CZ381598A3

CZ381598A3 - Protilátky proti ED-B doméně fibronektinu, jejich konstrukce a použití

Info

Publication number: CZ381598A3
Application number: CZ983815A
Authority: CZ
Inventors: Dario Neri; Barbara Carnemolla; Annalisa Siri; Enrica Balza; Patrizia Castellani; Alessandro Pini; Luciano Zardi; Gregory Paul Winter; Giovanni Neri; Laura Borsi
Original assignee: Philogen S. R. L.
Priority date: 1996-05-24
Filing date: 1997-05-23
Publication date: 1999-03-17
Also published as: CN100447159C; JP4750912B2; NO985459D0; AU2910197A; HUP0200546A2; KR20060035812A; KR20050010081A; US8703143B2; CN1219968A; BG65138B1; DK0906426T3; EP0906426B1; TR199802416T2; CZ295531B6; ATE361364T1; ES2286831T3; EA004329B1; NZ333083A; KR100741452B1; AU729081B2

Description

Oblast techniky

Tento vynález se vztahuje na členy vázající se specificky na zárodečnou izoformu fibronektinu označovanou ED-B, kterou také exprimují vyvíjející se neovaskulární nádory, jak se dá prokázat cestou imunocytochemie a cíleným zaváděním do nádorů in vivo. Vynález se dále popisuje materiály a metody, které se vztahují k těmto specificky se vázajícím členům.

Dosavadní stav techniky

Primárním cílem většiny existujících forem terapie nádorů je usmrtit co nejvíce konstitutivních buněk nádoru, jak jen je možné. Omezeného úspěchu se dosáhlo metodami chemoterapie a radioterapie, který závisí na relativním štěstí, co se týká specifiky léčby. Tyto metody jsou doprovázeny toxickými vedlejšími účinky, které postihují normální zdravé tkáně. Jednou z cest, jak lze dosáhnout zlepšení selektivity léčby nádorů je zavedení činidla přímo do nádoru pomocí vazebných proteinů, které obvykle obsahují vazebné domény protilátek a jsou specifické pro markerový antigen, jenž se exprimuje na povrchu nádoru, ale nenachází se na normálních buňkách. Tato forma cílové terapie, která se nazývá magie bullets se hlavně demonstruje pomocí • · monoklonálních protilátek (mAbs), které pochází z hlodavců a které jsou specifické pro tak zvané antigeny spojené s nádory. Tyto antigeny se exprimují na povrchu buněk. Takové monoklonální protilátky se spojují s cytotoxickou látkou chemickou cestou (např. toxin nebo lék) nebo se mohou produkovat jako rekombinantí fúzní protein, kde geny kódující mAb a toxin jsou spojeny a exprimují se v tandemu.

Přístup označovaný magie bullet má omezený, ačkoli podstatný, účinek při léčbě lidské rakoviny, zvláště při zavádění do nádorů lymfotického původu, kde maligní buňky jsou nejpřístupnější terapeutické dávce během cirkulace. Léčba pevných nádorů však zůstává vážným klinickým problémem. Tento problém spočívá v tom, že pouze malá část celkové buněčné masy, převládají nejperifernější buňky nádoru, je vystavena cirkulujícím terapeutickým imunokonjugantům; tyto periferní cíle tvoří tak zvanou bariéru vazebných míst vnitřní části nádoru (Juweid et al., 1992, Cancer Res. 52, 5144-5153) . V nádoru je tkáň obecně velmi hustá, tvoří ho vláknitá podpůrná tkáň a nádorové buňky, které jsou umístěné velmi blízko sebe, což umožňuje penetraci molekul v rozmezí velikostí odpovídající protilátkám. Nádory jsou však známy, že mají zvýšený intersticiální tlak, za který odpovídá nedostatek lymfatických cév, což ohrožuje přístup exogenních molekul. V publikaci Jain, R (1994), Sci. Am. 271 58-65 se popisují faktory, které ovlivňují vstup terapeutických činidel do nádorů.

Ačkoli existuje zřejmé omezení při léčbě nádorů pomocí cíleného zavádění antigenu do nádorů, tyto nádory mají běžný rys, který poskytuje alternativní antigenní cíl pro protilátkovou terapii. Jestliže nádory dorostou do určité velikosti, jsou univerzálně závislé, aby si udržely přívod kyslíku a nutrientů pro svůj růst, na nezávislém přísunu krve. V případě, že tato dodávka krve je zablokována nebo • 9 uzavřena, existuje realistický potenciál vyhladovět tisíce nádorových buněk. Jak se nádor vyvíjí, přechází na angiogenní fenotyp, přičemž produkuje odlišný soubor angiogenních faktorů, které působí na okolní endoteliální buňky kapilár, přičemž se indukuje jejich množení a migrace. Struktura těchto nově vytvořených krevních cév, na rozdíl od uspořádané struktury kapilár v normální tkáni, je vysoce neorganizovaná se slepými konci a s perforacemi, které vedou k únikům. Indukce angiogeneze je doprovázena neregulovanou expresí jistých buněčných povrchových antigenů, kdy řada z nich jsou běžné při vaskularizaci normální tkáně. Identifikované antigeny, které se vyskytují pouze při neovaskularizaci nádorů, jsou hlavním limitujícím faktorem při vývoji generické léčby pevných nádorů prostřednictvím vaskulárního cíleného zavádění. Antigen, který je předmět tohoto vynálezu přímo souvisí s tímto problémem.

Během vývoje nádoru se extracelulární matrice okolní tkáně remodeluje dvěma hlavními postupy: (1) proteolytická degradace komponentů extracelulární matrice normální tkáně a (2) de novo syntéza komponentů extracelulární matrice nádorovými buňkami a buňkami podpůrné tkáně, která se aktivuje nádorem indukovanými cytokíny. Tyto dva postupy generují nádorovou extracelulární matrici, která poskytuje vhodnější prostředí pro vývoj nádoru a kvantitativně a kvalitativně se liší od prostředí normálních tkání. Mezi komponenty uvedené matrice jsou velké izoformy tenaskinu a fibronektinu (FN); popis těchto proteinů, jako izoforem uvádí jejich rozsáhlou strukturální heterogenitu, která se získá na stupni transkripce, post-transkripčního a post-translačního zpracování (uvedeno dále v textu). Předmětem vynálezu je jedna izoforem fibronektinu, která se nazývá izoforma B+ (BFN) .

• ·

Fibronektiny (FN) mají více funkcí. Glykoproteiny s vysokou molekulovou hmotností tvoří extracelulární matrice a tělní kapaliny. Podílejí se na řadě různých biologických postupů, jako je zajištění a udržení normální buněčné morfologie, migrace buněk, haemostáze a trombózy, hojení ran a onkogenní transformace (popisuje se v publikacích Alitalo et al. , Adv. Cancer Res. 37, 111-158 (1982); Yamada, 1983; Hyneš Ann., Rev. Cell Biol. 1, 67-90 (1985); Owens et al., Oxf. Surv. Eucaryot. Genes 3, 141-160 (1986);). Strukturální diverzita FN se získá alternativním sestřihem tří oblastí (ED-A, ED-B a IIICS) primárního transkriptu FN (Hyneš Ann., Rev. Cell Biol. 1, 67-90 (1985); Zardi et al. , EMBO J. 6, 2337-2342 (1987), aby vzniklo nejméně 20 různých izoforem, přičemž některé z nich se odlišně exprimují v nádoru nebo v normální tkáni. Stejně jako regulace tkáňově a vývojově specifickým způsobem je známo, že patern sestřihu FN-pre-mRNA je v transformovaných a maligních buňkách deregulován (Castellani et al., J. Cell. Biol. 103, 1671-1677 (1986); Borsi et al., J. Cell. Biol. 104, 595-600 (1987); Vartio et al. , J. Cell Science 88, 419-430 (1987), Zardi et al. , EMBO J. 6, 2337-2342 (1987); Barone et al., EMBO J. 8, 1079-1085 (1989); Carnemolla et al., J. Cell Biol. 108, 1139-1148 (1989); Oyama et al., J. Biol. Chem. 10331-10334 (1989); Oyama et al., Cancer Res. 50, 1075-1078 (1990); Borsi et al., Exp. Cell Res. 199, 98-105 (1992b)). Izoformy FN obsahující sekvence ED-A, ED-B a IIICS se exprimují ve větším rozsahu v transformovaných buňkách a v buňkách maligních nádorů. Zvláště izoforma FN obsahující sekvenci ED-B (B+ izoforma) se silně exprimuje v zárodečné a nádorové tkáni, stejně jako během hojení ran, ale exprese je omezena v normálních dospělých tkáních (Norton a Hyneš, Mol. Cell. Biol. 7, 42974307 (1987); Gutman a Kornblihtt, Proč. Nati. Acad. Sci USA 90 7179-7182, 1987; ); Carnemolla et al., J. Cell Biol. 108, • · · · • · · · • · · · • · · · · · • · ·

1139-1148 (1989); Ffrench-Constant et al., J. Cell Biol. 109, 903-914 (1989); Ffrench-Constant et al., Development 106, 375-388 (1989); Laitinen et al., Lab. Invest. 64, 375-388 (1991)). Molekuly B+ FN nejsou v dospělých cévách detekovatelné, ale při normálním (např. vývoj endometria), patologickém (např. při diabetické retinopatii) a nádorovém vývoji (Castellani et al. , Int. J. Cancer 59, 612-618 (1994) angiogenních krevních cév je jejich množství vysoké.

Sekvence ED-B je celá homologní repetice typu III, která je kódovaná jediným exonem a obsahuje 91 aminokyselin. Narozdíl od alternativně sestřihané izoformy IIICS, která obsahuje vazebné místo specifické k buněčnému typu, biologická funkce izoforem A+ a B+ je stále předmětem spekulace (Humphries et al., J. Cell Biol. 103, 2637-2647 (1986) .

Samotná přítomnost izoformy B+ tvoří nádorem indukovaný neoantigen, ale navíc exprese ED-B vyjadřuje normálně kryptický antigen v repetici 7 typu III (předcházející EDB);protože tento epitop není v molekulách FN, kterým chybí ED-B, vyjádřen, což umožňuje, že exprese ED-B indukuje přímou a nepřímou expresi neoantigenů. Toto kryptické antigenní místo tvoří cíl monoklonálních protilátek (mAb), které se nazývají BC-1 (Carnemolla et al., J. Biol. Chem. 24689-24692 (1992). Specifita a biologické vlastnosti těchto mAb se popisují v EP 0 344 134 Bl a je možné získat z hybridomů uloženého v instituci European Collection of Animal Cell Cultures, Porton Down, Salisbury, UK s přístupovým číslem 88042101. Monoklonální protilátky se úspěšně používají při lokalizaci angiogenních krevních cév nádorů, aniž zkříženě reagují s dospělým vaskulárním endoteliem, což ukazuje potenciál izoforem FN při vaskulárním cílovém zavádění za použití protilátek.

• · • · · · · · • · · ·· « ·

Stále však existují jisté námitky a to ke specificitě monoklonálních protilátek BC-1. Na základě skutečnosti, že BC-1 přímo nerozeznávají izoformu B+, vyvstala otázka, zda v některých tkáních je možné odmaskovat epitop, který je rozpoznáván protilátkami BC-1, aniž je přítomna ED-B, což vede nepřímo k nechtěné zkřížené reaktivitě BC-1. Dále BC-1 je přísně specifický pro lidskou izoformu B+, což znamená, že studie biodistribuce BC-1 u zvířat a jejich lokalizace v nádoru není možná. Ačkoli se produkují polyklonální protilátky proti rekombinantím fúzním proteinům, které obsahují izoformu B+ (Peters et al., Cell. Adhes. Commun. 3, 67-89 (1995), reagují pouze s FN, na které se aplikovala Nglykanáza za účelem odkrytí epitopu.

Další obecný problém s použitím myších monoklonálních protilátek je odezva na anti-myší protilátky u lidí (HAMA) (Schroff et al. , 1985, Cancer Res. 45 :879-885; Dejager et al. , (1988), Proč. Am. Assoc. Cancer Res. 29:377). HAMA odezva má rozmezí účinků od neutralizace aplikovaných protilátek, které vedou ke snížení terapeutické dávky, alergickou reakci, sérové onemocnění a renální poškození.

Ačkoli se určily polyklonální antiséra reagující s rekombinantí ED-B (uvedeno shora v textu), izolace mAbs se stejnou specifikou jako BC-1 následující po imunizaci myší byla obecně zlepšena, protože lidské a myší proteiny ED-B vykazují 100 % sekvenční homologii. Lidský protein může proto vystupovat jako myší samoantigen, který pak nezesiluje imunitní odezvu. Ve skutečnosti po několika letech usilovného bádání se identifikovaly pouze jediné mAb s nepřímou reaktivitou k FN izoformě B+ (BC-1), které přímo nerozeznávají ED-B. Většinou je podstatné, že specificita ΒΕΙ se pro kryptický epitop vyjadřuje jako konsekvence ED-B, spíše než část samotného ED-B, který není pravděpodobně přítomen v myších FN a proto se nezdá být samotným myším imunitním systémem.

Realizace vynálezu se dosáhlo použitím strategie, která je alternativní k té používané dříve a kde předchozí imunizace s fibronektinem nebo ED-B není nutná: získaly se protilátky se specifitou pro izoformu ED-B, jako jeden řetězec Fvs (scFvs) z knihoven lidských protilátek variabilních oblastí vyjádřených na povrchu vláknitého bakteriofága (Nissim et al., EMBO J. 13, 692-698 (1994), dále také WO 92 / 01407, WO 92 / 20791, WO 93 / 06213, WO 93 / 11236, WO 93 / 19172) .

Je známé použití protilátkové fágové knihovny, kde se mohou izolovat specifické csFvs přímou selekcí rekombinantích fragmentů, které obsahují doménu ED-B a samotné ED-B, kdy tyto antigeny potahují pevný povrch (panning). Uvedené zdroje antigenu se s úspěchem použily při produkci druhé generace scFvs s vylepšenými vlastnostmi příbuznými s rodičovskými klony v procesu afinitní maturace. Zjistilo se, že izolované scFvs silně a specificky reagují s izoformou B+ lidského FN, aniž se předem aplikuje N-glykanáza.

Při anti-nádorových aplikacích lidské vazebné domény protilátkového antigenu podle vynálezu mají tu výhodu, že nejsou subjektem odezvy HAMA. Dále, jak se zde uvádí, používají se při imunohistochemické analýze nádorové tkáně způsobem in vivo a in vitro. Tyto a další použití jsou v oboru známa.

Terminologie

Specificky se vázající člen.

Termín popisuje člena páru molekul, které mají vzájemnou vazebnou specifitu. Členové specifického vazebného páru se mohu získat přirozenou cestou nebo se mohou zcela nebo zčásti syntetizovat. Jeden člen páru molekul má na svém povrchu oblast nebo dutinu, prostřednictvím které se váže na určitou prostorovou a polární organizaci dalšího člena páru molekul. Pak členové páru molekul se vzájemně specificky vážou jeden k druhému. Příklady typů specificky se vázajících párů jsou dvojice antigen-protilátka, biotin-avidin, receptor hormonhormon, receptor-ligand, enzym-substrát.

Protilátky.

Termín protilátky popisuje imunoglobulin produkovaný přirozeným způsobem nebo částečně nebo zcela syntetický. Termín také zahrnuje polypeptid nebo protein, který má vazebnou doménu, která je protilátkovou vazebnou doménou nebo je s ní homologní. Protilátky se dají získat z přirozených zdrojů nebo se mohou částečně nebo zcela syntetizovat. Příklady protilátek jsou imunoglobulinové izotypy a jejich izotypické podtřídy; fragmenty, které obsahují doménu vázající antigen, jako je Fab, scFv, Fv, dAb, Fd; a diabody.

Je možné vzít monoklonáiní a jiné protilátky a za použití metod genového inženýrství vytvořit jiné protilátky nebo chimérické molekuly, které si ponechávají specifitu původních protilátek. Takové metody například mohou zahrnovat zavedení DNA kódující variabilní oblast imunoglobulinu nebo oblasti určující komplementaritu (CDR) protilátek proti konstatním oblastem nebo konstantním oblastem plus rámcovým oblastem odlišného imunoglobulinu, což se popisuje například v EP-A-184187, GB 2188638A nebo EP-A-239400. Hybridom nebo jiné buňky, které produkují- protilátky se mohou stát předmětem genových mutací nebo jiných změn, které mohou nebo nemusí pozměnit vazebnou specifitu produkovaných protilátek.

Protilátky se mohou modifikovat řadou způsobů. Termín protilátky zahrnuje specificky se vázající členy nebo látky, které mají vazebnou doménu s požadovanou specifitou.

• 9 · ···

Dále zahrnují fragmenty protilátek, deriváty, funkční ekvivalenty a homology protilátek, libovolný polypeptid obsahující vazebnou doménu imunoglobulinu, ať už jsou připraveny přirozenou cestou nebo zčásti nebo zcela syntetizovány. Dále zahrnují chimérické molekuly obsahující vazebnou doménu imunoglobulinu nebo ekvivalentu fúzovaného s jiným polypeptidem. Klonování a exprese chimérických protilátek se popisují v EP-A-0120694 a EP-A-0125023.

Zjistilo se, že fragmenty celých protilátek vykonávají funkcí navázání antigenů. Příklady vazebných fragmentů jsou (i) Fab fragment obsahující VL, VH, CL a CH1 domény; (ii) Fd fragment obsahující domény VH a CH1; (iii) fragment Fv obsahující domény VL a VH jedné protilátky; (iv) fragment dAb (Ward, E. S. et al. , Nátuře 341, 544-546 (1989), který obsahuje doménu VH; (v) izolované oblasti CDR; (vi) fragmenty F(ab')2, což jsou bivalentní fragmenty obsahující dva spojené fragmenty Fab, (vii) jednořetězcové molekuly Fv (scFv), kde doména VH a VL jsou spojeny peptidovým linkerem, který umožňuje spojení dvou oblastí za vytvoření vazebného místa pro antigen (Bírd et al., Science, 242, 423-426. (1988), (viii) bispecifické jednořetězcové diméry Fv (PCT/US92/09965) a (ix) diabodies, což jsou multivalentní a multispecifické fragmenty konstruované fúzí genů (WO 94/13804; Holliger et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, 1993).

Diabodies jsou multiméry polypeptidů, kde každý polypeptid obsahuje první doménu, která zahrnuje vazebnou oblast lehkého řetězce imunoglobulinu, a druhou doménu , jenž zahrnuje vazebnou oblast těžkého řetězce imunoglobulinu. Tyto dvě domény jsou spojeny (např. peptidovým linkerem), ale nejsou schopny se spojit vzájemně za vzniku vazebného místa pro antigen: vazebná místa pro antigen se tvoří spojením první domény jednoho polypeptidů v multiméru s druhou doménou jiného polypeptidů v multiméru (WO 94/13804).

V případě, že se používají bispecifické protilátky, mohou to být běžné bispecifické protilátky, které se mohou vyrábět různými způsoby (Holliger, P. a Winter G., Current Opinion Bitechnol. 4, 446-449 (1993)) například chemickou cestou nebo z hybridních hybridomů nebo to mohou být libovolný ze shora zmíněných bispecifických protilátkových fragmentů. Může se preferovat spíše použití dimérů scFv nebo diabodies než celých protilátek. Diabodies a scFv se mohou konstruovat bez oblasti Fc, za použití pouze variabilních oblastí, které silně redukují účinky antiidiotypické reakce. Jiné formy bispecifických protilátek zahrnují jeden řetězec Janusins popsaný v publikaci Traunecker et al., Embo Journal, 10, 3655-3659, (1991).

Bispecifické diabodies narozdíl do bispecifických celých protilátek se mohou také zvláště používat, protože jejich konstrukce a exprese v bakteriích E.coli je snadná. Snadno se mohou vybrat diabodies (a řada jiných polypeptidů, jako jsou fragmenty protilátek) vhodné vazebné specifity za použití fágové knihovny (WO 94/13804). V případě, že jedno rameno diabody se udržuje konstantní, například se specifitou řízenou proti antigenů X, může se pak vytvořit knihovna, kde další rameno je variabilní a vyberou se protilátky s vhodnou specifitou.

Vazebná doména pro antigen

Tento termín popisuje část protilátek, která obsahuje oblast, která se specificky váže na část nebo na celý antigen a je s ním komplementární. V případě, že antigen je velký, protilátka se může vázat pouze na jeho část, která se nazývá epitop. Vazebná doména pro antigen může tvořit jedna nebo více variabilních domén protilátek. Upřednostňuje se, aby vazebná doména pro antigen byla variabilní oblast (VL)

lehkého řetězce protilátek a variabilní oblast (VH) těžkého řetězce protilátek.

Specifický

Termín specifický označuje situaci, kdy jeden člen specifického vazebného páru nevykazuje žádnou podstatnou vazbu s dalšími molekulami, než je jeho specifický vazebný partner. Termín se dá také využít v případě, že například vazebná doména pro antigen je specifická pro určitý epitop, který je nesen řadou antigenů, v takovém případě specifický vazebný člen nesoucí vazebnou doménu pro antigen bude schopen vázat různé antigeny, jenž nesou epitop.

Funkčně ekvivalentní forma varianty.

Tento termín zahrnuje molekulu (variantu), která ačkoli vykazuj e molekulou homologii strukturální odlišnosti ve srovnání mou (rodičovskou), rodičovské molekuly, antigen nebo epitop.

si stále uchovává podstatnou a také nejméně některou z biologických funkcí např. schopnost vázat se na určitý Varianty se mohou vyskytovat ve formě fragmentů, derivátů nebo mutantů. Varianta, derivát nebo mutant se může získat modifikací rodičovské molekuly adicí, delecí, substitucí nebo inzercí jedné nebo více aminokyselin nebo spojením s jinou molekulou. K těmto změnám může dojít na úrovni nukleotidu nebo proteinu. Kódovaným polypeptidem může být například fragment Fab, který se pak naváže na ocas FC z jiného zdroje. V jiném případě se může navázat markér, jako je například enzym, fluorescein atd..

Podstata vynálezu

Vynález popisuje specificky se vázajícího člena, který je specifický pro onkofoetální doménu fibronektinu (FN) ED-B.

Specificky se vázající členy podle vynálezu se vážou na doménu ED-B přímo. V jednom provedení vynálezu specificky se vázající členy se vážou po aplikaci proteázové termolyzinu na FN na libovolný nebo na všechny FN, které obsahují ED-B. V dalším provedení vynálezu se specificky se vázající členy váží na libovolný nebo všechny FN, které obsahují homologní repetice typu III, které zahrnují doménu ED-B. Známé FN se popisují ve dvou publikacích Carnemolla et al., J. Biol. Chem. 24689-24692 (1992) a Carnemolla et al. , J. Cell Biol. 108, 1139-1148 (1989). Odkaz na všechny FN, které obsahují ED-B se může brát jako odkaz na všechny FN popsané v této publikaci, které obsahují ED-B.

Specificky se vázající člen přednostně váže lidský ED-B a přednostně B+FN nejméně jedné další specie, jako je myš, krysa a/nebo kuře. Upřednostňuje se, aby specificky se vázající člen páru byl schopen vázat jak lidskou tak nelidskou ED-B fibronektinu, jako je myší ED-B, což umožňuje testování a analýzu sbp člena ve zvířecím modelu.

Specificky se vázající párový člen podle vynálezu váže ED-B fibronektinu , aniž dojde k soutěžení s běžně dostupnými uloženými protilátkami BC-1, které se popisují dále v textu.

Specificky se vázající párové členy podle vynálezu se nevážou na stejný epitop jako BC-1.

Navázání specificky se vázajícího člena podle vynálezu se může inhibovat doménou ED-B.

S ohledem na vynález vazebná doména vykazuje, jestliže se měří jako čištěný monomer, hodnotu disociační konstanty (Kd) 6 x ΙΟ^-8 M nebo v případě ED-B FN menší.

V souladu s vynálezem vazebná doména reaguje, což znamená je schopna se vázat, s ED-B fibronektinu, aniž se EDB fibronektinu předem upraví N-glykanázou.

Specificky se vázající párový členy podle vynálezu se mohou připravovat jako izoláty nebo v čištěné formě.

• ·

Připravují se do formulací nebo přípravků, které neobsahují jiné specificky se vázající párové členy, například protilátky nebo jejich fragmenty nebo neobsahují jiné specificky se vázající párové členy, které jsou schopny vázat ED-B fibronektinu. Upřednostňuje se, aby specificky se vázající párové členy podle vynálezu se připravovaly v podstatě čisté formě. Mohou být monoklonální ve smyslu pocházet z jednoho klonu, spíše než se omezit na protilátky, které se získaly použitím tradiční technologie hybridomů. Jak se uvedlo, specificky se vázající párové členy podle vynálezu se mohou získat za použití technologie vyjádření bakteriofága a/nebo exprese v rekombinantích, například v bakteriálních, hostitelských buňkách. Neexistuje prioritní požadavek na monoklonální specificky se vázající párové členy podle vynálezu, které přímo vážou ED-B fibronektinu.

Upřednostňuje se, aby specificky se vázající člen obsahoval protilátky. Specificky se vázající člen může obsahovat polypeptidovou sekvenci ve formě fragmentu protilátek, jako je jediný řetězec Fv (scFV) . Mohou se také využívat jiné typy fragmentů protilátek, jako jsou Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Facb nebo diabody (Winter, G a C. Milstein, Nátuře 349, 293-299, 1991; WO 94/13804). Specificky se vázající člen může být ve formě celých protilátek. Celé protilátky mohou být v libovolné z forem protilátkových izotypů např. IgG, IgA, IgD, IgE a IgM a v libovolných formách izotypových podtříd, například IgGl nebo IgG4.

Protilátky mohou být libovolného původu, například lidské, myší, ovčí. Jiné odvození je v oboru dobře známo. Upřednostňuje se, aby protilátky byly lidského původu. Termín lidský znamená protilátky, které se částečně nebo zcela získaly z lidské cDNA, proteinové nebo peptidové knihovny. Tento termín zahrnuje lidské peptidy a proteiny, které nemají lidský původ, jenž se modifikovaly za účelem si ponechat lidské charakteristiky k molekule protilátek a tak umožňují molekule obejít obranu lidského imunitního systému.

Specificky se vázající člen se může také vyskytovat ve formě manipulovaných protilátek, například ve formě bispecifické molekuly protilátek (nebo fragment, jako je F(ab')2), která má jedno rameno vázající antigen (to je specifickou doménu) proti ED-B fibronektinu a další rameno proti odlišné specifitě, nebo bivalentní nebo multivalentní molekulu.

Vedle sekvencí protilátek specificky se vázající člen může obsahovat jiné aminokyseliny, např. mohou tvořit peptid nebo polypeptid nebo mohou udílet molekule vedle schopnosti vázat antigen další funkční charakteristiku. Specificky se vázající člen může například obsahovat značku, enzym nebo jeho fragment a tak dále.

Vazebná doména může obsahovat část nebo celou doménu VH kódovanou segmentem zárodečné linie nebo znovu uspořádaného genového segmentu. Vazebná doména může obsahovat část nebo celou doménu VL kappa nebo VL lambda.

Vazebná doména může obsahovat VH1, VH3 nebo VH4 genové sekvence zárodečné linie nebo jejich znovu uspořádanou formu.

Specificky se vázající člen podle vynálezu může obsahovat těžký řetězec variabilní oblasti (VH oblasti) získaný z lidské zárodečné linie DP74, sekvenci, která je zobrazena na obr. č. 1(a) , zbytky 1 až 98. Nomenklatura DP se popisuje v publikaci Tomlinson I. M. et al. , (1992) J. Mol. Biol.227: 776-798.Aminokyselinová sekvence CDR3 může být Ser Leu Pro Lys. Aminokyselinová sekvence CDR3 může být Gly Val Gly Ala Phe Arg Pro Tyr Arg Lys His Glu. Pak vazebná doména specificky se vázajícího člena podle vynálezu může zahrnovat VH doménu, která obsahuje aminokyselinové sekvence na obr. č. 1(a) pro CGS1 a CGS2.

• ·

Vazebná doména může obsahovat variabilní oblast lehkého řetězce (VL doménu) získanou z lidské zárodečné linie DPL6, sekvenci, která je zobrazena na obr. č. 1(b) jako kodony 1 až 90.

Doména VL může obsahovat sekvenci CDR3 Asn Ser Ser Pro Val Val Leu Asn Gly Val Val. Doména VI může obsahovat sekvenci CDR3 Asn Ser Ser Pro Phe Glu His Asn Leu Val Val.

Specificky se vázající členy podle vynálezu mohou obsahovat funkčně ekvivalentní varianty sekvencí, které jsou zobrazeny na obr. č. 1, např. kde se začlenily, deletovaly, substituovaly nebo přidaly jedna nebo více aminokyselin, což poskytlo uvedené vlastnosti. Může se změnit sekvence CDR3 nebo se může provést jedna nebo více změn v rámcových oblastech nebo rámec může být nahrazen jinou rámcovou oblastí nebo modifikovanou formou za vzniku specifického vazebného člena, který váže ED-B.

Jeden nebo více CDR z domén VI nebo VH zde popsaných protilátek, které vážou antigen, se může použít při tzv. implantaci CDR, při které je jedna nebo více sekvencí CDR prvních protilátek umístěna do sekvencí rámce, který nesouvisí s protilátkami, např. jiných protilátek, jak se popisuje v EP-B-0239400. CDR sekvence pro CGS1 a CGS2 jsou uvedeny na obr. č. l(a) a 1(b).

Specificky se vázající člen podle vynálezu může být ten, který při vazbě s ED-B fibronektinu konkuruje protilátkám nebo zde popsanému scFv. Konkurence mezi specificky se vázajícími členy se může jednoduše testovat in vitro, například připojením specifické reportní molekuly k jednomu specificky se vázajícímu členu, který se může detekovat v přítomnosti jiných nepřipojených vazebných členů, což umožňuje identifikaci specificky se vázajícího člena, který se váže na stejný epitop nebo přesahující epitop.

·· ····

Specificky se vázající člen podle vynálezu se může využít při metodě, která způsobuje nebo umožňuje vazbu specificky se vázajícího člena na jeho epitop. Navázání může následovat po aplikaci specificky se vázajícího člena savci, například člověku nebo hlodavci, jako je myš.

Vynález popisuje použití specificky se vázajícího člena jako diagnostického činidla v případě nádorů. Experimentální důkaz na zvířecím modelu, jak se popisuje dále v textu, ukazuje, že specificky se vázající členy podle vynálezu se používají při in vivo lokalizaci nádoru.

Preferovanými specificky se vázajícími členy podle vynálezu jsou ty, které se váži na lidské nádory, například v sekci kryostatu, které vykazují invazivní a angiogenní fenotyp a které se vážou na embryonální tkáně, např. v sekci kryostatu. Navázání se může demonstrovat imunocytochemickým barvením.

V preferovaném provedení vynálezu se specificky se vázající člen neváže nebo se v podstatě neváže na tenaskin, což je extracelulární matricový protein.

V jiném preferovaném provedení vynálezu se specificky se vázající člen neváže na nebo se v podstatě neváže na normální lidskou kůži, například v sekci kryostatu a/nebo jak se demonstrovalo použitím imunocytochemického barvení.

Další provedení specificky se vázajících členů podle vynálezu se neváže nebo se v podstatě neváže na jeden nebo více normálních tkání (např. v sekci kryostatu a/nebo jak se demonstruje použitím imunocytochemického barvení) vybraných ze skupiny, která zahrnuje játra, slezinu, ledviny, žaludek, tenké střevo, tlusté střevo, vaječníky, děloha, močový měchýř, pankreas, suprarenální žlázy, skeletový sval, srdce, plíce, štítná žláza a mozek.

Specificky se vázající člen pro ED-B se může použít jako činidlo pro cílové zavádění in vivo, které se může použít při demonstraci přítomnosti a lokalizace nádorů, které exprimují nebo jsou jinak spojeny s ED-B fibronektinu. Mohou se používat jako zobrazovací činidlo. Vynález popisuje metodu stanovení přítomnosti buňky nebo nádoru, který exprimuje nebo je jinak spojen s expresí ED-B fibronektinu, přičemž způsob zahrnuje kontakt buněk se specificky se vázajícím členem a stanovení navázání specificky se vázajícího člena na buňky. Způsob se může uskutečnit in vivo nebo in vitro na testovacím vzorku buněk, které se izolovaly z těla.

Reaktivita protilátek v buněčném vzorku se může stanovit vhodným způsobem. Jedna z možností je označení s jednotlivými reportními molekulami. Reportni molekuly mohou přímo a nepřímo generovat detekovatelný a přednostně měřitelné signály. Spojení reportních molekul může být přímé nebo nepřímé, kovalentní, například prostřednictvím peptidové vazby nebo nekovalentní. Spojení prostřednictvím peptidové vazby může být jako výsledek rekombinantí exprese genové fúze, která kóduje protilátky a reportni molekulu.

Jedním z výhodných spojení je kovalentní spojení každé protilátky a jediným fluorochromem, fosforem nebo laserovým barvivém se spektrálně izolovanými absorpčními nebo emisními charakteristikami. Mezi vhodné fluorochromy patří fluoroscein, rhodamin, fykoerytrin a texasová červeň. Vhodná chromogenní barviva zahrnují diaminobenzidin.

Jiné reportni molekuly zahrnují makromolekulové koloidní partikule nebo částicový materiál, takový jako jsou latexové kuličky, které jsou obarvená, magnetická nebo paramagnetická a biologicky nebo chemicky aktivní činidla, která mohou přímo nebo nepřímo způsobovat detekovatelné signály, aby mohly být pozorovány vizuálně, elektronicky detekovatelné nebo jinak zaznamenávány. Těmito molekulami mohou být například enzymy, které katalyzují reakce, které vyvíjí nebo mění barvy a způsobují změny elektrických vlastností. Molekuly mohou být ·· ···· molekulárně excitabilní tak, že elektronická transitace mezi charakteristické spektrální energetickými stádii vede k absorpci nebo emisi. Mohou používané ve spojení s biosenzory. Jsou to biotin/avidin nebo biotin/streptavidin a detekční založené na alkalické fosfatáze.

Mód stanovující vazbu není rysem vynálezu a odborník je schopen vybrat vhodný mód na základě svých preferencí a obecných znalostí.

Signály generované jednotlivými konjugáty protilátkareportní molekula se mohou použít k získáni kvantifikovatelných absolutních relevantního navázání protilátek (normálních a testovaných). Navíc při použití obecného barvení jádra je možné stanovit ve vzorku celkovou buněčnou populaci, což umožňuje stanovit kvantitativní poměry jednotlivých buněčných populací vztahujících se k celkovému zahrnovat chemické entity spoj ení systémy nebo relativních dat v buněčných vzorcích počtu buněk. V případě že se radioaktivně značené nukleotidy I, In nebo ^mTc připojí k protilátkám, pak se tyto protilátky přednostně lokalizují v nádoru spíše než v radioaktivních značek v a kvantifikovat za použití normálních tkáních. Přítomnost nádorové tkáni se může detekovat gama snímače. Kvalita získaného zobrazení nádoru je přímo koreluje s poměrem signál : zvukový signál.

Protilátky se mohou používat jako diagnostická činidla pro sledování nově vaskularizovaných nádorů a mohou se také používat, např. v modifikované formě, pro zavedení cytotoxických činidel nebo při koagulaci v nových krevních cévách, přičemž vyvíjející se nádory trpí nedostatkem kyslíku a nutrientů a tvoří tak nepřímou formu terapie nádoru.

Vynález dále popisuje použití shora specifikovaného specificky se vázajícího člena, který se používá jako terapeutické činidlo při spojování, vázání nebo manipulaci • · ···· metodě která jako fúzní protein, aby získal funkci efektoru. Specificky se vázající člen podle vynálezu se může použít pro cílené zavedení toxinu, radioaktivních látek, T-buněk,smrtících buněk nebo jiných molekul do nádoru, který exprimuje nebo je spojen s antigenem ve středu zájmu.

Vynález dále popisuje způsoby léčby, které zahrnují aplikaci specificky se vázajícího člena, farmaceutických kompozic obsahující takový specificky se vázající člen a použití uvedeného specificky se vázajícího člena při výrobě medikamentu vhodného pro aplikaci, například při přípravy medikamentu nebo farmaceutické kompozice, obsahuje specificky se vázající člen s farmaceuticky přijatelným excipientem.

V souladu s vynálezem se mohou uvedené kompozice aplikovat jednotlivcům. Přednostně se aplikuje terapeuticky účinné množství, které je pro pacienta přínosem. Takový přínos může být přinejmenším zlepšení nejméně jednoho symptomu. Aktuální aplikované množství rychlost a časový průběh aplikace závisí na povaze a stavu onemocnění, které se léčí. Zodpovědnost za předpis léčby, například rozhodnutí o dávce atd., nesou praktičtí lékaři a jiní terapeuti. Vhodná dávka protilátek je v oboru dobře známa, uvádí se v publikaci Ledermann J. A. et al., (1991) Int. J. Cancer47: 659-664; Bagshawe K. D. et al. , (1991) Antibody, Immunokonjugates and

Radiopharmaticals 4: 915-922.

Kompozice se může aplikovat samotná nebo v kombinaci s jinou léčbou, buď současně nebo sekvenčně, což závisí na léčeném stavu.

Farmaceutické kompozice podle vynálezu a jejich použití v souladu s vynálezem může obsahovat vedle aktivní složky, farmaceuticky přijatelný excipient, nosič, pufr, stabilizátor nebo jiné materiály, které jsou dobře známy v oboru. Takové materiály by neměly být toxické a neměly by interferovat s • d ···· ·· ·· * · · · • · ·· e · • · · 9999 99

999 · ·

9 · účinností aktivní ingredience. Přesná povaha nosiče nebo jiného materiálu závisí na způsobu aplikace, která může být orální nebo injekcí např. intravenózní.

Farmaceutické kompozice pro orální aplikaci může být v tabletové, kapslové, práškové a kapalné formě. Tableta může obsahovat pevný nosič, jako je želatina nebo adjuvans. Kapalné farmaceutické kompozice obecně obsahují kapalný nosič, jako je voda, nafta, živočišné nebo rostlinné oleje, minerální olej nebo syntetický olej. Může se používat fyziologický roztok, dextróza nebo roztok jiný sacharidový roztok nebo glykoly, jako je etylenglykol, propylenglykol nebo polyetylenglykol.

Při intravenózní injekci nebo injekci do místa aplikace bude aktivní ingredience ve formě parenterálně přijatelného vodného roztoku, který neobsahuje žádné pyrogeny a má vhodné pH, je vhodně izotonický a stabilní. Odborníci jsou schopni snadno připravit vhodné roztoky za použití například solí, jako je například injekce chloridu sodného, Ringerova injekce, Laktátová Ringerova injekce. Roztoky mohou zahrnovat konzervační činidla, stabilizátory, pufry, antioxidanty a/nebo jiná aditiva, je-li to nutné.

Specificky se vázající člen podle vynálezu se může připravit expresí z nukleové kyseliny, která ho kóduje. Nukleová kyselina kódující specificky se vázající člen umožňuje způsob produkce uvedeného specificky se vázajícího člena, který zahrnuje expresi této kódující nukleové kyseliny. Exprese lze běžně dosáhnout kultivací rekombinantích hostitelských buněk, které obsahují uvedenou nukleovou kyselinu, za vhodných podmínek.

Nukleová kyselina může kódovat libovolné zde uvedené aminokyselinové sekvence domén protilátek vázající antigen nebo libovolnou funkčně ekvivalentní formu. Změny se mohou provést na úrovni nukleotidů adicí, substitucí, delecí nebo inzercí jednoho nebo více nukleotidů. Tyto změny se mohou nebo nemusí odrazit na úrovni aminokyseliny v závislosti na degeneraci genetického kódu.

různých

Systémy klonováni a exprese polypeptidu hostitelských buněk jsou dobře známy. Vhodné hostitelské buňky zahrnují bakterie, savčí buňky, kvasinky a bakuloviry. Savčí buněčné linie, které jsou dostupné pro expresi heterogenního polypeptidu zahrnují buňky vaječníků čínských morčat, buňky HeLa, ledvinové buňky novorozených morčat a mnoho dalších. Běžným preferovaným bakteriálním hostitelem je

E. coli.

Exprese protilátek a fragmentů protilátek v prokaryontních buňkách, jako jsou bakterie E. coli, je v oboru dobře zavedena. Přehled informací je uveden v publikaci Plůckthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991). Při produkci specificky se vázajícího člena je možné také využít jeho exprese v kultivovaných eukaryontních buňkách (Reff, Μ. E. (1993) Curr. Opinion Biotech; Trill J. J. et al., (1995) Curr

Opinion Biotech 6: 553-560.

Vhodné vektory se mohou vybrat nebo konstruovat. Měly by obsahovat vhodné regulační sekvence, mezi něž patří promotorové sekvence, polyadenylační sekvence, zesilovací sekvence, markerové geny a jiné sekvence, je-li třeba. Další detaily jsou uvedeny např. v publikaci Moleculař Cloning: a Laboratory Manual : 2^nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold

Spring Harbor Laboratory protokolů vhodných při například při přípravě

Press. Řada známých metod a manipulaci nukleové kyseliny, konstrukcí nukleových kyselin, mutagenezi, sekvenování zavedení DNA do buněk a expresi genu a analýze proteinů, se detailně popisují v publikaci Short Protocols in Moleculař Biology, Second Edition, Ausubel et al., eds., John Wiley and Sons, 1992.

• ·

Dále vynález popisuje hostitelskou buňku, která obsahuje zde popsanou nukleovou kyselinu. Dále vynález popisuje způsob zahrnující zavedení uvedené nukleové kyseliny do hostitelské buňky. Při zavedení nukleové kyseliny do hostitelské buňky se může použít libovolný dostupný způsob. V případě eukaryontních buněk vhodný způsob může zahrnovat transfekci s fosforečnanem vápenatým, DEAE-dextranem, elektroporaci, transfekci zprostředkovanou lipozómy a transdukci za použití retrovirů nebo jiných virů, např. vakcinie nebo v případě hmyzích buněk bakuloviry. V případě bakteriálních buněk vhodné metody mohou zahrnovat transformaci chloridem sodným, elektroporaci a transfekci za použití bakteriofága.

Po zavedení DNA může následovat exprese nukleové kyseliny, například v kultivovaných hostitelských buňkách za podmínek vhodných pro expresi genu.

V jednom provedení vynálezu je nukleová kyselina začleněna do genomu (např. chromozom) hostitelské buňky. Integrace se může podpořit v souladu se standardními matodami inkluzí sekvencí, které podporují rekombinaci s genomem.

Následující produkce specificky se vázajícího člena se může například používat libovolným zde popsaným způsobem, jako je například při formulaci farmaceutického nebo diagnostického produktu, jako je kit, který obsahuje mimo specificky se vázajícího člena jedno nebo více činidel, které slouží při stanovení navázání specificky se vázajícího člena na buňky, jak se diskutuje shora v textu.

Další předměty vynálezu a jejich provedení jsou pro odborníka zřejmé. Uvedené příklady provedení slouží k doložení vynálezu a nemají omezující charakter.

Přehled obrázků na výkrese

Na obrázky č. 1 jsou uvedeny aminokyselinové sekvence VH a VL scFvs CGS-1 a CGS-2. Obrázek č. 1 (a) ukazuje sekvence

VH; obrázek č. 1 (b) ukazuje sekvence VL. CDR (1, 2 a 3) jsou označeny. Lidská zárodečná linie VH, který vykazuje největší homologii k oběma scFvs je segment DP47 rodiny VH3; segment VL obou klonů je DPL16, lehký řetězec se používá pro vybudování původní knihovny scFv (Nissim et al., EMBO J. 13, 692-698 (1994)). Zbytky, kterými se odlišují jeden klon od druhého, jsou podtrženy.

Obrázek č. 2: Na obrázku č. 2A je zobrazen model doménové struktury lidské FN podjednotky. Označeny jsou variabilní oblasti IIICS, ED-A a ED-B, které jsou způsobeny alternativním sestřihem pre-mRNA FN. Obrázek také ukazuje vnitřní homologii, stejně jako hlavní produkty trávení termolyzínem obsahujícím ED-B (Zardi et al., EMBO J. 6, 23372342 (1987)). Obrázek 2B ukazuje 4 až 18 % SDS-PAGE plazmy a

WI38VA FN a produkty jejich štěpení termolyzínem obarvené Coomassieovou modří a imunobloty, které se testovaly sondou BC-1, IST-6, CGS-1 a CGS-2. V dráze (1) jsou neštěpené a v dráze (3) jsou štěpené FN plazmy za použití termolyzinu, přičemž koncentrace FN je 1 μς/ιηΐ a 10 μς/ιηΐ (dráha (4)) . V dráze (2) jsou neštěpené a v dráze (5) jsou štěpené WI38VA FN plazmy za použití termolyzinu, přičemž koncentrace FN je 1 μg/ml a 5 μς/πιΐ (dráha (6) ) a 10 μρ/ml (dráha 7) . Čísla na pravé straně indikují hlavní produkty štěpení termolyzínem, které jsou zobrazeny na obr. č. 2A. Hodnoty na levé straně indikují standardy molekulové hmotnosti v kilodaltonech (kD).

Obrázek č. 3. Na obrázku č. 3A jsou zobrazeny repetiční sekvence FN typu III, které jsou obsaženy ve fúzi a rekombinantí proteiny exprimované v bakteriích E. coli a reaktivita těchto proteinů s CGS-1 a CGS-2 a s mAbs BC-1 a IST-6. Obrázek č. 3B zobrazuje gel obarvený Coomassiovou modří a imunobloty, které se testovaly sondou CGS-1, CGS-2, BC-1, IST-6. Číslování drah odpovídá číslování peptidových konstrukcí ve vrchní části obrázku. Hodnoty nalevo označují molekulovou hmotnost standardů v kD.

Na obrázku č. 4 je uveden infračervený zobrazovač myší; zobrazovač myší se používá pří experimentech cíleného zavádění a tvoří ho černá, nefluorescenční skříňka, která je vybavena wolframovou halogenovou lampou, excitačními a emisními filtry, které jsou specifické pro CY7 fluorofor a počítačem řízenou osmi bitovou monochromatickou CCD-kameru.

Obrázek č. 5 zobrazuje cílové zavádění fluorescenčně značených protilátkových fragmentů proti F9 myšímu teratokarcinomu za použití monomerních scFv(CGS-l) a dimerních scFv(CGS-l)2 řízených k B-FN. Jako negativní kontrola sloužily dimerní scFv(D1.3)2 s vazebnou specifitou k lysozymu.

Obrázek č. 6 zobrazuje cílené zavádění fluorescenčně značených protilátkových fragmentů proti F9 myšímu teratokarcinomu za použití afinitních maturovaných scFV(CGS2) a méně afinitních scFv(28SI) řízených do stejného epitopu B-FN. Cílené zavádění se detekuje jak u velkých (přibližně 0,6 g) tak i u malých nádorů (přibližně 0,2 g) , které se po 48 hodinách pokryjí černou krustou, která částečně zastře obraz.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Izolace lidského scFvs specifických pro oblast EDB lidského FN.

Fágová knihovna lidských scFv ((Nissim et al., EMBO J. 13, 692-698 (1994) se používá při selekci rekombinantích protilátek. Jako zdroj antigenu při selekci se použily dvě různé formy izoformy ED-B. V obou případech izoformou byl rekombinantí lidský protein.

.1

Rekombinantní peptidy FN, které obsahují repetice typu :b+:

se exprimovaly v bakteriích (Chatsworth, CA) čistily imunoafinitní (Pierschbacher et al., spojeny se sefarózou

III 2-11 (B-) a 2-11

Escherichia coli.

Konstrukce se připravila za použití cDNA FN z klonů pFH154 (Kornblihtt et al. , EMBO J. 4, 1755 (1985)), χΠΟ a

XF2 (Carnemolla et al., J. Cell Biol. 108, 1139-1148 (1989)). Konstrukce cDNA v rozsahu 2229-4787 bází (Kornblihtt, Proč. Nati. Acad. Sci USA 90 7179-7182, 1987) se začlenila do vektoru pQE-3/5 za použití kitu QIAexpress od Qiagen Rekombinanty FN-III 2-11 (B-) a (B+) se chromatografií za použití mAb 3E3 Cell 26, 259-267 (1981)), které jsou

4B (Pharmacia). Fragmenty DNA pro přípravu rekombinantích fragmentů FN, které obsahují typ III homologní repetice 7B89, 789, ED-B a FN-6, se připravily polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) za použití UltMa DNA polymerázy (Perkin Elmer) , cDNA z klonů FN 2-11 (B+) a FN 211 (B-) jako templátu. Primery se navrhly tak, aby umožnily klonování PCR produktů do pQE-12 za použití kitu QIAexpress od Qiagen (Chatsworth, CA). Pak následuje transformace buněk bakterie E.coli a exprese. Všechny klony cDNA se sekvenovaly za použití Sequenase 2.0 DNA sekvenačního kitu (USB).

Rekombinantní proteiny se čistily Ni-NTA chromatografií (IMAC), podle instrukcí výrobce (Qiagen), za použití hexahistidinového úseku na C-konci fragmentů FN. Fúzní protein ED-B-pGal se připravil klonováním ED-B cDNA do bakteriofágového vektoru λρίΐΐ za vzniku klonu λΕΏ-Β. Klon

XchFN60 (obsahující část sekvence ED-B) se získal jako fúzní protein z klonovaného kuřecího FN pchFN60 (Norton and Hyneš, Mol. Cell. Biol. 7, 4297-4307 (1987)).

Při selekci fágové knihovny lidského scFv se testoval každý ze dvou různých rekombinantích antigenů (7B89 a ED-B) .1

Roskilde, • · · • · • · • · · • · · · · · ve třech kolech. Imunozkumavky (Nunc; Maxisorp,

Denmark) se pokryly antigeny přes noc v koncentraci 50 gg/ml v PBS (20 mM fosforečnanový pufr, 0,15 M NaCl, pH7,2). Prvním antigenem je rekombinantí fragment 7B89, ve kterém oblast EDB je lemována přilehlou homologní repeticí typu III FN; tento antigen se nanášel při teplotě 4 °C přes noc. Druhý používaný antigen je rekombiantní ED-B (Zardi et al., EMBO J. 6, 23372342 (1987)), který má na C-konci hexahistidinový úsek; tento protein neobsahuje zbytky lyzinu, což znamená, že terminální aminoskupina první aminokyseliny je dostupná pro místně specifickou kovalentní imobilizaci ED-B na reaktivní destičky pro test ELISA (Nunc; Covalink). Potahování se provedlo přes noc při teplotě místnosti.

Po třech kolech testování se buňky bakterie E.coli infikovaly eluovaným fágem HB2151 a nanesly se na plotny, jak se popisuje v publikaci (Nissim et al. , EMBO J. 13, 692-698 (1994)). Po každém kole selekce se testovalo 95 na ampicilin rezistentních jednotlivých kolonií, aby se testem ELISA identifikovaly antigen specifické scFvs. Pro další analýzu afinitní maturaci se vybraly klony, které vykazují nej silnější signál testu ELISA na imobilizované antigeny. Tyto klony také demonstrují při imunocytochemickém barvení specifické zbarvení sekcí multiforem glioblastomu a nádorů prsu, jak se popisuje detailněji v příkladu 4.

Příklad 2: Afinitní maturace lidského scFvs specifického pro oblast ED-B lidského FN.

Klony 35GE (vybrán za použití 7B89) a 28SI (vybrán pomocí samotné domény ED-B) se vybraly jako kandidáti protilátek pro afinitní maturaci. Za účelem obměnit lehké řetězce za účelem vylepšení afinity se pak zkoumaly jednotlivé maturační strategie založené na nahodilosti šesti centrálních zbytků (DSSGNH) lehkého řetězce CDR3 za použití • · · · • · * · • · « · · · · · degenerovaných oligonukleotidů a PCR (Obr. č. 1), což umožňuje potenciální sekvenční diverzitu 201⁶= 6.4 χ 10⁷. Tato oblast (podél těžkého řetězce CDR3) je lokalizována v centru vazebného místa antigenu (Padlan , 1994) . Dále se mutoval zbytek argininu, který přímo předchází řadě šesti zbytků k šeřinu za účelem zabránit možnosti elektrostatických účinků dominující selekce.

Plazmid získaný z jedné bakteriální kolonie, který exprimuje rodičovský scFv fragment se amplifikoval PCR s primery LMB3 (5'CAG GAA ACA GCT ATG AC 3') a CDR3-6-VLFOR (5' CTT GGT CCC TCC GCC GAA TAC CAC MNN MNN MNN MNN MNN MNN AGA GGA GTT ACA GTA ATA GTC AGC CTG 3') (94C ď) - 55C (1') 72C (1'30 ' '), 25 cyklů; v publikaci Marks et al., (1991), J. Mol. Biol., 222, 581-597 se popisují použité pufry a podmínky PCR). Výsledný produkt se čistil na gelu (za účelem odstranit stopy plazmidu, který obsahuje původní gen scFv) a použil se jako templát při druhé amplifikaci s primery LMB3 a Jl-NotFOR (5'ATT GCT TTT CCT TTT TGC GGC CGC GCC TAG GAC GGT CAG CTT GGT CCC TCC GCC 3') (94C (1') - 55C (1') -72C (1' 30'', 25 cyklů) . Surový produkt PCR, který se na agarózovém gelu jeví jako jediný pruh se správnou molekulovou vahou se přímo čistil ze směsi PCR za použití Spin-Bind (FMC, Rockland, ME, USA), se štěpil s restrikčními enzymy Ncol/Notl a ligoval se do na gelu čištěného fágemidu pHENl (Hoogenboom et al. , Nucl. Acids. Res. 19, 4133-4137 (1991) štěpeným restrikčními enzymy Ncol/Notl, který obsahuje inzert Ncol/Notl, což umožňuje separaci vektoru, který je štěpen dvakrát od vektoru, jenž je štěpen pouze jednou. Vektor se připravil plazmid maxi-prep kit Qiagen (Chatsworth, CA, U.S.A.). Při ligaci se smísilo přibližně 5 μg štěpeného plazmidu a inzertu. Ligační směs se extrahovala jednou s fenolem, jednou se směsí fenol/chloroform/izoamylalkohol (25:25:1), pak se • · • « ► · · · precipitovala etanolem za použití glykogenu (Boehringer, Mannheim, SRN) jako nosiče a sušila se na speed-vaku.

Peletka se resuspendovala ve 20 μΐ vody a elektroporací se vnesl do elektrokompetentních buněk E. coli TG1 (Gibson T. J. (1984), PhD thesis. (University of Cambridge, Cambridge, UK). V typickém případě se používají elektrokompetentní buňky s titrem 10⁹ transformantů na μρ v případě, že se používá glycerol, nebo 1O¹⁰ transformantů na μρ čerstvě připravených elektrokompetentních buněk. Elektroporace vede v typickém případě k vytvoření více jak 10⁷ klonů.

Maturační knihovna se pak zpracovala stejným způsobem jako knihovna podle Nissima (Nissim et al., EMBO J. 13, 692698 (1994)) za vzniku fágových partikul!, které se používají při selekci v jednom cyklu pomocí imunoblotů, kde se používá jako antigen 7B89 ( v koncentraci 10 μρ/ml), pak následuje kinetická selekce (Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226, 889-896 (1992). Tato selekce proběhla inkubací biotinylovaných 7B89 (v koncentraci 10 nM) s fágovou suspenzí (přibližně 10¹²t.u.) z prvního kola výběru v 2 % roztoku mléka a PBS (2% MPBS) po dobu 5 minut, pak se přidaly 7B89 (v koncentraci 1 μΜ) , které nejsou značené biotinem, a po dobu 30 minut probíhala kompetice. Do reakční směsi se přidalo 100 μΐ částic dyna (Dynal:M480) potažených streptavidinem, které byly předem zablokovány v 2% MPBS, vše se 2 minuty míchalo a pak se částice zachytily na magnetu a desetkrát se promyly roztokem PBS + 0,1 % Tween-20 nebo PBS. Fág se z částic eluoval 0,5 ml trietylaminu v koncentraci 100 mM. Tento roztok se pak neutralizoval 1 M Tris, pH 7,4 o objemu 0,25 ml a použil se pro infekci exponenciálně rostoucích buněk HB2151 (Nissim et al., EMBO J. 13, 692-698 (1994)). 95 jednotlivých kolonií rezistentních na ampicilin se použilo při produkci supernatantů, které obsahují scFv (Nissim et al., EMBO J. 13,

692-698 (1994) a které se testovaly testem ELISA, BIAcore a imunochemicky za účelem identifikace kolonií s nej silnější schopností se vázat. Ty se pak subklónovaly mezi restrikční místa Sfil/Notl expresivního vektoru pDN268 (Neri et al., (1996a), Bio/Techniques, 20, 708-713; Neri et al., (1996b), Nátuře Biotechnology, 14, 385-390), který připojil k C-konci scFv fosforylovatelný úsek, epitop FLAGa hexahistidinový úsek.

Jednotlivé kolonie relevantních protilátek subklónovaných do pDN268 se kultivovaly při teplotě 37 °C v 2x TY, který obsahuje 100 mg/1 ampicilinu a 0,1 % glukózy. Když buněčná kultura dosáhla hodnoty OD⁶⁰⁰ 0, 8, přidalo se IPTG tak, aby konečná koncentrace byla 1 mM a kultivace pokračovala 16 až 20 hodin při teplotě 30 °C. Po centrifugací (GS-3 Sorvall rotoru, při 7000 ot/min. a po dobu 30 min) se supernatant filtroval, zakoncentroval a za použití přístroje Minisette (Filtron) s tangencionálním tokem přešel do pufru (50 mM fosforečnan, pH7,4, 500 mM NaCl, 20 mM imidazol) . Čištěné protilátky se analyzovaly SDS-PAGE (Laemmli, 1970) a dialyzovaly se proti PBS při teplotě 4°C. Čištěné scFv se dále zpracovávaly gelovou filtrací za použití přístroj FPLC vybaveného kolonou S-75 (Pharmacia), jelikož je známo, že multivalentní fragmenty scFv mohou vykazovat dobré navázání na BIAcore (Jonsson et al., BioTechniques 11, 620-627 (1991) účinkem avidity (Nissim et al., EMBO J. 13, 692-698 (1994) ; Crothers and Metzger et al., Immunochemistry 9, 341-357 (1972). Koncentrace protilátek monomerických frakcí čištěných na FPLC se stanovila spektrofotometricky za předpokladu, že absorbance při vlnové délce 280 nm je pro roztok scFv v koncentraci 1 pg/ml 1,4 jednotek.

Na přístroji BIAcore (Pharmacia Biosensor) se měřilo navázání monovalentní scFV při koncentračním rozmezí 0,1 až 1 μΜ v PBS. Při uvedeném měření se použila tato činidla: (i) 1

000 jednotek rezonance (RU) biotinovaného rekombinantího FN fragmentu 7B89, který je imobilizován na čipu potaženém streptavidinem, který se specificky vázal 250 RU scFv; (ii) 200 RU rekombinantího ED-B, chemicky imobilizovaném na Nterminální aminoskupině, která se specificky váže 600 RU scFv; (iii) 3 500 RU fibronektinu WI38VA bohatého na ED-B ( uvedeno v příkladu 3), který se specificky vázal 150 RU scFv. Kinetická analýza dat se uskutečnila podle instrukcí výrobce. Na základě kvalitativní BIAcore analýzy supernatantů obsahujících protilátky se vybrala jedna afinitně maturovaná verze každého scFv klonu: klon CGS-1 z výběru pomocí fragmentu 78B9 aa CGS-2 z výběru s ED-B rekombinantím FN fragmentem. V tabulce č. 1 jsou uvedeny asociační rychlostní konstanty (k_on) a disociační rychlostní konstanty (k_off) dohromady s rovnovážnými disociačními konstantami (Kd) scFv a původního klonu 28SI. Ačkoli oba klony CGS-1 a CGS-2 mají Kd v nanomolárním rozmezí, klon CGS-2 vykazuje největší zlepšení ve srovnání s rodičovským klonem. Jeho Kd s ohledem na všechny tři testované proteiny na senzorovém čipu (tabulka č. 1) je 1 nM (původní hodnota byla 110 nM) . Vylepšení se provedlo hlavně pomalejší kinetickou disociační konstantou ( přibližně 10⁴ s”¹), což se měřilo monomerickými protilátkovými přípravky (data nejsou uvedena).

Strategie maturace se jeví být obecná a má výslednou afinitu vylepšenou protilátkami proti proteinu, který se váže na maltózu, cytochromu C, extracelulární doméně myšího endoglinu (D. N., L. Wyder, R. Klemenz), cytomegaloviru (A. P., G. Neri, R. Botti, P. N.), jadernému nádorovému markrovému HMGI-C proteinu (A.P., P. Saldani, V. Giancotta, P. N.) a placentové alkalické fosfatáze, což je markér nádoru vaječníků ( M. Deonarain and A. A. Epenetos) . Strategie se proto zdá být nejméně stejně účinná jako jiné maturační strategie (Marks et al., (1992), Bio/Technology, 10, 779-783;

• · • · · · * ···· ·· ··· ··· *·

Low et al., 1996) a výsledkem jsou protilátky se stejnými afinitami jako ty získané z velmi velkých fagových protilátkových knihoven (Griffiths et al., (1994), EMBO J.

13, 3245-3260; Vaughan et al. , (1996), Nátuře Biotechnol.,

14, 309-314).

Afinitní maturované klony CGS-1 a CGS-2 se sekvenovaly a zanesly se do databáze genů lidských zárodečních protilátek V (V-BASE), pak překládaly za použití softwaru MacVector. Gen VH obou klonů byl nejvíce homologní s lidskou zárodečnou linií DP47 (VH3) a navíc každý klon měl různé sekvence VH CDR3 (obr. č. 1). Gen VL obou klonů zárodečné linie DPL16 se použil při konstrukci repertoáru lidského syntetického scFv, jak popisuje (Nissim et al., EMBO J. 13, 692-698 (1994)).

Sekvence VL CDR3 se liší od každé jiné čtyřmi ze šesti náhodných zbytků (obr. č. 1).

* · • · ··· · • · ·· ··

TABULKA Č. 1

Kinetické a disociační konstanty monomerních scFv fragmentů CGS-1 a CGS-2 k proteinům obsahujícím doménu ED-B

>1	Φ	•rd
44	>	44
o		W
g	(Ú	g
P		l-1
0	Φ	p
P *	O	0
	(0
•	P	'Φ
>1	44	g
P	g	>ω
o	φ	-H
44	o	i—1
Φ	g	P
£	o	0
	p

	Cd	X	X	X
	co	lo7	(JY Lf)	7
	O	< o	K O	K o
	u	ÍO rd	Cd rd	Cd rd
>		X	X	X
00	00
co	Cd	Y	Cdvo	cnT
p m	rd	K O	w o	< o
fa S <	co	l> rd	1—1 1—1	L0 rd
	i—1	X	X	X
	1 co	o?	rd ld	cmY
	O	K O	< O	< o
	o	LO rd	rd	5-1 1-1
	cd	X	X	X
	1
	co	co 7		rd ,
	o	o	K O	< O
	u	Cd rd	1—1 1—1	Cd i—1
		x	X	X
ΟΊ	00
00	Cd	o Y	θ'! lO	o ^Γ\|
PQ	t—1	V o	< O	<. o
Γ-	co	CO rd	Cd rd	1—1 1-1
	t—1	X	X	X
	1 co	cn?	t—1 lT)	L4)Y
	0	** o	<. O	K O
	o	CO rd	rd rd	CO rd
	Cd	X	X	X
	co	lo 7	co	rd i
	o	< o	< o	< O
	o	t—i 1—1	rd rd	t—1 ?—1
		X	X	X
CQ	00
1	Cd	i^Y	LO lO	’—17
Q	rd	K O	O	< o
ω	CO	Cd rd	Cd rd	rd rd
	?—1	X	X	X
	1 co	oY	COld	'T i
	0	o	< o	<. O
	0	O rd	?—1 i—1	lO rd
tn		¹ CO	1 *
•H	>		£ „
-P	Ixi	Ψ4	1-1
c a	υ	o	tí- 1	P
a)	co	Λ4	-x y¹	w »

en >1	Ή g	>1 1-1 Ή
1—1	φ	>N
	>
-H	o	o
CL)	g g	ίλ
-P	44
al	o	Φ
£		co
	H
Ή	44	>Cd
0	(Ώ	>1
P	O	τΐ
Φ	g
W	ω

o g

w

Ή íd

O d

Φ w

'>1

Cl

Φ

4J

Λ4

Φ >C d

ro g

Μ—I co •H >

'Cti

N >N

O υ

o\°

O

CO

I-1 fC

M

Ή

N

Φ ω

'Φ

C

Φ +J β

Φ

Ό

O

W »g d

N >1 I-1

P (D >

O c

d

Φ o

>1

-P g

Φ £

-H c

Φ d

X

H °d d l P \ Φ + I—i w

Η Έί >

4-)

W o

d w

φ >c d

Ή •ι—i d P g w o P c:

o d

'>1 d

>ω

-H i—I

P

O >0) d

d

Ή λ;

d p

g

4-)

N >

»d g

d di tn

O w

d φ

w • · · · .ί. ·ί· ··“··’

Příklad 3: Specifita afinitních maturovaných scFvs u fibronektinů, které obsahují ED-B.

Imunoreaktivita dvou afinitních maturovaných scFvs, CGS1 a CGS-2 se zpočátku odhadla pomocí testu ELISA a porovnala se přímo mAb BC-1 (které rozpoznávají izoformu B-FN) a mAb IST-6, které rozpoznávají pouze izoformy FN, kterým chybí doména ED-B (Carnemolla et al., J. Cell Biol. 108, 1139-1148 (1989); Carnemolla et al., J. Biol. Chem. 24689-24692 (1992)). Po té proběhla analýza specifity za použití extenzivního panelu fragmentů FN, které se získaly aplikací termolyzinu, a rekombinantích fúzních proteinů.

Antigeny, imunoblotování, lidské plazmy které se použily v testu ELISA a při se připravily následovně. FN se čistil z a z upraveného média pro buněčnou linii

WI38VA13, jak se popisuje v publikaci Zardi et al., EMBO J. 6, 2337-2342 (1987). Čištěné FN se štěpily termolyzinem (proteáza typ X; Sigma Chemical Co.), jak se popisuje v publikaci Carnemolla et al., J. Cell Biol. 108, 1139-1148 (1989). Nativní fragmenty FN s molekulovou hmotností 110 000 (B-) a (B+) s molekulovou hmotností 120 000 (obr. č. 2) se čistily po štěpení FN, jak se popisuje v publikaci (Borsi et al., Anal. Biochem. 192, 372-379 (1991)). Velká izoforma tenaskinu-C se čistila, jak se popisuje v publikaci Saginati et al., Eur J. Biochem. 205, 545-549 (1992)). Rekombinantní proteiny se exprimovaly a čistily, jak se popisuje v příkladu 1. SDS-PAGE a westernovo blotování se popisuje v publikaci Carnemolla et al., J.

1139-1148 (1989).

provádí, jak se . Cell Biol. 108,

Všechny antigeny, které se užívaly při testu ELISA, se naředily roztokem PBS na koncentraci v rozmezí 50 až 100 gg/ml a potáhly se při teplotě 4 °C na buňky Imuno-destiček (Nunc, Roskilde, Dánsko). Nenavázané antigeny se odstranily promytím PBS a destičky se pak blokovaly roztokem PBS s 3%

·· · · · • · · • · · · (m/v) boviním sérovým albuminem (BSA) po dobu 2 hod při teplotě 37 °C. Pak následovaly čtyři promytí roztokem PBS a 0,5 % Tween 20 (PBST). Protilátky se pak nechaly navázat při teplotě 37 °C po dobu 1,5 hod; scFv se preinkubovaly s antisérem, které je určeno proti úseku sekvence: mAb M2 (Kodak, New Haven CT) pro FLAG úsek nebo 9E10 (ATCC, Rockville, MD) pro myc úsek. Jako kontrolní protilátky se použily mAb BC-1 a IST-6. Po čtyřech promytích roztokem PBST se plotny inkubovaly po dobu 1 hod. při teplotě 37 °C s biotinem značenými kozími protilátkami IgG (Bio-SPA Division, Milan, Italy) ředěnými 1 : 2 000( v roztoku PBST + 3 % BSA) . Promytí se opakovalo a přidal se komplex streptavidin biotinovaná alkalická fosfatáza (Bio-SPA Division, Milan, Italy) (ředěný 1 : 800 v roztoku PBST, který obsahuje 2 mM

MgCl₂) po dobu 1 hod při teplotě 37 °C. Reakce se vyvinula za použití tablet fosfatázového substrátu (Sigma) v 10 % dietanolaminu, pH 9,8 a optická hustota se odečítala při vlnové délce 405 nm. Výsledky jsou uvedeny v tabulce č. 2.

Tabulka č. 2

	CGS-1	CGS-2	BC-1	IST-6
FN plazmy	0, 07	0, 04	0, 09	1,73
FN WI38VA	1,16	0,72	1,20	1,12
nllO kD (B-)	0, 03	0, 01	0, 05	1,20
nl20 kD (B+)	0, 82	0, 81	1,20	0, 02
rec FN7B89	1, 11	1, 02	1, 02	0, 01
rec FN789	0, 01	0, 01	0, 05	1,25
rec ED-B	1,21	1,32	0, 15	0, 04
rec FN-6	0, 01	0, 01	0, 08	0, 03
tenaskin	0, 01	0, 02	0, 06	0, 02

Imunoreaktivita scFv a monoklonálních protilátek s antigeny odvozenými od fibronektinu se měřily testem ELISA. Hodnoty reprezentují OD měřené při vlnové délce 405 nm po subtrakci signálu pozadí. Data jsou průměr čtyř experimentů, které vykazují maximum 10 % standardní odchylky.

• · • · · ·

Identita různých forem fibronektinu používaného v experimentu je následující: Plazmový FN = lidskému plazmovému fibronektinu; WI38-VA FN = fibronektin ze supernatantů fibroblastů transformovaných SV-40 (Zardi et al., EMBO J. 6, 2337-2342 (1987)); nllOkD = domény 4 fibronektinu ošetřeného termolyzinem bez ED-B; nl20kD = domény 4 fibronektinu ošetřeného termolyzinem s ED-B; rec FN7B89 = doména ED-B, která je lemována přilehlými FN homologní repeticemi typu III s doménou ED-B; rec ED-B = samotnému rekombinantnímu ED-B; rec FN6 = doména 6 rekombinantního FN.

CGS-1 a CGS-2 rozeznávaly rekombinantí peptid ED-B, stejně jako nativní nebo rekombinantí fragmenty FN, které obsahují sekvenci ED-B, zatímco se naváží na žádný fragment FN, kterému chybí ED-B. Navíc CGS-1 a CGS-2 nereaguje s tenaskinem (který obsahuje 15 homologních repetic typu III, jak se popisuje v publikaci Siri et al., Nucl. Acids Res. 19, 525-531 (1991)) a s plazmovým FN, který v produktech štěpení termolyzinem neobsahuje detekovatelné množství sekvence ED-B (Zardi et al. , EMBO J. 6, 2337-2342 (1987)). Naopak CGS-1 a CGS-2 silně reaguje s FN, který se čistil z buněčné linie WI38VA transformované SV-40. Přibližně 70 až 90 % molekul FN z této buněčné linie obsahuje ED-B, jak se ukazuje při štěpení termolyzinem a v experimentech s SI nukleázou za použití čištěného FN a celkové RNA, jenž se získala z buněčné linie (Zardi et al., EMBO J. 6, 2337-2342 (1987); Borsi et al., Exp. Cell Res. 199, 98-105 (1992b)). Specifita scFvs pro ED-B komponent FN se demonstrovala použitím rozpustného rekombinantního ED-B za účelem inhibice vázání CGS-1 a/nebo CGS-2 na FN buněk WI38VA (data nejsou uvedena).

Data potvrdila, že CGS-1 a CGS-2 reagují specificky pouze s deriváty FN, které obsahují doménu ED-B. Obě vykazují stejnou reaktivitu jako mAb BC-1, mimo v případě rekombinantní ED-B, kterou nerozeznávají BC-1. Intenzita

získaného signálů testu ELISA, který je relativní vzhledem mAb kontrolám, reflektuje na vysokou specifitu dvou scFvs pro antigeny obsahující ED-B.

Specifita CGS-1 a CGS-2 se zkoumala dále na imunoblotech za použití FN z plazmy a buněk WI38V a produktů po štěpení FN termolyzínem. Po Štěpení termolyzinem FN z buněk WI38VA (většina z nich obsahuje ED-B) vzniká fragment o molekulové hmotnosti 120 000 (obsahující ED-B) a minoritní fragment o molekulové hmotnosti 110 000, kterému chybí oblast ED-B (uvedeno na obr. č. 2; Zardi et al., EMBO J. 6, 2337-2342 (1987)). Další štěpení domény o molekulové hmotnosti 120 000 generuje dva fragmenty; fragment o molekulové hmotnosti 85 000, který obsahuje na svém C-konci skoro celou sekvenci ED-B a sekvenci s molekulovou hmotností 35 000 (Obr. č. 2a, ; Zardi et al., EMBO J. 6, 2337-2342 (1987)).

Po levé straně obr. č. 2B je gel proteinových frakcí obarvený Comassieovou modří, které se analyzovaly imunoblotem. CGS-1 a CGS-2 nerozeznaly plazmový FN (dráha 1) a produkt proteinu štěpeného termolyzinem (dráha 3 obsahuje protein o molekulové hmotnosti 110 000 a dráha 4 obsahuje produkt štěpení proteinu o molekulové hmotnosti 110 000) . Naopak FN z buněk WI38VA bohaté na ED-B, oba intaktní (dráha 2) a štěpení termolyzinem (dráhy 5, 6 a 7) byly rozeznávány oběma fragmenty scFvs. Nejmenší fragment získaný z FN, který by mohl být specificky rozeznán CGS-1, byl protein o molekulové hmotnosti 120 000 (zahrnuje repetice 2 až 11 typu III), zatímco CGS-2 jsou schopny rozeznat fragment o molekulové hmotnosti 85 000, který zahrnuje repetice 2 až 7 vedle N-konce ED-B (obr. č. 2B; ; Zardi et al. , EMBO J. 6, 2337-2342 (1987)). Tyto výsledky indikují, že scFvs reagují s odlišnými epitopy v sekvenci ED-B. Navázání CGS-2 na doménu s molekulovou hmotností 85 000 indikuje, že epitop tohoto klonu leží na N-konci ED-B. Naopak CGS-1 se naváží pokud je doména • · ο molekulové hmotnosti 120 000 štěpena na fragment o molekulové hmotnosti 85 000 ukazuje, což znamená, že rozeznává epitop, který se nachází spíše na C-konci molekuly ED-B.

Specifita CGS-1 a CGS-2 se dále zkoumala imunoblotováním za použití rekombinantích fragmentů FN a fúzních proteinů, které obsahují nebo neobsahují sekvenci ED-B. Fúzní proteiny FN se připravily způsobem, jak se popisuje v publikaci Carnemolla et al., J. Cell Biol. 108, 1139-1148 (1989) . Výsledky těchto experimentů jsou uvedeny na obr. č. 3; v publikaci Carnemolla et al., J. Biol. Chem. 24689-24692 (1992) se uvádí spojení schématického diagramu se strukturou domén lidského FN. Získané vazebné profily v podstatě potvrzují, co se zjistilo testy ELISA a imunobloty provedenými s čištěným FN a produkty proteolytického štěpení: CGS-1 a CGS-2 silně reagovaly s fragmenty FN, které obsahovaly ED-B (dráha 2 a 4), ale nevykazují žádnou reaktivitu se sekvencemi FN, které neobsahují ED-B (dráhy 1 a 3) . CGS-lnereaguj i ani s lidským (dráha 5) ani z kuřecím (dráha 6) fúzním proteinem ED-B, zatímco CGS-2 reagují silně s oběma fragmenty (obr. č. 3) . Tento výsledek může odrážet jisté konformační omezení epitopu ve FN, který obsahuje ED-B a který je rozeznáván CGS-1; je například možné, že epitop je citlivý k denaturaci nebo je porušen při frakcionaci SDS-PAGE a přenosu na pevný podklad, kterým může být například nitrocelulóza.

Dohromady tyto výsledky demonstrují, že CGS-1 a CGS-2 se silně a specificky váží na FN obsahující ED-B v oblastech, které se od sebe liší a liší se také od struktury, kterou rozeznávají mAb BC-1.

Příklad 4: Použití afinitních maturovaných anti-ED-B scFvs při imunocytochemickém barvení lidských a myších nádorů.

CGS-1 a CGS-2 se používají při imunolokalizaci molekul FN, které obsahují ED-Bv různých normálních a neoplastických lidských tkáních. V případě normální tkáně se vybrala kůže, protože o B-FN izoformě se ví, že se exprimuje v makrofágách a fibroblastech během hojení kožních poranění (Carnemolla et al. , J. Cell Biol. 108, 1139-1148 (1989); Brown et al., Amer. J. Pathol. 142, 793-801 (1993). U dvou vybraných lidských nádorů se analyzovala specifita barvení pomocí antifibronektinových mAbs: detailněji se studovala multiforma glioblastomu, protože endoteliální buňky v cévách tohoto nádoru jsou ve stádiu vysoké proliferace se zvýšenou angiogenezi, což zahrnuje i expresi izoforem B-FN ( Castellani et al., Int. J. Cancer 59, 612-618 (1994). Navíc při studiu za použití odlišného panelu normálních, hyperplastických a neoplastických tkání lidského prsu se získal další důkaz korelace mezi angiogenezi a expresí B-FN ( Kaczmarek et al., Int. J. Cancer 58, 11-16 (1994)).

Ve zde popsaných experimentech se imunohistochemické barvení CGS-1 a CGS-2 srovnalo z barvením mAb BC-1 (které rozeznávají izoformu B-FN) a s dalšími mAb, o kterých se ví, že reagují buď se všemi známými izoformními variantami FN (IST-4) nebo pouze s izoformami FN, které nenesou ED-B (IST6). Charakterizace všech těchto kontrolních protilátek je uvedena v publikacích Carnemolla et al., J. Cell Biol. 108, 1139-1148 (1989) a Carnemolla et al., J. Biol. Chem. 2468924692 (1992) .

Ze vzorků odebraných během operace se získaly normální a neoplastické tkáně. Už dříve se zjistilo, že pro přesnou a citlivou detekci molekul, které obsahují FN, je kritická příprava a fixace tkání (Castellani et al., Int. J. Cancer 59, 612-618 (1994)). Při imunohistochemické analýze se 5 gm silné kryostatické sekce sušily na vzduchu a fixovaly se chladným acetonem po dobu 10 minut. Imunobarvení se provedlo • · · za použití barvícího kitu s komplexem streptavidinbiotinalkalická fosfatáza (Bio-SPA Division, Milan, Italy) a naftol-AS-MX-fosforečnanu a Fast Red TR (Sigma) . Jako kontrastní barvivo se použil Gillův haematoxylin a pak následovala fixace v glycergelu (Dako, Carpenteria, CA), jak se popisuje v publikaci Castellani et al., Int. J. Cancer 59, 612-618 (1994). Za účelem analyzovat specifitu dále v experimentech, kde se získalo pozitivní barvení tkání, se specifita pro ED-B demonstrovala preinkubací protilátek s rekombinantí ED-B doménou, po čemž následuje detekce, jak se popisuje shora v textu.

Výsledky těchto experimentů vykazují, že jak CGS-1 tak CGS-2 reagují se stejnými histologickými strukturami, jako jsou mAb BC-1. Vzor barvení, který se získal s kůží za použití CGS-1, CGS-2 a BC-1, reflektuje na nepřítomnost ED-B ve FN, jenž se exprimoval v dermisu. Při barvení sekcí invazivního duktálního karcinomu protilátky CGS-1, CGS-2 a BC-1 vykazují distribuci barvení omezenou na hranici mezi neoplastickými buňkami a stromatem. To je v souladu se skutečností, že ačkoli celkové FN je homogenně distribuované celým stromatem nádoru, exprese B-FN je omezena do určitých oblastí. Jsou to ty oblasti invazivního duktuálního karcinomu, kde se B-FN úspěšně lokalizovaly (v 95 % případů) za použití mAb BC-1 (Kaczmarek et al., Int. J. Cancer 58, 1116 (1994)).

Potvrdil se předchozí nález zbarvení protilátek BC-1 glioblstomového multiformního nádoru. V publikaci Castellani et al., Int. J. Cancer 59, 612-618 (1994) se pozoruje typický vzor barvení vaskulárních struktur, které jsou podobné glomerulárním, a v uvedených experimentech se zjistilo, že protilátky CGS-1 a CGS-2 vykazují kvalitativně identické výsledky.

·· ·· • · · · • · · ·

BBBB · • · «

Existuje však důležitý rozdíl mezi CGS-1 a CGS-2 a mAb BC-1: ukázalo se, že dva lidské scFv se váží na kuřecí a myší B-FN, zatímco BC-1 je striktně specifický jen pro člověka. CGS-2 reagovaly s kuřecími embryi (data nejsou uvedena) a CGS-1 a CGS-2 reagují s myšími nádory.

Také se prokázalo CGS-1 barvení vaskulárních struktur v sekcích myších teratokarcinomu F9. Na rozdíl od všech testovaných normálních myších tkání (játra, slezina, ledviny, žaludek, tenké střevo, tlusté střevo, vaječníky, děloha, močový měchýř, pankreas, suprarenální žlázy, skeletální sval, srdce, plíce, štítné žlázy a mozku) vykazují negativní barvící reakci s protilátkami CGS-1 a CGS-2 (data nejsou uvedena). Za použití rekombinantí ED-B domény, která zcela inhibuje získané barvení (data nejsou uvedena), se ukázalo, že struktury obarvené v sekcích teratokarcinomů F9 jsou ED-B specifické.

Příklad 5: Použití afinitních maturovaných anti-ED-B scFvs při in vivo cíleném zavádění do lidských nádorů.

Pro vývoj xenoimplantovaných nádorů u 6 až 10 týdnů starých holých myší (Balb-c nebo MF-1; Harlan UK), kdy se zavedlo 1 x 10⁷ buněk do boku jedné myši podkožní injekcí, se použila buněčná linie SKMEL-28 lidského melanomu. Myším, které nesly nádory, se aplikovala do ocasní cévy injekce se 100 μΐ roztoku scFvi-Cy7i v PBS o koncentraci 1 mg/ml, kdy nádory dosáhly přibližného průměru 1 cm.

Značení rekombinantích protilátek s CY7 se dosáhlo přidáním 100 μΐ 1M hydrogenuhličitanu sodného, pH9,3 a 200 μΐ CY7-bis-Osu (Amersham; Cat. Nr. PA17000; 2 mg/ml v DMSO) do 1 ml roztoku protilátek v PBS (1 mg/ml) . Po 30 minutách při teplotě místnosti se do směsi přidalo 100 μΐ 1 M Tris pH=7,4 a značené protilátky se separovaly od nezreagovaného barviva za použití kolon PD10 na jedno použití Pharmacia Biotech, • · ··

I · « « ί · ·· ·· · · ι • · « ·· *· ·· ····

Piscataway, NJ, USA). Tyto kolony se uvedly do rovnováhy roztokem PBS. Eluované zelené frakce protilátek se koncentrovaly na koncentraci přibližně 1 mg/ml za použití zkumavek Centricon-10 (Amicon, Beverly, MA, USA). Dosažený poměr barvení byl obecně blízko hodnotě 1 molekula CY7 : jedna molekula protilátek. To se odhadlo spektroskopicky v 1 cm kyvetách za předpokladu, že roztok protilátek o koncentraci 1 mg/ml vykazuje při vlnové délce 280 nm hodnotu absorbance 1,4 jednotek. Molární extenční koeficient CY7 při vlnové délce 747 nm je 200 000 (M^_ cm^_:), přičemž se zanedbává hodnota absorbce CY7 při vlnové délce 280 nm. Imunoreaktivita vzorků protilátek po značení se potvrdila posunem pruhů (Neri et al., Bio/Techniques, 20, 708-713 (1996b)) afinitní chromatografii na koloně s antigenem nebo analýzou BIAcore. Myš byla snímána postaveným snímačem myší v pravidelných časových intervalech při anastezi, která se dosáhla inhalací směsi kyslíku/fluorotanu. Za účelem zjistit reprodukovatelnost výsledků se v případě každého vzorku studovalo 2 až 8 zvířat. Proběhly procedury podle projektu D. Neri UK Project Licence Tumour Targeting (UK PPL 80/1056).

Infračervený snímač myší se postavil jako modifikace fotodetekčního systému podle publikace Folii, et al., (1994),

Cancer Res., infračerveného vybrala za který umožňuje použití

Infračervená iluminace se lepší penetrace tkáně.

54, 2643-2649, fluoroforu CY7. účelem dosáhnout

Fluorescence CY7 (vlnová délka je větší jak 7 60 nm) je lidským okem neviditelná a je nutné použít počítačem řízenou CCD kameru. Snímač myší se skládá z černou barvou nabarvené skříňky utěsněné před vstupem světla, vybavené 100 W wolframovou halogenovou lampou excitačním filtrem o průměru 50 mm, který se specificky navrhl pro CY7 (Chromá Corporation, Brattleboro, VT, USA; 673- 748 nm) . Výsledný iluminační paprsek je při dobrém přiblížení homogenní v ·· Φ··· φ φ · • · • · · • · · φφφφ ΦΦ • · ·· ··

ΦΦ φ φ · · · * • · · · ·· • · · ··· φ · • · · · · «ΦΦ φφφ ·· ·» oblasti ο velikosti 5 χ 10 cm, do které se umístila myš pro snímání. Fluorescence se detekovala osmibitovou monochromatickou Pulnix CCD kamerou, vybavenou C-orámovanou čočkou a 50 mm emisním filtrem ( Chromá Corporation, Brattleboro, VT, USA; 765-855 nm) a systémem ImageDok (Kinetic Imaging Ltd., Liverpool, UK). Tento systém obsahuje počítač vybavený pohlcovačem záření a softwarem pro integraci sekvenčních obrázků. Při postupu průměrizování se v typickém případě snímají tři sekvenční obrázky v 50 ms; tento počet se udržuje konstantní při sériích obrázků jednoho zvířete, aby se umožnilo přímé srovnání cílené zavádění do nádorů v různých časových okamžicích. Obrázky ve formátu TIFF se pak převedly do fajlů PICT za použití programu Graphics Converter a zpracovaly se za použití programu MacDraw Pro na počítači Power Macintosh 7100/66.

Schéma přístroje je uvedeno na obr. č. 4.

Tyto experimenty ukázaly že oba scFv, které se nacházejí v nádoru, se vizualizovaly v makroskopickém měřítku.

Mikroskopická demonstrace cílení neovaskulatury vyvíjejícího se nádoru se dvěma anti-ED-B scFvs je detajlněji popsána dále v textu.

Holým myším a/nebo myším SCID, které nesou ve svém boku xenoimplantované buňky SKMEL-28 lidského melanomu nebo myšího F9 teratokarcinomu', se aplikovaly injekcí buď neznačené fragmenty scFv s FLAG úsekem nebo biotinované fragmenty scFv.

Myši se usmrtily v různých časových intervalech po injekci, odebraly se nádorové a nenádorové sekce, které se pak obarvily podle běžného imunohistochemického protokolu za použití buď anti-FLAG M2 protilátek (Kodak , 181) nebo detekčních činidel založených na streptavidinu. Optimálního cíleného zavádění se obecně dosáhlo 12 hodin po injekci. Ukázalo se, že protilátky CGS1 a CGS2 se váží na » · · • · · • · · neovaskulaturu xenoimplantovaného nádoru a myšího teratokarcinomu.

Příklad 6: Cílené zavádění xenoimplantovaného myšího F9 teratokarcinomu do holých myší.

Po zavedení podkožní injekce 4 x 10^b buněk myšího F9 teratokarcinomu se na boku holých myší vyvinuly pevné nádory. Tento nádor roste u myší velmi rychle, přibližně po jednom týdnu po injekci dosahuje průměru 1 cm a je vysoce vaskularizován. Pro zobrazení cíleného zavádění protilátek se použila modifikace fotodetekční metody podle publikace Folii, et al., (1994), Cancer Res., 54, 2643-2649, která umožňuje kinetické zhodnocení cíleného zavádění do nádoru a změn na nádoru po aplikaci protilátek u stejných zvířat v různých časových okamžicích, jak se popisuje detailněji shora v textu ( obr. č. 4).

Za účelem cíleného zavádění do nádoru a provedení detekce protilátek, scFv(CGS-l), scFv(CGS-2) a anti-lysozym scFv(D1.3) (McCafferty j., Griffiths, A.D., Winter, G., Chiswell, D.J. (1990) Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. Nátuře (London), 348, 552-554) byly připojeny homodimerizační úsek (Pack et al., (1993), Bio/Technology, 11, 1271-1277) subklónováním protilátek do restrikčních míst Sfil/Notl expresivního vektoru pGIN50. Tento vektor je odvozen z pDN268 (Neri et al., (1996b), Nátuře Biotechnology, 14, 385-390), ve kterém je His6 úsek sekvence je nahrazen sekvencí: GGC LTD TLQ AFT DQL EDE KSA LQT EIA HLL KEK EKL EFI LAA H, který obsahuje cysteinový zbytek a amfipatický helix proteinu Fox pro kovalentní homodimerizaci fragmentů protilátek (Abate et al., 1990). Nedosáhlo se celkové kovalentní dimerizace: přibližně 30 až 50 % fragmentů protilátek tvořilo kovalentně spojené diméry.

• · · ♦ • · · · • · · · · • · · ·· ··

Fragmenty protilátek se čistily afinitní chromatografií na kolonách získaných spojením lysozymu ze slepicích vajec (Dl.3) nebo 7B89 (anti-ED-B protilátky; Carnemolla et al., J. Biol. Chem. 24689-24692 (1992)) se sefarózou aktivovanou CNBr (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA) . Supernatanty se nanesly na afinitní podklad, který se pak promyl PBS, s PBS + 0,5 M NaCl a eluoval se 100 mM Et3N. Protilátky se pak dialyzovaly proti PBS.

Protilátky se značily způsobem, který se popisuje shora v textu, a pak se zavedly injekcí do ocasní cévy myší, které nesou nádor. Injekce obsahovala 100 μΐ roztoku csFvx-Cyíi v PBS a aplikovala se v okamžiku, kdy nádory dosáhly průměru přibližně 1 cm.

Jak se ukázalo na obr. č. 5 scFv(CGS-l) se lokalizovaly na nádoru do tří dnů. V tomto čase také zmizel nádor. Objevilo se však také zbarvení femuru. Cílené zavádění protilátek CGS-1 do nádoru se významně vylepšilo zavedením amfipatického helixu, který obsahuje cysteinový zbytek na Ckonci, aby došlo k podpoření dimerizace protilátek (Pack et al. , (1993), Bio/Technology, 11, 1271-1277). Ve skutečnosti lokalizace dimérů scFv(CGS-2)₂ se neprojevila podstatným zvýšením ze 24 na 72 hodin. Naopak negativní kontrola (dimerické protilátky scFv(Dl,3)2, anti-lysozymové protilátky) vykazují rychlé zmizení a nedetekovatelnou lokalizaci na nádoru nebo femuru.

ScFv(28SI) vykazuje slabé cílení do nádoru po 6 hodinách (data nejsou uvedena), ale nebylo detekováno po 24 hodinách nebo později (obr. č. 6). Afinitní maturace vede k vylepšení cíleného zavádění; pak scFv(CGS-2) se cíleně zavádí do malých a velkých F9 nádorů s vysokou účinností, vyskytuje-li se jako monomer (obr. č. 6) nebo dimer (data nejsou uvedena). Po dvouch dnech se zjistilo, že v nádoru přetrvávají 2 % injektované dávky protilátek na gram nádoru v případě scFv(CGS-2) monomeru a v případě scFv(CGS-2) dimeru to jsou 3 až 4 %. Dávka zavedená do nádoru pomocí scFv(CGS-2) byla také vyšší než v případě scFv(CGS-l) (obrázky č. 5 a 6) a koreluje a jejich afinitou (tabulka č. 1). ScFv(28SI) a scFv(CGS-l) se jeví být náchylné k proteolytickému štěpení a vykazují vysoké pohlcení játrama (obr. č.6), zatímco protilátky scFv(CGS-l) jsou podstatně více stabilní a jsou méně pohlcovány játry (obr. č. 5).

SEZNAM SEKVENCÍ (1) VŠEOBECNÉ INFORMACE:

(i) PŘIHLAŠOVATEL: PHILOGEN S.r.l.

Via Roma 22, SIENA, Itálie, PSČ: 53100 (ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Protilátky proti ED-B doméně fibronektinu, jejich konstrukce a použití (iii) POČET SEKVENCÍ: 12 (iv) STROJNĚ ČITELNÁ FORMA:

(A) MEDIUM: Floppy disk (B) POČÍTAČ: kompatibilní s IBM PC (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Verse #1.30 (EPO) (vi) DATA O TÉTO PŘIHLÁŠCE:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: PCT/GB97/01412 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 4 aminokyseliny (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:1:

Ser Leu Pro Lys (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 12 aminokyseliny (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:2:

Gly Val Gly Ala Phe Arg Pro Tyr Arg Lys His Glu 1 5 10 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:3:

CAGGAAACAG CTATGAC (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 51 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:4:

CTTGGTCCCT CCGCCGAATA CCACMNNMNN MNNMNNMNNM NNAGAGGAGT TACAGTAATA GTCAGCCTC 69 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 54 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:5:

ATTGCTTTTC CTTTTTGCGG CCGCGCCTAG GACGGTCAGC TTGGTCCCTC CGCC 54 • c · · ··

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 43 aminokyseliny (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:6:

Gly	Gly	Cys	Leu	Thr	Asp Thr Leu Gin Ala Phe Thr Asp Gin Leu Glu
1				5	10 15
Asp	Glu	Lys	Ser	Ala	Leu Gin Thr Glu Ile Ala His Leu Leu Lys Glu
			20		25 30
Lys	Glu	Lys	Leu	Phe	Ile Leu Ala Ala His
		35			40

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 8 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:7:

Pro Val Val Leu Asn Gly Val Val 1 5 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 8 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární

(ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:8:

Pro Phe Glu His Asn Leu Val Val 1 5 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 113 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIE, lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(B)KMEN: CGS1 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:9:

Gin

Val

Gin

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Leu

Val

Gin Pro

Gly Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Val

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe Ser

Ser Tyr

20

25

30

Ala

Met

Ser

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu Glu

Trp Val

35

40

45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Ser Leu Pro Lys Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Arg 100 105 110 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NOTO:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 121 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (vi)PŮVODNÍ ZDROJ:

(B) KMEN: CGS2 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 10:

Gin

Val

Gin

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Leu

Val

Gin Pro

Gly Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe Ser

Ser Tyr

20

25

30

Ala

Met

Ser

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu Glu

Trp Val

35

40

45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Val Gly Ala Phe Arg Pro Tyr Arg Lys His Glu Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Arg 115 120 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 109 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (vi)PŮVODNÍ ZDROJ:

(B)KMEN: CGS1 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 11:

Ser	Ser	Glu	Leu	Thr	Gin Asp Pro Ala	Val	Ser	Val	Ala	Leu	Gly Gin
1				5		10					15
Thr	Val	Arg	Ile	Thr	Cys Gin Gly Asp	Ser	Leu	Arg	Ser	Tyr	Tyr Ala
			20		25					30
Ser	Trp	Tyr	Gin	Gin	Lys Pro Gly Gin	Ala	Pro	Val	Leu	Val	Ile Tyr
		35			40				45
Gly	Lys	Asn	Asr	i Arg Pro Ser Gly Ile	Pro	Asp	Arg	Phe	Ser	Gly Ser
	50				55			60

Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gin Ala Glu 65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ser Pro Val Val Leu Asn Gly 85 90 95

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(B) KMEN: CGS2 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 12:

Ser

Glu

Leu

Thr

Gin Asp Pro Ala

Val

Ser

Val

Ala

Leu

Gly

Gin

1

5

10

15

Thr

Val

Arg

Ile

Thr

Cys Gin Gly Asp

Ser

Leu

Arg

Ser

Tyr

Ala

20

25

30

Ser

Trp

Tyr

Gin

Lys Pro Gly Gin

Ala

Pro

Val

Leu

Val

Ile '

Tyr

35

40

45

Gly

Lys

Asn

Asr

i Arg Pro Ser Gly Ile

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

50

55

60

sz

Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gin Ala Glu 65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ser Pro Phe Glu His Asn Leu 85 90 95

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 $3

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY (změněné)

1. Způsob produkce specificky se vázajícího člena izolovaného ze zásobníku syntetických molekul, který je specifický k ED-B onkofetální doméně fibronektinu (FN) a přímo se na ni váže, vyznačující se tím, že zahrnuje expresi nukleové kyseliny kódující tohoto specificky se vázajícího člena.
2. Způsob podle nároku 1,vyznačuj ící se tím, že zahrnuje;

a) testování peptidové nebo proteinové knihovny, která se exprimuje ve fágu, rekombinantním fibronektinovým fragmentem obsahujícím ED-B doménu odvozeným z fibronektinového proteinu;

b) infekci hostitelských bakteriálních buněk pozitivními klony;

c) vystavení pozitivních fágových klonů procesu afinitní maturace;

d) opakování kroku a) a b), přičemž dochází k selekci pozitivních fágových klonů s vylepšenou afinitou k antigenu;

e) infekci hostitelských buněk s pozitivními klony a čištění molekul protilátek z uvedených hostitelských buněk.
3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že krok a) zahrnuje testování scF_v fágové knihovny rekombinantním antigenem odvozeným z fibronektinového proteinu.
4. Způsob podle nároku 3,vyznačující se tím, že uvedená fágová knihovna exprimuje scF_v lidského původu.
5. Způsob podle nároku 2, v y z n a č u j í c í se tím, ž e při kroku a) se fágové klony testují rekombinantními antigeny 7B89 nebo ED-B.
6. Specificky se vázající člen izolovaný ze zásobníku syntetických molekul, který je specifický k ED-B onkofetální doméně fibronektinu (FN) a přímo se na ni váže, připravený způsobem podle nároků 1 nebo 2.

··;

Φ « « · ·
7. Specificky se vázající člen podle nároku 6, který obsahuje protilátkovou doménu vázající antigen.
8. Specificky se vázající člen podle nároku 7, kde protilátková doména vázající antigen je lidského původu.
9. Specificky se vázající člen podle libovolného z nároků 6 až 8, který se váže na všechny fibronektiny, které obsahují ED-B, po té, co se fibronektin ošetří proteázovým termolyzinem.
10. Specificky se vázající člen podle libovolného z nároků 6 až 9, který se váže na všechny rekombinantní fibronektiny, které obsahují homologní repetice typu III, jež zahrnují doménu ED-B.
11. Specificky se vázající člen podle libovolného z nároků 6 až 10, jehož navázání na B-FN je inhibováno doménou ED-B.
12. Specificky se vázající člen podle libovolného z předchozích nároků, který se váže na B-FN, který pochází z lidského, myšího, krysího, kuřecího a libovolného dalšího species, kde doména ED-B je konzervativní.
13. Specificky se vázající člen podle libovolného z předchozích nároků, který se váže na B-FN, aniž je FN ošetřeno N-glykanázou.
14. Specificky se vázající člen podle libovolného z předchozích nároků, mající sekvenci variabilní oblasti těžkého řetězce (VH) odvozenou z lidské zárodečné linie DP47 (kodon 1 Glu až kodon 98 Arg včetně na obr. č. 1) a sekvenci CDR3 Ser Leu Pro Lys.
15. Specificky se vázající člen podle libovolného z nároků 6 až 13, mající sekvenci variabilní oblasti těžkého řetězce (VH) odvozenou z lidské zárodečné linie DP47 (kodon 1 Glu až kodon 98 Arg včetně na obr. č. 1) a sekvenci CDR3 Gly Val Gly Ala Phe Arg Pro Tyr Arg Lys His Glu.
16. Specificky se vázající člen podle libovolného z nároků 6 až 13, mající sekvenci variabilní oblasti lehkého řetězce (VL) odvozenou z lidské zárodečné linie DPL16 (kodon 1 Ser až kodon 90 Ser včetně na obr. č. 1) a zbytek sekvence CDR3 jako Pro Val Val Leu Asn Gly Val Val.
17. Specificky se vázající člen podle libovolného z nároků 6 až 13, mající sekvenci variabilní oblasti lehkého řetězce (VL) odvozenou z lidské zárodečné linie DPL16 (kodon 1 Ser až kodon 90 Ser včetně na obr. č. 1) a zbytek sekvence CDR3 jako Pro Phe Glu His Asn Leu Val Val.
18. Specificky se vázající člen podle libovolného z nároků 6 až 13, mající sekvenci variabilní oblasti těžkého řetězce (VH) odvozenou z lidské zárodečné linie DP47 (kodon 1 Glu až kodon 98 Arg včetně na obr. č. 1) a sekvenci CDR3.
19. Specificky se vázající člen podle libovolného z předchozích nároků, který má, měřeno jako čistý monomer, disociační konstantu (Ka) pro ED-B FN rovnou 6 x 10'⁸ M nebo méně.
20. Specificky se vázající člen podle libovolného z předchozích nároků, kde tento člen zahrnuje molekulu scF_v.
21. Specificky se vázající člen podle libovolného z předchozích nároků, kde tento člen zahrnuje dimemí molekulu scF_v.
22. Specificky se vázající člen podle libovolného z předchozích nároků, kde tímto členem je protilátko vý fragment, který je definován v nárocích 14 až 18.
23. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje specificky se vázajícího člena podle libovolného z předchozích nároků v účinném množství ve spojení s farmaceuticky přijatelným nosičem.

« · ·· · ·

Sb fc
24. Nukleová kyselina, která kóduje specificky se vázající člen podle libovolného z nároků 6 až 22.
25. Fág, který kóduje specificky se vázající člen podle libovolného z nároků 6 až 22.
26. Hostitelská buňka, která je transformována nebo transfektována nukleovou kyselinou podle nároku 24.
27. Specificky se vázající člen podle libovolného z nároků 6 až 22, pro použití při léčbě.
28. Použití specificky se vázajícího člena podle libovolného z nároků 6 až 22, při výrobě léčiva pro zobrazení nádorů nebo pro cílené zavádění do nádorů.
29. Diagnostický kit, vyznačující se tím, že obsahuje specificky se vázající člen podle libovolného z nároků 6 až 22 a jedno nebo více činidel, které umožňují stanovení navázání uvedeného člena na buňky.