Zeit 800 ml verwendet wurden, um den Hauptfermenter zu beimpfen, der das folgende Substrat enthielt: 160 g Cornsteep-Flüssigkeit, 80 g Ammoniumnitrat, 80 g Kaliumdihydrogenphosphat, 80 g Magnesiumsulfat, Heptahydrat, 40 g Guar-Gummi, 40 g Calciumcarbonat, 160 g Raffinose, 1 g Pluronic und Leitungswasser auf ein Volumen von 8 Litern. Der pH wurde auf 6,5 eingestellt. Wachstum wurde für 89 Stunden gehalten, wobei während dieser Zeit der pH von 6,25 auf 6,95 anstieg. Die Belüftung betrug 8 Liter/Minute, der Druck 0,5 ato und die Bewegung 520-830 UPM. Am Ende der Fermentation wurde der Tank abgekühlt und die Brühe zentrifugiert, um das Myzel zu entfernen. Der Überstand enthielt 13 GALU/ml.
Durch Reinigen von 7,5 Litern Kulturbrühe unter Verwendung des in Beispiel 4b beschriebenen Verfahrens wurden 40 ml einer Lösung des teilweise gereinigten Enzyms mit der Aktivität 660 GALU/ml und 93 EMANU/ml (8400 HCU/ml) erhalten.

Beispiel 7

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung eines Standardsubstrates, das im weiteren als Guar G bezeichnet wird. Dieses Substrat ist gut geeignet zur Diskriminierung von α-Galactomannangalactosidase von α-Galactosidasen, denen die Fähigkeit fehlt, Galactomannane mit intaktem Mannanrückgrat anzugreifen.
1 Liter Leitungswasser wurde auf 75ºC erhitzt, und 10 g Guar- Mehl wurden unter Rühren zugegeben. 16 ml Gamanase 1.5 L wurden zugegeben, und der pH wurde auf 5,0 eingestellt. 190 g Guar-Mehl wurden über eine Stunde unter Rühren zugegeben. Bereiche des Galactomannans, die nicht durch D-Galactopyranosylgruppen geschützt waren, wurden unter diesen Bedingungen von der in der Gamansase vorliegenden endo-β-Mannanase gespalten, und alle vorliegenden α-Galactomannangalactosidasen wurden bei 75ºC hitzeinaktiviert. Die Hydrolyse wurde durch Kochen gestoppt. Das modifizierte Guar G wurde durch Ausfällung mit 500 ml 96%igem (Gewicht/Volumen) Alkohol gereinigt, filtriert und getrocknet. Die Ausbeute betrug 140 g Guar G.

Beispiel 8

Dieses Beispiel veranschaulicht die Initiierungsrate, d. h. die Freisetzung von Galactose aus dem Standard-Screeningsubstrat, Guar G (s. Beispiel 7).
Alle getesteten teilweise gereinigten Enzyme wurden in 50 mM Natriumacetat-Puffer (pH: 5,5) verdünnt und danach mit Guar G in einer Konzentration von 4% (Gewicht/Volumen) für 30 und 60 Minuten bei 45ºC inkubiert. Die Freisetzung von Galactose wurde durch Verwendung der enzymatischen Galactose-UV-Methode von Boehringer Mannheim mit deren Kit bestimmt.
Die erhaltenen Ergebnisse erscheinen in Tabelle I unten. Tabelle I Enzym aus Beispiel Nr. Getestete Konzentration, GALU/ml Initiierungsrate, freigesetzte Galactose, g/(Liter·Stunde·GALU)
Beim Testen von Kaffeebohnen-α-Galactosidase (Sigma Nr. G 8507) in einer Konzentration von 0,05 GALU/ml betrug die Initiierungsrate 0,5 g Galactose/(Liter·Stunde·GALU).
Bei Verwendung von α-Galactosidase aus Aspergillus niger, erhalten von Sigma (Nr. G 9007) in einer Konzentration von 0,05 GALU/ml betrug die Initiierungsrate weniger als 0,5 g Galactose/(Liter·Stunde·GALU) in diesem Test.
Auch die folgenden Pilz-α-Galactosidasen waren nicht in der Lage, in diesem Test Galactose aus Guar G freizusetzen:
Aspergillus aculeateus, Aspergillus oryzae, Cephalosporium acremonium, Fomes unguleatus, Irpex lacteus, Penicillium aculeatum, Penicillium adametzi, Penicillium crustosum, penicillium mellinii, Penicillium oxalicum, Penicillium simplicissimum, Pycnoporus cinnabarius, Pycnoporus coccinus, Pycnoporus sanguineus, Streptomyces libani, Streptomyces sioyaensis, Trametes hirsuita und Tricoderma harzianum.

Beispiel 9

Dieses Beispiel veranschaulicht die Freisetzung von Galactose aus Guar-Mehl. Das verwendete Enzym war die α-Galactomannangalactosidase aus Penicillium chrysogenum, hergestellt wie in Beispiel 4 beschrieben. Die freigesetzte Galactose-Menge wurde bestimmt, wie in Beispiel 8 beschrieben, unter Verwendung des Kits von Boehringer Mannheim, und die freigesetzte Galactose- Menge wird ausgedrückt als mg freigesetzte Galactose pro g Galactose-Mehl. Die Inkubation wurde in einem Wasserbad mit einer Temperaturkontrolle und einem luftdichten Deckel durchgeführt. Das getestete Guar-Mehl wurde mit 20 GALU des Enzyms pro g Guar-Mehl und mit einem Acetat-Puffer angefeuchtet, was eine Endkonzentration von 40 Gew.-% Guar-Mehl ergab. Die erhaltenen Ergebnisse ergeben sich aus Tabelle II. Tabelle II Temperatur pH Freisetzung von Galactose, 5 Stunden Inkubation 24 Stunden Inkubation
Wie sich aus Tabelle II ergibt, ist das Enzym bei Temperaturen über 50ºC nicht lange stabil. Das pH-Optimum des Enzyms liegt zwischen 5,0 und 5,5.
Die Wirkung der Konzentration des Enzyms wurde durch Inkubation, analog wie oben beschrieben, unter Verwendung der Temperatur 45ºC, eines pHs von 5,0 und der in Tabelle III, die auch die erhaltenen Ergebnisse zeigt, angegebenen Enzymkonzentrationen getestet. Tabelle III Enzym-Dosis GALU/g Guar-Mehl Freisetzung von Galactose, 5 Stunden Inkubation 24 Stunden Inkubation

Beispiel 10

Dieses Beispiel veranschaulicht die Affinitätsreinigung der in den Beispielen 2 und 4 bis 6 erhaltenen Enzyme.
30 ml teilweise gereinigte α-Galactomannangalactosidase aus Beispiel 4 wurde mit dem folgenden Verfahren so gereinigt, daß sie frei von endo-β-Mannanase-Aktivität war: 100 ml Galactosamin (Sigma Nr. G 0500), gekoppelt an AH-Seharose® (Pharmacia, Schweden), wurden mit einem Puffer (50 mM Natriumacetat (pH: 5,0)) äquilibriert. Die 30 ml-Lösung wurde aufgebracht und die endo-β-Mannanase und etwas von der α-Galactomannangalactosidase durch die Säule laufen gelassen. Die α- Galactomannangalactosidase wurde mit einem Natriumchlorid- Gradienten eluiert. Die gereinigte, von endo-β-Mannanase freie α-Galactomannangalactosidase besaß eine spezifische Aktivität von 15 GALU pro mg Protein, und endo-β-Mannanase lag unterhalb der Nachweisgrenze. Das Molekulargewicht der Protein-Hauptbande nach SDS-Gelelektrophorese wurde zu zwischen 55.000 und 60.000 gefunden. (SDS ist Natriumdodecylsulfat). Das pH-Optimum lag zwischen etwa 5 und 6, das Temperatur-Optimum lag bei etwa 50ºC mit p-NPGal als Substrat, und der pI (isoelektrischer Punkt) betrug 4,3.
Die anderen Enzyme aus den Beispielen 5 und 6 wurden unter Verwendung desselben Verfahrens gereinigt. Es wurde festgestellt, daß die α-Galactomannangalactosidase aus Beispiel 6 ein Molekulargewicht zwischen 55.000 und 60.000 besaß, eine spezifische Aktivität von 75 GALU pro mg Protein, das pH-Optimum lag zwischen etwa 5 und 6, das Temperatur-Optimum lag bei etwa 50ºC mit p-NPGal als Substrat, und der pI betrug etwa 4,3.
Die α-Galactomannangalactosidase aus den Beispielen 2 und 5 besaß ein Molekulargewicht zwischen 62.000 und 67.000 und eine spezifische Aktivität von 90 GALU pro mg Protein. Das pH-Optimum dieses Enzyms lag zwischen etwa 4 und 5,5. Der pI betrug etwa 4,3.
Für alle drei Enzyme, bei denen Guar-Substrat verwendet wurde, betrug das Temperatur-Optimum für zweistündige Inkubation 55ºC und für 24stündige Inkubation betrug es 50ºC.
Eine Menge des hochgereinigten Enzyms aus Beispiel 4, die 4 GALU entspricht, wurde in 3 ml 50 mM Natriumacetat-Puffer (pH: 5,0) gelöst, und 2 g Guar-Mehl wurden hinzugegeben. Die resultierende Mischung wurde für 20 Stunden bei 45ºC inkubiert.
Danach wurde das Produkt getrocknet. Es wurde festgestellt, daß 140 mg Galactose während der Inkubation mit diesem Enzym abgespaltet worden waren.
Unter Verwendung des in Beispiel 11 unten beschriebenen Geliertest wurde beobachtet, daß alle hergestellten α-Galactomannangalactosidase-Produkte verwendet werden konnten, um Galactomannane mit verbesserter Gelierfähigkeit herzustellen.

Beispiel 11

Dieses Beispiel veranschaulicht einen Test für die Gelierfähigkeit.
a) 40 mg Xanthan (Sigma Nr. G1253) wurden in 10 ml entionisiertem Wasser suspendiert und dann gekocht, um das Material aufzulösen. Analog dazu wurden in einem zweiten Glas 40 mg Johannesbrotgummi (Sigma Nr. G 0753) in 10 ml entionisiertem Wasser suspendiert und gekocht, um das Material aufzulösen. Bei 75ºC wurden jeweils 2 ml der Lösungen in einem 10 ml Teströhrchen vermischt, woraufhin man das Röhrchen in einem Eisbad abkühlen ließ. 15 Minuten später wurde das Röhrchen umgedreht und die Mischung lief nicht heraus.
b) Unter Verwendung von Guar-Gummi (Sigma Nr. G 4129) anstelle von Johannesbrotgummi im in a) oben beschrieben Test lief die Mischung aus, wenn das Röhrchen umgedreht wurde.
c) Unter Verwendung von Guar-Gummi, das mit α-Galactosidase aus Aspergillus niger anstelle von Johannesbrotgummi im in a) oben beschriebenen Test behandelt worden war, lief die Mischung aus, wenn das Röhrchen umgedreht wurde.
d) Unter Verwendung von Guar-Gummi, das mit einer α-Galactomannangalactosidase gemäß dieser Erfindung anstelle eines Johannesbrotgummis im in a) oben beschrieben Test behandelt worden war, lief das Gel nicht aus, wenn das Röhrchen umgedreht wurde.
Die Hinterlegungen DSM 3214, DSM 3215 und DSM 3216 wurden bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen am 22. Januar 1985 durchgeführt und werden vom Budapester Vertrag bestimmt. Diese Stämme wurden in den vorstehenden Beispielen 4, 5 bzw. 6 verwendet.
Die in der vorstehenden Beschreibung und den folgenden Ansprüchen offenbarten Merkmale können, sowohl einzeln als auch in irgendeiner Kombination derselben, Gegenstand für die Verwirklichung der Erfindung in deren unterschiedlichen Formen sein.

Claims

1. Mikrobielle α-Galactomannangalactosidase mit einem Molekulargewicht zwischen 55.000 und 67.000, einem pH-Optimum im Bereich von 4 bis 6, einem pI-Wert von etwa 4,3, einem Temperatur- Optimum von 55ºC (Kurzzeit) und 50ºC (Langzeit) und hergestellt durch einen Stamm, der ausgewählt ist aus Penicillium chrysogenum, Penicillium islandicum und Penicillium notatum oder Mutanten derselben, die in der Lage sind, α-Galactomannangalactosidase zu produzieren.

2. α-Galactomannangalactosidase-Produkt mit wenigstens etwa 250 GALU pro g flüssiger oder fester Produktform und im wesentlichen frei von endo-β-Mannanase-Aktivität, wobei die α-Galactomannangalactosidase ein Molekulargewicht zwischen 55.000 und 67.000, ein pH-Optimum im Bereich von 4 bis 6, einen pI-Wert von etwa 4,3, ein Temperatur-Optimum von 55ºC (Kurzzeit) und 50ºC (Langzeit) besitzt und hergestellt worden ist durch einen Stamm, der ausgewählt ist aus Penicillium chrysogenum, Penicillium islandicum und Penicillium notatum oder Mutanten derselben, die in der Lage sind, α-Galactomannangalactosidase zu produzieren.

3. α-Galactomannangalactosidase-Produkt nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die endo-β-Mannanase-Aktivität weniger als etwa 0,001 EMANU pro GALU beträgt.

4. Mikrobielle α-Galactomannangalactosidase mit einem Molekulargewicht zwischen 55.000 und 67.000, einem pH-Optimum im Bereich von 4 bis 6, einem pI-Wert von etwa 4,3, einem Temperaturoptimum von 55ºC (Kurzzeit) und 50ºC (Langzeit), die extrazellulär durch Kultivierung eines Mikroorganismenstammes dargestellt, der besagtes Enzym produziert und ausgewählt ist aus Penicillium chrysogenum, Penicillium islandicum und Penicillium notatum oder Mutanten derselben, die in der Lage sind, α-Galactomannangalactosidase zu produzieren, und anschließend aus der Kulturbrühe gewonnen ist.

5. Verfahren zur Herstellung von α-Galactomannangalactosidase mit einem Molekulargewicht zwischen 55.000 und 67.000, einem pH- Optimum im Bereich von 4 bis 6, einem pI-Wert von etwa 4,3, einem Temperatur-Optimum von 55ºC (Kurzzeit) und 50ºC (Langzeit), welches das Kultivieren durch Submers-Kultivierung eines α-Galactomannangalactosidase produzierenden Stamms, ausgewählt aus Penicillium chrysogenum, Penicillium islandicum und Penicillium notatum oder Mutanten derselben, die in der Lage sind, α-Galactomannangalactosidase zu produzieren, und anschließend die Gewinnung des Enzyms aus dem Kulturmedium umfaßt.

6. Verwendung eines Produkts nach Anspruch 2 zur Modifizierung des Galactomannans von Guar-Gummi, Johannesbrotgummi und dergleichen durch Behandeln des Gummis in Lösung mit dem Produkt mit weniger als etwa 0,01 EMANU endo-β-Mannanase pro GALU, bis zumindest etwa 10% des Galactose-Gehalts im Gummi abgespalten worden sind, und anschließendes Stoppen der Behandlung.