DE69737683T2 - Antikörper gegen die ed-b domäne von fibronektin, ihre herstellung und verwendungen - Google Patents

Antikörper gegen die ed-b domäne von fibronektin, ihre herstellung und verwendungen Download PDF

Info

Publication number
DE69737683T2
DE69737683T2 DE1997637683 DE69737683T DE69737683T2 DE 69737683 T2 DE69737683 T2 DE 69737683T2 DE 1997637683 DE1997637683 DE 1997637683 DE 69737683 T DE69737683 T DE 69737683T DE 69737683 T2 DE69737683 T2 DE 69737683T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
antibody
isolated antibody
antibody fragment
isolated
fragment according
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE1997637683
Other languages
English (en)
Other versions
DE69737683D1 (de
Inventor
Dario Inst.für Mol NERI
Barbara Inst.Naz.plR CARNEMOLLA
Annalisa Inst.Naz.per SIRI
Enrica Inst.Naz.per BALZA
Patrizia Inst.Naz.Ric CASTELLANI
Alessandro Universita d PINI
Luciano Inst.Naz.per ZARDI
Greg Cambridge Ce WINTER
Giovanni Universita d NERI
Laura Inst.Naz.per BORSI
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Philogen SpA
Original Assignee
Philogen SpA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Philogen SpA filed Critical Philogen SpA
Application granted granted Critical
Publication of DE69737683D1 publication Critical patent/DE69737683D1/de
Publication of DE69737683T2 publication Critical patent/DE69737683T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft spezifische Bindungselemente für eine fötale Isoform von Fibronektin, ED-B, die auch in der sich entwickelnden Neovaskulatur von Tumoren exprimiert wird, wie sowohl durch Immunzytochemie als auch durch In-vivo-Targeting auf Tumoren gezeigt wird. Sie betrifft auch Materialien und Verfahren, die sich auf solche spezifische Bindungselemente beziehen.
  • Das primäre Ziel der meisten bestehenden Formen von Tumortherapie ist es, möglichst viele den Tumor bildende Zellen abzutöten. Der eingeschränkte Erfolg, der mit Chemotherapie und Strahlentherapie erreicht wurde, ist auf das relative Fehlen von Spezifität der Behandlung und die Tendenz zu toxischen Nebenwirkungen auf normales Gewebe zurückzuführen. Ein Weg, wie die Tumorselektivität der Therapie verbessert werden kann, ist es, das Mittel dem Tumor über ein Bindungsprotein, das für gewöhnlich eine Bindungsdomäne eines Antikörpers umfasst, mit Spezifität für ein Markerantigen, das auf der Oberfläche des Tumors exprimiert wird, aber in normalen Zellen fehlt, zuzuführen. Diese Form von gerichteter Therapie, die salopp "Zauberkugeln" genannt wird, ist hauptsächlich anhand von monoklonalen Antikörpern (MAKs) von Nagetieren veranschaulicht worden, die für so genannte tumorassoziierte Antigene spezifisch sind, die auf der Zelloberfläche exprimiert werden. Solche MAKs können entweder chemisch an die zytotoxische Gruppierung (z.B. ein Toxin oder ein Arzneimittel) konjugiert werden oder können als rekombinantes Fusionsprotein produziert werden, in dem die Gene, die für den MAK kodieren, und das Toxin aneinander gebunden sind und hintereinander exprimiert werden.
  • Der Ansatz der „Zauberkugeln" hat eine eingeschränkte, wenn auch signifikante Wirkung bei der Behandlung von Krebs beim Menschen gehabt, besonders beim Abzielen auf Tumoren von lymphoidem Ursprung, wo die meisten malignen Zellen für die therapeutische Dosis im Blutkreislauf frei zugänglich sind. Jedoch bleibt die Behandlung von soliden Tumoren insofern ein ernsthaftes klinisches Problem, als nur ein winziger Anteil der gesamten Zellmasse, vor allem die Zellen am äußersten Rand des Tumors therapeutischen Immunkonjugaten im Blutkreislauf ausgesetzt ist, wobei diese peripheren Ziele eine so genannte „Bindungsstellenbarriere" zum Tumorinneren bilden (Juweid et al., Cancer Res. 52, 5144-5135 (1992)). Innerhalb des Tumors ist die Gewebearchitektur bei fibrösem Stroms und eng gepackten Tumorzellen im Allgemeinen zu dicht, um die Penetration von Molekülen im Größenbereich von Antikörpern zu ermöglichen. Weiters ist bekannt, dass Tumoren aufgrund des Fehlens von Lymphdrainage einen erhöhten interstitiellen Druck aufweisen, was auch das Einströmen von exogenen Molekülen verhindert. Für einen jüngsten Bericht über die Faktoren, welche die Aufnahme von therapeutischen Mitteln in Tumoren beeinflussen, siehe R. Jain, Sci. Am. 271, 58-65 (1994).
  • Obwohl es bei der Behandlung von festen Tumoren durch das Abzielen auf tumorassoziierte Antigene offensichtliche Grenzen gibt, teilen diese Tumoren eine Eigenschaft, die ein alternatives Antigenziel für Antikörpertherapie bietet. Sobald sie eine bestimmte Größe überschritten haben, hängen Tumoren allgemein von einer unabhängigen Blutzufuhr ab, sodass ausreichend Sauerstoff und Nährstoffe das Wachstum aufrechterhalten können. Wenn diese Blutzufuhr beeinträchtigt oder okkludiert wird, besteht ein realistisches Potenzial, in diesem Prozess tausende von Tumorzellen auszuhungern. Wenn sich ein Tumor entwickelt, geht er in einen angiogenen Phänotyp über, wodurch ein vielfältiges Schema von angiogenen Faktoren produziert wird, die auf benachbarte Kapillarendothelzellen einwirken, wodurch diese proliferieren und wandern. Die Struktur dieser neu gebildeten Blutgefäße ist höchst desorganisiert mit Sackgassen und Höhlenbildungen, die zu erhöhter Durchlässigkeit führen, in merklichem Gegensatz zur geordneten Struktur von Kapillaren in normalem Gewebe. Induktion von Angiogenese ist von einer Hinaufregulierung der Expression bestimmter Zelloberflächenantigene begleitet, von denen viele auch bei der Vaskulatur normaler Gewebe vorkommen. Die Identifikation von Antigenen, die für die Neovaskulatur von Tumoren einzigartig sind, ist der wichtigste einschränkende Faktor in der Entwicklung einer generischen Behandlung fester Tumoren durch Abzielen auf Gefäße. Das Antigen, das der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, beschäftigt sich direkt mit diesem Problem.
  • Im Verlauf der Tumorprogression wird die extrazelluläre Matrix des umgebenden Gewebes durch zwei Hauptprozesse neu modelliert: (1) den proteolytischen Abbau von extrazellulären Matrixkomponenten von normalem Gewebe und (2) die De-novo-Synthese von extrazellulären Matrixkomponenten sowohl durch Tumorzellen als auch Stromazellen, die durch tumorinduzierte Zytokine aktiviert werden. Diese zwei Prozesse erzeugen im stationären Zustand eine „extrazelluläre Tumormatrix", die eine geeignetere Umgebung für Tumorprogression bereitstellt und sich qualitativ und quantitativ von jenen von normalen Geweben unterscheidet. Unter den Komponenten dieser Matrix sind die großen Isoformen von Tenascin und Fibronektin (FN), die Beschreibung dieser Proteine als Isoforme erkennt ihre weitgehende Strukturheterogenität, die auf Transkriptions-, Posttranskriptions- und Posttranslationsebene herbeigeführt wird (siehe unten). Eine der Isoformen von Fibronektin, die so genannte B+-Isoform (B-FN), ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
  • Fibronektine (FN) sind multifunktionelle Glykoproteinkomponenten mit hohem Molekulargewicht sowohl aus extrazellulärer Matrix als auch aus Körperflüssigkeiten. Sie sind in viele biologische Prozesse involviert, wie z.B. die Schaffung und Aufrechterhaltung normaler Zellmorphologie, Zellmigration, Hämostase und Thrombose, Wundheilung und onkogene Transformation (Berichte dazu siehe Alitalo et al. (1982), Yamada (1983), Hynes (1985), Ruoslahti et al. (1988), Hynes (1990); Owens et al. (1986)). Strukturdiversität bei FN wird durch alternatives Spleißen dreier Regionen (ED-A, ED-B und IIICS) des primären FN-Transkripts (Hynes (1985), Zardi et al. (1987)) verursacht, wobei zumindest 20 verschiedene Isoformen produziert werden, wovon einige in Tumor- und in normalem Gewebe unterschiedlich exprimiert werden. Wie es auch auf gewebe- und entwicklungsspezifische Art und Weise reguliert wird, ist bekannt, dass das Spleißmuster von FN-prä-mRNA in transformierten Zellen und in Malignitäten dereguliert wird (Castellani et al. (1986); Borsi et al. (1987); Vartio et al., (1987); Zardi et al. (1987); Barone et al. (1989); Carnemolla et al. (1989), Oyama et al. (1989) (1990); Borsi et al. (1992b)). Tatsächlich werden die FN-Isoformen, die ED-A-, ED-B- und IIICS-Sequenzen enthalten, in transformierten und malignen Tumorzellen in stärkerem Ausmaß exprimiert als in normalen Zellen. Insbesondere werden die FN-Isoformen, welche die ED-B-Sequenz enthalten (B+-Isoform), in fötalem und Tumorgewebe am stärksten exprimiert, wie auch während der Wundheilung, aber ihre Expression in normalem Gewebe ist eingeschränkt (Norton et al. (1987); Schwarzbauer et al. (1987); Guturan und Kornblihtt (1987), Carnemolla et al. (1989); Ffrench-Constant et al. (1989), Ffrench-Constant und Hynes (1989), Laitinen et al. (1991)). B+-FN-Moleküle sind in reifen Gefäßen nicht detektierbar, sind aber in angiogenen Blutgefäßen bei normaler (z.B. Entwicklung des Endometriums), pathologischer (z.B. bei diabetischer Retinopathie) und Tumorentwicklung hinaufreguliert (Castellani et al. (1994)).
  • Die ED-B-Sequenz ist eine vollständige Typ-III-Homologiewiederholung, für die ein einziges Exon kodiert und, welches 91 Aminosäuren umfasst. Im Gegensatz zur alternativ gespleißten IIICS-Isoform, die eine zelltypspezifische Bindungsstelle umfasst, ist die biologische Funktion der A+- und der B+-Isoform immer noch Anlass für Spekulationen (Humphries et al. (1986)).
  • Die Gegenwart der B+-Isoformen selbst konstituiert ein tumorinduziertes Neoantigen, aber zusätzlich exponiert die ED-B-Expression ein normalerweise kryptisches Antigen innerhalb der Typ-III-Wiederholung 7 (vor ED-B); da dieses Epitop nicht in FN-Molekülen exponiert ist, denen ED-B fehlt, folgt, dass ED-B-Expression die Expression von Neoantigenen sowohl direkt als auch indirekt induziert. Diese kryptische Antigenstelle bildet das Ziel eines monoklonalen Antikörpers (MAK), der BC-1 genannt wird (Carnemolla et al. (1992)). Die Spezifität und biologischen Eigenschaften dieses MAK sind in EP 0.344.134 B1 beschrieben worden, und selbiger ist aus dem Hybridom erhältlich, das bei der European Collection of Animal Cell Cultures, Porton Down, Salisbury, UK, unter der Nummer 88042101 zu beziehen ist. Der MAK ist erfolgreich eingesetzt worden, um die angiogenen Blutgefäße von Tumoren ohne Kreuzreaktivität mit reifem Gefäßendothel zu lokalisieren, was das Potenzial von FN-Isoformen für vaskuläres Abzielen unter Einsatz von Antikörpern veranschaulicht.
  • Allerdings bleiben bestimmte Vorbehalte bezüglich der Spezifität von BC-1-MAK aufrecht. Die Tatsache, dass BC-1 nicht direkt die B+-Isoform erkennt, hat die Frage aufgeworfen, ob in manchen Geweben das Epitop, das von BC-1 erkannt wird, ohne die Gegenwart von ED-B demaskiert werden kann und deshalb indirekt zu ungewollter Kreuzreaktivität von BC-1 führt. Weiters ist BC-1 streng spezifisch für die menschliche B+-Isoform, was bedeutet, dass Studien an Tieren über die Bioverteilung und Tumorlokalisierung von BC-1 nicht möglich sind. Obwohl polyklonale Antikörper gegen rekombinante Fusionsproteine, welche die B+-Isoform enthalten, produziert worden sind (Peters et al. (1995)), reagieren sie nur mit FN, das mit N-Glykanase behandelt worden ist, um das Epitop zu demaskieren.
  • Ein weiteres allgemeines Problem bei der Verwendung von monoklonalen Maus-Antikörpern ist die Antwort des menschlichen Anti-Maus-Antikörpers (RAMA) (Schroff et al. (1985), Dejager et al. (1988)). HAMA-Antworten haben eine Reihe von Wirkungen, von Neutralisation des verabreichten Antikörpers, was zu einer reduzierten therapeutischen Dosis führt, über allergische Antworten, Serumerkrankung, bis hin zu Nierenschäden.
  • Obwohl polyklonale Antiseren, die mit rekombinantem ED-B reagieren, identifiziert worden sind (siehe oben), hat sich die Isolierung von MAKs mit derselben Spezifität wie BC-1 nach Immunisierung von Mäusen allgemein als schwierig erwiesen, weil menschliche und Maus-ED-B-Proteine praktisch 100%ige Sequenzhomologie zeigen. Das menschliche Protein kann deshalb wie ein Eigen-Antigen für Mäuse aussehen, die dann keine Immunantwort darauf auslösen. Tatsächlich ist in über zehn Jahren intensiver Forschung in diesem Bereich nur ein einziger MAK mit indirekter Reaktivität auf die B+-FN-Isoform (BC-1) identifiziert worden, wobei keiner ED-B direkt erkennt. Es ist nahezu sicher signifikant, dass die Spezifität von BC-1 für ein kryptisches Epitop besteht, das als Folge von ED-B exponiert wird, und nicht für einen Teil von ED-B selbst, das wahrscheinlich in Maus-FN fehlt und deshalb vom Immunsystem der Maus nicht als „eigen" erkannt wird.
  • Die Umsetzung der vorliegenden Erfindung ist unter Einsatz einer zu den zuvor verwendeten Strategien alternativen Strategie gemacht worden, und wo keine vorherige Immunisierung mit Fibronektin oder ED-B erforderlich ist, gilt Folgendes: Antikörper mit Spezifität für die ED-B-Isoform sind als einkettige Fvs (ScFvs) aus Bibliotheken von variablen menschlichen Antiköper-Regionen erhalten worden, die auf der Oberfläche von filamentösen Bakteriophagen präsentiert werden (Nissim et al. (1994), siehe auch WO 92/01047 , WO 92/20791 , WO 93/06213 , WO 93/11236 , WO 93/19172 ).
  • Die Erfinder haben unter Einsatz einer Antikörper-Phagenbibliothek herausgefunden, dass spezifische scFvs sowohl durch direkte Selektion auf rekombinanten FN-Fragmenten, welche die ED-B-Domäne enthalten, als auch auf rekombinantem ED-B selbst isoliert werden können, wenn diese Antigene auf eine feste Oberfläche geschichtet werden („Panning"). Dieselben Quellen von Antigen sind auch erfolgreich eingesetzt worden, um eine „zweite Generation" von scFvs mit verbesserten Eigenschaften gegenüber den Ausgangsklonen in einem Prozess der „Affinitätsreifung" zu produzieren. Die Erfinder haben herausgefunden, dass die isolierten scFvs ohne vorherige Behandlung mit N-Glykanase stark und spezifisch mit der B+-Isoform von menschlichem FN reagieren.
  • In Antitumoranwendungen haben die Antigenbindungsdomänen des menschlichen Antikörpers, der von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt wird, den Vorteil, nicht Auslöser einer HAMA-Antwort zu sein. Weiters sind sie, wie hierin veranschaulicht wird, zur immunhistochemischen Analyse von Tumorengewebe, sowohl in vitro als auch in vivo, nützlich. Diese und andere Anwendungen werden hierin näher diskutiert und sind für den durchschnittlichen Fachmann offensichtlich.
  • Zang et al., Matrix Biology, Band 14, 623-633 (1994), beschreiben einen polyklonalen Antikörper, der gegen eine Extradomäne B von Fibronektin von Hunden gezüchtet wurde.
  • JP02076598 und JP 04169195 beschreiben monoklonale Antikörper gegen Fibronektin.
  • Terminologie
  • Spezifisches Bindungs(paar)element
  • Dies beschreibt ein Element eines Paars von Molekülen, die Bindungsspezifität füreinander haben. Die Elemente eines spezifischen Bindungspaars können natürlicher Abstammung sein oder vollständig oder teilweise synthetisch hergestellt werden. Ein Element des Paars von Molekülen hat einen Bereich auf seiner Oberfläche oder eine Höhle, die sich spezifisch an eine spezielle räumliche und polare Organisation des anderen Elements des Paars von Molekülen bindet und daher dazu komplementär ist. Daher haben die Elemente des Paars die Eigenschaft, sich spezifisch aneinander zu binden. Beispiele für solche Formen von spezifischen Bindungspaaren sind Antigen-Antikörper, Biotin-Avidin, Hormon-Hormon-Rezeptor, Rezeptor-Ligand, Enzym-Substrat.
  • Antikörper
  • Dies beschreibt ein Immunglobulin, ob natürlich oder teilweise oder vollständig synthetisch hergestellt. Der Begriff deckt auch ein beliebiges Polypeptid oder Protein ab, das über eine Bindungsdomäne verfügt, die eine Antikörperbindungsdomäne ist oder dazu homolog ist. Diese können von natürlichen Quellen abstammen oder teilweise oder vollständig synthetisch hergestellt werden. Beispiele für Antikörper sind die Immunglobulin-Isotypen und ihre Isotyp-Unterklassen, Fragmente, die eine Antigenbindungsdomäne umfassen, wie z.B. Fab, scFv, Fv, dAb, Fd, und Diakörper.
  • Es ist möglich, monoklonale und andere Antikörper heranzuziehen und DNA-Rekombinationstechnologie-Verfahren anzuwenden, um andere Antikörper oder chimäre Moleküle zu produzieren, welche die Spezifität des ursprünglichen Antikörpers beibehalten. Solche Verfahren können die Einführung von DNA, die für die variable Immunglobulinregion, oder die komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs), eines Antikörpers kodiert, in die konstanten Regionen oder konstanten Regionen plus Gerüstregionen eines anderen Immunglobulins umfassen. Siehe z.B. EP-A-184.187 , UK-A-2.188.638 oder EP-A-239.400 . Ein Hybridom oder eine andere Zelle, die einen Antikörper produziert, kann Genmutation oder anderen Veränderungen unterzogen werden, welche die Bindungsspezifität von produzierten Antikörpern ändern kann, oder auch nicht.
  • Da Antikörper in verschiedenster Art und Weise modifiziert werden können, sollte der Begriff „Antikörper" so abgegrenzt sein, dass er beliebige spezifische Bindungselemente oder Substanzen abdeckt, die über eine Bindungsdomäne mit der erforderlichen Spezifität verfügen. Daher deckt dieser Begriff Antikörperfragmente, Derivate, funktionelle Äquivalente und Homologe von Antikörpern ab, die ein beliebiges Polypeptid umfassen, das eine Immunglobulinbindungsdomäne umfasst, ob natürlich oder vollständig oder teilweise synthetisch. Es sind deshalb auch chimäre Moleküle enthalten, die eine Immunglobulinbindungsdomäne, oder ein Äquivalent davon, umfassen, die an ein anderes Polypeptid fusioniert ist. Die Klonierung und Expression von chimären Antikörpern wird in EP-A-0.210.694 und EP-A-0.125.023 beschrieben.
  • Es ist gezeigt worden, dass Fragmente eines gesamten Antikörpers die Funktion von Bindungsantigenen erfüllen können. Beispiele für Bindungsfragmente sind (i) das Fab-Fragment, das aus VL-, VH-, CL- und CH1-Domänen besteht; (ii) das Fd-Fragment, das aus VH- und CH1-Domänen besteht; (iii) das Fv-Fragment, das aus VL- und VN-Domänen eines einzigen Antikörpers besteht; (iv) das dAb-Fragment (Ward et al. (1989)), das aus einer VN-Domäne besteht; (v) isolierte CDR-Regionen; (vi) F(ab')2-Fragmente, bivalente Fragmente, die zwei verbundene Fab-Fragmente umfassen; (vii) einkettige Fv-Moleküle (scFv), worin eine VN-Domäne und eine VL-Domäne über einen Peptidlinker verbunden sind, der den beiden Domänen ermöglicht, sich zu assoziieren, um eine Antigenbindungsstelle zu bilden (Bird et al. (1988), Huston et al. (1988)); (viii) bispezifische scFv-Dimere ( PCT/US92/09965 ); und (ix) „Diakörper", multivalente oder multispezifische Fragmente, die durch Genfusion erzeugt werden ( WO 94/13804 ; Holliger et al. (1993)).
  • Diakörper sind Multimere von Polypeptiden, wobei jedes Polypeptid eine erste Domäne, die eine Bindungsregion einer Immunglobulin-Leichtkette umfasst, und eine zweite Domäne umfasst, die eine Bindungsregion einer Immunglobulin-Schwerkette enthält, wobei die beiden Domänen verbunden sind (z.B. über einen Peptidlinker), aber nicht in der Lage sind, sich miteinander zu assoziieren, um eine Antigenbindungsstelle zu bilden; Antigenbindungsstellen werden durch Assoziation der ersten Domäne eines Polypeptids innerhalb jedes Multimers mit der zweiten Domäne eines anderen Polypeptids innerhalb des Multimers gebildet ( WO 94/13804 ).
  • Wenn bispezifische Antikörper verwendet werden sollen, können diese herkömmliche bispezifische Antikörper sein, die auf eine Reihe von Arten (Holliger und Winter (1993)), z.B. chemisch oder aus Hybrid-Hybridomen, hergestellt werden können oder ein beliebiges der bispezifischen Antikörperfragmente sein können, die zuvor genannt wurden. Es kann bevorzugt sein, scFv-Dimere oder Diakörper anstelle von ganzen Antikörpern zu verwenden. Diakörper und scFvs können ohne Fc-Region hergestellt werden, wobei nur variable Domänen verwendet werden, die potenziell die Wirkungen von anti-idiotypischen Reaktionen reduzieren. Andere Formen bispezifischer Antikörper umfassen die einzelkettigen „Janusine", die von Traunecker et al. (1991) beschrieben werden.
  • Eispezifische Diakörper können im Gegensatz zu bispezifischen ganzen Antikörpern auch besonders nützlich sein, weil sie einfach herzustellen sind werden und in E. coli exprimiert werden können. Diakörper (und viele andere Polypeptide, wie z.B. Antikörperfragmente) mit geeigneten Bindungsspezifitäten können einfach unter Einsatz von Phagendisplay ( WO 94/13804 ) aus Bibliotheken selektiert werden. Wenn ein Arm des Diakörpers konstant gehalten werden soll, z.B. mit einer Spezifität, die gegen Antigen X gerichtet ist, dann kann eine Bibliothek, worin der andere Arm variabel ist, erzeugt und ein Antikörper von geeigneter Spezifität selektiert werden.
  • Antigenbindungsdomäne
  • Dies beschreibt den Teil eines Antikörpers, der jenen Bereich umfasst, der sich spezifisch an das gesamte Antigen oder einen Teil davon bindet und komplementär dazu ist. Wenn ein Antigen groß ist, kann ein Antikörper nur an einen bestimmten Teil des Antigens binden, dessen Teil Epitop genannt wird. Eine Antigenbindungsdomäne kann durch eine oder mehrere variable Antikörperdomänen bereitgestellt werden.
  • Vorzugsweise umfasst eine Antigenbindungsstelle eine variable Antikörper-Leichtketten- (VL-) Region und eine variable Antikörper-Schwerketten- (VH-) Region.
  • Spezifisch
  • Dies bezeichnet die Situation, in der ein Element eines spezifischen Bindungspaars keine signifikante Bindung an Moleküle zeigt, die nicht ihre spezifischen Bindungspartner sind. Der Begriff ist auch dann anwendbar, wenn beispielsweise eine Antigenbindungsdomäne für ein spezielles Epitop spezifisch ist, das von einer Reihe von Antigenen getragen wird, wobei in diesem Fall das spezifische Bindungselement, das die Antigenbindungsdomäne trägt, in der Lage sein wird, sich an die verschiedenen Antigene zu binden, die das Epitop tragen.
  • Funktionell äquivalente Variantenform
  • Dies bezeichnet ein Molekül (die Variante), die, obwohl sie strukturelle Unterschiede zu einem anderen Molekül (dem Stammmolekül) aufweist, eine gewisse signifikante Homologie und auch zumindest eine gewisse biologische Funktion des Stammmoleküls aufweist, z.B. die Fähigkeit, ein spezielles Antigen oder Epitop zu binden. Varianten können in Form von Fragmenten, Derivaten oder Mutanten vorliegen. Eine Variante, ein Derivat oder eine Mutante kann durch Modifikation des Stammmoleküls durch Addition, Deletion, Substitution oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren oder durch Bindung eines anderen Moleküls erhalten werden. Diese Veränderungen können auf Nucleotid- oder Proteinebene durchgeführt werden. Beispielsweise kann das kodierte Polypeptid ein Fab-Fragment sein, das dann an einen Fc-Schwanz aus anderer Quelle gebunden wird. Alternativ dazu kann ein Marker, wie z.B. ein Enzym, Fluorescein etc., angebunden werden.
  • Zusammenfassung der vorliegenden Erfindung
  • Gemäß vorliegender Erfindung wird, wie in Anspruch 1 beansprucht, ein spezifisches Bindungselement bereitgestellt, das für die onkofötale Domäne von Fibronektin (FN) spezifisch ist und sich direkt an diese bindet.
  • Spezifische Bindungselemente gemäß der Erfindung binden direkt die ED-B-Domäne. In einer Ausführungsform bindet ein spezifisches Bindungselement nach Behandlung des FN mit der Protease Thermolysin an ein, manche oder alle FN, die ED-B enthalten. In einer weiteren Ausführungsform bindet sich ein spezifisches Bindungselement an eine, manche oder alle FN-enthaltenden Typ-III-Homologiewiederholungen, welche die ED-B-Domäne umfassen. Bekannte FNs werden in zwei Berichten von Carnemolla et al. (1989) (1992) identifiziert. Verweise auf „alle FNs, die ED-B enthalten" können als Verweis auf alle FNs angesehen werden, die in diesen Berichten als FNs identifiziert werden, die ED-B enthalten.
  • Das spezifische Bindungselement bindet vorzugsweise menschliches ED-B und vorzugsweise B+FN zumindest einer anderen Spezies, wie z.B. Maus, Ratte und/oder Huhn. Vorzugsweise ist das spezifische Bindungspaarelement in der Lage, sowohl menschliches Fibronektin-ED-B als auch ein nichtmenschliches Fibronektin-ED-B zu binden, wie z.B. das einer Maus, um so das Testen und die Analyse des sbp-Elements in einem Tierversuch zu ermöglichen.
  • Spezifische Bindungspaarelemente gemäß vorliegender Erfindung binden Fibronektin-ED-B, ohne mit dem frei zugänglich hinterlegten Antikörper-BC-1 zu konkurrieren, der hierin an anderer Stelle diskutiert wird. BC-1 ist für eine menschliche B+-Isoform streng spezifisch. Spezifische Bindungspaarelemente gemäß vorliegender Erfindung binden nicht dasselbe Epitop wie BC-1.
  • Die Bindung eines spezifischen Bindungselements gemäß vorliegender Erfindung an B+FN kann durch die ED-B-Domäne gehemmt werden.
  • Die Bindungsdomäne hat, wenn sie als gereinigtes Monomer gemessen wird, eine Dissoziationskonstante (Kd) von 6 × 10–8 M oder weniger für ED-B-FN.
  • In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung reagiert die Bindungsdomäne mit Fibronektin-ED-B ohne vorherige Behandlung des Fibronektin-ED-B mit N-Glykanase, d.h. sie ist in der Lage, dieses zu binden.
  • Spezifische Bindungspaarelemente gemäß vorliegender Erfindung können als Isolate oder in gereinigter Form bereitgestellt werden, d.h. in einem Präparat oder einer Formulierung, das/die frei von anderen spezifischen Bindungspaarelementen, z.B. Antikörpern oder Antikörperfragmenten, oder frei von anderen spezifischen Bindungspaarelementen ist, die in der Lage sind, Fibronektin-ED-B spezifisch zu binden. Vorzugsweise werden die spezifischen Bindungselemente gemäß vorliegender Erfindung in im Wesentlichen reiner Form bereitgestellt. Sie können „monoklonal" sein, im dem Sinne, dass sie von einem einzigen Klon herrühren, und sind nicht auf Antikörper beschränkt, die unter Einsatz traditioneller Hybridomtechnologie gewonnen werden. Wie besprochen können spezifische Bindungspaarelemente gemäß vorliegender Erfindung unter Einsatz von Bakteriophagendisplayverfahren und/oder Expression in rekombinanten, z.B. bakteriellen, Wirtszellen erhalten werden.
  • Das spezifische Bindungselement umfasst einen Antikörper. Das spezifische Bindungselement kann eine Polypeptidsequenz in Form eines Antikörperfragments, wie z.B. eines einzelkettigen Fv (scFv), umfassen. Es können auch andere Formen von Antikörperfragmenten verwendet werden, wie z.B. Fab, Fab', F(ab')2, Facb, Facb, oder ein Diakörper (Winter und Milstein (1991); WO 94/13804 ). Das spezifische Bindungselement kann in Form eines gesamten Antikörpers vorliegen, der gesamte Antikörper kann in einer beliebigen der Antikörperisotyp-Formen, z.B. IgG, IgA, IgD, IgE und IgM, und in beliebigen der Isotypunterklassen-Formen, z.B. IgG1 oder IgG4, vorliegen.
  • Der Antikörper kann beliebigen Ursprungs sein, z.B. menschlichen, murinen, ovinen oder lapinen Ursprungs. Andere Abstammungen sind Fachleuten bekannt. Vorzugsweise ist der Antikörper menschlichen Ursprungs. Unter „menschlich" versteht man einen Antikörper, der zum Teil oder vollständig aus einer menschlichen cDNA-, Protein- oder Peptidbibliothek stammt. Dieser Begriff umfasst humanisierte Peptide und Proteine nichtmenschlichen Ursprungs, die modifiziert worden sind, um dem Antikörpermolekül menschliche Eigenschaften zu verleihen und dem Molekül so zu ermöglichen, die Verteidigungsmechanismen des menschlichen Immunsystems zu umgehen.
  • Das spezifische Bindungselement kann auch in Form eines gentechnologisch erzeugten Antikörpers, z.B. eines bispezifischen Antikörpermoleküls (oder eines Fragments wie z.B. F(ab')2), das einen Antigenbindungsarm (d.h. eine spezifische Domäne) gegen Fibronektin-ED-B, wie offenbart, und einen anderen Arm gegen eine andere Spezifität aufweist, oder als bivalentes oder multivalentes Molekül vorliegen.
  • Zusätzlich zu Antikörpersequenzen kann das spezifische Bindungselement andere Aminosäuren umfassen, die z.B. ein Peptid oder Polypeptid bilden, oder um dem Molekül zusätzlich zur Fähigkeit Antigen zu binden, eine andere funktionelle Eigenschaft zu verleihen. Beispielsweise kann das spezifische Bindungselement eine Markierung, ein Enzym oder ein Fragment davon umfassen usw.
  • Die Bindungsdomäne kann eine gesamte VN-Domäne oder einen Teil davon umfassen, für die ein Keimbahnsegment oder ein umgeordnetes Gensegment kodiert. Die Bindungsdomäne kann eine VL-kappa-Domäne oder eine VL-lambda-Domäne oder Teile davon umfassen.
  • Die Bindungsdomäne kann eine VH1-, VH3- oder VH4-Keimbahnsequenz oder eine umgeordnete Form davon umfassen.
  • Ein spezifisches Bindungselement gemäß vorliegender Erfindung kann eine variable Schwerketten- (VN-Domänen-) Region umfassen, die von der menschlichen Keimbahn DP47 abstammt, deren Sequenz in 1(a), Reste 1 bis 98, dargestellt ist. Die „DP"-Nomenklatur wird von Tomlinson et al. (1992) beschrieben. Die Aminosäuresequenz von CDR3 kann Ser Leu Pro Lys sein. Die Aminosäuresequenz von CDR3 kann Gly Val Gly Ala Phe Arg Pro Tyr Arg Lys His Glu sein. Daher kann die Bindungsdomäne eines spezifischen Bindungselements gemäß vorliegender Erfindung eine VN-Domäne umfassen, welche die Aminosäuresequenzen umfasst, die in 1(a) für CGS1 und CGS2 dargestellt sind.
  • Die Bindungsdomäne kann eine variable Leichtketten- („VL"-Domänen-) Region umfassen, die von der menschlichen Keimbahn DPL16 abstammt, deren Sequenz in 1(b) als Codons 1-90 dargestellt ist.
  • Die VE-Domäne kann eine CDR3-Sequenz Asn Ser Ser Pro Val Val Leu Asn Gly Val Val umfassen. Die VL-Domäne kann eine CDR3-Sequenz Asn Ser Ser Pro Phe Glu His Asn Leu Val Val umfassen.
  • Spezifische Bindungselemente der Erfindung können funktionell äquivalente Varianten der Sequenzen umfassen, die in 1 dargestellt sind, in denen beispielsweise eine oder mehrere Aminosäuren insertiert, deletiert, substituiert oder addiert worden sind, vorausgesetzt, eine hierin angeführte Eigenschaft wird beibehalten. Beispielsweise kann die CDR3-Sequenz geändert werden, oder es können eine oder mehrere Änderungen an den Gerüstregionen vorgenommen werden, oder das Gerüst kann durch eine andere Gerüstregion oder eine modifizierte Form ersetzt werden, vorausgesetzt, das spezifische Bindungselement bindet ED-B.
  • Eine oder mehrere CDRs aus einer VL- oder VN-Domäne einer Antigenbindungsdomäne eines hierin offenbarten Antikörpers kann/können in so genannter „CDR-Transplantation", bei der eine oder mehrere CDR-Sequenzen eines ersten Antikörpers in ein Gerüst aus Sequenzen platziert wird/werden, die nicht von diesem Antikörper stammen, z.B. von einem anderen Antikörper, wie in EP-B-0.239.400 offenbart. CDR-Sequenzen für CGS1 und CGS2 sind in 1(a) und 1(b) dargestellt.
  • Ein spezifisches Bindungselement gemäß der Erfindung kann eines sein, das mit einem hierin für die Bindung an Fibronektin-ED-B beschriebenen Antikörper oder scFv konkurriert. Konkurrenz zwischen Bindungselementen kann in vitro einfach getestet werden, z.B. durch Anbinden eines spezifischen Reportermoleküls an ein Bindungselement, das in Gegenwart eines oder mehrerer anderer nichtmarkierter Bindungselemente detektiert werden kann, um die Identifikation von spezifischen Bindungselementen zu ermöglichen, die dasselbe Epitop oder ein überlappendes Epitop binden.
  • Ein spezifisches Bindungselement gemäß vorliegender Erfindung kann in einem Verfahren verwendet werden, das die Verursachung oder Ermöglichung von Bindung des spezifischen Bindungselements an sein Epitop umfasst. Bindung kann der Verabreichung des spezifischen Bindungselements an ein Säugetier, z.B. einen Menschen oder ein Nagetier, wie z.B. eine Maus, folgen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung eines spezifischen Bindungselements wie oben bereit, um es als ein diagnostisches Reagens für Tumoren zu verwenden. Beweise aus Versuchen mit Tiermodellen, die nachstehend beschrieben sind, zeigen, dass Bindungselemente gemäß vorliegender Erfindung für in in-vivo-Tumor-Lokalisierung nützlich sind.
  • Bevorzugte spezifische Bindungselemente gemäß vorliegender Erfindung umfassen jene, die sich, z.B. in einem Kryostatschnitt, an menschliche Tumoren binden, die einen invasiven und angiogenen Phänotyp zeigen, und jene, die sich, z.B. in einem Kryostatschnitt, an embryonales Gewebe binden. Bindung kann durch immunzytochemische Färbung gezeigt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform bindet das spezifische Bindungselement nicht oder nicht signifikant Tenascin, ein extrazelluläres Matrixprotein.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform bindet das spezifische Bindungselement nicht oder nicht signifikant normale menschliche Haut, z.B. in einem Kryostatschnitt und/oder unter Einsatz von immunzytochemischer Färbung gezeigt.
  • Weitere Ausführungsformen von spezifischen Bindungselementen gemäß vorliegender Erfindung binden nicht oder nicht signifikant an ein oder mehrere normale Gewebe (z.B. in einem Kryostatschnitt und/oder unter Einsatz immunzytochemischer Färbung), ausgewählt aus Leber, Milz, Niere, Magen, Dünndarm, Dickdarm, Eierstock, Uterus, Blase, Pankreas, Nebenniere, Skelettmuskel, Herz, Lunge, Schilddrüse und Gehirn.
  • Ein spezifisches Bindungselement für ED-B kann als In-vivo-Targeting-Mittel verwendet werden, das dazu verwendet werden kann, die Gegenwart und Stelle von Tumoren spezifisch zu zeigen, die Fibronektin-ED-B exprimieren oder damit assoziiert sind. Es kann auch als Bildgebungsmittel verwendet werden. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweis der Gegenwart einer Zelle oder eines Tumors bereit, die/der Fibronektin-ED-B exprimiert oder mit Fibronektin-ED-B-Expression assoziiert ist, wobei das Verfahren das Kontaktieren von Zellen mit einem spezifischen Bindungselement und die Bestimmung der Bindung des spezifischen Bindungselements an die Zellen umfasst. Das Verfahren kann in vivo oder in vitro an einer Testprobe von Zellen durchgeführt werden, die aus dem Körper entfernt wurden.
  • Die Reaktivität von Antikörpern für eine Zellprobe können durch geeignete Mittel bestimmt werden. Markierung mit individuellen Reportermolekülen ist eine Möglichkeit. Die Reportermoleküle können direkt oder indirekt detektierbare und vorzugsweise messbare Signale erzeugen. Die Bindung von Reportermolekülen kann direkt oder indirekt, kovalent, z.B. über eine Peptidbindung, oder nicht-kovalent erfolgen. Bindung über eine Peptidbindung kann eine Folge von rekombinanter Expression einer Genfusion sein, die für einen Antikörper und ein Reportermolekül kodiert.
  • Ein bevorzugter Modus erfolgt über kovalente Bindung jedes Antikörpers an einen individuellen Fluoreszenzfarbstoff, Phosphor- oder Laserfarbstoff mit spektral isolierten Absorptions- oder Emissionseigenschaften. Geeignete Fluoreszenzfarbstoffe umfassen Fluorescein, Rhodamin, Phycoerythrin und Texas-Rot. Geeignete chromogene Farbstoffe umfassen Diaminobenzidin.
  • Andere Reporter umfassen makromolekulare kolloidale Teilchen oder Teilchenmaterial, wie z.B. Latexkügelchen, die gefärbt, magnetisch oder paramagnetisch sind, und biologisch oder chemisch aktive Mittel, die direkt oder indirekt detektierbare Signale erzeugen können, um visuell beobachtet, elektronisch detektiert oder anders aufgezeichnet zu werden. Diese Moleküle können Enzyme sein, die Reaktionen katalysieren, die Farben entwickeln oder verändern, oder z.B. Änderungen elektrischer Eigenschaften verursachen. Sie können molekular anregbar sein, sodass Elektronenüber gänge zwischen Energiezuständen zu charakteristischen Spektralabsorptionen oder -emissionen führen. Sie können chemische Einheiten umfassen, die in Verbindung mit Biosensoren verwendet werden. Es können Detektionssysteme für Biotin/Avidin oder Biotin/Streptavidin und alkalische Phosphatase verwendet werden.
  • Die Art der Bestimmung der Bindung ist kein Merkmal der vorliegenden Erfindung, und Fachleute sind in der Lage, gemäß ihren Präferenzen und ihrem Allgemeinwissen einen geeigneten Modus auszuwählen.
  • Die Signale, die von individuellen Antikörper-Reporter-Konjugaten erzeugt werden, können dazu verwendet werden, quantifizierbare absolute oder relative Daten der relativen Antikörperbindung in Zellproben (normale und Testproben) abzuleiten. Zusätzlich kann ein allgemeiner Kernfarbstoff, wie z.B. Propidiumiodid, dazu verwendet werden, die gesamte Zellpopulation in einer Probe zu spezifizieren, was die Bereitstellung von quantitativen Verhältnissen individueller Zellpopulationen im Vergleich zur Gesamtanzahl der Zellen ermöglicht. Bei Anbindung eines Radionucleotids, wie z.B. 125I, 111In oder 99mTc, an einen Antikörper, wenn sich dieser Antikörper bevorzugt in Tumoren anstatt in normalen Geweben lokalisiert, kann die Gegenwart von Radiomarkierungen in Tumorgeweben unter Einsatz einer Gamma-Kamera detektiert und quantifiziert werden. Die Qualität des erhaltenen Tumorbilds wird direkt mit dem Signal-Rausch-Verhältnis korreliert.
  • Die Antikörper können als diagnostische Mittel verwendet werden, um neu vaskularisierte Tumoren aufzuspüren, und können auch z.B. in modifizierter Form verwendet werden, um zytotoxische Mittel zuzuführen oder Koagulation innerhalb neuer Blutgefäße auszulösen, wodurch dem sich entwickelnden Tumor Sauerstoff und Nährstoffe entzogen werden, was eine indirekte Form der Tumortherapie darstellt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch die Verwendung eines spezifischen Bindungselements wie oben beschrieben bereit, um es als therapeutisches Reagens zu verwenden, z.B. wenn es gekoppelt, gebunden oder gentechnologisch als Fusionsprotein produziert wird, um eine Effektorfunktion zu besitzen. Ein spezifisches Bindungs element gemäß vorliegender Erfindung kann dazu verwendet werden, ein Toxin, Radioaktivität, T-Zellen, Killerzellen oder andere Moleküle auf einen Tumor abzuzielen, der das Antigen von Interesse exprimiert oder damit assoziiert ist.
  • Ein spezifisches Bindungselement kann in Behandlungsverfahren, welche die hierin bereitgestellte Verabreichung eines spezifischen Bindungselements umfassen, in pharmazeutischen Zusammensetzungen, die ein spezifisches Bindungselement umfassen, und in Verwendungen eines solchen spezifischen Bindungselements zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verabreichung, beispielsweise in einem Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung, das die Formulierung des spezifischen Bindungselements mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst, verwendet werden. Bereitgestellte Zusammensetzungen können an Personen verabreicht werden. Die Verabreichung erfolgt vorzugsweise in einer „therapeutisch wirksamen Menge, wobei diese ausreichend ist, um Vorteile für einen Patienten zu ergeben. Ein solcher Vorteil kann zumindest die Linderung zumindest eines Symptoms sein. Die gegenwärtig verabreichte Menge und die Rate und der Zeitverlauf der Verabreichung hängen vom Wesen und der Schwere dessen ab, was behandelt wird. Die Verschreibung von Behandlung, z.B. Entscheidungen über die Dosierung etc., liegt innerhalb der Verantwortung von Allgemeinmedizinern und anderen Ärzten. Geeignete Dosen von Antikörpern sind fachbekannt, siehe Ledermann et al. (1992), K. D. Bagshawe et al. (1991).
  • Eine Zusammensetzung kann alleine verabreicht werden oder in Kombination mit anderen Behandlungen, entweder gleichzeitig oder nacheinander, abhängig vom zu behandelnden Leiden.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen gemäß vorliegender Erfindung und zur Verwendung gemäß vorliegender Erfindung können zusätzlich zum Wirkstoff einen pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten, Träger, Puffer, Stabilisator oder andere fachbekannte Materialien enthalten. Solche Materialien sollten nichttoxisch sein und die Wirksamkeit des Wirkstoffs nicht beeinträchtigen. Das genaue Wesen des Trägers oder anderer Materialien hängt vom Verabreichungsweg ab, wobei diese Verabreichung oral oder durch Injektion erfolgen kann, z.B. intravenös.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung können in Tabletten-, Kapsel-, Pulver- oder flüssiger Form vorliegen. Eine Tablette kann einen festen Träger, wie z.B. Gelatine, oder ein Adjuvans umfassen. Flüssige pharmazeutische Zusammensetzungen umfassen einen flüssigen Träger, wie z.B. Wasser, Petroleum, tierische oder pflanzliche Öle, Mineralöl oder synthetisches Öl. Es kann physiologische Salzlösung, Dextrose- oder eine andere Saccharidlösung, Glykole, wie z.B. Ethylenglykol, Propylenglykol oder Polyethylenglykol, enthalten sein.
  • Zur intravenösen Infektion oder Injektion an der betroffenen Stelle kann der Wirkstoff in Form einer parenteral annehmbaren wässrigen Lösung vorliegen, die pyrogenfrei ist und geeignete(n) pH, Isotonie und Stabilität aufweist. Fachleute sind in der Lage, unter Einsatz von z.B. isotonischen Trägern, wie z.B. Natriumchlorid-Injektion, Ringerlösung und Ringer-Laktat, geeignete Lösungen herzustellen. Konservierungsmittel, Stabilisatoren, Puffer, Antioxidanzien und/oder andere Zusatzstoffe können, falls erforderlich, enthalten sein.
  • Ein spezifisches Bindungselement gemäß vorliegender Erfindung kann durch Expression aus kodierter Nucleinsäure hergestellt werden. Nucleinsäure, die für ein hierin bereitgestelltes spezifisches Bindungselement kodiert, bildet selbst einen Aspekt der vorliegenden Erfindung, wie auch ein Verfahren zur Produktion des spezifischen Bindungselements, wobei dieses Verfahren die Expression aus Nucleinsäure, die dafür kodiert, umfasst. Die Expression kann in geeigneter Weise durch Kultivieren von rekombinanten Wirtszellen, welche die Nucleinsäure umfassen, unter geeigneten Bedingungen erreicht werden.
  • Die Nucleinsäure kann für eine beliebige der Aminosäuresequenzen der Antikörper-Antigenbindungsdomänen, die hierin beschrieben sind, oder eine beliebige funktionell äquivalente Form kodieren. Änderungen können auf Nucleotidebene durch Addition, Substitution, Deletion oder Insertion eines oder mehrerer Nucleotide erfolgen, wobei diese Änderungen, abhängig von der Degeneration des genetischen Codes, sich auch auf Aminosäureebene widerspiegeln können, oder auch nicht.
  • Systeme zur Klonierung und Expression eines Polypeptids in einer Vielzahl von verschiedenen Wirtszellen sind bekannt. Geeignete Wirtszellen umfassen Bakterien, Säugetierzellen, Hefe- und Baculovirus-Systeme. Auf dem Gebiet verfügbare Säugetierzelllinien zur Expression eines heterologen Polypeptids umfassen China-Hamster-Ovarialzellen, HeLA-Zellen, Babyhamsternierenzellen und viele andere. Ein häufiger bevorzugter Bakterienwirt ist E. coli.
  • Die Expression von Antikörpern und Antikörperfragmenten in prokaryotischen Zellen, wie z.B. E. coli ist im Fachgebiet gut etabliert. Für einen Bericht siehe zum Beispiel Plückthun (1991). Expression in eukaryotischen Zellen in Kultur ist Fachleuten als Option zur Produktion eines spezifischen Bindungselements zugänglich, für jüngste Berichte siehe z.B. Reff (1993); Trill et al. (1995).
  • Es können geeignete Vektoren gewählt oder hergestellt werden, die geeignete regulierende Sequenzen enthalten, einschließlich Promotorensequenzen, Terminationssequenzen, Polyadenylierungssequenzen, Enhancer-Sequenzen, Markergene und anderer geeigneter Sequenzen. Vektoren können, je nach Bedarf, Plasmide, etwa virale, z.B. von Phagen, oder Phagemide sein. Für weitere Details siehe z.B. Molecular Cloning: A Laborstory Manual: 2. Auflage, Sambrook et al. (1989), Cold Spring Harbor Laborstory Press. Viele bekannte Verfahren und Vorschriften zur Manipulation von Nucleinsäure, z.B. zur Herstellung von Nucleinsäurekonstrukten, Mutagenese, Sequenzierung, Einführung von DNA in Zellen und Genexpression und Analyse von Proteinen sind in Short Protocols in Molecular Biology, 2. Auflage, Ausubel et al. Hrsg., John Wiley & Sons (1992) detailliert beschrieben. Die Offenbarungen von Sambrook et al. und Ausubel et al. sind hierin durch Verweis aufgenommen.
  • Daher stellt ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung eine Wirtszelle bereit, die Nucleinsäure wie hierin offenbart enthält. Ein weiterer Aspekt stellt ein Verfahren bereit, das die Einführung einer solchen Nucleinsäure in eine Wirtszelle umfasst. Die Einführung kann durch ein beliebiges Verfahren erfolgen. Für eukaryotische Zellen können geeignete Verfahren Kalziumphosphattransfektion, DEAE-Dextran, Elektroporation, liposomvermittelte Transfektion und Transduktion unter Einsatz von Retroviren oder anderen Viren, z.B. Vakzinia, oder für Insektenzellen Baculovirus umfassen. Für bakterielle Zellen können geeignete Verfahren Kalziumchloridtransformation, Elektroporation und Transfektion unter Einsatz eines Bakteriophagen umfassen.
  • Auf die Einführung kann die Herbeiführung oder Ermöglichung von Expression aus Nucleinsäure folgen, z.B. durch Kultivieren von Wirtszellen unter Bedingungen zur Expression des Gens.
  • In einer Ausführungsform wird die Nucleinsäure der Erfindung in das Genom (z.B. Chromosom) der Wirtszelle integriert. Integration kann durch Einbau von Sequenzen gefördert werden, die gemäß Standardverfahren eine Rekombination mit dem Genom fördern.
  • Nach der Produktion eines spezifischen Bindungselements kann es zum Beispiel auf eine der hierin offenbarten Arten, wie z.B. bei der Formulierung eines pharmazeutischen oder diagnostischen Produkts, verwendet werden, wie z.B. eines Sets, das wie beschrieben zusätzlich zum spezifischen Bindungselement ein oder mehrere Reagenzien zur Bestimmung der Bindung des Elements an Zellen umfasst.
  • Weitere Aspekte und Ausführungsformen der Erfindung sind Fachleuten bekannt. Zum vollständigen Verständnis der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Beispiele bereitgestellt, die nur zur Veranschaulichung und nicht als Einschränkung dienen sollen.
  • 1 zeigt angeordnete Aminosäuresequenzen der VH und VL der scFvs CGS-1 und CGS-2. 1(a) zeigt VN-Sequenzen, 1(b) zeigt VL-Sequenzen. CDRs (1, 2 und 3) sind angegeben. Die homologste menschliche Keimbahn VH zu beiden scFvs ist das DP47-Seqment der VH3-Familie; das VL-Segment beider Klone ist DPL16, die Leichtkette, die verwendet wird, um die ursprüngliche scFv-Bibliothek zu bilden (Nissim et al. (1994)). Reste, welche die zwei Klone voneinander unterscheiden, sind unterstrichen.
  • 2: 2A zeigt ein Modell der Domänenstruktur einer menschlichen FN-Untereinheit. Es sind die IIICS-, ED-A-, ED-B-Regionen mit Variabilität aufgrund von alternativem Spleißen der FN-prä-mRNA angegeben. Die Figur zeigt auch die internen Homologien, wie auch die hauptsächlichen Thermolysinverdauprodukte, die ED-B enthalten (Zardi et al. (1987)). 2B zeigt 4-18% SDS-PAGE von Plasma und WI38VA-FN und deren Thermolysin-Spaltprodukten an, die mit Coomassie-Blau gefärbt sind, wie auch Immunoblots, die mit BC-1, IST-6, CGS-1 und CGS-2 sondiert wurden. Unverdautes (Spur 1) und unter Einsatz von Thermolysin mit 1 μg/mg FN (Spur 3) und 10 μg/mg FN (Spur 4) verdautes Plasma-FN. Unverdautes (Spur 2) und unter Einsatz von Thermolysin mit 1 μg/mg (Spur 5), 5 μg/mg (Spur 6) und 10 μg/mg (Spur 7) FN verdautes WI38VA-FN. Die Zahlen auf der rechten Seite geben die hauptsächlichen Thermolysinverdauprodukte an, die in 2A dargestellt sind. Die Werte auf der linken Seite geben die Molekulargewichtsstandards in Kilodalton (kD) an.
  • 3: 3A zeigt die FN-Typ-III-Wiederholungssequenzen, die in der Fusion enthalten sind, und rekombinante Proteine, die in E. coli exprimiert werden, und die Reaktivität dieser Proteine mit CGS-1 und CGS2 und mit den MAKs BC-1 und IST-6. 3B zeigt ein mit Coomassie-Blau gefärbtes Gel und darauf die Immunoblots, die mit CGS-1, CGS-2, BC-1, IST-6 sondiert wurden. Die Nummerierung der Spuren entspricht jener der Peptidkonstrukte im oberen Teil der Figur. Die Werte auf der linken Seite geben die Molekulargewichtsstandards in kD an.
  • 4: Infrarot-Mäuse-Abbildungsgerät; das Mäuse-Abbildungsgerät, das für diese Targetingversuche verwendet wurde, bestand aus einer schwarzen, nichtfluoreszierenden Box, die mit einer Wolframhalogenlampe, mit Anregungs- und Emissionsfiltern, die für das CY7-Infrarotfluorophor spezifisch sind, und einer computergesteuerten 8-bit-Monochrom-CCD-Kamera ausgerüstet war.
  • 5: Abzielen fluoreszenzmarkierter Antikörperfragmente auf das murine F9-Teratokarzinom unter Einsatz des monomeren scFv(CGS-1) und dimeren scFv(CGS-1)2, die gegen B-FN gerichtet sind. Dimeres scFv(D1.3)2 mit Bindungsspezifität für Lysozym wurde als negative Kontrolle verwendet.
  • 6.: Abzielen fluoreszenzmarkierter Antikörperfragmente auf das murine F9-Teratokarzinom unter Einsatz von affinitätsgereiftem scFv(CGS-2) und scFv(28SI) mit geringerer Affinität, das auf dasselbe Epitop von B-FN ausgerichtet ist. Das Targeting wird sowohl bei großen Tumoren (etwa 0,6 g), die 48 h lang mit einer schwarzen Kruste bedeckt werden, die teilweise die Bildgebung verdunkelt, als auch bei kleinen Tumoren (etwa 0,2 g) detektiert.
  • Liste der Beispiele
    • Beispiel 1 – Isolierung von menschlichen scFvs, die für die ED-B-Domäne von menschlichem FN spezifisch sind.
    • Beispiel 2 – Affinitätsreifung von menschlichen scFvs, die für die ED-B-Domäne von menschlichen FN spezifisch sind.
    • Beispiel 3 – Spezifität von affinitätsgereiften scFvs für ED-B-enthaltende Fibronektine.
    • Beispiel 4 – Verwendung von affinitätsgereiften Anti-ED-B-scFvs für immunzytochemische Färbung von menschlichen und Maus-Tumorschnitten.
    • Beispiel 5 – Verwendung von affinitätsgereiften Anti-ED-B-scFvs für In-vivo-Targeting auf menschliche Tumoren.
    • Beispiel 6 – Abzielen auf xenotransplantiertes murines F9-Teratokarzinom bei Nacktmäusen.
  • Beispiel 1 – Isolierung von menschlichen scFvs, die für die ED-B-Domäne von menschlichem FN spezifisch sind
  • Eine menschliche scFv-Phagenbibliothek (Nissim et al. (1994)) wurde zur Selektion von rekombinanten Antikörpern verwendet. Zwei verschiedene Formen der ED-B- Isoform wurden als Antikörperquelle zur Selektion verwendet, und in beiden Fällen war die Isoform rekombinantes menschliches Protein.
  • Rekombinante FN-Peptide, welche die Typ-III-Wiederholungen 2-11 (B-) und 2-11 (B+) enthielten, wurden in Escherichia coli exprimiert.
  • Ein Konstrukt wurde unter Einsatz von FN-cDNA aus den Klonen pFH154 (Kornblihtt et al. (1985)), λF10 und λF2 (Carnemolla et al. (1989)) erzeugt. Die cDNA-Konstrukte, die sich über die Basen 2229-4787 erstreckten (Kornblihtt et al. (1985)), wurden unter Einsatz des QlAexpress-Sets von Qiagen (Chatsworth, Kalifornien) in den Vektor pQE-3/5 insertiert. Die Rekombinanten FN-III 2-11 (B-) und (B+) wurden durch Immunoaffinitätschromatographie unter Einsatz des MAK 3E3 (Pierschbacher et al. (1981)) gereinigt, der an Sepharose-4B konjugiert war (Pharmacia). DNA-Fragmente zur Herstellung der rekombinanten FN-Fragmente, welche die Typ-III-Homologiewiederholungen 7B89, 789, ED-B und FN-6 enthielten, wurden durch Polymerasekettenreaktions- (PCR-) Amplifikation unter Einsatz von UltMa-DNA-Polymerase (Perkin Elmer), unter Einsatz von cDNA aus den Klonen FN-2-11 (B+) und FN 2-11 (B+) als Matrizen produziert. Es wurden Primer entworfen, um das Klonieren von PCR-Produkten in pQE-12 unter Einsatz des QIAexpress-Sets (Qiagen) zu ermöglichen. Sie wurden in der Folge in E. coli transformiert und exprimiert. Alle cDNA-Klone wurden unter Einsatz eines Sequenase-2,0-DNA-Sequenzierungssets (USB) sequenziert.
  • Rekombinante Proteine wurden gemäß den Angaben des Herstellers (Qiagen) mittels Ni-NTA-Chromatographie (IMAC) unter Einsatz einer Hexahistidinmarkierung am Carboxy-Terminus der FN-Fragmente gereinigt. Das ED-B-βGal-Fusionsprotein wurde durch Klonieren von ED-B-cDNA in den λgt11-Bakteriophagenvektor hergestellt, um den Klon λED-B zu ergeben. Klon λchFN60 (der einen Teil der ED-B-Sequenz enthielt) wurde als Fusionsprotein aus dem klonierten Hühner-FN-pchFN60 erhalten (Norton et al. (1987)).
  • Zur Selektion der menschlichen scFv-Phagenbibliothek, wurden für jedes der beiden verschiedenen rekombinanten Antigene (7B89 und ED-B) drei Panning-Runden durchgeführt. Die Antigene wurden beide über Nacht bei 50 μg/ml in PBS (20 mM Phosphatpuffer, 0,15 M NaCl, pH 7,2) auf Immunröhrchen geschichtet (Nunc; Maxisorp, Roskilde, Dänemark). Das erste Antigen war das rekombinante FN-Fragment 7B89, in dem die ED-B-Domäne von benachbarten Typ-III-FN-Homologiewiederholungen flankiert ist, dieses wurde bei 4 °C über Nacht beschichtet. Das zweite verwendete Antigen war rekombinantes ED-B (Zardi et al. (1987)) mit einer carboxyterminalen Hexahistidinmarkierung; wobei dieses Protein keine Lysinreste enthielt, sodass die terminale Aminogruppe der ersten Aminosäure für ortsspezifische kovalente Immobilisierung von ED-B auf reaktiven ELISA-Platten (Nunc, Covalink) verfügbar ist. Die Beschichtung wurde über Nacht bei Raumtemperatur durchgeführt.
  • Nach drei Panning-Runden wurden die eluierten Phagen in HB2151-E.coli-Zellen infiziert und wie beschrieben ausplattiert (Nissim et al. (1994)). Nach jeder Selektionsrunde wurden 95 ampicillinresistente einzelne Klone gescreent, um antigenspezifische scFvs durch ELISA zu identifizieren. Klone, welche die stärksten ELISA-Signale auf den Antigenen ergaben, die zum Panning verwendet werden, wurden zur weiteren Analyse und zur Affinitätsreinigung ausgewählt. Es wurde auch gezeigt, dass diese Klone bei immunzytochemischer Färbung eine spezifische Färbung von Schnitten von Glioblastoma multiforme und Brusttumoren ergaben, wie in Beispiel 4 detaillierter beschrieben wird.
  • Beispiel 2 – Affinitätsreifung von menschlichen scFvs, die für die ED-B-Domäne von menschlichen FN spezifisch sind
  • Die Klone 35GE (aus Selektion mit 7B89) und 28SI (aus Selektion mit der ED-B-Domäne alleine) wurden als Kandidaten-Antikörper für die Affinitätsreifung ausgewählt. Um die Leichtketten als Mittel zur Verbesserung von Affinität zu diversifizieren, entdeckten die Erfinder eine einfache Affinitätsreifungsstrategie, basierend auf dem Randomisieren der zentralen sechs Reste (DSSGNH) der Leichtketten-CDR3 unter Einsatz von degenerierten Oligonucleotiden und PCR (1), wobei eine potenzielle Sequenzdiversität von 206 = 6,4 × 101 bereitgestellt wird. Diese Region (gemeinsam mit der Schwerketten-CDR3) liegt im Zentrum der Antigenbindungsstelle (Padlan (1994)). Die Erfinder mutierten auch den Argininrest direkt vor den sechs Resten zu Serin, um die Möglichkeit elektrostatischer Wirkungen zu vermeiden, welche die Selektion dominieren könnten.
  • Plasmide aus einer einzigen bakteriellen Kolonie, die das „Stamm"-ScFV-Fragment exprimierte, wurden mit PCR mit den Primern LMB3 (5' CAG GAA ACA GCT ATG AC 3') und CDR3-6-VL-FOR (5' CTT GGT CCC TCC GCC GAA TAC CAC MNN MNN MNN MNN MNN MNN AGA GGA GTT ACA GTA ATA GTC AGC CTC 3') (94C [1'] – 55C [1'] – 72C [1'30"], 25 Zyklen; siehe Marks et al. (1991) für Puffer und Bedingungen) amplifiziert. Das resultierende Produkt wurde gelgereinigt (um Spuren des Plasmids zu entfernen, welches das ursprüngliche scFv-Gen enthielt) und wurde als Matrize für einen zweiten Amplifikationsschritt mit den Primern LMB3 und J1-Not-FOR (5' ATT GCT TTT CCT TTT TGC GGC CCC GCC TAG GAC GGT CAG CTT GGT CCC TCC GCC 3') (94C [1'] – 55C [1'] – 72 C [1'30"], 25 Zyklen) verwendet. Das rohe PCR-Produkt, das als einzelne Bande mit korrektem Molekulargewicht auf Agarose-Gel läuft, wurde direkt unter Einsatz von Spin-Bind (FMC, Rockland, Maine, USA) aus dem PCR-Gemisch gereinigt, doppelt mit Nco1/Not1 verdaut und in gelgereinigtes, Nco1/Not1-verdautes Phagemid pHNE1 ligiert (Hoogenboom et al. (1991)), das ein Atrappen-Nco1/Not1-Insert enthielt, um die Trennung eines doppelt verdauten von einem einfach verdauten Vektor zu ermöglichen. Der Vektor wurde mit einem Plasmid-maxi-prep-Set von Qiagen (Chatsworth, Kalifornien, USA) hergestellt. Etwa 5 μg an verdautem Plasmid und Insert wurden im Ligationsgemisch verwendet, das einmal mit Phenol, einmal mit Phenol/Chlorofom/Isoamylalkohol (25:25:1) extrahiert wurde, dann unter Einsatz von Glykogen (Boehringer, Mannheim, Deutschland) als Träger ethanolgefällt und am Speed-vac getrocknet. Das Pellet wurde in 20 μl Wasser resuspendiert und in elektrokompetente TG1-E.-coli-Zellen elektroporiert (Gibson (1984)). Die Erfinder verwendeten typischerweise elektrokompetente Zellen mit einem Titer von 109 Transformanten/μg, wenn Glycerinstämme verwendet wur den, oder 1010 Transformanten/μg bei frisch hergestellten elektrokompetenten Zellen. Dies ergab mit dem hierin angeführten Verfahren typischerweise > 107 Klone.
  • Die Reifungsbibliothek wurde dann wie die Nissim-Bibliothek prozessiert (Nissim et al. (1994)), um Phagenteilchen zu produzieren, die für eine Selektionsrunde auf Immunröhrchen unter Einsatz von 7B89 (10 μg/ml) als Antigen, gefolgt von einer Runde kinetischer Selektion (Hawkins et al. (1992)) verwendet wurden. Dieser Selektionsschritt wurde durch Inkubation von biotinyliertem 76B89 (10 nm) mit der Phagensuspension (etwa 1012 Übertragungseinheiten) in 2% Milch-PBS (2% MPBS) aus der ersten Selektionsrunde 56 Minuten lang durchgeführt, dann wurde nicht-biotinyliertes 7B89 (1 μM) zugegeben und die Kompetition 30 Minuten lang fortgeführt. 100 μl streptavidinbeschichtete Dynabeads (Dynal: M480), die in 2% MPBS vorblockiert waren, wurden dann zum Reaktionsgemisch zugegeben, 2 Minuten lang gemischt und dann auf einem Magneten gefangen und 10-mal mit alternierenden Waschflüssigkeiten (PBS + 0,1% Tween-20) und PBS gewaschen. Der Phage wurde mit 0,5 ml 100 mM Triethylamin von den Kügelchen eluiert. Diese Lösung wurde dann mit 0,25 ml 1 M Tris, pH 7,4, neutralisiert und dazu verwendet, exponentiell wachsende HB2151-Zellen zu infizieren (Nissim et al. (1994)). 95 einzelne ampicillinresistente Kolonien wurden dazu verwendet, scFv-enthaltende Überstände zu produzieren (Nissim et al. (1994)), die durch ELISA, Immunohistochemie und BlAcore gescreent wurden, um die besten Bindemittel zu identifizieren. Sie wurden dann zwischen Sfi1/Not1-Stellen des pDN268-Expressionsvektors subkloniert (Neri et al. (1996)), der eine phoshorylierbare Markierung, das FLAG-Epitop und eine Hexahistidinmarkierung am C-terminalen Arm des scFv anbringt.
  • Einzelne Kolonien der relevanten Antikörper, die in pDN268 subkloniert wurden, wurden bei 37 °C in 2xTY gezüchtet, das 100 mg/l Ampicillin und 0,1% Glucose enthielt. Als die Zellkultur eine OD600 von 0,8 erreichte, wurde IPTG in einer Endkonzentration von 1 mM hinzugefügt, und das Wachstum wurde 16-20 Stunden lang bei 30 °C fortgesetzt. Nach Zentrifugation (GS-2 Sorvall-Rotor, 7000 rpm, 30 Minuten), wurde der Überstand filtriert, eingeengt und unter Einsatz eines tangentiellen Minisette- (Filtron) Durchflussgeräts gegen Ladungspuffer (50 mM Phosphat, pH 7,4, 500 mM NaCl, 20 mM Imidazol) ausgetauscht. Die resultierende Lösung wurde auf 1 ml Ni-NTA-Resin (Qiagen) geladen, mit 50 ml Ladungspuffer gewaschen und mit Elutionspuffer (50 mM Phosphat, pH 7,4, 500 mM NaCl, 100 mM Imidazol) eluiert. Der gereinigte Antikörper wurde durch SDS-PAGE analysiert (Laemmli (1970)) und bei 4 °C gegen PBS dialysiert. Gereinigte scFv-Formulierungen wurden weiters unter Einsatz eines FPLC-Geräts, das mit einer S-75-Säule ausgerüstet war, mittels Gelfiltration verarbeitet, da bekannt ist, dass mehrwertige scFv-Fragmente durch Aviditätswirkungen (Nossom et al. (1994), Crothers und Metzger (1972)) eine künstliche gute Bindung auf BlAcore zeigen (Jonsson et al. (1991)). Die Antikörperkonzentration von FPLC-gereinigten monomeren Fraktionen wurde spektralphotometrisch bestimmt, wobei eine Absorption bei 280 nm von 1,4 Einheiten für eine 1 mg/ml scFv-Lösung angenommen wurde.
  • Die Bindung einwertiger scFvs in verschiedenen Konzentrationen im 0,1-1 μM-Bereich in PBS wurde unter Einsatz der folgenden Antigene auf einem BIAcor-Gerät (Pharmacia Biosensor) gemessen: (i) 1000 Resonanzeinheiten (RU) von biotinyliertem rekombinanten FN-Fragment 7B89, das auf einem mit Strepatividin beschichteten Chip immobilisiert war, der dann von 250 RU scFv spezifisch gebunden wurde; (ii) 200 RU von rekombinantem ED-B, chemisch immobilisiert an der N-terminalen Aminogruppe, die dann von 600 RU scFv spezifisch gebunden wurde; (iii) 3500 RU von ED-B-reichem Fibronektin WI38VA (siehe Beispiel 3), das dann von 150 RU scFv spezifisch gebunden wurde. Eine kinetische Analyse der Daten wurde gemäß den Angaben des Herstellers durchgeführt. Auf Basis der qualitativen BlAcore-Analyse von antikörperenthaltenden Überständen wurde eine affinitätsgereifte Version jedes scFv-Klons ausgewählt: Klon CGS-1 durch Selektion mit dem 78B9-Fragment und cgS-2 durch Selektion mit rekombinantem ED-B-FN-Fragment. Die Assoziationsgeschwindigkeitskonstanten (kon) und Dissoziationsgeschwindigkeitskonstanten (koff) sind in Tabelle 1 gemeinsam mit den berechneten Gleichgewichtsdissoziationskonstanten (Kd) sowohl der scFvs als auch des ursprünglichen 28SI-Klons angegeben. Obwohl sowohl CGS-1- als auch CGS-2-Klone Kds im Nanomolbereich besitzen, zeigte Klon CGS-2 die beste Verbesserung gegenüber seinem Stammklon, wodurch sich in Hinblick auf alle drei Proteine, die auf dem Sensorchip getestet wurden (Tabelle 1) eine Kd von 1 nM ergab (verbessert gegenüber 110 nM). Die Verbesserung war hauptsächlich auf eine langsamere kinetische Dissoziationskonstante zurückzuführen (10–4 s–1), gemessen mit monomeren Antikörperformulierungen (nicht gezeigt).
  • Die Reifungsstrategie scheint allgemein zu sein und ergab affinitätsverbesserte Antikörper gegen Maltosebindungsprotein, Cytochrom C, die extrazelluläre Domäne von murinem Endoglin (D.N., L. Wyder, R. Klemenz), Cytomegalovirus (A. P., G. Neri, P. N. R. Botti), das nukleare Tumormarker-HMGI-CProtein (A. P., P. Soldani, V. Giancott, P. N.) und die plazentale alkalische Phosphatase als Eierstocktumormarker (M. Deonarain und A. A. Epenetos). Die Strategie scheint daher zumindest ebenso wirksam zu sein wie andere Reifungsstrategien (Marks et al. (1992), Low et al. (1996)) und liefert Antikörper mit ähnlichen Affinitäten wie jene, die von sehr großen Phagen-Antikörperbibliotheken herrühren (Griffiths et al. (1994), Vaughan et al., (1996)).
  • Die affinitätsgereiften Klone CGS-1 und CGS-2 wurden sequenziert und mit einer Datenbank von menschlichen Keimbahn-Antikörper-V-Genen (V-BASE) abgeglichen, dann unter Einsatz von MacVector-Software translatiert. Das VR-Gen beider Klone war am homologsten zur menschlichen Keimbahn DP47 (VH3), und zusätzlich hatte jeder Klon eine andere VH-CDR3-Sequenz (1). Das VR-Gen beider Klone war die DPL16-Keimbahn, die zur Herstellung des menschlichen synthetischen scFv-Repertoires verwendet wurde, das von Nissim et al. (1994) beschrieben wurde. Die VL-CDR3-Sequenzen unterschieden sich an vier von sechs randomisierten Resten voneinander (1b).
  • Figure 00300001
  • Beispiel 3 – Spezifität von affinitätsgereiften scFvs für ED-B-enthaltende Fibronektine
  • Die Immunreaktivität der zwei affinitätsgereiften scFvs CGS-1 und CGS-2 wurde anfänglich mittels ELISA beurteilt und direkt mit dem MAK BC-1 (der die B-FN-Isoform erkennt) und MAK IST-6, der nur FN-Isoformen erkennt, denen ED-B fehlt (Carnemolla et al. (1989) (1992)), verglichen. Von der Charakterisierung dieser MAKs ist zuvor berichtet worden (Carnemolla et al. (1989) (1992)). Die feine Spezifitätsanalyse wurde danach unter Einsatz einer großen Gruppe von durch Thermolysinbehandlung erhaltenen FN-Fragmenten und von rekombinanten Fusionsproteinen durchgeführt.
  • Die Antigene, die für ELISA und Immunoblotting verwendet wurden, wurden wie folgt hergestellt. FN wurde aus menschlichem Plasma und aus dem konditionierten Medium der WI38VA13-Zelllinie wie zuvor berichtet gereinigt (Zardi et al. (1987)). Gereinigte FNs wurden mit Thermolysin (Protease-Typ-X; Sigma Chemical Co.) wie von Carnemolla et al. (1989) berichtet verdaut. Native FN-Fragmente mit 110 kd (B-) und 120 kd (B+) (siehe 2) wurden aus einem FN-Verdau wie zuvor berichtet gereinigt (Borsi et al. (1991)). Die große Isoform von Tenascin-C wurde wie von Saginati et al. (1992) berichtet gereinigt, rekombinante Proteine wurden exprimiert und wie in Beispiel 1 beschrieben gereinigt. SDS-PAGE und Western-Blotting wurden wie von Carnemolla et al. (1989) beschrieben durchgeführt.
  • Alle Antigene, die im ELISA verwendet wurden, wurden in PBS auf zwischen 50-100 μg/ml verdünnt und bei 4 °C über Nacht auf Immuno-Platten-Wells beschichtet (Nunc, Roskilde, Dänemark). Ungebundenes Antigen wurde mit PBS entfernt, und die Platten wurden dann 2 h lang bei 37 °C mit PBS blockiert, das 3% (Gew./Vol.) Rinderserumalbumin (BSA) enthielt. Dem folgten vier Waschungen mit PBS, das 0,05% Tween 20 (PEST) enthielt. Antikörper wurden dann bei 37 °C 1,5 h lang binden gelassen, scFvs wurden mit einem Antiserum vorinkubiert, das gegen die taq-Sequenz gerichtet war: MAK M2 [Kodak, New Haven, Connecticut] für die FLAG-Markierung oder 9E10 [ATCC, Rockville, Maryland] für die myc-Markierung. Die getesteten Kontrollantikörper waren die MAKs BC-1 und IST-6. Nach vier Waschungen mit PEST wurden die Platten 1 h lang bei 37 °C mit 1:2000 verdünntem (in PEST + 3 % BSA) biotinyliertem Ziegen-Anti-Maus-IGG (Bio-SPA Division, Mailand, Italien) verdünnt. Die Waschungen wurden wiederholt, und ein Komplex aus Streptavidin und biotinylierter alkalischer Phosphatase (Bio-SPA Division, Mailand, Italien) wurde 1 h lang bei 37 °C zugesetzt (1:800 verdünnt in PEST, das 2 mM MgCl2 enthielt). Die Reaktion wurde unter Einsatz von Phosphatase-Substrattabletten (Sigma) in 10% Diethanolamin, pH 9,8 entwickelt, und die optische Dichte wurde bei 405 nm abgelesen. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 2 angeführt. TABELLE 2
    CGS-1 CGS-2 BC-1 IST-6
    Plasma FN 0,07 0,04 0,09 1,73
    WI38VA TN 1,16 0,72 1,20 1,12
    n110 kD (B) 0,03 0,01 0,05 1,20
    n120 kD (B+) 0,82 0,81 1,20 0,02
    rec FN7B89 1,11 1,02 1,02 0,01
    rec FN789 0,01 0,01 0,05 1,25
    rec ED-B 1,21 1,32 0,15 0,04
    rec FN-6 0,01 0,01 0,08 0,03
    Tenascin 0,01 0,02 0,06 0,02
  • Immunoreaktivität von scFv und monoklonalen Antikörpern mit von Fibronektin abstammenden Antigenen, gemessen mittels ELISA. Die Werte repräsentieren die OD, die bei 405 nm nach Subtraktion des Hintergrundsignals gemessen wurde. Die Daten sind die Mittelwerte von vier Versuchen, die eine maximale Standardabweichung von 10% aufweisen.
  • Die Identität der verschiedenen Formen von Fibronektin, die in diesem Versuch verwendet wurden, war wie folgt: Plasma-FN = menschliches Plasma-Fibronektin; WI38-VA-FN = Fibronektin aus Überständen von SV40-transformierten Fibroblasten (Zardi et al. (1987)); n110kd = mit Thermolysin behandelte FN-Domäne 4 ohne ED-B; n120kd = mit Thermolysin behandelte FN-Domäne 4, die ED-B enthielt; rec FN7B89 = ED-B-Domäne, flankiert von angrenzenden Typ-III-FN-Homologiewiederholungen; rec FN789 = Typ-III-FN-Homologiewiederholungen mit einer ED-B-Domäne; rec ED-B = rekombinantes ED-B alleine; rec FN6 = rekombinante FN-Domäne 6.
  • Sowohl CGS-1 als auch CGS-2 erkannten das rekombinante ED-B-Peptid, wie auch alle nativen oder rekombinanten FN-Fragmente, welche die ED-B-Sequenz enthielten, während sie sich an keinerlei FN-Fragmente banden, denen ED-B fehlte. Weiters reagierten CGS-1 und CGS-2 nicht mit Tenascin (das fünfzehn Typ-III-Homologiewiederholungen umfasst: Siri et al (1991)) und Plasma-Fn, das in Thermolysinverdauprodukten keine detektierbaren Mengen der ED-B-Sequenz enthielt (Zardi et al. (1987)). Hingegen reagierten CGS-1 und CGS-2 stark mit FN, das aus der SV40-transformierten Zelllinie WI378VA gereinigt worden war. Etwa 70-90% von FN-Molekülen aus dieser Zelllinie enthalten ED-B, was durch Thermolysin-Verdau und S1-Nucleaseversuche unter Einsatz von gereinigtem FN und von Gesamt-RNA, die aus der Zelllinie hergestellt wurde, gezeigt wurde (Zardi et al. (1987); Borsi et al. (1992)). Die Spezifität der scFVs für die ED-B-Komponente von FN wurde weiters durch die Verwendung von löslichen rekombinanten ED-B gezeigt, um die Bindung von CGS-1 und/oder CGS-2 an FN auf WI38VA-Zellen zu hemmen (Daten nicht angegeben).
  • Die Daten bestätigen, dass CGS-1 und CGS-2 nur spezifisch mit FN-Derivaten reagieren, welche die ED-B-Domäne enthalten. Sie zeigen beide dieselbe Reaktivität wie MAK BC-1, mit der Ausnahme des Falls von rekombinantem ED-B, das von BC-1 nicht erkannt wurde. Die Intensität der erhaltenen ELISA-Signale im Vergleich zu den MAK-Kontrollen zeigt die hohe Spezifität der zwei scFvs für ED-B-enthaltende Antigene.
  • Die Spezifität von CGS-1 und CGS-2 wurde weiters unter Einsatz von FN aus Plasma und WI38VA-Zellen und Thermolysinverdauen davon auf Immunoblots untersucht. Nach Thermolysinverdau erzeugte FN aus WI38VA-Zellen (die Mehrheit davon enthielt ED-B) ein 120-kd-Fragment (das ED-B enthielt) und ein kleineres 110-kd-Fragment, dem ED-B fehlte (2A; Zardi et al. (1987)). Der weitere Verdau der 120-kd-Domäne erzeugt zwei Fragmente; ein 85-kd-Fragment, das fast die gesamte ED-B-Sequenz an seinem Carboxyterminus enthält, und eine 35-kd-Sequenz (2A, Zardi et al., (1987)).
  • Auf der linken Seite von 2B ist ein mit Coomassie-Blau gefärbtes Gel der Proteinfraktionen zu sehen, die durch Immunoblotting analysiert wurden. Plasma-FN (Spur 1) und Thermolysin-Verdaue des Proteins (Spur 3, die das 110 kd Protein enthielt, und Spur 4, die verdautes 110-kd-Protein enthielt) wurden von CGS-1 und CGS-2 nicht erkannt. Hingegen wurde ED-B-reiches FN aus WI38VA-Zellen, sowohl intakt (Spur 2) als auch nach zunehmendem Thermolysinverdau (Spuren 5, 6 und 7) von beiden scFv-Fragmenten erkannt. Das kleinste von FN herrührende Fragment, das von CGS-1 spezifisch erkannt werden konnte, war das 120-kD-Protein (das die Typ-III-Wiederholungen 2-11 (Grenzen eingeschlossen) überspannte), während CGS-2 das 85-kd-Fragment erkennen konnte, das die Wiederholungen 2-7 überspannte, zusätzlich zum N-Terminus von ED-B (2B; Zardi et al. (1987)). Diese Ergebnisse zeigen, dass die zwei scFvs auf unterschiedliche Epitope innerhalb der ED-B-Sequenz reagieren. Die Bindung von CGS-2 an die 85-kd-Domäne zeigt, dass das Epitop für diesen Klon im Aminoterminus von ED-B liegt. Hingegen zeigt der Verlust an CGS-1-Bindung, wenn die 120-kD-Domäne zu 85 kD verdaut wird, dass es ein Epitop erkennt, dass sich weiter in Richtung des Carboxy-Terminus des ED-B-Moleküls befindet.
  • Die Feinspezifität von CGS-1 und CGS-2 wurde weiters durch Immunoblotting unter Einsatz rekombinanter FN-Fragmente und Fusionsproteine mit oder ohne der ED-B-Sequenz untersucht. Die FN-Fusionsproteine wurden wie von Carnemolla et al. (1989) beschrieben hergestellt. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in 3 dargestellt, für die Assoziation des schematischen Diagramms mit der Struktur der Domä nen von menschlichem FN siehe Carnemolla et al. (1992). Die erhaltenen Bindungsprofile bestätigten im Wesentlichen, was zuvor durch ELISA und Immunoblots an gereinigtem FN und proteolytischen Spaltprodukten durchgeführt wurde: CGS-1 und CGS-2 reagierten stark mit ED-B-enthaltenden FN-Fragmenten (Spuren 2 und 4), zeigten aber keine Reaktivität mit FN-Sequenzen, denen ED-B fehlte (Spuren 1 und 3). CGS-1 reagierte weder mit menschlichem (Spur 5) oder Hühner- (Spur 6) ED-B-Fusionsprotein, während CGS-2 stark mit beiden Fragmenten reagierte (3). Dieses Ergebnis kann bestimmte Konformationseinschränkungen des Epitops in ED-B-enthaltenden FN, die von CGS-1 erkannt werden, widerspiegeln, es ist z.B. möglich, dass das Epitop gegenüber Denaturierung empfindlich ist oder es nicht korrekt präsentiert wird, wenn es mittels SDS-PAGE fraktioniert wird und auf einen festen Träger, wie z.B. Nitrozellulose, übertragen wird.
  • Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass CGS-1 und CGS-2 sich in Regionen, die sich voneinander unterscheiden und eine andere als die ED-B-Struktur aufweisen, die vom MAK BC-1 erkannt wird, stark und spezifisch an ED-B-enthaltende FNs binden.
  • Beispiel 4 – Verwendung von affinitätsgereiften Anti-ED-B-scFvs zur immunzytochemischen Färbung von menschlichen und Maus-Tumoren
  • CGS-1 und CGS-1 sind beide dazu verwendet worden, ED-B-enthaltende FN-Moleküle in verschiedenen normalen und neoplastischen menschlichen Geweben zu immunolokalisieren. Als normales Gewebe wurde Haut ausgewählt, da bekannt ist, dass die B-FN-Isoform in Makrophagen und Fibroblasten während kutaner Wundheilung exprimiert wird (Carnemolla et al. (1989), Brown et al. (1993)). Die zwei ausgewählten menschlichen Tumoren sind zuvor auf die Spezifität der Färbung mit Anti-Fibronektin-MAKs analysiert worden: Glioblastoma multiforme ist detailliert studiert worden, weil Endothelzellen in den Gefäßen dieses Tumors in einem höchst proliferativen Zustand mit verstärkten angiogenetischen Prozessen sind, welche die Expression von B-FN-Isoformen umfassen (Castellani et al. (1994)). Weiters haben Studien unter Einsatz einer vielfältigen Gruppe von normalem, hyperplastischem und neoplastischem menschlichem Brustgewebe weitere Beweise für Korrelationen zwischen Angiogenese und B-FN-Expression bereitgestellt (Kaczmarek et al. (1994)).
  • Für die hierin beschriebenen Versuche ist die immunhistochemische Färbung von CGS-1 und CGS-2 mit jener des MAK BC-1 (der die B-FN-Isoform erkennt) und anderer MAKs verglichen worden, von denen bekannt ist, dass sie entweder auf alle bekannten FN-Isoformvarianten (IST-4) oder nur auf FN-Isoformen reagieren, denen ED-B (IST-6) fehlt. Es ist zuvor von der Charakterisierung aller dieser Kontroll-Antikörper berichtet worden (Carnemolla et al. (1989) (1992)).
  • Normale und neoplastische Gewebe wurden aus Proben erhalten, die bei chirurgischen Eingriffen entnommen wurden. Es ist bereits festgestellt worden, dass die Vorbereitung und Fixierung von Geweben für die genaue und empfindliche Detektion von FN-enthaltenden Molekülen entscheidend ist (Castellani et al. (1994)). Für Immunhistochemie wurden 5 μm dicke Kryostatschnitte luftgetrocknet und in kaltem Aceton zehn Minuten lang fixiert. Immunfärbung wurde unter Einsatz eines Streptavidin-Biotin-alkalische-Phosphatase-Komplex-Färbesets (Bio-SPA Division, Mailand, Italien) und Naphthil-AS-MX-Phosphat und Fast Red TR (Sigma) durchgeführt. Gills Hämatoxylin wurde als Gegenfärbung verwendet, gefolgt vom Einschließen in Glycergel (Dako, Carpenteria, Kalifornien) wie zuvor von Castellani et al. (1994) berichtet. Um die Spezifität weiters in Versuchen zu analysieren, in denen eine positive Färbung von Geweben erhalten wurde, wurde die Spezifität für ED-B durch Vorinkubation von Antikörpern mit der rekombinanten ED-B-Domäne, gefolgt von der zuvor beschriebenen Detektion erhalten.
  • Die Ergebnisse dieser Versuche zeigten allgemein, dass sowohl CGS-1 als auch CGS-2 mit denselben histologischen Strukturen reagieren wie der MAK BC-1. Das mit Haut unter Einsatz von CGS-1, CGS-2 und BC-1 erhaltene Farbmuster spiegelt das Fehlen von ED-B in FN, das in der Dermis exprimiert wurde, wider. Bei der Färbung von invasiven Duktalkarzinomschnitten zeigten CGS-1, CGS-2 und BC-1 eine eingeschränkte Verteilung der Färbung, die auf die Grenze zwischen den neoplastischen Zellen und dem Stroms beschränkt war. Das steht im Einklang mit der Tatsa che, dass, obwohl das gesamte FN im gesamten Tumorstroms homogen verteilt ist, die Expression von B-FN auf bestimmte Regionen beschränkt ist, und es sind diese Regionen, die zuvor erfolgreich (in 95% der Fälle) in invasivem duktalem Karzinom unter Einsatz des MAK BC-1 lokalisiert worden sind (Kaczmarek et al. (1994)).
  • Es sind vorherige Entdeckungen bei der Färbung von BC-1 des Tumors Glioblastoma multiforme nachgewiesen worden. Castellani et al. (1994) hatten ein typisches Färbungsmuster von glomerularähnlichen vaskulären Strukturen beobachtet, und in den Versuchen der Erfinder ist gezeigt worden, dass CGS-1 und CGS-2 qualitativ identische Ergebnisse ergeben.
  • Es gibt jedoch einen wichtigen Unterschied zwischen CGS-1 und CGS-2 und dem MAK BC-1: Es ist gezeigt worden, dass sich die zwei menschlichen scFvs an Hühner- und Maus-B-FN binden, während BC-1 strikt humanspezifisch ist. CGS-2 reagierte mit Hühnerembryonen (Daten nicht angegeben), und sowohl CGS-1 als auch CGS-2 reagierten mit Maustumoren.
  • Es ist auch CGS-1-Färbung von vaskulären Strukturen auf Schnitten von murinem F9-Teratokarzinoms gezeigt worden. Hingegen zeigten alle getesteten normalen Mausgewebe (Leber, Milz, Niere, Magen, Dünndarm, Dickdarm, Eierstock, Uterus, Blase, Pankreas, Nebennierendrüsen, Skelettmuskel, Herz, Lunge, Schilddrüse und Gehirn) eine negative Färbungsreaktion mit CGS-1 und CGS-2 (Daten nicht angegeben). Die in den F9-Teratokarzinom-Schnitten gefärbten Strukturen erwiesen sich als ED-B-spezifisch, indem die rekombiante ED-B-Domäne verwendet wurde, um die erhaltene Färbung vollständig zu hemmen (Daten nicht angegeben.)
  • Beispiel 5 – Verwendung von affinitätsgereiften Anti-ED-B-scFvs zum In-vivo-Targeting von menschlichen Tumoren
  • Die menschliche Melanom-Zelllinie SKMEL-28 wurde verwendet, um xenotransplantierte Tumoren in 6-10 Wochen alten Nacktmäusen (Balb-C oder MF-1; Harlan, UK) zu entwickeln, indem in eine Flanke subkutan 1 × 107 Zellen/Maus injiziert wurden.
  • Mäusen, die Tumoren trugen, wurde in die Schwanzvene 100 μl von 1 mg/ml scFv1-Cy71-Lösung in PBS injiziert, als die Tumoren einen Durchmesser von etwa 1 cm erreicht hatten.
  • Die Markierung von rekombinanten Antikörpern mit CY7 wurde durch Zugabe von 100 μl 1 M Natriumbicarbonat, pH = 9,3, und 200 μl CY7-bis-OSu (Amersham, Kat.-Nr. PA17000; 2 mg/ml in DMSO) zu 1 ml Antikörperlösung in PBS (1 mg/ml) erreicht. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur wurden 100 μl 1 M Tris, pH = 7,4 zum Gemisch hinzugefügt, und der markierte Antikörper wurde unter Einsatz von PD10-Säulen für den einmaligen Gebrauch (Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey, USA), mit PBS äquilibriert, von nichtumgesetztem Farbstoff getrennt. Die eluierten grünen Antikörperfraktionen wurden unter Einsatz von Centricon-10-Röhrchen auf etwa 1 mg/ml konzentriert (Amicon, Beverly, Massachusetts, USA). Das erreichte Markierungsverhältnis lag im Allgemeinen nahe 1 Molekül CY7 pro 1 Molekül Antikörper. Dies wurde spektroskopisch mit 1-cm-Küvetten beurteilt, in der Annahme, dass 1 mg/ml Antikörperlösung eine Absorption von 1,4 Einheiten bei 280 nm ergibt, dass der molare Extinktionskoeffizient von CY7 bei 747 nm 200.000 beträgt (M–1cm–1), und unter Vernachlässigung der CY7-Absorption bei 280 nm. Immunoreaktivität der Antikörperproben nach Markierung wurde entweder durch Bandenverschiebung (Neri et al. (1996b)) durch Affinitätschromatographie auf einer Antigensäule oder durch BIA-core-Analyse nachgewiesen. Die Mäuse wurden unter Anästhesie durch Inhalation eines Sauerstoff/Fluorothan-Gemisches mit einen hausgemachten Mäuse-Abbildungsgeräts in regulären Zeitabständen abgebildet. Für jede Probe wurden zwei bis acht Tiere studiert, um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu sichern. Die Verfahren wurden gemäß der Lizenz des Projekts des Vereinigten Königreichs „Tumour Targeting" durchgeführt, das an D. Neri vergeben wurde (UK PPL 80/1056).
  • Das Infrarot-Mäuse-Abbildungsgerät wurde als Modifikation des Photodetektionssystems von Folli et al. (1994) hergestellt, das die Verwendung des Infrarot-Fluorophors CY7 ermöglicht. Infrarotbeleuchtung wurde ausgewählt, um bessere Gewebepenetration zu erreichen. Die Fluoreszenz von CY7 (>760 nm) ist für Menschen unsicht bar und erfordert die Verwendung einer computergesteuerten CCD-Kamera. Das Mäuse-Abbildungsgerät bestand aus einer schwarz gefärbten, lichtundurchlässigen Box, die mit einer 100-W-Wolframhalogenlampe ausgerüstet war, die mit einem 50-mm-Durchmesser-Anregungsfilter ausgerüstet war, der spezifisch für CY7 entworfen wurde (Chroms Corporation, Brattleboro, Vermont, USA; 673-748 nm). Der resultierende Beleuchtungsstrahl ist in guter Annäherung über eine Fläche von 5 × 10 cm homogen, in der die Maus zur Abbildung platziert wurde. Fluoreszenz wurde durch eine 8-bit-Monochrom-Pulnix-CCD-Kamera detektiert, die mit einer C-Halterungslinse und einem 50-mm-Emissionsfilter ausgestattet war (Chroms Corporation, Brattleboro, Vermont, USA; 765-855 nm) und über das ImageDOK-System angeschlossen war (Kinetic Imaging Ltd., Liverpool, UK). Dieses System besteht aus einem Computer, der mit einem Framegrabber und Software zum Empfang und zur Integration von aufeinander folgenden Bildern ausgerüstet ist. Drei aufeinander folgende Bilder, die in 50 ms erhalten wurden, wurden jeweils typischerweise zur Mittelwertbildung verwendet, wobei diese Zahl für die Reihe von Bildern eines Tiers konstant gehalten wurde, um einen direkten Vergleich von Tumor-Targeting zu verschiedenen Zeitpunkten zu ermöglichen. Bilder im TIFF-Format wurden dann unter Einsatz des Programms Graphics Converter in PICT-Dateien konvertiert und unter Einsatz des Programms MacDraw Pro mit einem Power Macintosh 7100/66-Computer ausgearbeitet.
  • Eine schematische Skizze des Aufbaus dieses Geräts ist in 4 dargestellt.
  • Die Versuche zeigten, dass sich beide scFvs im Tumor lokalisierten, wenn auf makroskopischer Ebene visualisiert wurden.
  • Die mikroskopische Demonstration des Targetings auf Neovaskulatur von sich entwickelnden Tumoren mit den zwei Anti-EDB-scFvs erfolgte im Detail wie folgt.
  • Nacktmäusen und/oder SCID-Mäusen, die entweder ein menschliches xenotransplantiertes SKMEL-28-Melanom oder ein Maus-F9-Teratokarzinom in einer Flanke aufwiesen, wurden entweder nichtmarkierte scFV-Fragmente mit der FLAG-Markierung oder biotinylierte scFv-Fragmente injiziert.
  • Die Mäuse wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion getötet, es wurden Tumor- und Nicht-Tumorschnitte erhalten, die dann nach herkömmlichen Immunhistochemieprotokollen gefärbt wurden, wobei entweder der Anti-FLAG-M2-Antikörper (Kodak 181) oder streptavidinbasierte Detektionsreagenzien verwendet wurden. Optimales Targeting wird im Allgemeinen 12 Stunden nach Injektion erzielt. Es wurde gezeigt, dass sowohl CGS1 als auch CGS2 die Neovaskulatur sowohl des xenotransplantierten menschlichen Tumors als auch des murinen Teratokarzinoms banden.
  • Beispiel 6 – Abzielen auf xenotransplantiertes murines F9-Teratokarzinom bei Nacktmäusen
  • Die Erfinder entwickelten feste Tumoren in der Flanke von Nacktmäusen durch subkutane Injektion von 4 × 106 murinen F9-Teratokarzinomzellen. Dieser Tumor wuchs bei Mäusen sehr schnell, wobei in etwa einer Woche nach Injektion 1 cm Durchmesser erreicht wird und sehr stark vaskularisiert ist. Um das Abzielen auf die Antikörper zu veranschaulichen, verwendeten die Erfinder eine Modifikation des Photodetektionsverfahrens von Folli et al. (1994), die eine kinetische Evaluierung von Tumortargeting und von Antikörper-Clearance an demselben Tier zeigte, was zu verschiedenen Zeitpunkten veranschaulicht wurde, wie oben im Detail beschrieben ist (siehe 4).
  • Zum Abzielen auf den Tumor und zur Erleichterung der Detektion von Antikörpern wurden scFv(CGS-1), scFv (CGS-2) und Anti-Lysozym-scFv(D1.3) (McCafferty et al. (1990)) mit einer Homodimerisierungsmarkierung versehen (Pack et al. (1993)), indem die Antikörper in den Sfi1/Not1-Stellen des Expressionsvektors pGIN50 subkloniert wurden. Dieser Vektor ist ein Derivat von pDN268 (Neri et al. (1996b)), in dem die His6-Sequenz der Markierung durch die folgende Sequenz ersetzt wird: GGC LTD TLQ AFT DQL EDE KSA LQT EIA HLL KEK EKL EFI LAA H, die einen Cysteinrest und die amphipathische Helix des Fos-Proteins zur kovalenten Homodimerisierung von Antikörperfragmenten enthält (Abate et al. (1990)). Es wurde keine vollstän dige kovalente Dimerisierung erreicht: etwa 30-50% der Antikörperfragmente bestanden aus kovalent gebundenen Dimeren.
  • Antikörperfragmente wurden durch Affinitätschromatographie auf Säulen gereinigt, die durch Bindung von Hühnerei-Lysozym (D1,3) oder 7B89 (Anti-ED-B-Antikörper; Carnemolla et al. (1996)) an CNBr-aktivierte Sepharose (Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey, USA) erreicht wurde. Überstände wurden auf die Affinitätsträger geladen, die dann mit PBS und mit PBS + 0,5 M NaCl gewaschen und mit 100 mM Et3N eluiert wurden. Die Antikörper wurden dann gegen PBS dialysiert.
  • Die Antikörper wurden wie oben beschrieben markiert und dann in die Schwanzvene von tumortragenden Mäusen mit 100 μl von 1 mg/ml scFv1-Cy71-Lösung in PBS injiziert, als die Tumoren einen Durchmesser von etwa 1 cm erreicht hatten.
  • Wie in 5 dargestellt, lokalisierte sich scFv(CGS-1) für bis zu drei Tage auf dem Tumor, obwohl es in diesem Zeitraum eine rasche Clearance aus dem Tumor gab. Allerdings gab es auch eine gewisse Färbung des Femurs. Die Targeting-Leistung von CGS-1 zum Tumor wurde durch die Einführung einer amphipathischen Helix, die einen Cystein-Rest am C-Terminus enthielt, dramatisch verbessert, um Antikörperdimerisierung zu fördern (Pack et al. (1993)). Tatsächlich schien die Lokalisierung des dimeren scFv(CGS-2)2 24 bis 72 Stunden lang nicht signifikant abzunehmen. Hingegen zeigte eine negative Kontrolle (der dimere Antikörper scFv(D1,3)2, Anti-Lysozym-Antikörper) eine schnelle Clearance und keine detektierbare Lokalisierung auf dem Tumor oder Femur.
  • ScFv(28SI) zeigte schwaches Tumortargeting nach 6 Stunden (nicht angegeben), es konnte jedoch keines nach 24 Stunden oder später detektiert werden (6). Affinitätsreifung führte zu einem stark verbesserten Targeting, wodurch scFv(CGS-2) kleine und große F9-Tumoren wirksam ansteuerte, ob als Monomer (6) oder Dimer (nicht angegeben). Nach zwei Tagen wurde festgestellt, dass die prozentuelle injizierte Dosis von Antikörper pro Gramm Tumor etwa 2 für das scFv(CGS-2)-Monomer und 3-4 für das scFv(CGS-2)-Dimer war. Die durch scFv(CGS-2) an den Tumor ver abreichte Dosis war auch für scFv(CGS-2) (5 und 6) höher und korrelierte mit ihren jeweiligen Affinitäten (Tabelle 1). Jedoch scheinen sowohl scFv(28SI) als auch scFv(CGS-2) gegenüber proteolytischer Spaltung anfällig zu sein und zeigen hohe Leberaufnahme (6), während scFv(CGS-1)-Antikörper signifikant stabiler waren und geringere Leberaufnahme zeigten (5).
  • LITERATURZITATE
    • Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992; Short Protocols in Molecular Biology, Second Edition.
    • Alitalo et al. Adv. Cancer Res. 37, 111-158 (1982).
    • Bagshawe K.D. et al. (1991) Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915-922.
    • Barone et al. EMBO J. 8, 1079-1085 (1989).
    • Bird et al, Science, 242, 423-426, (1988).
    • Borsi et al. J. Cell. Biol. 104, 595-600 (1987).
    • Borsi et al. Anal. Biochem. 192, 372-379 (1991).
    • Borsi et al. Int. J. Cancer 52, 688-692 (1992a).
    • Borsi et al. Exp. Cell Res. 199, 98-105 (1992b).
    • Brown et al. Amer. J. Pathol. 142, 793-801 (1993).
    • Carnemolla et al. J. Cell Biol. 108, 1139-1148 (1989).
    • Carnemolla et al. J. Biol. Chem 24689-24692 (1992).
    • Castellani et al. J. Cell. Biol. 103, 1671-1677 (1986).
    • Castellani et al. Int. J. Cancer 59, 612-618 (1994).
    • Crothers et al. Immunochemistry 9, 341-357 (1972).
    • DeJager et al (1988) Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 29:377. Folli, et al (1994), Cancer Res., 54, 2643-2649.
    • Ffrench-Constant et al. J. Cell Biol. 109, 903-914 (1989).
    • Ffrench-Constant et al. Development 106, 375-388 (1989).
    • Gibson TJ (1984) PhD thesis. (University of Cambridge, Cambridge, UK).
    • Griffiths, et al. (1994), EMBO J. 13, 3245-3260. Gutman and Kornblihtt. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84, 7179-7182 (1987).
    • Hawkins et al. J. Mol. Biol. 226, 889-896 (1992). Molliger et al Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, 1993).
    • Holliger, P. and Winter G. Current Opinion Biotechnol. 4, 446-449 (1993).
    • Hoogenboom et al. Nucl. Acids Res 19, 4133-4137 (1991).
    • Humphries et al. J. Cell Biol. 103, 2637-2647 (1986).
    • Huston et al, PNAS USA, 85, 5879-5883, (1988)
    • Hynes Ann. Rev, Cell Biol. 1, 67-90 (1985).
    • Jain RK. Sci. Am. 271, 58-65 (1994).
    • Jonsson et al. BioTechniques 11, 620-627 (1991).
    • Juweid et al. Cancer Res 52, 5144-5153 (1992).
    • Kaczmarek et al. Int. J. Cancer 58, 11-16 (1994).
    • Kornblihtt et al. EMBO J. 4, 1755 (1985).
    • Laitinen et al. Lab. Invest. 64, 375-388 (1991).
    • Ledermann J.A. et al. (1991) Int J. Cancer 47: 659-664; Low et al (1996), J. Mol. Biol., 260, 359-368.
    • Marks et al (1991), J. Mol. Biol., 222, 581-597.
    • Marks et al, (1992), Bio/Technology, 10, 779-783. McCafferty, J., Griffiths, A.D., Winter, G., Chiswell, D.J. (1990) Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. Nature (London), 348, 552-554.
    • Neri et al (1996a), Bio/Techniques, 20, 708-713.
    • Neri et al (1996b), Nature Biotechnology, 14, 385-390. Nissim et al. EMBO J. 13, 692-698 (1994).
    • Norton and Hynes. Mol. Cell. Biol. 7, 4297-4307 (1987).
    • Owens et al. Oxf. Surv. Eucaryot. Genes 3, 141-160 (1986).
    • Oyama et al. J. Biol. Chem. 10331-10334 (1989).
    • Oyama et al. Cancer Res. 50, 1075-1078 (1990). Pack et al (1993), Bio/Technology, 11, 1271-1277.
    • Peters et al. Cell Adhes. Commun. 3, 67-89 (1995).
    • Pierschbacher et al. Cell 26, 259-267 (1981).
    • Plückthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991).
    • Reff, M.E. (1993) Curr. Opinion Biotech. 4: 573-576.
    • Ruoslahti. Ann. Rev. Biochem. 57, 375-413 (1988).
    • Saginati et al. Eur J. Biochem. 205, 545-549 (1992).
    • Schwarzbauer et al. EMBO J. 6, 2573-2580 (1987).
    • Schroff et al, 1985 Cancer Res 45: 879-885. Siri et al. Nucl. Acids Res. 19, 525-531 (1991).
    • Tomlinson I.M. et al, (1992) J. Mol. Biol. 227: 776-798. Traunecker et al Embo Journal, 10, 3655-3659, (1991).
    • Trill J.J. et al. (1995) Curr. Opinion Biotech 6: 553-560. Vartio et al. J. Cell Science 88, 419-430 (1987).
    • Vaughan et al (1996), Nature Biotechnol., 14, 309-314. Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546 (1989).
    • Winter, G and C. Milstein, Nature 349, 293-299,1991.
    • WO94/13804Yamada. Ann. Rev. Biochem. 52, 761-799 (1983).
    • Zardi et al. EMBO J. 6, 2337-2342 (1987).

Claims (26)

  1. Isolierter Antikörper oder isoliertes Antikörperfragment, der/das für die onkofötale ED-B-Domäne von Fibronektin (FN) spezifisch ist und direkt daran bindet und bei Messung als gereinigtes Monomer eine Dissoziationskonstante (Kd) für ED-B-Fn von weniger als 6 × 10–8M aufweist.
  2. Isolierter Antikörper oder isoliertes Antikörperfragment nach Anspruch 1, der/das eine Antikörper-Antigenbindungsdomäne menschlichen Ursprungs umfasst.
  3. Isolierter Antikörper oder isoliertes Antikörperfragment nach Anspruch 1, der/das an jegliches FN bindet, das nach Behandlung des FN mit der Protease Thermolysin ED-B enthält.
  4. Isolierter Antikörper oder isoliertes Antikörperfragment nach Anspruch 1, der/das ohne Behandlung des B-FN mit N-Glykanase an B-FN bindet.
  5. Isolierter Antikörper oder isoliertes Antikörperfragment nach Anspruch 1, der/das eine variable Schwerketten- (VH-) Region der von DP47, Codon 1 Glu bis einschließlich Codon 98 Arg in 1, der menschlichen Keimbahn stammenden Sequenz und die CDR3-Sequenz Ser Leu Pro Lys aufweist.
  6. Isolierter Antikörper oder isoliertes Antikörperfragment nach Anspruch 1, der/das eine variable Schwerketten- (VH-) Region der von DP47, Codon 1 Glu bis einschließlich Codon 98 Arg in 1, der menschlichen Keimbahn stammenden Sequenz und die CDR3-Sequenz Gly Val Gly Ala Phe Arg Pro Tyr Arg Lys His Glu aufweist.
  7. Isolierter Antikörper oder isoliertes Antikörperfragment nach Anspruch 1, der/das eine variable Leichtketten- (VL-) Region der von DPL16, Codon 1 Ser bis einschließlich Codon 90 Ser in 1, der menschlichen Keimbahn stammenden Sequenz und den Rest der CDR3-Sequenz, Pro Val Val Leu Asn Gly Val Val, aufweist.
  8. Isolierter Antikörper oder isoliertes Antikörperfragment nach Anspruch 1, der/das eine variable Leichtketten- (VL-) Region der von DPL16, Codon 1 Ser bis einschließlich Codon 90 Ser in 1, der menschlichen Keimbahn stammenden Sequenz und den Rest der CDR3-Sequenz, Pro Phe Glu His Asn Leu Val Val, aufweist.
  9. Isolierter Antikörper oder isoliertes Antikörperfragment nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin der Antikörper oder das Antikörperfragment ein scFv-Molekül umfasst.
  10. Isolierter Antikörper oder isoliertes Antikörperfragment nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin der Antikörper oder das Antikörperfragment ein dimeres scFv-Molekül umfasst.
  11. Isoliertes Antikörperfragment nach einem der Ansprüche 5 bis 8.
  12. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen isolierten Antikörper oder ein isoliertes Antikörperfragment nach einem der Ansprüche 1 bis 11 in einer wirksamen Menge in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
  13. Nucleinsäure, die für einen isolierten Antikörper oder ein isoliertes Antikörperfragment nach einem der Ansprüche 1 bis 11 kodiert.
  14. Phage, der für einen isolierten Antikörper oder ein isoliertes Antikörperfragment nach einem der Ansprüche 1 bis 11 kodiert.
  15. Wirtszelle, die mit Nucleinsäure nach Anspruch 13 in vitro transformiert oder transfiziert ist.
  16. Isolierter Antikörper oder isoliertes Antikörperfragment nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur therapeutischen Verwendung.
  17. Verwendung eines isolierten Antikörpers oder Antikörperfragments nach einem der Ansprüche 1 bis 11 bei der Herstellung eines Medikaments zum Abzielen auf Tumoren.
  18. Verwendung eines isolierten Antikörpers oder Antikörperfragments nach einem der Ansprüche 1 bis 11 bei der Herstellung eines Mittels zur Abbildung von Tumoren.
  19. Verfahren zur Produktion eines isolierten Antikörpers oder Antikörperfragments nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das Verfahren die In-vitro-Expression von Nucleinsäure nach Anspruch 13 in einer Wirtszelle umfasst, um den Antikörper oder das Antikörperfragment zu produzieren.
  20. Verfahren zur Produktion eines isolierten Antikörpers oder Antikörperfragments nach Anspruch 1, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: a) das Screenen einer in Phagen exprimierten Antikörperfragment-Bibliothek mit einem vom Fibronektinprotein stammenden rekombinanten Fibronektinfragment, das die ED-B-Domäne enthält, worin die Antikörperfragmente scFv-Moleküle sind; b) das Infizieren von Wirtsbakterienzellen mit positiven Klonen; c) das Unterziehen von positiven Phagenklonen einem Affinitätsreifungsverfahren; d) das Wiederholen der Schritte a) und b) zur Selektion positiver Phagenklone mit verbesserter Afffinität für das Antigen; e) das Infizieren von Wirtszellen mit positiven Klonen und Reinigen von Antikörpermolekülen aus diesen Wirtszellen.
  21. Verfahren nach Anspruch 20, worin die ScFv-Moleküle eine Antikörper-Antigenbindungsdomäne menschlichen Ursprungs umfassen.
  22. Verfahren nach Anspruch 20, worin Schritt a) das Screenen mit den rekombinanten Antigenen 7B89 oder ED-B umfasst.
  23. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 22, worin Nucleinsäure eines positiven Klons zur Produktion durch In-vitro-Expression eines Produkt-Antikörpers oder -Antikörperfragments, für den/das die Nucleinsäure kodiert, in einer Wirtszelle verwendet wird, wobei der/das Produkt-Antikörper oder -Antikörperfragment eine Antikörper-Antigenbindungsdomäne umfasst, die für die onkofötale ED-B-Domäne von Fibronektin (FN) spezifisch ist und direkt daran bindet.
  24. Verfahren nach Anspruch 23, worin der Produkt-Antikörper als ganzer Antikörper vorliegt.
  25. Verfahren nach Anspruch 23, worin das Produkt-Antikörperfragment als scFv-Molekül vorliegt.
  26. Diagnoseset, umfassend einen isolierten Antikörper oder ein isoliertes Antikörperfragment nach einem der Ansprüche 1 bis 11 sowie ein oder mehrere Reagenzien, welche die Bestimmung der Bindung des Elements an Zellen ermöglichen.
DE1997637683 1996-05-24 1997-05-23 Antikörper gegen die ed-b domäne von fibronektin, ihre herstellung und verwendungen Expired - Lifetime DE69737683T2 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB9610967 1996-05-24
GB9610967A GB9610967D0 (en) 1996-05-24 1996-05-24 Specific binding members,materials and methods
PCT/GB1997/001412 WO1997045544A1 (en) 1996-05-24 1997-05-23 Antibodies to the ed-b domain of fibronectin, their construction and uses

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69737683D1 DE69737683D1 (de) 2007-06-14
DE69737683T2 true DE69737683T2 (de) 2008-01-10

Family

ID=10794298

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE1997637683 Expired - Lifetime DE69737683T2 (de) 1996-05-24 1997-05-23 Antikörper gegen die ed-b domäne von fibronektin, ihre herstellung und verwendungen

Country Status (29)

Country Link
US (3) US7273924B1 (de)
EP (1) EP0906426B1 (de)
JP (2) JP4750912B2 (de)
KR (2) KR100741452B1 (de)
CN (1) CN100447159C (de)
AT (1) ATE361364T1 (de)
AU (1) AU729081B2 (de)
BG (1) BG65138B1 (de)
BR (1) BR9709350B1 (de)
CA (1) CA2256308C (de)
CZ (1) CZ295531B6 (de)
DE (1) DE69737683T2 (de)
DK (1) DK0906426T3 (de)
EA (1) EA004329B1 (de)
ES (1) ES2286831T3 (de)
GB (1) GB9610967D0 (de)
HK (1) HK1020990A1 (de)
HU (1) HUP0200546A2 (de)
IL (2) IL127216A0 (de)
IS (1) IS2508B (de)
NO (1) NO324904B1 (de)
NZ (1) NZ333083A (de)
PL (1) PL188557B1 (de)
PT (1) PT906426E (de)
SI (1) SI0906426T1 (de)
SK (1) SK285916B6 (de)
TR (1) TR199802416T2 (de)
UA (1) UA74129C2 (de)
WO (1) WO1997045544A1 (de)

Families Citing this family (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6749853B1 (en) 1992-03-05 2004-06-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Combined methods and compositions for coagulation and tumor treatment
US5965132A (en) 1992-03-05 1999-10-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for targeting the vasculature of solid tumors
GB9610967D0 (en) 1996-05-24 1996-07-31 Cambridge Antibody Tech Specific binding members,materials and methods
US6685943B1 (en) 1997-01-21 2004-02-03 The Texas A&M University System Fibronectin binding protein compositions and methods of use
US7244826B1 (en) * 1998-04-24 2007-07-17 The Regents Of The University Of California Internalizing ERB2 antibodies
US20030045681A1 (en) * 1998-05-11 2003-03-06 Anthony J. Zelano Specific binding molecules for scintigraphy, conjugates containing them and therapeutic method for treatment of angiogenesis
TWI259837B (en) * 1998-05-11 2006-08-11 Eidgenossische Tech Hochscule Specific binding molecules for scintigraphy, conjugates containing them and therapeutic method for treatment of angiogenesis
US20030176663A1 (en) * 1998-05-11 2003-09-18 Eidgenossische Technische Hochscule Specific binding molecules for scintigraphy
DE19932688B4 (de) 1999-07-13 2009-10-08 Scil Proteins Gmbh Design von Beta-Faltblatt-Proteinen des gamma-II-kristallins antikörperähnlichen
EP1259548A1 (de) * 2000-02-24 2002-11-27 Eidgenössische Technische Hochschule Zürich Antikörper gegen die ed-b domäne von fibronektin, konjugate die diesen antikörper enthalten, und deren verwendung zum nachweis und zur behandlung von angiogenese
AU2001239470A1 (en) * 2000-02-24 2001-09-03 Philogen S.R.L. Compositions and methods for treatment of angiogenesis in pathological lesions
EP1282642B1 (de) 2000-05-09 2006-09-06 Greenville Hospital System Therapeutische porenbildende peptide
AU2001281824A1 (en) * 2000-06-15 2001-12-24 Patrizia Castellani Methods for quantitative determination of b-fibronectin in biological fluids and tissues
SK2882003A3 (en) * 2000-09-07 2003-08-05 Schering Ag Receptor in the EDb fibronectin domain
IT1317108B1 (it) * 2000-12-06 2003-05-26 Philogen Srl Processo per la selezione di frammenti anticorporali anti-angiogenesi,frammenti anticorpali anti-angiogenesi cosi' ottenuti e loro uso.
US7456146B2 (en) * 2001-05-09 2008-11-25 Ghc Research Development Corporation Lytic peptide prodrugs
MXPA04006517A (es) 2002-01-03 2005-03-31 Schering Ag Conjugados que comprenden un anticuerpo especifico para el dominio ed-b de fibronectina y sus usos para la deteccion y tratamiento de tumores.
CA2478414C (en) * 2002-03-11 2012-11-13 Philogen S.P.A. Selective targeting of tumor vasculature using antibody molecules
ES2358730T3 (es) 2002-07-15 2011-05-13 Board Of Regents, The University Of Texas System Anticuerpos seleccionados y péptidos de duramicina que se enlazan a fosfolípidos aniónicos y aminofosfolípidos y sus usos en el tratamiento de infecciones virales y del cáncer.
RU2005131852A (ru) 2003-03-14 2006-04-20 Уайт (Us) Антитела против человеческого рецептора il-21 и их применение
DE10324447A1 (de) 2003-05-28 2004-12-30 Scil Proteins Gmbh Generierung künstlicher Bindungsproteine auf der Grundlage von Ubiquitin
EA011859B9 (ru) 2004-01-05 2013-07-30 Емд Лексиген Ресерч Сентер Корп. Соединения для адресной доставки препарата к ткани или органу-мишени
US20060024757A1 (en) 2004-07-30 2006-02-02 Robert Hussa Detection of oncofetal fibronectin for selection of concepti
US7785591B2 (en) 2004-10-14 2010-08-31 Morphosys Ag Identification and characterization of function-blocking anti-ED-B-fibronectin antibodies
EP1803814A1 (de) 2005-12-27 2007-07-04 SIGMA-TAU Industrie Farmaceutiche Riunite S.p.A. Methode zur Verbesserung der Antikörperselektionskapazität in einer Phagen-Display-Bibliothek
EP1925664A1 (de) 2006-11-15 2008-05-28 Scil proteins GmbH Künstliche Bindungsproteine auf Grundlage einer modifizierten alpha-Helix Region von Ubiquitin
US8253725B2 (en) * 2007-12-28 2012-08-28 St. Jude Medical, Atrial Fibrillation Division, Inc. Method and system for generating surface models of geometric structures
ATE548052T1 (de) * 2008-01-17 2012-03-15 Philogen Spa Kombination aus einem anti-edb-fibronectin- antikörper-il-2-fusionsprotein und einem b-zellen bindenden molekül, b-zellen-vorläufern und/oder deren krebserregendem gegenspieler
EP2100621A1 (de) 2008-03-10 2009-09-16 mivenion GmbH Polyether-Polyol-Dendron-Konjugate mit Effektormolekülen für biologisches Targeting
EP2116555A1 (de) 2008-05-08 2009-11-11 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Verwendung eines spezifisch an ED-B Fibronectin bindenden radioaktiv markierten Moleküls bei einem Verfahren zur Behandlung von Hodgkin-Lymphom
IT1392027B1 (it) * 2008-12-12 2012-02-09 Castellani Anticorpo monoclonale e suo uso per la identificazione della isoforma oncofetale della fibronettina (b-fn) a scopo diagnostico o terapeutico.
US20120301393A1 (en) 2009-12-14 2012-11-29 Scil Proteins Gmbh Modified ubiquitin proteins having a specific binding activity for the extradomain b of fibronectin
WO2011110490A1 (en) 2010-03-09 2011-09-15 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Process for the production of radioactively labelled scfv antibody fragments, kits and compositions
WO2012172055A1 (en) 2011-06-15 2012-12-20 Scil Proteins Gmbh Dimeric binding proteins based on modified ubiquitins
WO2012171541A1 (en) 2011-06-15 2012-12-20 Scil Proteins Gmbh Human fusion proteins comprising interferons and hetero-dimeric modified ubiquitin proteins
EP2861616A1 (de) 2012-06-13 2015-04-22 Scil Proteins GmbH Menschliche fusionsproteine mit einkettigem tnf-alpha und zielgerichteten domänen
WO2014094799A1 (en) 2012-12-19 2014-06-26 Scil-Proteins-Gmbh Ubiquitin moieties as a means for prolonging serum half-life
WO2014194784A1 (zh) * 2013-06-06 2014-12-11 合肥立方制药股份有限公司 人源抗纤连蛋白ed-b结构域的抗体及其用途
WO2016124702A1 (en) 2015-02-06 2016-08-11 Scil Proteins Gmbh Novel egfr binding proteins
PL3322721T3 (pl) 2015-07-16 2022-06-06 Navigo Proteins Gmbh Nowe białka wiążące immunoglobulinę i ich zastosowanie w oczyszczaniu na bazie powinowactwa
WO2017013136A1 (en) 2015-07-20 2017-01-26 Scil Proteins Gmbh Novel binding proteins based on di-ubiquitin muteins and methods for generation
WO2017084017A1 (zh) * 2015-11-16 2017-05-26 合肥立方制药股份有限公司 Ed-b蛋白在诊断组织增生中的应用
EP3452097A1 (de) 2016-05-04 2019-03-13 Navigo Proteins GmbH Zielgerichtete verbindungen zur stellenspezifischen kupplung chemischer einheiten mit einem peptidlinker
KR102578256B1 (ko) 2016-08-11 2023-09-15 리플리겐 코포레이션 친화성 크로마토그래피를 위한 알칼리 안정 fc-결합 단백질
KR102338660B1 (ko) 2016-10-17 2021-12-10 화이자 인코포레이티드 항-edb 항체 및 항체-약물 접합체
AU2018281871B2 (en) 2017-06-07 2022-07-28 Philogen S.P.A. Vascular endothelial growth factor/anti-fibronectin antibody fusion proteins
EP3689903A4 (de) 2017-09-30 2022-01-12 Hefei Lifeon Pharmaceutical Co. Ltd. Bindung von protein an fibronectin-b-domäne
US11414466B2 (en) 2017-11-07 2022-08-16 Navigo Proteins Gmbh Fusion proteins with specificity for ED-B and long serum half-life for diagnosis or treatment of cancer
WO2020070150A1 (en) 2018-10-02 2020-04-09 Philogen S.P.A Il2 immunoconjugates
EP3660039A1 (de) 2018-11-30 2020-06-03 Philogen S.p.A. Il2-immunkonjugate
BR112022002540A2 (pt) 2019-08-15 2022-06-14 Janssen Biotech Inc Materiais e métodos para fragmentos variáveis de cadeia única aprimorados
CN115087670A (zh) 2019-12-11 2022-09-20 西拉格国际有限责任公司 包含ltbr和edb结合结构域的多特异性结合分子及其用途
CN111171149B (zh) * 2020-02-23 2021-09-07 北京康普美特创新医药科技有限责任公司 一种抗补体c5分子的人源化单链抗体及其应用
CN111234016B (zh) * 2020-02-23 2021-09-07 北京康普美特创新医药科技有限责任公司 一种抗补体c5分子的全人源单克隆抗体及应用
KR102614063B1 (ko) 2020-12-24 2023-12-19 대화제약 주식회사 엑스트라도메인 b 피브로넥틴에 특이적으로 결합하는 신규한 항체
WO2023131611A1 (en) 2022-01-04 2023-07-13 Philogen S.P.A. Combination of an immunocytokine comprising il-12 and a kinase inhibitor
WO2024028258A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Philochem Ag Conjugates of psma-binding moieties with cytotoxic agents
WO2024052333A1 (en) 2022-09-06 2024-03-14 Philochem Ag Multivalent fibroblast activation protein ligands for targeted delivery applications

Family Cites Families (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
JPS61134325A (ja) 1984-12-04 1986-06-21 Teijin Ltd ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法
EP0460709B1 (de) 1985-01-28 1997-05-21 Xoma Corporation AraB-Promoter und Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden einschliesslich Cecropinen mittels mikrobiologischer Verfahren
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US4894326A (en) 1986-04-09 1990-01-16 Fred Hutchinson Cancer Research Center Monoclonal antibody defining oncofetal structure of fibronectin
US5243029A (en) 1986-04-09 1993-09-07 Fred Hutchinson Cancer Research Center Oncofetal structure of fibronectin
CA1341235C (en) 1987-07-24 2001-05-22 Randy R. Robinson Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
EP0311434A3 (de) * 1987-10-09 1990-05-09 The De La Rue Company Plc Karte für integrierte Schaltkreise
ATE140731T1 (de) 1988-01-11 1996-08-15 Xoma Corp Plasmidvektor mit pectatlyase-signalsequenz
IT1217724B (it) * 1988-05-26 1990-03-30 Ist Naz Ric Sul Cancro Anticorpo monoclonale specifico per una sequenza di fibronettina espressa in cellule trasformate ibridoma secernente tale anticorpo e impiego dell'anticorpo monoclonale per la diagnosi di tumori
US5177015A (en) 1988-08-12 1993-01-05 Fred Hutchinson Cancer Research Centre Onco-developmentally regulated α-N-acetylgalactosaminyltransferase
US5843156A (en) 1988-08-24 1998-12-01 Endoluminal Therapeutics, Inc. Local polymeric gel cellular therapy
JPH0276598A (ja) 1988-09-14 1990-03-15 Fujita Gakuen 抗ｅｄ−ｂ抗体
JPH04169195A (ja) * 1990-10-31 1992-06-17 Fujita Gakuen 抗ｅｄ―ｂモノクローナル抗体
ATE297465T1 (de) 1991-11-25 2005-06-15 Enzon Inc Verfahren zur herstellung von multivalenten antigenbindenden proteinen
US5629291A (en) 1992-01-31 1997-05-13 La Jolla Cancer Research Foundation Methods of modulating fibronectin extracellular matrix assembly
US6004555A (en) 1992-03-05 1999-12-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for the specific coagulation of vasculature
US6749853B1 (en) 1992-03-05 2004-06-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Combined methods and compositions for coagulation and tumor treatment
US6036955A (en) 1992-03-05 2000-03-14 The Scripps Research Institute Kits and methods for the specific coagulation of vasculature
US5877289A (en) 1992-03-05 1999-03-02 The Scripps Research Institute Tissue factor compositions and ligands for the specific coagulation of vasculature
US5965132A (en) 1992-03-05 1999-10-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for targeting the vasculature of solid tumors
US6093399A (en) 1992-03-05 2000-07-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for the specific coagulation of vasculature
US5976535A (en) 1992-06-09 1999-11-02 Neorx Corporation Pretargeting protocols for the enhanced localization of cytotoxins to target sites and cytotoxic combinations useful therefore
US5561114A (en) 1992-09-25 1996-10-01 Otsuka Pharmaceutical Factory Inc. Adsorbent for cellular fibronectin, a method for fractional purification of fibronectin and a method of hemocatharisis
US5491130A (en) 1992-11-10 1996-02-13 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Peptide inhibitors of fibronectin and related collagen-binding proteins
CA2150262C (en) 1992-12-04 2008-07-08 Kaspar-Philipp Holliger Multivalent and multispecific binding proteins, their manufacture and use
US6015897A (en) 1993-12-07 2000-01-18 Neorx Corporation Biotinamido-n-methylglycyl-seryl-o-succinamido-benzyl dota
US5523229A (en) 1994-03-22 1996-06-04 Trustees Of The University Of Pennsylvania Antibodies specific for oncofetal fibronectin
DE4417865A1 (de) 1994-05-20 1995-11-23 Behringwerke Ag Kombination von Tumornekrose-induzierenden Substanzen mit Substanzen, die durch Nekrosen aktiviert werden, zur selektiven Tumortherapie
ITFI940095A1 (it) 1994-05-23 1995-11-23 Molteni & C Coniugati fotodinamici aventi proprieta' biocide
US5648485A (en) 1994-10-26 1997-07-15 University Of British Columbia β, β-dihydroxy meso-substituted chlorins, isobacteriochlorins, and bacteriochlorins
WO1996023816A1 (en) 1995-02-01 1996-08-08 British Technology Group Limited Radiolabelled proteins
US6140470A (en) 1995-06-30 2000-10-31 Yale University Human monoclonal anti-tumor antibodies
US5808146A (en) 1995-11-09 1998-09-15 Emory University Amino acid analogs for tumor imaging
GB9610967D0 (en) 1996-05-24 1996-07-31 Cambridge Antibody Tech Specific binding members,materials and methods
US5913884A (en) 1996-09-19 1999-06-22 The General Hospital Corporation Inhibition of fibrosis by photodynamic therapy
GB9722131D0 (en) 1997-10-20 1997-12-17 Medical Res Council Method
US6394952B1 (en) 1998-02-03 2002-05-28 Adeza Biomedical Corporation Point of care diagnostic systems
US6267722B1 (en) 1998-02-03 2001-07-31 Adeza Biomedical Corporation Point of care diagnostic systems
TWI259837B (en) 1998-05-11 2006-08-11 Eidgenossische Tech Hochscule Specific binding molecules for scintigraphy, conjugates containing them and therapeutic method for treatment of angiogenesis
AU2001239470A1 (en) 2000-02-24 2001-09-03 Philogen S.R.L. Compositions and methods for treatment of angiogenesis in pathological lesions
EP1259548A1 (de) 2000-02-24 2002-11-27 Eidgenössische Technische Hochschule Zürich Antikörper gegen die ed-b domäne von fibronektin, konjugate die diesen antikörper enthalten, und deren verwendung zum nachweis und zur behandlung von angiogenese
MXPA04006517A (es) 2002-01-03 2005-03-31 Schering Ag Conjugados que comprenden un anticuerpo especifico para el dominio ed-b de fibronectina y sus usos para la deteccion y tratamiento de tumores.
JP4169195B2 (ja) * 2003-06-24 2008-10-22 株式会社河合楽器製作所 電子楽音発生装置の記録制御装置

Also Published As

Publication number Publication date
CN100447159C (zh) 2008-12-31
JP4750912B2 (ja) 2011-08-17
NO985459D0 (no) 1998-11-23
AU2910197A (en) 1998-01-05
HUP0200546A2 (en) 2002-07-29
KR20060035812A (ko) 2006-04-26
KR20050010081A (ko) 2005-01-26
US8703143B2 (en) 2014-04-22
CN1219968A (zh) 1999-06-16
BG65138B1 (bg) 2007-03-30
DK0906426T3 (da) 2007-09-10
EP0906426B1 (de) 2007-05-02
TR199802416T2 (xx) 1999-02-22
CZ295531B6 (cs) 2005-08-17
ATE361364T1 (de) 2007-05-15
ES2286831T3 (es) 2007-12-01
EA004329B1 (ru) 2004-04-29
NZ333083A (en) 2000-05-26
KR100741452B1 (ko) 2007-07-20
AU729081B2 (en) 2001-01-25
IL127216A0 (en) 1999-09-22
GB9610967D0 (en) 1996-07-31
UA74129C2 (uk) 2005-11-15
CA2256308A1 (en) 1997-12-04
US20080274099A1 (en) 2008-11-06
US20140134182A1 (en) 2014-05-15
IL127216A (en) 2008-11-26
EP0906426A1 (de) 1999-04-07
BR9709350A (pt) 2000-01-04
IS2508B (is) 2009-04-15
CZ381598A3 (cs) 1999-03-17
SI0906426T1 (sl) 2007-10-31
PL188557B1 (pl) 2005-02-28
BG102950A (en) 1999-08-31
JP2009050261A (ja) 2009-03-12
EA199801043A1 (ru) 1999-04-29
HK1020990A1 (en) 2000-05-26
DE69737683D1 (de) 2007-06-14
NO985459L (no) 1999-01-22
US7273924B1 (en) 2007-09-25
IS4883A (is) 1998-10-29
SK285916B6 (sk) 2007-11-02
PT906426E (pt) 2007-07-23
JP2000511416A (ja) 2000-09-05
WO1997045544A1 (en) 1997-12-04
PL330075A1 (en) 1999-04-26
CA2256308C (en) 2012-03-13
NO324904B1 (no) 2007-12-27
BR9709350B1 (pt) 2010-12-14
US9096670B2 (en) 2015-08-04
SK161298A3 (en) 1999-07-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69737683T2 (de) Antikörper gegen die ed-b domäne von fibronektin, ihre herstellung und verwendungen
DE69926630T2 (de) Antikörper gegen die ed-b domäne von fibronektin, solche antikörper enthaltende konjugate, und deren verwendung zur diagnose und therapie von angiogenese-assoziierten tumoren und krankheiten
DE60317677T2 (de) Ox40 (=cd134) rezeptor agonisten und therapeutische verwendung
DE60012500T2 (de) Antikörper und antikörperfragmente mit spezifität für tgfbeta1
CN101090913B (zh) 抗生腱蛋白c的抗体
CN107709361A (zh) 用于治疗突触核蛋白病的药剂、用途和方法
EP1945767A1 (de) Identifizierung und charakterisierung von funktionsblockierenden anti-ed-b-fibronektin antikörpern
DE69927268T2 (de) Spezifische antikörper enthaltende bindungsproteine die das nekrotische tumorzentrum binden und deren verwendung
JP2002503676A (ja) Ｆｃレセプターのリガンドを使用するマクロファージ媒介性疾患の治療および診断
CN108025093A (zh) 用于在治疗癌症中使用的放射性标记的抗体片段
DE60128452T2 (de) Monoklonale antikörper gegen den menschlichen ldl-rezeptor, deren herstellung und verwendung
EA010653B1 (ru) Нацеливание на опухолевую сосудистую сеть при использовании меченного радиоактивным изотопом антитела l19 к ed-b фибронектину
EP0954535A1 (de) Antikörper, die an die nidogen-bindungsdomäne des laminins binden, deren herstellung und verwendung
KR100494530B1 (ko) 피브로넥틴ed-b도메인에대한항체,그제조방법및용도
MXPA98009732A (en) Antibodies for the fibronectin ed-b domain, its construction and u
DE102004050101A1 (de) Identifizierung und Charakterisierung von funktionsblockierenden anti-ED-B-Fibronektin Antikörpern

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition