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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Proteintyrosinkinasen (PTKs) beinhalten
eine große
und diversifizierte Klasse von Proteinen mit enzymatischer Aktivität. Die PTKs
spielen bei der Kontrolle von Zellwachstum und -differenzierung
eine wichtige Rolle (für
eine Übersicht
siehe Schlessinger & Ullrich,
1992, Neuron 9: 383–391).
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Z. B. wird die Rezeptortyrosinkinase-vermittelte
Signaltransduktion durch die extrazelluläre Wechselwirkung mit einem
spezifischen Wachstumsfaktor (Ligand) initiiert, worauf typischerweise
die Rezeptordimerisierung, transiente Stimulierung der intrinsischen
Proteintyrosinkinase-Aktivität
und die Phosphorylierung folgen. Dabei werden Bindungsstellen für intrazelluläre Signaltransduktionsmoleküle geschaffen
und infolge Komplexe mit einem Spektrum zytoplasmatischer Signalmoleküle gebildet,
was für
die passende zelluläre
Antwort förderlich
ist (z. B. Zellteilung, Stoffwechseleffekte, Antworten auf die extrazelluläre Kleinstumgebung
(microenvironment), siehe Schlessinger und Ullrich, 1992, Neuron
9: 1–20.
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Was Rezeptortyrosinkinasen angeht,
ist auch gezeigt worden, dass Tyrosin-Phosphorylierungsstellen als
hoch affine Bindungsstellen für
SH2 (src-Homologie)-Domänen von
Signalmolekülen
dienen (Fantl. et al., 1992, Cell 69: 413–423; Songyang et al., 1994,
Mol. Cell. Bio. 14: 2777–2785;
Sonyang et al., 1993, Cell 72 767–778; und Koch et al., 1991,
Science 252: 668–678).
Es wurden einige intrazelluläre
Substratproteine identifiziert, die mit Rezeptortyrosinkinasen (RTKs)
assoziieren. Diese kann man in zwei Hauptgruppen einteilen: (1)
Substrate mit einer katalytischen Domäne; und (2) Substrate, denen
eine solche Domäne
fehlt, die aber als Adapter dienen und mit katalytisch aktiven Molekülen assoziieren
(Sonyang et al., 1993, Cell 72: 767–778). Die Spezifität der Wechselwirkungen
zwischen Rezeptoren oder Proteinen und SH2-Domänen ihrer Substrate wird von
den Aminosäureresten
bestimmt, die unmittelbar um den phosphorylierten Tyrosinrest angeordnet sind.
Unterschiede in den Bindungsaffinitäten zwischen SH2-Domänen und
den Aminosäuresequenzen,
die um die Phosphotyrosinreste angeordnet sind, auf bestimmte Rezeptoren
stehen in Einklang mit den beobachteten Unterschieden in ihren Substratphosphorylierungsprofilen
(Sonyang et al, 1993, Cell 72: 767–778). Aufgrund dieser Beobachtungen
nimmt man an, dass die Funktion jeder Rezeptortyrosinkinase nicht
nur von ihrem Expressionsmuster und der Verfügbarkeit des Liganden, sondern
auch von der Abfolge nachgeschalteter (Downstream) Signaltransduktionswege,
die von einem bestimmten Rezeptor aktiviert werden, bestimmt wird. Somit
ist die Phosphorylierung ein wichtiger regulatorischer Schritt,
der die Selektivität
der von speziellen Wachstumsfaktor-Rezeptoren sowie Differenzierungsfaktor-Rezeptoren
in Anspruch genommenen Signalwege bestimmt.
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Es ist gezeigt worden, dass aberrante
Stimulierung, Expression oder Mutationen in den PTKs entweder zu
unkontrollierter Zellproliferation (z. B. malignem Tumorwachstum)
oder zu Defekten in grundlegenden Entwicklungs- oder Reparaturvorgängen führen. Deshalb
wurden im biomedizinischen Bereich erhebliche Ressourcen aufgewendet,
um die spezifische biologische Rolle von Mitgliedern der PTK-Familie,
ihre Funktion in Differenzierungsvorgängen, ihre Beteiligung an der
Tumorentstehung und anderen Erkrankungen, die biochemischen Mechanismen,
die ihren durch Ligandstimulierung aktivierten Signaltransduktionswegen
zugrunde liegen, und die Entwicklung neuer Wirkstoffe aufzudecken.
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Tyrosinkinasen können vom Rezeptortyp (diese
haben extrazelluläre,
transmembrane und intrazelluläre
Domänen)
oder vom Nichtrezeptortyp (diese sind in ihrer Gesamtheit intrazellulär) sein.
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Rezeptortyrosinkinasen (RTKs). Die
RTKs beinhalten eine umfangreiche Familie von Transmembranrezeptoren
mit mannigfaltigen biologischen Aktivitäten. Zur Rezeptortyrosinkinase
(RTK)-Familie gehören
Rezeptoren, die für
das Wachstum und die Differenzierung einer Vielzahl von Zelltypen
entscheidend sind (Yarden und Ullrich, Ann. Rev. Biochem. 57: 433–478, 1988;
Ullrich und Schlessinger, Cell 61: 243–254, 1990). Die intrinsische
Funktion von RTKs wird durch die Ligandenbindung aktiviert, was
zur Phosphorylierung des Rezeptors und multipler zellulärer Substrate,
und anschließend
zu einer Vielzahl von zellulären
Antworten führt (Ullrich & Schlessinger,
1990, Cell 61: 203–212).
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Bis heute sind wenigstens 19 (19)
verschiedene RTK-Unterfamilien identifiziert worden. Eine als die HER-Unterfamilie
bezeichnete RTK-Unterfamilie soll EGFR, HER2, HER3 und HER4 umfassen.
Zu den Liganden für
die HER-Rezeptor-UnterFamilie
gehören
der epitheliale Wachstumsfaktor (EGF), TGF-α, Amphiregulin, HB-EGF, Betazellulin
und Heregulin. Eine aberrante Regulation der HER2/erbB2-Kinasenaktivität soll insbesondere
in Brustkarzinomen für
einen transformierten tumorgenen Phänotyp förderlich sein. Zwei weitere RTK-Unterfamilien
werden als die INS-R, IGF-1R und IR-R umfassende Insulinrezeptor-Unterfamilie
und die PDGFα-
und -β-Rezeptoren,
CSF-1R und c-kit umfassende „PDGFR"-Unterfamilie bezeichnet.
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Es wurde vorgeschlagen, dass mehrere
Rezeptortyrosinkinasen und daran bindende Wachstumsfaktoren eine
Rolle bei der Angionese spielen, wenngleich einige für die Angionese
indirekt förderlich
sein können (Mustonen
und Alitalo, J. Cell Biol. 129: 895–898, 1995). Eine derartige
Rezeptortyrosinkinase, die als fötale Leberkinase
1 (flk-1) bekannt ist, gehört
zur Typ-III-Unterklasse der RTKs. Eine alternative Bezeichnung für humane
flk-1 ist Kinaseninsertionsdomäne
enthaltender Rezeptor (KDR) (Teman et al., Oncogene 6: 1677–83, 1991).
Eine weitere alternative Bezeichnung für flk-1/KDR ist „vaskulärer endothelialer
Zellwachstumsrezeptor 2" (VEGFR-2).
Die murine Version von flk-1/VGFR-2 ist auch NYK genannt worden
(Oelrichs et al., Oncogene 8(1): 11–15, 1993). DNAs, die flk-1
aus Maus, Ratte und Mensch kodieren, sind isoliert worden, und es
wurde über
die Nukleotid- und die kodierten Aminosäuresequenzen berichtet (Matthews
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9026–30, 1991; Terman et al., 1991,
supra; Terman et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 187: 1579–86, 1992;
Sarzani et al., supra; und Millauer et al., Cell 72 835–846, 1993).
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Die als fms-artige Tyrosinkinase
1 (flt-1) bezeichnete RTK der Typ-III-Unterklasse ist verwandt mit flk-1/KDR
(de Vries et al., Science 255; 989–991, 1992; Shibuya et al.,
Oncogene 5: 519–524,
1990). Eine alternative Bezeichnung für flt-1 ist „vaskulärer endothelialer
Zellwachstumsfaktor-Rezeptor 1" (VEGFR-1).
Bis heute fand man, dass die Mitglieder der flk-1/KDR/VEGFR-2- und
flt-1/VEGFR-1-Unterfamilien in erster Linie auf endothelialen Zellen
exprimiert werden. Die Mitglieder dieser Unterklasse werden von
Mitgliedern der vaskulären
endothelialen Zellwachstumsfaktor (VEGF)-Ligandenfamilie spezifisch
stimuliert (Klagsburn und D'Amore,
Cytokine & Growth
Factor Reviews 7: 259–270,
1996). Man nimmt an, dass flt-1 während der vaskulären Entwicklung
für die
endotheliale Organisation essentiell ist. Die Expression von flt-1
hängt mit
der vaskulären
Frühentwicklung
in Mausembryos und mit der Neovaskularisierung während der Wundheilung zusammen
(Mustonen und Alitalo, supra). Die Expression von flt-1 in adulten
Organen lässt
auf eine zusätzliche Funktion
dieses Rezeptors, die sich nicht auf das Zellwachstum bezieht, schließen (Mustonen
und Alitalo, supra).
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Eine weitere RTK, die mit flt-1 und
flk-1/KDR verwandet ist, ist flt-4 (Galland et al., Oncogene 8: 1233–40, 1993,
Pajusola et al., Oncogene 8: 2931–37, 1993). Zu gemeinsamen
Merkmalen dieser drei Rezeptoren gehören die sieben immunglobulinartigen
Domänen
in ihren extrazellulären
Regionen. Die Aminosäuresequenz
von flt-4 weist eine signifikante Homologie mit den Sequenzen von
flt-1 und flk-1/KDR insbesondere in der Tyrosinkinasedomäne auf (Galland
et al, supra). Anders als flt-1 und flk-1 wird eine Vorläuferform
von flt-4 allerdings während
der posttranslationalen Prozessierung geschnitten, wodurch sich
zwei Disulfidverknüpfte
Polypeptide bilden (Pajusola et al., supra). Studien zur flt-4-Expression
während
der Entwicklung stützen
die Theorie des venösen
Ursprungs der Lymphgefäße (Kaipainen
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 3566–70, April, 1995).
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Angesichts der entscheidenden Rolle
endothelialer Zellen in der Angiogenese sind Wachstumsfaktoren,
die auf endotheliale Zellen wirken, für Studien zur Regulation der
Vaskularisierung von besonderer Bedeutung. Ein derartiger Faktor
ist der vaskuläre
endotheliale Zellwachstumsfaktor (VEGF), der sowohl an flk-1/KDR
als auch an flt-1 mit relativ hoher Affinität bindet und auf vaskuläre Endothelzellen
mitogen wirkt (Terman et a., 1992, supra; Mustonen et al., supra;
DeVries et al., supra). VEGF bindet nicht an flt-4 (Pajusola et al.,
supra). Die in Millauer et al., supra, berichteten Untersuchungen
lassen darauf schließen,
dass VEGF und flk- 1/KDR/VEGFR-2
ein Ligand-Rezeptor-Paar sind, das bei der Bildung und dem Sprießen von
Blutgefäßen, Vaskulogenese
bzw. Angiogenese genannt, eine wichtige Rolle spielen.
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Es wurde über unterschiedliche Formen
von VEGF, die auf ein alternatives Spleißen der mRNA zurückzuführen sind,
berichtet; hierzu gehören
die vier von Ferrara et al., (J. Cell. Biochem, 47: 211–218, 1991) beschriebenen
Arten. Sowohl sekretierte als auch vornehmlich Zell-assoziierte
Arten von VEGF wurden von Ferrera et al., supra, identifiziert,
und es ist bekannt, dass das Protein in Form Disulfid-verknüpfter Dimere
vorkommt.
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Es ist ebenfalls bekannt, dass es
eine Vielzahl physiologischer und biochemischer Mechanismen gibt, die Ödemen und
der Bildung des ödemartigen
Zustandes in einem Individuum zugrunde liegen. Ein wichtiger Mediator
in einem oder mehreren dieser Mechanismen ist der „vaskuläre endotheliale
Zellwachstumsfaktor" (VEGF).
Dieser Mediator ist ebenfalls bekannt als „vaskulärer Permeabilitätsfaktor" (VPF). Dieser Faktor
bewirkt eine Hochregulation des Transports in vaskuläre endotheliale
Zellen und eine Zunahme der Permeabilität vieler vaskulärer Auskleidungen,
wozu die Haut, subkutane Gewebe, das Bauchfell, das Mesenterium,
das Diaphragma, die Trachea, die Bronchien, der Zwölffingerdarm
und der Uterus gehören.
Diese erhöhten
Permeabilitätswirkungen
können
begleitet sein von einer signifikanten Diapedesis, Veränderungen
des Austauschs über
das Endothel, einer Extravasation und Ablagerung von Makromolekülen an diesen
Stellen und einer ausgedehnten Hypotonie. Diese Vorgänge sollen
bei der Einleitung der Neovaskularisierung helfen. VEGF wird von
inflammatorischen T-Zellen, Makrophagen, Neutrophilen und Eosinophilen,
etc. an Entzündungsherden exprimiert.
Dieser Faktor wird durch Hypoxie, bestimmte vasopressorische Hormone,
Wachstumsfaktoren, reproduktive Hormone und viele inflammatorische
Zytokine hochreguliert. VEGF-vermittelte vaskuläre Permeabilität ist mit
Erkrankungen wie Tumorascites, Endometriose, ödemartigen Antworten auf Verbrennungen
und Trauma, endothelialer Dysfunktion bei Diabetes, Komplikationen
des ovarialen Hyperstimulationssyndroms und Augenödemen in
Verbindung gebracht worden.
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Es ist daher klar, dass die Inhibierung
der VEGF-Produktion oder -aktivität vorteilhaft wäre, insbesondere
um das Auftreten der oben aufgeführten
Erkrankungen zu blockieren. Vor allem wären Agenzien, welche die VEGFvermittelte
Hyperpermeabilität
und Ödeme
und damit zusammenhängende
Syndrome zu blockieren vermögen,
für die
Milderung dieser Erkrankungen brauchbar.
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Der Plazentawachstumsfaktor (PIGF)
hat eine Aminosäuresequenz,
die eine signifikante Homologie mit der VEGF-Sequenz aufweist (Park
et al., J. Biol. Chem. 269: 25646–54, 1994; Maglione et al.
Oncogene 8, 925–31,
1993). Wie im Falle von VEGF sind unterschiedliche Arten von PIGF
auf ein alternatives Spleißen der
mRNA zurückzuführen und
das Protein kommt in dimerer Form vor (Park et al., supra). PIGF
bindet an flt-1 mit hoher Affinität, nicht jedoch an flk-1/KDR
(Park et al., supra). PIGF potenziert die mitogene Wirkung von VEGF
auf endotheliale Zellen, wenn VEGF in niedrigen Konzentrationen
zugegen ist; es hat jedoch keine nachweisbare Wirkung, wenn VEGF
in höheren
Konzentrationen zugegen ist (Park et al., supra).
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Zwei weitere Unterfamilien von RTKs
sind als die FGF-Rezeptorfamilie (FGFR1, FGFR2, FGFR3 und FGFR4)
und die Met-Unterfamilie (c-met und Ron) bezeichnet worden.
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Wegen der Ähnlichkeiten zwischen den PDGF-
und FLK-Unterfamilien, werden die beiden Unterfamilien oftmals zusammen
berücksichtigt.
Die bekannten RTK-Unterfamilien
werden in Plowman et al., 1994, DN&P 7(6): 334–339 identifiziert.
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In gewissen klinischen Situationen
(z. B. wenn das Wachstum und die Metastasierung solider Tumoren unterdrückt werden
soll, oder bei der Behandlung rheumatoider Arthritis) ist eine Inhibierung
der Angiogenese wünschenswert,
während
für die
Behandlung anderer Zustände
(z. B. bei der Wundheilung) die Förderung der Vaskularisierung
von Vorteil ist. Folglich sind sowohl Moleküle, die durch die Transduktion
von Signalen über die
oben diskutierten Rezeptoren die Angiogenese fördern, als auch Moleküle, die
eine derartige Signaltransduktion zu inhibieren vermögen, von
Interesse.
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Die Nichtrezeptortyrosinkinasen.
Die Nichtrezeptortyrosinkinasen stellen eine Sammlung zellulärer Enzyme
dar, denen extrazelluläre
und transmembrane Sequenzen fehlen. Bis heute sind über 24 einzelne Nichtrezeptortyrosinkinasen
identifiziert worden, wozu elf (11) Unterfamilien (Src, Frk, Btk,
Csk, Abl, Zap70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack und LIMK) gehören. Die
Src-Unterfamilie von Nichtrezeptortyrosinkinasen besteht zur Zeit
aus der größten Anzahl
von PTKs; hierzu gehören
Src, Yes, Fyn, Lck, Blk, Hck, Fgr und Yrk. Die Src-Unterfamilie
von Enzymen ist mit der Oncogenese in Verbindung gebracht worden.
Eine detailliertere Auseinandersetzung mit Nichtrezeptortyrosinkinasen
findet sich in Bolen, 1993, Oncogene 8: 2025–2031.
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Man hat gefunden, dass viele der
Tyrosinkinasen, ob RTK oder Nichtrezeptortyrosinkinase, an zellulären Signalwegen
beteiligt sind, die wiederum an zahlreichen pathogenen Zuständen, Krebs,
Psoriasis und weitere hyperproliferative Erkrankungen oder Hyperimmunantworten
eingeschlossen, beteiligt sind.
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Entwicklung von Verbindungen zur
Modellierung der PTKs. Angesichts der vermuteten Bedeutung von PTKs
für die
Kontrolle, Regulation und Modulation der Zellproliferation, sowie
für Krankheiten
und Erkrankungen, die mit einer anormalen Zellproliferation in Verbindung
stehen, sind viele Versuche unternommen worden, „Inhibitoren" für Rezeptor-
und Nichtrezeptortyrosinkinasen zu identifizieren, wobei man eine
Vielzahl von Ansätzen
verwendete, wozu die Verwendung mutierter Liganden (US-Anmeldung
Nr. 4,966,849), lösliche
Rezeptoren und Antikörper
(Anmeldungsnummer WO 94/10202; Kendall & Thomas, 1994, Proc. Natl. Acad.
Sci 90: 10705–09;
Kim et al., 1993, Nature 362: 841–844), RNA-Liganden (Jellinek
et al., Biochemistry 33: 10450–56; Takano,
et al., 1993, Mol. Bio. Cell 4: 358A; Kinsella et al., 1992, Exp.
Cell Res. 199: 56–62;
Wright et al., 1992, J. Cellular Phys. 152: 448–57) und Tyrosinkinaseinhibitoren
(WO 94/03427; WO 92/21660; WO 91/15495; WO 94/14808; US-Patent Nr.
5,330,992; Mariani et al., 1994 Proc. Am. Associ. Cancer Res., 35:
2268) gehören.
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Kürzlich
wurden Versuche unternommen, kleine Moleküle zu identifizieren, die als Tyrosinkinaseinhibitoren
wirken. Bismonocyklische, bicyklische oder heterocyklische Arylverbindungen
(PCT WO 92/20642), Pyrazolochinazolin-Verbindungen (Palmer et al.,
J. Med. Chem. (1997), 40: 1519), 4-Amino-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidine
(PCT WO 96/31510), substituierte Pyrazole (PCT WO 96/14843) und
Vinylenazaindol-Derivate
(PCT WO 94/14808) wurden beispielsweise in allgemeiner Form als
Tyrosinkinaseinhibitoren beschrieben. Styrylverbindungen (US-Patent
Nr. 5.217,999), Styryl-substituierte Pyridylverbindungen (US-Patent-
Nr. 5,302,606), gewissen Chinazolin-Derivate (EP-Anmeldungsnr. 0
566 266 A1), Selenoindole und Selenide (PCT WO 94/03427), tricyklische
Polyhydroxyverbindungen (PCT WO 92/21660), 4-Amino-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidine
(PCT WO 96/31510) und Benzylphosphonsäureverbindungen (PCT WO 91/15495)
sind als Verbindungen für
die Verwendung als Tyrosinkinaseinhibitoren zur Behandlung von Krebs
beschrieben worden.
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Indeno-, Naphtho- und Cycloheptapyrazole
sind als abortiv und fertilitätsvermindernd
wirkende Agenzien beschrieben worden (Coombs und Houlihan, US-Patent
Nr. 3,843,665 und Habeck und Houlihan. US-Patent Nr. 3.932,430).
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Die Identifizierung wirksamer kleiner
Moleküle,
welche die Tyrosinsignaltransduktion durch eine Modulierung der
Aktivität
von Rezeptor- und Nichtrezeptortyrosinkinasen inhibieren, um eine
anormale oder unzweckmäßige Zellproliferation
zu regulieren und zu modulieren, ist daher wünschenswert.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die Erfindung betrifft ein Verfahren
zur Inhibierung einer Tyrosinkinase-Aktivität, wobei man Verbindungen der
Formel:
worin Ring A für die tautomeren
Strukturen
steht; n für 1, 2 oder
3 steht; Ar für
steht; und R
1,
R
2 und R
4, R
5 jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff,
Halogen mit einem Atomgewicht von etwa 19 bis 36, Niederalkyl mit
1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Niederalkoxy, Trifluormethyl stehen oder
R
1, R
2 und R
4, R
5 zusammengenommen
unabhängig
voneinander für
Methylendioxy, das an die angrenzenden Kohlenstoffatome gebunden
ist, stehen;
R
3 für Wasserstoff, -COR
6 oder -SO
2R
6 steht; und
R
6 für -CH
3 oder
steht, worin Y für Wasserstoff,
Chlor oder -CH
3 steht, verabreicht.
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Enantiomere, Tautomere, und Gemische
dieser Verbindungen gehören
zur Erfindung. Pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze dieser Verbindungen gehören auch
zu dieser Erfindung.
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Die Verbindungen der Strukturformel
I sind als Inhibitoren der Tyrosinkinase-Aktivität brauchbar. Vor allem sind
diese Verbindungen brauchbar als Inhibitoren von Tyrosinkinasen,
die für
den Angiogenesevorgang von Bedeutung sind. Hinzu kommt, dass diese
Verbindungen auch als Inhibitoren von Tyrosinkinasen brauchbar sind,
die beim vaskulären
Hyperpermeabilitätsvorgang
von Bedeutung sind. Da diese Verbindungen antiangiogen sind und
die vaskuläre
Hyperpermeabilität
inhibieren, stellen sie wichtige Substanzen dar, um die Progredienz
von Erkrankungszuständen
zu inhibieren, bei denen Angiogenese und vaskuläre Hyperpermeabilität wichtige
Komponenten sind.
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Bevorzugte Verbindungen zur Verwendung
im erfindungsgemäßen Verfahren
haben die Formel:
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Zur vorliegenden Erfindung gehört des weiteren
die Verwendung dieser Verbindungen in pharmazeutischen Zusammensetzungen
mit einer pharmazeutisch wirksamen Menge der oben beschriebenen
Verbindungen und einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder
Exzipienten. Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen können Individuen
verabreicht werden, um den Angiogenesevorgang in Angiogenese-unterstützten Erkrankungen
oder die vaskuläre
Hyperpermeabilität
in Erkrankungen, die mit diesem Vorgang zusammenhängen, zu
verlangsamen oder aufzuhalten.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die Verbindungen der Strukturformel
I haben antiangiogene Eigenschaften. Deshalb können diese Verbindungen als
aktive Agenzien bei Erkrankungszuständen verwendet werden, wie
Arthritis, Atherosklerose, Psoriasis, Hämangiome, myocardiale Angiogenese,
koronaren und zerebralen Kollateralen, Angiogenese ischämischer
Gliedmaßen,
Wundheilung, mit gastrointestinalem Helicobacter-Ulcus in Verbindung
stehenden Erkrankungen, Frakturen, Katzenkratzkrankheit, Rubeose,
neovaskulärem
Glaukom, und Retinopathien wie denjenigen, die mit diabetischer
Retinopathie oder altersbedingter Makuladegeneration in Zusammenhang stehen.
Hinzu kommt, dass einige dieser Verbindungen als aktive Agenzien
gegen solide Tumoren und hyperproliferative Erkrankungen verwendet
werden können,
da derartige Erkrankungen eine Proliferation von Blutgefäßzellen
für Wachstum
und Metastase benötigen.
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Die Verbindungen der Strukturformel
I besitzen eine inhibierende Aktivität auf Tyrosinkinasen. Diese Verbindungen
modulieren nämlich
die Signaltransduktion durch Tyrosinkinasen. Vor allem inhibieren
diese Verbindungen selektiv die Aktivität der KDR/FLK-1NGFR-2-Tyrosinkinasen.
Bestimmte Verbindungen der Erfindung inhibieren auch die Aktivität weiterer
Tyrosinkinasen wie Flt-1, VEGFR-1, Kinasen der Src-Unterfamilie wie
Lck, Src, fyn, yes, etc. Das Auftreten und die Potenz der inhibitorischen
Aktivität
der erfindungsgemäßen Verbindungen
gegen eine bestimmte Tyrosinkinase hängt von der Art, Anzahl und
Anordnung der Substituenten (d. h. R1, R2, R3, R4,
R5 und R6) dieser
Verbindungen ab.
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Die Verbindungen der Strukturformel
I inhibieren auch die vaskuläre
Hyperpermeabilität
und die Ödembildung
in denjenigen Individuen, die diese benötigen und denen solche Verbindungen
verabreicht werden. Die Verbindungen wirken, so glaubt man, indem
sie die Aktivität
inhibieren, die von VEGF-Rezeptoren vermittelt wird, die an dem
Vorgang der vaskulären
Hyperpermeabilität
und Ödembildung
beteiligt sind. VEGF ist einzigartig darin, dass er der einzige
angiogene Wachstumsfaktor ist, von dem man weiß, dass er direkt zur vaskulären Hyperpermeabilität und zur Ödembildung
beiträgt.
Tatsächlich
scheinen die vaskuläre
Hyperpermeabilität
und Ödeme,
die mit der Expression oder Verabreichung vieler weiterer Wachstumsfaktoren
in Zusammenhang stehen, über
die VGEF-Produktion vermittelt zu sein. Vaskuläre Hyperpermeabilität wird oftmals auch
von Diapedesis begleitet. In ähnlicher
Weise kann eine exzessive vaskuläre
Hyperpermeabilität
den normalen molekularen Austausch über das Endothel in kritischen
Geweben und Organen (z. B. Lunge und Niere) unterbrechen, wodurch
Funktionsstörungen
auftreten und makromolekulare Extravasation und Ablagerung hervorgerufen
wird. Indem man die Kinaseaktivität von VEGF-Rezeptoren inhibiert,
werden die Hyperpermeabilität
genauso wie die damit in Verbindung stehende Extravasation, die
darauf folgende Bildung von Ödemen oder
Ascites und Matrixablagerungen inhibiert und minimiert.
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Hinzu kommt, dass N-acylierte (R3 = -COR6) Formen
oder N-sulfonylierte (R3 = -SO2R6) Analoga der erfindungsgemäßen Verbindungen
auch als Prodrugs dienen können,
die als metabolisch aktive antiangiogene Agenzien wirken.
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Man stellt sich vor, dass die oben
aufgeführten
Erkrankungen in einem beträchtlichen
Maß durch
eine Proteintyrosinkinase-Aktivität vermittelt sind, an denen
die KDR/VEGFR-2- und/oder die Flt1/VEGFR-1-Tyrosinkinasen beteiligt
sind. Indem man die Aktivität
dieser Tyrosinkinasen inhibiert, wird die Progredienz der aufgeführten Erkrankungen
inhibiert, da die angiogene Komponente des Erkrankungszustandes
stark eingeschränkt
wird. Die Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen führen wegen
ihrer Selektivität
für spezifische
Tyrosinkinasen zu einer Minimierung von Nebenwirkungen, die dann
auftreten würden,
wenn weniger selektive Tyrosinkinaseinhibitoren verwendet würden.
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Die Potenz und Spezifität der erfindungsgemäßen generischen
Verbindungen kann oftmals durch Variationen der Substituenten und
Konformationseinschränkungen
verändert
und optimiert werden.
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Erfindungsgemäß gelten
die folgenden Definitionen:
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„Pharmazeutisch verträgliches
Säureadditionssalz" bezieht sich auf
diejenigen Salze, welche die biologische Wirksamkeit und Eigenschaften
der freien Basen beibehalten und die durch Umsetzung mit anorganischen
Säuren
wie Chlorwasserstoffsäure,
Bromwasserstoffsäure,
Schwefelsäure,
Salpetersäure,
Phosphorsäure
oder organischen Säuren
wie Sulfonsäure,
Carbonsäure,
organischer Phosphorsäure,
Methansulfonsäure,
Ethansulfonsäure,
p-Toluolsulfonsäure, Salicylsäure, Milchsäure, Weinsäure und
dergleichen erhalten werden.
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„Alkyl" bezieht sich auf einen gesättigten
aliphatischen Kohlenwasserstoff, wozu geradkettige und verzweigte
Gruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen gehören.
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„Alkoxy" bezieht sich auf eine „O-Alkyl"-Gruppe, worin „Alkyl" wie zuvor beschrieben
definiert ist.
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Pharmazeutische
Formulierungen und Verabreichungswege
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Die identifizierten erfindungsgemäßen Verbindungen
können
als solche oder in pharmazeutischen Zusammensetzungen, in denen
sie mit geeigneten Trägern
oder Exzipienten vermischt sind, einem menschlichen Patienten in
Dosen zur Behandlung oder Verbesserung einer Vielzahl von Erkrankungen
verabreicht werden. Eine therapeutisch wirksame Dosis bezieht sich
des Weiteren auf diejenige Menge der Verbindung, die ausreicht,
um zu einer Verbesserung von Symptomen zu führen. Techniken zur Formulierung
und Verabreichung der Verbindungen der vorliegenden Anmeldung sind
in „Remington's Pharmaceutical
Sciences", Mack
Publishing Co., Easton, PA, letzte Ausgabe, zu finden.
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Verabreichungswege
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Zu geeigneten Verabreichungswegen
gehören
beispielsweise die orale, rektale, transmuköse, topische oder intestinale
Verabreichung oder die Verabreichung in Form von Augentropfen; die
parenterale Abgabe – intramuskuläre, subkutane,
intrameduläre
Injektionen genauso wie intrathecale, direkte intraventrikuläre, intravenöse, intraperitoneale,
intranasale oder intraokuläre
Injektionen eingeschlossen.
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Alternativ kann man die Verbindung
in einer eher lokalen als systemischen Weise verabreichen, beispielsweise
durch Injektion der Verbindung direkt in einen soliden Tumor, oftmals
in einer Depotformulierung oder einer Formulierung mit verzögerter Freisetzung.
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Außerdem kann man den Wirkstoff
in einem System zur gezielten Wirkstoffabgabe verabreichen, beispielsweise
in einem mit tumorspezifischem Antikörper beschichteten Liposom.
Die Liposomen werden gezielt an den Tumor herangeführt und
von ihm selektiv aufgenommen.
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Zusammensetzung/Formulierung
-
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen
können
in einer Weise hergestellt werden, die an sich bekannt ist, z. B.
mittels konventioneller Verfahren zum Vermischen, Lösen, Granulieren, Dragieren,
Pulverisieren, Emulgieren, Einkapseln, Einschließen oder Lyophilisieren.
-
Pharmazeutische Zusammensetzungen
für die
erfindungsgemäße Verwendung
können
somit in konventioneller Art und Weise formuliert werden, wobei
man einen oder mehrere physiologisch verträgliche. Träger verwendet, die Exzipienten
und Hilfsstoffe beinhalten, welche das Prozessieren der aktiven
Verbindungen in pharmazeutisch verwendbare Zubereitungen erleichtern.
Die richtige Formulierung hängt
von dem gewählten
Verabreichungsweg ab.
-
Zur Injektion können die Agenzien der Erfindung
in wässrigen
Lösungen,
vorzugsweise in physiologisch kompatiblen Puffern, wie Hanks-Lösung, Ringer-Lösung oder physiologischer Kochsalzlösung formuliert werden.
Für die
transmuköse
Verabreichung werden für
die zu permeierende Barriere geeignete Penetriermittel in der Formulierung
verwendet. Derartige Penetriermittel sind dem Fachmann allgemein
bekannt.
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Für
die orale Verabreichung können
die Verbindungen auf einfache Art und Weise formuliert werden, indem
man die aktiven Verbindungen mit dem Fachmann hinlänglich bekannten
pharmazeutisch verträglichen Trägern kombiniert.
Derartige Träger
gestatten es, die erfindungsgemäßen Verbindungen
als Tabletten, Pillen, Dragees, Kapseln, Flüssigkeiten, Gele, Sirups, Breis,
Suspensionen und dergleichen für
die orale Aufnahme durch den zu behandelnden Patienten zu formulieren.
Pharmazeutische Zubereitungen zur oralen Verwendung können erhalten
werden, indem man die aktive Verbindung mit einem festen Exzipienten
kombiniert, das resultierende Gemisch gegebenenfalls mahlt und das
Granulatgemisch, nach Zusatz geeigneter Hilfsmittel, sofern gewünscht, zu
Tabletten oder Drageekernen verarbeitet. Geeignete Exzipienten sind
vor allem Füllmittel,
wie Zucker – Lactose,
Sucrose, Mannitol oder Sorbitol eingeschlossen; Cellulose-Zubereitungen,
wie beispielsweise Maisstärke,
Weizenstärke,
Reisstärke,
Kartoffelstärke,
Gelatine, Tragantgummi, Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose,
Natriumcarboxymethylcellulose und/oder Polyvinylpyrrolidon (PVP).
Sofern gewünscht,
können
desintegrierende Mittel zugesetzt werden, wie quervernetztes Polyvinylpyrrolidon,
Agar oder Alginsäure,
oder ein Salz davon, wie Natriumalginat.
-
Drageekerne werden mit geeigneten Überzügen versehen.
Dazu kann man konzentrierte Zuckerlösungen verwenden, die gegebenenfalls
arabisches Gummi, Talc, Polyvinylpyrrolidon, Carbopolgel, Polyethlenglykol
und/oder Titandioxid, Lacklösungen
und geeignete organische Lösungsmittel
oder Lösungsmittelgemische
enthalten. Farbstoffe oder Pigmente können den Tabletten- oder Dragee-Überzügen zugesetzt
werden, um sie erkennbar oder verschiedene Kombinationen von Dosen
aktiver Verbindung kenntlich zu machen.
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Zu pharmazeutischen Zubereitungen,
die oral verwendet werden können,
gehören
Steckkapseln aus Gelatine genauso wie geschlossene Weichkapseln
aus Gelatine und einem Weichmacher wie Glyzerin oder Sorbitol. Die
Hartkapseln können
die aktiven Inhaltsstoffe im Gemisch mit Füllmitteln wie Lactose, Bindemitteln wie
Stärken
und/oder Gleitmitteln wie Talc oder Magnesiumstearat und gegebenenfalls
Stabilisierungsmitteln enthalten. In Weichkapseln können die
aktiven Verbindungen in geeigneten Flüssigkeiten, wie fetten Ölen, Flüssigparaffin
oder flüssigen
Polyethylenglykolen, gelöst
oder suspendiert sein. Hinzu kommt, dass Stabilisierungsmittel zugegeben
werden können.
Sämtliche
Formulierungen für
die orale Verabreichung sollten in für die Verabreichung geeigneten
Dosierungen vorliegen.
-
Für
die buccale Verabreichung können
die Zusammensetzungen die Form von Tabletten oder Pastillen haben,
die in herkömmlicher
Art und Weise formuliert sind.
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Für
die Verabreichung durch Inhalation können die Verbindungen zur erfindungsgemäßen Verwendung
bequem in Form einer Aerosol-Spray-Zubereitung aus Druckbehältern oder
Nebulisierern unter Verwendung eines geeigneten Treibmittels, z.
B. Dichlordifluormethan, Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluorethan, Kohlendioxid
oder eines anderen geeigneten Gases, abgegeben werden. im Fall eines
Druckaerosols kann die Dosiseinheit bestimmt werden, indem man ein
Ventil zur Abgabe einer abgemessenen Menge vorsieht. Kapseln oder
Kartuschen aus beispielsweise Gelatine zur Verwendung in einem Inhalator
oder Pulverzerstäuber
können
formuliert werden, wobei sie ein Pulvergemisch der Verbindung und
einer geeigneten Pulverbase wie Laktose oder Stärke enthalten.
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Die Verbindungen können für die parenterale
Verabreichung durch Injektion, z. B. Bolusinjektion oder kontinuierliche
Infusion, formuliert werden. Formulierungen zur Injektion können in
Dosiseinheitsform vorliegen, z. B. in Ampullen oder Multidosis-Behältern, mit
einem zugesetzten Konservierungsmittel. Die Zusammensetzungen können als
Suspensionen, Lösungen
oder Emulsionen in öligen
oder wässrigen
Vehikeln vorliegen, und sie können
Formuliermittel wie Suspendier-, Stabilisier- und/oder Dispergiermittel enthalten.
-
Zu pharmazeutischen Formulierungen
zur parenteralen Verabreichung gehören wässrige Lösung der aktiven Verbindungen
in wasserlöslicher
Form. Hinzu kommt, dass Suspensionen der aktiven Verbindungen als
zweckmäßige ölige Injektionssuspensionen
zubereitet werden können.
Zu geeigneten lipophilen Lösungsmitteln
oder Vehikeln gehören
fette Öle
wie Sesamöl
oder synthetische Fettsäureester
wie Ethyloleat oder Triglyceride oder Liposomen. Wässrige Injektionssuspensionen
können
Substanzen enthalten, die die Viskosität der Suspension erhöhen, wie
Natriumcarboxymethylcellulose, Sorbitol oder Dextran.
-
Gegebenenfalls können die Suspensionen auch
geeignete Stabilisierungsmittel oder Mittel, welche die Löslichkeit
der Verbindungen erhöhen
oder mit denen sich hochkonzentrierte Lösungen zubereiten lassen, enthalten.
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Alternativ kann der aktive Inhaltsstoff
in Pulverform vorliegen, um vor Gebrauch mit einem geeigneten Vehikel,
z. B. sterilem pyrogenfreien Wasser, rekonstituiert zu werden.
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Die Verbindungen können auch
in rektalen Zusammensetzungen, wie Suppositorien oder Retentionsklistern,
die z. B. herkömmliche
Suppositorienbasen wie Kakaobutter oder andere Glyceride enthalten,
formuliert werden.
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Zusätzlich zu den zuvor beschriebenen
Formulierungen können
die Verbindungen auch als Depotzubereitungen formuliert werden.
Derartige langwirkende Formulierungen können mittels Implantation (beispielsweise
subkutan oder intramuskulär
oder durch intramuskuläre
Injektion) verabreicht werden. So können die Verbindungen beispielsweise
mit geeigneten polymeren oder hydrophoben Materialien (beispielsweise
einer Emulsion in einem verträglichen Öl) oder
Ionenaustauschharzen, oder als wenig lösliche Derivate, beispielsweise
als wenig lösliches
Salz, formuliert werden.
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Ein pharmazeutischer Träger für die erfindungsgemäßen hydrophoben
Verbindungen ist ein Cosolvenssystem, das Benzylalkohol, ein nichtpolares
Tensid, ein wassermischbares organisches Polymer und eine wässrige Phase
umfasst. Das Cosolvenssystem kann das VPD-Cosolvenssystem sein.
VPD ist eine Lösung aus
3% G/V Benzylalkohol, 8% G/V des nichtpolaren Tensids Polysorbat
80 und 65% G/V Polyethylenglykol 300 in absolutem Ethanol. Das VPD-Cosolvenssystem
(VPD : 5W) besteht aus VPD, das 1 : 1 mit einer Lösung von
5% Dextrose in Wasser verdünnt
ist. Dieses Cocolvenssystem löst
hydrophobe Verbindungen gut und ruft nach systemischer Verabreichung
geringe Toxizität
hervor. Natürlich
kann die anteilige Zusammensetzung des Cosolvenssystems beachtlich
variiert werden, ohne dass dessen Lösungs- und Toxizitätseigenschaften
abhanden kommen. Außerdem
kann die Art der Cosolvenskomponenten variiert werden: Beispielsweise
können an
Stelle von Polysorbat 80 andere nichtpolare Tenside mit geringer
Toxizität
verwendet werden; die Fraktionsgröße des Polyethylenglykols kann
variiert werden; weitere biokompatible Polymere können Polyethylenglykol ersetzen,
z. B. Polyvinylpyrrolidon; und weitere Zucker oder Polysaccharide
können
Dextrose ersetzen.
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Alternativ können andere Abgabesysteme für hydrophobe
pharmazeutische Verbindungen eingesetzt werden. Liposomen und Emulsionen
stellen hinlänglich
bekannte Beispiele für
Abgabevehikel oder Träger
für hydrophobe
Wirkstoffe dar. Bestimmte organische Lösungsmittel wie Dimethylsulfoxid
können
auch eingesetzt werden, wenngleich in der Regel auf Kosten einer
größeren Toxizität. Hinzu
kommt, dass die Verbindungen abgegeben werden können, indem man ein System
mit verzögerter
Freisetzung verwendet, wie semipermeable Matrizes fester hydrophober
Polymere, die das therapeutische Agens enthalten. Verschiedene Materialien
mit verzögerter
Freisetzung sind etabliert worden und dem Fachmann hinlänglich bekannt.
Kapseln mit verzögerter
Freisetzung können
in Abhängigkeit
von ihrer chemischen Natur die Verbindungen wenige Wochen bis zu über 100
Tage lang freisetzen. In Abhängigkeit
von der chemischen Natur und der biologischen Stabilität des therapeutischen
Agens, können
zusätzliche
Strategien zur Stabilisierung von Proteinen eingesetzt werden.
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Die pharmazeutischen Zusammensetzungen
können
auch geeignete Träger
oder Exzipienten für
eine Fest- oder Gelphase umfassen. Zu solchen Trägern oder Exzipienten gehören beispielsweise
Calciumcarbonat, Calciumphosphat, verschiedene Zucker, Stärken, Cellulosederivate,
Gelatine und Polymere wie Polyethylenglykole, ohne darauf beschränkt zu sein.
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Viele der endungsgemäßen PTK-modulierenden
Verbindungen können
als Salze mit pharmazeutisch kompatiblen Gegenionen zur Verfügung gestellt
werden. Pharmazeutisch kompatible Salze können mit vielen Säuren gebildet
werden; hierzu gehören
Chlorwasserstoff-, Schwefel-, Essig-, Milch-, Wein-, Äpfel-, Bernsteinsäure etc.,
ohne darauf beschränkt
zu sein. Salze neigen dazu, in wässrigen
oder anderen protischen Lösungsmitteln
löslicher
zu sein als die entsprechenden freien Basenformen.
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Wirksame Dosierung
-
Zu pharmazeutischen Zusammensetzungen,
die für
die endungsgemäße Verwendung
geeignet sind, gehören
Zusammensetzungen, in denen die aktiven Inhaltsstoffe in einer wirksamen
Menge enthalten sind, so dass der beabsichtigte Zweck erreicht wird.
Insbesondere meint eine therapeutisch wirksame Menge eine Menge,
die wirksam die Entwicklung von Symptomen des zu behandelnden Subjekts
verhindert oder vorhandene Symptome lindert. Die Bestimmung der
wirksamen Mengen liegt ohne weiteres im Bereich fachmännischen
Könnens,
vor allem dann, wenn man die hier gegebene detaillierte Offenbarung
berücksichtigt.
-
Für
jede beliebige, im endungsgemäßen Verfahren
verwendete Verbindung kann die therapeutisch wirksame Dosis zunächst an
zellulären
Assays bestimmt werden. Beispielsweise kann eine Dosis in Tiermodellen
formuliert werden, um einen Kreislaufkonzentrationsbereich zu erzielen,
welcher die im zellulären
Assay bestimmte IC50 (d. h. diejenige Konzentration
der Testverbindung, welche eine halbmaximale Inhibierung der PTK-Aktivität bewirkt)
beinhaltet. Eine derartige Information kann verwendet werden, um
die in Menschen brauchbaren Dosen genauer zu bestimmen.
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Eine therapeutisch wirksame Dosis
bezieht sich auf diejenige Menge der Verbindung, die zu einer Verbesserung
von Symptomen oder einem längeren Überleben
eines Patienten führt.
Toxizität
und therapeutische Wirksamkeit therapeutischer Verbindungen können mit
Hilfe standardisierter pharmazeutischer Vorgehensweisen in Zellkulturen
oder Versuchstieren bestimmt werden, z. B. zur Bestimmung der LD50 (die Dosis, die auf 50% der Population
letal wirkt) und der ED50 (die Dosis, die
bei 50% der Population therapeutisch wirksam ist). Das Dosisverhältnis zwischen
toxischen und therapeutischen Wirkungen ist der therapeutische Index
und kann als Verhältnis
zwischen LD50 und ED50 angegeben
werden. Bevorzugt werden Verbindungen, die hohe therapeutische Indizes
haben. Die mit diesen Zellkultur-Assays und Tierstudien erhaltenen
Daten können
bei der Formulierung eines für
Menschen verwendbaren Dosierungsbereichs verwendet werden. Die Dosierung derartiger
Verbindungen liegt vorzugsweise innerhalb eines Bereichs von Kreislaufkonzentrationen,
welche die ED50 mit geringer Toxizität oder ohne
Toxizität
beinhalten. Die Dosierung kann innerhalb dieses Bereichs variieren,
je nach eingesetzter Dosierungsform und des verwendeten Verabreichungswegs.
Die Formulierung, Verabreichungsweg und Dosierung können letztendlich
von dem jeweiligen Arzt unter Berücksichtigung des Zustandes
des Patienten gewählt
werden (siehe z. B. Fingl et al., 1975, in „The Pharmacological Basis
of Therapeutics",
Ch. 1 p1).
-
Dosierungsmenge und Dosierungsabstand
können
individuell eingestellt werden, um Plasmaspiegel der aktiven Einheit
zur Verfügung
zu stellen, die ausreichen, um die Kinase-modulierenden Wirkungen
oder die minimal wirksame Konzentration (MEC) aufrecht zu erhalten.
Die MEC ist von Verbindung zu Verbindung verschieden; sie kann aber
anhand von in vitro-Daten bestimmt werden; z. B. diejenige Konzentration,
die unter Verwendung des hier beschriebenen Assays eine 50 bis 90%ige
Inhibition der Kinase erzielt. Die zum Erreichen der MEC erforderliche
Dosierung hängt
von den individuellen Eigenschaften und dem Verabreichungsweg ab.
HPLC-Assays oder Bioassays können
allerdings verwendet werden, um die Plasmakonzentrationen zu bestimmen.
-
Dosisabstände können auch unter Verwendung
des MEC-Wertes bestimmt werden. Verbindungen sollten unter Verwendung
eines Verabreichungsschemas verabreicht werden, mit dem die Plasmaspiegel
10 bis 90% der Zeit, vorzugsweise 30 bis 90% und am bevorzugtesten
50 bis 90% oberhalb der MEC gehalten werden. Im Falle einer lokalen
Verabreichung oder einer selektiven Aufnahme kann die wirksame lokale
Konzentration des Wirkstoffs nicht mit der Plasmakonzentration in
Zusammenhang stehen.
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Die verabreichte Menge der Verbindung
wird natürlich
von dem zu behandelnden Subjekt, dem Gewicht des Subjekts, der Schwere
des Leidens, der Art der Verabreichung und der Beurteilung des verschreibenden
Arztes abhängen.
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Verpackung
-
Falls gewünscht, kann die Zusammensetzung
in einer Verpackung oder einer Abgabevorrichtung dargeboten werden,
in der eine oder mehrere den aktiven Inhaltsstoff enthaltende Dosierungseinheiten
enthalten sind. Die Packung kann beispielsweise eine Metall- oder
Plastikfolie umfassen, beispielsweise einen Blister. Der Packung
oder Abgabevorrichtung können
Instruktionen für
die Verabreichung beigefügt
sein. Zusammensetzungen, die eine erfindungsgemäße, in einem kompatiblen pharmazeutischen
Träger
formulierte Verbindung beinhalten, können auch zubereitet werden,
in einen geeigneten Behälter
gegeben werden und zur Behandlung eines angegebenen Zustandes markiert
werden. Zu geeigneten Zuständen,
die auf der Markierung angegeben sind, gehören die Behandlung zellulärer hyperproliferativer
Erkrankungen, die Inhibierung der Angiogenese, die Behandlung von
Fibrose, Diabetes, Ödeme,
Ascites, und dergleichen.
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Beispiele
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I. Synthese
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Es gibt zwei allgemeine Ansätze für die Synthese
der Indeno-, Naphtho- und Cyclohepta(1,2-c]pyrazol-Ringsysteme,
die im US-Patent 3,843,665 und US-Patent 3,843,666 angegeben sind
und Formel I entsprechen.
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In dem US-Patent 3,843,665 wird die
Cyclisierung des Pyrazolrings dadurch bewirkt, dass man Verbindungen
der Struktur II mit einem aromatischen Sulfonylhydrazid in einem
inerten Lösungsmittel
und einer katalytischen Menge Säure
erwärmt.
Die Reaktion wird für
eine Zeitspanne von 5 bis 30 Stunden bei einer Temperatur von 75
bis 100°C
durchgeführt.
Das folgende Schema steht für
diese Transformation.
worin: p 0, 1, 2 ist; und
W Niederalkyl ist.
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Verbindungen der Formel II werden
hergestellt, indem man ein in geeigneter Weise funktionalisiertes 1-Indanon,
alpha-Tetralon oder 1-Benzoesuberon mit einem Arylaldehyd in Gegenwart
eines sauren oder basischen Katalysators behandelt (Braun, R. A.;
Mosher, W. A., J. Amer. Chem. Soc., 1958, 80, 2749).
-
-
Ein zweites Verfahren zur Herstellung
von Indeno-, Naphtho- und Benzo[6,7)cyclohepta[1,2-c]pyrazol ist
im US-Patent 3,843,666 angegeben, wonach Verbindungen der allgemeinen
Formel VI mit einer katalytischen Menge einer organischen Carbonsäure oder
einer organischen Sulfonsäure
in einem inerten Lösungsmittel
wie einem aromatischen Kohlenwasserstoff für eine Zeitspanne von 6 bis
24 Stunden auf 75 bis 175°C erwärmt werden.
worin: Ar, R
1 und
R
2 obige Bedeutungen haben.
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Verbindungen mit der allgemeinen
Formel VI werden hergestellt, indem man Verbindungen der allgemeinen
Formel VII mit Hydrazin in einem inerten Lösungsmittel behandelt. Die
Reaktion wird für
eine Zeitspanne von bis zu 24 Stunden bei 15 bis 20°C durchgeführt.
-
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Verbindungen der allgemeinen Formel
VII werden hergestellt, indem man II mit alkalischem Wasserstoffperoxid
bei Raumtemperatur in einem geeigneten organischen Cosolvens-Gemisch
wie CH
2Cl
2/MeOH
behandelt. Alternativ resultiert VII aus der Reaktion von VIII mit
einem Arylaldehyd unter basischen Bedingungen. Die Reaktion wird
in einem inerten Lösungsmittel
bei einer Temperatur von 5 bis 10 °C für eine Zeitspanne von 3 bis
6 Stunden durchgeführt.
worin:
Y eine beliebige
herkömmliche
Abgangsgruppe wie Chlor, Brom, Jod, Tosylat oder Mesylat ist.
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Die Cyclisierung von VI kann ebenfalls
bewirkt werden, indem man mit einer Mineralsäure wie Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure oder
Phosphorsäure
behandelt. Die Reaktion wird in einem Niederalkanol bei einer Temperatur
von 15°C
bis 20°C
für eine
Zeitspanne von 12 bis 48 Stunden durchgeführt. Das Produkt der Reaktion,
nämlich
IX, kann dann zu I aromatisiert werden, indem man es mit einer organischen
Carbonsäure
oder einer organischen Sulfonsäure
in einem geradkettigen Ether oder einem cyclischen Ether für eine Zeitspannne
von 8 bis 30 Stunden auf eine Temperatur von 50 bis 150°C erwärmt.
-
-
Die Verbindung IX kann deacetyliert
werden, indem man mit Essigsäureanhydrid
in einem inerten Lösungsmittel
wie einem aromatischen Kohlenwasserstoff bei einer Temperatur von
35 bis 200°C
für eine
Zeitspanne von 5 bis 8 Stunden behandelt.
-
-
Die Verbindung XI kann dann zu Verbindung
XII aromatisiert werden, indem man sie mit einer Mineralsäure oder
einer organischen Säure
in einem inerten Lösungsmittel
für eine
Zeitspanne von 4 bis 8 Stunden auf eine Temperatur von 35 bis 200°C erwärmt. Schließlich kann
die Verbindung XII in I überführt werden,
indem man sie in einem inerten Lösungsmittel
wie Wasser oder einem Niederalkohol in Gegenwart eines Alkalimetalls
oder eines Alkalimetallhydroxids für eine Zeitspanne von 8 bis
30 Stunden auf eine Temperatur von 50 bis 150°C erwärmt.
-
-
Verbindungen der allgemeinen Formel
XIII können
erhalten werden, indem man VII mit einer Verbindung der Formel XIV
in Gegenwart eines inerten (Lösungsmittels
wie einem Niederalkanol, einem geradkettigen Ether oder einem cyclischen
Ether bei einer Temperatur von 15 bis 20°C für eine Zeitspanne von 24 Stunden
behandelt.
worin:
R
3 für Wasserstoff,
-COR
6 oder -SOR
6 steht,
und
R für
-CH
3 oder
steht.
Y ist Wasserstoff,
Chlor oder -CH
3.
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Verbindungen der allgemeinen Formel
XIII können
zu XV cyclisiert werden, indem man sie mit einer katalytischen Menge
einer organischen Carbonsäure
oder einer organischen Sulfonsäure
in einem inerten Lösungsmittel
wie einern aromatischen Kohlenwasserstoff für eine Zeitspanne von 6 bis
24 Stunden auf 75 bis 175°C
erwärmt.
Verbindungen der allgemeinen Formel XV (R3 #
H) können
in I überführt werden,
indem man sie in einem inerten Lösungsmittel
wie Wasser oder einem Niederalkohol in Gegenwart eines Alkalimetalls oder
eines Alkalimetallhydroxids für
eine Zeitspanne von 8 bis 30 Stunden auf eine Temperatur von 50
bis 150°C
erwärmt.
-
-
Spezielle Beispiele für die obigen
Transformationen sind in den US-Patenten 3,843,665 und 3,843,666 zu
finden.
-
Beispiele
-
Durch die folgenden, lediglich beispielhaft
angegebenen Beispiele wird die Erfindung weiter erläutert. Das
Endprodukt jedes dieser Beispiele wurde mit einer oder mehrerer
der folgenden Vorgehensweisen charakterisiert: Hochleistungsflüssig-Chromatographie;
Elementaranalyse, magnetische Kernresonanzspektroskopie, Infrarotspektroskopie
und hochauflösende
Massenspektroskopie:
THF = Tetrahydrofuran;
DMF = Dimethylformamid;
IMS
= industrielles methyliertes Benzin; und
LCMS = Flüssigchromatographie/Massenspektroskopie.
-
Die Beispiele 1 bis 3 wurden mit
den in
US 3,932,430 (Sandoz,
1976) angegebenen Verfahren hergestellt:
-
Beispiel 1
-
3-(3-Pyridyl)-1,4-dihdroindeno[1,2-c]pyrazol,
Schmelzpunkt 223–224°C;
-
Beispiel 2
-
3-(4-Pyridyl)-1,4-dihdroindeno[1,2-c]pyrazol,
Schmelzpunkt 264–266°C (Zersetzung);
-
Beispiel 3
-
3-(2-Thienyl)-4,5-dihdro-1H-benz[g]indazol,
Schmelzpunkt 206–208°C.
-
Beispiel 4
-
Ein Gemisch aus 2-Benzyliden-indan-1-on
(3.99 g), p-Toluolsulphonylhydrazin (4,0 g), p-Toluolsulphonsäure-Hydrat
(0,7 g) und Ethanol (60 ml) wurde unter Rückfluss 1,5 Stunden erhitzt
und dann 18 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das Gemisch
wurde weitere 74 Stunden unter Rückfluss
erhitzt und dann 74 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen.
Das Lösungsmittel
wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand
zwischen Dichlormethan (100 ml) und 2 M Natriumhydroxidlösung (50
ml) verteilt. Die organische Schicht wurde abgetrennt, über Magnesiumsulfat
getrocknet und filtriert. Das Magnesiumsulfat wurde mit Ethylacetat
gewaschen und filtriert. Das Ethylacetatfiltrat wurde zur Trockne
eingeengt, was einen Feststoff ergab, der aus Ethanol unter Erhalt
von 3-Phenyl-1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazol
mit einem Schmelzpunkt von 234–236°C umkristallisiert
wurde.
-
Beispiel 5
-
- a) Ein Gemisch aus Indan-1-on (10,0 g), Ethanol
(35 ml), Hydrazinhydrat (10,0 ml) und Eisessig (2,0 ml) wurde unter
Rückfluss
und Stickstoff 1 Stunde erhitzt. Das Gemisch wurde auf 20°C abgekühlt, und
das Gemisch wurde unter vermindertem Druck eingeengt, was einen
Feststoff ergab, der durch Filtration gewonnen wurde, wobei man
Indan-1-on-hydrazon mit einem Schmelzpunkt von 84–86°C erhielt.
- b) Das Hydrazon aus a) (3,55 g) wurde in Tetrahydrofuran (80
ml) gelöst
und unter Stickstoff auf 0°C
abgekühlt,
während
eine Lösung
von n-Butyllithium (28,8 ml einer 2,5 M Lösung in Hexan) zugegeben wurde. Das
Gemisch wurde bei 0°C
30 Minuten gerührt;
dann wurde Ethyl-3-methoxybenzoat (2,16 g) zugegeben, und das Gemisch
wurde bei 0°C
20 Minuten gerührt.
3 M Chlorwasserstoffsäure
(80 ml) wurden zugegeben, und das Gemisch wurde 1 Stunde unter Rückfluss
erhitzt. Die organische Schicht wurde abgetrennt und die wässrige Schicht
wurde mit Natriuimbicarbonat neutralisiert und mit Ether extrahiert,
was ein Öl
ergab, welches durch Flashsäulenchromatographie
unter Verwendung von 30 bis 40% Ethylacetat in Petrolether (Siedepunkt
von 60 bis 80°C)
als mobile Phase gereinigt wurde, wobei man 3-(3-Methoxyphenyl)-1,4-dihydroindeno(1,2-c]pyrazol
mit einem Schmelzpunkt von 172 bis 174°C erhielt.
-
Beispiel 6
-
Ein Gemisch aus 2-(4-Methoxybenzoyl)indan-1,3-dion
(1,4 g, hergestellt nach einer Abänderung des in J. Het. Chem.
8, 855–859
(1971) beschriebenen Verfahrens) und Hydrazinhydrat (15 ml) wurde
unter Rückfluss
24 Stunden erhitzt. Das Gemisch wurde abgekühlt, in Eiswasser gegossen,
und der ausfallende Feststoff wurde durch Filtration gewonnen, mit
absolutem Ethanol gewaschen und getrocknet, wobei man 3-(4-Methoxyphenyl)-1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazol
mit einem Schmelzpunkt von 247°C
erhielt.
-
Beispiel 7
-
Ein Gemisch aus 2-(4-Methylbenzoyl)indan-1,3-dion
(1,32 g, in ähnlicher
Weise hergestellt wie das Ausgangsmaterial in Beispiel 6) und Hydrazinhydrat
(15 ml) wurde 24 Stunden unter Rückfluss
erhitzt. Das Gemisch wurde abgekühlt,
in Eiswasser gegossen, und der Feststoff wurde durch Filtration
gewonnen, mit absolutem Ethanol gewaschen und getrocknet, wobei
man 3-(p-Tolyl)-1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazol
mit einem Schmelzpunkt von 267 bis 269°C erhielt.
-
Beispiel 8
-
- a) Eine Lösung
von 5-Methoxyindan-1-on (5,46 g) und tert-Butylcarbazat (4,45 g)
in Ethanol (100 ml) und Eisessig (1 Tropfen) wurde gerührt und
2 Stunden unter Rückfluss
erhitzt. Das Volumen wurde unter vermindertem Druck auf die Hälfte reduziert
und der auskristallisierende Feststoff wurde durch Filtration gewonnen,
wobei man 5-Methoxyindan-1-on-tert-butyloxycarbonylhydrazon erhielt.
- b) Eine Lösung
aus Lithiumdiisopropylamid (11,3 ml einer 2,0 M Lösung in
Heptan/THF/Ethylbenzol) wurde zu einer gerührten Lösung von 5-Methoxyindan-1-on-tert-butyloxycarbonylhydrazon
(2,5 g) in Tetrahydrofuran (100 ml) bei –78°C unter Stickstoff getropft.
Das Gemisch wurde bei dieser Temperatur 1,5 Stunden gerührt; dann
wurde eine Lösung
von Ethylthiophen-2-carboxylat (1,69 g) in Tetrahydrofuran (10 ml)
zugetropft. Nach der Zugabe wurde das Gemisch 30 Minuten bei –78°C gerührt; man
ließ es
dann auf Raumtemperatur erwärmen.
Nach weiterem 20-minütigen
Rühren
bei Raumtemperatur, wurde eine gesättigte Ammoniumchloridlösung (100
ml) zugegeben, und das Gemisch wurde 10 Minuten heftig gerührt. Die Schichten
wurden voneinander getrennt, und die wässrige Schicht wurde mit Ether
(3 × 75
ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit
1 M Chlorwasserstoffsäure
und dann mit Kochsalzlösung gewaschen,
anschließend
getrocknet, filtriert und verdampft, was ein gelbes Gummi ergab,
das in Dichlormethan (25 ml) suspendiert wurde, und es wurde Pentamethylbenzol
(1,34 g) zugegeben. Das Gemisch wurde auf 0°C abgekühlt, und Trifluoressigsäure (0,2
ml) wurde zugegeben. Das Gemisch wurde 64 Stunden gerührt und
dann unter vermindertem Druck eingeengt, was ein Öl ergab,
das in Ether (200 ml) gelöst wurde,
mit gesättigter
Natriumbicarbonatlösung
(100 ml) und dann mit Kochsalzlösung
gewaschen wurde, und anschließend
getrocknet, filtriert und verdampft wurde, wobei man ein Gummi erhielt,
das durch Flashsäulenchromatographie
unter Verwendung von Petrolether (Siedepunkt 60 bis 80°C)/Ethylacetat
(4 : 1) als mobile Phase gereinigt wurde, wobei man 6-Methoxy-2-tert-butyloxycarbonyl-3-(2-thienyl)-1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazol
mit einem Schmelzpunkt von 163 bis 165°C erhielt.
- c) 3 M Chlorwasserstoffsäure
(10 ml) wurde zu einer gerührten
Lösung
des Produkts aus b) (100 mg) in Ethylacetat (10 ml) bei Raumtemperatur
gegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde gerührt und
dann unter Rückfluss
erwärmt.
Das Gemisch wurde unter Rückfluss
30 Minuten erhitzt und dann abgekühlt. Das Gemisch wurde in Wasser
(50 ml) gegossen, und die organische Schicht wurde abgetrennt und
mit Wasser gewaschen. Die vereinigten wässrigen Schichten und Waschlösungen wurden
mit gesättigter
Natriumbicarbonatlösung
basisch gemacht und mit Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten
Dichlormethanwaschlösungen
und -extrakte wurden mit Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet,
filtriert und verdampft, wobei man 6-Methoxy-3-(2-thienyl)-1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazol
mit einem Schmelzpunkt von 212 bis 214°C erhielt.
-
Beispiel 9
-
- a) Eine Lösung
aus Indan-1-on (5,0 g) und tert-Butylcarbazat (5,0 g) in Methanol
(20 ml), die Eisessig (1 Tropfen) enthielt, wurde unter Rückfluss
1,5 Stunden erhitzt und gerührt.
Das Gemisch wurde abgekühlt und
unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde aus Ethanol umkristallisiert,
wobei man Indan-1-on-tertbutyloxycarbonylhydrazon erhielt.
- b) In ähnlicher
Weise wie im vorhergehenden Beispiel wurde das Produkt aus a) (500
mg) mit Lithiumdüsopropylamid
(2,23 ml einer 2,0 M Lösung
in Heptan/THF/Ethylbenzol) und dann mit Ethyl-2-furoat (299 mg)
umgesetzt, und die erhaltene Verbindung wurde mit Trifluoressigsäure (5 ml)
behandelt, wobei man 3-(2-Furyl)-1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazol
mit einem Schmelzpunkt von 195 bis 197 °C erhielt.
-
Beispiel 10
-
In einem ähnlichen Experiment wie in
den beiden vorhergehenden Beispielen wurde 6-Fluoro-3-(2-thienyl)-1,4-dihydroindeno[,2-c]pyrazol
mit einem Schmelzpunkt von 222 bis 224°C ausgehend von 5-Fluorindan-1-on
und unter Verwendung von Ethylthiophen-2-carboxylat hergestellt.
-
Beispiele 11 bis 28 (allgemeines
Verfahren)
-
- a) Ein 1 : 1 Gemisch (bezogen auf das Volumen)
von Dichlormethan : Methanol (1 ml) wurde über eine Flüssigkeitszugabevorrichtung
Gilson 215 zum Ausgangsenon (etwa 50 mg, siehe Tabelle I) in einem
mit einem Septum verschlossenen Röhrchen gegeben; anschließend wurden
eine wässrige
2 M Natriumhydroxidlösung
(1 Moläquivalent,
siehe Tabelle I) und dann 100 Volumina wässriges Wasserstoffperoxid
(1,8 Moläquivalente)
zugegeben. Die resultierenden Lösungen/Suspensionen
wurden dann 20 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Im Anschluss an eine
LCMS-Analyse wurden weitere 100 Volumina wässriges Hydrogenperoxid (1,8
Moläquivalente)
zu jedem Reaktionsröhrchen
gegeben, diesmal manuell über
eine Pipette mit einer Plastikspitze. Weiteres 1 : 1 (bezogen auf
das Volumen) Dichlormethan : Methanol (1 ml) wurde zu denjenigen
Röhrchen,
die eine signifikante Menge unlöslichen
Materials enthielten, gegeben. Es wurde weitere 24 Stunden geschüttelt.
-
Sämtliche
Reaktionen wurden mit TLC analysiert und diejenigen, die demnach unvollständig abreagiert
hatten, wurden mit etwa 100 Volumina wässrigem Wasserstoffperoxid
(1,8 Moläquivalente)
wiederum mit einer Pipette mit einer Plastikspitze versetzt (siehe
diejenigen Reaktionen, die in Tabelle I mit ×3 angegeben sind). Diese Reaktionsgemische
wurden 3 Tage bei Raumtemperatur gerührt.
-
-
-
Die Reaktionslösungen/-suspensionen wurden
zwischen Dichlormethan (etwa 5 ml) und Wasser (etwa 2 ml) verteilt,
von der organischen Phase über
eine Filterkartusche Empore abfiltriert und mit Dichlormethan gewaschen
(etwa 2 ml). Die Dichlormethanphasen wurden verdampft und die Rückstände im Vakuum
weiter getrocknet.
-
Die Produkte aus a) wurden in b)
als die entsprechenden 2,3-Epoxyketone eingesetzt.
-
- b) Zu den Produkten aus Schritt 1 in einem
mit einem Septum verschlossenen Röhrchen gab man über eine Flüssigkeitszugabevorrichtung
Gilson 215 n-Butanol (2 ml) und anschließend Hydrazinhydrat (bezogen
auf die in Schritt 1 verwendete Menge Ausgangsenon 2 Moläquivalente)
als eine 10 Vol.-%ige Lösung
in n-Butanol (siehe Tabelle II). Schließlich wurde zu jedem Röhrchen manuell
mit einer Spritze Eisessig (2 Tropfen) zugegeben. Die Reaktionen
wurden unter Schütteln
auf 100°C
für die
in Tabelle II angegebenen Zeiten erwärmt; Grundlage war die Überwachung durch
TLC-Analyse. Die Reaktionsgemische wurden zur Trockne eingeengt,
und die Rückstände wurden
mit Chromatographie auf Siliciumdioxid mit Ethylacetat, der erforderlichenfalls
mit Petrolether (Siedepunkt 40 bis 60°C) verdünnt war, gereinigt. Geeignete
Fraktionen wurden verdampft und im Vakuum getrocknet, was die fertigen
Pyrrole ergab. Die Identität
der Produkte wurde mit LCMS unter den nachstehend angegebenen Bedingungen
bestätigt. LC
Säule: | 5μ HYPERSIL
BDS C18 (100 × 2,1
mm) |
Mobile
Phase: | 0,1%
Ameisensäure:
MeCN (Gradient – siehe
unten) |
Bedingungen: | 10–100% MeCN
in 8 Minuten |
(Gradient) | 100%
MeCN, 1 Minute |
| 100–10% MeCN
in 2 Minuten |
| (Gesamtanalysenzeit
11 Minuten) |
Fließgeschwindigkeit: | 1
ml/min |
Wellenlängenbereich: | 206–320 nm |
Injektionsvolumen: | 20 μl |
MS Ionisation | APcl
+ve/–ve |
Massenbereich: | 150–500 m/z |
Kegelspannung: | 20 |
-
Die Reaktionsdetails und Ausbeuten
für die
Verbindungen 11–28
sind in Tabelle II gezeigt:
-
Tabelle
II
Reaktionsdetails
-
Tabelle
II (Fortsetzung)
Ausbeuten/LCMS
-
-
Die in den Beispielen 11–28 hergestellten
Verbindungen sind:
-
Beispiel 11
-
3-(2-Pyridyl)-4,5-dihydro-2H-benz[g]indazol
-
Beispiel 12
-
3-(3-Pyridyl)-4,5-dihydro-2H-benz[g]indazol
-
Beispiel 13
-
3-(4-Fluorphenyl)-1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazol
-
Beispiel 14
-
3-Phenyl-2,4,5,6-tetrahydrobenzo[6,7]cyciohepta[1,2-c]pyrazol
-
Beispiel 15
-
3-(2-Thienyl)-2,4,5,6-tetrahydrobenzo[6,7]cyclohepta[1,2-c]pyrazol
-
Beispiel 16
-
3-(4-Methoxyphenyl)-4,5-dihydro-2H-benz[g]indazol
-
Beispiel 17
-
3-(2-Chlorphenyl)-4,5-dihydro-2H-benz[g]indazol
-
Beispiel 18
-
3-(3-Chlorphenyl)-4,5-dihydro-2N-benz[g]indazol
-
Beispiel 19
-
3-(4-Chlorphenyl)-4,5-dihydro-2H-benz[g]indazol
-
Beispiel 20
-
3-(4-Isopropylphenyl)-4,5-dihydro-2H-benz[g]indazol
-
Beispiel 21
-
3-Piperonyl-4,5-dihydro-2H-benz[g]indazol
-
Beispiel 22
-
7-Methoxy-2-(4-tolyl)-4,5-dihydro-2H-benz[g]indazol
-
Beispiel 23
-
3-(4-Trifluormethylphenyl)-1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazol
-
Beispiel 24
-
3-(2,4-Dichlorphenyl)-1,4-dihydroindeno[1,2-c)pyrazol
-
Beispiel 25
-
3-(2,3-Dimethoxyphenyl)-4,5-dihydro-2H-benz[g]indazol
-
Beispiel 26
-
7-Methoxy-3-(4-methoxyphenyl)-4,5-dihydro-2H-benz[g]indazol
-
Beispiel 27
-
3-(3,5-Dimethoxyphenyl)-4,5-dihydro-2H-benz[g]indazol
-
Beispiel 28
-
6,7-Dimethoxy-3-(4-methoxyphenyl)-1,4-dihydroindeno[1,2-c]pyrazol
-
Beispiel 29
-
- a) Indan-1-on (3,30 g), Thiophen-3-carboxaldehyd
(2,60 ml), Essigsäure
(0,47 ml) und Piperidin (0,57 ml) wurden zusammen auf einem Dampfbad
16 Stunden erwärmt.
Das Gemisch wurde abgekühlt,
was eine feste Masse ergab, die mit IMS (120 ml) erhitzt und heiß filtriert
wurde, um unlösliches
Material zu entfernen. Das Filtrat wurde auf Eis abgekühlt, um
einen braunen Feststoff auszufällen,
der durch Filtration gewonnen und getrocknet wurde, wobei man 2-(3-Thienyl)methylenindan-1-on mit einem Schmelzpunkt
von 137 bis 138°C
erhielt.
- b) Ein Gemisch des Produkts aus a) (2,03 g), p-Toluolsulfonylhydrazin
(2,00 g), p-Toluolsulfonsäure (0,35 g)
und Ethanol (30 ml) wurde unter Rückfluss 44 Stunden erhitzt.
Das Lösungsmittel
wurde unter vermindertem Druck entfernt, und der Rückstand
wurde in Dichlormethan gelöst
(100 ml). Die Lösung
wurde mit 2 M wässriger
Natriumhydroxidlösung
(25 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet, über ein
Siliziumdioxidbett filtriert, mit Ethylacetat gewaschen, und verdampft,
was ein Öl
ergab, das durch Flashsäulenchromatographie
auf Siliziumdioxid unter Verwendung von Petrolether (Siedepunkt
60 bis 80 °C)/Ethylacetat
(2 : 1) und anschließend
derselben Lösungsmittel
in einem Verhältnis
von 1 : 1 als mobile Phase gereinigt wurde. Geeignete Fraktionen
wurden vereinigt und verdampft, was einen Feststoff ergab, der mit
Diethylether verrieben und filtriert wurde, wobei man 3-(3-Thienyl)-1,4-Dihydroindeno[1,2-c]pyrazol mit
einem Schmelzpunkt von 219–220°C erhielt.
-
Die chemischen Strukturen der in
diesen Beispielen hergestellten Verbindungen sind in Tabelle III
gezeigt:
-
-
-
II. in Vitro-PTK-Assays
-
Die nachstehenden in vitro-Assays
können
verwendet werden, um das Aktivitäts- und Wirkungsniveau der
verschiedenen erfindungsgemäßen Verbindungen
auf eine oder mehrere der PTKs zu bestimmen. In Anlehnung an dieselben
Vorgaben können ähnliche
Assays für
weitere Tyrosinkinasen entworfen werden, indem man hinlänglich bekannte
Techniken verwendet.
-
A. KDR-Proteinproduktion
unter Verwendung eines Baculovirus-Systems:
-
Die kodierende Sequenz für die KDR-intrazelluläre Domäne (AS 789–1354) wurde
durch PCR unter Verwendung von aus HUVEC-Zellen isolierten cDNAs
erzeugt. Am N-Terminus dieses Proteins wurde auch eine Poly-Hiss-Sequenz
eingefügt.
Dieses Fragment wurde an der Xba1- und Not1-Stelle in den Transfektionsvektor
pVL 1393 kloniert. Ein rekombinanter Baculovirus (BV) wurde durch
Cotransfektion erzeugt, wobei man das BaculoGold-Transfektionsreagens
(Phar Mingen) verwendete. Der rekombinante BV wurde plaquegereinigt
und mittels Western-Analyse verifiziert. Für die Proteinproduktion ließ man SF-9-Zellen
in SF-9-11-Medium bei 2 × 106/ml wachsen, und diese wurden mit 0,5 plaquebildenden
Einheiten pro Zelle (MOI) infiziert. 48 Stunden nach Infektion wurden
die Zellen geerntet.
-
B. KDR-Reinigung
-
(His)6KDR(AS
789–1354)
exprimierende SF-9-Zellen wurden lysiert, indem man 50 ml Triton X-100-Lyse-Puffer
(20 mM Tris, pH 8,0, 137 mM NaCl, 10% Glycerin, 1% Triton X-100,
1 mM PMSF, 10 μg/ml Aprotinin,
1 μg/ml
Leupeptin) zum Zellpellet aus 1 L Zellkultur gab. Das Lysat wurde
bei 19000 UPM in einem Sorval SS-34-Rotor 30 Minuten bei 4°C zentrifugiert.
Das Zelllysat wurde auf eine 5 ml NiCl2-chelatisierende Sepharosesäule, die
mit 50 mM HEPES, pH 7,5, 0,3 M NaCl äquilibriert worden war, aufgetragen.
KDR wurde unter Verwendung desselben, 0,25 M Imidazol enthaltenden
Puffers eluiert. Die Säulenfraktionen
wurden unter Verwendung von SDS-PAGE und einem ELISA-Assay (siehe
unten), der die Kinase-Aktivität misst,
analysiert. Der gereinigte KDR wurde in einen 25 mM HEPES, pH 7,5,
25 mM NaCl, 5 mM DTT-Puffer überführt und
bei –80°C gelagert.
-
C. Herstellung und Reinigung
der humanen Tie-2-Kinase
-
Die kodierende Sequenz für die humane
Tie-2-intrazelluläre
Domäne
(AS 775-1124) wurde
durch PCR unter Verwendung von aus Humanplazenta isolierten cDNAs
als Templat erzeugt. Am N-Terminus wurde ein Poly-His6-Sequenz
eingefügt,
und dieses Konstrukt wurde an der Xba 1- und Not1-Stelle in den
Transfektionsvektor pVL1939 kloniert. Rekombinanter BV wurde unter
Verwendung von BaculoGold-Transfektionsreagens (PharMingen) durch
Cotransfektion erzeugt. Rekombinanter BV wurde plaquegereinigt und
durch Western-Analyse verifiziert. Für die Proteinproduktion ließ man SF-9-Insektenzellen
in SF-900-II-Medium bei 2 × 106/ml wachsen, und diese wurden bei einer
MOI von 0,5 infiziert. Die Reinigung der im Screening verwendeten
His-markierten Kinase war analog zu der für KDR beschriebenen.
-
D. Produktion und Reinigung
der humanen Flt-1-Tyrosinkinase
-
Es wurde der baculovirale Expressionsvektor
pVL1393 (PharMingen, Los Angeles, CA) verwendet. Die die Kinasedomäne kodierende
Nukleotidsequenz wurde durch PCR unter Verwendung von aus HUVEC-Zellen
isolierten cDNA-Bänken
erzeugt.
-
Eine Poly-His6 kodierende
Nukleotidsequenz wurde 5' zur
Nukleotidregion, welche die gesamte intrazelluläre Kinasedomäne von humanem
Flt-1 (Aminosäuren
786– 1338)
kodiert, angeordnet. Die Histidinreste ermöglichten die Affinitätsreinigung
des Proteins in einer Weise, die zu der für KDR (Abschnitt B.) und ZAP70 (Abschnitt
F.) analog war. SF-9-Insektenzellen wurden bei einer Multiplizität von 0,5
infiziert und 48 Stunden nach Infektion geerntet.
-
E. Quellen für Lck- und
EGFR-Tyrosinkinasen
-
Lck oder verkürzte Formen von Lck waren kommerziell
erhältlich
(z. B. Upstate Biotechnology Ind., Saranac Lake, NY oder Santa Crus
Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) oder wurden aus bekannten natürlichen
oder rekombinanten Quellen unter Verwendung konventioneller Methoden
gereinigt. EGFR wurde von Sigma (Cat #E-3641; 500 Einheiten/50 μl) und der
EGF-Ligand von Oncogene Research Products/Calbiochem (Cat # PF011-100)
erworben.
-
F. Produktion der ZAP70-Tyrosinkinase
-
Es wurde der baculovirale Expressionsvektor
pVL1393 (PharMingen, Los Angeles, CA) verwendet. Eine Poly-His6 kodierende Nukleotidsequenz wurde 5' zur Nukleotidregion,
welche das gesamte ZAP70 (Aminosäuren
1-619) kodiert, angeordnet. Die Nukleotidsequenz, welche die ZAP70
kodierende Region kodiert, wurde durch PCR unter Verwendung von
aus immortalisierten Jurkat-T-Zellen isolierten cDNA-Bänken erzeugt.
Die Histidinreste ermöglichten
die Affinitätsreinigung
des Proteins. Die LVPRGS-Brücke
stellte eine Erkennungssequenz für
die proteolytische Spaltung durch Thrombin dar, wodurch die Entfernung
des Affinitätstags
aus dem Enzym ermöglicht
wurde. SF-9-Insektenzellen wurden bei einer Multiplizität von 0,5
infiziert und 48 Stunden nach Infektion geerntet.
-
G. Reinigung von ZAP70
-
SF-9-Zellen wurden in einem Puffer
lysiert, der 20 mM Tris, pH 8,0, 137 mM NaCl, 10% Glycerin, 1% Triton
X-100, 1 mM PMSF, 1 μg/ml
Leupeptin, 10 μg/ml Aprotinin
und 1 mM Natriumorthovanadat enthielt. Das lösliche Lysat wurde auf eine
chelatisierende Sepharose-Hi-Trap-Säule (Parmacia), die in 50 mM
HEPES, pH 7,5, 0,3 M NaCl äquilibriert
worden war, aufgetragen. Das Fusionsprotein wurde mit 250 mM Imidazol
eluiert. Das gewonnene Enzym wurde in einem Puffer aufbewahrt, der
50 mM HEPES, pH 7,5, 50 mM NaCl und 5 mM DTT enthielt.
-
H. Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay
(ELISA)
-
Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assays
(ELISA) können
verwendet werden, um vorhandene Tyrosinkinase-Aktivität nachzuweisen
und zu messen. Die ELISA können
in Anlehnung an bekannte Protokolle durchgeführt werden, die beispielsweise
in Voller et al., 1980, „Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay" in
Manual of Clinical Immunology, 2. Ausgabe, hgg. von Rose and Friedman,
S. 359– 371,
Am. Soc. of Microbiology, Washington, D. C. beschrieben sind.
-
Das wiedergegebene Protokoll kann
angepasst werden, um die Aktivität
in Bezug auf eine spezielle RTK zu bestimmen. Beispielsweise werden
bevorzugte Protokolle zur Durchführung
der ELISA-Experimente für
KDR nachstehend vorgestellt. Es gehört zum fachmännischen
Können,
diese Protokolle anzupassen, um die Aktivität einer Verbindung für weitere
Mitglieder aus der RTK-Familie und Nichtrezeptortyrosinkinasen zu bestimmen.
Um die Inhibitorselektivität
zu bestimmen, wurde ein universelles PTK-Substrat (z. B. ein Zufallscopolymer
aus Poly(Glu4Tyr), 20000 bis 50000 Molekulargewicht)
zusammen mit ATP (typischerweise 5 μM) bei Konzentrationen, die
etwa dem zweifachen des scheinbaren Km-Werts entsprechen, im Assay
eingesetzt.
-
KDR-IN VITRO-ELISA
-
Die folgende Vorgehensweise wurde
verwendet, um die inhibierende Wirkung von erfindungsgemäßen Verbindungen
auf die KDR-Tyrosinkinase-Aktivität zu bestimmen:
-
Puffer und Lösungen:
-
- 1. PGT : Poly (Glu, Tyr) 4 : 1
Bewahre
Pulver bei –20°C auf. Löse das Pulver
in phosphatgepufferter Kochsalzlösung
(PBS) mit 50 mg/ml Lösung.
Bewahre Aliquots von 1 ml bei – 20°C auf. Für die Anfertigung
von Platten verdünne
auf 250 μg/ml in
Gibco-PBS.
- 2. Reaktionspuffer:
100 mM HEPES, 20 mM MgCl2,
4 mM MnCl2, 5 mM DTT, 0,02% BSA, 200 μM NaVO4, pH 7, 10
- 3. ATP: Bewahre Aliquots von 100 mM bei –20°C auf. Verdünne auf 20 μM in Wasser.
- 4. Waschpuffer:
PBS mit 0,1% Tween 20
- 5. Antikörper-Verdünnungspuffer:
0,1%
Rinderserumalbumin (BSA) in PBS
- 6. TMB-Substrat:
Vermische TMB-Substrat und Peroxidlösungen 9
: 1 unmittelbar vor Gebrauch oder verwende K-Blue-Substrat von Neogen
- 7. Stopplösung:
1
M Phosphorsäure
-
Vorgehensweise
-
1. Plattenzubereitung:
-
Verdünne PGT-Stammlösung (50
mg/ml, gefroren) in PBS auf 250 μg/ml.
Verwende modifizierte Hochaffinitäts-ELISA-Platten mit flachen
Böden von
Corning #25805-96 und gebe 125 μl
pro Loch zu. Gebe 125 μl PBS
in freie Löcher.
Bedecke mit Verschlussband und inkubiere über Nacht bei 37°C. Wasche
1× mit
250 μl Waschpuffer
und trockne etwa 2 Stunden bei 37°C
in einem Trockeninkubator.
-
Bewahre die beschichteten Platten
in einem verschlossenen Behälter
bei 4°C
bis zum Gebrauch auf.
-
- 2. Tyrosinkinasereaktion:
- – Bereite
Inhibitorlösungen
mit 4×-Konzentration
in 20% DMSO in Wasser zu.
- – Bereite
Reaktionspuffer zu.
- – Bereite
Enzymlösungen
zu, so dass die gewünschten
Einheiten in 50 μl
vorliegen, z. B. verdünne
für KDR auf
1 ng/μl
bei insgesamt 50 ng pro Reaktionsloch. Bewahre auf Eis auf.
- – Stelle
4×-ATP-Lösungen zu
20 μm aus
100 mM Stammlösungen
in Wasser her. Bewahre auf Eis auf.
- – Gebe
pro Loch 50 μl
Enzymlösung
zu.
- – Gebe
25 μl 4×-Inhibitor
zu.
- – Gebe
25 μl 4×-ATP für den Inhibitionsassay
zu.
- – Inkubiere
10 Minuten bei Raumtemperatur.
- – Stoppe
Reaktion durch Zugabe von 50 μl
0,05 N HCl pro Loch
- – Wasche
Platte
- ** Endkonzentrationen für
Reaktion:
ATP: 5 μM
5%
DMSO
- 3. Antikörperbindung
- – Verdünne 1 mg/ml
Aliquot von PY20-HRP (Pierce)-Antikörper auf 50 ng/ml in 0,1% BSA
in PBS durch 2-stufige Verdünnung
(100×,
dann 200×).
- – Gebe
pro Loch 100 μl
Ak zu. Inkubiere 1 Stunde bei Raumtemperatur. Inkubiere 1 Stunde
bei 4°C.
- – Wasche
Platte 4×.
- 4. Farbreaktion
- – Bereite
TMB-Substrat zu uns gebe pro Loch 100 μl zu.
- – Verfolge
OD bei 650 nm bis 0,6 erreicht ist
- – Stoppe
mit 1 M Phorphorsäure.
Schüttle
auf Plattenlesegerät.
-
Die optimalen Inkubationszeiten und
Enzymreaktionsbedingungen variieren leicht mit den Enzymzubereitungen
und werden empirisch für
jede Charge bestimmt.
-
Analoge Assaybedingungen wurden für Flt-1,
Tie-2, EGFR und ZAP70 verwendet. Der für Lck verwendete Reaktionspuffer
war 100 mM MOPSO, pH 6,5, 4 mM MnCl2, 20
mM MgCl2, 5 mM DTT, 0,2% BSA, 200 mM NaVO4 bei analogen Assay-Bedingungen.
-
PKC-Kinasequelle
-
Die katalytische Untereinheit von
PKC kann kommerziell bezogen werden (Calbiochem).
-
PKC-Kinaseassay
-
Es wurde ein radioaktiver Kinaseassay
eingesetzt, wobei man einer veröffentlichten
Vorgehensweise folgte (Yasuda, I., Kirshimoto, A., Tanaka, S., Tominaga,
M., Sakurai, A., Nishizuka, Y., Biochemical and Biophysical Research
Communication 3: 166, 1220–1227
(1990). Kurzum, alle Reaktionen wurden in einem Kinasepuffer durchgeführt, der
aus 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2,
2 mM DTT, 1 mM EGTA, 100 μM
ATP, 8 μM
Peptid, 5% DMSO und 33P ATP (8 Ci/mM) bestand.
Verbindung und Enzym wurden in dem Reaktionsbehältnis miteinander vermischt,
und die Reaktion wurde durch Zugabe des ATPs und des Substratgemisches initiiert.
Im Anschluss an die Beendigung der Reaktion durch Zugabe von 10 μL Stopppuffer
(5 mM ATP in 75 mM Phorphorsäure)
wurde ein Teil des Gemisches auf Phosphocellulosefilter gespottet.
Die gespotteten Proben wurden dreimal in 75 mM Phosphorsäure bei
Raumtemperatur 5 bis 15 Minuten gewaschen. Der Einbau der radioaktiven
Markierung wurde durch Flüssigszintillationszählung quantitativ
bestimmt.
-
Östrogenrezeptor-Bindungsassay
-
Die Bindung von 1 nM radiomarkiertem
17β-Östradiol
an den humanen Östrogenrezeptor
im Cytosol von MCF-7-Säugerkarzinomzellen
wurde im Anschluss an eine 20-stündige
Inkubation bei 4°C
unter Verwendung der Reaktionsbedingungen von Shein et al., Cancer
Res. 45: 4192 (1985) bestimmt. Im Anschluss an die Inkubation wurden
die Cytosolfraktionen mit einer Suspension von dextranbeschichteter
Aktivkohle 10 Minuten bei 4°C
inkubiert, zentrifugiert, und die Überstände wurden gewonnen. Im Aktivkohleüberstand
verbleibende, gebundene Radioaktivität wurde mit einem Szintillationszähler (LS
6000, Beckman) unter Verwendung eines Flüssigszintillationscocktails
(Formula 989 Packard) gemessen. Die Verbindungen wurden simultan
bei 8 Konzentrationen zweifach ausgetestet, um eine Kompetitionskurve
zur Quantifizierung der inhibitorischen Aktivität zu erhalten. Die spezifische
Bindung des Radioliganden an den Östrogenrezeptor wurde als der
Unterschied zwischen der Gesamtbindung und der nichtspezifischen
Bindung, die in Gegenwart eines Überschusses
von nichtmarkiertem 17-Östradiol
(6 μM) bestimmt
worden war, definiert.
-
Resultate
-
Die folgenden inhibitorischen Konzentrationen
einer repräsentativen
Verbindung (Beispiel 4) mit der Strukturformel:
wurden erhalten:
-
-
Zusätzlich wurde die folgende inhibitorische
Konzentration einer weiteren repräsentativen Verbindung erhalten:
-
-
Diese Resultate zeigen, dass erfindungsgemäße und hier
beispielhaft belegte Verbindungen eine bemerkenswerte inhibitorische
Aktivität
für die
KDR-Tyrosinkinase
besitzen und als KDR-Tyrosinkinaseinhibitoren besonders selektiv
sind.
-
III. Zelluläre RTK-Assays
-
Die folgenden zellulären Assays
können
verwendet werden, um die Aktivitäts-
und Wirkungsniveaus verschiedener erfindungsgemäßer Verbindungen auf eine oder
mehrere der RTKs zu bestimmen. In Anlehnung an dieselben Vorgaben
können ähnliche
Assays für
weitere Tyrosinkinasen entworten werden, wobei man hinlänglich bekannte
Techniken verwendet.
-
A. VEGF-induzierte KDR-Phosphorylierung
in humanen Nabelvenenzellen (HUVEC), gemessen mit Western-Blots.
-
- 1. HUVEC-Zellen (aus gepoolten Spendern) wurden
von Clonetics (San Diego, CA) bezogen und den Herstellerhinweisen
entsprechend kultiviert. Nur die frühen Passagen (3–8) wurden
für diesen
Assay verwendet. Die Zellen wurden in 100-mm-Schälchen (Falcon für Gewebekultur;
Becton Dickinson; Plymouth, England) kultiviert, wobei man komplette
EBM-Medien (Clonetics) verwendete.
- 2. Um die inhibitorische Aktivität einer Verbindung zu bewerten,
wurden die Zellen mit Trypsin behandelt und jedes Loch von 6-Clusterplatten
(Costar; Cambridge, MA) wurde mit 0,5–1,0 × 105 Zellen/Loch
beimpft.
- 3. 3–4
Tage nach dem Beimpfen waren die Platten zu 90–100% konfluent. Es wurde das
Medium aus allen Löchern
entfernt, die Zellen wurden mit 5–10 ml PBS gewaschen und 18–24 Stunden
mit 5 ml EBM-Basismedium ohne zugesetzte Supplementierung (d. h.
Serumstarvation) inkubiert.
- 4. Serielle Verdünnungen
von Inhibitoren wurden in 1 ml EBM-Medium (25 μM, 5 μM, oder 1 μM Endkonzentration) zu den Zellen
gegeben und 1 Stunde bei 37°C
inkubiert. Humaner rekombinanter VEGF(165) (R & D Systemes) wurde
in 2 ml EBM-Medium dann zu allen Löchern mit einer Endkonzentration
von 50 ng/ml gegeben und 10 Minuten bei 37°C inkubiert. Unbehandelte oder
nur mit VEGF behandelte Kontrollzellen wurden verwendet, um den
Phosphorylierungshintergrund durch VEGF zu bewerten.
- 5. Alle Löcher
wurden dann mit 5–10
ml kaltem PBS, der 1 mM Natriumorthovanadat (Sigma) enthielt, gespült, und
die Zellen wurden lysiert und in 200 μl RIPA-Puffer (50 mM Tris-HCl
pH7, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,25% Natriumdeoxycholat, 1 mM EDTA),
welcher Proteaseinhibitoren (PMSF 1 mM, Aprotinin 1 μg/ml, Pepstatin
1 μg/ml,
Leupeptin 1 μg/ml,
Na-Vanadat 1 mM,
Na-Fluorid 1 mM) und 1 μg/ml
Dnase (sämtliche
Chemicalien von Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) enthielt,
geschabt. Das Lysat wurde bei 14000 UPM 30 Minuten zentrifugiert,
um Kerne zu entfernen.
- 6. Gleiche Mengen Proteine wurden dann durch Zugabe von kaltem
(–20°C) Ethanol
(2 Volumina) für
mindestens 1 Stunde oder maximal über Nacht präzipitiert.
Die Pellets wurden in Laemli-Probepuffer, der 5% β-Mercaptoethanol
(BioRad; Hercules, CA) enthielt, rekonstituiert und 5 Minuten erwärmt. Die
Proteine wurden durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese (6%, 1,5 mm
Novex, San Diego, CA) aufgelöst
und auf eine Nitrocellulosemembran unter Verwendung des Novex-Systems
transferiert. Nachdem man mit Rinderserumalbumin (3%) blockiert
hatte, wurden die Proteine über
Nacht mit polyklonalem anti-KDR-Antikörper (C20, Santa Cruz Biotechnology,
Santa Crluz, CA) oder mit monoklonalem anti-Phosphotyrosin-Antikörper (4G10,
Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) bei 4°C ausgetestet. Nachdem man gewaschen
und 1 Stunde mit HRP-konjugiertem F(ab)2 von
Ziege-anti-Kaninchen-
oder Ziege-anti-Maus-IgG inkubiert hatte, wurden die Banden unter
Verwendung des Emissionschemilumineszenz (ECL)-Systems (Amersham
Life Sciences, Arlington Height, IL) visualisiert.
-
Resultate
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Die folgenden inhibitorischen Konzentrationen
einer repräsentativen
Verbindung wurden erhalten:
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-
Zusätzlich wurden die folgenden
inhibitorischen Konzentrationen einer weiteren repräsentativen
Verbindung mit der Strukturformel:
erhalten:
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Diese Verbindung zeigte auch Tyrosinkinase-Selektivität.
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Diese Resultate zeigen, dass erfindungsgemäße Verbindungen
eine bemerkenswerte inhibitorische Aktivität für die VEGF-induzierte Tyrosin-Phosphorylierung
der KDR-Tyrosinkinase in Endothelzellen haben.
-
B. HUVEC-Mitogenese-Assay
-
Humane Nabelvenen-Endothelzellen
(HUVEC) wurden in kompletten EGM-Medien (endothele Wachstumsmedien,
die mit 10% FBS, Hydrocortison, epidermalem Wachstumsfaktor und
Rinderhirnextrakt nach den Herstelleranweisungen supplementiert
waren) kultiviert. Die Zellen, Medien und Supplementierungen wurden
von Clonetics (San Diego, CA) bezogen. Der HUVEG-Mitogenese-Assay
wurde verwendet, um die durch VEGF, FGF oder komplette Medien induzierte
Inhibierung der Mitogenese zu messen. Die Zellen wurden durch Behandlung
mit Trypsin geerntet, einmal gewaschen und in kompletten Medien
(CM) bei einer Konzentration von 5000 Zellen/0,15 ml suspendiert.
96-Lochplatten wurden mit den Zellen bei 5000 Zellen/Loch beimpft
und 24 Stunden bei 37°C
inkubiert. Die Zeilen wurden einmal mit serumfreien Medien (SFM) gewaschen
und unter serumfreien Bedingungen 24 Stunden inkubiert. Kontrolllöcher ohne
Serummangel wurden während
dieser Zeit mit CM kultiviert. Die Testverbindungen wurden als 10
mM Stammlösungen
in DMSO zubereitet, in SFM verdünnt
und zu den Löchern über einen
Konzentrationsbereich (0,005–50 μM Endkonzentration)
gegeben. Die Zellen wurden 1 Stunde inkubiert, bevor man 50 ng/ml
VEGF oder FGF (R & D
Systems, Minneapolis, MN) zugab. Mit kompletten Medien stimulierte
Löcher
bekamen die Testverbindung und den Stimulus gleichzeitig. Nach 5-stündiger Inkubation
gab man 0,5 Ci/Loch tritiummarkiertes Thymidin (Amersham) zu, und
die Zellen wurden über
Nacht inkubiert. Der Assay wurde gestoppt, indem man die Platten
bei –20°C 24 Stunden
einfror. Die Platten wurden auf Filtermatten mit einem Tomtec-Erntegerät geerntet
und mit einem Betaplate-Flüssigszintillationszähler (Wallac)
ausgezählt.
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Resultate
-
Die folgenden inhibitorischen Konzentrationen
einer repräsentativen
Verbindung wurden erhalten:
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Diese Resultate zeigen, dass die
erfindungsgemäßen Verbindungen
eine bemerkenswerte inhibitorische Aktivität für die VEGF-stimulierte Mitogenese
haben.