DE60037455T2 - Kinaseinhibitoren als arzneimittel - Google Patents

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Description

  • Es gibt mindestens 400 Enzyme, die als Proteinkinasen indentifiziert sind. Diese Enzyme katalysieren die Phosphorylierung von Zielproteinsubstraten. Die Phosphorylierung ist üblicherweise eine Transferreaktion einer Phosphatgruppe von ATP zu dem Proteinsubstrat. Die spezifische Struktur in dem Zielsubstrat, zu welchem das Phosphat transferiert wird, ist ein Tyrosin, Serin oder Threoninrest. Da diese Aminosäurereste die Zielstrukturen für den Phosphoryltransfer sind, werden diese Proteinkinasenenzyme üblicherweise als Tyrosinkinasen oder Serin/Threoninkinasen bezeichnet.
  • Die Phosphorylierungsreaktionen, und entgegenwirkende Phosphatasereaktionen, an den Tyrosin, Serin und Threoninresten, sind in zahllose zelluläre Prozesse involviert, die den Reaktionen auf diverse intrazelluläre Signale (typischerweise vermittelt durch zelluläre Rezeptoren), der Regulierung von zellulären Funktionen, und der Aktivierung oder Deaktivierung von zellulären Prozessen unterliegen. Eine Kaskade von Proteinkinasen nimmt of in der intrazellulären Signalvermittlung teil und sie sind für die Realisierung dieser zellulären Prozesse notwendig. Aufgrund ihrer Allgegenwart in diesen Prozessen können die Proteinkinasen als ein integraler Teil der Plasmamembran gefunden werden oder als cytoplasmatische Enzyme oder in dem Nukleus lokalisiert, oft als Komponenten von Enzymkomplexen. In vielen Fällen sind diese Proteinkinasen ein essentielles Element von Enzym- und strukturellen Proteinkomplexen, die bestimmen, wo und wann ein zellulärer Prozeß innerhalb einer Zelle auftritt.
  • Proteintyrosinkinasen. Proteintyrosinkinasen (PTKs) sind Enzyme, welche die Phosphorylierung von spezifischen Tyrosinresten in zellulären Proteinen katalysieren. Diese posttranslationale Modifikation dieser Substratproteine, oft selbst Enzyme, wirkt als eine molekulare Verschiebung, die die Zellproliferation, die Aktivierung oder die Differenzierung reguliert (zur Durchsicht siehe Schlessinger und Ulrich, 1992, Neuron 9:383–391). Abnormale oder exzessive PTK Aktivität wurde in vielen Krankheitsstadien beobachtet, einschließlich benignen und malignen proliferativen Erkrankungen ebenso wie Krankheiten, die aus unpassender Aktivierung des Immunsystems (zum Beispiel Autoimmunkrankheiten) resultieren, Transplantatabstoßung, und Graft vs. Host Erkrankung. Zusätzlich vermitteln Endothelialzell-spezifische Rezeptor PTKs wie zum Beispiel KDR und Tie-2, den angiogenen Prozess, und sind somit involviert in die Unterstützung des Fortschreitens von Krebserkrankungen und anderen Erkrankungen, die eine unpassende Gefäßneubildung einschließen (zum Beispiel diabetische Retinopathie, choroidale Neovaskularisation aufgrund von altersbedingter Makuladegeneration, Psoriasis, Arthritis, frühzeitige Retinopathie, infantile Hämangiome).
  • Tyrosinkinasen können vom Rezeptortyp sein (mit extrazellulären Transmembran- und intrazellulären Domänen) oder vom nicht-Rezeptortyp (vollständig intrazellulär).
  • Rezeptortyrosinkinasen (RTKs). Die RTKs umfassen eine große Familie von Transmembranrezeptoren mit unterschiedlichen biologischen Aktivitäten. Bis jetzt wurden mindestens neunzehn (19) unterschiedliche RTK Unterfamilien identifiziert. Die Rezeptortyrosinkinase (RTK) Familie schließt Rezeptoren ein, die entscheidend sind für das Wachstum und für die Differenzierung einer Vielzahl von Zelltypen (Yarden und Ullrich, Ann. Rev. Biochem. 57:433–478, 1988; Ullrich und Schlessinger, Cell 61:243–254, 1990). Die intrinsische Funktion von RTKs wird nach Ligandenbindung aktiviert, was zu einer Phosphorylierung des Rezeptors und vielfacher zellulärer Substrate führt, und folglich zu einer Vielzahl von zellulären Reaktionen (Ullrich & Schlessinger, 1990, Cell 61:203–212). Somit wird die Rezeptortyrosinkinase-vermittelte Signaltransduktion durch zelluläre Wechselwirkung mit einem spezifischen Wachstumsfaktor (Ligand) initiiert, typischerweise gefolgt von Rezeptordimerisierung, Stimulierung der intrinsischen Proteintyrosinkinaseaktivität und der Rezeptortransphosphorylierung. Dabei werden Bindungsstellen erzeugt für intrazelluläre Signalübertragungsmoleküle, und sie führen zu der Bildung von Komplexen mit einem Spektrum von cytoplasmatischen Signalgebungsmolekülen, die die passende zelluläre Reaktion erleichtern (zum Beispiel Zellteilung, Differenzierung, metabolische Effekte, Änderungen in der extrazellulären Mikroumgebung) siehe Schlessinger und Ullrich, 1992, Neuron 9:1–20.
  • Proteine mit SH2 (src Homologie 2) oder Phosphotyrosinbindungs-(PTB)Domains binden aktivierte Tyrosinkinaserezeptoren und ihre Substrate mit hoher Affinität, um Signale in die Zelle weiterzuleiten. Beide Domains erkennen Phosphotyrosin (Fantl et al., 1992, Cell 69:413–423; Songyang et al., 1994, Mol. Cell. Biol. 14:2777–2785; Songyang et al., 1993, Cell 72:767–778; und Koch et al., 1991, Science 252:668–678; Shoelson, Curr. Opin. Chem. Biol. (1997), 1(2), 227–234; Cowburn, Curr. Opin. Struct. Biol. (1997), 7(6), 835–838). Verschiedene intrazelluläre Substratproteine, die sich mit Rezeptortyrosinkinasen (RTKs) verbinden, wurden identifiziert. Sie können unterteilt werden in zwei Hauptgruppen: (1) Substrate, welche eine katalytische Domain haben; und (2) Substrate, denen eine solche Domain fehlt, die aber als Adapter dienen und mit katalytisch aktiven Molekülen assoziieren (Songyang et al., 1993, Cell 72:767–778). Die Spezifität der Wechselwirkungen zwischen Rezeptoren oder Proteinen oder SH2 oder PTB Domains ihrer Substrate wird bestimmt durch die Aminosäurereste, die unmittelbar den phosphorylierten Tyrosinrest umgeben. Zum Beispiel korrelieren Unterschiede in den Bindungsaffinitäten zwischen SH2 Domains und den Aminosäuresequenzen, die die Phosphotyrosinreste auf speziellen Rezeptoren umgeben, mit den beobachteten Unterschieden in ihren Substratphosphorylierungsprofilen (Songyang et al., 1993, Cell 72:767–778). Beobachtungen schlagen vor, daß die Funktion von jeder Rezeptortyrosinkinase nicht nur durch ihr Expressionsmuster und ihre Ligandenverfügbarkeit bestimmt wird, sondern auch durch die Anordnung von stromabwärts-Signaltransduktionswegen, die durch einen speziellen Rezeptor aktiviert werden, ebenso wie durch das Timing und die Dauer dieser Stimuli. Somit liefert die Phosphorylierung einen wichtigen regulatorischen Schritt, welcher die Selektivität von signalgebenden Wegen bestimmt, die durch spezifische Wachstumsfaktorrezeptoren ausgelöst werden, ebenso wie Differenzierungsfaktorrezeptoren.
  • Von verschiedenen Rezeptortyrosinkinasen wie zum Beispiel FGFR-1, PDGFR, TIE-2 und c-Met und Wachstumsfaktoren, die daran binden, wurde vorgeschlagen, daß sie in der Angiogenese eine Rolle spielen, obwohl einige die Angiogenese indirekt fördern können (Mustonen und Alitalo, J. Cell Biol. 129:895–898, 1995). Eine solche Rezeptortyrosinkinase, bekannt als "fetale Leberkinase 1" (FLK-1) ist ein Mitglied der Typ III Unterklasse von RTKs. Eine alternative Bezeichnung für menschliches FLK-1 ist "Kinase insert Domain-enthaltender Rezeptor" (KDR) (Terman et al., Oncogene 6:1677–83, 1991). Eine andere alternative Bezeichnung für FLK-1/KDR ist "endothelialer Gefäßzellwachstumsfaktorrezeptor 2" (VEGFR-2), da er VEGF mit hoher Affinität bindet. Die murine Version von FLK-1/VEGFR-2 wurde auch NYK genannt (Oelrichs et al., Oncogene 8(1):11–15, 1993). DNAs, die Mäuse-, Ratten- und menschliches FLK-1 kodieren, wurden isoliert, und das Nukleotid und die kodierten Aminosäuresequenzen wurden bekannt gegeben (Matthews et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9026–30, 1991; Terman et al., 1991, supra; Terman et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 187:1579–86, 1992; Sarzani et al., supra; und Millauer et al., Cell 72:835–846, 1993). Vielzählige Studien wie zum Beispiel diejenigen, die in Millauer et al., oben, berichtet sind, schlagen vor, daß VEGF und FLK-1/KDR/VEGFR-2 ein Ligandenrezeptorpaar sind, das eine wichtige Rolle spielt in der Proliferation von endothelialen Gefäßzellen und der Bildung und Verteilung von Blutgefäßen, als Vaskulogenese bzw. Angiogenese bezeichnet.
  • Eine andere Typ III Unterklasse RTK bezeichnet als "fms-ähnliche Tyrosinkinase-1" (flt-1) ist verwandt mit FLK-1/KDR (DeVries et al., Science 255; 989–991, 1992; Shibuya et al., Oncogene 5:519–524, 1990). Eine alternative Bezeichnung für Flt-1 ist "endothelialer Gefäßzellwachstumsfaktorrezeptor 1" (VEGFR-1). Bis jetzt wurde herausgefunden, daß Mitglieder der FLK-1/KDR/VEGFR-2 und Flt-1/VEGFR-1 Unterfamilien primär auf Endothelialzellen exprimiert werden. Diese Unterklassenmitglieder werden spezifisch stimuliert durch Mitglieder der vaskulären Endothelzellwachstumsfaktor (VEGF) Familie von Liganden (Klagsburn und D'Amore, Cytokine & Growth Factor Reviews 7:259–270, 1996). Der vaskuläre Endothelzellwachstumsfaktor (VEGF) bindet an Flt-1 mit einer höheren Affinität als an FLK-1/KDR und ist mitogen gegenüber vaskulären Endothelzellen (Terman et al., 1992, oben; Mustonen et al., oben; DeVries et al., oben). Von Flt-1 wird geglaubt, daß es essentiell ist für die Endothelorganisation während der Gefäßentwicklung. Die Flt-1 Expression ist assoziiert mit der frühen Gefäßentwicklung in Mäuseembrios, und mit der Neovaskularisation während der Wundheilung (Mustonen und Alitalo, oben). Die Expression von Flt-1 in Monozyten, Osteoklasten, und Osteoblasten, ebenso wie in Geweben von Erwachsenen wie zum Beispiel Nierenglomeruli schlägt eine zusätzliche Funktion für diesen Rezeptor vor, die nicht auf das Zellwachstum bezogen ist (Mustonen und Alitalo, oben).
  • Wie zuvor angegeben schlagen jüngere Beweise vor, daß VEGF eine Rolle spielt in der Stimulation von sowohl normaler als auch pathologischer Angiogenese (Jakeman et al., Endocrinology 133:848–859, 1993; Kolch et al., Breast Cancer Research and Treatment 36:139–155, 1995; Ferrara et al., Endocrine Reviews 18 (1); 4–25, 1997; Ferrara et al., Regulation of Angiogenesis (ed. L. D. Goldberg und E. M. Rosen), 209–232, 1997). Zusätzlich wurde VEGF mit der Kontrolle und der Verstärkung von vaskulärer Permeabilität in Zusammenhang gebracht (Connolly, et al., J. Biol. Chem. 264:20017–20024, 1989; Brown et al., Regulation of Angiogenesis (ed. L. D. Goldberg und E. M. Rosen), 233–269, 1997). Verschiedene Formen von VEGF, entstehend aus alternativem Splicing der mRNA wurden berichtet, einschließlich der vier Spezies, die von Ferrara et al., beschrieben sind (J. Cell. Biochem. 47:211–218, 1991). Beide sezernierten und vorwiegend Zell-assoziierten Spezies von VEGF wurden durch Ferrara et al., oben, identifiziert, und das Protein ist dafür bekannt, daß es in der Form von Disulfid verknüpften Dimeren existiert.
  • Verschiedene verwandte Homologe von VEGF wurden in jüngster Zeit identifiziert. Jedoch wurden ihre Rollen in normalen physiologischen und Krankheitsprozessen noch nicht beleuchtet. Zusätzlich werden die Mitglieder der VEGF Familie oft mit VEGF in einer Vielzahl von Geweben koexprimiert und sind im allgemeinen in der Lage Heterodimere mit VEGF zu bilden. Diese Eigenschaft verändert wahrscheinlich die Rezeptorspezifität und die biologischen Effekte der Heterodimere und erschwert weiterhin die Beleuchtung ihrer spezifischen Funktionen, wie unten veranschaulicht (Korpelainen und Alitalo, Curr. Opin. Cell Biol., 159–164, 1998 und darin zitierte Referenzen).
  • Der Plazentawachstumsfaktor (PlGF) hat eine Aminosäuresequenz, die signifikante Homologie zeigt zu der VEGF Sequenz (Park et al., J. Biol. Chem. 269-25646–54, 1994; Maglione et al., Oncogene 8:925–31, 1993). Wie bei VEGF, entstehen unterschiedliche Spezies von PlGF aus alternativem Splicing der mRNA, und das Protein existiert in dimerer Form (Park et al., oben). PlGF-1 und PlGF-2 binden an Flt-1 mit hoher Affinität, und PlGF-2 bindet auch eifrig an Neuropilin-1 (Migdal et al., J. Biol. Chem. 273 (35):22272–22278), bindet aber nicht an FLK-1/KDR (Park et al., oben). Es wurde berichtet, daß PlGF sowohl die vaskuläre Permeabilität als auch den mitogenen Effekt von VEGF auf Endothelialzellen verstärkt, wenn VEGF in niedrigen Konzentrationen vorhanden ist (wie man sagt, aufgrund von Heterodimerbildung) (Park et al., oben).
  • VEGF-B wird als zwei Isoformen (167 und 185 Reste) produziert, die auch an Flt-1/VEGFR-1 zu binden scheinen. Es könnte eine Rolle spielen in der Regulation von extrazellulärer Matrixdegradation, Zelladhesion, und Migration durch Modulierung der Expression und der Aktivität von Urokinasetyp Plasminogenaktivator und Plasminogenaktivatorinhibitor 1 (Pepper et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (1998), 95(20): 11709–11714).
  • VEGF-C wurde ursprünglich als ein Ligand für VEGF-3/Flt-4 kloniert, welches primär durch lymphatische Endothelialzellen exprimiert wird. In seiner vollständig verarbeiteten Form kann VEGF-C auch KDR/VEGFR-2 binden und die Proliferation und die Migration von Endothelialzellen in vitro und die Angiogenese in in vivo Modellen stimulieren (Lymboussaki et al., Am. J. Pathol. (1998), 153(2):395–403; Witzenbichler et al., Am. J. Pathol. (1998), 153(2), 381–394). Die transgene Überexpression von VEGF-C bewirkt die Proliferation und die Vergrößerung nur von lymphatischen Gefäßen, wobei Blutgefäße unberührt bleiben. Im Gegensatz zu VEGF wird die Expression von VEGF-C nicht durch Hypoxie induziert (Ristimaki et al., J. Biol. Chem. (1998), 273 (14), 8413–8418).
  • Das in aller jüngster Zeit entdeckte VEGF-D ist strukturell sehr ähnlich zu VEGF-C. Von VEGF-D wird berichtet, daß es an mindestens zwei VEGFs, VEGF-3/Flt-4 und KDR/VEGFR-2 bindet und sie aktiviert. Es wurde ursprünglich kloniert als ein c-fos induzierbares Mitogen für Fibroblasten und es wird vorwiegend in den Mesenchymalzellen der Lunge und der Haut exprimiert (Achen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (1998), 95(2), 548–553 und Referenzen darin).
  • Wie für VEGF, wurde für VEGF-C und VEGF-D beansprucht, daß sie in einem Miles Assay Anstiege in der vaskulären Permeabilität in vivo induzieren, wenn in kutanes Gewebe injiziert ( PCT/US97/14696 ; WO98/07832 , Witzenbichler et al., oben). Die physiologische Rolle und die Signifikanz dieser Liganden in der Modulierung der vaskulären Hyperpermeabilität und der Endothelreaktionen in Geweben, wo sie exprimiert werden, bleibt ungewiss.
  • Es wurde jüngst von einem viral kondierten, neuen Typ von vaskulärem Endothelwachstumsfaktor, VEGF-E (NZ-7 VEGF) berichtet, welcher vorzugsweise den KDR-Flk-1 Rezeptor verwendet und eine potente mitotische Aktivität trägt, ohne Heparinbindende Domain (Meyer et al., EMBO J. (1999), 18(2), 363–374; Ogawa et al., J. Biol. Chem. (1998), 273(47), 31273–31282).
  • VEGF-E Sequenzen besitzen 25% Homologie zu Säugetier VEGF und werden durch das Parapoxvirus Orf Virus (OV) kodiert. Dieses Parapoxvirus, das Schafe und Ziegen und gelegentlich Menschen befüllt, erzeugt Läsionen mit Angiogenese. VEGF-E ist ein Dimer von ungefähr 20 kDa mit weder einer basischen Domain noch mit Affinität für Heparin, aber es hat das charakteristische Cysteinknotenmotiv, das in allen Säugetier VEGFs vorhanden ist, und es wurde überraschend herausgefunden, daß Wirksamkeit und Bioaktivitäten besitzt, ähnlich zu der Heparin-bindenden VEGF165 Isoform von VEGF-A, d. h. beide Faktoren stimulieren die Freistezung von Gewebefaktor (TF), die Proliferation, die Chemotaxe und das Wachsen von kultivierten Endothelgefäßzellen in vitro und die Angiogenese in vivo. Wie VEGF165 wurde von VEGF-E herausgefunden, daß es mit hoher Affinität an den VEGF Rezeptor-2 (KDR) bindet, was zu der Rezeptorautophosphorylierung und einem zweiphasigen Anstieg in freien intrazellulären Cal+ Konzentrationen führt, während im Gegensatz zu VEGF165, VEGF-E nicht an VEGF Rezeptor-1 (Flt-1) band.
  • Basierend auf hervorkommenden Entdeckungen anderer Homologe von VEGF und VEGFRs und den vorhergehenden für Liganden und Rezeptorheterodimerisierung, können die Wirkungen von solchen VEGF Homologen die Bildung von VEGF Ligandenheterodimeren einschließen, und/oder die Heterodimerisierung von Rezeptoren, oder die Bindung an ein noch unentdecktes VEGFR (Witzenbichler et al., oben). Auch schlagen jüngere Berichte Neuropilin-1 (Migdal et al., oben) oder VEGFR-3/Flt-4 (Witzenbichler et al., oben) oder andere Rezeptoren als KDR/VEGFR-2 vor, welche in die Induktion von Gefäßpermeabilität involviert sein können (Stacker, S. A., Vitali, A., Domagala, T., Nice, E., und Wilks, A. E., "Angiogenesis and Cancer" Conference, Amer. Assoc. Cancer Res., Jan. 1998, Orlando, FL; Williams, Diabetelogia 40: S118–120 (1997)). Bis jetzt wurde kein direkter Beweis für die wesentliche Rolle von KDR in VEGF-vermittelter vaskulärer Hyperpermeabilität offenbart.
  • Die Nicht-Rezeptortyrosinkinasen. Die Nicht-Rezeptortyrosinkinasen stellen eine Sammlung von zellulären Enzymen dar, denen extrazelluläre und Transmembransequenzen fehlen. Derzeit wurden über vierundzwanzig einzelne Nicht-Rezeptortyrosinkinasen, umfassend elf (11) Unterfamilien (Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack und LIMK), identifiziert. Bis jetzt setzt sich die Src Unterfamilie der Nicht-Rezeptortyrosinkinasen zusammen aus der größten Anzahl von PTKs und sie schließt Src, Yes, Fyn, Lyn, Lck, Blk, Hck, Fgr und Yrk ein. Die Src Unterfamilie von Enzymen wurde mit der Onkogenese und Immunreaktionen verbunden. Eine ausführlichere Diskussion von Nicht-Rezeptortyrosinkinasen wird bereitgestellt in Bolen, 1993, Oncogene 8:2025–2031, welches hierin durch die Bezugnahme eingeschlossen ist.
  • Von vielen der Tyrosinkinasen, ob eine RTK oder Nicht-Rezeptortyrosinkinase, wurde herausgefunden, daß sie in zelluläre Signal-gebende Wege involviert sind, die in vielzählige pathogene Zustände involviert sind, einschließlich Krebs, Psoriasis, und andere hyperproliferative Erkrankungen oder Hyper-Immunreaktionen.
  • Entwicklung von Verbindungen zur Modulierung der PTKs. Hinsichtlich der vermuteten Wichtigkeit der PTKs in der Kontrolle, Regulierung und Modulation von Zellproliferation den Krankheiten und Störungen, die mit abnormaler Zellproliferation assoziiert sind, wurden viele Versuche unternommen, um Rezeptor und Nicht-Rezeptortyrosinkinase "Inhibitoren" zu identifizieren unter Verwendung einer Vielzahl von Herangehensweisen, einschließlich der Verwendung von Mutantenliganden ( U. S. Anmeldung Nr. 4,966,849 ), löslichen Rezeptoren und Antikörpern (Anmeldung Nr. WO 94/102002 ; Kendall & Thomas, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci 90: 10705-09; Kim et al., 1993, Nature 362:841–844), RNA Liganden (Jellinek, et al., Biochemistry 33:10450–56; Takano, et al., 1993, Mol. Bio. Cell 4:358A; Kinsella, et al. 1992, Exp. Cell Res. 199:56–61; Wright, et al., 1992, J. Cellular Phys. 152:448–57) und Tyrosinkinaseinhibitoren ( WO 94/03427 ; WO 92/21660 ; WO 91/15495 ; WO 94/14808 ; U.S. Patent Nr. 5; Mariani, et al., 1994, Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 35:2268).
  • In jüngerer Zeit wurden Versuche unternommen kleine Moleküle zu identifizieren, die als Tyrosinkinaseinhibitoren wirken. Zum Beispiel wurden bis-monocyclische, bicyclische oder heterocyclische Arylverbindungen (PCT WO 92/20642 ) und Vinylen-Azaindolderivate (PCT WO 94/14808 ) allgemein als Tyrosinkinaseinhibitoren beschrieben. Styrylverbindungen ( U.S. Patent Nr. 5,217,999 ); Styryl-substituierte Pyridylverbindungen ( U.S. Patent Nr. 5,302,606 ), bestimmte Chinazolinderivate ( EP Anmeldung Nr. 0 566 266 A1 ; Expert Opin. Ther. Pat. (1998), 8 (4): 475–478), Selenoindole und Selenide (PCT WO 94/03427 ), tricyclische Polyhydroxylverbindungen (PCT WO 92/21660 ) und Benzylphosphonsäureverbindungen (PCT WO 91/15495 ) wurden als Verbindungen zur Verwendung als Tyrosinkinaseinhibitoren für die Verwendung in der Behandlung von Krebs beschrieben. Anilinocinnoline (PCT WO 97/34876 ) und Chinazolinderivatverbindungen (PCT WO 97/22596 ; PCT WO 97/42187 ) wurden als Inhibitoren der Angiogenese und der Gefäßpermeabilität beschrieben.
  • Zusätzlich wurden Versuche unternommen kleine Moleküle zu identifizieren, welche als Serin/Threoninkinaseinhibitoren wirken. Zum Beispiel wurden bis(Indolylmaleimid) Verbindungen beschrieben als bestimmte PKC Serin/Threoninkinaseisoformen hemmend, deren Signal übermittelnde Funktion mit einer veränderten vaskulären Permeabilität in VEGF-verwandten Erkrankungen assoziiert ist (PCT WO 97/40830 ; PCT WO 97/40831 ).
  • Plk-1 Kinaseinhibitoren
  • Plk-1 ist eine Serin/Threoninkinase, welche ein wichtiger Regulator des Fortschreitens des Zellzyklus ist. Sie spielt entscheidende Rollen in dem Zusammenbau und der dynamischen Funktion des mitotischen Spindelapparats. Plk-1 und verwandte Kinasen haben auch gezeigt, daß sie eng in die Aktivierung und Inaktivierung von anderen Zellcyclusregulatoren, wie zum Beispiel Cyclin-abhängigen Kinasen, involviert sind. Hohe Spiegel von Plk-1 Expression sind mit Zellproliferationsaktivitäten assoziiert. Sie wird oft in malignen Tumoren verschiedener Ursprünge gefunden. Von Inhibitoren der Plk-1 wird erwartet, daß sie die Krebszellproliferation blockieren durch Unterbrechen von Prozessen, die mitotische Spindeln einschließen und unpassend aktivierte Cyclin-abhängige Kinasen.
  • Cdc2/Cyclin B Kinaseinhibitoren (Cdc2 ist auch bekannt als cdk1) Cdc2/Cyclin B ist ein anderes Serin/Threoninkinaseenzym, welches zu der Cyclin-abhängigen Kinase (cdks) Familie gehört. Diese Enzyme sind in den kritischen Übergang zwischen verschiedenen Phasen des Fortschreitens des Zellcyclus involviert. Es wird geglaubt, daß eine unkontrollierte Zellproliferation, welche eine Kennzeichen von Krebs ist, abhängig ist von erhöhten cdk Aktivitäten in diesen Zellen. Die Hemmung von erhöhten cdk Aktivitäten in Krebszellen durch cdc2/Cyclin B Kinaseinhibitoren könnte die Proliferation unterdrücken und die normale Kontrolle des Fortschreitens des Zellcyclus wieder herstellen.
  • Die Identifikation von wirksamen kleinen Verbindungen, welche spezifisch die Signaltransduktion und die zelluläre Proliferation hemmen in dem sie die Aktivität von Rezeptor und Nicht-Rezeptortyrosin und Serin/Threoninkinasen modulieren, um abnormale oder unpassende Zellproliferation, Differenzierung oder Metabolismus zu regulieren und zu modulieren, ist daher wünschenswert. Insbesondere wäre die Identifikation von Verfahren und Verbindungen nützlich, die spezifisch die Funktion einer Tyrosinkinase hemmen, welche essentiell ist für antiogene Prozesse oder die Bildung von vaskulärer Hyperpermeabilitätm, was zu Ödem, Aszites, Effusionen, Exsudaten und makromolekularer Extravasation und Matrixdeposition ebenso wie damit assoziierten Erkrankungen führt.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Verbindung der Formel (I), die racemisch-diastereomeren Mischungen, optischen Isomere oder pharmazeutisch verträglichen Salze davon bereit,
    Figure 00110001
    worin R1
    Figure 00120001
    ist;
    Z100 ist ein wahlweise substituiertes Phenyl,
    worin Z100 wahlweise mit einem oder mehreren Substituenten substituiert ist, jeweils unabhängig gewählt aus der Gruppe bestehend aus F, Cl, CN, NO2, wahlweise substituiertem Alkyl, -O- (wahlweise substituiertem Alkyl), -C(O)H, -CONH2, -NHSO2CF3, wahlweise substituiertem Heteroaryl, COOH, -Z105-C(O)N(R)2, -Z105-N (R) -C(O)-Z200, -Z105–N(R)-S(O)2-Z200 und -Z105-N(R)-C(O)-N(R)-Z200;
    Z105 ist eine kovalente Bindung oder (C1-C6);
    Z200 ist eine wahlweise substituierte Gruppe gewählt aus der Gruppe bestehend aus (C1-C6), Phenyl und -(C1-C6)-Phenyl;
    Z110 und Z111 sind jeweils eine kovalente Bindung und
    A ist O;
    Ra ist Wasserstoff;
    R3 ist H;
    R2 ist -Z101-Z102;
    Z101 ist eine kovalente Bindung,
    Z102 ist eine substituierte oder unsubstituierte Cycloalkylgruppe.
  • Die Verbindungen dieser Erfindung sind nützlich als Inhibioren von Serin/Threonin und Tyrosinkinasen. Insbesondere sind Verbindungen dieser Erfindung nützlich als Inhibitoren von Tyrosinkinasen, die wichtig sind in hyperproliferativen Erkrankungen, insbesondere in Krebs und in dem Prozess der Angiogenese. Zum Beispiel sind bestimmte dieser Verbindungen Inhibitoren von solchen Rezeptorkinasen wie KDR, Flt-1, FGFR, PDGFR, c-Met, TIE-2 oder IGF-1-R.
  • Bestimmte Verbindungen der Erfindung sind wirksam als Inhibitoren von Serin/Threoninkinasen.
  • Zusätzlich sind bestimmte Verbindungen wirksame Inhibitoren von Nicht-Rezeptorkinasen, wie zum Beispiel denjenigen der Src (zum Beispiel Ick, blk und lyn) Familie.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit zur Hemmung der Kinaseaktivität von Tyrosinkinasen und Serin/Threoninkinasen umfassend das Verabreichen einer Verbindung, die durch Formel I dargestellt ist, an die Kinase in ausreichender Konzentration, um die Enzymaktivität der Kinase zu hemmen.
  • Die vorliegende Erfindung schließt weiter die Verwendung dieser Verbindungen in pharmazeutischen Zusammensetzungen mit einer pharmazeutisch wirksamen Menge der oben beschriebenen Verbindungen und einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Bindemittel ein.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Das Fortschreiten durch den eukaryotischen Zellcyclus wird gesteuert durch eine Familie von Kinasen, bezeichnet als Cyclinabhängige Kinasen (CDKs) (Myerson et al., EMBO Journal, 11:2909–2917 (1992)). Die Regulierung der CDK Aktivierung ist komplex, erfordert aber die Assoziierung der CDK mit einem Mitglied der Cyclinfamilie der regulatorischen Untereinheiten (Draetta, Trends in Cell Biology, 3:287–289 (1993)); Murray und Kirschner, Nature, 339:275–280 (1989); Solomon et al., Molecular Biology of the Cell, 3:13–27 (1992)). Ein weiterer Spiegel der Regulation tritt auf durch sowohl die Aktivierung als auch die Inaktivierung von Phosphorylierungen der CDK Untereinheit (Draetta, Trends in Cell Biology, 3:287–289 (1993)); Murray und Kirschner, Nature, 339:275–280 (1989); Solomon et al., Molecular Biology of the Cell, 3:13–27 (1992); Ducommun et al., EMBO Journal, 10:3311–3319 (1991); Gautier et al., Nature 339:626– 629 (1989); Gould und Nurse, Nature, 342:39–45 (1989); Krek und Nigg, EMBO Journal, 10:3331–3341 (1991); Solomon et al., Cell, 63:1013–1024 (1990)). Die koordinierte Aktivierung und Inaktivierung von verschiedenen Cyclin/CDK Komplexen ist notwendig für ein normales Fortschreiten durch den Zellcyclus (eines, Trends in Biochemical Sciences, 18:195–197 (1993); Sherr, Cell, 73:1059–1065 (1993)). Sowohl die entscheidenden G1-S als auch G2-M Übergänge werden gesteuert durch die Aktivierung von verschiedenen Cyclin/CDK Aktivitäten. In G1 wird sowohl von Cyclin D/CDK4 als auch Cyclin E/CDK2 geglaubt, daß sie den Beginn der S-Phase vermitteln (Matsushima et al., Molecular & Cellular Biology, 14:2066–2076 (1994); Ohtsubo und Roberts, Science, 259:1908–1912 (1993); Quelle et al., Genes & Development, 7:1559–1571 (1993); Tesnitzky et al., Molecular & Cellular Biology, 14:1669–1679 (1994)). Das Fortschreiten durch die S-Phase erfordert die Aktivität von Cyclin A/CDK2 (Girard et al., Cell, 67:1169–1179 (1991), Pagano et al., EMBO Journal, 11:961–971 (1992); Rosenblatt et al., Proceedings of the National Academy of Science USA, 89:2824–2828 (1992); Walker und Maller, Nature, 354:314–317 (1991); Zindy et al., Biochemical & Biophysical Research Communications, 182:1144–1154 (1992)), wohingegen die Aktivierung von Cyclin A/cdc2 (CDK1) und Cyclin B/cdc2 für den Beginn der Metaphase erforderlich sind (Draetta, Trends in Cell Biology, 3:287–289 (1993)); Murray und Kirschner, Nature, 339:275–280 (1989); Solomon et al., Molecular Biology of the Cell, 3:13–27 (1992); Girard et al., Cell, 67:1169–1179 (1991); Pagano et al., EMBO Journal, 11:961–971 (1992); Rosenblatt et al., Proceedings of the National Academy of Science USA, 89:2824–2828 (1992); Walker und Maller, Nature, 354:314–317 (1991); Zindy et al., Biochemical & Biophysical Research Communications, 182:1144–1154 (1992)). Es ist daher nicht überraschend daß der Verlust der Kontrolle der CDK Regulierung ein häufiges Ereignis in hyperproliferativen Erkrankungen und Krebs ist. (eines, Current Opinion in Cell Biology, 4:144–148 (1992); Lees, Current Opinion in Cell Biology, 7:773–780 (1995); Hunter und Pines, Cell, 79:573–582 (1994)). Die selektive Hemmung der CDKs ist deshalb ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
  • In einer Untergruppe der Verbindungen der Formel (I), ist
    R3 H;
    R2 ist Cyclopentyl; und
    R1 ist
    Figure 00150001
  • In einer anderen Untergruppe der Verbindungen der Formel (I), ist Z110 eine kovalente Bindung, A ist O; und Z100 ist wahlweise substituiertes Phenyl, worin Z100 wahlweise substituiert ist mit einem oder mehreren Substituenten, jeweils unabhängig gewählt aus der Gruppe bestehend aus F, COOH, NO2, Ome, -COOMe, OCF3 und CF3.
  • In einer anderen Untergruppe von Verbindungen der Formel (I), ist Z110 eine kovalente Bindung, A ist -O-,
    Z100 ist ein wahlweise substituiertes Phenyl,
    worin Z100 wahlweise substituiert ist mit einem oder mehreren Substituenten gewählt aus der Gruppe bestehend aus Alkyl, Alkoxy, Halo, Hydroxy und Alkoxycarbonyl.
  • In einer anderen Untergruppe der Verbindungen der Formel (I), ist R2 eine wahlweise substituierte Gruppe, gewählt aus der Gruppe bestehend aus Cyclobutyl und Cyclohexyl.
  • In einer anderen Untergruppe der Verbindungen der Formel (I), ist R2 wahlweise substituiert mit einem oder mehreren Substituenten gewählt aus der Gruppe bestehend aus Hydroxy, Alkyl, Hydroxyalkyl, Carboxyalkyl und Phenylalkoxyalkyl.
  • In einer anderen Untergruppe der Verbindungen der Formel (I) ist R1 4-Phenoxyphenyl.
  • Eine Untergruppe der Verbindungen der Formel (I) hat R1 = 4-Phenoxyphenyl, R2 = Cyclopentyl und beide R3 = H.
  • Verbindungen der Formel I können als Salze mit pharmazeutisch verträglichen Säuren existieren. Die vorliegende Erfindung schließt solche Salze ein. Beispiele für solche Salze schließen Hydrochloride, Hydrobromide, Sulfate, Methansulfonate, Nitrate, Maleate, Acetate, Citrate, Fumarate, Tartrate [zum Beispiel (+)-Tartrate, (–)-Tartrate oder Mischungen daraus, einschließlich racemischen Mischungen], Succinate, Benzoate und Salze mit Aminosäure, wie zum Beispiel Glutaminsäure ein. Diese Salze können durch Verfahren hergestellt werden, die denjenigen, die im Fachgebiet bewandert sind, bekannt sind.
  • Bestimmte Verbindungen der Formel I, welche saure Substituenten haben, können als Salze mit pharmazeutisch verträglichen Basen existieren. Die vorliegende Erfindung schließt solche Salze ein. Beispiele für solche Salze schließen Natriumsalze, Kaliumsalze, Lysinsalze und Argininsalze ein. Diese Salze können durch Verfahren hergestellt werden, die denjenigen, die im Fachgebiet bewandert sind, bekannt sind.
  • Bestimmte Verbindungen der Formel I und ihre Salze können in mehr als einer Kristallform existieren und die vorliegende Erfindung schließt jede Kristallform und Mischungen daraus ein.
  • Bestimmte Verbindungen der Formel I und ihre Salze können auch in der Form von Solvaten, zum Beispiel Hydraten, existieren und die vorliegende Erfindung schließt jedes Solvat und Mischungen ein.
  • Bestimmte Verbindungen der Formel I können eines oder mehrere chirale Zentren enthalten und in unterschiedlichen optisch aktiven Formen existieren. Wenn Verbindungen der Formel I ein chirales Zentrum enthalten, existieren die Verbindungen in zwei enantiomeren Formen und die vorliegende Erfindung schließt beide Enantiomere und Mischungen aus Enantiomeren, wie zum Beispiel racemische Mischungen ein. Die Enantiomere können durch Verfahren getrennt werden, die denjenigen, die im Fachgebiet bewandert sind, bekannt sind, zum Beispiel durch Bildung von diastereoisomeren Salzen, welche getrennt werden können, zum Beispiel durch Kristallisation; Bildung von diastereoisomeren Derivaten oder Komplexen, welche zum Beispiel getrennt werden können, durch Kristallisation, Gas-flüssig oder Flüssigchromatographie; selektive Reaktion von einem Enantiomer mit einem Enantiomer-spezifischen Reagenz, zum Beispiel enzymatischer Veresterung; oder Gas-flüssig oder Flüssigchromatographie in einer chiralen Umgebung, zum Beispiel auf einem chiralen Träger zum Beispiel Siliziumdioxid mit einem gebundenen chiralen Liganden oder in der Anwesenheit eines chiralen Lösungsmittels. Es wird anerkannt werden, daß, wo das gewünschte Enantiomer in eine andere chemische Einheit durch eine der oben beschriebenen Separationsverfahren umgewandelt wird, ein weiterer Schritt erforderlich ist, um die gewünschte enantiomere Form freizusetzen. Alternativ können spezifische Enantiomere durch asymmetrische Synthese unter Verwendung von optisch aktiven Reagenzien, Substraten, Katalysatoren oder Lösungsmitteln synthetisiert werden, oder durch Umwandeln eines Enantiomers in das Andere durch asymmetrische Transformation.
  • Wenn eine Verbindung der Formel I mehr als ein chirales Zentrum enthält, kann sie in diastereoisomeren Formen existieren. Die diastereoisomeren Paare können durch Verfahren getrennt werden, die denjenigen, die im Fachgebiet bewandert sind, bekannt sind, zum Beispiel durch Chromatographie oder Kristallisation und die einzelnen Enantiomere innerhalb jedes Paares können wie oben beschrieben getrennt werden. Die vorliegende Erfindung schließt jedes Diastereoisomer der Verbindungen der Formel I und Mischungen daraus ein.
  • Bestimmte Verbindungen der Formel I können in verschiedenen tautomeren Formen oder als unterschiedliche geometrische Isomere existieren, und die vorliegende Erfindung schließt jedes Tautomer und/oder geometrisches Isomer der Verbindungen der Formel I und Mischungen daraus ein.
  • Bestimmte Verbindungen der Formel I können in verschiedenen stabilen Konformationsformen existieren, welche trennbar sein können. Torsionsasymmetrie aufgrund von behinderter Rotation um eine asymmetrische Einzelbindung, zum Beispiel aufgrund von sterischer Hemmung oder Ringfesthaltung kann eine Trennung von verschiedenen Konformeren erlauben. Die vorliegende Erfindung schließt jedes Konformationsisomer der Verbindungen der Formel I und Mischungen daraus ein.
  • Bestimmte Verbindungen der Formel I können in zwitterionischer Form existieren und die vorliegende Erfindung schließt jede zwitterionische Form der Verbindungen der Formel I und Mischungen davon ein. Heteroaromatische Gruppen, wie hierin verwendet, schließen Heteroarylringsysteme ein (zum Beispiel als beispielhafte Darstellung, was nicht als den Schutzumfang dieser Erfindung einschränkend ausgelegt werden sollte: Thienyl, Pyridyl, Pyrazol, Isoxazolyl, Thiadiazolyl, Oxadiazolyl, Indazolyl, Furane, Pyrrole, Imidazole, Pyrazole, Triazole, Pyrimidine, Pyrazine, Thiazole, Isothiazole, Oxazolyl oder Tetrazole) und Heteroarylringsysteme in welchen ein carbocyclischer aromatischer Ring, carbocyclischer nicht aromatischer Ring oder Heteroarylring an einen oder mehrere andere Heteroarylringe fusioniert ist (zum Beispiel für die Zwecke der beispielhaften Darstellung, welche nicht als den Schutzumfang dieser Erfindung einschränkend ausgelegt werden sollen: Benzo(b)thienyl, Benzimidazolyl, Benzoxazolyl, Benzothiazolyl, Benzothiadiazolyl, Benzoxadiazolyl, Indol, Tetrahydroindol, Azaindol, Indazol, Chinolin, Imidazopyridin, Chinazolinpurin, Pyrrolo[2,3-b]pyrimidin, Pyrazolo[3,4-d] pyrimidin) und ihre N-Oxide. Substituierte Heteroarylgruppen sind vorzugsweise mit einem oder mehreren Substituenten substituiert, jeweils unabhängig gewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Halogen, Hydroxy, Alkyl, Alkoxy, Alkyl-O-C(O)-, Alkoxyalkyl, einer Heterocycloalkylgruppe, wahlweise substituiertem Phenyl, Nitro, Amino, mono-substituiertem Amino oder di-substituiertem Amino.
  • Wie hierin verwendet sind viele Einheiten oder Substituenten als entweder "substituiert oder unsubstituiert" oder "wahlweise substituiert" bezeichnet. Wenn eine Einheit durch einen dieser Ausdrücke modifiziert ist, bezeichnet es, daß irgendein Teil der Einheit, der einen Fachmann als für die Substitution verfügbar bekannt ist, substituiert sein kann, was einen oder mehrere Substituenten einschließt, wobei, wenn mehr als ein Substituent vorhanden ist, dann ist jeder Substituent unabhängig gewählt. Solche Mittel für die Substitution sind im Fachgebiet wohl bekannt und/oder werden durch die hiesige Offenbarung gelehrt. Für die Zwecke der beispielhaften Darstellung, welche nicht als den Schutzumfang dieser Erfindung einschränkend ausgelegt werden sollten, sind einige Beispiele für Gruppen, die Substituenten sind, folgende: Alkylgruppen (welche selbst auch substituiert sein können, wie zum Beispiel CF3), eine Alkoxygruppe (welche selbst substituiert sein kann, wie zum Beispiel OCF3), eine Halogen oder Halogruppe (F, Cl, Br, I), Hydroxy, Nitro, Oxo, CN, COH, COOH, Amino, N-Alkylamino oder N,N-Dialkylamino (in welchen die Alkylgruppen auch substituiert sein können), Ester (-C(O)-OR, worin R Gruppen darstellt, wie zum Beispiel Alkyl, Aryl, etc., welche substituiert sein können), Aryl (am bevorzugtesten ist Phenyl, welches substituiert sein kann) und Arylalkyl (welches substituiert sein kann).
  • Tie-2 (TEK) ist ein Mitglied einer jüngst entdeckten Familie von Endothelzell-spezifischen Rezeptortyrosinkinasen, welcher in entscheidende angiogene Prozesse involviert ist, wie zum Beispiel Gefäßverzweigung, Verteilung, Umbau, Reifung und Stabilität. Tie-2 ist die erste Säugetierrezeptortyrosinkinase für welche sowohl Agonistenligand(en) (zum Beispiel Angiopoietin1 ("Ang1"), welches die Rezeptorautophosphorylierung und die Signalübertragung stimuliert) als auch Antagonistenligand(en) (zum Beispiel Angiopoietin1 ("Ang2")) identifiziert wurden. Knock-out und transgene Manipulation der Expression von Tie-2 und seinen Liganden zeigt, daß eine enge räumliche und zeitliche Kontrolle der Tie-2 Signalgebung essentiell ist für die richtige Entwicklung eines neuen Gefäßsystems. Das derzeitige Modell schlägt vor, daß die Stimulation von Tie-2 Kinase durch den Ang1 Liganden direkt involviert ist, in die Verzweigung, das Wachstum und den Überwuchs von neuen Gefäßen, und die Einberufung und Wechselwirkung von Periendothelialunterstützungszellen, die wichtig sind bei der Aufrechterhaltung der Gefäßintegrität und der Induktion der Stilllegung. Die Abwesenheit von Ang1 Stimulation von Tie-2 oder die Hemmung von Tie-2 Autophosphorylierung durch Ang2, welches in hohen Spiegeln an Stellen des Gefäßrückgangs produziert wird, kann zu einem Verlust in der Gefäßsturktur und den Matrixkontakten führen, was zum Endothelzelltod führt, insbesondere in der Abwesenheit von Wachstums/Überlebensstimuli. Die Situation ist jedoch komplexer, da kürzlich von zwei zusätzlichen Tie-2 Liganden (Ang3 und Ang4) berichtet wurde, und die Kapazität für die Heterooligomerisierung der verschiedenen agonistischen und antagonistischen Angiopoietine, wodurch ihre Aktivität modifiziert wird, wurde gezeigt. Das Targeting von Tie-2 Liganden-Rezeptorwechselwirkungen als ein angiogenes therapeutisches Ziel wird somit weniger bevorzugt und eine Kinase hemmende Strategie wird bevorzugt.
  • Die lösliche extrazelluläre Domain von Tie-2 ("ExTek") kann so wirken, daß die Erstellung eines Tumorgefäßsystems in einem Brusttumorheterotransplantat und Lungenmetastasemodellen und in Tumorzell-vermittelten okularen Gefäßneubildungen unterbrochen wird. Durch adenovirale Infektion kann die in vivo Produktion von mg/ml Spiegeln ExTek in Nagetieren für 7–10 Tage ohne nachteilige Nebenwirkungen erzielt werden. Diese Ergebnisse schlagen vor, daß die Unterbrechung von Tie-2 Signalgebungswegen in normalen gesunden Tieren gut toleriert werden kann. Diese Tie-2 hemmenden Reaktionen auf ExTek können eine Folgesequestration von Liganden) und/oder die Erzeugung eines nicht produktiven Heterodimers mit Volllängen Tie-2 sein.
  • Die Verbindungen dieser Erfindung haben hemmende Wirksamkeit gegen Proteinkinasen. D. h., diese Verbindungen modulieren die Signalübertragung durch Proteinkinasen. Verbindungen dieser Erfindung hemmen Proteinkinasen von Serin/Threonin und Tyrosinkinaseklassen. Insbesondere hemmend diese Verbindungen selektiv die Aktivität der KDRFLK-1/VEGFR-2 Tyrosinkinasen. Bestimmte Verbindungen dieser Erfindung hemmen auch die Aktivität von zusätzlichen Tyrosinkinasen wie zum Beispiel Flt-1/VEGFR-1, Flt-4/VEGFR-3, Tie-1, Tie-2, FGFR, PDGFR, IGF-1R, c-Met, Src-Unterfamilienkinasen, wie zum Beispiel Lck, hck, fgr, Src, fyn, yes etc. Zusätzlich hemmen einige Verbindungen dieser Erfindung signifikant Serin/Threoninkinasen, wie zum Beispiel PKC, MAP Kinasen, erk, CDKs, Plk-1, oder Raf-1, welche eine wesentliche Rolle spielen in der Zellproliferation und dem Fortschreiten des Zellcyclus. Die Wirksamkeit und Spezifität der allgemeinen Verbindungen dieser Erfindung gegenüber einer speziellen Proteinkinase kann oft verändert und optimiert werden durch Variationen in der Natur, der Anzahl und der Anordnung der Substituenten (d. h. R1, R2, R3, A und Ring 1) und Konformationsbeschränkungen. Zusätzlich können die Metaboliten von bestimmten Verbindungen auch signifikante Proteinkinase hemmende Aktivität haben.
  • Die Verbindungen dieser Erfindung wirken, wie geglaubt wird, durch Hemmen der Aktivität von KDR Tyrosinkinase, welche in den Prozess der Gefäßhyperpermeabilität und der Ödembildung involviert ist. Die KDR Tyrosinkinase kann auch als FLK-1 Tyrosinkinase, NYK Tyrosinkinase oder VEGFR-2 Tyrosinkinase bezeichnet werden. KDR Tyrosinkinase wird aktiviert, wenn Gefäßendothelzellwachstumsfaktor (VEGF) oder ein anderer aktivierender Ligand (wie zum Beispiel VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E oder HIV Tat Protein) an einen KDR Tyrosinkinaserezeptor bindet, welcher auf der Oberfläche von Gefäßendothelzellen liegt. Nach einer solchen KDR Tyrosinkinaseaktivierung tritt eine Hyperpermeabilität der Blutgefäße auf und Flüssigkeit wandert von dem Blutstrom über die Blutgefäßwände hinaus in den Interstitialraum, wodurch ein Ödemgebiet gebildet wird. Diapedese begleitet auch oft diese Reaktion. In ähnlicher Weise kann eine übermäßige Gefäßhyperpermeabilität den normalen molekularen Austausch entlang des Endothels in entscheidenden Geweben und Organen (zum Beispiel Lunge und Niere) unterbrechen, wodurch eine makromolekulare Extravasation und Ablagerung bewirkt wird. Nach dieser akuten Reaktion auf KDR Stimulation, von der geglaubt wird, daß sie den nachfolgenden angiogenen Prozess erleichtert, führt eine verlängerte KDR Tyrosinkinasestimulation zu der Proliferation und Chemotaxe von Gefäßendothelzellen und der Bildung von neuen Gefäßen. Durch Hemmen der KDR Tyrosinkinaseaktivität entweder durch Blockieren der Produktion des aktivierenden Liganden, durch Blockieren der Bindung des aktivierenden Liganden an den KDR Tyrosinkinaserezeptor, durch Verhindern der Rezeptordimerisierung und Transphosphorylierung, durch Hemmen der Enzymaktivität der KDR Tyrosinkinase (was die Phosphorylierungsfunktion des Enzyms hemmt) oder durch irgendeinen anderen Mechanismus, der seine stromabwärts Signalgebung unterbricht (D. Mukhopedhyay et al., Cancer Res. 58:1278–1284 (1998) und Referenzen darin), Hyperpermeabilität ebenso wie damit verbundene Extravasation, darauf folgende Ödembildung und Matrixdeposition, und angiogene Reaktionen, können gehemmt und minimiert werden.
  • Eine Gruppe- der bevorzugten Verbindungen dieser Erfindung hat die Eigenschaft der Hemmung der KDR Tyrosinkinaseaktivität ohne die Flt-1 Tyrosinkinaseaktivität signifikant zu hemmen (Flt-1 Tyrosinkinase wird auch als VEGFR-1 Tyrosinkinase bezeichnet). Sowohl KDR Tyrosinkinase als auch Flt-1 Tyrosinkinase werden aktiviert durch VEGF Bindung an KDR Tyrosinkinaserezeptoren bzw. an Flt-1 Tyrosinkinaserezeptoren. Bestimmte bevorzugte Verbindungen dieser Erfindung sind einzigartig, weil sie die Aktivität von einer VEGF Rezeptortyrosinkinase (KDR) hemmen, die aktiviert wird durch aktivierende Liganden, aber sie hemmen nicht andere Rezeptortyrosinkinasen, wie zum Beispiel Flt-1, die auch aktiviert werden durch bestimmte aktivierende Liganden. In dieser Art und Weise sind bestimmte bevorzugte Verbindungen dieser Erfindung deshalb selektiv in ihrer Tyrosinkinase hemmenden Aktivität.
  • In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit zur Behandlung einer Proteinkinasevermittelten Erkrankung in einem Patienten, das das Verabreichen an den Patienten einer therapeutisch oder prophylaktisch wirksamen Menge von einer oder mehreren Verbindungen der Formel I umfaßt.
  • Eine "Proteinkinase-vermittelte Erkrankung" oder eine "Erkrankung vermittelt durch Proteinkinaseaktivität" ist ein medizinischer Zustand, wie zum Beispiel eine Krankheit oder ein anderer unerwünschter physikalischer Zustand, dessen Entstehung oder Fortschreiten mindestens teilweise von der Aktivität von mindestens einer Proteinkinase abhängt. Die Proteinkinase kann zum Beispiel eine Proteintyrosinkinase oder eine Proteinserin/Threoninkinase sein.
  • Eine "therapeutisch wirksame Menge" ist eine Menge einer Verbindung der Formel I oder eine Kombination aus zwei oder mehreren solchen Verbindungen, welche ganz oder teilweise das Fortschreiten der Erkrankung hemmt oder zumindest teilweise eines oder mehrere Symptome der Erkrankung lindert. Eine therapeutisch wirksame Menge kann auch eine Menge sein, welche prophylaktisch wirksam ist. Die Menge, welche therapeutisch wirksam ist, wird von der Größe und dem Geschlecht des Patienten, der zu behandelnden Krankheit, der Schwere der Krankheit und dem beabsichtigten Ergebnis abhängen. Für einen gegebenen Patienten kann eine therapeutisch wirksame Menge durch Verfahren bestimmt werden, die denjenigen, die im Fachgebiet bewandert sind, bekannt sind.
  • Die Src, Tec, Jak, Map, Csk, NfκB und Syk Familien von Kinasen spielen zentrale Rollen in der Regulierung der Immunfunktion. Die Src Familie schließt derzeit Fyn, Lck, Fgr, Fes, Lyn, Src, Yrk, Fyk, Yes, Hck und Blk ein. Die Syk Familie wird derzeit verstanden, daß sie nur Zap und Syk einschließt. Die TEC Familie schließt Tec, Btk, Rlk und Itk ein. Die Janus Familie von Kinasen ist in die Transduktion von Wachstumsfaktor und proinflammatorischen Cytokinsignalen durch eine Anzahl von Rezeptoren involviert. Obwohl BTK und ITK, Mitglieder der Tec Familie von Kinasen, eine weniger gut verstandene Rolle in der Immunbiologie spielen, könnte ihre Modulation durch einen Inhibitor sich als therapeutisch nützlich erweisen. Die Csk Familie wird derzeit verstanden, daß sie Csk und Chk einschließt. Die Kinasen RIP, IRAK-1, IRAK-2, NIK, p38 MAP Kinasen, Jnk, IKK-1 und IKK-2 sind in die Signaltransduktionswege für Schlüssel pro-inflammatorische Cytokine, wie zum Beispiel TNF und IL-1 involviert.
  • Von einer Anzahl von Proteinkinasen wurde gezeigt, daß sie Protooncogene sind. Chromosombruch (an dem Itk Kinasebruchpunkt auf Chromosom 5), Translokation wie in dem Fall des Abl Gens mit BCR (Philadelphia Chromosom), Abstumpfung in Fällen wie zum Beispiel c-Kit oder EGFR oder Mutation (zum Beispiel Met) führt zu der Erzeugung von misregulierten Proteinen, welche sie von Protooncogen zu Oncogenprodukten umwandeln. In anderen Tumoren wird die Oncogenese angetrieben durch Autocrin oder Paracrinligand/Wachstumsfaktorrezeptorwechselwirkungen. Mitglieder der src-Familie Kinasen sind typischerweise in stromabwärts Signaltransduktion involviert, wodurch die Oncogenese verstärkt wird und sie selbst oncogen werden durch Überexpression oder Mutation. Durch Hemmen der Proteinkinaseaktivität dieser Proteine kann der Krankheitsprozess unterbrochen werden. Gefäßrestenose kann FGF und/oder PDGF-vermittelte glatte Muskel und Endothelzellproliferation einschließen. Die Ligandenstimulation von FGFR, PDGFR, IGF1-R und c-Met in vivo ist proangiogen, und verstärkt Angiogenese-abhängige Krankheiten. Die Hemmung von FGFr, PDGFr, c-Met oder IGF1-R Kinaseaktivitäten einzeln oder in Kombination kann eine wirksame Strategie darstellen zur Hemmung dieser Phänomene.
  • Es wird geglaubt, daß Gefäßdestabilisierung des Antagonistenliganden von Tie-2 (Ang2) ein unstabiles "plastisches" Stadium in dem Endothel induziert. In der Anwesenheit von hohen VEGF Spiegeln kann eine robuste angiogene Reaktion entstehen; jedoch kann, in der Abwesenheit von VEGF oder einem VEGF-verwandten Stimulus, eine offene Gefäßregression und Endothelapoptose auftreten (Genes und Devel 13: 1055–1066 (1999)). In einer analogen Art und Weise kann ein Tie-2 Kinaseinhibitor proangiogen oder antiangiogen sein in der Anwesenheit bzw. Abwesenheit eines VEGF-verwandten Stimulus.
  • In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Verbindungen der Formel I wie anfangs oben definiert bereit, für die Verwendung als Medikamente, insbesondere als Inhibitoren der Proteinkinaseaktivität, zum Beispiel der Tyrosinkinaseaktivität, der Serinkinaseaktivität und der Threoninkinaseaktivität. In wiederum einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung von Verbindungen der Formel I wie anfangs oben definiert bereit, in der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der Hemmung der Proteinkinaseaktivität.
  • In dieser Erfindung sind die folgenden Definitionen anwendbar:
    "Physiologisch verträgliche Salze" bezieht sich auf diejenigen Salze, welche die biologische Wirksamkeit und die Eigenschaften der freien Basen beibehalten und welche erhalten werden durch Reaktion mit anorganischen Säuren, wie zum Beispiel Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure oder organische Säuren, wie zum Beispiel Sulfonsäure, Carbonsäure, organische Phosphorsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, p-Toluensulfonsäure, Salicylsäure, Milchsäure, Weinsäure und dergleichen.
  • Pharmazeutische Formulierungen
  • Die Verbindungen dieser Erfindung können einem menschlichen Patienten durch sich selbst verabreicht werden oder in pharmazeutischen Zusammensetzungen, worin sie mit geeigneten Trägern oder Bindemittel(n) gemischt sind bei Dosierungen, um vaskuläre Hyperpermeabilität, Ödeme und damit assoziierte Erkrankungen zu behandeln oder zu verbessern. Mischungen aus diesen Verbindungen können auch an den Patienten als eine simple Mischung oder in geeignet formulierten pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht werden. Eine therapeutisch wirksame Dosis bezieht sich weiter auf die Menge der Verbindung oder der Verbindungen, die ausreicht, um zu der Verhütung oder der Abschwächung von unpassender Neovaskularisation, Fortschreiten der hyperproliferativen Erkrankungen, Ödeme, VEGF- assoziierter Hyperpermeabilität und/oder VEGF-verwandter Hypotension zu führen. Techniken für die Formulierung und die Verabreichung der Verbindungen der vorliegenden Anmeldung können gefunden werden in "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, neueste Ausgabe.
  • Verabreichungswege
  • Geeignete Verabreichungswege können zum Beispiel orale, Augentropfen, rektale, transmukosale, topische, oder intestinale Verabreichung; parenterale Zuführung einschließlich intramuskulärer, subkutaner, intramedulärer Injektion, ebenso wie intrathecale, direk intraventriculare, intravenöse, intraperitoneale, intranasale oder intraoculare Injektionen einschließen.
  • Alternativ kann man die Verbindung eher in einer lokalen als in einer systemischen Art und Weise verabreichen, zum Beispiel über Injektion der Verbindung direkt in eine ödematöse Stelle, oft in einer Depotformulierung oder einer Formulierung mit verzögerter Freisetzung.
  • Desweiteren kann man den Arzneistoff in einem zielgerichteten Arzneistoffzuführungssystem verabreichen, zum Beispiel in einem Liposom beschichtet mit Endothelzellspezifischem Antikörper.
  • Zusammensetzung/Formulierung
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können in einer Art und Weise hergestellt werden, die selbst bekannt ist, zum Beispiel durch konventionelles Mischen, Auflösen, Granulieren, Dragee herstellt, Verreiben, Emulgieren, Verkapseln, oder durch Lyophilisierungsprozesse.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen für die Verwendung in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung können somit in einer konventionellen Art und Weise formuliert werden unter Verwendung von einem oder mehreren physiologisch verträglichen Trägern, umfassend Bindemittel und Hilfsstoffe, welche das Verarbeiten der aktiven Verbindungen in Zubereitungen, welche pharmazeutisch verwendet werden können, erleichtern. Eine geeignete Formulierung ist abhängig von dem gewählten Verabreichungsweg.
  • Für die Injektion können die Wirkstoffe der Erfindung in wässerige Lösungen formuliert werden, vorzugsweise in physiologisch kompatible Puffer, wie zum Beispiel Ranks Lösung, Ringer Lösung, oder physiologischen Salzlösungspuffer. Für die transmukosale Verabreichung werden Penetrationsmittel, die geeignet sind für die Barriere, die durchdrungen werden soll, in der Formulierung verwendet. Solche Penetrationsmittel sind allgemein im Fachgebiet bekannt.
  • Für die orale Verabreichung können die Verbindungen leicht formuliert werden durch Kombinieren der aktiven Verbindungen mit pharmazeutisch verträglichen Trägern, die im Fachgebiet wohl bekannt sind. Solche Träger erlauben, daß die Verbindungen der Erfindung als Tabletten, Pillen, Dragees, Kapseln, Flüssigkeiten, Gele, Sirupe, Aufschlämmungen, Suspensionen und dergleichen, für die orale Aufnahme durch einen zu behandelnden Patienten formuliert werden können. Pharmazeutische Zubereitungen für die orale Verwendung können erhalten werden durch kombinieren der aktiven Verbindung mit einem festen Bindemittel, wahlweise Verreiben einer resultierenden Mischung, und Verarbeiten der Mischung von Granulaten, nach dem geeignete Hilfsstoffe hinzugefügt wurden, um Tabletten oder Drageekerne zu erhalten. Geeignete Bindemittel sind insbesondere Füllstoffe wie zum Beispiel Zucker, einschließlich Laktose, Saccharose, Mannitol oder Sorbitol; Zellulosezubereitungen, wie zum Beispiel Maisstärke, Weizenstärke, Reisstärke, Kartoffelstärke, Gelatine, Tragantgummi, Methylzellulose, Hydroxypropylmethylzellulose, Natriumcarboxymethylzellulose, und/oder Polyvinylpyrrolidon (PVP). Wenn gewünscht, können Zerfallsmittel hinzugefügt werden, wie zum Beispiel das quervernetzte Polyvinylpyrrolidon, Agar, oder Alginsäure oder ein Salz davon, wie zum Beispiel Natriumalginat.
  • Drageekerne werden mit geeigneten Beschichtungen bereitgestellt. Für diesen Zweck können konzentrierte Zuckerlösungen verwendet werden, welche wahlweise Gummiarabikum, Talkum, Polyvinylpyrrolidon, Carbopolgel, Polyethylenglykol und/oder Titandioxid, Lacklösungen und geeignete organische Lösungsmittel oder Lösungsmittelmischungen enthalten können. Farbstoffe oder Pigmente können zu den Tabletten oder Drageebeschichtungen hinzugefügt werden zur Identifikation oder um verschiedene Kombinationen von aktiven Verbindungsdosierungen zu kennzeichnen.
  • Pharmazeutische Zubereitungen, welche oral verwendet werden können, schließen push-fit Kapseln ein, hergestellt aus Gelatine, ebenso wie weiche, verschlossene Kapseln, hergestellt aus Gelatine und einem Weichmacher, wie zum Beispiel Glycerol oder Sorbitol. Die push-fit Kapseln können die aktiven Inhaltsstoffe in Beimischung mit Füllstoff wie zumb Laktose, Bindemittel, wie zum Beispiel Stärken und/oder Schmiermitteln, wie zum Beispiel Talkum oder Magnesiumstearat und, wahlweise, Stabilisatoren enthalten. In weichen Kapseln können die aktiven Verbindungen in geeigneten Flüssigkeiten, wie zum Beispiel fetten Ölen, flüssigen Parafin oder flüssigen Polyethylenglykolen aufgelöst oder suspendiert werden. Zusätzlich können Stabilisatoren hinzugefügt werden. Alle Formulierungen für die orale Verabreichung sollten in Dosierungen geeignet für eine solche Verabreichung sein.
  • Für die bukale Verabreichung können die Zusammensetzungen, die Form von Tabletten oder Pastillen, formuliert in einer üblichen Art und Weise habe.
  • Für die Verabreichung durch Inhalation, werden die Verbindungen zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung üblicherweise in der Form einer Aerosolspraydarstellung aus unter Druck gesetzten Packungen oder einem Zerstäuber zugeführt, unter der Verwendung eines geeigneten Treibmittels, zum Beispiel Dichlordifluormethan, Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluorethan, Kohlenstoffdioxid und einem anderen geeigneten Gas. In dem Fall von einem unter Druck gesetzten Aerosol kann die Dosiereinheit bestimmt werden durch Bereitstellen eines Ventils, um eine abgemessene Menge zuzuführen. Kapseln und Kartuschen von zum Beispiel Gelatine für die Verwendung in einem Inhalator oder einem Insufflator, können so formuliert sein, daß sie eine Pulvermischung der Verbindung und eine geeignete Pulverbasis wie zum Beispiel Laktose oder Stärke enthalten.
  • Die Verbindungen können für die parenterale Verabreichung durch Injektion, zum Beispiel Bolusinjektion oder kontinuierliche Infusion formuliert sein. Formulierungen für die Injektion können in Einheitsdosierform präsentiert werden, d. h. in Ampullen oder in Multidosisbehältern, mit einem zugesetzten Konservierungsstoff. Die Zusammensetzungen können solche Formen annehmen, wie Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wässerigen Vehikeln und sie können Formulierungsstoffe enthalten, wie zum Beispiel Suspendier-, Stabilisierungs- und/oder Dispersionsmittel.
  • Pharmazeutische Formulierungen für die parenterale Verabreichung schließen wässerige Lösungen der aktiven Verbindungen in Wasser-löslicher Form ein. Zusätzlich können Suspensionen der aktiven Verbindungen als geeignete ölige Injektionssuspensionen hergestellt werden. Geeignete lipophile Lösungsmittel oder Vehikel schließen fette Öle, wie zum Beispiel Sesamöl, oder synthetische Fettsäureester, wie zum Beispiel Ethyloleat oder Triglyceride oder Liposome ein. Wässerige Injektionssuspensionen könne Substanzen enthalten, welche die Viskosität der Suspension erhöhen, wie zum Beispiel Natriumcarboxymethylzellulose, Sorbitol, oder Dextran. Wahlweise kann die Suspension auch geeignete Stabilisatoren oder Mittel enthalten, welche die Löslichkeit der Verbindungen erhöhen, um die Herstellung von hochkonzentrierten Lösungen zu erlauben.
  • Alternativ kann der aktive Inhaltsstoff in Pulverform vorliegen, für die Konstitution mit einem geeigneten Vehikel, zum Beispiel sterilem Pyrogen-freiem Wasser vor der Verwendung.
  • Die Verbindungen können auch in rektalen Zusammensetzungen formuliert werden, wie zum Beispiel Suppositorien oder Retentionseinläufen, die zum Beispiel konventionelle Suppositorienbasen enthalten, wie zum Beispiel Kakaobutter oder andere Glyceride.
  • Zusätzlich zu den zuvor beschriebenen Formulierungen können die Verbindungen auch als eine Depotzubereitung hergestellt werden. Solche langwirkenden Formulierungen können durch Implantation verabreicht werden (zum Beispiel subkutan oder intramuskulär oder durch intramuskuläre Injektion). Somit können zum Beispiel die Verbindungen mit geeigneten Polymeren oder hydrophoben Materialien formuliert werden (zum Beispiel als eine Emulsion in einem verträglichen Öl) oder Ionenaustauscherharzen, oder als schwer lösliche Derivate, zum Beispiel als ein schwer lösliches Salz.
  • Ein Beispiel eines pharmazeutischen Trägers für die hydrophoben Verbindungen der Erfindung ist ein Cosolvenzsystem umfassend Benzylalkohol, einen nicht polaren oberflächenaktiven Stoff, ein Wasser-mischbares organisches Polymer und eine wässerige Phase. Das Cosolvenzsystem kann das VPD Cosolvenzsystem sein. VPD ist eine Lösung aus 3% m/v Benzylalkohol, 8% m/v des nicht polaren oberflächenaktiven Stoffs Polysorbat 80, und 65% m/v Polyethylenglycol 300, aufgefüllt mit absolutem Ethanol. Das VPD Cosolvenzsystem (VPD:5W) besteht aus VPD verdünnt 1:1 mit einer 5% Dextrose in Wasserlösung. Dieses Cosolvenzsystem löst auch hydrophobe Verbindungen gut, und erzeugt selbst eine geringe Toxizität nach systemischer Verabreichung. Natülicherweise können die Verhältnisse eines Colovenzsystems beträchtlich variiert werden ohne seine Löslichkeits- und Toxizitätscharakteristika zu zerstören. Desweiteren kann die Identität der Cosolvenzkomponenten variiert werden: zum Beispiel können andere nicht polare oberflächenaktive Stoffe mit geringer Toxizität verwendet werden anstatt Polysorbat 80; die Fraktionsgröße von Polyethylenglycol kann variiert werden; andere biokompatible Polymere können Polyethylenglycol ersetzen, zum Beispiel Polyvinylpyrrolidon; und andere Zucker oder Polysaccharide können Dextrose ersetzen.
  • Alternativ können andere Zuführungssysteme für hydrophobe pharmazeutische Verbindungen verwendet werden. Liposome und Emulsionen sind wohl bekannte Beispiele für Zuführungsvehikel oder Träger für hydrophobe Arzneistoffe. Bestimmte organische Lösungsmittel wie zum Beispiel Dimethylsulfoxid können auch verwendet werden, obwohl üblicherweise zu Lasten einer größeren Toxizität. Zusätzlich können die Verbindungen unter Verwendung eines Systems mit anhaltender Freisetzung zugeführt werden, wie zum Beispiel semipermeablen Matrixen aus festen hydrophoben Polymeren, die den therapeutischen Wirkstoff enthalten. Verschiedene Materialien mit anhaltender Freisetzung wurden eingeführt und sind denjenigen, die im Fachgebiet bewandert sind, wohl bekannt. Kapseln mit anhaltender Freisetzung können abhängig von ihrer chemischen Natur, die Verbindungen für wenige Wochen bis zu über 100 Tagen freisetzen. Abhängig von der chemischen Natur und der biologischen Stabilität des therapeutischen Reagenz, können zusätzliche Strategien für die Proteinstabilisierung verwendet werden.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch geeignete feste oder Gelphasenträger oder Bindemittel umfassen. Beispiele für solche träger oder Bindemittel schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Kalziumcarbonat, Kalziumphosphat, verschiedene Zucker, Stärken, Zellulosederivate, Gelatine, und Polymere, wie zum Beispiel Polyethylenglycole.
  • Viele der Verbindungen der Erfindung können als Salze bereitgestellt werden mit pharmazeutisch kompatiblen Gegenionen. Pharmazeutisch kompatible Salze können mit vielen Säuren gebildet werden, einschließlich aber nicht beschränkt auf Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Essigsäure, Milchsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Bernsteinsäure etc. Salze tendieren dazu in wässerigen oder anderen protonischen Lösungsmitteln löslicher zu sein als die entsprechenden freien Hasenformen.
  • Wirksame Dosis
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen, die geeignet sind für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung schließen Zusammensetzungen ein, worin die aktiven Inhaltsstoffe in einer wirksamen Menge enthalten sind, um ihren beabsichtigten Zweck zu erzielen. Genauer bedeutet eine therapeutisch wirksame Menge eine Menge, die wirksam ist, um die Entwicklung zu verhindern oder um die existierenden Sympome der behandelten Person zu lindern. Die Bestimmung der wirksamen Mengen liegt wohl innerhalb der Fähigkeit derjeniger, die im Fachgebiet bewandert sind.
  • Für jede Verbindung, die in dem Verfahren der Erfindung verwendet wird, kann die therapeutisch wirksame Dosis anfangs aus zellulären Assays geschätzt werden. Zum Beispiel kann eine Dosis in zellulären und tierischen Modellen formuliert werden, um einen zirkulierenden Konzentrationsbereich zu ereichen, der die IC50 wie in zellulären Assays bestimmt einschließt (d. h. die Konzentration der Testverbindung, welche eine halb-maximale Hemmung einer gegebenen Proteinkinaseaktivität erzielt). In einigen Fällen ist es angebracht, die IC50 in der Anwesenheit von 3 bis 5% Serumalbumin zu bestimmen, da eine solche Bestimmung sich den Bindungseffekten von Plasmaprotein an die Verbindung annähert. Eine solche Information kann verwendet werden, um nützliche Dosierungen in Menschen genauer zu bestimmen. Desweiteren hemmen die bevorzugtesten Verbindungen für die systemische Verabreichung wirksam die Proteinkinasesignalgabe in intakten Zellen bei Spiegeln, die in Plasma sicher ereichbar sind.
  • Eine therapeutisch wirksame Dosis bezieht sich auf die Menge der Verbindung, die zu einer Verbesserung der Symptome in einem Patienten führt. Die Toxizität und therapeutische Wirksamkeit solcher Verbindungen kann durch pharmazeutische Standardverfahren in Zellkulturen oder experimentellen Tieren bestimmt werden, zum Beispiel zur Bestimmung der maximal tolerierten Dosis (MTD) und der ED50 (effektive Dosis für 50% der maximalen Reaktion). Das Dosisverhältnis zwischen toxischen und therapeutischen Effekten ist der therapeutische Index und er kann ausgedrückt werden als das Verhältnis zwischen MTD und ED50. Verbindungen, welche hohe therapeutische Indizes zeigen sind bevorzugt. Die Daten, die aus diesen Zellkulturassays erhalten werden und tierische Studien können verwendet werden bei der Formulierung eines Dosierbereichs zur Verwendung in Menschen. Die Dosierung solcher Verbindungen liegt vorzugsweise innerhalb eines Bereichs von zirkulierenden Konzentrationen, die die ED50 mit geringer oder keiner Toxizität einschließen. Die Dosierung kann innerhalb dieses Bereichs variieren, abhängig von der Dosierform, die verwendet wird, und dem verwendeten Verabreichungsweg. Die exakte Formulierung, der Verabreichungsweg und die Dosierung können durch den einzelnen Arzt gewählt werden, im Hinblick auf den Zustand des Patienten. (Siehe zum Beispiel Fingl et al., 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Kapitel 1, Seite 1). In der Behandlung von Krisen, kann die Verabreichung eines akuten Bolus oder einer Infusion, die die MTD erreicht, erforderlich sein, um eine schnelle Reaktion zu erhalten.
  • Die Dosiermenge und der Intervall können individuell eingestellt werden, um Plasmaspiegel des aktiven Anteils bereitzustellen, welche ausreichend sind, um die Kinase modulierenden Effekte, oder die minimale wirksame Konzentration (MEC) aufrecht zu erhalten. Die MEC wird für jede Verbindung variieren, kann aber geschätzt werden von in vitro Daten; zum Beispiel der Konzentration, die notwendig ist, um 50–90% Hemmung der Proteinkinase unter Verwendung der hierin beschriebenen Assays zu erreichen. Dosierungen, die notwendig sind, um die MEC zu erreichen, werden von einzelnen Charakteristika und dem Verabreichungsweg abhängen. Jedoch können HPLC Assays oder Bioassays verwendet werden, um Plasmakonzentrationen zu bestimmen.
  • Dosierintervalle können auch bestimmt werden unter Verwendung des MEC Werts. Verbindungen sollten unter Verwendung eines Regimes verabreicht werden, welches Plasmaspiegel oberhalb der MEC für 10–90% der Zeit, vorzugsweise zwischen 30–90% und am bevorzugtesten zwischen 50–90% aufrechterhält, bis die gewünschte Verbesserung der Symptome erreicht ist. In Fällen der lokalen Verabreichung oder der selektiven Aufnahme, kann die wirksame lokale Konzentration des Arzneistoffs nicht mit der Plasmakonzentration in Zusammenhang stehen.
  • Die Menge der verabreichten Zusammensetzung wird natürlich von der behandelten Person abhängen, von dem Gewicht der Person, der Schwere der Krankheit, der Art der Verabreichung und der Beurteilung des behandelnden Arztes.
  • Verpackung
  • Die Zusammensetzungen können, wenn gewünscht, in einer Packung oder einer Spendervorrichtung präsentiert werden, welche eine oder mehrere Einheitsdosierformen enthalten kann, die den aktiven Inhaltsstoff enthält. Die Packung kann zum Beispiel Metall- oder Plastikfolie umfassen, wie zum Beispiel eine Blisterpackung. Die Packung oder die Spendervorrichtung kann von Angaben zur Verabreichung begleitet werden. Zusammensetzungen, die eine Verbindung der Erfindung formuliert in einem kompatiblen pharmazeutischen Träger umfassen, können auch hergestellt werden, in einen geeigneten Behälter gegeben werden, und für die Behandlung eines angegebenen Zustands markiert werden.
  • In einigen Formulierungen kann es nützlich sein, die Verbindungen der vorliegenden Erfindung in der Form von Partikeln mit sehr geringer Größe zu verwenden, zum Beispiel wie durch eine Strahlmühle erhalten.
  • Die Verwendung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung in der Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen wird durch die folgende Beschreibung veranschaulicht. In dieser Beschreibung bezeichnet der Ausdruck "aktive Verbindung" jede Verbindung der Erfindung, aber insbesondere jede Verbindung, welche das Endprodukt von einem der vorhergehenden Beispiele ist.
  • a) Kapseln
  • In der Herstellung von Kapseln können 10 Gewichtsteile aktive Verbindung und 240 Gewichtsteile Laktose entaggregiert und gemischt werden. Die Mischung kann in harte Gelatinekapseln gefüllt werden, wobei jede Kapsel eine Einheitsdosis oder einen Teil einer Einheitsdosis der aktiven Verbindung enthält.
  • b) Tabletten
  • Tabletten können aus den folgenden Inhaltsstoffen hergestellt werden.
    Gewichtsteile
    Aktive Verbindung 10
    Laktose 190
    Maisstärke 22
    Polyvinylpyrrolidon 10
    Magnesiumstearat 3
  • Die aktive Verbindung, die Laktose und einiges der Stärke können entaggregiert werden, gemischt und die resultierende Mischung kann mit einer Lösung des Polyvinylpyrrolidons in Ethanol granuliert werden. Das trockene Granulat kann mit dem Magnesiumstearat und dem Rest der Stärke gemischt werden. Die Mischung wird dann in einer Tablettiermaschine komprimiert, um Tabletten zu ergeben, die jeweils eine Einheitsdosis oder einen Teil einer Einheitsdosis der aktiven Verbindung enthalten.
  • c) Magensaftresistent beschichtete Tabletten
  • Tabletten können hergestellt werden durch das Verfahren, das in (b) oben beschrieben ist. Die Tabletten können magensaftresistent beschichtet werden in einer konventionellen Art und Weise unter Verwendung einer Lösung von 20% Zelluloseacetatphthalat und 3% Diethylphthalat in Ethanol:Dichlormethan (1:1).
  • d) Suppositorien
  • In der Herstellung von Suppositorien können 100 Gewichtsteile aktiver Verbindung in 1300 Gewichtsteile Triglyceridsuppositorienbasis eingeschlossen werden und die Mischung kann in Suppositorien geformt werden, die jeweils eine therapeutisch wirksame Menge des aktiven Inhaltsstoffs enthalten.
  • In den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung kann die aktive Verbindung, wenn gewünscht, mit anderen kompatiblen pharmakologisch wirksamen Inhaltsstoffen assoziiert werden. Zum Beispiel können die Verbindungen dieser Erfindung in Kombination mit einem oder mehreren zusätzlichen pharmazeutischen Wirkstoffen verabreicht werden, die die Produktion von VEGF oder Angiopoietinen hemmen oder verhindern, die intrazellulären Reaktion auf VEGF oder Angiopoietine abschwächen, die intrazelluläre Signalübertragung blockieren, die Gefäßhyperpermeabilität hemmen, die Entzündung vermindern oder die Bildung von Ödemen oder Gefäßneubildung hemmen oder verhindern. Die Verbindungen der Erfindung können davor, danach oder gleichzeitig mit dem zusätzlichen pharmazeutischen Wirkstoff verabreicht werden, welcher Verabreichungsweg auch immer geeignet ist. Die zusätzlichen pharmazeutischen Wirkstoffe schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf anti-Ödemsteroide, NSAIDS, Ras Inhibitoren, anti-TNF Wirkstoffe, anti-IL1 Wirkstoffe, Antihistamine, PAF-Antagonisten, COX-1 Inhibitoren, COX-2 Inhibitoren, NO Synthaseinhibitoren, Akt/PTB Inhibitoren, IGF-1R Inhibitoren, PKC Inhibitoren und PI3 Kinaseinhibitoren. Die Verbindungen der Erfindung und die zusätzlichen pharmazeutischen Wirkstoffe wirken entweder additiv oder synergistisch.
  • Die vorliegende Erfindung umfaßt auch die Verwendung einer Verbindung der Formel I als ein Medikament.
  • Die in vitro Wirksamkeit der Verbindungen bei der Hemmung dieser Proteinkinasen kann durch die unten gezeigten Verfahren bestimmt werden.
  • Die Wirksamkeit der Verbindungen kann durch die Menge der Hemmung der Phosphorylierung eines exogenen Substrats (zum Beispiel synthetischem Peptid (Z. Songyang et al., Nature. 373:536–539) durch eine Testverbindung relativ zur Kontrolle bestimmt werden.
  • KDR Tyrosinkinaseproduktion unter Verwendung eines Baculovirus Systems:
    Die kodierende Sequenz für die menschliche KDR intrazelluläre Domain (Aminosäuren aa789-1354) wurde durch PCR unter Verwendung von cDNAs die aus HUVEC Zellen isoliert wurden, erzeugt. Eine Poly-Hiso Sequenz wurde ebenso an dem N-Terminus dieses Proteins eingeführt. Dieses Fragment wurde in den Transfektionsvektor pVL1393 bei der Xba1 und Not1 Stelle kloniert. Ein rekombinanter Baculovirus (BV) wurde erzeugt durch Cotransfektion unter Verwendung des BaculoGold Transfektonsreagenzes (PharMingen). Rekombinantes BV war von Plaques gereinigt und durch Western Analyse bestätigt. Für die Proteinproduktion wurden SF-9 Zellen in SF-900-II Medium bei 2 × 106/ml gezüchtet, und wurden bei 0,5 Plaque bildenden Einheiten pro Zelle (MOI) infiziert. Die Zellen wurden 48 Stunden nach der Infizierung geerntet.
  • Reinigung von KDR
  • SF-9 Zellen, die (His)6KDR(aa789-1354) exprimierten, wurden lysiert durch Hinzufügen von 50 ml Triton X-100 Lysepuffer (20 mM Tris, pH 8,0, 137 mM NaCl, 10% Gylcerol, 1% Triton X-100, 1 mM PMSF, 10 μg/ml Aprotinin, 1 μg/ml Leupeptin) zu dem Zellpellet von 11 Zellkultur. Das Lysat wurde bei 19,000 rpm in einem Sorval SS-34 Rotor für 30 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Das Zelllysat wurde auf eine 5 ml NiCl2 chelatisierende Sepharosesäule aufgetragen, ins Gleichgewicht gebracht mit 50 mM HEPES, pH 7,5, 0,3 M NaCl. KDR wurde eluiert unter Verwendung desselben Puffers enthaltend 0,25 M Imidazol. Die Säulenfraktionen wurden analysiert unter Verwendung von SDS-PAGE und einem ELISA Assay (unten), welcher die Kinaseaktivität mißt. Das gereinigte KDR wurde in 25 mM HEPES, pH 7,5, 25 mM NaCl, 5 mM DTT Puffer ausgetauscht und bei –80°C gelagert.
  • Menschliche Tie-2 Kinaseproduktion und Reinigung
  • Die kodierende Sequenz für die menschliche Tie-2 intrazelluläre Domain (aa775-1124) wurde erzeugt durch PCR unter Verwendung von cDNAs die aus menschlicher Plazenta als einer Matrixe isoliert wurden. Eine polt'-His6 Sequenz wurde an dem N-Terminus eingeführt und dieses Konstrukt wurde in den Transfektionsvektor pVL 1939 an der Xba1 und Not1 Stelle kloniert. Rekombinantes BV wurde erzeugt durch Cotransfektion unter Verwendung des BaculoGold Transfektionsreagenz (PharMingen). Rekombinantes BV wurde von Plaques gereinigt und durch Western Analyse bestätigt. Für die Proteinproduktion wurden SF-9 Insektenzellen in SF-900-II Medium bei 2 × 106/ml gezüchtet, und sie wurden bei MOI von 0,5 infiziert. Reinigung der His-markierten Kinase, die in dem Screening verwendet wurde, war analog zu der, die für KDR beschrieben wurde.
  • Menschliche Flt-1 Tyrosinkinaseproduktion und Reinigung
  • Der baculovirale Expressionsvektor pVL 1393 (Phar Mingen, Los Angeles, CA) wurde verwendet. Eine Nukleotidsequenz, die poly-His6 kodierte, wurde 5' zu der Nukleotidregion platziert, die die gesamte intrazelluläre Kinasedomain von menschlichem Flt-1 kodierte (Aminosäuren 786–1338). Die Nukleotidsequenz, die die Kinasedomain kodierte, wurde erzeugt durch PCR unter Verwendung von cDNA Bibliotheken, isoliert aus HUVEC Zellen. Die Histidinreste erlaubten eine Affinitätsreinigung des Proteins, als eine analoge Art und Weise zu der für KDR und ZAP70. SF-9 Insektenzellen wurden bei einer 0,5 Multiplizität infiziert und 48 Stunden nach der Infektion geerntet.
  • EGFR Tyrosinkinasequelle
  • EGFR wurde von Sigma (Cat #E-3641; 500 Einheiten/50 μl) erworben und der EGF Ligand wurde erworben von Oncogene Research Poducts/Calbiochem (Cat #PF011-100).
  • Expression von ZAP70
  • Der baculovirale Expressionsvektor, der verwendet wurde, war pVL1393. (Pharmingen, Los Angeles, Ca). Die Nukleotidsequenz, die Aminosäuren M(H)6 LVPR9S kodiert, wurde 5' zu der Region platziert, die das Ganze von ZAP70 (Aminosäuren 1-619) kodiert. Die Nukleotidsequenz, die die ZAP70 kodierende Region kodiert, wurde erzeugt durch PCR unter Verwendung von cDNA Bibliotheken, isoliert von Jurkat immortalisierten T-Zellen. Die Histidinreste erlaubten eine Affinitätsreinigung des Proteins (siehe oben). Die LVPR9S Brücke stellt eine Wiedererkennungssequenz dar, für die proteolytische Abspaltung durch Thrombin, wodurch die Entfernung des Affinitätsmarkers von dem Enzym erlaubt wird. SF-9 Insektenzellen wurden bei einer Multiplizität der Infektion von 0,5 infiziert und 48 Stunden nach der Infektion geerntet.
  • Extraktion und Reinigung von ZAP70
  • SF-9 Zellen wurden in einem Puffer bestehend aus 20 mM Tris, pH 8,0, 137 mM NaCl, 10% Glycerol, 1% Triton X-100, 1 mM PMSF, 1 μg/ml Leupeptin, 10 μg/ml Aprotinin und 1 mM Natriumorthovanadat lysiert. Das lösliche Lysat wurde auf eine chelatisierende Sepharose HiTrap Säule (Pharmacia) aufgebracht ins Gleichgewicht gebracht mit 50 mM HEPES, pH 7,5, 0,3 M NaCl. Das Fusionsprotein wurde mit 250 mM Imidazol eluiert. Das Enzym wurde in Puffer enthaltend 50 mM HEPES, pH 7,5, 50 mM NaCl und 5 mM DTT gelagert.
  • Proteinkinasequelle
  • Lck, Fyn, Src, Blk, Csk und Lyn, und abgestumpfte Formen davon können kommerziell erhalten werden (zum Beispiel von Upstate Biotechnology Inc. (Saranac Lake, N.Y.) und Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, Ca.)) oder gereinigt aus bekannten natürlichen oder rekombinanten Quellen unter Verwendung von konventionellen Verfahren.
  • Heterologer Enzym-Immunoassay (ELISA) für PTKs
  • Heterologe Enzym-Immunoassays (ELISA) wurden verwendet, um das Vorhandensein von Tyrosinkinaseaktivität zu detektieren und zu messen. Der ELISA wurde durchgeführt gemäß bekannten Protokollen, welche zum Beispiel beschrieben sind in Voller, et al., 1980, "Enzyme-Linked Immunosorbent Assay" In: Manaual fo Clinical Immunology, 2te Ausgabe, herausgegeben durch Rose und Friedman, Seiten 359–371 Am. Soc. Of Microbiology, Washington, D. C.
  • Das offenbarte Protokoll wurde angepaßt zur Bestimmung der Aktivität hinsichtlich einer spezifischen PTK. Zum Beispiel sind bevorzugte Protokolle zur Durchführung der ELISA Experimente unten bereitgestellt. Die Anpassung dieser Protokolle zur Bestimmung einer Verbindungsaktivität für andere Mitglieder der Rezeptor PTK Familie, ebenso wie nicht Rezeptortyrosinkinasen, liegt wohl innerhalb der Fähigkeiten derjeniger, die im Fachgebiet bewandert sind. Für die Zwecke der Bestimmung der Inhibitorselektivität wurde ein universielles PTK Substrat (zum Beispiel zufälliges Copolymer von poly(Glu4 Tyr), 20,000–50,000 MW) zusammen mit ATP (typischerweise 5 μM) verwendet, bei ungefähr zwei mal der Konzentration der scheinbaren Km in dem Assay.
  • Das folgende Verfahren wurde verwendet, um den inhibitorischen Effekt von Verbindungen dieser Erfindung auf KDR, Flt-1, Flt-4, Tie-1, Tie-2, EGFR, FGFR, PDGFR, IGF-1-R, c-Met, Lck, hck, Blk, Csk, Src, Lyn, fgr, Fyn und ZAP70
  • Tyrosinkinaseaktivität zu untersuchen:
    • Puffer und Lösungen: PGTPoly (Glu, Tyr) 4:1
    • Vorratspulver bei –20°C. Löse Pulver in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) für 50 mg/ml Lösung. Lagere 1 ml Aliquote bei –20°C. Wenn Platten gemacht werden, verdünne auvh 250 μg/ml in Gibco PBS.
    • Reaktionspuffer: 100 mM Hepes, 20 mM MgCl2, 4 mM MnCl2, 5 mM DTT, 0,02% BSA, 200 µM NaVO4, pH 7,10
    • ATP: Vorratsaliquote von 100 mM bei –20°C. Verdünne auf 20 µM in Wasser
    • Waschpuffer: PBS mit 0,1% Tween 20
    • Antikörperverdünnungspuffer: 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS
    • TMB Substrat: Mische TMB Substrat und Peroxidkösung 9:1 unmittelbar vor der Verwendung oder verwende K-blau Substrat von Neogen
    • Stoplösung: 1M Phosphorsäure
  • Verfahren
  • 1. Plattenherstellung:
  • Verdünne PGT Vorrat (50 mg/ml, gefroren) in PBS auf 250 µg/ml. Füge 125 µl pro Auskerbung der Corning modifizierten Flachboden Hochaffinitäts-ELISA-Platten hinzu (Corning #25805-96). Füge 125 µl PBS zu den leeren Auskerbungen hinzu. Bedecke mit Abdichtungsband und inkubiere über Nacht bei 37°C. Wasche 1× mit 250 µl Waschpuffer und trockne für ungefähr 2 Stunden in 37°C Trockeninkubator.
    Lagere beschichtete Platten in einer verschlossenen Tasche bei 4°C bis zur Verwendung.
  • 2. Tyrosinkinasereaktion:
    • – Bereite Inhibitorlösungen bei einer 4× Konzentration in 20% DMSO in Wasser
    • – Bereite Reaktionspuffer
    • – Bereite Enzymlösung, so daß die gewünschten Einheiten in 50 µl sind, zum Beispiel für KDR mache auf 1 ng/µl für insgesamt 50 ng pro Auskerbung in den Reaktionen. Lagere auf Eis
    • – Mache 4× ATP Lösung auf 20 µM aus 100 mM Vorrat in Wasser. Lagere auf Eis
    • – Füge 50 µl der Enzymlösung pro Auskerbung hinzu (typischerweise 5–50 ng Enzym/Auskerbung abhängig von der spezifischen Aktivität der Kinase)
    • – Füge 25 µl 4× Inhibitor hinzu
    • – Füge 25 µl 4× ATP für den Inhibitorassay hinzu
    • – Inkubiere für 10 Minuten bei Raumtemperatur
    • – Stoppe die Reaktion durch Hinzufügen von 50 µl 0,05 N HCl pro Auskerbung
    • – Wasche die Platte **Endkonzentrationen für die Reaktion: 5 µM ATP, 5% DMSO
  • 3. Antikörperbindung
    • – Verdünne 1 mg/ml Aliquot von PY20-HRP (Pierce) Antikörper (ein Phosphotyrosinantikörper) auf 50 ng/ml in 0,1% BSA in PBS durch eine 2 Schrittverdünnung (100×, dann 200×)
    • – Füge 100 µl Ab pro Auskerbung hinzu. Inkubiere 1 Stunde bei Raumtemperatur. Inkubiere 1 Stunde bei 4°C.
    • – Wasche 4× die Platte.
  • 4. Farbreaktion
    • – Bereite TMB Substrat und füge 100 µl pro Auskerbung hinzu
    • – Überwache OD bei 650 nm bis 0,6 erreicht ist
    • – Stoppe mit 1M Phosphorsäure. Schüttle auf dem Plattenlesegerät
    • – Lese OD unmittelbar bei 450 nm
  • Optimale Inkubationszeiten und Enzymreaktionsbedingungen variieren leicht mit den Enzymzubereitungen und werden für jede Charge empirische bestimmt.
  • Für Lck war der verwendete Reaktionspuffer 100 mM MOPSO, pH 6,5 4 mM MnCl2, 20 mM MgCl2, 5 mM DTT, 0,2% BSA, 200 mM NaVO4 unter den analogen Assaybedingungen.
  • Verbindungen der Formeln 1–109 können therapeutische Nützlichkeit haben in der Behandlung von Krankheiten, die sowohl identifizierte, einschließlich derer die hierin nicht erwähnt sind, als auch noch unidentifizierte Proteintyrosinkinasen einschließen, welche durch Verbindungen der Formeln 1–109 gehemmt werden.
  • Cdc2 Quelle
  • Das menschliche rekombinante Enzym und der Assaypuffer können kommerziell erhalten werden (New England Biolabs, Veverly, MA. USA) oder aus bekannten natürlichen oder rekombinanten Quellen unter Verwendung von konventionellen Verfahren gereinigt werden.
  • Cdc2 Assay
  • Ein Protokoll, das verwendet werden kann, ist das, das mit den erworbenen Reagenzien bereit gestellt ist mit geringen Modifikationen. Kurz gesagt wird die Reaktion in einem Puffer ausgeführt, der aus 50 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EGTA, 2 mM DTT, 0,01% Brij, 5% DMSO und 10 mM MgCl2 besteht (kommerzieller Puffer), ergänzt mit frischem 300 µM ATP (31 µCi/ml) und 30 µg/ml Histon Typ IIIss Endkonzentrationen. Ein Reaktionsvolumen von 80 µl, enthaltend Einheiten von Enzym, wird für 20 Minuten bei 25 Grad C in der Anwesenheit oder Abwesenheit von Inhibitor laufen gelassen. Die Reaktion wird beendet durch die Zugabe von 120 µl von 10% Essigsäure. Das Substrat wird von uneingeschlossenem Marker abgetrennt durch Auftupfen der Mischung auf Phosphozellulosepapier, gefolgt von 3 Waschungen von 5 Minuten jeweils mit 75 mM Phosphorsäure. Zählungen werden gemessen durch einen Betacounter in der Anwesenheit von flüssigem Szintillationsmittel.
  • PKC Kinasequelle
  • Die katalytische Untereinheit von PKC kann kommerziell erhalten werden (Calbiochem).
  • PKC Kinaseassay
  • Ein radioaktiver Kinaseassay wird verwendet gemäß einem veröffentlichten Verfahren (Yasuda, I., Kirshimoto, A., Tanaka, S., Tominaga, M., Sakurai, A., Nishizuka, Y. Biochemical and Biophysical Research Communication 3:166, 1220–1227 (1990)). Kurz gesagt werden alle Reaktionen in einem Kinasepuffer durchgeführt, der aus 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 2 mM DTT, 1 mM EGTA, 100 µM ATP, 8 µM Peptid, 5% DMSO und 33P ATP (8Ci/mM) besteht. Verbindung und Enzyme werden in dem Reaktionsgefäß gemischt und die Reaktion wird durch Zugabe der ATP und Substratmischung gestartet. Nach der Beendigung der Reaktion durch die Zugabe von 10 µl Stopppuffer (5 mM ATP in 75 mM Phosphorsäure) wird ein Teil der Mischung auf Phosphozellulosefilter getupft. Die aufgetupften Proben werden 3 mal in 75 mM Phosphorsäure bei Raumtemperatur für 5 bis 15 Minuten gewaschen. Der Einschluß von Radiomarkern wird quantitativ bestimmt durch Flüssigszintillationszählung.
  • Erk2 Enzymquelle
  • Das rekombinante murine Enzym und der Assaypuffer können kommerziell erhalten werden (New England Biolabs, Beverly MA. USA) oder gereinigt aus bekannten natürlichen oder rekombinanten Quellen unter Verwendung von konventionellen Verfahren.
  • Erk2 Enzymassay
  • Kurz gesagt wird die Reaktion in einem Puffer ausgeführt, der aus 50 mM Tris pH 7,5, 1 mM EGTA, 2 mM DTT, 0,01% Brij, 5% DMSO und 10 mM MgCl2 besteht (kommerzieller Puffer), ergänzt mit frischem 100 M ATP (31 µCi/ml) und 30 µM Myelin basischem Protein unter Bedingungen, die vom Hersteller empfohlen werden. Reaktionsvolumina und das Verfahren zur Untersuchung eingeschlossener Radioaktivität sind für den PKC Assay beschrieben (siehe oben).
  • In vitro Modelle für die T-Zellaktivierung
  • Nach Aktivierung durch Mitogen oder Antigen werden T-Zellen induziert IL-2 zu sezernieren, einen Wachstumsfaktor, der ihre nachfolgende proliferative Phase unterstützt. Deshalb kann man entweder die Produktion von IL-2 oder die Zellproliferation von primären T-Zellen oder geeigneten T-Zelllinien als ein Stellvertreter für die T-Zellaktivierung messen. Beide diese Assays sind in der Literatur wohl beschrieben und ihre Parameter sind gut dokumentiert (in Current Protocols in Immunology, Band 2, 7.10.1–7.11.2).
  • Kurz gesagt können T-Zellen durch Co-Kultivierung mit allogenen Stimulatorzellen aktiviert werden, ein Verfahren, bezeichnet als die irreversible gemischte Lymphozytenreaktion. Periphere Responder und Stimulator einkernige Blutzellen werden gereinigt durch Ficoll-Hypaque Gradient (Pharmacia) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Stimulatorzellen werden mitotisch inaktiviert durch Behandlung mit Mitomycin C (Sigma) oder Gammastrahlung. Responder und Stimulatorzellen werden cokultiviert bei einem Verhältnis von zwei zu eins in der Anwesenheit oder Abwesenheit der Testverbindung. Typischerweise werden 105 Responder gemischt mit 5 × 104 Stimulatoren und in einer U-Boden Mikrotiterplatte (Costar Scientific) platziert (200 µl Volumen). Die Zellen werden in RPMI 1640 kultiviert ergänzt mit entweder Hitze-aktiviertem fetalem Rinderserum (Hyclone Laboratories) oder gepooltem menschlichem AB Serum von männlichen Donoren, 5 × 10–5 Mischung 2Mercaptoethanol und 0,5% DMSO. Die Kulturen werden mit 0,5 µCi von 3H Thymidin (Amersham) einen Tag vor der Ernte (typischerweise Tag drei) vibriert. Die Kulturen werden geerntet (Betaplate harvester, Wallac) und die Isotopaufnahme wurde bewertet durch Flüssigkszintillation (Betaplate, Wallac).
  • Das selbe Kultursystem kann verwendet werden zur Bewertung der T-Zellaktivierung durch Messung der IL-2 Produktion. Achtzehn bis vierundzwanzig Stunden nach dem Kulturbeginn werden die Überstände entfernt und die IL-2 Konzentration wird durch ELISA (R und D Systeme) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen.
  • In vivo Modelle der T-Zellaktivierung
  • Die in vivo Wirksamkeit der Verbindungen kann in tierischen Modellen getestet werden, die dafür bekannt sind, daß sie direkt die T-Zellaktivierung messen oder für welche gezeigt wurde, daß T-Zellen die Effektoren sind. T-Zellen können in vivo durch Ligation des konstanten Teils des T-Zellrezeptors mit einem monoklonalen anti-CD3 Antikörper (Ab) aktiviert werden. In diesem Modell werden BALG/c Mäusen 10 µg von anti-CD3 Ab intraperitoneal zwei Stunden vor der Tötung gegeben. Tiere, die einen Testarzneistoff erhalten sollen, werden vorbehandelt mit einer einzelnen Dosis, der Verbindung eine Stunde vor der anti-CD3 Ab Verabreichung. Serumspiegel der proinflammatorischen Cytokine Interferon-γ (IFN-γ) und Tumornecrosefaktor-α (TNF-α), Indikatoren der T-Zellaktivierung, werden durch ELISA gemessen. Ein ähnliches Modell verwendet in vivo T-Zellpriming mit einem spezifischen Antigen wie zum Beispiel Napfschneckenhämocyanin (KLH) gefolgt von einer sekundären in vivo Herausforderung der Entleerung von Lymphknotenzellen mit demselben Antigen. Wie zuvor wird die Messung der Cytokinproduktion verwendet, um den Aktivierungsstatus der kultivierten Zellen zu bewerten. Kurz gesagt werden C57BL/6 Mäuse subkutan mit 100 µg KLH, emulgiert in komplettem Freund'schem Adjuvanz (CFA) am Tag null immunisiert. Die Tiere werden vorbehandelt mit der Verbindung einen Tag vor der Immunisierung und darauf folgend an den Tagen eins, zwei und drei nach der Immunisierung. Entleerende Lymphknoten werden geerntet am Tag 4 und ihre Zellen werden bei 6 × 106 pro ml in Gewebekulturmedium kultiviert (RPMI 1640 ergänzt mit Hitze inaktiviertem fetalem Rinderserum (Hyclone Laboratories) 5 × 10–5 M 2-Mercaptoethanol und 0,5% DMSO) für sowohl vierundzwanzig als auch achtundvierzig Stunden. Die Kulturüberstände werden dann auf das autocrine T-Zellwachstumsfaktor Interleukin-2 (IL-2) und/oder IFN-γ Spiegel durch ELISA bewertet.
  • Führende Verbindungen können auch in Tiermodellen der menschlichen Krankheit getestet werden. Diese sind beispielhaft dargestellt durch experimentelle auto-immun-Encephalomyelitis (EAE) und Kollagen-induzierte Arthritis (CIA). EAE Modelle, welche Aspekte von menschlicher multipler Sklerose imitieren, wurden sowohl in Ratten als auch in Mäusen beschrieben (besprochen durch FASER J. 5:2560–2566, 1991; murines Modell: Lab. Invest. 4(3):278, 1981; Nagermodell: J. Immunol 146(4): 1163–8, 1991). Kurz gesagt werden Mäuse oder Ratten mit einer Emulsion von Myelin basischem Protein (MBP), oder neurogenen Peptidderivaten davon, und CFA immunisiert. Die akute Krankheit kann induziert werden durch die Zugabe der bakteriellen Toxine, wie zum Beispiel Bordetella Pertussis. Eine rückfallende/wiederauftretende Krankheit wird induziert durch angenommenen Transfer von T-Zellen von MBP/Peptid immunisierten Tieren.
  • CIA kann in DBA/1 Mäusen durch Immunisierung mit Typ II Kollagen (J. Immunol: 142(7):2237-2243) induziert werden. Die Mäuse werden Zeichen von Arthritis entwickeln so früh wie zehn Tage nach der Antigenherausforderung und sie können für so lange wie neunzig Tage nach der Immunisierung ausgewertet werden. In beiden, den EAE und den CIA Modellen kann eine Verbindung entweder prophylaktisch oder zum Zeitpunkt des Krankheitsbeginns verabreicht werden. Wirksame Arzneistoffe sollten die Schwere und/oder das Auftreten reduzieren.
  • Bestimmte Verbindungen dieser Erfindung, welche eine oder mehrere angiogene Rezeptor PTK, und/oder eine Proteinkinase, wie zum Beispiel lck, die in die Vermittlung von Entzündungsreaktionen involviert ist, hemmen, können die Schwere und das Auftreten von Arthritis in diesen Modellen reduzieren.
  • Verbindungen können auch in Mausallotransplantatmodellen getestet werden, entweder Haut (besprochen in Ann. Rec. Immunol., 10:333–58, 1992; Transplantation: 57(12):1701–17D6, 1994) oder Herz (Am. J. Anat.: 113:273, 1963). Kurz gesagt werden Hauttransplantate voller Dicke von C57BL/6 Mäusen zu BALG/c Mäusen transplantiert. Die Transplantate können täglich untersucht werden, beginnend am Tag sechs, auf einen Hinweis der Abstoßung. In dem Mäuse-neonatalen Herztransplantatmodell werden neonatale Herzen ectopisch von C57BL/6 Mäusen in die Ohrmuscheln von Erwachsenen CBA/J Mäusen tranplantiert. Die Herzen beginnen zu schlagen vier bis sieben Tage nach der Transplantation und eine Abstoßung kann visuell bewertet werden unter Verwendung eines Seziermikroskops, um nach einem Aufhören des Schlagens zu schauen.
  • Zelluläre Rezeptor PTK Assays
  • Der folgende zelluläre Assay wurde verwendet, um den Spiegel der Aktivität und den Effekt der unterschiedlichen Verbindungen der vorliegenden Erfindung auf KDR/VEGFR2 zu bestimmen. Ähnliche Rezeptor PTK Assays die einen spezifischen Ligandenstimulus verwenden, können entlang derselben Linien für andere Tyrosinkinasen unter Verwendung von Techniken, die im Fachgebiet wohl bekannt sind, entwickelt werden.
  • VEGF-induzierte KDR Phosphorylierung in menschlichen Nabelvenenendothelialzellen (HUVEC) wie gemessen durch Westernblots:
    • 1. HUVEC Zellen (von gepoolten Donoren) können erworben werden von Clonetics (San Diego, CA) und gemäß den Anweisungen des Herstellers kultiviert werden. Nur frühe Durchgänge (3–8) werden für diesen Assay verwendet. Die Zellen werden in 100 mm Schalen kultiviert (Falcon für Gewebekultur; Becton Dickinson; Plymouth, England) unter Verwendung von vollständigem EBM Medium (Clonetics).
    • 2. Zur Bewertung der inhibitorischen Aktivität einer Verbindung werden die Zellen trypsinisiert und bei 0,5–1,0 × 105 Zellen/Auskerbung in jeder Auskerbung von 6 Auskerbungen Clusterplatten gesät (Costar, Cambridge, MA).
    • 3. 3–4 Tage nach dem Säen werden die Platten typischerweise 90–100% zusammenfließend. Das Medium wird von allen Auskerbungen entfernt, die Zellen werden mit 5–10 ml PBS gespült und 18–24 Stunden mit 5 ml von EBM Rasenmedium ohne hinzugefügte Ergänzungen inkubiert (d. h. Serumaushungerung).
    • 4. Serielle Verdünnungen von Inhibitoren werden in 1 ml von EBM Medium (25 µM, 5 µM oder 1 µM Endkonzentration zu Zellen hinzugefügt und für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Menschliches rekombinantes VEGF165 (R & D Systeme) wird dann zu allen Auskerbungen in 2 ml von EBM Medium als einer Endkonzentration von 50 mg/ml hinzugefügt und bei 37°C für 10 Minuten inkubiert. Kontrollzellen, unbehandelt oder behandelt mit VEGF allein werden verwendet, um die Hintergrundphosphorylierung und die Phosphorylierungsinduktion durch VEGF zu bewerten.
  • Alle Auskerbungen wurden dann mit 5–10 ml kalter PBS enthaltend 1 mM Natriumorthovanadat (Sigma) gespült, und die Zellen wurden lysiert und in 200 µl von RIPA Puffer zusammengekratzt (50 mM Tris-HCl) pH 7, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,25% Natriumdesoxycholat, 1 mM EDTA), enthaltend Proteaseinhibitoren (PMSF 1 mM, Aprotinin 1 µg/ml Pepstatin 1 µg/ml, Leupeptin 1 µg/ml, Natriumvanadat 1 mM, Natriumfluorid 1 mM) und 1 µg/ml von Dnase (alle Chemikalien von Sigma Chemical Company, St Louis, MO). Das Lysat wird bei 14,000 rpm für 30 Minuten gedreht, um die Kerne zu entfernen.
  • Gleiche Mengen von Proteinen werden dann durch die Zugabe von kaltem (–20°C) Ethanol (2 Volumina) für ein Minimum von 1 Stunde oder ein Maximum von über Nacht ausgefällt. Die Pellets werden in Laemli Probenpuffer enthaltend 5% Mercaptoethanol (BioRad; Hercules, CA) rekonstituiert und für 5 Minuten gekocht. Die Proteine werden durch Polyacrylamidgelelektrophorese (6%, 1,5 mm Novex, San Deigo, CA) getrennt und auf eine Nitrozellulosemembran unter Verwendung des Novex System überführt. Nach der Blockierung mit Rinderserumalbumin (3%) werden die Proteine über Nacht mit anti-KDR polyklonalem Antikörper gesondet (C20, Santa Cruz Biotechnology; Santa Cruz, CA) oder mit dem anti-Phosphortyrosin monoklonalen Antirkörper (4G10, Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) bei 4°C. Nach dem Waschen und Inkubieren für 1 Stunde mit HRP-konjugiertem Formel (ab)2 von Ziegen oder anti-Hasen oder Ziegen anti-Maus IgG werden die Banden unter Verwendung des Emissionschemilumineszenz (ECL) Systems sichtbar gemacht (Amersham Life Sciences, Arlington Height, IL).
  • In vivo Uterus Ödemmodell
  • Dieser Assay mißt die Kapazität von Verbindungen den akuten Anstieg im Uterusgewicht in Mäusen zu hemmen, was in den ersten wenigen Stunden nach einer Östrogenstimulation auftritt. Dieser frühe Beginn des Anstiegs des Uterusgewichts ist dafür bekannt, daß es aufgrund von Ödemen ist, die durch eine erhöhte Permeabilität des Uterusgefäßsystems bewirkt ist. Cullinan-Bove und Koss (Endorcrinology (1993), 133:829–837) zeigten eine enge zeitliche Beziehung von Östrogen-stimulierten Uterusödemen mit einer erhöhten Expression von VEGF mRNA in dem Uterus. Diese Ergebnisse wurden bestätigt durch die Verwendung von neutralisierendem monoklonalen Antikörper für VEGF, welcher signifikant den akuten Anstieg im Uterusgewicht nach einer Östrogenstimulation reduzierte ( WO 97/42187 ). Somit kann dieses System als ein Modell für die in vivo Hemmung der VEGF Signalgebung und der assoziierten Hyperpermeabilität und Ödemen dienen.
  • Materialien: Alle Hormone können von Sigma (St. Louis, MO) oder Cal Biochem (La Jolla, CA) als lyophylisierte Pulver erworben werden und gemäß den Angaben des Herstellers zubereitet werden. Vehikelkomponenten (DMSO, Cremophor EL) können erworben werden von Sigma (St. Louis, MO).
  • Mäuse (Salb/c, 8–12 Wochen alt) können erworben werden von Taconic (Germantown, NY) und in einer Pathogen-freien Tiereinrichtung in Übereinstimmung mit Tierheimpflege und der Verwendung der Kommissionsrichtlinien gehalten werden.
  • Verfahren:
  • Tag 1: Balb/c Mäusen wird eine intraperitoneale (i. p.) Injektion von 12,5 Einheiten von Serumgonadotropin schwangerer Stuten (PMSG) gegeben.
  • Tag 3: Mäuse erhalten 15 Einheiten von humanen Choriongonadotropin (hCG) i. p.
  • Tag 4: Mäuse werden zufällig ausgewählt und in Gruppen von 5–10 unterteilt. Testverbindungen werden verabreicht durch i. p., i. v. oder p. o. Wege abhängig von der Löslichkeit und dem Vehikel bei Dosierungen im Bereich von 1–100 mg/kg. Die Vehikelkontrollgruppe erhält nur Vehikel und zwei Gruppen werden unbehandelt gelassen.
  • Dreißig Minuten später, experimentell, werden der Vehikelgruppe und einer der unbehandelten Gruppen eine i. p. Injektion von 17 Östradiol (500 µg/kg) gegeben. Nach 2–3 Stunden werden die Tiere durch CO2 Inhalation getötet. Nach einem Mittelschnitt wurde jeder Uterus isoliert und entfert, indem unmittelbar unterhalb des Cervix und an den Übergängen des Uterus und der Eileiter geschnitten wurde. Fett und Bindegewebe wurden vorsichtig entfernt, um nicht die Integrität des Uterus vor dem Wiegen (Naßgewicht) zu stören. Die Uteri werden abgetupft, um Flüssigkeit zu entfernen, in dem sie zwischen zwei Blättern von Filterpapier gepreßt wurden, wobei eine. ein Liter Glasflasche mit Wasser gefüllt wurde. Die Uteri werden gewogen nach dem Abtupfen (Abtupfgewicht). Der Unterschied zwischen nassem und abgetupftem Gewicht wird als der Flüssigkeitsgehalt des Uterus genommen. Der mittlere Flüssigkeitsgehalt von behandelten Gruppen wird mit unbehandelten oder Vehikel behandelten Gruppen verglichen. Die Signifikanz wird bestimmt durch den Studenttest. Nicht stimulierte Kontrollgruppe wird verwendet, um die Östradiolreaktion zu überwachen.
  • Bestimmte Verbindungen dieser Erfindung, welche Inhibitoren der angiogenen Rezeptortyrosinkinasen sind, können sich auch in einem Matrigelimplantatmodell der Neovaskularisierung als wirksam zeigen. Das Matrigel Neovaskulasisierungsmodell schließt die Bildung von neuen Blutgefäßen innerhalb einer klaren Glaskugel von extrazellulärer Matrix ein, welche subkutan implantiert wurde, welche durch die Anwesenheit von proangiogenem Faktor induziert wird, der Tumorzellen produziert (zum Beispiel siehe: Passaniti, A., et al., Lab. Investig. (1992), 67(4), 519–528; Anat. Rec. (1997), 249(1), 63–73; Int. J. Cancer (1995), 63(5), 694–701; Vasc. Biol. (1995), 15(11), 1857-6). Das Modell läuft vorzugsweise über 3–4 Tage und die Endpunkte schließen mikroskopische visuelle/Bildgebungsbewertungen der Neovaskularisierung, mikroskopische Mikrogefäßdichtebestimmungen, und die Hämoglobinquantifizierung (Drabkin Verfahren) ein, nach der Entfernung des Implantats gegenüber Kontrollen aus Tieren, die nicht mit Inhibitoren behandelt wurden. Das Modell kann alternativ bFGF oder HGF als den Stimulus verwenden.
  • Beispiel 1:
  • 7-Cyclopentyl-5-(4-phenoxyphenyl)-5H-pyrrolo[3,2-d]pyrimidin-4-ymin
  • a) 2-Cyclopentylacetonitril
  • Eine Mischung aus Natriumhydrid (2,17 g, 60% in Öl, 54,2 mmol) in Diethylether (100 ml) wurde auf 0°C abgekühlt, dann mit Diethyl(cyanomethyl)phosphonat (9,6 g, 54,2 mmol) behandelt, während die Temperatur der Mischung bei weniger als 0°C gehalten wurde. Cyclopentanon (4,13 g, 49,3 mmol) in Diethylether (25 ml) wurde zu der Mischung bei weniger als 5°C hinzugefügt, dann wurde die Reaktion auf Raumtemperatur erwärmt und für zusätzliche 16 Stunden gerührt. Wasser (240 ml) wurde zu der Mischung hinzugefügt und die Schichten wurden dann getrennt. Die wässerige Schicht wurde mit Diethylether (50 ml) extrahiert. Die kombinierten organischen Lösungen wurden mit Wasser (50 ml) dann Salzlösung (50 ml) extrahiert und letztlich über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und das Filtrat unter vermindertem Druck konzentriert. Der resultierende Rückstand wurde in Ethanol (40 ml) aufgelöst, dann wurden 10% Palladium auf Kohlenstoff (250 mg) hinzugefügt und die Mischung wurde bei Atmosphärendruck und Raumtemperatur für 16 Stunden hydriert. Der Katalysator wurde durch Filtration durch ein Celitekissen entfernt und das Filtrat wurde zu einem Öl unter vermindertem Druck konzentriert. Die Titelverbindung wurde gereinigt durch fraktionierte Destillation, um 4,08 g (75,6%) als ein hell gelbes Öl zu ergeben (Kochpunkt 63°C bei 20 Torr):
    1H NMR (Chloroform-d, 400 MHz) δ 2.35 (d, 2H), 2.18 (m, 1H), 1.87 (m, 2H), 1.59-1.69 (m, 4H), 1.29 (m, 2H).
  • b) 1-Cyclopentyl-2-oxoethylcyanid
  • Eine Mischung aus 2-Cyclopentylacetonitril (0,50 g, 4,59 mmol in Tetrahydrofuran (10 ml) wurde auf –60°C abgekühlt, dann mit 1,7 M tert-Butylltihium in Pentan (3,25 ml, 5,50 mmol) behandelt, während die Reaktionstemperatur bei weniger als –55°C gehalten wurde. Die Lösung wurde für 10 Minuten gerührt, dann wurde Ethylformiat 0,41 g, 5,50 mmol) tropfenweise hinzugefügt. Die Mischung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und zusätzliche 16 Stunden gerührt. Die Mischung wurde unter vermindertem Druck konzentriert und der resultierende Rückstand wurde auf eine Silikagelsäule aufgebracht und mit Dichlormethan/Ethylacetat (95:5) eluiert. Die Fraktionen, die Material enthielten mit einem Rf von 0,1–0,3 [TLC, Dichlormtehan/Ethylacetat (95:5), Kaliumpermanganatfärbung) wurden kombiniert und Konzentriert, um ein Öl zu ergeben, welches ohne weitere Reinigung verwendet wurde:
    1H NMR. (Chloroform-d, 400 MHz) δ 9.57 (s, 1H), 3.54 (d, 1H), 2.45 (m, 1H), 1.4-1.9 (m, 8H).
  • c) 4-Phenoxyanilino)methylcyanid
  • Eine Mischung aus 4-Phenoxyanilin (7,0 g, 37,8 mmol), Bromacetonitril (4,5 g, 37,8 mmol) und Triethylamin (4,2 g, 41,6 mmol) in Tetrahydrofuran (50 ml) wurde auf 85°C für 5,25 Stunden erhitzt, dann abgekühlt und ein anderer Teil von Bromacetonitril (6,5 g, 5,46 mmol) wurde hinzugefügt. Die Mischung wurde bei 85° C für 18 Stunden erhitzt, dann abgekühlt und unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde zwischen Dichlormethan (50 ml) und Wasser (50 ml) aufgeteilt. Die wässerige Schicht wurde mit Dichlormethan (30 ml) extrahiert, dann wurden die kombinierten organischen Lösungen mit 5 N wässerigem Natriumhydrid (30 ml) extrahiert, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde dann durch Flashchromatographie auf Silikagel unter Verwendung von Dichlormethan/Ethylacetat (98:2) als ein Eluent gereinigt, um 3,8 g (45%) der Titelverbindung als einen dunkel braunen Feststoff zu ergeben:
    1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 7.32 (t, 2H), 7.03 (t, 1H), 6.87-6.94 (m, 411), 6.76 (d, 2H), 6.26 (bs, 2H), 4.25 (s, 2H); RP-HPLC (Hypersil HS-C18, 5 µm, 100 A, 4.6 × 250 mm;
    25%–100% Acetonitril-0,05 M Ammoniumacetat über 25 Minuten, 1 ml/Min) t, 18,4
    min.; MS: MH+ 225.1.
  • d) 3-Amino-4-cyclopentyl-1-(4-phenoxyphenyl)-1H-2-pyrrolcarbonitril
  • Eine Mischung von (4-Phenoxyanilino)methylcyanid (0,68 g, 3,30 mmol) und 1-Cyclopentyl-2-oxoethylcanid (0,54 g, 3,94 mmol) in 1,2-Dimethoxyethan (10 ml) wurde mit 2 Tropfen Essigsäure behandelt, dann auf 85°C für 45 Minuten erhitzt. Die Mischung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, dann wurden 1,5-Diazabicyclo [4.3.0]non-5-en (DBN) (1,13 g, 9,09 mmol) hinzugefügt. Die Mischung wurde dann auf 65°C für 16 Stunden und auf 85°C für 6 Stunden erhitzt. Frisches DEN (0,25 ml) wurde hinzugefügt und die Mischung wurde auf 85°C für zusätzliche 18 Stunden erhitzt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt, dann wurde der Rückstand auf eine Silikagelsäule aufgebracht und mit Heptan/Ethylacetat (7:3) eluiert, um 185 mg (17,8%) der Titelverbindung als ein Glas zu ergeben:
    1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 7.42 (m, 411), 7.17 (t, 1H), 7.04-7.11 (m, 4H), 6.99 (s, 1H), 5.10 (bs, 211), 2.82 (m, 1H), 1.97 (m, 2H), 1.69 (m, 2H), 1.58 (m, 2H); RP-HPLC (Hypersil HS-C18, 5 µm, 100 A, 4.6 × 250 mm; 25%–100% acetonitrile-0.05 M ammonium acetate over 25 min, 1 mL/min) t, 26.2 min.; MS: MH+ 343.9.
  • e) 7-Cyclopentyl-5-(4-phenoxyphenyl)-5H-pyrrolo[3,2-d]pyrimidin-4-amin
  • Eine Mischung des 3-Amino-4-cyclopentyl-1-(4-phenoxyphenyl)-1H-2-pyrrolcarbonitril (185 mg, 0,539 mmol) in absolutem Ethanol (10 ml) wurde mit Formamidinacetat (450 mg, 4,33 mmol) behandelt, dann bei 85°C für 2 Stunden erhitzt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck verdampft, dann wurde der Rückstand durch präparative reverse Phase HPLC gereinigt, um 145 mg (73%) der Titelverbindung als einen weißen Feststoff nach der Lyophilisierung zu ergeben:
    1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 8.19 (s, 1H), 7.44 (m, 5H), 7.19 (t, 1H), 7.13 (m, 4H), 5.79 (bs, 2H), 3.23 (m, 1H), 2.05 (m, 2H), 1.77 (m, 4H), 1.64 (m, 2H); RP-HPLC (Hypersil HS-C18, 5 µm, 100A, 4.6 × 250 mm; 5%–100% acetonitrile-0.05 M ammonium acetate over 25 mm, 1 mL/min) t, 23.3 min.; MS: MH+ 371.5.

Claims (13)

  1. Eine Verbindung mit der Formel (I), die racemischdiastereomeren Mischungen, optischen Isomere oder pharamazeutisch verträglichen Salze davon,
    Figure 00540001
    worin: R1
    Figure 00540002
    ist; Z100 ein wahlweise substituiertes Phenyl ist, worin Z100 wahlweise substituiert ist mit einem oder mehreren Substituenten, jeweils unabhängig gewählt aus der Gruppe bestehend aus F, Cl, CN, NO2, – wahlweise substituiertem Alkyl, -O-(wahlweise substituiertes Alkyl), -C(O)H, -CONH2, -NHSO2CF3, wahlweise substituiertem Heteroaryl, COOH, -Z105-C(O)N(R)2, -Z105-N(R)-C(O)-Z200, -Z105-N(R)-S(O)2-Z200 und -Z105-N(R)-C(O)-N(R)-Z200; Z105 ist eine kovalente Bindung oder (C1-C6); Z200 ist eine wahlweise substituierte Gruppe, gewählt aus der Gruppe bestehend aus (C1-C6), Phenyl und -(C1-C6), Phenyl; Z110 und Z111 sind jeweils unabhängig eine kovalente Bindung und A ist O; Ra ist Wasserstoff; R3 ist H; R2 ist -Z101-Z102; Z101 ist eine kovalente Bindung; Z102 ist eine substituierte oder unsubstituierte Cycloalkylgruppe.
  2. Eine Verbindung gemäß Anspruch 1, worin R2 Cyclopentyl ist.
  3. Eine Verbindung gemäß Anspruch 2, worin Z100 wahlweise substituiertes Phenyl ist, worin Z100 wahlweise substituiert ist mit einem oder mehreren Substituenten, jeweils unabhängig gewählt aus der Gruppe bestehend aus F, COOH, NO2, OMe, -COOMe, OCF3 und CF3.
  4. Eine Verbindung gemäß Anspruch 2, worin Z100 ein wahlweise substituiertes Phenyl ist, worin Z100 wahlweise substituiert ist mit einem oder mehreren Substituenten gewählt aus der Gruppe bestehend aus Alkyl, Alkoxy, Halo, Hydroxy und Alkoxycarbonyl.
  5. Eine Verbindung gemäß Anspruch 1, worin R2 eine wahlweise substituierte Gruppe ist, gewählt aus der Gruppe bestehend aus Cyclobutyl und Cyclohexyl.
  6. Eine Verbindung gemäß Anspruch 5, worin R2 wahlweise substituiert ist mit einem oder mehreren Substituenten gewählt aus der Gruppe bestehend aus Hydroxy, Alkyl, Hydroxyalkyl, Carboxyalkyl und Phenylalkoxyalkyl.
  7. Eine Verbindung gemäß Anspruch 1, worin R1 4-Phenoxyphenyl ist.
  8. Eine Verbindung mit der Formel I gemäß Anspruch 1, worin R1 = 4-Phenoxyphenyl, R2 = Cyclopentyl und beide R3 = H.
  9. Verwendung einer Verbindung von Anspruch 1 oder eines physiologisch verträglichen Salzes davon zur Herstellung eines Medikaments zum Hemmen von einer oder mehreren Proteinkinaseaktivitäten in einem Patienten durch Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Mengen an den Patienten.
  10. Die Verwendung von Anspruch 9, worin die Proteinkinase gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus KDR, FGFR-1, PDGFRβ, PDGFRα, IGF-1R, c-Met, Flt-1, Flt-4, TIE-2, TIE-1, Lck, Src, fyn, Lyn, Blk, hck, fgr und yes.
  11. Die Verwendung von Anspruch 9, worin die Proteinkinase eine Proteinserin/Threoninkinase oder eine Proteintyrosinkinase ist.
  12. Die Verwendung von Anspruch 10, worin die Proteinkinase Tie-2 ist.
  13. Die Verwendung von Anspruch 9, worin die Proteinkinaseaktivität in die T-Zellaktivierung, B-Zellaktivierung, Mastzelldegranulation, Monozytenaktivierung, die Verstärkung einer entzündlichen Reaktion oder eine Kombination davon involviert ist.
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