JP3340129B2 - グリコヘモグロビンの迅速測定 - Google Patents

グリコヘモグロビンの迅速測定

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 グリコヘモグロビンは、ヘモグロビン分子に各種の糖
類（最も一般的にはグルコース）が結合して生成される
一連のヘモグロビン少量成分を意味する一般的用語であ
る。糖尿病の観点からしてこれらヘモグロビン少量成分
のうち最も重要なものは、ヘモグロビンA1cである。こ
れは、ヘモグロビンＡの一方もしくは両方のβ鎖におけ
るＮ−末端アミノ酸残基バリンにグルコースが結合して
形成される［Goldstein,D.E.等、Clin.Chem.32:B64−B7
0,1986］。
ヒト赤血球はグルコースを自由に透過しうる。各赤血
球内には、グリコヘモグロビンがヘモグロビンＡ（天然
の正常型）から周囲グルコース濃度に比例した割合で形
成される。この反応は自発的であって酵素触媒を要しな
いものの、充分に遅く、このため赤血球の寿命（120
日）の間にはヘモグロビンのごく一部が修飾されるだけ
で、かつこれは不可逆性である。その結果、グリコヘモ
グロビンは過去の血糖値の加重「移動」平均の尺度とな
り、より最近の血糖値がより大きく影響する［Singer
等,Ann.Clin.Biochem.26:213−219,1989］。
グリコヘモグロビンのレベル上昇は真性糖尿病に関連
することが知られている。非糖尿病患者ではグリコヘモ
グロビンは全ヘモグロビンの約５％のレベルにて存在す
るのに対し、糖尿病患者はこの量の２〜４倍を示す。グ
リコヘモグロビンレベルは血糖値の短期変動には比較的
影響を受けず、糖尿病患者における血糖管理の状態を比
較的正確に反映する。その結果は、過去１〜３ケ月にわ
たる期間平均血糖濃度を示す。グリコヘモグロビン測定
は糖尿病患者におけるグルコース不耐性程度の評価およ
び真性糖尿病の管理に使用される［Lester,Ann.Clin.Bi
ochem.26:213−219,1989;Kennedy等,Br.Med.Bull.45:17
4−190,1989;Flueckiger等,J.Chromatogr.429:279−29
2,1988;Goldstein,等,Clin.Chem.32:B64−70,1986;Mort
ensen,Dan.Med.Bull.32:309−328,1985;Goldstein等,CR
C Crit.Rev.Clin.Lab.Sci.21:187−228,1984,Peacock,
J.Clin.Pathol.37:841−851,1984;Miedema等,Ann.Clin.
Biochem.21:2−15,1984;Mayer等,Clin,Chem.Acta 127:1
47−184,1983;Gabbay,Med.Clin.North Am.66:1309−131
5,1982」。
グリコヘモグロビンを、ヘモグロビンA1cもしくはヘ
モグロビンA1として或いは全グリコヘモグロビンとして
測定するには種々の方法がある（イオン交換クロマトグ
ラフィー、チオバルビツール酸法、等電点照準法および
親和性クロマトグラフ分析）［Cole,R.A.等,Metabolism
27:289−301,1978;Nathan,D.M.Clin.Chem.27:1261−12
63,1981;Moore,J.C.等,Ann.Clin.Biochem.23:85−91,19
86］。イオン交換クロマトグラフィーにおいて、ヘモグ
ロビンA1cを含めて多くのグリコヘモグロビン物質は中
性pHにてヘモグロビンAcよりも陽帯電が低く、陰帯電樹
脂にあまり結合しない［Rosenthal,P.K.等,Am.J.Clin.P
athol.75:45−49,1981;米国特許第4,407,961号、米国特
許第4,649,122号］。ヘモグロビンA1cをヘモグロビンA
1a+bフラクションから分離する幾つかの方法が記載され
ている［Coldstein,D.E.等,Diabetes 31:70−78,1982;M
aquart,F.X.等,Clin.Chim.Acta 108:329−332,1980;Jon
es,M.D.等,Hemoglobin 2:53−58,1978;Clarke,J.T.等,D
iabete Metabol.5:293−296,1979;Davis,J.E.等,Diabet
es 27:102−107,1978;Cole,R.A.等,Metabolism 27:289
−301,1978;米国特許第4,389,491;Bio−Rad Laboratori
es,Hemoglobin A1c Micro Column Test Instruction Ma
nual,March 1990］。しながら、これら方法にはいろい
ろの欠点を有する、これら方法の多くは２種の緩衝液を
用い、その第１緩衝液は特異結合した物質を脱着させな
いように未結合物質をイオン交換樹脂から溶出させる。
異なるpHもしくはイオン強度で用いられ或いは競合抑制
剤を含有する第２緩衝液が、特異結合した物質を溶出さ
せるのに必要とされる。温度、pH、イオン強度およびカ
ラム寸法が試験結果に影響を及ぼす［Simon,M.等,Diabe
tes 29:467−474,1980;Schellekens,A.P.M.等,Clin.Che
m.27:94−99,1981;Castagnola,M.等,J.Chromatogr.272:
51−65,1983］。さらに、これら方法は幾つかの異なる
工程および数個の容器を必要とし、殆どの方法は自動化
されず、或いは半自動化されるに過ぎない。
用いる方法に応じ、これら分析法の他の限界は可逆性
の中間グリコ型「プレ−ヘモグロビン−A1c」を含むこ
とであり、これは分析を行う前に除去する必要がある
［Goldstein,D.E.等,Diabetes 31:70−78,1982;Bunn,H.
F.Diabetes 30:613−617,1981;Nathan,D.M.Clin.Chem.2
7:1261−1263,1981;Mayer,T.K.等,Clin.Chim.Acta 127:
147−184,1983;Health and Public Policy Committee,A
merican College of Physicians Ann.Intern Med.101:7
10−713,1984;Nathan,D.M.Clin.Chem.27:1261−1263,19
81］。高レベルの胎児ヘモグロビン、鎌状ヘモグロビン
および他の希な状態がこの分析を阻害しうる［Niejadli
k,D.C.等,JAMA 224:1734−1736,1973］。
グリコヘモグロビンを測定する他の方法は、グリコヘ
モグロビンと結合する特異的親和性もしくは結合剤を使
用する。次の特許、すなわち米国特許第4,200,435号；
第4,260,516号；第4,274,978号；第4,255,385号；およ
び第4,438,204号において、グリコヘモグロビンは親和
性法またはヘモグロビンのアロステリック特性を用いて
測定される。ドイツ特許第159569号には、親和性試薬と
して糖結合性蛋白が記載されている。
他の親和性結合性は、グリコヘモグロビンとボロン酸
（boronic acid）誘導体との間の特異的な錯体形成に基
づいている［Middle等,Biochem.J.209:771−779,1983;K
lenk等,Clin.Chem.28:2088−2094,1982;Little等,Clin.
Chem.32:358−360,1986、米国特許第4,269,605号；米国
特許第4,861,728号；英国特許出願第2 206 411A号;Isol
ab,Inc.Technical Publication:GlycAffintm GHb,1986;
Forrest,R.D.等,Clin.Chem.34:145−148,1988］。親和
性結合法はHbAの他にグリコヘモグロビン類も検出する
が、これらはたとえばイオン交換クロマトグラフィーの
ようなHbA1cに対し一層特異的な方法に対し比例関係に
ある［Little等,Clin.Chem.32:358−360,1986］。グリ
コヘモグロビンに関するイオン交換分析および比色分析
と同様に、親和性法も限界を有する。これら限界の１つ
は、２種の異なる緩衝液を必要とすることである。第１
緩衝液は、cis−ジオール基を持たない非グリコフラク
ションを溶出させる。グリコヘモグロビンが多い結合フ
ラクションは、たとえば糖アルコールのようなカラムか
らグリコヘモグロビンを排除する置換剤を含有した第２
緩衝液で溶出される。さらに流速およびカラムの寸法
も、親和性試薬に結合するヘモグロビンの量を制限す
る。
標準曲線を作成し分析精度を決定するための、グリコ
ヘモグロビン分析に用いるのに適した安定なグリココシ
ル化標準または較正手段もしくは対照については種々の
意見がある［Goldstein,D.E.等,Clin.Chem.32,10B:B64
−B70,1986;Franzini,C.等,G.Ital.Chim.Clin.9:187−1
92,1984］。これら対照の中には、保存料を添加した赤
血球の溶血物に過ぎないものもある［東独特許第150543
号；米国特許第3519572号；英国特許第934461号］。こ
れら物質はしばしば凍結乾燥され、使用地の実験室で再
編成されて数日間〜数週間にわたり使用される［Bio−R
ad Laboratories,Hemoglobin A1c Micro Column Test I
nstruction Manual,March 1990］。このようにしたとき
の物質の安定性は充分に説明されていない。シアノメテ
モグロビン；オキシヘモグロビン−ポリヒドロキシ化合
物；および一酸化炭素型のヘモグロビンを用いて、安定
なヘモグロビン標準を形成するよう試みた人もいる［ド
イツ特許第3311458号；ヨーロッパ特許第72440号；およ
びMosca,A.等,J.Clin.Chem.Clin.Biochem.23:361−364,
1985］。現地で作成される対照（一般に正常および糖尿
病の試料から作成した全血もしくは充填赤血球の溶血
物）を用いることにより、多くの実験室は分析精度を管
理している［Goldstein,D.E.Diabetes 31:70−78,1982;
Cole,R.A.等Metabolism 27:289−301,1978;Simon,M.等,
Clin.Chem.28:195−198,1982;Parker,K.M.等,Clin.Che
m.27:669−672,1981］。これらの対照は、安定性を保つ
よう精密に制御された条件下で貯蔵せねばならない［Wa
linder,O.Clin.Chem.28:96−99（1982）］。
実施が容易であり、阻害を受けず、かつたとえばpHお
よび温度のような実験変動因子に対し比較的敏感でない
グリコヘモグロビン分析については、引き続き要求があ
る。さらに、この種の分析に用いるための安定な標準お
よび対照、並びに標準の作成方法も期待されている。
発明の要点 本発明は、検出すべき基質結合性物質と基質非結合性
物質とを含有する試料において、基質結合性物質の比率
もしくは濃度を検出すると共に定量する方法に関するも
のである。より詳細には本発明は、検出すべき基質結合
性物質と基質非結合性物質とを含有する試料において、
基質結合性物質の比率もしくは濃度を検出すると共に定
量する迅速法に関するものである。
本発明によれば、基質結合性物質と基質非結合性物質
とを含有する試料の吸光度を測定し、特異的結合剤もし
くは親和性剤を付着させた固体基質を添加する。結合反
応における基本的成分は試料と、結合剤を付着させた固
体基質と、結合反応に適合性の緩衝溶液とである。
結合反応の後、試験の吸光度を適する検出装置を用い
て測定する。試料の量もしくは相対活性は、固体基質に
より結合された結合性物質の量に逆相関する。
したがって本発明の一態様は、基質結合性物質を含有
すると思われる試料におけるこの基質結合性物質の存在
および量を決定する方法に関し、この方法は基質結合性
物質と基質非結合性物質とを含有する試料の初期吸光度
を測定し、結合性物質に対し特異的な結合剤を付着させ
た固体支持体に基質結合性物質を結合させ、基質結合性
物質が除去され或いは減少した試料の吸光度を測定し、
次いで基質結合性物質の比率を計算することを含む。
本発明の好適態様は、グリコヘモグロビンと非グリコ
ヘモグロビンとの両者を含有する試料において、グリコ
ヘモグロビンの相対量を決定する方法に関する。グリコ
ヘモグロビンを特異的に結合する結合剤もしくは親和剤
を固体基質に付着させ、これを混合すると共に粒子を試
験溶液から分離するようにした容器に仕込む。２回の吸
光度測定を試験溶液につき行うが、１回目は試薬／希釈
剤と試験溶液との混合直後に行い、さらに他方の吸光度
測定はグリコヘモグロビンが固体基質に実質的に結合し
た後に行う。分析の化学的原理は、３−アミノフェニル
ボロン酸に対するcis−ジオール化合物の親和性結合に
基づいている。全グリコヘモグロビンとヘモグロビンA
1cとの間には直線的関係があるので、％ヘモグロビンA
1cに相当する単位の基準化および記録が可能となる。
本発明の他の態様は、グリコヘモグロビンの測定に用
いるための安定な液体グリコおよび非グリコヘモグロビ
ン溶液の製造方法に関するものである。
さらに他の態様において本発明は、グリコヘモグロビ
ンの測定に用いるためのキットに関するものである。
さらに他の態様において本発明は、糖尿病患者の診断
および管理に際し有用なグリコヘモグロビン比率の決定
方法を提供する。
図面の説明 本発明のこれらおよび他の目的、特徴および多くの利
点は添付図面を参照する以下の詳細な説明から一層よく
理解されるであろう。
第１図は本発明の好適実施例に用いる試験パックの図
解の平面図である。試験パックの詳細については、多孔
質フィルタを含むよう改変した米国特許第4,883,763号
に記載されている。
第２図は、アボット・ビジョン（登録商標）分析器に
て本発明の方法により決定された牛アジド−メト−ヘモ
グロビン検量手段を用いるグリコヘモグロビンの標準曲
線である。
第３図はグルコール濃度の関数としての牛ヘモグロビ
ンのインビトログリコ化における経時的試験である。
第４図は45℃にて24時間のストレスにより示したシア
ノ硼水素化ナトリウムでの還元によるグリコ牛アジド−
メト−ヘモグロビンの安定化を示す。
第５図はグリコ化されかつ還元されたヘモグロビンと
グリコ化されずかつ還元されないヘモグロビンとの比較
安定性を示す。
第６図は−20℃および２〜８℃で貯蔵したグリコ牛ア
ジド−メト−ヘモグロビン検量物質の長期安定性を示
す。検量手段Ａ＝4.4〜5.0％グリコヘモグロビン（HbA
1c）；検定手段Ｂ＝12.4〜14.0％HbA1c;検定手段Ｃ＝2
0.7〜23.3％HbA1c。
第７図は本発明による方法とHPLC−グリコHb法との間
の相関関係を示す。相関係数（CC）＝0.979。
第８図は本発明による方法とイソラブGlyc−Affinヘ
モグロビン分析との間の相関関係を示す。相関係数（C
C）＝0.991。
発明の詳細な説明 本発明により解決された主たる問題は、２回の吸光度
測定が必要とされる方法の自動化であった。１回目の測
定は試料における結合性物質および非結合性物質の合計
濃度に比例するものであり、他方は結合反応の後の結合
もしくは遊離のいずれかのフラクションに比例するもの
である。両測定を単一の試験溶液から単一の試験容器内
で行いたいという点に困難の原因がある。これは、自蔵
の試薬容器を用い、慣用のカラムクロマトグラフ分離ま
たは緩衝液の変更なしに、好ましくは自動化装置で行う
ことができる。
本発明の一態様は、試料における基質結合性物質と基
質非結合性物質との全体に対する基質結合性物質の比を
決定するための連続法（好ましくは自動化法）を提供
し、この方法は試料を固体基質と混合し、基質結合性物
質と基質非結合性物質とを含有する試料の初期吸光度を
測定し、基質結合性物質が除去された試料の吸光度を測
定し、次いで基質結合性物質の比を計算することからな
っている。固体基質は、基質結合性物質のための結合剤
を付着させた粒子で構成することができる。これら粒子
は吸光度の測定に際し試料から分離される。これは数種
の手段によって行うことができ、その１つは試料と粒子
との混合物をこれら粒子を保持する多孔質フィルタに通
すことである。
基質結合性物質は、結合剤に対し親和性を有する任意
の分子とすることができる。この種の結合性物質は炭水
化物、蛋白質、核酸、脂質などを包含する。結合性物質
は動物、植物、細菌、酵母、原生動物、ウィルス、組換
産生させた物質などから誘導することもできる。試料か
ら基質結合性物質を除去したとき、試料に測定可能な変
化が生じ、これをたとえば分光光度計、蛍光度計などの
装置によって検出することができる。好ましくは、測定
可能な変化は分光光度計を用いて測定されるような試料
の光学密度変化である。基質結合性物質が試料から除去
され或いは部分的に除去されたことを検出するには、増
幅システムを必要とすることが容易に了解されよう。こ
の種の増幅システムは当業者にて公知であり、酵素：基
質系などを包含する。
本発明の一態様は、グリコおよび非グリコヘモグロビ
ンを含有する試料におけるグリコヘモグロビンの比もし
くは比率を決定する方法を提供し、この方法はグリコお
よび非グリコヘモグロビンを遊離させるよう試料を処理
し、次いで固体基質をグリコヘモグロビンと固体基質と
の間の錯体形成を行う条件下で試料と接触させ、次いで
試料の全ヘモグロビン含有量に関連する初期吸光度を測
定し、グリコヘモグロビンを固体基質に結合させること
によりこのグリコヘモグロビンを試料から分離し、次い
でグリコヘモグロビンが除去され或いはグリコヘモグロ
ビンが著しく減少した試料の吸光度を測定することから
なっている。
本発明の方法は、たとえばRNA、オリゴヌクレオチド
のような他のcis−ジオールを含有する物質、たとえば
D,L−ドーパ、エピネフリン、ノルエピネフリンなどを
包含するカテコールのような小生理分子、たとえばクエ
ン酸、乳酸などのα−ヒドロキシカルボン酸、およびた
とえばアルブミンなどの他のグリコ蛋白質を検出するた
め用いることができる。必要な1,2−cis−ジオール構造
を持たない物質でも、しばしばポリオールで容易に誘導
でき、これを次いでジヒドロキシボリル成分に結合でき
る。たとえば大抵のヌクレオチドおよび核酸は、0.5Mの
MOPS緩衝液（pH5.5）にて25℃で２時間にわたり過剰の
ソルビトールおよび１−エチル−３（３−ジメチルアミ
ノプロピル）−カルボジイミド（EDC）で処理して末端
ホスフェートを介しソルビトールに結合させることがで
きる［生化学分離におけるボロネートリガンド、パブリ
ケーション501、アミコン・コーポレーション社、198
1］。通常はボロネートに結合しないデオキシリボヌク
レオチドおよびDNAを、ポリオール誘導化に関し３′も
しくは５′末端ホスフェートが利用できれば、緊密結合
されることができる。誘導化したリガンドは、所望なら
ばホスホジエステラーゼでの処理によりもとの形態に戻
すこともできる。ソルビトールの代わりにメチル−グル
カミンを用いて、化学切断しうる基を形成させることが
できる。或いは、非cis−ジオール含有分子をジヒドロ
キシボリル成分に結合させることもでき、これにはcis
−ジオール含有分子を結合剤として用い、ただしcis−
ジオール含有分子は非cis−ジオール含有分子に対し親
和性を有するものとする。この種のcis−ジオールおよ
び非cis−ジオール結合対の例は次のものを包含する：
メチル−α−Ｄ−グルコピラノシド：コンカナバリンA;
NAD（Ｐ）+:グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲ
ナーゼ;ATP:ヘキソキナーゼなど。
グリコヘモグロビンを測定するための本発明は、グリ
コヘモグロビンを固体支持体から溶出させることを必要
としない迅速連続システムで前記グリコヘモグロビンを
測定する点において従来技術とは相違する。また本発明
は分析に際し緩衝液の交換を必要としない。好ましく
は、システムは自動化させる。
さらに本発明は、グリコヘモグロビンを測定する分析
で検量手段および対照として使用するための、明瞭に規
定された安定なグリコ標準およびこれら標準の作成方法
をも提供する。
本発明の原理は小アガロースビーズに固体化させた３
−アミノフェニルボロン酸に対するグリコヘモグロビン
の親和性結合に基づいており、553/628nmにて二色吸光
度を介して測定する。全ヘモグロビン濃度に比例する初
期吸光度測定を、試料と試薬および希釈剤との混合の後
に行う。グリコヘモグロビン（たとえばHbA1c）の同一
平面cis−ジオール基と固定化３−アミノフェニルボロ
ン酸との間の錯体形成が、希釈試料をボロネートアガロ
ースと反復混合する際に生ずる。この結果、グリコヘモ
グロビンが希釈試料から除去される。［合計−グリコヘ
モグロビン］の濃度に比例する最終吸光度測定により結
合Hb％の計算が可能となり、これを用意した検量曲線を
用いて基準化HbA1c％に変換する。
第１工程として、試料（好ましくはグリコヘモグロビ
ンを含有すると思われる試料、特に好ましくは全血試
料）を得ねばならない。次の試料、すなわちヘパリンも
しくはEDTAを用いて凝固防止した全血が好適である。し
かしながら、クエン酸ナトリウムおよび弗化ナトリウム
中に集めた試料も使用することができる。血液試料のお
けるグリコヘモグロビンを測定するに先立ち、赤血球を
溶解させる必要がある。赤血球の溶解により、グリコヘ
モグロビンと非グリコヘモグロビンとの両者が細胞から
放出される。一般的な陽イオン型（たとえば臭化セチル
トリメチルアンモニウム）；陰イオン型（たとえばドデ
シル硫酸ナトリウムおよびデオキシコリン酸ナトリウ
ム）；並びに中性（たとえばサポニンおよびオクチルフ
ェノキシポリエトキシエタノール）活性剤が、赤血球を
溶解させるのに有用である。約0.025〜0.5容量％の濃度
範囲における中性活性剤が好適である。機械的破壊、た
とえば超音波処理および低張性溶解も赤血球からヘモグ
ロビンを遊離させるのに効果的な方法である。
試薬の長期貯蔵安定性を得るには、少量の微生物防止
剤を系に添加することが望ましく、これは溶剤、抗生物
質および毒を包含する。他の生化学物質（たとえばグリ
コヘモグロビンの測定におけるKCN）を溶血した血液試
料に導入することもできる。
次いで、試料をグリコヘモグロビンに対し特異的な結
合剤もしくは新和剤で処理して、グリコヘモグロビンを
非グリコヘモグロビンから分離させる。１つの方法にお
いては、グリコおよび非グリコヘモグロビンを含有する
溶血した赤血球の試料を、ジヒドロキシボリル成分が結
合された固体基質と接触させる。他の具体例において
は、固体支持体に、たとえばHbA1cに対し特異的に結合
する抗体またはHbA1cに特異的に結合するレクチンのよ
うな異なる結合剤もしくは親和剤を結合させる。
固体支持体はビーズ、樹脂などの形態とすることがで
きる。特に好適な具体例においては、固体支持体を個々
の粒子または微粒子の形態とする。これら粒子は天然も
しくは合成ポリマー物質で構成することができ、所望に
応じこれらを架橋させてもさせなくても良く、或いは化
学的に改変することもできる。好ましくはポリマーはた
とえばポリアクリルアミドのように親水性であり、或い
はたとえば登録商標ウルトラゲルとして販売されるよう
なアガロースポリアクリルアミド共重合体またはアガロ
ース或いはたとえばセルロース、セルロース誘導体、澱
粉、デキストランおよび架橋デキストランのような遊離
ヒドロキシル基を有するポリマー、たとえば登録商標セ
ファデックス、セファロースおよびセファクリルとして
販売されるものである。粒子の直径は広範囲に変化しう
るが、40〜200μｍの粒子が好適である。
この性質を有する粒子は結合剤もしくは親和剤を付着
させるための固定基質として役立ち、容器内で容易に使
用することができる。容器は、グリコヘモグロビンと固
定支持体との間の結合を生ぜしめると共に吸光度を測定
するものである。好適容器は、粒子を試験溶液と混合し
うると共に粒子を吸光度測定に際し溶液から分離しうる
容器である。最も好適な容器は、米国特許第4,883,763
号（参考のためここに引用する）に記載されたような固
相分析装置もしくは試料処理カードの改良型である。混
合リブ領域における円筒穴部は多孔質フィルタ挿入物を
収容する。フィルタ挿入物はアガロース粒子がキュベッ
ト内に侵入するのを防ぐと共に、希釈試料が流過するア
ガロース充填ベットの形成を可能にする。試薬および希
釈剤を二重（ピール）カップに精密に充填する。希釈比
は約1:60である。希釈比は、この分析が質量／容積濃度
を測定するものでないため重要でない。
この固相分析装置を用い、装置内に入れた粒子にグリ
コヘモグロビン用の特異的結合剤を固定化させる。粒子
が保持されかつ固定化される。試料を固体基質と混合
し、グリコヘモグロビンを捕獲すると共に粒子上の試薬
によって粒子上へ保持する。非グリコヘモグロビンは試
薬により結合されず、したがって溶液中に遊離状態で留
まる。
グリコヘモグロビンに特異的な結合剤は、米国特許第
4,269,605号（参考のためここに引用する）に記載され
たようなジヒドロキシボリル成分で構成することができ
る。この成分は好ましくはフェニルもしくは置換フェニ
ルボロン酸、硼酸または他のボロン酸、たとえばエタン
ボロン酸および１−プロパンボロン酸などである。結合
剤は機械的、物理的もしくは化学的手段により固体基質
に結合させることができる。好ましくは、リガンドを直
接共有結合によりマトリックスに結合させる。結合剤
は、その後の反応に際し脱着してボロン酸ヒドロキシル
に遊離しないように、基質に結合させるべきである。好
適方法において、親和性樹脂は、ｍ−アミノフェニルボ
ロン酸を１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）−カルボジイミド（EDC）用いて活性化されたカル
ボキシメチル−アガロースビーズ（CM−セファロース
（登録商標）、ファルマシア社）と反応させて作成され
る。反応条件は、グリコヘモグロビン（GHb）の特異的
結合を最大化させると共に非グリコヘモグロビンの非特
異的結合を最少化させるべく、適切な置換度を有する生
成物を生ずるよう選択される。選択したジヒドロキシボ
リル成分とは無関係に、グリコヘモグロビンの糖部分は
所望の分離を達成するようジヒドロキシボリル成分に結
合しうることが必要である。
代案として特異的結合剤は、被覆され、固定化され或
いは粒子に共有結合される抗体で構成することもでき
る。免疫化および回収工程により抗血清を得る方法は一
般に当業界で知られている。抗体はモノクローナル抗体
とすることもでき、その手順も当業界で知られている。
HbA1cに対するモノクローナル抗体の例はノーレス等に
係る米国特許第4,727,036号に記載されている。
被覆し、固定化し或いは粒子に対し共有結合しうる他
の特異的結合剤は、糖成分に対し特異的な試薬を包含す
る。これらはコンカナバリンＡ、スクシニル−コンＡお
よびビシア・ファバなどを包含するα−Ｄ−グルコース
に対し特異性を有するレクチン類を包含する。他のレク
チンおよびその炭水化物特異性も周知されており、遊離
レクチンまたは固体支持体に結合したレクチン、たとえ
ばセファロース（登録商標）−レクチンとして入手でき
る。他の炭水化物特異性支持体はアルミナゲル、燐酸カ
ルシウムゲル、炭酸マグネシウム、珪酸マグネシウム、
シリカゲルを包含する。
試料におけるグリコおよび非グリコヘモグロビンは、
溶液の光学密度（吸光度）を測定する装置、好ましくは
340〜633nmの波長範囲における吸光度を測定しうる分光
光度計を用いて分析的に検出および定量される。好適具
体例の装置は、ヨーロッパ特許第0 160 901 B1号（参照
のため、その開示をここに引用する）に記載された自動
化アボット・ビジョン（登録商標）アナライザである。
自動化分析装置は、二次元遠心分離の原理を用いて血
漿を細胞から分離すると共に試験パック内で流体を測定
しかつ混合する。試験の開始に際し、回転板により発生
した遠心力（1800rpmの回転板速度）により試験パック
内の各試薬を１個もしくはそれ以上の試薬測定用もしく
は保持用チャンバに移動させる。同時に、試料を毛細管
もしくは試料穴部から血液分離室まで移動させる。凝固
防止されかつ溶血された全血試料の場合、遠心力により
溶解した赤血球ストロマを沈降させて、ヘモグロビン含
有試料をチャンバの上部に残す。次いで試料パックホル
ダーによる一連の回転が生ずると共に、回転板が回転し
続ける。
試験パックホルダーは試験パックを反時計方向に90゜
回転させて、緩衝試薬および希釈剤緩衝液を反応室中へ
注入させると共に試料の１部を第１図に示したように試
料保持室に注入させる。次いで試験パックホルダーは時
計方向に90゜回転して、試薬および希釈剤の液体成分を
キュベット中へ移動させると共に試料を測定室に移動さ
せる。次いで試験パックホルダーは反時計方向に90℃回
転して、測定された試料を反応室中へ移動させ、ここで
固体試験ならびにキュベットから流出する試薬および希
釈剤の液体成分と混合する。試験パックホルダーの時計
方向における最後の90゜回転は希釈試料をキュベットに
移動させ、ここで光学系が初期測定および試料と試薬と
の複数回の回転後における最終測定につき553〜628nmに
て光学密度を測定する。アボット・ビジョン（登録商
標）・アナライザの詳細についてはアボット・ビジョン
（登録商標）・アナライザ・マニュアル、第13.7頁に記
載されている。同様な仕様を有する他の自動化分析装置
も上記方法に使用することができる。
緩衝剤 pHは、ボレート成分の親和性カラムに対するcis−ジ
オール化合物の結合に影響を及ぼすことが知られてい
る。緩衝液のpHが高い（9.6より大）とヘモグロビンの
結合および安定性が低下するのに対し、低pH値では非特
異性結合が増大する。非特異性結合は、陰帯電したボロ
ネート成分およびフェニル環により導入された疎水性成
分に関連するイオン効果を包含する。分析に使用する緩
衝剤を考慮する際、たとえばトリス［トリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン］のような複数ヒドロキシル基
を有する緩衝剤はボロネート成分に結合するため避ける
べきである。ソルビトール、セリン、エタノールアミン
および硼酸も避けるべきである。生成されるボレート−
ジオール錯体を強化するよう作用する緩衝剤が好まし
い。この試験システムに適する緩衝剤は約7.5〜11.0の
範囲のpKaを有する緩衝剤である。この範囲の緩衝剤は
当業界にて公知である。分析に際し37℃にて約7.8〜9.6
のpH範囲、より好ましくは約8.5〜9.2、特に好ましくは
９〜9.2の範囲にpHを維持するには、約8.5〜9.2のpKaを
有する緩衝剤がより好適である。アミンは錯体を強化す
るよう作用し、したがってたとえばグリシン、モルホリ
ン、HEPESのような緩衝剤またはたとえばアンモニウム
塩もしくはピペリジンのような添加剤が結合を促進する
のに有利である。好適具体例においてpHを維持するよう
使用される緩衝剤は、２−アミノエチルスルホン酸（タ
ウリン）であって、20〜50mM（好ましくは25mM）の濃度
にて9.06のpKaを有する。
Middle,F.A.等,Biochem.J.209:771−779（1983）およ
び「生化学分離におけるボロネートリガンド、出版物50
1、アミコン・コーポレーション社（1981）」は、二価
陽イオン、主としてMgCl2から誘導されたMg2+を用い
て、陰帯電した固定化ボロネートと陰帯電したリガンド
との間の斥力を解消することを記載している。本発明も
この目的でMg2+を使用する。しかしながら、本発明は好
ましくはMgCl2の代りにMgSO4を用いて、発明を最適に操
作しうる。MgSO4の好適濃度は約10〜500mM、より好まし
くは50〜200mM、特に好ましくは約100〜150mMである。
ヘモグロビンは37℃および高められたpHではあまり安定
でない。塩化物の存在下で分析を実施すれば、ボロネー
トアガロースの不存在下で約８％の吸光度低下が生ず
る。これは、試験パックのプラスチック表面に対する沈
殿と吸着との組合せに起因する。吸光度の８％低下とい
う値は、溶液からのヘモグロビンの非特異的損失がない
正常なグリコヘモグロビンレベルを有する試料につき予
想される信号の約２倍にもなる。換言すれば、バックグ
ラウンドが信号の大きさの約２倍である。MgCl2の代り
にMgSO4を使用すれば、この損失は約３％まで減少する
ことが判明した。
ゼラチン（魚鱗）およびポリビニルピロリドン（PV
P）を緩衝剤に混入すると、さらにヘモグロビンが安定
化された。
MgSO4と組合せて、これは損失を約１％まで減少させ
る。この実験からのデータを第１表に示す。たとえばカ
ゼイン、他の原料からのゼラチン、アルブミンなどの他
の蛋白質安定剤および水溶性ポリマーも同様な結果を与
えると予想することができる。
分析 分析の目的で、既知量の固体基質（10〜200μの範
囲、典型的には65μ）を乾燥錠剤もしくは湿潤懸濁物
のいずれかとして適量の緩衝溶液と共に供給する。緩衝
溶液は、反応のpHを血液試料の添加に際し約8.5〜9.2の
範囲の一定値に維持するのに適したpKaを有する20〜50m
Mの化合物を含有する。約10〜500mM、より好ましくは約
50〜200mM、特に好ましくは約100〜150mMの一定濃度で
緩衝剤にMg++塩を添加して、固体基質におけるGHbとボ
ロネートとの間の静電反発力を解消する。ヘモグロビン
沈殿を防止する蛋白質安定剤および抗微生物保存料も緩
衝剤に含ませることができる。分析温度は約24〜39℃、
より好ましくは約30〜37℃の範囲であり、約37℃の温度
が最も好適である。
血液試料を先ず最初にヘパリンで処理して、凝血を防
止すると共にサポニンで処理して赤血球を溶解させる。
次いで、試料を遠心分離すると共に試料の１部を樹脂お
よび緩衝剤とざっと混合する。希釈した試料を樹脂から
分離し、希釈試料の初期吸光度を得る。次いで、希釈試
料を激しく樹脂と、グリコヘモグロビンがほとんど固体
基質に結合するまで混合する。樹脂を取出し、最終吸光
度の測定を行う。吸光度データを処理して、結合したヘ
モグロビンの相対量もしくは比率を計算する。グリコヘ
モグロビンの比率は、結合ヘモグロビン対グリコヘモグ
ロビン％の標準曲線から決定される。標準曲線は、既知
比率のグリコヘモグロビンの検量試料を用いて同じ手順
により作成される。既知％のグリコヘモグロビンの対照
を用いて、標準曲線の正確性を定期的に試験し或いは確
認する。
グリコヘモグロビンのデータ整理 標準曲線を作成すると共に、この曲線から未知試料を
測定するには、分析器によって次の工程を行う。全ヘモ
グロビン濃度に比例する初期吸光度測定値（Ai）と（合
計−非結合）ヘモグロビンに比例する最終吸光度測定値
（Af）とを測定して記憶する。結合ヘモグロビン％（％
Ｂ）の測定値を次式： ％Ｂ＝100×（Ai−Af）/Ai を用いて計算する。この結合％を次の２つの作用につき
補正せねばならない:1.或る程度の結合が初期測定の前
に生ずる。2.平衡に達する前に最終測定を行う。その結
果、測定した結合％は全ヘモグロビン濃度により影響を
受ける。測定結合％はヘモグロビン濃度の減少と共に増
大する。したがって補正結合％（％Ｄ）は、一対の定数
（ＥおよびＩ）と初期吸光度測定値（Ai）とを用い、測
定結合％を調整して得られる： ％Ｄ＝％Ｂ−Ｅ×（Ai−Ｉ） ここで、Ｉは約13g/dの濃度における「正常」ヘモグ
ロビンの試料につき得られる初期吸光測定値に等しい。
このパラメータは実際の測定波長、試験パックにおける
希釈度、および試験パックにおけるキュベットの路長に
依存する。Ｉに関する２つの異なる数値の一方を、試料
が検量手段／対照であるか或いは患者の試料であるかに
応じて選択する。希釈度および路長は試験パックの製造
に際し調節される。実際の測定波長は装置毎に若干変化
する。したがって、Ｉに関する独特の対を各装置に用い
る。Ｅは、結合％をヘモグロビン濃度の関数として決定
すると共にグリコ化％を一定に維持して実験的に求めた
恒数である。Ｅに関する２つの異なる数値の一方は、試
料が検量手段／対照であるか或いは患者の試料であるか
に応じて選択される。
直線的標準曲線は、％HbA1cの所定の数値を用いて検
量手段につき％Ｄと％HbA1cとの回帰分析から計算され
る： ％HbA1c＝（ｍ×％Ｄ）＋Ｂ ［式中、ｍは傾斜であり、ＢはＹ軸切片である］。
例：標準曲線： ％HbA1c＝（0.8741×％Ｄ）＋0.996 Ｅ＝7.7×10-4 Ｉ＝1500 Hb濃度（g/dl） Ai（mA.U） ％Ｂ ％Ｄ ％HbA1c 17.0 1962 8.82 9.18 9.02 15.0 1731 9.00 9.18 9.02 13.0 1500 9.18 9.18 9.02 11.0 1269 9.36 9.18 9.02 9.0 1038 9.54 9.18 9.02 7.0 808 9.71 9.18 9.02 標準曲線を第２図にプロットする。このデータを用いた
換算法によれば、大幅に変化するヘモグロビン濃度の試
料に対しても％HbA1cの正確な測定を可能にする。１つ
の有力な利点は、限定容積の試料（たとえばネオナター
ル）を希釈してもまだ精密に分析しうる点である。
検量試料／対照 グリコヘモグロビン分析に使用するためのグリコヘモ
グロビン検量試料および／または対照は、好ましくはヒ
トもしくは動物の血液から作成された液体材料である。
１具体例において、グリコヘモグロビン材料は牛赤血球
から作成される。グリコヘモグロビン検量試料は好まし
くは低レベル、中レベルおよび高レベルのグリコアジド
−メト−ヘモグロビン（実施例３）を好ましくは還元型
にて約５〜９、より好ましくは６〜８のpHの緩衝溶液中
に含有する。検量試料に含有されるグリコヘモグロビン
材料のレベルは、全グリコヘモグロビン（TGHb）の比率
またはヘモグロビン（HbA1c）の比率のいずれかにより
示すことができ、これは試料中のヘモグロビンの全量に
対するグリコヘモグロビンもしくはヘモグロビンA1cの
量である。低水準の検量試験は約０〜10％TGHb即ち０〜
８％HbA1c、より好ましくは約２〜７％TGHb即ち３〜６
％HbA1c、特に好ましくは４〜５％TGHb即ちHbA1cの範囲
である。中水準の検量試料は約10〜27％TGHb即ち８〜16
％HbA1c、より好ましくは13〜21％TGHb即ち10〜15％HbA
1c、特に好ましくは約15〜18％TGHb即ち11〜13％HbA1c
の範囲とすることができる。高水準の検量試験は約22〜
44％TGHb即ち16〜30％HbA1c、より好ましくは26〜36％T
GHb即ち18〜25％HbA1c、特に好ましくは約27〜30％TGHb
即ち19〜21％HbA1cの範囲とすることができる。低、中
および高水準の検量試料は、45％TGHb即ち30％HbA1cよ
りも大きな、より好ましくは約45〜60％TGHb即ち30〜40
％HbA1cのグリコ％範囲におけるグリコヘモグロビン材
料の保存溶液と、非グリコ還元ヘモグロビン溶液との混
合物から処方することができる。非グリコヘモグロビン
溶液はごく少量であればグリコ化物を含むことができ
る。
検量試料および対照の安定性は、約８℃もしくはそれ
以下で貯蔵する際には約10ケ月より大、より好ましくは
10〜14ケ月の範囲、特に好ましくは少なくとも14ケ月の
安定性を有すべきである。
対照は検量試料と同様に作成される。対照レベルは、
好ましくはグリコヘモグロビンの正常（４〜６％Hb
A1c）および高められた（８％HbA1cより大）生理的レベ
ルを反映するように選択される。
本発明の１具体例において、安定なヘモグロビン溶液
はアジド−メト−ヘモグロビンから作成される。アジド
−メト−ヘモグロビンは、洗浄した赤血球から低張性衝
撃により放出された脂質フリーのヘモグロビンから作成
することができる。赤血球の原料はヒトまたは動物（好
ましくは哺乳動物）であり、より好ましくは牛赤血球で
ある。ヘモグロビンは、たとえばフェリシアン化カリウ
ム、硝酸ナトリウムなどの酸化剤によりメト−ヘモグロ
ビンまで酸化される。次いでメト−ヘモグロビンをアジ
ド塩（たとえばナトリウムアジドなど）と接触させアジ
ド−メト−ヘモグロビンまで変換する。
赤血球におけるヘモグロビンは、非酵素過程によりグ
ルコースの存在下でグリコ化される。先ず最初に、易可
逆性反応がグルコースとヘモグロビンβ鎖のＮ−末端バ
リンとの間で生じて、不安定なアルジミン即ちシッフ塩
基を生成する。この迅速な平衡に続いて遅いアマドリ転
位が生じ、ヘモグロビンA1cの安定なケトアミン結合を
形成する。ヘモグロビンA1cの測定は長期糖尿病管理の
有用な指標である。
本発明の他の具体例において、安定なグリコヘモグロ
ビン溶液はアジド−メト−ヘモグロビンから作成され
る。非酵素的ヘモグロビン反応を、安定な液体グリコヘ
モグロビン検量試料および対照材料のインビトロ合成に
つき用いた。ヒトもしくは牛赤血球からのアジド−メト
−ヘモグロビンを好ましくは37℃にて数日間にわたり種
々の濃度のグルコースと共に培養した。グルコース分子
はアミン基と、シッフ塩基物質をヘモグロビン上で形成
する。未反応グルコースを除去した後、不安定なシッフ
塩基物質を緩和な還元剤（たとえばシアノ硼水素化ナト
リウム）での還元、たとえばパラジウムなどの触媒の存
在下における触媒水素化、硼水素化ナトリウムなどでの
還元によって安定化させた。還元の完結は、高められた
温度（たとえば約45℃）にて還元グリコアジド−メト−
ヘモグロビンを熱処理（heat−stressing）して試験す
ることができる。還元副生物をゲル濾過もしくは透析に
よって除去した。
グリコヘモグロビンを生成させるべくアジド−メト−
ヘモグロビンに添加するグルコースの濃度は約50〜1000
mM、好ましくは約100〜500mM、特に好ましくは約150〜3
00mMの範囲である。グルコースをアジド−メト−ヘモグ
ロビンと共に約１〜10日間にわたり或いは所望のグリコ
化％に達するまで培養する。
さらに他の具体例においては、シアノ基をアジドの基
の代りに使用することができる。シアノ−メト−ヘモグ
ロビンおよび還元グリコシアノ−メト−ヘモグロビンも
安定なヘモグロビンおよびグリコヘモグロビン溶液を形
成する。アジド−メト−ヘモグロビンおよび還元グリコ
アジド−メト−ヘモグロビンの作成方法を用いて、シア
ノ−メト−ヘモグロビンおよび還元グリコシアノ−メト
−ヘモグロビンを作成することができる。たとえばシア
ン化ナトリウムのようなシアン化物が、この作成方法で
アジド塩の代りに使用される。
さらに他の具体例においてはカルボニル基をアジド基
の代りに使用することもできる。カルボニル−ヘモグロ
ビンおよび還元グリコカルボニル−ヘモグロビンも安定
なヘモグロビンおよびグリコヘモグロビン溶液を形成す
る。カルボニル−ヘモグロビンの作成方法は、一酸化炭
素ガスをオキシ−ヘモグロビン溶液中にグリコ化の前に
吹込むことを含む。この場合、フェリシアン化カリウム
または他の酸化剤は必要とされない。何故なら、オキシ
−ヘモグロビンはカルボニルヘモグロビン成形のための
好適先駆体になるからである。一酸化炭素の吹込み過程
に際し発泡を最小化するには消泡剤が必要とされる。得
られるカルボニル−ヘモグロビン物質は、アジド−メト
−ヘモグロビンもしくはシアノ−メト−ヘモグロビンと
同様にグリコ化されて処理される。
キット さらに本発明は、試料（好ましくはグリコおよび非グ
リコヘモグロビンを含有する血液試料）のグリコヘモグ
ロビン含有量を分析する際に使用するための試験キット
をも包含する。この試験キットは次の各成分を含む：
（１）約６〜８（好ましくは7.7）のpHを有し、グリコ
ヘモグロビンのための結合剤（好ましくはジヒドロキシ
ボリル成分、より好ましくは３−アミノフェニルボロン
酸を付着させた粒子の懸濁物とMg2+源とを含有する緩衝
試薬溶液、および（２）反応混合物のpHを37℃にて約7.
8〜9.6、より好ましくは8.5〜9.5、特に好ましくは９〜
9.2の範囲に維持しうると共に、緩衝剤が約7.5〜11、好
ましくは8.5〜9.2のpKaを有する希釈剤緩衝溶液。試験
に用いる粒子材料および結合剤に応じ、試験キット成分
は別々に或いは組合せて供給することができ、或いは予
備混合して単一溶液混合物として供給することもでき
る。
他の具体例において、親和性粒子は抗−グリコヘモグ
ロビン抗体またはレクチンを結合剤として付着させる。
より好ましくは、緩衝試薬溶液はジヒドロキシボリル
誘導粒子と約10〜500mMのMgSO4、特に好ましくは約100
〜150mMのMgSO4を含有する。緩衝試薬溶液はさらに抗微
生物剤および／または保存料、たとえばゲンタマイシ
ン、ナトリウムアジドなどをも含有することができる。
特に好ましくは緩衝試薬溶液は、8.4mMのHEPES（Ｎ−
２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンス
ルホン酸）と150mMのMgSO4と0.4g/リットルのゲンタマ
イシン硫酸塩と0.05％のナトリウムアジドとを含有する
緩衝試薬溶液（pH7.7）における、３−アミノフェニル
ボロン酸誘導アガロースビーズ粒子の懸濁物を含有す
る。より好ましくは希釈緩衝剤溶液はさらにたとえばゼ
ラチン、アルブミン、カゼインなど、好ましくは魚鱗ゼ
ラチンのような蛋白質安定剤を約0.5〜５％、より好ま
しくは１〜２％、特に好ましくは1.65％の濃度で含有す
ると共に、たとえばポリビニルピロリドン（PVP）（Ｋ
値90）のような水溶性ポリマーを約0.5〜５％、より好
ましくは１〜２％、特に好ましくは1.65％の濃度で含有
し、さらにたとえばゲンタマイシンおよびナトリウムア
ジドのような抗微生物剤および保存料をも含有する。好
ましくは、約65μの沈降した水和ビーズを含有する約
190μの緩衝試薬溶液を、約４〜７μの試料につき
用いる。
緩衝試薬溶液および希釈剤緩衝溶液は別々に、或いは
２種の試薬として組合せ或いは単一の試薬として、より
好ましくは２種の試薬として包装することができる。好
適具体例において、緩衝試薬および希釈剤緩衝液は、た
とえば試験パックのような形式で供給される。好ましく
は各試験パックは次のものを含有する:8.4mMのHEPES
（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エ
タンスルホン酸）と150mMのMgSO4と0.4g/リットルのゲ
ンタマイシン硫酸塩と0.05％のナトリウムアジドとを含
有する緩衝溶液（pH7.7）における、３−アミノフェニ
ルボロン酸誘導アガロースビーズ粒子（3.5mg、乾燥重
量）の懸濁物を含有する約190μの緩衝試薬。希釈剤
緩衝液は、次の濃度にて安定剤と抗微生物剤とを含有す
る約140μの緩衝溶液（pH9.6）である:94.2mMのタウ
リン（２−アミノエチルスルホン酸）、1.65％の魚鱗ゼ
ラチン、1.65％のポリビニルピロリドン（Ｋ値90）、0.
4g/リットルのゲンタマイシン硫酸塩および0.05％のナ
トリウムアジド。
ボロネート誘導アガロースは、最終分析条件下で用い
る際に、高pHでは凝集する傾向を有する。これは材料の
取扱および分配を困難にする。この問題を解決するに
は、試薬系を試験パック内の封止２−室装置に設ける。
１室は低pHの緩衝液（緩衝試薬）におけるボロネート−
アガロースを含有し、他室は希釈剤緩衝溶液を含有す
る。２個の分室の内容物を分析を行う時点でのみ合し、
この時点でボロネートアガロースのpHを最終分析pHまで
上昇させる。当業者は、各成分を個々に或いは組合せて
順次にまたは同時に試料へ添加しうることを認識するで
あろう。好適具体例において、緩衝試薬溶液および希釈
剤緩衝溶液は試料へ同時に添加される。他の好適具体例
においては、希釈剤を試料に添加した後に緩衝試薬溶液
を添加する。
好ましくは、キットはさらに第３の分離した成分とし
て、たとえば乾燥サポニンを含有する毛細管のような試
料用の溶解剤をも含む。
検量試料および対照は、別々に包装して或いはキット
内にまとめて或いは試験キットで供給することができ
る。検量試料は、好ましくは約０〜８％、８〜16％およ
び16〜30％HbA1cの範囲内のグリコ化レベルを有する還
元グリコアジド−メト−ヘモグロビンを含有する。比較
は、好ましくは正常および異常な患者範囲におけるグリ
コ化レベルを持った還元グリコアジド−メト−ヘモグロ
ビンを含有する。
実施例１ ボロネートアガロースの作成 アガロース、すなわちファルマシア社からのCMセファ
ロース（登録商標）CL6Bを蒸留水で洗浄した後、100mM
のMES（２−Ｎ−モルホリノエタンスルホン酸）緩衝液
（pH4.7）で洗浄した。アガロースを50％固形分まで懸
濁させ、次いで減圧下に０℃まで冷却した。66mMのmAPB
A（３−アミノフェニルボロン酸）を作成し、減圧下に
０℃まで冷却し、次いでアガロースに添加した。800mM
のEDC（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド塩酸塩）を作成し、反応混合物に添
加した。この混合物を減圧下に０℃にて１時間にわたり
反応させ、次いで4Mの酢酸ナトリウムにより反応停止さ
せた。mAPBA誘導化アガロースを順次に100mM酢酸と50mM
NaOH/1M NaClと100mM酢酸と50mM NaOH/1M NaClと次
いで蒸留水とで洗浄した。洗浄したmAPBA誘導化アガロ
ースを次いでHEPES緩衝液で洗浄し、約55％固形分まで
懸濁させた。最終混合物のpHを検査し、必要に応じ7.7
のpHに調整した。検量操作を実施例２における方法にし
たがい空試験パックにおける上記粒子を用いて行い、検
量曲線を作成した。正確な検量曲線を得るため、粒子の
固形物％を希釈または粒子の添加によって調整すること
ができる。
実施例２ アボット・ビジョン試験パックおよびアボット・ビジョ
ン分析装置を用いるグリコHb法 第１図に示したようなビジョン試験パックを冷蔵庫か
ら取出す。試験パックを室温にて最小30分間にわたり加
温させる。乾燥サポニンおよびヘパリンが充填されかつ
試料を含有する毛細管を試験パックの毛細管スロットに
挿入する。検量試料と対照とを、試験パックの検量試料
および対照穴部に直接に滴下装置を用いて加える。試験
パックを分析装置に入れ、「操作」ボタンを押す。
次いで分析器は次の工程を自動的に行う： 実施例３ 検量試料および対照材料作成 A.アジド−メト−ヘモグロビン（牛）の作成 1.牛赤血球から血漿を20mMの等張燐酸塩緩衝塩水で洗浄
除去した。
2.赤血球細胞を、0.01Mの燐酸塩緩衝液を用い凍結／解
凍することにより低張性衝撃によって溶解させる。
3.ヘモグロビンを19.5g/d Hbまで分子量10,000のカ
ットオフのフィルタによる限外濾過で濃縮した。pHを2N
NaOHにより7.2〜7.8に調整した。
4.Hb溶液における脂質を40g/Lのエアロシル380（バン・
ウォータース社）により抽出した。この混合物を４℃に
て１〜18時間攪拌した。混合物を４℃にて4200rpmで10
分間にわたり遠心分離し、ヘモグロビンを回収して濾過
した。ヘモグロビンを20mMの燐酸塩緩衝塩水に対し分子
量10,000のフィルタを用いて透析濾過した。
5.ヘモグロビンを1.3×モル過剰のフェリシアン化カリ
ウムを用いて２〜８℃で30〜40分間にわたりメト−ヘモ
グロビンまで酸化させた。
6.メト−ヘモグロビンを、３×モル過剰のナトリウムア
ジドを添加して２〜８℃で15〜30分間にわたりアジド−
メト−ヘモグロビンまで変換させた。
7.この材料を分子量10,000のカットオフフィルタにより
透析濾過した。溶液のpHを7.3〜7.5に調整し、抗微生物
剤を添加した。
8.濃度を約19.5g/dヘモグロビンに調整した。
9.この材料を滅菌濾過し、２〜８℃にて貯蔵した。
B.グリコヘモグロビン保存溶液の作成 1.無水グルコースをアジド−メト−ヘモグロビンに添加
し、２〜８℃で30分間混合して250mMのグルコース最終
濃度を得た。
2.この溶液を、30〜40％のグリコ化レベルに達するまで
37℃にて保温した。
3.溶液を分子量10,000のフィルタにより２〜８℃にて20
mM燐酸塩緩衝塩水に対し透析して、未反応グルコース
（≦5mg/d）を除去した。
4.グリコヘモグロビンを分子量10,000〜30.000のカット
オフフィルタを用いる透析濾過により約19.5g/dまで
濃縮した。
5.ヘモグロビン／グルコースアダクトを、10×モル過剰
のシアノ硼水素化ナトリウムを２〜８℃で添加する還元
によって安定化させた。
6.還元の完結を、45℃にて材料を熱処理することにより
試験した。必要に応じ、工程５を反復した。
7.ヘモグロビンを燐酸塩緩衝液で透析した。
8.ヘモグロビン濃度を19.5g/dに調整した。
9.pHを7.4に調整し、溶液を滅菌濾過すると共に２〜８
℃で貯蔵した。
C.非グリコヘモグロビン保存溶液の作成 この溶液は、グルコースを添加しない以外はグリコヘ
モグロビン保存溶液と同様に作成した。
D.グリコおよび非グリコ保存溶液の混合物を作成するこ
とにより最終的な検量試料および対照溶液を作成した。
実施例４ ヘモグロビンをグリコ化する方法の最適化 非酵素的ヘモグロビン反応を用いて、液状の安定グリ
コヘモグロビン検量試料もしくは対照のインビトロ合成
に関する方法を開発した。実施例３における方法にした
がい牛赤血球から作成した新鮮または凍結のアジド−メ
ト−ヘモグロビンを37℃にて種々の時間にわたり250mM
のグルコース（100mの19.5g/d アジド−メト−ヘ
モグロビンに対し、4.53gのグルコース）と共に培養し
た。未反応グルコースをゲル濾過によって除去し、グリ
コアジド−メト−ヘモグロビンを過剰のシアノ硼水素化
ナトリウムで還元した。還元の副生物を20mM燐酸塩緩衝
塩水に対する透析によって除去し、全グリコヘモグロビ
ン％をIso−lab Glyc−Affin親和性カラム法によって
分析した。結果を第３表に示す。
ヒトヘモグロビンを同様にグリコ化し、結果を第４表
に示す。凍結貯蔵したヒトヘモグロビンを用い、63％の
最大全グリコ化％が約144時間後に観察され、その時点
でヒトヘモグロビンは凝集し始めた（第４表）。
全グリコ化％に対するグルコース濃度と牛ヘモグロビ
ンとの経時比較は、グリコ化法における２つの重要な因
子を示した（第３図）。第１に最大グリコ化％はグルコ
ース濃度の増加と共に増大し、第２にグリコ化％の速度
はより高いグルコース濃度にて加速された。両因子はグ
リコ化過程を最適化するのに貢献する。
24時間にわたる45℃での熱処理がシアノ硼水素化ナト
リウム（NaCNBH3）の効果を示す有効な指標であること
を証明するため、高レベルの検量試料を45℃にて種々の
濃度のNaCNBH3と共に保温した。種々の量のNaCNBH3を検
量試料におけるヘム濃度に基づき高レベルの検量試料に
添加して、第５表に示す最終濃度を得た。各溶液を２つ
の部分に分割し、一方を45℃にて24時間保温し、他方を
２〜８℃で貯蔵した。この実験からのデータを第５表お
よび第４図に示す。この実験は、適量で存在する場合の
グリコヘモグロビンの安定化に関するNaCNBH3還元の効
果およびNaCNBH3還元のためのモニターもしくは対照と
して使用する45℃熱処理の効果を示す。
グリコ牛アジド−メト−ヘモグロビンのシアノ硼水素
化ナトリウム還元が非グリコ非還元アジド−メト−ヘモ
グロビンの安定性と比較してヘモグロビン（Hb）の安定
性を増大させることを証明するため、グリコ化された還
元試料につき約17.5g/dHbおよび非グリコ非還元試料
につき18.1g/dの濃度における各１部を45℃にて保温
し、同じ濃度の対照を２〜８℃にて貯蔵した。それぞれ
の試料を所定の時間間隔で34日間にわたり定期的に採取
し、ヘモグロビン濃度を測定した。第６表および第５図
における結果は、グリコ化された還元牛アジド−メト−
ヘモグロビンの非グリコ非還元型よりも安定であること
を示す。
還元型のグリコ牛アジド−メト−ヘモグロビン検量手
段の長期間安定性を−20℃および２〜８℃での保温によ
って測定した。各標準の１部を全部で309日間にわたりH
bA1c％につき毎日試験した。第７表および第６図におけ
る結果は、検量手段が−20℃もしくは２〜８℃のいずれ
かにおける長時間の貯蔵につき安定であることを示す。
悪作用は認められなかった。
実施例５ 予想値 本発明の方法を用い、グリコヘモグロビン基準範囲は
4.1〜5.7標準化％HbA1cであることが決定された。この
範囲は101名の明かに健康な個人（女性41名、男性60
名）を試験した確認された。基準範囲は特定の患者集団
に応じて変化することがある。
実施例６ 再現性 本発明による方法の再現性を、１つの分析装置を用い
て５日間にわたり４反復で２レベルのグリコヘモグロビ
ン比較をフィールド試験することにより決定した。総平
均および変動係数（％CV）を変動分析から計算した。全
％CVは日内変化及び日間変化に基づくものの合計であ
る。
実施例７ 精度 ％グリコHb試験を決定するための本発明による方法の
精度を、この試験とHPLCグリコヘモグロビン分析または
Isolab Glyc Affin分析（親和性による全グリコヘモ
グロビン）との比較によりヒト全血液試料のフィールド
試験にて決定した。％グリコヘモグロビンを測定するた
めの本発明による方法とグリコヘモグロビンのHPLC法と
の間の相関試験を行った。
グリコヘモグロビンを測定する本発明の方法を病院環
境で行い、4.5〜13.3％のグリコヘモグロビン値の範囲
にわたる51人のヒト全血試料を用いて病院で行った。そ
れらの結果を、HPLCグリコヘモグロビン法を用いて得ら
れた結果と相関させた。
全試料を現場にて単一試料で分析した。ビジョン・グ
リコHbシステムとHPLCグリコヘモグロビンシステムとの
相関関係を第７図に示す。直線回帰分析は次の結果を与
えた： 比較：ビジョン・グリコHb（Ｙ軸）対HPLCグリコヘモ
グロビン（Ｘ軸） 試料数＝51 傾斜＝0.98 切片＝0.33 相関係数＝0.983 偏り＝0.2 Sd線＝0.4 Sd差＝0.4 ｔ＝0.40 統計的または臨床的な有意差は観察されなかった。
グリコヘモグロビン対Isolab GlycAffin試験につき
本発明の方法を用いて、次の相関関係が観察された： Ｎ＝51 傾斜＝0.652 切片＝1.40 相関係数＝0.991 偏り＝−1.6 Sd線＝0.3 Sd差＝1.3 対ｔ＝−8.97 非対ｔ＝−2.69 これらデータを第８図にプロットする。
実施例８ 妨害 下記の一般的に処方した薬剤を本発明の方法に対する
妨害につき、添加物質を含有する全血試料を試験して検
査した。所定濃度における次の物質は、特定レベルのHb
A1cを含有する試料に対し10％未満の妨害を示した：試験物質 濃 度 ％HbA1c 内生物質 ビリルビン 30mg/d 4.7 グルコース 800mg/d 4.5 トリグリセリド 1300mg/d 4.8 タイプII糖尿病につき処方した薬剤 クロルプロパミド 75mg/d 5.5 グリピジド 50mg/d 5.5 グリブリド 50mg/d 5.5 トルブタミド 100mg/d 5.8 次の物質は、示した試料濃度にて本発明の方法を有意
には妨害しなかった。有意の妨害とは、正常範囲の試料
につき試験結果にて10％より大きい差をもたらすものと
して規定される。
一般的処方薬剤 試験した濃度 アセトアミノフェン（タイレノール） 30mg/d アセチルサリチル酸（アスピリン） 50ml/d アスコルビン酸（ビタミンＣ） 10mg/d カフェイン 6mg/d セホキシチン 2.5mg/d シメチジン（タガメット） 7.5mg/d Ｌ−ドーパ 10mg/d エピネフリン（アドレナリン） 0.1mg/d ハイドロクロルチアジド 5mg/d イソニアジド 2.5mg/d ペニシリンＧ 1000単位/d フェニトイン（ジランチン） 8mg/d サリチル酸 40mg/d テオフィリン 8mg/d ワルファリン（クマジン） 10mg/d 実施例９ ヘモグロビン変種（異常ヘモグロビン） グリコヘモグロビンの親和性結合法は、ヘモグロビン
変種による最小の妨害を示す［Middle,F.A.等,Biochem.
J.209:771−779,1983;Abraham,E.C.等,J.Lab.Clin.Med.
102:187−197,1983;Talwar,D.等,Clin.Chem,Acta 128:6
1−67,1983;Yatscoff,R.W.等,Clin.Chem.29:543−545,1
983］。ヘモグロビンＦ（胎児）、ＳおよびＣは、本発
明に記載した試験を妨害しないことが判明した。同様
に、他の変種も妨害しないと思われる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 イングランド，バーバラ・ジエイ アメリカ合衆国、ウイスコンシン・ 53211、ミルウオーキー、イースト・ケ ンウツド・ブウルバード・1808 (72)発明者 アニーノ，メアリー・ジエイ アメリカ合衆国、イリノイ・60004、ア ーリントン・ハイツ、ノース・ハイラン ド・アベニユー・2616 (56)参考文献 特開 平１−155268（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−101052（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−98657（ＪＰ，Ａ) 実開 平１−105850（ＪＰ，Ｕ) 特表 昭60−501522（ＪＰ，Ａ) 米国特許4269605（ＵＳ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/53 G01N 33/531 G01N 33/543 587

Claims (20)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】基質結合性および基質非結合性の物質を含
    有する試料中における、基質結合性物質の相対量を測定
    するに際し： （ａ）試料を最終測定濃度まで希釈して希釈試料を作
    り； （ｂ）基質結合性物質のための結合剤が付着している固
    体基質と希釈試料とを合し； （ｃ）固体基質と希釈試料とを合した後に直ちに希釈試
    料の初期吸光度を測定する； （ｄ）基質結合性物質の固体基質への実質的結合をもた
    らすのに充分な条件下で希釈試料と固体基質とを混合す
    る； （ｅ）固体基質と希釈試料とを溶出液を用いずに濾別
    し；及び （ｆ）基質結合性物質の固体基質への結合をもたらす実
    質的な結合の後の希釈試料の吸光度を測定することで固
    体基質に結合した基質結合性物質の量を決定する ことを特徴とする、基質結合性物質の相対量の測定方
    法。
  2. 【請求項２】方法が自動化されている、請求項１に記載
    の方法。
  3. 【請求項３】試料中の基質結合性物質の相対量が初期吸
    光度測定値及び段階（ｆ）における吸光度測定値から計
    算される、請求の範囲第１項に記載の方法。
  4. 【請求項４】固体基質が基質結合性物質のための結合剤
    を付着させた粒子を含む、請求の範囲第１項に記載の方
    法。
  5. 【請求項５】グリコおよび非グリコヘモグロビンを含有
    する全血試料中における、グリコヘモグロビンの相対量
    を測定するに際し： （ａ）グリコおよび非グリコヘモグロビンを放出するよ
    う全血試料を処理し； （ｂ）この試料を最終測定濃度まで希釈して希釈試料を
    作り； （ｃ）グリコヘモグロビンのための結合剤が付着してい
    る固体基質と希釈試料とを合し （ｄ）固体基質と希釈試料とを合した後直ちに希釈試料
    から固体基質を分離し、続いて希釈試料の初期吸光度を
    測定し、 （ｅ）段階（ｄ）で分離した希釈試料と固体基質をグリ
    コヘモグロビンの固体基質への実質的結合をもたらすの
    に充分な条件下で混合し； （ｆ）固体基質を希釈試料から分離し； （ｇ）希釈試料の吸光度を測定し； （ｈ）初期の吸光度、段階（ｇ）における吸光度、及び
    １以上のキャリブレーターから得た標準曲線から全血試
    料中のグリコヘモグロビンの相対的な量を決定する 全血試料中におけるグリコヘモグロビンの相対量を測定
    する方法。
  6. 【請求項６】固体基質が粒子を含む請求項５に記載の方
    法。
  7. 【請求項７】結合剤がジヒドロキシボリル成分を有する
    基である請求項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】ジヒドロキシボリル成分を有する基が３−
    アミノフェニルボロン酸から誘導される請求項７に記載
    の方法。
  9. 【請求項９】結合剤が抗−グリコヘモグロビン抗体から
    誘導される請求項６に記載の方法。
  10. 【請求項１０】結合剤がレクチンから誘導される請求項
    ６に記載の方法。
  11. 【請求項１１】結合したグリコヘモグロビンの測定を、
    初期吸光度測定値を得る前に生じた固体基質に対するグ
    リコヘモグロビンの結合を補償するよう調整する請求項
    ５に記載の方法。
  12. 【請求項１２】サポニンを段階（ａ）の試料に添加して
    グリコおよび非グリコヘモグロビンを遊離させる、請求
    項５に記載の方法。
  13. 【請求項１３】グリコおよび非グリコヘモグロビンを含
    有する全血試料中におけるグリコヘモグロビンの相対量
    を測定するに際し： （ａ）グリコおよび非グリコヘモグロビンを放出するよ
    う全血試料を処理し； （ｂ）MgSO4及びグリコヘモグロビンのための結合剤が
    付着している粒子を含む固体基質を含む、最終測定濃度
    の試料の希釈溶液を作成し； （ｃ）固体基質と希釈試料とを合した後直ちに試料の希
    釈溶液から固体基質を分離し、続いて試料の希釈溶液の
    初期吸光度を測定し； （ｄ）希釈試料と段階（ｃ）で分離した固体基質をグリ
    コヘモグロビンの固体基質への実質的結合をもたらすの
    に充分な条件下で混合し； （ｅ）固体基質を試料の希釈溶液から分離し； （ｆ）試料の希釈溶液の吸光度を測定し； （ｇ）初期の吸光度、段階（ｆ）における吸光度、及び
    １以上のキャリブレーターから得た標準曲線から全血試
    料中のグリコヘモグロビンの相対的な量を決定する 全血試料中におけるグリコヘモグロビンの相対量を測定
    する方法。
  14. 【請求項１４】希釈試料におけるMgSO4の最終濃度が約1
    0〜500mMである請求項13に記載の方法。
  15. 【請求項１５】希釈試料が初期吸光度を測定する前に少
    なくとも１種の蛋白質安定剤を含有する、請求項13に記
    載の方法。
  16. 【請求項１６】蛋白質安定剤がゼラチン、ポリビニルピ
    ロリドン、カゼインおよびアルブミンよりなる群から選
    択される請求項15に記載の方法。
  17. 【請求項１７】試料におけるグリコヘモグロビンの相対
    量を分析するためのキットにおいて、別々に包装された
    成分が： （ａ）緩衝剤と約10〜500mMのMgSO4とグリコヘモグロビ
    ンのための結合剤を付着させた固体基質とを含有する試
    薬溶液； （ｂ）ゼラチン、ポリビニルピロリドン、カゼインおよ
    びアルブミンよりなる群から選択される少なくとも１種
    の蛋白質安定剤を含有し、約7.8〜9.6の範囲の数値にpH
    を維持し得る希釈緩衝溶液；及び （ｃ）全血試料からグリコおよび非グリコヘモグロビン
    を放出する試薬 からなることを特徴とするグリコヘモグロビンの相対量
    の分析キット。
  18. 【請求項１８】さらに１種もしくはそれ以上のキャリブ
    レーター及び対照をさらに備える請求項17に記載のキッ
    ト。
  19. 【請求項１９】グリコおよび非グリコヘモグロビンを含
    有する全血試料中におけるグリコヘモグロビンの相対量
    を測定するに際し、以下の連続するステップ； （ａ）グリコおよび非グリコヘモグロビンを放出するよ
    う全血試料を処理し； （ｂ）この試料を最終測定濃度まで希釈して希釈試料を
    作り； （ｃ）グリコヘモグロビンのための結合剤が付着してい
    る固体基質と希釈試料とを合し （ｄ）固体基質と希釈試料とを合した後直ちに希釈試料
    の初期吸光度を測定し、 （ｅ）希釈試料と固体基質をグリコヘモグロビンの固体
    基質への実質的結合をもたらすのに充分な条件下で混合
    し； （ｆ）固体基質を希釈試料から分離し；及び （ｇ）希釈試料の吸光度を測定して固体基質に結合した
    グリコヘモグロビンの量を決定する を含む、全血試料中におけるグリコヘモグロビンの相対
    量を測定する方法。
  20. 【請求項２０】固体基質が粒子を含む請求項19に記載の
    方法。
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