DE69817794T2

DE69817794T2 - Verfahren zur bestimmung des prozentualen anteils von glykosiliertem hämoglobin

Info

Publication number: DE69817794T2
Application number: DE69817794T
Authority: DE
Inventors: Mok Evelyn LEE; A. David WESTERBERG; H. Haiou YAO; Janina Adamczyk; A. Melissa CHRISTENSEN
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1997-03-13
Filing date: 1998-03-13
Publication date: 2004-08-05
Anticipated expiration: 2018-03-14
Also published as: EP0974060B1; EP0974060A1; DE69817794D1; ATE249049T1; CA2282586A1; US6162645A; JP3356785B2; ES2206900T3; WO1998040750A1; JP2000514196A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins und der Menge an glykiertem Hämoglobin (GHb) in einer Blutprobe, und insbesondere auf ein verbessertes, hochpräzises Einmallese-Verfahren zur Bestimmung des prozentuellen Anteils von glykiertem Hämoglobin, das bedeutet ein Verfahren, das keine Messung des Gesamt-Hämoglobins (THb) erfordert.
Hintergrund der Erfindung
Glykiertes Hämoglobin (GHb) bezieht sich auf eine Reihe von geringfügigen Hämoglobin-Komponenten, die durch die Bindung verschiedener Zucker (meistens Glucose) an das Hämoglobin-Molekül gebildet werden. Die humanen Erythrozyten sind für Glucose leicht permeabel. Innerhalb jedes Erythrozyten wird GHb mit einer Geschwindigkeit gebildet, die zur Umgebungs-Glucosekonzentration direkt proportional ist. Die Reaktion von Glucose mit Hämoglobin ist nicht enzymatisch, irreversibel und langsam, so dass nur ein Teil des Gesamt-Hämoglobins während der Lebensspanne einer Erythrozyte (120 Tage) glykiert wird. Als Ergebnis stellt die Messung von GHb einen gewichteten „beweglichen" Mittelwert der Glucose-Spiegel im Blut dar, der dazu verwendet werden kann, um die langfristigen Blut-Glucosespiegel im Blut zu überwachen, womit ein akkurater Index der durchschnittlichen Glucosekonzentration im Blut über die vorangegangenen 2 bis 3 Monate zur Verfügung gestellt wird. Die wichtigste klinische Anwendung davon ist in der Bewertung der glykämischen Kontrolle bei einem Diabetes-Patienten.
Hämoglobin A1c (HbA1c) ist ein spezifischer Typ von glykiertem Hämoglobin und ist die wichtigste Hämoglobin-Spezies im Bezug auf Diabetes. Die Menge an Gesamt-Hämoglobin, das HbA1c ist, beträgt ungefähr 3 bis 6% bei nicht-Diabetikern und 20 oder mehr bei Diabetes, der schlecht kontrolliert ist (Goldstein DE, et al., Clin. Chem. 32: B64–B70 (1986)). In HbA1c ist die Glucose am aminoterminalen Valinrest einer oder beider der Hämoglobin A beta-Ketten gebunden. Hbalc (wie auch andere glykierte Hämoglobin A1 Spezies) kann von nicht-glykiertem Hämoglobin mittels Verfahren getrennt werden, welche die Moleküle basierend auf Unterschieden in ihren elektrischen Ladungen trennen. Die Glykierung von Hämoglobin findet auch an anderen Stellen auf dem Hämoglobin-Molekül statt, aber diese Spezies können nicht aufgrund von Ladungsunterschieden von nicht-glykierten Hämoglobinen getrennt werden, so dass all diese Hämoglobin-Spezies HbA0 benannt werden. Über die Verfahren, die alle Formen von glykiertem Hämoglobin messen, wird gesagt, dass sie das Gesamt-GHb messen. Weil die Glykierung an einer Stelle zu der Glykierung an jeder anderen Stelle proportional zu sein scheint, gibt es ein lineares Verhältnis zwischen GHb und HbA1c. Die Forschungsgruppe Diabetes Control and Complications Trial (DCCT – Prüfung der Diabeteskontrolle und der Komplikationen) berichtete, dass eine 1%ige Veränderung im GHb (%Hba1c) eine durchschnittliche Veränderung des Glucosespiegels im Blut von 300 mg/L über die vorangegangenen 120 Tage darstellt.
Die traditionellen Verfahren zur Bewertung der Blut-Glucose-Kontrolle bei Diabetes, einschließlich der Glucosespiegels im Urin und im Blut, sind von nur eingeschränktem Wert, weil sie schwanken können, keine Informationen über die Glucosespiegel über eine Zeitspanne hinweg liefern und sie stark durch Diät beeinflußt werden. Die Messung des GHb ist aber ein zuverlässiger Index für den durchschnittlichen Glucosespiegel im Blut einer Person über die vorangegangenen 2 bis 3 Monate und kann einem Diabetes-Patienten einen Überblick über seinen Erfolg beim Erreichen der Langzeitziele in der Kontrolle seines Glucosespiegels im Blut bereitstellen. Weil die GHb-Spiegel dazu verwendet werden können, die glykämische Kontrolle über eine Zeitspanne hin zu überwachen, ist ein hoher Grad an Präzision und Standardisierung der Langzeit-Assays über verschiedene Methodiken wesentlich. Als Antwort auf diese klinischen Erfordernisse hat die American Association for Clinical Chemistry (AACC – Amerikanischer Verein für Klinische Chemie) 1993 ein Subkomitee für die GHb-Standardisierung gegründet. Das Subkomitee für die GHb-Standardisierung hat empfohlen, dass die CVs (Variationskoeffizienten) innerhalb eines Labors, zwischen den Läufen bei unter 5% oder niedriger für alle GHb-Assays gehalten werden sollen und, dass die Standardisierung auf der Korrelation der DCCT für frische Proben basieren soll. Um die Zertifizierung zu bekommen, müssen alle hergestellten Assays diese Anforderungen erfüllen.
Die Verfahren für klinische Assays trennen GHb vom Gesamt-Hämoglobin, entweder basierend auf Ladungsunterschieden oder auf Struktureigenschaften. Die Verfahren, die auf Ladungsunterschieden basieren, schließen Kationenaustauschchromatographie und Elektrophorese ein und trennen HbA1 oder HbA1c von HbA0, basierend auf dem Unterschied in ihren Ladungen. Die Ionenaustauschchromatographie kann entweder in großen Säulen, in Mini- oder Mikrosäulen oder durch Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC) durchgeführt werden. Die Verfahren, die große Säulen verwenden, sind für Routineverwendung in einem klinischen Labor unpraktisch, aber vereinfachte Mini- oder Mikrosäulen sind verfügbar. Diese Verfahren zeigen aber eine schlechte Reproduzierbarkeit und sind gegenüber Schwankungen der Temperatur, des pH-Werts und der Ionenstärke sehr empfindlich. Obwohl die elektrophoretischen Verfahren der Temperatur, dem pH-Wert und der Ionenstärke gegenüber nicht so empfindlich sind, haben sie andere Nachteile, die auch bei den Ionenaustauschverfahren zu finden sind, nämlich Störung durch ein instabiles GHb-Intermediat, das vor der Untersuchung des GHb entfernt werden muß, Probleme, wenn eine Hämoglobinopathie vorhanden ist, Empfindlichkeit gegenüber den Lagerungsbedingungen der Proben und Störungen durch fremde klinische Faktoren, wie die Behandlung mit Aspirin, Ethanolspiegel und Urämie. Außerdem benötigen HPLC und Elektrophorese eine spezialisierte Ausstattung.
Verfahren, die auf Struktureigenschaften basieren, schließen Affinitätsbindung oder Chromatographie und Immunoassays ein. Diese Verfahren sind leichten Veränderungen der Temperatur, des pH-Werts oder der Ionenstärke gegenüber weniger empfindlich und werden im allgemeinen nicht von labilen GHb-Intermediaten, Hämoglobinopathie oder den Lagerungsbedingungen der Proben oder den oben erwähnten fremden klinischen Faktoren beeinträchtigt. Diese Verfahren beruhen aber entweder auf der Trennung des GHb von nicht glykierten Komponenten, oder sie benötigen zwei getrennte Bestimmungen – eine für das Gesamt-Hämoglobin und eine zweite für GHb oder HbA1c – um den GHb zu errechnen. Die EP 227240 offenbart die Verwendung eines Boronat – Liganden, der an eine Festphasen-Matrix gekoppelt ist, die in einem Affinitätsbindungs-Assay verwendet werden kann, aufgrund der Affinität des Boronats für GHb. Die EP 0445225 offenbart die Verwendung von Boronat, um das glykosylierte Hämoglobin zu komplexieren. Die US 4.269.60 offenbart die Verwendung eines an eine Festphasen-Matrix gekoppelten Antikörpers, der in einem Affinitätsbindungs-Assay verwendet werden kann, aufgrund der Affinität des Antikörpers für GHb, und nach der Abtrennung des glykosylierten Hämoglobins, die Verwendung von Boronat, um die Menge an glykosyliertem Hämoglobin zu bestimmen. Die Verhältnisse von gebundenem (glykiertem) Hämoglobin zu nicht gebundenem (nicht-glykiertem) Hämoglobin können dann quantifiziert werden. Die Immunoassays messen HbA1c mit Hilfe von HbA1c-spezifischen Antikörpern, aber benötigen zwei getrennte Bestimmungen, eine für das Gesamt-Hämoglobin und eine andere für HbA1c, um den %GHb zu errechnen. Alternativ kann ein Immunoassay alle Hämoglobin-Spezies durch passive Adsorption binden, dann das HbA1c mit Hilfe eines spezifischen Antikörper-Konjugats detektieren; dieses Verfahren kann aber nachteilig durch Hämoglobin-Varianten beeinflusst werden.
Deshalb wird im Fachgebiet ein verbessertes, hochpräzises Verfahren benötigt, zur Detektion des Vorhandenseins oder der Menge an glykiertem Hämoglobin in einer Blutprobe, das nicht auch die Bestimmung des Gesamt-Hämoglobin-Gehalts erfordert.
EP 708338 offenbart eine Substratschicht zur Aufnahme eines Reaktionsgemisches nach der Vervollständigung einer immunologischen Reaktion zwischen dem glykierten Hämoglobin und einem Enzym-markierten Antikörper gegen das glykierte Hämoglobin, und einer Reagensschicht.
Zusammenfassung der Erfindung
Die hierin beschriebene einzigartige und neue Vorgehensweise mißt GHb in Vollblut-Proben und liefert ein GHb Ergebnis nach nur einer einzigen Messung. Dies unterscheidet sich von den oben beschriebenen und aktuell im Fachbereich zur Verfügung stehenden Verfahren, die getrennte Gesamt- und GHb Messungen erfordern, um ein GHb Ergebnis zu berechnen, wie zum Beispiel, als ein Verhältnis von GHb/THb X 100. Der hierin beschriebene GHb Assay verwendet eine einfache Vorgehensweise zur Bestimmung von DCCT standardisiertem GHb in Vollblut-Proben. Zuerst wird eine lysierte Vollblut-Probe mit einer festen Phase inkubiert, die an Bor-, Borphenyl- oder Borsäure oder eine verwandte Borverbindung gekoppelt ist, über die im Fachgebiet bekannte Chemie der kovalenten Bindungen. Diese feste Phase ist neu, weil sie spezifisch GHb einfängt, in direktem Verhältnis zum %GHb in der Probe. Danach wird eine markierte Komponente, die das humane Hämoglobin erkennt, hinzugefügt und das resultierende Signal ist direkt proportional zum GHb in der Probe. Die Vorteile der Messung des %GHb mit Hilfe einer einzigen Bestimmung schließen eine hohe Präzision (weniger als etwa 5% CVs) und einen hohen Durchsatz (100 bis 200 Tests/Stunde) ein, weil der Assay leicht automatisiert werden kann. Durch Automatisierung kann dieser Assay auch zusammen mit anderen Untersuchungen auf einem Analysator zusammengelegt werden.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 ist eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse der Untersuchung von Vollblut-Proben erläutert, zur Bestimmung der %GHb-Spiegel, mit Hilfe von mit CMA/Merquat beschichteten Partikeln und Proben, die mit einem Polyanion-Reagens vorgemischt sind, entsprechend einer Ausführungsform der Erfindung.
2 ist eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse der Untersuchung von Vollblut-Proben erläutert, zur Bestimmung der %GHb-Spiegel, mit Hilfe von mit CMA/Merquat beschichteten Partikeln mit einem Polyanion-Reagens, entsprechend einer Ausführungsform der Erfindung.
3 ist eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse der Untersuchung von Vollblut-Proben erläutert, zur Bestimmung der %GHb-Spiegel, mit Hilfe von CMA-APBA beschichteten Partikeln, entsprechend einer Ausführungsform der Erfindung.
4 ist eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse der Untersuchung von Vollblut-Proben erläutert, zur Bestimmung der %GHb-Spiegel, mit Hilfe von CMC-APBA beschichteten Partikeln, entsprechend einer Ausführungsform der Erfindung.
5 ist eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse der Untersuchung von Vollblut-Proben erläutert, zur Bestimmung der %GHb-Spiegel, mit Hilfe von PAA-APBA beschichteten Partikeln, entsprechend einer Ausführungsform der Erfindung.
6 ist eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse der Untersuchung von Vollblut-Proben erläutert, zur Bestimmung der %GHb-Spiegel, mit Hilfe von TREN-CMA-APBA beschichteten Partikeln, entsprechend einer Ausführungsform der Erfindung.
7 ist eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse der Untersuchung von Vollblut-Proben erläutert, zur Bestimmung der %GHb-Spiegel, mit Hilfe von TREN-CMC-APBA beschichteten Partikeln, entsprechend einer Ausführungsform der Erfindung.
8 ist eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse der Untersuchung von Vollblut-Proben erläutert, zur Bestimmung der %GHb-Spiegel, mit Hilfe von APBA beschichteten Partikeln, entsprechend einer Ausführungsform der Erfindung.
8A ist eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse der Untersuchung von Vollblut-Proben erläutert, zur Bestimmung der %GHb-Spiegel, mit Hilfe von EDR-CMA-APBA beschichteten Partikeln, entsprechend einer Ausführungsform der Erfindung.
9 ist eine graphische Darstellung, die die Korrelation zwischen den %GHb-Spiegeln, die mit Hilfe der Biorad Diamant HPLC und der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung bestimmt wurden, erläutert.
10 ist eine graphische Darstellung, die die Korrelation zwischen den %GHb-Spiegeln, die mit Hilfe des Abbott IMx^® GHb Assay und der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung bestimmt wurden, erläutert.
11 ist eine graphische Darstellung, die die Lauf-zu-Lauf Korrelation erläutert, wenn die %GHb-Spiegel mit Hilfe der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung bestimmt werden.
12 ist eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse der Untersuchung von Vollblut-Proben erläutert, zur Bestimmung der %GHb-Spiegel, mit Hilfe eines Ein-Schritt-Formats (simultan), entsprechend einer Ausführungsform der Erfindung.
13 ist eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse der Untersuchung von Vollblut-Proben erläutert, zur Bestimmung der %GHb-Spiegel, mit Hilfe von mit Acridinium markiertem Cortex polyklonalem Ziegen anti-humanem Hämoglobin, entsprechend einer Ausführungsform der Erfindung.
14 ist eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse der Untersuchung von Vollblut-Proben erläutert, zur Bestimmung der %GHb-Spiegel, mit Hilfe von mit Acridinium markiertem BiosPacific monoklonalem Ziegen anti-humanem Hämoglobin, entsprechend einer Ausführungsform der Erfindung.
15 ist eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse der Untersuchung von Vollblut-Proben erläutert, zur Bestimmung der %GHb-Spiegel, mit Hilfe von mit Acridinium markiertem BiosPacific polyklonalem Ziegen anti-humanem Hämoglobin, entsprechend einer Ausführungsform der Erfindung.
16 ist eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse der Untersuchung von Vollblut-Proben erläutert, zur Bestimmung der %GHb-Spiegel, mit Hilfe von mit Acridinium markiertem Dako polyklonalem Kaninchen anti-humanem Hämoglobin, entsprechend einer Ausführungsform der Erfindung.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Der Prozentsatz an glykiertem Hämoglobin (GHb) wird nach der Hämolyse der roten Blutkörperchen im Vollblut bestimmt, um Hämoglobin freizusetzen, wonach die Proben verdünnt und mit einer festen Phase inkubiert werden, die eine Bor-reaktive Gruppe besitzt, an die das glykierte Hämoglobin bindet. Danach, oder gleichzeitig, wird das Probengemisch mit einem markierten Anti-Hämoglobin Ak reagieren gelassen. Das resultierende Signal wird detektiert und ist zum %GHb in der Probe direkt proportional. Somit eliminiert das den verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung entsprechende Verfahren die Notwendigkeit zwei Messungen durchzuführen: eine für das GHb und eine zweite für das Gesamt-Hämoglobin, mit einem Verhältnis, um dann den %GHb zu bestimmen.
Ohne sich auf eine bestimmte Theorie zu beschränken bindet das glykierte Hämoglobin anscheinend an den Boronat-Affinitätskomplex, der an die feste Phase gebunden ist. Das Gesamt-Hämoglobin könnte mit dem glykierten Hämoglobin direkt um die Bindung an die feste Phase konkurrieren und somit die genaue Bestimmung des prozentualen Anteils an glykiertem Hämoglobin im Rahmen einer einzigen Messung ermöglichen.
Das Vollblut kann auf verschiedene Weise hämolysiert werden, entweder durch Verdünnung der Vollblut-Probe in Wasser, oder, vorzugsweise, mit Hilfe eines Agens, wie ein nichtionisches oberflächenaktives Detergens, so wie TRITON^® X-100. Die Hämolyse setzt Hämoglobin und seine Derivate aus den roten Blutkörperchen zur Analyse frei.
Der der vorliegenden Erfindung entsprechende GHb Assay basiert auf der Affinität von Boronsäure-, Phenylboronsäure-, Borsäure und Boronat etc. (im folgenden „Boronat") Verbindungen oder Anteilen für glykiertes Hämoglobin. Über den cis-Diol Anteil der an Hämoglobin gebundenen Glucose reagiert das Boronat mit GHb in einer Probe, wobei eine fünfgliedrige Ringstruktur entsteht. Eine Borohatgruppe kann kovalent an eine feste Phase gebunden werden, über verschiedene Arten von chemischen Wirkungsweisen, oder elektrostatisch, und solche Verfahren wurden im Fachbereich beschrieben, einschließlich, beispielsweise im US Patent No. 5.459.080.
Die feste Phase an sich kann aus einer Vielfalt an Materialien ausgesucht werden, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Kügelchen, Mikropartikel, magnetische Mikropartikel, Mikrotiterplatten, Röhrchen und dergleichen, die hergestellt sind aus Polystyrol, Polyacrylamid, Agarose, Dextran, Latex, Silika, Glas, etc., die weiterhin derivatisiert seien können, um funktionelle Oberflächengruppen zu enthalten. Diese funktionellen Oberflächengruppen schließen ein, ohne darauf beschränkt zu sein, Aldehyd, aliphatische Amine, aromatische Amine, Amide, Carbonsäure, Sulfhydryl, Chloromethyl, Epoxy, Hydrazid, Hydroxyl, etc., die dann kovalent an das Boronat oder den Boronatträger gebunden werden können, nach für jene mit Erfahrung im Fachgebiet bekannten Bindungstechniken. Bevorzugte feste Phasen schließen Amino-funktionalisierte magnetische Latexpartikel ein und besonders bevorzugte carboxylierte magnetische Latexpartikel, die zu Amino-Partikeln derivatisiert worden sind, mit Hilfe eines Diamins und Standardbindungstechniken. Die Diamine schließen ein, ohne darauf beschränkt zu sein, Ethylendiamin, 1,6-Hexadiamin, 1,4-trans-Cyclohexandiamin, wobei Ethylendiamin bevorzugt wird.
Bevorzugte funktionelle Oberflächen-Anteile für die Bindung von Boronatverbindungen können aus einer Vielfalt von Materialien ausgewählt werden, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Carboxymethylamylose, Carboxymethylcellulose, Polyasparaginsäure, Proteine, Albumine, Antikörper, etc. und können via bekannter Techniken an die feste Phase gekoppelt werden. Bevorzugte funktionelle Oberflächen-Anteile sind Carboxymethylcellulose, wobei Carboxymethylamylose besonders bevorzugt wird.
Boronatverbindungen zur Verwendung im Verfahren der Erfindung schließen diejenigen ein, die in Gallop, US Patent No. 4.496.722, beschrieben sind. Bevorzugte Verbindungen schließen 4-Carboxyphenylboronsäure, 3-Nitro-5-Carboxyphenylboronsäure und m-Aminophenylboronsäure (APBA) ein. m-Aminophenylboronsäure (APBA) wird besonders bevorzugt.
Das über eine Boronatbindungsgruppe an eine feste Phase gebundene GHb kann dann mit Hilfe eines Antikörpers detektiert werden, der einen Teil des Hämoglobin-Moleküls erkennt, wobei solche Antikörper an einen detektierbaren Anteil gebunden oder mit ihm konjugiert sind. Die markierte Komponente kann ein Antikörper sein, und kann wünschenswerterweise ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper (Ak), oder ein Ak Fragment sein, das die Antigen-Bindungsstelle oder die Komplementarität bestimmende Region (CDR), so wie ein F(ab')₂ oder Fab Fragment enthält. Der detektierbare Anteil oder der Marker kann eine radioaktive, eine fluoreszierende oder eine chemilumineszente Substanz oder ein Enzym sein. Alternativ kann auch ein markierter zweiter Ak verwendet werden, der das Spezies spezifische Fc Fragment des ersten Ab erkennt. Auch ist es möglich, lediglich einen Marker als die markierte Komponente zu haben. In allen Fällen würde ein Signal generiert und detektiert werden, abhängig von der Art der verwendeten Markierungssubstanz.
Als andere Alternative kann, statt einem hinzugefügten Marker, das gebundene Hämoglobin selbst ein detektierbares Signal erzeugen, hervorgerufen durch seine Peroxidase-ähnlichen Eigenschaften. Dieses wird durch die Zugabe von Wasserstoffperoxid erreicht, mit oder ohne Zugabe eines anderen Substrats (z. B. Isoluminol).
Vorzugsweise werden Vollblut-Proben lysiert und verdünnt, mit Hilfe von im Fachgebiet bekannten Verfahren. Die Blutkörperchen werden mit Hilfe von Agenzien lysiert, die dem fähigen Anwender zur Verfügung stehen. Davon werden oberflächenaktive Stoffe und insbesondere nichtionische oberflächenaktive Stoffe bevorzugt. Typisch ist eine 1 : 80 Verdünnung, wobei, zum Beispiel, 0,5% TRITON^® X-100. nichtionischer oberflächenaktiver Stoff verwendet wird. Azovalerian-initiierte, carboxylierte magnetische Mikropartikel werden mit einem Amin beschichtet, vorzugsweise Ethylendiamin (EDA), an das ein Polymer angeheftet ist, vorzugsweise ein polymeres Anion, und insbesondere ein auf Carbonsäure basierendes polymeres Anion, und eine Boronatverbindung. Besonders bevorzugt ist Carboxymethylamylose (CMA) und m- Aminophenylboronsäure (APBA), mit Verwendung von 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (EDAC) als die funktionelle Oberflächenkomponente. Der derivatisierte Mikropartikel wird dann mit der lysierten Probe inkubiert. Nach der Waschung wird mit Acridinium markierter monoklonaler Anti-Hämoglobin-Ak hinzugefügt. Nach Inkubation und Waschung werden Triggerreagenzien hinzugefügt und das resultierende chemilumineszente Signal wird gemessen, als Relative Licht Einheiten (Relative Light Units, ALU). Andere Verfahren zum Ablesen des Signals, das von der markierten Komponente erzeugt wird, befinden sich ebenfalls innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung. Die Kalibratoren oder Standards, die mit dem Assay laufen gelassen werden, stellen Kalibrierungskurven (oder Eichkurven) bereit, aus denen das %GHb in der Probe bestimmt wird, mit Hilfe des gemessenen chemilumineszenten Signals. Das gemessene chemilumineszente Signal ist direkt proportional zum %GHb in der Probe.
Beispiele
Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung verschiedener Ausführungsformen der Erfindung. Diese sind nur als Erläuterung bestimmt und sollten nicht als Einschränkung des Schutzumfangs der Erfindung betrachtet werden.
In Kurzform, das %GHb wurde nach der Hämolyse von Vollblut bestimmt, um Hämoglobine freizusetzen, wonach die Proben verdünnt und mit einer festen Phase inkubiert wurden, die eine Boronat-reaktive Gruppe besaß, an die glykiertes Hämoglobin bindet. Danach, oder gleichzeitig, wurde das Probengemisch mit einem markierten Anti-Hämoglobin-Ak reagieren gelassen. Nach der Waschung wurde das resultierende Signal detektiert und es war direkt proportional zum %GHb in der Probe.
Die folgenden Beispiele zeigen verschiedene Verfahren zur Hämolyse und Verdünnung, verschiedene Mittel zur Bindung einer Boronatgruppe an magnetische Mikropartikel und die Verwendung von Anti-Hämoglobin-Antikörper. Alle Verfahren verwenden einen Sulfopropylacridiniumester (10-(3-Sulfopropyl)-N-tonsyl-N-(2- carboxypropyl)-9-acridiniumcarboxamid) für die chemilumineszente Markierung von Ak, wie in US Patent No. 5.468.646 und US Patent No. 5.543.524 dargelegt und beschrieben, mit der Detektion von Relativen Licht Einheiten (RLU), um die Menge an detektierten Ak, und somit %GHb, quantitativ zu bestimmen.
Beispiel 1 – Anheftung von Boronat an magnetische Mikropartikel
A. CMA/MERQUAT^® beschichtete Amino-Mikropartikel.
Zwei ml Amino-magnetische-Mikropartikel (#AM 40-500, Spherotech, Libertyville, IL) bei 5% Festkörpern wurden 3 mal mit 10 ml 50 mM 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure, pH 6,2 (MES Puffer) gewaschen. Die gewaschenen Mikropartikel wurden dann in 10 ml MES Puffer, der 240 mg Carboxymethylamylose (CMA; #C4947, Sigma, St. Louis, MO) und 96 mg 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (EDAC) enthielt, 60 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Drehschüttler inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Mikropartikel 3 Mal mit 100 mM Taurin Puffer, pH 9, 0, gewaschen und in 10 ml einer 2%igen Merquat Lösung resuspendiert.
Die CMA/Merquat beschichteten Mikropartikel wurden zusammen mit dem IMx^® GHb Polyanion-Reagens (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) verwendet, wie weiter unten in den Beispielen 4.A und 4.B beschrieben. Das Polyanion Reagens besteht aus an Polyacrylsäure gebundene Phenylboronsäure.
B. CMA-APBA beschichtete Amino-Mikropartikel
Zwei ml Amino-magnetische-Mikropartikel (#AM 40-500, Spherotech, Libertyville, IL) bei 5% Festkörpern wurden 3 Mal mit 10 ml MES Puffer gewaschen. Die gewaschenen Mikropartikel wurden dann in 10 ml MES Puffer, der 240 mg CMA und 96 mg EDAC enthielt, 60 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Drehschüttler inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Mikropartikel mit einem Magneten angezogen und der Überstand wurde verworfen. Die Mikropartikel wurden einmal mit 10 ml MES Puffer gewaschen, dann in 10 ml MES Puffer, der 46,5 mg m-Aminophenylboronsäure (Hemisulfat) (APBA) und 96 mg EDRC enthielt, 60 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Drehschüttler inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Mikropartikel 3 Mal mit 100 mM Taurin Puffer, pH 9,0, gewaschen und in 10 ml des gleichen Puffers resuspendiert.
C. CMC-APBA beschichtete Amino-Mikropartikel
Zwei ml Amino-magnetische-Mikropartikel (#AM 40-500, Spherotech, Libertyville, IL) bei 5% Festkörpern wurden 3 Mal mit 10 ml MES Puffer gewaschen. Die gewaschenen Mikropartikel wurden dann in 10 ml MES Puffer, der 240 mg Carboxymethylcellulose (CMC) (MW 250.000; #41931-1, Aldrich, Milwaukee, WI) und 96 mg EDAC enthielt, 60 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Drehschüttler inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Mikropartikel mit einem Magneten angezogen und der Überstand wurde verworfen. Die Mikropartikel wurden einmal mit 10 ml MES Puffer gewaschen, dann in 10 ml MES Puffer, der 46,5 mg APBA und 96 mg EDAC enthielt, 60 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Drehschüttler inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Mikropartikel 3 Mal mit 100 mM Taurin Puffer, pH 9,0, gewaschen und in 10 ml des gleichen Puffers resuspendiert.
D. PAA-APBA beschichtete Amino-Mikropartikel
Zwei ml Amino-magnetische-Mikropartikel (#AM 40-500, Spherotech, Libertyville, IL) bei 5% Festkörpern wurden 3 Mal mit 10 ml MES Puffer gewaschen. Die gewaschenen Mikropartikel wurden dann in 10 ml MES Puffer, der 209 mg 35%iger Polyacrylsäure (PAA) (MW 250.000; #41600-2, Aldrich, Milwaukee, WI) und 96 mg EDAC enthielt, 60 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Drehschüttler inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Mikropartikel mit einem Magneten angezogen und der Überstand wurde verworfen. Die Mikropartikel wurden einmal mit 10 ml MES Puffer gewaschen, dann in 10 ml MES Puffer, der 46,5 mg APBA und 96 mg EDAC enthielt, 60 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Drehschüttler inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Mikropartikel 3 Mal mit 100 mM Taurin Puffer, pH 9,0, gewaschen und in 10 ml des gleichen Puffers resuspendiert.
E. TREN-CMA-APBA beschichtete Carboxyl-Mikropartikel
Zwei ml Carboxyl-magnetische-Mikropartikel (SP1267, Polymer Labs, Shropshire, UK) bei 5% Festkörpern wurden 3 Mal mit 10 ml MES Puffer gewaschen. Die gewaschenen Mikropartikel wurden dann in 10 ml MES Puffer, der 73 mg Tris(2-aminoethyl)amin (TREN) und 96 mg EDAC enthielt, 60 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Drehschüttler inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Mikropartikel mit einem Magneten angezogen und der Überstand wurde verworfen. Die Mikropartikel wurden drei Mal mit 10 ml MES Puffer gewaschen, dann in 10 ml MES Puffer, der 120 mg CMA und 48 mg EDAC enthielt, 60 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Drehschüttler inkubiert. Nach der zweiten Inkubation wurden die Mikropartikel einmal mit 10 ml MES Puffer gewaschen, dann in 10 ml MES Puffer, der 46,5 mg APBA und 96 mg EDAC enthielt, weitere 60 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Drehschüttler inkubiert. Nach der letzten Inkubation wurden die Mikropartikel 3 Mal mit 100 mM Taurin Puffer, pH 9, 0, gewaschen und in 10 ml des gleichen Puffers resuspendiert.
F. TREN-CMC-APBA beschichtete Carboxyl-Mikropartikel
Zwei ml Carboxyl-magnetische-Mikropartikel (SP1267, Polymer Labs, Shropshire, UK) bei 5% Festkörpern wurden 3 Mal mit 10 ml MES Puffer gewaschen. Die gewaschenen Mikropartikel wurden dann in 10 ml MES Puffer, der 73 mg Tris(2-aminoethyl)amin (TREN) und 96 mg EDAC enthielt, 60 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Drehschüttler inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Mikropartikel mit einem Magneten angezogen und der Überstand wurde verworfen. Die Mikropartikel wurden drei Mal mit 10 ml MES Puffer gewaschen, dann in 10 ml MES Puffer, der 120 mg CMC (MW 700.000; 41933-8, Aldrich, Milwaukee, WI) und 48 mg EDAC enthielt, 60 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Drehschüttler inkubiert. Nach der zweiten Inkubation wurden die Mikropartikel einmal mit 10 ml MES Puffer gewaschen, dann in 10 ml MES Puffer, der 46,5 mg APBA und 96 mg EDAC enthielt, weitere 60 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Drehschüttler inkubiert. Nach dieser letzten Inkubation wurden die Mikropartikel 3 Mal mit 100 mM Taurin Puffer, pH 9,0, gewaschen und in 10 ml des gleichen Puffers resuspendiert.
G. APBA beschichtete Carboxyl-Mikropartikel
Zwei ml Carboxyl-magnetischen-Mikropartikeln (SP1267, Polymer Labs, Shropshire, UK) bei 5% Festkörpern wurden 3 Mal mit 10 ml MES Puffer gewaschen. Die gewaschenen Mikropartikel wurden dann in 10 ml MES Puffer, der 43,2 mg APBA und 96 mg EDAC enthielt, 60 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Drehschüttler inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Mikropartikel zwei Mal mit 10 ml 50 mM Taurin Puffer, pH 9,0, gewaschen und in 10 ml des gleichen Puffers resuspendiert.
H. EDR-CMA-APBA beschichtete Carboxyl-Mikropartikel
Zwei ml Azovalerian-initiierte, carboxylierte magnetische Mikropartikel (AB007C, Polymer Labs, Shropshire, UK) bei 5% Festkörpern wurden 3 Mal mit 10 ml MES Puffer gewaschen. Die gewaschenen Mikropartikel wurden dann in 10 ml MES Puffer, der 15 μl Ethylendiamin (EDA) und 10 mg EDAC enthielt, 60 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Drehschüttler inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Mikropartikel mit einem Magneten angezogen und der Überstand wurde verworfen. Die Mikropartikel wurden drei Mal mit 10 ml MES Puffer gewaschen, dann in 10 ml MES Puffer, der 120 mg CMA und 19,6 mg EDAC enthielt, 60 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Drehschüttler inkubiert. Nach der zweiten Inkubation wurden die Mikropartikel einmal mit 10 ml MES Puffer gewaschen, dann in 10 ml MES Puffer, der 46,5 mg APBA und 96 mg EDAC enthielt, weitere 60 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Drehschüttler inkubiert. Nach dieser letzten Inkubation wurden die Mikropartikel 3 Mal mit 50 mM Taurin Puffer, pH 9,0, gewaschen und in 10 ml des gleichen Puffers resuspendiert.
Beispiel 2 – Antikörper Konjugation mit Akridinium
Die zu konjugierenden Antikörper wurden zuerst gegen 3 Wechsel Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) dialysiert, wobei 4 bis 6 Stunden pro Dialysewechsel angewendet wurden. Der Antikörper wurde dann auf eine Konzentration von 1 mg/ml verdünnt. Während die 1 mg/ml Antikörper-Lösung rührte, wurden 10% 3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propansulfonat (CHAPS) und 5 μg/ml Sulfopropylacridimiumester hinzugefügt. Dieses wurde 10 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt und dann auf eine Pharmacia Sephacryl 5-200 Säule, mit einem Bettvolumen von 120 ml (1,6 × 60 cm), geladen. Der verwendete Säulenpuffer war 2,28 mM Mononatriumphosphat, 7,68 mM Dinatriumphosphat, 145 mM NaCl, 0,1% CHAPS, pH 6,3. Es wurden 1 ml Fraktionen gesammelt und jene Fraktionen mit einer Extinktion von 0,1 oder mehr bei 280 nm wurden gepoolt. Der Acridinium-markierte Antikörper wurde auf eine Endkonzentration von 40 ng/ml in Konjugat-Verdünner (10 mM MES, 150 mM NaCl, pH 6,3, der 2% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,5% TRITON^® X-100 enthielt) verdünnt.
Beispiel 3 – GHb Assay Protokoll
Die Mikropartikel wurden mit 100 mM Taurin Puffer, pH 9,0, gewaschen und im gleichen Puffer resuspendiert, auf 0,1% Festkörper, wenn nicht anders erwähnt. Die Vollblut-Proben wurden lysiert und verdünnt, dann wurden 50 μl Probe mit 50 μl Mikropartikeln gemischt und 18 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Dann wurden die Mikropartikel mit einem Magneten angezogen und 4 Mal mit 1 ml Gebräuchlichem Puffer (4 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 7,5, der 0,05 Brij und 0,1% NaN₃ enthielt) gewaschen.
Es wurden fünfzig Mikroliter Acridinium-markierter Antikörper gegen humanes Hämoglobin, wie in Beispiel 2 hergestellt, zu den gewaschenen Mikropartikeln hinzugefügt. Der markierte Antikörper wurde 4 Minuten lang mit Mikropartikeln bei 37°C inkubiert, dann wurden die Mikropartikel mit einem Magneten angezogen und 4 Mal mit 1 ml Gebräuchlichem Puffer gewaschen.
Ein chemilumineszentes Signal wurde generiert, durch die Zugabe von Trigger-Reagenzien, 0,053% HNO₃, 1,2% H₂O₂ und 0,9% Diethylentriaminpentaessigsäure (DPTA), gefolgt von 0,35 N NaOH und 2% TRITON^® X-100. Das chemilumineszente Signal wurde in Relativen Licht Einheiten (RLU) gemessen.
Beispiel 4 – Verwendung von Boronat-magnetischen-Mikropartikeln im GHb Assay
Sechs bis acht Vollblut-Proben wurden für die Untersuchung gewählt, die einen klinischen Bereich von %GHb-Spiegeln abdecken würde, basierend auf ihren %GHb-Spiegeln im IMx^® GHb Assay (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL).
A. CMA/Merquat beschichtete Partikel: Probe + Polyanion Reagens
Die Vollblut-Proben wurden lysiert, durch 1 : 5 Verdünnung in destilliertem Wasser. Das Hämolysat wurde dann weiter 1 : 16 in 0,5%igem TETRONIC^®1307 (BASF #550193, Mount Olive, NJ) in PBS verdünnt. Die Mikropartikel wurden wie in Beispiel 1.A hergestellt, mit 100 mM Taurin Puffer, pH 9,0, gewaschen und dann im gleichen Taurin Puffer, bei 0,1% Festkörpern, resuspendiert. Die verdünnten Vollblut-Proben wurden mit dem gleichen Volumen an IMx^® GHb Polyanion Reagens (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) gemischt und 7 Minuten lang bei 37°C inkubiert, um es dem GHb in der Probe zu ermöglichen, an die Boronatgruppe des Polyanion Reagens zu binden. Nach der Inkubation wurden 50 μl dieser Mischung mit 50 μl Mikropartikeln gemischt, inkubiert und wie in Beispiel 3 gewaschen.
Ein DEAE-gereinigter Maus- monoklonaler Antikörper (IgG₁) gegen humanes Hämoglobin (Klon MIH 9505, Medix Biotech, Inc., San Carlos, CA), der wie in Beispiel 2 mit Acridinium markiert worden war, wurde zu den gewaschenen Mikropartikeln hinzugefügt und das Experiment wurde wie in Beispiel 3 abgeschlossen. Die 1 zeigt, dass das chemilumineszente Signal (RLU) zu dem GHb in der Probe direkt proportional war (R = 0,956).
B. CMA/Merquat beschichtete Partikel + Polyanion Reagens
Die CMA/Merquat beschichteten Mikropartikel von Beispiel 1.A. wurden mit dem IMx^® GHb Polyanion Reagens (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) beschichtet, durch Waschung der Mikropartikel mit 100 mM Taurin Puffer, pH 9,0, und ihre erneute Suspension im Polyanion Reagens bei 0,1% Festkörper. Die Mikropartikel wurden dann mit 100 mM Taurin Puffer, pH 9,0, gewaschen, um den Überschuß an Polyanion Reagens zu entfernen, und im Taurin Puffer bei 0,1% Festkörper resuspendiert.
Fünfzig Mikroliter Proben-Hämolysat, wie in Beispiel 4.A. hergestellt, wurden dann mit 50 μl Mikropartikeln gemischt und der GHb Assay wurde wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt, wobei der gleiche Antikörper wie in Beispiel 4.A. verwendet wurde. Die 2 zeigt, dass das chemilumineszente Signal (RLU) zu dem %GHb in der Probe direkt proportional war (R = 0,984).
C. CMA-APBA beschichtete Partikel
Vollblut-Proben wurden wie in Beispiel 4.A. ausgewählt und mittels 1 : 80 Verdünnung in 0,5% TRITON^® X-100 in destilliertem Wasser hämolysiert. Der GHb Assay wurde dann wie in Beispiel 3 durchgeführt, wobei die Mikropartikel aus Beispiel 1.B. verwendet wurden und der gleiche Antikörper wie in Beispiel 4.A. Die 3 zeigt, dass das chemilumineszente Signal (RLU) zu dem GHb in der Probe direkt proportional war (R = 0,981).
D. CMC-APBA beschichtete Partikel
Der GHb Assay wurde wie in Beispiel 3 durchgeführt, wobei Proben verwendet wurden, die wie in Beispiel 4.C. hergestellt worden waren, die Mikropartikel aus Beispiel 1.C. verwendet wurden und der gleiche Antikörper wie in Beispiel 4.A. Die 4 zeigt, dass das chemilumineszente Signal (RLU) zu dem GHb in der Probe direkt proportional war (R = 0,961).
E. PAA-APBA beschichtete Partikel
Der GHb Assay wurde wie in Beispiel 3 durchgeführt, wobei Proben verwendet wurden, die wie in Beispiel 4.C. hergestellt worden waren, die Mikropartikel aus Beispiel 1.D. verwendet wurden und der gleiche Antikörper wie in Beispiel 4.A. Die 5 zeigt, dass das chemilumineszente Signal (RLU) zu dem GHb in der Probe direkt proportional war (R = 0,928).
F. TREN-CMA-APBA beschichtete Partikel
Der GHb Assay wurde wie in Beispiel 3 durchgeführt, wobei Proben verwendet wurden, die wie in Beispiel 4.C. hergestellt worden waren, die Mikropartikel aus Beispiel 1.E. verwendet wurden und der gleiche Antikörper wie in Beispiel 4.A. Die 6 zeigt, dass das chemilumineszente Signal (RLU) zu dem %GHb in der Probe direkt proportional war (R = 0,978).
G. TREN-CMC-APBA beschichtete Partikel
Der GHb Assay wurde wie in Beispiel 3 durchgeführt, wobei Proben verwendet wurden, die wie in Beispiel 4.C. hergestellt worden waren, die Mikropartikel aus Beispiel 1.F. verwendet wurden und der gleiche Antikörper wie in Beispiel 4.A. Die 7 zeigt, dass das chemilumineszente Signal (RLU) zu dem GHb in der Probe direkt proportional war (R = 0,994).
H. APBA beschichtete Partikel
Der GHb Assay wurde wie in Beispiel 3 durchgeführt, wobei Proben verwendet wurden, die wie in Beispiel 4.C. hergestellt worden waren, die Mikropartikel aus Beispiel 1.G. und der gleiche Antikörper wie in Beispiel 4.A. Die 8 zeigt, dass das chemilumineszente Signal (RLU) zu dem %GHb in der Probe direkt proportional war (R = 0,991).
I. EDA-CMA-APBA beschichtete Partikel
Der GHb Assay wurde wie in Beispiel 3 durchgeführt, wobei Proben verwendet wurden, die wie in Beispiel 4.C. hergestellt worden waren, die Mikropartikel aus Beispiel 1.H. und der gleiche Antikörper wie in Beispiel 4.A. (Das Verfahren in diesem Format wird als der IPLS GHb Assay bezeichnet). Die 8A zeigt, dass das chemilumineszente Signal (RLU) zu dem %GHb in der Probe direkt proportional war (R = 0,985).
Beispiel 5 – Korrelation des IPLS GHb Assays mit Biorad Diamant HPLC und Abbott IMx^® GHb
110 Vollblut-Proben wurden von einem Krankenhauslabor erhalten, wo sie im vorhinein auf GHb untersucht worden waren, mit Hilfe des Biorad Diamant HPLC Verfahrens, um die %Hbalc- Spiegel zu erhalten. Boronat-Affinitäts-Bindungs-Verfahren, wie diejenigen die in den hier beschriebenen Assays verwendet werden, detektieren alle GHb Spezies, einschließlich HbA1c. Weil ein lineares Verhältnis zwischen GHb und HbA1c existiert, können Vergleiche gemacht werden zwischen Tests, die GHb und HbA1c messen.
Der IPLS GHb Assay wurde wie in Beispiel 4.I. durchgeführt, mit den 110 Proben die wie in Beispiel 4.C. hergestellt waren. Die Ergebnisse wurden mit den Biorad Diamant HPLC (Brea, CA) und IMx^® GHb (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) Assays korreliert (9 beziehungsweise 10).
Die Korrelation zwischen den IPLS GHb und den Diamant HPLC Assays (9) war 91%. Die Korrelation zwischen den IPLS GHb und den IMx^® GHb Assays (10) war 93%.
Zusätzlich wurden zwei Läufe mit denselben 110 Proben durchgeführt, mit Hilfe des IPLS GHb Assays, um die Lauf-zu-Lauf Korrelation zu bestimmen. Diese in 11 gezeigten Ergebnisse zeigten eine ausgezeichnete Übereinstimmung (98%) zwischen den zwei Läufen (Lauf 1 versus Lauf 2).
Beispiel 6 – Ein-Schritt Format
Die Hämolysat-Proben wurden wie in Beispiel 4.C. hergestellt. Die wie in Beispiel 1.H. hergestellten Mikropartikel wurden mit 50 mM Taurin Puffer, pH 9,0, gewaschen und im gleichen Puffer, bei 0,1% Festkörper, resuspendiert. Der markierte Antikörper war der gleiche Antikörper wie in Beispiel 4.A. Der Assay wurde durch Inkubation von 50 μl Hämolysat, 50 μl Mikropartikel und 50 μl Acridinium-markiertem Antikörper bei 37°C, 25 Minuten lang, durchgeführt. Die Partikel wurden dann mit einem Magneten angezogen und 4 Mal mit 1 ml gebräuchlichem Puffer gewaschen. Ein chemilumineszentes Signal wurde durch die Zugabe von Trigger-Reagenzien generiert. Die 12 zeigt, dass das chemilumineszente Signal (RLU) zu dem %GHb in der Probe direkt proportional war (R = 0,973). Somit detektiert der Assay genau %GHb, sowohl in Ein-Schritt, als auch in Zwei-Schritt Formaten.
Beispiel 7 – Verwendung von verschiedenen Antikörpern
Die vorigen Beispiele verwenden alle DERE-gereinigte Mausmonoklonale-Antikörper (IgG₁) gegen humanes Hämoglobin, von Medix Biotech: Es können auch andere Antikörper, einschließlich polyklonale, von verschiedenen Spezies, und auch monoklonale verwendet werden.
Der GHb Assay wurde wie in Beispiel 3 durchgeführt, außer dass beide Inkubationen bei 37°C 10 Minuten lang durchgeführt wurden, mit Proben die wie in Beispiel 4.A. hergestellt wurden, den Mikropartikeln von Beispiel 1.A. und den folgenden, wie in Beispiel 2 mit Acridinium markierten Antikörpern gegen humanes Hämoglobin: (1) polyklonales Ziegen anti-human Hämoglobin (#CR8000 GAP, Cortex Biochem, San Leandro, CA), (2) monoklonales anti-human Hämoglobin (#A36380, BiosPacific, Emeryville, CA), (3) polyklonales Ziegen anti-human Hämoglobin (#G32100, BiosPacific, Emeryville, CA) und (4)) polyklonales Kaninchen anti-human Hämoglobin (#A118, Dako Corp., Carpinteria, CA). Die in den 12 bis 16 gezeigten Ergebnisse zeigen, dass das chemilumineszente Signal (RLU) zu dem %GHb in der Probe direkt proportional war. Die Korrelationskoeffizienten (R Werte) für Assays, bei Verwendung jedes Ak, waren 0,982, 0,975, 0,946 und beziehungsweise 0,869. Somit sind polyklonale oder monoklonale Antikörper gegen humanes Hämoglobin in diesem Assay Format für die genaue Detektion von %GHb verwendbar.

Claims

Ein Einmallese-Verfahren zur Bestimmung des Prozentsatzes von glykiertem Hämoglobin (GHb) in einer Vollblut-Probe, das folgende Schritte umfasst: a) Lysieren einer Vollblut-Probe, um glykiertes Hämoglobin freizusetzen; b) Inkubieren der lysierten Blutprobe mit einer festen Phase, wobei die feste Phase an einen Boronat-Anteil gekoppelt ist, worin die feste Phase spezifisch glykiertes Hämoglobin (Hb) einfängt, in direktem Verhältnis zu dem Prozentsatz von glykiertem Hämoglobin (Hb) in der Probe; c) Hinzufügen einer markierten Komponente, die spezifisch ist für Hämoglobin, zu der Probe; d) Abtrennen der markierten Komponente, die nicht an Hämoglobin gebunden ist, das auf der festen Phase immobilisiert ist, von markiertem Hämoglobin, das auf der festen Phase immobilisiert ist; e) Messen eines resultierenden Signals; und f) Bestimmen eines Prozentsatzes von glykiertem Hämoglobin in der Probe, basierend auf dem resultierenden Signal, unter der Voraussetzung, dass das Gesamt-Hämoglobin nicht gemessen wird.
Das Verfahren von Anspruch 1, worin die feste Phase gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Kügelchen, Mikropartikeln, magnetischen Mikropartikeln, Mikrotiterplatten und Röhrchen.
Das Verfahren von Anspruch 1, worin der Boronat-Anteil gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Borsäure, Boronat-Verbindungen und Phenylboronsäuren.
Das Verfahren von Anspruch 3, worin die Phenylboronsäuren gewählt sind aus der Gruppe bestehend aus 4-Carboxyphenylboronsäure, 3-Nitro-5-carboxyphenylboronsäure und m-Aminophenylboronsäure (APBA).
Das Verfahren von Anspruch 1, worin die markierte Komponente gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus markierten monoklonalen und polyklonalen Antikörpern und anderen markierten Molekülen mit einer Affinität für Hämoglobin.
Das Verfahren von Anspruch 1, worin die markierte Komponente ein Marker ist.
Das Verfahren von Anspruch 1, worin ein Marker der markierten Komponente gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus radioaktiven, fluoreszierenden, chemilumineszenten Substanzen und Enzymen.
Ein Einmallese-Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das resultierende Signal von Schritt c) von der markierten Komponente gemessen wird.