JP2014532720A - バイオセンサーにおいて使用される新規化学 - Google Patents
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Abstract
Description
kET=(4π3/h2λkBT)1/2(HAB)2exp[(−ΔG°+λ)2/λkBT]
に依存すると予測している。
E0がレドックス反応の標準電位である場合、Rは、一般気体定数(8.314JK−1mol−1)であり、Tは、ケルビン温度であり、nは、反応内に移される電子の数であり、Fは、ファラデー定数(96,487クーロン)である。E0の負の側で、したがって酸化型は、還元される傾向があり、順反応(すなわち、還元)がより好都合である。電気活性種の酸化状態の変化から生じる電流は、ファラデー電流と呼ばれる。
アンカー−スペーサー1−EAM−(スペーサー2)n−CL
(式中、前記アンカーは環状ジスルフィド基を含み、
EAMは、溶媒アクセス可能なレドックス化合物を含む電気活性部分であり、
CLは捕捉リガンドであり、
スペーサー1はSAM形成種であり、
スペーサー2はリンカーであり、
n=0または1である)
を有する化合物を含む。
アンカー−スペーサー1−EAM−(スペーサー2)n−CL (I)
(式中、EAMは、遷移金属および少なくとも1つの電荷中和性配位子を含む電気活性部分である)を有する化合物を含む。この電荷中和性配位子は、ジチオカルバメート、ベンゼンジチオレート、シッフ塩基、EDTA、DTPA、カルボキシレート、アミン、チオレート、ホスフィン、イミダゾール、ピリジン、ビピリジン、テルピリジン、tacn、サレン、アカセン(acacen)、Cp、ピンサー、スコーピオネートおよびペンタアミンからなる群から選択することができる。
a)電子求引性カルバメート連結ボロン酸エステル置換リガンドを含有する出発フェロセニルEAM、および
b)出発化学種と別個のレドックス電位を生じさせる、フェロセン上に電子供与性アミノリガンドをもたらす過酸化物との反応。
a)存在する場合、標的酵素が、前記EAMが第2のE0を有するように前記捕捉リガンドを変更する条件下で、試料を、
i)第1のE0を有する1,3−二置換フェロセンを含む電気活性部分(EAM);
ii)捕捉リガンド;
を含む電極を備えた構成物と接触させるステップと
b)前記第2のE0を測定するステップと
を含む方法を提供する。
i)第1のE0を有する1,3−二置換フェロセンを含む電気活性部分(EAM);
ii)捕捉リガンド
を含む複数の電極を備えた支持体を含む。
a)存在する場合、標的酵素が、前記EAMが第2のE0を有するように前記捕捉リガンドを変更する条件下で、試料を:
i)第1のE0を有する1,3−二置換フェロセンを含む電気活性部分(EAM);
ii)捕捉リガンド;
を含むREAMCを備えた構成物と接触させるステップと
b)前記第2のE0を測定するステップと
を含む方法を提供する。
a)官能基を含む第1の種;および
b)1,3−二置換フェロセンを含む電気活性複合体(EAM)
を含む電極を備えた構成物を提供する。
a):i)第1の官能基を含む第1の種;および
ii)1,3−二置換フェロセンを含む電気活性複合体(EAM)
を含む電極を準備するステップと
c)前記電極を第2の官能基を含む生体分子と接触させて前記第1の種と前記生体分子の共有結合を形成させるステップと
を含む方法を提供する。
アンカー−スペーサー1−EAM−(スペーサー2)n−CL (I)
(式中、前記アンカーは環状ジスルフィド基を含み、
EAMは1,3−二置換フェロセンであり、
CLは捕捉リガンドであり、
スペーサー1はSAM形成種であり、
スペーサー2はリンカーであり、
n=0または1である)
を有する化合物を提供する。
アンカー−スペーサー1−EAM−スペーサー2−CL (II)
(式中、前記アンカーはジスルフィド基を介して前記電極基と連結しており、
EAMは1,3−二置換フェロセンであり、
CLは捕捉リガンドであり、
スペーサー1は絶縁性であるかまたは導電性であり、
スペーサー2は任意選択のリンカーである)
を有する化合物を含む構成物を提供する。
a)次式:
アンカー−スペーサー1−EAM−(スペーサー2)n−CL (I)
(式中、前記アンカーは環状ジスルフィド基を含み、
EAMは1,3−二置換フェロセンであり、
CLは捕捉リガンドであり、
スペーサー1は絶縁性であるかまたは導電性であり、
スペーサー2はリンカーであり、
n=0または1である)
を有する化合物を準備するステップと、
b)前記環状ジスルフィドを開環することによって前記化合物を電極と接触させて、前記アンカーの前記電極への付着を形成させるステップと
を含む方法を提供する。
a)次式:
アンカー−スペーサー1−EAM−(スペーサー2)n−CL (I)
(式中、前記アンカーは環状ジスルフィド基を含み、
EAMは1,3−二置換フェロセンであり、
CLは捕捉リガンドであり、
スペーサー1は絶縁性であるかまたは導電性であり、
スペーサー2はリンカーであり、
n=0または1である)
を有する化合物を含む電極を準備するステップと、
b)前記電極を前記検査試料と接触させるステップと;
c)前記EAMの再構成エネルギーを測定することによって前記標的分析物の存在を決定するステップと
を含む方法を提供する。
(i)任意選択の自己組織化単分子層(SAM);および
(ii)1,3−二置換フェロセンを含む電気活性活性部分(EAM)
を含む電極を備える構成物を提供する。
(a)捕捉結合リガンドが、存在する場合、検査試料中の標的分析物と特異的に結合して第1の複合体を形成するような条件下で、前記検査試料を捕捉結合リガンドと接触させるステップであって、その捕捉結合リガンドが第1の固体支持体と結合しているステップと;
(b)存在する場合、前記第1の複合体を可溶性捕捉リガンドと接触させて第2の複合体を形成するステップであって、前記可溶性捕捉リガンドが過酸化物生成系を含むステップと;
(c)過酸化物が生成してアッセイ混合物を形成する条件下で、前記第2の複合体を前記過酸化物生成系のための基質と接触させるステップと;
(d)アッセイ混合物を、
(i)電気活性活性部分(EAM)の自己組織化単分子層(SAM)または
(ii)EAMおよび任意選択のSAM
を含む電極を備えた第2の固体支持体と接触させるステップであって、前記EAMが1,3−二置換フェロセン、自壊的部分および過酸化物感受性部分(PSM)を含み、第1のE0を有しており、前記過酸化物が前記PSMと反応して前記EAMから前記SIMを放出し、第2のE0を有する前記EAMをもたらし;第2のE0を有するステップと;
(f)第1のE0および第2のE0での前記EAMの電気化学的特性を測定するステップと;
(g)前記電気化学的特性から前記標的分析物を検出するステップと
を含む方法を提供する。
(a)検査試料を、過酸化物生成系を含む可溶性捕捉リガンドと接触させて第1の複合体を形成させるステップと、
(b)捕捉結合リガンドが標的分析物と特異的に結合して第2の複合体を形成するような条件下で、存在する場合、前記第1の複合体を捕捉結合リガンドと接触させるステップであって、その捕捉結合リガンドが第1の固体支持体と結合しているステップと;
(c)過酸化物が生成してアッセイ混合物を形成する条件下で、前記第2の複合体を前記過酸化物生成系のための基質と接触させるステップと;
(d)そのアッセイ混合物を、
(i)電気活性活性部分(EAM)の自己組織化単分子層(SAM)または
(ii)EAMおよび任意選択のSAM
を含む電極を備えた第2の固体支持体と接触させるステップであって、
前記EAMが1,3−二置換フェロセン、自壊的部分および過酸化物感受性部分(PSM)を含み、第1のE0を有し、前記過酸化物を前記PSMと反応して前記EAMから前記SIMを放出し、第2のE0を有する前記EAMをもたらし;第2のE0を有するステップと;
(f)第1のE0および第2のE0で前記EAMの電気化学的特性を測定するステップと;
(g)前記電気化学的特性から前記標的分析物を検出するステップと
を含む方法を提供する。
R1は、水素、−S−C1〜C20アルキル、−S−C2〜C20アルケニルまたは−S−C2〜C20アルキニルであり;
Xは、−C1〜C20アルキル−、−C2〜C20アルケニル−、−C2〜C20アルキニル−、−X1−CONH−、−X1−CO2−または−X1−OCNH−であり、ここでX1は、ポリオキシアルキレン、ポリメチレン、オリゴフェニレンおよびポリフェニレン(エチニレン)からなる群から選択され;
R2は水素またはC1〜C6アルキルであり;
R3は−NR4R5、−CO2R5、−CONR4R5または−NR5CO2−R6であり;
ここでR4は水素またはC1〜C6アルキルであり;
ここでR5は、水素、C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル、アリール(C1〜C6アルキル)、アリール(C2〜C6アルケニル)、ヘテロアリール(C1〜C6アルキル)またはヘテロアリール(C2〜C6アルケニル)であり、ここで、それぞれは、ハロゲン、−CN、−NO2、−N3、C1〜C6アルキル、ハロ(C1〜C6アルキル)、C1〜C6アルコキシ、アミノ、C1〜C6アルキルアミノ、ジC1〜C6アルキルアミノ、−CO2H、−COH、−CO2(C1〜C6アルキル)、−CONH2、−CON(C1〜C6アルキル)2または過酸化物感受性部分から選択される1〜4個の置換基で任意選択で置換されており;
ここでR6は、C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル、アリール(C1〜C6アルキル)、アリール(C2〜C6アルケニル)、ヘテロアリール(C1〜C6アルキル)またはヘテロアリール(C2〜C6アルケニル)であり、ここで、それぞれは、ハロゲン、−CN、−NO2、−N3、C1〜C6アルキル、ハロ(C1〜C6アルキル)、C1〜C6アルコキシ、アミノ、C1〜C6アルキルアミノ、ジC1〜C6アルキルアミノ、−CO2H、−COH、−CO2(C1〜C6アルキル)、−CONH2、−CON(C1〜C6アルキル)2または過酸化物感受性部分から選択される1〜4個の置換基で任意選択で置換されている)
のフェロセン化合物を提供する。
本発明は、レドックス活性分子と電極との間の電子移動を容易にするまたは妨害するための、分析物の結合によるレドックス活性分子の再構成エネルギーの変化を用いて標的分析物を検出するための方法および構成物を提供する。本発明は、遷移金属イオンなどのレドックス活性分子が酸化されるか(電子を失う)、または還元される(電子を獲得する)と、分子構造ならびにその近接溶媒環境に変化が起こるという事実に基づいている。分子構造(結合の長さおよび角度)およびその分子を取り囲む溶媒分子の構成におけるこれらの変化は、新規の酸化状態をエネルギー的に安定化させる役目を果たす。これらの変化の合計が、レドックス反応の再構成エネルギーλを構成する。分子内変化は内圏再構成エネルギーλiと称され、溶媒および環境の変化は外圏または溶媒再構成エネルギーλoと称される。
特に有用な一実施形態では、提供されるアッセイは、2011年1月19日に出願された米国仮出願第61/434,122号および2011年8月15日に出願された同第61/523,679号の優先権の利益を主張する、2012年1月19日に出願されたOhmxの米国特許公開第20120181186号、および2009年8月7日に出願された米国仮出願第61/232,339号の優先権の利益を主張する、2010年8月9日に出願された米国特許公開第12/853,204号、ならびに2012年10月17日に出願された米国特許出願第13/653931号に記載されているE−TRACEアッセイに部分的に基づく。これらはすべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。E−TRACEアッセイは、基本的に、電気化学的検出のための代用標的として過酸化物を産生するオキシダーゼタグ付き二次抗体を有する電気化学的プラットホームでのサンドイッチアッセイである。
ステップ1:一次抗体を用いた修飾:電気化学的プラットフォームの表面を、過酸化物のE−TRACE検出用センシング分子(EAM)を含むように修飾する。さらに、第2の固体支持体を捕捉プローブで修飾する。この捕捉プローブ、例えば、抗体は、標的(例えば、ヘモグロビンおよび糖化ヘモグロビンを含めたヘモグロビン)のすべての変異型に選択的および同等に結合する。本明細書の定義では、用語「選択的に結合する」は、所定の標的(例えば、ヘモグロビンA1cを含む総ヘモグロビン)に結合することを意味し、「同等に結合する」は、タンパク質(例えば、ヘモグロビン)および糖化タンパク質(例えば、ヘモグロビンA1c)の両方に非選択的に、を意味する。
標的分析物は一般に、試料中に存在する。当業者が理解することになるように、試料溶液は、それだけに限らないが、体液(それだけに限らないが、実質的に任意の生物の血液、尿、血清、リンパ、唾液、肛門分泌物および膣分泌物、汗および***を含み、哺乳動物試料が好適であり、ヒト試料が特に好適である);環境試料(それだけに限らないが、空気、農業、水、および土壌の試料を含む);植物材料;生物兵器剤試料;研究試料、精製試料、生の試料などを含めた任意の数のものを含むことができる。当業者が理解することになるように、実質的に任意の実験的操作を試料に対して行うことができる。いくつかの実施形態では、貯蔵された(例えば、凍結および/またはアーカイブされた)またはフレッシュな組織からの標的試料を利用する。パラフィン包埋試料は、多くの実施形態で特に有用であり、その理由は、これらの試料が診断および予後などの試料と関連した追加のデータの存在に起因して非常に有用であり得るためである。本明細書に記載の固定組織試料およびパラフィン包埋組織試料は、貯蔵可能またはアーカイバル組織試料を指す。ほとんどの患者由来病理標本は、組織分析および後続のアーカイバル貯蔵が可能になるように日常的に固定またはパラフィン包埋される。
標的分析物は、電極を備える固体支持体を使用して検出される。本明細書で「基板」もしくは「固体支持体」または他の文法的均等物とは、捕捉リガンドの付着または会合に適切な別個の個々の部位を含有するように修飾することができる任意の材料を意味する。適当な基板としては、金などの金属表面、以下に定義される電極、ガラスおよび改質ガラスまたは機能化ガラス、繊維ガラス、テフロン、セラミック、雲母、プラスチック(アクリル樹脂、ポリスチレン、およびスチレンと他の材料のコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリウレタン、テフロン(登録商標)、およびこれらの誘導体などを含む)、GETEK(ポリプロピレンオキシドと繊維ガラスのブレンド)など、多糖、ナイロンまたはニトロセルロース、樹脂、ケイ素および変性ケイ素を含めたシリカまたはシリカ系材料、炭素、金属、無機ガラス、ならびに様々な他のポリマーがあり、プリント回路板(PCB)材料が特に好適である。
本発明は、電極の表面上か、またはいくつかの場合、溶液中でのレドックス活性分子の電気化学的電位E0の変化をもとにした標的分析物を検出するための方法および構成物を対象とする(本明細書での説明の大部分は固相アッセイを対象とするが、当業者が理解することになるように、本発明は溶液においても用いることができ、本明細書でのそうした説明は溶液相アッセイにも適用可能なものとして適用されるものとする)。
AG−スペーサー1−EAM (Ia)
AG−スペーサー1−CL (Ib)
AG−スペーサー1−TGn (Ic)
(式中、AGはアンカー基であり、EAMは溶媒アクセス可能レドックス複合体を含む電気活性部分であり、スペーサー1は本明細書で説明するSAM形成種であり、CLは捕捉リガンドであり、TGは末端基であり、nは0または1である)。
AG−スペーサー1−EAM−(スペーサー2)n−CL (II)
(式中、AGはアンカー基であり、EAMは溶媒アクセス可能レドックス複合体を含む電気活性部分であり、CLは捕捉リガンドであり、スペーサー1は本明細書で説明するSAM形成種であり、スペーサー2はリンカーであり、n=0または1である)
を有する化合物を提供する。
を有する化合物を提供する。
この配置の一例を以下に示す:
一態様では、本発明は、電極に付着したこれらのリガンドアーキテクチャを提供する。本明細書で「電極」とは、電子デバイスに接続されているとき、電流または電荷を検知し、それを信号に変換することができる構成物を意味する。好適な電極は、当技術分野で公知であり、これらとして、それだけに限らないが、金;白金;パラジウム;ケイ素;アルミニウムを含めたある特定の金属およびこれらの酸化物;酸化白金、酸化チタン、酸化スズ、インジウムスズ酸化物、酸化パラジウム、酸化ケイ素、酸化アルミニウム、酸化モリブデン(Mo2O6)、酸化タングステン(WO3)、および酸化ルテニウムを含めた金属酸化物電極;ならびに炭素(ガラス状炭素電極、グラファイト、および炭素ペーストを含む)がある。好適な電極には、金、ケイ素、炭素、および金属酸化物電極が含まれ、金が特に好適である。
いくつかの実施形態では、電極は任意選択でSAMをさらに含む。本明細書で「単分子層」または「自己組織化単分子層」または「SAM」は、表面上に自発的に化学吸着された分子の相対的に秩序あるアセンブリーを意味し、ここで分子は、互いにほぼ平行に、かつ表面に対しておおよそ垂直に配向している。分子のそれぞれは、表面に接着する官能基、および単分子層内で隣接分子と相互作用して相対的に秩序あるアレイを形成する部分を含む。「混合」単分子層は、異種の単分子層を含み、すなわちこの場合、少なくとも2種の異なる分子が単分子層を構成する。本明細書に概説したように、単分子層を使用すると、表面への生体分子の非特異的結合の量が低減し、核酸の場合では、電極からのオリゴヌクレオチドの距離の結果としてオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの効率が増大する。したがって、単分子層は、電極表面から離して標的酵素を維持することを促進する。さらに、単分子層は、電極の表面から離して電荷担体を保持する機能を果たす。したがって、この層は、電極とReAMとの間、または電極と溶媒内の荷電種との間の電気的接触を防止するのに役立つ。このような接触は、直接「短絡」または試料中に存在し得る荷電種を介した間接短絡をもたらし得る。したがって、単分子層は、存在する「ホール」が最小限であるように、電極表面上で、均一層でしっかりとパックされていることが好ましい。したがって、単分子層は、電極への溶媒接近性を遮断する物理的バリアとして機能を果たす。
本発明は、アンカー基を含む化合物を提供する。本明細書で「アンカー」または「アンカー基」とは、本発明の化合物を電極に付着させる化学基を意味する。
一態様では、本発明は、本発明の化合物を表面に付着させるためのピリジンおよびその誘導体の使用を提供する。
単一部分として構造1で表されているが、導電性オリゴマーは、1つを超える「A」部分で電極に付着される場合があり、「A」部分は、同じであっても異なっていてもよい。したがって、例えば、電極が金電極である場合、「A」は、硫黄原子または部分であり、構造2、3、および4に以下で一般に表されているものなど、複数の硫黄原子を使用して電極に導電性オリゴマーを付着させることができる。当業者が理解することになるように、他のこのような構造を作製することができる。構造2、3、および4では、A部分は、単に硫黄原子であるが、置換硫黄部分も使用することができる。
アンカー基に加えて、本発明は、電気活性部分を含む化合物を提供する。本明細書で「電気活性部分(EAM)」または「遷移金属錯体」または「レドックス活性分子」または「電子伝達部分(ETM)」とは、1つまたは複数の電子を可逆的または半可逆的に移動させることができる金属含有化合物を意味する。電子ドナーおよびアクセプター能力は、相対的である、すなわち、ある特定の実験条件下で電子を失うことができる分子は、異なる実験条件下で電子を受容することができることが理解されるべきである。
本発明のEAMは、EAMが、存在するとき第1のE0、および以下に記載するように除去されているとき第2のE0を有するようにEAMに共有結合的に付着している少なくとも1つの自壊的部分を含む。
自壊的スペーサーは、本発明の過酸化物感受性部分(PSM、時にPOMと本明細書で呼ばれる)およびEAMを接合する。一般に、過酸化物感受性部分はホウ素を含むことができる。例えば、適切な1,2−ジオール化合物は、ボロン酸部分とエステルを形成して過酸化物感受性部分を提供することができる。ホウ素を含有する過酸化物感受性部分のいくつかの例を以下に示す:
いくつかの実施形態では、EAMは置換1,1’−フェロセンを含む。フェロセンは空気中で安定である。これは、捕捉リガンドとアンカー基の両方で容易に置換することができる。フェロセン上の捕捉リガンドとの標的タンパク質の結合によって、これは、フェロセン周りの環境を変えるだけでなく、シクロペンタジエニル環がスピンするのを阻止することになり、これはエネルギーを約4kJ/mol変えることになる。WO/1998/57159;Heinze and Schlenker、Eur.J.Inorg.Chem.2974〜2988頁(2004);Heinze and Schlenker、Eur.J.Inorg.Chem.66〜71頁(2005);およびHolleman−Wiberg、Inorganic Chemistry、Academic Press第34版、at 1620、すべてが参照により組み込まれている。
Xは、−C1〜C20アルキル−、−C2〜C20アルケニル−、−C2〜C20アルキニル−、−X1−CONH−、−X1−CO2−または−X1−OCNH−であり、ここでX1は、ポリオキシアルキレン、ポリメチレン、オリゴフェニレンおよびポリフェニレン(エチニレン)からなる群から選択され、
R2は水素またはC1〜C6アルキルであり、
R3は−NR4R5、−CO2R5、−CONR4R5または−NR5CO2−R6であり、
ここでR4は水素またはC1〜C6アルキルであり、
ここでR5は、水素、C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル、アリール(C1〜C6アルキル)、アリール(C2〜C6アルケニル)、ヘテロアリール(C1〜C6アルキル)またはヘテロアリール(C2〜C6アルケニル)であり、ここで、それぞれは、ハロゲン、−CN、−NO2、−N3、C1〜C6アルキル、ハロ(C1〜C6アルキル)、C1〜C6アルコキシ、アミノ、C1〜C6アルキルアミノ、ジC1〜C6アルキルアミノ、−CO2H、−COH、−CO2(C1〜C6アルキル)、−CONH2、−CON(C1〜C6アルキル)2または過酸化物感受性部分から選択される1〜4個の置換基で任意選択で置換されており、
ここでR6は、C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル、アリール(C1〜C6アルキル)、アリール(C2〜C6アルケニル)、ヘテロアリール(C1〜C6アルキル)またはヘテロアリール(C2〜C6アルケニル)であり、ここで、それぞれは、ハロゲン、−CN、−NO2、−N3、C1〜C6アルキル、ハロ(C1〜C6アルキル)、C1〜C6アルコキシ、アミノ、C1〜C6アルキルアミノ、ジC1〜C6アルキルアミノ、−CO2H、−COH、−CO2(C1〜C6アルキル)、−CONH2、−CON(C1〜C6アルキル)2または過酸化物感受性部分から選択される1〜4個の置換基で任意選択で置換されている)
の化合物である。
である、式(III)を参照して上述したようなフェロセン化合物を提供する。
いくつかの実施形態では、EAMまたはReAMCは、付着リンカーの電極との会合を可能にする官能性部分を一般にさらに含む付着リンカーまたはスペーサー(「スペーサー1」)を介して、アンカー基(これは電極に付着している)と共有結合的に付着している。例えば米国特許第7,384,749号を参照されたい。これはその全体が参照により、特に付着リンカーの考察のため本明細書に組み込まれている。金電極の場合、硫黄原子を、官能基(本発明の目的のためには、この付着は共有結合であると考えられる)として使用できることに留意すべきである。本明細書で「スペーサー」または「付着リンカー」とは、電極の表面から離れて、レドックス活性複合体を保持する部分を意味する。いくつかの実施形態では、スペーサーは本明細書で概説するような導電性オリゴマーであるが、適切なスペーサー部分は、以下で概説するような不動態化剤および絶縁体を含む。いくつかの場合、スペーサー分子はSAM形成種である。スペーサー部分は実質的に非導電性であってよいが、好ましくは(しかし要求されるわけではない)、レドックス活性分子と電極(HAB)との間の電子結合が、電子移動の速度を制限しないものである。
本発明において、様々な分子を捕捉リガンドとして使用することができる。本明細書では、「捕捉リガンド」、「結合リガンド」、「捕捉結合リガンド」、「捕捉結合種」または「捕捉プローブ」は、標的分析物と結合することになる、標的分析物の存在を探るために使用される化合物を意味する。一般に、捕捉リガンドは、検出のために、標的分析物の電極への付着を可能にする。以下でより完全に概説するように、標的分析物の捕捉プローブへの付着は直接的(すなわち、標的分析物が捕捉リガンドと結合する)であっても間接的(1つまたは複数の捕捉延長リガンドが使用される)であってもよい。本明細書で「共有結合的に付着した(covalently attached)」とは、2つの部分が、σ結合、π結合および配位結合を含む少なくとも1つの結合によって付着されていることを意味する。
当業者が理解することになるように、この構成物は、当技術分野で公知の様々な技術を用いて作製することができる。例えば、米国特許第6,013,459号、同第6,248,229号、同第7,018,523号、同第7,267,939号、米国特許出願第09/096593号および同第60/980,733号ならびに「Electrochemical Assay for the Detection of Enzymes」という名称の米国仮出願の開示を参照されたい。これは参照により本明細書に組み込まれている。
A.標的分析物および試料
一態様では、本発明は、標的分析物の検出において有用な方法および構成物を提供する。本明細書で「標的分析物」もしくは「分析物」または文法的均等物とは、検出しようとするものであり、結合種、例えば以下で定義する捕捉リガンドと結合できる任意の分子または化合物を意味する。適切な分析物には、これらに限定されないが、化学小分子、例えばこれらに限定されないが農薬、殺虫剤、毒素、治療薬および乱用薬物、ホルモン、抗生物質、抗体、有機材料等を含む環境的もしくは臨床的な化学物質または汚染物質あるいは生体分子が含まれる。適切な生体分子には、これらに限定されないが、タンパク質(酵素、免疫グロブリンおよび糖タンパク質を含む)、核酸、脂質、レクチン、炭水化物、ホルモン、全細胞(原核細胞(病原性細菌など)および哺乳動物腫瘍細胞を含む真核細胞を含む)、ウイルス、胞子等が含まれる。特に好適な分析物は、酵素を含むタンパク質;薬物、細胞;抗体;抗原;細胞膜抗原および受容体(神経受容体、ホルモン受容体、栄養受容体および細胞表面受容体)またはこれらのリガンドである。
このクラスは、明確に異なる2つのファミリーを含む。哺乳動物酵素、例えばキモトリプシン、トリプシンもしくはエラスターゼまたはカリクレインを含むキモトリプシンファミリー、および細菌酵素、例えばスブチリシンを含むスブチリシンファミリーである。全体的な三次元(3D)構造は2つのファミリーで異なるが、これらは同じ活性部位の幾何学的形状を有しており、触媒作用は同じ機序によって進行する。セリンエンドペプチダーゼは、基質残基と相互作用する種々の酵素サブサイト中でのアミノ酸置換に関連する、異なった基質特異性を示す。いくつかの酵素が基質で拡大された相互作用部位を有するのに対して、他の酵素はP1基質残基に限定された特異性を有する。
このファミリーには、植物プロテアーゼ、例えばパパイン、アクチニジンもしくはブロメライン;リソソームカテプシンならびにカテプシンB、L、S、H、J、NおよびOを含むいくつかの哺乳動物カテプシン;細胞質カルパイン(カルシウム活性化された)ならびにいくつかの寄生虫プロテアーゼ(例えば、トリパノソーマ、住血吸虫属)およびインターロイキン変換酵素(ICE)を含むカスパーゼが含まれる。
アスパラギン酸エンドペプチダーゼの大部分はペプシンファミリーに属する。ペプシンファミリーには、消化酵素、例えばペプシンおよびキモシンならびにリソソームカテプシンDおよびプロセシング酵素、例えばレニンおよび特定の真菌プロテアーゼ(ペニシロペプシン、リゾプスペプシン、エンドチアペプシン)が含まれる。第2のファミリーは、ウイルスエンドペプチダーゼ、例えばレトロペプシンとも称されるAIDSウイルス(HIV)からのプロテアーゼを含む。
金属エンドペプチダーゼは、細菌、菌類ならびにより高度な生物において見られる。これらは、その配列およびその構造は広く異なるが、その大多数の酵素は、触媒的に活性な亜鉛原子を含む。いくつかの場合、活性を失うことなく、亜鉛をコバルトまたはニッケルなどの別の金属で置き換えることができる。細菌サーモリシンは十分特性評価されており、その結晶学的構造は、亜鉛が、2つのヒスチジンおよび1つのグルタミン酸によって結合されていることを示している。多くの酵素は、亜鉛について2つのヒスチジンリガンドを提供する配列HEXXHを含み、一方で、第3のリガンドは、グルタミン酸(サーモリシン、ネプリライシン、アラニルアミノペプチダーゼ)かまたはヒスチジン(アスタシン)である。他のファミリーは、明確に異なるモードのZn原子の結合を示す。切断可能な結合のカルボニル基への亜鉛結合水分子の攻撃の後、触媒機序は非共有結合性の四面体中間体の形成をもたらす。この中間体は、グルタミン酸プロトンの離脱基への移動によってさらに分解する。
通常細菌由来である毒素エンドペプチダーゼは、宿主生物に対して破壊的な、時には致命的な影響を有する可能性がある。より良好な公知の細菌エンドペプチダーゼ毒素のいくつかを以下の表2に挙げる。
一態様では、本発明は、標的分析物を検出する方法を提供する。検査試料中に含まれる標的分析物を、存在する場合、その標的分析物が捕捉リガンドと結合する条件下で、溶媒アクセス可能レドックス活性複合体かまたは溶媒アクセス可能レドックス活性分子と捕捉リガンドの混合物を含む電極に加える。これらの条件は一般に生理学的条件である。通常、種々の濃度に対する差分的応答を得るために、複数のアッセイ混合物を異なる濃度で並行して実行する。一般に、これらの濃度の1つは陰性対照、すなわちゼロ濃度または検出レベル以下としての役目を果たす。さらに、様々な他の任意の試薬をスクリーニングアッセイに含めることができる。これらには、最適な結合を促進し、かつ/または非特異的もしくはバックグラウンド相互作用を低減するのに使用され得る、塩、中性タンパク質、例えばアルブミン、界面活性剤などのような試薬が含まれる。アッセイの効率を他の方法で改善する試薬、例えば、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗微生物剤なども使用することができる。成分の混合物を、要求される結合をもたらす任意の順序で添加することができる。
レドックス活性分子と電極との間の電子移動は、様々な方法で検出することができ、それだけに限らないが、アンペロメトリー、ボルタンメトリー、電気容量、およびインピーダンスを含めた電子検出が好適である。これらの方法としては、ACまたはDC電流に基づく時間または周波数依存法、パルス法、ロックイン技法、およびフィルタリング(高域通過、低域通過、帯域通過)がある。いくつかの実施形態では、必要なことは、電子移動の検出であり、他の実施形態では、電子移動速度を求めることができる。
入力信号を送信して電子移動を開始した後、出力信号が受信または検出される。出力信号の存在および規模は、入力信号の過電位/振幅;入力AC信号の周波数;電子伝達部分同士間の介在媒体の組成、すなわちインピーダンス;DCオフセット;システムの環境;および溶媒に依存することになる。所与の入力信号において、出力信号の存在および規模は、金属イオンの酸化状態の変化を生じさせるのに要求される溶媒再配置エネルギーに一般に依存することになる。したがって、AC成分およびDCオフセットを含む入力信号を送信すると、電子は、電極とレドックス活性分子との間で移動され、溶媒再配置エネルギーが十分低いとき、周波数は範囲内であり、振幅は十分であり、出力信号をもたらす。
本発明は、AC検出法を使用して分析物を検出するための装置をさらに提供する。装置は、少なくとも第1の測定電極または試料電極、および第2の測定電極または対電極を有する試験チャンバーを含む。3電極システムも有用である。第1のおよび第2の測定電極は、検査試料受容領域と接触しており、その結果、液体検査試料の存在下で、2つの電極は、電気的接触していることができる。
本明細書で使用する以下の用語および表現は表示された意味を有する。
化合物200〜206の合成
1,3−二置換フェロセンEAM
一連の1,3−二置換フェロセン誘導体(1〜4)を、金の上でのSAM形成のために、異なる官能性部分および有機硫黄アンカー基を用いて合成した(図12)。
1,3−二置換フェロセンEAM21〜24
以下の略語を用いた:DCM、ジクロロメタン;HOAc、酢酸;PPh3、トリフェニルホスフィン;THF、テトラヒドロフラン;EDC、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド;KOH、水酸化カリウム;TFA、トリフルオロ酢酸;TES、トリエチルシラン;DPPA、ジフェニルホスホリルアジド;TEA、トリエチルアミン;DBTC、ジ−n−ジブチルスズジラウレート;NaH、水素化ナトリウム;MeI、ヨードメタン;DMAP、ジメチルアミノピリジン。
1,3−二置換フェロセンEAM31
図16Bに示すように、DCM(25mL)中の25(0.259g、0.90mmol)の0℃溶液に、BOC−グリシン(0.269g、153mmol)、HOBT(0.235g、1.53mmol)およびEDC(0.311g、1.62mmol)を加えた。反応物を19時間撹拌し、減圧下で濃縮した。カラムクロマトグラフィーで精製して26を暗黄色油状物(0.397g、0.89mmol、99%)として得た。
Claims (30)
- 次式のフェロセン化合物
R1は、水素、−S−C1〜C20アルキル、−S−C2〜C20アルケニルまたは−S−C2〜C20アルキニルであり、
Xは、−C1〜C20アルキル−、−C2〜C20アルケニル−、−C2〜C20アルキニル−、−X1−CONH−、−X1−CO2−または−X1−OCNH−であり、ここでX1は、ポリオキシアルキレン、ポリメチレン、オリゴフェニレンおよびポリフェニレン(エチニレン)からなる群から選択され、
R2は、水素またはC1〜C6アルキルであり、および
R3は、−NR4R5、−CO2R5、−CONR4R5または−NR5CO2−R6であり、
ここでR4は、水素またはC1〜C6アルキルであり、
ここでR5は、水素、C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル、アリール(C1〜C6アルキル)、アリール(C2〜C6アルケニル)、ヘテロアリール(C1〜C6アルキル)またはヘテロアリール(C2〜C6アルケニル)であり、ここで、それぞれは、ハロゲン、−CN、−NO2、−N3、C1〜C6アルキル、ハロ(C1〜C6アルキル)、C1〜C6アルコキシ、アミノ、C1〜C6アルキルアミノ、ジC1〜C6アルキルアミノ、−CO2H、−COH、−CO2(C1〜C6アルキル)、−CONH2、−CON(C1〜C6アルキル)2または過酸化物感受性部分から選択される1〜4個の置換基で任意選択で置換されており、および
ここでR6は、C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル、アリール(C1〜C6アルキル)、アリール(C2〜C6アルケニル)、ヘテロアリール(C1〜C6アルキル)またはヘテロアリール(C2〜C6アルケニル)であり、ここで、それぞれは、ハロゲン、−CN、−NO2、−N3、C1〜C6アルキル、ハロ(C1〜C6アルキル)、C1〜C6アルコキシ、アミノ、C1〜C6アルキルアミノ、ジC1〜C6アルキルアミノ、−CO2H、−COH、−CO2(C1〜C6アルキル)、−CONH2、−CON(C1〜C6アルキル)2または過酸化物感受性部分から選択される1〜4個の置換基で任意選択で置換されている)。 - R1が、水素または−S−C1〜C20アルキルである、請求項1に記載のフェロセン化合物。
- Xが、−C1〜C20アルキル−、−C2〜C20アルケニル−または−C2〜C20アルキニル−である、請求項1または2のいずれか一項に記載のフェロセン化合物。
- Xが、ノニレンである、請求項3に記載のフェロセン化合物。
- Xが、−X1−CONH−、−X1−CO2−または−X1−OCNH−であり、ここでX1は、ポリオキシアルキレン、ポリメチレン、オリゴフェニレンおよびポリフェニレン(エチニレン)からなる群から選択される、請求項1〜4のいずれか一項に記載のフェロセン化合物。
- Xが−X1−CONH−であり、X1はポリオキシアルキレンである、請求項5に記載のフェロセン化合物。
- R3が、−NR4R5、−CO2R5または−CONR4R5である、請求項1〜6のいずれか一項に記載のフェロセン化合物。
- R3が、−NH2、−CO2(C1〜C6アルキル)または−CO2Hである、請求項7に記載のフェロセン化合物。
- R3が−CONR4R5であり、R4は水素またはC1〜C6アルキルであり、R5はC1〜C6アルキル、アリール(C1〜C6アルキル)またはヘテロアリール(C1〜C6アルキル)である、請求項1〜8のいずれか一項に記載のフェロセン化合物。
- R3が−NR5CO2−R6であり、R5は水素、C1〜C6アルキルまたはアリール(C1〜C6アルキル)である、請求項1〜8のいずれか一項に記載のフェロセン化合物。
- R6が、アリール(C1〜C6アルキル)またはC2〜C6アルケニルであり、それぞれは過酸化物感受性部分で任意選択で置換されている、請求項10に記載のフェロセン化合物。
- 過酸化物感受性部分が、4,4,5,5−テトラメチル−1,3,2−ジオキサボロラニルである、請求項11に記載のフェロセン化合物。
- (i)任意選択の自己組織化単分子層(SAM)、および
(ii)1,3−二置換フェロセンを含む電気活性活性部分(EAM)
を含む電極を備える構成物。 - 前記1,3−二置換フェロセンが、請求項1〜15のいずれかに記載の化合物を含む、請求項16に記載の構成物。
- 前記1,3−二置換フェロセンが官能基をさらに含む、請求項16に記載の構成物。
- 官能基が自壊的部分および過酸化物感受性部分を含む、請求項18に記載の構成物。
- 前記電極が官能基をさらに含む、請求項16〜19のいずれかに記載の構成物。
- 前記官能基が捕捉リガンドを含む、請求項18または20のいずれかに記載の構成物。
- 前記官能基が、マレイミド、イミドエステル、N−ヒドロキシスクシンイミジル、アルキルハライド、アリールハライド、α−ハロアシルおよびピリジルジスルフィドを含む部分からなる群から選択される、請求項18または20のいずれかに記載の構成物。
- 自己組織化単分子層(SAM)をさらに含む、請求項16〜22のいずれかに記載の構成物。
- SAMが非導電性オリゴマーまたは導電性オリゴマーである、請求項23に記載の構成物。
- 自己組織化単分子層(SAM)を含む電極を備えた構成物であって、前記SAMが次式:
アンカー−スペーサー1−EAM−(スペーサー2)n−FG (I)
(式中、前記アンカーは環状ジスルフィド基を含み、
EAMは1,3−二置換フェロセンであり、
FGは官能基であり、
スペーサー1はSAM形成種であり、
スペーサー2はリンカーであり、および
n=0または1である)
を有する化合物を含む構成物。 - 自己組織化単分子層(SAM)を含む電極を備えた構成物であって、前記SAMが次式:
アンカー−スペーサー1−EAM−スペーサー2−FG (II)
(式中、前記アンカーはジスルフィド基を介して前記電極基と結合しており、
EAMは1,3−二置換フェロセンであり、
FGは官能基であり、
スペーサー1は絶縁性であるかまたは導電性であり、および
スペーサー2は任意選択のリンカーである)
を有する化合物を含む構成物。 - 検査試料中の1つまたは複数の標的分析物を検出する方法であって、
(a)捕捉結合リガンドが、存在する場合、検査試料中の標的分析物と特異的に結合して第1の複合体を形成するような条件下で、前記検査試料を捕捉結合リガンドと接触させるステップであって、前記捕捉結合リガンドが第1の固体支持体と結合しているステップと、
(b)存在する場合、前記第1の複合体を可溶性捕捉リガンドと接触させて第2の複合体を形成するステップであって、前記可溶性捕捉リガンドが過酸化物生成系を含むステップと、
(c)過酸化物が生成してアッセイ混合物を形成する条件下で、前記第2の複合体を前記過酸化物生成系のための基質と接触させるステップと、
(d)アッセイ混合物を、(i)電気活性活性部分(EAM)の自己組織化単分子層(SAM)または(ii)EAMおよび任意選択のSAMを含む電極を備えた第2の固体支持体と接触させるステップであって、前記EAMが1,3−二置換フェロセン、自壊的部分および過酸化物感受性部分(PSM)を含み、第1のE0を有しており、前記過酸化物が前記PSMと反応して前記EAMから前記SIMを放出し、第2のE0を有する前記EAMをもたらし、第2のE0を有するステップと、
(f)第1のE0および第2のE0で前記EAMの電気化学的特性を測定するステップと、
(g)前記電気化学的特性から前記標的分析物を検出するステップと
を含む方法。 - 検査試料中の1つまたは複数の標的分析物を検出する方法であって、
(a)検査試料を、過酸化物生成系を含む可溶性捕捉リガンドと接触させて、第1の複合体を形成させるステップと、
(b)捕捉結合リガンドが標的分析物と特異的に結合して第2の複合体を形成するような条件下で、存在する場合、前記第1の複合体を捕捉結合リガンドと接触させるステップであって、前記捕捉結合リガンドが第1の固体支持体と結合しているステップと、
(c)過酸化物が生成してアッセイ混合物を形成する条件下で、前記第2の複合体を前記過酸化物生成系のための基質と接触させるステップと、
(d)アッセイ混合物を、(i)電気活性活性部分(EAM)の自己組織化単分子層(SAM)または(ii)EAMおよび任意選択のSAMを含む電極を備えた第2の固体支持体と接触させるステップであって、前記EAMが1,3−二置換フェロセン、自壊的部分および過酸化物感受性部分(PSM)を含み、第1のE0を有し、前記過酸化物を前記PSMと反応して前記EAMから前記SIMを放出し、第2のE0を有する前記EAMをもたらし、第2のE0を有するステップと、
(f)第1のE0および第2のE0で前記EAMの電気化学的特性を測定するステップと
(g)前記電気化学的特性から前記標的分析物を検出するステップと
を含む方法。 - ステップ(c)の前に、第2の複合体を単離するステップをさらに含む、請求項27または28のいずれか一項に記載の方法。
- 1,3−二置換フェロセンが請求項1〜20のいずれかに記載の化合物である、請求項27または28のいずれかに記載の方法。
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