CN1278725A - 茚并[1,2－c]－、萘并[1,2－c]－和苯并[6,7]芳庚并[1,2－c]吡唑类衍生物 - Google Patents

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Abstract

茚并[1,2－c]、萘并[1,2－c]和苯并[6,7]芳庚并[1,2－c]吡唑衍生物类的化合物是酪氨酸激酶活性的抑制剂。其活性受到此类化合物抑制的若干种酪氨酸激酶参与过度增殖、血管发生或血管透性过高的进程。所以,这些化合物可以缓解其中肿瘤形成、转移、血管发生、血管透性过高或内皮细胞增殖是因素之一的疾病状态。

Description

茚并[1，2—c]—、萘并[1，2—c]—和苯并[6，7] 芳庚并[1，2—c]吡唑类衍生物
发明背景
蛋白酪氨酸激酶(PTK)包括了大量且种类繁多的具有酶促活性的蛋白类物质。PTK类物质在控制细胞生长和分化中发挥重要作用(参见Schlessinger&Ullrich，1992，《神经元》9：383—391)。
譬如，受体酪氨酸激酶介导的信号转导是通过与特异性生长因子(配体)的胞外相互作用所引发，随后受体通常二聚化，瞬时刺激内在蛋白酪氨酸激酶的活性和磷酸化。由此成为胞内信号转导分子的结合位点并诱发与一系列胞质信号传输分子形成复合物，从而便于适当的细胞反应(例如细胞***、代谢作用、对胞外微环境产生反应)(参见Schlessinger&Ullrich，1992，《神经元》9：1—20)。
对于受体酪氨酸激酶，迄今已证实了酪氨酸的磷酸化位点具有作为信号转导分子SH2(src同源)域的高亲和性结合位点的功能(Fantl等人，1992，《细胞学》69：413—423；Songyang等人，1994，《分子细胞学和生物学》14：2777—2785；Songyang等人，《细胞》72：767—778；和Koch等人，1991，《科学》252：668—678)。现已鉴定出数种与受体酪氨酸激酶(PTK类)有关的胞内底物蛋白质。它们主要分为两类：(1)具有催化结构域的底物；和(2)没有催化结构域，但可以作为接合体同时与催化活性分子有关的底物(Songyang等人，1993，《细胞学》72：767—778)。受体或蛋白与其底物SH2结构域之间相互作用的特异性决定于紧紧包围在磷酸化酪氨酸残基周围的氨基酸残基。SH2结构域和紧密包围在磷酸酪氨酸残基周围的氨基酸序列对特定受体的结合亲和性之间的差别正与所发现的在其底物磷酸化的性能的差别相吻合(Songyang等人，1993，《细胞学》72：767—778)。这些观察结果提示，各种受体酪氨酸激酶的功能不但取决于其表达的模式和配体的有效性，而且取决于由特定受体激活的下游信号转导途径的阵列。所以，磷酸化作用是重要的调控步骤，它决定了通过特异性生长因子受体以及分化因子受体复原的信号转导途径的选择性。
已证明在PTK中，异常的刺激、表达或突变可诱导细胞增殖失控(例如恶性肿瘤生长)或缺失关键发育或修复过程。所以，生物医学界将大量财力投入到用于发现PTK家族成员的特定生物学作用、其在分化进程中的功能、其在肿瘤生成和其他疾病中的参与行为、其在由配体刺激所激活的信号转导途径中的生物化学机理以及新药的开发中。
酪氨酸激酶可以是受体型(具有胞外，跨膜和胞内结构域)或非受体型(全部位于胞内)。
受体型酪氨酸激酶(RTK)：RTK包括一大家族的具有不同生物活性的跨膜受体。受体型酪氨酸激酶(RTK)家族包括对多种细胞的生长和分化来说极其重要的受体(Yarden&Ullrich，《生物化学年鉴》57：433—478；Ullrich&Schlessinger，《细胞学》61：243—254，1990)。RTK的内在功能是通过配体结合激活，由此诱发受体和许多细胞底物被磷酸化，随后引发多种细胞反应(Ullrich&Schlessinger，《细胞学》1990，61：203—212)。
现在，业已鉴定出至少19种特殊的RTK亚族。据信一个RTK亚族，也称作HER亚族由EGFR、HER2、HER3和HER4组成。HER亚族受体的配体包括表皮生长因子(EGF)、TGF—α、双调蛋白、HB—EGF、β—动物纤维素和heregulin。据信对HER2／erbB2激酶活性的异常调节促进了转化型致瘤表型，特别是在乳腺癌中。其他两种RTK亚族被称作胰岛素受体亚族和“PDGFR”亚族，所述胰岛素受体亚族包括INS—R、IGF—1R和IR—R，所述“PDGFR”亚族包括PDGFα和β—受体、CSF—1R和c—试剂盒。
若干受体型酪氨酸激酶及其所结合的生长因子在血管发生中起一定作用，尽管它们之中的一些间接促进血管发生(Mustonen&Alitalo，《细胞生物学杂志》129：895—898，1995)。此类受体型酪氨酸激酶中的一种，也称作胎儿肝脏激酶1(flk—1)，是Ⅲ类亚型RTK中的一员。人体flk—1的一种可替换的名称是含有内插结构域的激酶受体(KDR)(Teran等人，《致癌基因》6：1677—83，1991)。flk—1／KDR另一种可替换的名称是“血管内皮细胞生长因子受体2”(VEGFR—2)。鼠型flk—1／VEGFR—2也称作NYK(Oelrichs等人，《致癌基因》8(1)：11—15，1993)。迄今为止已分离出编码小鼠、大鼠和人体flk—1的DNA以及报告了核苷酸所和所编码的氨基酸序列(Matthews等人，《美国国家科学院院报》88：9026—30，1991；Terman等人，1991，文献如上；Terman等人，《生物化学和生物物理血研究通讯》187：1579—86，1992；Sarzani等人，文献如上；和Millauer等人，《细胞》72：835—846，1993)。
称作fms样酪氨酸激酶1(flt—1)的Ⅲ型亚类RTK与flk—1／KDR有关(DeVires等人，《科学》255：989—991，1992；Shibuya等人，《致癌基因》5：519—524，1990)。flt—1的一种可替换的名称是“血管内皮细胞生长因子受体1”(VEGFR—1)。至今为止，已发现flk—1／KDR／VEGFR—1和flt—1／VEGFR—1亚族的成员主要表达在内皮细胞上。血管内皮细胞生长因子(VEGF)族的配体的成员对这些亚类成员产生特异性地刺激(Klagsbum&D’Amore，《细胞因子和生长因子评论》7：259—270，1996)。在血管发育期间，Flt—1被认为是内皮组织所必需的。flt—1的表达与小鼠胚胎中早期血管发育有关，并且在创伤愈合期间与新血管发育有关(Mustonen&Alitalo，文献如上)。flt—1在成年人器官中的表达提示了与细胞生长无关的此受体的附加功能(Mustonen&Alitalo，文献如上)。
另一种与flt—1和flk—1／KDR有关的RTK是flt—4(Galland等人，《致癌基因》8：1233—40，1993；Pajusola等人，《致癌基因》8：2931—37，1993)。这三种受体共同的特征是其胞外区内具有7种免疫球蛋白样结构域。flt—4的氨基酸序列与flt—1和flk—1／KDR的氨基酸序列，尤其是在酪氨酸激酶结构域中具有明显的同源性(Galland等人，文献如上)。但是，和flt—1和flk—1不同的是，前体形式的flt—4在翻译过程后期断裂，形成两个二硫连接多肽(Pajusola等人，文献如上)。对发育期间flt—4表达的研究支持了***起源于静脉的理论(Kaipainen等人，《美国国家科学院院报》92：3566—70，4，1995)。
在发现了内皮细胞在血管发生中的决定性作用后，生长因子对内皮细胞的作用成为研究血管形成调节的重点。其中一种因子是血管内皮细胞生长因子(VEGF)，它对flk—1／KDR和flt—都具有较高的结合亲和性，并且促使有丝裂为血管内皮细胞(Termand人，1992，文献如上，Mustonen等人，文献如上；DeVries等人，文献如上)。VEGF与flt—4不结合(Pajusola等人，文献如上)。Millauer等人在上述文献中报导，VEGF和flk—1／KDR／VEGFR—2是一个配体—受体对，它们在血管的形成和萌发(分别称作血管形成和血管发生)中起重要作用。
有报导称可变剪接的mRNA可以生成不同形式的VEGF，其中包括Ferrara等人所述的四种(《细胞学和生物化学杂志》47：211—218，1991)。Ferrare等人鉴定出分泌型VRGF和主要与细胞相关的VEGF，而且已知这种蛋白以二硫连接二聚体的形式存在。
人们还了解到多种在个体中成为水肿基础和形成水肿状态的生理和生物化学机制。在一个或多个这样的机制中，一种重要的介体是“血管内皮细胞生长因子”(VEGF)。这种介体也被称作“血管透性因子”(VPF)。该因子对血管内皮细胞中的转运进行增量调节，并且导致许多血管床的透性增高，所述血管床包括皮肤、皮下组织、腹壁、肠系膜、隔膜、气管、支气管、十二指肠和子宫。严重的血细胞渗出、跨内皮层交换的改变、大分子在上述位置外渗并沉积以及长时间血压过低都可能伴发有渗透化作用增高。这些过程被认为是促使新血管形成的前奏。在炎症处，VEGF由炎症T细胞、巨噬细胞、嗜中性白细胞和嗜酸性细胞等表达。氧不足、某些血管加压激素、生长因子、生殖激素和多种炎症细胞因子增量调节该因子。VEGF介导的血管透性参与如肿瘤腹水、子宫内膜异位、灼伤和创伤所致水肿、糖尿病中的内皮机能障碍、卵巢过度兴奋综合征的并发症以及眼水肿等疾病。
因此，显然对VEGF的生产或活性的抑制将有积极作用，尤其可以阻断上述疾病的表征。特别是，有能力阻断VEGF介导的高透性、水肿和有关综合征的药物将有效地减轻上述疾病。
胎盘生长因子(P1GF)具有与VEGF序列明显同源性的氨基酸序列(Park等人，《生物化学杂志》268：25646—54，1994；Maglione等人，《致癌基因》8：925—31，1993)。对于VEGF，不同种类的PlGF是由可变剪接的mRNA生成，并且蛋白质以二聚体形式存在(Park等人，文献如上)。P1GF以高亲和性与flt—1结合，但不和flk—1／KDR结合(Park等人，文献如上)。当VEGF以低浓度存在时，PlGF可增强VEGF对内皮细胞的促细胞***作用，但当VEGF以较高浓度存在时还未测试出这种作用(Park等人，文献如上)。
其他两种RTK亚族被称作FGF受体族(FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4)和Met亚族(c—met和Ron)。
由于PDGF和FLK亚族之间存在着相似性，所以这两种亚族经常被同时考虑。已知的RTK亚族是由Plowman等人在1994，DN&P7(6):334—339中鉴定，该文献在此引入作为参考。
在某些临床情况中希望能够抑制血管发生(例如，抑制实体瘤的生长和转移，或治疗类风湿性关节炎)，而促进血管形成有利于其他疾病(例如损伤愈合)的治疗。所以，通过上述受体转导信号促进血管发生的分子以及能够抑制这种信号转导的分子都受到关注。
非受体型酪氨酸激酶：非受体型酪氨酸激酶代表一系列无胞外和跨膜序列的细胞酶。现在，已鉴定出超过24种非受体型酪氨酸激酶，包括11个亚族(Src、Frk、Btk、Csk、Abl、Zap70、Fes／Fps、Fak、Jak、Ack和LIMK)。迄今为止，Src亚族的非受体型酪氨酸激酶在PTK中所占的数量最大，其中包括Src、Yes、Fyn、Lyn、Blk、Hck、Fgr和Yrk。Src亚族的酶与肿瘤发生有关。Bolen在《致癌基因》8：2025—2031，1993中更详细讨论了非受体型酪氨酸激，该文献在此引入作为参考。
现已发现，许多酪氨酸激酶，RTK或非受体型酪氨酸激酶，参与多种致病状态中的细胞信号途径，其中包括癌症、牛皮癣和其他过度增生性疾病和过度免疫反应。
对用于PTK的化合物的开发：鉴于PTK在控制、调节和调制细胞增殖、细胞异常增殖相关性疾病或机能障碍中的推知的重要作用，人们试图通过多种途径来鉴定受体和非受体型酪氨酸激酶“抑制剂”，其中包括利用突变配体(美国专利申请4966849)、可溶性受体和抗体(WO 94／10202；Kendall&Thomas，1994，《美国国家科学院院报》90：10705—09；Kim等人，1993，《自然》362：841—844)、RNA配体(Jellinek等人，《生物化学》33：10450—56；Takano等人，1993《分子生物学和细胞学》4：358A；Kinsella等人，1992，《实验细胞学研究》199：56—62；Wright等人，1992，《细胞物理学杂志》152：448—57)和酪氨酸激酶抑制剂(WO 94／03427；WO 92／21660；WO91／15495；WO 94／14808；US 530992；Mariani等人，1994，《美国癌症研究学会会志》35：2268)。
最近，人们试图鉴定出可以作为酪氨酸激酶抑制剂的小分子。例如，现已普遍认为双单环、二环或杂环芳基化合物(PCT WO92／20642)和亚乙烯基氮杂吲哚类衍生物(PCT WO 94／14808)可以作为酪氨酸激酶抑制剂。苯乙烯类化合物(美国专利5217999)、苯乙烯基取代吡啶类化合物(美国专利5302606)、某些喹唑啉衍生物(EP申请 0566266A1)、硒基吲哚类和硒化物(PCT WO 94／03427)、三环多羟基类化合物(PCT WO 92／21660)和苄基膦酸类化合物(PCT WO91／15495)也被描述是用作用于治疗癌症的酪氨酸激酶抑制剂的化合物。
因此，人们希望鉴别出有效的小型化合物，它们能够特异性地抑制由受体型和非受体型酪氨酸激酶活性所调控的酪氨酸信号的转导，从而调节和调制异常或不适当的细胞增殖。
发明概述
本发明涉及式Ⅰ所示的化合物：其中环A表示以下结构：
Figure 9881112200112
n是1、2或3；Ar是
Figure 9881112200113
和
R1、R2和R4和R5各自独立地表示氢、原子量约为19—36的卤素、具有1—4个碳原子的低级烷基、低级烷氧基、三氟甲基或
R1、R2和R4、R5共同独立地表示与相邻碳原子连接的亚甲二氧基；
R3是氢、COR6或SO2R6
R6是—CH3或
其中Y是氢、氯或—CH2。
这些化合物的对映异构体、互变异构体及其混合物都包括在本发明中。本发明还包括这些化合物的药物可接受酸加成盐。
本发明的化合物是酪氨酸激酶活性的有效抑制剂。特别是，本发明化合物是在血管发生进程中起重要作用的酪氨酸激酶的有效抑制剂。这些化合物还是在血管透性过高进程中起重要作用的酪氨酸激酶的有用抑制剂。由于这些化合物能够抗血管发生并抑制血管透性过高，所以它们是抑制其中血管发生和血管透性过高是重要的组成部分的疾病状态的进程的重要物质。
本发明优选的化合物如下式所示：
Figure 9881112200122
本发明还涉及这些化合物在药物组合物中的应用，所述药物组合物含有药用有效量的上述化合物和药物可接受载体或赋形剂。这些药物组合物可以施用给个体以缓解或阻止血管发生—协助性疾病中的血管发生进程或与该进程有关疾病中的血管透性过高。发明详述
本发明的化合物具有抗血管发生特性。因此，这些化合物可以用作对抗如下病症的活性药物，所述病症例如关节炎、动脉粥样硬化、牛皮癣、血管瘤、心肌血管发生、冠状和脑并生(coronary andcerebral colaterals)、缺血性四肢血管发生、创伤愈合、消化性溃疡螺杆菌相关性疾病、骨折、猫抓热、潮红、新血管性青光眼和视网膜病，如糖尿病视网膜病有关的或与衰老有关的黄斑变性。此外，一些此类化合物可以用作对抗实体瘤和过度增殖性疾病的活性药物，因为这些疾病的生长和转移需要血管细胞增殖。
本发明的化合物对酪氨酸激酶具有抑制活性。即，这些化合物通过酪氨酸激酶调节信号转导。特别是，这些化合物选择性地抑制KDR／FLK—1／VEGF—2酪氨酸激酶的活性。本发明的某些化合物也抑制其他酪氨酸激酶的活性，例如抑制Flt—1／VEGFR—1、Src亚族激酶(如Lck、Src、fyn、yes)等的活性。本发明化合物的抗特定的酪氨酸激酶的抑制作用的产生和效能取决于这些化合物上的取代基(即 R1、R2、R3、R4、R5和R6)性质、数量和排列。
当向需要此类化合物的个体给药时，本发明的化合物也可以抑制这些个体中的血管透性过高和水肿形成。据信此类化合物是通过抑制由VEGF受体所介导的参与血管透性过高和水肿形成进程的活性来发挥其作用。VEGF的独特性在于它是已知的唯一直接起作用于血管透性过高和水肿形成的血管发生生长因子。事实上，与许多其他生长因子的表达或施用有关的血管透性过高和水肿似乎是由VEGF生产介导的。血细胞渗出还经常伴发有血管透性过高。同样，过度的血管透性过高将破坏关键组织和器官(例如肺和肾)中的正常分子的跨内皮交换，由此扰乱机能并引起大分子外渗和沉积。通过抑制VEGF受体的激酶活性，透性过高以及有关的外渗、随后的水肿或腹水形成和基质沉积将得到抑制，并且被减小到最低限度。
另外，还可以将本发明化合物的N—酰化(R3=—COR6)形式或N—磺酰化(R3=—SO2R6)类似物用作前药，该前药是经代谢激活的抗血管发生药物。
设想上述疾病很大程度上是由蛋白酪氨酸激酶活性(包括KDR／VEGFR—2和／或Flt—1／VEGFR—1酪氨酸激酶)介导的。通过抑制这些酪氨酸激酶的活性，上述疾病的进程得到抑制，这归因于疾病状态中的血管发生部分受到严重削弱。利用对特异性酪氨酸激酶的选择性，本发明化合物的作用结果是最大程度地减少了在采用低选择性酪氨酸激酶抑制剂时出现的副作用。
本发明一般化合物的效能和特异性常常是通过取代基变化和构象限制来加以改变并最佳化。
在本发明中，可用下列定义：
“药物可接受酸加成盐”是指那些保留了游离碱的生物有效性和性质且通过与无机酸或有机酸反应得到的盐，所述无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸，所述有机酸例如是磺酸、羧酸、有机磷酸、甲磺酸、乙磺酸、对—甲苯磺酸、水杨酸、乳酸、酒石酸等。
“烷基”是指饱和脂族烃，其中包括含有1—4个碳原子的直链和支链基团。
“烷氧基”是指“O—烷基”，其中“烷基”定义如上。药物制剂和给药途径
用本发明的化合物本身或其药物组合物以治疗或缓解多种疾病的剂量对病人给药，所述药物组合物是将本发明化合物与适当的载体或赋形剂混合。治疗有效量进一步是指足以达到症状缓解所需的化合物用量。在《Remington氏药物科学》(Mark Publishing Co．，Easton，PA，最新版)中可见本申请化合物制剂和给药的技术。给药途径
适当的给药途径包括，例如：口服、滴眼、直肠、经粘膜、局部涂敷或肠内给药；非肠道给药，包括肌肉内、皮下、髓内注射，以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。
可替换地，化合物可以以局部方式而不是全身方式给药，例如将化合物直接注射到实体瘤中，并常常采用储库型或缓释制剂。
此外，可以将所述药物置于靶向给药体系中给药，例如，置于具有肿瘤特异性抗体包被的脂质体内。这种脂质体将以肿瘤为靶向并选择性地被肿瘤摄取。组合物／制剂
本发明的药物组合物可以按照已知方式来制造，例如采用常规的混合、溶解、制粒、制糖衣、研碎、乳化、包囊、俘获或冷冻干燥的方式。
因此，本发明所采用的药物组合物可以以常规方式利用一种或多种易于将活性化合物加工成可药用制剂的生理可接受载体(包括赋形剂和辅料)来配制。所选的给药途径决定了相匹配的制剂。
为了注射，可以将本发明的药物配制为水溶液，优选在生理相容性缓冲液中配制，例如Hanks氏溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液。为了经粘膜给药，制剂中可以采用适合于待透过的屏障的渗透剂。所述渗透剂一般为所属技术领域的技术人员熟知。
为了口服给药，易于通过将活性化合物与该领域所熟知的药物可接受载体相混合来配制所述化合物。所述载体能够使本发明的化合物被制成片剂、丸剂、糖衣剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆剂、淤浆、混悬剂等，便于被治疗患者口服摄取。口服药物制剂的获得可以通过将活性化合物与固体赋形剂混合，任选地将所得化合物研磨，如果需要，在加入辅料后加工颗粒状混合物，得到片剂或糖衣芯。特别适当的赋形剂是填充剂如糖类，其中包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；纤维素类制剂，例如玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、土豆淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和／或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可以加入崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、藻酸或其盐如藻酸钠。
糖衣片芯具有适当的包衣。为了达到该目的，可以采用：浓糖液，该溶液任选地含有***树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普尔胶、聚乙二醇、和／或二氧化钛；漆溶液和适当的有机溶剂或溶剂混合物。片剂或糖衣剂涂层中还可以加入染料或颜料类物质，用来区分或特征化活性化合物剂量不同的组合。
可用于口服的药物制剂包括压入装配的明胶胶囊、用明胶和增塑剂(如甘油或山梨糖醇)封闭的软胶囊。压入装配胶囊所含活性成分可以与填充剂如乳糖、粘合剂如淀粉和／或润滑剂如滑石或硬脂酸镁以及任选的稳定剂相混合。在软胶囊中，可以将活性化合物溶解或悬浮在适当的液体中，如脂油、液体石蜡或液体聚乙二醇。此外，可以加入稳定剂。所有用于口服给药的制剂应具有适合如此给药的剂量。
对于经颊给药，所述组合物可以采取常规方式制备的片剂或锭剂形式。
对于吸入给药，本发明的化合物一般是以气溶胶喷雾剂的形式给药，该喷雾剂是由加压包装或喷雾器来提供，同时采用适当的抛射剂，例如二氯二氟甲烷、三氯一氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他适当气体。在这种加压气溶胶的情况中，剂量单位取决于提供释放的计量量的阀门。例如，适用于吸入器或吹入器的明胶胶囊和药筒可以含有所述化合物和适当的粉末基质，如乳糖或淀粉的粉末混合物。
可以将所述化合物配制为注射剂用于非肠道给药，例如用于快速浓注和连续输注。注射剂可以以单位剂型存在，例如存在于安瓿或多剂量容器中，并且加入防腐剂。所述组合物可以采取如存在于油性或含水载体中的悬浮液、溶液或乳化体的形式，并且可以含有配制剂，如助悬剂、稳定剂和／或分散剂。
用于非肠道给药的药物制剂包括水溶性形式的活性化合物的水溶液。此外，可以将活性化合物的悬浮液制备为适当的油性注射悬浮液。适当的亲脂性溶剂或载体包括：脂油，如芝麻油；或合成脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯；或脂质体。含水注射悬浮液可以含有用于提高混悬液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。所述混悬液还可以任选地含有适当的稳定剂或用于提高化合物溶解度的试剂，以便制备高浓缩溶液。
此外，活性组分可以采取粉末形式，在粉末在使用前与适当载体如无菌无热原水一起配制。
所述化合物还可以配制为直肠用组合物，例如栓剂和贮留灌肠剂，例如含有常规栓剂基质，如可可油或其他甘油酯。
除了上述制剂，所述化合物还可以配制为储库型制剂。这种长效制剂可以通过植入给药(例如植入皮下或肌肉内或肌肉内注射)。所以，例如，所述化合物可以用适当的高分子或疏水性材料(例如作为存在于可接受油内的乳液)或离子交换树脂来配制，或作为略溶性衍生物如略溶性盐。
适用于本发明疏水性化合物的药用载体是共溶剂体系，其中含有苄醇、非极性表面活性剂、水可溶混的有机聚合物和水相。该共溶剂体系可以是VPD共溶剂体系。VPD含有3％(w／v)苄醇、8％(w／v)非极性表面活性剂聚山梨醇酯80和65％聚乙二醇300，且用无水乙醇调至预定体积的溶液。VPD共溶剂体系(VPD：5W)由用含有5％葡萄糖水溶液1∶1稀释的VPD组成。该共溶剂体系较易将疏水性化合物溶解，并且其本身对于全身性给药毒性较低。显然，可以相当大地改变共溶剂体系的配比，而不破坏其溶解度和毒性特征。此外，可以将共溶剂体系中组分进行改变：例如用其他低毒非极性表面活性剂代替聚山梨醇酯80；可以改变聚乙二醇的级分大小；用其他生物相容性聚合物代替聚乙二醇，例如聚乙烯吡咯烷酮；和用其他糖类物质或多糖代取代葡萄糖。
可替换地，疏水性药物化合物也可以采用其他给药体系。脂质体和乳化体是人们所熟知的用于疏水性药物给药的赋形剂或载体的例子。还可以采用某些有机溶剂如二甲基亚砜，但其代价通常是毒性较高。此外，所述化合物可以用缓释体系给药，例如含有治疗药物的固体疏水性聚合物的半透基质。现已建立了多种缓释材料并且为该领域技术人员所熟知。缓释胶囊根据其化学特性在数周至超过100天内释放化合物。根据治疗药物的化学特性和生物稳定性，还可以采用其他方法来稳定蛋白。
药物组合物还可以含有适当的固体或凝胶相载体或赋形剂。所述载体或赋形剂的例子包括但不限于：碳酸钙、磷酸钙、多种糖类、淀粉类、纤维素类衍生物、明胶和聚合物如聚乙二醇。
本发明的许多PTK调节化合物可以以和药物相容性抗衡离子形成的盐来提供。可以与多种酸形成药物相容性盐，其中包括但不限于盐酸、硫酸、醋酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸等。盐趋于比其相应的游离碱型较易溶于含水溶剂或其他质子溶剂中。有效剂量
适用于本发明的药物组合物包括其中活性组分的量是其能够达到预期目标的有效量的组合物。具体而言，治疗有效量是指能够有效防止被治疗对象所患症状的恶化的或减轻该症状的用量。对有效量的判断是所属领域技术人员力所能及的，尤其是根据在此提供的详细内容。
对于任何本发明方法中采用的化合物，其治疗有效剂量最初是根据细胞实验来判断的。例如，在动物模型中配制给药剂量，以便获取循环浓度范围，该范围包括在细胞实验中测定的IC50(即被测化合物对PTK活性的抑制作用达到最大值的50％时的浓度)。利用此类信息可以更精确地计算出人体中的有效剂量。
治疗有效剂量是指所述化合物可以缓解患者的症状或延长患者存活期的用量。通过在细胞培养或试验动物中进行的标准药学方法可以测定出所述化合物的毒性和治疗功效，例如测定LD50(半数致死量)和ED50(半数治疗有效量)。毒性和治疗作用的剂量比率为治疗指数并且表示为LD50与ED50的比例。具有高治疗指数的化合物是优选化合物。利用由细胞培养试验和动物研究实验获得的数据可确定用于人体给药的剂量范围。此类化合物的剂量优选地介于包括ED50在内的毒性较低或无毒性的循环浓度范围内。在此范围内，给药剂量可取决于所用的剂型和给药途径而变化。鉴于患者的状况，可以由个体主治医师来决定准确的制剂、给药途径和剂量。(参见，例如，Fingl等人，1975，《治疗学的药理学基础》第1章，第1部分)。
对给药剂量和给药间隔可以进行个别调整以使活性组分的血浆水平足以维持激酶调节作用，或最低有效浓度(MEC)。根据各个化合物不同，MEC有所变化，但可以根据体外实验数据推定；例如，利用此处公开的实验来测定激酶抑制达到50—90％时的必要浓度。达到MEC所必需的剂量将取决于个体性质和给药途径。但是，可以采用HPLC法和生物鉴定法来测定血浆浓度。
利用MEC值也可以确定给药间隔。化合物应采用一定的给药方案给药，使其血药浓度在此期间的10—90％，优选30—90％，首选50—90％高于MEC。在局部给药和有选择摄取药物的情况中，药物的局部有效浓度与血浆浓度无关。
当然，组合物的给药量取决于被治疗对象，如患者体重、患病的严重程度、给药方式和主治医师的判断。包装
如果需要，组合物可以存在于包装和分配装置内，其中可以含有一个或多个含有活性组分的单位剂型。例如，所述包装包括金属或塑料箔，例如凸泡包装。包装或分配装置配有给药说明书。也可以制备在相容药物载体中配制的含有本发明化合物的组合物，置于适当的容器内并标明可治疗的适应症。适宜在标签上标明的疾病包括对细胞过度增殖性疾病的治疗、对血管发生的抑制、对纤维变性。糖尿病、水肿、腹水等的治疗。实施例Ⅰ．合成
早在美国专利3843665和美国专利3843666中已公开了两种合成茚并—、萘并和芳庚并[1，2—c]吡唑环系的通用方法，并且这些化合物由式Ⅰ表示。
在美国专利3843665中，在惰性溶剂中和催化量酸的存在下将结构如Ⅱ的化合物与芳香磺酰肼加热使吡唑环化。该反应是在75—100℃下进行5—30小时。下列合成路线是该转化作用的代表例。
Figure 9881112200201
其中：
  p是0、1、2；和
  W是低级烷基。
式Ⅱ的化合物是通过将适当官能化的1—二氢茚酮、α—四氢萘酮或1—苯并环庚酮在酸性或碱性催化剂的存在下用芳基醛处理来制备(Braum，R．A．；Mosher，W．A．《美国化学协会会志》1958，80，
第二种制备茚并—、萘并和苯并[6，7]芳庚并[1，2—c]吡唑的方法公开在美国专利3843666中，其中将通式Ⅵ的化合物与催化量的有机羧酸或有机磺酸在惰性溶剂如芳香烃中加热到75℃—175℃下6—24小时。
Figure 9881112200211
其中：
Ar、R1和R2定义如上。
通式Ⅵ的化合物是通过将通式Ⅶ的化合物在惰性溶剂中用肼处理来制备。该反应在15℃—20℃下进行达24小时。
Figure 9881112200212
通式Ⅶ的化合物可以通过将Ⅱ在室温下并在适当的有机助溶剂混合物(例如CH2CL2／MeOH)中用碱性过氧化氢处理来制备。或者，在碱性条件下式Ⅷ与芳基醛反应生成Ⅶ。该反应在惰性溶剂中、于5℃—10℃下进行3—6小时。
其中：
Y是任何常规的离去基团，例如氯、溴、碘、甲苯磺酰基或甲磺酰基。
Ⅵ的环化也可以在无机酸如盐酸、硫酸或磷酸的作用下完成。该反应是在低级链烷醇中、于15℃—20℃的温度下进行12—48小时。该反应的产物，Ⅸ随后通过与有机羧酸或有机磺酸在直链醚或环醚中加热到50℃—150℃8—30小时而被芳香化成Ⅰ。
化合物Ⅸ通过在惰性溶剂(如芳香烃)中、于35℃—200℃的温度下用乙酸酐处理5—8小时而被二乙酰化。
此后，化合物Ⅺ可以通过与无机酸或有机酸在惰性溶剂中加热到35℃—200℃4—8小时而被芳构化为化合物Ⅻ。最终，将化合物Ⅻ在惰性溶剂如水或低级醇中、于碱金属或碱金属的氢氧化物的存在下加热到50℃—150℃8—30小时而被转化为化合物Ⅰ。
Figure 9881112200231
通式ⅩⅢ的化合物可以通过将Ⅶ在惰性溶剂(例如低级链烷醇、直链醚或环状醚)的存在下、于15℃—20℃下用式ⅩⅣ的化合物处理24小时来制得。
Figure 9881112200232
通式ⅩⅢ的化合物可以通过用催化量的有机羧酸或有机磺酸在惰性溶剂如芳香烃中加热到75℃—175℃6—24小时来环化为ⅩⅤ。通式ⅩⅤ的化合物(R3≠H)可以通过在惰性溶剂(如水或低级醇)中、在碱金属或碱金属氢氧化物的存在下加热到50—150℃8—30小时而被转化为Ⅰ。
Figure 9881112200234
上述转化反应的具体例子可以参见美国专利3843665和3843666。
实施例
本发明进一步通过下列实施例来举例说明，这些实施例只是例举。各实施例的终产物通过下列一种或多种方法来定性：高效液相色谱；元素分析、核磁共振光谱、红外光谱和高分辨质谱：
THF=四氢呋喃；
DMF=二甲基甲酰胺；
IMS=工业含甲基化酒精；和
LCMS=液相色谱／质谱。
实施例1—3按照美国专利3932430(Sandoz，1976)的方法制备。实施例1
3—(3—吡啶基)—1，4—二氢茚并[1，2—c]吡唑，m．p．223—224℃；实施例2
3—(4—吡啶基)—1，4—二氢茚并[1，2—c]吡唑，m．p．264—266℃(分解)；实施例3
3—(2—噻吩基)—4，5—二氢—1H—苯并[g]吲唑，m．p．206—208℃。实施例4
将2—亚苄基—二氢茚—1—酮(3．99g)、对—甲苯磺酰肼(4．0g)、对—甲苯磺酸水合物(0．7g)和乙醇(60ml)的混合物在回流下沸腾1．5小时，随后在室温下静置18小时。令混合物再在回流下沸腾74小时，此后在室温下放置74小时。减压下除去溶剂，令残余物在二氯甲烷(100ml)和2M氢氧化钠溶液(50ml)之间分配。分离有机层，用硫酸镁干燥且过滤。用乙酸乙酯洗涤硫酸镁并过滤，将乙酸乙酯滤液蒸发至干得到固体，将其自乙醇中重结晶，得到3—苯基—1，4—二氢茚并[1，2—c]吡唑，mp 234—236℃。实施例5a)将二氢茚—1—酮(10．0g)、乙醇(35ml)、水合肼(10．0ml)和冰醋酸(2．0ml)的混合物在回流和氮气氛下沸腾1小时。将混合物冷却至20℃且将混合物在减压下浓缩，所得固体经过滤收集，得到二氢茚—1—酮腙，mp：84—86℃。b)将a)制得的腙(3．55g)溶解在四氢呋喃(80ml)中并在氮气氛下冷却至0℃，同时加入正丁基锂(28．8ml的2．5M己烷溶液)溶液。将该混合物在0℃下搅拌30分钟，随后加入3—甲氧基苯甲酸乙酯(2．16g)，将该混合物在0℃下搅拌20分钟。加入3M盐酸(80ml)且在回流下令混合物沸腾1小时。分离有机层，用碳酸氢钠中和水层，用***提取，得到油状物，将其通过闪式柱色谱用含有30—40％乙酸乙酯的石油醚(沸点60—80℃)作为流动相提纯，得到3—(3—甲氧基苯基)—1，4—二氢茚并[1，2—c]吡唑，m．p．：172—174℃。实施例6
将2—(4—甲氧基苯甲酰基)二氢茚—1，3—二酮(1．4g，根据《杂环化学杂志》8 855—859(1971)所述方法的改进方法制备)和水合肼(15ml)在回流下沸腾24小时。冷却该混合物，倾入冰水中，通过过滤收集沉淀出的固体，用无水乙醇洗涤，干燥，得到3—(4—甲氧基苯基)—1，4—二氢茚并[1，2—c]吡唑，m．p．247℃。实施例 7  将2—(4—加碱苯甲酰基)二氢茚—1，3—二酮(1．32g，按照与实施例6起始原料的相同方式来制备)和水合肼(15ml)的混合物在回流下沸腾24小时。冷却该混合物，倾入冰水中，过滤收集固体，用无水乙醇洗涤，干燥，得到3—(对—甲苯基)—1，4—二氢茚并[1，2—c]吡唑，m．p．267—269℃。实施例8a)将5—甲氧基二氢茚—1—酮(5．46g)和肼基甲酸叔丁酯(4．45g)在乙醇(100ml)和冰醋酸(1滴)中的溶液搅拌且在回流下沸腾2小时。减压下令体积减少至一半，过滤收集结晶出的固体，得到5—甲氧基二氢茚—1—酮叔丁氧基羰基腙。b)在—78℃和氮气下，将二异丙基氨化锂(11．3ml的2．0M庚烷／THF／乙苯溶液)滴加到搅拌的5—甲氧基二氢茚—1—酮叔丁氧基羰基腙(2．5g)的四氢呋喃(100ml)溶液中。在此温度下搅拌该混合物1．5小时，随后滴加噻吩—2—甲酸乙酯(1．69g)的四氢呋喃(10ml)溶液。加料完毕后，将混合物在—78℃下搅拌30分钟，随后升至室温。再在室温下搅拌20分钟，加入饱和氯化铵溶液(100ml)且将混合物剧烈搅拌10分钟。分离各层，水层用***(3×75ml)提取。合并的有机物依次用1M盐酸、盐水洗涤，干燥，过滤并蒸发，得到黄色胶状物，将其悬浮在二氯甲烷(25ml)中，加入五甲基苯(1．34g)。将混合物冷却至0℃，加入三氟乙酸(0．2ml)。将该混合物搅拌64小时且减压下浓缩，得到油状物，将其溶解在***(200ml)中，用饱和碳酸氢钠溶液(100ml)洗涤，随后用盐水洗涤，干燥，过滤并蒸发，得到胶状物，该胶状物通过柱色谱法、用石油醚(沸点60—80℃)／乙酸乙酯(4∶1)作为流动相纯化，得到6—甲氧基—2—叔丁氧基羰基—3—(2—噻吩基)—1，4—二氢茚并[1，2—c]吡唑，m．p．163—165℃。c)在室温下，将3M盐酸(10ml)加入到b)产物(100mg)在乙酸乙酯(10ml)中的搅拌溶液内。将混合物在室温下搅拌1小时且加热回流。令混合物在回流下沸腾30分钟，随后冷却。将混合物倾入水(50ml)中，分离有机层，用水洗涤。合并的水层和洗涤液用饱和碳酸氢钠溶液调至碱性，用二氯甲烷提取。合并的二氯甲烷洗涤液和提取液用盐水洗涤，干燥，过滤且蒸发，得到6—甲氧基—3—(2—噻吩基)—1，4—二氢茚并[1，2—c]吡唑，m．p．：212—214℃。实施例9a)将二氢茚—1—酮(5．0g)和肼基甲酸叔丁酯(5．0g)在甲醇(20ml)中的含有冰醋酸(1滴)的溶液沸腾并在回流下搅拌1．5小时。将混合物冷却并减压下蒸发。残余物自乙醇中重结晶，得到二氢茚—1—酮叔丁氧基羰基腙。b)按照与前面实施例相同的方式，将a)的产物(500mg)与二异丙基氨化锂(2．23ml的2．0M庚烷／THF／乙苯溶液)反应，随后与2—糠酸乙酯(299mg)反应，所得混合物用三氟乙酸(5ml)处理，得到3—(2—呋喃基)—1，4—二氢茚并[1，2—c]吡唑，m．p．195—197℃。实施例10
按照与上述两个实施例相同的方式，由5—氟二氢茚—1—酮开始并采用噻吩—2—甲酸乙酯来制备6—氟—3—(2—噻吩基)—1，4—二氢茚并[1，2—c]吡唑，m．p．222—224℃。实施例11—28(通用方法)a)将二氯甲烷：甲醇(1∶1v／v)的混合物经Gilson215液体加样器(handler)加入到装在隔膜封试管内的起始原料烯酮(enone)(约50mg，参见表Ⅰ)中，随后加入2M氢氧化钠水溶液(1摩尔当量，参见表1)，再加入100体积的过氧化氢水溶液(1．8摩尔当量)。将所得溶液／悬浮液在室温下振摇20小时，经LCMS分析后，再用塑料滴管手工向各反应管内加入100个体积的过氧化氢水溶液(1．8摩尔当量)。向那些含有大量不溶性物质的反应管中进一步加入1∶1(体积比)二氯甲烷∶甲醇(1ml)。随后继续振摇24小时。
所有反应均通过薄层层析分析，向那些认为反应不完全的反应管内用塑料滴管加入100个体积的过氧化物水溶液(1．8摩尔当量)(参见表Ⅰx3所示的反应)。将这些反应混合物在室温下搅拌3天。表Ⅰ
实施例 起始的烯酮(mg) 2N的NaOH水溶液(μl) 100个体积H2O2水溶液(μl)
l1 2—(2—吡啶基亚甲基)—1—四氢萘酮(51．2mg) 108．8 44．5×2
12 2—(3—吡啶基亚甲基)—1—四氢萘酮(49．3mg) 104．8 42．9×2
13 2—(4—氟代亚苄基)—1—二氢茚酮(50．1mg) 105．1 43．0×2
14 2—亚苄基—1—苯并环庚酮(50．3mg) 101．3 41．4×2
15 2—(2—噻吩基亚甲基)—1—苯并环庚酮(51．9ng) 102．0 41．7×2
16 2—(4—甲氧基亚苄基)—1—四氢萘酮(50．2mg) 95．0 38．8×2
17 2—(2—氯代亚苄基)—1—四氢萘酮(50．4mg) 93．8 38．4×2
18 2—(3—氯代亚苄基)—1—四氢萘酮(49．6mg) 92．3 37．8×2
19 2—(4—氯代亚苄基)—1—四氢萘酮(51．7mg) 96．2 39．4×2
20 2—(4—异丙基亚苄基)—1—四氢萘酮(50．4mg) 91．2 37．3×3
21 2—亚胡椒基—1—四氢萘酮(50．5mg) 90．7 37．1×3
22 6—甲氧基—2—(4—甲基亚苄基)—1—四氢萘酮(51．8mg) 93．0 38．1×3
23 2—(4—三氟甲基亚苄基)—1—二氢茚酮(49．3mg) 85．5 35．0×2
24 2—(2，4—二氯亚苄基)—1—二氢茚酮(51．9mg) 89．7 36．7×2
25 2—(2，3—二甲氧基亚苄基)—1—四氢萘酮(49．6mg) 84．3 34．5×3
26 6—甲氧基—2—(4—甲氧基亚苄基)—1—四氢萘酮(50．6mg) 86．0 35．2×3
27 2—(3，5—二甲氧基亚苄基)—1—四氢萘酮(48．8mg) 82．9 33．9×3
28 5，6—二甲氧基—2—(4—甲氧基亚苄基)—1—二氢茚酮(51．5mg) 83．0 33．93×3
令反应溶液／悬浮液在二氯甲烷(约5ml)和水(约2ml)之间达到平衡，经Empore滤筒将有机相滤除并用二氯甲烷洗涤(约2ml)。将二氯甲烷相蒸发，将残余物真空干燥。
在成为相应2，3—环氧酮类化合物的基础上，a)的产物进行b)步反应。b)经Gilson 215液体加样器向装在隔膜封管内的步骤1的产物中加入正丁醇(2ml)，随后加入10％(体积)水合肼(2摩尔当量，基于步骤1中所用的起始原料烯酮的用量)的正丁醇水溶液(参见表Ⅱ)。最后用注射器手工向各管内加入冰醋酸(2滴)。在振摇的同时，将反应在100℃下加热一段如表Ⅱ所述的时间，基于通过薄层层析监测。将反应化合物蒸发至干，残余物用硅胶色谱法以乙酸乙酯作为洗脱剂来提纯，如果必要可以用石油醚(沸点40—60℃)稀释乙酸乙酯。将适当的馏分至干且在真空下蒸发，给出最终的吡唑类化合物。利用LCMS且按照下列条件鉴定产物的特性。LC层析柱：    5μHYPERSIL BDS C18(100×2．1mm)流动相：    0．1％甲酸：MeCN(梯度—如下所示)条件：      在8分钟内10—100％MeCN，(梯度)      100％MeCN 1分钟，2分钟内100—10％ MeCN，(总的分析运转时间11分钟)流速：      1ml／min波长范围：  206—320nm注射体积：  10μlMS电离：      API+ve／—ve质量范围：  150—500m／z锥形电压：  20
实施例11—28化合物的反应细节和收率如表Ⅱ所示：表Ⅱ反应细节
    实施例 10％NH2NH2．H2O的体积μl 在100℃下加热的时间
    11     212．0     38h
    12     204．1     38h
    13     204．8     6h
    14     197．3     38h
    15     198．7     22h
    16     185．0     38h
    17     182．7     38h
    18     179．8     38h
    19     187．4     38h
    20     177．6     22h
    21     176．7     38h
    22     181．3     38h
    23     166．6     6h
    24     174．8     38h
    25     164．1     38h
    26     167．4     22h
    27     161．5     38h
    28     161．6     6h
表Ⅱ(续)收率／LCMS
实施例     MF     MW 实测 MH+ 保留时间(分钟) 终质量
    11  C16H13N3  247 是     4．26  15．9mg
    12  C16H13N3  247 是     3．74  10．4mg
    13  C16H11FN2  250 是     4．60  24．9mg
    14  C18H16N2  260 是     5．10  15．8mg
    15  C16H14N2S  266 是     5．07  24．1mg
    16  C18H16N2O  276 是     4．75  23．6mg
    17  C17H13ClN2  280．5 是     5．03  4．2mg
    18  C17H13ClN2  280．5 是     5．38  16．7mg
    19  C17H13ClN2  280．5 是     5．40  15．7mg
    20  C20H20N2  288 是     5．87  15．0mg
    21  C18H14N2O2  290 是     4．70  11．9mg
    22  C19H18N2O  290 是     5．06  7．6mg
    23  C17H11F3N2  300 是     5．32  3．9mg
    24  C16H10Cl2N2  301 是     5．45  5．1mg
    25  C19H18N2O2  306 是     4．77  10．4mg
    26  C19H18N2O2  306 是     4．64  9．8mg
    27  C19H18N2O2  306 是     4．91  11．7mg
    28  C19H18N2O3  322 是     3．93  29．1mg
实施例11—28制备的化合物是：实施例11
3—(2—吡啶基)—4，5—二氢—2H—苯并[g]吲唑实施例12
3—(3—吡啶基)—4，5—二氢—2H—苯并[g]吲唑实施例13
3—(4—氟代苯基)—1，4—二氢茚并[1，2—c]吡唑实施例14
3—苯基—2，4，5，6—四氢苯并[6，7]芳庚并[1，2—c]吡唑实施例15
3—(2—噻吩基)—2，4，5，6—四氢苯并[6，7]芳庚并[1，2—c]吡唑实施例16
3—(4—甲氧基苯基)—4，5—二氢—2H—苯并[g]吲唑实施例17
3—(2—氯代苯基)—4，5—二氢—2H—苯并[g]吲唑实施例18
3—(3—氯代苯基)—4，5—二氢—2H—苯并[g]吲唑实施例19
3—(4—氯代苯基)—4，5—二氢—2H—苯并[g]吲唑实施例20
3—(4—异丙基苯基)—4，5—二氢—2H—苯并[g]吲唑实施例21
3—胡椒基—4，5—二氢—2H—苯并[g]吲唑实施例22
7—甲氧基—3—(4—甲苯基)—4，5—二氢—2H—苯并[g]吲唑实施例23
3—(4—三氟甲基苯基)—1，4—二氢茚并[1，2—c]吡唑实施例24
3—(2，4—二氯苯基)—1，4—二氢茚并[1，2—c]吡唑实施例25
3—(2，3—二甲氧基苯基)—4，5—二氢—2H—苯并[g]吲唑实施例26
7—甲氧基—3—(4—甲氧基苯基)—4，5—二氢—2H—苯并[g]吲唑实施例27
3—(3，5—二甲氧基苯基)—4，5—二氢—2H—苯并[g]吲唑实施例28
6，7—二甲氧基—3—(4—甲氧基苯基)—1，4—二氢茚并[1，2—c]吡唑实施例29a)将二氢茚—1—酮(3．30g)、噻吩—3—甲醛(2．60ml)、乙酸(0．47ml)和哌啶(0．57ml)一起在蒸汽浴上加热16小时。将混合物冷却，得到固体物，将其与IMS(120ml)沸腾并热过滤除去不溶性原料。在冰中冷却滤液，沉淀出褐色固体，过滤收集，干燥，得到2—(3—噻吩基)亚甲基二氢茚—1—酮，m．p．137—1382。b)将a)的产物(2．03g)、对—甲苯磺酸肼(2．00g)、对—甲苯磺酸(0．35g)和乙醇(30ml)的混合物在回流下沸腾44小时。减压下除去溶剂，将残余物溶解在二氯甲烷(100ml)中。用2M氢氧化钠水溶液(25ml)洗涤该溶液。将有机相干燥，经硅胶垫过滤，用乙酸乙酯洗涤，蒸发，得到油状物，将其通过闪式硅胶柱色谱用石油醚(沸点60—80℃)／乙酸乙酯(2∶1)洗脱，再用(沸点60—80℃)／乙酸乙酯(1∶1)洗脱提纯。将适当的馏分合并，蒸发，得到固体，将其在***中研制，过滤，得到3—(3—噻吩基)—1，4—二氢茚并[1，2—c]吡唑，m．p．219—220℃。
在这些实施例中制备的化合物的化学结构如表Ⅲ所示：表Ⅲ
Figure 9881112200331
实施例     n     Ar     R1     R2     R4     R5     R6
    1     1     3—吡啶基     H     H     H     H     H     H
    2     1     4—吡啶基     H     H     H     H     H     H
    3     2     2—噻吩基     H     H     H     H     H     H
    4     1     苯基     H     H     H     H     H     H
    5     1     苯基(取代)     H     H     H  3—OCH3     H     H
    6     1     苯基(取代)     H     H     H  4—OCH3     H     H
    7     1     苯基(取代)     H     H     H  4—CH3     H     H
    8     1     2—噻吩基 6—OCH3     H     H     H     H     H
    9     1     2—呋喃基     H     H     H     H     H     H
    10     1     2—噻吩基     H     H     H     H     H     H
    11     2     2—吡啶基     H     H     H     H     H     H
    12     2     3—吡啶基     H     H     H     H     H     H
    13     1     苯基(取代)     H     H     H     H     H     H
    14     3     苯基     H     H     H     H     H     H
    15     3     2—噻吩基     H     H     H     H     H     H
    16     2     苯基(取代)     H     H     H  4—OCH3     H     H
    17     2     苯基( 取代)     H     H     H  2—Cl     H     H
    18     2     苯基(取代)     H     H     H  3—Cl     H     H
    19     2     苯基(取代)     H     H     H  4—Cl     H     H
    20     2     苯基(取代)     H     H     H  4—isoPr     H     H
    21     2     苯基(取代)     H     H     H     3．4—OCH2O—     H
    22     2     苯基(取代) 7—OCH3     H     H  4—CH3     H     H
    23     2     苯基(取代)     H     H     H  4—CF3     H     H
    24     1     苯基(取代)     H     H     H  2—Cl  4—Cl     H
    25     2     苯基(取代)     H     H     H  2—OCH3  3—OCH3     H
    26     2     苯基(取代) 7—OCH3     H     H  4—OCH3     H     H
    27     2     苯基(取代)     H     H     H  3—OCH3  5—OCH3     H
    28     1     苯基(取代) 6—OCH3  7—OCH3     H  4—OCH3     H     H
    29     1     3—噻吩基     H     H     H     H     H     H
Ⅱ．体外PTK实验
下列体外实验用于测试本发明不同的化合物对于一种或多种PTK的活性水平和作用。按照相同的思路利用所属领域技术人员熟知的技术可以为其他酪氨酸激酶设计出类似的实验。A．杆状病毒体系的KDR蛋白生产
用从HUVEC细胞中分离出了cDNA通过PCR技术来生产KDR胞内结构域(aa789—1354)的编码序列。在该蛋白的N末端引入聚His6序列。该片段被克隆到转染载体pVL1393的Xba1和Not1位点。用BaculoGold转染试剂(PharMingen)通过共转染来生成重组杆状病毒(BV)。将重组BV噬斑纯化并利用蛋白质印迹法(Western analysis)检验。为了生成蛋白质，令SF—9细胞在SF—900—Ⅱ培养基中以2×106／ml生长，并且以0．5个噬斑形成单位／细胞(MOI)感染。在感染48小时后收获细胞。B．KDR的纯化
向由1L细胞培养物中得到的细胞团内加入50ml TritonX—100溶胞缓冲液(20mMTris，pH 8．0，137mM NaCl，10％甘油，1％TritonX—100，1mM PMSF，10μg／ml抑酶肽，1μg／ml亮抑酶肽)使表达(His)6KDR(aa789—1354)的SF—9细胞裂解。将裂解产物在4℃的Sorval SS—34转子内以19000rpm离心30分钟。将该细胞裂解产物加入到 5ml NiCl2螯合琼脂糖柱中，该柱用 50mMHEPES，pH 7．5，0．3MNacl平衡。用含有0．25M咪唑的相同缓冲液洗脱KDR。利用SDS—PAGE分析法和 ELISA法(如下所述)分析柱的馏分，ELISA可以测定激酶活性。将纯化 KDR 交换至 25mM HEPES，pH 7．5，25mM Nacl，5mMDTT缓冲液中并储藏在—80℃。C．人体Tie—2激酶的生产和纯化
用从人体胎盘中分离出的cDNA通过PCR技术来生产人体Tie—2胞内结构域(aa775—1124)的编码序列。在该蛋白的N末端引入聚His6序列并将此结构克隆到转染载体pVL1393的Xba1和Not1位点。用BaculoGold转染试剂(PharMingen)通过共转染来生成重组杆状病毒(BV)。将重组BV噬斑纯化并利用蛋白质印迹法(Western analysis)检验。为了生产蛋白质，令SF—9昆虫细胞在SF—900—Ⅱ培养基中以2×106／ml生长，并且感染达到MOI为0．5。按照与KDR类似的方法纯化筛选中所用的His标记激酶。D．人体Flt—1酪氨酸激酶的生产和纯化
采用杆状病毒表达载体pVL 1393(Phar Mingen，Los Angeles，CA)。用从HUVEC细胞中分离出的cDNA库通过PCR技术来生产编码激酶结构域的核苷酸序列。将编码聚—His6的核苷酸序列引入到编码的人体Flt—1整个胞内激酶结构域(氨基酸786—1338)的核苷酸区5’端。按照类似于KDR(B部分)和ZAP 70(F部分)的方式将组氨酸残基亲和纯化，将SF—9昆虫细胞以0．5感染复数感染并在感染48小时后收获。E．Lck和EGFR酪氨酸激酶的来源
从市场上购得Lck或截短形式的Lck(lir UpstteBiotechnology Inc，Saranac Lake，NY或Santa CruzBiotechnology，Inc．，Santa Cruz，CA)，或用常规方法由天然或重组原料纯化得到。EGFR 购自 Sigma(Cat#E—3641；500单位／50μl)，从 Oncogene Research Products／Calbiochem(Cat#PF011—100)获得EGF配体。F．ZAP70酪氨酸激酶的生产
采用杆状病毒表达载体pVL 1393(Phar Mingen，Los Angeles，CA)。将编码聚—His6的核苷酸序列引入到编码整个ZAP70(氨基酸1—619)的核苷酸区5’端。用从Jurkat无限增殖T细胞分离出的cDNA库通过PCR技术来生产编码ZAP70编码区的核苷酸序列。组氨酸残基确保蛋白的亲和纯化。LBPRGS桥构成了可被凝血酶蛋白酶解断裂的识别序列，由此从酶上除去亲和标记。将SF—9昆虫细胞以0．5复数感染并在感染48小时后收获。G．ZAP70的纯化
将SF—9细胞在含有20mM Tris，pH 8．0，137mM NaCl，10％甘油，1％Triton X—100，1mM PMSF，1μg／ml亮抑酶肽，10μg／ml抑酶肽和1mM原矾酸钠的缓冲液中裂解。将可溶的裂解产物加入到螯合琼脂糖Hi Trap柱(Pharmacia)上，该柱被50mM HEPES，pH7．5，0．3MNaCl平衡过。融合蛋白质用250mM咪唑洗脱。将回收的酶储备在含有50mM HEPES，pH7．5，50mM NaCl和5mM DTT的缓冲液中。H．酶联免疫吸附测定(ELISA)
酶联免疫吸附测定法(ELISA)是用于检测且测量是否存在酪氨酸激酶活性。ELISA可以按照已公开的方案来进行，例如Voller等人，1980，“酶联免疫吸附测定法”，《临床免疫学手册》第2版，Rose&Friedman，第359—371，美国微生物学协会，华盛顿，D．C．。
所公开的方案适用于测定特异性RTK的活性。例如，下文提供了利用ELISA实验测试KDR的优选方案。对这些方案进行改进以便于测定针对RTK族其他成员以及非受体型酪氨酸激酶的化合物的活性也是所属技术领域技术人员能力所及的。为了测定抑制剂的选择性，采用通用的PTK底物(例如聚(Glu4Tyr)20000—50000MW的无规共聚物)以及ATP(通常为5μM)，ATP在试验中的浓度约为表观Km的两倍。KDR体外ELISA
下列方法用于测试本发明化合物对KDR酪氨酸激酶活性的抑制作用：缓冲液和溶液：1．PGT：聚(Glu，Tyr)4∶1
在—20℃下储存粉末。将粉末溶解在磷酸缓冲盐水(PBS)成为50mg／ml的溶液。将1ml等份的溶液储存在—20℃下。当制备平板时，将其在Gibco PBS中稀释为250μg／ml。2．反应缓冲液：
100mM Hepes，20mM MgCl2，4mM MnCl2，5mM DTT，0．02％BSA，200μM NaVO4，pH 7．103．ATP：100mM等份的溶液储存在—20℃下。用水稀释至20μM。4．洗涤缓冲液：
含有0．1％吐温20的PBS。5．抗体稀释缓冲液：
0．1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液。6．TMB底物：
在使用前将TMB底物和过氧化物溶液以9∶1混合，或采用Neogen的K—Blue底物。7．终止液
1M磷酸方法1．平板的制备
用PBS稀释PGT储备液(50mg／ml，冷藏)至250μg／ml。在Corning改进的平底高亲和ELISA平板(Corning#25805—96)的各孔内加入125μl。向空白孔内加入125μlPBS。用密封带覆盖并在37℃下保温过夜。用1×250μl洗涤缓冲液洗涤并在37℃的干燥保温箱内干燥约2小时。
将密封在袋中的覆盖平板储存在4℃下直至使用为止。2．酪氨酸激酶的反应：
—制备在含有20％DMSO的水溶液中达到4X浓度的抑制剂溶液。
—制备反应缓冲液
—制备在50μl中含有预定单位酶的酶溶液，例如制备1ng／μl的KDR溶液使反应中各孔内的总量为50ng。储存在冰上。
—由100mM在水中的储备液制备20μM的4X ATP溶液。储存在冰上。
—各孔内加入50μl酶溶液。
—加入25μl的4×抑制剂
—加入25μl的4×ATP溶液用于测定抑制剂。
—在室温下保温10分钟
—在各孔内加入50μl 0．05N HCl终止反应
—洗涤平板
**反应的终浓度：
ATP：5μM
     5％DMSO3．抗体的结合
—用含有0．1％BSA的PBS经两步(100x，随后200x)将1mg／ml等份的PY20—HRP(Pierce)抗体稀释至50ng／ml。
—各孔内加入100μl抗体。在室温下保温1小时。在4℃下保温1小时。
—将平板洗涤4次。4．着色反应
—制备TMB底物并各孔内加入100μl
—在650nm下监测OD直至达到0．6为止
—用1M磷酸终止。在平板读取器上振摇。
酶制剂的最佳保温时间和酶反应条件会略有变动而针对每批次，可根据经验确定。
对于Flt—1、Tie—2、EGFR和ZAP70采用类似的试验条件。对于Lck，在类似试验条件下所用的反应缓冲液是100mM MOPSO，pH 6．5，4mM MnCl2，20mM MgCl2，5mM DTT，0．2％BSA，200μM NaVO4。PKC激酶的来源
可以购得PKC的催化亚基(Calbiochem)。PKC激酶试验
按照下列已公开的方法进行放射性激酶试验(Yasuda，I．，Kirshimoto，A．，Tanaka，S．，Tominaga，M．，Sakurai，A．，Nishizuka，Y．《生物化学和生物物理研究通讯》3：166，1220—1227(1990))。简单而言，所有反应均是在由50mM Tris—HCl pH 7．5，10mM MgCl2，2mM DTT，1mM EGTA，100μM ATP，8μM肽，5％DMSO和33P ATP(8Ci／mM)组成的激酶缓冲液中进行。化合物和酶在反应器内混合并加入ATP和底物混合物来引发反应。随后加入10μL终止缓冲液(5mM ATP在75mM磷酸中的溶液)，将一部分混合物点滴到磷酸纤维素滤膜上。室温下用75mM磷酸将斑点洗涤3次5—15分钟。利用液体闪烁计数法定量测定掺混的放射性标记。***受体结合试验
采用Shein等人在《癌症研究》45：4192(1985)(在此引入作为参考)中公开的反应条件，在4℃小保温20小时后，测定1nM放射标记的17β***对MCF—7乳腺癌细胞胞质溶胶中的人体***受体的结合作用。保温后，将胞质溶胶部分与4℃的葡聚糖涂层木炭的悬浮液中混合10分钟，离心，收集上清液。通过闪烁计数器(LS6000，Beckman)用液体闪烁混合物(Formula 989 Packard)测定炭上清液中残留的束缚放射性。同时以双份在8种不同的浓度下对化合物进行测定获得用于定量抑制活性的竞争曲线。特异性放射性配体对***受体的结合作用被定义为在过量未标记17***(6μM)的存在下测定的总结合结果与非特异性结合结果之差。结果
获得的具有下列结构式的代表性化合物(实施例4)的以下抑制浓度为：
Figure 9881112200411
试验 化合物的IC50
KDR 0．20μM
flt—1 ＞50．0μM
Lck ＞50．0μM
TIE2 ＞50．0μM
ZAP70 ＞50．0μM
EGFR ＞50．0μM
PKC ≥20μM
***受体 ＞10．0μM(＜10％inh@，10μM)
此外，另一代表化合物所得的以下抑制浓度为：
上述结果证明，本发明和在此例举的化合物对于KDR酪氨酸激酶的具有显著的抑制活性，并且特别适合选择作为KDR酪氨酸激酶抑制剂。Ⅲ．细胞RTK实验
下列细胞实验用于测试本发明不同的化合物对于一种或多种RTK的活性和作用的水平。按照相同的思路利用所属领域技术人员熟知的技术可以为其他酪氨酸激酶设计出类似的实验。A．利用蛋白质印迹法测定人体脐静脉细胞(HUVEC)中的VEGF诱发型KDR磷酸化
1．由Clonetics(San Diego，CA)购得HUVEC细胞(自混合供体)且按照生产说明书进行培养。本实验只选用早期传代(3—8)。用完全EBM培养基(Clonetics)使细胞在100mm平皿(用于组织培养的Falcon，Becton Dickinson；Plymouth，英国)中培养。
2．为了评价化合物的抑制作用，将细胞用胰蛋白酶消化，在6孔的成组平板(Costar；Cambridge，MA)的各孔内接种0．5—1．0x105细胞／孔。
3．接种3—4天后，平板是90—100％铺满的。除去所有孔内的培养基，用5—10ml PBS漂洗细胞并用不含有任何补充物的5ml EBM基础培养基(即缺乏血清)保温18—24小时。
4．将存在于1ml EBM培养基中的抑制剂的连续稀释液(终浓度为25μM、50μM或1uM)加入细胞中且在37℃下保温1小时。随后向所有孔加入在2ml EBM培养基中的人体重组VEGF(165)(R&D体系)使终浓度为50ng／ml且在37℃下保温10分钟。利用未经处理或只用VEGF处理的对照细胞来评估本底磷酸化和VEGF诱导的磷酸化。
5．此后，用5—10ml含有1mM原矾酸钠(Sigma)的冷PBS漂洗所有孔并将细胞在200μl的含有蛋白酶抑制剂(PMSF 1mM，抑蛋白酶肽1μg／ml，抑胃酶肽1μg／ml，亮抑酶肽1μg／ml，原矾酸钠 1mM，氟化钠1mM)和1μg／ml脱氧核糖核酸酶(均购自Sigma ChemicalCompany，St．Louis，MO)的RIPA缓冲液(50mM Tris—HCl pH 7，150mMNaCl，1％NP—40，0．25％脱氧胆酸钠，1mM EDTA)中裂解，刮擦。将裂解产物14000rpm下离心30分钟以除去核。
6．此后，通过加入冷(—20℃)的乙醇(2体积)在1小时—过夜的时间内沉淀出等量蛋白质。将沉淀团再次溶解在含有5％β—巯乙醇(BioRad；Hercules，CA)的Laemli样本缓冲液中并沸腾5分钟。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(6％，1．5mmNovex，San Deig，CA)将蛋白质分离且用Novex***转移到硝基纤维素膜上。用牛血清白蛋白(3％)封闭后，在4℃下用抗KDR多克隆抗体(C20，Santa CruzBiote—chnology：Aanta Cruz，CA)或用抗磷酸酪氨酸单克隆抗体(4G10，Upstate Biotechnology，Lake Placid，NY)探测蛋白质过夜。洗涤后，用山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG的HRP缀合F(ab)2保温1小时，利用发射化学发光(ECL)***(Amersham Life sciences，Arlington Height，IL)显示各带。结果
由下列代表性化合物所得的以下抑制浓度是：
式Ⅰ的化舍物，其中 细胞VEGF诱导的KDR磷酸化IC50
R1是氢，R2是氢，R3是氢，n=1和Ar是2—噻吩基 3．0μM
此外，另一个具有下列结构式的代表性化合物所得的以下抑制浓度为：
Figure 9881112200441
HUVEC 化合物的细胞IC50
KDR磷酸化 5—10μM
此化合物还被证实为对酪氨酸激酶具有选择性。
上述结果表明，本发明的化合物对内皮细胞中KDR酪氨酸激酶的VEGF诱发型酪氨酸磷酸化具有显著的抑制活性。B．HUVEC细胞***检测
在EGM完全培养基(如每个供应商说明书所述的补加有10％FBS、氢化可的松、表皮生长因子和牛脑提取物的内皮生长培养基)中培养人体脐静脉内皮细胞(HUVEC)。细胞、培养基和补加物购自Clonetics(San Diego，CA)。利用HUVEC细胞***试验测试对VEGF、FGF或完全培养基诱发的细胞***的抑制作用。通过胰蛋白酶消化来收获细胞，洗涤1次并吸附在完全培养基(CM)中，浓度为5000个细胞／0．15ml。将细胞接种在96孔平板中且达到5000个细胞／孔，在37℃下保温24小时。细胞用无血清培养基(SFM)洗涤1次且在无血清条件下保温24小时。在此期间，非血清缺乏的对照孔内用CM进行培养。将试验化合物制备为溶于DMSO中的10mM储备液，用SFM稀释，向孔中加入一定浓度范围(0．005—50μM终浓度)内的化合物溶液。将细胞保温1小时，随后加入50ng／mlVEGF 或 FGF(R&D体系，Minneapolis，MN)。向由完全培养基刺激的孔中加入试验化合物且同时刺激。保温5小时后，加入0．5Ci／孔的氚代胸苷(Amersham)且将细胞保温过夜。将平板在—20℃下冷冻24小时终止试验。用Tomtec收集器将平板收获至过滤垫上并用β平板液体闪烁计数器(Wallac)计数。结果
该代表性化合物所得抑制浓度为：
式Ⅰ的化合物，其中 VEGF刺激的细胞***IC50
R1是氢，R2是氢，R3是氢，n=1和Ar是2—噻吩基 2．0μM
上述结果证明，本发明的化合物对VRGF刺激的细胞***具有显著的抑制作用。
尽管本发明参照其优选实施方案作了具体的公开和描述，但所属领域技术人员应理解，在不背离本发明权利要求书定义的本发明实质和范围下可以在形式和细节上进行多种变更。本领域技术人员仅用常规试验就可以发现或确定许多等同于本文所述的本发明具体实施方案的技术方案。这些等同方案属于本发明的范围。

Claims (10)

1．一种抑制酪氨酸激酶活性的方法，该方法包括对所述酪氨酸激酶施用足够浓度的下式所示化合物以抑制该酪氨酸激酶的酶活性：其中环A代表互变异构结构：
Figure 9881112200022
n是1、2或3；Ar是和R1、R2、R4和R5分别独立地代表氢、原子量约为19—36的卤素、含有1—4个碳原子的低级烷基、低级烷氧基、三氟甲基或
R1、R2和R4、R5共同独立地表示与相邻碳原子连接的亚甲二氧基；
R3是氢、—COR6或—SO2R6，和
R6是—CH3或
Figure 9881112200031
其中Y是氢、氯或—CH3。
2．如权利要求1所述的方法，其中该化合物为对映异构体形式，与一种或多种其它此类化合物形成的混合物形式，或同时为对映异构体和与一种或多种其它的此类化合物形成的混合物形式。
3．如权利要求1所述的方法，其中所示酪氨酸激酶是受体型酪氨酸激酶或非受体型酪氨酸激酶。
4．如权利要求3所述的方法，其中该酪氨酸激酶选自KDR、flt—1、TIE—2、Lck、Src、fyn和yes。
5．如权利要求1所述的方法，其中所述酪氨酸激酶的活性影响血管发生。
6．如权利要求5所述的方法，其中对所述酪氨酸激酶的抑制作用是抗血管发生。
7．如权利要求6所述的方法，其中对所述酪氨酸激酶的抑制作用阻碍了一种疾病状态的进程，所述疾病状态选自过度增殖性疾病、关节炎、动脉粥样硬化、牛皮癣、血管瘤、心肌血管发生、冠状和脑并生、缺血性肢血管发生、角膜疾病、潮红、新血管性青光眼、黄斑变性、创伤愈合、消化性溃疡螺杆菌相关性疾病、骨折、糖尿病视网膜病和猫抓热。
8．如权利要求1所述的方法，所述酪氨酸激酶的活性影响血管透性过高。
9．如权利要求1所述的方法，其中n是1；R3是氢、R1选自氢、甲氧基和氟；和Ar选自2—噻吩基、3—噻吩基和2—呋喃基。
10．如权利要求1所述的方法，其中该化合物是：
Figure 9881112200041
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