KR101005559B1 - 바이오센서를 이용한 단백질 측정 장치 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 기존의 임피던스 측정법보다 향상된 측정속도를 가진 단백질 측정센서에 대한 것으로 단백질과의 선택적 결합에 의해 발생하는 임피던스를 델타 함수 파형의 전위신호를 인가하여 얻어지는 전류신호를 푸리에 변환법을 통해 빠르고 정확하게 산출할 수 있는 바이오센서를 이용한 단백질 측정장치에 대한 것이다.
본 발명의 바이오센서를 이용한 단백질 측정장치는 시료가 흡입되는 시료주입부와, 상기 흡입된 시료 내에 포함된 특정 단백질과의 선택적 결합을 위한 리셉터 층이 도포된 작업전극 및 상기 작업전극와의 전위차를 형성하는 기준전극을 포함하는 측정부를 포함하는 바이오 센서와, 상기 작업전극 및 기준전극에 델타함수 파형의 전위신호를 인가하는 파형발생기와, 상기 델타함수 파형에 감응하여 얻어진 전류를 푸리에 변환하여 상기 작업전극의 임피던스를 측정하는 데이터 처리부를 포함한다.
본 발명의 바이오센서를 이용한 단백질 측정장치에 따르면 측정시간이 짧아지면서도 확산에 의한 영향이 제거되어 정확하게 단백질의 농도를 측정할 수 있으며, 다중의 신호를 일정신간 동안 축적하여 S/N 비가 획기적으로 개선되는 효과가 있다.
당화단백질, 임피던스, 자기조립단일층, 푸리에 변환, 보론 산(boronic acid) 유도체

Description

바이오센서를 이용한 단백질 측정 장치{Protein measurement apparatus by using biosensor}
본 발명은 단백질 측정 장치에 대한 것으로 시료 내에 포함된 특정 단백질의 농도를 특정 단백질과 선택적으로 결합하는 리셉터 층을 전극에 마련하고 결합물에의해 발생하는 임피던스를 통해 특정 단백질의 농도를 측정하는 바이오센서를 이용한 단백질 측정 장치에 대한 것이다.
최근 당뇨병을 진단하고 예방하는데 있어서 혈액내의 포도당(혈당: blood glucose)의 양을 주기적으로 측정해야 할 필요성이 증대되고 있다. 이러한 혈당 측정은 손에 쥘 수 있는 휴대용 계측기를 이용하여 손쉽게 측정할 수 있으며, 구체적으로 각자가 스트립 형태의 바이오센서를 사용하여 손쉽게 측정할 수 있다.
이러한 혈당 측정에는 당화혈색소에 특이적으로 반응하는 면역항체를 고정한 패드를 마련하고 시료가 고정된 패드로 전개하도록 한 후 반사광의 강도로 산출하는 방법이 US 5,541,117에 개시되어 있으나 비싼 항체를 사용해야하고 다공성 패드의 불균일성에 의해 일정한 품질의 센서를 생산하는 것이 어려운 문제점이 있다.
US 5,242,842에는 보론 산 유도체와 당화단백질을 결합시킨 후 함께 침전시키거나 분리한 후 분광학적 방법을 사용하여 측정하는 방법이 개시되어 있으나 당화단백질과 결합하지 않은 보론 산 유도체를 세척하는 과정이 필요하고 시료의 양을 정확하게 맞추어야 옳은 결과를 얻을 수 있어 측정이 까다로운 문제점이 있다.
또한, US 6,162,645와 EP0455225B1 및 US 6,174,734에는 면역항체를 고정한 고체상을 사용하여 시료 중의 단백질을 분리한 후 표식자 화합물을 사용하여 당화단백질의 상대적 양을 결정하는 방법이 제시되어 있으나, 이러한 종래의 전기화학적 당화단백질 결정방법들은 당화단백질 및 당화단백질-표식자들을 전극표면에 경쟁적으로 모이게 한 후 표식자와 전기화학적 반응을 일으키는 기질을 주입하여 신호의 크기를 결정하는 것으로 당화단백질의 농도 측정이 복잡하고 재현성이 어려운 문제점이 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 델타 함수 파형을 인가하고 그에 따라 발생하는 전류를 푸리에 변환을 이용하여 임피던스를 산출하여 빠르고 정확하게 시료내의 특정 단백질의 농도 측정이 가능한 바이오센서를 이용한 단백질 측정 장치를 제공함에 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명의 바이오센서를 이용한 단백질 측정 장치는 시료가 흡입되는 시료주입부와, 상기 흡입된 시료 내에 포함된 특정 단백질과의 선택적 결합을 위한 리셉터 층이 도포된 작업 전극 및 상기 작업 전극과의 전위차를 형성하는 기준전극을 포함하는 측정부를 포함하는 바이오센서와, 상기 작업 전극 및 기준전극에 델타함수 파형의 전위신호를 인가하는 파형발생기와, 상기 델타함수 파형에 감응하여 얻어진 전류를 푸리에 변환하여 상기 작업 전극의 임피던스를 측정하는 데이터 처리부를 포함한다.
또한, 상기 측정부는 상기 작업 전극의 임피던스의 측정을 위해 보조전극을 더 포함하고, 상기 델타함수 파형은 상기 작업 전극과 보조전극 사이에 인가한다.
또한, 상기 단백질은 헤모글로빈에 글루코오즈가 결합하여 변형된 당화헤모글로빈 단백질인 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 리셉터 층은 보론 산유도체의 말단기를 갖는 자가조립단일층으로 형성된다.
또한, 상기 특정 단백질의 농도는 상기 리셉터 층과의 선택적 결합에 의해 작업 전극에 유발되는 임피던스를 측정하여 산출한다.
또한, 상기 파형발생기는 상기 델타함수 파형을 적분하여 스텝 전위신호를 인가한다.
또한, 상기 바이오센서는 시료가 모세관 현상에 의해 상기 시료 주입부를 통해 측정부로 이동할 수 있도록 공기 배출구를 더 포함한다.
또한, 상기 시료 주입부는 미세유로를 통해 연결되고, 상기 시료 내에 포함된 헤모글로빈의 산화-환원 반응을 통해 헤모글로빈의 양을 전류법으로 측정할 수 있는 전기화학적 바이오센서를 더 포함한다.
또한, 상기 당화헤모글로빈과 상기 헤모글로빈을 동시에 측정하기 위해 채혈 모세관이 용이하게 삽입 결합할 수 있도록 마련된 플랑저, 용혈제재 및 산화-환원 쌍이 포함된 완충용액이 들어있는 몸체, 상기 몸체의 일단부에 마련된 필터를 포함하는 배출구를 갖는 시료전처리 주입기를 더 포함한다.
또한, 상기 작업 전극은 금 또는 백금으로 구성된다.
또한, 상기 리셉터 층은 보론 산유도체의 말단기를 갖는 자가조립단일층으로 형성되고, 상기 보론 산유도체는 금전극과 쉽게 결합할 수 있도록 일부가 티올기로 변형된 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 데이터 처리부는 상기 작업 전극의 표면에 형성된 리셉터 층과 선택적으로 결합된 단백질 결합물에 의해 산화-환원 쌍의 전자전달을 방해하여 발생하는 임피던스를 측정한다.
또한, 상기 산화환원쌍은 페로센(ferrocene), 페로센 유도체, 퀴논(quinones), 퀴논 유도체, 유기 전도성 염(organic conducting salt), 또는 비오로겐(viologen), 헥사아민루세늄(III)클로라이드(hexaammineruthenium(III)chloride), 디메틸페로센(dimethylferrocene (DMF)), 페리시니움(ferricinium), 페로센모노카르복실산(ferocene monocarboxylic acid (FCOOH)), 7,7,8,8,-테트라시아노퀴노디메탄(7,7,8,8-tetracyanoquino- dimethane (TCNQ)), 테트라티아풀발렌 (tetrathia fulvalene(TTF)), 니켈로센(nickelocene(Nc)), N-메틸아시디니움(N-methyl acidinium(NMA+)), 테트라티아테트라센(tetrathiatetracene(TTT)), N-메틸페나지니움(N-methylphenazinium (NMP+)), 히드로퀴논(hydroquinone), 3-디메틸아미노벤조산(3-dimethylaminobenzoic acid(MBTHDMAB)), 3-메틸-2-벤조티오조리논히드라존 (3-methyl-2-benzothiozolinone hydrazone), 2-메톡시-4-아릴페놀(2-methoxy-4-allylphenol), 4-아미노안티피린(4-aminoantipyrin(AAP)), 디메틸아닐린(dimethylaniline), 4-아미노안티피렌(4-aminoantipyrene), 4-메톡시나프톨(4-methoxynaphthol), 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(3,3',5,5'-tetramethyl benzidine(TMB)), 2,2-아지노-디-[3-에틸-벤즈티아졸린 술포네이트] (2,2-azino- di-[3-ethyl-benzthiazoline sulfonate]), o-디아니지딘(o-dianisidine), o-톨루이딘(o-toluidine), 2,4-디클로로페놀(2,4-dichlorophenol), 4-아미노페나논(4-amino phenazone), 벤지딘(benzidine)로 이루어진 그룹 중 선택한다.
이상과 같은 구성의 본 발명은 시료 내의 특정단백질의 농도를 빠르고 정확하게 측정할 수 있는 효과가 있다.
또한, 측정 시간이 짧으므로 다중 측정을 통해 S/N비를 크게 향상되는 효과가 있다.
또한, 당화단백질의 농도를 측정하는 경우 헤모글로빈과 당화헤모글로빈의 분리단계를 거치지 않고 동시에 두 물질의 농도를 측정하여 그 비율을 구할 수 있 는 효과가 있다.
또한, 빠르고 정확하게 당화단백질의 양을 정량적으로 측정할 수 있어 측정의 정확성 및 신뢰성을 향상시킬 수 있으며, 일회용의 센서로 만들기에도 적합하다.
이하에서 도면을 참조하여 본 발명에 따른 바이오센서를 이용한 단백질 측정 장치에 대해 상세히 설명한다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 바이오센서를 이용한 단백질 측정 장치의 개략도인데 도 1에 도시한 바와 같이, Fourier 변환을 이용한 임피던스 측정을 통해 빠르고 간편하게 당화단백질의 농도를 측정할 수 있는 본 발명에 따른 단백질 측정 장치는 파형발생기(function generator; 110), 일정전위 장치(120), 바이오센서(130), 데이터 처리부(140)를 포함한다.
본 발명에서 이용한 당화단백질 측정의원리는 도 2에 도시한 바와 같이 혈액 속에 존재하는 당화단백질의 농도가 증가함에 따라 전극표면에 도포된 자가조립단일층(self-assembled monolayer, SAM)의 분자와 결합이 증가해 Fe(CN)63-/Fe(CN)64- 또는 Ru(NH3)3+/Ru(NH3)2+과 같은 산화-환원 물질의 전극 표면으로의 전자 전달 반응을 방해하는 임피던스가 더불어 증가하므로 푸리에 변환을 통해 임피던스를 측정하여 시료 중 당화단백질의 농도를 측정한다.
이때 사용할 수 있는 전자전달 산화환원 물질은 페로센(ferrocene), 페로센 유도체, 퀴논(quinones), 퀴논 유도체, 유기 전도성 염(organic conducting salt), 또는 비오로겐(viologen), 헥사아민루세늄(III)클로라이드(hexaammineruthenium(III)chloride), 포타슘페리시아나이드 (potassium ferricyanide), 포타슘페로시아나이드(potassium ferrocyanide), 디메틸페로센(dimethylferrocene (DMF)), 페리시니움(ferricinium), 페로센모노카르복실산(ferocene monocarboxylic acid (FCOOH)), 7,7,8,8,-테트라시아노퀴노디메탄(7,7,8,8-tetracyanoquino- dimethane (TCNQ)), 테트라티아풀발렌 (tetrathia fulvalene(TTF)), 니켈로센(nickelocene(Nc)), N-메틸아시디니움(N-methyl acidinium(NMA+)), 테트라티아테트라센(tetrathiatetracene(TTT)), N-메틸페나지니움(N-methylphenazinium (NMP+)), 히드로퀴논(hydroquinone), 3-디메틸아미노벤조산(3-dimethylaminobenzoic acid(MBTHDMAB)), 3-메틸-2-벤조티오조리논히드라존 (3-methyl-2-benzothiozolinone hydrazone), 2-메톡시-4-아릴페놀(2-methoxy-4-allylphenol), 4-아미노안티피린(4-aminoantipyrin(AAP)), 디메틸아닐린(dimethylaniline), 4-아미노안티피렌(4-aminoantipyrene), 4-메톡시나프톨(4-methoxynaphthol), 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(3,3',5,5'-tetramethyl benzidine(TMB)), 2,2-아지노-디-[3-에틸-벤즈티아졸린 술포네이트] (2,2-azino- di-[3-ethyl-benzthiazoline sulfonate]), o-디아니지딘(o-dianisidine), o-톨루이딘(o-toluidine), 2,4-디클로로페놀(2,4-dichlorophenol), 4-아미노페나논(4-amino phenazone), 벤지딘(benzidine), 프루시안 블루(prussian blue) 등의 혼합 전자가 화합물을 사용할 수도 있다.
본 발명의 단백질 측정 장치는 빠른 임피던스 측정을 위해, 각각의 주파수를 교류전위와 섭동 시킨 뒤 화학 반응계에 적용하여 이로 인해 발생하는 교류전류 값을 이용해 임피던스를 측정하는 기존의 주파수감응분석기(frequency response analyzer, FRA)와는 달리 본 발명에서는 동일한 진폭과 위상을 가지는 모든 주파수의 교류파형으로 구성된 파를 적분된 델타파형으로 적용함으로써 측정시간을 획기적으로 줄일 수 있는 특징을 가지고 있다. 즉, 파형발생기는 델타 함수 파형을 적분한 펄스전위를 인가하고 이에 의해 발생하는 전류를 측정하고 이를 푸리에 변환하여 임피던스를 측정한다. 도 2에서 도시한 것과 같이 적분된 델타파형은 펄스전위(potential step)와 동일해 일반적 전기 장치로도 쉽게 이용할 수 있는 특징을 가지고 있다(J.-S. Yoo and S.-M. Park, An Electrochemical Impedance Measurement Technique Employing Fourier Transform Anal. Chem., 72, 9, 2035-2041, 2000). 또한, 적분된 형태의 펄스전위(potential step)를 전기화학 시스템에 인가하기 위해서는 전위-전류 함수 자체가 직선의 관계를 가져야 바람직하며, 본 발명의 실시 예들에서는 5~15 mV의 작은 델타펄스전위를 적용하였으나, 바람직한 결과의 인가전위가 이에 국한되는 것은 아니다.
파형 발생기(110)는 델타펄스전위(potential step)을 발생시키는 전기 장치와 같다. 일정전위 장치(120)는 임의파형발생기(110)에 의해 만들어진 델타펄스전위를 받아 측정하고자 하는 화학 반응계에 일정한 직류 전위를 가하는 장치로서 보다 빠르고 안정하게 전위를 부여하기 위해 이용하였다.
바이오센서의 측정부(130)는 기준전극(131)과 일정전위를 유지하기 위한 보조전극(132)으로 구성되며, 측정하고자 하는 당화단백질과 선택적 결합능력을 가지고 있는 보론산 유도체가 자가조립단일층(self-assembled monolayer, SAM)의 형태로 작업전극(133)에 도포된다. 보조전극은 측정시료와 화학적 반응을 일으키지 않는 도체가 바람직하며, 기준전극은 일정전위를 유지할 수 있는 은/염화은 또는 유사 기준전극으로 사용할 수 있는 전극들이 바람직하고, 작업전극의 기판전극은 금, 은, 동 등이 바람직하나 SAM 형성에 유리한 일체의 물질들을 사용할 수 있다. 혈액 중 당화단백질의 존재에 의해 상기 측정부(130)의 작업전극(133) 표면에 형성된 SAM분자는 당화단백질과 결합을 형성하게 되고 그 결합에 의해 전극 표면에 형성된 SAM-당화단백질의 개체 수에 따라 용액 속에 존재하는 Fe(CN)63-/Fe(CN)64- 와 같은 전기 활성종의 산화, 환원에 의한 전자 전달 효율이 영향을 받게 되며 이는 상기 일정전위장치(120)를 이용하여 전기화학적 방법을 통해 전류의 양을 측정한다. 이렇게 일정전위장치(120)에 의해 측정된 전류신호는 데이터 처리부(140)로 전달되며, 시간대전류법(chronoamperometry)을 통하여 측정된 전류신호를 도 2와 같은 과정을 거쳐 푸리에변환을 통해 임피던스를 측정한다.
본 발명에 따른 일실시예에서 임피던스 측정은 미분함수에 해당하는 델타 펄스 전위를 가하여 그 대응신호를 측정하고 이를 미분한 뒤 푸리에 변환하여 그 결과 값을 얻었으며 이를 통해 총 측정시간이 2ms 이내이므로 확산에 의한 영향이 제거되어 보다 정확히 분석물의 농도를 측정할 수 있는 장점을 가지고 있으며, 다중의 신호를 일정시간 동안 축적하여 S/N 비를 획기적으로 개선할 수 있는 장점을 갖는다.
당화단백질 중 당화혈색소의 양은 종종 혈액 중 총 헤모글로빈의 양에 대한 상대적인 당화헤모글로빈의 양으로 나타낸다. 따라서 당화헤모글로빈의 수치를 구하려면 총 헤모글로빈의 양을 함께 측정해야 함으로 헤모글로빈과 당화헤모글로빈을 분리하는 단계를 거쳐 측정하는 방법이 종래에 사용되었다. 이에 반해 본 발명에서 제시하는 당화헤모글로빈 측정 센서는 도 3에 나타낸 것과 같이 Fe3+를 헤모글로빈과 당화헤모글로빈의 반응지표물질로 사용하여 분리과정 없이 동시에 측정한다.
헤모글로빈의 경우 헤모글로빈을 구성하는 햄(HEME)기에 포함된 Fe2+와 완충용액에 혼합된 Fe3+와의 가역적 산화, 환원 반응에 의한 전류를 전기화학적 방법을 통해 측정된다. 즉 본 발명의 경우 기존의 당화단백질의 측정방법과는 달리 헤모글로빈과 당화단백질의 분리과정 없이 측정이 가능하며 도 4에서 보는 것과 같이 각 측정 물질에 따른 센서가 구분되어 있다. 본 측정센서는 금 작업전극(133)과 보조전극(132) 그리고 은/염화은 기준전극(131)과 각 전극을 측정장비와 연결하는 전기 연결선(134)으로 구성되어있다. 3가지 전극을 제외한 나머지 부분은 절연물질을 이용해 절연층을 형성하였다. 그리고 소량의 혈액 시료를 빠른 시간에 측정하기 위해 모세관 현상을 이용하며 이를 위해 미세한 유로를 양면 테이프(136)를 이용해 제작하였다. 또한 본 측정센서는 측정용액이 주입되는 용액 주입구(137), 그리고 원활한 용액 주입을 위한 공기배출구(138)로 구성되어 있다. 당화단백질의 측정센서의 경우 금 작업전극(133) 표면에 상기에서 제시한 보론산 유도체를 이용해 SAM 구조물을 제작하는 반면, 헤모글로빈 측정센서의 경우 금 작업전극(133) 표면을 처리하지 않는다.
도 5에서 보는 것과 같이 용혈시약(Hemolysis reagent), 완충용액, Fe3+가 화합된 용액에 일정 양의 혈액을 첨가한 측정용액을 각 전극에 주입하는 방식을 나타낸 그림으로 헤모글로빈과 당화단백질 측정을 위해 상기 도 4에서 제시한 전극을 두 개를 측정 장비에 삽입하며 용혈 과정을 거친 측정용액을 혈액 주입구(140)로 주입하면 모세관 현상에 의해 소량의 용액이 유로를 통해 각 전극으로 이동하게 된다.
도 6은 채취한 전 혈(Whole blood)을 용혈 과정을 통해 당화단백질 및 헤모글로빈의 측정을 위한 측정 용액으로 변형시키기 위한 방법으로 모세관 현상을 이용한 채혈 침이 구비된 혈액 포집 모세관(201)으로 일정 양의 혈액을 채취한 뒤 쉽게 찢어질 수 있는 막으로 구성된 혈액 주입 구(202)에 삽입하여 용혈시약, 완충용액, Fe3+가 혼합된 용액(204)에 주사기의 피스톤 원리를 이용하여 플런저(203)로 밀어 넣게 된다. 상기 용액(204)과 혼합된 혈액 중 기타 고형물질은 필터(205)를 통하여 제거된다. 혼합된 측정용액은 용액 주입 구(207)를 통해 상기 용액 저장소(137)에 끼워져 주입되게 된다. 뚜껑(207)은 혼합 및 시료 주입 전 오염을 방지하는 역할을 한다.
아래에 본 발명에 대한 다음의 실시 예를 제시하나, 본 발명의 효과는 아래의 실시 예에 제한되지 않는다.
실시 예 1. 푸리에 변환법을 이용한 임피던스를 통한 당화단백질의 측정
실험방법은 상기에서 제시한 방법 및 원리를 이용하였으며, 실험조건은 다음과 같다. 완충용액은 pH 7.4, 10mM PBS(Phosphate Buffered Saline)와 2.5mM Fe3+을 바탕 용액으로 사용하였으며, 혈액 샘플은 용혈된 혈액샘플을 사용하였으며, 당화헤모글로빈의 농도는 4.5%, 5.2%, 7.0%, 9.2%, 11.6%의 용액을 사용하였다. 금 작업전극(133)에 자가조립단일층(SAM)은 10mM 싸이오펜 보로산(Thiophene boronic acid)을 사용하여 제작하였다.
그 측정 결과는 도 7의 감응곡선을 통해 볼 수 있으며, 각 농도에 따른 전하전이저항(Rct)를 측정하여 바탕용액의 전하전이저항에 대한 비율로 나타내었다. 도 7은 주파수 감응 분석기를 이용하여 임피던스를 측정한 것으로 종래의 방법은 측정시간이 많이 걸리고 신호대 잡음비를 효과적으로 향상시키기 위해 출력되는 신호의 평균을 취하는 작업을 수행함에 따라 데이터의 처리시간이 많이 걸리는 문제점이 있다. 하지만 본 발명의 측정방법은 넓은 영역의 다양한 주파수를 델차함수의 파형으로 한 번에 인가함에 따라 측정시간을 획기적으로 줄일 수 있고 50ms 이내의 짧은 시간에 임피던스 측정법 등 전기화학반응을 실시간으로 모니터링 할 수 있는 장점이 있다.
도 8은 1200초의 전하전이저항의 평균값을 로그 값을 취한 뒤 검정곡선을 나타낸 것이다. 도 8에서와 같이 좋은 직진성을 보이는 것으로 보아 본 발명의 임피 던스 측정법이 바이오 센서로 적용이 가능함을 알 수 있다.
실시 예 2. 주파수감응분석 임피던스를 통한 당화단백질의 측정
본 발명은 Fourier 변환법을 이용한 임피던스를 통한 당화단백질의 측정센서를 개발하는 것으로 임피던스법 자체의 당화단백질 센서로의 가능성을 확인하기 기존 측정 방법인 주파수 감응 분석기를 이용해 당화단백질 각 농도에 따른 임피던스를 측정하였다.
실험방법은 상기 실시 예 1에서 제시한 방법과 동일하며 그 측정 결과는 도 9의 감응곡선과 도 10의 검정곡선을 통해 확인 할 수 있다.
도 9와 도 10에서 알 수 있듯이 당화단백질의 농도의 증가에 따라 임피던스의 증가율이 직선적으로 증가하는 것으로 보아 임피던스법의 바이오 센서로의 적합성을 확인할 수 있었고 이는 Fourier 변환법을 이용한 임피던스법에 의해 당화단백질이 효과적으로 검출됨을 알 수 있다.
실시 예 3. 푸리에변환임피던스를통한당화헤모글로빈측정
포텐셜 상승 시간이 50ms보다 작은 포텐시오스탯을 이용하여 푸리에변환 임피던스법을 실시예 1의 전극에 적용하였다. 임피던스 데이터는 0.4Hz에 해당하는 2.5초 10mV의 전위스텝을 써서 첫 2.5초 동안 수집하였다. 여기서 얻어진 시간대전류법 데이터로부터 임피던스 데이터는 0.4 ~ 10kHz의 범위에서 계산하였으며, 2.5초 동안 순환전압전류법을 400mV/s의 스캔속도로 실시하였다. 전하이동저항은 4mL pH 8.5의 완충용액으로 제조한 여러 농도의 스톡 용액에서 40㎕를 취하여 전극과 산화-환원 쌍이 있는 용액에 주입하여 측정하였다. 표준물질로는 전체 헤모글로빈 양(140±10g/L)에 대하여 4 ~ 13%의 당화헤모글로빈을 포함한 JCCLS CRM004a (Japanese Committee for Clinical Laboratory Standards)을 사용하였다. 임피던스는 전위차스텝을 미분하고 전위차스텝에서 얻어진 시간대전류법 결과를 시간영역에서 0.4 ~ 10kHz의 주파수 영역으로 변환함으로써 얻었으며, 데이터는 20분간 측정하였다. 여기서 얻어진 결과는 도 11에 나타내었으며, 시료에 포함된 헤모글로빈의 양에 관계없이 당화헤모글로빈의 양에 비례하는 결과가 나타남을 볼 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 바이오센서를 이용한 단백질 측정장치를 나타내는 개략도이고,
도 2는 본 발명에 따른 푸리에 임피던스 측정의 원리를 나타낸 모식도이고,
도 3은 본 발명의 측정 방법을 나타낸 개략도이고,
도 4는 본 발명에 따른 측정센서의 정면도이고,
도 5는 본 발명에 따른 측정센서 카트리지의 정면도이다.
도 6는 본 발명에 따른 주사기 형태의 혈액 혼합/주입 장치의 모식도이다.
도 7는 본 발명에 따른 푸리에 임피던스를 이용한 당화단백질의 감응곡선이다.
도 8는 본 발명에 따른 푸리에 임피던스를 이용한 당화단백질의 검정곡선이다.
도 9는 본 발명에 따른 주파수감응분석기를 이용한 당화단백질의 감응곡선이다.
도 10는 본 발명에 따른 주파수감응분석기를 이용한 당화단백질의 검정곡선이다.
도 11a, b는 본 발명에 따른 1200초 간의 푸리에 변환 임피던스의 변화와 헤모글로빈에 대해 4.54, 5.27, 6.96, 9.24, and 11.58%의 당화단백질을 포함한 시료가 가해졌을 때의 전자전달저항 검정곡선이다.
<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명>
파형 발생기 : 110 전위장치 : 120
측정 장치 : 130 데이터 처리부 : 140

Claims (13)

  1. 바이오센서를 이용한 단백질 측정장치에 있어서,
    시료가 흡입되는 시료주입부와, 상기 흡입된 시료 내에 포함된 특정 단백질과의 선택적 결합을 위한 리셉터 층이 도포된 작업 전극 및 상기 작업 전극과의 전위차를 형성하는 기준전극을 포함하는 측정부를 포함하는 바이오센서와,
    상기 작업 전극 및 기준전극에 델타함수 파형의 전위신호를 인가하는 파형발생기와,
    상기 델타함수 파형에 감응하여 얻어진 전류를 푸리에 변환하여 상기 작업 전극의 임피던스를 측정하는 데이터 처리부를 포함하여 구성되고,
    상기 단백질은 헤모글로빈에 글루코오즈가 결합하여 변형된 당화 헤모글로빈 단백질이며,
    상기 리셉터 층은 보론산 유도체의 말단기를 가지는 자가조립단일층으로 형성되는 것을 특징으로 하는 바이오센서를 이용한 단백질 측정장치.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 측정부는 상기 작업 전극의 임피던스의 측정을 위해 보조전극을 더 포함하고,
    상기 델타함수 파형은 상기 작업 전극과 보조전극 사이에 인가하는 것을 특징으로 하는 바이오센서를 이용한 단백질 측정장치.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 특정 단백질의 농도는 상기 리셉터 층과의 선택적 결합에 의해 작업 전극에 유발되는 임피던스를 측정하여 산출하는 것을 특징으로 하는 바이오센서를 이용한 단백질 측정장치.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 파형발생기는 상기 델타함수 파형을 적분하여 스텝전위신호를 인가하는 것을 특징으로 하는 바이오센서를 이용한 단백질 측정장치.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 바이오센서는 시료가 모세관 현상에 의해 상기 시료 주입부를 통해 측정부로 이동할 수 있도록 공기 배출구를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오센서를 이용한 단백질 측정장치.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 시료 주입부와 미세유로를 통해 연결되고,
    상기 시료 내에 포함된 헤모글로빈의 산화환원 반응을 통해 헤모글로빈의 양을 전류법으로 측정할 수 있는 전기화학적 바이오센서를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오센서를 이용한 단백질 측정장치.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 당화헤모글로빈과 상기 헤모글로빈을 동시에 측정하기 위해 채혈 모세관이 용이하게 삽입 결합할 수 있도록 마련된 플랑저, 용혈제재 및 산화환원쌍이 포함된 완충용액이 들어있는 몸체, 상기 몸체의 일단부에 마련된 필터를 포함하는 배출구를 가지는 시료전처리 주입기를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오센서를 이용한 단백질 측정장치.
  10. 제 1항에 있어서,
    상기 작업전극은 금 또는 백금으로 구성되는 것을 특징으로 하는 바이오센서를 이용한 단백질 측정장치.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 리셉터 층은 보론산 유도체의 말단기를 가지는 자가조립단일층으로 형성되고,
    상기 보론산 유도체는 금전극과 쉽게 결합할 수 있도록 일부가 싸이올기로 변형된 것을 특징으로 하는 바이오센서를 이용한 단백질 측정장치.
  12. 제 1항에 있어서,
    상기 데이터 처리부는 상기 작업전극의 표면에 형성된 리셉터 층과 선택적으로 결합된 단백질 결합물에 의해 산화-환원 쌍의 전자전달을 방해하여 발생하는 임피던스를 측정하는 것을 특징으로 하는 바이오센서를 이용한 단백질 측정장치.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 산화-환원 쌍은 페로센(ferrocene), 페로센 유도체, 퀴논(quinones), 퀴논 유도체, 유기 전도성염(organic conducting salt), 또는 비오로겐(viologen), 헥사아민루세늄(III)클로라이드(hexaammineruthenium(III)chloride), 디메틸페로센(dimethylferrocene(DMF)), 페리시니움(ferricinium), 페로센모노카르복실산(ferocene monocarboxylic acid (FCOOH)), 7,7,8,8,-테트라시아노퀴노디메탄(7,7,8,8-tetracyanoquino- dimethane (TCNQ)), 테트라티아풀발렌(tetrathia fulvalene(TTF)), 니켈로센(nickelocene(Nc)), N-메틸아시디니움(N-methyl acidinium(NMA+)), 테트라티아테트라센(tetrathiatetracene(TTT)), N-메틸페나지니움(N-methylphenazinium (NMP+)), 히드로퀴논(hydroquinone), 3-디메틸아미노벤조산(3-dimethylaminobenzoic acid(MBTHDMAB)), 3-메틸-2-벤조티오조리논히드라존 (3-methyl-2-benzothiozolinone hydrazone), 2-메톡시-4-아릴페놀(2-methoxy-4-allylphenol), 4-아미노안티피린(4-aminoantipyrin(AAP)), 디메틸아닐린(dimethylaniline), 4-아미노안티피렌(4-aminoantipyrene), 4-메톡시나프톨(4-methoxynaphthol), 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(3,3',5,5'-tetramethyl benzidine(TMB)), 2,2-아지노-디-[3-에틸-벤즈티아졸린 술포네이트] (2,2-azino- di-[3-ethyl-benzthiazoline sulfonate]), o-디아니지딘(o-dianisidine), o-톨루이딘(o-toluidine), 2,4-디클로로페놀(2,4-dichlorophenol), 4-아미노페나논(4-amino phenazone), 벤지딘(benzidine)로 이루어진 그룹 중에서 선택한 것을 특징으로 하는 바이오센서를 이용한 단백질 측정장치.
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